DE2705878C3 - Beifuttermittel zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd, Tokio - Google Patents

Beifuttermittel zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd, Tokio

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DE2705878C3
DE2705878C3 DE2705878A DE2705878A DE2705878C3 DE 2705878 C3 DE2705878 C3 DE 2705878C3 DE 2705878 A DE2705878 A DE 2705878A DE 2705878 A DE2705878 A DE 2705878A DE 2705878 C3 DE2705878 C3 DE 2705878C3
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism

Description

Die Erfindung betrifft ein Beifuttermittel, nämlich ein Enzympräparat, mit dessen Hilfe die Milchsekretion bei Tieren, insbesondere von Kühen, erhöht werden kann.
Unter genetischen, ernährungswissenschaftlichen und tiermedizinischen Gesichtspunkten wurden in der Milchviehhaltung eine Reihe von Versuchen unternommen, die Milchsekretion und die Milchqualität zu erhöhen. Bei Tierzüchtern und Herstellern von Molkereiprodukten besteht aber immer noch das Bedürfnis nach einer weiteren Steigerung der Milchsekretion und einer Erhöhung der Milchqualität.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Beifuttermittel zu schaffen, das die Aktivitäten von Cellulase, Laminarinase, Xylanase, Pectinase, Dextranase, Amylase und Protease aufweist und sich zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren eignet. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß dieses Beifuttermittel beim Züchten von bestimmten Stämmen der Art Irpex lacteus anfällt. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
In der modernen Tierhaltung werden Tieren mit einem Magen, wie Schweinen, Hühnern, Pferden und dergl., häufig Enzyme verabreicht, um die Futterverwertung zu verbessern und die Verdauung zu fördern. Auch ist die Verwendung von Enzymen zur Herstellung von Molkereiprodukten geläufig. Es wurde jedoch bisher noch nicht versucht, Tieren Enzyme zu verabfolgen, um die Milchsekretion zu erhöhen und außerdem die Milchqualität zu verbessern. Soweit ersichtlich, wird diese Aufgabe durch das Beifuttermittel der Erfindung erstmals gelöst.
Die Menge der Milchausscheidung, der Anteil an Milchfett und festen Nichtfettbestandteilen kann erhöht werden, wenn man den Tieren das erfindungsgemäße Beifuttermittel verabfolgt. Als Tiere kommen vor allem Kühe, Ziegen und Schafe in Frage.
Das Beifuttermittel der Erfindung läßt sich durch Züchten von Irpex lacteus NRRL 11063 und Irpex lacteus ATCC 20123 in einem festen oder flüssigen Medium erhalten.
Irpex lacteus NRRL 11063 wurde beim Northern Regional Research Laboratory, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, V.St.A., hinterlegt. Der Stamm Irpex lacteus ATCC 20123 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., hinterlegt.
Die mikrobiologischen Eigenschaften der Stämme dieserGattungen sind in »Genshoku Nippon Kinrui Zukan« (Enzyklopädie der japanischen Mikroorganismen), Bd. 1, 1957, Hrsg. Hoiku-sha, beschrieben.
Das Verfahren zur Züchtung von Basidiomyceten ist beispielsweise in Journal of Fermentation Technology, Japan, Bd. 50 (1972), S. 691 bis 697 beschrieben und dem Fachmann an sich geläufig.
Das Beifuttermittel wird im allgemeinen aus ainer Enzymlösung hergestellt, die nach dem Entfernen der Zellen von der Gärbrühe erhalten worden ist Dazu bedient man sich herkömmlicher Verfahren zur Reinigung von Enzymen, wie Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen, Eindampfen unter vermindertem
ι ο Druck und Adsorption und Desorption an Ionenaustauschern.
Es können aber auch die nach der Züchtung iia Medium erhaltenen Zellen, das Kulturfiltrat oder ähnliche Produkte direkt als Enzymquelle ohne weitere Behandlung verwendet werden.
Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Beifuttermittel weist folgende Enzymaktivitäten auf:
Enzym Substrat Aktivität
Cellulase Filterpapier u/g J 20000-40000
Xylanase Xylan r/mg-Std. 1600-3 400
Dextranase Dextrin r/mg-Std. 10-120
Laminarinase Laminarin r/mg-Std. 2000-4 600
Amylase Stärke u/mg 4-15
Protease Casein u/mg 2-20
Pectinase Pectin %/0,3mg 26-81
r: Menge an reduziertem Zucker (wie Glucose), die innerhalb einer Stunde durch 1 mg des Enzyms gebildet wird.
Die im Patentanspruch genannten Enzymaktivitäten werden ausschließlich wie folgt bestimmt:
I. Messung der Cellulase-Aktivität
Verfahren
Verdünnte Enzymlösung1)
— 2 Stücke Filterpapier2)
L-Reagenzglas3)
Schütteln bei 40 C im Monod-Inkubator4)
Messung der Zeit, die zum vollständigen Zerfall des Filterpapiers erforderlich ist (min)5)
ι) Verdünnte Enzymlösung: Eine entsprechende Menge der Probe wird in 0,1 m AcetatpufFer vom pH-Wert 4,5 gelöst, so daß die durchschnittliche Zerfallszeit etwa 60 Minuten beträgt. Bei der Verwendung einer Enzymlösung mit einer Konzentration von 200 u/5 m! zerfallt das Filterpapier in 50 Minuten. Die Pufferlösung ohne Enzym wird als Kontrolle verwendet.
2) Zum Messen der Cellulaseakl.ivität mittels der Zerfallsgeschwindigkeit von Filterpapier; Abmessungen lcmxl cm.
·') L)-Reagenzglas: Innendurchmesser 17 bis 18 mm, senkrechter Abschnitt 75 bis 76 mm hoch, horizontaler Abschnitt 150 mm lang.
") Monod-Inkubator: 60 Schüttelbewegungen pro Minute mit einem Ausschlag von 4 cm.
5) Durchschnittliche Zerfallszeit: 5 Reagenzgläser mit den entsprechenden Proben werden gleichzeitig dem Versuch unterworfen. Die längste und die kürzeste Zerfallszeit werden gestrichen, und aus den restlichen Zerfallszeiten wird der Mittelwert bestimmt.
Berechnung
Die Aktivität wird in Einheiten angegeben. 10 000 Einheiten sind als die Enzyramenge definiert, die das Filterpapier innerhalb einer Minute vollständig zerfallen läßt. Die Aktivität wird nach nachstehender Gleichung berechnet:
„...,,. 25000 „ 1000
Aktivität (u/g) =
durchschnittliche Zerfallszeit (min)
Probemenge in S ml der verdünnten Enzymlösung (mg)
Zur Bestimmung der Aktivität einer Flüssigkeit wird zur Berechnung das Volumen in ml anstelle des Gewichts in g herangezogen. Die Aktivität wird als u/ml angegeben.
II. Messung der Laminarinase-Aktivität
Verfahren
2,5prozentige Lösung von Laminarin in Wasser 1 ml
0,1 m Acetatpufler
vom pH-Wert 4,5:3 ml
verdünnte Enzymlösung: 1 ml1) Inkubationszeit bei 40°C: 60 min
Abbruch der Reaktion durch 5minütiges Eintauchen in siedendes Wasser
Bestimmung des reduzierenden Zuckers in der Reaktionslösung.
') Das Enzym wird in 0,1 m Acetatpufler vom pH-Wert
4,5 gelöst.
Zur Kontrolle wird anstelle der verdünnten Enzymlösung Puffer eingesetzt.
Berechnung
Die Enzymaktivität wird als die Menge (r) an reduziertem Zucker wiedergegeben, der innerhalb von 60 Minuten durch 1 mg Enzym gebildet wird.
Reduzierter
Zucker
in der
Reaktionslösung
Reduzierter
Zucker
in der
Kontrolllösung
Durch das Enzym reduzierter Zucker in der Reaktionslösung (r)
Nach Division durch die Enzymmenge in mg und durch die Zeit in Stunden, erhält man den Wert für die Enzymaktivität.
HI. Messung der Dextranase-Aktivität
Das Verfahren und die Berechnung wird gemäß der Messung der Laminarinase-Aktivität durchgeführt, wobei als Substrat eine 2,5prozentige Dextrinlösung in Wasser verwendet wird.
IV. Messung der Xylanase-Aktivitäl
Das Verfahren und die Berechnung wird gemäß der Messung der Laminarinase-Aktivität durchgeführt, wobei eine 2,5prozentige Xylanlösung in Wasser als Substrat verwendet wird.
V. Messung der Pektinase-Aktivität
Viskositäts-Depressionsmethode
Verfahren
Ostwald-Viskosimeter
10 - Acetatpuffer vom pH-Wert 4,5:2 ml -2prozentige Pectinlösung: 2 ml1)
lOminütiges Vorerwärmen auf 40 C2)
verdünnte Enzymlösung: 1 ml3l
25
JO
35 lOminütige Inkubation bei 4O0C, anschließend Messung der Viskosität (see).
Berechnung
Die Aktivität wird wiedergegeben als die prozentuale Viskositätserniedrigung pro Einheitsmenge des verwendeten Enzyms.
Vo - Vt
— x 100% / verwendete Enzymmenge;
Vo: Durchlaufzeit (see) für eine Flüssigkeit, die ansteile der Enzymlösung vollentsalztes Wasser enthält
Vt: Durchlaufzeit für eine Lösung, 10 Minuten nach der Zugabe der Enzymlösung.
Vw: Durchlaufzeit für vollentsalztes Wasser.
') 2prozentige Pectinlösung in Wasser.
2) Zur Viskositätsmessung muß großer Wert auf die Vorerwärmung gelegt werden.
3) Das Enzym wird in 0,1 m Acetatpufler vom pH-Wert 4,5 gelöst
VI. Messung der Amylase-Aklivität
Die Messung der Amylase-Aktivität ist in Method of Enzymatic Analysis, Bd. 1 (1974), S. 432, Academic Press, New York, beschrieben.
Testgemisch')
1
5minütiges Erwärmen im siedenden Wasserbad
1
Abkühlen
Zugabe von 10,00 ml destilliertem Wasser
Ablesen der Extinktion bei 546 nm (Quecksilberlinie) )0 gegen einen Leerwert.
0 0,50ml Stärkelösung (10mg Stärke/ml in 2OmMIimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 6,miilimolar NaCl)
0,48 ml destilliertes Wasser
0,02 ml Enzymlösung in destilliertem Wasser
1,00 ml Farbreagenz (Ig 3,5-Dinitrosalicylsäure in 20 ml 2 n-NaOH, 30g Kaliumnatriumtartrat, destilliertes Wasser auf 100 ml).
55
60
b5 VII. Messung der Protease-Aktivität
Die Protease-Aktivität wird nach dem Casein-Folin-Verfahren gemäß »Koso Kenkyu Method«(Verfahren in der Enzymforschung), Bd. 2 (1956), S. 237 bis 246, gemessen.
Das Beifuttermittel kann den Tieren direkt verabfolgt werden. Im allgemeinen wird es aber im Gemisch mit Futter gegeben.
Die wirksame Menge des zu verabfolgenden Beifuttermitteis besteht aus einer oder mehreren Einheiten, bezogen auf die Cellulase-Aktivität, pro 1 g Trockenmasse des Futters. Am besten werden 2 bis 6 Einheiten des Beifuttermittels, bezogen auf die Cellulase-Aktivität, pro 1 g Futtertrockenmasse, verwendet.
2 oder 3 Tage nach Beginn der Verabreichung beginnt die Milchsekretion zu steigen. Bei fortdauernder Verabfolgung des Beifuttermittels bleibt die hohe Milchsekretion erhalten. Dies gilt auch bis zu einem Zeitraum von 2 oder 3 Tagen nach dem Ende der Verabreichung. Demgemäß soll das Beifuttermittel mindestens an 3 aufeinanderfolgenden Tagen verabfolgt werden.
Bei Verabfolgung des erfindungsgemäßen Beifuttermittels an Milchkühe steigt die Milchsekretion um 8 bis 12 %, die Menge an festen Nichtfettbestandteilen um etwa 3% und die Milchfettmenge um etwa 5%.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Wirkung bei der Verabfolgung des erfindungsgemäßen Beifuttermittels.
Versuch 1
Futter von gleichbleibender, feststehender Zusammensetzung (nachstehend als Standardfutter bezeich net) wird während einer Vorbereitungszeit von 10 Tagen an 10 Holstein-Milchkühe gegeben. Dabei werden pro Tier und Tag etwa 15 kg Trockenbestandteile verfüttert, die sich aus S kg Grünfutter, 3 kg Stroh, 3 kg Heuwürfel, 2 kg Rübenbrei, 7 kg Bohnen und Bohnenabfall, 5,5 kggepreBteGerste, 1 kgWeizenkleieundl,5 kgSojabohnenmehl zusammensetzen. D>e Menge an Milch, festen Nichtfettbestandteilen und Milchfett wird während dieser Zeit gemessen. Anschließend erhalten die
to Kühe 30Tage lang das Standardfutter, das pro Tier und Tag mit 30 g Beifiittermittel mit einer Cellulase-Aktivität von 1000 Einheiten/g vesetzt wird. Dieses Beifuttermittel weist ferner folgende Enzymaktivitäten auf: Xylanase 120r/mg-Std., Dextranase 4 r/mg-Std., Lamina- rinase 100 r/mg-Std., Amylase 0,5 u/mg, Protease 0,5 u/mg und Pectinase 2,5 Prozent/0,3 mg. Auch während dieser Zeit wird die Menge an Milch, festen Nichtfettbestandteilen und Milchfett gemessen. Anschließend erhalten die Tiere 20 Tage lang nur das Standard- futter, wobei wieder Milch, feste Nichtfettbestandteile und Milchfett gemessen werden. Die Mittelwerte der während dieser Zeit ermittelten Werte sind in nachstehender Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle 1
Tage
Anzahl der Kühe Durchschnittliche Milchleistung
Gehalt an festen Nichtfettbestandteilen
Milchfett gehalt
Vorbereitungszeit 10 10 17,4 kg Verabfolgung von Beifuttermittel 30 9*) 19,3 kg Restliche Beobachtungszeit 20 8**) 17,7 kg
8,40 % 8,60 % 8,45 %
*) Durchschnitt aus 9 Kühen, da eine Kuh ausfiel. **) Durchschnitt aus 8 Kühen, da bei einer Kuh Verdacht auf eine Erkrankung (Mastitis) bestand.
3,20 % 3,35 % 3,25 %
Versuch 2
15 Milchkühe mit einer unterdurchschnittlichen Milchleistung werden aus einer Gruppe von erwachsenen Holstein-Weidekühen ausgewählt und in drei Gruppen von jeweils 5 Tieren dem nachstehenden
Versuch unterworfen.
Die drei Gruppen A, B und C, die aus jeweils 5 Tieren bestehen, erhalten Futter und mit Beifuttermittel angereichertes Futter nach dem in der Tabelle II angegebenen Plan.
Tabelle II Tage
1. - 10.
Tag 		11.- 25.
Tag 		26. - 40.
Tag 		41. - 55.
Tag 		56. - 70.
Tag 		71. -
Tag 		80.
A1B1C A
B1C 		A, B
C 		B, C -
A 		C
A, B 		A, B, C
Mit Beifuttermittel
Ohne Beifuttermittel
Pro Tag und Tier werden etwa 13 kg Trockenbestandteile verfüttert, die sich aus 6,5 kg gepreßtem Hafer, 1,6 kg Weizenkleie, 3,9 kg Mischfutter (Zenraku Nr. 2), 2,1 kg Heuwürfel und 5 kg zerkleinertem Reisstroh zusammensetzen. Als Beifuttermittel dienen 30 g des in Versuch 1 verwendeten Enzympräparats pro Tag und Tier.
Während des Versuchs werden die Kühe gruppenweise 2mal täglich jeweils morgens und abends gemolken. Die durchschnittliche Milchleistung (kg) und der durchschnittliche Milchfettgehalt (%) pro Tier wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
7 - 10. 11. 27 - 25. 05 878 41. 8 19,6 C 17,8 A - 70. 71. -80.
"lag Tag (3,12) (2,96) Tag
Tabelle III Tage B 19,2 B
1. - A 19,2*) - 55. 56. (3,14) 19,7
lag (3,15) 26. - 40. C Tag (3,17)
Tag
Mit Beifuttermittel 17,3 A 19,5 A 17,4
(2,90) B 17,5 (λ.!7) 17,4 (2,92)
17,5 (2,90) B 19,3 A (2,92) . B 17,6
A (2,90) C 17,3 (3,10) 17,8 (3,04)
Ohne Beifuttermittel 17,4 (2,91) (3,08) C 17,5
B (2,92) (3,02)
C 17,4
C (2,92)
*) Die Zahlen in der oberen Reihe geben die Milchleistung in kg und die in runde Klammern gesetzten Zahlen in der unteren Reihe den Milchfettgehalt in % an.
Das nachstehende Beispiel erläutert die Herstellung eines Beifuttermittels der Erfindung.
Beispiel
Als Anzuchtstamm wird Irpex lacteus Nr. 82, (NRRL 11063) verwendet. Das Nährmedium enthält 40 g/ Liter Rohrzucker, 30 g/Liter lösliche Rückstände der Alkoholdestillation, 3 g/Liter pulverformigen Hefeextrakt, lg/Liter KH2PO4 und 0,2g/Liter MgSO4-7H2O. Der pH-Wert dieses ersten Nährmediums vor der Sterilisation beträgt 4,0. Der Anzuchtstamm wird mit einer Öse auf 30 ml des vorgenannten ersten Anzuchtmediums, das sich in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet, übergeimpft. Anschließend wird 4 Tage bei 30cC unter Schütteln gezüchtet. Sodann werden 30 ml der auf diese Weise erhaltenen ersten Anzuchtkultur auf 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums übergeimpft, das sich in einem 2-Liter-Kolben befindet. Das zweite Anzuchtmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie das erste Anzuchtmedium. Die zweite Züchtung wird 2 Tage bei 30cC unter Schütteln durchgeführt. Anschließend werden 300 ml der zweiten Anzuchtkultur auf 15 ml des Hauptmediums, das sich in einem 30 Liter fassenden Fermenter befindet, übergeimpft. Das Hauptmedium enthält 20 g/Liter Cellulosepulver, 30 g/Liter Sojabohnenmehl, 5 g/Liter Trockenhefe, 5 g/Liter KH2PO4 und 0,5 g/Liter MgSO4 · 7H2O. Vor der Sterilisation beträgt der pH-Wert dieses Hauptmediums 4,0. Die Züchtung wird unter Belüftung und Rühren (Drehzahl 400 U/min, Belüftungsgeschwindigkeit 15 Liter/ min) 3 Tage bei 28CC durchgeführt.
Nach beendeter Züchtung wird die Cellulase-Aktivität des nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltenen Kulturfiltrats zu 600 u/ml bestimmt.
10 Liter dieses Filtrats werden mit 6,5 kg Ammoniumsulfat versetzt. Der gebildete Niederschlag wird in Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit dem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex G-25 bekannten, mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran behandelt. Nach dem Gefriertrocknen erhält man 150 g Beifuttermittel mit folgenden Enzymaktivitäten:
Cellulase
Xylanase
Laminarinase
Dextranase
Amylase
Protease
Pectinase
23000 u/g
2 800 r/mg-Std.
2300r/mg-Std.
80 r/mg/Std.
14 u/mg
9 u/mg
53 %/0,3 mg

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Beifuttermittel zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 20000 bis 40 000 u/g Cellulase, 1600 bis 3400 r/mg-Std. Xylanase, 10 bis 120 r/mg-Std. Dextranase, 2000 bis 4600 r/mg-Std. Laminarinase, 4 bis 15 u/mg Amylase, 2 bis 20 u/mg Protease und 26 bis 81%/O,3mg Pectinase besteht und durch Züchten von Irpex lacteus NRRL 11063 oder Irpex lacteus ATCC 20123 erhalten worden ist.
DE2705878A 1976-02-12 1977-02-11 Beifuttermittel zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd, Tokio Expired DE2705878C3 (de)

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