DE69533473T2

DE69533473T2 - Verarbeitung von pflantzlichem material mit xylanase

Info

Publication number: DE69533473T2
Application number: DE69533473T
Authority: DE
Inventors: Tina Sejersgard Novo Alle JACOBSEN; Hans Peter Heldt-Hansen; Lene Venke Kofod; Christian Bagger; Anette MÜLLERTZ
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1994-03-02
Filing date: 1995-02-24
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2015-02-25
Also published as: KR970701500A; AU696360B2; US5874274A; WO1995023514A1; AU1755095A; DE69533473D1; CN1144457A; ES2229237T3; EP0746206B1; JPH09509830A; EP0746206A1; ATE275343T1; CA2184591A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Xylanasezubereitung zur Viskositätsreduktion eines Pflanzenmaterials und zum Trennen eines Pflanzenmaterials, wie Weizen, in getrennte nützliche Komponenten sowie die Verwendung von besagter Zubereitung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Weizen enthält wertvolle Komponenten von Gluten und Stärke, die in Nassvermahlungsverfahren wiedergewonnen werden können. Lebenswichtiges Gluten ist das Primärprodukt, während A-Stärke von hoher Qualität und B-Stärke von niedriger Qualität wertvolle Nebenprodukte sind. Zurückbleibende Fasern und lösliche Feststoffe sind weitere Nebenprodukte.
Die kommerziell erhältliche Trichoderma reesei Cellulase-Enzymzubereitung, Spezyme^® CP (Genencor, USA) wurde zur Senkung der Viskosität und zur Verbesserung der Verarbeitung von Weizen- und Getreide-(corn)Stärke vorgeschlagen.
Weegels et al., (1992), beschreiben die Verwendung von Enzymen (Cellulase, Hemicellulase, Lipase und Protease/Amylase) in einem Weizentrennverfahren. Es wird gefolgert, dass Cellulasen und Hemicellulasen die Verarbeitungseigenschaften von Weizen verbessern und die Ausbeute an Gluten und Stärke erhöhen. Die verwendete Hemicellulase war eine Xylanasezubereitung, welche wesentliche Nebenaktivitäten einschließlich Amylase- und Proteaseaktivität enthielt.
Es ist bekannt, dass Xylanasen in der Lage sind, Weizenmehl und andere von Pflanzen abgeleitete Materialien in eine Anzahl von unterschiedlichen Abbauprodukten abzubauen. Aus einem Stamm der Pilzspezies Aspergillus awamori gereinigte Xylanasen wurden in einer Anzahl von Referenzen beschrieben, siehe z.B. Kormelink et al., (1993), welcher physikochemische und kinetische Charakteristika von drei A. awamori Endoxylanasen offenbart. Die Abbauprodukte, die durch Verwendung solcher A. awamori Xylanasen bei dem enzymatischen Abbau von verschiedenen Pflanzenmaterialien einschließlich Reiskleie, Haferspelze, Weizenmehl, Lärchenholz und Birkenholz erhalten werden, sind u.a. bei Kormelink et al., (1991), Kormelink et al., (1992), J.M. Kormelink und A.G.J. Voragen (1993), Gruppen et al., (1992) und Gruppen et al., Symposium Oktober 1993, beschrieben.
Voragen et al., (1992), und Gruppen et al., (1993a und 1993b), offenbaren den Abbau von wasserextrahierbaren und nicht-wasserextrahierbaren Arabinoxylanfraktionen, die mit A. awamori Endoxylanasen aus Weizenmehl isoliert wurden. Die letztere Referenz beschreibt die Verwendung von zwei der A. awamori Xylanasen zum Backen von Weizenbrotlaiben.
Shei et al., (1985), und Fournier et al., (1985), beschreiben die Reinigung und Charakterisierung von Endoxylanasen, die aus A. niger isoliert wurden.
Keine der obigen Referenzen erwähnt, dass Xylanasen zur Weizentrennung verwendet werden könnten, noch wie man Xylanasen auswählen könnte, die für besagten Zweck besonders verwendbar sind.
Düsterhöft et al., Symposium Okt. 1993, beschreiben die Verwendung von Endoxylanase im Abbau von Nicht-Stärke-Polysacchariden in Tierfutter und Vietor et al., (1993), beschreiben die Verwendung von Endoxylanase zum Reduzieren der Viskosität von Stammwürze während dem Bierbrauverfahren.
WO 91/19782 offenbart die Herstellung einer Aspergillus niger var awamori Xylanase, die z.B. in einem Nahrungsmittel-verarbeitenden Verfahren, wie der Herstellung von Backwaren, verwendet wird.
WO 92/01793 offenbart eine Zusammensetzung, die eine von Aspergillus tubigensis abgeleitete Endoxylanase zum Backen von Brot oder für die Zugabe zu Tierfutter umfasst. Die Xylanase kann verwendet werden um die Viskosität von Futter zu reduzieren, das Xylane enthält.
WO 93/25693 offenbart eine rekombinante Xylanase aus anaeroben Pilzen, insbesondere Neocallimastix patriciarum, zur Verwendung in der Faserstoff- und Papierindustrie.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Xylanasezubereitung zur Verfügung zu stellen, die zur Modifikation der Viskosität eines Pflanzenmaterials und zur Trennung eines Pflanzenmaterials in erwünschte Komponenten geeignet ist.
KURZE OFFENBARUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die spezifische Viskosität von Xylanase II kombiniert mit anderen Enzymen.
2 zeigt das Prinzip des Nassvermahlungs-Weizentrennverfahrens.
3 zeigt die AMEn von Weizen in Brathähnchen.

BF+ = Bio-Feed^® Plus
Xyl II = Xylanase II

In erster Hinsicht bezieht sich die Erfindung auf eine Zubereitung umfassend

a) eine Xylanase, aufweisend
i) ein Verhältnis zwischen wasserlöslicher Pentosaneinheit (WSPU) und wasserunlöslichen Pentosaneinheiten (WIPU) pro mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert sind, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches zugesetztes Protein, welches höher als 0,06 ist und/oder
ii) eine wasserlösliche Pentosaneinheit (WSPU) pro mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert ist, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches zugesetztes Protein, welches höher als 15 ist, und/oder üi)eine spezifische Aktivität von mehr als 0,053 FVRU pro mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert ist, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches Protein und
b) Endoglucanase I gezeigt in SEQ ID NO: 5, erhältlich aus Humicola insolens oder einer 43 kD Humicola insolens Endoglucanase, gezeigt in SEQ ID NO: 7.

KURZE OFFENBARUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder haben nun überraschenderweise herausgefunden, dass die Aktivität von Xylanase auf wasserlösliche bzw. wasserunlösliche Pentosane f[r die Effizienz der Xylanase im Reduzieren der Viskosität und/oder bei der Trennung von Komponenten eines Pflanzenmaterials wichtig zu sein scheint. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesem Ergebnis.
In erster Hinsicht bezieht sich die Erfindung auf eine Zubereitung umfassend

a) eine Xylanase, aufweisend
i) ein Verhältnis zwischen wasserlöslicher Pentosaneinheit (WSPU) und wasserunlöslichen Pentosaneinheiten (WIPU) pro mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert sind, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurück gewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches zugesetztes Protein, welches höher als 0,06 ist und/oder
ii) eine wasserlösliche Pentosaneinheit (WSPU) pro mg Protein, die mit dem Enzym assozüert ist, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches zugesetztes Protein, welches höher als 15 ist, und/oder
iii) eine spezifische Aktivität von mehr als 0,053 FVRU pro mg Protein, die mit dem Enzym assozüert ist, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches Protein und
b) Endoglucanase I, erhältlich aus Humicola insolens oder einer 43 kD Humicola insolens Endoglucanase.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung einer solchen Zubereitung für eine Anzahl von Zwecken.
Im vorliegenden Zusammenhang ist WSPU (wasserlösliche Pentosaneinheit) definiert als die Aktivität einer Xylanasezubereitung pro mg Protein auf wasserlösliche Pentosane und WIPU (wasserunlösliche Pentosaneinheit) als die Aktivität auf wasserunlösliche Pentosane pro mg Protein, wobei die Aktivitäten als reduzierende Zucker gemessen werden. Die Herstellung von löslichen bzw. unlöslichen Pentosanen ist unten im Abschnitt Material und Methoden beschrieben. In Beispiel 4 ist ein Test zur Bestimmung von WSPU und WIPU beschrieben. WSPS ist das Verhältnis zwischen WSPU und WIPU pro mg hinzugefügtem Protein, wobei das Protein nach Kjeldahl bestimmt wird, siehe den nachfolgenden Abschnitt Material und Methoden.
Im vorliegenden Zusammenhang ist der Begriff "zugefügtes Protein" beabsichtigt, die Menge an xylanolytische Aktivität enthaltendem Protein zu sein, welche aus einer Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, in welcher das Enzym hergestellt wurde und welche anschließend für den vorliegenden Zweck verwendet wird. Somit bezieht sich der Begriff "mg Protein" bei der wie hier definierten Bestimmung der WSPS-, WSPU- und FVRU-Werte eines gegebenen Enzyms auf die mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert sind, wenn es aus der Fermentationsbrühe rückgewonnen wird und kein inertes oder nicht-xylanolytisches zugesetztes Protein.
Es ist zu verstehen, dass Xylanasezubereitungen, die für den vorliegenden Zweck zu verwenden sind, eine im Vergleich zu Xylanasen aus dem Stand der Technik und Cellulasen aus dem Stand der Technik erhebliche xylanolytische Aktivität pro mg Protein enthalten. Dies bedeutet, dass bei Verwendung einer übenaschend niedrigen Dosis (in mg Protein) der Xylanasezubereitung der Erfindung eine wesentliche Viskositätsreduktion (ausgedrückt als spezifische Viskosität) bzw. Weizentrennkapazität erhalten wird. Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Enzym ist vorzugsweise im Wesentlichen ein Einkomponenten-Enzym, welches typischerweise mit einer hohen Effizienz durch Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken in einer hochreinen Form hergestellt werden kann (d.h. relativ geringe Mengen an unerwünschten Nebenaktivitäten enthaltend (im Vergleich zu der xylanolytischen Aktivität)).
FVRU ist definiert als die spezifische Viskosität des Enzyms relativ zu der spezifischen Viskosität einer Standard-Enzymzubereitung einer von Bacillus pumilus DSM 6124 hergestellten Xylanase, wie in WO 92/03540 beschrieben, pro mg hinzugefügtem Protein. Besagtes Enzym wird in der folgenden Offenbarung als B. pumilus Xylanase bezeichnet. Die spezifische Viskosität der B. pumilus Zubereitung wird im Verhältnis zu den mg hinzugefügtem B. pumilus Xylanaseprotein gemessen. Die spezifische Viskosität kann wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt werden.
Die oben definierte Klasse von Xylanasen wird als besonders verwendbar in der Weizentrennung angesehen. So haben die vorliegenden Erfinder beobachtet, dass Xylanasen mit einer guten Leistung bei der Weizentrennung die wasserlöslichen Weizenpentosane sehr schnell und die wasserunlöslichen Weizenpentosane mit einer sehr niedrigen Geschwindigkeit abbauen. Ohne auf irgendeine Theorie beschränkt zu sein, wird derzeit angenommen, dass die gute Leistung bei der Weizentrennung durch einen Abbau der viskosen wasserlöslichen Pentosane verursacht wird. Der niedrige Abbau von unlöslichen Pentosanen ist ebenfalls wichtig für die Viskositätsreduktion, die durch Xylanasen, wie sie hier definiert sind, erreicht wird, da die löslich gemachten unlöslichen Pentosane die Viskosität erhöhen könnten.
In weiterer Hinsicht bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung einer Zubereitung der Erfindung zum Reduzieren der Viskosität von Pflanzenmaterial und zur Trennung von Getreidekomponenten.
AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG Die Xylanasezubereitung
Wie es sich aus der obigen Offenbarung versteht, wird die Aktivität (wie definiert in Begriffen von WSPS oder WSPU) der Xylanasezubereitung, die für den aktuellen Zweck zu verwenden ist, als entscheidend angesehen. Vorzugsweise weist die Xylanasezubereitung, die für den vorliegenden Zweck zu verwenden ist, ein WSPS pro mg hinzugefügtem Protein von höher als 0,06 auf. Bevorzugterweise ist das hinzugefügte WSPS im Bereich von 0,06 bis maximal 10,0 pro mg Protein, besonders bevorzugt von mindestens 0,7 bis maximal 8,0 pro mg Protein, noch mehr bevorzugt zwischen 0,9 und 6,0 pro mg Protein, besonders von mindestens 1,5 bis 4,0 pro mg Protein und/oder ein WSPU pro mg hinzugefügtem Protein, welches höher als 15 wie 25 oder mehr ist. Vorzugsweise ist das WSPU pro mg hinzugefügtem Protein mindestens 100 bis maximal 150.000, besonders bevorzugt mindestens 130 bis maximal 120.000, wie mindestens 160 bis maximal 100.000, besonders bevorzugt von mindestens 300 bis maximal 90.000 und noch mehr be vorzugt von mindestens 20.000 bis maximal 85.000 und/oder eine spezifische Aktivität von mindestens 0,053 FVRU/mg Protein. Die spezifische Aktivität ist vorzugsweise im Bereich von 0,053 bis 3,0 FVRU/mg Protein, wie zwischen 0,4, 0,5 oder 0,6 und 3,0 FVRU/mg Protein, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 2,0 FVRU/mg Protein, noch mehr bevorzugt zwischen 0,4 und 1,0 FVRU/mg Protein.
Während die für den vorliegenden Zweck zu verwendende Xylanasezubereitung von beliebiger Herkunft einschließlich Säugetier, Pflanze oder Tier sein kann, ist es zurzeit bevorzugt, dass die Xylanase von mikrobieller Herkunft ist. Insbesondere kann es sich bei der Xylanasezubereitung um eine Zubereitung handeln, die von einem filamentösen Pilz oder einer Hefe ableitbar ist.
Xylanasen wurden in einer Anzahl von Pilzarten gefunden, insbesondere Arten von Aspergillus, wie A. niger, A. awamori, A. aculeatus und A. oryzae, Trichoderma, wie T. reesei oder T. harzianum, Penicillium, wie P. camenbertü, Fusarium, wie F. oxysporum und Humicola, wie H. lanuginosa und H. insolens. Xylanasen wurden auch in Bakterienarten gefunden, z.B. in der Gattung Bacillus wie B. pumilus.
Eine für den vorliegenden Zweck verwendbare Xylanasezubereitung kann durch eine Methode zur Verfügung gestellt werden, die umfasst

a) Isolieren einer Xylanasezubereitung aus irgendeinem Xylanaseproduzierenden Organismus mit im Stand der Technik bekannten Methoden und anschließend
b) Testen der WSPS, WSPU und/oder FVRU-Aktivität der Xylanase wie hier beschrieben, um herauszufinden, ob es für den vorliegenden Zweck geeignet ist.

Der Xylanase-produzierende Organismus, auf den in a) Bezug genommen wird, kann ein Organismus sein, der ein natürlicher Produzent von Xylanase ist oder ein Organismus, der mit DNA transformiert wurde, welche für die besagte Xylanase kodiert.
Es wurde gefunden, dass die Pilzart A. aculeatus, vorzugsweiser der Stamm CBS 101.43, eine f[r den vorliegenden Zweck vorzugsweise verwendbare Xylanase produziert. Besagte Xylanase wird in der vorliegenden Offenbarung als Xylanase II (oder Xyl II) bezeichnet und ist weiter in WO 94/21785 beschrieben, welche hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird.
In Beispiel 4 werden die WSPS- bzw. WSPU-Werte einer Anzahl von Xylanasen aus dem Stand der Technik zusammen mit denen von Xylanase II aufgelistet. Außerdem wird die Wirkung auf die Weizentrennung (angegeben als FVRU) dieser Enzyme gezeigt. Es ist offensichtlich, dass keine dieser Xylanasen aus dem Stand der Technik einen Weizentrenneffekt aufweist, der mit dem der hier offenbarten Xylanase II vergleichbar ist.
Die für Xylanase II kodierende DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO. 2 von WO 94/21785 und in SEQ ID NO: 1 hierin und die zugehörige Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 5 und in SEQ ID NO: 2 hierin gezeigt. Es wird erwartet, dass Xylanasen, die Homologie zu Xylanase II aufweisen, ein ähnliches Aktivitätsmuster wie Xylanase II haben und somit für den vorliegenden Zweck verwendbar sein könnten. Dementsprechend ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Xylanase eine solche, die

i) durch die in SEQ ID NO: 1 hierin gezeigte DNA-Sequenz kodiert wird oder ein Analogon hiervon, welches ein Homolog von Xylanase II kodiert,
ii) die in SEQ ID NO: 2 hierin gezeigte oder eine dazu homologe Aminosäuresequenz umfasst und/oder
iii) immunologisch mit einem Antikörper reagiert, der gegen eine von Aspergillus aculeatus CBS 101.43 abgeleitete gereinigte Xylanase gerichtet ist.

Im vorliegenden Zusammenhang ist beabsichtigt, dass der Begriff "Homolog" ein Polypeptid bezeichnet, das Xylanaseaktivität aufweist (in Form von WSPS, WSPU und/oder FVRU, wie hierin definiert) und durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die mit einer auf der Basis der für Xylanase II Enzym kodierenden DNA-Sequenz hergestellten Oligonukleotidsonde unter bestimmten näher beschriebenen Bedingungen hybridisiert (wie Voreinweichen in 5×SSC und Prähybridisieren für eine h bei ⁓ 40°C in einer Lösung von SxSSC, SxDenhardt's Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8 und 50 µg denaturierte, ultraschallbehandelte Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung, ergänzt mit µ50 Ci 32-P-dCTP-markierter Sonde für 18 h bei ⁓ 40°C, gefolgt von 3mal Waschen in 2×SSC, 0,2% SDS bei 40°C für 30 Minuten). Noch spezifischer ist es beabsichtigt, dass sich der Ausdruck auf eine DNA-Sequenz bezieht, die mindestens 70% homolog ist zu der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist oder zu einem erheblichen Teil hiervon, wie mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% homolog zu der DNA-Sequenz gezeigt in SEQ ID NO: 1 oder einem erheblichen Teil hiervon, welche ein Polypeptid mit Xylanaseaktivität kodiert. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff Modifikationen der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz einschließt, wie Nukleotidsubstitutionen, welche keine andere Aminosäuresequenz der Xylanase verursachen, welche aber der Codonverwendung des Wirtsorganismus entsprechen, in den das DNA-Konstrukt eingefügt ist, oder Nukleotidsubstitutionen, die eine andere Aminosäuresequenz verursachen und daher, möglicherweise, eine andere Proteinstruktur, welche eine Xylanasemutante mit anderen Eigenschaften im Vergleich zu denen des nativen Enzyms verursachen könnte. Weitere Beispiele für mögliche Modifikationen sind die Insertion von einem oder mehreren Codons in die Sequenz, die Addition von einem oder mehreren Codons an einem oder beiden Enden (either end) der Sequenz oder die Deletion von einem oder mehreren Codons an einem oder beiden Enden (either end) oder innerhalb der Sequenz. Es ist zu verstehen, dass das hier definierte Homolog der Xylanase II eine Anzahl von verschiedenen Aminosäureresten umfassen kann, solange die Xylanaseaktivität wie hier beschrieben ist.
Die Produktion von Xylanase II und deren weitere Charakterisierung ist aus der Offenbarung ersichtlich, die in WO 94/21785 dargelegt ist, welche in der vorliegenden Anmeldung enthalten ist.
Die hier zu verwendende Xylanasezubereitung kann von besagtem Mikroorganismus unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Technik erhalten werden. Eine Xylanasezubereitung kann zum Beispiel durch Fermentation eines Mikroorganismus und anschließende Isolierung des Enzyms durch eine im Stand der Technik bekannte Methode erhalten werden, besonders bevorzugt aber durch Verwendung von im Stand der Technik bekannten rekombinanten DNA-Techniken. Eine solche Methode umfasst gewöhnlicherweise die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert ist, welcher in der Lage ist, eine die besagte Xylanase kodierende DNA-Sequenz zu exprimieren und zu übertragen, in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des Enzyms und die Rückgewinnung des Enzyms aus der Kultur erlauben.
Im Schutzbereich der Erfindung sind beliebige Enzymzubereitungen, die aus Einkomponenten-Enzymen mikrobieller Herkunft gewonnen wurden (d.h. im Wesentlichen ohne Nebenaktivitäten), worin die Xylanase die oben definierten Xylanasemerkmale a) – c) aufweist. Die Xylanase der Erfindung kann durch Bestimmung der WSPS-, WSPU- und FVRU-Werte identifiziert werden, nachdem die Komponenten-Enzyme isoliert wurden.
Die DNA-Sequenz, die die zu verwendende Xylanase kodiert, kann von beliebiger Herkunft sein, z.B. eine cDNA-Sequenz, eine genomische Sequenz, eine synthetische Sequenz oder eine beliebige Kombination hiervon. Die Zubereitung einer für den vorliegenden Zweck geeigneten Xylanase wird im Detail in WO 94/21785 beschrieben.
Wenn die Xylanase in einem Verfahren zur Weizentrennung zu verwenden ist (oder anderen Verfahren, in welchen Stärke zu produzieren ist), ist bevorzugt, dass die Xylanasezubereitung im Wesentlichen frei von Amylase ist, weil jede vorhandene Amylaseaktivität die zu produzierende Stärke abbauen kann. Entsprechend ist es bevorzugt, dass, wenn die Xylanase in der Herstellung von Proteinen zu verwenden ist, z.B. in einem Weizentrennverfahren der Erfindung, in welchem Gluten hergestellt wird, die Xylanasezubereitung im Wesentlichen frei von Protease ist, weil das letztere Enzym das zu produzierende Gluten beschädigen könnte. Amylase- und Proteaseaktivitäten können mit im Stand der Technik bekannten Methoden entfernt werden. Ein Beispiel ist die Thermoinaktivierung, welche von besonderem Vorteil in Verbindung mit in Aspergillus oryzae produzierter Xylanase II ist, weil Xylanase II im Allgemeinen thermostabiler ist als von besagter Wirtszelle produzierte Amylasen und Proteasen.
Es wurde gefunden, dass der im Trennverfahren von Pflanzenmaterial erhaltene Xylanaseeffekt entscheidend verbessert werden kann, wenn die Xylanase zusammen mit einer Cellulase verwendet wird.
Die Xylanasezubereitung der vorliegenden Erfindung umfasst Endoglucanase I, die aus H. insolens erhältlich ist und durch die Aminosäuresequenz von 14 in WO 91/17244 oder die 43 kD H. insolens Endoglucanase, beschrieben in WO 91/17243, definiert ist.
Kommerziell erhältliche Cellulasezubereitungen, die in der Xylanasezubereitung der Erfindung enthalten sein können, beinhalten Celluclast^® (erhältlich von Novo Nordisk A/S), Spezyme^® CP (erhältlich von Genencor, USA) und Rohament^® 7069 W (erhältlich von Röhm, Deutschland).
Das Pflanzenmaterial-Trennverfahren
Während ein beliebiges Xylan-umfassendes Pflanzenmaterial (wie Weichholz und Hartholz) gemäß der Erfindung behandelt werden kann, ist es bevorzugt, dass das Pflanzenmaterial von der Familie Poaceae (Syn: Graminaceae) abgeleitet wird und insbesondere aus einem Getreide wie Weizen, Roggen, Gerste oder Hafer hergestellt wird. Das Pflanzenmaterial kann zusätzlich von Gemüse oder Frucht abstammen, z.B. hergestellt aus Mais, Reis, Sorghumbohne oder Fruchtschalen. Das Pflanzenmaterial kann aus einer beliebigen Kombination oben genannter Pflanzen hergestellt werden und kann zusätzlich Nicht-Pflanzenmaterialien umfassen.
Das zu behandelnde Pflanzenmaterial kann in beliebiger geeigneter Form vorliegen. Wie unten weiter erklärt wird, kann das Pflanzenmaterial vorteilhafterweise in Form einer pumpbaren Dispersion oder Lösung vorliegen, was die Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens erlaubt. Diese Dispersion wird gewöhnlicherweise durch Mischen eines trocken vermahlenen Materials, speziell Weizen mit einer mittleren Partikelgröße von 50-100 μm, und Wasser hergestellt.
Das derzeit bevorzugte zu verarbeitende Pflanzenmaterial ist Weizen. Bei der Verarbeitung wird Weizen in eine Gluten-, eine Stärke- und eine Faserfraktion getrennt. Das so hergestellte Gluten kann z.B. zu Mehl hinzugefügt werden, um dessen Backeigenschaften zu verbessern, oder kann zur Verbesserung des Nährwertes von Produkten wie Fleisch, Frühstücksgetreide und Haustierfutter verwendet werden. Die Stärke kann z.B. zur Sirupproduktion, in der Papierindustrie, z.B. zur Papierbeschichtung, und in der Textilindustrie verwendet werden. Die Faserfraktion kann z.B. f[r Tierfutter verwendet werden.
Im Folgenden wird das Verfahren zur Trennung von Pflanzenmaterial im Hinblick auf die Weizentrennung beschrieben. Es ist jedoch zu verstehen, dass die Trennung beliebiger anderer Arten von Pflanzenmaterial wie oben genannt durch eine ähnliche An von Verfahren durchgeführt werden kann und der Fachmann wissen wird, welche An von Verfahren er zur Trennung eines gegebenen Pflanzenmaterials auszuwählen hat, siehe z.B. das Buch mit dem Titel "Starch production technology", Ed. von J.A. Radley. In 2 ist ein Flussdiagramm gezeigt, welches ein Weizentrennverfahren veranschaulicht.
Das Verfahren kann durch irgendein im Stand der Technik bekanntes industrielles Weizentrennverfahren ausgeführt werden. Jedoch wird vorliegend die Verwendung eines so genannten Rührverfahrens (oder Nassvermahlungsverfahrens) bevorzugt, in welchem das Ausgangsmaterial eine verdünnte, pumpbare Dispersion des zu trennenden Weizens ist. Gewöhnlicherweise wird die Dispersion aus Weizenmehl und Wasser hergestellt. Der Trockensubstanzgehalt der Dispersion ist gewöhnlicherweise im Bereich von 35-50%. Zwei Haupttypen von Rührverfahren sind bekannt: das Hydrozyklon-Verfahren und das Dekantierverfahren. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als dass der Wasserverbrauch relativ niedrig ist.
Im Hydrozyklon-Verfahren wird das Mehl zunächst mit Wasser gemischt, um einen Teig herzustellen, der dann weiter verdünnt wird und in einen gerührten Agglomerationsbehälter weitergeleitet wird, in dem Gluten agglomeriert. Die Dispersion mit den kleinen Glutenagglomeraten und der Stärke wird in eine Reihe von Hydrozyklonen gepumpt, wo eine zentrifugale Trennung stattfindet. Das Gluten und die "B"-Stärke, welche die leichteste Fraktion sind, verlassen das obere Ende des Hydrozyklons gemeinsam und das Gluten wird von der "B"-Stärke durch Siebe (screens) getrennt. Der Unterlauf aus den Hydrozyklonen besteht hauptsächlich aus "A"-Stärke, während Pentosan (oder Fasern) in beiden Fraktionen gefunden werden. Die Fraktionen werden weiter durch eine Reihe von Wasch-/Konzentrationsschritten gereinigt.
Das Dekantierverfahren unterscheidet sich von dem Hydrozyklon-Verfahren in mindestens einem Hauptpunkt, nämlich wenn das Gluten agglomeriert wird. Im Dekantierverfahren ist es sehr wichtig, dass die Konzentration des Rührteigs nied rig gehalten wird, um zu vermeiden, dass das Gluten vor der Trennung in einem Zwei-Phasen- oder Drei-Phasen-Dekantierer größere Klumpen bildet. Vor der Trennung wird die gemischte Mehl/Wasser-Dispersion durch einen Homogenisator gepumpt – eine spezielle Stiftmühle mit hohen Scherkräften, wodurch die Agglomerierung von Gluten gestartet wird, und kurz vor der Trennung findet eine weitere Verdünnung der Dispersion statt. Im Falle eines Zwei-Phasen-Dekantierers enthält der Unterlauf ziemlich saubere "A"-Stärke und der Überlauf enthält Gluten, "B"-Stärke und Pentosane. Für Drei-Phasen-Dekantierer enthalten die zwei Phasen außer der "A"-Stärke Gluten mit etwas "B"-Stärke und eine Phase mit "B"-Stärke und Pentosanen.
Wenn eine Xylanasezubereitung der Erfindung f[r die Weizentrennung verwendet wird, ist es möglich, eine verbesserte Kapazität des Mischens und Homogenisierens von Teig, eine verbesserte Trennkapazität, eine reduzierte Viskosität der Pentosanfraktion (welche den Energieverbrauch beim Verdampfen und Trocknen reduziert) und einen reduzierten Stromverbrauch der Dekantierer zu erhalten. Außerdem können Endprodukte von größerer Reinheit erhalten werden und aufgrund des durch die reduzierte Viskosität ermöglichten erhöhten Flusses kann die Verfahrenszeit reduziert werden.
Das Trennverfahren für Pflanzenmaterial wird gewöhnlicherweise bei einem pH im Bereich von 3-8, wie 4-7 und insbesondere im Bereich von 5,5-6,5 durchgeführt. Typischerweise liegt die Temperatur im Bereich von 15-50°C, wie 35-45°C. Im Trennverfahren für Weizen wird die Trennung gemäß der Erfindung gewöhnlicherweise in 1-5 Minuten bei einer Temperatur von 40°C erreicht.
Für einige Zwecke kann es von Vorteil sein, ein weiteres Enzym zusammen mit der Xylanasezubereitung der Erfindung zu verwenden. Es wurde zum Beispiel gefunden, dass die kombinierte Verwendung von Xylanasezubereitung der Erfindung und einer Cellulase einen synergistischen Effekt hat. Geeignete Arten von Cellulasen sind oben im Abschnitt mit dem Titel "Die Xylanasezubereitung" ge nannt. Die Cellulase kann in einer Menge entsprechend 0-30.000 EGU pro kg Mehl, vorzugsweise in einer Menge entsprechend 200-5.000 EGU/kg Mehl verwendet werden.
Viskositätsreduktion
Wie oben erwähnt, kann die Xylanasezubereitung der Erfindung zum Reduzieren der Viskosität eines Pflanzenmaterials verwendet werden. Die Viskositätsreduktion kann z.B. in einem kontinuierlichen Weizentrennverfahren wie hier beschrieben wichtig sein, dadurch dass ein erhöhter Fluss von Weizenmehl erreicht wird. Außerdem ist die Viskositätsreduktion in der Herstellung von Lebensmitteln oder Futtermitteln und im Brauwesen wichtig, siehe Visser et al., Xylans and Xylanases, (1991).
Brauen
Die Xylanasezubereitungen der Erfindung werden als besonders nützlich zum Reduzieren der Viskosität der Stammwürze im Brauverfahren angesehen. Die Zubereitung der Erfindung kann im Zusammenhang mit aus Gerste und Sorghum gewonnener Stammwürze verwendet werden und kann in gleicher Weise verwendet werden wie die herkömmlich zum Brauen verwendeten Pentosanasen, siehe z.B. Vietor et al., (1993) und EP 227 159 .
Futter
Das zuzubereitende Futter basiert gewöhnlicherweise auf den oben identifizierten Pflanzenmaterialien, wie Getreide und insbesondere Weizen und/oder Gerste. Die Xylanasezubereitung der Erfindung übt ihre Wirkung durch Abbau von in dem Pflanzenmaterial enthaltenem Arabinoxylan aus, wobei eine verbesserte allgemeine Verwertung der Energie-enthaltenden und anderer Nährstofikomponenten des Tierfutters erhalten wird. Außerdem kann, insbesondere was Brathähnchen (broi lers) anbelangt, die Viskosität des Speisebreis reduziert werden. Eine reduzierte Viskosität wird für die Verdaubarkeit des Futters als wichtig angesehen, möglicherweise aufgrund eines besseren Zugangs der endogenen Enzyme zu Substraten oder eines erhöhten Diffusionsvermögens der Verdauungsprodukte, welches eine erhöhte Absorption zur Folge hat. Zusätzlich könnte der Abbau zur Stabilisierung der mikrobiellen Darmflora beitragen, indem die Nährstoffe leichter verfügbar gemacht werden. Das herzustellende Futter kann z.B. Futter für Brathähnchen (broilers), Legehennen und Ferkel sein. Die Xylanasezubereitung der Erfindung kann dem Futter in beliebiger geeigneter Dosis wie 5-2.000 FXU/kg des Futters, bevorzugt 20-1.000 FXU/kg Futter, beigemengt werden.
Zubereitung von beta-Glucan und anderen Getreidebestandteilen
Die Xylanasezubereitung der Erfindung wird durch Abbau von Arabinoxylan, vorhanden z.B. in Nicht-Stärke-Polysaccharid-Abfallprodukten als besonders verwendbar für die Zubereitung von Beta-Glucan angesehen. Das Beta-Glucan kann als Gummi oder als Füllstoff (bulking agent) verwendet werden (in abgebauter Form).
Des Weiteren ist aus der obigen Offenbarung offensichtlich, dass die Xylanasezubereitung bei der Zubereitung von Stärke, insbesondere Weizenstärke und Gluten, verwendet werden kann.
MATERIALIEN UND METHODEN
Herstellung von löslichem Pentosan (WSP) aus Weizenmehl
100 kg gewöhnliches Weizenmehl wurden in 300 kg kaltem Wasser suspendiert. Nach 1 Stunde Rühren wurde der Schlamm unter Verwendung eines Dekantierers entfernt. Der resultierende Überstand wurde dann enzymatischen Behandlungen zur Entfernung von Stärke und Protein unterworfen. Nach Einstellen des pH auf 6,5 und der Temperatur auf 90°C wurden zunächst 2% (der Trockenmasse, d.m.) Termamyl^® 120L unter 90 min Rühren hinzugefügt, gefolgt von einer ähnlichen Behandlung mit 3% (der Trockenmasse) AMG^® 300L bei pH 4,6 und 60°C für 120 min, um die Stärkefraktion zu hydrolysieren. Schließlich wurde der Überstand mit 1% (der Trockenmasse) Alkalase^® 2,4L bei pH 8,0 und 55°C für 120 min unter konstantem Rühren behandelt. Nach der Hydrolyse von Stärke und Protein wurde das Produkt zur Entfernung von restlichem unlöslichem Material mit einer Filterpresse unter Verwendung von Seitzfilter K250 filtriert und der Überstand wurde unter Verwendung einer Membran mit einem Rückhaltevermögen von 10.000 MG ultrafiltriert, um Produkte der Stärke- und Proteinhydrolyse zu entfernen. Das Retentat wurde weiter diafiltriert, bis 0° BRIX erreicht waren. Das Produkt wurde durch Verdampfen mit einem Luwa-Verdampfer konzentriert und schließlich gefriergetrocknet.
Herstellung von unlöslichem Pentosan (WIP) aus Weizenmehl 150 kg gewöhnliches Weizenmehl wurden in 450 kg kaltem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde auf 60°C erhitzt und 600 g Termamyl^® 120L wurden hinzugegeben. Nach Erhitzen auf 95°C, was zu einer Gelatinisierung der Stärkefraktion führte, wurde die Suspension mit fortgesetzter Hydrolyse über 180 min auf 60°C abgekühlt. Nach Einstellen des pH auf 8,0 unter Verwendung von NaOH wurden 300 g Alcalase^® 2,4L hinzugefügt. Während der Proteinhydrolyse unter konstantem Rühren wurde der pH durch Titrieren mit NaOH zwischen 7,5 und 8,0 gehalten. Die Hydrolyse wurde für 120 min fortgesetzt. Das Präzipitat wurde nach der Zentrifugation zurückgewonnen, einmal mit Wasser gewaschen und dann zur Entfernung allen restlichen löslichen Materials weiter auf einem 35 µm-Sieb mit kaltem Wasser gewaschen. Zu dem resultierenden unlöslichen Material wurden bis zu 20 1 Wasser hinzugefügt, auf 60°C erhitzt, und nach Einstellen des pH auf 8,0 mit NaOH wurden 100 g Alcalase^® 2,4L hinzugefügt. Die Hydrolyse und NaOH-Titration wurde fortgesetzt, bis kein weiterer Abfall des pH beobachtet wurde. Das Material wurde dann wieder auf einem 35 μm-Sieb gewaschen, bis alles lösliche Material entfernt war, und schließlich gefriergetrocknet.
Die Aktivität der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Xylanase wird über die Freisetzung von reduzierenden Zuckern von löslichem Pentosan (verdünnt 25 x nach Inkubation) und unlöslichem Pentosan (verdünnt 5 x nach Inkubation) gemessen.
0,5 % wasserlösliche oder wasserunlösliche Pentosane, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, werden in einem 0,1 M Citrat/Phosphat-Puffer, pH 6,0 gelöst oder suspendiert. Pro Probe werden 0,9 ml des Substrats mit 0,1 ml der Enzymlösung gemischt. Das Substrat wird vor und während des Mischens von Enzym und Substrat auf Eis gehalten. Die Inkubation findet bei 40°C für 15 Min. statt, wonach das Enzym bei 100°C für 5 Min. denaturiert wird. Wenn die Proben abgekühlt sind, werden die löslichen Pentosanlösungen 25-fach verdünnt, während die unlöslichen Lösungen 5-fach verdünnt werden. Dann werden reduzierende Zucker durch eine Reaktion, in Mikrotiterplatten, mit einem PHBAH-Reagens bestimmt, welches 0,15 g para-Hydroxybenzoesäurehydrazid (Sigma H-9882), 0,50 g Kalium-Natrium-Tartrat (Merck 8087) und 2% NaOH-Lösung bis auf 10,0 ml umfasst. Ergebnisse von Leerwerten werden abgezogen. Xylose wird als Standard verwendet. Die reduzierenden Zucker können zur Bestimmung von WSPU und WSPS verwendet werden.
Proteintest – Kjeldahl
Der Test wurde unter Verwendung eines Tecator-Biokonverters (Digestor) und einer Destillationseinheit Typ 1003 durchgeführt.
Abbau (Tecator-Biokonverter (Digestor))
Die zu analysierenden Proben werden in Kjeldahl-Röhrchen überführt, bei flüssigen Proben ungefähr 1,5 g und bei gefriergetrockneten Proben ungefähr 0,1 g. Zu den Proben werden hinzugef[gt:

a) 3,0 ml Schwefelsäure (konz. H₂SO₄)
b) 1,5 ml Wasserstoffperoxid (32 % H₂O₂)
c) 1 Kjeltab (Se + K₂SO₄)

Wenn die Proben nach Hinzufügen der Chemikalien schäumen, werden sie nicht vor dem nächsten Tag abgebaut. Unter gewöhnlichen Bedingungen werden die Proben nach 10 min in den Abbaublock gestellt. Die Blocktemperatur wird auf 370°C eingestellt. Sobald die Proben klar oder schwach gelb sind, werden sie entfernt. Der Abbau erfordert üblicherweise 1/2-1 Stunde, gemäß der Probenzusammensetzung. Die Proben werden für ungefähr 20 min bei Raumtemperatur gekühlt. Dann sind sie bereit zur Destillation.
Destillation (Tecator-Destillationseinheit Typ 1003)
Die Proben werden in 25 m12 % Borsäure enthaltend Kjeldahlindikator (A: 0,12 g Methylenblau in 100 m196% Alkohol und B: 0,125 g Methylenrot in 100 ml 96% Alkohol, A und B gemischt im Verhältnis 1A:2B) destilliert. Die abgebaute Probe wird mit 32,5% NaOH gemischt. Das Ammoniak wird in die 2% Borsäure destilliert, welche dann mit 0,1 N HCl titriert wird, bis der pH 4,85 erreicht.
Bestimmung von Endoglucanaseaktivität (EGU)
Analytische Methoden
Die Fermentationsbrühen werden durch Vibrationsviskosimetrie auf CMC bei pH 6,0 analysiert. Noch spezieller wird eine Substratlösung enthaltend 34,0 g/1 CMC (Blanose Aqualon) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0 hergestellt. Die zu analysierende Enzymprobe wird in dem gleichen Puffer gelöst. 14 ml Substratlösung und 0,5 ml Enzymlösung werden gemischt und in ein Vibrationsviskosimeter (z.B. MIVI 3000 erhältlich von Sofraser, Frankreich) überführt, temperiert bei 40°C. Eine Endoglucanaseeinheit (EGLn wird als das Verhältnis zwischen der Viskosität der Probe und der Viskosität einer Standardenzymlösung bestimmt.
Bestimmung von Xylanaseaktivität (FXU)
Die Endoxylanaseaktivität wird in einem Test bestimmt, in welchem die Xylanaseprobe mit einem Remazol-Xylansubstrat (4-0-Methyl-D-glucurono-D-xylan gefärbt mit Remazol Brilliant Blue R, Fluka), pH 6,0 inkubiert wird. Die Inkubation wird bei 50°C für 30 min durchgeführt. Der Hintergrund an nichtabgebautem, gefärbtem Substrat wird mit Ethanol gefällt. Die verbleibende blaue Farbe im Überstand wird spektrophotometrisch bei 585 nm bestimmt und ist proportional zu der Endoxylanaseaktivität.
Die Endoxylanaseaktivität der Probe wird relativ zu einem Enzymstandard bestimmt, Der Test wird näher beschrieben in der Publikation AF 293.6/1-GB, auf Nachfrage erhältlich von Novo Nordisk A/S, Dänemark.
Bestimmung von Endoglucanaseeinheiten (ECU)
Die EC U (endocellulose unit) wird relativ zu einem Enzymstandard bestimmt.
Endocellulase baut Carboxymethylcellulose, CMC, ab. Die resultierende Viskositätsreduktion wird durch ein CMC-Vibrationsviskosimeter (z.B. MIVI 3000 erhältlich von Sofraser, Frankreich) bestimmt. Die hergestellte Substratlösung enthält 35 g/l CMC (Blanose Aqualon) in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,5. Die zu analysierende Enzymprobe wird im selben Puffer gelöst.
0,15 ml Standardenzymlösung oder die unbekannte Enzymprobe werden in 10 ml Teströhrchen gegeben. 5 ml CMC-Substratlösung, vorerhitzt auf 40°C, werden hinzugefügt. Die gemeinsame Lösung wird gründlich gemischt, für 30 Minuten inkubiert und in den Viskosimeter gestellt.
Die Methode ist näher beschrieben in AF302/1-GB, auf Anfrage erhältlich von Novo Nordisk.
Mehl
Das in den folgenden Beispielen verwendete Mehl hat die folgenden Komponenten:
Zusammensetzung der verwendeten Mehle.
Fakta Mehl: ein kommerzielles Mehl von nicht-spezifiziertem Typ ("Luksus hvedemel", zubereitet von Dagligvaregruppen, DK-7100 Vejle).
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Viskositätsreduktion von Weizenmehl
Verschiedene Xylanasen wurden wie oben definiert auf ihre viskositätsreduzierenden Fähigkeiten bezüglich Fakta Mehl getestet.
Die getesteten Xylanasen waren

– Spezyme^® CP erhältlich von Genencor, USA
– eine H. insolens Xylanase (hergestellt wie in Beispiel 2 von WO 92/17573 beschrieben)
– Xylanase I-Pulver (hergestellt unter Verwendung von Xylanase I (beschrieben in WO 94/21785 und hier gezeigt in SEQ ID NO: 4) als Startmaterial, durch Fest/Flüssig-Trennung, Konzentration und Gefriertrocknen gemäß Standardmethoden)
– Xylanase II (hergestellt wie beschrieben in WO 94/21785)
– eine von dem B. pumilus Stamm DSM 6124 hergestellte Xylanase wie in WO 92/03540 beschrieben (im Folgenden bezeichnet als B. pumilus Xylanase).

Die Viskositätsreduktion wurde mit der folgenden Methode gemessen: 100 g Mehl wird genau eingewogen. Zu 120 ml deionisiertem, bei 35°C gehaltenem Wasser wurden oben genannte Enzyme hinzugefügt. Die Enzymdosen waren wie folgt: Spezyme CP: 8,5 FXU (entsprechend 3,4 mg Protein) Xylanase I-Pulver: 28,3 FXU (entsprechend 0,19 mg Enzymprotein und 0,24 mg Protein) Xylanase II: 7,5 FXU (entsprechend 0,19 mg Enzymprotein und 0,25 mg Protein) H. insolens Xylanase: 82,2 FXU (entsprechend 2,2 mg Enzymprotein und 22,3 mg Protein) B. pumilus Xylanase: 21 FXU (entsprechend 0,2 mg Protein) Eine Leerprobe wird als Kontrolle verwendet (kein hinzugefügtes Enzym). Das Mehl und das Wasser werden für 30 Sek. per Hand gerührt und dann für genau 30 sec mit einem Mixgerät (Waring, kommerzielles Labormixgerät, Struers, Einstellungen AUS 1-7, Rotor im Boden (4 Blätter)) bei 7 (max. Geschwindigkeit) vermischt. Es dauert 30 Sek., um die Flüssigkeit in das Messröhrchen des Viskosimeters zu füllen (programmierbares Rheometer, Modell DV-111, Brookfield, Spindel 25, das Messröhrchen temperiert bei 38°C). Die Viskosität bei 40 rpm wird über 4 Minuten alle 15 Sek. gemessen. Die spezifische Viskosität, ausgedrückt als mittlere Viskosität der Probe / mittlere Viskosität des Leerwerts in Prozent, wird als Maß der Viskositätsreduktion verwendet. Die mittlere Viskosität ist ein Mittelwert des Grades, der nach 60 Sek. und bis zum Ende der Messungen erreicht wird.
Die niedrigste spezifische Viskosität wurde unter Verwendung von Xylanase II gefunden. Bei anderen Xylanasen wurde herausgefunden, dass sie die spezifische Viskosität erniedrigen (Xylanase I, Spezyme^® CP), allerdings in einem geringeren Ausmaß. Für die H. insolens Xylanase wurde gefunden, dass sie die Viskosität bei dieser Dosierung erhöht. Als ein Beispiel führten die oben genannten Dosierungen zu einer spezifischen Viskosität von 69% für Xylanase II, 78 % für Xylanase I, 87% für Spezyme^® CP und 128% für H. insolens Xylanase (entsprechend 0,63 FVRU/mg Protein, 0,044 FVRU/mg Protein, 0,053 FVRU/mg Protein und 0,012 FVRU/mg Protein).
BEISPIEL 2
Weizentrennung
Die Kapazität der in Beispiel 1 genannten Enzyme zur Weizentrennung wurde durch einen Zentrifugationstest evaluiert. Der Test wurde mit dem in Beispiel 1 genannten Mehl durchgeführt.
Das Mehl und Wasser wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemischt. Nach dem Mischen wurden 10 ml des Teigs bei 4332 g für 5 Minuten zentrifugiert (Megafuge 1,0 Heraeus Sepatech). Die Stärke fand sich in der Bodenschicht, gefolgt von Gluten, Schlamm und der Abflussschicht zuoberst. Die Trennung wird als Abfluss-Prozent ausgedrückt. Je höher der Prozentsatz, desto besser die Trennung.
Es wurde bestätigt, dass Xylanase II am Besten abschneidet. Zum Beispiel war der Abfluss des Mehls 14% für einen Leerwert, 21 % für Spezyme^® CP, 22% für Xylanase I und 23% für Xylanase II.
BEISPIEL 3
Viskositätsreduktion durch Xylanase II kombiniert mit einem anderen Enzym Verschiedene Xylanasen wurden auf ihre viskositätsreduzierende Kapazität in Kombination mit Xylanase II getestet. Das oben beschriebene Fakta Mehl wurde verwendet.
Die getesteten Xylanasen waren

– Celluclast^® CCN3035, erhältlich von Novo Nordisk A/S
– Endoglucanase I, eine H. insolens Cellulase, umfassend die in 14 in WO 91/17244 gezeigte Aminosäuresequenz und hergestellt wie in besagter Referenz beschrieben
– 43 kD Endoglucanase, eine H. insolens Cellulase, beschrieben und hergestellt wie in WO 91/17243 beschrieben
– eine H. insolens Xylanase (hergestellt wie in Beispiel 2 von WO 92/17573 beschrieben)
– Xylanase I-Pulver (oben bestimmt)
– B. pumilus Xylanase (oben bestimmt)

Jedes der Enzyme wurde kombiniert mit Xylanase II verwendet und mit Spezyme CP verglichen. Die Viskositätsreduktion wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen.

Die Enzymdosen waren wie folgt:
Celluclast^®: 16 EGU (entsprechend 0,024 ml)
Endoglucanase: 26,5 ECU (entsprechend 0,0053 ml)
43 kD Endoglucanase: 101 ECU (entsprechend 0,017 ml)
H. insolens Xylanase: 82,2 FXU (entsprechend 2,2 mg Enzymprotein und 22,3 mg Protein)
Xylanase I-Pulver: 28,3 FXU (entsprechend 0,19 mg Enzymprotein und 0,24 mg Protein)
B. pumilus Xylanase: 21 FXU (entsprechend 0,024 ml und 0,2 mg Protein)
Xylanase II: 7,5 FXU (entsprechend 0,19 mg Enzymprotein und 0,25 mg Protein)
Spezyme^® CP: 8,5 FXU (entsprechend 0,024 ml und 3,4 mg Protein)

Aus 1 ist ersichtlich, dass kein anderes Enzym die Viskosität im gleichen Ausmaß wie Xylanase II reduziert. Des Weiteren ist eine bemerkenswerte Viskositätsreduktion zu beobachten, wenn Xylanase II speziell mit Endoglucanase I und der 43 kD Cellulase kombiniert wird. Xylanase II kann auch mit vorhandenen Mehrkomponenten-Enzymen kombiniert werden, wie dies mit Celluclast^® beobachtet werden kann.
In 1 zeigen die dunklen Säulen die Enzymleistung allein. Die hellen Säulen zeigen den beobachteten Effekt der Enzyme in Kombination mit Xylanase II:

1 = Xylanase II 2 = Xylanase II

3 = Spezyme^® CP 4 = 43 kD Endoglucanase

5 = H. insolens Xylanase 6 = Endoglucanase I

7 = Xylanase I-Pulver 8 = Celluclast^®

9 = B. pumilus Xylanase
BEISPIEL 4
WSPS- und WSPU-Bestimmungen
Zur Bestimmung von WSPS und WSPU muss der Proteingehalt des zugesetzten Enzyms gemäß Kjeldahl bestimmt werden und die Aktivitäten der Enzyme auf wasserunlösliche (WIP) und wasserlösliche Pentosane (WSP), hergestellt wie vorher beschrieben, gemessen als reduzierende Zucker, müssen bestimmt werden.
Die für eine Anzahl von Zubereitungen bestimmten WSPS- und WSPU-Werte waren wie folgt:
Die WSPU ist die Aktivität auf WSP pro mg Protein pro kg Mehl und das WSPS ist das Verhältnis WSP/WIP pr. mg Protein pr. kg Mehl.
Wie ersichtlich zeigt Xylanase II eine bemerkenswert hohe WSPU und ein bemerkenswert hohes WSPS, was den Abbau von wasserlöslichen Pentosanen bei einer hohen Geschwindigkeit und einen niedrigen Abbau von unlöslichen Pentosanen im Vergleich zum Proteinzusatz widerspiegelt.
BEISPIEL 5
Verwendung von Xylanase in Tierfutter
Brathähnchen (broiler chickens) wurden für 6 Wochen mit einer experimentellen Kost mit und ohne Enzyme gefüttert. Die Kost enthielt in den ersten 3 Wochen des Tests 81% Weizen und in den letzten 3 Wochen 84,5% Weizen. Sie wurden in 3 Behandlungen aufgeteilt; für die ersten drei Wochen enthielt jede Behandlung 12 Wiederholungen mit jeweils 8 Brathähnchen (broilers), die letzten 3 Wochen 6 Wiederholungen mit jeweils 5 Hähnchen (chickens). Die Behandlungen enthielten eine Kontrolle ohne Enzyme und die folgenden enzymatischen Behandlungen: 400 FXU/kg Futter Bio-Feed Plus (BF+) (erhältlich von Novo Nordisk A/S) und 400 FXU/kg Futter Xylanase II. Beide Enzyme wurden gemäß der in WO 92/12645 beschriebenen Methode als CT-Granulat formuliert. Gewichtsanstieg und Futterverbrauch wurden bestimmt und das Futter-Umsetzungsverhältnis (feed conversion ratio, FCR) wurde von 0 bis 3 und von 3 bis 6 Wochen berechnet. Außerdem wurde die jejunale und ileale Viskosität eines Überstandes des Darminhalts bestimmt, wobei ein Brookfield LVTDV-II-Viskosimeter verwendet wurde.
Die Ergebnisse sind aus den folgenden Tabellen ersichtlich.
Tabelle 4. Ileale Viskosität bei 3 und 6 Wochen.
Wie aus Tabelle 1 und 2 ersichtlich, ist das FCR in den Gruppen, die Enzyme erhalten, niedriger, sowohl nach 3 als auch nach 6 Wochen. In beiden Fällen ist Xylanase II besser als BF+. Dies beruht hauptsächlich auf einem besseren Wachstum der Tiere in diesen Gruppen.
Bezüglich jejunaler Viskosität verleiht Xylanase II eine niedrigere Viskosität verglichen mit sowohl BF+ als auch Kontrolle. Dies ist auch für die ileale Viskosität der Fall. Sowohl die Kontrolle als auch Xylanase 1 verleihen eine niedrigere Viskosität nach 6 Wochen als nach 3 Wochen, während dies Für BF+ nicht der Fall ist. Es scheint daher, dass Xylanase II während der letzten 3 Wochen besser arbeitet als BF+, was auch durch das vergleichsweise niedrigere FCR von Xylanase II im Vergleich zu BF+ bei 6 Wochen angezeigt wird.
Dieses Experiment zeigt somit, dass Xylanase II auf der gleichen FXU-Basis eine bessere Futterumsetzung ergibt als BF+, d.h. dass mit Xylanase II mehr Nährstoffe zugänglich gemacht werden. Dies kann zum Teil auf einer niedrigeren ilealen Viskosität in der Xylanase II Gruppe beruhen.
BEISPIEL 6
Metabolisierbare Energie von Xylanase II in Tierfutter
Die Wirkung von Xylanase II (100 FXU/kg und 200 FXU/kg) auf die AME (Apparent Metabolizable Energy, scheinbare metabolisierbare Energie) von Weizen wurde nach der europäischen Referenzmethode (Bourdillon et al., (1990)) bestimmt und mit dem kommerziellen Produkt Bio-Feed Plus (400 FXU/kg) (BF+) von Novo Nordisk A/S verglichen. Der AMEn-Wert drückt die metabolisierbare Energie im Futter, korrigiert um die N-Retention, aus.
Einen Tag alte männliche Ross Brathähnchen, geliefert von einer kommerziellen Brutstätte, wurden verwendet.
Von Tag 1 bis Tag 16 wurden die Hähnchen mit einer kommerziellen Starterkost gefüttert. Am Tag 16 wurden die Hähnchen einzeln gewogen. Hähnchen mit zu hohem oder zu niedrigem Körpergewicht wurden verworfen und der Rest wurde Batteriekäfigen zugeordnet. Von Tag 16 bis Tag 23 wurden sie an die Käfige gewöhnt. Der Bilanzierungstest wurde vom Tag 24 bis Tag 28 gemäß Bourdillon et al., (1990), supra, in vivo ausgeführt. Der Test enthielt 9 Behandlungen mit 5 Wiederholungen von 4 Brathähnchen pro Wiederholung.
Die Grundkost enthielt 56% Sorghum, 32,5% Sojabohnenmehl, 6% tierisches Fett, 1% Sojabohnenöl und 5% Mineralien, Vitamine, Spurenelemente und Aminosäuren. In der experimentellen Kost wurde die Hälfte der Grundkost durch Weizen ersetzt. Den Hähnchen wurde die Kost bis zu einem Anteil von 90% der ad-libitum-Aufnahme als Brei verfüttert.
Bestimmung von AMEn
Die Hähnchenexkremente wurden täglich quantitativ gesammelt. Proben von Futter und gefriergetrockneten Exkrementen wurden auf Fett, Bruttoenergie (gross energy, GE) und Stickstoff analysiert.
Der AME-Gehalt der Kost wurde aus dem jeweiligen Exkrementen/Futter-Verhältnis wie auch aus dem entsprechenden Bruttoenergie-(GE)-Gehalt berechnet. Die Korrektur um die N-Retention gegen Null (AMEn) wurde unter Verwendung eines Energieäquivalents von 34,36 kJ/g zurückbehaltenem N durchgeführt.
Fettverdaubarkeit wurde durch Fettextraktion von Diäten und gefriergetrockneten , Exkrementen bestimmt.
Die bestimmte AMEn ist in 3 dargestellt.
Aus 3 ist ersichtlich, dass die Ergänzung der Grundkost mit Xylanase II zu einer signifikanten Verbesserung der metabolisierbaren Energie im Vergleich zu Bio-Feed (BF+) führte.
REFERENZEN

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Shei, J.C., et al., Biotech. and Bioeng. Vol. XXVII, pp. 533-538, 1985.
Fournier, R. et al., Biotech. and Bioeng. Vol. XXVII, pp. 539-546, 1985.
Bourdillon et al. (1990), Br. Poultry Sci., 31, 557-565)

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zubereitung umfassend a) eine Xylanase, aufweisend i) ein Verhältnis zwischen wasserlöslicher Pentosaneinheit (WSPU) und wasserunlöslichen Pentosaneinheiten (WIPU) pro mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert sind, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches zugesetztes Protein, welches höher als 0,06 ist und/oder ii) eine wasserlösliche Pentosaneinheit (WSPU) pro mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert ist, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches zugesetztes Protein, welches höher als 15 ist, und/oder iii) eine spezifische Aktivität von mehr als 0,053 FVRU pro mg Protein, die mit dem Enzym assoziiert ist, wenn es aus der Fermentationsbrühe zurückgewonnen wird, und kein inertes oder nicht-xylanolytisches Protein und b) Endo-Glucanase I gezeigt in SEQ ID NO: 5, erhältlich aus Humicola insolens oder einer 43 kD Humicola insolens Endo-Glucanase, gezeigt in SEQ ID NO: 7.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 1, in welcher die Xylanase von mikrobieller Herkunft ist.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 2, in welcher die Xylanase von einem filamentösen Pilz oder einer Hefe ableitbar ist.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 3, in welcher die Xylanase von einem Stamm von Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium oder Humicola ableitbar ist.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 4, in welcher die Xylanase von einem Stamm von Aspergillus, insbesondere einem Stamm von Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae ableitbar ist.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 5, in welcher die Xylanase Xylanase II ist, welche i) durch die in SEQ ID NO: 2 gezeigte DNA-Sequenz kodiert wird, ii) die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Die Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1-6, worin die Xylanase aus isolierten Einkomponenten Enzymen zubereitet wird.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 5, in welcher die Xylanase Xylanase I ist, welche i) durch die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz kodiert wird, ii) die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 8, worin die Xylanase Xylanase I-Pulver ist.
Verwendung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Reduzieren der Viskosität eines Pflanzenmaterials.
Verwendung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Trennung von Getreidekomponenten.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, in welcher das Getreide Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis und Sorghum enthält.
Die Verwendung gemäß Anspruch 12, in welcher das Getreide Weizen ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11-13, in welcher das Getreide in eine stärkehaltige und eine proteinhaltige Komponente getrennt wird.
Verwendung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Zubereitung von beta-Glucan.
Verwendung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Brauen.
Verwendung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Zubereitung von Tierfutter.
Die Verwendung gemäß Anspruch 17 zum Reduzieren der Viskosität von Tierfutter.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 17 oder 18 zur Verbesserung der Verdaubarkeit von Tierfutter.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 17-19 zur Verbesserung der verstoffwechselbaren Energie von Tierfutter.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17-20, worin das Tierfutter Hühnerfutter ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17-20, worin das Tierfutter Schweinefutter ist.