ES2229237T3 - Tratamiento de material vegetal con xilanasa. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO PARA REDUCIR LA VISCOSIDAD DEL MATERIAL DE UNA PLANTA, PROCESO QUE COMPRENDE EL TRATAMIENTO DEL MATERIAL DE LA PLANTA CON UNA XILANASA QUE TENGA I) UNA PROTEINA AÑADIDA WSPS POR MG, MAYOR DE 0,06 Y/O II) UNA PROTEINA AÑADIDA WSPU POR MG, MAYOR DE 15 Y/O III) UNA ACTIVIDAD CONCRETA DE MAS DE 0,053 DE PROTEINA FVRU/MG. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE UNA PREPARACION DE XILANASA PARA SEPARAR EL MATERIAL DE UNA PLANTA, COMO EL TRIGO, EN COMPONENTES SEPARADOS UTILES, ASI COMO PROCESOS PARA ESTA SEPARACION O REDUCCION DE LA VISCOSIDAD.
Description
Tratamiento de material vegetal con xilanasa.
La presente invención se refiere a una
preparación de xilanasa para reducir la viscosidad de un material
vegetal y para separar un material vegetal, como el trigo, en
componentes útiles separados así como al uso de dicha
preparación.
El trigo contiene algunos componentes importantes
de gluten y almidón que pueden ser recuperados en procesos de
molienda húmeda. El gluten vital es el producto primario, mientras
que el almidón-A de alta calidad y el
almidón-B de baja calidad son subproductos
importantes. La fibra residual y los sólidos solubles son
subproductos adicionales.
La preparación de la enzima de celulasa de
Trichoderma reesei comercialmente disponible, Spezyme® CP
(Genencor, EEUU) ha sido sugerida para reducir la viscosidad y
mejorar el tratamiento del trigo y del almidón de maíz.
Weegels et al., (1992), describen el uso
de enzimas (celulasa, hemicelulasa, lipasa y proteasa/amilasa) en
un proceso de separación del trigo. Se ha concluido que las
celulasas y hemicelulasas mejoran las propiedades del tratamiento
del trigo y aumentan el rendimiento del gluten y el almidón. La
hemicelulasa usada fue una preparación de xilanasa que contenía
varios tipos de actividad significantes incluyendo la actividad
amilasa y proteasa.
Se sabe que las xilanasas son capaces de degradar
la harina de trigo y otros materiales derivados de vegetales en
varios productos de degradación. Las xilanasas purificadas a partir
de una cepa de Aspergillus awamori de especies fúngicas han
sido descritas en algunas referencias, ver, p. ej. Kormelink et
al., (1993) que describe las características fisicoquímicas y
cinéticas de tres endoxilanasas de A. awamori. Los productos
de degradación obtenidos usando estas xilanasas de A.
awamori en la degradación enzimática de varios materiales
vegetales incluyendo salvado de arroz, cáscaras de avena, harina de
trigo, madera de alerce y madera de abedul están descritos, entre
otros, por Kormelink
et al., (1991), Kormelink et al., (1992), J.M. Kormelink y A.G.J. Voragen (1993), Gruppen et al., (1992), y Gruppen et al., Symposium October 1993.
et al., (1991), Kormelink et al., (1992), J.M. Kormelink y A.G.J. Voragen (1993), Gruppen et al., (1992), y Gruppen et al., Symposium October 1993.
Voragen et al., (1992), y Gruppen et
al., (1993a y 1993b) revelan la degradación de fracciones de
arabinoxilano extraíble por agua y no extraible por agua aisladas
de la harina de trigo con endoxilanasas de A. awamori. Esta
referencia describe el uso de dos de las xilanasas de A.
awamori en la cocción de rebanadas de trigo.
Shei et al., (1985), y Fournier et
al., (1985), describen la purificación y caracterización de las
endoxilanasas aisladas de A. Níger.
Ninguna de las referencias anteriores mencionan
que las xilanasas puedan ser usadas para la separación del trigo ni
para seleccionar xilanasas de uso particular para dicho
objetivo.
Düsterhöft et al., Symposium Oct. 1993,
describen el uso de la endoxilanasa para la degradación de
polisacáridos sin almidón en piensos y Vidtor et al.,
(1993), el uso de la endoxilanasa para la reducción de la viscosidad
del mosto durante el proceso de fabricación de cerveza.
WO 91/19782 expone la producción de una xilanasa
de Aspergillus Niger var awamori usada, por ejemplo, en un
proceso de tratamiento de alimentos como la preparación de
productos de panadería.
WO 92/01793 expone una composición que comprende
una endoxilanasa derivada de Aspergillus tubigensis para
cocer el pan o para añadir al pienso. La xilanasa puede ser usada
para reducir la viscosidad de alimentos que contienen xilanos.
WO 93/25693 expone una xilanasa recombinante de
hongos anaeróbicos, particularmente Neocallimastix
patriciarum para el uso en la industria de la pasta y el
papel.
Es un objeto de la presente invención el hecho de
proporcionar una preparación de xilanasa adecuada para modificar la
viscosidad de un material vegetal y para separar un material
vegetal en los componentes deseables.
La Figura 1 muestra la viscosidad específica de
la xilanasa II combinada con otras enzimas.
La Figura 2 muestra el principio en el proceso de
separación del trigo de molienda húmeda.
La Figura 3 muestra el AMEn de trigo en pollos
Broilers.
BF+ = Bio-Feed® Plus
Xyl II = Xilanasa II
En el primer aspecto la invención se refiere a
una preparación que comprende
a) una xilanasa que tiene
- i)
- una proporción entre una unidad de pentosano soluble en agua (WSPU) y unidades de pentosano insolubles en agua (WIPU) por mg de proteína en relación con la enzima cuando se recupera del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica añadida que sea superior a 0.06, y/o
- ii)
- una unidad de pentosano soluble en agua (WSPU) por mg de proteína en relación con la enzima cuando se recupera del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica añadida que sea superior a 15, y/o
- iii)
- una actividad específica superior a 0.053 FVRU por mg de proteína en relación con la enzima cuando se recupera del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica, y
b) endoglucanasa 1 mostrada en SEC ID No: 5 que
se puede obtener a partir de Humicola insolens o de una
endoglucanasa de 43 kD de Humicola insolens mostrada en SEC
ID No: 7.
Estos inventores han hallado ahora
sorprendentemente que la actividad de xilanasa en pentosanos
solubles en agua e insolubles en agua insolubles, respectivamente,
parece ser importante para la eficacia de la xilanasa en la
reducción de la viscosidad y/o separación de componentes de un
material vegetal. La presente invención se basa en este
resultado.
En el primer aspecto la invención se refiere a
una preparación que comprende
a) una xilanasa que tiene
- i)
- una proporción entre una unidad de pentosano soluble en agua (WSPU) y unidades de pentosano insolubles en agua (WIPU) por mg de proteína en relación con la enzima cuando es recuperada del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica añadida que sea superior a 0.06, y/o
- ii)
- una unidad de pentosano soluble en agua (WSPU) por mg de proteían en relación con la enzima cuando es recuperada del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica añadida que sea superior a 15, y/o
- iii)
- una actividad específica superior a 0.053 FVRU por mg de proteina en relación con la enzima cuando es recuperada del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no-xilanolítica, y
b) endoglucanasa 1 que se puede obtener a partir
de Humicola insolens o una endoglucanasa de 43 kD de
Humicola insolens.
Además la invención se refiere al uso de esta
preparación para varios objetivos.
En este contexto, WSPU (Unidad de pentosano
soluble en agua) está definida como la actividad de la preparación
de xilanasa por mg de proteína en pentosanos solubles en agua y
WIPU (Unidad de pentosano Insoluble en agua) como la actividad en
pentosanos insolubles en agua por mg de proteína donde las
actividades se miden como azúcares reductores. La producción de
pentosanos solubles e insolubles, respectivamente, está descrita en
la sección Materiales y Métodos más abajo. En el ejemplo 4 se
describe un ensayo para determinar WSPU y WIPU. WSPS es la
proporción entre WSPU y WIPU por mg de proteína añadida donde la
proteína está determinada según Kjeldahl, ver la sección Materiales
y Métodos en la presente.
En este contexto, el término "proteína
añadida" se refiere a la cantidad de actividad xilanolítica que
comprende la proteína, recuperada de un caldo de fermentación donde
se ha producido la enzima, y que posteriormente se usa para este
objetivo. Así, cuando se calculan los valores de WSPS, WSPU y FVRU
tal y como se define ahí de una enzima dada, el término "mg de
proteina" se refiere al mg de proteína 'asociado a la enzima
cuando se recupera del caldo de fermentación y sin proteína inerte
o no xilanolítica añadida.
Se entenderá que las preparaciones de xilanasa
para su uso para este objetivo contienen una actividad xilanolítica
sustancial por mg de proteína en comparación con las xilanasas y
celulasas de la técnica precedente. Esto significa que usando una
dosificación sorprendentemente baja (en mg de proteína) de la
preparación de xilanasa de la invención, se obtiene una reducción de
la viscosidad sustancial (expresada como viscosidad específica) y
una capacidad de separación del trigo, respectivamente. La enzima
que se usará en la presente invención es preferiblemente
sustancialmente una enzima monocomponente que normalmente puede ser
producida con gran eficacia usando técnicas de ADN recombinante en
una forma altamente pura (es decir que comprenden cantidades
relativamente bajas de tipos de actividades indeseadas (en
comparación con la actividad xilanolítica).
FVRU se define como la viscosidad específica de
la enzima relativa a la viscosidad específica de una preparación
enzimática estándar de una xilanasa producida por Bacillus
pumilus DSM 6124 como se describe en WO 92/03540 por mg de
proteína añadida. Dicha enzima se denomina xilanasa de B.
pumilus en la siguiente descripción. La viscosidad específica
de la preparación de B. pumilus se mide por mg de proteína
de xilanasa de B. pumilus añadida. La viscosidad específica
puede ser determinada como se describe en el ejemplo 1.
La clase de xilanasas antes definida está
considerada de uso particular para la separación del trigo. Así,
estos inventores han observado que las xilanasas que tienen un buen
funcionamiento para la separación del trigo degradan los pentosanos
del trigo solubles en agua muy rápido y los pentosanos del trigo
insolubles en agua en un nivel muy bajo. Sin estar limitado a
cualquier teoría se cree actualmente que el buen funcionamiento en
cuanto a la separación del trigo viene provocado por una
degradación de los pentosanos viscosos solubles en agua. La baja
degradación de pentosanos insolubles es también importante en la
reducción de la viscosidad obtenida por las xilanasas tal y como se
define en la presente puesto que los pentosanos insolubles
solubilizados pueden aumentar la
viscosidad.
viscosidad.
Según otro aspecto la invención se refiere al uso
de una preparación de la invención para reducir la viscosidad de la
materia vegetal y para la separación de componentes de
cereales.
Como se entenderá a partir de la descripción
anterior la actividad (según se define para WSPS o WSPU) de la
preparación de la xilanasa a usar para este objetivo está
considerada fundamental. Se prefiere que la preparación de la
xilanasa a usar para este objetivo tenga un WSPS por mg de proteína
añadida superior a 0.06. Preferiblemente el WSPS añadido se
encuentra en la gama de 0.06 hasta como mucho 10.0 por mg de
proteína, más preferiblemente de al menos 0.7 hasta como mucho 8.0
por mg de proteína, además más preferiblemente entre 0.9 y 6.0 por
mg de proteína, especialmente de al menos 1.5 a 4.0 por mg de
proteína, y/o un WSPU por mg de proteína añadida superior a 15,
como 25 o más. Preferiblemente el WSPU por mg de proteína añadida
es al menos 100 hasta como mucho 150.000, más preferiblemente al
menos 130 hasta como mucho 120.000, como al menos 160 hasta como
mucho 100.000, más preferiblemente de al menos 300 hasta como mucho
90.000, y además más preferiblemente de al menos 20.000 hasta como
mucho 85.000, y/o una actividad específica de al menos 0.053 FVRU/mg
de proteína. Preferiblemente la actividad específica está en la
gama 0.053 a 3.0 FVRU/mg de proteína, así como entre 0.4, 0.5 o 0.6
y 3.0 FVRU/mg de proteína, más preferiblemente entre 0.1 y 2.0
FVRU/mg de proteína, aún más preferiblemente entre 0.4 y 1.0
FVRU/mg de proteína.
Mientras que la preparación de xilanasa a usar
para este objetivo puede ser de cualquier origen incluidos
mamíferos, plantas u origen animal actualmente se prefiere que la
xilanasa sea de origen microbiano. En particular la preparación de
xilanasa puede ser una que derive de un hongo filamentoso o una
levadura.
Las xilanasas han sido encontradas en un número
de especies fúngicas, en particular especies de Aspergillus,
como A. niger, A. awamori, A. aculeatus y A. oryzae,
Trichoderma, como T. reesei o T.harzianum,
Penicillium, como P. camenbertii, Fusarium, como F.
oxysporum, y Humicola, como H. lanuginosa, y
H.insolens. Las xilanasas también se han encontrado en
especies bacterianas, p. ej. dentro del género Bacillus,
como B. pumilus.
Una preparación de xilanasa a usar para este
objetivo puede ser proporcionada por un método que comprende
a) aislamiento de una preparación de xilanasa de
cualquier organismo productor de xilanasa por métodos conocidos en
la técnica, y posteriormente
b) evaluación de la actividad WSPS, WSPU y/o FVRU
de la xilanasa como se describe aquí con el objetivo de evaluar si
es adecuada para este objetivo.
El organismo productor de xilanasa al que se hace
referencia en a) puede ser un organismo que sea un productor
natural de xilanasa o un organismo que haya sido transformado con
ADN que codifica la xilanasa en cuestión.
Se ha descubierto que las especies fúngicas de
A. aculeatus, en particular la cepa CBS 101.43, produce una
xilanasa de uso particular para este objetivo. Dicha xilanasa se
denomina Xilanasa II (o Xyl II) en esta descripción y está
posteriormente descrita en WO 94/21785 incluida en esta
solicitud.
En el ejemplo 4 los valores WSPS y WSPU,
respectivamente, de varias xilanasas de la técnica precedente son
catalogados junto con los de la xilanasa II. Además, se muestra el
efecto en la separación del trigo (expresado como FVRU) de estas
enzimas. Es evidente que ninguna de estas xilanasas de la técnica
precedente muestran un efecto de separación del trigo comparable al
de la xilanasa II descrita aquí.
La Xilanasa II que codifica la secuencia de ADN
está mostrada en SEC ID No. 2 de WO 94/21785 y en SEC ID No: 1 de
la presente y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID
No. 5 y en SEC ID No: 2 de la presente. Se ha observado que las
xilanasas que muestran homología con la xilanasa II pueden tener un
modelo de actividad similar a la xilanasa II y así ser útil para
este objetivo. En consecuencia, en una forma de realización
particularmente preferida la xilanasa a usar en la presente
invención es una, que
- i)
- esté codificada por la secuencia de ADN mostrada en SEC ID No: 1 en la presente o un análogo de ésta que codifique un homólogo de Xilanasa II,
- ii)
- comprenda la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID No: 2 de la presente o una secuencia homóloga de ésta, y/o
- iii)
- sea inmunológicamente reactiva con un anticuerpo preparado contra una xilanasa purificada derivada de Aspergillus aculeatus, CBS 101.43.
En este contexto, el término "homólogo"
pretende indicar un polipéptido que muestra actividad xilanasa (en
términos de WSPS, WSPU y/o FVRU tal y como se define aquí)
codificada por una secuencia de ADN que se hibrida con una sonda de
oligonucleótidos preparada en base a la enzima Xilanasa II que
codifica la secuencia de ADN bajo condiciones específicas
determinadas (como preenjuague en 5xSSC y prehibridación durante 1 h
a \sim40°C en una solución de 5xSSC, 5xsolución Denhardt, 50 mM
fosfato sódico, pH 6.8, y 50 pg de ADN de timo de ternero
ultrasónico desnaturalizado, seguido de hibridación en la misma
solución completada con una sonda marcada de 50 \muCi
32-P-dCTP durante 18 h a \sim40°C
seguido de tres lavados en 2xSSC, 0.2% SDS a 40°C durante 30
minutos). Más específicamente, el término pretende hacer alusión a
una secuencia de ADN que tiene al menos el 70% de homología con la
secuencia de ADN mostrada en SEC ID No: 1 o una parte sustancial de
esta, como al menos el 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos
90% o incluso al menos 95% de homología con la secuencia de ADN
mostrada en SEC ID No: 1 o una parte sustancial de ésta que
codifica un polipéptido con actividad xilanasa. El término pretende
incluir modificaciones de la secuencia de ADN mostrada en SEC ID
No: 1, como sustituciones de nucleótidos que no originan otra
secuencia de aminoácidos de la xilanasa, pero que corresponden al
uso del codón del organismo huésped en el que se introduce el
constructo de ADN o sustituciones de nucleótidos que originan una
secuencia de aminoácidos diferente y en consecuencia, posiblemente,
una estructura de la proteína diferente que puede originar una
xilanasa mutante con propiedades diferentes a las de la enzima
nativa. Otros ejemplos de modificaciones posibles son la inserción
de uno o más codones en la secuencia, adición de uno o más codones
a cada extremo de la secuencia, o supresión de uno o más codones a
cada extremo o dentro de la secuencia. Se entenderá que el homólogo
de xilanasa II definido aquí puede comprender varios residuos de
aminoácidos diferentes puesto que la actividad xilanasa es tal y
como se define aquí.
La producción de Xilanasa II y posterior
caracterización de ésta resulta a partir de la descripción
presentada en WO 94/21785 incluida en la presente solicitud.
La preparación de xilanasa para ser usada aquí
puede obtenerse a partir del microorganismo en cuestión usando
cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, una preparación de
xilanasa puede ser obtenida por fermentación de un microorganismo y
posterior aislamiento de la enzima por un método conocido en la
técnica, pero más preferiblemente usando técnicas de ADN
recombinante conocidas en la técnica. Este método normalmente
comprende el cultivo de una célula huésped transformada con un
vector de ADN recombinante capaz de expresar y llevar una secuencia
de ADN que codifica la xilanasa en cuestión, en un medio de cultivo
bajo condiciones que permitan la expresión de la enzima y la
recuperación de la enzima del cultivo.
Dentro del campo de la invención se hallan
aquellas preparaciones enzimáticas preparadas a partir de enzimas
monocomponentes derivadas de manera microbiana (es decir
sustancialmente sin actividad lateral) donde la xilanasa tiene las
características a)-c) de la xilanasa arriba
definidas. La xilanasa de la invención puede ser identificada
determinando los valores WSPS, WSPU y FVRU, después de aislar las
enzimas del componente.
La secuencia de ADN que codifica la xilanasa a
usar puede ser de cualquier origen, p. ej. una secuencia de ADNc,
una secuencia genómica, una secuencia sintética o cualquier
combinación de éstas. La preparación de una xilanasa adecuada para
este objetivo está descrita con detalle en WO 94/21785.
Cuando la xilanasa va a ser usada en un proceso
para la separación del trigo (u otros procesos en los que el
almidón deba ser producido) se prefiere que la preparación de
xilanasa esté sustancialmente libre de amilasa, en la que cualquier
actividad amilasa presente puede degradar el almidón a producir.
Correspondientemente, cuando la xilanasa va a ser usada para la
producción de proteínas, p. ej. en un proceso de la invención de
separación del trigo donde se produce gluten, se prefiere que la
preparación de xilanasa esté sustancialmente libre de proteasa, en
la que esta última enzima puede estropear el gluten a producir. Se
puede eliminar la actividad amilasa y proteasa por métodos
conocidos en la técnica. Un ejemplo es
termo-inactivación que tiene una ventaja particular
en relación con la xilanasa II producida en Aspergillus
oryzae, donde la Xilanasa II, en general, es más
termo-estable que las amilasas y proteasas
producidas por dicha célula huésped.
Se ha descubierto que el efecto de la xilanasa
obtenido en el proceso de separación del material vegetal puede ser
considerablemente mejorado cuando la xilanasa se usa junto con una
celulasa.
La preparación de xilanasa de la presente
invención comprende endoglucanasa 1 que se puede obtener a partir
de H. insolens y posteriormente definida por la secuencia de
aminoácidos de la fig. 14 en WO 91/17244 o la endoglucanasa de
H. insolens de 43 kD descrita en WO 91/17243.
Las preparaciones con celulasa comercialmente
disponibles que pueden estar comprendidas en la preparación de
xilanasa de la invención incluyen Celluclast® (disponible por Novo
Nordisk A/S), Spezyme® CP (disponible por Genencor, EEUU) y
Rohament® 7069 W (disponible por Röhm, Alemania).
Mientras que cualquier material vegetal que
comprenda xilano (como madera de coníferas y madera dura) puede ser
tratado según la invención se prefiere que el material vegetal
derive de la familia de Poaceae (Sin: Graminaceae) y sea
particularmente preparado a partir un cereal como el trigo, centeno,
cebada o avena. El material vegetal puede además ser de origen
vegetal o frutal, p. ej. preparado a partir de maíz, arroz, granos
de sorgo, o cáscaras de fruta. El material vegetal puede ser
preparado a partir cualquier combinación de las plantas
anteriormente mencionadas y puede, además comprender materiales no
vegetales.
El material vegetal a tratar puede ser de
cualquier forma adecuada. Como se explicará ulteriormente más
abajo, el material vegetal puede convenientemente estar en forma de
una dispersión bombeable o solución que permita que se realice un
proceso continuo. Esta dispersión se hace normalmente mezclando
material molido seco, especialmente trigo con un tamaño medio de
partícula de 50-100 \mum y agua.
El material vegetal actualmente preferido para
ser procesado es el trigo. Mediante el tratamiento el trigo se
separa en un gluten, un almidón y una fracción de fibra. El gluten
así producido puede, p. ej., ser añadido a la harina con el
objetivo de mejorar sus propiedades de cocción, o se puede usar
para mejorar el valor nutritivo de productos como la carne, cereales
de desayuno y alimentos para animales. El almidón puede, p. ej.,
ser usado para la producción de jarabe, en la industria papelera,
p. ej. para revestir papel, y en la industria textil. La fracción
de fibra puede, p. ej., ser usada para piensos.
A partir de ahora, el proceso para la separación
de un material vegetal se describirá con referencia a la separación
de trigo. No obstante, se entenderá que la separación de cualquiera
de los otros tipos de material vegetal anteriormente mencionados
puede ser realizado mediante un tipo de proceso similar y el experto
de la técnica sabrá qué tipo de proceso seleccionar para la
separación de un material vegetal dado, ver, por ejemplo, el libro
titulado "Starch production technology", Ed. por J.A. Radley.
En la fig. 2 se muestra un diagrama de flujo que ilustra un proceso
de separación del trigo.
El proceso puede ser realizado mediante cualquier
proceso de separación del trigo industrial conocido en la técnica.
No obstante, se prefiere actualmente usar un proceso denominado de
rebozado (o proceso de molienda húmeda), donde el material
iniciador es una dispersión bombeable diluida del trigo que va a ser
separado. Normalmente, la dispersión se hace a partir de harina de
trigo y agua. El contenido de sustancia en seco de la dispersión
está normalmente en la gama de 35-50%. Dos tipos
más importantes de procesos de rebozado son conocidos: el proceso
hidrociclón y el proceso decantador. Estos procesos. son ventajosos
en los que el consumo de agua es relativamente bajo.
En el proceso de hidrociclón la harina es
mezclada primero con agua para hacer una masa, que es luego
adicionalmente diluida y pasada a un tanque de aglomeración agitado
donde se aglomera el gluten. La dispersión con los pequeños
aglomerados de gluten y almidón es bombeada hasta un grupo de
hidrociclones, donde se produce una separación por centrifugación.
El gluten y el almidón "B" siendo la fracción más pequeña deja
la parte superior de los hidrociclones juntos y el gluten es
separado del almidón "B" por pantallas. El flujo inferior de
los hidrociclones consiste principalmente en almidón "A",
mientras que el pentosano (o fibras) se encuentran en ambas
fracciones. Las fracciones son también limpiadas por una serie de
fases de lavado/concentración.
El proceso decantador difiere del proceso de
hidrociclón en al menos un punto más importante es decir cuando el
gluten es aglomerado. En el proceso decantador es muy importante
que la concentración del rebozado sea mantenida baja para evitar
que el gluten forme grumos mayores antes de la separación en un
decantador de dos fases o tres fases. Antes de la separación la
dispersión de harina/agua mezclada es bombeada a través de un
homogenizador - un molino de púas especial con grandes fuerzas de
cizalla que inician la aglomeración del gluten y justo antes de la
separación se produce una dilución adicional de la dispersión. En
el caso de un decantador de dos fases, el flujo inferior contiene
preferiblemente almidón A limpio y el flujo superior contiene
gluten, almidón "B" y pentosanos. Para decantadores de tres
fases las dos fases contienen además del almidón "A" gluten
con algún almidón "B" y una fase con almidón "B" y
pentosanos.
Cuando una preparación de xilanasa de la
invención se usa para la separación del trigo es posible obtener
una capacidad mejorada de la mezcla de masa y homogenización, una
capacidad de separación mejorada, una viscosidad reducida en la
fracción de pentosano (que reduce el consumo de energía al
evaporarse y secarse) y un consumo de amperios reducido en
decantadores. Además, se pueden obtener productos finales de una
pureza más alta y el tiempo de procesamiento puede ser reducido
debido al flujo aumentado permitido por la viscosidad reducida.
El proceso de separación del material vegetal es
normalmente llevado a un pH en la gama de 3-8, así
como 4-7 y en particular en la gama de
5.5-6.5. Normalmente, la temperatura está en la
gama de 15-50 °C así como 35-45°C.
En el proceso de separación del trigo, la separación según la
invención normalmente se consigue en 1-5 minutos a
una temperatura de 40°C.
Para algunos objetivos puede ser ventajoso usar
otra enzima junto con la preparación de xilanasa de la invención.
Por ejemplo, se ha descubierto que el uso combinado de la
preparación de xilanasa de la invención y una celulasa tiene un
efecto sinergístico. Unos tipos adecuados de celulasas están
mencionados anteriormente en la sección titulada "La preparación
de xilanasa". La celulasa puede ser usada en una cantidad
correspondiente a 0-30,000 EGU por kg de harina,
preferiblemente en una cantidad correspondiente a
200-5000 EGU/kg de harina.
Según se ha mencionado anteriormente la
preparación de xilanasa de la invención puede ser usada para
reducir la viscosidad de un material vegetal. La reducción de la
viscosidad puede ser importante, p. ej. en un proceso de separación
del trigo continuo como se describe en este caso, en el que se puede
obtener un flujo aumentado de la harina de trigo. Además, la
reducción de la viscosidad es importante en la preparación de
alimentos o piensos y en fabricación de cerveza, ver Visser et
al., Xylans and Xylanases, (1991).
Las preparaciones de xilanasa de la invención
están consideradas de uso particular para reducir la viscosidad del
mosto en el proceso de fabricación de la cerveza. La preparación de
la invención puede ser usada en relación con el mosto preparado a
partir cebada y sorgo y puede ser usada de la misma manera que las
pentosanasas usadas de forma convencional para la fabricación de la
cerveza, ver p. ej. Vidtor et al., (1993) y EP 227 159.
Los piensos que se van a preparar están
normalmente basados en los materiales vegetales identificados
arriba, como cereales, y en particular trigo y/o cebada. La
preparación de xilanasa de la invención ejerce su efecto para
degradar el arabino-xilano contenido en el material
vegetal donde se obtiene una utilización global mejorada de los
componentes nutritivos del pienso contenedores de energía y otros.
Además, especialmente en lo que se refiere a los pollos broilers, la
viscosidad del quimo puede ser reducida. Una viscosidad reducida
está considerada importante para la digestibilidad del pienso
posiblemente debido a un mejor acceso de las enzimas endógenas a
sustratos o a una difusibilidad aumentada de los productos de
digestión, que resulta en una absorción aumentada. Además, la
degradación puede ayudar a estabilizar la flora microbiana
intestinal haciendo que los nutrientes estén disponibles con más
facilidad. El pienso que se va a preparar puede, p. ej., ser pienso
para pollos broilers, gallinas ponedoras y lechones. La preparación
de xilanasa de la invención puede ser incorporada en el pienso en
cualquier dosificación adecuada como 5-2000 FXU/kg
de pienso, preferiblemente 20-1000 FXU/kg de
pienso.
La preparación de xilanasa de la invención está
considerada de uso particular para la preparación de beta glucano
mediante la degradación del arabinoxilano presente en, p. ej.,
productos de desecho polisacáridos sin almidón. El
beta-glucano puede ser usado como una goma o un
agente de estabilización (en forma degradada).
Además, a partir de la descripción anterior es
evidente que la preparación de xilanasa puede ser usada en la
preparación de almidón, en particular almidón de trigo y
gluten.
100 kg de harina de trigo común fueron
suspendidos en 300 kg de agua fría. Después de la agitación durante
1 hora el residuo fue extraído usando un decantador. El
sobrenadante resultante fue luego sometido a tratamientos
enzimáticos para eliminar el almidón y la proteína. Después de
ajustar el pH a 6.5 y la temperatura a 90°C se añadió primero el 2%
(de d.m..) de Termamyl® 120L con 90 min. de agitación, seguido de
un tratamiento similar con el 3% (de d.m..) AMG® 300L a pH 4.6 y
60°C durante 120 minutos para hidrolizar la fracción de almidón.
Finalmente, el sobrenadante fue tratado con el 1% (de d.m.) de
Alcalase® 2.4L a pH 8.0 y 55°C durante 120 minutos bajo agitación
constante. Después de la hidrólisis del almidón y la proteína el
producto fue filtrado en un filtro-prensa usando
Seitzfilter K250 para eliminar material insoluble residual, y el
sobrenadante ultrafiltrado usando una membrana de corte de 10,000
PM para eliminar los productos de la hidrólisis del almidón y de la
proteína. El concentrado fue también sometido a diafiltración hasta
alcanzar 0° BRIX. El producto fue concentrado por evaporación en un
evaporador Luwa y finalmente liofilizado.
Se suspendieron 150 kg de harina de trigo común
en 450 kg de agua fría. La suspensión fue calentada a 60°C y se
añadieron 600 g de Termamyl® 120L. Después de calentarse a 95°C
produciendo la gelatinización de la fracción de almidón, la
suspensión fue enfriada a 60°C con hidrólisis continua durante 180
min. Después del ajuste del pH a 8.0 usando NaOH se añadieron 300 g
de Alcalase® 2.4L. Durante la hidrólisis de proteína bajo agitación
constante, el pH fue mantenido entre 7.5 y 8.0 con titración con
NaOH. La hidrólisis fue continuada durante 120 min. El precipitado
fue recuperado después del centrifugado, lavado con agua una vez y
luego adicionalmente lavado en un tamiz de 35 \mum con agua fría
para eliminar todo el material soluble residual. Al material
insoluble resultante se añadieron hasta 20 L de agua, calentándose
a 60°C y después de una regularización del pH a 8.0 con NaOH 100 g
de Alcalase® se añadieron 2.4L. La hidrólisis y titración con NaOH
fueron continuadas hasta que no se observó ninguna caída ulterior
en el pH. El material fue luego lavado nuevamente en un tamiz de 35
\mum hasta que todo el material soluble fuera extraído y,
finalmente, liofilizado.
La actividad de la xilanasa para su uso en
la presente invención se mide por la liberación de azúcares
reductores a partir de pentosano soluble (diluido 25 X tras la
incubación), y pentosano insoluble (diluido 5 X tras la
incubación).
El 0.5% de pentosanos solubles en agua o
insolubles en agua producidos según el modo descrito anteriormente
son disueltos o suspendidos en un tampón citrato/fosfato 0.1 M, pH
6.0. Se mezclan 0.9 ml del sustrato por muestra con 0.1 ml de
solución enzimática. El sustrato es mantenido en hielo antes y
durante la mezcla de la enzima y el sustrato. La incubación se
realiza a 40°C durante 15 min. tras lo cual la enzima es
desnaturalizada a 100°C durante 5 min. Cuando las muestras son
enfriadas las soluciones de pentosano soluble son diluidas 25 veces
mientras que las soluciones insolubles son diluidas 5 veces. Luego,
los azúcares reductores son determinados mediante la reacción, en
placas de microtitración, con un PHBAH reactivo que comprende 0.15
g de hidracida del ácido para hidroxi benzoico (Sigma
H-9882), 0.50 g de tartrato de
potasio-sodio (Merck 8087) y el 2% de una solución
de NaOH hasta 10.0 ml. Los resultados de las muestras en blanco son
sustraídos. Se usa la xilosa como modelo estándar. Los azúcares
reductores pueden ser usados para determinar WSPU y WSPS.
El ensayo fue realizado usando un destilador
Tecator y unidad de destilación tipo 1003.
Las muestras a analizar son transferidas a tubos
Kjeldahl, para muestras de fluido de aprox. 1.5 g y para muestras
liofilizadas de aprox. 0.1 g.
A las muestras se les agrega:
a) 3.0 ml de ácido sulfúrico (conc. H_{2}
SO_{4})
b) 1.5 ml de peróxido de hidrógeno (32% H_{2}
O_{2})
c) 1 Kjeltab (Se + K_{2} SO_{4})
Si las muestras hacen espuma después de la
adición de los productos químicos no se destruirán hasta el día
siguiente. Bajo circunstancias normales las muestras son colocadas
en el bloque de destrucción después de 10 min. la temperatura del
bloque se fija en 370°C. Cuando las muestras son claras o un poco
amarillas, éstas son eliminadas. La destrucción normalmente dura
+-1 hora según la composición de la muestra. Las muestras son
enfriadas a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 min.
Luego éstas son preparadas para la destilación.
Las muestras son destiladas en 25 ml de ácido
bórico al 2% que contiene un indicador Kjeldahl (A: 0.12 g de
cloruro de metiltioninio en 100 ml de alcohol al 96% y B: 0.125 g
de rojo de metileno en 100 ml de alcohol al 96%, A y B son
mezclados en la proporción 1A:2B). La muestra destruida se mezcla
con NaOH al 32.5%. El amonio es destilado en ácido bórico al 2% que
es luego sometido a titración con 0.1 N de HCl hasta que el pH
alcanza 4.85.
Los caldos de fermentación son analizados por
viscosimetría con vibración en CMC con un pH 6.0. Más
específicamente, se prepara una solución de sustrato que contiene
34.0 g/l de CMC (Blanose Aqualon) en 0.1 M de tampón fosfato, pH
6.0. La muestra de enzima a analizar se disuelve en el mismo
tampón. 14 ml de solución de sustrato y 0.5 ml de solución
enzimática son mezclados y transferidos a un viscosímetro por
vibración (p. ej. MIVI 3000 disponible por Sofraser, Francia)
termostatizados a 40°C. Se determina la unidad de endoglucanasa
(EGU) como la proporción entre la viscosidad de la muestra y la
viscosidad de una solución enzimática estándar.
La actividad endoxilanasa está determinada por un
ensayo, en el que la muestra de xilanasa es incubada con un
sustrato remazol-xilano
(4-O-metil-D-glucurono-D-xilano
teñido con Azul R Brillante de Remazol, Fluka), pH 6.0. La
incubación se realiza a 50°C durante 30 min. El fondo del sustrato
teñido no-degradado es precipitado por etanol. El
color azul restante en el sobrenadante es determinado
espectrofotométricamente a 585 nm y es proporcional a la actividad
endoxilanasa.
La actividad endoxilanasa de la muestra es
determinada en relación con un tipo estándar de enzima.
El ensayo está posteriormente descrito en la
publicación AF 293.6/1-GB, disponible por pedido
por Novo Nordisk A/S, Dinamarca.
La ECU (unidad endocelulosa) está determinada en
relación con un tipo estándar de enzima.
La endocelulasa descompone la
carboximetilcelulosa, CMC. La reducción resultante de la viscosidad
está determinada por un viscosímetro por vibración de CMC (p. ej.
MIVI 3000 disponible por Sofraser, Francia).
La solución de sustrato preparado contiene 35 g/l
de CMC (Blanose Aqualon) en un tampón fosfato 0.1 M a pH 7.5. La
muestra de la enzima a analizar se disuelve en el mismo tampón.
0.15 ml de una solución enzimática estándar o la
muestra de la enzima desconocida son colocados en tubos de ensayo
de 10 ml. Se añade una solución de sustrato CMC de 5 ml,
precalentada a 40°C. La solución conjunta es mezclada íntegramente,
incubada durante 30 minutos y colocada en el viscosímetro.
El método está posteriormente descrito en
AF302-1-GB disponible por Novo
Nordisk por pedido.
La harina usada en los ejemplos siguientes tenían
los componentes siguientes:
| Composición de las harinas usadas | |
| Componente (en pct) | Harina de Fakta |
| Proteína | 10.4 |
| Ceniza | 0.2 |
| Sustancia seca | 10.5 |
| Composición de carbohidratos (en PCT): | |
| Glucosa | 97.7 |
| Arabinosa | 1.1 |
| Xilosa | 0.9 |
| Galactosa | 0.3 |
\vskip1.000000\baselineskip
Harina de Fakta: una harina comercial de tipo
no-especifico ("Luksus hvedemel", preparado
por Dagligvaregruppen, DK-7100 Vejle).
Se evaluó la capacidad de reducir la viscosidad
de distintas xilanasas en harina de Fakta tal y como se ha definido
anteriormente.
Las xilanasas evaluadas fueron
- Spezyme® CP disponibles por Genencor, EEUU
- una xilanasa de H. insolens (producida
según se describe en el ejemplo 2 de WO 92/17573)
- Polvo de Xilanasa 1 (producida usando Xilanasa
I (descrita en WO 94/21785 y mostrada en SEC ID No: 4 de la
presente) como material iniciador, mediante la separación del
líquido sólido, concentración y liofilización según unos métodos
estándar).
- xilanasa II (producida según se describe en WO
94/21785)
- una xilanasa producida por una cepa DSM 6124 de
B. pumilus según se describe en WO 92/03540 (a partir de
ahora se denominará xilanasa de B. pumilus).
La reducción de la viscosidad fue medida por el
método siguiente:
Se pesan 100 g de harina con precisión. A 120 ml
de agua desionizada mantenida a 35°C se añadieron las enzimas
anteriormente mencionadas. Las enzimas fueron dosificadas como
sigue:
- Spezyme® CP: 8.5 FXU (correspondiente a 3.4 mg
de proteína)
- polvo de Xilanasa I: 28.3 FXU (correspondiente
a 0.19 mg de proteína enzimática y 0.24 mg de proteína)
- Xilanasa II: 7.5 FXU (correspondiente a 0.19 mg
de proteína enzimática y 0.25 mg de proteína)
- xilanasa de H. insolens: 82.2 FXU
(correspondiente a 2.2 mg de proteína enzimática y 22.3 mg de
proteína)
- xilanasa de B. pumilus: 21 FXU
(correspondiente a 0.2 mg de proteína)
Se usa una muestra en blanco como control (sin
enzima añadida). Se agita la harina y el agua a mano durante 30 seg
y luego se mezcla para precisamente 30 seg en una mezcladora
(Waring, mezcladora de laboratorio Commercial, Struers, Adjustments
OFF 1-7, rotor en el fondo (4 cuchillas) a 7
(velocidad máxima). Esto precisa 30 seg para echar el líquido en el
tubo de medición en el viscosímetro (reómetro programable, modelo
DV-111, Brookfield, Spindel 25, el tubo de medición
siendo termostatizado a 38°C). La viscosidad a 40 rpm es medida
cada 15 seg durante 4 minutos. La viscosidad específica expresada
como viscosidad media de la muestra/viscosidad media del blanco en
porcentaje se usa como medida de la reducción de la viscosidad. La
viscosidad media es una media del nivel alcanzado después de 60 seg
y hasta el final de las mediciones.
La viscosidad mínima específica fue hallada al
usar xilanasa II. Se halló que otras xilanasas bajaban la
viscosidad específica (xilanasa I, Spezyme® CP) aunque a una
extensión inferior. Se halló que la xilanasa de H. insolens
aumentaba la viscosidad con esta dosificación. Como un ejemplo las
dosificaciones anteriormente mencionadas resultaron en una
viscosidad específica del 69% para la xilanasa II, 78% para la
xilanasa I, 87% para Spezyme® CP y 128% para la xilanasa de H.
insolens (correspondiente a 0.63 FVRU/mg de proteína, 0.044
FVRU/mg de proteína, 0.053 FVRU/mg de proteína y 0.012 FVRU/mg de
proteína).
La capacidad de separación del trigo de las
enzimas mencionadas en el ejemplo 1 fue evaluada mediante una
prueba de centrifugado. La prueba fue realizada en la harina
mencionada en el ejemplo 1.
La harina y el agua fueron mezclados según el
procedimiento descrito en el ejemplo 1. Después de mezclar 10 ml
del rebozado se sometió a centrifugado (Megafuge 1.0 Heraeus
Sepatech) a 4332 g durante 5 minutos. Se halló almidón en la capa
inferior, seguido de gluten, sedimento y la capa de efluente en la
parte superior. La separación se expresa como un porcentaje de
efluente. Cuanto más alto sea el porcentaje mejor separación.
Se confirmó que la xilanasa II tiene mejor
rendimiento. A modo de ejemplo el efluente de la harina fue del 14%
para una muestra en blanco, 21% para Spezyme® CP, 22% para xilanasa
1 y 23% para xilanasa II.
Se evaluaron distintas xilanasas por su capacidad
de reducción de la viscosidad al combinarse con la Xilanasa II. Se
usó la harina de Fakta anteriormente descrita.
Las xilanasas evaluadas fueron
- Celluclast® CCN3035 disponibles por Novo
Nordisk A/S
- Endoglucanasa I, una celulasa de H.
insolens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en
la Fig. 14 en WO 91/17244 y producida según se describe en dicha
referencia
- endoglucanasa de 43 kD, una celulasa de H.
insolens descrita y producida según se describe en WO
91/17243
- una xilanasa de H. insolens (producida
según se describe en el ejemplo 2 de WO 92/17573)
- polvo de xilanasa I (arriba identificada)
- xilanasa de B. pumilus (arriba
identificada).
Cada una de las enzimas fue usada en combinación
con la Xilanasa II y en comparación con Spezyme® CP. La reducción
de la viscosidad fue medida según se describe en el ejemplo 1.
Las dosificaciones de la enzima fueron las
siguientes:
- Celluclast®: 16 EGU (correspondiente a 0.024 ml)
- Endoglucanasa 1: 26.5 ECU (correspondiente a 0.0053 ml)
- Endoglucanasa de 43 kD: 101 ECU (correspondiente a 0.017 ml)
- Xilanasa de H. insolens: 82.2 FXU (correspondiente a 2.2 mg de proteína enzimática y 22.3 mg de proteína)
- Polvo de Xilanasa I: 28.3 FXU (correspondiente a 0.19 mg de proteína enzimática y 0.24 mg de proteína)
- Xilanasa de B. pumilus: 21 FXU (correspondiente a 0.024 ml y 0.2 mg de proteína)
- Xilanasa II: 7.5 FXU (correspondiente a 0.19 mg de proteína enzimática y 0.25 mg de proteína)
- Spezyme® CP: 8.5 FXU (correspondiente a 0.024 ml y 3.4 mg de proteína)
A partir de la figura 1 se constata que ninguna
otra enzima reduce la viscosidad al mismo nivel que lo hace la
Xilanasa II. Además se observa una reducción destacable de la
viscosidad al combinar especialmente la Xilanasa II con
Endoglucanasa I y celulasa de 43 kD. También se puede combinar la
Xilanasa II con enzimas multi-componentes
existentes como se puede observar con Celluclast®.
En la figura 1 las columnas oscuras indican el
rendimiento de la enzima sola. Las columnas de luz indican el
efecto observado de las enzimas en combinación con la Xilanasa
II:
| 1 = Xilanasa II | 2 = Xilanasa II |
| 3 = Spezymel® CP | 4 = Endoglucanasa de 43 kD |
| 5 = xilanasa de H. insolens | 6 = Endoglucanasa I |
| 7 = polvo de Xilanasa I | 8 = Celluclast® |
| 9 = xilanasa de B. pumilus |
Determinando el WSPS y WSPU se debe determinar el
contenido de la proteína de la enzima añadida determinada según
Kjeldahl y las actividades de las enzimas en agua insoluble (WIP) y
pentosanos solubles (WSP) producidos según se describe previamente
medidos como azúcares reductores.
Los valores de WSPS y WSPU determinados para
varias preparaciones fueron los siguientes:
El WSPU es la actividad en WSP por mg de proteína
pr. kg de harina y el WSPS es la proporción WSP/WIP por mg de
proteína pr. kg de harina.
Según se puede observar la Xilanasa II muestra un
WSPU y WSPS bastante alto que refleja la degradación de pentosanos
solubles en agua con un nivel alto y con una degradación baja en
pentosanos insolubles en comparación con la adición de
proteína.
Se alimentó unos pollos Broiler durante 6 semanas
con una dieta experimental con y sin enzimas. La dieta contenía el
81% de trigo en las primeras 3 semanas de la prueba y el 84.5% de
trigo en las últimas 3 semanas. Se dividieron en 3 tratamientos; en
las tres primeras semanas cada tratamiento incluía 12 repeticiones
con 8 Broilers en cada una, las últimas 3 semanas 6 repeticiones
con 5 pollos en cada una. Los tratamientos incluían un control sin
enzimas y los tratamientos enzimáticos siguientes: 400 FXU/kg de
pienso Bio-Feed™Plus (BF+) (disponible por Novo
Nordisk A/S) y 400 FXU/kg de Xilanasa II de pienso. Ambas enzimas
fueron formuladas como un granulado de CT según el método descrito
en WO 92/12645. Se determinó un aumento de peso y consumo de pienso
y la proporción de conversión de pienso (FCR) fue calculada de 0 a
3 y de 3 a 6 semanas. Además, la viscosidad yeyunal e ileal fue
determinada en un sobrenadante de los contenidos del intestino,
usando un viscosímetro Brookfield LVTDV-II.
Los resultados son evidentes a partir de las
tablas siguientes.
Como se puede observar en la tabla 1 y 2, el FCR
es más bajo en los grupos que reciben enzimas, ambos después de 3 y
6 semanas. En ambos casos la Xilanasa II es mejor que el BF+. Esto
se debe principalmente a un mejor crecimiento de los animales de
este grupo.
Respecto a la viscosidad yeyunal, la Xilanasa II
da una viscosidad inferior en comparación con el BF+ y el control.
Este también es el caso de la viscosidad ileal. El control y
xilanasa II dan una viscosidad inferior después de 6 semanas que
después de 3 semanas, mientras que este no es el caso del BF+. Por
lo tanto parece que la xilanasa II trabaja mejor durante las
últimas 3 semanas que el BF+, lo cual también viene indicado por el
FCR relativamente inferior de la Xilanasa II en comparación con el
BF+ en 6 semanas.
Este experimento muestra por lo tanto que la
Xilanasa II da una mejor conversión del pienso que el BF+ en la
misma base de FXU, es decir que se han vuelto disponibles más
nutrientes con la Xilanasa II. Esto puede deberse en parte a una
viscosidad ileal inferior en el grupo de la xilanasa II.
El impacto de la Xilanasa II (100 FXU/kg y 200
FXU/kg) en la AME (energía metabolizable aparente) de trigo fue
determinado por el método de referencia Europea (Bourdillon et
al., (1990), y en comparación con el producto comercial
Bio-Feed™Plus (400 FXU/kg) (BF+) de Novo Nordisk
A/S. El valor de AMEn expresa la energía metabolizable en el pienso
corregido para la retención-N.
Se utilizaron pollos broiler Ross machos de un
día, proporcionados por un criadero comercial.
Del día 1 al día 16 los pollos fueron alimentados
con una dieta de iniciación comercial. En el día 16 los pollos
fueron pesados individualmente. Los pollos con peso corporal muy
alto o muy bajo fueron descartados y los demás fueron puestos en
jaulas en batería. Desde el día 16 hasta el día 23 se adaptaron a
las jaulas. La prueba de balanza se efectuó in vivo desde el
día 24 hasta el día 28 según Bourdillon et al., (1990),
supra. La prueba incluía 9 tratamientos con réplicas de 4
pollos broiler por réplica.
La dieta básica contenía el 56% de sorgo, 32.5%
de harina de soja, 6% de grasa de origen animal, 1% de aceite de
soja y 5% de minerales, vitaminas, oligoelementos y aminoácidos. En
la dieta experimental la mitad de la dieta básica fue reemplazada
por trigo. Los pollos fueron alimentados con dietas como una pasta
a un nivel del 90% de una ingesta ad libitum.
Los excrementos de pollo fueron recogidos de
forma cuantitativa a diario. Las muestras de pienso y excrementos
liofilizados fueron analizados por su grasa, energía bruta (GE) y
nitrógeno.
El contenido de AME de las dietas fue calculado a
partir de su respectiva proporción de excrementos/pienso así como
su contenido de energía bruta correspondiente (GE). La corrección
de la retención-N hasta cero (AMEn) fue hecha
usando una energía equivalente de 34.36 kJ/g de N retenido.
La digestibilidad de grasa fue determinada por
extracción de la grasa de las dietas y excrementos
liofilizados.
La AMEn determinada está mostrada visualmente en
la figura 3.
De la figura 3 se puede observar que la
suplementación de la dieta básica con Xilanasa II resultó en una
mejora significante de la energía metabolizable en comparación con
Bio-Feed™(BF+).
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<211> 1327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(1221)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1225)..(1314)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1318)..(1326)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 439
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (68)..(1048)
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<223>
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1106)..(1273)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1052)..(0084)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1088)..(1093)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1097)..(1102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (109)..(1413)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1060
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> sig_péptido
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<222> (10)..(72)
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<223>
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(924)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (22)
1. Una preparación que comprende
a) una xilanasa que tiene
- i)
- una proporción entre unidad de pentosano soluble en agua (WSPU) y unidades de pentosano insolubles en agua (WIPU) por mg de proteína en relación con la enzima cuando se recupera del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica añadida que sea superior a 0.06, y/o
- ii)
- una unidad de pentosano soluble en agua (WSPU) por mg de proteína en relación con la enzima cuando se recupera del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica añadida que sea superior a 15, y/o
- iii)
- una actividad específica superior a 0.053 FVRU por mg de proteína en relación con la enzima cuando se recupera del caldo de fermentación y sin proteína inerte o no xilanolítica, y
b) Endoglucanasa I mostrada en SEC ID No: 5 que
se puede obtener a partir de Humicola insolens o una
Endoglucanasa de humicola insolens de 43 kD mostrada en SEC
ID No: 7.
2. La preparación según la reivindicación 1, en
la que la xilanasa es de origen microbiano.
3. La preparación según la reivindicación 2, en
la que la xilanasa es derivable de un hongo filamentoso o una
levadura.
4. La preparación según la reivindicación 3, en
la que la xilanasa es derivable de una cepa de Aspergillus,
Trichoderma, Penicillium, Fusarium o Humicola.
5. La preparación según la reivindicación 4, en
la que la xilanasa es derivable de una cepa de Aspergillus,
en particular una cepa de Aspergillus aculeatus, Aspergillus
Niger o Aspergillus oryzae.
6. La preparación según la reivindicación 5, en
la que la xilanasa es xilanasa II, que
- i)
- está codificada por la secuencia de ADN mostrada en SEC ID No: 2.
- ii)
- comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID No: 5.
7. La preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde la xilanasa está
preparada a partir enzimas monocomponentes aisladas.
8. La preparación según la reivindicación 5, en
la que la xilanasa es xilanasa I, que
- i)
- está codificada por la secuencia de ADN mostrada en SEC ID No: 1,
- ii)
- comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID No: 4.
9. La preparación según la reivindicación 8,
donde la xilanasa es polvo de Xilanasa I.
10. Uso de una preparación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para reducir la viscosidad de un
material vegetal.
11. Uso de una preparación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para la separación de componentes de
cereales.
12. El uso según la reivindicación 11, en el que
el cereal incluye trigo, cebada, centeno, avena, arroz, y
sorgo.
13. El uso según la reivindicación 12, en el que
el cereal es trigo.
14. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 11-13, en el que el cereal está
separado en un componente que contiene almidón y proteína.
15. Uso de una preparación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de
beta-glucano.
16. Uso de una preparación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de la cerveza.
17. Uso de una preparación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de pienso.
18. El uso según la reivindicación 17, para
reducir la viscosidad del pienso.
19. El uso según las reivindicaciones 17 o 18,
para mejorar la digestibilidad del pienso.
20. El uso según las reivindicaciones
17-19, para mejorar la energía metabolizable del
pienso.
21. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 17-20, donde el pienso es pienso
para pollos.
22. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 17-20, donde el pienso consiste en
pienso para cerdos.
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