DE2735456A1 - Neues antibiotikum - Google Patents

Neues antibiotikum

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DE2735456A1
DE2735456A1 DE19772735456 DE2735456A DE2735456A1 DE 2735456 A1 DE2735456 A1 DE 2735456A1 DE 19772735456 DE19772735456 DE 19772735456 DE 2735456 A DE2735456 A DE 2735456A DE 2735456 A1 DE2735456 A1 DE 2735456A1
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DE
Germany
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antibiotic
formula
streptomyces
pharmaceutically acceptable
acetonitrile
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Withdrawn
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DE19772735456
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English (en)
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Chao-Min Liu
John Westley
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Description

.Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz der Formel .
'al·· X
und pharmazeutisch verträgliche Salze dieser Verbindung. Dieses Antibiotikum besitzt ionophore Eigenschaften und gehört der
Gruppe der Polyätherantibiotika an. Das Antibiotikum der Formel I und dessen pharmazeutisch verträglichen Salze hemmen das
Wachstum von grampositiven Bakterien und sind ausserdem verwendbar als antihypertensives Agens sowie zur Verbesserung des
Futternutzeffektes bei Wiederkäuern.
Mn/29.7.1977
709886/1003
Das Antibiotikum der Formel I und dessen pharmazeutisch verträgliche Salze werden erfindungsgemäss gemäss einem Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Streptomyces sp. X-14547, von welchem NRRL 8167 einen Stamm darstellt, in einem Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Nährstoffe und Mineralsalze enthaltenden Nährboden kultiviert, wonach man das erhaltene Antibiotikum der Formel I aus der Gärlösung isoliert und erwünschtenfalls das erhaltene Produkt in ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon überführt.
Die Verbindung der Formel I wird chemisch als α (R), 5 (S)-Dimethyl-6(R)-/l-äthyl-4-[4-(R) -(2-pyrrolyl-carbonyl)-1(S) äthyl-3a(R),4,5(R),7a(R)-tetrahydroindan-5-yl/-l(E),3 (E) butadienyl-tetrahydropyran-2-essigsäure bezeichnet.
Der das erfindungsgemässe Antibiotikum erzeugende Mikroorganismus stellt eine neue Species mit dem Namen Streptomyces sp. X-14547 dar. Eine Kultur dieses lebenden Organismus mit der Laborbezeichnung X-14547 wurde in der Mikroorganismen-Sammlung des United States Department für Landwirtschaft, Agriculture Research Service, NRRL, Peoria, Illinois, USA unter der Nr. NRRL 8167 deponiert. Die Kultur ist als einen Stamm von Streptomyces antibioticus identifiziert worden.
Der neue Mikroorganismus wurde aus einer in Martinsville, Virginia gefundenen Erdprobe isoliert. Der repräsentative Stamm von Streptomyces sp. X-14547 besitzt folgende Kennzeichen:
Allgemeine Kennzeichen
Streptomyces X-14547 erzeugt ein Substratmyeel, welches in Sporen nicht fragmentiert· und ein Luftmycel, das Sporenketten mit "rectus-flexibilis" Charakteristik bildet; die Sporen haben eine glatte Oberfläche. Die Sporen besitzen eine Länge von 1,26 bis 1,42 μ und eine Breite von 0,69 bis 0,91 μ. Die Zellenwände enthalten ein Isomeres von Diaminopimelinsäure, welches von der Meso-Form verschieden ist. Diese Fakten sowohl als die obigen
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- -gr-
Koloniekennzeichen rechtfertigen die Klassifizierung dieser Kultur unter dem Genus Streptomyces.
Wachstumskennzeichen
Die standardisierten ISP Medien in Shirling and Gottlieb "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. System. Bacteriol. , 1(5, Seiten 313-400, 1966, sowohl als andere, zur Characterisierung der Kultur verwendeten Medien werden nachstehend beschrieben:
ISP-I bis ISP-9 werden von Shirling and Gottlieb im
obigen Artikel beschrieben.
Czapek-Dox-Agar: Czapek-Dox-Brühe (BBL), der 1,5% Agar zugefügt wurde.
Bennett's-Agar: Hefeextrakt 0,1%; Fleischextrakt 0,1%; N-Z Amine A (Caseinhydrolysat aus Sheffield Inc.) 0,2%; Dextrose 1%; Agar 1,8%; pH 7,3.
Sabouraud Dextrose Agar: (Difco).
Thermoactinomyces Fermentations-Agar: Bacto Thermoactinomyces Fermentationsmedium (Difco), dem 1,5% Agar zugefügt wurde.
ATCC Medium 5: Sporulierungsagar: Hefeextrakt 0,1%; Fleischextrakt 0,1%; Tryptose 0,2%; FeSO. Spuren; Dextrose 1,O%; Agar 1,5%; pH 7,2.
Amidex Agar: Amidex (Corn Products Co., Decatur, 111.) 1%; N-Z Mine'A 0,2%; Fleischextrakt 0,1%; Hefeextrakt 0,1%; CaCl2.2H2O 0,0014%; Agar 2%; pH 7,3.
Stärke/Casein-Agar: Lösliche Stärke 1%; Casein 0,1%; K2HPO4 0,05%; MgSO4 0,05%; Agar 1,5%; pH 7,4.
Die nachstehende Tabelle 1 beschreibt das Wachstum, die Sporenbildung, Farbe der Sporen und die Farbe der Rückseite des Mycels. Die Agarplatten wurden nach 14-tägiger Bebrütung bei 48°C beobachtet. Die Farbskala stammt aus Color Harmony Manual 4. Auflage, 1958 (Container Corp. of America).
709886/1003
JO
Tabelle Kulturkennzeichen von Streptomyces sp. X-14547
Agarmedium Wachstum
Sporulationsgrad		 Farbe der
Sporen		 Farbe der Rück
seite des Mycels
Hefe/Malz-
Extrakt
(ISP-2)		 mittleres bis
reichliches
Wachstum; gut
sporuliert;
leicht hygros
kopisch		 zur Hauptsache
3 fe (silber
grau) ; einige
Büschel von a
(weiss)		 2 nl (braun) in der
Mitte; 2 ca (hell
e1fenbeinfarben)
Hafermehl
(ISP-3)		 reichliches
Wachstum;
gut sporuliert		 3 fe (silber
grau)		 3 fe (silbergrau)
in der Mitte;
2 de (naturfarben)
am Rande
anorgani s ehe
Salze/Stärke
(ISP-4)		 reichliches
Wachstum; gut
sporuliert		 3 fe (silber
grau) mit
Rändern und
Flecken von b
(austernweiss)		 2 de (natur
farben)
Glycerin/
Asparagin
(ISP-5)		 massiges Wachs
tum; massig bis
gut sporuliert;
leicht hygros
kopisch		 2 fe (grau)
mit Rändern
und Flecken von
b (austernweiss)		 zur Hauptsache 2 ec
(bisquitfarben);
2 ge (bräunlich)
am Rande
Pepton/Hefe
extrakt/Ei sen
(ISP-6)		 massiges Wachs
tum; keine
Sporulation;
dunkelbraunes
lösliches Pigment		 i (grau) wo
keine Sporu
lation		 i (grau) wo keine
Sporulation
Tyrosin
(ISP-7)		 schwaches Wachs
tum; etwas Sporu
lation; gering
fügiges Auftreten
eines braunen,
löslichen Pigmentes		 2 de (natur-
farben)		 3 Ii (biberfarben)
Czapek-Dox
Agar		 schwaches Wachs
tum; spärlich
sporuliert		 b (austern
weiss)		 b (austernweiss)
Bennetts Agar massiges Wachs
tum; gut sporu
liert; hygrosko
pisch		 2 fe (grau) 3 Ig (ziegelbraun)
Sabouraud
Dextrose Agar		 massiges Wachs
tum; keine
Sporulation
I		 3 ie (kamel-
farben) wo
nicht sporu
liert		 3 ie (kamelfarben)
wo nicht sporu
liert
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Agarmedium Wachstum Farbe der Farbe der Rück
Sporulationsgrad Sporen seite des Mycels
Thermoactino- reichliches Wachs zur Hauptsache 3 pn (dunkelbraun)
myces Fermen- tum; gut sporu- 3 fe (silber in der Mitte; 3 ng
tationsagar liert; hygrosko grau) ; mit (ahorngelb) am
pisch Büscheln von b Rande
(austernweiss)
ATCC Medium 5 massiges Wachs 3 fe (silber 3 pl (senfbraun)
(American Type tum; gut sporu- grau) ; mit Zonen
Culture Collec liert; hygros von 3 de
tion Katalog kopisch (naturfarben)
der Stämme.
12. Auflage
1976, Rock-
ville, Md. USA)
Amidex Agar reichliches Wachs zur Hauptsache 3 pl (senfbraun)
tum; gut sporu- 3 fe (silber in der Mitte; 2 cb
liert; leicht grau) ; b am (Stich ins Elfen
hygroskopisch Rande (austern bein) um den Rand
weiss)
Stärke/Casein reichliches Wachs 3 fe (silber 2 dc (naturfarben)
Agar tum; gut sporu- grau) ; b
liert; hygrosko (austernweiss);
pisch in einer Zone
Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die morphologischen und physiologischen Kennzeichen von Streptomyces sp. X-14547.
Tabelle 2
Morphologische und physiologische Kennzeichen von Streptomyces sp. X-14547
Test
Kennzeichen
chromogene Reaktion, ISP-6 Melanin, ISP-7 Sporenoberflache Farbe der Sporen Form der Sporenketten D-Glucose Verwertung
709886/1003
+ schwach
glatt
grau
rectus-flexibilis
D-Xylose Verwertung ++ bis +
L-Arabinose Verwertung ++
L-Rhamnose Verwertung ++
D-Fructose Verwertung ++
D-Galactose Verwertung ++
Raffinose Verwertung -
D-Mannit Verwertung ++
i-Inosit Verwertung ++
Salicin Verwertung -
Saccharose Verwertung -
Cellulose Verwertung -
Pigment der Rückseite -
Lösliches Pigment -
Streptomycin-Empfindlichkeit,
10 Mg Platte +
Nitratreduktion -
Casein-Hydrolyse +
Gelatine-Hydrolyse +
Stärke-Hydrolyse +
ISP-I Verdunkelung +
NaCi Toleranz (%) 5
Temperaturbereich des Wachstums, 0C 10-37
Diaminopimelinsäure-Isomeres anders als das Meso-
Isomere
++ = stark positive Reaktion; - = negative Reaktion
Gemäss R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, Williams and Wilkins Co., Baltomore, Md., ist der Mikroorganismus Streptomyces X-14547 dem bisher bekannten Streptomyces antibioticus ähnlich, jedoch ergibt ein Vergleich Unterschiede in Verwertung von L-Arabinose, Melanin-Erzeugung an ISP-7 und Nitratreduktion. Die Kultur X-14547 zeigt jedoch ausreichende Aehnlichkeiten zu dem bisher bekannten Streptomyces antibioticus, um deren Identifizierung als ein Stamm von Streptomyces antibioticus
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2735A56 zu rechtfertigen.
Die hier beschriebene Species Streptmyces X-14547 schliesst sämtliche Stämme von Streptmyces ein, welche die Verbindung der Formel I erzeugen und welche nicht eindeutig von der Kultur Nr. X-14547 und dessen Subkulturen, einschliesslich Mutanten und Varianten davon, unterschieden werden können. Mit Hilfe der hier identifizierten Verbindung der Formel I bietet die Differenzierung der diese Verbindung erzeugenden Stämme von anderen dem Fachmann keine Schwierigkeiten.
Streptomyces sp. X-14547 erzeugt nach Züchtung unter geeigneten Bedingungen eine Verbindung der Formel I. Die dafür benötigte Gärlösung wird durch Beimpfung des Nährmediums mit Sporen oder Mycel des Mikroorganismus hergestellt; die Nährlösung wird anschliessend unter aeroben Bedingungen kultiviert. Es ist ebenfalls möglich, Kultivierung an einem festen Nährboden durchzuführen, jedoch wird für die Erzeugung grösserer Mengen ein flüssiges Medium bevorzugt. Die Gärtemperatur kann im weiten Bereich, 20-25* C, variiert werden, jedoch sind Temperaturen von 26-30 C und im wesentlichen neutrales pH bevorzugt. Für die submerse aerobe Fermentation kann das Nährmedium als Kohlenstoffquelle ein im Handel erhältliches Glycerinöl oder ein Kohlenhydrat, wie z.B. Glycerin, Glucose, Maltose, Lactose, Dextrin, Stärke, etc. in reinem oder rohem Zustand enthalten; als Stickstoffquelle kommen organische Malterialien, wie Sojabohnenmehl, lösliche Rückstände aus der Brennerei, Erdnussmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt, Maisquellwasser, etc. in Betracht. Erwünschtenfalls können auch anorganische Stickstoffquellen verwendet werden, wie z.B. Nitrate und Ammoniumsalze. Mineralsalze sind beispielsweise Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat, Calciumcarbonat und Spurenmengen von Schwermetallsalzen. Das Nährmedium kann ebenfalls Puffersubstanzen, wie beispielsweise Natriumeitrat oder Phosphate, enthalten. Wenn die Fermentation unter belüfteten submersen Bedingungen durchgeführt wird, verwendet man
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vorzugsweise ein Schaumbekämpfungsmittel wie flüssiges Paraffin, fettes OeI oder Silikonprodukte. Mehr als eine Art von Kohlenstoff quelle, Stickstoffquelle bzw. Schaumbekämpfungsmittel können verwendet werden.
Nach beendigtem Gärvorgang kann das Antibiotikum X-14547 bzw. seine Salze aus dem Gärmedium isoliert werden. Die Isolierung kann nach mehreren Methoden erfolgen, beispielsweise durch Extraktion der ganzen Gärlösung mit einem Lösungsmittel oder durch Filtration der Gärlösung und Extraktion des Mycels mit einem geeigneten Lösungsmittel. Für die Extraktion des Mycels geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Aceton, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und gemischte Lösungsmittel, wie Methylenchlorid-Methanol und Aethylacetat-Aethanol.
Allgemein für die Extraktionstechnik geeignete Lösungsmittel sind z.B. Chloroform, halogenierte Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Aetherlösungsmittel, Aethyl- und Butylacetat. Kristallisation des Endproduktes kann unter Verwendung von beispielsweise Aethylacetat, Butylacetat, Methylenchlorid oder Chloroform erfolgen.
Das Antibiotikum X-14547 kann eine Vielzahl pharmazeutisch verträglicher Salze bilden. Diese Salze werden aus der freien Säureform des Antibiotikums nach an sich bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch Waschen der freien Säure in Lösung mit einer geeigneten Base oder einem geeigneten Salz. Beispiele für solche pharmazeutisch verträgliche basische Substanzen sind Alkalimetallbasen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid und dergleichen; Erdalkalimetallbasen, wie Calciumhydroxid, Bariumhydroxid und dergleichen; und Ammoniumhydroxid. Alkalimetall oder Erdalkalimetallsalze, welche verwendet werden können, sind beispielsweise Carbonate, Bicarbonate und Sulfate.
Nachstehend werden verschiedene physiologische Eigenschaften für das Antibiotikum X-14547 aufgeführt:
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- «rf -
1 Das Infrarot-Spektrum in Kaliumbromid ist aus Figur ersichtlich. Das Antibiotikum besitzt charakteristische Absorption bei den folgenden Frequenzen (cm ):
5 Peaks u.a. bei 3140 (OH), 2740-2400 (Carboxyl OH), 1735, 171O (C=O), 1650 (konjugiertes C=O) und 1627 cm" (konjugierte C=C)
Das Antibiotikum X-14547 besitzt eine orale Toxizität 10 (LD50) an der Maus von 129 mg/kg (beobachtet nach 24 Stunden).
Das Antibiotikum X-14547 besitzt antiraikrobielle Wirkung gegen eine Vielzahl grampositive Bakterien und Mycobakterien gemäss der nachstehenden Tabelle 3: 15
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Ji
Tabelle
Name des Organismus
Mikroorganismen- Sammlung Nr.
Mxndestheirankonzentration Mg/ml *
ATCC NRRL O,l
Bacillus megaterium 8011 0,1
Sarcina lutea 9341 O,2
Bacillus species E 27859 0,1
Bacillus subtilis 558 0,2
Staphylococcus aureus 6538P O,2
Bacillus TA 27860 3,1
Mycobacterium phlei 355 0,8
Streptomyces cellulosae 3313 6,3
Paecilomyces varioti 26820
* niedrigste zweifache Verdünnung mit einer Hemmzone im Agardiffusionstest.
Die oben beschriebene Gärung erzeugt ebenfalls einen Kometaboliten, das 3-Aethyl-l,3-dihydro-3-methoxy-2H-indol-2-on, eine neue Verbindung, welche ebenfalls antimikrobiell Wirksamkeit gegen eine Vielzahl Mikroorganismen zeigt. Die nachstehende Tabelle 4 macht dies ersichtlich:
709886/1003
- -Atr-
Name des Organismus
fr
Tabelle 4 		2735456
Mikroorganismen-
Sammlung Nr.
ATCC 		Mindesthenunkonzen
tration, pg/ml
27856 5,0
87O9 5,O
27858 5,0
6538P 5,0
2786O 2,5
26820 2,5
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Bacillus TA
Paecilomyces varioti
Wie oben gezeigt, hemmen das Antibiotikum X-14547 und dessen Salze sowie dessen Kometabolit 3-Aethyl-l,3-dihydro-3-methoxy-2H-indol-2-on das Wachstum gewisser grampositiver Bakterien. Diese Substanzen sind in Waschlösungen für sanitäre Zwecke verwendbar, wie z.B. zum Händewaschen und Reinigung von Ausrüstungen bzw. Einrichtungen von kontaminierten Räumen oder Laboratorien.
Das Antibiotikum X-14547 verbessert ebenfalls den Futternutzeffekt bei Wiederkäuern, d.h. es verbessert die Verdauungswirkung bei gewissen Pflanzenfresser, z.B. Rindvieh. Eine Erläuterung des Mechanismus, wodurch das Futter in wieder- käuenden Tieren verdaut, abgebaut und metabolisiert wird, wird in der U.S. Patentschrift Nr. 3,839,557 gegeben; es wird dort die Verwendung gewisser Antibiotika zur Verbesserung des Futternutzeffektes bei Wiederkäuern beschrieben. Wirtschaft lich wichtige Wiederkäuer sind Rind, Schaf und Ziege.
Die Wirksamkeit des Antibiotikums X-14547 zur Modifizierung des Verhältnissen der im Pansen erzeuyLen flüchtigen Fettsäuren (wobei die Futterverwertung verbessert wird) ist aus den nachstehenden in vitro Versuchsergcbriissen ersichtlich.
Flüssigkeit wird über eine Fistel vom Pansen eines Stieres gezogen. Der Stier erhält folgendes Futter:
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Mais 89,93%
Alfalfamehl 5,OOO%
Sojabohnenölmehl 3,00%
Kalkstein 0,80%
NaCl 0,60%
Dicalciumphosphat 0,50%
Spurenmineralien 0,025%
Vitaminepremix-
zusätze 0,1%
Vitamin A, TIU 4,0003
Vitamin D3, IU 0,801
Vitamin E, TIU 3,002
Die Pansenflüssigkeit wird unmittelbar durch ein Sieb gesiebt. Die Flüssigkeit wird einer Fermentation unterworfen wie folgt:
75 ml der erhaltenen Flüssigkeit wird in einem 250 ml- Kolben vorgelegt, der ausserdem folgende Zusätze enthält:
1 g 80%:20% fein gemahlener Korn: Heu; 1 ml einer 18%igen wässrigen Glucoselösung (1 mMol pro Kolben); 1,5 ml einer 3,l%igen wässerigen Harnstofflösung (0,76 mMol/Kolben); 60 Mikromol von je der 10 essentiellen Aminosäuren (Arginin, Histidin, Lysin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan); 1 ml einer wässerigen Lösung dor Testsubstanz zu entweder 10 oder 25 ng/ml (berechnetes totales Volumen der Fermentationsmischumj: 80 ml).
Jeder Kolbon wird bei i8 C in einem mit Abzug versehenen, schüttelnden Wasserbad bebriilet. Kohlendioxid wLrd kontinuierlich durch den Abzug geleitet. Nach 4-stündiger Bebrütung werden 10 ml der Fermontati onsf liissigkoit 20 Minuten bei 141OOO U pm (etwa 301OOO <j) eeiit rifug ier t. 1 ml einer 25V. igen Metapho:;phoj: r.ciurelösung ent hu I tend 2 J pg/ml 2-Methy L-valerinnsäure wird mit 5 ml der au:: der ("entri f'ugiorung erhaltenen überstehenden rhaso voisct.'t. Ine erhaltene Flüssigkeit v/itd bei Zimmertemperatur JO Minuten stehen gelassen. Die flü;iüi.|-
? α n^e 9 ■ /1 η ο 3 BAD original
- YT-
keit wird durch ein 0,22 Millimikron Filter filtriert und bis zur gaschromatographischen Analyse flüchtiger Fettsäuren in der Kälte aufbewahrt.
Gaschromatographische Analyse von vier in vitro Kontrollgärungen und zwei Gärungen mit je 10 bzw. 25 Mikrogramm Antibiotikum X-14547 pro ml sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:
Molverhältnis von Propionat (C3) zu Acetat (C-) plus n-Butyrat
Beschreibung
(Bebrütungszeit)		 μΐηοΐ C-s/nmol C~ + μΐηοΐ nC.
Kontrollen (0 Stunden) einzelne Fermen
tationen		 Durchschnitt + 1
Kontrollen (4 Stunden) 0,372
0,361
0,364
0,350		 0,362 (+ 0,009)
Antibiotikum X-14547 0,393
0,337
0,427
0,388		 0,386 (+ 0,037)
(4 Stunden) 10 pg-ml 0,493 0,491
Antibiotikum X-14547 0,489
(4 Stunden) 25 ug-ml 0,531 0,521
0,510
Die obige Tabelle zeigt, dass das Verhältnis von Propionat zur Summe von Acetat und n-Butyrat wesentlich verbessert wird. Bei vermehrter Bildung von Propionat eher als Acetat aus den Kohlenhydraten wird die Wirkung der Kohlenhydrate und daher die Futterverwertung erhöht.
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Durch Verabreichung des Antibiotikums X-14547 (nachstehend "das Antibiotikum" benannt) wird Ketose verhindert bzw. geheilt? gleichzeitig wird die Futterverwertung verbessert. Die Ursache der Ketose liegt in einer rückständigen Bildung von Propionat.
Eine gegenwärtig empfohlene Behandlungsmethode besteht aus Verabreichung von Propionsäure bzw. von Futtern, welche bevorzugt Propionate erzeugen. Es ist offensichtlich, dass die bevorzugte Bildung von Propionat bei der Einnahme von üblichen Futtermitteln die Ketosefälle vermindern wird.
Die einfachste Methode zur Verabreichung des Antibiotikums besteht darin, dass man es mit dem Tierfutter vermischt. Das Antibiotikum kann jedoch auch in anderer Weise verabreicht werden. Es kann beispielsweise zu Tabletten, Tränken, BoIi oder Kapseln verarbeitet werden, welche dem Tier in dosierter Form verabreicht werden können. Formulierungen des Antibiotikums in derartiger Dosierungsformen werden nach an sich in der Veterinär-Pharmazie bekannten Methoden hergestellt.
Kapseln werden in üblicher Weise hergestellt durch Auffüllen von Gelatinekapseln mit dem Antibiotikum in beliebiger Form. Erwünschtenfalls kann das Antibiotikum mit einem inerten, festen Verdünnungsmittel verdünnt werden, wie beispielsweise mit einem Zucker, Stärke oder gereinigter kristalliner Cellulose, um das Volumen aus Zweckmässigkeitsgrunden zu erhöhen.
Tabletten werden durch herkömmliche pharmazeutische Methoden hergestellt. Eine Tablette enthält im allgemeinen ausser dem Wirkstoff eine Base, einen Desintegrator, ein Adsorbens, ein Bindemittel und ein Gleitmittel. Typische Basen sind z.B.
Milchzucker, feiner Puderzucker, Natriumchlorid, Stärke und Mannit. Stärke ist ebenfalls ein guter Desintegrator,wie ebenso Alginsäure. Oberflächenaktive Mittel, wie Natriumlaurylsulfat und Dioktylnatriumsulfosuccinat werden gelegentlich ebenfalls verwendet. Ueblicherweise verwendete Adsorbentien sind z.B. Stärke und Milchzucker, während Magnesiumcarbonat bei öligen Substanzen Verwendung findet. Oft verwendete Bindemittel sind
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Gelatine, Gummi arabicum, Stärke, Dextrin und verschiedene Cellulosederivate. Häufig verwendete Gleitmittel sind z.B. Magnesiumstearat, Talk, Paraffinwachs, verschiedene Metallseifen und Polyäthylenglykol.
Das Antibiotikum kann ebenfalls in Form eines Bolus mit
verzögerter Wirkung verabreicht werden'. Derartige BoIi werden als Tabletten hergestellt, wobei jedoch ein Mittel zur Verzögerung der Auflösung des Antibiotikums zugefügt wird. BoIi sind für Freisetzung während längerer Perioden vorgesehen. Die langsame Auflösung wird durch Wahl einer stark wasserunlöslichen Form des Antibiotikums gewährleistet. Beispielsweise können Eisenfeilspäne zugegeben^; um die Dichte des Bolus zu erhöhen, damit dieses am Boden des Pansens statisch bleibt.
Auflösung des Antibiotikums wird verzögert durch Verwendung einer Matritze unlöslichen Materials, in welcher der Wirkstoff eingebettet wird. Beispielsweise können pflanzliche Wachse, gereinigte Mineralwachse und wasserunlösliche, polymere Materialien verwendet werden.
Tränke des Antibiotikums werden zweckmässig durch Wahl einer wasserlöslichen Form des Antibiotikums hergestellt. Wird eine unlösliche Form gewünscht, kann eine Suspension hergestellt werden. Wahlweise kann ein Trank als eine Lösung in einem physiologisch einwandfreien Lösungsmittel, wie beispielsweise Polyäthylenglykol, zubereitet werden.
Suspensionen von unlöslichen Formen des Antibiotikums können in Nicht-Lösungsmitteln hergestellt werden, wie beispielsweise in pflanzlichen Oelen, z.B. Erdnuss-, Mais-oder Sesam-Oel, in einem Glykol, wie z.B. Propylenglykol oder Polyäthylenglykol, oder in Wasser, je nach der gewählten Form des Antibiotikums.
35
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Geeignete physiologisch verträgliche Zusätze sind notwendig, um das Antibiotikum in Suspension zu halten. Die Zusätze können Verdickungsmittel sein, wie z.B. Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine oder Alginate. Verschiedene Klassen von Schaumerzeugern dienen dazu, das Antibiotikum in Suspension zu halten. Beispielsweise sind Lecithin, Alkylphenol/Polyäthylenoxid-Addukte, Naphtalinsulfonate, Alkylbenzolsulfonate und Polyoxyäthylensorbitanester für die Herstellung von Suspensionen in flüssigen Nicht-Lösungsmitteln verwendbar.
Für die Herstellung von Suspensionen können zusätzlich verschiedene Substanzen, welche die Hydrophilität, Dichte und Oberflächenspannung beeinflussen, verwendet werden. Beispiele sind Silikone, Glykole, Sorbit und Zucker, die als Suspendierungsmittel Verwendung finden.
Das Antibiotikum kann dem Verbraucher als eine Suspension oder als ein trockenes Gemisch mit entsprechenden Hilfsmitteln zur Verdünnung vor der Verwendung vorgelegt werden.
Das Antibiotikum kann ebenfalls dem Trinkwasser des Wiederkäuers zugeführt werden. Dabei wird eine wasserlösliche oder wassersuspendierbare Form des Antibiotikums dem Trinkwasser in entsprechender Menge zugegeben. Die Zubereitung des Antibiotikums für das Vermischen mit dem Trinkwasser folgt den gleichen Prinzipien wie die Formulierung von Tränken.
Die zweckmässigste Art, das Tier mit dem Antibiotikum zu behandeln, basiert auf die Formulierung in das Tierfutter.
Beliebige Tierfutter können dazu verwendet werden, z.B. übliche Trockenfutter, flüssige Futter und tablettierte Futter. Zur Herstellung eines medikierten Tierfutters wird üblicherweise zuvor eine konzentrierte Vormischung mit dem Antibiotikum hergestellt. Beispielsweise kann eine Vormischung von etwa 2 bis etwa 900 Gramm Antibiotikum pro Kilo Vormischung enthalten. Dieser weite Bereich ist durch den benötigten, weiten Konzen-
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trationsbereich für das fertige Futter bedingt. Vormischungen können sowohl in flüssiger als auch in fester Form vorliegen.
Wie oben gezeigt, bewirkt die orale Verabreichung des Antibiotikums eine vorteilhafte Aenderung der Erzeugung von Propionat im Verhältnis zu Acetat im Pansen. Es kann deshalb postuliert werden, dass die gleiche Behandlung ebenfalls monogastrische Tiere, die faseriges Pflanzenmaterial im Blinddarm vergären, günstig beeinflussen, denn es kann erwartet werden, dass eine vorteilhafte Veränderung im Propionat/Acetatverhältnis nach oraler Gabe des Antibiotikums auftreten wird. Pferde, Schweine und Kaninchen sind Beispiele von Tieren, welche ein Teil ihres Futters durch Fermentation im Blinddarm verdauen.
Das Antibiotikum X-14547 zeigt ebenfalls Wirksamkeit bei der Behandlung von erhöhtem Blutdruck in Warmblütlern.
Die ant!hypertensive Wirkung wird an Sprague Dawley (Charles River) männlichen Ratten zu 170-210 g getestet. DOCA-Na Hypertension wird erzeugt durch einseitige Nierenentfernung, gefolgt durch subkutane Implantation einer 25 rag Desoxycortikosteron (DOCA) Pille. Die Tiere werden in einzelne Käfige plaziert und erhalten 0,9% Natriumchloridlösung und Futter ad libidum. Nach zwei Wochen tritt Hypertension auf, d.h. systolischer Blutdruck von mindestens 150 mm Hg.
Der systolische Blutdruck und die Herzfrequenz werden indirekt vom Schwanz nicht-anästhesierter Ratten gemessen unter Verwendung eines pneumatischen Pulswandlers. Blutdruck und Herzfrequenz werden gemessen vor Verabreichung der Testsubstanz sowie 1, 3,6 und 24 Stunden nachher.
Die Ergebnisse werden sowohl absolut als auch prozentual (Aenderungen im Vergleich zur Kontrolle) ausgedrückt. 35
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TAG
KONTROLLEN VOR VERABREICHUNG
Tabelle 4
SYSTOLISCHER BLUTDRUCK (mmHg)
RATTE RATTE RATTE RATTE RATTE RATTE DURCH-12 3 4 5 6 SCHNITT
223 203
BLUTDRUCK 1 216 178 184
NACH DER
VERABREI		 2 211 2Ol 176
CHUNG (mmHg) 2 184 174 161
3 214 195 193
3 210 177 173
4 197 172 229
199 203 209 206.7
10 MG/KG x 3 Tage PO
198 151 203
168 168 19O
165 165 179
219 198 211
206 190 220
212 179 228
PROZENT AENDERUNG
188.3 - 9.0
185.7 -10.3
171.3 -17.1
205.0 - 0.7
196.0 - 5.2
202.8 - 1.7
KONTROLLEN VOR VERABREICHUNG
HERZFREQUENZ (SCHLAEGE/ MIN) NACH
VERABREICHUNG
HERZFREQUENZ (SCHLAEGE/MIN)
440 360 460 410 400 400 411.7
10 MG/KG x 3 Tage PO
1 48O 360 450 440 390 400
2 430 32O 36O 49O 370 43O
2 420 310 4OO 31O 380 45O
3 380 36O 360 360 370 350
3 370 360 350 360 380 370
4 370 320 36O . 350 340 4OO
420.0 2.0
400.0 - 2.6
378.3 - 8.1
363.3 -11.3
365.0 -1O.8
356.7 -13.1
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Das Antibiotikum X-14547 wird zur Verwendung als antihypertensives Mittel in für die orale Verabreichung geeigneten Dosierungsformen formuliert, wobei herkömmliche inerte pharmazeutische Hilfsmittel verwendet werden. Andere Dosierungsformen, z.B. parenterale Dosierungsformen sind möglich, jedoch nicht bevorzugt. Die oralen Dosierungsformen sind beispielsweise Tabletten, Kapseln, Dragees, Suspensionen, Lösungen und dergleichen. Als Hilfsmittel kommen sowohl anorganische als organische Hilfsmittel in Betracht, beispielsweise Gelatine, Albumin, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Konservierungsmittel (Stabilisatoren), Schmelzmittel, Emulgatoren, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes, Puffer etc.
Das antihypertensive Mittel wird im allgemeinen einmal oder zweimal pro Tag verabreicht.
Die oben erwähnten Dosierungsformen enthalten im allgemeinen 1-10 mg des Antibiotikums X-14547 pro Einheitsdosis. Die einem Patienten zu verabreichende Dosierung basiert auf dessen Gewicht sowie auf seinen Allgemeinzustand. Eine wirksame Dosierung kann deshalb nur unter Berücksichtigung des Urteils des Klinikers unter den vorherrschenden Umständen bestimmt werden.
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Beispiel 1 Gärung mit Streptomyces sp. X-14547
Der das Antibiotikum X-14547 erzeugende Mikroorganismus wird auf einer Amidex Agarschrägkultur folgender Zusammensetzung (g/l destilliertes Wasser) gezüchtet und aufbewahrt:
Amidex 10,0
N-Z Amine A 2,0
Fleischextrakt 1,0
Hefeextrakt 1,0
CoCl2.6H2O 0,02
Agar 20,0
Die Schrägkultur wird mit dem das Antibiotikum X-14547
erzeugenden Mikroorganismus beimpft und bei 28 C 7-10 Tage bebrütet. Ein Teil des Agars mit Sporen und Mycel der sporulierten Schrägkultur wird zur Beimpfung eines 6 1-Erlenmeyer-Kolbens mit 2 1 sterilisiertem Impfsubstrat folgender Zusammensetzung (g/l destilliertes Wasser) verwendet:
Tomatenmark 5,0
getrocknete Rück
stände aus der
Brennerei 5,0
Pepton 5,0
entbitterte Hefe 5,0
Maisstärke 20,0
CaCO3 1,0
K2HPO- (wasserfrei) 1,0
Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung auf 7 einge-
2 stellt; anschliessend wird 45 Minuten bei 1-1 1/2 kg/cm autoklaviert.
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Die beimpfte Nährlösung wird bei 28 0C 72 Stunden auf einer Schüttelmaschine (250 üpm; 5 cm Ausschlag) bebrütet.
Eine 4 1 Portion der erhaltenen Kultur wird zur Beimpfung von 230 1 Nährmedium folgender Zusammensetzung (g/l destilliertes Wasser) in einem 380 1 Fermenter verwendet:
Glucose 10,0
essbare Melasse 20,0
HySoy T 5,0
CaCO- 2,0
Der pH-Wert wird mit wässriger Natriumhydroxidlösung auf
7,2 eingestellt; änschliessend wird 1 1/4 Stunden mit Dampf
2
vom 4 kg/cm sterilisiert.
Das beimpfte Medium wird mit sterilisierter Druckluft von einer Geschwindigkeit von 9 l/min belüftet und mit einem Rührwerk (380 üpm) gerührt. Die Gärung wird bei 28°C 4-6 Tage durchgeführt.
Beispiel 2
Isolierung des Antibiotikums X-14547 und der Kometaboliten 3-Aethyl-l,3-dihydro-3-methoxy-2H-lndol-2-on und Pyrrol-2-carbonsäure
Stufe A. Die aus Beispiel 1 gewonnene Gärlösung (380 1) wird mit der gleichen Menge Aethylacetat versetzt. Nach 1-stündigem Rühren wird die Lösungsmittelschicht abgetrennt und unter vermindertem Druck auf 2 1 eingedampft. Der konzentrierte Extrakt wird dreimal mit gleichen Mengen wässriger 1-n Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem OeI konzentriert. Das erhaltene OeI wird in Diäthylather aufgelöst, wonach rohe Kristalle von Pyrrol-2-carbonsäure durch Filtration abgetrennt werden. Nach Umkristallisieren aus
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"X. J.
Aethanol/Aether erhält man reine Pyrrol-2-carbonsäure vom Schmelzpunkt 2O2-2O3°C.
Mikroanalyse: Berechnet für C5H5NO2 (111,10):
%C, 54,06; %H, 4,54; %N, 12,60 gefunden %C, 54,33; %H, 4,65; %N, 12,60.
Stufe B. Die Mutterlauge wird unter vermindertem Druck zu einem OeI konzentriert, in 250 ml Acetonitril aufgelöst und zweimal mit gleichen Mengen η-Hexan gewaschen. Die n-Hexan-Flüssigkeiten werden zusammengenommen und mit dem halben Volumen Methanol extrahiert. Der Methanol-Extrakt wird mit der Acetonitril-Lösung vereinigt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der zurückbleibende ölige Feststoff wird in Acetonitril aufgelöst. Nach dem Stehen bei etwa 3°C über Nacht erhält man nach Filtration kristallines Antibiotikum X-14547
als ein Hemihydrat vom Schmelzpunkt 137°C, [α] = -285° (c -in Chloroform).
Mikroanalyse: Berechnet für C31H43NO4^H2O)0 5 (502,70):
%C, 74,07; %H, 8,82;'%N, 2,78; %0, 14,32
Gefunden %C, 74,36; %H, 8,93; %N, 2,50; %0, 13,81.
Stufe C. Die Acetonitril-Mutterlauge wird zu einem öligen Feststoff konzentriert und an einer mit η-Hexan gepackten 600 g Kieselgel (Davison grade 62) Kolonne chromatographiert. Die Kolonne wird mit 250 ml η-Hexan und anschliessend mit einem Gradienten zwischen 1 Liter 2%igem Aethylacetat in η-Hexan bis 1 Liter Aethylacetat/n-Hexan (3:1) und anschliessend mit 500 ml Aethylacetat eluiert. 6 ml Fraktionen werden aufgefangen; durch Vereinigung der Fraktionen mit den Nrs. 100-200 und Eindampfen der Lösung unter vermindertem Druck erhält man zusätzliche Portionen des Antibiotikums X-14547. Aus den Fraktionen 201-290 erhält man nach dem Konzentrieren und Kristallisieren aus Acetonitril 3-Aethyl-l,3-dihydro-3-methoxy-2H-indol-2-on vom Schmelzpunkt 179°C.
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-iar-
' -j Mikroanalyse: Berechnet für C11H13NO3 (191,23):
%C, 69,09; %H, 6,85; %N, 7,33 Gefunden %C, 69,02; %H, 6,96; %N, 7,19.
Beispiel 3 Gärung in Grossfermenter
Der das Antibiotikum X-14547 erzeugende Mikroorganismus •jO wird an einer wie in Beispiel 1 beschriebenen Amidex Agarschrägkultur gezüchtet und aufbewahrt oder auch an einer Stärke/ Casein-Agarschrägkultur folgender Zusammensetzung (g/l destilliertes Wasser):
lösliche Stärke 10,0
Casein 1,0
K2HPO. (wasserfrei) 0,5
MgSO. (wasserfrei) 0,5
Agar 20,0
•Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt;
2 anschliessend wird 2O Minuten bei 1-1 1/2 kg/cm autoklaviert.
Die Schrägkultur wird mit dem das Antibiotikum X-14547 erzeugenden Mikroorganismus (Streptomyces sp. X-14547) beimpft und anschliessend bei 28°C 7-10 Tage bebrütet. Ein Stück Agar der so erhaltenen sporulierten Kultur wird nun zur Herstellung eines vegetativen Inoculums verwendet, indem man in einem 6 1 Erlenmeyerkolben mit 2 1 sterilisiertem Medium folgender Zusammensetzung (g/l destilliertes Wasser) beimpft:
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Tomatenmark 5,0
getrocknete lösliche
Rückstände aus der
Brennerei 5,0
OM Pepton 5,0
entbitterte Hefe 5,0
Maisstärke 20,0
CaCO3 1,0
K~ HPO- (wasserfrei) 1,0
Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt; anschliessend wird
2
bei 1-1 1/2 kg/cm 45 Minuten autoklaviert.
Das so beimpfte Nährmedium wird 72 Stunden bei 28°C be-15 brütet und unter Verwendung einer Schüttelmaschine (250 Upm; 5 cm Ausschlag).
4 1 dieser Kultur wird zur Beimpfung von 230 1 des folgenden Nährmediums in einem 380 1 Gärfass (g/l Leitungs-20 wasser) verwendet:
Tomatenmark 5,0
getrocknete lösliche
Rückstände aus der
Brennerei 5,0
OM Pepton 5,0
entbitterte Hefe 5,0
Maisstärke 20,0
CaCO3 1,0
K2HPO4 (wasserfrei) 1,0
Sag 4130 Schaumbe
kämpfungsmittel
(Union carbide) 0,1
35 Der pH-Wert des Nährmediums wird mit Natriumhydroxid auf
2 7,0 eingestellt; anschliessend wird 1 1/4 Stunden mit 4 kg/cm Wasserdampf sterilisiert.
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Das beimpfte Nährmedium wird mit Druckluft zu 9 l/min, belüftet und mit einem Rührwerk bei 280 Upm gerührt. Die Fermentation wird bei 28°C 43 Stunden durchgeführt.
19 1 der so erhaltenen Kultur wird zur Beimpfung von 1315 des folgenden Mediums in einem 3800 1 Grossfermenter (g/l Leitungswasser) verwendet:
Tomatenmark 5,0
getrocknete lösliche
Rückstände aus der
Brennerei 5,0
OM Pepton 5,0
entbitterte Hefe 5,0
Maisstärke 20,0
CaCO3 1,0
K2HPO4 (wasserfrei) 1,0
Sag 4130 Schaumbe
kämpfungsmittel
(Union carbide) 0,1
Der pH-Wert des Nährmediums wird mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt; anschliessend wird 1 1/4 Stunden mit Wasserdampf zu 4 kg/cm sterilisiert. 25
Das beimpfte Nährmedium wird mit Druckluft zu 9 l/min, belüftet und mit einem Rührwerk zu 280 Upm gerührt. Die Fermentation wird bei 28°C 118 Stunden durchgeführt.
Beispiel 4
Isolierung des Antibiotikums X-14547 und der Kometaboliten 3-Aethyl-l,3-dihydro-3-methoxy-2H-indol-2-on und Pyrrol-2-carbonsäure 35
Stufe A. Die ganze Gärlösung aus einer 1350 1 Fermentierung gemäss Beispiel 3 wird nach 118 Stunden Bebrütung mit
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der gleichen Menge Aethylacetat versetzt. Nach 1-stündigem Rühren wird die Lösungsmittelschicht abgetrennt und unter vermindertem Druck auf 7,25 1 eingedampft. Der konzentrierte Lösungsmittelextrakt wird mit 3 1 wässriger 1-n Salzsäure dreimal gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem OeI konzentriert. Dieses OeI wird in Diäthylather aufgelöst, wonach rohe Kristalle von Pyrrol-2-carbonsäure durch Filtration entfernt werden. Nach dem Umkristallisieren aus Aethanol/Aether erhält man reine Pyrrol-2-carbonsäure vom Schmelzpunkt 2O2-2O3°C.
Mikroanalyse: Berechnet für C5H5NO3 (111,10):
%C, 54,06; %H, 4,54; %N, 12,60 Gefunden %C, 54,33; %H, 4,65; %N, 12,60.
Stufe B. Die Mutterlauge wird unter vermindertem Druck
zu einem OeI konzentriert, in 1 Liter Acetonitril gelöst und zweimal mit der gleichen Menge η-Hexan gewaschen. Die n-Hexanflüssigkeiten werden vereinigt und mit der halben Menge Methanol extrahiert. Der Methanol-Extrakt wird mit dem Acetonitril-Extrakt vereinigt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der ölige Rückstand wird in Acetonitril gelöst; nach dem Stehen über Nacht bei etwa 3°C erhält man kristallines Antibiotikum X-14547 nach Filtration als ein Hemihydrat vom Schmelzpunkt 137°C, [σ]_ = -285° (c = 1 in Chloroform).
Mikroanalyse: Berechnet für C31H43NO^(H2O)0 5 (502,70):
%C, 74,07; %H, 8,82; %N, 2,78; %0, 14,32 Gefunden %C, 74,36; %H, 8,93; %N, 2,50;
%0, 13,81.
Stufe C. Die Acetonitril-Mutterlauge wird zu einem öligen Feststoff konzentriert und anschliessend an einer mit n-Hexan gepackten 600 g Kieselgel (Davison grade 62) Kolonne chromatographiert. Die Kolonne wird mit 1 Liter n-Hexan eluiert und anschliessend mit einem Gradienten zwischen
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4 1 2%igem Aethylacetat in η-Hexan bis 4 1 Aethylacetat/n-Hexan (3:1) und anschliessend mit 2 1 Aethylacetat eluiert. 25 ml Fraktionen werden aufgesammelt; aus den Fraktionen Nr. 100-200 erhält man nach dem Eindampfen unter vermindertem Druck zusätzliches Antibiotikum X-14547. Aus den Fraktionen 201-290 erhält man nach dem Konzentrieren und Kristallisieren aus Acetonitril 3-Aethyl-l,3-dihydro-3-methoxy-2H-indol-2-on vom Schmelzpunkt 179°C.
Mikroanalyse: Berechnet für C11H13NO3 (191,23):
%C, 69,09; %H, 6,85; %N, 7,33
Gefunden %C, 69,02; %H, 6,96; %N, 7,19.
Beispiel 5
Isolierung des Natriumsalzes des Antibiotikums X-14547
Die ganze Gärlösung einer anderen Fermentation wird mit dem halben Volumen Chloroform extrahiert. Die Lösungsmittelsch'icht wird abgetrennt, unter vermindertem Druck auf 2,35 1 eingedampft und anschliessend nacheinander mit gleichen Mengen wässriger Salzsäure, wässriger Natriumhydroxidlösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und zu einem OeI konzentriert. Dieses OeI wird in 2 Acetonitril gelöst und mit 2 1 η-Hexan gewaschen. Die Acetonitril-Phase wird zu einem OeI konzentriert und durch Kieselgel mit 4 1 Methylenchlorid und anschliessend mit 8 1 Methylenchlorid/Aceton (1:1) filtriert. Die biologisch aktiven Fraktionen werden an einer Kieselgelkolonne (hergestellt aus 300 g Kieselgel in Methylenchlorid) chromatographiert und mit einem Gradienten zwischen 7 1 Methylenchlorid und 7 1 Methylenchlorid/ Diäthyläther/ Aethanol (48:48:14) eluiert. Die Fraktionen Nr. 290-460 (je 25 ml) werden vereinigt und zu einem OeI konzentriert, Das erhaltene OeI wird in einer kleinen Menge Acetonitril gelöst. Nach Zugabe von η-Hexan erhält man das Natriumsalz des Antibiotikums X-14547 durch Filtration als ein weisses Pulver, das pro Mol Substanz 1 Mol η-Hexan enthält.
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•ι
Berechnet für C31H43N NaO41CgH14 (599,83):
%C, 74,09; %H, 9,08; %N, 2,34; %Na 3,83 Gefunden %C, 74,00; %H, 8,86; %N, 2,10; %Na 4,04.
Beispiel 6
Herstellung von Salzen des Antibiotikums X-14547.
a) Herstellung des Mono-N-Methylglukaminsalzes des Antibiotikums X-14547.
Eine Lösung von 0,395 g (2 mMol) N-Methylglukamin in Methanol/Wasser (3:1) wird mit einer Lösung von 0,986 g der freien Säureform des Antibiotikums X-14547 in Methylenchlorid/ Methanol (1:1) versetzt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und durch Zugabe von n-Hexan/Aethanol kristallisiert. Das erhaltene kristalline Methylglukaminsalz-hydrat des Antibiotikums X-14547 schmilzt bei 109-111° C.
b) Herstellung des Di-N-MethyIglukaminsalzes des Antibiotikums X-14547.
Eine Lösung von 1,580 g (8 mMol) N-Methylglukamin in Methanol/Wasser (2:1) wird mit einer Lösung von 1,972 g (4 mMol) der freien Säureform des Antibiotikums X-14547 in Methylenchlorid versetzt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und aus n-Hexan/Aethanol kristallisiert. Das erhaltene Di-N-Methylglukaminsalz-hydrat des Antibiotikums X-14547 schmilzt bei 80-120° C.
c) Herstellung des Calciumsalzes des Antibiotikums X-14547.
Eine Lösung von 0,50 g (1 mMol) der freien Säureform des Antibiotikums X-14547 in Aethylacetat wird mit 3 mMol einer wässrigen Calciumhydroxidlösung gewaschen. Die Lösung wird abgetrennt und unter vermindertem Druck eingedampft; Kristallisation erfolgt aus Aceton/Acetonitril. Das erhaltene kristalline
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' 1 Calciumsalz-heridhydrat des Antibiotikums X-14547 schmilzt bei
179°C, α£5 = -401° . (i% chloroform).
Beispiel 7
Herstellung des R-(+)-l-Amino-l-(4-bromphenyl)-äthansalzes
des Antibiotikums X-14547
Eine Lösung von 1,81 mg R-(+)-l-Amino-1-(4-bromphenyl)-äthan in Methylenchlorid wird mit einer Lösung von 4,93 mg (1 mMol) des Antibiotikums X-14547 in Methylenchlorid versetzt. Nach Zugabe von η-Hexan und langsames Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das Endprodukt in kristalliner Form. Nach dem Umkristallisieren aus Methylenchlorid/n-Hexan erhält man für Röntgenanalyse geeignete Kristalle des R-(+)-l-Amino-l-(4-bromphenyl)-äthansalzes des Antibiotikums X-14547 vom Schmelzpunkt 128-131°C.
Berechnet für C70H95BrN3O8 (1187,46):
%C, 70,70; %H, 8,15; %N, 3,54; %Br, 6,73 Gefunden %C, 70,96; %H, 8,30; %N, 3,68; %Br, 6,83.
Das kristalline Salz enthält pro Molekül des Amins zwei Moleküle des Antibiotikums X-14547. Daraus ergibt sich die zur Berechnung der Mikroanalyse verwendeten Formeln (analog dem Hemihydrat des Antibiotikums X-14547 in Beispiel 4).
Beispiel 8 Herstellung von Tabletten
pro Tablette
Antibiotikum X-14547 1,0 mg
wasserfreier Milchzucker 137,0 mg
Maisstärke 20,0 mg
mikrokristalline Cellulose 40,0 mg
Magnesiumstearat 2,0 mg
200,0 mg
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Der Wirkstoff wird mit einem Teil des Milchzuckers vorgemischt. Das Gemisch wird gemahlen und anschliessend 15 Minuten mit der Maisstärke, dem verbleibenden Milchzucker und der Cellulose gemischt. Das Geraisch wird gemahlen und anschliessend 2 Minuten mit dem Magnesiumstearat gemischt. Aus diesem Gemisch werden Tabletten zu 200 mg und von einem Durchmesser von 6 mm ausgestanzt. Die Tabletten können flach oder bikonvex sein und können erwünschtenfalls mit einer Bruchrille versehen werden.
Beispiel 9
Ein Tierfutter zur Verwendung gemäss der Erfindung hat z.B. folgende Zusammensetzung:
Gewichtsprozent
Gewichtsprozent auf Basis der Trockensubstanz
Mais, Silofutter Proteinzusatz Alfalfaheu 21,6 15,49 1O,7
gewalzter Trockenmais gewalztes Trockenkorn von Sorghum 70,7 3,72 80,0
Proteinzusatz Baumwollsamenmehl 7,7% 63,56 9,3%
Kalkstein 8,97
Salz (NaCl) 3,40
Spurenmineralien 0,11
Vitamin A-Vormischung 0,13
KCl 4r36
Χ-Γ4547 Vormischung (15 Gew.%) 0,26
100,0
X-14547
Reissamenhülsen
X-14547 Vormischung
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15 85
Nummer: Int. Cl.*: Anmeldetag: Offenlegungstag:
C 07 D 405/08
5. August 1977 9. Februar 1978
O O O
ο cn oo
in <5 rt NOtSSIHSNVm lN3Z<Wd
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Claims (15)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer neuen antibiotischen Substanz der Formel
• "CM H C2H5
und von pharmazeutisch verträglichen Salzen dieser Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces sp. X-14547, von welchem NRRL 8167 einen Stamm darstellt, in einem Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Nährstoffe und Mineralsalze enthaltenden Nährboden kultiviert, wonach man das erhaltene Antibiotikum der Formel I aus der Gärlösung isoliert und erwünschtenfalls das erhaltene Produkt in ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stamm von Streptomyces sp X-14547 NRRL 8167 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung von Streptomyces sp. X-14547 unter submersen, aeroben Bedingungen durchführt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung von Streptomyces sp. X-14547 in Gegenwart eines Schaumbekämpfungsmittels durchführt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung von Streptomyces sp. X-14547 bei einer Temperatur von 20° bis 35°C und bei einem im wesentlichen neutralen pH-Wert durchführt.
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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum der Formel I in der Weise isoliert, dass man die Gärlösung mit Aethylacetat extrahiert, das Lösungsmittel aus dem Extrakt entfernt, den Rückstand mit
5 wässriger Salzsäure wäscht und anschliessend mit Diäthyläther extrahiert, das Lösungsmittel aus dem Extrakt entfernt, den Rückstand in Acetonitril auflöst, die Acetonitril-Lösung mit η-Hexan wäscht, die n-Hexan-Waschflüssigkeiten mit Methanol wäscht, die Acetonitril- und Methanol-Lösungen vereinigt und
10 das Lösungsmittel entfernt, wobei nach Umkristallisieren aus Acetonitril reines Antibiotikum der Formel I erhalten wird.
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7. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum der Formel
CH
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon als wirksamen Bestandteil inerten, für die therapeutische Verabreichung geeigneten an sich in solchen Präparaten üblichen festen oder flüssigen Trägern zufügt.
8. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es das Antibiotikum der Formel
H3CX
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und einen Träger enthält.
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9. Verfahren zur Herstellung von Präparaten zur Erhöhung des Futternutzeffektes bei Wiederkäuern und bei monogastrischen Tieren, die faseriges Pflanzenmaterial im Blinddarm vergären, sowie auch Vormischungen zur Verwendung bei der Herstellung dieser Präparate durch entsprechende Verdünnung, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum der Formel
!3LX
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon mit einem nicht-toxischen, inerten Träger vermischt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als nicht-toxischen, inerten Träger ein Futtermittel verwendet.
11. Präparat zur Erhöhung des Futternutzeffektes bei Wiederkäuern und bei monogastrischen Tieren, die faseriges Pflanzenmaterial im Blinddarm vergären, sowie auch Vormischung zur Verwendung bei der Herstellung dieses Präparates durch entsprechende Verdünnung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Antibiotikum der Formel
H C2H5
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- ΊΑ -
s-
oder an einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon in Vermischung mit einem nicht-toxischen, inerten Träger.
12. Präparat bzw. Vormischung gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht-toxische inerte Träger ein Futtermittel darstellt.
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13. Neue antibiotische Substanz der Formel
und pharmazeutisch verträgliche Salze dieser Verbindung.
14. Mikroorganismen Spezies Streptomyces sp. X-14547,
15. Stamm NRRL 8167 aus Streptomyces sp. X-14547.
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