NO772766L - Nytt antibiotikum. - Google Patents

Description

Nytt antibiotikum

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny antibiotisk substans

med formelen

og farmasøytisk fordragelige salter derav. Dette antibiotikum har ionofore egenskaper og klassifiseres som et polyetergruppe-antibiotikum. Antibiotikumet med formel I og dets farmasøy-' tisk fordragelige salter er virksomme ved inhibering av vektsten til gram-positive bakterier og har anvendelse som et antihyper-tensivt middel og som en forbindelse for å bedre utnyttelsen av føde i rumen.

Antibiotikumet med formel I og dets farmasøytisk fordragelige salter fremstilles ifølge oppfinnelsen ved å kultivere mikro-organismens Streptomyces sp. X-14 547 hvorav den deponerte stamme NRRL 8167 inngår i en vandig karbohydratløsning som inneholder nitrogen-næringsstoffer og mineralsalter, deretter isolere antibiotikumet fra fermenteringsbrygget og om ønsket overføre det erholdte produkt i et farmasøytisk fordragelig salt derav.

Kjemisk kalles forbindelsen med formel I

a (R),5 (S)-dimetyl-6(R)-[l-etyl-4-[4-(R)-(2-p<y>rrol<y>l-karbon<y>l)!<->1 (S)-etyl-3a(R),4,5(R),7a(R)-tetrahydroindan-5-yl]-1(E), 3{E)-butadienyl)-tetrahydropyran-2-eddiksyre.

Organismen som prodserer antibiotikumet ifølge foreliggende oppfinnelse er en ny art som kalles Streptomyces sp. X-14547. En kultur av den levende organismen med laboratoriebetegnelsen X-14547 er deponert i U.S. Department of Agriculture, Agriculture Resarch Service, NRRL, Peoria, Illinois og føyet til den permanente samlingen av mikroorganisme som NRRL 8167. Kulturen er identifisert som en stamme av Streptomyces antibioticus.

Den nye mikroorganismen ble isolert fra en jordprøve samlet ved Martinsville, Virginia. Den representative stamme Streptomyces sp. X-14547 har følgende karakteristika:

Generelle karakteristika

Streptomyces X-14547 produserer et substratmycel som ikke fragmenterer i sporer og et luftmycel som danner rectus-flexibilis kjeder av sporer, og sporene har en glatt over-falte. Sporene er 1.26 til 1 42 p i lengde og 0.69 til 0.91 ja brede. Celleveggen innholder en isomer av diamino-pimelinsyre forskjellig fra mesoformen. Denne kjensgjerning samt ovennevnte koloni karakteristika plasserer denne kulturen i genus Streptomyces.

Vekst karakteristika

Standard ISP-mediumet som er beskrevet av Shirling and Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. System. Bacteriol., !L6, sidene 313-400, 1966 samt andre forskjellige media som anvendes for å karakterisere kulturen er

anført nedenunder:

ISP-1 til . ISP-9 er beskrevet av Shirling and Gottlieb i ovennevnte artikkel.

i i

Czapek-Dox agar : Czapek-Dox "brygg (BBL) hvortil ble satt 1.5% agar.

Bennetts agar: Gjærekstrakt, 0.1%, kjøttekstrakt, 0.1%, N-Z

amin A (kaseinhydrolysat fra Sheffield INC.), 0.2%, dekstrose 1%, agar 1.8%, pH 7.3.

.Sabouraud dekstrose agar: (Difco).

Thermoactinomyces fermenterings agar: Bacto Thermoactinomyces fermenteringsmedium (Difco) hvortil ble satt 1.5% agar.

ATCC-medium 5: Sporulerings agar: Gjærekstrakt 0.1%, kjøtt, -ekstrakt 0.1%, tryptose 0.2%, FeS04spor, dekstrose 1%, agar 1.5%, pH 7.2.

Amidex agar: Amidex (Corn Products Co., Decatur, 111.),

1%, N-Z amin A 0.2% kjøttekstrak 0.1%, gjærekstrakt 0.1%, CaCl2.2H20 0.0014%, agar 2%, pH 7.3.

Stivelse/kasein agar: oppløslig i stivelse 1%, kasein 0.1%., I^HPO^0.05%, MgS04 0.05%, agar 1.5%, pH 7.4

Tabell I nedenfor beskriver vekstmengden, sporeleringsgraden, spormasse.farge og fargen av det rever se substrat mycelet. Agar-plater ble avlest etter 14 dagers inkubering ved 28°C. Det anvendte fargeskjema var Color Harmony Manual Fourth eddition, 1958 (Container Corp. of America). Ifølge R.E. Buchanan og N.E. Gibbons, Bergeys Nanual of Deter-minative Bacteriology, 8. utgave, 1974, Williams and Wilkins Co. Baltimore, Md. er kultur X-14547 liknende hittil kjent Sprep-tomyces antibiotucus, men i sammenlikning var det forskjell i forbruk av L-arabinose, melaninproduksjon på ISP-7 og produksjon av nitrat. Kulturen X-14547 er fremdeles tilstrek-kelig lik Stremtomyces antibioticus som er tidligere kjent til å berettige klassifiseringen av den som en stamme av Streptomyces antibioticus.

Den arten X-14547 som er beskrevet heri omfatter alle Streptomyces-stammer som danner en forbindelse med formel I og som ikke kan klart adskilles fra kulturnummeret X 14547 og dens underkulturer inklusive mutanter og varianter. Forbindelse med formel I er her definert og etter at dene identifika-sjonen er kjent, er det lett å adskille stammer som fremstiller en forbindelse med formel I fra andre.

I

I

<i>streptomyces sp. X-14547 produserer ved dyrkning under egnede betingelser en forbindelse:med formel I. Et fermenterings-brygg som inneholder Streptomyces sp. X-14547 fremstilles ved å inokulere sporer eller mucel av den organiske som fremstiller forbinelse med formel I i et egnet medium og så dyrkes under aerobe betingelser. For fremstillingen av en forbindelse med formel I er dyrking på et fast medium mulig, men for en fremstilling i stor skala er et flytende medium å foretrekke. Dyrkningstemperaturen kan varieres • over et vidt område, 20° -

35°C, innen hvilket organismen kan vokse, men en temperatur på

26 - 30°C og en hovedsaklig nøytral pH foretrekkes. I den

aerobedypfermenteringen av organismen for fremstilling av organismen -for fremstilling av en forbinelser med formel I

kan mediumet inneholde som karbonkilde en kommersielt til-gjengelig glyceridolje eller et karbohydrat som glycerin, glukose, maltose laktose, dextrin, stivelse og etc. i ren eller rå tilstand og som nitrogenkilde et organiske materiale som-soyabønnemel, "distillers<1>solubles", peanøttmel, bomullsfrø-mel, kjøttekstrakt, pepton, fiskemel, gjørekstrakt, maisstøp-væske osv. og når ønsket uorganiske nitrogenkilder som nitrater og ammoniumssalter. Tilstedeværende mineralsalter er f. eks. ammoniumsulfat, magnesiumsulfat, natriumklorid, kaliumklorid, kaliumfosfat, kaliumkarbonat og spormengder .av tung metall-salter. Mediumet kan også inneholde puffermidler som natrium-citrat eller fosfater. I lufttilførte dypkultur-metoder fore-tekkkes å. bruke et anti-skum-middel som flytende parafin, fett-oljer eller silikonforbinelser. Mer enn en type karbonkilde, nitrogenkilde eller anti-skum-kilde kan anvendes for fremstilling av en forbindelse med formel I.

Etter avslutting av fermenteringen kan antibiotikum X-14547 eller dens salter derav utvinnes fra .fermenteringsmediumet. Dette kan oppnås ved flere metoder, f. eks. ved løsnings-middelekstraksjon av hele fermenteringsbrygget eller ved filtrering av hele brygget og ekstraksjon av mycelcellene med egnet løsningsmiddel. Løsningsmiddelet som er egnet for ekstraksjon av mycelceller er aceton, tetrahydrofuran, dimetyl-sulfoksyd eller blånede løsningsmidler som metylen-klorid-metanol Tabell 2 nedenunder viser de morfologiske og fysiologiske karakteristika av Streptomyces sp. X-14547.

I

I j !eller etyl-acetat-etanol. Løsningsmidler som generelt er egnet for løsningsmiddel-ekstraksjons teknikk er kloroform, halogenert løsningsmidler som metylenklorid, eter-løsningsmidler, etyl eller acetat. Den endelige krystallisering kan utføres ved å anvende f. eks. etyl acetat, butyl acetat, metylen klorid eller kloroform som løsningsmiddel for krystalliseringen

Antibiotikum 14547A danner flere farmasøytisk fordragelige salter. Disse saltene fremstilles fra den frie syreformen av antibiotikumet ved velkjente metoder innen området, f. eks. ved å vaske den frie syren i løsning med en egnet base eller salt. Eksempel på slike farmasøytisk fordragelige basis substanser som er i stand til å danne salter for formålet ved foreliggende oppfinnesle er alkalimetall-baser som natriumhydroksyd, kalium-hydroksyd, litiumhydroksyd og likn., jordalkaline-metallbaser som kalsiumhydroksyd, bariumhydroksy og likn., og ammonium-hydroksyd. Alkalimetall eller jordalkalinmetall-salter som

er egnet for å danne farmasøytisk fordraglige salter kan være anioner som karbonater, bikarbonater og sulfater.

De følgende fysikalske karakteristika for antibiotikum X-145457 er:

De infrrøde absorpsjonsspektrum for antibiotikum X-14547 i

en KBr-skive er vist i figur 1. Antibiotikumet viser karak-teristiske absorpsjoner i det infrarøde området i spekteret

ved følgende frekvens som er uttrykket i resiproke centimeter: Topper opptrådte inter alia ved 3140 (OH), 2470-2400 (karboksyl OH) , 1735, 1710 (C=0), 1650 (konjugert C=0) og 1627 cm<-1>(konjugert C=C).

Antibiotikum X-14547 viser en oral toksisitet (LD^q) hos mus på 129 mg pr. kg (24 timer).

Antibiotikum X-14547 har antimikrobisk aktivitet mot flere gram positive bakterier og mycobakterium som vist i tabell 3 nedenunder.

i i

Det er også funnet og må betraktes som en del av foreliggende oppfinnelse at den nye 3-etyl-l,3-dihydro-3-metoksy-2H-indol-2-on co-metabolit også har anti-mikrobisk aktivitet mot flere mikroorganismer som anført i tabell 4 nedenunder.

Som ovenfor angitt har antibiotikum X-14547 og dets salter sammen med dets co-metabolit 3-etyl-l,3-dihydro-3-metoksy-2H-indol-2-on den egenskap at de nedsetter veksten av disse

i

<I>gram-positive bakterier. De er anvendelige i vaskeløsninger for sanitære formål og i vask av hender og rensning av utstyr, gulver og inventar i kontaminerte rom eller laboratorier.

Antibiotikum X-14547 har også funnet å bedre opptak av føde i rumen, dvs. å forbedre fordøyelseseffektiviteten hos visse drøvtyggende dyr, f.eks. fe. En omtale av mekanismen hvorved føden fordøyes, nedbrytes og metaboliseres i et rumendyr kan finnes i U.S. patent nr. 3,83 9,557 som omfatter bruk av visse antibiotika i å forbedre rumenføde-utnyttelsen og refereres herved dertil. Økomonisk-viktige rumendyr er fe, sauer og gjeiter.

Effektiviteten av antibiotikum X-14547 ved modifisering-av forholdet av flyktige fettsyrer som dannes i rumen (og der-

ved forbedre rumentilførsels-utnyttelsen) demonstreres ved hjelp av det følgende in vitro forsøk.

Rumenvæske erholdes fra en stut med en fistulert rumen. Stuten holdes på følgende rasjon:

Rumenvæsken kjøres umiddelbart gjennom en 3 0 mesh sikt. For hver fermentering tilsettes 7 5 ml av den resulterende væsken til en 250 ml væske som inneholder følgende: i

.lg 80% - 20% finmalt korn: høyt forhold

I

1 ml 18% vandig glukoseløsning

(1 millimol pr. flaske),

1.5 ml 3.1% vandig urealøsning

(0.76 millimol pr. flaske),

60 mikromol av hver av de 10 essensielle

aminosyrer (arginin, histidin, leucin,

metionin, treonin, valin, lysin,

isoleucin, fenylalanin, tryptofan),

1 ml av en vånding løsning av en forsøks-

droge for å gi enten 10 eller 25 ug pr. ml (beregnet totalvolum av fermenteringsbland-

ing 80 ml).

Hver flaske inkuberes ved 38°C på et rystende vannbad utstyrt med en gasshette. Karbondioksyd kjøres kontinuerlig gjennom hetten. Etter 4 timers inkubasjon sentrifugeres en 10 ml-mengde av fermenteringsvæsken ved 14,000 rpm (omtrent 30.000

g) i 20 minutter. Tre ml av supernantanten settes til 1 ml 25% metafosforsyre-løsning som inneholder 23 mikromol 2-metyl

valereansyre som intern standard. Den resulterende væsken

får sette seg ved romtempratur i 30 minutter. Væsken filt-reres gjennom et 0.22 millimikron millipor-filter og kjøles til gassvæske kromatografisk analyse for flyktige fettsyrer.

Gass-væske kromatografisk (GLC) analyse av fire in vitro kontrollfermenteringer og to fermenteringer hver med 10

og 25 ppm antibiotikum X-14547 er oppstilt i følgende tabell.

Molforhol av propionat (C^) til acetat (C2) pluss n-butyrat (nC^) i in vitro rumenferraenteringer

Som vist i ovenstående tabell er forholdet av propionat (C^)'til acetater og n-butyrater betrakelig forbedret. Ved økningen av propionatene fremfor acetaene fra karbohydratene økes effektiviteten av karbohydrat og derfor næringsutnyttelsen.

Administrering av antibiotikum X-14 547 (heretter "antibiotikum" eller "antibiotisk forbindelse") forhindrer og kurerer ketoser som forbedrer næringsutnyttelsen. Ketosens kausale mekanisme er en defekt produksjon av propionatforbindelser.

En behandling som anbefales i øyeblikket er administrering av propinosyrer eller næring som fortrinnsvis gir propionater. Det er åpenbart at stimmulering av propionatproduksjonen fra ordinær næring vil redusere ketosesykdom.

Det er funnet at antibiotikum X-14547 øker virkningen av

næringsutnyttelse hos rumendyr ved oral administrering til

I dyr. Den letteste veien å gi antibiotikumet er å blande med dyrets næring.

Imidlertid kan antibiotikumet også gis på andre måter. For eksempel kan det innbygges i tabletter, dragéer, store piller eller kapsler og doseres til dyrene. Formuleringen av antibiotikumforbindelsen i slike forbindelser i slike doseringsformer kan gjøres ved hjelp av velkjente metoder på det veterinærfarmasøytiske området.

Kapsler fremstilles lett ved å fylle gelatinkapsler med enhver form av det ønskede antibiotikum. Om ønsket kan antibiotikumet fortynnes med et inert pulverisert fortynningsmiddel som et sukker, stivelse eller renset krystallinsk cellulose -for å øke dets volum for å lette fyllingen av kapslene.

Tabletter av antibiotikumet fremstilles ved konvensjonelle farmasøytiske prosesser. I tillegg til den aktive bestanddel inneholder en tablett normalt en base, et sprengmiddel, en absorbent , et bindelmiddel og et smøremiddel. Typiske baser er laktose, fintknust sukker, natriumklorid, stivelse og mannitol. Stivelse er også et godt sprengmiddel liksom alginsyre. Overflateaktive midler som natriumlauryl-sulfat og dioktyl-natrium sulfosuccinat anvendes også noen ganger. Vanlig brukte absorbenter er igjen stivelse, laktose, mens magnesiumkarbonat er anvendelig for oljeaktige substanser. Hyppig anvendte bindemidler er gelatin, gummi, stivelse, dextrin og forskjellige cellulosederivater. Blant vandig brukte smøremidler er magnesiumsearat, talkum, parafinvoks, forskjellig metalliske såper og polyetylen glykol.

Administrering av den antibiotiske forbindelsen kan være som en langsomtavgivende stor pille. Slike store piller lages som tabletter, bortsett fra at midler for å forsinke opp-løsningen av antibiotikumet foreligger. Store piller lages for å avgi over lengere perioder. Den langsomme oppløsning oppnås ved å velge en sterk vannuløslig form av antibiotikumet. En substans som jernspon tilsettes for å øke de store pillenes densitet og stadig holde den på bunnen av rumen.

Oppløsning av antibiotikumet forsinkes ved å bruke en matrise av uløsDige materialer hvori drogen er innbeddet. For eksempel er substanser som vegatabilske vokser, rensede minerale vokser og vannuløslige polymermaterialer anvendelige.

Dragéer av antibiotikumet fremstilles lettest ved å velge en vannløslig form av antibiotikumet. Hvis en uløslig form er ønsket av noen grunn, kan en suspensjon fremstilles. Alter- . nativt kan en dosering formuleres som en løsning i et fyso-logise fordragelig løsningsmiddel slik som en polyetylen-glyckol.

Suspensjoner av uløselige former av antibiotikumet kan frem-- stilles i- ikke-oppløsningsmidler som vegatabilske oljer slik som peanøtt, mais eller sesamolje, i en glykol som propylen-glykol eller en polyetylen-glykol eller i vann avhengig av formen som velges av antibiotikumet.

Egnede fysologisk fordragelige hjelpemidler er nødvendige for å holde antibiotikumet suspendert. Hjelpestoffene kan velges blant fortykkningsmidler som karboksymetylcellulose, poly-vinylpyrrolidon, gelatin og alginatene. Mange klasser overflateaktive midler tjener til å suspendere.antibiotikumet. For eksempel er lecitin, alkylfenol/polyetylenoksyd-addukter, naftalensulfonater, alkylbenzensulfonater og polyoksyetylen-sorbitanéstere anvendelige for å lage suspensjoner i flytende ikke-løsningsmidler.

I tillegg kan mange substanser som påvirker hydrofilisiteten, densiteten og overflatespenningen på væsken hjelpe fremstillingen av suspensjonene i enkelte tilfeller. Som eksempel kan silikon antiskum-midler, glykoler, sorbitol og sukkere være anvendelige suspensjonsmidler.

Det suspenderbare antibiotikum kan gis avleren som en suspensjon eller som en tørrblanding av antibiotikumet og hjelpestoffer som skal fortynnes før bruk.

i

Antibiotikumet kan også administreres i drikkevannet til drøvtyggerne. Iblandning i drikkevannet oppnås ved å til-sette en vannløslig eller en vann-suspenderbar form av antibiotikumet til vannet i passende mengde. Formuleringen av antibiotikumet for tilsetting til drikkevann følger de sam-me prinsipper som formuleringer av doseringer.

Den mest praktiske måten å behandle dyr med den antibiotiske forbindelsen er ved formulering av forbindelsen i nærings-tilførselen. Enhver type næring kan tilsettes de antibiotiske forbindelsene så som vanlige tørre næringsstoffer, flytende næringsstoffer og pelleterte næringsstoffer i - Metodene -for å formulere drogene i dyrenæringer er velkjente. Det er vanlig å lage en konsentrert droge forblanding som et råmateriale for medikerte næringer. For eksempel kan en typisk droge forblanding inneholde fra rundt 1 til 400 gram droge pr. pund forblanding. Det brede forholdet kommer av det brede konsentrasjonstallet av drogen som kan være ønskelig i den endelige næringen. Forblandinger kan være enten flytende eller faste.

Formuleringen av rumennæringer som inneholder de riktige mengder av antibiotikumet for hensiktsmessig behandling er åpenbar. Det er bare nødvendig å beregne den mengde av forbindelsen som er ønsket og gi hvert dyr, tar i betrakt-ning den mengde næring pr. dag som dyret eter og konsentrasjonen av antibiotikumforbindelsen i forblandingen som brukes og kalkulere den riktige konsentrasjonen av den antibiotiske forbindelsen eller forblandingen i næringen.

Alle formuleringsmetodene, blanding, og pelletering av næringer som normalt brukes ved rumenføde er helt velegnet forfremstilling av næring som inneholder.-den antibiotiske forbindelsen.

Som det er vist endrer oral administrering av antibiotikumet fordelaktig produksjonen av propionater i forhold til pro-

i

duksjonen av acetater i rumen. Det kan derfor postuleres at den ^amme behandling også vil være fordelaktig på enmavede • dyr som fermenterer vegetablisk fibermateriale i cecum da det ville ventes at den fordelaktig forandring i propionat/ acetat-forholdet ville opptre etter oraladministrering av det foreliggende antibiotikumet. Hester, svin og kaniner er eksempler på dyr som fordøyer en del av føden ved cecal fermentering.

Antibiotikum X-14547 viser også aktivitet i behandlingen av hypertensjon i varmblodsdyr.

Antihypertensiv virkning undersøkes i Sprague Dawley ( -harles River) hannrotter med vekt på 170 - 210 gram. DOCA-Na hypertensjon fremkalles ved unilateral nefrektomy fulge av subkutan implantasjon av en 25 mg desokdykortikosteron (DOCA) pellet. Dyr plasseres i inviduelle bur og får 0.9% natriumklorid-løsning og rotte chow diet ad libitum. To uker får gå fra operasjonstiden for utvikling av hypertensjon, dvs. systolisk blodtrykk på minst 150 mm Hg.

Systolisk blodtrykk og hjertehastighet måles indirekte fra halen til unanesteserte rotter ved bruk av- en pneumatisk pulstranducer. Kontroll-avlesninger tas før drogegivning og ved 1, 3, 6 og 24 timer etter drogegivning.

Resultatene er uttrykt som absolutte verdier og prosentfor-andring fra kontroller.

For bruk som et anti-hypertensiv middel formuleres antibiotikum X-14547 ved bruk av konvensjonelle inerte farmasøytiske hjelpe-materialer i doseringsformer som er.egnet for oral administrering. Andre doseringsformer, for eksempel parenteral er mulig men foretrekkes ikke. De orale doseringsformene er tabletter, kapsler, drogéer, suspensjoner, løsninger og liknende. Identiteten av de inerte hjelpematerialene som anvendes i formuleringen av de aktive bestanddeler til orale .

doseringsformer er åpenbare for fagmannen. Disse hjelpe-

I

materialene, enten av uorganisk eller organisk natur er for eksempel gelatin, albumin, laktose, stivelse, magnesium.-stearat, preservativer (stabilisatorer), smeltemidler, emul-ger ingsmidler , salter for endring av osmotisk trykk, puffere etc. som kan være innført om ønsket i slike formuleringer.

Generelt gis drogen en eller to ganger om dagen.

Mengden av antibiotikum X-14 547 som er tilstede i hver av de ovenfor beskrevne doseringsformer varierer generelt fra 1-10 mg pr. enhet dosering. Doseringen som gis en spesiell pasient er variabel, basert på pasientens vekt og pasientens tilstand. En effektiv doseringsmengde av aktivt middel kan derfor bare - bestemmes ut fra legens bedømmelse av pasientens tilstand.

Følgende eksempler vil tjene til å illustrere oppfinnelsen uten å være begrenset til denne.

EKSEMPEL 1

Tankfermentering

Antibiotikum X-14547 .produserende kultur dyrkes og holdes på en "Amidex"-agarplate med følgende sammensetning (gram/liter destillert vann):

Platen inokuleres med antibiotikum X-14547 produserende kultur og inkuberes ved 28°C i 7-10 dager. En dråpe av agaren som inneholder sporer og mycel fra den sporulerte kulturen benyttes så for å inokulere en 6-liters Erlenmeyer-flaske som inneholder 2 liter sterilisert inokulum-medium med følgende sammensetning (gram/liter destillert vann):

pH justeres til 7 med NaOH før autoklavering ved 6,7 5 - 9 kg trykk i 45 minutter.

Det inokulerte inokulumsmedium inkuberes ved 28°C i 72 timer på en roterende rystemaskin som opererer ved 250 omdreininger pr. minutt med et 5 cm's lag.

En 4-liters porsjon av den resulterende kulturen brukes så for

å inokulere 23,7 dekaliter i en 37,8 dekaliters fermentor med følgende komposisjon (gram/liter destillert vann):

pH justeres til 7,2 med NaOH for sterilisering i 1 1/4 time med 4,1 atm. damp.

Det inokulerte medium luftes så med sterilisert trykkluft, 85 dm<3>pr. minutt og røres med rørerverk med 280 omdreininger pr. minutt. Fermenteringen utføres ved 28°G i 4-6 dager.

EKSEMPEL 2

Isolering av antibiotikum X- 14547 og ko- metabolitter 3- etyl- l, 3-dihydro- 3- metoksy- 2H- indol- 2- on og pyrrol- 2- karboksylsyre

Trinn A. Til det totale brygg fra en 380 liters fermentering slik som angitt i eksempel 1 ble, etter 4-6 dagers vekst- et likt volum etylacetat tilsatt. Etter omrøring i 1 time ble oppløs-ningsmiddellaget separert og konsentrert til 2 liter under redusert trykk. Det konsentrerte oppløsningsmiddelekstrakt ble vasket med like volumer IN HC1 3 ganger. Oppløsningsmidlet ble tørket over vannfritt Na2S04og konsentrert til en olje under redusert trykk. Oljen ble oppløst i dietyleter og rå pyrrol-2-karboksylsyrekrystaller ble skilt fra ved filtrering. Omkrystallisasjon fra etanol/eter ga den analytiske prøve på forbindelsen foran: smp. 202-203°C.

Mikroanalyse: Beregnet for C^H^N02(.111,10):

%C, 54,06; %H, 4,54; %N, 12,60.

Funnet: %C, 54,33; %H, 4,65; %N, 12,60.

Trinn B. Modervæsken ble konsentrert til en olje under redusert trykk, gjenoppløst i 250 ml acetonitril og vasket to ganger med like volum n-heksan. n-heksanvaskevæskene ble slått sammen og ekstrahert med 1/2 volum metanol. Metanolekstraktet ble slått sammen med acetonitril og oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Det oljeaktige faste stoff ble oppløst i acetonitril og etter kjøling til tilnærmet 3°C over natten ble krystallinsk

i

antibiotikum X-14547 utvunnet etter filtrering som et hemihydrat, smp. 137°C [ct]D-285° (C, 1 i CHC13).

Mikroanalyse: Beregnet for C3]_H43N04 • (H2°) o 5 (502»70): %C, 74,07; %H, 8,82; %N, 2,78; %0;

14,32.

Funnet: %C, 74,36; %H, 8.93; %N, 2,50; %0, 13,81. ' r

Trinn C. Acetonitril-modervæsken ble konsentrert til et oljeak-tig fast stoff og utsatt for kromatografi på en 600 g's silikagel (Davison grade 62) kolonne pakket med n-heksanoppslemning. Kolonnen ble eluert med 250 ml n-heksan og derpå en gradient mellom liter 2%'"s etylacetat i n-heksan til 1 liter etylacetat n-heksan (3:1) og derpå 500 ml etylacetat. Fraksjoner på 6 ml hver ble samlet opp, og fra fraksjonsnummer 100 til 200, etterfølgende fjerning av oppløsningsmidlet under redusert trykk, ble ytterligere antibiotikum X-14547 utvunnet. Fra fraksjoner 201 til 290, etter konsentrasjon og krystallisasjon fra acetonitril, ble 3-etyl-1,3-dihydro-3-metoksy-2H-indol-2-on utvunnet, smp. 179°C.

Mikroanalyse: Beregnet for C11H1^N02(191,23): %C, 69,09; %H, 6,85; %N, 7,33. Funnet: %C, 69,02; %H, 6,96; %N, 7,19.

EKSEMPEL 3

Tankfermentering

Antibiotikum X-14547 produserende kultur dyrkes og holdes på en "Amidex"-agarplate slik som beskrevet i eksempel 1 eller på en stivelse-kasein-agarplate med følgende sammensetning:

Juster pH til 7,4 med NaOH før autoklavering

ved 1,05 - 1,40 i 20 minutter.

Platen inokuleres med antibiotikum X-14547 produserende kultur (Streptomyces sp. X-14547) og inkuberes ved 28°C i 7-10 dager.

En dråpe av agaren som inneholder sporer anvendes deretter for

å fremstille vegetativt inokulum ved å inokulere en 6-liters

Erlenmeyer-flaske som inneholder 2 liter sterilisert inokulum-medium med den følgende sammensetning (gram/liter destillert vann):

pH justeres til 7,0 før autoklavering ved 1,04-1,40 kg/cm<2>i 40-45 minutter. i Det inokulerte inokulummedium inkuberes i 72 timer ved 28°C på en roterende rysteanordning som arbeider med 250 omdreininger med et 5 cm's lag. 4 liter av denne kultur anvendes for å inokulere 23,7 dekaliter i en 37,8 dekaliters fermentor (gram/liter ledningsvann):

pH for mediet justeres til 7,0 med NaOH før steri-fisering i 1 1/4 time med et damptrykk på 4,20 kg/cm 2..

D' et inokulerte medium luftes med trykkluft, 85 dm 3 pr. minutt og røres med rørerverk med 280 omdreininger pr. minutt. Fermenteringen utføres ved 28°C i 4 3 timer.

18,9 liter av denne kultur anvendes for å inokulere 132,5

liter av det følgende medium i en 380 liters beholder (gram/liter ledningsvann):

pH for mediet justeres til 7,0 med NaOH før sterilisering i 1 1/4 time med et damptrykk på 4,20 kg/cm<2>.

Det inokulerte medium luftes med trykkluft, 85 dm 3 pr. minutt og røres med rørerverk med 280 omdreininger pr.-minutt. Fermenteringen utføres ved 28°C i 118 timer.

EKSEMPEL 4

Isolering av antibotikum X- 14547 og ko- metabolitter 3- etyl-1, 3- dihydro- 3- metoksy- 2H- indol- 2- on og pyrrol- 2- karboksylsyre

Trinn A. Til det totale brygg fra en B50 liters fermentering slik som angitt i eksempel 2 ble, etter 118 timers dyrkning, et likt volum etylacetat tilsatt. Etter omrøring i 1 time ble opp-løsningsmiddellaget skilt fra og konsentrert til 7,25 liter under rédusert trykk. Det konsentrerte oppløsningsmiddelekstrakt ble vasket med 3 liter IN HC1 tre ganger. Oppløsningsmidlet ble tør-ket over vannfritt Na2S04 og konsentrert til en olje under redusert trykk. Oljen ble oppløst i dietyleter og rå pyrrol-2-karboksylsyrekrystaller ble skilt fra ved filtrering. Omkrystal-llisasjon fra etanol/eter ga den analytiske prøve for den foran-| nevnte forbindelse: smp. 202-203°C. I

Mikroanalyse: Beregnet for C5H5N02(111,10):

%C, 54,06; %H, 4,54; %N, 12,60. Funnet: %C, 54,33; %H, 4,65; %N, 12,60.

Trinn B. Modervæsken ble konsentrert til en olje under redusert trykk, gjenoppløst i 1 liter acetonitril og vasket to ganger med like volum n-heksan-., n-heksan-vaskevæskene ble slått sammen og ekstrahert med 1/2 volum metanol. Metanolekstraktet ble slått sammen med acetonitrillet og oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Det oljeaktige faste stoff ble oppløst i acetonitril og etter avkjøling til tilnærmet 3°C over natten ble krystallinsk antibiotikum X-14547 utvunnet etter filtrering som et hemihydrat, smp. 137°C, [a]D-285° (C, 1 i CHC13).

Mikroanalyse: Beregnet for C3]_H43N04'(H2°^o s^502'70)5

%C, 74,07; %H, 8,82; %N, 2,78; %0, 14,32.

Funnet: %C, 74,36; %H, 8,93; %N, 2,50;

%0, 13,81.

Trinn C. Acetonitril-modervæsken ble konsentrert til et olje-aktig faststoff og utsatt for kromatografi på en 600 g's silikagel- (Davison grade 62) kolonne pakket med en n-heksan oppslemning. Kolonnen ble eluert med 1 liter n-heksan og deretter en gradient mellom 4 liter 2% etylacetat i n-heksan til 4 liter etyl-acetat n-heksan (3:1) og derpå 2 liter etylacetat. Fraksjoner på hver 25 ml ble samlet opp, og fra fraksjon nummer 100,til 200, etter at oppløsningsmidlet er blitt fjernet under redusert trykk, ble ytterligere antibiotikum X-14547 utvunnet. Fra frasjoner 201 til 290, etter konsentrasjon og krystallisasjon fra acetonitril, ble 3-etyl-l,3-dihydro-3-metoksy-2H-indol-2-on utvunnet, smp. 179°C.

Mikroanalyse: Beregnet for cii.H13N02 (191,23):

%C, 69,09; %H, 6,85; %N, 7,33.

i Funnet: %C, 69,02} %H, 6,96; %N, 7,19.

EKSEMPEL 5

Isolering av natriumsaltet av antibiotikum X- 14547

Det totale brygg fra et annet fermenteringsforsøk ble ekstrahert med et 1/2 volum derav kloroform. Oppløsningsmiddellaget ble skilt fra og konsentrert under redusert trykk til 2,35 liter og

vasket suksessivt med like volumer IN HC1, IN NaOH og vann. Opp-løsningsmidlet ble tørket over Na2S04og konsentrert til en olje.

Oljen ble gjenoppløst i 2 liter acetonitril og vasket med 2 liter n-heksan. Acetonitrillet ble konsentrert til en olje og filtrert

gjennom 970 g silikagel med 4 liter metylenklorid og deretter 8 liter metylenklorid-aceton (1:1). Den biologisk aktive fraksjon ble kromatografert på en silikagelkolonne pakket med en 300 g's oppslemning (metylenklorid) og eluert med en tiltagende gradient på 7 liter metylenklorid og 7 liter metylenklorid-dietyleter-etanol (48:48:14). Fraksjoner nummerert 290-460 ( 25 ml.hver) ble slått sammen og konsentrert til en olje. Oljen ble oppløst i en liten mengde acetonitril, og ble med tilsetningen av n-heksan natriumsaltet av antibiotikum X-14547 utvunnet ved filtrering som et hvitt pulver som inneholder 1 mol n-heksan pr, mol forbindelse.

Beregnet for C,,H„<0N>NaO,.C^H,. (599,83):

314 2 4 6 14 . ■ >■>

%C, 74,09; %H, 9,08; %N, 2,34; %Na 3,83.

Funnet: %C, 74,00; %H, 8,86; %N, 2,10; %Na, 4,04.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av salter av antibiotikum X- 14547

A. Fremstilling av mono-N-metyl-glukaminsaltet av antibiotikum X-14547

En oppløsning av 0,986 g av den frie syreform for antibiotikum X-14547 i metylenklorid-metanol (1:1) ble tilsatt til en oppløs-ning av 0,395 g (2 mm) N-metylglukamin i métanol-vann (3:1). Opp-løsningen ble konsentrert under redusert trykk til et pulver som ble krystallisert ved tilsetning av n-heksan-etanol. Det krystallinske antibiotikum X-14547 N-metyl-glukaminsalthydrat som ble pppnådd hadde et smeltepunkt på 109-111°C.

B.Fremstilling av di-N-metylglukaminsaltet av antibiotikum X-14547

En oppløsning av 1,972 g (4 mm) av den frie syreform av antibiotikum X-14547 i metylenklorid ble tilsatt til en oppløsning av 1,580 g.(8 mm) N-metylglukamin i metanol-vann (2:1). Oppløsnin-gen ble konsentrert under redusert trykk til et pulver, og krystallisert fra n-heksan-etanol. Det krystallinske antibiotikum X-14547-di-N-metylglukaminsalt-hydratet som ble oppnådd hadde

et smeltepunkt på 80-120°C.

C. Fremstilling av kalsiumsaltet av antibiotikum X-14547.

-En oppløsning av 0,50 g (1 mm) av den frie syreform av antibito-tikummet X-14547 i etylacetat ble vasket med 3 mmol av en vandig Ca(0H)2 oppløsning. Oppløsningen ble skilt fra og konsentrert under redusert trykk til et pulver som ble krystallisert fra aceton-acetonitril. Det krystallinske antibiotikum X-14547 kalsiumssalt-hemihydrat som ble oppnådd hadde et smeltepunkt på 179°C, [a]D-401° (1%, CHC13).

EKSEMPEL 7

Fremstilling av R - ( +) - 1- amino- l- ( 4- bromf eny 1 )- etansaltet av antibiotikum X- 14547

En oppløsning av 493 mg (1 mmol) antibiotikum X-14547 i metylen-klorid ble tilsatt til en oppløsning av 181 mg R-(+)-1-amino-l-(4-bromfeny1)-etan i metylenklorid. Etter tilsetning av n-heksan og langsom fordampning av opplø sningsmiddel ble det krystallinske sluttprodukt utvunnet. Omkrystallisasjon fra metylenklorid/ n-heksan ga krystaller egnet for røntgenstråle-analyse, smp. 128-131°C.

Beregnet:<C>^H<g>gBrN-jOg (1187.46):

%C, 70,70; %H, 8,15; %N, 3,54; %Br, 6,73.

Funnet: %C, 70,96; %H, 8,30; %N, 3,68; %Br, 6,83.

Det krystallinske salt inneholdt to molekyler antibiotikum

I X-14547 pr. ett molekyl av aminet, hvilket forklarer formlen anvendt for å beregnet mikroanalysen (analogt ril antibiotikum ' X-14547 hemihydrat i eksempel 3).

EKSEMPEL 8

Et eksempel på en tablettformulering er som følger:

Tablettformulering

Drogen forblandes med en del av laktosen i en egnet blandeanrod-ning og males deretter. Blandingen blandes ytterligere med mais-stivelse, den gjenværende laktose og cellulose i 15 minutter og males derpå. Blandingen blandes så med magnesiumstearatet i to minutter. Tablettene komprimeres med en tablettvekt på 200 mg under anvendlese av tablett-punchemaskiner med en diameter på tilnærmet 0,6 cm. Tablettene kan være enten flate eller bi-konvekse og kan være forsynt med riller hvis ønsket.

EKSEMPEL 9

Et animalsk næringsmiddel for anvendelse ifølge oppfinnelsen:

Protein- supplement

Protein- supplement X- 14547 Forblanding

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en ny antibiotisk substans med formelen

og farmasøytisk fordraglige salter derav karakterisert ved at den består av dyrkning av Streptomyces sp. ;X-14547 hvortil stammen NRRL 8167 hører i en vandig karbo- 'hydratløsnings som inneholder nitrogenholdige næringsstoffer og mineralsalter, deretter isolere antibiotikumet fra fermenteringsbrygget og om ønsket overføre det erholdte produkt til et farma-søytisk fordraglig salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en stamme av Streptomyces sp. X-14547 som er NRRL 8167.

3. Fremgangsmåte^ ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at dyrkningen av Streptomyces sp. X-14547 ut-føres som aerob dypkultur.

4. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-3, karakterisert ved at dyrkningen av Streptomyces sp. X-14 54 7 utføres i nærvær av et antiskummiddel.

5. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at dyrkningen av Streptomyces sp. X-14547 utføres ved en temperatur fra 20 - 35°C ved en hovedsaklig nøytral pH.

6. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-5, karakterisert ved at isoleringen av antibiotikumet med formel I utføres ved å.ekstrahere fermenteringsbrygget med etyl-acetat, fjerne løsningsmiddelet fra ekstraktet, vaske resten med vandig saltsyre og ekstrahere sammen med dietyleter, fjerne løsningsmiddelet fra ekstraktet, oppløse resten i acetonitril, vaske acetonitrilløsningen med n-heksan, ekstrahere n-heksanet vasket med metanol, kombinere acetonitrilet og metanolløsningene ' og fjerne løsningsmiddelet derav for å oppnå rent antibiotikum med formelen I etter omkrystallisering fra acetontril.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater karakterisert ved at antibiotikumet med formel

eller et farmasøytisk fordragelig salt derav blandes som aktiv substans med ikke-toksiske, inerte, terapeutisk fordragelige faste eller flytende bæremidler som vanligvis brukes i slike preparater og/eller eksipienter.

8. Farmasøytiske komposisjoner som inneholder antibiotikumet med formel

eller et farmasøytisk fordragelig salt derav og et bæremiddel.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av komposisjoner som øker effektiviteten av næringsutnyttélsen hos drøvtyggere og monogastriske dyr som fermenterer vegetabilsk fibermateriale i coecum samt forblandinger for bruk ved fremstilling av slike komposisjoner ved passende fortynning karakterisert ved at den består av å blande antibiotikumet med formel

eller et farmasøytisk fordragelig salt derav med en ikke-toksisk. inert bestanddel.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9 karakterisert ved at den ikke-toksiske inerte bestanddelen er dyreføde.

11. Komposisjoner som øker effektiviteten av næringsutnyttelse hos drøvtyggere og monogastriske dyr som fermenterer vegetablisk fibermateriale i coecum samt blandninger for bruk ved fremstilling av slike komposisjoner ved passende fortynning karakterisert ved at den består av en blanding av antibiotikumet med formel

eller et farmasøytiske fordragelig salt derav med en ikke-toksisk inert bestanddel.

12. Komposisjoner og f orblandinger ifølge krav 11 karak- terisert ved at den ikke-toksiske inerte bestanddelen er animalsk føde. !13. 3-etyl-l,3-dihydro-3-metoksy-2H-indol-2-on. 14. Ny aktibiotisk substans karakterisert ved at formelen

og farmasøytisk fordrageligs salter derav.