FI57614C - Foerfarande foer framstaellning av nya polyeterantibiotika - Google Patents

Description

ESiFFl [B] (H)KW«L«TU*jULKAIiU C7614 fffiSjft ' ' UTLAGGNINGSSKRIPT D f w i

C (45) Fate.'.tti V-v ? 0 Γ0 I'-J

^ v ^ (51) K».ik.3yint.a3 C 12 P 17/16* C 07 D 405/08 SUOMI —FINLAND (21) P*t*nttlhtk*rou*—P«*nt*n»6ki*»n| 772373 (22) Htk*mltp»»v·—Ameknln^ 05.08.77 ' * (23) Alkupiivt—Giltl|httsd>| 05.08.77

(41) Tulhit JulklMkM—.Bltvtt offantllg qj q£ jQ

ymta-1. NWriMiia, (44) eeh r*giat*rftyr«lMn AiwBkan utltgd och utl.*krtft*n publlc«r*d 30.05.80 (32)(33)(31) Pyrdeey ttuo)k*u«—«n»rt priorlt·* 0g > o8> USA(US) 712286 (71) F. Hofftnann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, CH-UÖ02 Basel,

Sveitsi-Schveiz(CH) (72) John Westley, Clifton, N.J., Chao-Min Liu, Cedar Grove, N.J., USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5^) Menetelmä uusien polyeetteriantibioottien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av nya polyeterantibiotika

Keksinnön kohteena on menetelmä uuden antibiootin *(R),5(S)-dimetyyli-6 (R)- fl-etyyli-it-/Il-(R)-(2-pyrrolyylikarbonyyli)-1 (S)-etyyli-3a(R) ,U,5(r) ,7a(R)- tetrahydroindan-5-yyli7-1(E),3(E)-butadienyyli$-t etrahydropyraani-2-et ikkahapon valmistamiseksi, jolla on kaava .. ^ CH3 °V^\/ 1

I l H,//J H H

^ o —\

O^^OH C2H5 //>;,'CH

~ 2 5

H

ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

2 57614 Tällä antibiootilla on ionifori-ominaisuuksia ja se luokitellaan poly-eetteriryhmäantibiootiksi. Kaavan I antibiootti ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat estävät tehokkaasti gram-positiivisten bakteerien kasvua ja niillä on käyttöä verenpainetta alentavana aineena ja märehtijöiden rehunkäyttöä edistävänä aineena.

Kaavan I antibiootti ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että viljellään Streptomyces antibioticus sp. X-lU5**7:ää NRRL 8167, hiilihydraattivesiliuoksessa, joka sisältää typpiravinteita ja kivennäissuo-loja, eristetään antibiootti fermentointiliemestä ja siinä olevasta 3-etyyli-l,3-dihyd-ro-3-metoksi-2H-indol-2-onista ja pyrroli-2-karboksyylihaposta tavallisella tavalla ja haluttaessa muutetaan saatu tuote farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty antibioottia tuottava organismi on uusi Streptomyces antibioticus kanta sp. X—1J+5U7. Elävän organismin viljelmä laboratoriomerkinnällä X-IU5U7 on talletettu U.S. Department of Agriculture, Agriculture Research Service, NRRL, Peoria, Illinois ja liitetty sen pysyvään mikro-organismikokoelmaan merkinnällä NRRL 8167-

Uusi mikro-organismi eristettiin maanäytteestä Martinsvillessa (Virginia). Streptomyces antibioticus sp. X-lk5^7:n edustavalla kannalla on seuraavat tunnusmerkit .

Streptomyces antibioticus X-li+5^7 muodostaa alusta-ainehuovaston, joka ei hajoa itiöiksi, ja ilmahuovaston, jonka itiöketjut ovat suoria tai taipuvia. Itiöt ovat sileäpintaisia. Itiöiden pituus on 1,26 - 1 ,k2 μ ja leveys 0,69 - 0,91 ^1. Soluseinämät sisältävät diaminopimeliinihappoisomeeriä, joka on muu kuin meso-muoto. Tämän ja yllä mainittujen kasvupesäketunnusmerkkien perusteella viljelmä kuuluu sukuun Streptomyces.

Viljelmän tunnistamiseksi käytettiin ISP-vakioalustoja, joita ovat kuvanneet Shirling ja Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. System, Bacteriol., 16. s. 313-^00, 1966, sekä muita alustoja seuraavasti: ISP-1 - ISP-9 Shirlingin ja Gottliebin yllä mainitussa julkaisussa Czapek-Dox'n agar: Czapek-Dox'in liemi (BBL), johon lisättiin 1,5 % agaria.

Bennett'in agar: 0,1 % hiivauutetta, 0,1 % häränlihauutetta, 0,2 % N-Z Amine A:ta (kaseiinihydrolysaatti, Sheffield Inc.), 1 % dekstroosia, 1,8 % agaria, pH 7,3.

Sabourad'in dekstroosiägar: (Difco).

Thermoactinomyces fermentointiagar: Bacto Thermoactinomyces fermentointialusta (Difco), johon lisättiin 1,5 % agaria.

ATCC-alusta 5: itiöitymisagar: 0,1 % hiivauutetta, 0,1 % häränlihauutetta 0,2 % tryptoosia, hivenmäärä ferrosulfaattia, 1,0 % dekstroosia, 1,5 % agaria, pH 7,2.

3 5761 4

Amidex-agar: 1 % Amidex:ia (Corn Products Co., Decatur, 111.), 0,2 % N-Z Amine A:ta, 0,1 % häränlihauutetta, 0,1 % hiivauutetta, 0,001^ % CaCl^-H^Chta, 2 % agaria, pH 7,3- Tärkkelys-kaseiiniagar: 1 % liukenevaa tärkkelystä, 0,1 % kaseiinia, 0,05 % K^HPO^rää, 0,05 % MgS0^:ää, 1,5 % agaria, pH T,b.

Alla olevasta taulukosta 1 ilmenevät kasvun määrä, itiöitymisaste, itiö-massan väri ja alustahuovaston kääntöpuolen väri. Inkuboitiin 1 h vrk 28°C:ssa, jonka jälkeen agarlevyt tutkittiin. Väriasteikkona oli Color Harmony Manual, neljäs painos, 1958, (Container Corp. of America).

Taulukko 1

Streptomyces sp. X-1^5^7:n viljelytunnusmerkit

Agaralusta Kasvun määrä Itiömassan väri Alustahuovaston _Itiöitymisaste _kääntöpuolen väri_ hiiva-mallas- keskinkertainen, run- 3-fe (hopeanhar- 2 nl (himmeän rus- uute (ISP-2) sas kasvu, hyvä iti- maa) enimmäkseen, kea) keskellä, 2ca öityminen, hieman muutama tupsu a (vaalean norsunluun vetistyvä (valkoinen) värinen) reunoilla kaurajauho runsas kasvu, hyvä 3 fe (hopean- 3 fe (hopeanharmaa) (ISP-3) itiöityminen harmaa) keskellä, 2dc (luonnon- väri) reunoilla epäorgaanisia runsas kasvu, hyvä 3 fe (hopeanhar- 2 dc (luonnonväri) suoloja-tärkke- itiöityminen maa), reunat ja lys (ISP-U) täpliä b (osterin- valkoinen glyseroli- keskinkertainen 2 fe(himmeän 2 ec (vaaleanruskea) asparagiini kasvu, keskinker- harmaa), täpliä enimmäkseen, (ISP-5) täinen - hyvä iti- ja reunat b(os- 2 ge (himmeän nahan- öityminen, hieman terinvalkoinen) ruskea) reunoilla vetistyvä u 57614

Agaralusta Kasvun määrä Itiömassan väri Alustahuovaston _Itiöitymisaste___kääntöpuolen väri peptoni-hiiva- keskinkertainen kas- i (harmaa) joi- 9 (harmaa) jollei uute-rauta vu, ei itiöitymistä, lei itiöitä itiöitä (ISP-6) tummanruskea, liu- ke va pigmentti tyrosiini heikko kasvu, hieman 2 dc (luonnon- 3 li (majavanväri- (ISP-7) itiöitymistä, pieni väri) nen) määrä tummanruskeaa, liukenevaa pigmenttiä

Czapek-Dox'n heikko kasvu, niuk- b (osterinval- b (osterinval- agar kaa itiöitymistä koinen) koinen

Bennett'in keskinkertainen kas- 2 fe (peitty- 3 lg (tiilenruskea) agar vu, hyvä itiöity- neen harmaa) minen, vetistyvä

Sabouraud'in keskinkertainen kas- 3 ie (kamelin- 3 ie (kamelinväri- dekstroosi vu, ei itiöitymistä värinen) jollei nen) jollei itiöitä agar itiöitä

Thermoacti runsas kasvu, hyvä 3 fe (hopeanhar- 3 pn (tummanruskea) nomyces itiöityminen, maa)enimmäkseen, keskellä ja fermentointi- vetistyvä tupsuja b (oste- 3 ng (vaahterankel- agar rinvalkoinen) täinen) reunoilla ATCC-alusta 5 keskinkeratinen kas- 3 fe (hopeanhar- 3 pl (pippurin- (American Type vu, hyvä itiöitymi- maa), myös alu- ruskea) culture Collec- nen, vetistyvä eitä 3 dc tion Catalogue of (luonnonvärinen)

Strains, 12 th ed., 1976 Rockville Md.)

Amidex-agar runsas kasvu, hyvä 3 fe (hopeanharmaa), 3 pl (pippurinruskea itiöityminen, hieman reunat b (osterinval- keskellä, 2 cb (nor- vetistyvä koinen sunluusävy) reunan ympärillä tärkkelys- runsas kasvu, hyvä 3 fe (hopeanharraea), 2 dc (luonnonvärinen) kaseiini agar itiöityminen, ve- (osterinvalkoinen) tistyvä yhdellä alueella 5 5761 4

Alla olevasta taulukosta 2 ilmenevät Streptomyces sp. X-lk547:n morfologiset ja fysiologiset tunnusmerkit-

Taulukko 2

Streptomyces sp. X-lk5k7:n morfologiset ja fysiologiset tunminmnrki l

Testi Tulus kromogeeninen reaktio ISP-6 + melaniini + heikko itiön pinta sileä itiömassan väri harmaa itiöketjun muoto suora-taipuva D-glukoosin käyttö ++ D-ksyloosin käyttö ++...+ L-arabinoosin käyttö ++ L-ramnoosin käyttö ++ D-fruktoosin käyttö ++ D-galaktoosin käyttö ++ raffinoosin käyttö D-mannitolin käyttö ++ i-inositolin käyttö ++ salisiinin käyttö _ sakkaroosin käyttö selluloosan käyttö kääntöpuolen pigmentti liukeneva pigmentti sreptomysiiniherkkyys 10^,u kiekko + nitraattipelkistys kaseiinihydrolyysi + gelatiinihydrolyysi + tärkkelyshydrolyysi + ISP-1 tummuminen +

NaCl-sietokyky % 5 kasvulämpötila °C 10-37 diaminopimeliinihappoisomeeri muu kuin meso-isomeeri ++ = voimakas positiivinen reaktio = negatiivinen reaktio 6 57614 R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, 197H Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md. perusteella S.kanta X-IU5U7 on samantapainen kuin ennalta tunnettu Streptomyces antibioticus, mutta eroja havaittiin L-arabinoosin käytössä, melamiinimuodostuksessa ISP-7:llä ja nitraat-tipelkistyksessä. Lisäksi aikaisemmin tunnettu S.antibioticus ei tuota kaavan I mukaista antibioottia, eikä uusi kanta puolestaan tuota aktincmysiini X(b) kompelk-sia, jota tunnettu S.antibioticus tuottaa. S.kanta X-1^5^7 on kuitenkin riittävän samanlainen kuin tähän saakka tunnettu Streptomyces antibioticus, joten sitä voidaan pitää Streptomyces antibioticus-lajiin kuuluvana kantana.

Viljeltynä sopivissa olosuhteissa Streptomyces antibioticus sp. X-ll+5^7 muodostaa kaavan I yhdistettä. Streptomyces antibioticus sp. X-lU57:ää sisältävä fer-mentointiliemi valmistetaan siirrostamalla kaavan I yhdistettä muodostavan organismin itiöitä tai huovastoa sopivaan alustaan ja viljelemällä aerobisissa olosuhteissa. Kaavan I yhdisteen tuottamiseksi viljely kiintoalustalla on mahdollista, mutta suurtuotanto on edullisempi suorittaa nestemäisessä viljelyväliaineessa. Viljely-lämpötila voi vaihdella laajasti eli organismi voi kasvaa 20-35°C:ssa, mutta lämpötila 26~30°C ja lähes neutraali pH ovat suositeltavia. Kaavan I yhdistettä muodostavan organismin aerobisessa submersifermentoinnissa viljelyväliaine voi hiililähteenä sisältää kaupallisesti saatavissa olevaa glyseridiöljyä tai hiilihydraattia kuten glyserolia, glukoosia, maltoosia, laktoosia, dekstriiniä tai tärkkelystä puhtaina tai epäpuhtaina ja typpilähteenä orgaanista ainesta kuten soijajauhoa, liukenevaa alkoholitislaamojätettä, maapähkinäjauhoa, puuvillansiemenjauhoa, lihauutetta, pep-tonia, kalajauhoa, hiivauutetta tai maissin liuotusnestettä ja haluttaessa epäorgaanisia typpilähteitä kuten nitraatteja amnoniumsuoloja. Käytettäviä kivennäissuoloja ovat esim. ammoniumsulfaatti, magnesiumsulfaatti, natriumkloridi, kaliumkloridi, kaliumfosfaatti, kalsiumkarbonaatti sekä hivenmäärinä raskasmetallisuolat. Viljely-väliaine voi myös sisältää puskureita kuten natriumsitraattia tai fosfaatteja. Ilmastetuissa submersiviljelymenetelmissä käytetään mieluiten vaahdonestoainetta kuten nestemäistä parafiinia, 7 5761 4 rasvaöljyjä tai silikoniyhdisteitä. Kaavan I yhdisteen valmistuksessa voidaan käyttää useampaa kuin yhtä hiili lähdettä, typpi lähdettä tai vaahdonestoainetta.

Fermentoinnin päätyttyä antibiootti X-14547 tai sen suolat voidaan eristää fermentointialustästä.Tämä voidaan suorittaa erilaisin menetelmin esim. uuttamalla koko fermentointiliemi liuottimena tai suodattamalla koko fermentointiliemi ja uuttamalla huovastosoluja sopivalla liuottimena. Huovastosolujen sopivia uutt . 1 liuottimia ovat asetoni, tetrahydrof utaani , dimetyylisulfoksidi hai 1 i untinscn.kse L kuten metyleenikloridi-metanoli tai etyyliasetaatti-etanoli. Liuotinuuttotekniikessa yleensä sopivia liuottimia ovat kloroformi, halogenoidut liuottimet kuten metyleenikloridi, eetteriliuottimet, etyyli- tai butyyliasetaatti. Lopullisessa kiteyttämisessä voidaan liuottimena käyttää esim. etyyliasetaattia, butyyliasetaattia, metyleenikloridia tai kloroformia.

Antibiootti 14547A muodostaa useita farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. Nämä suolat valmistetaan antibiootin vapaasta happomuodosta alan hyvin tuntemin menetelmin esim. pesemällä vapaata happoa liuoksessa sopivalla emäksellä tai suolalla. Esimerkkejä tällaisista farmaseuttisesti hyväksyttävistä emäksistä, jotka käsiteltävänä olevan keksinnön mielessä pystyvät muodostamaan suoloja, ovat alkalimetalliemäkset, esim. natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi ja litiumhydroksidi, maa-alkalimetalliemäkset, esim. kalsiumhydroksidi ja bariumhydroksidi, sekä ammoniumhydroksidi. Farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja muodostavien alkalimetalli- tai maa-alkalimetal-lisuolojen anioneina voivat olla esim. karbonaatit, bikarbonaatit ja sulfaatit.

Antibiootin X-14547 fysikaaliset tunnusarvot ovat:

Antibiootin X-14547 IR-absorptiospektri KBr-tablettina ilmenee kuviosta 1. IR-spektrissä antibiootin tunnusomainen absorptio esiintyy seuraavilla taajuuksilla cm 'L:mm. 3140 (OH), 2470-2400 (karboksyyli-OH), 1735, 1710 (C=0), 1650 (konjugoitu 0=0) ja 1627 (konjugoitu C=C).

Antibiootin X-14547 suun kautta annon myrkyllisyys (LDcf.)

DU

hiirellä on 129 mg/kg (1 vrk.).

Kuten alla olevasta taulukosta 3 ilmenee antibiootilla X-14547 on mikrobinvastainen vaikutus erilaisiin gram-posifiivisiin bakteereihin ja mykobakteeriin.

8 57614

Taulukko 3

Organismi Viljelmäkoko- Antibiootin X-14547 elma mikrobinvastainen teho.Minimiestokon-sentraatio+) ATCC [NRRL yq/ml_

Bacillus megaterium 8011 0.1

Sareina lutea 9341 0.1

Bacillus species E 27859 0.2

Bacillus subtilis 558 0.1

Staphylococcus aureus 6538P 0.2

Bacillus species TA 27860 0.2

Mycobacterium phlei 355 3.1

Streptomyces cellulosac 3313 0.8

Paecilomyces varioti 26820 6.3 +^Pienin kaksinkertainen laimennus, jolla muodostuu estovyöhyke agarkuoppadiffuusiokokeessa.

Uudella kometabolaatilla, 3-etyyli-1,3-dihydro-3-metoksi-2H-indol-2-onilla on myös havaittu olevan mikrobinvastainen vaikutus erilaisiin mikro-organismeihin, mikä ilmenee alla olevasta taulukosta 4.

Taulukko 4

Organismi Viljelmäkokoelma Minimiestokonsen- n:o raatio^ug/ml

ATCC

Escherichia coli 27856 5.0

Pseudomonas aeruginosa 8709 5.0

Klebsiella pneumoniae 27858 5.0

Staphylococcus aureus 6538P 5.0

Bacillus sp. TA 27860 2.5

Paecilomyces varioti 26820 2.5 9 57614

Antibiootti X-145^T, sen suolat ja 3-etyyli-1,3-dihydro-3-nietoksi-2H-indol- 2-oni estävät määrättyjen gram-positiivisten bakteerien kasvua. Ne ovat käyttökelpoisia desinfektoivissa pesuliuoksissa esim. käsien pesussa ja puhdistettaessa saastuneiden huoneiden tai laboratorioiden varusteita, lattioita tai huonekaluja.

Antibiootti X-IU5U7 tehoaa myös hoidettaessa lämminveristen eläinten kohonnutta verenpainetta.

Kohonnutta verenpainetta alentavaa tehoa testattiin Sprague-Dawley-(Charles River) koirasrotilla, paino 170 - 210 g. DOCA-Na-hypertensio aiheutettiin toispuolisella munuaisenpoistolla ja istuttamalla ihon alle 25 mg:n desoksikortikos-teronitabletti (DOCA). Eläimet asetettiin yksittäishäkkeihin ja ne saivat vapaasti 0,9 $:sta natriumkloridiliuosta ja rotanmuonaa. Leikkauksen jälkeen annettiin hypertension kehittyä kaksi viikkoa, so. kunnes veren systolipaine oli vähintään 150 mmHg.

Veren systolipaine ja sydämen lyöntitiheys mitattiin nukuttamattomien rottien hännästä epäsuorasti käyttäen pulssin paineilmasiirtojärjestelmää. Kontrollimit-taukset suoritettiin ennen lääkitystä ja 1,3,6 ja 2k tuntia lääkityksen jälkeen. Tulokset on ilmoitettu absoluutioarvoina ja kontrollien prosentuaalisina muutoksina.

10 5761 4

Taulukko 5

Veren systolipaine (mmHg) päivä rotta rotta rotta rotta rotta rotta 123456 keski- muutos-%

Kontrolli ennen lääki- „ arvo tystä 223 203 203 199 203 209 200·7 10 mg/kg X 2 päivää suun kautta

Arvot lääkityksen i 216 178 184 198 151 203 188.3 -9.0 jälkeen (mmHg) 2 211 201 176 168 168 190 185.7 -10.3 2 184 174 161 165 165 179 171.3 -17.1 3 214 195 193 219 198 211 205.0 -0.7 3 210 177 173 206 190 220 196.0 -5.2 4 197 172 229 212 179 228 202.8 -1.7 sydämen lyöntitiheys (sykettä/min) kontrollit ennen 440 3co 460 410 400 400 411.7 lääkitystä 10 mg/kg x 3 päivää suun kautta

Arvot lääkityksen 480 3G0 450 440 390 400 420.0 2.0 jälkeen (sykettä/min) 2 430 320 360 490 370 430 400.0 "2.6 2 420 310 400 310 380 450 378.3 -8-1 3 380 360 360 360 370 350 363.3 -Π-3 3 370 360 350 360 380 370 365.0 -10.8 4 370 320 360 ' 350' 340 400 356.7 -13.1 5761 4

Seuraavat esimerkit selventävät tätä keksintöä.

Esimerkki 1 Säiliöviljely

Streptomyces antibioticus NRRL 8167-viljelmää kasvatettiin ja pidettiin Amidex-agarvinoalustalla, jonka koostumus oli (g/l tislattua vettä):

Amidexia 10,0 N-Z amine A:ta 2,0 Häränlihauut ett a 1,0

Hiivauutetta 1,0

CoCl2.6H20:ta 0,02

Agaria 20,0

Vinoalustalle siirrostettiin Streptomyces antibioticus NRRL 8167-viljelmää ja inkuboitiin 7-10 vuorokautta 28°C:ssa. Sitten agarmöhkäle, joka sisälsi itiöityneestä viljelmästä muodostuneita itiöitä ja huovastoa, siirrostettiin 6 1 erlenmeyerkolviin, jossa oli 2 1 steriloitua viljelyalustaa. Tämän koostumus oli (g/l tislattua vettä):

Tomaattisoseen kiintoainesta 5,0

Alkoholitislaamon kuivattua liukoista ainesta 5,0

Peptonia 5,0

Hiivaa (karvaus poistettu) 5,0

Maissitärkkelystä 20,0

CaCO^a 1,0

KgHPOj^ää (vedetöntä) 1,0 pH säädettiin arvoon 7 natriumhydroksidilla ennen 1*5 minuutin autoklavisoin- 2 tia paineessa 1,05 ~ 1,1*0 kp/cm .

Siirrostettua viljelyalustaa inkuboitiin 72 tuntia 28°C:ssa pyörivässä ravistimessa, nopues 250 kierr/min, iskunpituus 5,1 cm.

Siirrostettiin k 1 muodostunutta viljelmää 3δθ litran fermentorissa olevaan 228 litraan, jonka koostumus oli (g/l tislattua vettä): 12 5761 4

Glukoosia 10,0

Syötävää melassia 20,0

HySoy T:tä 5»0

CaCO^ra 2,0 pH säädettiin arvoon 7>2 natriumhydorksidilla ennen 75 minuu- 2 tin sterilointia höyryllä paineessa k,2 kp/cm .

Siirrostettua alustaa ilmastettiin steriloidulla paineilmalla nopeudella 85 1/min ja sekoitettiin sekoittimilla nopeudella 2Ö0 kierr/ min. Fermentoitiin U-6 vrk 28°C:ssa.

Esimerkki 2

Antibiootin X-1U5^7 ja ko-metabolaattien 3~etyyli-1,3-dihydro-3-metok-si-2H-indol-2-onin ja pyrroli-2-karboksyylihapon eristäminen.

Vaihe A. Esimerkissä 1 kuvatun 380 litran fermentorin kokonais-liemeen lisättiin U-6 vrk:n kasvun jälkeen sama tilavuus etyyliasetaattia. Sekoitettiin tunti, liuotinkerros eristettiin ja konsentroitiin vakuumissa kahdeksi litraksi. Konsentroitua liuotinuutetta pestiin kolmasti yhtä suurilla tilavuuksilla 1-n kloorivetyhappoa. Liuotin kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutettiin vakuumissa öljyksi. Öljy liuotettiin dietyylieetteriin ja epäpuhtaat pyrroli-2-karboksyylihappokiteet eristettiin suodattamalla. Kiteyttämällä uudelleen etanoli-eetteristä saatiin yllä mainitun yhdisteen analyyttinen näyte, sp. 202-203°C.

1 3 5761 4

Mikroanalyysi CgNgNC^ (111,10)

Laskettu: C 54,06 % H 4,54 % N 12,60 %

Saatu: C 54,33 % H 4,65 % N 12,60 %

Vaihe B. Emäliuos konsentroitiin vakuumissa öljyksi, liuotettiin uudelleen 250 ml: aan asetonitriiliä ja pestiin I aluin:; I. i yhI ä suurilla tilavuuksilla n-heksaania. n-heksaanipesut yhdistettiin ja uutettiin puolella tilavuudella metanolia. Metanoliuute ja asetonit-riili yhdistettiin ja yön aikana n. 30°C:een jäähtymisen jälkeen kiteinen antibiootti X-14547 eristettiin suodattamalla puolihydraatti-na, sp. 137°C, fA7D = -285° (c = 1 CHClgissa).

Mikroanalyysi Cg^H^gNO^. (i^O) g ^ (502,70)

Laskettu: C 74,07 % H 8,82 % N 2,78 % 0 14,32 %

Saatu: C 74,36 % H 8,93 % N 2,50 % 0 13,81 %

Vaihe C. Asetonitriiliemäliuos konsentroitiin öljyksi ja kro-matografioitiin pylväässä, jossa oli 600 g silikageeliä lietettynä n-heksaaniin. Pylvästä eluoitiin 250 ml:lla n-hek saania ja sitten liuoksilla kasvaen yhdestä litrasta 2 %:sta etyyliasetaattia n-heksaania yhteen litraan etyyliasetaatti-n-heksaania (3:1) sekä 500 ml :11a etyyliasetaattia. Eristettiin 6 ml:n fraktioita. Kun fraktioista n:o 100-200 oli liuotin poistettu vakuumissa saatiin lisää antibioottia X-14547. Konsentroimalla fraktiot 201-290 ja kiteyttämällä asetonitriilistä saatiin 3-etyyli-l,3-dihydro- 3-metoksi-2H-indol-2-oni, sp. 179°C.

Mikroanalyysi (191,23)

Laskettu: C 69,09 % H 6,85 % N 7,33 %

Saatu: C 69,02 % H 6,96 % N 7,19.

Esimerkki 3 Säiliöfermentointi

Antibioottia X-14547 muodostavaa viljelmää kasvatetaan ja pidetään Amidex-agarvinoalustalla esimerkissä 1 kuvatulla tavalla tai tärkkelys- kaseiini-agarvinoalustalla, jonka koostumus on (g/1 tislattua vettä):

Liukenevaa tärkkelystä 10,0

Kaseiinia 1,0

KgHPO^iää (vedetöntä) 0,5

MgSO^iää (vedetöntä) 0,5

Agaria 20,0 14 5761 4 pH säädettiin arvoon 7,4 natriumhydroksidilla ennen 20 minuu-tin autoklavisointia paineessa 1,05 - 1,40 kp/cm .

Vinoalusta11 e siirrostettiin Streptomyces a nt i b io t taus NRRL 8167-viljslmaä ja inkuboitiin 7-10 vuorokautta 28°C:ssa. Sitten itiöityneestä viljelmästä otettiin agarmöykky kasvusiirrosteen valmistamiseksi siirrostamalla 6 1 erlenmeyerkol-viin, jossa oli 2 1 steriloitua viljelyalustaa. Sen koostumus oli (g/1 tislattua vettä):

Tomaattisosean kiintoainesta 5,0

Alkoholitislaamon kuivattua liukoainesta 5,0

Peptonic 5,0

Hiivaa (karvaus poistettu) 5,0

Maissitärkkelystä 20,0

CaCO 3:a 1,0 l^HPO^rää (vedetöntä) 1,0 pH säädettiin arvoon 7,0 ennen 45 minuutin autoklavisointia n paineessa 1,05 - 1,40 kp/cm .

Siirrostettua viljelyalustaa inkuboitiin 72 tuntia 28°C:ssa pyörivässä ravistimessa, nopeus 250 kierr/min, iskunpituus 5,1 cm.

Neljä litraa tätä viljelmää siirrostettiin 380 litran fermento-rissa 228 litraan seuraava alustaa (g/1 vesijohtovettä):

Tomaattisoseen kiintoainesta 5,0

Alkoholitislaamon kuivattua liukoainesta 5,0

Pcptöni n 5,0

Hiivaa (karvaus poistettu) 5,0

Maissitärkkelystä 20,0

CaCOgia 1,0

KoHP0u:ää (vedetöntä) 1,0 1 μ <B>

Sag 4130 vaahdonestoainetta(Umon Carbide) 0,1

Alustan pH säädettiin arvoon 7,0 natriumhydroksidlla ennen

O

75 minuutin sterilointia höyryllä paineessa 4,2 kp/cm .

Siirrostettua alustaa ilmastettiin paineilmalla nopeudella 85 1/min ja sekoitettiin sekoittimilla nopeudella 280 kierr/min. Fermentoitiin 43 tuntia 28°C:ssa.

Siirrostettiin 19,3 1 tätä viljelmää 3857 litran säiliössä 1350 litraan seuraavaa alustaa (g/1 vesijohtovettä): 1 5 5761 4

Tomaattisoseen kiintoainesta 5,0

Alkoholitislaamon kuivattua liukoainesta 5,0 OM-peptonia 5,0

Hiivaa (karvaus poistettu) 5,0

Maissitärkkelystä 20,0

CaCOgia 1,0 l^HPO^iä^ (vedetöntä) 1,0

Sag *4130 vaahdonestoainetta(Union Carbide) 0,1

Alustan pH säädettiin arvoon 7,0 natriumhydroksidilla ennen 75 minuutin sterilointia höyryllä paineessa 4,2 kp/cm?.

Siirrostettua alustaa ilmastettiin pai nm l.mal la nopnudel la 85 1/min ja sekoitettiin sekoittimilla nopeudella 280 kierr/min. fermentoitiin 118 tuntia 28°C:ssa.

Esimerkki 4

Antibiootin X-14547 ja kometabolaattien 3-etyy-li-1,3-dihydro-3-metoksi-2H-indol-2-onin j a pyrroli-2-karboksyylihapon eristäminen.

Vaihe A. Esimerkissä 2 kuvatun 1350 litran fermentoinnin ko-konaisliemeen lisättiin 118 tunnin kasvun jälkeen sama tilavuus etyyliasetaattia. Sekoitettiin tunti, liuotinkerros eristettiin ja konsentroitiin vakuumissa 7,25 litraksi. Konsentroitua liuotinuutet-ta pestiin kolmasti kolmella litralla 1-n kloorivetyhappoa. Liuotin kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutettiin vakuumissa öljyksi, öljy liuotettiin dietyylieetteriin ja epäpuhtaat pyrroli-2-karboksyylihappokiteet eristettiin suodattamalla. Kiteyttämällä uudelleen etanoli-eetteristä saatiin yllä mainitun yhdisteen analyyttinen näyte, sp. 202 - 203°C.

Mikroanalyysi C^HgNOg (111,10) laskettu: C 54,06 % H 4,54 % N 12,60 Saatu: C 54,33 % H 4,65 % N 12,60 %

Vaihe B. Emäliuos konsentroitiin vakuumissa öljyksi, joka liuotettiin uudelleen 1 litraan asetonitriiliä ja pestiin kahdesti yhtä suurilla tilavuuksilla n-heksaania. n-heksaanipesut yhdistettiin ja uutettiin puolella tilavuudella metanolia. Metanoliuute ja aeeto-nitriili yhdistettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa. öljy liuotettiin asetonitriiliin ja yli yön n. 3°C:ssa jäähtymisen jälkeen kiteinen antibiootti X-14547 eristettiin suodattamalla puolihydraat-tina, sp. 137°C, [d J ^ = -285° (c = 1, CHCl3:ssa).

ib 5 761 4

Mikroanalyysi (H20)Q 5 (502,70)

Laskettu: C 74,07 % H 8,82 %*N 2,78 % 0 14,32 %

Saatu: C 74,36 % H 8,93 % N 2,50 % 0 13,81 %

Vaihe C. Asetonitriiliemäliuos konsentroitiin öljyksi, joka kromatografoitiin pylväässä, jossa oli 600 g silikageeliä lietettynä n-heksaaniin. Pylvästä eluoitiin vhdellä litralla n-heksaania ja sitten liuoksilla kasvaen neljästä litrasta 2 %:sta etyyliasetaattia n-heksaanissa neljään litraan etyyliasetaat-ti-n-heksaania (3:1) sekä kahdella litralla etyyliasetaattia. Eristettiin 25 ml:n fraktioita, fraktioista n:o 100-200 poistettiin liuotin vakuumissa ja saatiin lisää antibioottia X-14547. Konsentroimalla fraktiot 201-290 ja kiteyttämällä asetonitriilistä saatiin 3-etyyli-l,3-dihydro-3-metoksi-2H-indol-2-oni, sp. 179°C.

Mikroanalyysi C^H^NC^ (191,2 3)

Laskettu: C 69,09 % H 6,85 % N 7,33 %

Saatu: C 69,02 % H 6,96 % N 7,19 %

Esimerkki 5

Antibiootti X-14547 natriumsuolan eristäminen.

Toisen fermentointiajon kokonaislientä uutettiin puolella tilavuudella kloroformia. Liuotinkerros eristettiin ja konsentroitiin vakuumissa 2,35 litraksi ja pestiin peräkkäin yhtä suurilla tilavuuksilla 1-n kloorivetyhappoa, 1-n natriumhydroksidiliuosta ja vettä. Liuotin kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin öljyksi. Tämä liuotettiin uudelleen kahteen litraan asetonitriiliä ja pestiin kahdella litralla n-heksaania. Asetonitriili konsentroitiin öljyksi ja suodatettiin 970 g:n läpi silikageeliä käyttäen 4 1 metyleenikloridia ja sitten 8 1 metyleenikloridi-ar.ntnnia (1:1) . Biologisesti aktiivinen fraktio kromatografoitiin pylväässä, jossa oli 300 g silikageeliä lietettynä metyleenikloridiin ja eluoitiin liuoksilla kasvaen 7 litrasta metyleenikloridia 7 litraan metyleenikloridi-dietyylieetteri-etanolia (48:48:14). Yhdistettiin fraktiot n:o 290 - 460 (kukin 25 ml) ja konsentroitiin öljyksi. Tämä liuotettiin pieneen määrään asetonitriiliä ja lisäämällä n-heksaania antibiootin X-14547 natriumsuola eristettiin suodattamalla valkoisena jauheena, jossa oli 1 mooli n-heksaania yhdistemoolia kohti. Mikroanalyysi (599,83)

Laskettu: C 74,09 % H 9,08 % N 2,34 % Na 3,83 %

Saatu: C 74,00 % H 8,86 % N 2,10 % Na 4,04 % 17 5761 4

Esimerkki 6

Antibiootti X-14547:n suolojen valmistus A. Antibiootti X-14547 :n mono-N-metyyliglukamiinisuolan valmistus .

Liuos, pssa oli 0,986 g antibiootti X-14547:n vapaan hapon muotoa metyleenikloridi-metanolissa (1:1) lisättiin liuokseen, jossa oli 0,395 g (2 mmoolia) N-metyyliglukamiinia etanoli-vedessä (3:1). Liuos konsentroitiin vakuumissa jauheeksi, joka kiteytettiin lisäämällä n-heksaani-etanolia. Saatiin antibiootti X-14547:n kiteinen N-metyyliglukamiinisuolahydraatti, sp. 109 - 111°C.

B. Antibiootti X-14547:n di-N-metyyliglukamiinisuolan valmistus

Liuos, jossa oli 1,972 g (4ranoolia) antibiootti X-14547:n vapaan hapon muotoa metyleenikloridissa lisättiin liuokseen, jossa oli 1,580 g (8 mmoolia) N-metyyliglukamiinia metanoli-vedessä (2:1).

Liuos haihdutettiin vakuumissa jauheeksi, joka kiteytettiin n-hek-saani-etanolista. Saatiin antibiootti X-14547:n kiteinen di-N-metyy-liglukamiinisuolahydraatti, sp. 80 - 120°C.

C. Antibiootti X-14547 :n ]<alsiumsuolan valmistus

Liuosta, jossa oli 0,50 g (1 mmooli) antibiootti X-14547:n vapaan hapon muotoa etyyliasetaatissa pestiin 3 mmoolilla kalsium-hydroksidivesiliuosta. Liuos eristettiin ja konsentroitiin vakuumissa jauheeksi, joka kiteytettiin asetoni-nitriilistä. Saatiin antibiootti X-14547:n kiteinen kalsiumsuolapuolihydraatti, sp.

179°C, = -401° (1 %, CHC13).

Esimerkki 7

Antibiootti X-14547 R-(+)-l-amino-l-(4-bromifenyyli)-etaani-suolan valmistus

Liuos, jossa oli 493 mg (1 mmooli) antibioottia X-14547 metyleenikloridissa lisättiin liuokseen, jossa oli 181 mg R-(+)-l-amino-1-(4-bromifenyyli)-etaania metyleenikloridissa. Lisäämällä n-heksaa-nia ja haihduttamalla liuotin hitaasti saatiin kiteinen lopputuote. Kiteyttämällä uudelleen metyleenikloridi-n-heksaanista saatiin röntgenanalyysiin sopivia kiteitä, sp. 128 - 131°C.

Mikroanalyysi C^gHggBrNOg (1187,46) laskettu: C 70,70 % H 8,15 % N 3,54 % Br 6,73 %

Saatu: C 70,96 % H 8,30 % N 3,68 % Br 6,83 %

Kiteinen suola sisälsi kaksi molekyyliä antibioottia X-14547 ja yhden molekyylin amiinia, mikä selittää mikroanalyysissä käytetyn kaavan laskemisen (vastaten antibiootin X-14547 puolihydraattia esimerkissä 3).

Claims (3)

18 5761 4

1. Menetelmä uuden antibi oot i n ?< (R), 5 (S)-dimetyy1i-6(R)-£1-etyy1i-k-[4 - (R) -(2-pyrrolyylikarbonyyli)-l(S)-etyyli-3a(R),U,5(R).7a(R)-tetrahydroindan-5-yyli7-1-(E),3(E)-butadieenyliJ -tetrahydropyraani-2-etikkahapon valmistamiseksi, jolla on kaava °V\) H3C I l ^ "4 „ h h H 1 αή y 0^-OH C2H5 H V ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että aerobisissa submersi-olosuhteissa, lämpötilassa 20-35°C lähes neutraalissa pH-arvossa viljellään Streptomyces antibioticus sp. X-lU5^7:ää NRRL 8167, hii-lihydraattivesiliuoksessa, joka sisältää typpiravinteita ja kivennäissuoloja, eristetään antibiootti fermentointiliemestä ja siinä olevasta 3~etyyli-l,3-dihydro-3-metoksi-2H-indol-2-onista ja pyrroli-2-karboksyylihaposta tavallisella tavalla ja haluttaessa muutetaan saatu tuote farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen, esim. kalsium- tai R-(+)-l-amino-l-(U-bromifenyyli)-etaani-suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljely tapahtuu vaahdonestoaineen läsnäollessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I antibiootti eristetään uuttamalla fermentointiliemi etyyliasetaatilla, poistamalla liuotin uutteesta, pesemällä jäännös kloorivetyhappovesiliuoksella ja uuttamalla tätä dietyylieetterillä»poistamalla liuotin uutteesta, liuottamalla jäännös asetonitriiliin, pesemällä asetonitriililiuosta n-heksaanilla, uuttamalla n-hek-saanipesunesteet metanolilla, yhdistämällä asetonitriili- ja metanoliliuokset ja poistamalla liuotin niistä ja kiteyttämällä jäännös asetonitriilistä puhtaan kaavan I mukaisen antibiootin saamiseksi.