CN102498401B - 在纤维素材料水解中分析纤维素衰变的方法 - Google Patents

在纤维素材料水解中分析纤维素衰变的方法 Download PDF

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Abstract

通过使用指示剂成分如荧光剂在纤维素材料水解过程中衡量感兴趣的酶和/或多肽和/或混合物，导致酶和/或多肽的有效的高通量分析。还公开了用于除了分析其他之外，分析经预处理的玉米秸秆(PCS)水解的高通量测定。

Description

在纤维素材料水解中分析纤维素衰变的方法
发明背景
技术领域
本发明涉及的分析、筛选和/或衡量感兴趣的酶、多肽、酶混合物、多肽混合物和/或酶和多肽的混合物的方法。本发明可用于检测残余的纤维素和衡量感兴趣的酶、多肽或混合物的水解活性，等等。本公开进一步涉及高通量测定法，例如，公开了用于定量感兴趣的酶或多肽在经预处理的玉米秸秆(PCS)水解中的纤维素分解活性和/或纤维素酶活性的高通量测定法。
背景技术
目前分析、衡量或筛选感兴趣的酶、多肽或混合物的方法存在问题，且并不非常适于高通量分析。例如，一种分析经预处理的玉米秸秆(下文中称作“PCS”)水解的方法需要冗长的高压液相色谱(下文中称作“HPLC”)分析以确定糖的量。其中，PCS中的纤维素经酶法水解为葡萄糖、纤维二糖和更高级的β-葡聚糖。使用HPLC测量葡萄糖和纤维二糖。本领域技术人员，已知底物的纤维素含量，可然后使用该信息计算纤维素至糖的转化百分比。因此，可测量水解中的酶的纤维素分解活性。然而HPLC步骤费时费力。使用HPLC的测定法不适于高通量分析，和/或在单一测定中快速分析多个感兴趣的酶。
已进行了使用加载于深孔板中的可移液的底物来改善HPLC测定法的尝试；然而，仍然需要水解之后的HPLC糖分析。HPLC测定耗费时间，例如，96孔板需要大约19小时的HPLC时间。尝试的改善充满问题，因为其在HPLC之前包括耗时的过滤、移液和稀释步骤。
已知测定法中存在的问题导致更高的研究成本，枯燥的测定法格式化(assayformatting)，以及耗时的酶活性衡量。因此，存在对具有改善的准确度和/或减少的操作时间，具有优异的准确性，优异的反应速率和/或优异的纤维素转化率(特别是当需要高通量分析时)的测定法和分析方法的持续需要。
发明内容
现已发现将指示剂成分(indicatorconstituent)或增亮添加剂(brighteningadditive)如荧光指示剂化合物和/或增强剂添加至水解反应，对筛选和/或衡量感兴趣的酶、多肽和混合物在含有纤维素材料的水解反应中的性能具有显著的作用。例如，添加荧光指示剂化合物可用于检测残余的纤维素并衡量感兴趣的酶或酶混合物的水解活性。因此，现已可能在指示剂成分如荧光指示剂提供的益处下进行感兴趣的酶和/或多肽的化学测定。此外，现已可能在减少的时间中进行高通量测定。而且，现已可能以高通量形式检测出残余的纤维素并衡量感兴趣的酶、多肽或混合物的水解活性。这些方法亦可用于发现具有改善的性能特征的感兴趣的酶或感兴趣的多肽和/或对制造出的酶、肽或多肽的质量控制。在实施方案中，这些方法消除了HPLC的使用，并且因为避免通常冗长的HPLC测定法而更快速。
本公开的第一个方面涉及分析纤维素材料的水解如木素纤维素水解中的纤维素衰变的方法。
本公开的第二个方面涉及确定感兴趣的酶或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法。
本公开的第三个方面涉及分析感兴趣的酶或多肽的高通量方法。
本公开的第四个方面涉及分析酶或多肽性能的方法。
本公开的第五个方面涉及用于衡量酶和/或多肽性能的系统。
本公开的第六个方面涉及确定感兴趣的多肽是否具有纤维素分解增强活性的方法。
本公开的第七个方面涉及用于如上所述本公开的诸方面的标准化方法。
本公开的第八个方面涉及质量控制方法。例如，可在产生一个或多个批次的多肽或酶之后由生产商检查质量控制参数如酶活性、纤维素酶活性、纤维素分解增强活性和/或稳定性。此外，质量控制参数如多肽活性、酶活性、纤维素酶活性、纤维素分解增强活性和/或稳定性可由酶或多肽的购买者检查。
本公开的目标通过提供分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素的衰变的方法来实现，所述方法包括在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的纤维素材料；和检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述方法在水解步骤之前包括：(a)将纤维素材料(如木素纤维素材料)与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触。
本公开的目标通过提供分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素衰变的方法来实现，所述方法包括下述步骤：(a)将纤维素材料(例如木素纤维素)与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和(d)检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述指示剂成分是荧光指示剂化合物包括苯和联苯的苯乙烯基衍生物，茋(stilbene)衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉(carbostyrils)或其混合物。
本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤：在含有指示剂成分的反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解反应(hydrolyzedreaction)是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或多肽的纤维素酶活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述方法在水解之前包括下述步骤：(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触。
本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤：(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或多肽的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述光信号指示感兴趣的多肽的纤维素分解活性和/或纤维素分解增强活性。
本公开的目标还通过提供分析感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的高通量方法来实现，包括下述步骤：(a)将生物质与指示剂成分如荧光化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述指示剂成分例如荧光指示剂化合物的信号，其中信号强度预示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。
本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤：(a)将生物质与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会结合纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素水解。这些方法还可包括提供感兴趣的酶的步骤。这些方法还可包括提供感兴趣的多肽。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。这些野生型、突变体和变体的组合亦涵盖于依照本公开的感兴趣的酶混合物。本文亦涵盖具有a)、b)或c)的活性的片段。
本公开的目标还通过提供分析酶性能的方法来实现，所述方法包括下述步骤：(a)将木素纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的木素纤维素材料；和(d)检测来自所述指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。酶性能的非限定性实例包括在木素纤维素水解中纤维素衰变的指标。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。这些野生型、突变体和变体的组合亦涵盖于依照本公开的感兴趣的酶混合物。本文亦涵盖具有a)、b)或c)的活性的片段。
本公开的目标还通过提供分析生物质水解中纤维素衰变的方法来实现，所述方法包括下述步骤：(a)将生物质与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的质量参数。此类方法可在系统中进行。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。这些野生型、突变体和变体的组合亦涵盖于依照本公开的感兴趣的酶混合物。本文亦涵盖具有a)、b)或c)的活性的片段。
本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶或多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤：(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会改变纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定所述水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或多肽的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。
本公开的目标还通过提供用于衡量酶和/或多肽性能的系统来实现，所述系统包含：至少一个反应区，其中所述反应区用于分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中的纤维素衰变，所述反应区包含：至少一个用于下述的孔：(a)将纤维素材料(例如木素纤维素)与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。在一个系统实施方案中，检测器位于反应介质之下，并位于反应介质所处于的平板之下。
本公开的目标还通过提供标准化荧光强度数据的方法来实现，所述方法包括下述步骤：(a)不添加酶或多肽，确定纤维素材料(例如PCS)的水解反应的平均荧光强度；和(b)使用步骤(a)中确定的荧光强度标准化一种或多种第二水解反应的荧光强度。
本发明的目标还在实施方案中通过提供在底物的水解反应中分析由一种或多种感兴趣的酶或多肽所致的纤维素衰变的方法来实现，所述方法包括在反应介质中水解含有纤维素的底物，然后添加指示剂成分，其中所述指示剂成分会使得纤维素染色；和检测来自指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由感兴趣的酶水解的纤维素的量。
术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”在本文中定义为一种或多种(几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括WhatmanNo.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用WhatmanNo.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的。
就本公开而言，纤维素分解活性使用本公开的方法确定，或如为了获得比较数据的目的，通过测量在下述条件下由纤维素分解混合物进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在50-65℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mMMnSO4，50℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素成分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,PureandAppl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测定内切葡聚糖酶活性。
术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechnology15:160-167;Teeri等,1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本公开而言，根据vanTilbeurgh等,1982,FEBSLetters149:152-156及vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288描述的方法针对荧光性二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷来测定纤维二糖水解酶活性。
术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等,2002,Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在40℃,pH5，以1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷为底物，在100mM柠檬酸钠，0.01%20中每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。
术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为由GH61A多肽催化的、增强由具有纤维素分解活性的酶水解纤维素材料的生物学活性。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/gPCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽的蛋白质，在50-65℃历时1-7天，与用相等的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/gPCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白重量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)存在下使用1.5L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)的混合物的纤维素酶蛋白加载量作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。
术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”在本文中定义为一种或多种(几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支链和直链糖类的异质组，所述糖类在植物细胞壁中通过氢键结合于纤维素微纤维，交联为鲁棒的(robust)网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素多变的结构和组织需要多种酶的协同作用才能使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖基水解酶(GH)，或糖酯酶(CE)，其水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可分配至通过数字标记的GH和CE家族。一些家族，由于总体类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，用字母标记(例如，GH-A)。对于这些和其他糖活性酶的最具信息性和最新的分类可从Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&AppI.Chem.59:1739-1752测量。
术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定义为水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oatspelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可在37℃用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在0.01%TritonX-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6，从200mM磷酸钠pH6缓冲液中作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(SigmaChemicalCo.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
术语“木聚糖酶”在本文中定义为1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本公开而言，木聚糖酶活性是使用桦木木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在50℃，pH5从2g/L桦木木聚糖作为底物在50mM乙酸钠，0.01%20中水解的起始期间每分钟产生1.0μmol还原糖(以葡萄糖当量(glucoseequivalents)测定，如Lever，1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述)。
术语“β-木糖苷酶”在本文中定义为β-D木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷在含有0.01%20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolateanion)。
术语“乙酰木聚糖酯酶”在本文中定义为羧酸酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物，在含有0.01%TWEENTM20的50mM乙酸钠pH5.0中确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
术语“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”在本文中定义为EC3.1.1.73(IUBMBEnzymeNomenclature)中的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰糖水解酶，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放出1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。
术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”在本文中定义为α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolaseactivity)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖苷酸水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放出1μmol葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”在本文中定义为α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘性小麦阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
术语“家族3”、“家族5”、“家族6”、“家族7”、“家族10”、“家族11”、“家族61”、“GH3”、“GH5”、“GH6”、“GH7”、“GH10”、“GH11”、“GH61”、“Cel3”、“Cel5”、“Cel6”或“Cel7”在本文中定义为根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族3、5、6、7、10、11和61的多肽。
纤维素材料在本文中定义为任何含有纤维素的材料。生物质初生细胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondarycellwall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995,于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719;Mosier等,,1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,NewYork)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。
在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。
在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。
纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的传统方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
术语“经预处理的玉米秸秆”或“PCS”在本文中定义为经过一种或多种预处理步骤的源自玉米秸秆的纤维素材料。
术语“变体”在本文中定义为具有生物活性的酶或多肽，其包含改变，即在一个或多个(几个)位置取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基。取代意指用另一个氨基酸替代占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；而插入意指在占据一个位置的氨基酸邻接处添加一个或多个(几个)氨基酸例如1-5个氨基酸。
术语“野生型”酶在本文中定义为由天然出现的微生物如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌所表达的酶。
术语“亲本酶”在本文中定义为对其进行修饰，例如取代、插入、缺失和/或截短，以产生本公开的酶变体的酶，如感兴趣的酶。该术语亦指变体可与之相比较和比对的多肽。所述亲本可为天然出现的(野生型)多肽或变体。例如，所述亲本蛋白可为氨基酸序列受修饰或改变的天然出现的多肽的变体。亲本亦可为等位变体，其为由占据相同染色体座的基因的两种或更多种可选形式所编码的多肽。
术语“分离的多肽”在本文中定义为从来源分离的多肽。在一个优选的方面，多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。
术语“基本上纯的多肽”在本文中定义为多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%，并且甚至最优选至多0%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少90%纯，优选至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99.5%纯，并且甚至最优选100%纯。所述多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过以下实现：通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)来预测。
术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)来预测。
参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序(优选3.0.0版或更高版本)中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gappenalty)10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)的Needle程序(优选3.0.0版或更高版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
术语“多肽片段”在本文中定义为从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。
术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从成熟编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸，其中所述亚序列编码具有生物活性的片段。
术语“等位变体”在本文中定义为占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
术语“分离的多核苷酸”在本文中定义为从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。
术语“基本上纯的多核苷酸”在本文中定义为不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%，最优选至少99.5%纯，并且甚至最优选至少100%纯的。优选所述多核苷酸是“基本上纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
术语“编码序列”在本文中定义为直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。
术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
术语“核酸构建体”在本文中定义为单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或将其以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
术语“调控序列”在本文定义为对编码多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
术语“可操作地连接”在本文中定义为这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
术语“表达”在本文中定义为涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
术语“宿主细胞”在本文中定义为任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞的后代。
术语“改善的性质”在本文中定义为与变体或突变体酶或多肽相关的特征，其与亲本或未突变的酶或多肽相比经改善。此类改善的性质包括但不限于：增强的纤维素分解活性，改变的温度依存性活性概貌，热稳定性，pH活性，pH稳定性，底物特异性，产物特异性，产物稳定性，产物活性和/或化学稳定性。
术语“多肽”在本文中定义为数个通过肽键连接在一起的氨基酸。多肽的非限定性实例包括多肽片段，大蛋白，小蛋白，和蛋白部分。
术语“改善的产物特异性”在本文中定义为相对于亲本呈现改变的产物概貌的变体酶或多肽，其中所述改变的产物概貌改善了所述变体或多肽相对于亲本在给定应用中的性能。术语“产物概貌”在本文中定义为由酶水解产生的反应产物的化学组成。
术语“突变体”在本文中定义为发生突变的生物体。
术语“突变体酶”在本文中定义为来源于突变体的酶，其中将来自亲本细胞的同一酶与所述突变体酶相比时，所述突变体酶具有改变。
术语“模块”在本文中定义为在系统中实现完善定义的任务的智能成分。
术语“例如(e.g.)”一般指拉丁语短语exempligratia的缩写。如用于本文中，“e.g.”指一个或多个非限定性实例。所谓该术语是非限定性的，是指例示的对象并不限于提供的具体实例的范围。
术语“如”用于本文中一般指一个或多个非限定性实例。
本公开的这些和其他方面参照下述具体描述会是显而易见的。
附图说明
图1A是显示本公开的系统的一个实施方案的图示；图1B是显示本公开的系统中的读板器模块的一个实施方案的图示。
图2是显示几种3.8μMFB28的稀释系列在360nm处的激发之后在460nm处的顶部读取所收集的荧光发射的图的图像表示。
图3A是显示在80μl体积的UV可传递微滴定板中在360nm处激发测得的荧光谱的图的图像表示。图3B是显示用8μM荧光增亮剂28在100μl的体积的UV可传递微滴定板中在360nm处激发测得的荧光谱的图的图像表示。图3C是显示以80μl体积收集的经预处理的玉米秸秆的吸光度谱的图像表示。图3D是显示80μl体积的商业性木质素的吸光度谱的图像表示。
图4是显示当将荧光指示剂成分添加至经水解的PCS样品时，荧光强度相对于葡萄糖释放的图的图像表示。
图5A是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-A样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5A包括添加酶所得的值。图5B是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-A样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5B排除了来自未添加酶的生物质的值。图5C是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-B样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5C包括了添加酶所得的值。图5D是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-B样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5D排除了来自未添加酶的生物质的值。图5E是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-B样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5E包括了添加酶所得的值。图5F是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-C样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5F排除了来自未添加酶的生物质的值。
图6A是显示在添加和不添加200μM指示剂成分时，多个对PCS-A和PCS-B的水解反应中葡萄糖浓度对酶加载的图的图像表示。图6B是显示使用指示剂成分的水解与不使用指示剂成分的水解之间的偏差的图的图像表示。
图7是显示当通过加载指示量的纤维素酶(mg/g纤维素)将含200μMFB28的5%PCS-A在50℃水解超过72小时时标准化的荧光发射对时间(h)的图的图像表示。误差棒显示一标准偏差。
图8是显示分别含4、16和204μMFB28的1%、3%和5%PCS-A，在50℃通过添加不同量的根据WO2008/151079获得的里氏木霉(Trichodermareesei)纤维素分解蛋白组合物(包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的里氏木霉菌株RutC30培养液)水解超过72小时的图的图像表示。释放的葡萄糖通过HPLC测量，而纤维素转化是基于5%总固形物处的最大葡萄糖释放。
图9A是显示当用3%PCS和150μMFB28在3364平板中使用300μl反应物在50℃将PCS-A水解72小时时，估计的转化率(%)对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。图9B是显示实际转化率(%)对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示，其中实际转化率是基于来自图9A中的反应物通过HPLC测量的葡萄糖和纤维二糖。
图10A是显示本公开的一个实施方案的分析的直方图的图像表示，其中显示了5mg/g纤维素的加载在内侧、外侧和边缘孔中估计的转化率。图10B是显示本公开的一个实施方案的分析的直方图的图像表示，其中显示了8mg/g纤维素的加载在内侧、外侧和边缘孔中估计的转化率。注意：RutC30指里氏木霉菌株RutC30。
图11是显示存在(+)或不存在(-)150μMFB28时在用第一组酶在50℃水解72小时的3%PCS-A反应物中实际转化率(%)对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。实际转化率由葡萄糖和纤维二糖的HPLC测量来计算。实际转化率根据葡萄糖和纤维二糖的HPLC测量来计算。图11显示了存在FB28(实线，实心符号)和不存在FB28(虚线，空心符号)时的不同组的酶。
图12是显示使用多种模型时转化率(%)对不同酶的直方图的图像表示。显示了实际HPLC测量的纤维素至葡萄糖和纤维二糖的转化率与来自荧光发射强度测量的模型的比较。注意：RutC30指里氏木霉菌株RutC30。
图13A是显示在两个不同PCS-A批次的72小时水解之后，估计的转化率(%)对HPLC测量的转化率(%)的图的图像表示。图13B是显示作为某些剂量的放大而作图的估计的转化率(%)对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。图13C是显示作为某些剂量的放大而作图的估计的转化率(%)对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。
具体实施方式
已发现添加一种或多种结合于、染色或增亮纤维素的指示剂成分，如增亮剂或荧光指示剂化合物，有效地最大化或增加对于纤维素水解的速率，可以此速率衡量感兴趣的酶或多肽如野生型、突变体、变体和/或重组酶。此外，已发现依照本公开的方法可以在高通量测定法中实施。这节约了时间，并提供了一种或多种感兴趣的酶、多肽、酶混合物、多肽混合物和/或酶和多肽的混合物的纤维素分解活性和/或纤维素分解增强活性的准确指标。本公开的方法可用于测试大量多肽和/或酶样品(含有一种或多种感兴趣的酶和/或多肽、酶混合物、多肽混合物和/或酶和多肽的混合物)，例如对指定的生物质样品具有已知的蛋白浓度的。例如，可有效地衡量来自诱变文库、野生型筛选和/或发酵运行的感兴趣的酶和/或多肽样品。依照本公开的合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和/或变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。感兴趣的酶亦可包括酶混合物如前述感兴趣的酶的组合。感兴趣的多肽的非限定性实例包括一种或多种根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,以及Henrissat和Bairoch,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖基水解酶家族3、5、6、7、10、11和61的多肽。认为可分析多肽和酶的混合物，例如可依照本公开对突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶和具有纤维素分解增强活性的GH61多肽进行本测定法。
不拘于本公开，认为当一种或多种指示剂成分如荧光指示剂化合物接触纤维素时，所述指示剂成分结合于或染色所述纤维素。例如，染色是在适于促进给定指示剂化合物如荧光指示剂化合物结合于纤维素的条件下进行的。认为染色步骤是有效的，因为指示剂成分如荧光指示剂化合物或染料特异性结合于纤维素的能力，凸显(highlight)纤维素与残余的反应介质和其中的其他成分的反差。尽管最小的背景凸显可不至于破坏依照本公开的方法的准确性，背景凸显(由相同或类似的指示剂成分导致)是不优选的，并应最小化或避免。不拘于本公开，认为染色或结合步骤使用所述指示剂成分和纤维素成分之间的部分的可能的相互作用。这些相互作用可包括离子键、共价键和疏水键。
所述结合或染色允许在纤维素水解之后，残余的纤维素更容易观察到/测量。在实施方案中，来自指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号的强度可用于指示一种或多种感兴趣的酶的质量参数。质量参数的非限定性实例包括一种或多种感兴趣的酶的性质，一种或多种感兴趣的酶的产物特异性，一种或多种感兴趣的酶的改善的产物特异性和/或改善的性质。在实施方案中，来自指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号的强度可用于指示一种或多种感兴趣的多肽的质量参数。
在实施方案中，所需的来自结合的指示剂成分如荧光指示剂化合物的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素分解。例如，信号如光信号可在一个样品中比另一个更明亮，指示更多纤维素存在于较明亮的样品中。此种指示警示本领域技术人员在较明亮的样品中的水解不如暗淡的(dull)或较不明亮的样品有效或完全。
因此，本公开除了其他方法之外，还提供了分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和检测来自所述指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。
此外，本公开除了其他方法之外，还提供了分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料(例如木素纤维素)与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和(d)检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。
在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：在含有指示剂成分的反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，感兴趣的多肽的纤维素分解增强活性，和/或由所述感兴趣的酶，单独或与感兴趣的多肽组合而水解的纤维素的量。在实施方案中，所述反应介质含有一种或多种感兴趣的酶，单独或与一种或多种感兴趣的多肽组合。
在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶和/或多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，感兴趣的多肽的纤维素分解增强活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述反应介质含有一种或多种感兴趣的酶，单独或与一种或多种感兴趣的多肽组合。
在实施方案中，本公开提供了分析感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的高通量方法，包括下述步骤：在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的生物质；和检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度预示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。在实施方案中，所述反应介质含有一种或多种感兴趣的酶，单独或与一种或多种感兴趣的多肽组合。
在实施方案中，本公开提供了分析感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的高通量方法，包括下述步骤：(a)将生物质与指示剂成分如荧光化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述指示剂成分的信号，其中信号强度预示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。
在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法，所述方法包括下述步骤：(a)将生物质与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会结合纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素水解。这些方法还可包括提供感兴趣的多肽的步骤。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。感兴趣的酶的其他非限定性实例包括这些野生型、突变体或变体酶的组合。感兴趣的多肽亦可通过这些方法衡量。此外，这些方法亦可包括添加感兴趣的多肽如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的步骤。
在实施方案中，本公开提供了分析酶和/或多肽性能的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料(例如木素纤维素材料)与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素材料)；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由反应介质成分如酶和/或多肽成分水解的纤维素的量。酶性能的非限定性实例包括在木素纤维素水解中纤维素衰变的指标。合适的酶的非限定性实例包括选自下组的酶：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。认为感兴趣的肽和/或肽片段对于依照本公开的分析是合适的感兴趣的组合物。
在实施方案中，本公开提供了分析生物质水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：在含有指示剂成分如荧光指示剂化合物的反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解含有纤维素的生物质；和检测来自荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的质量参数。此类方法可在系统中进行。
在实施方案中，本公开提供了分析生物质水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：(a)将生物质与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解所述生物质；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的质量参数。此类方法可在系统中进行。
在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶或多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会改变纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定所述水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，感兴趣的多肽的纤维素分解增强活性，和/或由所述感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽水解的纤维素的量。
在实施方案中，本公开提供了分析纤维素材料(例如木素纤维素材料如玉米秸秆)水解中的纤维素衰变的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料(例如木素纤维素材料)与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合于纤维素的条件下水解所述含有纤维素的纤维素材料；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽水解的纤维素的量。
在实施方案中，本公开提供了用于衡量酶性能的系统，所述系统包含：至少一个反应区，其中所述反应区用于分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中的纤维素衰变，所述反应区包含：至少一个用于下述的孔：(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由含有任何感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质水解的纤维素的量。在一个系统实施方案中，检测器位于反应介质之下，并位于反应容器所处于的平板之下。
在实施方案中，本公开提供了用于衡量酶性能的系统，所述系统包含：至少一个反应区，其中所述反应区用于分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中的纤维素衰变，所述反应区包含：至少一个用于下述的孔：在含有指示剂成分的反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的纤维素材料；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由含有任何感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质水解的纤维素的量。在实施方案中，下述步骤：(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触，发生在水解之前。然而，在实施方案中，涵盖了可在水解完全之后添加指示剂成分。
指示剂成分
在实施方案中，依照本公开的方法将一种或多种指示剂成分以有效量添加至纤维素水解中以结合或染色水解反应介质中的纤维素。所述反应介质可含有待分析的一种或多种感兴趣的酶和/或多肽，酶混合物，多肽混合物和/或酶和多肽的混合物。在实施方案中，依照本公开的方法将一种或多种指示剂成分以有效量添加至纤维素水解以指示一种或多种感兴趣的酶和/或多肽的质量参数。最优地，仅纤维素凸显于反应介质中，而指示剂化合物不凸显其他反应介质成分。然而，在实施方案中，主要是纤维素凸显于反应介质中，而少量其他成分亦由指示剂化合物凸显。应避免除了纤维素之外的反应混合物的成分的背景凸显，然而少量除了纤维素之外的其他成分的背景凸显并不会使得本公开的方法不准确。
依照本公开合适的指示剂成分的非限定性实例包括苯和联苯的苯乙烯衍生物，茋衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉或其混合物。这些指示剂成分可直接添加至水解中，或通过首先将纤维素材料如木素纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物。然后可将该混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触。在指示剂成分存在的情况下进行水解，如例如在反应介质中在所述指示剂成分会染色或结合纤维素的条件下水解含有纤维素的纤维素材料或木素纤维素材料。依照本公开使用所述指示剂成分，则来自剩余纤维素的信号可高至或强至来自未与依照本公开的指示剂成分接触的剩余纤维素的信号的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少100倍，至少1000倍，或至少10,000倍。此外，剩余纤维素的指标可变佳或改善至未与依照本公开的指示剂成分接触的水解反应的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少100倍，至少1000倍，或至少10,000倍。例如，所述指标的改善可体现在较短时间进行测定。
在实施方案中，依照本公开的方法将一种或多种指示剂成分以有效量添加至纤维素水解以指示水解中一种或多种感兴趣的酶和/或多肽的质量参数。因此，本公开的方法适于酶和/或多肽购买者检查例如产物稳定性和/或酶活性。而且，生产商可就品质保障目的来检查产物稳定性和活性。
在实施方案中，依照本公开的方法包括依照本公开以足以凸显纤维素的量添加一种或多种荧光指示剂成分。在实施方案中，以足以使反应介质中的纤维素发荧光或凸显的量添加荧光指示剂成分。供依照本公开使用的合适的荧光指示剂成分的非限定性实例包括苯和联苯的苯乙烯衍生物，茋衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉或其混合物。这些化合物的许多化学结构示于并描述于HaroldJ.McElhone的FluorescentWhiteningAgents,Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology,1994(通过全文提述并入本文)。
合适的茋衍生物的非限定性实例包括4,4’-二氨基茋-2,2’-二磺酸(4,4'-diaminostilbene-2,2'-disulfonicacid)的双三嗪基(bistriazinyl)衍生物。其他茋衍生物包括对硝基甲苯邻磺酸(p-nitrotolueneortho-sulfonicacid)和4,4’-二硝基茋-2,2’-二磺酸(4.4'-dinitrostilibene2.2'disulfonicacid)。在实施方案中，二氨基茋类(diaminostilbenes)适于用作供依照本公开使用的荧光指示剂成分。二氨基茋类的非限定性实例包括4,4’-二[4-苯胺基-6-二(2-乙基)氨基-s-三嗪-2-基氨基]-2,2’-二磺酸(4,4'-bis[4-anilino-6-bis(2-ethyl)amino-s-triazin-2-ylamino]-2,2'-disulfonicacid)(荧光增亮剂28或CalcofluorWhiteM2R牌增亮剂，可从获得)，和/或牌增亮剂。
4,4’-二[(4-苯胺基-6-二(2-羟乙基氨基)-s-三嗪-2-基)氨基]-2,2’-茋二磺酸可从获得，并具有如下所示的化学结构。
在实施方案中，供依照本公开使用的合适的指示剂成分是可从Bayer获得的牌增亮剂，并具有如下所示的一般化学结构。
在实施方案中，香豆素是供依照本公开使用的合适的指示剂成分。示于依照本公开使用的香豆素的非限定性实例是4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone)，其具有如下所示的化学式：
在实施方案中，任何能够使得纤维素凸显或发荧光以产生可检测信号的化合物可适于依照本公开使用。如用于本文中，指示剂成分是非限定的，且亦可包括光学增亮剂，增白剂。其他指示剂成分的非限定性实例包括来自PolysciencesInc.的Uvitex2B荧光染料，RyluxBSU牌光学增亮剂，FITC-标记的WGA(经FITC标记的麦胚凝集素)和/或ConA-外源凝集素(lectin)。
在实施方案中，所述指示剂成分并不改变水解的化学性质或使得水解更有利。在实施方案中，所述指示剂成分并不凸显反应介质中的其他成分。因此，最小化或避免了破坏性背景凸显。
在实施方案中，4,4’-二[(4-苯胺基-6-二(2-羟乙基氨基)-s-三嗪-2-基)氨基]-2,2’-茋二磺酸适于供依照本公开使用。该化学物，亦称作荧光增亮剂28(FB28)，是二氨基茋化合物，能够结合纤维素。不拘于本公开，认为在荧光增亮剂28结合于纤维素之后，纤维素羟基基团的振动受限。因此，该结合主要是由于氢键。然而，二氨基茋增亮剂的结构可暗示芳香环的p电子系统之间的堆积和葡糖单元堆积的环亦可在结合中起作用。
在实施方案中，适用于洗涤剂(washingdetergent)的荧光增亮剂适于供依照本公开使用。不拘于任何理论，此类增亮剂可由于不可见UV范围的光吸收，和在蓝光范围的发射而起作用。结合纤维素使得荧光增亮剂与未结合的荧光增亮剂相比量子产率增加。
在实施方案中，4,4’-二[(4-苯胺基-6-二(2-羟乙基氨基)-s-三嗪-2-基)氨基]-2,2’-茋二磺酸适用于检测纤维素、壳多糖和甘露聚糖。认为该化学物的优异结合特异于具有β(1-3)-和β(1-4)-连接的D-吡喃葡糖基单元的多糖。
在实施方案中，其他适于用作增亮剂的化合物包括Uvitex2B，RyluxBSU，以及FITC-标记的WGA-和ConA-外源凝集素。
在实施方案中，依照本公开适于用作指示剂成分的荧光染料包括萘二酰亚胺(naphthalimide)染料，香豆素染料，呫吨染料，噻吨染料，萘内酰胺(naphtholactam)染料，二氢噁唑酮染料，甲烷染料，噁嗪和噻嗪染料，及其组合。以足以凸显水解反应之后的残余的纤维素的量添加染料。不应以产生反应介质其他成分过量的背景凸显的量添加染料。
在实施方案中，本公开的指示剂成分示于产生信号。所述信号可为电磁辐射如电磁谱上的光线。例如，所述信号可以以具有电磁谱的UV、Vis或NIR部分的波长为特征。在实施方案中，所述信号以化学发光，或任何其中能量以与其吸收的波长不同的波长从物质发射的过程为特征。在实施方案中，所述信号以荧光性或具有荧光为特征。荧光信号具体体现为下述现象：其中电子去激发(de-excitation)几乎自发进行，且其中当移除激发源时，来自发光物质的发射停止。因此，认为本文中的实施方案包括激发所述指示剂成分的步骤。例如，可将电磁辐射施于所述指示剂成分从而使得其以预决的强度发射能量或信号。
在实施方案中，所述信号使得其可由微板读数器检测。微板读数器是设计用于检测一个或多个微滴定板中样品的生物、化学或物理事件的实验室仪器。样品反应可在除了其他形式之外，6-1536孔形式的微滴定板中进行测定。通常，高强度的灯将光传至微滴定孔，而由在微板孔中发生的反应发射的光通过检测器定量。常用于微板测定的检测模式为吸光度、荧光强度、发光度、时间分辨荧光度和荧光偏振。
底物
适于依照本公开使用的底物是任何依照本公开在反应介质中受水解反应的材料。适于依照本公开使用的底物包括纤维素。适于依照本公开使用的底物的非限定性实例包括生物质、纤维素材料、木素纤维素或木素纤维素材料，经预处理的木素纤维素材料，草底物(grassysubstrate)，高果胶植物，玉米秸秆，经预处理的玉米秸秆或PCS，或这些材料的组合。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料的非限定性实例包括草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和/或纸浆与造纸厂残余物，及其组合。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。纤维素材料的其他非限定实例包括玉米秸秆，玉米纤维，稻秆，纸和纸浆加工废物，木本或草本植物或甘蔗渣。纤维素材料的其他非限定性实例包括受使用本领域已知的常规方法预处理的纤维素材料。例如，物理预处理方法可包括多种类型的磨制，辐射，汽蒸/蒸汽爆炸，和水热解；化学预处理技术可包括稀酸，碱，有机溶剂，氨，二氧化硫，二氧化碳和pH控制的水热解；而生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如Hsu,T.A.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol：ProductionandUtilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,D.C.,179-212;Ghosh,P.和Singh,A.,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview，inEnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker，J.O.和Overend,R.P.编,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety，Washington,D.C.,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,inAdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper，T.编,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany，65:207-241;Olsson,L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;以及Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
在实施方案中，一种合适的底物是经预处理的玉米秸秆或“PCS”。PCS指来源于玉米秸秆，经受一个或多个预处理步骤的纤维素材料。PCS的非限定性实例是来源于玉米秸秆并与热和稀酸相接触的纤维素材料。在本公开的实施方案中，可通过美国专利号7,271,244(通过提述以其整体并入本文)的实施例9中所述的方法，或其在时间、温度和酸量的变型来制备PCS。实施例和附图亦指称PCS-A、PCS-B和PCS-C。在此，添加A、B和C仅是为了表明每个指明的PCS指代经受不同预处理的来源于玉米秸秆的纤维素材料。
如用于本文中，术语“生物质”指可再生的有机物质。生物质的非限定性实例包括农业作物和残余物，木材和木材废物，动物废物，水生植物以及城市和工业废物的有机成分。植物生物质的非限定性实例可指草底物，高纤维素底物，木本植物底物，高果胶底物和/或其混合物或组合。
如用于本文中，“草底物”指是草的植物生物质。草底物的非限定性实例包括梯牧草(timothygrass)、百慕大草(bermudagrass)，象草(napiergrass)，高粱和/或柳枝稷(switchgrass)，以及其混合物和/或组合。草底物的其他非限定性实例包括下述之一或其成员：高粱属种(Sorghumspp.)(例如高粱(Sorghumbicolor))，芒草属种(Miscanthusspp.)(例如芒(Miscanthussinesis))，甘蔗属种(Saccharumspp.)(例如Saccharumravennae)，玉蜀黍属种(Zeaspp.)(例如玉蜀黍(Zeamays))，黍属种(Panicumspp.)(例如柳枝稷(Panicumvirgatum))，狗牙根属种(Cynodonspp.)(例如狗牙根(Cynodondactylon)、Cynodontransvaalensis、Cynodonmagennissii等)，梯牧草属种(Phleumspp.)(例如梯牧草(Phleumpratense))或狼尾草属种(Pennisetumspp)(例如Pennisetumpurpureum)。草底物的非限定性实例还包括杂种草，如例如Miscanthusgiganteus或芒草属种和甘蔗属种的杂种(例如芒蔗(miscane)和能源甘蔗(energycane))。高纤维素底物的非限定性实例包括含有至少50%纤维素的植物材料，如例如棉(棉属种(Gossypiumspp.))和来自例如松(松属种(Pinusspp.))或白杨(杨属种(Populusspp.))的木浆。高果胶植物生物质底物的非限定性实例包括含有至少0.5%果胶的植物材料，如例如苹果、杏、柑橘、糖甜菜和其他果实和植物/蔬菜。
在实施方案中，木素纤维素是供依照本公开使用的合适底物。木素纤维素的结构起始并不能直接受酶水解作用。因此，在实施方案中，对含木素纤维素材料进行预处理，例如，通过在充分的压力和温度条件下进行酸水解，以打破木质素密封(ligninseal)并破坏纤维素的晶态结构。预处理可导致半纤维素和纤维素级分的溶解。然后依照本公开可酶水解纤维素和半纤维素，例如，通过纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶，或依照本公开一种或多种感兴趣的酶。可能需要将糖聚合物转化为可发酵的糖，其可发酵为发酵产物，例如乙醇。任选地，可回收发酵产物，例如，通过亦如上所述的蒸馏。含木素纤维素材料可依照本公开使用本领域已知方法进行预处理。在实施方案中，依照本公开水解，例如酶水解经预处理的材料。预处理的目的是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素而且此方式改进了酶水解的速率。
依照本公开预处理可以是使用本领域已知的常规预处理步骤。预处理可发生在含水浆料(aqueousslurry)中。含木素纤维素材料在预处理过程中可以以10-80wt.%，例如20-50wt.%的量存在。
在实施方案中，含木素纤维素材料可以在水解之前以化学、机械和/或生物方法进行预处理。机械处理(常常称作物理预处理)可以单独使用或与后续或同时的水解(特别是酶水解)组合使用，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在实施方案中，所述化学、机械和/或生物预处理在水解之前进行。或者，所述化学、机械和/或生物预处理与水解同时进行，如与一种或多种纤维素分解酶，其它下文所述酶活性，和/或一种或多种感兴趣的酶的加入同时进行，以释放例如可发酵的糖，如葡萄糖和/或纤维二糖。
在本公开的实施方案中，在水解步骤之前或之后对经预处理的含木素纤维素材料进行洗涤和/或脱毒。这可改善例如经稀酸水解的含木素纤维素材料，如玉米秸秆的可发酵性。脱毒可以以任何合适的方式进行，例如通过液体级分的树脂或木炭处理、汽提、蒸发、离子交换，或通过洗涤经预处理的材料进行。
依照本公开，术语“化学预处理”是指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的化学处理。合适的化学预处理步骤的非限定性实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行的处理。另外，湿氧化和pH受控的水热解(hydrothermolysis)也是所考虑的化学预处理。
在实施方案中，化学预处理是酸处理，例如，是连续的稀酸和/或弱酸(mildacid)处理，如用硫酸，或另一有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物进行的处理。也可以使用其它酸。在本公开的语境中弱酸处理是指处理pH处于1-5，例如pH1-3。在一个具体的实施方案中，酸的浓度为0.1-2.0wt.%的酸，例如硫酸。可以将酸与依照本公开待发酵的材料混合或接触，并且可以将所述混合物在160-220℃，例如165-195℃的温度范围保持数分钟至数秒，例如，1-60分钟，例如2-30分钟或3-12分钟。可以应用强酸如硫酸的加入来去除半纤维素。这使纤维素的可消化性增强。
依照本公开还涵盖的纤维素溶剂处理，已显示其将大约90%的纤维素转化成葡萄糖。也显示了当木素纤维素结构被破坏时酶水解能够大幅增强。碱、H2O2、臭氧、有机溶剂(organosolv)(使用含水醇(aqueousalcohol)中的路易斯酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二烷(dioxane)、酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等,BioresourceTechnology96(2005),p.673-686)。
使用碱例如NaOH、Na2CO3和/或氨等的碱性化学预处理也在本公开的范围内。使用氨的预处理方法在例如WO2006110891、WO2006110899、WO2006110900和WO2006/110901中描述(将它们通过全文提述并入本文)。
湿氧化技术涉及氧化剂的使用，所述氧化剂如：基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的非限定性实例包括使用DMSO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1-60分钟，如5-30分钟，但也可以进行更短或更长的时间，其取决于要预处理的材料。
合适预处理方法的其它非限定性实例描述于Schell等,2003,Appl.BiochemandBiotechn.105-108:69-85,以及Mosier等,2005,BioresourceTechnology96:673-686,以及美国公开号2002/0164730，将这些参考文献通过提述全部并入本文。
如用于本文的语境中，术语“机械预处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械或物理预处理。机械预处理的非限定性实例包括多种类型的磨制、辐照(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆炸和水热解。
机械预处理包括粉碎(机械减小粒度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratoryballmilling)。机械预处理可以包括高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本公开的一个实施方案中，高压是指量为300-600psi，例如400-500psi，或例如大约450psi的压力。在本公开的一个实施方案中，高温是指范围在大约100-300℃，例如大约140-235℃的温度。在实施方案中，机械预处理是一种分批过程的蒸汽枪水解仪系统(abatch-process,steamgunhydrolyzersystem)，其使用如上限定的高压和高温。为此可使用Sunds水解仪(可从SundsDefibratorAB(Sweden)获得)。
在本公开的实施方案中，将化学和机械预处理一同进行，涉及，例如稀酸或弱酸预处理以及高温和高压处理。化学和机械预处理可以根据需要顺次进行或同时进行。
因此，在实施方案中，对所述含木素纤维素材料进行化学和机械预处理两者以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在实施方案中，预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸步骤(或AFEX预处理步骤)进行。
如用于本公开中，术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol：ProductionandUtilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.和Singh,A.,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview，inEnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety，Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper，T.编,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany，65:207-241；Olsson,L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander,L.和Eriksson,K.-E.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
在实施方案中，生物预处理涉及将木质素降解酶施用于木质素或经预处理的材料。合适的木质素降解酶的非限定性实例包括一种或多种木质素分解酶，一种或多种氧还酶，及其组合。木质素分解酶的非限定性实例包括锰过氧化物酶，木质素过氧化物酶和纤维二糖脱氢酶，及其组合。合适的预处理酶的非限定性实例还包括一种或多种漆酶，一种或多种纤维二糖脱氢酶，及其组合。
在实施方案中，木质素过氧化物酶如“木质素酶”，EC编号1.14.99，适于供依照本公开使用。
在一个实施方案中，可从Zymetis获得的EthazymeTMPre适用于依照本公开的预处理。
在实施方案中，经预处理的玉米秸秆适于依照本公开用作底物。PCS的非限定性实例为来源于玉米秸秆并与热和稀酸接触过的纤维素材料。在本公开的实施方案中，PCS可通过美国专利号7,271,244(通过全文提述并入本文)的实施例9中所述的方法，或其在时间、温度和酸量上的变型来制备。
水解
在实施方案中，依照本公开的方法在反应介质中在所述指示剂成分会结合和/或染色纤维素的条件下水解纤维素材料。酶水解可在本文中所述的条件下在合适的水性环境中进行。在实施方案中，水解在对于所讨论的感兴趣的酶和/或多肽合适或最适的条件下进行。合适的工艺时间、温度和pH条件描述于本文。在实施方案中，水解在25℃至70℃，例如40至60℃的温度进行，或者，在实施方案中，在大约50℃进行。在实施方案中，水解步骤在10℃至90℃进行。在实施方案中，水解步骤可在pH为3-8，例如pH4-8或4-6的范围进行。
水解通常进行1至150小时，例如60至80小时，或在实施方案中，1至5小时。例如，使用96孔板，至少96个感兴趣的酶可进行水解72小时。
在实施方案中，反应介质具有10-1000μl的体积。然而，反应介质的体积可由本领域技术人员进行调整。适于供依照本公开使用的反应介质的非限定性体积包括5-10,000μl，或在实施方案中为10-5000μl，或在实施方案中为20-2500μl，或在实施方案中为50-1500μl，或在实施方案中为100-900μl或在实施方案中为100-500μl，或在实施方案中为100-300μl，或在实施方案中为10-200μl或在实施方案中为约100μl，150μl，200μl，300μl，400μl，500μl，600μl或700μl。在实施方案中，反应介质具有10-1000μl的体积。在实施方案中，反应介质具有100-500μl的体积。在实施方案中，反应介质具有250-300μl的体积。
在实施方案中，所述反应介质配有包含至少两个孔的多孔板。例如，包含12、24、96、384、1536或3456个孔的多孔板适于供依照本公开使用。合适的板包括由聚丙烯制成的板。在实施方案中，这些孔是密封的，例如，反应介质可配置在至少两个密封的孔中。
在实施方案中，将一种或多种感兴趣的酶以足以水解20%至100%底物的量添加至反应介质。例如，若底物是木素纤维素材料，将一种或多种感兴趣的酶以足以水解20%至100%木素纤维素材料的量添加至反应介质。在实施方案中，将感兴趣的酶以足以水解木素纤维素的量添加。在实施方案中，将一种或多种感兴趣的多肽以足以水解20%至100%底物的量添加至反应介质。
在实施方案中，将一种或多种感兴趣的酶和/或多肽以0.1ng至10g的量添加至一个或多个孔或反应介质。在实施方案中，将一种或多种感兴趣的酶和/或底物以0.005g至10g的量添加至每个孔。在实施方案中，将一种或多种感兴趣的酶和/或底物以0.1ng至10mg的量添加至每个孔或反应。在实施方案中，将一种或多种感兴趣的酶和/或底物以0.1μg至300μg的量添加至每个孔或反应。其他非限定性实例包括足以水解30%至100%底物，40%至100%底物，50%至100%底物，60%至100%底物，70%至100%底物，80%至100%底物，90%至100%底物或约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%底物的量的一种或多种感兴趣的酶和/或多肽。
在实施方案中，所述反应介质包括缓冲系统。例如，5mM柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液适于供依照本公开使用。在实施方案中，含10mM硫酸锰的0.5M乙酸钠pH5.0适用于水解反应。涵盖了缓冲液储液可用于稀释水解反应1-30倍，包括10倍。
在实施方案中，所述反应介质包含0-500mM盐。在实施方案中，所述反应介质包含10-500mM盐或50-300mM盐。适于供依照本公开使用的盐的一个非限定性实例是NaCl。
在实施方案中，所述反应介质包含一种或多种表面活性剂。在实施方案中，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂，商业上可获得的80牌表面活性剂(ICISpecialties)，或任何其他60牌系列产品，其为POE山梨坦衍生物。其他非限定性的合适非离子型表面活性剂包括来自HighPointChemicalCorp.的D1600牌表面活性剂；D1600牌表面活性剂是烷氧化的脂肪酸。此外，芳基烷基聚醚醇(arylalkylpolyetheralcohol)，例如UnionCarbide的牌表面活性剂X-100系列的表面活性剂；聚乙二醇的烷基苯基醚(alkylphenyletherofpolyethyleneglycol)，例如UnionCarbide的Tergitol牌表面活性剂系列的表面活性剂；烷基酚环氧乙烷缩合产物(alkylphenolethyleneoxidecondensationproducts)，例如RhonePoulenc，Incorporated的Igepal牌表面活性剂系列的表面活性剂。在实施方案中，可使用阴离子型表面活性剂。适于供依照本公开使用的阴离子型表面活性剂的非限定性实例为：来源于12至14碳直链伯醇的硫酸化乙氧化物(sulfatedethoxylate)的铵盐或钠盐；如Vista的Alfonic牌表面活性剂1412A或1412S，和磺酸化的萘甲醛缩合物(sulfonatednaphthaleneformaldehydecondensates)，例如Rohm和Haas的Tamol牌表面活性剂SN。在实施方案中，可使用阳离子型表面活性剂。合适的阳离子型表面活性剂包括咪唑化合物，例如Ciba-Geigy的Amasoft牌表面活性剂16-7和Sapamine牌表面活性剂，P季铵化合物；QuakerChemicals的Quaker牌表面活性剂2001；以及AmericanCynanamid的Cyanatex牌表面活性剂。
在实施方案中，所述反应介质具有约0.5%至10%的总固形物。在实施方案中，所述反应介质包含0.5%至10%总固形物。在实施方案中，所述反应介质包含1%至9%总固形物。在实施方案中，所述反应介质包含2%至8%总固形物。在实施方案中，所述反应介质包含3%至7%总固形物。在实施方案中，所述反应介质包含4%至6%总固形物。在实施方案中，所述反应介质包含1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%或10%总固形物。在实施方案中，以这些量添加PCS。
在实施方案中，水解是使用一种或多种感兴趣的酶或感兴趣的酶的混合物通过酶法进行的。
在实施方案中，水解是使用一种或多种感兴趣的多肽或感兴趣的多肽的混合物通过酶法进行的。
在实施方案中，水解是使用一种或多种酶和一种或多种感兴趣的多肽或感兴趣的酶和多肽的混合物通过酶法进行的。
缓冲液、离子强度、温度、抑制剂和表面活性剂添加的作用描述于下文实施例3中。在实施方案中，柠檬酸和乙酸缓冲液是可接受供依照本公开使用的；pH工作范围为5至6；本公开的方法的可接受的温度为50℃。已发现依照本公开的方法并不受添加多至200mMNaCl的影响。此外，抑制剂如乙醇并不干扰依照本公开的方法。
在实施方案中，依照本公开方法中可使用pH范围5至6的柠檬酸、乙酸和BIS/TRIS缓冲液。在实施方案中，pH7是可行的，例如当进行完全水解反应时。
在实施方案中，依照本公开的方法在50至60℃的温度运行非常良好。
在实施方案中，反应介质的总固形物或“TS”是1-5%，例如3%或4%TSPCS的量。在实施方案中，PCS以0.4-0.7g纤维素每gPCS的量含有纤维素。例如，PCS可含有0.55g纤维素每gPCS。在实施方案中，例如当使用根据WO2008/151079获得的酶组合物如里氏木霉纤维素分解蛋白组合物(里氏木霉菌株RutC30培养液，包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白)时，可将0.01-200mgEP酶组合物/g纤维素包含于水解反应中，例如4mg/g纤维素。在实施方案中，反应体积为10-1000μL，例如250μL。
在实施方案中，所述反应介质是液体，例如基本上为水性的液体如水。
感兴趣的酶和多肽
应理解的是，依照本公开的方法涉及分析、筛选和/或衡量单独的酶或与感兴趣的多肽组合的酶，和感兴趣的酶/多肽混合物。认为这些方法适用于一种或多种已知的酶或已知的酶混合物，未知的酶或未知的酶混合物，或已知的和未知的酶的组合，或感兴趣的酶混合物。进一步认为本公开的方法适用于下述酶或酶混合物，其包含一种或多种新颖的，或在提交本公开时尚未发现的酶。还认为依照本公开的方法适用于已知的酶；然而此类已知的酶可具有未知的特征，例如未知的纤维素分解活性。
认为这些方法适用于一种或多种已知的多肽或已知的多肽混合物，未知的多肽或未知的多肽混合物，或已知的和未知的多肽的组合，或感兴趣的多肽混合物。进一步认为本公开的方法适用于下述多肽或多肽混合物，其包含一种或多种新颖的，或在提交本公开时尚未发现的多肽。还认为依照本公开的方法适用于已知的多肽；然而此类已知的多肽可具有未知的特征，例如未知的纤维素分解增强活性。
即便未在本公开的方法或工艺的语境中特别提及，应理解的是感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是以有效量使用的。例如，酶的有效量可指依照本公开足以诱导对依照本公开的工艺的特定正面益处的酶量。所述正面益处可涉及活性，例如，针对底物的活性。例如，所述益处可为纤维素分解水解。
如上讨论，水解是使用一种或多种感兴趣的酶或感兴趣的酶的混合物通过酶法进行的。认为感兴趣的酶包括变体酶、突变体酶、野生型酶、杂合酶或其具有感兴趣的酶活性的片段。
还认为感兴趣的酶适用于纤维素水解，因为本公开的方法涉及测量感兴趣的酶的纤维素分解活性。因此，感兴趣的酶包括但不限于那些可能对纤维素水解有益的酶。感兴趣的酶的非限定性实例包括亲本纤维素酶通过取代、插入和/或缺失而衍生的新颖的和/或已知的纤维素酶变体。依照本公开的纤维素酶变体可为具有不见于自然界的氨基酸序列的纤维素酶变体或突变的纤维素酶。适用于本公开的方法的纤维素变体因此可显示改善的性能，特别是对于增加的纤维素分解酶活性。还认为此类纤维素酶变体具有改善的催化活性性能；和/或改变的对阴离子型表面活性剂(tenside)的敏感性；和/或改变的最适pH；和/或改变的热稳定性。在实施方案中，适用于依照本公开的方法的纤维素酶变体或突变的纤维素酶包括那些被认为是亲本纤维素酶(即天然或野生型酶)的功能性衍生物的酶，且可通过改变编码亲本酶的亲本基因或其衍生物的DNA核苷酸序列来获得。当将编码所述纤维素酶变体的DNA核苷酸序列插入合适的宿主生物中的合适的载体时，可表达和产生所述纤维素酶变体或突变的纤维素酶。所述宿主生物无需与所述亲本基因所来源的生物相同。
还认为感兴趣的多肽适用于纤维素水解，因为本公开的方法涉及测量感兴趣的多肽的纤维素分解活性。感兴趣的多肽的非限定性实例包括根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat和Bairoch,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696(两者均通过全文提述并入本文)属于糖基水解酶家族3、5、6、7、10、11和61的多肽。
还认为一种或多种感兴趣的酶或多肽可来源于通过本领域已知方法诱变的亲本细胞。例如，亲本细胞的诱变可通过亲本细胞的辐照，例如UV、X射线或伽马辐射来达成。此外，诱变可通过用化学诱变剂例如亚硝酸、亚硝胺、甲基亚硝基胍以及碱基类似物如5-溴尿嘧啶来获得。认为诱变剂可施用于亲本株的孢子，并将存活的孢子铺板以在固体培养基上生长。还应理解的是，在缺乏特别的诱变步骤(无论是选择、筛选或选择和筛选的组合)时，突变体亦可为群体中天然存在的变体。对于镰孢属(Fusarium)菌株A3/5形态突变体的分离，参见，例如Wiebe等,1992,MycologicalResearch96:555-562和Wiebe等,1991,MycologicalResearch95:1284-1288。因此，就本公开而言，术语“突变体”还涵盖非刻意施用诱变剂而天然存在的变体或突变体，即自发突变体。进一步认为经诱变的亲本细胞可为丝状真菌亲本细胞。丝状真菌的非限定性实例包括所有分类真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,于，AinsworthandBisby′sDictionaryofTheFungi,第8版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定义)的丝状形式。丝状真菌的特征为包含壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖或其他复杂多糖的营养菌丝体。营养生长是通过菌丝延伸，而碳代谢是专性需氧的。
非限定性的感兴趣的酶包括一种或多种野生型、突变体或变体水解酶(根据酶命名法为E.C.3类)，例如一种或多种野生型、突变体或变体糖酶，包括纤维素分解酶和半纤维素分解酶，或其杂合体或片段，及其组合。此外，蛋白酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等亦可存在于水解过程中，因此视作感兴趣的酶。
在实施方案中，酶制备物含有一种或多种下述活性：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀素和木糖异构酶。在实施方案中，所述纤维素酶优选为一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在实施方案中，所述半纤维素酶优选为一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶和木糖苷酶。
在实施方案中，合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括一种或多种选自下组的酶：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。这些酶可单独存在或在酶混合物中与其他感兴趣的酶组合。还认为感兴趣的酶包括杂合酶，如前述感兴趣的酶的杂合体。还认为感兴趣的酶包含前述感兴趣的酶的片段，包括具有活性如感兴趣的酶活性的片段。例如，感兴趣的纤维素酶的片段会具有纤维素酶活性，而感兴趣的淀粉酶的片段会具有淀粉酶活性。
感兴趣的具有纤维素分解活性的酶和/或多肽
认为感兴趣的酶包括一种或多种分类(EC3.2.1.91)下的酶，以及纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，具有内切葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)的酶。
至少三类酶对于将纤维素转化为可发酵的糖是重要的：随机切割纤维素链的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)；从纤维素链端切割纤维二糖基单元的纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化为葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。在这三类涉及纤维素生物降解的酶中，显示纤维二糖水解酶为降解天然晶态纤维素的关键酶。
在实施方案中，所述纤维素分解活性可为真菌来源的酶制备物的形式，如来自木霉属(Trichoderma)的菌株，或里氏木霉(Trichodermareesei)的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，或特异腐质霉(Humicolainsolens)的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，或Chrysosporiumlucknowense的菌株(参见，例如来自DyadicInc,USA的美国申请公开号2007/0238155)。
在实施方案中，酶组合物为共同待决的申请美国申请序列号60/941,251(通过全文提述并入本文)中涉及的组合物。在实施方案中，所述酶制备物包含具有纤维素分解增强活性的多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，或公开于WO2005/074656，WO2008/148131，WO2005/074656，WO2010/065830，WO2007/089290WO2009/085935，WO2009/085859，WO2009/085864和WO2009/085868(Novozymes)的GH61多肽之一。所述酶制备物还可包含β-葡糖苷酶，例如来源于木霉属、曲霉属或青霉属(Penicillium)菌株的β-葡糖苷酶，包括共同待决的美国申请序列号60/832,511(PCT/US2007/074038)(Novozymes)中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在实施方案中，所述酶制备物还可包含CBHII酶，例如土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在实施方案中，所述酶制备物还可包含纤维素分解酶，例如来源于里氏木霉、特异腐质霉和/或Chrysosporiumlucknowense的纤维素分解酶。
在实施方案中，所述酶制备物还可包含公开于WO2005/074656中的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；β-葡糖苷酶(US60/832,511或PCT/US2007/074038中公开的融合蛋白)以及来源于里氏木霉的纤维素分解酶。
在实施方案中，所述酶制备物可包含公开于WO2005/074656中的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；β-葡糖苷酶(US60/832,511或PCT/US2007/074038中公开的融合蛋白)；来自土生梭孢霉的CBHII酶(CEL6A)；以及来源于里氏木霉的纤维素分解酶。
在实施方案中，所述酶制备物为商业上可获得的产品如CELLICTMCtec(NovozymesA/S)，CELLUCLASTTM(NovozymesA/S)，NOVOZYMTM188(NovozymesA/S)，CELLUZYMETM(NovozymesA/S)，CEREFLOTM(NovozymesA/S)，和ULTRAFLOTM(NovozymesA/S)，ACCELERASETM(GenencorInt.)，LAMINEXTM(GenencorInt.)，SPEZYMETMCP(GenencorInt.)，ROHAMENTTM7069W(GmbH)，LDI(DyadicInternational，Inc.)，LBR(DyadicInternational，Inc.)，或150L(DyadicInternational,Inc.)。
纤维素分解活性可以以0.1-100FPU每克总固体(TS)，或在实施方案中以0.5-50FPU每克TS，或1-20FPU每克TS的剂量加入。
感兴趣的内切葡聚糖酶(EG)
内切葡聚糖酶是适于供依照本公开使用的感兴趣的酶。内切葡聚糖酶的非限定性实例包括来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，例如Chrysosporiumlucknowense的菌株的那些。
感兴趣的纤维二糖水解酶(CBH)
纤维二糖水解酶依照本公开是合适的感兴趣的酶。如用于本文中，术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)。此类酶能够在纤维素，纤维寡糖或任何含有β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中催化1,4-β-D-葡糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖。
纤维二糖水解酶的非限定性实例为上面提及的，包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBHI和CBHII；和来自土生梭孢霉的CBHII纤维二糖水解酶(CELL6A)。
纤维二糖水解酶活性可根据由Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279和由vanTilbeurgh等,1982,FEBSLetters149:152-156;vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288描述的方法来确定。所述Lever等的方法适用于评估玉米秸杆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等的方法适用于基于荧光二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)来确定纤维二糖水解酶的活性。
感兴趣的β-葡糖苷酶
β-葡糖苷酶依照本公开，特别是在水解过程中，是合适的感兴趣的酶。如用于本文中，术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.21)。此类酶通常适于催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本公开而言，β-葡糖苷酶活性根据由Venturi等,2002,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法确定，只是如本文所述使用不同的条件。一单位的β-葡糖苷酶活性定义为在100mM柠檬酸钠、0.01%20中在50℃、pH5自作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚。
在实施方案中，依照本公开的β-葡糖苷酶为真菌来源，例如木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。β-葡糖苷酶的非限定性实例包括来源于里氏木霉的β-葡糖苷酶，如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP562003的图1)，或来源于米曲霉(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(根据WO20/095014的实施例22在米曲霉中重组产生；WO2005/047499)，黑曲霉(Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980)，棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(Kawaguchi等,1996,Gene173:287-288)或巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)(WO2007/019442)的β-葡糖苷酶。
其他可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于使用根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分类的多个糖基水解酶家族。
感兴趣的具有纤维素分解增强活性的多肽
具有纤维素分解增强活性的多肽使由具有纤维素分解活性的蛋白催化的木素纤维素衍生材料的水解增强，即减少达到相同程度的水解所需的纤维素分解酶的量至少1.01倍，或至少1.05倍，或至少1.10倍，或至少1.25倍，或至少1.5倍，或至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少20倍。
在实施方案中，水解和/或发酵是在纤维素分解酶与具有增强活性的多肽组合的存在下进行的。在实施方案中，具有增强活性的多肽是家族GH61多肽。WO2005/074647和WO2008/148131公开了来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO2005/074656和WO2010/065830公开了来自橙橘热子囊菌的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO2007/089290公开了来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO2009/085935、WO2009/085859、WO2009/085864和WO2009/085868公开了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO2008/151043公开了增加具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的方法，即将可溶性的活化二价金属阳离子添加至包含所述具有纤维素分解增强活性的多肽的组合物。
感兴趣的半纤维素分解酶
半纤维素分解酶依照本公开是合适的感兴趣的酶。例如，可对经预处理的含木素纤维素材料进一步施以一种或多种半纤维素分解酶，例如一种或多种半纤维素酶。
半纤维素可由半纤维素酶和/或酸水解分解以释放其五和六碳糖组分。
在实施方案中，用一种或多种半纤维素酶处理木素纤维素衍生的材料。
可使用任何适用于水解半纤维素，例如水解为木糖的半纤维素酶。半纤维素酶的非限定性实例包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶以及上述两种或更多种的混合物。在实施方案中，用于本公开的半纤维素酶为外作用的(exo-acting)半纤维素酶。在实施方案中，所述半纤维素酶为下述的外作用的半纤维素酶，其具有在pH7以下，或在实施方案中pH3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适用于本公开的半纤维素酶的非限定性实例包括VISCOZYMETM(可自NovozymesA/S,Denmark得到)。
在一个实施方案中，所述半纤维素酶为木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可为微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属(Trichoderma)、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属(Humisola)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus))。在实施方案中，所述木聚糖酶来源于丝状真菌，例如来源于曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)或烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(WO2006/078256)的菌株；梭孢壳属，例如土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)(WO2009/079210)的菌株，或腐质霉属，例如疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可为内-1,4-β-木聚糖酶，或GH10或GH11的内-1,4-β-木聚糖酶。
商业木聚糖酶的非限定性实例包括SHEARZYMETM(NovozymesA/S)，CELLICTMHtec(NovozymesA/S)，BIOFEEDWHEAT(NovozymesA/S)，(NovozymesA/S)，(NovozymesA/S)，HC(NovozymesA/S)，Xylanase(Genencor)，TX-200A(ABEnzymes)，HSP6000Xylanase(DSM)，DEPOLTM333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)，DEPOLTM740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)，和DEPOLTM762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)。
在实施方案中，所述半纤维素酶是β-木糖苷酶。在实施方案中，所述β木糖苷酶来源于里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)，埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。
在实施方案中，所述半纤维素酶是乙酰木聚糖酯酶。在实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶来源于红褐肉座菌(Hypocreajecorina)(WO2005/001036)，粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)(UniProt登录号q7s259)，土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)NRRL8126(WO2009/042846)，球毛壳(Chaetomiumglobosum)(Uniprot登录号Q2GWX4)，细丽毛壳(Chaetomiumgracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)，Phaeosphaerianodorum(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicolainsolens)(WO2009/073709)。
在实施方案中，所述半纤维素酶是阿魏酸酯酶。在实施方案中，所述阿魏酸酯酶来源于特异腐质霉(Humicolainsolens)(WO2009/076122)，粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)(UniProt登录号A1D9T4)。
在实施方案中，所述半纤维素酶是阿拉伯呋喃糖苷酶。在实施方案中，所述阿拉伯呋喃糖苷酶来源于特异腐质霉(Humicolainsolens)(WO2009/073383)和黑曲霉(Aspergillusniger)(GeneSeqP登录号AAR94170)。
在实施方案中，所述半纤维素酶是α-葡糖醛酸糖苷酶。在实施方案中，所述α-葡糖醛酸糖苷酶来源于棒曲霉(Aspergillusclavatus)(UniProt登录号alcc12)，里氏木霉(Trichodermareesei)(Uniprot登录号Q99024)，埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(UniProt登录号Q8X211)，黑曲霉(Aspergillusniger)(Uniprot登录号Q96WX9)，土曲霉(Aspergillusterreus)(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(SwissProt登录号Q4WW45)
在实施方案中，半纤维素酶以有效水解半纤维素的量添加，如，以约0.001至0.5wt%总固体(TS)，或在实施方案中以约0.05到0.5wt%TS的量添加。
木聚糖酶也可以0.001-1.0g/kgDM或干物质底物的量，或在实施方案中以0.005-0.5g/kgDM底物的量，或在实施方案中以0.05-0.10g/kgDM底物的量添加。
其他可用于水解的感兴趣的酶的非限定性实例包括下述酶的野生型、突变体或变体。
感兴趣的α-淀粉酶
依照本公开任何α-淀粉酶可用作感兴趣的酶，如细菌、真菌或植物来源的。例如，所述α-淀粉酶可为酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。短语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，当其以有效量添加时，在3到7，或在实施方案中3.5到6，或在实施方案中4-5的范围内的pH具有最佳活性。
感兴趣的细菌α-淀粉酶
在实施方案中，适于供依照本公开用作感兴趣的酶的细菌α-淀粉酶包括那些来源于芽孢杆菌属的。所述芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的菌株，但也可来源于其他芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的非限定性实例包括示于WO1999/19467的SEQIDNO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO1999/19467的SEQIDNO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO1999/19467的SEQIDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列均通过全文提述并入本文)。在实施方案中，所述α-淀粉酶可为与分别示于WO99/19467的SEQIDNO:1，2或3中的任何序列具有至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少96%，或至少97%，或至少98%或至少99%的同一性程度的酶。
所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是描述于WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10355(所有文件通过全文提述并入本文)中任一的变体和/或杂合体。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利6,093,562、6,297,038或美国专利6,187,576号(通过全文提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，或WO1996/023873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过全文提述并入本文)，例如与WO99/19467公开的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO99/19467中的SEQIDNO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(其通过全文提述并入本文)。其他非限定性实例包括芽孢杆菌属α-淀粉酶，例如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其较之WO99/19467公开的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
感兴趣的细菌杂合体α-淀粉酶
细菌杂合体α-淀粉酶适于供依照本公开用作感兴趣的酶。特别涵盖的杂合体α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO:4)的445个C-末端氨基酸残基，以及来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO:5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQIDNO:4的地衣芽孢杆菌编号)。其他非限定性实例包括具有一个或更多下述突变的变体(或在其他芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQIDNO:5编号)。
在实施方案中，细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每gDS，或0.001-1KNU每gDS，或在实施方案中约0.050KNU每gDS的量添加。
感兴趣的真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶适于供依照本公开用作酶。非限定性实例包括来源于曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)，黑曲霉(Aspergillusniger)和川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。
在实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶包括样α-淀粉酶，其来源于米曲霉的菌株。根据本公开，术语“样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即与WO96/23874的SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
另一个酸性α-淀粉酶的非限定性实例来源于黑曲霉的菌株。在实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶可为来自黑曲霉的α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO89/01969(参见其中的实施例3，通过全文提述并入本文)。在实施方案中，来源于黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S,Denmark得到)其适于供依照本公开用作感兴趣的酶。
其他非限定性实例包括涵盖的野生型α-淀粉酶，包括来源于根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株，或微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(参见WO2004/055178，其通过全文提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilusgiganteus)菌株的那些α-淀粉酶。
在实施方案中，α-淀粉酶是来源于川地曲霉(Aspergilluskawachii)，并公开于Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298“Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stableα-amylasefromAspergilluskawachii”，并进一步作为EMBL:#AB008370公开。
在实施方案中，所述真菌α-淀粉酶也可为包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非杂合体)，或其变体。在实施方案中，所述野生型α-淀粉酶来源于川地曲霉(Aspergilluskawachii)的菌株。
感兴趣的真菌杂合体α-淀粉酶
真菌杂合体α-淀粉酶适于供依照本公开使用。在实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。供依照本公开使用的真菌杂合体α-淀粉酶的非限定性实例包括公开于WO2005/003311或美国申请号2005/0054071(Novozymes)或美国申请序列号60/638,614(Novozymes)中的那些，将其通过全文提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。
所涵盖的杂合体α-淀粉酶的非限定性实例包括美国申请序列号60/638,614实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的变体(US申请序列60/638,614号中的SEQIDNO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US申请序列60/638,614号中的SEQIDNO:101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请序列号11/316,535中氨基酸序列SEQIDNO:20,SEQIDNO:72和SEQIDNO:96的组合公开于表5)，或作为WO2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US申请60/638,614中的SEQIDNO:102)。其他杂合体α-淀粉酶的非限定性实例为美国申请号11/316,535和WO2006/069290(均通过全文提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中所列的任何杂合体α-淀粉酶。
涵盖的杂合体α-淀粉酶的其他非限定性实例包括美国申请公开2005/0054071号中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
在实施方案中，α-淀粉酶包括与任何上面提及的α-淀粉酶显示高同一性，例如，与成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性的那些。
酸性α-淀粉酶可依照本公开以0.001至10AFAU/gDS，或在实施方案中以0.10至5AFAU/gDS，或0.3至2AFAU/gDS或0.001至1FAU-F/gDS的，或在实施方案中以0.01至1FAU-F/gDS的量添加。
感兴趣的商业α-淀粉酶产品
商业α-淀粉酶适于供依照本公开使用。包含α-淀粉酶的商业组合物的非限定性实例包括来自DSM的MYCOLASETM(GistBrocades)；BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMX、LIQUOZYMETMSC和SANTMSUPER、SANTMEXTRAL(NovozymesA/S)和CLARASETML-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETMFRED、SPEZYMETMAA和SPEZYMETMDELTAAA(GenencorInt.)、FUELZYMETM(来自VereniumCorp,USA)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。
感兴趣的糖源生成酶
如用于本文中，术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生成者)，还有芽霉菌糖酶/支链淀粉酶(pullulanase)和α-葡糖苷酶。糖源生成酶能够产生糖，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本公开的产生发酵产物例如乙醇的工艺时。所产生的糖可直接或间接的转化为期望的发酵产物，例如乙醇。依照本公开，可使用糖源生成酶的混合物。特别涵盖的共混物为至少是葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，例如酸性淀粉酶，或酸性真菌α-淀粉酶的混合物。葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)(例如，AGU每FAU-F)之间的比例在本公开的实施方案中可为0.1至100AGU/FAU-F的量，或在实施方案中为2至50AGU/FAU-F，如10-40AGU/FAU-F的量，特别是当需要感兴趣的酶最终进行一步发酵时(粗淀粉水解(RawStarchHydrolysis–RSH))，例如，当同时进行糖化和发酵时(例如，无液化步骤)。
在常规淀粉至乙醇工艺中(例如，包括液化步骤(a))，该比例可如EP140,410-B1中所定义，特别是当步骤ii)中的糖化和步骤iii)中的发酵同时进行时。
感兴趣的葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶适于供依照本公开使用。非限定性实例包括来源于任何合适的来源，例如来源于微生物或植物的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶的非限定性实例是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBOJ.3(5):p.1097-1102)，或其变体，如公开于WO92/00381,WO00/04136和WO01/04273(来自Novozymes,Denmark)的那些；公开于WO84/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.55:.941-949,1991)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等,1997,ProteinEng.10:1199-1204)。
葡糖淀粉酶的其他非限定性实例包括罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利4,727,026号和Nagasaka等，1998,“Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticiumrolfsii,ApplMicrobiolBiotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来源于埃莫森踝节菌(Talaromycesemersonii)(WO99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利Re.32,153号)、杜邦踝节菌(Talaromycesduponti)、嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)(美国专利4,587,215号)的。
细菌葡糖淀粉酶的非限定性包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)以及瓣环栓菌(Trametescingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytosporapapyracea)和大白桩菇(Leucopaxillusgiganteus)的葡糖淀粉酶(这些均公开于WO2006/069289)，公开于PCT/US2007/066618中的Peniophorarufomarginata，或其混合物。此外杂合体葡糖淀粉酶可适于供依照本公开使用。非限定性实例包括WO2005/045018中公开的杂合体葡糖淀粉酶和实施例1的表1和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(这些杂合体通过全文提述并入本文)。
在实施方案中，适于供依照本公开使用的葡糖淀粉酶包括那些与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性的那些。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物的非限定性实例包括AMG200L、AMG300L、SANTMSUPER、SANTMEXTRAL、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMEULTRATM和AMGTME(来自NovozymesA/S)；OPTIDEXTM300、GC480TM和GC147TM(来自GenencorInt.,USA)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自GenencorInt.)。
在实施方案中，葡糖淀粉酶可以以0.0001-20AGU/gDS，或在实施方案中以0.001-10AGU/gDS，或0.01-5AGU/gDS，例如0.1-2AGU/gDS的量添加。
感兴趣的β-淀粉酶
β-淀粉酶适于供依照本公开使用。β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1,4-α-葡糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly,1979,ProgressinIndustrialMicrobiology15:112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有范围在40℃到65℃的最适温度以及范围在4.5到7的最适pH。适于供依照本公开使用的β-淀粉酶的非限定性实例包括来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶，称作NOVOZYMTMWBA(来自NovozymesA/S,Denmark)和SPEZYMETMBBA1500(来自GenencorInt.,USA)。
感兴趣的产麦芽糖淀粉酶
产麦芽糖淀粉酶为适于供依照本公开使用的酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构象的麦芽糖。产麦芽糖淀粉酶的非限定性实例包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837，商业上可由NovozymesA/S得到的那些。产麦芽糖的α-淀粉酶的其他实例包括描述于美国专利4,598,048，4,604,355和6,162,628号的那些，其全文通过提述并入本文。
在实施方案中，产麦芽糖淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白/克DS或在实施方案中以0.05-5MANU/gDS的量添加。
感兴趣的蛋白酶
蛋白酶适于供依照本公开作为感兴趣的酶，并可包含于感兴趣的酶混合物中。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，例如真菌或细菌来源的。在实施方案中，酸性真菌蛋白酶适于供依照本公开使用，但也可使用其他蛋白酶。
合适的蛋白酶的非限定性实例包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。在实施方案中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶，例如，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶的非限定性实例包括来源于曲霉属，毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。其他非限定性实例包括来源于黑曲霉(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛曲霉(Hayashida等,1977Agric.Biol.Chem.,42,927-933)，棘孢曲霉(WO95/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶，以及来自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucormiehei)的酸性蛋白酶。
其他蛋白酶的非限定性实例包括中性或碱性蛋白酶，例如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。本公开具体涵盖的蛋白酶为来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列的蛋白酶。也涵盖与在Swissprot可作为登录号P06832得到的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%同一性的蛋白酶。
蛋白酶的非限定性实例还包括与WO2003/048353中作为SEQIDNO:1公开的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%的同一性的蛋白酶。
蛋白酶的非限定性实例还包括木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在实施方案中，所述蛋白酶为来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施方案中，所述蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的菌株。在另一个实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，例如来源于曲霉属(例如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(例如曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。
其他合适的蛋白酶包括天冬氨酸蛋白酶，例如，描述于HandbookofProteolyticEnzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编,AcademicPress,SanDiego,1998,270章)的那些。天冬氨酸蛋白酶的非限定性实例包括，例如，R.M.Berka等,1990,Gene96:313);R.M.Berka等,1993,Gene125:195-198;以及Gomi等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100公开的那些，其通过全文提述并入本文。
商业上可得到的蛋白酶产品的非限定性实例包括ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、PROMIXTM、 NOVOZYMTMFM2.0L、以及NOVOZYMTM50006(可由NovozymesA/S、Denmark得到)以及来自GenencorInt.,Inc.USA.的GC106TM和SPEZYMETMFAN。其他酶包括来自Genencor的FERMGENTM和GC212。
在实施方案中，所述蛋白酶可以0.0001-1mg酶蛋白每克DS，或在实施方案中以0.001到0.1mg酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/gDS，或在实施方案中以0.001到0.1LAPU/gDS和/或0.0001到1mAU-RH/gDS，或0.001到0.1mAU-RH/gDS的量存在。
感兴趣的非限定性商业酶
在实施方案中，颗粒状淀粉水解酶适于供依照本公开用作酶。例如，可将α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶共混以供未烹制的淀粉的加工。商业上可获得的共混物包括可从Genencor获得的STARGENTM001和STARGENTM002。
在实施方案中，适于供依照本公开使用的酶包括用于淀粉液化的酶，如来自Genencor的ALPHA、FREDL、HPA和XTRA牌酶。
在实施方案中，适于供依照本公开使用的酶包括下述酶，如可从Genencor获得的C和L-400牌酶。
其他依照本公开使用的商业上可获得的酶包括下述酶，如来自Genencor的L-400、L-500、VHP、480ETHANOL、OPTIMASETBG、OPTIMASHVR、OPTIMASHXL和OPTIMASHBG牌酶。
还认为，感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽包括与任何上述提及感兴趣的酶或多肽在家族以及同一性程度方面相关的酶和/或多肽。例如，感兴趣的酶和多肽包括与任何上述提及的酶或多肽具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的酶或多肽。
特别认为，依照本公开的方法衡量感兴趣的酶和/或多肽及其未知的组合。因此，上文列出的酶和多肽是合适的感兴趣的酶和/或多肽的非限定性实例，其可单独或组合作为依照本公开的感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽来使用。
检测
在依照本公开水解底物之后，从反应介质中残余的纤维素检测到信号。在实施方案中，可使用微板读数器检测来自反应介质中纤维素的信号。例如，本领域技术人员可使用任何适于在基于荧光或发光的测定法中检测信号的检测器。
在实施方案中，来自MolecularDevices的SPECTRAmaxGEMINIXSMicroplateSpectrofluorometer是适于供依照本公开使用的微板读数器。该装置能够从基于荧光或发光的测定法检测信号。该装置包含标准的微板读数器特征，包括温度控制和振荡器。其敏感度适于获得精确而可重复的测量，甚至在其中感兴趣的酶具有低酶活性时亦如此。在实施方案中，适于运行该装置的软件包括与该分光荧光光度计(spectrofluorometer)一同出售的SOFTmaxPROSoftware。
在实施方案中，BeckmannDTX微板读数器适用于依照本公开确定残余的纤维素。该装置以多种模式运行，检测荧光强度(Intensity)，吸光度(Absorbance)(可见光(Visible))，发光度(Luminescence)(辉光(Glow))积分的振荡(IntegratedShaking)；激发滤镜(ExcitationFilters)：Abs405nm，450nm，492nm，620nmFl.360nm485nm发射滤镜(EmissionFilters)：Fl.465nm，535nm多模式检测软件(MultimodeDetectionSoftware)。因此，认为本公开的实施方案包括激发反应介质如对其接触或进行激发的步骤。
在实施方案中，使用具有一个或多个处理下述操作的移液管的机器人：
反应介质
底物
指示剂成分
平板(具有一个或多个孔)
平板盖(Platecover)
温育箱
读板器
在实施方案中，检测步骤是在反应介质下方进行的。
在实施方案中，提供系统以具体实现本公开的方法，其包含完成样品准备、分析和衡量提供化学信息的实验室模块的组合。在实施方案中，提供系统以供进行本公开的方法。所述系统含有多个具有标准化通信和系统界面的模块，允许数据、状态信息和材料的交换，认为这些模块可为硬件或软件实体，其设计为由另一个机器远程控制。模块能够独立于环境自动进行其操作。
现参照图1A和1B，显示了依照本公开的方法的系统。图1A显示系统100操作和如何采用多个SLM(130、135、140、145)和SSM(108和110)执行这些操作。所述系统含有多个标准模块，其包括一个或多个标准实验室模块(SLM)和一个或多个标准支持模块(SSM)。标准实验室模块是进行分析规程的亚任务的实验室单元操作的逻辑编组。SLM还指进行分析规程中的完整亚任务的硬件和/或软件模块。
SSM100是提供转运模态的机器人关节臂(robotarticulatedarm)，或其他用于在系统内移动物体的装置。SSM110可单独或与SSM108组合运作以操纵样品或供应品如底物、反应介质、平板165(如96孔板)、平板盖160、一种或多种感兴趣的酶和/或多肽，以及来自储室(storage)120的指示剂成分，对其进行准备，使其能够被SLM130、135、140、145获得，移除样品和消除废物。
SLM130、135、140和145知道是否可获得SSM108和110。例如，SLM130“知道”是否有足够的供应品或材料使其能够发挥功能。这是因为在可通过任务控制器指导SLM进行功能之前，首先必需确认其是否具有足以完成任务的材料。例如，SLM130检查任务为提供材料的SSM108，并继续执行或报道其无法如此进行，并陈述原因。
SLM130、135、140和145，以及SSM108和110，均具有驱动组件如执行器、检测器和伺服电机的低水平控制器(未显示)。控制器亦协调SLM130、135、140和145，以及SSM108和110的内部机电活动。控制器亦包含提供可编程“配置(configuration)”的菜单的软件包，而这些“配置”中的每一个对应于由模块实现的定制任务。例如，在液体分配(liquid-dispensing)SLM中，配置可提供新鲜试管(未显示)，对每个添加几个试剂等分试样，接着对其封盖。在温育模块中，配置可指定预决的温育温度和期间。可编程的配置是通过某些物理参数(体积、次数、温度等等)定义的，且设计良好的控制器不允许出现操作上不合适的情况，如过填充试管和离心颠倒的试管。对于酶研究，某些高水平工具可动态地对SLM控制器进行编程，使得一个装置能够进行任意数量的独特测定。
SLM130、135、140和145，以及SSM108和110通信偶联至一个或多个任务顺序控制器136。任务顺序控制器136为中等水平的装置，其使用来自操作研究的工具来管理供应品和样品经过自动化装置的复杂流动。在进行实际测试之前，计算机模拟模仿SSM108和110控制器，并遵照候选测试步骤的关键时机事件(criticaltimingevent)。然后，该虚拟装置生成启动时间，并优化所有任务执行的顺序。任务顺序控制器136用户包括实验室技术员和工程师，前者将材料上样于自动化装置并日常监视其性能，而后者对开发新装置并对其进行除错，或寻找改善现行装置的方法。任务顺序控制器136能够进行动态任务重设(dynamicretasking)，例如，这允许在自动化装置开启并运行同时添加和减少测定法。
任务顺序控制器136通信偶联于过程控制器128。系统100包含输入和供应SSM108。该模块将供应材料和反应物，如孔板165回收至系统100SLM。在一个实施方案中，所述输入和供应SSM可仅进行次要修改即可成为并入机器人的SSM。类似地，SLM间转运SSM110在不同模块之间传送样品。在一个实施方案中，所述模块间转运SSM110包含机器人/关节臂。这些关节臂沿直线轨道运行，并具有可接受的定位容忍(positioningtolerance)，自由度和用于高精度操作的控制软件。
平板准备SLM130合并新鲜底物、液体试剂和指示剂成分，然后将平板盖160添加至平板165。该模块包含单尖移液工具，移液尖弃置单元和用于过程控制的整合软件。
温育SLM135对于密封的反应平板165提供了温度受控的环境。选择的温度概貌可视需要为恒定的或变化的。温育SLM135储藏关于温育环境例示的信息，如在指定的温育条件下每个平板或每组平板花费的时间。商业上可获得的装置，如可从Lab-LineInstruments获得的那些可进行大部分所需功能，但可能需要修饰，例如，添加动力化的门(motorizeddoor)以供在命令下开启或关闭温育箱。
提供读板器SLM145用于依照本公开检测残余纤维素。在实施方案中，该装置以多种模式运行，检测荧光强度。在实施方案中，修饰或调整该装置从而使得检测器位于反应平板之下。例如，参照图1B，显示了位于反应平板底部210之下的检测器200的图。
样品输出和废物弃置SSM145弃置废物材料包括污染的平板、移液尖、反应介质和其他塑料器具和液体。
其他系统实施方案可根据本领域已知的自动化方法来装配。用于实施方案的系统装配的指南可通过参照美国专利号5,968,731和5,366,896(通过全文提述并入本文)获得。亦参见T.J.Beugelsdijk等,Thestandardlaboratorymodule:anintegratedapproachtostandardizationintheanalyticallaboratory，Lab.If.Manage.21(1993)(通过全文提述并入本文)。
认为标准分析方法，其包括样品准备、分析和数据解释，亦适用于实施本公开的方法。本领域一般技术人员可将依照本公开的方法应用于多种测定步骤和实验方案/规程。
下述非限定性实施例进一步说明依照本公开的方法。
实施例
材料和方法
指示剂成分
荧光增亮剂28(F3543,Sigma-Aldrich)，4-甲基伞形酮(M-1381,)和牌增亮剂(B-1003,A.G.Scientific)作为指示剂成分提供。作为缓冲液，将含10mM硫酸锰的0.5M乙酸钠pH5.0的储液在水解反应液中稀释10倍。
分析
对于起始荧光谱，从水中的2mM储液制备10xFB28储液，并将20μl储液添加至80μl糖、木质素或PCS溶液。在FB28添加之前测量不含FB28的荧光谱和吸光谱。
PCS水解以1ml规模在深孔板中进行。水解通过将下述合并来进行：1)800μl6.25%干重生物质，其pH通过添加缓冲液调整至5.0；2)100μl500mM乙酸终混合物pH5.0，含有各种添加剂如金属、去污剂等；和3)100μl酶混合物。酶的剂量设为0.1至50mg/g纤维素。值和体积适于1g测定。将平板密封并剧烈倒置使其混合。50℃进行3日的温育是合适的。
对于5%WGS-NRELPCS(本文中亦简称为“PCS-A”)使用200μMFB28，而对于3%使用150μM。在标准微滴定板中用3%总固形物进行的测定中，将240μl的3.75%WGS-NRELPCS，30μl的乙酸钠缓冲液和30μl的酶混合物通过吸取-排出(pipettingupanddown)三次进行混合。将平板在APLS3000上密封(165℃进行1.5秒)，并在50℃温育72小时，每日手动倒置两次。在确定时点读取荧光。在72小时处，过滤样品，并就葡萄糖和纤维二糖通过HPLC对其进行分析。
对于统计分析，使用来自SAS,Cary，NorthCarolina的JMP包。
装置
对于从顶部读取荧光，使用MolecularDeviceGEMINI或BeckmannDTX分别作为单色仪或基于滤镜的读板器。底部读取在BeckmanDTX中进行。对于激发使用具有35nm带宽的360nm滤镜，而对于发射使用35nm带宽的465nm滤镜。在MolecularDeviceSpectramax中读取吸光谱。在读取谱之前，将平板以最高速度定轨振荡20秒。
对于96孔微滴定板，使用聚丙烯2ml深孔板，聚苯乙烯9017和聚丙烯3364平板。对于聚苯乙烯(聚丙烯)用AbgeneALP3000在165℃将平板密封1.5秒而对于聚苯乙烯平板在160℃进行7秒。
将释放的葡萄糖的HPLC分析用于评价移入孔的PCS总量。
底物/缓冲液
使用来自两个不同批次(KCMF1752-81和-96)的经洗涤、磨碎和筛过的NRELPCS，经磨碎和筛过的NRELPCS，和经洗涤、磨碎和筛过的PCS-C。
将PH101(11365,Fluka)，来自桦木的木聚糖(X0502,Sigma)，Kelig100和VANISPERSE(木聚糖衍生物)CB(LignotechUSA,Rothschild,Wisconsin,USA)在纯化的水中稀释。在移液之前，将悬液充分混合。
酶
使用下述酶制备物：
1)根据WO2008/151079获得的里氏木霉纤维素分解蛋白组合物(里氏木霉菌株RutC30纤维素酶，含有具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白)(本文中亦称作“CP1”)。酶从SaMeMF268的批次CZP0003和CZP0001获得；和
2)混合物1.5L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)和3%米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)(本文中亦称作“CP2”)。组合物还包含里氏木霉菌株RutC30纤维素酶，其包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
实施例1
与荧光增亮剂混合的PCS成分的光谱学
当将FB28添加至β1-4葡聚糖时，报道荧光强度随着β1-4葡聚糖浓度的增加而增加。因此，将恒定浓度的FB28添加至不同量的WGS-NRELPCS(PCS-A)、纤维素、木质素和其他PCS的可能成分。先前的UV-A辐照显著减少了背景荧光。现参照图2，显示了在360nm处激发之后在460nm处的上方读数中收集的用3.8mMFB28的稀释系列的荧光发射。在此，将FB28添加至5至0.005%PCS-A的两倍稀释系列。开始从26g/l分散的牌纤维素材料、木聚糖、淀粉和10g/l的VANISPERSE牌木质素衍生物测试类似的稀释系列。在荧光发射读数之前，用UV-A灯对平板辐照15分钟。图2显示了对于不溶性纤维素纤维的纤维素依存性信号。用羧甲基纤维素获得了类似的结果。木质素吸收或淬灭FB28荧光团的基础发射。木聚糖和淀粉并不显著改变FB28信号强度。对于木聚糖这可能是由于木聚糖核心的强取代妨碍FB28的附接。PCS信号是阳性纤维素依存性信号和阴性木质素依存性信号的组合。
现参照图3A，在不含荧光增亮剂28的UV可传递的微孔板中以80μl每孔的体积在360nm处激发来测量荧光谱。观察到纤维素事实上具有弱的浓度依存性自发荧光，最大值为410至460nm。现参照图3B，在含有3.8μM荧光增亮剂28的UV可传递的微孔板中以100μl每孔的体积在360nm处激发来测量荧光谱。在FB28结合之后，纤维素荧光度强烈增加，伴随着30nm的最大发射的红移。该移动在当FB28结合PCS时不那么显著。尽管在5%PCS-A中还存在约21g/l纤维素，信号仅增加至1.7倍，与之比较，对于纯纤维素为22倍。由于样品中的木质素，观察到PCS浓度和信号强度之间的反比关系—随着PCS浓度的减少，信号增加。代表木质残余物(lignaceousresidue)，测试了商业性木质素级分。Kelig(木素磺酸盐)显示了强烈的自发荧光，其最大发射为440nm，并具有与来自3.8μMFB28的信号类似的发射强度。当将FB28添加至木质素级分时，观察到FB28的减少。这对于非自发荧光性木质素VANISPERSE牌木质素衍生物而言非常强。Kelig主要显示与无FB28添加相同的自发荧光。
现参照图3C和3D，在80μl每孔的体积收集了吸光谱。PCS-A(图3C)和商业性木质素(图3D)的吸光谱在相关的激发和发射波长处显示了强吸光度。在5%总固形物处，PCS-A吸收从未低于OD为2。甚至将PCS稀释至低于1%总固形物，仍在相关波长范围显示超过1OD的强吸光度。对商业性木质素吸光度的测量显示VANISPERSE(木质素衍生物)与Kelig相比在更高的波长吸收。较低的木质素浓度显示吸光谱的蓝移，但仍达到最大OD水平。总之，这表明木质残余物强烈吸收荧光增亮剂28的发射，这亦称作内滤作用(innerfiltereffect)。类似的作用可由碰撞淬灭导致，但这可能性较低，因为FB28浓度的增加导致更高的信号强度和纤维素依存性信号。当涉及淬灭时，这会是无法预料的，因为荧光团的增加只会增加淬灭率。
在PCS水解中测试荧光增亮剂
在用不同加载的CP1对5%PCS-A进行水解72小时之后，将FB28添加至8μM的终浓度。可观察到信号的纤维素依存性减少，但散射比信号更高。
在更高浓度测试了接下来三个不同的荧光增亮剂。现参照图4，显示了对水解的PCS-A样品添加荧光增亮剂，以及指示了葡萄糖释放。实心符号对应于左轴，而空心符号是对右轴作图的。荧光发射是以360nm激发通过孔底在465nm处读取。更具体而言，将4-甲基伞形酮，荧光增亮剂FB28或牌增亮剂分别以200μM、380μM和480μM的浓度添加至来自PCS-A的72小时水解的样品。CP1剂量的改变导致葡萄糖释放量的差异。为了获得释放的葡萄糖和发射强度之间的关联，通过底部读取荧光发射。不添加荧光增亮剂，则仅观察到由于纤维素自身荧光所致的荧光发射强度的少量增加。含荧光增亮剂的样品均在较高的葡萄糖释放显示信号减少。荧光增亮剂28具有最高的信号比。因此，将其进一步以终浓度200μM使用。顶部读取显示在高水解程度下强烈增加的发射。水解减少了不溶性物质的量，导致剩余不溶性物质沉降。该沉降的不溶性物质含有吸收光的木质素。因此，在最顶部的液体层，剩余FB28的吸收减少，导致强FB28荧光信号。亦调查了UV-A辐照，但其并不显著改善信噪比。
荧光发射是从反应介质底部，或之下读取的。
在实施方案中，对于在PCS水解过程中测量纤维素浓度，重要的是木质素浓度保持恒定。若在对PCS水解的筛选中，添加了破坏木质素的酶活性，会鉴定出假阳性。然而，这会鉴定出木质素的解聚，这仍可对生物质水解是有益的。
在不同PCS的水解物中测量纤维素衰变
对三个不同的生物质样品-PCS-和GS-NREL(本文中简称为PCS-B)和PCS-C运行根据1ml测定使用CP1的剂量应答。在3日之后将八十μl的水解与10μl的0.5M乙酸钠缓冲液pH5.0和10μM的2mMFB28混合。现参照图5A、5B、5C、5D、5E和5F，JMP图显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和对应的荧光发射强度。一些数据点显示未添加酶的值，并在下图中排除。线性回归显示为线。图5A、5B、5C、5D、5E和5F显示测得的荧光发射与剩余纤维素的量成比例，这意味着其与通过HPLC测得的释放的葡萄糖浓度成反比。在Jump中，构建了包含(PCS-C)或排除(PCS-A)未添加酶的值的模型。对于荧光发射强度的平均变异系数或“CV”的范围是5.8至13.3%，这与对于通过HPLC测得的葡萄糖的0.7至3.5%相比较高。
表1：通过线性回归从JMP获得的模型
线性 模型 y=mx+b y 葡萄糖
x 荧光
m 标准误差 b 标准误差 评论
WGS-NREL(PCS-A) -7.14E-06 3.24E-07 36.38 0.72 排除不含酶
GS-NREL(PCS-B) -7.71E-06 3.69E-07 31.29 0.50 排除不含酶
PCS-C -1.09E-05 4.39E-07 19.07 0.40
在相同实验条件下，对每种生物质用和不用具有纤维素分解增强活性的GH61多肽进行了附加测试。酶添加是基于含4mgCP2每g纤维素的PCS-A。当添加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽时，使用3.2mgCP2和0.8mgGH61。第二组条件是对于后者加倍总酶浓度。从测得的荧光发射强度，使用表1中的模型方程预测对应的葡萄糖浓度。将这些与实际葡萄糖浓度相比较，并观察到10.4%的平均偏差。预测的葡萄糖是基于表1中所述的模型从测得的荧光发射强度计算的。对平均值加/减标准偏差进行作图。该图显示预测值对实际值。该图显示预测和实际值之间的优异的关联性。
将指示剂成分添加至水解
依照本公开的测定法适用于高通量筛选生物质水解，因为增亮剂如例如FB28可直接添加至水解反应。这允许在水解反应过程中而非仅在终点进行直接测量。因此，通过比较由HPLC测量的释放的葡萄糖来调查增亮剂添加对水解的作用。同样，测量了荧光发射强度。参照图6A和6B，显示了添加和不添加200μMFB28不同CP1剂量的PCS-B和PCS-C水解。在49小时和72小时处取样，并通过HPLC测量释放的葡萄糖。更具体而言，图6A显示了水解过程中的葡萄糖浓度对酶加载(mg/g纤维素)。图6A显示在中等酶加载时，FB28的添加导致释放的葡萄糖的减少。现参照图6B，显示了用FB28的水解和不用FB28水解的偏差。亦可见葡萄糖释放减少的趋势。释放的葡萄糖的量减少的最大值对于PCS-B为5%，而对于PCS-C为10%。
现参照下表2，显示了在PCS-B和PCS-C的水解反应(添加和不添加200μMFB28，变化的CP1剂量)中显示葡萄糖浓度(g/l)对荧光强度(MioAu)的数据。在49和72小时处测量荧光发射强度，并取样以供通过HPLC测量释放的葡萄糖。每个通过HPLC测得的平均荧光强度和葡萄糖浓度来自一个酶剂量的三次重复实验。使用0至50mg纤维素酶/g纤维素范围的八种不同酶剂量。
表2
对上述数据进行了作图。对于用FB28的水解，荧光发射强度曲线类似于之前在检查的范围上显示近乎线性行为的运行。变异系数(CV)减少至3.9%，与之相比对于HPLC为1.6%。当从荧光数据预测葡萄糖时，这些CV是可比较的，因为葡萄糖范围小于荧光发射信号的范围。
在相同标准微滴定板中反应和测量的组合
具有透明平底的聚丙烯(PP，3364)标准微滴定板非常适用于以300μl的总反应体积运行依照本公开的测定法。参照下表3，300μl体积并不显著影响水解。这是在未添加FB28的三种酶加载(2、5和8mg/g纤维素)调查的，且偏差小于3%。
表3
通过添加不同CP1剂量水解含200μMFB28的PCS-A(5%)。该测试是以1ml在聚苯乙烯深孔板或以300μl在聚苯乙烯和聚丙烯平板中进行的。聚苯乙烯(PS，9107)标准微滴定板的使用并不优选，因为无法良好地进行密封，导致1.8%的重量丧失。释放的葡萄糖的平均值与PP平板中相同，但观察到荧光发射强度的更高散射(CV9.3%)。不拘于本公开，认为散射可能是由于FB28通过疏水相互作用结合于PS表面而导致的。
在聚丙烯(PP)平板中，1000和300μl体积的水解释放类似的葡萄糖量。此外，标准化的荧光发射与通过HPLC测得的葡萄糖释放良好相关。在此，荧光发射通过将其从不添加酶的水解反应的平均强度减去来标准化。该样品具有最高的纤维素含量。对于1ml测定，三次重复每一个的平均变异系数(CV)对于HPLC测量为6%，而对于标准化的荧光发射为5.9%。300μl测定仅具有5.0%的CV，且亦得到更加线性的曲线。
现参照表4，通过添加不同量的CP1在50℃将PCS-A水解72小时；在用于测定的最终5%和3%总固形物的水解之前，分别添加200和150μMFB28。纤维素浓度依存性FB28荧光发射通过微滴定板底部在360nm处的激发后在465nm处测量。这些值通过从未水解的样品的平均发射强度减去并除以一百万来标准化。葡萄糖释放通过HPLC测量。仍旧参照表4，提供了显示荧光发射(AU0-AU)对下述PCS-A的水解反应的葡萄糖释放的数据，其中PCS-A在50℃水解72小时，即添加不同量的酶，并在水解之前，对于水解设定为深孔板中1000μl和PP标准平板(3364)中300μl，最终5%总固形物的测定，分别添加200和150μMFB28。
表4
此外，获得了在50℃直接移除或在4℃进行1.5小时之后测得的PP标准平板中的300μl的最终3%总固形物。结果表明300μl体积可用于生物质水解，且荧光测定甚至比HPLC更加略为准确。在将酶添加至生物质之后，将平板在165℃密封1.5秒。这亦运行良好，在72小时中完整的测定平板仅有0.1%的重量丧失。参照表5，获得了显示荧光发射(AU0-AU)对下述PCS-A的水解反应的葡萄糖释放的数据，其中PCS-A在50℃水解72小时，即添加不同量的酶，并在水解之前，对于在50℃直接移除或在4℃进行1.5小时之后测得的PP标准平板中的300μl的最终3%总固形物的测定，添加150μMFB28。
表5
衡量对水解更早评价的时间过程
在具有透明平底的PP标准平板中进行的基于荧光的测定可与线性对于HPLC的样品准备(包括混合、移除和过滤)相比，更加频繁地测量并无需移液步骤。现参照图7，显示了对于不同的CP1酶加载的时间过程。更具体而言，通过加载指示量的CP1(mg/g纤维素)，在50℃将含200μMFB28的5%WGSNRELPCS水解了72小时。在图7中指示的不同时点测量并计算了标准化的荧光发射。误差棒显示一标准偏差。重复实验吻合良好。
检查不同的总固形物加载和相应的FB28浓度
因为对于5%总固形物用机器人对PCS进行移液是困难的，调查了更低的总固形物加载3%和1%。必须对于每种总固形物加载调整FB28浓度，因为淬灭FB28发射的木质素的浓度不同。使用3%总固形物加载及150μMFB28获得了最优或改善的结果。测量是在从50℃温育箱直接移除或在4℃储藏1.5小时之后进行的。与5%总固形物测定相比较，CV得到显著改善。对于3%总固形物，HPLC葡萄糖确定的CV为2.5%，直接荧光测量的CV为3.6%，而在4℃储藏之后甚至可减少至2.3%。观察到标准化的荧光发射和释放的葡萄糖之间近乎线性的关联。相关系数为0.97。对于直接荧光测量，葡萄糖可根据下述公式计算：
模型1：葡萄糖(g/l)=4.576*标准化的荧光发射-1.250。
现参照图8，将分别含有4、16和204μMFB28的1%、3%和5%PCS-A在50℃通过添加不同量的CP1水解72小时。通过HPLC测量释放的葡萄糖，而纤维素转化率基于5%总固形物的最大葡萄糖释放。3%和5%总固形物的测定显示与HPLC测量的纤维素转化率类似的剂量应答曲线。主要差别之一为仅在最高酶加载观察到释放的葡萄糖少了7％。在1%总固形物，观察到释放的葡萄糖的高散射。在1％，葡萄糖的总释放亦仅为在3%的三分之一。在更低的葡萄糖量，HPLC测量的误差增加。此外，对更少量的酶进行移液，导致移液中的高误差。这两个原因可导致确定的转化率中更高的误差。
同样，测试了测定法中的体积，因为300μl是聚丙烯微孔板(3364)的充量限制(fillinglimit)。当测试了150至300μl的总测定体积时，荧光信号及其噪音在较低体积增加。用250至300μl的体积获得了优异结果。获得了数据并显示于下表6：
表6
PCS总固体 总酶加载(mg总酶/g纤维素) 纤维素转化率
5.0% 0.00 1.28%
5.0% 0.10 4.88%
5.0% 0.50 12.76%
5.0% 1.00 19.58%
5.0% 2.00 31.68%
5.0% 3.00 44.19%
5.0% 4.00 30.36%
5.0% 5.00 56.61%
5.0% 4.00 47.47%
5.0% 6.00 57.90%
5.0% 8.00 66.28%
5.0% 10.00 72.94%
5.0% 14.00 82.39%
5.0% 50.00 99.40%
5.0% 2.00 31.78%
5.0% 8.00 68.79%
5.0% 0.00 0.20%
5.0% 0.10 5.59%
5.0% 0.50 12.92%
5.0% 1.00 20.53%
5.0% 2.00 33.33%
5.0% 3.00 42.90%
5.0% 4.00 51.32%
5.0% 5.00 59.68%
5.0% 4.00 48.12%
5.0% 6.00 58.48%
5.0% 8.00 67.59%
5.0% 10.00 72.38%
5.0% 14.00 79.70%
5.0% 50.00 99.06%
5.0% 2.00 29.54%
5.0% 8.00 63.79%
5.0% 0.00 0.44%
5.0% 0.10 5.80%
5.0% 0.50 13.88%
5.0% 1.00 21.59%
5.0% 2.00 34.39%
5.0% 3.00 47.19%
5.0% 4.00 52.27%
5.0% 5.00 60.10%
5.0% 4.00 51.70%
5.0% 6.00 60.79%
5.0% 8.00 69.35%
5.0% 10.00 74.57%
5.0% 14.00 83.71%
5.0% 50.00 101.54%
5.0% 2.00 36.62%
5.0% 8.00 69.91%
3.0% 0.00 0.13%
3.0% 0.10 4.31%
3.0% 0.50 12.43%
3.0% 0.00 0.25%
3.0% 3.00 45.12%
3.0% 3.00 44.80%
3.0% 4.00 51.76%
3.0% 5.00 56.57%
3.0% 4.00 50.18%
3.0% 6.00 60.66%
3.0% 8.00 69.32%
3.0% 10.00 77.16%
3.0% 14.00 82.72%
3.0% 50.00 91.29%
3.0% 2.00 31.85%
3.0% 8.00 68.96%
3.0% 0.00 0.07%
3.0% 0.10 4.16%
3.0% 0.50 12.15%
3.0% 0.00 0.11%
3.0% 3.00 43.37%
3.0% 3.00 42.69%
3.0% 4.00 48.96%
3.0% 5.00 51.81%
3.0% 4.00 53.15%
3.0% 6.00 62.28%
3.0% 8.00 70.67%
3.0% 10.00 77.05%
3.0% 14.00 84.26%
3.0% 50.00 94.05%
3.0% 2.00 31.29%
3.0% 8.00 67.41%
3.0% 0.00 0.18%
3.0% 0.10 4.32%
3.0% 0.50 11.63%
3.0% 0.00 0.12%
3.0% 3.00 41.20%
3.0% 3.00 42.98%
3.0% 4.00 48.53%
3.0% 5.00 51.01%
1.0% 0.00 0.38%
1.0% 0.10 4.12%
1.0% 0.50 11.57%
1.0% 0.00 0.23%
1.0% 3.00 41.77%
1.0% 3.00 43.99%
1.0% 4.00 50.43%
1.0% 5.00 55.09%
1.0% 4.00 51.91%
1.0% 6.00 67.88%
1.0% 8.00 80.15%
1.0% 10.00 81.44%
1.0% 14.00 87.90%
1.0% 50.00 100.08%
1.0% 2.00 32.92%
1.0% 8.00 71.35%
1.0% 0.00 0.10%
1.0% 0.10 5.74%
1.0% 0.50 16.15%
1.0% 0.00 0.10%
1.0% 3.00 56.08%
1.0% 3.00 54.10%
1.0% 4.00 60.26%
1.0% 5.00 67.13%
1.0% 4.00 50.38%
1.0% 6.00 62.73%
1.0% 8.00 71.06%
1.0% 10.00 77.67%
1.0% 14.00 83.33%
1.0% 50.00 92.78%
1.0% 2.00 31.28%
1.0% 8.00 68.63%
1.0% 0.00 0.26%
1.0% 0.10 3.98%
1.0% 0.50 12.18%
1.0% 0.00 0.21%
1.0% 3.00 40.20%
1.0% 3.00 39.80%
1.0% 4.00 47.90%
1.0% 5.00 53.45%
1.0% 4.00 48.44%
1.0% 6.00 59.40%
1.0% 8.00 67.88%
1.0% 10.00 72.86%
1.0% 14.00 77.71%
1.0% 50.00 85.82%
1.0% 2.00 28.96%
1.0% 8.00 65.06%
用机器人对PCS进行移液
开发了用各120μl注入4个3364PP平板两次的步骤。添加了五十mgCP1/g纤维素酶和缓冲液，得到300μl的最终体积。在温育72小时之后，释放的葡萄糖总量的变异系数(CV)对于内侧孔为0.4至0.5％。这表明PCS移液非常一致。测试了widebor移液尖和Beckman牌移液尖。发现对于Beckman牌移液尖CV略微较低，但偶尔出现异常值。在实施方案中，推荐使用具有较宽开口的widebor移液尖。
用已知或未知的感兴趣的酶混合物进行衡量
就其预测能力测试了使用指示剂成分如FB28用于在3364微滴定板中测量3%PCS水解中的纤维素量测定。测试了三种已知的酶制备物。所述已知的酶制备物为CP1、CP2和里氏木霉菌株RutC30纤维素酶。在每个平板上，用2、5、6、7或8mg酶每g纤维素的剂量重复三次分析三种酶制备物。此外，在5mg/g纤维素加载，用具有纤维素分解增强活性的GH61多肽替换20%的酶制备物。此外，在外侧孔中，对每种酶加载2和8mg/g纤维素以比较内侧和外侧孔的性能。作为标样，测定法需要重复三次无酶添加和50mgCP1/g纤维素。温育在50℃进行72.5小时，每日进行倒置。平板以360nm的激发和465nm的发射从底部读取。进行HPLC分析以获得实际的基于葡萄糖和纤维二糖的转化率数据。
里氏木霉菌株RutC30纤维素酶仅含有少量β-葡糖苷酶。依照本公开的测定法测量剩余纤维素，并一般并不区分纤维素、纤维二糖或短的β1,4-葡聚糖。因此，对于转化率的计算，考虑了HPLC测量的葡萄糖和纤维二糖，而之前纤维二糖常被忽略，因为由于较高的米曲霉β-葡糖苷酶含量，其在CP1和CP2水解物中较低。
现参照图9A，将经洗涤、磨碎和筛过的PCS-A在50℃在3364中在含3%PCS和150μMFB28的300μl反应中水解72小时。从以360nm激发和465nm发射的荧光发射测量估计转化率。使用下述模型方程：葡萄糖(g/l)=4.593*(AU0-AU)/1E6–1.379。将该模型方程用于估计基于葡萄糖的转化率，并获得了与来自HPLC的基于葡萄糖和纤维二糖的转化率类似的结果。参见，例如图9B，其显示来自图9A中的反应的通过HPLC测量的基于葡萄糖和纤维二糖的实际转化率。之前并未考虑纤维二糖，因为其在CP1和CP2剂量应答中低至可忽视。在里氏木霉菌株纤维素酶中，不存在β-葡糖苷酶(BG)，而获得了高纤维二糖水平。在测定法中，FB28测量纤维素的量，且无法区分葡萄糖和纤维二糖。在比较中，总转化率并不相同，但是所有样品可以以正确顺序归类，即
CP1>CP2>里氏木霉菌株RutC30
现参照图10A和10B，显示了分别加载5和8mg/g纤维素酶的内侧、外侧和边缘孔中的测定法估计的转化率的分析。内侧和外侧孔显示相同的性能，因此可利用整个平板。同样，再次调查了FB28对转化率的影响。未添加FB28的平板显示约5%更高的转化率。用FB28的剂量应答曲线几乎总是简单地在转化率方面向下移动5%。参见图11，其中用(+)或不用(-)150μMFB28在50℃将3%WGS-NRELPCS水解72小时。从葡萄糖和纤维二糖的HPLC测量计算真实转化率。图11显示含(实线，实心符号)和不含FB28(虚线，空心符号)的不同组的酶。
预测建模
当前数据用于开发基于新的荧光发射信号标准化的模型。该标准化包括对于50mg/g的CP1加载除以72小时水解之后的最大信号：
100 · AU ‾ 0 - AU ( AU ‾ 0 - AU ‾ 50 ) 72 h 模型2
其中AU为测量时间处任意单位的荧光发射强度，为不添加酶的孔的平均值(最高的AU值)，而为含50mgCP1/g纤维素的孔的平均值。
该标准化需要由50mgCP1/g纤维素在72小时中进行完全消化该新的标准化(模型2)基本上是将72小时处50mg/g纤维素的转化率设为100，而荧光信号和纤维素含量之间的关系为线性。目标是使得该标准化的值更加独立于测量装置，因为荧光发射强度的实际测量值在读数器之间可有显著差异。这运行良好，从而使得当在不同的BeckmannDTX读板器上测量在PCS水解中具有不同的转化率的平板时，来自参照读数器的平均偏差低于6%。参见，例如表7，其显示具有用不同BeckmannDTX读数器在360nm激发和465nm发射测得的不同程度PCS水解的平板。读数器#3中的零值并非测得的数据点。
来自下表7的数据显示不同BeckmannDTX读数器(#1-#4)的标准化信号(100*(AU0-AU)/(AU0-AU50)72h)，其中具有不同程度的PCS水解的平板在360nm激发和465nm发射测量。
表7
读数器#1 读数器#2 读数器#2，重复读数 读数器#3 读数器#4
98.1 99.1 99.3 98.4 99.4
28.4 27.1 27.4 29.8 33.3
45.0 46.8 46.8 48.5 51.7
63.0 63.4 63.7 65.7 67.8
60.4 60.5 60.9 63.1 65.5
44.4 46.0 46.4 47.1 50.0
31.8 34.6 35.0 33.9 36.2
67.4 68.6 69.0 70.2 72.8
52.4 52.9 53.0 53.4 56.7
50.1 52.3 51.9 52.1 56.5
47.5 47.8 47.7 49.7 51.3
55.9 57.9 57.8 57.5 60.6
52.9 53.6 54.1 55.8 58.0
50.2 52.8 53.3 52.1 55.2
47.7 51.0 50.9 49.6 53.4
45.9 45.8 46.0 47.5 51.8
60.5 58.5 59.2 61.1 64.2
62.0 62.7 63.2 64.5 66.6
22.0 14.0 14.6 16.3 20.6
17.3 15.0 15.2 14.3 16.3
18.9 15.0 15.5 17.5 20.0
40.7 39.0 39.1 41.9 45.9
54.5 53.8 53.8 54.6 58.8
55.0 54.2 54.7 56.8 59.7
57.9 57.9 58.3 59.8 62.4
102.2 101.0 100.8 102.3 101.5
29.0 26.5 26.3 29.3 32.7
51.2 49.3 48.9 51.2 54.9
64.1 63.5 63.5 64.1 68.0
61.7 61.5 61.0 62.7 65.3
19.6 16.7 16.6 16.6 19.3
46.4 45.7 45.4 44.7 50.2
49.5 50.9 50.9 51.5 54.7
48.0 47.0 47.9 46.9 52.2
47.1 44.7 44.3 45.8 50.5
58.8 58.0 57.9 57.8 62.4
56.1 57.5 57.5 58.1 60.8
52.5 53.1 53.2 52.9 55.6
48.6 48.3 48.3 48.4 51.4
46.3 45.7 46.0 46.5 50.8
63.9 61.6 61.9 63.8 66.3
66.2 65.6 66.2 66.2 69.2
20.3 16.3 16.3 18.0 20.0
15.9 11.6 11.7 12.6 13.7
17.1 10.3 10.6 13.5 14.8
20.8 14.5 15.1 18.8 20.4
41.6 37.7 38.1 41.1 44.4
53.6 52.7 52.4 53.7 56.8
55.8 54.8 54.9 56.4 59.0
56.7 56.5 57.0 57.3 60.7
99.7 99.8 99.9 99.4 99.1
31.0 27.0 27.2 27.8 30.0
47.0 46.9 47.2 48.3 50.7
64.3 62.4 62.7 64.3 66.6
63.2 61.1 61.0 61.9 64.5
47.5 47.9 47.5 48.1 50.3
52.6 55.0 55.2 54.4 55.6
46.8 48.3 48.3 47.0 49.2
43.3 43.2 42.7 43.7 46.1
44.0 42.9 43.2 42.8 44.5
55.2 56.9 57.0 56.9 59.3
54.4 53.9 54.2 54.8 57.3
50.4 51.3 51.7 51.5 51.6
45.3 46.9 46.7 46.9 46.9
44.2 43.6 43.9 44.5 46.3
59.9 59.2 58.5 61.3 62.7
61.7 64.2 63.9 63.5 64.6
16.5 13.2 13.3 16.5 15.7
14.3 10.4 10.7 12.4 10.3
37.2 39.5 39.5 38.4 38.9
51.3 52.9 53.3 52.0 52.3
52.8 54.3 54.6 52.8 53.9
52.4 54.8 54.9 54.4 53.6
在50g测定法中确定PCS-AKCMF1752-81在50mg/g加载在50℃进行168小时的试剂纤维素含量为59.17%。在300μl规模，该纤维素酶仅94.3%在72小时处降解。当将标准化的信号乘以0.943时，获得了优异的数据拟合(模型3)，其与模型1和2相比更好地描述了数据。参见图12，其显示实际HPLC测得的纤维素至葡萄糖和纤维二糖的转化率与来自荧光发射强度测量的模型的比较。模型1使用(AU0-AU)作为具截距的线性模型中的变量。模型二为100*(AU0-AU)/(AU0-AU50)72h，而模型3将该值校正至其94.3％，这是在该测定法中用50mgCP1每g纤维素达到的最大纤维素转化率。在实施方案中，若依照本公开的测定法中的最大消化设为100%时，则会使用模型2，并从而会与模型3具有相同的预测力。
将来自当前批次(KCMF1752-81)和来自新批次(KCMF1752-96)的PCS-A在新PCS水解实验中进行测试，其中再次在不同剂量使用CP1。在72小时之后，将50mgCP1每g纤维素用HPLC测量的纤维素转化率对于两种生物质均设为100%，从而使得可简单地应用模型2。估计的转化率对试剂HPLC测得的转化率的比较示于图13A。在20%以下该预测是无效的。从20%至85%，对于两个生物质批次预测略低。在85%以上至100%依照本公开的测定法对于批次96预测非常良好，而对于批次81产生略微过低的值。在高于20%的范围，与实际值的偏差对于批次91为5.6%而对于批次96为8.8%。
下表8中的数据显示两个不同的PCS-A批次水解72小时之后从荧光强度估计的转化率对HPLC测量的转化率。
表8
HPLC测量的转化率的剂量应答曲线显示来自批次96的WGS-NREL-PCS对于80%转化率与批次81相比需要较高量的酶(参见图13B)。在较高和较低转化率，曲线再次重合(参见图13C)。这也在测定法估计中观察到，但存在一些与HPLC测量的转化率的偏差。因此，依照本公开的测定法善于将不同酶混合物对一种生物质样品彼此比较以及在不同生物质样品之间进行比较。
上述结果显示荧光增亮剂28可用于在相同缓冲系统中对不同酶混合物对于相同PCS的水解性能进行排序。也可使用其他指示剂成分。
该测定亦可用于其他生物质样品。已经显示了对于未洗涤的、磨碎和筛过的PCS-C和NRELPCS的关联，但是其他生物质样品如玉米纤维、玉米穗轴、柳枝稷、甘蔗渣等亦适于供依照本公开使用。
实施例2
对适用于依照本公开的方法的多种指示剂成分进行了研究。更具体而言，研究了多种染料及其与不同生物质底物相关的荧光行为。FB28染料显示优异的品质。
在实施方案中，本公开的方法面临来自木质素的少量背景吸光度(下面由Kelig表示)。最好最小化或避免此种来自木质素的背景吸光度，因此进行研究以鉴定反应条件。目标是鉴定出在不同波长发射的指示剂成分，并由此减少任何来自木质素的干扰。检查了多种染料-生物质组合的多种光谱。
经衡量的染料和生物质分别总结于表9和10。染料制备为0.6g/L溶液，底物为36g/L，两者均为DDI水中。为了获得光谱，将合适的染料溶液与相应的底物或DDI水(染料本身)以1:5的比例混合。类似地，使用水:生物质的1:5比例以制备底物本身的样品。然后将300μl的此类样品置于一个96孔3364平板的孔中以供在购自MolecularDevices的M5型荧光读板器上进行荧光检测。所有光谱是通过将材料在360nm激发然后在400-500nm波长记录荧光来获得的。
表9
表10
所有染料和底物的预扫描
获得了表10的底物本身或表9的荧光染料本身的光谱。将光谱作为荧光单位对400-500nm的波长范围进行作图。结果表明除了Kelig和(能够达到4000-5000的最大值)之外，底物在所述波长范围总体具有低荧光，仅达到大约1500荧光单位。然而，Kelig和光谱与这些染料的光谱相比被视为背景，后者通常延伸至2万至12万的荧光单位或更高。
大多数染料光谱具有约450nm附近的λ最大值，类似FB28。然而，发现FB28最善于该区域中降低木质素(例如Kelig)荧光的影响。
多种染料与WGS3%PCS的光谱
将WGSPCS(30g/L；3%)与一系列荧光染料混合，并构建其光谱。与染料本身的光谱相比，所有的染料均在添加3%WGSPCS之后遭受荧光淬灭，其部分是由PCS溶液中含有的色素及已知或未知化学物造成的。根据这些结果，牌增亮剂、Tinopal5BM-GX、TinopalCBS-X和FB28鉴定为非常适于对WGSPCS的荧光研究。这四种染料具有450nm或更低的λmax。
在与多种底物混合之后检查FB28的荧光：绘制了(a)整体光谱；和(b)荧光单位10-100k范围的光谱。令人惊讶的是，和FB28的混合物取得了高度荧光性材料，其具有450nm的λmax并达到高至500k荧光单位。该表明优异的参数以使用荧光染料检查的消化至非常敏感和具体的水平。
与FB28+WGS3%PCS的混合物相比较，下述材料更具荧光性：淀粉、葡萄糖、木糖和Kelig。葡萄糖和木糖均为单组分的透明溶液，其荧光可比置于富含色素的液体如WGS-PCS中要少得多。在该实验中，使淀粉和Kelig的水平等于PCS的浓度。然而，在依照本公开的测定条件下，这两种底物是可忽略的或处于显著较低的水平，如通过PCS的成分分析所揭示。测试HPLC结果的原型(葡萄糖和纤维二糖收率)与测定法所预测的良好相关，这证明木质素的影响被降至最低。
结论
总而言之，将不同染料-底物的组合在360nm处激发，并记录其在400-500nm的发射。未发现来自底物的显著背景荧光。这些配对中一些具高度荧光性，如牌增亮剂，和-FB28，这可对于其他目的是有益的，如设定动力学测定。最终，这些研究发现来自Kelig和其他成分对FB28-PCS吸光度的干扰是最小限的，且并未完全避免。
发现该荧光纤维素衰变测定对于检测PCS酶水解水平与HPLC测定法相比是迅速的并具有优异的准确率(+/-5-10%)。对感兴趣的酶如纤维素酶和感兴趣的多肽如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的高通量筛选现为可行的，而且使用本公开的方法获得了方便的QC标准。
实施例3
化学品、底物、酶
荧光增亮剂28(F3543)从获得。90(INEOS)、PEG3350、PEG200、80和X-100用作表面活性剂。底物提供为经洗涤、磨碎和筛过的—来自批次KCMF1752-96的NRELPCS。使用来自SaMeMF268的CZP0001的CP1，并在使用当天新鲜稀释。
测试/分析
在依照本公开的方法中使用含150μMFB28的PCS-A(3%)。在3364平板中，通常通过洗去-排出3次将240μl的3.75%WGS-NRELPCS，30μl的含10mM硫酸镁的500mM乙酸钠缓冲液pH5.0，和30μl酶混合物混合。若柠檬酸用作缓冲剂，将缓冲液体积减少至15μl，并使用1M柠檬酸钠pH4.6。这导致5.0的最终pH。对于pH试验，将添加或不添加10mM二价阳离子的不同缓冲液用作500mM储液：对于pH4至pH5使用乙酸缓冲液，对于pH6至7使用BIS-TRIS缓冲液，对于pH8使用TRIS缓冲液。通过减少酶体积和将添加剂作为储液添加来添加添加剂。
用ALPS3000(165℃进行1.5秒)密封平板，并在50℃温育72小时，每日手动倒置两次。在BeckmanDTX读数器上通过平板底部以360nm处的激发滤镜和465nm处的发射滤镜读取荧光发射。荧光发射强度以任意单位(AU)报道。估计的转化率是从荧光发射强度计算的，如下所述：
100 · AU ‾ 0 - AU ( AU ‾ 0 - AU ‾ 50 ) 72 h
其中AU=荧光发射强度的任意单位
如一些情况中所示，进行了使用各将添加剂或缓冲液添加至无酶或50mg/g酶样品的标准化。
在72小时处，将样品过滤并就葡萄糖和纤维二糖通过HPLC进行分析。这些样品通常取自与依照本公开的测定的相同平板，这意味着在水解过程中存在FB28。
在一些实验(如文中所示)中，使用250μl的最终体积。此外，在最后平板中，亦包含10mM叠氮化钠以供保存平板。
变异系数(CV)通常仅从三次重复样品计算。若给出了平均CV，其涉及一个实验中所有三次重复的CV的平均值。排除具有低于10%转化率的样品。
在pH5柠檬酸和乙酸缓冲液的比较。
对于添加两种不同缓冲系统的相同PCS-A测试依照本公开的测定。使用1M柠檬酸缓冲液的第一试验显示在pH5的1M储液，50mM处的最终pH为5.8。因此，将1M柠檬酸缓冲液调整为pH4.6以获得5.0的最终pH。将纤维素酶作为依照本公开的典型剂量应答与5.0的最终pH的乙酸或柠檬酸缓冲液添加。荧光纤维素衰变(“FCD”)转化率从荧光发射计算，而HPLC转化率从FCD测定之后测得的葡萄糖和纤维二糖计算。使用乙酸或柠檬酸的CP1剂量应答显示与从FCD估计的以及从HPLC计算的转化率的良好拟合。FCD和HPLC数据是相似的，除了在4.1和5.1mg/g的酶加载中观察到显著差异以外。柠檬酸和乙酸仅在HPLC分析中的2.1mg/g的酶加载处显著不同。与之相比，FCD预测在2.1至5.1mg/g的酶加载范围显示更显著的差异。这是由于FCD测定法在该范围较低的变异系数(CV)。比较FCD和HPLC分析的CVa，其中将来自每一个三次重复的CV对相应的对于FCD分析和HPLC分析的HPLC转化率作图。数据表明HPLC具有整个测定范围的约5%的近乎恒定的CV。与之相对，FCD测定法在较高转化率具有较低CV，但其CV随着转化率的减少而增加。因此，该测定法可在高转化率非常有效，并显示优于HPLC的较小显著差异。
4至8的pH范围
对4至8的pH范围测试了依照本公开的测定法。这是通过添加10mMCaCl2进行的。未使用锰，因为在较高pH锰氧化为Mn3+，使得缓冲液呈褐色或黑色。在72小时水解之后，未添加酶的样品的荧光发射不受pH改变。在pH5至pH4观察到荧光发射强度的显著减少。以0.1pH梯度测试4至5的pH范围，并在低于pH4.7观察到强烈减少。
由于该荧光的强烈减少，测定中需要控制pH，且测定应优选在pH5以上运行。
将FCD估计的转化率与HPLC转化率相比，明显可在pH5至6的范围使用该测定法。在相应pH用未添加CP1对照的标准化并未在其他pH值改善预测。然而，在相应pH未添加CP1或添加50mg/gCP1的标准化可观地改善了对于pH7的预测。pH8处的转化率低于20%，因此该pH并无实际意义。
测试中的剂量应答显示pH4.9至pH6数据与通常标准化具有良好拟合。该拟合还在pH7与用两种对照在相应pH的标准化得到改善。在通常标准化之后，来自FCD的pH曲线明确表明最大值在pH4.9至8的范围，但在pH7，FCD预测过低。在各pH用两种对照的标准化导致从pH4至pH7的数据的更佳拟合。若应在pH7和8应用FCD测定，需要更高的酶加载以改善转化率预测。
将用4mgCP1每g纤维素加载的第二实验在5至7的pH范围以0.5pH间隔进行。获得的结论和结果与第一实验一致。在第二实验中，测定体积减少至250μl，且添加10mM叠氮化钠。
确定依照本公开的测定法可用于pH5至pH6。对于pH7，需要用在该pH处的对照的标准化。在pH4.7以下，FB28荧光强度强烈下降，可能是由于荧光团的质子化。
30至60℃的温度
使用CP1在30、50、55和60℃进行依照本公开的测定法。确定可使用线性模型以比较50至60℃内的每个温度。60与50和55℃的比较显示60℃样品比它们实际要好7%。在实施方案中，对于温度之间的比较在50和55℃之间的比较是优异的。
盐的添加
不同的氯化钠浓度常常存在于酶样品中，特别是在通过阴离子交换柱纯化并用盐梯度洗脱之后。因此，调查了0至400mMNaCl添加至FCD测定法的作用。荧光发射显示未添加酶的样品的荧光发射随着氯化钠浓度的增加而减少。3至5mg/g纤维素加载的CP1的0小时样品紧密遵循该趋势。在73小时的水解之后，所有CP1加载的荧光发射非常独立于盐浓度。通常的测定标准化会表明该转化率几乎不受盐添加的影响。然而，并未观察到这样。在HPLC测定中，观察到随着盐浓度增加而减少。基础荧光发射信号中的变化可通过总是在相应的盐浓度测量不含酶样品来校正。使用该标准化，获得了与通过将FCD估计的转化率对HPLC测量的转化率作图而显示的未添加盐的剂量应答吻合良好的测定估计。观察到FCD转化率低于HPLC测量的转化率，但相同的减少趋势在所有加载都是可见的。在400mMNaCl，偏差增加至大约5%以上。在0至200mM，这对于所有加载是类似的，并低于约6%。在更高盐浓度减少的转化率显示涉及纤维二糖的增加，这可表明在较高盐浓度的较低BG活性。
在通过离子交换层析进行的酶纯化之后，洗脱级分中的盐浓度通常是未知的，并随着级分数的增加而增加。因此，不可能在不含酶添加的对照中用特定氯化钠浓度进行校正。相反，使用在0小时处起始测定之后直接测得的值可能是有用的。显示该值密切相关于在相应盐浓度处的未添加酶的荧光发射。然而，由于缺乏平衡，这些值高于未添加酶的对照的平衡值。
在此，FCD转化率用下式计算：
100*(AUx,0h-AUx,72h)/(AUx,0h-AU50,72h)
亦显示该数据甚至比在每个NaCl浓度使用无酶对照的标准化更接近HPLC转化率。测定转化率甚至在高至400mMNaCl也紧密遵循HPLC测量的转化率。3mg/g加载仍显示随着盐浓度增加而多至+5%的偏差。因此，推荐将该方法用于含有不同水平的盐的样品。
发现盐的添加减少荧光发射。若通过在相应的盐浓度测量每个无酶添加对照来校正测定转化率计算，则在高至200mM氯化钠获得测定法预测和HPLC测量的转化率之间的良好关联。优异的关联可通过使用起始测定之后立即的荧光发射获得。然后FCD预测计算为100*(AUx,0h-AUx,72h)/(AUx,0h-AU50,72h)。该数据与高至400mM氯化钠拟合良好。然而，该方法在低水平转化率存在困难，因为基线荧光在测定起始之后下降至新的基线。在一般可使用该标准化之前，需要首先消除该下降。
干涉剂的添加
进行测试表明乙醇并不干扰指示剂成分的荧光发射。依照本公开的方法因此非常适用于对乙醇耐受的纤维素酶的筛选。
表面活性剂的添加
对添加至依照本公开的方法的表面活性剂进行测试。发现能够用小规模测定接着进行HPLC分析来筛选表面活性剂，但使用荧光增亮剂确定转化率是困难的。不拘于本公开，认为表面活性剂可修饰FB28对纤维素的结合。对于一些表面活性剂(90、80、X-100)，将表面活性剂添加至无酶对照的标准化运行良好。聚乙二醇似可观地改变FCD结果，并无法不经额外校正而使用。
应理解的是，前文仅为本发明的说明而非限制，且对上文所述的实施方案的多种改变和修饰对于本领域技术人员而言会是显而易见的。可不悖于本发明的精神和范围进行此类改变和修饰，且因此旨在使此类变化和修饰受所附权利要求覆盖。同样，应理解的是当本文中任何术语和/或定义与通过提述并入本文的任何申请中类似的术语或定义不同时，应以本文中的术语和定义为准。
本公开进一步通过下述编号段落描述：
[1]一种分析纤维素材料水解中纤维素的衰变的方法，包括在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的纤维素材料；和检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由感兴趣的酶水解的纤维素的量。
[2]段1的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触。
[3]段1或2的方法，其中所述指示剂成分是荧光指示剂化合物，包括：荧光团，高波长荧光团，苯和联苯的苯乙烯基衍生物，茋(stilbene)衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉，或二氨基茋；或其混合物。
[4]段3的方法，所述二氨基茋是4,4’-二[(4-苯胺基-6-二(2-羟乙基氨基)-s-三嗪-2-基)氨基]-2,2’-茋二磺酸或4,4’-二氨基茋-2,2’-二磺酸的四磺酸化衍生物。
[5]段1或2的方法，其中所述指示剂成分是4,4’-二[(4-苯胺基-6-二(2-羟乙基氨基)-s-三嗪-2-基)氨基]-2,2’-茋二磺酸。
[6]段1-5任一项的方法，其中所述反应介质具有10-1000μl的体积。
[7]段1-5任一项的方法，其中所述反应介质具有100-500μl的体积。
[8]段1-7任一项的方法，其中所述反应介质配置于包含至少两个孔的多孔板。
[9]段8的方法，其中所述平板由聚丙烯制成。
[10]段8的方法，其中所述多孔板包含12、24、96、384、1,536或3,456个孔。
[11]段1-10任一项的方法，其中感兴趣的酶以0.1ng至10mg的量添加至每个孔。
本公开进一步通过下述编号段落描述：
[1]一种分析纤维素材料水解中纤维素的衰变的方法，包括在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的纤维素材料；和检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由感兴趣的酶水解的纤维素的量。
[2]段1的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触。
[3]段1或2的方法，其中所述指示剂成分是荧光指示剂化合物，包括：荧光团，高波长荧光团，苯和联苯的苯乙烯基衍生物，茋(stilbene)衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉，或二氨基茋；或其混合物。
[4]段3的方法，所述二氨基茋是4,4’-二[4-苯胺基-6-二(2-乙基)氨基-s-三嗪-2-基氨基]-2,2’-二磺酸或4,4’-二氨基茋-2,2’-二磺酸的四磺酸化衍生物。
[5]段1或2的方法，其中所述指示剂成分是4,4’-二[4-苯胺基-6-二(2-乙基)氨基-s-三嗪-2-基氨基]-2,2’-二磺酸。
[6]段1-5任一项的方法，其中所述反应介质具有10-1000μl的体积。
[7]段1-5任一项的方法，其中所述反应介质具有100-500μl的体积。
[8]段1-7任一项的方法，其中所述反应介质配置于包含至少两个孔的多孔板。
[9]段8的方法，其中所述平板由聚丙烯制成。
[10]段8的方法，其中所述多孔板包含12、24、96、384、1,536或3,456个孔。
[11]段1-10任一项的方法，其中感兴趣的酶以0.1ng至10mg的量添加至每个孔。
[12]段1-11任一项的方法，其中在水解步骤之后少于五分钟内对至少96个感兴趣的酶测试了纤维素水解活性。
[13]段1-12任一项的方法，其中水解步骤是在10℃至90℃进行的。
[14]段1-13任一项的方法，其中所述反应介质配置在至少两个密封的孔中。
[15]段1-14任一项的方法，其中检测步骤发生在反应介质之下。
[16]段1-15任一项的方法，其中所述反应介质具有4至8的pH。
[17]段1-16任一项的方法，其中所述反应介质包含0-500mM的盐。
[18]段1-17任一项的方法，其中所述反应介质包含缓冲系统。
[19]段1-18任一项的方法，其中感兴趣的酶以足以水解20%至100%纤维素材料的量添加。
[20]段1-18任一项的方法，其中感兴趣的酶以足以水解所述纤维素材料的量添加。
[21]段1-20任一项的方法，其中所述反应介质包含一种或多种表面活性剂。
[22]段1-21任一项的方法，其中所述反应介质具有约0.5%至约10%总固形物。
[23]段1-22任一项的方法，其中所述感兴趣的酶包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[24]段23的方法，其中所述纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[25]段23的方法，其中所述半纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸苷酶。
[26]段1-24任一项的方法，其中所述感兴趣的酶包括：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合；(d)具有(a)、(b)或(c)的活性的片段；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的组合。
[27]段1-26任一项的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的多肽的反应介质相接触。
[28]段27的方法，其中所述感兴趣的多肽是来自一个或多个糖基水解酶家族的多肽。
[29]段28的方法，其中所述多肽是具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
[30]一种确定感兴趣的酶是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：在含有荧光指示剂化合物的反应介质中在所述荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。
[31]段30的方法，进一步在水解之前包括下述步骤：(a)将纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶的反应介质相接触。
[32]段30或31的方法，其中感兴趣的酶/多肽包含一种或多种(几种)选自下组的：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[33]段32的方法，其中所述纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[34]段32的方法，其中所述半纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸苷酶。
[35]段30-33任一项的方法，其中所述感兴趣的酶包括：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合；(d)具有(a)、(b)或(c)的活性的片段；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的组合。
[36]一种分析感兴趣的酶和/或多肽的高通量方法，包括下述步骤：(a)将生物质与荧光化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中信号强度预示生物质水解中感兴趣的酶和/或多肽的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。
[37]段36的方法，其中所述多孔板配置于进一步包含移液管的系统中。
[38]段36或37的方法，其中所述系统进一步包含读板器。
[39]段36-38任一项的方法，其中所述质量参数是纤维素分解活性指标或质量控制参数。
[40]段36-39任一项的方法，其中所述生物质是木素纤维素材料。
[41]段36-40任一项的方法，其中所述感兴趣的酶/多肽包括选自下组的一种或多种：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[42]段41的方法，其中所述纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[43]段41的方法，其中所述半纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸苷酶。
[44]段36-42任一项的方法，其中所述感兴趣的酶包括：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合；(d)具有(a)、(b)或(c)的活性的片段；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的组合。
[45]一种确定感兴趣的酶是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：(a)将生物质与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素水解。
[46]段45的方法，包括提供感兴趣的酶/多肽的步骤。
[47]段45或46项的方法，其中所述感兴趣的酶/多肽包括选自下组的一种或多种(几种)：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[48]段47的方法，其中所述纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[49]段47的方法，其中所述半纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸苷酶。
[50]段45-48任一项的方法，其中所述感兴趣的酶包括：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合；(d)具有(a)、(b)或(c)的活性的片段；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的组合。
[51]一种分析酶性能的方法，所述方法包括下述步骤：(a)将木素纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的木素纤维素材料；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。
[52]段51的方法，其中所述酶性能是木素纤维素水解中的纤维素衰变。
[53]段51或52项的方法，其中所述感兴趣的酶/多肽包括选自下组的一种或多种：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[54]段52的方法，其中所述纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[55]段52的方法，其中所述半纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸苷酶。
[56]段51-54任一项的方法，其中所述感兴趣的酶包括：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外切纤维二糖水解酶，变体内-1,4-β-葡聚糖酶，变体外-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合；(d)具有(a)、(b)或(c)的活性的片段；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的组合。
[57]一种分析生物质水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：(a)将生物质与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数。
[58]段57的方法，其中所述方法在系统中发生。
[59]一种确定感兴趣的酶是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：(a)将纤维素材料与如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会改变纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定所述水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。
[60]一种分析木素纤维素水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：(a)将木素纤维素与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解含有纤维素的玉米秸秆；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由所述酶水解的纤维素的量。
[61]一种用于衡量酶性能的系统，包含：至少一个反应区，其中所述反应区用于分析木素纤维素材料水解中的纤维素衰变，所述反应区包含：至少一个用于下述的孔：(a)将木素纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的木素纤维素材料；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由所述酶水解的纤维素的量。
[62]段61的系统，其中所述检测器位于反应介质之下。
[63]一种标准化用于确定生物样品中目标纤维素的量的方法的方法，包括下述步骤：(a)在反应体积中测量样品中目标纤维素的荧光强度；(b)确定不添加酶的底物水解的平均荧光强度；和(c)通过将目标纤维素的荧光强度从未添加酶的水解反应的平均强度减去来标准化目标纤维素测量。
[64]段63的方法，其中所述底物是PCS。
[65]一种标准化荧光强度数据的方法，所述方法包括下述步骤：(a)确定不添加酶的PCS水解反应的平均荧光强度；和(b)使用步骤(a)中确定的荧光强度标准化一种或多种第二水解反应的荧光强度。
[66]一种确定感兴趣的酶和感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：在含有荧光指示剂化合物的反应介质中在荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解反应是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和感兴趣的多肽的纤维素分解活性，和/或由感兴趣的酶和感兴趣的多肽水解的纤维素的量。

Claims (39)

1.一种分析木素纤维素材料水解中纤维素的衰变的方法，包括：
在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分是荧光指示剂化合物并会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的木素纤维素材料；和
检测来自所述指示剂成分的荧光发射，其中荧光发射强度中的减少指示由感兴趣的酶水解的纤维素的量。
2.权利要求1的方法，包括下述步骤：(a)将木素纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触。
3.权利要求1或2的方法，其中所述指示剂成分是荧光指示剂化合物，该荧光指示剂化合物包括荧光团。
4.权利要求3的方法，其中所述荧光指示剂化合物包括高波长荧光团。
5.权利要求1或2的方法，其中所述荧光指示剂化合物包括苯的苯乙烯基衍生物，联苯的苯乙烯基衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉(carbostyrils)，或其混合物。
6.权利要求1或2的方法，其中所述荧光指示剂化合物包括茋(stilbene)衍生物。
7.权利要求6的方法，其中所述荧光指示剂化合物包括二氨基茋。
8.权利要求7的方法，其中所述二氨基茋是4,4’-二[(4-苯胺基-6-二(2-羟乙基氨基)-s-三嗪-2-基)氨基]-2,2’-茋二磺酸，或4,4’-二氨基茋-2,2’-二磺酸的四磺酸化衍生物。
9.权利要求1或2的方法，其中所述指示剂成分是4,4’-二[(4-苯胺基-6-二(2-羟乙基氨基)-s-三嗪-2-基)氨基]-2,2’-茋二磺酸。
10.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质具有10-1000μl的体积。
11.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质具有100-500μl的体积。
12.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质配置于包含至少两个孔的多孔板。
13.权利要求12的方法，其中所述多孔板由聚丙烯制成。
14.权利要求12的方法，其中所述多孔板包含12、24、96、384、1,536或3,456个孔。
15.权利要求12的方法，其中感兴趣的酶以0.1ng至10mg的量添加至每个孔。
16.权利要求1或2的方法，其中在水解步骤之后少于五分钟内对至少96个感兴趣的酶测试了纤维素水解活性。
17.权利要求1或2的方法，其中水解步骤是在10℃至90℃进行的。
18.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质配置在至少两个密封的孔中。
19.权利要求1或2的方法，其中检测步骤发生在反应介质之下。
20.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质具有4至8的pH。
21.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质包含0-500mM的盐。
22.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质包含缓冲系统。
23.权利要求1或2的方法，其中感兴趣的酶以足以水解20％至100％木素纤维素材料的量添加。
24.权利要求1或2的方法，其中感兴趣的酶以足以水解所述木素纤维素材料的量添加。
25.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质包含一种或多种表面活性剂。
26.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质具有约0.5％至约10％总固形物。
27.权利要求1或2的方法，其中所述感兴趣的酶包含一种或几种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
28.权利要求27的方法，其中所述纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
29.权利要求27的方法，其中所述半纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸苷酶。
30.权利要求1或2的方法，其中所述感兴趣的酶包括：(a)野生型外切纤维二糖水解酶，野生型内切-1,4-β-葡聚糖酶，野生型外切-1,4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)变体外切纤维二糖水解酶，变体内切-1,4-β-葡聚糖酶，变体外切-1,4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合；(c)具有(a)或(b)的活性的片段；或(d)(a)、(b)、或(c)的组合。
31.权利要求30的方法，其中所述感兴趣的酶包括：突变的外切纤维二糖水解酶，突变的内切-1,4-β-葡聚糖酶，突变的外切-1,4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合。
32.权利要求1或2的方法，包括下述步骤：(a)将木素纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的多肽的反应介质相接触。
33.权利要求32的方法，其中所述感兴趣的多肽是来自一个或多个糖基水解酶家族的多肽。
34.权利要求33的方法，其中所述多肽是具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
35.一种分析含有纤维素的生物质水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：
(a)将含有纤维素的生物质与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；
(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；
(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和
(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的荧光发射，其中荧光发射强度中的减少指示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数。
36.权利要求35的方法，其中所述方法在系统中发生。
37.一种确定感兴趣的酶是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤：
(a)将木素纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；
(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶的反应介质相接触；
(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色并产生指示纤维素存在的荧光发射的条件下水解所述木素纤维素材料；和
(d)确定所述水解反应是否具有减少的荧光发射，其中所述减少的荧光发射指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。
38.一种分析木素纤维素水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤：
(a)将木素纤维素与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；
(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；
(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解木素纤维素；和
(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的荧光发射，其中荧光发射强度中的减少指示由所述酶水解的纤维素的量。
39.权利要求38的方法，其中所述木素纤维素为含有纤维素的玉米秸秆。
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