JP3649338B2

JP3649338B2 - 精製されたマイセリオフトラ・ラッカーゼ及びそれをコードする核酸

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Publication number: JP3649338B2
Application number: JP50113296A
Authority: JP
Inventors: エム．バーカ，ランディ; エイチ．ブラウン，スティーブン; シュー，フェン; シェニデール，パール; アニタアースリン，ドーリット; エム．オクセンベール，カレン
Original assignee: ノボザイムスバイオテック，インコーポレイティド; ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2020-05-18
Also published as: MX9606013A; PT765394E; AU694954B2; FI964808A; ATE206460T1; DE69523052T2; DE69523052D1; KR970703426A; FI964808A0; CN1157008A; EP0765394A1; WO1995033836A1; ES2165420T3; BR9507817A; US5795760A; DK0765394T3; EP0765394B1; CN1192108C; CA2191718A1; JPH10501137A

Description

発明の分野
本発明は菌類オキシドリダクターゼ酵素をコードする単離された核酸酵素フラグメント及びそれにより産生された精製酵素に関する。より詳しくは、本発明はフェノールオキシダーゼ、特に好熱性子嚢菌綱マイセリオフトラ（Myceliophthora）のラッカーゼをコードする核酸フラグメントに関する。
発明の背景
ラッカーゼ（ベンゼンジオール：酸素オキシドリダクターゼ）は多銅含有酵素であり、フェノール類の酸化を触媒する。ラッカーゼ媒介式酸化は適当なフェノール系基質からのアリールオキシ基中間体の産生をもたらす。このようにして産生された中間体の究極的なカップリングは二量体、オリゴマー及び重合反応産物の組合せを供する。かかる反応はメラニン、アルカロイド、毒素、リグニン及びフミン酸（humic acid）の形成をもたらす生合成経路において本質的に重要である。ラッカーゼは多種多様な菌類、例えば子嚢菌綱、例えばアスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、及びポドスポラ（Podospora）、不完全菌類ボツリチス（Botrytis）、並びに担子菌綱、例えばコリビア（Collybia）、ホーメス（Fomes）、レンチヌス（Lentinus）、プレウロトゥス（Pleurotus）、トラメテス（Trametes）、及びリゾコトニア（Rhizoctonia）の完全形態により産生される。ラッカーゼは幅広い基質特異性を示し、そして各種の菌類ラッカーゼは通常フェノール系基質を酸化するその能力において互いと力価的に相違する。基質多様性を理由に、ラッカーゼには一緒に多くの潜在的な産業用途が見い出されている。それはとりわけリグニンの修飾、紙の強化、洗剤における染料転移の阻害、フェノールの重合、ジュースの製造、フェノール樹脂の製造及び廃水処理である。
種々の菌類種により作られるラッカーゼの触媒能力は類似しているか、異なる至適温度及びpHを有し、そしてこれらは特定の基質に依存しても相違しうる。数多くのこれらの菌類ラッカーゼが単離されており、そしてこれらのいくつかについての遺伝子がクローニングされている。例えば、Choiら（Mol.Plant−Microbe Interactions ５:119−128,1992）には、チェストナッツ・ブライト（chestut blight）菌類クリホネクトリア・パラシチカ（Cryphonectria parasitica）のラッカーゼをコードする遺伝子の分子特性決定及びクローニングが記載されている。Kojimaら（J.Biol.Chem.265:15224−15230,1990;JP2−23885）はホワイト・ロット（white−rot）担子菌綱コリオルス・ハーストゥス（Coriolus hirsutus）のラッカーゼの２通りの対立形質の説明を供する。Germann and Lerch（Experientia 41:801,1985;PNAS USA 83:8854−8858,1986）はニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）ラッカーゼ遺伝子のクローニング及び部分配列決定を報告する。Saloheimoら（J.Gen.Microbiol.137:1537−1544,1985;WO92/014046）は菌類フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）由来のラッカーゼ遺伝子の構造分析を開示する。
異種菌類系においてラッカーゼ遺伝子を発現させる試みは往々にして非常に低い収量をもたらす（Kojimaら、前掲;Saloheimoら、Bio/Technol.９:987−990,1991）。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）におけるフレビア・ラジアタラッカーゼの異種発現は１リットル当り20mgの活性酵素しか供していない（Saloheimo,1991、前掲）。ラッカーゼは偉大な商業的潜在性を有するが、大量に酵素を発現する能力はその商業的用途にとって重要である。現時点では、商業的に利用されている宿主、例えばアスペルギルスにおいて高レベルで発現されるようなラッカーゼはない。即ち、商業的に有用な（即ちグラム／リットル又はそれより多くの）量で産生されうるラッカーゼの存在のニーズがある。本発明はかかるニーズに応える。
発明の概要
本発明はマイセリオフトラ・ラッカーゼをコードする核酸配列を含むDNA構築体に関する。本発明は更に核酸配列によりコードされる単離されたラッカーゼにも関連する。好ましくは、ラッカーゼは実質的に純粋である。「実質的に純粋」とは、ラッカーゼがその他の非ラッカーゼタンパク質を本質的に含まないことを意味する（即ち≧90％）。
新規ラッカーゼの産生を助長するため、本発明は更に請求の範囲記載の核酸配列を含んで成るベクター及び宿主細胞も提供し、このベクター及び宿主細胞はラッカーゼの組換生産において有用である。この配列は選定した宿主細胞におけるラッカーゼタンパク質の発現を指令することのできる転写及び翻訳シグナルに作用可能式に連結されている。好適な宿主細胞は菌類細胞であり、最も好ましいのはアスペルギルス属のそれである。本発明のラッカーゼの組換生産は本発明の構築体により形質転換された又はトランスフェクションされた宿主細胞又はその子孫を、ラッカーゼタンパク質の発現に適する条件下で培養し、そしてその培養物からラッカーゼタンパク質を回収することにより達成される。
本発明のラッカーゼはフェノール類の酸化を必要とする数多くの産業プロセスにおいて有用である。これらのプロセスにはリグニンの処理、ジュースの製造、フェノールの重合及びフェノール樹脂の製造が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１はpRaMB1における7.5EcoR Iフラグメントの制限地図を示す。N.クラッサ・ラッカーゼ遺伝子プローブハイブリダイズする領域に陰影をつけた。
図２はマイセリオフトラ・サーモフィラ（M.thermophila）ラッカーゼのヌクレオチド（SEQ ID NO:1）及びアミノ酸（SEQ ID NO:2）を示す。ヌクレオチド配列における下方の小文字はイントロンの位置を示す。プロモーター領域の中の推定TATA及びCAAT配列を太文字で示し、そして下線を付した。イントロン内の共通ラリアット構築（PuCTPuAC）に下線を付した。
図３はプラスミドpRaMB5の構築を示す。
発明の詳細な説明
マイセリオフトラ・サーモフィラは最初にApinisにより論じられ（Nova Hedwigia ５:57−78,1963）、そしてスポロトリカム・サーモフィル（Sporotrichum thermophile）と称された好熱性子嚢菌綱である。その後の分類学的修正はこの生物をクリソスポリウム属に属させ（Von Klopotek,A.Arch.Microbiol.98:365−369,1974）、そしてその後マイセリオフトラに属させた（Van Oorschot,Persoonia ９:401−408,1977）。その他の名称で知られるいくつかの生物もこの種に属することが明らかとされた。それらにはスポロトリカム。セルロフィルム（S.cellulophilum）（米国特許第4,106,989号）；シーラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）（Fergus and Sinden,Can.J.Botany 47:1635−1637,1968）；クリソスポリウム・ファーガシ（C.fergussi）及びコリナスカス・サーモフィルス（Corynascus thermophilus）（Von Klopotek、前掲）が含まれる。この種はいくつかの種々の工業的に有用な酵素、例えばセルラーゼ、β−グルコシダーゼ及びキシラナーゼの起源として知られる（例えば、Obersonら、Enzyme Microb.Technol.14:303−312,1992;Merchantら、Biotechnol.Lett.10:513−516,1988;Breuilら、Biotechnol.Lett.８:673−676,1986;Gilbertら、Bioresource Technol.39:147−154,1992を参照のこと）。マイセリオフトラは中性pHのラッカーゼを産生し、そしてこのラッカーゼをコードする遺伝子は慣用の宿主系、例えばアスペルギルスを大量に生産するために利用できることがこの度決定された。
マイセリオフトラにおけるラッカーゼ遺伝子の存在を同定するため、ニューロスポラ・クラッサ・ラッカーゼ遺伝子の5'領域（lcc 1）は、種々の菌類種の全ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションにおける温和なストンジェンシーの条件下でのプローブとして用いられる。約12kbのラッカーゼ特異性配列がマイセリオフトラDNAにおいて検出される。次いでN.クラッサフラグメントをλEMBL4バクテリオファージクローニングベクターの中の約20,000プラークのM.サーモフィラ・ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするために用いる。８プラークがこのプローブと強くハイブリダイズする。この８つのうち、３つからDNAを単離した。これらのクローンをそれぞれは7.5EcoR Iフラグメントを含み、それもプローブにハイブリダイズする（図１）。フラグメントのうちの１つをpBR322の中にサブクローニングし、プラスミドpRaMB1を作り上げた。lcc 1プローブを用い、クローンのコード領域の位置を決定する。全M.サーモフィラコード領域は3.2kbのNhe−I Bgl IIセグメントを含むことが明らかとなり、それをpUC119にクローニングし、そしてプライマー歩行法により配列決定した。
配列が決定されたら、遺伝子内のイントロン及びエキソンの位置を、対応のN.クラッサ・ラッカーゼ遺伝子産物に対する推定アミノ酸配列の整合に基づき認定する。この対比から、M.サーモフィラの遺伝子（lccM）は６つのイントロン（85,84,102,72,147及び93ヌクレオチド）により介在された７つのエキソン（246,79,12,70,973,69及び411ヌクレオチド）より成ることが明らかとなる。介在配列を除くコード領域は非常にGCリッチ（65.5％のＧ＋Ｃ）であり、そして620アミノ酸のプレプロ酵素:22アミノ酸のシグナルペプチド、25アミノ酸のプロペプチド及び573個のアミノ酸を含んで成る成熟ラッカーゼをコードする。M.サーモフィラ遺伝子の配列及び推定アミノ酸配列を図２に示す（SEQ ID NO:1及び２）。
次いでラッカーゼ遺伝子をアスペルギルス宿主細胞の形質転換のための発現ベクターを作り上げるために利用する。このベクターpRaMB5はA.オリザTAKA−アミラーゼプロモーター及びターミネーター領域を含む。pRaMB5の構築を図３に概略する。アスペルギルス細胞をこの発現ベクター及びpyrG又はamds選択マーカーを含むプラスミドにより同時形質転換させる。形質転換体はABTSを含む適当な選択培地に基づいて選定する。ラッカーゼ産生コロニーは緑色の輪を示し、従って容易に単離できる。選定した形質転換体を振盪フラスコの中で増殖させ、そして培養培地をシリンガルダジン（syringaldazine）法によりラッカーゼ活性について試験した。振盪フラスコ培養物は0.2g/1以上のラッカーゼを産生でき、そして発酵槽の中では１〜2g/1を超える収量が認められる。
本発明に従うと、ラッカーゼをコードするマイセリオフトラ遺伝子は上記の方法により、又は本明細書において提供する情報を利用して当業界公知の別の方法により得られうる。この遺伝子は発現ベクターを用い、活性形態で発現されうる。有用な発現ベクターは宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な組込み又は宿主細胞のゲノムと独立した宿主細胞の中でのベクターの自己複製を可能とする因子、及び好ましくは形質転換宿主細胞の容易な選定を可能とする１又は複数の表現型マーカーを含む。発現ベクターは更に、プロモーター、リボソーム結合性部位、翻訳開始シグナル、及び任意的にリプレッサー遺伝子又は様々な活性化性遺伝子をコードするコントロール配列を含みうる。発現されたタンパク質の分泌を可能とするため、シグナル配列をコードするヌクレオチドを遺伝子のコード配列の前に挿入してよい。コントロール配列の指令下での発現のため、本発明に従って利用されるラッカーゼ遺伝子は適当なリーディングフレーム内でコントロール配列に作用可能式に連結されている。プラスミドベクターの中に組込むことができ、そしてラッカーゼ遺伝子の転写を指令できうるプロモーター配列には、限定することなく、原核β−ラクタマーゼプロモーター（Villa−Kamaroffら、1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 75:3727−3731）及びtacプロモーター（DeBoerら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80:21−25）が含まれる。更なる参考は「Useful proteins from recombinant bacteria」Scientific American,1980,242:74−94及びSambrookら、「Molecular Cloning」1989に見い出せうる。
本発明のDNA構築体を担持する発現ベクターは、組換DNA手順に簡単に委ねることのできうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの選定は一般にそれを導入する宿主細胞に依存するであろう。即ち、ベクターは自己複製式ベクター、即ち、染色体外資として存在し、その複製が染色体の複製とは独立したベクター、例えばプラスミド、又は染色体外因子、ミニクロモソームもしくは人工染色体でありうる。他方、このベクターは、宿主細胞の中に導入したとき、宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、そしてそれの組込まれた染色体と一緒に複製するものでありうる。
ベクターの中では、ラッカーゼDNA配列は適当なプロモーター配列に作用可能式に連結されているべきである。このプロモーターは選定の宿主細胞の中で転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、そして宿主細胞と同族又は異種のいづれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。本発明のDNA構築体の転写を指令するのに適当なプロモーター、特に細菌宿主におけるプロモーターの例は、E.コリ（E.coli）のlacオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リシュニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエス（B.amyloliquefaciens）α−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、バチルス・スブチリス（B.subtilis）xylA及びxylB遺伝子のプロモーターである。酵母宿主において有用なプロモーターはeno−１プロモーターである。菌類宿主における転写のために有用なプロモーターの例は、A.オリザ（A.oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニガー（A.niger）中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸安定性α−アミラーゼ、A.ニガー又はA.アワモリ（A.awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコール・ミーヘイ・リパーゼ、A.オリザアルカリ性プロテアーゼ、A.オリザ・トリオース・ホスフェート・イソメラーゼ、又はA.ニドゥランス（A.nidulans）アセレアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。TAKA−アミラーゼ及びglaAプロモーターが好ましい。
本発明の発現ベクターは適当な転写ターミネーターを含んで成ってよく、そして真核細胞においては、本発明のラッカーゼをコードするDNA配列に作用可能式に連結されたポリアデニル化配列も含んで成ってよい。転写及びポリアデニル化配列は適切にはプロモーターと同一の起源に由来していてよい。このベクターは更にベクターが課題の宿主細胞の中で複製できるようにするDNA配列を含んで成りうる。かかる配列の例はプラスミドpUC19,pACY177,pUB110,pE194,pAMB1及びpIJ702の複製起点である。
このベクターは更に選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、例えばB.スブチリスもしくはB.リシェニホルミス由来のdal遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を授ける遺伝子も含んで成りうる。アスペルギルス選択マーカーの例には、amdS,pyrG,argB,niaD,sC及びヒグロマイシン耐性をもたらすマーカーhygBが含まれる。アスペルギルス・宿主細胞における使用にとって好ましいのはA.ニドゥランス又はA.オリザのamdS及びpyrGマーカーである。往々にして利用される哺乳動物のマーカーはジヒドロフォレートリダクターゼ（DHFR）遺伝子である。更に、選定はWO91/17243号に記載の如く、同時形質転換により成し遂げられうる。
一般に発現は細胞外となる産物をもたらすことが好ましい。本発明のラッカーゼはそれ故培養培地に発現タンパク質を分泌させるプレ領域を含んで成りうる。所望するなら、このプレ領域は本発明のラッカーゼにとって天然でありうるか、又はプレ領域もしくはシグナル配列により置換されていてよく、それは好都合には反応のプレ領域をコードするDNA配列の置換により成し遂げられる。例えば、プレ領域はアスペルギルス種由来のグルコアミラーゼ、もしくはアミラーゼ遺伝子、バチルス種由来のアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘイ由来のリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）もしくは子牛由来のα−因子についての遺伝子に由来しうる。特に好ましくは、宿主が菌類細胞であるとき、A.オリザTAKAアミラーゼ、A.ニガー中性アミラーゼ、バチルスNCIB 11837由来のマルトジェニックアミラーゼ、B.ステアロサーモフィルスα−アミラーゼ又はバチルス・リシェニホルミススブチリシンである。有効なシグナル配列はA.オリザTAKAアミラーゼシグナル、リゾムコール・ミーヘイ・アスパラギン酸プロテイナーゼシグナル及びリゾムコール・ミーヘイ・リパーゼシグナルである。
本発明のDNA構築体、プロモーター、ターミネーター及びその他の因子をそれぞれライゲーションする、並びにそれらを複製にとって必須の情報を含む適当なベクターに挿入するために利用する手順は当業者にとって公知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning,1989を参照のこと）。
上記の本発明のDNA構築体又は発現ベクターのいづれかを含んで成る本発明の細胞は好都合には本発明の酵素の組換生産における宿主細胞として用いられる。この細胞は本発明のDNA構築体により、好都合にはそのDNA構築体を宿主染色体の中に組込むことにより形質転換されうる。この組込みが一般に好都合と解され、なぜならDNA配列が細胞の中に安定に維持され易いからである。宿主の染色体へのDNA構築体の組込みは例えば相同性又は異種組換により、慣用の方法に従って実施されうる。他方、この細胞は種々のタイプの宿主細胞との関連で上記した通りにして発現ベクターにより形質転換されうる。
宿主細胞は原核細胞、例えば細菌細胞から選定されうる。適当な細菌の例はグラム陽性菌、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・リシェニホルミス、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・ブレビス（B.brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス（B.alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアジュランス（B.coagulans）、バチルス・サーキュランス（B.circulans）、バチルス・ロータス（B.lautus）、バチルス・メガテリウム（B.megaterium）、バチルス・スリンジェンシス（B.thuringiensis）、又はストレプトマイセス・リビダンス（S.lividans）もしくはストレプトマイセス・ミュリナス（S.murinus）、又はグラム陰性菌、例えばE.コリである。細菌の形質転換は例えばプロトプラスト形質転換により、又は本質的に公知の態様でコンピテント細胞を利用することにより行ってよい。
宿主細胞は真核系、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は好ましくは菌類細胞、例えば酵母及び糸状菌類であってもよい。例えば、有用な哺乳動物細胞にはCHO又はCOS細胞が含まれる。酵母宿主細胞はサッカロマイセス又はシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）の種、例えばサッカロマイセス・セレビジエから選定されうる。有用な糸状菌類はアスペルギルス種から選定され得、例えばアスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーである。他方、フサリウム種の株、例えばF.オキシスポルムを宿主細胞として利用できうる。菌類細胞は、本質的に公知の態様でのプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、その後の細胞壁の再生により形質転換してよい。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のために適当な手順はEP 238,023号に記載されている。フサリウム種を形質転換するのに適当な方法はMalardierら、1989により述べられている。
従って、本発明は本発明の組換ラッカーゼを生産する方法を提供し、この方法は上記の宿主細胞を酵素の産生を誘導する条件下で培養し、そして酵素を細胞及び／又は培養培地から回収することを含んで成る。細胞を培養するのに用いられる培地は課題の宿主細胞を増殖させ、且つ本発明のラッカーゼの発現を獲得するのに適当な任意の慣用の培地であってよい。適当な培地は商業的供給者から入手できるものであるか、又は公開の処方に従って調製されうるものである（例えば、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載）。
好適な態様において、培養物中のラッカーゼの組換生産は過剰量の銅の存在下で達成される。培養培地に添加する微量金属は少量の銅を含むが、本発明との関連で行う実験は培地への銅添加物の添加が活性酵素の収量を何倍にも高めうることを示す。好ましくは、銅は培地に可溶性形態で、好ましくは可溶性銅塩の形態で、例えば塩化銅、硫酸銅又は酢酸銅の形態で添加する。培地中の銅の最終濃度は0.2〜2mMの範囲、好ましくは0.05〜0.5mMの範囲にあるべきである。この方法は任意の組換的に生産した菌類ラッカーゼ、及びその他の銅含有酵素、特にオキシドリダクターゼの収量を高めるのに利用できうる。
得られる酵素は培地から、慣用の手順、例えば遠心又は濾過により培地から細胞を分離させ、上清液又は濾液のタンパク質性成分を塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿させ、次いで様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製することにより、回収できうる。好ましくは、単離したタンパク質はSDS−PAGEによる決定に従い約90％の純度でなり、その純度は食品、ジュース又は洗剤の用途において最も重要である。
特に好適な態様において、ラッカーゼの発現は菌類宿主細胞、例えばアスペルギルスにおいて達成される。以下の実施例において詳細に説明する通り、ラッカーゼ遺伝子はアスペルギルス・オリガTAKAα−アミラーゼプロモーター及びアスペルギルス・ニドゥランスamdS選択マーカーを含むプラスミドの中にライゲーションする。他方、amdSが独立したプラスミドの上にあり、そして同時形質転換において利用できる。１又は複数のプラスミドを、アスペルギルス種の宿主細胞、例えばA.オリザ又はA.ニガーをYeltorら（PNAS USA 81:1470−1474,1984）に記載の方法に従って形質転換するために利用する。
当業者は、本発明が本明細書に詳しく開示してある核酸フラグメント、例えば図１におけるそれの利用に限定されないことを理解するであろう。本発明は、図１に示しているのと同じアミノ酸配列をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重により特定表示のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を包括することも明らかであろう。また、本明細書及び請求の範囲における図１に対する言及は、その中に記載のゲノム配列並びに対応のcDNA及びRNA配列を包括することが理解され、そして本明細書において用いる「DNA構築体」及び「核酸配列」なる語はその全ての変異体を包括することが理解されるであろう。「DNA構築体」は一般に一本鎖又は二本鎖のいづれかのDNA分子を意味することが理解され、それは天然遺伝子から部分形態で単離されているか、又は天然では存在していないような態様で結合及び並んでいるDNAのセグメントを含むように改変されている。
本明細書に記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼは、その比活性が論じられているその他の公知の子嚢菌綱又は不完全菌類と比べ、シリンガルダジン基質に対して極めて高い比活性を有する。本発明はその他の子嚢菌綱及び／又は不完全菌類ラッカーゼをも単離せしめうる手段を提供する。本明細書に特異的に例示したもの以外の起源からのラッカーゼ遺伝子の同定及び単離は本実施例に記載の方法の利用により、公的に入手できる子嚢菌綱及び不完全菌類株によって達成できうる。特に、本明細書に開示の特定の配列は標準のPCR又はサザンハイブリダイゼーション技術により類似のラッカーゼ遺伝子を単離するうえで有用なプライマー及び／又はプローブをデザインするのに利用できうる。従って、本発明は約30SOU/mg以上、そして好ましくは約40SOU/mg以上の比活性を有する子嚢菌綱及び不完全菌類ラッカーゼを包括する。「SOU」は至適pHで基質としてシリンガルダジンを用いて測定して、１分間当りに酸化される基質のμmole量として定義する。
更に、本発明はその他のマイセリオフトラ・ラッカーゼを包括し、例えばM.サーモフィラにおいて見い出せうるラッカーゼの別の形態、及びVan Oorschot,1977、前掲による定義に従ってマイセリオフトラの定義内に属するその他の菌類において見い出せうるラッカーゼを含む。本明細書において特異的に例示したもの以外の起源からのラッカーゼ遺伝子の同定及び単離は本実施例に記載の方法の利用により、公的に入手できるマイセリオフトラ株を用いて達成されうる。他方、本明細書に開示の配列は標準のPCRまたはサザンハイブリダイゼーション技術によりラッカーゼ遺伝子を単離するうえで有用なプライマー及び／又はプローブをデザインするために利用できうる。その他の名称のマイセリオフトラ種には、マイセリオフトラ・ヒンヌレア（M.hinnulea）（Awaoら、Mycotaxon,16:436−440,1983）、マイセリオフトラ・バレレア（M.vellerea）（Guarroら、Mycotaxon,23:419−427,1985）及びマイセリオフトラ・レテア・コスタンチン（M.lutea Costantin）が含まれる。また、別名のラッカーゼ、例えばマイセリオフトラ属の種又は株のアナモルフ又は完全状態も包括される。マイセリオフトラの株は数多くの培養物寄託機関において容易に公的にアクセス可能である。例えばATCC 48102,48103,48104等;CBS 117.65,131.65,379.65等;DSM 1799（M.サーモフィラ）、ATCC 52474,CBS 539.82,540.82等（M.ヒンヌレア）、DSM 62114,DBS 146.50,147.50,157.51等（M.ルテア）、並びにCBS 478.76,479.76及び715.84（M.ベレレア）。本発明は更に任意の変異ヌクレオチド配列及びそれによりコードされるタンパク質を包括し、そのタンパク質は図１に示すアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは85％以上、そして最も好ましくは90〜95％以上の相同性を保持し、そしてそれは本明細書記載の配列のラッカーゼ活性を定性的に保持している。上記のカテゴリー内における有用な変異体には例えば保存アミノ酸置換されているものが含まれ、その置換はタンパク質の活性に有意な影響を及ぼさないものとする。保存置換とは、同じクラスのアミノ酸がそのクラスの任意の別のものにより置換されうることを意味する。例えば、非極性脂肪族残基Ala,Val,Leu及びIleは、塩基性残基Lys及びArg、又は酸性残基Asp及びGluと同様に相互変換してよい。同様に、Ser及びThrは、Asn及びGlnと同様に、互いと保存置換の関係にある。かかる置換は分子の機能にとって重要な領域の外部で成し得、従って未だ活性な酵素をもたらすことが当業者にとって明らかであろう。所望の活性の保持は標準のABTS酸化法、例えば本実施例に記載のそれを実施することにより容易に決定できる。
タンパク質は数多くの様々な産業的プロセスにおいて利用できる。これらのプロセスは高分子量を有するリグニンを製造するための、リグニンのクラフト及びリグノスルフェートの双方での溶液重合が含まれる。中性／アルカリ性ラッカーゼは、クラフトリグニンが高めのpHで一層可溶性である点で特に有利である。かかる方法は例えばJinら、Holzforshung45（６）:467−468,1991;米国特許第4,432,921号;EP 0,275,544号;PCT/DK93/00217,1992に記載されている。
本発明のラッカーゼはクラフトパルプにおけるリグニンのin−situ脱重合のためにも利用でき、これにより低リグニン含有量を有するパルプが製造できる。ラッカーゼの利用はリグニンの脱重合のための現状の塩素の利用よりも優れる。塩素の利用は塩素化芳香族化合物の生成を招き、それは製紙工場の環境的に望ましくない副産物である。かかる利用は例えばCurrent opinion,Biotechnology ３:261−266,1992;J.Biotechnol.25:333−339,1992;Hiroiら、Svensk paperstidning ５:162−166,1976に記載されている。製紙工場における環境は一般にアルカリ性であるため、該ラッカーゼは、酸性条件下で最も良く機能するその他の公知のラッカーゼよりもこの目的にとってより有用である。
染料及び染料前駆体、並びにその他の発色化合物の酸化は化合物の脱色を招く。ラッカーゼはこの目的のために利用でき、それは布帛間での染料の転移が望ましくないとき、例えば繊維産業及び洗剤産業における状況において極めて好都合でありうる。染色転移阻害及び染料の酸化のための方法はWO92/01406号;WO92.18683号;EP 0,495,836号;Calvo,Mededelingen van de Faculteit Landboum−wetenschappen/Rijiksuniversitet Gent.56:1565−1567,1991;Tsujinoら、J.Soc.Chem.42:273−282,1991において見い出せうる。
ラッカーゼは毛髪の染色における利用に極めてよく適する。かかる用途においては、ラッカーゼを染料前駆体と好ましくは毛髪の上で接触させ、これにより染料前駆体の制御された酸化が達成され、前駆体は染料へと又は顔料生成化合物、例えばキノイド化合物へと変換される。染料前駆体は好ましくは３種の主要化学族、即ちジアミン類、アミノフェノール類（又はアミノナフトール類）及びフェノール類のいづれかに属する芳香族化合物である。染料前駆体は単独又は組合せで利用できうる。共重合にける中間体の少なくとも一種はオルト−もしくはパラ−ジアミン又はアミノフェノール（一次中間体）でなくてはならない。かかるものの例は後述の第IV章に見い出され、そしてｐ−フェニレン−ジアミン（pPD）、ｐ−トルイレン−ジアミン、クロロ−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−アミノフェノール、ｏ−アミノフェノール、3,4−ジアミノトルエンが含まれる。米国特許第3,251,742号にはその他の化合物も記載されており、その内容は引用することで本明細書に組入れる。一の態様において、出発材料は酵素及び一次中間体のみでなく、更には改質剤（カップラ−）（又は改質剤の組合せ）も含み、その改質剤は一般にメタ−ジアミン、メタ−アミノフェノール又はポリフェノールである。改質化合物の例にはｍ−フェニレン−ジアミン、2,4−ジアミノアニソール、α−ナフトール、ヒドロキノン、ピロカテコール、レゾルシノール及び４−クロロレゾルシノールが含まれる。次いで改質剤をラッカーゼの存在下で一次中間体と反応させ、それを有用化合物に変換させる。別の態様において、ラッカーゼは一次中間体と直接、それを有色化合物へと酸化するため、利用してよい。全てのケースにおいて、染色工程は１又は複数種の一次中間体により、単独で、又は１もしくは複数種の改質剤と組合せて行ってよい。成分の量の類似の成分についての通常の商業的な量に応じ、そして成分の比はそれに従って変えられうる。
このラッカーゼの利用はより伝統的なH₂O₂の利用よりも、その後者が毛髪に損傷を及ぼし、そしてその利用が通常高いpH（これも毛髪を損傷せしめる）を必要とするという点で、優れている。反対に、ラッカーゼとの反応はアルカリ性、中性又は酸性のpHでさえも行うことができ、そして酸化のために必要な酸素は苛酷な化学酸化を介するではなく、大気に由来する。マイセリオフトラ・ラッカーゼの利用により供される結果はH₂O₂の利用により達成されるそれに匹敵し、それは発色のみならず、洗濯安定性及び輝度の消失性においてもそうである。更なる商業的な利点は、ラッカーゼ及び前駆体の無酸素雰囲気の中での単一容器包装にあり、そのような方式はH₂O₂の利用は不可能である。
該ラッカーゼは液体の中に存在するフェノール系化合物の重合のためにも利用できる。かかる有用性の例はジュース、例えばアップルジュースの処理により、ラッカーゼはジュースの中に存在するフェノール系化合物の沈殿を促進せしめ、それ故一層安定なジュースが製造されるようになるであろう。かかる用途はStutz,Fruit processing 7/93,248−252,1993;Maierら、Dt.Lebensmittel−rindschau 86（５）:137−142,1990;Dietrichら、Fluss.Obst 57（２）:67−73,1990に記載されている。
ラッカーゼ、例えばマイセリオフトラ・ラッカーゼは土壌の解毒においても有用である（Nannipieriら、J.Environ.Qual.20:510−517,1991;Dec and Bollag,Arch.Environ.Contam.Toxicol.19:543−550,1990）。
本発明を以下の非限定的な実施例により更に説明する。
実施例
I.マイセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼ遺伝子の単離
A.材料及び方法
1.DNAの抽出及びハイブリダイゼーション分析
全細胞DNAを、以下のプロトコールを利用して、25mlのYEG培地（0.5％の酵母抽出物、２％のグルコース）の中で24時間増殖させたマイセリオフトラ・サーモフィラ株E421の菌類細胞から抽出した：菌糸体をMiracloth（Calbiochem）を通じる濾過により集め、そして25mlのTEバッファーで１回洗った。よけいなバッファーを菌糸体から除き、菌糸体を液体窒素の中で凍結した。凍結した菌糸体を電気コーヒーグラインダーで微粉末に砕き、そしてその粉をディスポーザブルプラスチック遠沈管中の20mlのTEバッファー及び5mlの20％のSDS（w/v）に加えた。この混合物を静かに数回反転させて混合を確実なものとし、そして等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）で２回抽出した。酢酸ナトリウム（3Mの溶液）を0.3Mの最終濃度となるように加え、そして核酸を2.5容量の氷冷エタノールで沈殿させた。これらのチューブを15,000×ｇで30分遠心し、そしてそのペレットを30分風乾させ、次いで0.5mlのTEバッファーの中に再懸濁させた。DNase非含有リボヌクレアーゼＡを100μg/mlの濃度となるように加え、そしてその混合物を37℃で30分インキュベーションした。プロテイナーゼＫ（200μg/ml）を加え、そして各チューブを更に１時間37℃でインキュベーションした。最後に、各サンプルをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで２回抽出し、次いで酢酸ナトリウム及びエタノールでDNAを沈殿させた。DNAペレットを真空で乾かし、TEバッファーの中で再懸濁し、そして４℃で保存した。
形質転換及び未形質転換コントロール株由来の全細胞DNAサンプルをサザンハイブリダイゼーションにより分析する。約５μｇのDNAをEcoR Iにより消化し、そして１％のアガロースゲル上でサイズ分別する。このゲルを短波長UV下で写真撮影し、そして0.5MのNaOH,1.5MのNaCl中に15分、次いで1Mのトリス−HCl,pH8,1.5MのNaClの中で15分浸す。ゲル中のDNAをZeta−Probe（商標）ハイブリダイゼーション膜（BioRad Laboratories）上に20×のSSPE（R.W.Davisら、Advanced Bacterial Genetics,A Manual for Genetic Engineering.Cold Spring Habor press.1980）中でのキャピラリーブロッティングにより移す。膜を２時間、80℃、真空下で焼き、そして以下のハイブリダイゼーションバッファーの中で45℃にて静かに攪拌しながら浸す:5×SSPE,35％のホルムアミド（v/v）、0.3％のSCS,200μg/mlの変性且つ剪断したサケ精巣DNA。N.クラッサlcc 1遺伝子の5'領域をコードするラッカーゼ特異性プロ−フラグメント（約1.5kb）をN.クラッサ・ゲノムDNAから、標準のPCR条件（Perkin−Elmer Cetus,Emeryville,CA）を利用し、以下のプライマーペアーを用いて増幅させる：フォワードプライマー5'CGAGACTGATAACTGGCTTGG 3';リバースプライマー5'ACGGCGCATTGTCAGGGAAGT 3'。増幅させたDNAセグメントをまずTA−クローニングベクター（Invitrogen,Inc.,San Diego,CA）の中にクローニングし、次いでアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてEcoR Iで消化する。精製したプローブフラグメントをα〔³²P〕dCTP（Amersham）によるニックトランスレーションにより放射能ラベルし、そしてバッファー1ml当り約１×10⁶cpmの活性においてハイブリダイゼーションバッファーに加える。その混合物を振盪浴槽中で45℃にて一夜インキュベーションする。インキュベーション後、膜を0.2×のSSPEと0.1％のSDSで45％において１回洗い、次いで0.2×のSSPE（SDSなし）で同じ温度で２回洗う。膜をペーパータオル上で15分かけて乾かし、次いでSaran Wrap（商標）の中に包み、そしてＸ線フィルムに−70℃で増強スクリーン（Kodak）を伴って一夜曝露する。
2.ラッカーゼクローンのDNAライブラリー及び同定
ゲノムDNAライブラリーをバクテリオファージクローニングベクターλ−EMBL4の中で構築する（J.A.Sorge.Vectors,A Snrvey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Rodriguesら、編pp43−60,Butterworths,Boston,1988）。簡単には、前細胞DNAをSan 3Aで部分消化し、そして低融点アガロースゲル上でサイズ分別する。9kb〜23kbの間で泳動するDNAフラグメントを切り出し、そしてβ−アガラーゼ（New England Biolabs,Beverly MA）を用いてゲルから溶出させる。溶出したDNAフラグメントをBamH 1−切断し、且つ脱ホスホリル化したλ−EMBL4ベクターアームにライゲーションし、そしてそのライゲーション混合物を商業的なパッケージング抽出物（Stratagene,La Jolla,CA）を用いてパッケージングする。パッケージングしたDNAライブラリーをプレート培養し、そしてエッシェリヒア・コリK802細胞上で増殖させる。各ライブラリー由来の約10,000〜20,000プラークを上記の条件を利用し、放射能ラベルしたlcc 1 DNAフラグメントとのプラークハイブリダイ−ゼーションによりスクリーニングする。このプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを出すプラークをE.コリK802細胞上に基づいて２回精製し、そして対応のファージ由来のDNAをQiagen Lamda kit（Qiagen,Inc.,Chatswarth,CA）を用い、高力価リゼートから精製する。
3.ラッカーゼ遺伝子の分析
ラッカーゼクローンの制限地図化を標準の方法を利用して行う（Lewin,Genes,第２版、Wiley ＆ Sons,1985,New York）。DNA配列決定はApplied Biosystemsモデル373A自動化DNAシーケンサー（Applied Biosystems.Inc.,Foster City,CA）により、色素−ターミネーター化学によるプライマー歩行技術を利用して行う（H.Gieseckeら、J.Virol.Methods 38:47−60,1992）。オリゴヌクレオチド配列決定用プライマーはApplied Biosystemsモデル394DNA/RNAシンセサイザーで合成する。
B.結果及び考察
1.ラッカーゼ遺伝子配列の同定
全細胞DNAサンプルをニューロスポラ・クラッサ、ボツリチス・シネレア（B.cinerea）及びマイセリオフトラの種から調製する。これらのDNA調製品のアリコートをBamH 1で消化し、そしてアガロースゲル電気泳動により分別する。ゲル中のDNAをZcta−Probe（商標）膜フィルター（BioRad Laboratories,Hercules,CA）にブロッティングし、そして前述の通りにしてN.クラッサlcc 1遺伝子の一部をコードする放射能ラベルしたフラグメントと温和なストリンジェンシーの条件下でプロービングする。ラッカーゼ特異性配列はM.サーモフィラ及びN.クラッサ・コントロールのゲノムにおいて検出されるが、B.シネレアゲノムDNAにおいてはこのプローブでは検出されない。
2.マイセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼ（Mt L）遺伝子のクローニング及び特性決定
λ−EMBL4クローニング用ベクターの中に構築したM.サーモフィラゲノムDNAライブラリー由来の約20,000のプラークをスクリーニングする。このライブラリーは約10,000個の独立クローンより成り、インサートは9kbから23kbのサイズに範囲した。M.サーモフィラについて平均インサートサイズを10kb、そして全ゲノムサイズを４×10⁷bpと仮定して、この数字は全ゲノムを表示するのに必要とされるクローンの数の約2.5倍である。８つのプラークがN.クラッサ・ラッカーゼ遺伝子と強くハイブリダイズすることが同定された。DNAをそのうちの３つから単離し、EcoR Iで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションにより分析する。これらの３つのクローンは全てラッカーゼ特異性プローブとハイブリダイズする。7.5kbのEcoR Iフラグメントを含む。これらのEcoR Iフラグメントの１つをpBR322（Bolivarら、Gene 2:95−113,1977）にサブクローニングしてプラスミドpRaMB1を作り上げる。このDNAセグメントの制限地図を図１に示す。このクローン上のラッカーゼコード領域の位置を上記のlcc 1遺伝子フラグメントとのハイブリダイゼーションにより決定する。得られる地図データー、及び約80kdalのラッカーゼタンパク質の推定サイズに基づき、全M.サーモフィララッカーゼコード領域は3.2kbのNhe I−Bgl IIセグメントを含むことと判定され、そのセグメントをpUC119（Viera and Messing,Methods Enzymol.153:3−11,1987）の中にサブクローニングする。このセグメントのヌクレオチド配列をプライマー歩行法（Gieseckeら、前掲）を用いて決定する。核酸配列を図２及びSEQ ID NO:1に示す。
MtLの推定アミノ酸配列をN.クラッサラッカーゼとのアミノ酸配列相同性に基づき得る。アミノ酸レベルは、これら２種類のラッカーゼは約60％の配列同一性を共有する。トリヌクレアー銅クラスターの形成に関与する４個のヒスチジン及び１個のシステインに対応する領域において類似性が最も高い（Perryら、J.Gen.Microbiol.139:1209−1218,1993;Collら、Appl.Environ.Microbiol.59:4129−4135,1993;Messerschmidtら、J.Mol.Biol.206:513−530,1989）。MtLの推定アミノ酸配列におけるＮ−連結化グリコシル化にとって11個の潜在部位がある。MtLの最初の22個のアミノ酸はAla残基の後方に推定切断部位のある標準的なシグナルペプチドを含んで成ることが認められた（von Heijne,J.Mol.Biol.173:243−251,1984）。天然MtLのアミノ末端配列は未知であるが、A.オリザにおいて生成される組換MtLのアミノ末端はパイロ−グルタミン酸残基によりブロッキングされている。この残基の酵素的除去、それに続くアミノ酸配列決定は成熟MtLがGln残基（図２において１位;SEQ ID NO:2）で始まることを示唆する。即ち、MtLは22個のアミノ酸のシグナルペプチド及び25残基のプロペプチドを有する620個のアミノ酸のプレプロ酵素として合成されることが明らかである。ニューロスポラ・クラッサ・ラッカーゼ（NcL）は同様にしてそのアミノ末端でプロセシングされる。更に、NcLもそのＣ末端でタンパク質分解的にプロセシングされ、13個のアミノ酸の除去がもたらされる（Germannら、J.Biol.Chem.263:885−896,1988）。プロセシング部位は配列Asp−Ser−Gly−Leu^＊Arg₅₅₈（ここで＊は切断部位を示す）内に含まれる。類似の配列がMtLのＣ末端付近（Asp−Ser−Gly−Leu−Lys₅₆₀）にあり、マイセリオフトラ酵素がＣ末端プロセシング（Asp−Ser−Gly−Leu^＊Lys₅₆₀）にも委ねられ、12個のアミノ酸が除去されることを示唆する。
lcc 1コード領域内の６つのイントロン（85,84,102,72,147及び93ヌクレオチド）の位置は、MtLの推定アミノ酸配列をNcLのそれと対比させることにより、及び糸状菌類におけるイントロンの特徴に関する共通の原則（Gurrら、Gene Structure in Eukaryotic Microbes,J.R.Kinghorn絹pp93−139,IRL Press,Oxford,1987）を適用することにより決定される。イントロンを除く1860ヌクレオチドのコード配列はグアノシン及びシトシンリッチである（65.5％のGtC）。この遺伝子に関するコドン用法パターンは、Ｇ又はＣで終えるコドンについての強力な偏り（89.7％）のDNA塩基組成を反映する。
II.アスペルギルスにおけるマイセリオフトラ・ラッカーゼの発現
A.材料及び方法
1.細菌及び菌類宿主株
エッシェリア・コリJM101（Messingら、Nucl.Acids Res.9:309−321,1981）を本研究におけるラッカーゼ発現ベクターの構築及びルーチン的な増殖のための宿主として用いる。ラッカーゼ発現のための菌類宿主にはアスペルギルス・ニガー株Bo−1,AB4.1及びAB1.13（Matternら、Mol.Gen.Genet.234:332−336）並びにα−アミラーゼ欠損アスペルギルス・オリザ株How B104のウリジン要求（pyrG）突然変異体が含まれる。
2.プラスミド
プラスミドpRaMB2はMtLをコードするM.サーモフィラゲノムDNAの3.2kbのBgl II−Nhe Iフラグメントを含む。ベクターpMWRはpUC18（Yanisch−Perronら、Gene3 3:103−119,1985）の中にA.オリザTAKA−アミラーゼプロモーター及びpTAKA17由来のターミネーター因子（Christensenら、Bio/Technol.６:1419−1422,1988;EP 238,023号）を挿入することにより構築する。このベクターにおいて、プロモーター因子の終点に固有Swa I部位があり、そしてターミネーターの始点にコード配列の指令的クローニングのための単一Nsi I部位がある。クローニング用ビヒクルpUC518はpUC118（Vieira and Messing,前掲）の隣接し合うBamH 1及びXba I部位の間にNsi I,Cla I,Xho I及びBgl II制限部位を含む小さなリンカーを挿入することにより誘導する。プラスミドpToC68（WO91/17243）はA.オリザTAKA−アミラーゼプロモーター及びA.ニガーglaAターミネーターを含み、そしてpToC90（WO91/17243）はA.ニドゥランスamdS遺伝子を担持する。
3.ラッカーゼ発現ベクターの構築
ラッカーゼ発現ベクターpRaMB5についての構築手法を図３に概略する。ラッカーゼ遺伝子の転写を指令するプロモーターはA.オリザα−アミラーゼ（TAKA−アミラーゼ）遺伝子（Christensenら、前掲）及びTAKA−アミラーゼターミネーター領域から得られる。このプラスミドはSwa I及びNsi I部位の間にApa I部位を含む小さなリカンーを挿入してpMWR3−SANと称するプラスミドを作り上げることによってpMWR3を改質することにより構築する。Pfu Iポリメラーゼ依存性PCR（Stratagene,La Jolla,CA）を、開始コドンから内部Pst I部位に至る（約0.5kb）MTLの5'部をコードする短いDNAセグメントを増幅するために用いる。このPCR反応のためのフォワードプライマーは開始コドンのすぐ上流のEcoR I部位を作り上げるようにデザインされている。次に、増幅フラグメントをEcoR I及びPst Iで消化し（この工程の際、EcoR I部位はdNTP及びDNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）による処理によりブラント化（接着末端化）する）、そしてアガロースゲル電気泳動により精製する。M.サーモフィラコード領域の3'部をpRaMB2から2kbのPst I−Apa Iフラグメントとして切り出す（このセグメントも3'非翻訳領域から約110bpを含む）。これら２本のフラグメントをSwa I−及びApa I−切断pMWR3−SANと三部ライゲーション反応で組合せ、ラッカーゼ発現ベクターpRaMB5を作る。
4.アスペルギルス宿主細胞の形質転換
アスペルギルス株の同時形質転換のための方法はChristensenら前掲に記載されている。A.オリザHowB104pyrGへのラッカーゼ発現ベクターの導入のため、等量（約５μｇづつ）のラッカーゼ発現ベクター、並びに以下のプラスミドのいづれかを使用する:pPYRG（Fungal Genetics Stock Center,Kansas City,KS）〔これはA.ニドゥランスpyrG遺伝子を含む（Oakleyら、Gene 61 385−399,1987）〕;pSO2〔これはクローンA.オリザpyrG遺伝子をもつ〕;pPRYG24〔これはA.フィキューム（A.ficuum）（＝A.ニガー）pyrG遺伝子を含む〕。原栄養性（Pyr⁺）形質転換体をアスペルギルス最少培地（Rowlands and Turner,Mol.Gen.Genet.126:201−216,1973）上で選別し、そしてその形質転換体を1mMの2,2'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）〔ABTS〕を含む最少培地上でラッカーゼを産生する能力についてスクリーニングする。活性ラッカーゼを分泌する細胞はABTSを酸化し、コロニーを囲む緑色の輪をもたらす。最後に、A.ニガーBo−１プロトプラストを等量（約５μｇづつ）のラッカーゼ発現ベクター及びA.ニドゥランスamdS（アセトアミダーゼ）遺伝子（Hynesら、Mol.Cell Biol.３:1430−1439,1983）含有pToC90を用いて同時形質転換する。amdS⁺形質転換体をCove最少培地（Cove,Biochim.Biophys.Acta 113:51−56,1966）上で、炭素源としての１％のグルコース及び唯一の窒素源としてのアセトアミドを伴って選別し、そして1mMのABTSを含むcove培地上でのラッカーゼ発現についてスクリーニングする。
5.ラッカーゼ産生形質転換体の分析
アガ−プレート上でラッカーゼ活性体を産生する形質転換体を、それから滅菌0.01％Tween−80中の分生子柄及び胞子懸濁物を作ることを通じて２回精製する。各懸濁物中の胞子の密度を光学的に評価する（A₅₉₅nm）。約0.5吸収単位の胞子を、125mlのプラスチック製フラスコ中の25mlのASPO 4又はMY50培地を接種せしめるために用いる。その培養物を37℃にて、多大な通気を伴い（約200rpm）、４〜５日間インキュベーションする。培養液を遠心により獲得し、そして上清液中のラッカーゼ活性の値を基質としてシリンガルダジンを用いて決定する。簡単には、800μ１のアッセイバッファー（25mMの酢酸ナトリウム、pH5.5,40μＭのCnSO₄）を20μ１の培養上清液及び50％のETOH中の60μ１の0.28mMのシリンガルダジン（Sigma Chemical Co.,St.Lonis,MO）と混合する。530nmでの吸収をGenesys 5UV−ビス光度計（Milton−Roy）で経時的に測定する。１ラッカーゼ単位（LACU）は室温において１分間当り１μmoleの基質を酸化する酵素の量と定義する。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）をNovex（San Diego,CA）由来のプレカスト10〜27％グラジエントゲルを用いて行う。タンパク質バンドをクマジー・ブリリアント・ブルー（Sigma）を用いて発色させる。
B.結果及び考察
1.マイセリオフトラ・ラッカーゼの発現
ラッカーゼ産生形質転換体は選択培地へのABTSの組込みにより検出される。選択マーカーとしてpyrG又はamdSを利用することで、同時形質転換頻度は約30％から70％に変動する。MtLの異種発現はA.オリザ形質転換において最も高いことが認められた。更に、MY50と比べてASPO 4培地における方が生産率が良いことが認められ、しかしながらこの理由はわからない。培養液サンプルのSDS−PAGEは約80kdalにおいて主要ラッカーゼがバンドを示し、それはM.サーモフィラから精製した天然酵素のサイズと類似する。A.ニガーBo形質転換体由来の培養濾液の類似の分析は、ラッカーゼバンドが非常に強いグルコアミラーゼ及び酸安定性アミラーゼタンパク質バンドによりかくされていることを示唆する。結果を表１に示す。

2.過剰の銅の有無での発現
アスペルギルス・オリザ形質転換体HowB104−pRaMB5.30（約10⁹胞子/ml）の胞子懸濁物1mlのアリコートを無菌的に100mlの無菌振盪フラスコ培地（マルトース50g/1;MgSO₄・7H₂O 2g/1;KH₂PO₄ 10g/1;K₂SO₄ 2g/1;GaCl₂・2H₂O 0.5g/1;クエン酸2g/1;酵母抽出物10g/1;微量金属〔ZnSO₄・7H₂O 14.3g/1;CuSO₄・5H₂O 2.5g/1;NiCl₂・6H₂O 0.5g/1;FeSO₄・7H₂O 13.8g/1;MnSO₄・H₂O 8.5g/1;クエン酸3.0g/1〕、0.5ml/1;尿素2g/1;水道水でメスアップし、オートクレーブにかける前にpH6.0に調整）を含む500mlの振盪フラスコに入れ、そして37℃においてロータリーシェーカー上で200rpmにて18時間インキュベーションする。この培養物50mlを無菌的に1.8リットルの発酵培地（MgSO₄・7H₂O 2g/1;KH₂PO₄ 2g/1;クエン酸 4g/1;K₂SO₄ 3g/1;CaCl₂・2H₂O 2g/1;微量金属0.5ml/1;プルロニック発泡抑制剤1ml/1）を含む３リットルの発酵槽に移す。この発酵槽の温度は発酵槽ジャケットを通じる冷却水の循環により34℃に保つ。無菌エアーを1.8リットル／分（1v/v/m）の率で発酵槽に散布する。撹拌速度は培養物中の溶解酸素レベルを20％より高く保つのに必要とされるほぼ最低レベルである。600〜1300rpmに維持する。無菌添加物（Nutriose 725〔マルトースシロップ〕225g/1;尿素30g/1;酵母抽出物15g/1;プルロニック発泡抑制剤1.5ml/1;蒸留水でメスアップし、そしてオートクレーブにかける）をペリスターポンプを利用して発酵槽に加える。発酵の際の供給速度は以下の通りとする：接種前は当初30gの添加物;0〜24h 2g/1h;24〜48h 4g/1h;48h−終了 6g/1h。
銅を水又は適当なバッファー中で400×のストックとして調製し、無菌濾過し、そして無菌的にタンクに0.5mMの最終レベルとなるように加える。上記の発酵をタンク培地への銅添加物の添加抜きでも行う。酵素活性の決定のためのサンプルを抜き取り、そしてMiraclothで濾過して菌糸体を除去する。これらのサンプルを上記のLACUアッセイによりラッカーゼ活性についてアッセイする。ラッカーゼ活性は発酵中に連続的に上昇することが認められ、過剰の銅を含む発酵においては180時間後に約45LACU/mlの値が達成される。22LACU/mgの比活性において、これは2g/1の発現組換ラッカーゼに相当する。他方、銅添加物抜きの発酵において達成される最大ラッカーゼ活性は170時間後に約10LACU/mlであり、添加銅の存在下で見い出せる値の約25％であった。
III.マイセリオフトラ・ラッカーゼの精製及び特性決定
A.材料及び方法
1.材料
バッファー及び基質として用いる化学試薬は最低でも試薬級の商品とする。エンド/N−グリコシダーゼＦ及びパイログルタミン酸アミノペプチダーゼをBoehringer Mannheimより購入した。クロマトグラフィーはPharmacia FPLC又は慣用の低圧システムのいづれかで行う。吸光アッセイは光度計（Shimadzu PC160）又はマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）のいづれかで行う。Britton ＆ Robinson（Ｂ＆Ｒ）バッファーをQuelle,Biochemisches Taschenbuch,H.M.Raven,II.Teil,S.93u,102,1964に記載のプロトコールに従って調製する。
2.酵素活性
ラッカーゼ活性はシリンガルダジン酸化により、30℃にて１−cm石英キュベットの中で決定する。60μ１のシリンガルダジンストック溶液（50％のエタノール中0.28mM）及び20μ１のサンプルを0.8mlの予備加熱したバッファー溶液と混合する。酸化は５分間にわたり530nmでモニターする。活性は１分間当りに酸化された基質のμmoleとして表示する。様々なpHのＢ＆Ｒバッファーを使用する。活性単位はここでは「SOU」と称する。上述の通りLACUと称する活性を決定するために25mMの酢酸ナトリウム、40μＭのCuSO₄,pH5.5のバッファーも使用する。2,2'−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）酸化アッセイは0.4mMのABTS,B＆Ｒバッファー、pH4.1を用い、室温においてA₄₀₅をモニターすることにより行う。ABTSオキシダーゼ活性上層（オーバーレー）アッセイは、冷却したABTS−アガロース（0.05gのABTS,1gのアガロース、50mlのH₂O、アガロースを溶かすために加熱）を自然IEFゲルの上に注ぎ、そして室温でインキュベートすることにより行う。ラッカーゼ（ｒ−MtL）の熱安定性分析は、Ｂ＆ＲバッファーpH6の中で様々な温度において予備インキュベーションした3SOU活性を有するサンプルを用いて行う。サンプルは同じバッファーに400倍に希釈してから室温でアッセイする。
3.発酵培養液からの精製
3.7リットルのチーズクロス濾過した培養液（pH7.6,16mS）をWhatman＃２濾紙で濾過する。その培養液をS1Y100膜（MWCO:100）の付いたSpiral Concentrator（Amicon）で3700mlから200mlへと濃縮する。その濃縮液を水に希釈することにより0.75mSに調整し、そしてS1Y100で170mlに再濃縮する。洗浄且つ濃縮した培養液は濃緑色を帯びた色調を有する。
その培養液を−20℃で一夜凍結し、翌日融解し、そして10mMのトリス、pH7.5,0.7mS（バッファーＡ）で予備平衡化しておいたＱ−sepharose XK26カラム（120ml）に載せる。青色のラッカーゼバンドは添加中にカラムをゆっくり下降する。青色画分の１のグループは添加及びバッファーＡによる洗浄の後はカラムを通り抜ける。第２グループはバッファーＢ（バッファーＡと2MのNaCl）による線形勾配の際に溶出する。ラッカーゼ活性のない一部の茶色の物質は1MのNaOHによりその後溶出する。SDS−PAGE分析はこの調製が純粋なラッカーゼをもたらすことを示す。
4.アミノ酸含有量、グリコシル化の程度及びＮ−末端配列の分析
Ｎ−末端配列決定をABI 476Aシーケンサーで行う。全アミノ酸分析（それからｒ−MtLの励起係数を決定）をHP Amino Quant装置で実施する。脱グリコシル化はエンド/N−クルコシダーゼＦを用いて製造業者の仕様書に従って行い、そして炭水化物含有量はSDS−PAGEにより決定される移動度の相違により評価する。パイログルタミン酸アミノペプチダーゼによるＮ−末端の脱ブロッキングは製造業者の仕様書に従って実施する。約80μｇのｒ−MtLを４μｇのペプチダーゼにより、1Mの尿素又は0.1MのグアニジンHClの存在下又は非存在下で処理し、次いで配列決定のためにPVDF膜にブロッティングする。約20pmolの脱ブロッキングされたタンパク質が得られ、そして配列決定する。
SDS−PAGE及び自然IFF分析はNovexセル又はMini Protean II及びモデルIII Mini IEFセル（Bio−Rad）のいづれかで行う。ゲル濾過分析はSephacryl S−300（Pharmacia）で行い、それより自然MWをカラムを較正するためのブルーデキストラン（2000kdal）、牛IgG（158kdal）、牛血清アルブミン（66kdal）、オバルブミン（45kdal）及び馬心臓ミオグロビン（17kdal）を用いることにより推定する。
B.結果及び考察
1.発酵培養液からのｒ−MtLの精製及び特性決定
3.71の発酵培養液から、約２〜3gのｒ−MtLが単離される。100kdalのMWCOを有する膜を用いる最初の濃縮は有意な量の茶色物質及び少量の夾雑タンパク質を除去した。10mMのトリス、pH7.5で平衡化しておいたＱ−Sepharoseマトリックスに対するｒ−MtLの低親和力はその他のより酸性、且つより強く結合した不純物からのその分離を助長する。SDS−PAGEにより示される通り、この調製はピークのまわりに位置している最も活性な画分に関する本質的に純粋ラッカーゼをもたらした。その他の活性の弱い画分はより浅い勾配によるMon−Ｑ又はゲル濾過カラム、例えばＳ−300のいづれかで更に精製でき、それより夾雑物は小さめのMWに基づき分離される。総合的に18倍の精製度及び67％の回収率が達せられる。以下に記載の通り、Ｑ−Sepharoseクロマトグラフィーでのｒ−MtLの２本の溶出バンドの存在はおそらくは示差的なグリコシル化に基づく。
精製したｒ−MtLはＳ−300ゲル濾過で100〜140kdalのMW、そしてSDS−PAGEで85kdalのMWを示す。脱グリコシル化後のSDS−PAGEでのｒ−MtLの移動度の上昇は炭水化物がその全質量の14％を占めることを示す。自然IEFはABTSオーバーレーアッセイにおいて活性なpI〜4.2の主要バンドを示した。
脱塩した溶液又はPVDF膜のいづれかのサンプル由来の精製ｒ−MtLのＮ−末端の直接配列決定は不成功に終わった。しかしながら、パイログルタミン酸アミノペプチダーゼによるｒ−MtLの処理は脱ブロッキングされたＮ−末端を有するタンパク質をもたらした。これは、ｒ−MtLの成熟化の際のプロペプチドのプロセシング、即ち、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の如きその他のラッカーゼにおいては認められないが、N.クラッサ・ラッカーゼのそれに類似する後翻訳現象を示唆する。考えられるスキームを以下に概略する。

青色のｒ−MtLのスペクトルは276及び589nmにて最大吸収を有していた。
ラッカーゼの活性を基質としてシリンガルダジン及びABTSのいづれかを用いて試験する。Abs₂₇₆当り又はmg当りとして表示して、ラッカーゼはpH6.5において20又はSOUに関する45単位の値それぞれを有した。LACUアッセイはAbs₂₇₆当り又はmg当り10又は22単位の値をもたらした。
ｒ−MtL活性のpHプロフィールは野生型のそれとかなり近く、6.5の至適pHを有する。ｒ−MtLについて観察される20分の予備インキュベーション後に保持している完全活性にとっての上記温度値は約60℃である。精製ｒ−MtLはＱ−Sepharose溶出バッファーの中で−20℃で凍結して５週間保存しても活性を失わないことを示した。
Ｑ−Sepharoseで単離した発酵培養液から得られるｒ−MtLの２通りの形態を比較したとき、SDS−PAGE、自然PAGE、自然IEF,S−300ゲル濾過、UV可視スペクトル、シリンガルダジン及びABTSに対する比活性、並びに脱ブロッキングしたＮ−末端配列決定尺度の観点において有意な差はなかった。同様に、Ｑ−Sepaharoseでの種々の溶出パターンは数種の異なるグリコシル化に由来する。
IV.毛髪の染色におけるマイセリオフトラ・ラッカーゼの利用
マイセリオフトラ・ラッカーゼの染色効果を様々な染料前駆体に基づき、そして更にはいく種かの改質剤と対比させた0.1％ｐ−フェニレンジアミンに基づいて試験した。
材料：
染料前駆体：
0.1MのＫ−リン酸バッファー（pH7.0）中の0.1％のｐ−フェニレン−ジアミン
0.1MのＫ−リン酸バッファー（pH7.0）中の0.1％のアミノフェノール
酵素：
組換マイセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼ16LACU/ml（最終染色溶液中）。
装置：
Datacolor Textflash 2000（CIE−Lab）
毛髪の色の評価
巻き毛の定性的色調をDatacolor Textflash 2000で、CIE−LabパラメーターＬ^＊（「０」＝黒、そして「100」＝白）とａ^＊（「−」＝緑、そして「＋」＝赤）を利用して決定する。
結果：
染色効果
ヨーロッパ人の金髪の巻き毛（1g）を酸化性毛髪染色についてマイセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼを試験するために用いる。染料前駆体としてｐ−フェニレンジアミン及びｏ−アミノフェノールを使用する。
毛髪染色
4mlの染料前駆体溶液をWhirleyミキサーで1mlのラッカーゼと混合し、巻き毛に塗布し、そして30℃で60分保つ。その巻き毛を水道水で約３すすぎ、２本の指の間で押え、くしを通し、そして風乾する。
染色効果試験の結果を以下の表１及び２に示す。

試験の結果
表１及び２から、マイセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼが毛髪の酸化的染色のために利用できることがわかる。
生物材料の寄託
以下の生物材料をブダペスト条約のもとで、1994年５月25日にAgricultural Research Service Patent Culture Collection,Nothern Regional Research Center,1815 University Street,Peoria,Illinois,61604に寄託し、そして以下の受託番号が与えられている。
寄託物受託番号
pRaMB5含有のE.コリJM101 NRRL B−21261
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称:Novo Nordisk Biotech,Inc.
（Ｂ）通り:1445 Drew Avenue
（Ｃ）市:Davis,California
（Ｄ）国:United States of America
（Ｅ）郵便番号:95616−4880
（Ｆ）電話番号：（916）757−8100
（Ｇ）ファックス番号：（916）758−0317
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称:Novo Nordisk A/S
（Ｂ）通り:Novo Alle
（Ｃ）市:Bagsv rd
（Ｄ）国:Denmark
（Ｅ）郵便番号:DK−2880
（Ｆ）電話番号：＋45 4444 8888
（Ｇ）ファックス番号：＋45 4449 3256
（ii）発明の名称：精製されたマイセリオフトラ・ラッカーゼ及びそれをコードする核酸
（iii）配列の数:2
（iv）連絡先：
（Ａ）名称:Novo Nordisk of North America,Inc.
（Ｂ）通り:405 Lexington Avenue,Suite 6400
（Ｃ）市及び州:New York,New York
（Ｄ）国:U.S.A.
（Ｅ）郵便番号:10174−6401
（ｖ）コンピューター読取フォーム：
（Ａ）媒体タイプ:Floppy disk
（Ｂ）コンピューター:IBM PC compatible
（Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release＃1.0,Version＃1.25（EPO）
（vi）現出願人データー：
（Ａ）出願番号：認定前
（Ｂ）出願日:1995年５月31日
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願のデーター：
（Ａ）出願番号:US 08/253,781
（Ｂ）出願日:1994年６月３日
（viii）代理人／代理店情報：
（Ａ）名称:Lowney,Karen A.
（Ｂ）登録番号:31,274
（Ｃ）参照／事件番号:4184.204−WO
（ix）通信情報：
（Ａ）電話番号:212 867 0123
（Ｂ）ファックス番号:212 867 0298
（２）SEQ ID NO:1についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:3187塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム）
（vi）起源：
（Ａ）生物：マイセリオフトラ・サーモフィラ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置:833...917
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置:996...1077
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置:1090...1188
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置:1261...1332
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置:2305...2451
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置:2521...2613
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置：連絡（587..832,918..995,1078..1089,1189..1260,1333..2304,2452..2520,2614..3024）
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:1:

（２）SEQ ID NO:2についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:620アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（vi）起源：
（Ａ）生物：マイセリオフトラ・サーモフィラ
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:2:

Claims

SEQ ID NO.2に記載のアミノ酸配列と90％以上相同であるアミノ酸配列から成る、マイセリオフトラ・ラッカーゼ。
SEQ ID NO.2に記載のアミノ酸配列と95％以上相同であるアミノ酸配列から成る、マイセリオフトラ・ラッカーゼ。
マイセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼである請求項１記載のラッカーゼ。
SEQ ID NO.2に記載のアミノ酸配列から成る、請求項１記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼ。
至適pHにおいてシリンガルダジンに対して30SOU/mg以上の比活性を有する請求項１記載のラッカーゼ。
請求項１記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼをコードする核酸を含んで成るDNA構築体。
請求項２記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼをコードする核酸を含んで成るDNA構築体。
請求項３記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼをコードする核酸を含んで成るDNA構築体。
請求項４記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼをコードする核酸を含んで成るDNA構築体。
請求項５記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼをコードする核酸を含んで成るDNA構築体。
請求項６記載のDNA構築体を含んで成る組換ベクター。
前記構築体がプロモーター配列に作用可能式に連結されている、請求項11記載のベクター。
前記プロモーターが菌類又は酵母プロモーターである、請求項12記載のベクター。
前記プロモーターがアスペルギルス・オリザのTAKAアミラーゼプロモーターである、請求項13記載のベクター。
前記プロモーターがアスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（gluA）プロモーターである、請求項13記載のベクター。
選択マーカーも含んで成る、請求項11記載のベクター。
前記選択マーカーがamds,pyrG,argB,niaD,sC及びhygＢより成る群から選ばれる、請求項16記載のベクター。
前記選択マーカーがアスペルギルス・ニドゥランスもしくはアスペルギルス・オリザのamdSマーカー、又はアスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリもしくはアスペルギルス・オリザのpyrGマーカーである、請求項16記載のベクター。
アスペルギルス・オリザのTAKAアミラーゼプロモーターと、アスペルギルス・ニドゥランス又はアスペルギルス・オリザのamdS又はpyrGマーカーとの双方を含んで成る、請求項16記載のベクター。
請求項６記載の異種DNA構築体を含んで成る組換宿主細胞。
菌類細胞である請求項20記載の細胞。
アスペルギルス細胞である請求項20記載の細胞。
前記構築体が宿主細胞のゲノムの中に組込まれている、請求項20記載の細胞。
前記構築体がベクター上に含まれている、請求項20記載の細胞。
前記核酸がSEQ ID NO.2に示されているアミノ酸配列から成るラッカーゼをコードする、請求項20記載の細胞。
請求項６又は７記載のラッカーゼをコードする核酸を含んで成るDNA構築体を含んで成る組換宿主細胞を該ラッカーゼの発現を誘導する条件下で培養し、次いでその培養物からこの酵素を回収することを含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項記載のラッカーゼを獲得するための方法。
銅含有酵素をコードする配列を含むDNA構築体を含んで成る組換宿主細胞を該酵素の発現を誘導する条件下で、0.05〜0.5mMの銅の存在下で培養することを含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項記載の活性組換ラッカーゼの収量を高める方法。
リグニン又はリグノスルフェート基質を溶液重合するための方法であって、前記基質を請求項１〜５のいずれか１項記載のラッカーゼと接触させることを含んで成る方法。
クラフトパルプにおけるin situ脱重合のための方法であって、前記パルプを請求項１〜５のいずれか１項記載のラッカーゼと接触させることを含んで成る方法。
染料又は染料前駆体を酸化するための方法であって、前記染料を請求項１〜５のいずれか１項記載のラッカーゼと接触させることを含んで成る方法。
毛髪を染色するための方法であって、請求項１〜５のいずれか１項記載のラッカーゼを、少なくとも一種の改質剤の存在下又は非存在下で、少なくとも一種の染料前駆体と、その染料前駆体が染料へと酸化するのに足りる時間及び条件下で接触させることを含んで成る、方法。
前記染料前駆体がジアミン、アミノフェノール及びフェノールより成る群から選ばれる、請求項31記載の方法。
前記改質剤が、使用する場合、メタ−ジアミン、メタ−アミノフェノール又はポリフェノールである、請求項31記載の方法。
前記染料前駆体がオルト−もしくはパラ−ジアミン又はアミノフェノールより成る群から選ばれる一次中間体である、請求項32記載の方法。
一種より多くの染料前駆体を使用する、請求項31記載の方法。
一種より多くの改質剤を使用する、請求項31記載の方法。
一次中間体及び改質剤の双方を使用する、請求項31記載の方法。
少なくとも一種の染料前駆体と組合された請求項１〜５のいずれか１項記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼを含んで成る染料組成物。
少なくとも一種の一次中間体及び少なくとも一種の改質剤を更に含んで成る請求項38記載の染料組成物。
請求項38記載の染料組成物を無酸素雰囲気下で含む容器。
少なくとも一種の改質剤と組合された少なくとも一種の一次中間染料前駆体を更に含んで成る請求項40記載の容器。
フェノール系又はアニリン化合物を重合又は酸化するための方法であって、フェノール系又はアニリン化合物を請求項１〜５のいずれか１項記載のマイセリオフトラ・ラッカーゼと接触させることを含んで成る方法。