ES2370216B1 - Lacasa de alto potencial redox. - Google Patents
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Abstract
Lacasa de alto potencial redox.#La presente invención describe la evolución dirigida de una lacasa de alto potencial redox expresada funcionalmente en S. cerevisiae que presenta una alta tasa de producción, una elevada actividad y una gran termoestabilidad. La presente invención se refiere a la secuencia aminoacídica de dicha lacasa y a la secuencia nucleotídica que codifica para dicha lacasa. La lacasa de la invención presenta aplicaciones en diversos sectores: nano-biotecnología, industria papelera, biorremediación, industria textil, industria alimentaria, industria farmacéutica, industria química, etc.
Description
Lacasa de alto potencial redox.
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular,la tecnología del ADN recombinante yla biotecnología. Específicamente,se refiereauna enzimaoxidasadetipo lacasa mejoradaensuexpresión funcional, su actividad catalíticay su termoestabilidad.Laexpresión funcional, mejorade actividad catalíticaytermoestabilidad de la lacasa se lleva a cabo en células eucariotas de Saccharomyces cerevisiae a través de un proceso de evolución molecular dirigida. Dicha enzima pueden emplearse como catalizador en procesos industriales relacionados con la transformación de la biomasa lignocelulósica para la obtención de biocombustibles o la elaboración de productos de maderaypapelconnuevas propiedades,parael sector alimentario,la produccióntextilyel sector químico,asícomo parala biorremediacióndeefluentesycontaminantes ambientales,yparael diseñode bionanodispositivos.
Estado de la técnica anterior
Las lacasas (EC 1.10.3.2) son un grupo de oxidasas ampliamente distribuido en plantas superioresy en hongos, aunque también se han descrito en algunas bacterias e incluso en cutículas de insectos (Alcalde, 2007. Industrial enzymes. Structure, function and applications. Ed. Polaina, J.yMacCabe, A.P. Springer, Heidelberg(Alemania),pp. 459-474). Pertenecenalafamiliadelas oxidasas multicobreazul(juntoconlasascorbato oxidasayla ceruloplasmina), yse presentan generalmente como glicoproteínas monoméricas extracelulares.
Las lacasas, individualmente, catalizan la oxidación de un amplio espectro de sustancias orgánicas aromáticas. Entre estas sustancias se encuentran los ortoypara-difenoles, los fenoles metoxi-substituidos, los bencenotioles, los hidroxindoles, el1-naftolyla siringaldazina (Gianfreda et al., 1999. Bioremediation Journal 3:1-25). Los radicales libres resultantes sufren diferentes reacciones dependiendodesu estructuraydelas condicionesde reacción.Elacoplamientode radicales libres generando productos diméricoso poliméricosylas descarboxilaciones oxidativas sonlasreaccionesmás frecuentes.Tambiénson sustratosde lacasaslos compuestos metálicosinorgánicos/orgánicos.ElMn2+ es oxidado a Mn3+ ytambién el Fe (EDTA)2− es aceptado por la enzima (Thurston, 1994. Microbiology-UK 140:19-26).
La oxidación de todos estos sustratos va acoplada a la reducción del oxígeno molecular a dos moléculas de agua. Esto significaqueporcada moléculade oxígeno reducida,se oxidan4moléculasde sustratosin producir peróxidode hidrógeno.Por estosmotivos,las lacasasse consideran comolos catalizadores“verdes” idealesyaque empleanO2 como co-sustrato generandoúnicamenteH2Ocomo subproducto.
Las lacasas contienenun cobredetipo1(T1) donde tienelugarla oxidacióndel sustrato reductor,y un centroo cluster trinuclear con tres cobres, un T2ydos T3, donde tiene lugar la reducción delO2. El mecanismo de reacción debe funcionar como una batería, almacenando electrones de las reacciones de oxidación individuales para reducir el oxígeno molecularyproduciragua(Davies, 2002. Lacease.En: Handbookof Metallproteins.(edA. Messercschimdt et al), pp. 1359-1368. JohnWileyandSons,LTD,NewYork).
El potencial redox formal (Eº’) de las lacasas tiene una relación directa con la energía requerida para arrancar un electrón al sustrato reductor, constituyendo una de las características fundamentales de estas enzimas. De hecho, el comportamiento catalítico de las lacasas sobre la mayoría de los sustratos reductores depende del Eº’ en el Cu T1 (aceptor de electrones). De este modo, las lacasas con un mayor Eº’T1 son de especial interés en biotecnología debido a que son capaces de oxidar sustratos con mayor Eº’ como ciertos hidrocarburos aromáticos policíclicos o diversos colorantes orgánicos sintéticos. El Eº’ de diferentes lacasas ha sido ampliamente estudiado mediante técnicas espectroelectroquímicas (principalmente voltamperometría cíclicay valoraciones redox) haciendo usode diferentes tiposde electrodosymediadores redox(Xu,F. et al., 1998. Biochem. J. 334:63-70; Shleev,S.V. et al. 2004. Biochimie 86:693-703).
ElEº’delCuT1dealgunas lacasasfúngicasesmayor(Eº’T1 cercanoa+800mV)queeldelas lacasasdeplantas
o bacterianas (por ejemplo la lacasa de Rhus vernicifera tiene un Eº’T1= +400 mV)yotras oxidasas multicobre azul (ascorbato oxidasa Eº’T1= +340 mV). Sin embargo, es importante señalar que también existen marcadas diferencias en los Eº’T1 de las diferentes lacasas fúngicas, desde +465 mV de la lacasa del ascomiceto Myceliophtorathermophila hasta +790 mV de la lacasa del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus. En este sentido, se ha realizado un enorme esfuerzoconla intenciónde dilucidarquéfactores determinanestas diferenciasenlosEº’T1,sobretodosisetienenen cuenta las geometrías de coordinación de los sitios de Cu, prácticamente conservadas. La mayor parte de estos estudios físico-químicos se ha servido del conocimiento aportado por los modelos cristalográficos disponibles. En concreto se han resueltoafechadehoylas estructurasen3Dde8lacasasde Coprinus cinereus, Melanocarpus albomyces, Bacillus subtilis,Trametes versicolor, Rigidoporus lignosus, Lentinus tigrinus,Trametes trogii yPycnoporus cinnabarinus.
Las llamadas “lacasas de alto potencial redox” -procedentes de hongos basidiomicetos de podredumbre blanca-poseen un enorme potencial biotecnológico debido a su amplia especificidad de sustrato (oxidan fenoles, aminas, tioles, antraceno,etc.)yasusbajos requerimientosde aplicación(sólorequieren oxígeno,quees transformadoenagua durantela reacción).Cuandoactúansobreelpolímerodelignina(ocompuestosdetipofenólico)pueden catalizartanto actividades de degradación como de polimerización. Además, su rango de sustratos puede ser ampliado a compuestos no fenólicos más difíciles de degradar utilizando mediadores redox, de origen natural o sintético, en los denominados sistemas lacasa-mediador (Camarero et al., 2005. Appl. Environ. Microb. 71:1775-1784).
La tecnología de las lacasas de alto potencial redox puede ser empleada en prácticamente la totalidad de la cadena de producción de productos papeleros: la elaboración de la pasta de papel, el blanqueo libre de cloro de las pastas, la eliminación del pitch o el tratamiento de efluentes.
Enla industriadeproductos forestalesdos áreas másdeinvestigación emergentes sona)el diseñode materiales lignocelulósicos con nuevas propiedades de resistencia y estabilidad mediante el injerto de compuestos fenólicos catalizado por lacasa, enla denominada “funcionalizaciónde las fibrasde celulosa”;yb)el usode lacasas parala mejora en la adhesión de tableros de madera (mediante el acoplamiento enzimático in situ de la lignina), sin necesidad de utilizar adhesivos tóxicos a base de formaldehído. Además, las lacasas encuentran aplicaciones en los siguientes sectores (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1:38-50):
i) La industria alimentaria: procesamiento de bebidas o de productos de panadería.
ii) La industria textil: degradación (detoxificación) de los colorantes de los efluentes o blanqueo de tejidos (lavado a la piedra de jeans).
iii) Nanobiotecología: a) como detectores de fenoles, oxígeno, azidas, morfina, codeína, catecolaminas o flavonoides enla elaboraciónde biosensores para análisis clínicosy medioambientales;yb) elaboraciónde biopilas de combustible que ofrecen energía eléctrica limpia (sin utilizar combustibles fósiles) mediante la inmovilización de lacasas en elcátodo.
iv) Biorremediación: degradación dePAHs (Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos), compuestosAOX(Halógenos Orgánicos Absorbibles), etc.
v) Síntesis química: a) producción de polímeros complejos (ej. policatecol para resinas de cromatografía); b) síntesis de agentes farmacológicos: antitumorales (ej. viblastina), nuevos derivados antibióticos (ej de la ciclosporina A), o colorantes (Suberasa® de Novozymes); c) cosméticos: tintes de cabello formulados con lacasa.
La aplicacióndelas lacasasanivel industrial requierede sistemasdeexpresiónrobustosque proporcionen altos niveles de enzima activa. El empleo de sistemas de expresión heterólogos posibilita la producción de lacasas de diferentes procedencias en un mismo hospedador, así comode nuevasvariantes con propiedades mejoradas con respecto a la enzima salvaje.
Por este motivo, se ha estudiado en profundidad la expresión heteróloga de lacasas fúngicas en hospedadores eucariotas (Kunameni et al. 2008 Microbial CellFactories., 7:32). Se ha realizado especial hincapié en sistemas de expresión basados en hongos filamentosos(Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus sojae y Trichoderma reseei);y levaduras(Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Pichia methalonica,Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis). Graciasalosavances obtenidosenel diseñode biorreactoresy ala optimizacióndelas condiciones de expresión en levaduras, se han alcanzado niveles de expresión de unos 20 mg de lacasa activa por litro de cultivo en Yarrowia lipolyticao Pichia pastoris. Estos niveles son significativamente inferiores a los 135 mg/L obtenidos en Aspergillus oryzae o los 920 mg/L en Trichoderma. Sin embargo, la elección de levaduras como S. cerevisiae como hospedador ofrece la valiosa ventaja de poder mejorar las propiedades catalíticas de las lacasas recombinantes o su estabilidad en las condiciones de operación, mediante técnicas de evolución molecular dirigida.
Seha estudiadolaexpresiónen S. cerevisiae de lacasas de los hongos Coriolus hirsutus,Trametes versicolor,Melanocarpus albomyces,Trametes sp. strainC30, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus coccineus yPleurotus eryngii, aunque los niveles de expresión funcional detectados han sido mínimos (Kunameni et al., 2008. Microbial CellFactories. 7:32).No obstante,laexpresiónfuncionalde lacasas fúngicasen S. cerevisiae puede ser incrementada significativamente mediante técnicas de evolución molecular dirigida, que permite el diseño de nuevas funciones enzimáticas no existentes en ambientes naturales o la mejora de ciertas propiedades de la enzima (Arnold, 2001. Nature 409:253257). Esta metodología recrea en el laboratorio los procesos claves de la evolución natural (mutación, recombinaciónyselección) de manera que es posible diseñar enzimas de gran interés científicoytecnológico. De esta manera, sometiendo los genes seleccionados a ciclos sucesivos de evolución molecular, las diferentes mutaciones puntuales beneficiosasse irán acumulandoy combinando hasta adquirirla propiedad deseada,queseve mejoradade manera exponencial, generación tras generación. Utilizando este procedimiento se consiguió incrementar hasta 18 mg/Lla producción de lacasa del ascomiceto Myceliophthora thermophila en S. cerevisiae (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995. 2003).
En la evolución in vitro, mediante mutagénesisaleatoria induciday/o recombinacionesenel material genéticoque codifica para unaovarias proteínas, se crea unadiversidad genéticaque posteriormente seexpresay explora bajolas condiciones en las que se quiere mejorar la enzima (altas temperaturas o medios no convencionales, pHs extremos, etc.). La mayoría de las características enzimáticas -regioespecificidad, enantioespecificidad, termoestabilidad, estabilidaden disolventesorgánicos,expresióngénica, inclusola búsquedadeactividades de novo en el caso de anticuerpos catalíticos-puedenser sometidasaexperimentosdeevolucióndirigida(Tao&Cornish,2002.Curr.Opin.Chem.Biol. 6:858-864.).
Aunque, considerandola eficienciade transformación,la estabilidaddelADN plasmídicoyla tasade crecimiento,
E. coli es el organismo hospedador más frecuentemente utilizado en la expresión funcional heteróloga de los genes que codifican la proteína de interés, el diferente uso de codones,y la imposibilidad de realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias para la correcta secreción de la proteína madura (como el procesamiento proteolítico
o las glicosilaciones) pueden causar un plegamiento inapropiado de la proteína que es acumulada en cuerpos de inclusión, impidiendo su expresión funcional. Esto es especialmente cierto para las lacasas fúngicas para las que no se ha logrado todavía su expresión funcional en E. coli. Algunos de estos problemas pueden evitarse si estos genes se expresan en hospedadores eucarióticos cuya maquinaria celular sea más próxima a la nativa, como es el caso de las levaduras. En especial, el uso de Saccharomyces cerevisiae es de gran interés ya que posee la habilidad de glicosilar y secretar las proteínas al medio extracelular (lo cual evita en muchos casos pasos intermedios de lisis celular) y tiene una elevada eficienciade transformación.Además, haciendo usode unvector episódico adecuado, no integra el plásmido dentrode su genoma,facilitando así su posterior manipulación. Otraventaja muy interesante desdeun punto de vista evolutivo es su elevada frecuencia de recombinación de ADN, la cual a diferencia de E. coli permite la construcción de genotecas in vivo a través de la recombinación homologa de diferentes genes (conocido como in vivo ADN shuffling o “barajeo”). Por último,laligaciónde los genes mutados envectoresdeexpresión es, en muchos casos, un paso laborioso que requiere un ajuste fino. En levaduras, el mecanismo reparador de huecos(in vivo gap repair)puede sustituir la ligaciónin vitro de una manera rápidayprecisa (Bulter&Alcalde, 2003. Directedevolution: librarycreation. Methodsand protocols.Ed.Arnold,F.H.yGeorgiou,G.HumanaPress,Totowa,NewJersey(EEUU), pp. 17-22).
La evolución molecular dirigida de lacasas fúngicas presenta como requisito indispensable la expresión funcional de la enzima en Saccharomyces cerevisiae. La expresión funcional en S. cerevisiae de lacasas de alto potencial redox-procedentesde basidiomicetos-no seha descrito conéxito hastael momento. Únicamente seha reportadola mejora porevolución dirigidade lacasasdebajopotencialde oxido-reducciónporel grupodeM.Alcaldeycolaboradores. Dichos trabajos se han centrado en la lacasa de bajo potencial redox (Eº’T1 = +475 mV) del ascomiceto Myceliophthora thermophila. En estos trabajos, los niveles de expresión funcional en S. cerevisiae se lograron beneficiándose de la similitudexistente entreel microorganismode partida(Myceliophthora thermophila)yS. cerevisiae,ambos ascomicetos. Con este sistema seha conseguido medianteevolución dirigida:i) suexpresión funcional en S. cerevisiae, (Bulter et al..,2003.Appl.Environ.Microb.69: 987-995.);yii)suestabilizaciónencosolventesorgánicos,(Zumarraga et al., 2007. Chem. Biol. 14: 1052-1064.; Zumarraga et al., 2008. Proteins 71: 250-260.; Zumarraga et al., 2007 Biocatal. Biotrans. 25: 219-228; Alcalde et al., 2005.J. Biomol. Screen. 10:624-631).
Dadoqueel rangode actuacióndela lacasaevolucionadade Myceliophthora thermophila está limitado por su bajo potencial redox (Eº’T1 = +475 mV) que le impide catalizar eficientemente la oxidación de moléculas con potenciales redox superiores al suyo, las lacasas de alto potencial redox producidas por hongos basidiomicetos de podredumbre de la madera suponen un punto de partida más adecuado para la mejora de las propiedades de la lacasa por evolución dirigida, debido a su mayor aplicabilidad biotecnológica.
Las lacasas de alto potencial redox son un claro ejemplo de biocatalizador generalista que convierte en virtud su promiscuidad de sustratos. Impulsadas por oxígeno molecular, las lacasas de alto potencial redox transforman cientosde sustratosde diferente naturalezaycomplejidad, abarcando desdexenobióticos(por ejemplo: pesticidas, tintes industriales, hidrocarburos aromáticos policíclicos)hastabiopolímeros (lignina, almidón).De aquí quelas lacasasde alto potencial redox encuentren aplicaciones potenciales en biorremediación, refinado de textiles, bioblanqueo de pasta de papel, biocombustibles, síntesis orgánicaymuchos otros procesos (Xu, 2005. Biochem.J. 334, 63-70;Kunamneni et al., 2008. Microb. CellFact.7, 32;WidstenyKandelbauer, 2008. Enzyme Microb.Tech.42, 293-307). Además, las lacasas de alto potencialredox son de las pocas enzimas capaces de aceptar electrones de manera directa desde un compartimento catódico, siendo así esenciales para la bioelectroquímica en la ingeniería de nanobiodispositivos, lo cual genera un interés especial enel diseñode bionanosensores tridimensionalesybiopilasde combustible (Shleev et al., 2005. Bioelectrochemistry 67, 115-124). Desafortunadamente, su diseño práctico mediante evolución dirigida se havistohastaahoraimpedidoporlafaltadeenfoques apropiadosparaevitarloscomplejosproblemasencontradosdurante suexpresión funcional (Roodveldt et al.,2005. Curr. Opin. Struc. Biol.15, 50-56).De hecho,existen únicamente unos pocos estudios preliminares debido a la pobre exocitosis producida por la levadura (Festa et al., 2008. Proteins 72, 25-34; Cusano et al., 2009; Miele et al., 2010. J. Appl. Microbiol. 108, 998-1006). La lacasa de alto potencial redox de la presente invención, diseñada ad hoc, es fácilmenteexportableysoluble, en forma activayestable,lo que abreunabanicode posibilidadesparasufuturaingeniería.Enefecto,el meticulosodiseñoexperimentalempleado,que involucrólaevolución dirigidayla mutagénesis dirigida,ha sido crucial para crearun biocatalizador altamente activo ytermoestable que ahora está disponible para enfrentarsea nuevos retos. Asimismo,laevolución conjunta delgen foráneo de la lacasa de alto potencial redox con el gen del preprolíder delfactor α proporciona una forma idónea de mejorar estas capacidades a partir de niveles de expresión indetectables. Esta estrategia puede ser ahora aprovechada para diseñar otras lacasasde alto potencial redox,loqueapoyala idea generalde emplearlaevolución dirigidadel preprolíder delfactor α como molde general para la expresión de diferentes sistemas enzimáticos (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol.Bioeng.103,1192-1201).Esperamosqueenelfuturopróximo,las lacasasdealtopotencialredox diseñadas medianteevolución dirigidayenfoques racionales en S. cerevisiae puedan afrontar retos atractivos presentes enla biocatálisis tradicionalymoderna.
El grupodeM. Alcaldeycolaboradores describeenMicrobialCellFactories(2010,9:17)varias lacasas generadas mediantevarios métodosdeevolución dirigidadelas secuencias polinucleotídicasque comprendenelgendela lacasa dealto potencialredox(Eº’T1 =+790mV)delhongo basidiomicetoPM1,yla secuencia codificantedela secuencia señal nativa del factor α. De esta forma, estos autores han dado lugar a una expresión funcional mejorada en S. cerevisiae ya una actividad enzimática aumentada hacia uno o más sustratos.
Sin embargo, hasta la fecha no se ha conseguido producir lacasas de alto potencial redox con una elevada actividad yuna elevada termoestabilidad en cantidad suficiente.
Descripción de la invención
La presente invención describe la evolución dirigida de una lacasa de alto potencial redox expresada funcionalmente en S. cerevisiae que presenta una elevada actividady una grantermoestabilidad.El puntode partida fuela lacasade alto potencial redox del basidiomiceto PM1,la cualexhibe unas destacables propiedadesde estabilidady actividad, incluyendo activación térmica (Coll et al., 1993.Appl.Environ. Microb.59, 2607-2613).Tras reemplazarla secuencia señal nativaporla secuencia preprolíderdelfactor α con el fin de regular el tráfico de la proteína heteróloga, la proteínade fusión fue objetode8ciclosdeevoluciónde laboratorio en combinación con enfoques racionales.El último mutantede este proceso, constituye unavaliosa herramienta para diseñar lacasasde alto potencial redox ad hoc para diferentes aplicaciones.
Por tanto, la presente invención proporciona una nuevalacasa con alto potencial redox, alta tasa de producción, alta actividadyalta termoestabilidad.La presenteinvención se refiereala secuencia aminoacídicade dicha lacasaya la secuencia nucleotídica que codifica para dicha lacasa.
Los autores de la presente invención han utilizado una combinación metodológica basada en laevolucióny la mutagénesis dirigida y han confeccionado una lacasa que resuelve la necesidad de un biocatalizador con elevada actividady termoestabilidad,y que además presenta una alta tasa de producción funcional(8 mg/L; 1400 U/Lde fermentado).
La lacasadela presenteinvención es altamente estable frenteala temperatura(valoresdeT50= 73ºC),la presencia de cosolventesorgánicosyenunamplio intervalodepH(estableenel intervalo3a9).Dicha lacasaposeeunosvalores cinéticosdelordende6veces superioresalos descritospara lacasasequivalentesenel estadodela técnica,porloque su diseño evolutivo ha permitido:
- i)
- incrementar 34000 veces los niveles de actividad total;
- ii)
- incrementar sus constantes catalíticas,
- iii)
- mantener una elevada estabilidad frente a diversos factores (temperatura, pH, cosolventes).
Por tanto, las principales ventajas de la lacasa de la presente invención son:
i) presenta una alta tasa de producción,
ii) presenta una elevada actividady
iii) presenta una elevada termoestabilidad.
Un primer aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido (en adelante llamado polinucleótido de la invención)que codificaparael polipéptidode secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1(en adelante llamado polipéptidode la invención). En una realización preferida, el polinucleótido de la invención tiene la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2.
El término “polinucleótido”,talycomose empleaenla descripción,se refierea formas poliméricasde nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos.
El término “codifica”, taly como se emplea enla descripción, hace referenciaala correlación queexiste entre los tripletesde nucleótidosocodonesen una secuenciadeADNylosaminoácidosque formanlos péptidos,las secuencias aminoacídicasolas proteínas. Cuandosediceque una secuencia nucleotídica codificaparaun péptido, significaque cuando dicha secuencia nucleotídica sea transcritaaARN mensajero (ARNm)yeste ARNm sea traducido, se generará dicho péptido.
El término “péptido”, “polipéptido”o “proteína”,taly comoseempleaenla descripción,se refiereaunaforma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud.
Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética (en adelante llamada construcción genética de la invención) que comprende:
a. el polinucleótido de la invención, o
b. el polinucleótidodelainvención,que además comprendeunsistemaovectordeexpresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido, y/o con otras secuencias nucleotídicas necesarias o apropiadas para la transcripción in vitro o in vivo ysu regulación en tiempoylugar.
Una construcción genéticapuede incluirlosvectoresde clonacióny expresióngénicaque comprendeelpolinucleótidodelainvención.Talesvectoresdeexpresión génica incluyen secuenciasde control, tales como, por ejemplo, elementos de control de la traducción (como códigos de iniciación y de parada) y de la transcripción (por ejemplo,regionesdepromotor-operador, sitiosdeunión).Losvectores conformealainvenciónpueden incluirplásmidos bacterianosy vectores virales,y otrosvectoresde acuerdo con los procedimientos bien conocidosydocumentados enelestadodelatécnica,ypuedenexpresarse en unavariedadde sistemasdeexpresión diferentes, asimismobien conocidosydocumentados.Se conoce,asímismo,unavariedadde técnicasquepueden utilizarsepara introducirtales vectores en células procarióticas o eucarióticas (células hospedadoras) para su expresión. Técnicas adecuadas de transformación o transfección están bien descritas en el estado de la técnica. Un “vector” es un replicón alque se ha unidootrosegmento polinucleótido,para realizarla replicacióny/oexpresióndelsegmento unido.Un “replicón”es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control. El término “secuencia de control” se refiere a secuencias de nucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal,y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria paralaexpresión,ytambién puede incluir componentes adicionales cuya presencia seaventajosa.Laexpresión “unidosde forma operativa”se refierea una yuxtaposiciónenlaquelos componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
En una realización preferida, la construcción genética de la invención además comprende un polinucleótido que codifica para un péptido señal mejorado porevolución dirigida quefavorecelaexpresión funcional del polipéptido de la invención. Preferiblemente, el péptido señal es el delfactor α, de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9. Más preferiblemente, el polinucleótido que codifica para el péptido señal es la secuencia nuecleotídica SEQ ID NO: 10. Preferiblemente, la construcción genética de la invención comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3. Más preferiblemente, la construcción genética de la invención comprende el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4.
El término “péptido señal”, taly como se emplea en la descripción, se refiere a un péptido que se localiza en elextremo aminodeun polipéptido o proteína,ycuyafunciónes dirigirla localizacióndela proteínaa distintos compartimentos de la célula (núcleo, mitocondria, cloroplasto, retículo endoplásmico (RE), aparato de Golgi (AG), etc.) o al espacio extracelular, en el caso de que la proteína sea secretada.
El péptido señal delfactor α es un polipéptido de 83 aminoácidos. Los 19 primeros aminoácidos constituyen el prelíder que dirige el polipéptido en creación hacia el RE. Tras entrar en el RE, el prelíder es escindido por una peptidasa, dejando una pro-proteína. En este punto, lasN-glicosilaciones de tres residuos de asparaginafacilitan el tránsito de la pro-proteína del RE alAG. En elAG, el prolíder puede actuar como chaperona hasta que es procesado por las proteasas KEX1, KEX2ySTE13 (Romanos et al., 1992.Yeast8, 423-488; Shuster, 1991. Curr. Opin. Biotech. 2, 685-690). Además,elprolíder parece estar implicadoenun procesode señaladovacuolar,quees perjudicialparala secreción heteróloga (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng. 103, 1192-1201).
En una realización preferida de la construcción genética de la invención, entre la secuencia nucleotídica que codifica paraelpéptido señal delfactor α SEQ ID NO:9yla secuencia nucleotídicaque codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1(ambos mejoradosporevolución dirigida),se encuentrala secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos ácido glutámicoy fenilalanina. Más preferiblemente, la construcción genéticadelainvención comprendeel polinucleótidoque codificaparael polipéptidode secuencia aminoacídicaSEQ ID NO: 5. Más preferiblemente, la construcción genéticade la invención comprende el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 6.
Estos dos aminoácidos (ácido glutámicoy fenilalanina) son consecuencia de la estrategia de clonaje empleada para fusionarla secuencia nucleotídicaque codifica paraelfactor α con la secuencia nucleotídica que codifica para la lacasa de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora (en adelante llamada célula de la invención) que comprendeel polinucleótidodelainvenciónola construccióngenéticadelainvención.Más preferiblemente,la célula de la invención es una levadura. Más preferiblemente, la célula de la invención pertenece al género Saccharomyces. Aún más preferiblemente, la célula de la invención pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).
El término “célula hospedadora”,taly comoseempleaenla descripción,se refiereauna célulaquesirve como recipiente del polinucleótidodelainvenciónodela construcción genéticadelainvención.El término “célula hospedadora”, taly como se emplea enla descripción, también puede referirsea una célula queexpresa una proteínade interés(por ejemplo,la lacasadelainvención) dondela célula hospedadoraes transformada conunvectordeexpresión que contiene el polinucleótido de la invención o la construcción genética de la invención, además de otras secuencias nucleotídicas de control.
La levadura de cerveza S. cerevisiae es un hongo unicelular que pertenecealSuperreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Fungi, SubreinoDikarya,Phylum Ascomycota, Subphylum Saccharomycotina,Clase Saccharomycetes, Orden Saccharomycetales,Familia Saccharomycetaceae yGéneroSaccharomyces.
Otro aspecto de la invención se refiere a una lacasa de alto potencial redox (en adelante llamada lacasa de la invención) que comprende el polipéptido de la invención. Preferiblemente, la lacasa de la invención además comprende losaminoácidos ácido glutámicoyfenilalaninaenelextremo aminodel polipéptido,y su secuencia aminoacídicaes SEQ ID NO: 7. Más preferiblemente, la lacasa de la invención además comprende los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal delfactor α mejorado por evolución dirigida (ácido glutámico, treonina, ácido glutámico, alanina) en el extremo aminodel polipéptido,y su secuencia aminoacídicaesSEQIDNO:8.
La cola extra amino terminal de 2 aminoácidos no altera la termoestabilidad ni la actividad de la lacasa de la invención.
La presencia de los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal delfactor α (ácido glutámico, treonina, ácido glutámico, alanina)sedebealafaltade procesadoporpartedela proteasa STE13.Esteesun fenómenocomúnen casos en los que una proteína alcanza niveles de hipersecreción, como sucede con la lacasa de la invención cuando es producida por la célula hospedadora de la invención. Es bien sabido que la cantidad de proteasa STE13 producida por la maquinaria de S. cerevisiae estáligadaala producción delfactor α, de ahí que cuando la lacasa fusionada al preprolíder delfactor α se hipersecreta, los niveles de la proteasa STE13 generados no son suficientes para procesar correctamenteelextremo terminal del prolíder.La colaextra amino terminalde6 aminoácidos (los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal delfactor α ylos dos aminoácidos producto de la estrategia de clonaje) no altera la termoestabilidad ni la actividad de la lacasa de la invención.
El término “amino terminal”, taly como se emplea enla descripción, se refierealextremo desdeel que se creael polipéptido o proteína durante la traducción del ARNm. Este extremo se denomina animo terminal porque el aminoácido que se sitúa en la posición inicial presenta el grupo amino libre.
El término “proteasa”,taly comose empleaenla descripción,se refiereauna proteína con actividad enzimática
o enzima capaz de cortar (digerir, lisar, proteolizar o procesar) un polipéptido o proteína en una región concreta de su secuencia aminoacídica.Una proteasa tambiénpuedellamarsepeptidasao hidrolasa,yaque rompeelenlace peptídico entre dos aminoácidos de una secuencia aminoacídica, polipéptido o proteína.
Laexpresión“faltade procesado”, taly como se emplea enla descripción, se refiereala ausenciade corte por parte de la proteasa. Se entiende por procesamiento de una enzima el fenómeno por el cual dicha enzima modifica su sustrato. En este caso, se entiende por procesamiento de la proteasa el corte del polipéptido al final de la secuencia aminoacídica del péptido señal delfactor α.
El término “hiperseoreción”, taly como se emplea enla descripción, se refierea una secreción aumentada en gran medida. Esta secreción grandemente aumentada se debeala presencia del péptido señal delfactora conla secuencia aminoacídica mejorada SEQ ID NO: 9. La hipersecreción de la lacasa de la invención permite la alta tasa de producción de dicha lacasa.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de la lacasa de la invención, que comprende:
- a.
- cultivarla célula hospedadoradelainvención,y
- b.
- purificar la lacasa.
El término “purificar”,talycomoseempleaenladescripción,se refiereala separacióndela lacasadelainvención yasu concentración,apartirdelmediodecultivodelacéluladelainvención.Laseparacióndelalacasapuedellevarse a cabo mediante técnicas de solubilidad diferencial, cromatografía, electroforesis o isoelectroenfoque. Las técnicas de cromatografíapueden estar basadasenelpeso molecular,lacargaola afinidaddelaproteínaypuede realizarseen columna, en papel o en placa. La separación de la proteína puede realizarse, por ejemplo, por cromatografía líquida rápida (FPLC, del inglés Fast Protein LiquidCromatography), en un sistema automatizado que reduce notablemente el tiempode purificacióneincrementael rendimientodela purificación.
Otro aspectodelainvenciónse refiereal usodel polinucleótidodelainvenciónodelas construcciones genéticas de la invención para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora de la invención para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
Otro aspecto de la invención se refiere a un cultivo de células hospedadoras de la invención.
Un cultivode células hospedadorasserefiereal procesode mantenerycrecerlas células hospedadoras.Los cultivos celulares necesitan condiciones controladas de temperatura, pH, porcentajes degases como el dióxido de carbonoy el oxígeno, así como la presencia de los nutrientes adecuados para permitir la viabilidady la división celular.Los cultivos celulares pueden desarrollarse en sustratos sólidos como el agar, o en medio líquido, lo que permite cultivar grandes cantidades de células en suspensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del cultivo de células hospedadoras de la invención para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplosydibujosse proporcionana modode ilustración,y nose pretendeque sean limitativosdela presente invención.
Descripción de las figuras
Figura. 1. Muestra la Ruta de Evolución Artificial de α-PM1.Se empleó una combinaciónde estrategiasevolutivas (mutagénesis aleatoria, barajado in vivo del ADN (del inglés “in vivo DNA-shuffiing”), ensamblaje in vivo de librerías mutagénicas con diferente espectro mutacional (IvAM, del inglés “in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra”)y racionales (mutagénesisdirigida tanto para recuperar mutaciones beneficiosas como para el intercambio mutacional con HRPL evolucionadas) durante la evolución del gen de fusión α-PM1. El punto de partida para las mutaciones incorporadas en el 7º ciclo por mutagénesis dirigida está indicado por las flechas punteadas. MAT: mejora en la actividad total frente al tipo parental de la generación anterior. MT:mejora en la termoestabilidad frente al tipo parental de la generación anterior.
Figura 2. Muestran los entrecruzamientos sugeridos durante la Evolución Dirigida de α-PM1. El pre-líder del factor-α está representado en gris, el prolíder delfactor-α en blancoyla PM1 madura en negro. Las nuevas mutaciones puntuales están señaladas en gris. Con doble asterisco está señalado el mutante 16B10, el mejor mutante de termoestabilidad de la 6ª generación.
Figura.3.Muestrael enfoque racionaldelaTermoestabilidad.(A) Detalledel modelo3Ddela lacasa mostrando la ubicación del Residuo 454 en las inmediaciones del sitio Cu T1 para el parental PM1y el mutante 7H2. S454 establecedos puentesde hidrógenocon A458y despuésdela mutación, formaun enlace adicional con A161.La esferaesel cobreT1.Termoestabilidadde HRPLsevolucionadas:(B)T50delos mutantesdela4ª,5ªy6ª generación. Círculos negros, mutante 1D11 (4ª G); triángulos blancos, mutante 11A2 (4ª G); triángulos negros, mutante 7H2(5ª G); círculos blancos, mutante6C8(6ªG);cuadradosnegros, mutante 16B10(6ªG).(C)T50delos mutantes construidos por mutagénesis dirigida usandoel mutante 6C8 como molde.Triángulos negros, mutante P393H; cuadrados negros, mutante D281E; triángulosblancosinvertidos, mutante S224G; círculos blancos, mutante revertido S454F.
Figura.4. Muestrala caracterización bioquímicadel mutanteOB-1.(A,B) PerfilesdepHactividaddelas lacasas mutantes. Círculos blancos, mutante 5G3 (3ª G); círculos negros, mutante 1D11 (4ª G); triángulos negros, mutante S454F(7ªG); triángulos blancos, mutanteOB-1(8ªG).Lasactividadesse midieronenbuffer BrittonyRobinson100 mMadiferentespHscon3mMDMP(A)oABTS(B) como sustratos.Laactividad lacasafue normalizadaalvalorde actividadóptimoycadapunto, incluyendoladesviación estándar,eslamediadetresexperimentos independientes.(C) T50del mutanteOB-1yotrasHRPLs relacionadas.Triángulosnegros, lacasade Coriolopsis gallica;círculos negros, lacasa de Pleurotus ostreatus;cuadrados negros, lacasa dePycnoporus cinnabarinus;triángulos blancos invertidos, la-casa de Trametes versicolor,círculos blancos, lacasa deTrametes hirsuta;cuadrados blancos, mutante OB-1. (D) EstabilidaddeOB-1en presenciade concentraciones crecientes(v/v)de distintos disolventesorgánicos.Losexperimentos se realizaron en viales con tapónde rosca conteniendolavarianteOB-1 en una mezcla disolvente/buffer BrittonyRobinson100mM(pH6,0).Tras4h,seextrajeron alícuotasysemidiólaactividadconABTS3mMenbuffer acetatosódico 100 mM (pH 4,0). Cuadrados negros, acetonitrilo; triángulos negros invertidos, etanol; cuadrados blancos, N,N’dimetilformamida; círculos blancos,metanol; círculos negros, dimetilacetamida; triángulos blancos, dimetilsulfóxido. La actividad residual estáexpresada comoel porcentajede actividad originalala correspondiente concentracióndedisolventeorgánico.(E) Estabilidad frentealpHdel mutanteOB-1apH3,0,6,0y9,0.Las muestrasde enzima fueronincubadasenbuffer BrittonyRobinson10mMa diferentespHs,ylaactividad residualsemidióenABTS3mMenbuffer acetato sódico 100 mM (pH4,0). Círculos negros, pH 3,0; cuadrados blancos, pH 6,0; triángulos negros, pH 9,0.
Figura.5.Muestralas mutacionesenla LacasaEvolucionada. Muestralos detallesdelas siete mutaciones presentes enlavarianteOB-1(B,D,F) comparadas con los correspondientes residuosdela lacasa PM1 nativa(A,C,E). Las esferas representan átomos de Cu. Se muestran los ligandos del Cu T1y del cluster trinuclear Cu T2/T3. Los puentes de hidrógeno relacionados con los residuos mutados (antes y después de la mutación) se muestran como líneas discontinuas.
Figura. 6. Muestra la estrategia de clonaje para la construcción de α-PM1.
Figura. 7. Muestra la Ruta de Evolución Artificial de α-PcL.La figura muestralas tres primeras generacionesdela lacasa de Pycnoporus cinnabarinus. MAP: mejoraenlaactividad total frentealtipo parentaldela generación anterior. Esta figura está relacionada con la Figura 1.
Figura. 8. Muestra la caracterización del mutante OB-1. (A) espectro de masas del mutante OB-1. (B) Electroforesis del mutante OB-1purificado. Los carriles contienen lo siguiente. 1: marcador de peso molecular, 2: filtrado del cultivo, 3: precipitación fraccionada con sulfato de amonio, 4: intercambio aniónico, 5: intercambio aniónico de alta resolución. (C)N-deglicosilación de OB-1. Los carriles contienen lo siguiente: 1: OB-1, 2:OB-1 deglicosilado,3: marcadorde peso molecular.La enzima purificada fuedeglicosilada usandolaN-glicosidasa PNGasaF. Las muestras se analizaronenungeldeSDSyacrilamidaal12%y se tiñeronconazuldeCoomassie.Estafiguraestá relacionada con la Figura 4.
Figura. 9. Muestra la estructura general de la Lacasa Evolucionada OB-1. Están representados los tres dominios de tipo cobre (D1, D2yD3), los átomos de cobre como esferas grisesylas sustituciones de aminoácidos, en negro. También se muestran las distanciasde los residuos mutadosal cobreT1 (representadas como líneas discontinuas)yla superficie de la proteína. Esta figura está relacionada con la Figura 5.
Figura10.Muestrael alineamientoparcialdelasecuencia aminoacídicadePM1ydeotraslacasasdealtopotencial redox muy relacionadas. La numeración incluye las secuencias señal. El alineamiento de las secuencias se realizó con el algoritmo cobalto en el servidor NCBI-Blast. PM1, lacasa del basidiomiceto PM1 (CAA78144.1) (SEQ ID NO: 34);T. C30, lacasa de Trametessp. C30 Lacc1 (AAF06967.1) (SEQ ID NO: 35); T. trogii, lacasa de Trametes trogii (2HRG-A(SEQ ID NO: 36)); C. gallica, lacasa de Coriolopsis gallica (ABD93940.1) (SEQ ID NO: 37); C. rigida, lacasa de Coriolopsis rigida (ACU29545.1) (SEQ ID NO: 38); T. sp AH28-2, lacasa A de Trametes sp. AH28-2 (AAW28933.1) (SEQ ID NO: 39); T. versicolor, lacasa III de Trametes versicolor(AAL93622.1) (SEQ ID NO: 40);
T. pubescens,lacasa2deTrametes pubescens(AAM18407.1) (SEQ ID NO: 41); T. hirsuta,lacasa deTrametes hirsuta (ACC43989.1)(SEQIDNO:42);T. I-62, lacasade Trametessp. I-62 (AAQ12269.1) (SEQ ID NO: 43); P. coccineus, lacasa de Pycnoporus coccineus (BAB69775.1) (SEQ IDNO: 44); P. sanguineus, lacasa de Pycnoporus sanguineus (ACN69056.1) (SEQ ID NO: 45); P. cinnabarinus, lacasa de Pycnoporus cinnabarinus (AAF13052.1) (SEQ ID NO: 46); L. tigrinus, lacasa de Lentinus triginus (2QT6-A) (SEQ ID NO: 47).
Modos de realización de lainvención
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
Ejemplo1
Punto de partida para la evolución: la construcción de α-PM1
Nuestro punto de partida fue la lacasa de alto potencial redox del basidiomiceto PM1. Además de su elevado potencial redox (por encimade +700 mV),la lacasa PM1 esaltamente estable enel intervalodepHde3 a9y a elevada temperatura (con una actividad óptima a 80ºC) (Coll et al, 1993. Appl. Environ. Microb. 59, 2607-2613, Coll et al, 1993, Appl. Environ. Microb. 59, 4129-4135). Estas características la convierten en altamente deseable no sóloparauso prácticosino tambiénparallevaracaboexperimentosdeevolución dirigida.Teniendoenmentequela acumulaciónde mutaciones beneficiosas durantevarios ciclosdeevoluciónde laboratorio generalmente conduceala desestabilización del molde proteico, cuanto mejor sea la estabilidad de la enzima de partida, mayor es la probabilidad de alcanzar las mejoras perseguidas sin poner en peligro la función proteica (Bloom y Arnold, 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 9.995-10.000). En primer lugar, el ADN copia de la lacasa PM1 con la secuencia señal nativa fue clonado en el correspondiente vector lanzadera, aunque no se detectaron niveles de expresión funcional en S. cerevisiae.Para aumentarlosnivelesdeexpresiónavaloresque pudieran detectarseenlos ensayosde screening, la secuencia señal nativa de la lacasa PM1 fue reemplazada por diferentes péptidos señales comúnmente empleados para expresar proteínas heterólogas en levadura. El mejor resultado se consiguió con la construcción α-PM1 (Figura 6) constituida por el preprolíder de la feromona delfactor α (Shuster, 1991. Curr. Opin. Biotech. 2, 685-690) acoplada alaPM1 madura,locualgenerónivelesdeexpresiónmuybajospero detectables(∼35 mU/L). Los coeficientes de varianza (CV) para los ensayos de screening se ajustaron duranteel procesodeevolución (alcanzandoCVspordebajo del11%apartirdeltercercicloen adelante)ylas condicionesdemicrofermentación fueron optimizadas (asimilación de cobre, composición del medio, disponibilidadde oxígenoytemperatura).
El vector pUEX1 con el cDNA de la PM1 nativa fue cedido por el Prof. R. Santamaría (Universidad de Sala-manca). La lacasa de Trametes versicolor, las lacasas de Pycnoporus cinnabarinus yTrametes hirsuta,ylas lacasas de Coriolopsis gallica y Pleurotus ostreatus, fueron donadas por Novozymes (Davis, CA, USA), Prof. E. Record (Universidadde Marsella, Francia), Prof.A.Yaropolov (Institutode Bioquímica, Moscú, Rusia)yProf.R. VázquezDuhalt (UNAM, Cuernavaca, México), respectivamente. ElABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)),elDMP(2,6-dimetoxifenol),laTaqpolimerasayel kitde transformación en S. cerevisiae fueron comprados a Sigma-Aldrich. Las células competentes de E. coli XL2-Blueylos kits GenemorphIyII Random mutagénesis son de Stratagene. La cepa BJ5465 de S. cerevisiae deficiente en proteasas es de LGCPromochem. El vector lanzadera pJRoC30 conel gende resistencia a ampicilinayelde auxotrofía para uraciloprocede del InstitutodeTecnología de California (Caltech, CA, USA), mientras que el vector pGAPZα, que contiene el prepro-líder delfactor α, es de Invitrogen, USA. Los kits Zymoprep yeast plasmid miniprep, ZymodeangelDNArecovery,yDNAclean&concentrator TM-5 se compraron a Zymo Research. El kit NucleoSpin Plasmid se compróa Macherey-Nagelylas enzimasde restricción BamHIyXhoIaNew England Biolabs.Todos los reactivos usados fueron losde mayor pureza disponible.
El ADN copia de la PM1 incluyendo la señal líder nativa fue clonado en el vector lanzadera pJRoC30 en S. cerevisiae.ElvectorpUEX1 conel ADN copiadela PM1 se usó como molde para amplificarla PM1 incluyendolos 21 aminoácidos del péptido señal. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron: (SEQ ID NO: 11) F3PM1: 5’CTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAART-3’y(SEQID NO:12) R3PM1: 5’GACATAACTAAT TACATGATGCGGCCC TCTAGATGCATGCTCGAGCtcactggtcgtcaggcgagagc3’, donde las letras mayúsculas indican los fragmentos que anillan específicamente in vivo en las células de S. cerevisiae conelvector pJRoC30 linearizado con BamHI yXhoI.La correspondiente construcciónpJRoC30-PM1nodiolugaranivelesdeexpresión funcionalen S. cerevisiae. En consecuencia, la secuencia señal nativa de la PM1 fue sustituida por las señales líder de MtLT2 (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69, 987-995), la de la glucosa oxidasa de Aspergillus niger (Frederick et al., 1990.
J. Biol. Chem. 265, 3793-3802)yel preprolíder delfactor α (Brake et al., 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 46424646), siendo el último elúnico que dio lugar a niveles detectables de secreción de la PM1 en S. cerevisiae (inferior a 35 mU/L). La construcción α-PM1 se obtuvo por amplificación del gen de la PM1 nativa excluyendo la señal líder usando los cebadores (SEQ ID NO: 13) PM1Eco-F(5’-gcGAATTCagcattgggccagtc-3’)y(SEQ ID NO: 14) PM1-R (5’-atGGCGGCCGCttactggtcgtcaggcgagagc-3), que incluyen las dianas para EcoRIyNotI(en letras mayúsculas) así comoelcodóndeparadaóptimo(ennegritaysubrayado)para PichiaPastoris. El vector pGAPZα con el preprolíder delfactor α fue linearizado con EcoRIyNotI,yel fragmento amplificado correspondiente fue digerido con EcoRIy NotIyclonado en el pGAPZα linearizado, dando lugar a la construcción pGAPZα-PM1. La construcción pGAPZαPM1 se utilizó para amplificar el gen de fusión α-PM1 por medio de los siguientes cebadores: (SEQ ID NO: 15) αF (5’-ATAGGATCCatgagatttccttcaatttttactgctgtt-3’) que incluye la diana de BamHI (en letras mayúsculas)y (SEQ ID NO: 16) PM1-R(5’-tcaatgtccgcgttcgcaggga-3’). El fragmento obtenido se digirió con NotI. El vector episómico pJRoC30 fue digerido con BamHIy amplificado con Klenow para el clonaje con extremos romos. Finalmente, el plásmido fue digerido con NotI, desfosforiladoyligado con αPM1 para generar el pJRoC30-αPM1.
Ejemplo2
Evolución de laboratorio de α-PM1
La estrategiadeevolucióndirigidafue elaborada siguiendolas siguientesreglas:i)para ajustar adecuadamentelos requisitos de la ruta secretora del hospedador durante la expresión funcional de la lacasa, el gen de fusión completo fue objetode mutagénesis aleatoriay/o recombinación. Porlo tanto, seevolucionó conjuntamente tantoel preprolíder delfactor α comoelgendelalacasa foráneaconelfindeadaptarambos elementosparaunaexportaciónexitosapor S. cerevisiae;ii)paraasegurarquelamejoradeactividadnofuera dependientedeun sustratoen concreto,sevalidarony emplearon durantelaevolución molecular ensayosde screening basadosenla oxidaciónde compuestosfenólicos(2,6 DMP)y no fenólicos (ABTS); iii) paragarantizar latermoestabilidad general del mutante final, las pérdidas en estabilidad producidas porla acumulaciónde mutaciones durantelaevolución fueron detectadasyrecuperadas mediante enfoques racionales acoplados con el screening determoestabilidadde libreríade mutantes;yiv)las mutacionesque representaron mejoras significativas durante los primeros ciclos de evolución in vitro, pero que no fueron finalmente seleccionadas tras las recombinacionesyel screening, fueron recuperadas individualmente, analizadas e introducidas en las últimas variantes mediante mutagénesis dirigida.
La generación de diversidad fue emulada aprovechando la maquinaria celular eucariota de S. cerevisiae. Los altos niveles de recombinaciónhomologa que ofrece S. cerevisiae permiten reparar in vivo los productos mutagenizados con el vector linearizado a través de la ingeniería de extremos solapantes diseñados al efecto sin alterar la clase de lectura. Las librerías mutagénicas fueron recombinadas mediante barajado in vivo del ADN (del inglés “in vivo DNA shuffling” y/o mediante ensamblaje in vivo de librerías mutagénicas con diferente espectro mutacional (IvAM, del inglés “in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra”) (Okkels, 2004. Enzyme functionality: design, engineering, and screening, A. Svendsen, ed. (NewYork: Marcel Dekker, Inc.). 413-424; Zumárraga et al., 2008. Proteins 71, 250-260).Para aumentar el número de entrecruzamientos entre los insertos sin comprometer la eficiencia de transformación, se chequearon varias regiones solapantes con baja homología respecto al vector linearizado.Las tasas mutacionalesse ajustaronde formaque aproximadamente1-3aminoácidospor proteínadefusión fueran introducidos,de media,por cada ciclodeevolución(TracewellyArnold, 2009. Curr. Opin. Chem.Biol. 13, 3-9).
Másde 50.000 clones fueronexploradosen8ciclosdeevolucióndirigidaymutagénesis dirigida, culminandoen la selección de la última variante, el mutante OB-1, con una mejora total sobre α-PM1 de 34.000 veces (Figura 1). Con independenciadela enzimayla característica sometidaaevolución dirigida,es raro alcanzar unas mejorastan elevadas.Parecelógico pensarquelaevolución conjuntadel preprolíderdelfactor α junto con la PM1 madura para su secreción enlevadura, hayafavorecido un efecto sinérgico entre ambos polipéptidos,locualeventualmente se traduce en una mejora en la exportación de α-PM1 por el hospedador eucariota. Durante la ruta de evolución artificial (Figura 1),se caracterizarony fueron recombinados26 mutantes con mejoras entre1,3a12veces respectodel mejortipo parental correspondiente en cada ciclo.En términos generales, hasta28 posiciones diferentes fueron mutadas(9de ellas mutaciones sinónimas) a lo largo del gen de fusión α-PM1(Tabla1).De éstas,9mutacionesse encontraronen el preprolíder delfactor α ylas restantes 19 en el gen de la lacasa.
Los dos primeros ciclos de evolución se llevaron a cabo mediante PCR propensa a error con diferentes tasas mutacionalesy conADN polimerasas con distinto perfil mutacional (Figura1,Tabla1).Para aceleraraúnmásla evolución, a partir del segundo ciclo en adelante se empleó un protocolo que combinó la construcción de librerías mutantes a partir de cada parental mediante barajado in vivo del ADN. Esta estrategia produjo entrecruzamientos complejos para cada descendencia junto con la introducción de nuevas mutacionespuntuales (Figura 2). La mejor variante del quinto ciclo,el mutante 7H2, tuvo aprox.24.300veces mejor actividad que α-PM1, con una actividad totalde 1.000U/L.La caracterizaciónpreliminarde7H2 demostró una fuerte reducciónensu termoestabilidadconun descensoensuT50de aprox.5ºCcon respectoasus correspondientesparentales,los mutantes1D11y11A2(de73ºC a 68ºC, Figura 3B), lo cual estuvo relacionado con la significativa caída de actividad durante su almacenamiento en largos períodos (perdiendo aproximadamenteel30%desuactividadtras14díasa4ºC).La acumulaciónde mutaciones beneficiosas pero desestabilizantes durante la evolución es un fenómeno bien descrito(Bloom et al., 2006.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 5869-5874; BloomyArnold, 2009. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 9995-10000; García et al., 2010. Microb. CellFact.9, 17).
Para superar este problemayrecuperarla estabilidadal tiempo que permitiera tolerarla introducciónde un nuevo set de mutaciones beneficiosas, se incorporó en el sexto ciclo un screening de termoestabilidad basado en la determinacióndelaT50 (definida comola temperaturaala quelaenzima retieneel 50%de su actividad tras10 minde incubación) (García et al., 2010. Microb. CellFact.9,17; Bommarius et al., 2006. Curr. Opin. Biotech. 17, 606-610). Para esta ocasión,la librería se construyó mediante IvAM, mezclando diferentes perfilesypredisposiciones mutacionales.Lamejorvariantede termoestabilidad,16B10,recuperópartedesu termoestabilidadconunamejoraensuT50 de 3ºC (Figura3B), peroaexpensasde su actividad,la cual se redujoala mitad(de 1.000a 510 U/L) (Figura1,Tabla 1).Porotrolado,lamejorvariantedeactividadde este ciclo,elmutante6C8,todavíamejorósuactividadtotalhasta valores de 2.000 U/L mientras que retuvo una estabilidad similar a 7H2.
En este punto, estuvimos en la encrucijada de o bien continuar evolucionando para termoestabilidad a partir de 16B10 pero poniendo en peligro la actividad, o emplear el mutante 6C8 como parental e intentar resolver el problema de estabilidad “racionalmente”.
Más que enfrentarnos con el bien conocido “trueque” que normalmente surge entre la actividadyla estabilidad paramuchasmutacionespuntuales(RomeroyArnold,2009.Nat.Rev.Mol.CellBio.10,866-876), decidimosvolver a analizarel inestable mutante 7H2. Este mutante procedede uneventode entrecruzamiento entre 1D11y11A2,lo cual permitió unir las mutacionesV(α10)D,A(α87)TyV162A del mutante 11A2 con las mutaciones H208Y, A239P, S426NyA461Tdel mutante1D11 (Figura2,Tabla1).
TABLA1: Mutaciones introducidasenlaevolución dirigidadeα-PM1.+, mutación acumulada; •,nuevamutación. En sombreado se detallan las mutaciones sinónimas; con subíndices se indican el uso de codones en S. cerevisiae. *EI mutanteOB-1incorporólasdos mutaciones recuperadasS224GyD281másla mutaciónrevertidaS454F introducidas mediante mutagénesis dirigida en los ciclosdeevolución7ºy8º.
Además, 7H2 incorporó una mutación sinónima más la mutación F454S, generada por mutagénesis en combinación con barajado in vivo del ADN. Decidimos mapear esta mutación en un modelo 3D basado en la estructura cristalográfica de la lacasa de Trametes trogii(con un 97% de identidad de secuencia con la PM1). La Phe454 está localizada en una α hélice cercana al cobre del sitio T1, el lugar donde se une el sustrato reductor. De hecho, la Phe454 se sitúa al lado de uno de los ligandos de coordinación del cobre T1, la His455 que parece estar involucrada en la unión del sustrato reductorfacilitando la entrada de electrones al cobre T1 (Bertrand et al., 2002. Biochemistry 41, 73257333; Matera et al., 2008. Inorg. Chim. Acta 361, 4129-4137). La inspección del modelo sugiere que la mutación F454S permite un puentedeHadicional conla Alai61 (Figura 3A).
Parece posible que este nuevo puente deHprovoque el movimiento del segmento helicoidal donde se encuentra la His455, amplificando la distancia entre el ligando de coordinacióny el cobre T1. Este efecto incrementaría las velocidades catalíticas,pero disminuiría dramáticamentela estabilidaddelavariante.Porlo tanto,sedecidiórevertir la mutación F454S en el mutante 6C8 mediante mutagénesis dirigida. El mutante revertido generado (mutante S454F) recupero completamentesu estabilidad con unaT50 idénticaaladelos parentalesdel4ºcicloyanteriores (Figura3C). Notoriamente, mientras el mutante revertido fue 0,5 veces más débil catalíticamente (900 U/L) mostró unos valores de actividad similaresa los descritos para7H2pero siendode nuevo altamente termoestable.El efecto sinérgicode recombinar1D11y11A2,juntoconlanueva mutación beneficiosaqueaparecióen6C8(N[α23]K)sirvió para superar la pérdida de la mutación F454, que resultó ser beneficiosa pero altamente desestabilizante, en términos de mejora de actividad total.
Durante el diseño de la lacasa de alto potencial redox en S. cerevisiae,algunasdelas mutaciones descubiertasenlas fases inicialesdelaevoluciónque afectaronlaactividad fueron finalmente descartadasporel aparatode recombinación homologa de S. cerevisiae,a pesarde suspotenciales efectos beneficiosos.Enel hospedador eucariota,la probabilidad dequeuneventode entrecruzamiento suceda entredos mutacioneses directamente proporcionalal númerode nucleótidos que separa ambas mutaciones. Así, no es sorprendente que algunas mutaciones beneficiosas nofueran finalmente incorporadasenun moldequeya conteníala mutación A239P, tales comolas mutaciones S224Go D281G(Figura2). Pensamosque sería interesante rescatar estasmutacionesyprobarlas individualmenteenlavariante 6C8.La mutación S224Gfuela única mutación presente enel mutante PM1-30C(dela primera generación) produciendo una mejorade 7veces en la actividad (Figura 1). Esta variante fue de nuevo empleada como parental en eltercer ciclo para ejercer un efecto de backcrossing yasí, S224G se incorporó a la descendencia. Desafortunadamente, debido al ya mencionado entrecruzamiento entre 1D11y11A2 enel quinto ciclo,la mutación S224G finalmente se perdió. Asimismo,la mutación D281E aparecióde forma independienteen diferentes momentosdelaevolución(enlos mutantes PM1-1A2 y2G5dela primeraysegunda generación) con unas mejorasde aprox.4 veces.De nuevo,la recombinación entre 1D11y11A2 eliminóla mutación D281E del gendela lacasa. Ambas mutaciones fueron estudiadas individualmente mediante mutagénesis dirigida en el séptimo cicloy en ambos casos, la actividad total aumento sin comprometerla termoestabilidad (Figuras1,3C).Asípues,las mutaciones S224GyD281Ese incorporaron conjuntamenteal mutante revertidoenel último cicloparadarlugaral mutante OB-1.
Enun esfuerzoparalelo,tambiénhemosestadoinvolucradosenlaevolucióndirigidadeotralacasadealtopotencial redox procedente del hongo Pycnoporus cinnabarinus (Camarero et al., 2009.Patent PCT/ES2009/070516), la cual comparte el77% de identidad de secuencia con la lacasa PM1. Emulando el mismo enfoque que hemos seguido con la lacasa PM1, la secuencia señal nativa de la lacasa de P. cinnabarinusse reemplazóporel preprolíderdelfactor α,y la correspondiente proteínade fusión fue objetodevarios ciclosde mutagénesis aleatoriayrecombinación (Figura7). Unadelas mejores mutaciones encontradas durantelaevolucióndela lacasade P. cinnabarinus(P394H) se encuentra en la vecindad del cobre T1. La sustitución de una Pro por una His en la posición 394 promueve un nuevo puente deH conla Asn208que está próximaala His295, unodelosligandodel cobreT1 (Camarero et al., 2009.Patent PCT/ES2009/070516). El alineado de secuencias de la lacasa PM1 con la lacasa de P. cinnabarinusíndica que la P394 pertenece a una región altamente conservada entre las lacasas de alto potencial redox (Figura 10). Por lo tanto, la mutación P394H (P393H empleando la numeración de la PM1) fue introducida en 6C8 durante el séptimo ciclo con mejoras en la actividad de hasta 3.000 U/L pero con una pérdida significativa de termoestabilidad (laT50 bajo 2ºC, Figura 3C).
Realmente desconocemos si la pérdida de termoestabilidad tras la mutación fue un efecto lateral común en ambas lacasas o si únicamente aconteció en el mutante 6C8. De hecho, no se pudo realizar un análisis de termoestabilidad en la lacasa de P. cinnabarinusya que la P394H fue introducida en el primer ciclo, cuando los niveles de expresión eran virtualmente indetectables (Figura7).Teniendoen cuentaque nuestro principal objetivo erael diseñar unaHRPL altamente activayestable,y apesardela mejoraen actividad,la mutación P393Hnofue finalmente incorporadaen el último mutante, la variante OB-1.
La secuencia señal preprolíder delfactor α codifica un polipéptido de 83 aminoácidos delcual los 19 primeros residuos constituyenel prelíder que dirigeel polipéptido en creación haciael retículo endoplasmático (RE).Tras entrar enelRE,elprelíderes escindidoporunapeptidasadejandounapro-proteína.Enestepunto,lasN-glicosilacionesde tres residuosde asparaginafacilitanel tránsitodelapro-proteínadelREal aparatode Golgi.Enel Golgi,el prolíder puede actuar como chaperona hasta que es procesado por las proteasas KEX1, KEX2 ySTE13 (Romanos et al., 1992. Yeast8,423-488; Shuster, 1991.Curr.Opin. Biotech.2,685-690).Además,elprolíderpareceestarimplicadoenun proceso de señalado vacuolar, que es perjudicial para la secreción heteróloga (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng.103, 1192-1201).Hasta8mutaciones,(3 sinónimas) fueron introducidasenel preprolíderdelfactor α durante la evolución de la α-PM1 aunque únicamente las mutacionesV[α10]D,N[α23]K,A[α87]Tyla mutación sinónima G[α62]Gse conservaronenla últimavariante mutante OB-1.V[α10]D se localiza en el dominio hidrofóbico del prelídereinteresantemente, unadelas mejores mutaciones encontradas durantelaevolucióndela lacasade P. cinnabarinus fusionada con el preprolíder delfactor α fue también descubierta en este dominio (mutaciónA[α9]D, Figura 7). Se ha descritoquelas mutacionesenlapre-región pueden afectarel señaladoenelREylasecreción (Romanos et al., 1992.Yeast8, 423-488).El papelde estas dos mutaciones consecutivas enel tráficode lacasa fue testado mediante la construcciónde mutantes individuales, doblesy revertidos a partir del mutante 6C8 duranteel séptimo ciclode evolución (Tabla 2).
TABLA2
Mejorasde actividad para los mutantes en las posiciones9y10 delprelíder del factor α. Los mutantes fueron construidos empleando el mutante 6C8 como tipo parental
Los datosexperimentales indicanquela mutaciones individuales,A[α9]DyV[α10]D, ejercen una clara mejoría en la secreción aunque no cuando son combinadas: la hidrofobicidad de este dominio es entonces disminuida drásticamente.
Es bien sabido que la mayoría de las alteraciones que reducen la eficiencia de translocación están relacionadas con el descenso general en la hidrofobicidad de este dominio (Romanos et al., 1992.Yeast8, 423-488). Suponemos que los cambiosindividualesenlos residuos carboxílicoscargadosenlasposiciones9o10del preprolíderdelfactor α podrían afectar positivamente la interacción entre el péptido señalyla partícula de reconocimiento de señal involucrada en orientare insertarla cadena polipeptídicadela lacasaenla bicapadelamembranadelRE(NothwehryGordon,1990. BioEssays12, 479-484;BoydyBeckwith, 1990.Cell62, 1031-1033).La mutaciónN[α23]K aparece en el primer de los tres sitiosde Asn-glicosilación del prolíder (Romanos et al., 1992). Aunque no es absolutamente necesario para la secreción, tales glicosilaciones podríanfacilitar el transporte del RE al Golgi (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng. 103, 1192-1201). Sin embargo, nuestros resultados no apoyan esta hipótesis ya que tras la eliminación del sitio de glicosilación en el sexto ciclo de evolución (generando el mutante 6C8) se mejoró la secreción.
Finalmente, la mutación A[α87]T se encontró en el sitio de procesado para STE13, una dipeptidil aminopeptidasa que elimina los residuos espaciadores (Glu/Asp-Ala)2 en el amino terminalentre el prolíder delfactor α yla lacasa PM1 madura.Trasla mutación,los residuos espaciadores proporcionanun ambiente inclusomás hidrofílicoaladiana del sitio de restricción para la KEX2 (Lys-Arg),lo cual podría afectarala secrecióndela lacasa madura(Brake, 1990. Meth Enzymol 185, 408-421).
Encada generación,los fragmentosdePCRselavaron, concentraronycargaronenungeldeagarosadebajopunto de fusión, tras lo cual se purificaron usando el kit Zymoclean gel DNA recovery (Zymo Research). Los productos de PCRse clonaronbajoel controldel promotorGal1delvectordeexpresión pJRoC30,reemplazandoelgen nativo presente en el mismo. Para eliminar el gen nativo, el plásmido pJRoC30 fue linearizado con XhoIy BamHIy el plásmido lineal fue concentradoypurificado del mismo modo que se describió arriba para los fragmentosde PCR.
Se prepararon tres librerías independientes con distintas ADN polimerasasybajo diferentes tasas mutacionales. La primera librería mutagénica(∼15.000 mutantes) se construyó conel kit GenemorphIajustandola tasa mutacional a 1,1-3,5 mutaciones por kb. La segundaylatercera librería(∼15.000 mutantes cada una) fueron construidas con el kit GenemorphII ajustandola tasa mutacionala0-4,5y4,5-9mutacionesporkb, respectivamente.LaPCR propensa a error se llevó a cabo en un termociclador de gradiente (Mycycler, BioRad, USA)usando los siguientes parámetros: 95ºC durante2min(1ciclo);94ºC durante0,45min,53ºC durante0,45min,74ºC durante3min(28ciclos);y74ºC durante 10 min (1 ciclo). Los cebadores usados para la amplificación fueron: RMLN directo (SEQ ID NO: 17) (5CCTCTATACTTTAACGTCAAGG-3’, que se une a las pb 160-180 del pJRoC30-αPM1)yRMLC inverso (SEQ ID NO:18) (5’-GGGAGGGCGTGAATGTAAGC-3’,quese unealaspb2028-2048del pJRoC30-αPM1).Para promover la ligación in vivo, se diseñaron fragmentosde40y66pb homologasalvector lineal. Los productosde PCR (400 ng) se mezclaron con el vector linerarizado (100 ng) y se transformaron en células competentes usando el kit de transformación en levadura de Sigma. Las células transformantes se sembraron en placas SCy se incubaron durante 3díasa 30ºC.Las colonias conelvector completode replicación autónomase picaronysesometieronaensayosde screening, así como a re-screenings adicionales. Del primer al quinto ciclo de evolución las librerías se exploraron de caraa encontrar mejoras ende actividad,ya partir del sexto ciclo, se incorporó un ensayode termoestabilidad.
La segunda generación se realizó por PCR mutagénica con la ADN polimerasa MutazymeIyusando el mutante PM1-60 como parental.La tasa mutacional se ajustóa2,1-3,5 mutacionesporkbyla librería mutagénica(∼1.000 mutantes) se preparó como se describió para la primera generación.
Las mejores variantes de la segunda generación (3E1, 10D2, 2G5 y 4C2) se sometieron a amplificación con Taq/MnCl2 y recombinación por barajado in vivo del ADN(∼1.000 clones). El mutante PM1-30C de la primera generación también fue incluido como parental para backcrossing. Las amplificacionesTaq/MnCl2 se prepararon en un volumen final de 50 µL conteniendo 90 nM RMLN, 90 nMRMLC, 0,1 ng/µLtemplate, 0,3 mM dNTPs (0,075 mMdecada uno),3%DMSO,1,5mMMgCl2,0,05U/µLTaq polimerasa. Seprobaron diferentes concentraciones de MnCl2 para estimar la tasa mutacional adecuada, obteniendo 0,01 mM como la concentración final,yla PCR se realizó igual que en las generaciones anteriores. Se diseñaron varias áreas de solapamiento, con un tamaño variable desde5 a70pb, para aumentarel númerode entrecruzamientos sin comprometerla eficienciadela transformación. Los productosde PCR se mezclaron en cantidades equimolaresy se transformaron junto conelvector linearizado en lalevadura (ratio productosPCR:vector, 4:1).
Lasmejoresvariantesdela tercera generación(5G3,7D2,9H4,4E12,4B8,8G8y11B3)se sometieronaamplificación conTaq/MnCl2yrecombinación por barajadoin vivo del ADN(∼1.000 clones) como se describió para la tercera generación.
Lasmejoresvariantesdela cuarta generación(1D11,11A2,y7F2)se sometierona amplificaciónconTaq/MnCl2 yrecombinación por barajadoin vivo del ADN(∼1.000 clones) como se describió para la tercera generación.
Se construyó una librería de ∼1.300 clones por ensamblaje de librerías mutantes IvAM (Zumárraga et al., 2008. Proteins 71, 250-260). El mutante 7H2 se utilizó como parental,ylas libreríasTaq/MnCl2yMutazima se mezclaron en cantidades equimolares,y se transformaron en célulasde S. cerevisiae competentes junto con el vector linearizado taly como se describió arriba (ratio librería:vector, 8:1).A partir de esta generación se incorporó un screening de termoestabilidad (véase más adelante).
La séptimayoctavageneración se obtuvieron por mutagénesis dirigida usando “in vivo Overlap Extension” (IVOE) (Alcalde, 2010. In vitro Mutagenesis Protocols,J. Bramman,ed.(Totowa,New Jersey,US: Humana Press).Se realizaron simultáneamente dos reacciones de PCR para amplificar los dos fragmentos de ADN que superponen en posiciones específicas correspondientesalasregiones objetivode mutagénesis dirigidaenla secuenciaparental.Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen final de 50 µLconteniendo 0,25µMde cada cebador, 100 ng de molde, 0,25 mM decadadNTP,3%DMSOy2,5 UnidadesdelaADN polimerasaPfu-Ultra.Las condicionesdelaPCRfueronlassiguientes:95ºC durante2min(1ciclo);94ºC durante0,45min,55ºC durante0,45min,74ºC durante2min(28 ciclos); y74ºC durante10 min(1 ciclo). Losfragmentosde PCR se cargaron en gelesdeagarosade bajo puntode fusiónyse purificaron usando el kit “Zymocleangel DNA recovery”. El plásmido pJRoC30 fue linearizado con XhoIyBamHIy elvector linearizadose purificó comose describió arriba paralos fragmentosdePCR.Los fragmentosdePCR(400 ngdecadauno)se mezclaronconelvector linearizado(100ng,8:1ratio productoPCR:vector)yse transformaronen células de levadura competentes como se describió anteriormente. En promedio, se analizaron 50 clones individuales por mutación. Los plásmidos seleccionados fueron aisladosysecuenciados paraverificarla mutagénesis dirigida.
Los siguientes mutantes se construyeron usando la variante 6C8 como parental:
Mutante revertido S454F: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN y DEL-REV (SEQ ID NO: 19) (5’cgtgaacccagcctcaaggtgGAAgtcgatgtggcagtggagg-3’ que se une en pb 5’-1823-1866-3’ del pJRoC30-αPM1). Los cebadoresparalaPCR2fueron: DEL-FOR(SEQIDNO:20) (5’-cctccactgccacatcgacTTCcaccttgaggctgggttcacg-3’que se une en pb 5’-1823-1866-3’ delpJRoC30-αPM1)yRMLC.
Mutante S224G:Los cebadoresparalaPCR1fueron:RMLNy5-S315G-REV(SEQIDNO:21) (5’-gtctggggcttga gattcacGCCgtccgcctcgatgacg-3’ que se une en pb 5’-1136-1174-3’ del pJRoC30-αPM1). Los cebadores para la PCR 2fueron:5’-S315G-FOR(SEQIDNO:22)(5’-cgtcatcgaggcggacGGCgtgaatctcaagccccagac-3’quese uneenpb5’1136-1174-3’ del pJRoC30-αPM1)yRMLC.
Mutante D281E:Los cebadoresparalaPCR1fueron:RMLNy4-D372E-REV(SEQIDNO:23) (5’-gctcaacgggcg cagcaccTTCgtagcgaaggatggc-3’ que se une enpb5’-1308-1344-3’ del pJRoC30-αPM1).Los cebadoresparalaPCR2 fueron: 4-D372E-FOR (SEQID NO:24) (5’-gccatccttcgctacGAAggtgctgcgcccggttgagc-3’ que se une enpb 5’-16391678-3’ del pJRoC30-αPM1)yRMLC.
Mutante P393H:Los cebadoresparalaPCR1fueron:RMLNy3CP484HREV(SEQIDNO:25) (5’-gcaagtggaagg ggtgGTGgaagccgggggcggcggagg-3’ que se une en pb 5’-1639-1678-3’ del pJRoC30-αPM1). Los cebadores para la PCR2fueron: 3CP484HFOR(SEQID NO:26)(5’-cctccgccgcccccggcttcCACcaccccttccacttgc-3’que se une enpb 5’-1639-1678-3’ del pJRoC30-αPM1)yRMLC.
Mutante A[α9]D:Los cebadoresparalaPCR1fueron: RMLN-2(SEQIDNO:27) (5’-ggtaattaatcagcgaagc-3’que se une enpb5’-5-24-3’ del pJRoC30-α)y1C-REVDI (SEQ ID NO: 28) (5’-gaggatgctgcgaataaATCatcagtaaaaattgaagg3’ que se une en pb 5’-219-257-3’ del pJRoC30-αPM1). Los cebadores para la PCR2fueron: 1C-FORDI (SEQ ID NO: 29) (5’-ccttcaatttttactgatGATttattcgcagcatcctc-3’ que se une en pb 5’-219-257-3’ del pJRoC30-αPM1)yRMLC.
Doble mutanteA[α9]D-D[α10]V: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN-2 y 1C-PREALREV (SEQ ID NO:30)(5-gaggatgctgcgaaAACATCatcagtaaaaattgaagg-3’quese uneenpb 5’-219-257-3’del pJRoC30-αPM1). Los cebadores para la PCR2 fueron: 1C-PREALFOR (SEQ ID NO: 31) (5’-ccttcaatttttactGATGTTttattcgcagcatcctc-3’ que se une enpb 5’-219-257-3’del pJRoC30-αPM1)yRMLC.
Mutante revertido D[α10]V: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN-2 y 1C-PREALDOBREV (SEQ ID NO: 32) (5’-gaggatgctgcgaaAACatcatcagtaaaaattgaagg-3’ que se une en pb 5’-219-257-3’ del pJRoC30-αPM1). Los cebadores para la PCR2fueron: 1C-PREALDOBFOR (SEQ ID NO: 33) (5’-ccttcaatttttactgatGTTttattcgcagcatcctc3’ que se une en pb 5’-219-257-3’ del pJRoC30-αPM1)yRMLC.
El mutante OB-1 se obtuvo por introducciónde las mutaciones S224GyD281E enel mutante revertido S454Fde la 7ªgeneración. Los cebadores para la PCR1 fueron: RMLNy5-S315G-REV. Los cebadores para la PCR2 fueron: 5-S315G-FORy4-D372E-REV. Los cebadores parala PCR3 fueron: 4-D372E-FORyRMLC.
Todos los codones sometidos a mutagénesis dirigida están subrayados.
Los screenings de actividadytermoestabilidadse realizaronen formato sólidoylíquido(en placasde96 pocillos). Los mutantes seleccionados fueron producidosypurificados como se describe más adelante.
Modelado de la Proteína
Enla basede datosde proteínas “Protein Data Bank” se llevóa cabo unabúsquedade proteínas con homología estructural respectoala lacasa PM1.La proteínamás similaralaPM1fuela lacasade Trametes trogii,cuya estructura cristalográficaestá resueltaconuna resoluciónde1,58 A˚ytieneun97%de identidadde secuencia(PDBid:2hrgA) (Matera et al., 2008. Inorg. Chim. Acta 361, 4129-4137). Se generó un modelo por medio del servidor para el modelado deproteínas Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)y se analizó con DeepView/Swiss-PdbViewery PyMol Viewer.
Ejemplo3
Caracterización del mutante OB-1
El último mutante obtenido,lavarianteOB-1, fue purificadoa homogeneidadycaracterizado bioquímicamente (Tabla 3, Figuras 4 y 8). La actividad específica del mutante OB-1 fue de 400 U/mg y presentó unos niveles de secreción de ∼8mg/L. La masa molecular de OB-1 fue estimada por espectrometría de masas MALDI-TOF en 60.310 Da, 3.690Da por debajo del peso molecular parala lacasa nativaexpresada porel basidiomicetoPM1 (Coll et al., 1993. Appl.Environ. Microb.59, 2607-2613) (Figura8).La masa molecular determinadaapartirdela composiciónde aminoácidosdeOB-1fue 53.284Dayla contribuciónala glicosilación deducidaapartirdelpatrónde desglicosilación fue entorno al 10% (Figura 8).
TABLA3
Cinéticas para la lacasa evolucionada
Nuestros resultadosdeevolución dirigidaen S. cerevisiae de las lacasas de P. cinnabarinus(PcL) (Camarero et al., 2009.Patent PCT/ES2009/070516)yde la lacasa M. thermophila (MtL) (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69, 987-995; Zumárraga et al., 2007. Chem. Biol. 14, 1052-1064) fueron bastante diferentesy al contrario que la variante OB-1, los mutantes de PcLyMtL fueron hiperglicosilados con residuos de azúcar que contribuyeron alrededor del 50% del peso molecular total.Ya que en el aparato de Golgi es donde se produce la compleja adiciónde cadenas periféricas de carbohidratos mediante la incorporación de residuos de mañosa, la hiperglicosilación puede ser considerada como una consecuencia de tiempos de residencia más largos en este compartimento celular. Suponemos que nuestro mutante evolucionado es fácilmente secretado por S. cerevisiae mientra que otras lacasas heterólogas experimentan serias dificultades para salir del Golgi. Los perfilesdepH para compuestos fenólicosy no fenólicos no se vieron alterados significativamente durantelaevolución,porloqueOB-1ylasvariantespreviasdel procesoevolutivo mostraron similaresvaloresdepH (aproximadamente4,0y3,0paraDMPyABTSrespectivamente,Figuras4A,4B). Los parámetros cinéticos se valoraron con sustratos clásicos frecuentemente usados para caracterizar lacasas (Tabla 3). Las cinéticas de OB-1 fueron ∼4a6veces mejoresquelas descritasparalas lacasas altamente relacionadasdeTrametes C30y Trametes trogii, que comparten99y97%de identidadde secuencia conla lacasaPM1, respectivamente (Klonowska et al., 2002. Eur. J. Biochem. 269, 6119-6125; Colao et al., 2006. Microb. CellFact.5, 31). Notablemente, tras8ciclosdeevoluciónla termoestabilidaddel mutanteOB-1 seconservó 100%, convaloresdeT50de ∼73ºC. La lacasa PM1 pertenece al grupo de lacasas de alto potencial redox aisladas de la región oeste del Mediterráneo, junto con las lacasas de T. troggi,TrametesC30y Coriolopsis gallica.Todas estas lacasas de alto potencial redox comparten unelevado gradode identidadde secuencia (superioral97%)ysimilarescaracterísticas bioquímicas, incluyendoen todos los casos una elevada termoestabilidad (Colao et al., 2003. Appl. Microbiol. Biot. 63, 153-158; Hilden et al., 2009. Biotechnol. Lett.31, 1117-1128).Paraevaluar adicionalmentela termoestabilidadde nuestralacasaevolucionada, se comparó con una batería de lacasas de alto potencial redox de diferentes procedencias (Figura 4C). LaT50 del mutante OB-1fue mayor que las de las lacasas de alto potencial redox de Trametes hirsuta,Trametes versicolor,
P. cinnabarinus,o Pleurotus ostreatus ycomose presumía, similaralaT50de Coriolopsis gallica (con un 96% de identidadde secuencia conlaPM1, Figura10).La estabilidaddeOB-1fue adicionalmenteevaluadaen presenciade altas concentracionesde cosolventes orgánicos con diferentes polaridadesynaturaleza química (Figura 4D). Como era de esperar de una enzima altamente termoestable (Zumárraga et al., 2007), la lacasa evolucionada PM1 fue altamente toleranteala presenciade cosolventes (reteniendo entre un30a un 90%de su actividad tras4hde incubación en concentraciones de cosolventes tan altas como 50% (v/v)). La estabilidad de la lacasa evolucionada a diferentes valoresdepHs fue tambiénevaluada, manteniendo cerca del 90%de su actividad enel intervalodepH 3-9 tras4hde incubación (Figura 4E).
La últimavarianteOB-1 acumuló15 mutaciones:5 enla secuencia preprolíder delfactor α (dos sinónimas),y10 enla proteína madura(3 sinónimas).Tresde las cinco mutaciones sinónimasfavorecieronel usode codones(Tabla 1),lo cual puede ser unfactor potencial para beneficiarel rendimientodela secreción afectandoalavelocidadde elongación (Romanos et al., 1992.Yeast8,423-488).Las mutaciones beneficiosasenla lacasa madurase mapearon básicamente en residuos más bien accesibles, algunos localizados lejos de los cobres catalíticos mientras que otros aparecieron enlavecindadde los sitios catalíticos(laTabla4ylas Figuras5,9 resumen las característicasde estos cambios en la estructura de la lacasa mutante).
En particular, las mutaciones V162A, S426NyA461T están enlavecindad del cobreT1.LaVal162 es unode los residuos hidrofóbicos en el lazo que delimita la cavidad del bolsillo de sustrato del sitio T1 (Bertrand et al., 2002. Biochemistry41, 7325-7333).El cambiodeValaAlaen esta posición representala sustitucióndeun residuo hidrofóbicoporotroquetambiénloesperomás pequeño,locualpodríafavorecerlaunióndel sustrato (Figuras5A, 5B).La Ser426 está unidamedianteun puentedeH ala Gly428pero trasla mutaciónel puentedeH se interrumpe yla Asn426 resultante establece un nuevo puentedeHconla Thr427adyacente.A consecuenciade este efecto,la Thr427 se encuentra doblemente unida a la His394 que es ligando del cobre T1, por lo que este cambio podría afecta la posición relativadelaHis394 respectodel sitioT1 (Figuras5A,5B).
La Ala461es adyacenteala Phe460,que constituyela posicióndel cuartoligando axialen lacasasdeplantasy bacterianas (Alcalde, 2007. Industrial Enzymes: Structure, functions and applications, J. Polaina and A.P. MacCabe, eds. (Dordrecht, The Netherlands: Springer) 459-474),yestablece puentes de hidrógeno con los ligandos del cobre T1,His455yCys450.LamutaciónA461Tparece generarunnuevopuentedeHconlaPhe460,locualpodríacambiar la geometría local del sitio T1 (Xu et al., 1998. Biochem. J. 334, 63-70), Figuras 5A, 5B.
La mayoría de las mutaciones beneficiosas restantes (H208Y, S224G, A239P, D281E) fueron localizadas lejos de los cobres catalíticos, apareciendo en girosymotivos secundarios cuyo papel en la función de la lacasa es incierto (Tabla 4, Figuras 5C, 5D, 5E, 5F). Es altamente improbable que tales mutaciones pudieran haber sido anticipadas mediante diseño racional, sin embargo, el empleo de la evolución dirigida ha permitido descubrir la relevancia funcional de éstas regiones de la lacasa previamente desconocidas.
(Tabla pasa a página siguiente)
Por ejemplo, el Asp281 está localizado en un loop distal del dominio D2 quedando prácticamente expuesto a la superficie proteica(a unos40 A˚del sitiodel cobreT1).La substitucióndeunAspporunGluenla posición281 rompiódospuentesdeH conla Thr188y la Thr190deunbuclevecino,y produjoun nuevo puentedeH conla Gly282delmismomotivo,locualpodríaincrementarlaflexibilidaddeesta zona (Figuras5E,5F).En cualquiercaso, tampocosepuede descartarquelas mutaciones mencionadasmejorenelplegamientoyla maduracióndela lacasaen
S. cerevisiae, además de su posible contribución a la robustez final de la proteína.
Claims (23)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Polinucleótidoque codificaparael polipéptidode secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1.
-
- 2.
- Polinucleótidosegúnlareivindicación1de secuencia nucleotídicaSEQIDNO:2.
-
- 3.
- Construcción genética que comprende:
- a.
- el polinucleótido según cualquierade las reivindicaciones1ó2.
- b.
- el polinucleótidosegún cualquieradelasreivindicaciones1ó2,que además comprendeun sistemaovector deexpresión génica, operativamente enlazado con,al menos, un promotor que dirijala transcripciónde dicho polinucleótido, y/o con otras secuencias nucleotídicas necesarias o apropiadas para la transcripción in vitro o in vivo ysu regulación en tiempoylugar.
-
- 4.
- Construcción genética según la reivindicación 3, que además comprende un polinucleótido que codifica para un péptido señalquefavorecelaexpresión funcionaldel polipéptidode secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1.
-
- 5.
- Construcción genética según la reivindicación 4, donde el péptido señal es el del factor α evolucionado de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9.
-
- 6.
- Construcción genética según cualquierade las reivindicaciones4ó5, dondeel polinucleótido que codifica para el péptido señal es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 10.
-
- 7.
- Construcción genéticasegún cualquieradelasreivindicaciones4-6,que comprendeunpolinucleótidoque codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.
-
- 8.
- Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4.
-
- 9.
- Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones3-8, donde entre la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido señal delfactor α yla secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1,se encuentrala secuencia nucleotídicaque codificaparalos aminoácidosácidoglutámico yfenilalanina.
-
- 10.
- Construcción genética según la reivindicación9que comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5.
-
- 11.
- Construcción genética según cualquierade las reivindicaciones9 o10 que comprendeel polinucleótidode secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 6.
-
- 12.
- Célula hospedadora que comprende un polinucleótido según cualquierade las reivindicaciones1ó2,o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 3-11.
-
- 13.
- Célula hospedadora según la reivindicación 12, que es una levadura.
-
- 14.
- Célula hospedadora según la reivindicación 13, que pertenece al género Saccharomyces.
-
- 15.
- Célula hospedadorasegún cualquieradelasreivindicaciones13ó14que perteneceala especie Saccharomyces cerevisiae.
- 16. Lacasa de alto potencial redox que comprende el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
-
- 17.
- Lacasa de alto potencial redox según la reivindicación 16 que además comprende los aminoácidos ácido glutámicoyfenilalaninaenelextremo aminodel polipéptido,cuya secuencia aminoacídicaesSEQIDNO:7.
-
- 18.
- Lacasa de alto potencial redox según cualquiera de las reivindicaciones16ó17, que además comprende los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal delfactor α (ácido glutámico, treonina, ácido glutámico, alanina) en el extremo amino del polipéptido, cuya secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 8.
-
- 19.
- Método de obtención de una lacasa de alto potencial redox según se describe en las reivindicaciones 16-18, que comprende:
- a.
- cultivarla célula hospedadora según cualquierade las reivindicaciones 12-15,y
- b.
- purificar la lacasa.
-
- 20.
- Usode los polinucleótidos según cualquierade las reivindicaciones1ó2 ode las construcciones genéticas según cualquierade las reivindicaciones 3-11 parala obtenciónde una lacasade altopotencial redox.
-
- 21.
- Uso de la célula hospedadora según cualquiera delas reivindicaciones 12-15 para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
-
- 22.
- Cultivo celular que comprende las células hospedadoras según cualquiera de las reivindicaciones 12-15.
-
- 23.
- Uso del cultivo según la reivindicación 22 para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
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