JP2020505942A - フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、増強した触媒活性、ならびにタンパク質分解に対する低下した感受性および高温での貯蔵に対する増加した耐性をもたらすように最適化される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、野生型ＰＡＬポリペプチドより少ないフェニルアラニン残基を含有する。本発明はまた、治療および工業目的での操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物の使用の方法も提供する。

Description

本出願は、２０１７年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／５６５，５５５号および２０１７年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／４５８，２３２号の優先権を主張し、その両方の全体が、全ての目的のため参照により援用される。
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリスト付録の参照
サイズ４４キロバイト、マシンフォーマットＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティングシステムで２０１７年２月１０日に作成された、ファイルＣＸ７−１５９ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ＴＸＴに書かれた配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、増強した触媒活性、ならびにタンパク質分解に対する低下した感受性および高温での貯蔵に対する増加した耐性をもたらすように最適化される。一部の実施形態では操作されたＰＡＬポリペプチドは、より少ないフェニルアラニン残基を含有する。本発明はまた、治療および工業目的での操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と共に、芳香族アミノ酸リアーゼファミリーのメンバーである（ＥＣ４．３．１．２３〜１．２５および４．３．１．３）。より詳細には、ＰＡＬ活性を有する酵素（ＥＣ４．３．１．２３〜１．２５および以前にＥＣ４．３．１．５として分類された）は、Ｌ−フェニルアラニンの（Ｅ）−ケイ皮酸への非酸化的脱アミノ化を触媒する。ＰＡＬは、植物において広く分布し、真菌および限られた数の細菌でも同定されている非哺乳動物酵素である。
ＰＡＬ酵素は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）としてより公知の代謝障害、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症（ＰＡＨＤ）の処置に治療用タンパク質として使用することができる。ＰＫＵは、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、または補因子テトラヒドロビオプテリンの合成もしくはリサイクルに関与する１つもしくは複数の酵素が、対応する遺伝子の変異のために部分的に機能するまたは機能しない、常染色体代謝性遺伝障害である。機能性のこの欠如は、血流中のフェニルアラニンレベルの上昇をもたらす。変異のタイプに応じて、ＰＫＵ患者の血流中のフェニルアラニン濃度は、典型的には＞３６０μＭとなる。フェニルアラニンは、フェニルピルビン酸（フェニルケトン）および他の誘導体へ変換される。ヒトでは、ＰＫＵが早期に処置されない場合、高レベルのフェニルアラニンおよびその分解生成物の一部が、知的障害、小頭症およびてんかん発作を含む重大な医学的問題を引き起こす可能性がある。数多くの研究が、酵素置換によるＰＫＵの処置におけるＰＡＬの使用に着目している（Ａｍｂｒｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１巻：８３７〜８３９頁［１９７８年］；Ｂｏｕｒｇｅｔら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：５７〜５９頁［１９８４年］；およびＳａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６巻：２３３９〜２３４４頁［１９９９年］）。
Ａｍｂｒｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１巻：８３７〜８３９頁［１９７８年］ Ｂｏｕｒｇｅｔら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：５７〜５９頁［１９８４年］ Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６巻：２３３９〜２３４４頁［１９９９年］
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、増強した触媒活性、ならびにタンパク質分解に対する低下した感受性および高温での貯蔵に対する増加した耐性をもたらすように最適化される。一部の実施形態では操作されたＰＡＬポリペプチドは、より少ないフェニルアラニン残基を含有する。本発明はまた、治療および工業目的での操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。一部の実施形態では、本発明は、貯蔵安定性の向上および／またはタンパク質分解に対する低下した感受性などの改善された特性を有する、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドならびに生物学的に活性なその断片および類似体に関する。
本発明は、基本的に同じ条件下で野生型ＰＡＬ酵素または参照ＰＡＬポリペプチドと比較された場合に改善された特性を有する、操作されたＰＡＬポリペプチドならびに生物学的に活性なその断片および類似体に関する。本発明はさらに、治療用および／または工業用組成物において操作されたＰＡＬポリペプチドならびに生物学的に活性なその断片および類似体を使用する方法、ならびに治療および／または工業目的でそのような組成物を使用する方法に関する。
本発明は、配列番号４、６、８、１０、および／または１２の少なくとも１つに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列または参照配列として指定された別のアミノ酸配列を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４、６、８、１０、および／または１２の少なくとも１つに対して少なくとも８５％またはそれよりも多い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列または参照配列として指定された別のアミノ酸配列を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４、６、８、１０、および／または１２の少なくとも１つに対して少なくとも９０％またはそれよりも多い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列または参照配列として指定された別のアミノ酸配列を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４、６、８、１０、および／または１２の少なくとも１つに対して少なくとも９５％またはそれよりも多い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列または参照配列として指定された別のアミノ酸配列を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４、６、８、１０、および／または１２の少なくとも１つに対して少なくとも９８％またはそれよりも多い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列または参照配列として指定された別のアミノ酸配列を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４、６、８、１０、および／または１２の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列または参照配列として指定された別のアミノ酸配列を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドを提供する。
本発明はまた、１６、１６／１５０、４４／５６、４４／５６／１０２／２３９／２８５／４６９／４７０／４９５、４４／２３９、４４／２３９／２８５／４６９／４９５、４４／２３９／２８５／４７０、４４／２３９／４６９／４７０、４４／２３９／４７０／５４６、４４／２３９／４９５、４４／２３９／４９５／５４６、４４／４６９／４７０、１０２、１０２／４７０、１６２、１６５、１８８、２３９／２８５、２３９／２８５／４６９、２３９／４６９／４７０／４９５、２６４、２６７、２８５／４６９／４７０／４９５、２８５／４７０、２８５／４７０／４９５、３６４、４５５、４６９／４７０、４７２、および４８２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、アミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドも提供する。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、１６、２６４、３６４、４７２、４８２、および／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換を含み、アミノ酸位置は配列番号６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１６、１６／１５０、１６２、１８８、２６４、２６７、３９８、４３４、４７２、および４８２、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、アミノ酸位置は配列番号６を参照して番号付けされる。
本発明はまた、４４／４７／２０４／２０９／２８５、４４／４７／３６４／４７０／４９５、４４／５４／５６／２０４／２３９／２８５／３６４／４９５、４４／５４／５６／２０４／２３９／４７０／４９５、４４／５４／２８５／４７０、４４／１０２／２８５／３６４、４４／２０４／２０９／２８５、４４／２０４／２８５／３６４／４７０／４９５、４４／２０９／２８５／４６０／４９５、４４／２８５／３６４、４７／５４／２０９、４７／２０４／２０９／２３９／２８５／４９５、４７／２０４／２８５／３６４／４９５、４７／２０９／２３９／３６４、４７／２３９／２８５／３６４、４７／４７０、５４、５４／５６、５４／５６／２０４／２０９／４７０、５４／５６／２０４／２０９／４９５、５４／５６／２０４／４９５、５４／５６／２０９／５６２、５４／５６／２８５／３６４／４７０、５４／５６／２８５／４７０、５４／１６５／２０４／２０９／２３９／２８５／４７０／４９５、５４／２３９／４９５、５４／２８５／４７０、５４／４７０、５６、１６５、２０４、２０４／２０９／２３９／２８５／４７０／４９５、２０４／２０９／３６４、２０４／２０９／３６４／４９５、２０４／２３９、２０４／２３９／２８５、２０４／３６４、２０４／４７０、２０９／２８５／３６４／４７０、２０９／２８５／３６４／４７０／４９５、２０９／３６４、２０９／３６４／４９５、２０９／４７０、２３９／３６４、２８５／３６４、２８５／３６４／４９５、３６４、３６４／４７０、４７０、および４９５、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、アミノ酸位置が、配列番号８を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドも提供する。
本発明はまた、５４／５６／１６２／２０４／２８５、５４／５６／１６２／２０４／３９８、５４／５６／２０４／２８５、５４／５６／２０４／３９８、５４／５６／２０４／３９８／４７２、５４／５６／２８５、５４／５６／３９８、５４／５６／３９８／４７２、５４／１６２／２０４／３９８、５４／１６２／３９８、５４／２０４／２８５／３９８／４７２、５４／２０４／３９８、５４／２８５／３９８、５４／２８５／３９８／４７２、５６／１６２／３９８、５６／２０４／２８５、５６／２０４／３９８、５６／２０４／３９８／４６０、５６／２０４／３９８／４７２、５６／２８５、５６／２８５／３９８／４７２、５６／３９８、５６／３９８／４７２、および２０１／２０４／３９８、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、アミノ酸位置が、配列番号１２を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドも提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１６、１８、３９、４７、５４、５９、７３、９１、２０９、２１４、２８５、２９０、３０５、３０７、３６４、４０７、４５０、４７０、５０３、５２１、５２４、および５６５、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、アミノ酸位置は配列番号１２を参照して番号付けされる。
本発明はまた、１５／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／１９／２１４／４０７、１６／１８／２３／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４３／４４／５９／２０９／５０３／５６５、１６／１８／３９／４５／４７／５４／５９／７３／９８／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／４９／５４／５９／７３／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３１３／３６４／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／５０３、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／９８／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／７３／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／９１／２１４／２８５／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、１６／１８／３９／４７／５４／２０９／２１４／４０７／５０３／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５９／７３／９１／２１４／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、１６／１８／３９／４７／５９／２１４／５０３／５６５、１６／１８／３９／４７／９１／２９０／４０７、１６／１８／３９／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／５４／５９／７３／２０９／２１４／２８５／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／５９／７３／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／７３／９１／２０９／２１０／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／５４／７３／９８／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／７３／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／９１／２１４／２８５／２９０／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／９１／５０３／５２１、１６／１８／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２８５／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５４／５９／７３／９８／２０９／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５４／５９／７３／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５９／２８５／４０７／４５０／５６５、１６／１８／４７／７３／９１／２０９／２８５／２９０／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／４７／７３／２１４／３０７／５０３、１６／１８／４７／７３／２９０／４０７／４５０、１６／１８／４７／２０９、１６／１８／４７／２８５／３６４／５０３／５２１、１６／１８／４７／３６４／４０７、１６／１８／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１、１６／１８／５４／５９／２９０／４０７／４５０／５０３／５２４、１６／１８／５４／７３／９１／２１４／２８５／２９０／４０７／５６１、１６／１８／５４／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／５４／４０７、１６／１８／５５／２０９／２８５／３０５、１６／１８／５９／２０９／４５０／５０３／５２４、１６／１８／７３／２０９／２１４／４５０、１６／１８／９１／２０９／４０７／５０３、１６／１８／９１／２１４／４０７／５２１／５２４／５６５、１６／１８／２０９／４５０／５０３、１６／１８／２１４／４０７／４５０／５０３、１６／１８／２８５／２９０／４７０、１６／１８／５０３、１６／２２／２１４／５０３／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２９０／３０５／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５０３／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９８／２０９／２８５／３０５／３０７／４０７／４５０／４７０／５０３／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／３０７／３６４／４０７／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／２１４／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／７３／９１／２０９／
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／３６４／４０７／４７０／５０３／５２４／５６５、３９／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／５０３／５２４／５６５、３９／５９／７３／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、３９／５９／２０２／４０７／５２４／５６５、３９／５９／３６４／４５０／４７０／５６５、３９／７３／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／５２４／５６５、３９／２０９／２１４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、３９／２０９／４５０／４７０／５０３、３９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／５０３／５２１／５２４、３９／２１４／３０７／５０３／５２４、４７、４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２４／５６５、４７／５４／５９／７３／９１／２８５／２９０／３１１／３６４／４０７／５０３／５２１／５２４／５６５、４７／５４／５９／７３／９１／２８５／３０５／３０７／４０７／４７０／５２１／５２４、４７／５４／５９／７３／９８／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、４７／５４／５９／７３／２０９／２８５／２９０／３６４／４０７／４３２／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、４７／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、４７／５４／７３／９１／２８５／２９０／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、４７／５４／９１／９７／２０９／３６４／５０３／５６５、４７／５５、４７／５９／９１／４０７／４７０／５０３／５６５、４７／５９／９１／５０３／５２１、４７／５９／２０９、４７／５９／４５０／４７０／５０３、４７／７３、４７／７３／９１／２１４、４７／７３／９１／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、４７／７３／９１／２９０／４０７／４１６／４５０／５０３／５２１／５２４、４７／７３／２０９／３６４／４５０／５２１、４７／７３／２１４／３０５／３０７／３６４／５０３／５６５、４７／７３／２１４／３０５／４０７／５０３／５６５、４７／７３／２１４／３６４／４０７、４７／７３／４０７／４７０／５０３、４７／２０９／２１４／３０５／３０７／３６４／５０３／５２１／５２４、４７／２０９／５０３／５２４／５６５、４７／２１４／３６４／５０３、４７／２１４／４０７、４７／２８５／２９０／３６４／５０３／５６５、４７／３０５、４７／３６４／４０７／４７０／５２１／５２４、４７／３６４／５２４／５６５、４７／４０７、４７／４０７／４５０／５２１／５２４、４７／４０７／５６５、４７／５２４／５６５、５１／４０７／４７０／５０３／５２４、５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３６４／４０７／４７０／５０３／５２４／５６５、５４／５９／９１／２０９／４０７、５４／７３／９１／２１４／４５０／５０３／５２１／５２４、５４／７３／９１／３０５／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、５４／７３／４５０、５４／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５６５、５４／２０９／４０７／４５０／４７０／５６５、５４／２０９／４７０／５０３／５２４／５６５、５４／４５０、５４／５０３、５５／２９０／３０５／３６４／４５０／５０３、５９／７３／２９０／４０７／５０３／５５４、５９／７３／３０５／３０７／５０３、５９／９１／４０７／４５０、５９／２０９／３６４／４７０／５０３、５９／２１４、５９／２１４／３６４／４０７／４５２／５０３、５９／２１４／４５０／５０３、５９／４０７／５０３／５２１／５２４、５９／４５０／５０３、５９／５６５、７３／９１／２１４／５２４／５６５、７３／９１／５２１、９１／９７／２０９／２８５、９１／２０９／２１４／２５５／２８５／２９０／３０７／４５０、９１／２０９／２１４／３６４／４０７／４５０／４７０／５６５、９１／２０９／２１４／４０７／５０３／５６５、９１／２０９／２１４／４５０／５２１／５２４／５６５、９１／２０９／２１４／４７０／５６５、９１／２０９／４０７、９１／２１４、２０９、２０９／２１４／３０５、２０９／２１４／３０７／４０７／４５０／５０３、２０９／２１４／４０７／４５０／４７０／５０３、２０９／４７０、２１４／２８５／３０７／５０３／５６５、２１４／４０７／５０３／５６５、２１４／４７０／５０３、２１４／４７０／５２１、２９０／４７０、３０５／４０７／５２１、３６４、３６４／４０７／４１９／４５０／４７０／５２１／５６５、３６４／４０７／５６５、３６４／４７０／５０３／５２１／５２４、４０７、４０７／４５０／５６５、４０７／５０３、４５０／５０３、４５０／５２４、５０３、および５２４、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチドも提供する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓバリアント酵素である。一部のさらなる実施形態では、本発明の操作されたポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより熱安定性である。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼよりタンパク質分解に耐性を示す。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより、少なくとも１つの消化管酵素によるタンパク質分解に耐性を示す。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、および／またはエラスターゼによるタンパク質分解に耐性を示す。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより酸安定性である。さらにさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは精製されている。
本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、および／もしくは１２、またはその機能的断片に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドも提供する。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、および／もしくは１２、またはその機能的断片に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、および／もしくは１２、またはその機能的断片に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、表６．１、表７．１、表８．１、表９．１、表１０．１、表１４．１、および／または表１５．１のいずれかに記載されたバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドである。
一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓバリアント酵素である。一部のさらなる実施形態では、本発明の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより熱安定性である。一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼよりタンパク質分解に耐性を示す。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより、少なくとも１つの消化管酵素によるタンパク質分解に耐性を示す。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、および／またはエラスターゼによるタンパク質分解に耐性を示す。一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより酸安定性である。一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは精製されている。
本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドおよび／またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードする。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される操作されたポリペプチドをコードする。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結される。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列はコドン最適化される。
本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、発現ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、発現ベクターは制御配列をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、制御配列はプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは異種プロモーターである。
本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列で形質転換される。一部のさらなる実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または本明細書で提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および／または本明細書で提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたポリペプチドが産生されるように、適切な培養条件下で培養するステップを含む、操作されたポリペプチドを宿主細胞において産生する方法も提供する。一部の実施形態では、本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または本明細書で提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および／または本明細書で提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドが産生されるように、適切な培養条件下で培養するステップを含む、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを宿主細胞において産生する方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドおよび／またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを、培養物および／または宿主細胞から回収するステップをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、方法は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドおよび／またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを精製するステップをさらに含む。
本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドを含む組成物も提供する。本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを含む組成物も提供する。本発明はまた、本明細書で提供される操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを含む組成物も提供する。
本発明はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。一部のさらなる実施形態では、組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、組成物は、フェニルケトン尿症の処置に適している。一部のさらなる実施形態では、組成物は、上昇した血中フェニルアラニンの処置に適している。一部の実施形態では、組成物は、高フェニルアラニン血症の処置に適している。一部のさらなる実施形態では、組成物は、チロシン血症の処置に適している。一部のさらなる実施形態では、組成物は、上昇した血中チロシンの処置に適している。一部の実施形態では、組成物は、高チロシン血症の処置に適している。さらに一部のさらなる実施形態では、組成物は、遺伝子治療における使用に適している。一部のさらなる実施形態では、組成物は、フェニルケトン尿症、上昇した血中フェニルアラニン、高フェニルアラニン血症、チロシン血症、上昇した血中チロシン血症、および／または高チロシン血症を処置する遺伝子治療における使用に適している。さらに一部のさらなる実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ治療における使用に適している。一部のさらなる実施形態では、組成物は、フェニルケトン尿症、上昇した血中フェニルアラニン、高フェニルアラニン血症、チロシン血症、上昇した血中チロシン血症、および／または高チロシン血症を処置するｍＲＮＡ治療における使用に適している。一部の実施形態では、組成物は、ヒトへの経口投与に適している。一部のさらなる実施形態では、組成物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、液体、またはエマルジョンの形態である。一部のさらなる実施形態では、丸剤、錠剤、カプセル剤、またはゲルキャップは、腸溶コーティングをさらに含む。一部の代替の実施形態では、組成物は、ヒトへの非経口注射に適している。さらに一部のさらなる実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療有効化合物と共に投与される。一部の他の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療有効化合物を含む。
本発明はまた、対象におけるフェニルケトン尿症の症状を処置および／または防止する方法であって、フェニルケトン尿症を有する対象を用意するステップと、本明細書で提供される少なくとも１つの組成物を対象に提供するステップとを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、対象の血液中のフェニルアラニン濃度は、組成物を対象に提供すると低減する。一部のさらなる実施形態では、対象の血液中のケイ皮酸濃度は、組成物を対象に提供すると増加する。一部のさらなる実施形態では、対象におけるフェニルケトン尿症の症状が改善される。さらに一部のさらなる実施形態では、対象は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む少なくとも１つの医薬組成物を提供されていない対象に必要とされる食事よりフェニルアラニン含量が少なく制限された食事を摂ることができる。一部の実施形態では、対象は乳児であるが、一部の他の実施形態では、対象は小児であり、一部の他の実施形態では、対象は若年成人であり、さらに一部のさらなる実施形態では、対象は成人である。
本発明はまた、本明細書で提供されるいずれかの組成物の使用も提供する。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む。一部の実施形態では、単独または任意の組合せの、本明細書で提供されるいずれかの組成物。本発明が、任意の特定の使用に限定されることを意図するものではない。
図１は、プロテアーゼなしの腸液に対するＡｖＰＡＬおよびバリアント＃１２６の耐性を示すグラフである。トリプシンおよびキモトリプシンの非存在下、空腹状態模擬腸液（ＦａＳＳＩＦ）、初期摂食状態模擬腸液（ＦｅＳＳＩＦ初期）、中期摂食状態模擬腸液（ＦｅＳＳＩＦ中期）、および後期摂食状態模擬腸液（ＦｅＳＳＩＦ後期）中でインキュベーション後の、野生型ＡｖＰＡＬおよびバリアント＃１２６の残りのＰＡＬ活性が示されている。
図２は、プロテアーゼありの腸液に対するＡｖＰＡＬおよびバリアント＃１２６の耐性を示すグラフである。トリプシンおよびキモトリプシンの存在下、空腹状態模擬腸液（ＦａＳＳＩＦ）、初期摂食状態模擬腸液（ＦｅＳＳＩＦ初期）、中期摂食状態模擬腸液（ＦｅＳＳＩＦ中期）、および後期摂食状態模擬腸液（ＦｅＳＳＩＦ後期）中でインキュベーション後の、ＡｖＰＡＬおよびバリアント＃１２６の残りのＰＡＬ活性が示されている。
図３は、様々な用量のバリアント＃１２６で処置された群に関するビーグルの相対的血漿フェニルアラニンレベルを示すグラフである。わかりやすくするためにエラーバーは省略されている（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
図４は、様々な用量のバリアント１２６で処置された群に関するビーグルの血漿ＣＡレベルを示すグラフである。
図５は、様々な用量のバリアント１２６で処置された群に関する血漿レベルにおけるビーグルのケイ皮酸のＡＵＣを示すグラフである。各群対ビヒクルについて示された統計的有意（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
図６は、様々な用量のバリアント１２６で処置された群に関するカニクイザルにおける相対的血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルを示すグラフである。一部の群は、ファモチジン（−ｆａｍｏ）で前処置されなかった。
図７は、様々な用量のバリアント１２６で処置された群に関するカニクイザルの血漿中の相対的フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のＡＵＣを示すグラフである。破線は、全ての用量のバリアント１２６の平均ＡＵＣを示す（ビヒクルと組み合わされた全ての用量とのｔ検定について、＊＊：ｐ＜０．０１）。
図８Ａは、ファモチジンで前処置され、様々な用量のバリアント１２６を受けた群に関するカニクイザルにおける血漿ケイ皮酸（ＣＡ）レベルを示すグラフである。
図８Ｂは、ファモチジンで前処置されず、様々な用量のバリアント１２６を受けた群に関するカニクイザルにおける血漿ケイ皮酸（ＣＡ）レベルを示すグラフである。
図９Ａは、ファモチジンで前処置された（上）、またはファモチジンで前処置されなかった（中）カニクイザルにおける、様々な用量のバリアント１２６で処置されたカニクイザル群の０〜４時間にわたる血漿ケイ皮酸（ＣＡ）ＡＵＣを示すグラフである。
図９Ｂは、ファモチジンで前処置されなかったカニクイザルにおける、様々な用量のバリアント１２６で処置されたカニクイザル群の０〜４時間にわたる血漿ケイ皮酸（ＣＡ）ＡＵＣを示すグラフである。
図９Ｃは、ファモチジンで前処置されなかった、または投与の２時間前にファモチジンを受けた２０および２００ｍｇ／ｋｇ群の直接比較を示すグラフである（下）（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチド、その変異体、生物学的に活性な断片、および類似体、ならびにこれを含む医薬組成物および工業用組成物を提供する。
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、増強した触媒活性、ならびにタンパク質分解に対する低下した感受性および高温での貯蔵に対する増加した耐性をもたらすように最適化される。一部の実施形態では操作されたＰＡＬポリペプチドは、より少ないフェニルアラニン残基を含有する。本発明はまた、治療および工業目的での操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物の使用の方法も提供する。
血流中のフェニルアラニンを解毒する１つの方法は、注射用組換えＰＡＬおよびペグ化により修飾されたＰＡＬバリアント（ＰＥＧ−ＰＡＬ）の使用である。ペグ化は、酵素半減期を改善し、対象の抗原応答を低減することが示されている（例えば、ＷＯ２００８／１５３７７６、ＷＯ２０１１／０９７３３５、および米国特許第７，５３１，３４１号参照）。ＰＥＧ−ＰＡＬ組成物において有用なＰＡＬバリアントは、野生型Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐＰＡＬ）；Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（ＡｖＰＡＬ）およびＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ＲｔＰＡＬ）のバリアントとして記載されている。特に、６４、３１８、５０３および５６５位のシステイン残基がセリンで置換されている野生型ＡｖＰＡＬのバリアントが記載されている（例えば、米国特許第７，７９０，４３３号；第７，５６０，２６３号；および第７，５３７，９２３号参照）。
ＰＫＵ対象におけるＬ−フェニルアラニンの血漿濃度を低減する手段としてのＰＡＬ投与の代替経路は、経口製剤などの非侵襲性製剤である（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６巻：２３３９〜２３４４頁［１９９９年］）。ＰＡＬの経口送達の重要な利点は、酵素の免疫系への曝露が低減し、これにより注射用ＰＥＧ−ＰＡで観察される免疫応答を最小化することである。しかし、ＰＡＬの経口製剤の主な限界は、胃および腸の管腔における酵素活性の喪失である。有効および機能的であるためには、ＰＡＬは、酸性ｐＨ、ならびに通常、タンパク質食品をオリゴペプチドおよびアミノ酸に分解するトリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼおよびペプシンなどのプロテアーゼによる分解に抵抗しなければならない。一部の以前の研究（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ、上記を参照）では、一つにはプロテアーゼによる酵素分解、および一つにはｐＨ７．０での比較的低い比活性が原因で、ＰＡＬの経口投与の有意な効果を達成するためには大量の酵素が必要とされた。消化時のＰＡＬ分解を抑制するために様々な手段が探求されている（Ｋｉｍら、Ｍｏｌｅｃ． Ｔｈｅｒａｐ．、１０巻：２２０〜２２４頁［２００４年］；およびＳｈａｈら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．、３５６巻：６１〜６８頁［２００８年］）。
消化管の厳しい条件下でＰＡＬの有効性を高める１つのアプローチは、固有の厳しい条件に耐性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドを提供することである。Ｋａｎｇらは、ＡｖＰＡＬのキモトリプシン切断部位の部位特異的変異誘発および表面リシンのペグ化を使用して、タンパク質分解不活性化を低減した（Ｋａｎｇら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｍｅｔａｂｏｌ．、９９巻：４〜９頁［２０１０年］参照）。これらの研究では１０個の切断部位が特異的に変異され、これらの得られた変異体のうち２つ（Ｆ１８ＡおよびＲ９４Ｇ）を除く全てが、元の酵素活性の５０％超を喪失した。活性の増加を示した変異体はなく、Ｆ１８Ａ変異体がトリプシン耐性のわずかな増加を示した（Ｋａｎｇら、上記を参照）。ＰＡＬを用いたさらなる研究は、有効ではあるが、より寿命の長い酵素を概してもたらさなかった。したがって、文献に以前に記載されたＰＡＬ変異体およびその誘導体の経口投与は、ＰＫＵの有効な処置をもたらさなかった。
ＰＡＬの様々な製剤でなされた進歩にもかかわらず、経口投与用の改善された特性を有するＰＡＬポリペプチドの必要性が依然として存在する。これらの改善された特性には、より大きい半減期、増加した触媒活性、消化管中の条件および貯蔵条件に対する改善された安定性、ならびに低減した凝集が挙げられるが、これらに限定されない。
ＰＡＬ酵素は、チロシン血症Ｉ型、チロシン血症ＩＩ型、チロシン血症ＩＩＩ型、およびアルカプトン尿症などのチロシン代謝障害を処置するための治療用タンパク質としても用いることができる。チロシン代謝のこれらの障害は、チロシンの分解に関与する酵素の１つが、対応する遺伝子の変異が原因で部分的に機能性、または非機能性となる常染色体代謝性遺伝障害である。機能性のこの欠如は、血流中のチロシンおよび他のチロシン代謝産物レベルの上昇をもたらす。チロシンは、フェニルアラニンに由来するため、フェニルアラニンおよびチロシン摂取を制限することが、チロシン代謝障害を有する患者にとって有益となる。ＰＡＬ酵素は故に、チロシン代謝障害の有望な処置である。
チロシン代謝障害を有する患者が早期に処置されなければ、高レベルのチロシンおよびその分解生成物の一部が、肝不全および腎不全、肝臓がん、知的障害、ならびにさらには死亡を含む重大な医学的問題を引き起こす可能性がある。
治療用途に加えてＰＡＬ酵素は、Ｌ−フェニルアラニンおよび他の置換されたＬ−フェニルアラニン誘導体の工業的合成において使用することもできる。これらの誘導体は、次いで医薬前駆体として使用され得る（Ｇｌｏｇｅら、Ｃｈｅｍ．、６巻：３３８６〜３３９０頁［２０００年］；Ｂａｒｔｓｃｈら、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．、２３巻：９２９〜９３３頁［２０１０年］；およびＴｕｒｎｅｒ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、２３４〜２４０頁［２０１１年］）。ＰＡＬ酵素は、農業用途において使用することもできる。ＰＡＬは、植物、真菌および細菌におけるフェニルプロパノイド（フラボノイドおよびリグニンなど）の生合成において重要な役割を果たし、防御関連酵素として作用することができる（Ｂａｔｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：７６０８〜７６１２頁［１９９４年］）。ＰＡＬ活性を有する組換えポリペプチドを使用することによるＰＡＬ活性の調節は、有効な除草剤をもたらす可能性があり得る。
略語および定義：
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を一般的に有する。一般的に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は周知のものであり、当技術分野で一般に使用されている。そのような手法は周知であり、当業者に周知の数多くのテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な手法、またはその変形形態が、化学合成および化学分析に使用される。上記でも下記でも本明細書で言及される全ての特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本明細書に記載されたものと類似したまたは同等の任意の適切な方法および材料が本発明の実施において用いられるが、一部の方法および材料が本明細書に記載される。本発明は、記載されている特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことが理解されるべきである。その理由は、これらが、当業者によって使用される文脈に応じて変わり得るためである。したがって、すぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することにより、より十分に記載される。上記でも下記でも本明細書で言及される全ての特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
また、本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が特に明確に指示しない限り、複数の言及を含む。
数値範囲は、範囲を定義する数を含む。故に、本明細書に開示されるあらゆる数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に全て明示的に書かれているかのごとく、そのようなより広い数値範囲内にあるあらゆるより狭い数値範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されるあらゆる最大（または最小）数値限定は、そのようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明示的に書かれているかのごとく、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。
用語「約」は、特定の値に対する許容誤差を意味する。一部の例では「約」は、所与の値範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。
さらに、本明細書に示される見出しは、本発明の様々な態様も実施形態も限定するものではなく、本出願を全体として参照することによりなされ得る。したがって、すぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することにより、より十分に定義される。それでもなお、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が以下に定義される。
特に指示がない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同語源語は、これらの包含的意味において使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同語源語と同等）。
「ＥＣ」番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素の数値分類体系である。
「ＡＴＣＣ」は、アメリカンタイプカルチャーコレクションを指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。
「ＮＣＢＩ」は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、およびその中で提供される配列データベースを指す。
本明細書で使用される場合、用語「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチド」は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、およびチロシンアンモニアリアーゼも含む、芳香族アミノ酸リアーゼファミリー内の酵素のクラスを指す（ＥＣ４．３．１．２３、ＥＣ４．３．１．２４およびＥＣ４．３．１．２５）。一部のＰＡＬ酵素は、基質としてチロシンおよびフェニルアラニンを使用し得るため、ＰＡＬポリペプチドは、フェニルアラニン／チロシンアンモニアリアーゼとも呼ばれることがある。しかし、本明細書に開示および特許請求されたＡｖＰＡＬおよびバリアントは、チロシンを基質として使用しない。ＰＡＬポリペプチドは、Ｌ−フェニルアラニンからトランス−ケイ皮酸およびアンモニアへの変換を触媒する。ＰＡＬ活性は、ＰＡＬポリペプチドの酵素活性を指す。一部の好ましい実施形態では、ＰＡＬ酵素は、補因子３，５−ジヒドロ−５−メチリデン−４Ｈ−イミダゾール−４−オン（ＭＩＯ）も含有する。この補因子は、触媒活性に必要とされる場合があり、保存された活性部位Ａｌａ１６７−Ｓｅｒ１６８−Ｇｌｙ１６９トリペプチドセグメントの環化および脱水により形成される。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、アミド結合により共有結合された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すように本明細書において互換的に使用される。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのどちらかである少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーを示すように本明細書において使用される。
「アミノ酸」は、その一般に公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨された１文字記号のどちらかにより、本明細書において言及される。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている一文字表記により言及され得る。
細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用されるとき、用語「操作された」、「組換え」、「非天然起源の」、および「バリアント」は、さもなければ天然には存在しないと予想される様式で修飾されている、またはこれと同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え手法を用いる操作により生成されまたは得られる材料、または材料の天然もしくは本来の形態に対応する材料を指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然起源の」は、天然に見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができる、およびヒトの操作により意図的に修飾されていない、生物中に存在する配列である。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）のその部分を指す。
用語「パーセント（％）の配列同一性」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの間の比較を指すのに本明細書で使用され、比較ウィンドウで２つの最適に整列された配列を比較して決定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのための参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の合計数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列で生じるか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと共に整列される位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の合計数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを理解している。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁［１９８１年］）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁［１９７０年］）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁［１９８８年］）、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または当技術分野で公知の目視検査により行うことができる。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例には、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁［１９９０年］；ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３８９〜３４０２頁［１９７７年］参照）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを通じて公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列されたときに一致するまたはある正の値の閾値スコア「Ｔ」を満たす、クエリー配列中の長さ「Ｗ」の短いワードを同定して、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記を参照）。これらの初期の近傍ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するシードとしての役割を果たす。ワードヒットは次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータ「Ｍ」（一対の一致する残基に対する報酬スコア；常に＞０）および「Ｎ」（一致しない残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するのにスコア行列が使用される。各方向におけるワードヒットの延長は、累積アライメントスコアが、その最大到達値から量「Ｘ」だけ減少するとき；１つもしくは複数のマイナススコア残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロもしくはそれより下になるとき；またはどちらかの配列の末端に到達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして使用する（例えば、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻：１０９１５頁［１９８９年］参照）。配列アライメントおよび配列同一性％の例示的決定は、提供されたデフォルトパラメータを用いて、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅにおいてＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することができる（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）。
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般的に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長もしくはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または完全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、各々、（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全配列の一部）を含み得、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含み得るため、２つの（またはそれよりも多い）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」で比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することにより典型的には行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づいてもよく、参照配列は、一次配列における１つまたは複数の変化を有し得る配列となる。例えば、語句「Ｘ３９に対応する残基にバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」は、配列番号４のＸ３９位の対応する残基（例えば、アラニン）が、バリンに変更されている参照配列を指す。
「比較ウィンドウ」は、配列が、少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得る、および２つの配列の最適なアライメントに関して、比較ウィンドウ中の配列の部分が、（付加も欠失も含まない）参照配列と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、少なくとも約２０個の隣接するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、２０個の隣接する残基より長くてもよく、必要に応じて３０、４０、５０、１００個、またはそれよりも長いウィンドウを含む。
「〜に対応する」、「〜を参照して」、および「〜と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときに指定された参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置ではなく、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたＰＡＬのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２つの配列間の残基マッチを最適化することにより、参照配列に対して整列させることができる。これらの場合、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それと整列させる参照配列に対してなされる。
「アミノ酸の差異」および「残基の差異」は、参照配列における対応する位置のアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸の差異の位置は、一般的に、本明細書では「Ｘｎ」（ｎは、残基の差異が基づく参照配列中の対応する位置を指す）と呼ばれる。例えば、「配列番号４と比較したＸ９１位の残基の差異」は、配列番号４の９１位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。故に、配列番号４の参照ポリペプチドが９１位にアラニンを有するならば、「配列番号４と比較したＸ９１位における残基の差異」は、配列番号４の９１位に対応するポリペプチドの位置における、アラニン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基の差異は「ＸｎＹ」（「Ｘｎ」は、参照ポリペプチドの対応する残基および位置を指定し（上記のように）、および「Ｙ」は、操作されたポリペプチドで見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）の一文字識別子である）として示される。一部の例では（例えば、実施例の表では）、本開示はまた、従来の記号「ＡｎＢ」（Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、およびＢは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である）により表される特定のアミノ酸の差異も提供する。一部の例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を含み得、これは、参照配列と比べて残基の差異が存在する指定された位置のリストにより示される。１個を超えるアミノ酸がポリペプチドの特定の残基位置において使用され得る一部の実施形態では、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ３０７Ｇ／Ｘ３０７ＱまたはＸ３０７Ｇ／Ｑ）。本開示は、保存的および非保存的アミノ酸置換のどちらか／または両方を含む、１つまたは複数のアミノ酸の差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
用語「アミノ酸置換のセット」および「置換のセット」は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換群を指す。一部の実施形態では、置換のセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれよりも多いアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、置換のセットは、実施例の表のいずれかに列挙されたバリアントＡｖＰＡＬポリペプチドのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
「保存的アミノ酸置換」は、残基を類似した側鎖を有する異なる残基で置換することを指し、故に典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸を、アミノ酸の同じまたは類似した定義されたクラス内のアミノ酸で置換することを含む。例としておよび限定するものではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換されてもよく；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；および疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。例示的な保存的置換を表１に示す。
Figure 2020505942
「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸を、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸で置換することを指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換（例えば、グリシンに対するプロリン）の領域内のペプチド骨格の構造；（ｂ）電荷もしくは疎水性；および／または（ｃ）側鎖のかさ高さに影響を与えることができる。例としておよび限定するものではなく、例示的な非保存的置換には、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小さなアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸が挙げられる。
「欠失」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を除去することによるポリペプチドへの修飾を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および／または操作されたトランスアミナーゼ酵素の改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の１０％まで、またはアミノ酸の総数の２０％まで、１個もしくはそれよりも多いアミノ酸、２個もしくはそれよりも多いアミノ酸、５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、または２０個もしくはそれよりも多いアミノ酸の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に関してもよい。様々な実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含んでもよく、または不連続であってもよい。
「挿入」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を付加することによるポリペプチドへの修飾を指す。挿入は、ポリペプチド内部部分へ、またはカルボキシもしくはアミノ末端に対してであってもよい。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の融合タンパク質を含む。挿入は、天然起源のポリペプチドにおけるアミノ酸の隣接セグメントであってもよく、または１つもしくは複数のアミノ酸によって隔てられてもよい。
用語「機能的断片」および「生物学的に活性な断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、比較されている配列（例えば、本発明の完全長の操作されたＰＡＬ）中の対応する位置と同一であり、完全長ポリペプチドの活性の全てを実質的に保持するポリペプチドを指すのに、本明細書において互換的に使用される。
「単離されたポリペプチド」は、これに天然に付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然起源の環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。組換えＰＡＬポリペプチドは、細胞内に存在してもよく、細胞媒体中に存在してもよく、または溶解物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製されてもよい。そのため、一部の実施形態では、本明細書で提供される組換えＰＡＬポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、中に存在する優勢種である（すなわち、モルまたは重量ベースで、ポリペプチド種が組成物中の任意の他の個々の高分子種より豊富である）組成物を指し、一般的には、対象種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを含むとき、実質的に精製された組成物である。一般的に、実質的に純粋なＰＡＬ組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在する全ての高分子種の約６０％またはそれよりも多く、約７０％またはそれよりも多く、約８０％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９５％またはそれよりも多く、および約９８％またはそれよりも多くを含むと予想される。一部の実施形態では、対象種は、基本的に均一性となる（すなわち、夾雑物種が、従来の検出方法により組成物中に検出され得ない）まで精製され、組成物は、単一の高分子種から基本的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。一部の実施形態では、単離された組換えＰＡＬポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「改善された酵素特性」は、野生型ＰＡＬポリペプチド（例えば、配列番号４を有するＡｖＰＡＬ野生型）または別の操作されたＰＡＬポリペプチドなどの参照ＰＡＬポリペプチドと比較して、何らかの酵素特性の改善を示す操作されたＰＡＬポリペプチドを指す。改善された特性には、増加したタンパク質発現、増加した熱活性、向上した熱安定性、増加したｐＨ活性、向上した安定性、増加した酵素活性、向上した基質特異性および／または親和性、増加した比活性、基質阻害および／または最終生成物阻害に対する増加した耐性、向上した化学安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する低下した感受性）、低減した凝集、向上した溶解性、低減した免疫原性、および変化した温度プロファイルのような特性が挙げられるが、これらに限定されない。
語句「より少ないフェニルアラニン残基を含有する」は、本発明による操作されたＰＡＬポリペプチドが、参照ＰＡＬと比較された場合に、１つまたは複数のフェニルアラニン残基が、そのポリペプチド配列から任意の他のアミノ酸の変異を介して除去された後、標準的なアッセイ（例えば、実施例に記載されているような）において少なくとも活性、または安定性を保持することを意味する。
「増加した酵素活性」および「増強した触媒活性」は、参照ＰＡＬ酵素（例えば、野生型ＡｖＰＡＬおよび／または別の操作されたＡｖＰＡＬ）と比較して、比活性（例えば、生成される生成物／時間／重量タンパク質）の増加および／または基質から生成物への変換パーセント（例えば、指定された量のＰＡＬを用いた指定された期間における基質の出発量から生成物への変換パーセント）の増加により表すことができる、操作されたＰＡＬポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に示されている。その変化が増加した酵素活性をもたらし得る、Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関するいずれの特性も影響され得る。酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の約１．１倍の酵素活性から、ＰＡＬポリペプチドが由来した天然起源のＰＡＬまたは別の操作されたＰＡＬより２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれよりも多い酵素活性となり得る。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、少なくとも０．１／秒、少なくとも０．２／秒、少なくとも０．３／秒、少なくとも０．５／秒、少なくとも１．０／秒のｋｃａｔ、および一部の好ましい実施形態では２．０／秒を超えるｋｃａｔを有する。一部の実施形態では、Ｋｍは、約１μｍから約５ｍＭの範囲；約５μｍから約２ｍＭの範囲；約１０μｍから約２ｍＭの範囲；または約１０μｍから約１ｍＭの範囲にある。一部の特定の実施形態では、操作されたＰＡＬ酵素は、参照ＰＡＬ酵素の酵素活性より１．５から１０倍、１．５から２５倍、１．５から５０倍、１．５から１００倍の範囲またはそれよりも大きい範囲の改善された酵素活性を示す。ＰＡＬ活性は、当技術分野で公知の任意の標準的なアッセイにより（例えば、反応物または生成物の分光光度特性の変化をモニタリングすることにより）測定することができる。一部の実施形態では、生成される生成物の量は、ＵＶ吸光度または蛍光検出と直接またはｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化後に組み合わされた、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離により測定される。一部の実施形態では、酵素活性の比較は、本明細書において詳細にさらに記載されているように、酵素の定義された調製、セット条件下の定義されたアッセイ、および１つまたは複数の定義された基質を用いてなされる。一般的に、溶解物が比較される場合、宿主細胞により生成され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小化するために、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するのみならず、アッセイされる細胞数およびタンパク質の量が決定される。
「生理的ｐＨ」は本明細書で使用される場合、対象の（例えば、ヒト）小腸において一般的に見出されるｐＨ範囲を意味する。通常は、幽門弁から大腸まで、約６．０から７．５の範囲の勾配ｐＨがある。
本明細書において互換的に使用される用語「タンパク質分解活性」および「タンパク質分解」は、より小さいポリペプチドまたはアミノ酸へのタンパク質の分解を指す。タンパク質の分解は、一般的に、プロテアーゼ（プロテイナーゼ）酵素によるペプチド結合の加水分解の結果である。プロテアーゼ酵素には、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ；カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、ならびにペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびエンテロペプチダーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において互換的に使用される語句「タンパク質分解に対する低下した感受性」、「低下したタンパク質分解感受性」および「タンパク質分解に対する増加した耐性」は、本発明による操作されたＰＡＬポリペプチドが、１つまたは複数のプロテアーゼによる処置後、標準的なアッセイ（例えば、実施例に記載されているような）において参照ＰＡＬと比べてより高い酵素活性を有することを意味する。
語句「高温での貯蔵安定性の向上」は、本発明による操作されたＰＡＬポリペプチドが、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥により乾燥形態で生成され、室温より上の温度（例えば、３０℃、３７℃、４５℃、５５℃等）で数日から数カ月に及ぶ期間貯蔵された後、標準的なアッセイ（例えば、実施例に記載されているような）において参照ＰＡＬと比べてより多くの活性を保持すると予想されることを意味する。
「凝集」は、ＰＡＬポリペプチドの集塊または沈降を意味する。凝集は、酵素の不活性化をもたらし得る。用語「低下した凝集」は、参照ＰＡＬと比較して、操作されたＰＡＬポリペプチドが凝集しにくくなることを意味する。適当な色素（例えば、チオフラビンＴまたはナイルレッド）を用いた蛍光顕微鏡、動的光散乱、適当な色素（例えば、ボディパイ）を用いたフローサイトメトリー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる濾過および分析、ならびに／またはウエスタンブロッティング、蛍光相関分光測定、および電子顕微鏡の使用を含むがこれらに限定されない凝集を評価する方法が、当技術分野で公知である。凝集を評価するための市販のキットがある（例えば、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）タンパク質凝集アッセイキット［Ｅｎｚｏ］）。
「変換」は、基質から対応する生成物への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「変換パーセント」は、指定された条件下で一定の期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。故に、ＰＡＬポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間における基質から生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシー条件下で行われ、その後様々な、ただしより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡと約６０％同一性、好ましくは約７５％同一性、約８５％同一性を有し、標的ポリヌクレオチドと約９０％を超える同一性を有する相補的な核酸を結合できるようにする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーションと、その後の０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃での洗浄に等しい条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般的に、定義されたポリヌクレオチド配列に関する溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ、６５℃で安定でないならば、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー条件下では安定でないと予想される）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃に等しい条件でのハイブリダイゼーションと、その後の０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ、６５℃での洗浄により提供されてもよい。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ、６５℃でのハイブリダイジングに等しい条件でのハイブリダイジング、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ、６５℃での洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中程度にストリンジェントな条件は、上記に引用された参考文献に記載されている。
「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が特定の生物においてより効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、その生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で、遺伝暗号は縮重するが、特定の生物によるコドン使用は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先の遺伝子、高発現タンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの凝集したタンパク質コード領域に関して、より高くなり得る。一部の実施形態では、ＰＡＬ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現用に選択された宿主生物からの最適な生成のためにコドン最適化される。「制御配列」は、本明細書において、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利な全ての成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に由来してもまたは外来性であってもよい。そのような制御配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最小でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。一部の実施形態では、制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的で、リンカーと共に提供される。
「作動可能に連結された」は、制御配列が、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を誘導または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する相対位置に適当に（すなわち、機能的な関係で）置かれた立体配置として本明細書では定義される。
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される、コード配列などの核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体プロモーター、切断プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞と同種または異種のどちらかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
酵素変換反応プロセスの文脈での「基質」は、ＰＡＬポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。酵素変換プロセスの文脈での「生成物」は、基質上でのＰＡＬポリペプチドの作用から生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「培養」は、任意の適切な培地（例えば、液体、ゲル、または固体）を用いた適切な条件下の微生物細胞集団の増殖を指す。
組換えポリペプチド（例えば、ＰＡＬ酵素バリアント）は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて生成することができる。例えば、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発法がある。さらに、変異誘発キットも多くの商業的分子生物学サプライヤーから入手可能である。定義されたアミノ酸における特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（領域特異的）、または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を作る方法が利用可能である。ＰＣＲを用いた一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学的飽和変異誘発、または当技術分野で公知の任意の他の適切な方法を含むがこれらに限定されない、酵素バリアントを作製するための数多くの適切な方法が、当業者に公知である。ＤＮＡおよびタンパク質操作に使用される方法の非限定的な例は、以下の特許：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号に提供されている。バリアントが生成された後、バリアントは、任意の所望の特性（例えば、高活性もしくは増加した活性、または低活性もしくは低下した活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性等）についてスクリーニングされ得る。一部の実施形態では、「組換えＰＡＬポリペプチド」（本明細書では「操作されたＰＡＬポリペプチド」、「バリアントＰＡＬ酵素」、および「ＰＡＬバリアント」とも呼ばれる）が用いられる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドの適切な宿主での発現をもたらすことができる適切な制御配列に、作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞での発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等）は、２つの配列が天然には結合されないならば、作動可能に連結されたもう１つの配列と「異種」である。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、少なくとも１つのＡｖＰＡＬバリアントをコードするポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクターのための適切な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ法を用いて構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。
用語「類似体」は、参照ポリペプチドと７０％を超える配列同一性であるが１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体は、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリン、および天然起源のアミノ酸を含むがこれらに限定されない、非天然起源のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、類似体は、１個または複数個のＤ−アミノ酸残基および２個またはそれよりも多いアミノ酸残基間の非ペプチド結合も含む。
用語「治療薬」は、有益なまたは望ましい医学的効果を有する、病態の徴候または症状を示す対象に投与される化合物を指す。
用語「医薬組成物」は、本発明により包含される薬学的有効量の操作されたＰＡＬポリペプチドおよび許容される担体を含む、哺乳動物対象（例えば、ヒト）における薬学的用途に適した組成物を指す。
用語「遺伝子治療」は、哺乳動物対象（例えば、ヒト）において疾患を処置および／または防止するための遺伝子（すなわち、遺伝物質）の使用に関して使用される。一部の実施形態では、遺伝物質は、哺乳動物対象の少なくとも一部の細胞に直接導入される。本発明が、遺伝子治療に有用な任意の特定の方法または組成物に限定されることを意図するものではない。
用語「ｍＲＮＡ治療」は、哺乳動物対象（例えば、ヒト）において疾患を処置および／または防止するためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の使用に関して使用される。一部の実施形態では、遺伝物質は、哺乳動物対象の少なくとも一部の細胞に直接導入される。本発明が、ｍＲＮＡ治療に有用な任意の特定の方法または組成物に限定されることを意図するものではない。
用語「有効量」は、所望の結果をもたらすのに十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用して有効量は何かを決定することができる。
用語「単離された」および「精製された」は、天然に結合された少なくとも１つの他の成分から除去された、分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチド等）または他の成分を指すのに使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的な定義として意図される。
用語「対象」は、ヒト、ヒト以外の霊長類、家畜、コンパニオン動物、および実験動物（例えば、げっ歯類およびウサギ類）などの哺乳動物を包含する。この用語は、メスおよびオスを包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、疾患を評価されている、処置されている、または経験している任意の対象を意味する。
用語「乳児」は、生後１カ月から約１歳までの期間の小児を指す。本明細書で使用される場合、用語「新生児」は、誕生から生後２８日までの期間の小児を指す。用語「未熟児」は、一般的に出生時の体重が約５００グラムから約２４９９グラムの、妊娠満２０週以後であるが満期前に生まれた乳児を指す。「超低出生体重児」は、出生時の体重が１５００ｇ未満の乳児である。
本明細書で使用される場合、用語「小児」は、処置または研究手順に対する同意を得るための法定年齢に達していない者を指す。一部の実施形態では、この用語は、出生時から青年期の間の者を指す。
本明細書で使用される場合、用語「成人」は、関連する管轄区域の法定年齢（例えば、米国では１８歳）に達した者を指す。一部の実施形態では、この用語は、任意の完全に成長した成熟した生物を指す。一部の実施形態では、用語「若年成人」は、１８歳未満であるが性的成熟に達した者を指す。
本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、任意の適切な用途（例えば、医薬組成物、食事／栄養サプリメント、飼料等）のために意図された、本発明の少なくとも１つの操作されたＰＡＬを含む生成物を包含する。
用語、組成物の「投与」および組成物を「投与すること」は、本発明の組成物を対象（例えば、ＰＫＵの影響に苦しんでいる者）に提供することを意味する。
用語「担体」は、医薬組成物に関して使用される場合、安定剤、保存剤、および補助剤などの、標準的な医薬担体、緩衝液、および賦形剤のいずれかを意味する。
用語「薬学的に許容される」は、いかなる望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、またはそれを含有する成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく対象に投与することができ、および所望の生物学的活性を有する材料を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、医薬品有効成分（ＡＰＩ；例えば、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチド）以外の、任意の薬学的に許容される添加剤、担体、希釈剤、補助剤、または他の成分を指す。賦形剤は、典型的には、製剤化および／または投与目的で含まれる。
用語「治療有効量」は、疾患／状態の症状に関して使用される場合、疾患／状態の１つもしくは複数の症状を改善、減弱、もしくは排除する、または症状（例えば、ＰＫＵ）の発症を防止もしくは遅延させる、化合物（例えば、操作されたＰＡＬポリペプチド）の量および／または濃度を指す。一部の実施形態では、この用語は、研究者、医師、獣医師、または他の臨床医によって探求される、組織、系、または動物対象による生物学的（例えば、医学的）応答を誘発する組成物の量に関して使用される。
用語「治療有効量」は、疾患／状態に関して使用される場合、疾患／状態を改善、減弱、または排除する組成物の量および／または濃度を指す。
用語「処置すること」、「処置する」および「処置」は、防止的（例えば、予防的）、および緩和的処置を包含することが意図される。
操作されたＰＡＬポリペプチド：
本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドが由来する親ＰＡＬポリペプチドには、Ａｎａｂａｅｎａ（例えば、Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、Ｎｏｓｔｏｃ（例えば、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓまたはＳ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．、およびＲｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐなどの細菌株が挙げられる。これらの株由来のＰＡＬ酵素が同定されており、周知されている。Ａｎａｂａｅｎａ（Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ ２９４１３およびＮＣＢＩ ＹＰ＿３２４４８８．１；Ｎｏｓｔｏｃ（Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）ＡＴＣＣ ２９１３３およびＮＣＢＩ ＹＰ＿００１８６５６３．１；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ＰＣＣ ６５０６およびＮＣＢＩ ＺＰ＿０７１０８４８２．１、ならびにＧｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．ＰＣＣ７４２８およびＮＣＢＩ ＹＰ＿００７１２７０５４．１由来の相同酵素配列が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４／０３１４８４３号の図１に示されている。
さらに、野生型ＰＡＬまたは参照ＰＡＬの配列中の特定のアミノ酸残基の修飾を参照することにより、特定のＰＡＬバリアント（すなわち、操作されたＰＡＬポリペプチド）が言及される場合、同等の位置（それぞれのアミノ酸配列間の任意のアミノ酸配列アライメントから決定された）で修飾された別のＰＡＬのバリアントが、本明細書に包含されることが理解されるべきである。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、上記の細菌株（すなわち、Ｎｏｓｔｏｃ［Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ］、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ［Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ［Ｓ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓまたはＳ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ］、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐおよびＲｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．）からリストされたポリペプチドのいずれか１つに由来する。一部のさらなる実施形態では、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、保存された活性部位Ａｌａ１６７−Ｓｅｒ１６８−Ｇｌｙ１６９を含み、配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドはＰＡＬ活性を含むだけでなく、チロシンおよび／またはヒスチジン基質においても活性である。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、少なくとも１つの操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む微生物を、操作されたＰＡＬポリペプチドの生成を促す条件下で培養して生成される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、その後、得られた培養培地および／または細胞から回収される。
本発明は、ＰＡＬ活性を有する例示的な操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。実施例は、特定のアミノ酸配列特徴を、操作されたＰＡＬポリペプチドの機能的活性と相関させる配列構造情報を示す表を提供する。この構造−機能相関情報は、配列番号２の参照の操作されたポリペプチドと比べた特定のアミノ酸残基の差異、および例示的な操作されたＰＡＬポリペプチドについての関連する実験的に決定された活性データの形態で提供される。
一部の実施形態では、ＰＡＬ活性を有する本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、ａ）参照配列、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）１つまたは複数のアミノ酸位置における、配列番号２と比較したアミノ酸残基の差異を含み、ｃ）参照配列と比較して、ｉ）増強した触媒活性、ｉｉ）低下したタンパク質分解感受性、ｉｉｉ）低下した凝集、ｉｖ）凍結乾燥調製物としての高温に対する向上した安定性、ｖ）その一次構造における低減したフェニルアラニン残基数、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、配列番号２、または配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号２と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の位置における、配列番号２と比較した残基の差異は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多い保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、実施例で示される表にリストされたポリペプチドである。
一部の実施形態では、ＰＡＬ活性を有する本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、ａ）参照配列、配列番号４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）１つまたは複数のアミノ酸位置における、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を含み、ｃ）参照配列と比較して、ｉ）増強した触媒活性、ｉｉ）低下したタンパク質分解感受性、ｉｉｉ）低下した凝集、ｉｖ）凍結乾燥調製物としての高温に対する向上した安定性、ｖ）その一次構造における低減したフェニルアラニン残基数、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、配列番号４、または配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の位置における、配列番号４と比較した残基の差異は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多い保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、実施例で示される表にリストされたポリペプチドである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置である。一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、およびアミノ酸位置が配列番号６と比べて番号付けされた１６、１６／１５０、４４／２３９／４９５、４４／５６、４４／５６／１０２／２３９／２８５／４６９／４７０／４９５、４４／２３９、４４／２３９／２８５／４７０、４４／２３９／２８５／４６９／４９５、４４／２３９／２８５／４７０、４４／２３９／４６９／４７０、４４／２３９／４７０／５４６、４４／２３９／４９５／５４６、４４／４６９／４７０、１０２、１０２／４７０、１６２、１６２、１６５、１８８、２３９／２８５／４６９、２３９／２８５、２３９／４６９／４７０／４９５、２６４、２６７、２６７、２８５／４７０、２８５／４６９／４７０／４９５、２８５／４７０／４９５、３６４、４５５、４６９／４７０、４７２、および４８２、またはそれらの任意の組合せから選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置に、配列番号６と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、アミノ酸位置が配列番号６と比べて番号付けされたＦ１６Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｆ１６Ｋ／Ｆ１５０Ａ、Ｎ４４Ｃ／Ｔ２３９Ａ／Ｔ４９５Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｉ５６Ｖ、Ｎ４４Ｈ／Ｉ５６Ｖ／Ｔ１０２Ｑ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｌ／Ｖ４６９Ｉ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｔ２３９Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｌ／Ｄ４７０Ｅ、Ｎ４４Ｈ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｖ４６９Ｉ／Ｔ４９５Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｄ４７０Ｅ、Ｎ４４Ｈ／Ｔ２３９Ａ／Ｖ４６９Ｉ／Ｄ４７０Ｅ、Ｎ４４Ｈ／Ｔ２３９Ａ／Ｄ４７０Ｅ／Ｓ５４６Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｔ２３９Ａ／Ｔ４９５Ａ／Ｓ５４６Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｖ４６９Ｉ／Ｄ４７０Ｅ、Ｔ１０２Ｑ、Ｔ１０２Ｑ／Ｄ４７０Ｅ、Ｆ１６２Ｑ／Ｗ、Ｉ１６５Ｌ、Ｆ１８８Ｉ、Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｌ／Ｖ４６９Ｉ、Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ、Ｔ２３９Ａ／Ｖ４６９Ｉ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｆ２６４Ｈ、Ｆ２６７Ｇ／Ｖ、Ｉ２８５Ｌ／Ｄ４７０Ｅ、Ｉ２８５Ｌ／Ｖ４６９Ｉ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｉ２８５Ｒ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｌ３６４Ｅ／Ｈ／Ｓ／Ｔ、Ｎ４５５Ｓ、Ｖ４６９Ｉ／Ｄ４７０Ｅ、Ｆ４７２Ａ、およびＦ４８２Ｃ／Ｎから選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態ではアミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置である。一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、ならびにアミノ酸位置が配列番号８と比べて番号付けされた１６、２６４、３６４、および４７２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、配列番号６比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、アミノ酸位置が配列番号６と比べて番号付けされたＦ１６Ｓ、Ｆ２６４Ｈ、Ｌ３６４Ｈ、Ｆ４７２Ａ、およびＦ４８２Ｎから選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態ではアミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置である。一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、ならびにアミノ酸位置が配列番号６と比べて番号付けされた１６、１６／１５０、１６２、１８８、２６４、２６７、３９８、４３４、４７２Ａ／Ｌ／Ｖ、およびＦ４８２Ｃ／Ｎ／Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、配列番号８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、アミノ酸位置が配列番号６と比べて番号付けされたＦ１６Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｆ１６Ｋ／Ｆ１５０Ａ、Ｆ１６２Ｍ／Ｑ／Ｗ、Ｆ１８８Ａ／Ｉ／Ｎ、Ｆ２６４Ｈ、Ｆ２６７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｆ３９８Ｈ、Ｆ４３４Ｖ、Ｆ４７２Ａ／Ｌ／Ｖ、およびＦ４８２Ｃ／Ｎ／Ｓから選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態ではアミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置である。一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、ならびにアミノ酸位置が配列番号８と比べて番号付けされた４４／１０２／２８５／３６４、４４／２８５／３６４、４４／４７／２０４／２０９／２８５、４４／４７／３６４／４７０／４９５、４４／５４／２８５／４７０、４４／５４／５６／２０４／２３９／２８５／３６４／４９５、４４／５４／５６／２０４／２３９／４７０／４９５、４４／２０４／２８５／３６４／４７０／４９５、４４／２０４／２０９／２８５、４４／２０９／２８５／４６０／４９５、４７／５４／２０９、４７／２０４／２０９／２３９／２８５／４９５、４７／２０４／２８５／３６４／４９５、４７／２０９／２３９／３６４、４７／２３９／２８５／３６４、４７／４７０、５４、５４／２８５／４７０、５４／５６／２０４／２０９／４７０、５４／５６／２０４／２０９／４９５、５４／５６／２８５／３６４／４７０、５４／５６、５４／５６／２８５／４７０、５４／５６／２０４／４９５、５４／５６／２０９／５６２、５４／１６５／２０４／２０９／２３９／２８５／４７０／４９５、５４／２３９／４９５、５４／４７０、５６、１６５、２０４、２０４／２０９／２３９／２８５／４７０／４９５、２０４／２０９／３６４、２０４／２０９／３６４／４９５、２０４／２３９、２０４／２３９／２８５、２０４／３６４、２０４／４７０から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、配列番号８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、アミノ酸位置が配列番号８と比べて番号付けされたＮ４４Ｃ／Ｔ１０２Ｑ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ、Ｎ４４Ｃ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｅ、Ｎ４４Ｈ／Ａ４７Ｋ／Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｉ２８５Ｒ、Ｎ４４Ｈ／Ａ４７Ｋ／Ｌ３６４Ｈ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｋ５４Ｐ／Ｉ２８５Ｒ／Ｄ４７０Ｅ、Ｎ４４Ｈ／Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｓ／Ｔ４９５Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｔ２３９Ａ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｒ２０４Ｋ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｎ４４Ｈ／Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｉ２８５Ｒ、Ｎ４４Ｈ／Ｓ２０９Ｐ／Ｉ２８５Ｒ／Ｔ４６０Ｇ／Ｔ４９５Ａ、Ａ４７Ｋ／Ｋ５４Ｐ／Ｓ２０９Ｐ、Ａ４７Ｋ／Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｔ４９５Ａ、Ａ４７Ｋ／Ｒ２０４Ｋ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ／Ｔ４９５Ａ、Ａ４７Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｔ２３９Ａ／Ｌ３６４Ｈ、Ａ４７Ｋ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ、Ａ４７Ｋ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ、Ａ４７Ｋ／Ｄ４７０Ｅ、Ｋ５４Ｅ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ２８５Ｌ／Ｄ４７０Ｅ、Ｋ５４Ｅ／Ｉ２８５Ｒ／Ｄ４７０Ｅ、Ｋ５４Ｅ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｄ４７０Ｅ、Ｋ５４Ｅ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｔ４９５Ａ、Ｋ５４Ｅ／Ｉ５６Ｖ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｓ／Ｄ４７０Ｅ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｉ２８５Ｌ／Ｄ４７０Ｅ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｔ４９５Ａ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｓ２０９Ｐ／Ｉ５６２Ｎ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ１６５Ｌ／Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｋ５４Ｐ／Ｔ２３９Ａ／Ｔ４９５Ａ、Ｋ５４Ｐ／Ｄ４７０Ｅ、Ｉ５６Ｖ、Ｉ１６５Ｌ、Ｒ２０４Ｋ、Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｌ３６４Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｌ３６４Ｈ、Ｒ２０４Ｋ／Ｓ２０９Ｐ／Ｌ３６４Ｈ／Ｔ４９５Ａ、Ｒ２０４Ｋ／Ｔ２３９Ａ、Ｒ２０４Ｋ／Ｔ２３９Ａ／Ｉ２８５Ｒ、Ｒ２０４Ｋ／Ｌ３６４Ｈ、Ｒ２０４Ｋ／Ｄ４７０Ｅ、Ｓ２０９Ｐ／Ｉ２８５Ｌ／Ｌ３６４Ｈ／Ｄ４７０Ｅ、Ｓ２０９Ｐ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｅ／Ｄ４７０Ｅ、Ｓ２０９Ｐ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｅ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｓ２０９Ｐ／Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ／Ｄ４７０Ｅ／Ｔ４９５Ａ、Ｓ２０９Ｐ／Ｌ３６４Ｈ，Ｓ２０９Ｐ／Ｌ３６４Ｈ／Ｔ４９５Ａ、Ｓ２０９Ｐ／Ｄ４７０Ｅ、Ｔ２３９Ａ／Ｌ３６４Ｈ、Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ、Ｉ２８５Ｒ／Ｌ３６４Ｈ／Ｔ４９５Ａ、Ｌ３６４Ｈ、Ｌ３６４Ｈ／Ｄ４７０Ｅ、Ｄ４７０Ｅ、およびＴ４９５Ａから選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態ではアミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置である。一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、およびアミノ酸位置が配列番号１２と比べて番号付けされた５４／５６／１６２／２０４／２８５、５４／５６／３９８／４７２、５４／１６２／２０４／３９８、５４／１６２／３９８、５４／２０４／３９８、５４／５６／１６２／２０４／３９８、５４／５６／２０４／２８５、５４／５６／２０４／３９８、５４／５６／２０４／３９８／４７２、５４／５６／２８５、５４／５６／３９８、５４／１６２／３９８、５４／２０４／２８５／３９８／４７２、５４／２８５／３９８、５４／２８５／３９８／４７２、５６／１６２／３９８、５６／２０４／２８５、５６／２０４／３９８、５６／２０４／３９８／４６０、５６／２０４／３９８／４７２、５６／２８５、５６／２８５／３９８／４７２、５６／３９８、５６／３９８／４７２、および２０１／２０４／３９８から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、配列番号１２と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、アミノ酸位置が配列番号１２と比べて番号付けされたＫ５４Ｅ／Ｉ５６Ｖ／Ｆ１６２Ｗ／Ｒ２０４Ｋ／Ｌ２８５Ｉ、Ｋ５４Ｅ／Ｉ５６Ｖ／Ｆ３９８Ｈ／Ｆ４７２Ｌ、Ｋ５４Ｅ／Ｆ１６２Ｗ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｅ／Ｆ１６２Ｗ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｅ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｆ１６２Ｗ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｌ２８５Ｉ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ／Ｆ４７２Ｌ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｌ２８５Ｉ、Ｋ５４Ｐ／Ｉ５６Ｖ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｐ／Ｆ１６２Ｗ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｐ／Ｒ２０４Ｋ／Ｌ２８５Ｉ／Ｆ３９８Ｈ／Ｆ４７２Ｌ、Ｋ５４Ｐ／Ｌ２８５Ｉ／Ｆ３９８Ｈ、Ｋ５４Ｐ／Ｌ２８５Ｉ／Ｆ３９８Ｈ／Ｆ４７２Ｌ、Ｉ５６Ｖ／Ｆ１６２Ｗ／Ｆ３９８Ｈ、Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｌ２８５Ｉ、Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ、Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ／Ｔ４６０Ｇ、Ｉ５６Ｖ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈ／Ｆ４７２Ｌ、Ｉ５６Ｖ／Ｌ２８５Ｈ、Ｉ５６Ｖ／Ｌ２８５Ｉ、Ｉ５６Ｖ／Ｌ２８５Ｉ／Ｆ３９８Ｈ／Ｆ４７２Ｌ、Ｉ５６Ｖ／Ｆ３９８Ｈ、Ｉ５６Ｖ／Ｆ３９８Ｈ、Ｉ５６Ｖ／Ｆ３９８Ｈ／Ｆ４７２Ｌ、およびＴ２０１Ａ／Ｒ２０４Ｋ／Ｆ３９８Ｈから選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０、および／または１２に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、および１２から選択される。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態では、機能的断片は、これが由来した操作されたＰＡＬポリペプチド（すなわち、親の操作されたＰＡＬ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたＰＡＬの親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、および５０個未満のアミノ酸が切断される。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態では、機能的断片は、これが由来した操作されたＰＡＬポリペプチド（すなわち、親の操作されたＰＡＬ）の活性の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたＰＡＬの親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。一部の実施形態では機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、５５個未満、６０個未満、６５個未満、または７０個未満のアミノ酸が切断される。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、および／または１４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、ならびに配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比べた１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２、または配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬは、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多いアミノ酸位置の、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、および／または１２の配列からなる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４、またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および配列番号４、または配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬは、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多いアミノ酸位置の、配列番号４と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４の配列からなる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６、またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および配列番号６、または配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号６と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬは、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多いアミノ酸位置の、配列番号６比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６の配列からなる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号８、またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および配列番号８、または配列番号８と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号８と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬは、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多いアミノ酸位置の、配列番号８と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号８の配列からなる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１０、またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および配列番号１０、または配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬは、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多いアミノ酸位置の、配列番号１０と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１０の配列からなる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１２またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および配列番号１２、または配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号１２と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬは、配列番号１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多いアミノ酸位置の、配列番号１２と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１２の配列からなる。
タンパク質分解に対する感受性が低下したバリアント：
一部の実施形態では、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、ＰＡＬ活性を有し、タンパク質分解に対する低下した感受性を示し、ａ）参照配列、配列番号４、６、８、１０、および／または１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびにｂ）１つまたは複数のアミノ酸位置における、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較したアミノ酸残基の差異を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解に対する低下した感受性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、および１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２、または配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較したアミノ酸残基の差異を有する。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドのタンパク質分解感受性は、野生型ＰＡＬ（例えば、配列番号２を有するＡｖＰＡＬ）のタンパク質分解感受性の、または基本的に同じ条件下で参照ＰＡＬポリペプチドと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低下する。タンパク質分解活性は、実施例に記載されたものを含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。
一部の実施形態では、タンパク質分解に対する低下した感受性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、参照ＰＡＬおよび低下した感受性を有する操作されたＰＡＬの両方が比較され、基本的に同じ条件下で基本的に同じ量および種類のプロテアーゼに曝露される場合、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、ペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびエンテロペプチダーゼ）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のプロテアーゼを含む組成物に対する低下した感受性を有する。
一部の実施形態では、タンパク質分解に対する低下した感受性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、参照ＰＡＬ（例えば、ＡｖＰＡＬ）の酵素活性の約１．０倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれよりも高い酵素活性レベルを有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、活性が４．５〜７．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が４．５〜６．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が５．０〜７．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が５．０〜６．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が５．５〜７．５のｐＨ範囲で測定される場合；および／または活性が５．５〜６．５のｐＨ範囲で測定される場合も、参照ＰＡＬと比較してより高い酵素活性を有する。一部の他の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、１μＭ〜５ｍＭの範囲にＫｍ値を有する。
高温での貯蔵に対する耐性が増加したバリアント：
一部の実施形態では、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドはＰＡＬ活性を有し、高温での貯蔵に対してより耐性であり、ａ）参照配列、配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２、またはその断片に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびにｂ）１つまたは複数のアミノ酸位置における、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較したアミノ酸残基の差異を含む。
一部の実施形態では、野生型ＡｖＰＡＬおよび／または別の参照ポリペプチドと比較して、高温での貯蔵に対する増加した耐性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、ならびに配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２、または配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置に、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。
一部の実施形態では、全ての他のアッセイ条件が基本的に同じである場合、参照ＰＡＬポリペプチドと比較して高温での貯蔵に対する増加した耐性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、約２５ｏＣ、２６ｏＣ、２７ｏＣ、２８ｏＣ、２９ｏＣ、３０ｏＣ、３１ｏＣ、３２ｏＣ、３３ｏＣ、３４ｏＣ、３５ｏＣ、３６ｏＣ、３７ｏＣ、３８ｏＣ、３９ｏＣ、４０ｏＣ、４１ｏＣ、４２ｏＣ、４３ｏＣ、４４ｏＣ、４５ｏＣ、４６ｏＣ、４７ｏＣ、４８ｏＣ、４９ｏＣ、５０ｏＣ、５１ｏＣ、５２ｏＣ、５３ｏＣ、５４ｏＣ、５５ｏＣ、５６ｏＣ、５７ｏＣ、５８ｏＣ、５９ｏＣ、６０ｏＣ、ｅｔｃの温度での増加した耐性を有する。
一部の実施形態では、高温での貯蔵に対する増加した耐性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、標準的なアッセイにより測定される場合、参照ＰＡＬと比較してより大きいＰＡＬ活性も示す。本明細書で提供されるものを含むが、これらに限定されない任意の適切なアッセイが、本発明において用いられる。
より少ないフェニルアラニン残基を含有するバリアント：
一部の実施形態では、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、ＰＡＬ活性、およびその一次配列中に低減したフェニルアラニン残基数を有し、ａ）参照配列、配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに／またはｂ）１つもしくは複数のアミノ酸位置における、配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２と比較したアミノ酸残基の差異を含む。
一部の実施形態では、その一次配列中に低減したフェニルアラニン残基数を含有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、ならびに１つまたは複数のアミノ酸位置に（例えば、配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２、または配列番号４、６、８、１０、および／もしくは１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれよりも多いアミノ酸位置に）、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較したアミノ酸残基の差異を有する。
一部の実施形態では、その一次配列中に低減したフェニルアラニン残基数を含有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有し、ならびに配列番号６のアミノ酸配列と最適に整列された場合、１６、１６／１５０、１６２、１８８、２６４、２６７、３９８、４３４、４７２Ａ／Ｌ／Ｖ、およびＦ４８２Ｃ／Ｎ／Ｓ、またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、配列番号６と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態ではアミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、もしくは２５個、またはそれよりも多いアミノ酸位置である。
一部の実施形態では、その一次配列中に低減したフェニルアラニン残基数を含有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６に対して少なくとも８５％、少なくとも８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ならびにＦ１６位、Ｆ１５０位、Ｆ１６２位、Ｆ１８８位、Ｆ２６４位、Ｆ２６７位、Ｆ３９８位、Ｆ４３４位、Ｆ４７２位、Ｆ４８２位にアミノ酸残基の差異を含み、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多いアミノ酸位置にアミノ酸残基の差異を含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基の差異は、アミノ酸残基が配列番号６を参照して番号付けされたＦ１６Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｆ１６Ｋ／Ｆ１５０Ａ、Ｆ１６２Ｍ／Ｑ／Ｗ、Ｆ１８８Ａ／Ｉ／Ｎ、Ｆ２６４Ｈ、Ｆ２６７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｆ３９８Ｈ、Ｆ４３４Ｖ、Ｆ４７２Ａ／Ｌ／Ｖ、およびＦ４８２Ｃ／Ｎ／Ｓから選択される。
一部の実施形態では、野生型ＰＡＬより少ないフェニルアラニン残基を含有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、野生型ＰＡＬ（例えば、配列番号２を有するＡｖＰＡＬ）のタンパク質分解感受性の、または基本的に同じ条件下で参照ＰＡＬポリペプチドと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低下したタンパク質分解感受性も有する。活性は、実施例に記載されたものを含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。
一部の実施形態では、その一次配列中に野生型ＰＡＬより少ないフェニルアラニン残基を含有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、参照ＰＡＬおよび低下したフェニルアラニン含量を有する操作されたＰＡＬの両方が比較され、基本的に同じ条件下で基本的に同じ量および種類のプロテアーゼに曝露される場合、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、ペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびエンテロペプチダーゼ）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のプロテアーゼを含む組成物に対する低下した感受性を有する。
一部の実施形態では、その一次配列中に低減したフェニルアラニン残基数を含有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、参照ＰＡＬ（例えば、ＡｖＰＡＬ）の酵素活性の約１．０倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれよりも高い酵素活性レベルを有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、活性が４．５〜７．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が４．５〜６．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が５．０〜７．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が５．０〜６．５のｐＨ範囲で測定される場合；活性が５．５〜７．５のｐＨ範囲で測定される場合；および／または活性が５．５〜６．５のｐＨ範囲で測定される場合も、参照ＰＡＬと比較してより高い酵素活性を有する。一部の他の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、１μＭ〜５ｍＭの範囲にＫｍ値を有する。
例示的な操作されたポリペプチドのいずれも（すなわち、表に示され、本明細書に記載されたバリアントの全ては）、例えば、本明細書に記載された他のポリペプチドおよび他の残基位置から様々なアミノ酸の差異の新たな組合せを加えることによるその後の進化ラウンドにより、他の操作されたＰＡＬポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列として用いられることがさらに企図される。一部の実施形態では、追加の改善は、より初期の進化ラウンドを通じて不変の残基位置として維持された残基位置におけるアミノ酸の差異を含むことにより生じる。本明細書で提供される方法を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法が用いられることから、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドを生成するための任意の特定の方法に限定されることを意図するものではない。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載された操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作成するために、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物が、対応するＰＡＬポリペプチドを発現するための適当な宿主細胞に導入される。
当業者には明らかなように、タンパク質配列および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識が入手可能であり、それにより対象ポリペプチドをコードできる全てのポリヌクレオチドの記載が得られる。同じアミノ酸が、代替または同義のコドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、その全てが操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする、極めて多数の核酸が作られるようになる。故に、本発明は、可能性のあるコドン選択に基づき組合せを選択することにより、本明細書に記載されたＰＡＬポリペプチドをコードする、作られ得るＰＡＬポリヌクレオチドのありとあらゆる可能性のあるバリエーションを生成するための方法および組成物を提供し、全てのそのようなバリエーションは、実施例（例えば、様々な表）に提示されたアミノ酸配列を含む、本明細書に記載された任意のポリペプチドに関して、具体的に開示されていると見なされるべきである。
一部の実施形態では、コドンは、タンパク質生成用に選択された宿主細胞による利用のために好ましくは最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、典型的には細菌での発現に使用される。その結果、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、完全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超において好ましいコドンを含有する。
一部の実施形態では、ＰＡＬポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性を有するＰＡＬ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、および／もしくは１１から選択される参照配列、または任意のバリアント（例えば、実施例に示されたもの）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも大きい同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号３、５、７、９、および／もしくは１１の参照ポリヌクレオチド、または実施例に開示された任意のバリアントのアミノ酸配列と比較した１つもしくは複数の残基の差異（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多いアミノ酸残基位置）を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号３、５、７、９、および／または１１から選択される。
一部の実施形態では、ＰＡＬポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性を有するＰＡＬ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、参照配列、配列番号４、６、８、１０、および／または１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きい配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較して１つまたは複数の残基の差異を含む。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、および／または１１から選択されるポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、および／または１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド残基同一性を有する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、および／もしくは１１から選択される参照ポリヌクレオチド配列、またはその相補体、または本明細書で提供されるバリアントＰＡＬポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較して１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含むＰＡＬポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本明細書における操作されたＰＡＬポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ＰＡＬポリペプチドの発現を容易にする様々な方法で操作される。一部の実施形態では、ＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＰＡＬポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節する１つまたは複数の制御配列が存在する発現ベクターを含む。単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作することが、利用される発現ベクターに応じて望ましいまたは必要となる場合がある。組換えＤＮＡ方法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する手法は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、制御配列は、とりわけプロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、適切なプロモーターは、宿主細胞選択に基づき選択される。細菌宿主細胞に関して、本開示の核酸構築物の転写を誘導する適切なプロモーターには、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５巻：３７２７〜３７３１頁［１９７８年］参照）、およびｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０巻：２１〜２５頁［１９８３年］参照）から得られるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７参照）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体、切断、およびハイブリッドプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来であってもよい。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ ８巻：４２３〜４８８頁［１９９２年］参照）。
一部の実施形態では、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結させることが宿主細胞によって認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、ＰＡＬポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能性である任意の適切なターミネーターが、本発明において用いられる。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、上記を参照）。
一部の実施形態では、制御配列は、適切なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、ＰＡＬポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能性である任意の適切なリーダー配列が、本発明において用いられる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列であって、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。最適な宿主細胞において機能性である任意の適切なポリアデニル化配列が、本発明において用いられる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、公知である（例えば、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ．、１５巻：５９８３〜５９９０頁［１９９５年］参照）。
一部の実施形態では、制御配列は、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へ誘導するコード領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレーム中で天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列に外来性のシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に誘導する任意の適切なシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現に用いられる。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、シグナルペプチドコード領域であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野で公知である（例えば、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、５７巻：１０９〜１３７頁［１９９３年］参照）。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「チモーゲン」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプチドへ変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない、任意の適切な供給源から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６参照）。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにさせるものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列には、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞では、適切な調節系には、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌では、適切な調節配列には、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様では、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにプロモーターおよびターミネーター、複製起点等などの１つまたは複数の発現調節領域を、それらが導入される宿主のタイプに応じて含む組換え発現ベクターに関する。一部の実施形態では、本明細書に記載された様々な核酸および制御配列が、組換え発現ベクターを生成するように組み合わされる。組換え発現ベクターは、１つまたは複数の好都合な制限部位を含んで、そのような部位でのＰＡＬポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列を含む核酸配列または核酸構築物を発現のための適当なベクターに挿入して発現される。発現ベクターの作成を伴う一部の実施形態では、コード配列が発現のための適当な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列はベクター中に位置している。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合には供され、ＰＡＬポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターが導入されるべき宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであってもよい。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、その複製が染色体の複製とは無関係である、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体などの染色体外実体として存在するベクター）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有してもよい。一部の代替の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものである。さらに、一部の実施形態では、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡを一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミド、または２つもしくはそれよりも多いベクターもしくはプラスミド、および／またはトランスポゾンが利用される。
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された細胞を容易に選択できるようにする１つまたは複数の選択可能なマーカーを含有する。「選択可能なマーカー」は、その生成物が、殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性等を提供する遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞における使用のための選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、およびそれらの同等物が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、宿主細胞における操作されたＰＡＬ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされたポリペプチドの発現に使用するのに適した宿主細胞は、当技術分野で周知であり、これらには、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞には、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も挙げられる。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドを生成する方法であって、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されたＰＡＬポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。
宿主細胞の適当な培養培地および増殖条件は、当技術分野で周知である。ＰＡＬポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドを細胞に導入する任意の適切な方法が、本発明において用いられることが企図される。適切な手法には、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される特性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、天然起源のまたは操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知の、および／または本明細書に記載された任意の適切な変異誘発および／または指向性進化方法に供することにより得ることができる。例示的な指向性進化法は、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：１０７４７〜１０７５１頁［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号参照）。使用され得る他の指向性進化手順には、とりわけ、スタッガード伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：２５８〜２６１頁［１９９８年］参照）、変異原性ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、３巻：Ｓ１３６〜Ｓ１４０頁［１９９４年］参照）、およびカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３巻：３５２５〜３５２９頁［１９９６年］参照）が挙げられる。
変異誘発および指向性進化方法は、発現、スクリーニング、およびアッセイされ得るバリアントライブラリーを作製するために、ＰＡＬコードポリヌクレオチドに容易に適用することができる。任意の適切な変異誘発および指向性進化方法が、本発明において用いられ、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２６５，２０１、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３３７，１８６、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８３，０１１、６，４８４，１０５、６，４８９，１４６、６，５００，６１７、６，５００，６３９、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１８，０６５、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６０５，４３０、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，６８６，５１５、６，７０３，２４０、６，７１６，６３１、６，８２５，００１、６，９０２，９２２、６，９１７，８８２、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、７，１４８，０５４、７，２２０，５６６、７，２８８，３７５、７，３８４，３８７、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，４６２，４６９、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，７８３，４２８、７，８７３，４７７、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、７，９５７，９１２、７，９８１，６１４、８，０１４，９６１、８，０２９，９８８、８，０４８，６７４、８，０５８，００１、８，０７６，１３８、８，１０８，１５０、８，１７０，８０６、８，２２４，５８０、８，３７７，６８１、８，３８３，３４６、８，４５７，９０３、８，５０４，４９８、８，５８９，０８５、８，７６２，０６６、８，７６８，８７１、 ９，５９３，３２６号、ならびに全ての関連する米国および米国以外の対応物；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７−７８ ［１９９７］； Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５７：３６９−７４ ［１９９６］； Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３−４６２ ［１９８５］； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３−１２０１ ［１９８５］； Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２３７：１−７ ［１９８６］； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、３８：８７９−８８７ ［１９８４］； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、３４：３１５−３２３ ［１９８５］； Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、３：２８４−２９０ ［１９９９］； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：２５９−２６４ ［１９９９］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８−２９１ ［１９９８］； Ｃｒａｍｅｒｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：４３６−４３８ ［１９９７］； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５０４−４５０９ ［１９９７］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３１５−３１９ ［１９９６］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９−３９１ ［１９９４］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：１０７４７−１０７５１ ［１９９４］； ＷＯ ９５／２２６２５； ＷＯ ９７／００７８； ＷＯ ９７／３５９６６； ＷＯ ９８／２７２３０； ＷＯ ００／４２６５１； ＷＯ ０１／７５７６７； ＷＯ ２００９／１５２３３６； およびＵ．Ｓ． Ｐａｔ． Ａｐｐｌｎ． Ｐｕｂｌ． Ｎｏｓ． ２０１１／００８２０５５、２０１４／０００５０５７、２０１４／０２１４３９１、２０１４／０２２１２１６、２０１５／０１３３３０７、２０１５／０１３４３１５、および２０１５／００５０６５８参照；これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、変異誘発処置後に得られる酵素クローンは、酵素調製物を定義された温度（または他のアッセイ条件）に供すること、および熱処理または他の適切なアッセイ条件後に残っている酵素活性の量を測定することによりスクリーニングされる。ＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンが、次いで遺伝子から単離され、ヌクレオチド配列変化（もしあれば）を同定するために配列決定され、および宿主細胞において酵素を発現するのに使用される。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定は、当技術分野で公知の任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学的手法）を用いて行うことができる。
既知の配列の操作されたポリペプチドには、酵素をコードするポリヌクレオチドが、公知の合成方法に従って標準的な固体相方法により調製され得る。一部の実施形態では、最大約１００塩基の断片が、個々に合成され、次いで任意の所望の連続配列を形成するように（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション方法、またはポリメラーゼ媒介方法により）連結されてもよい。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、典型的には自動合成方法で実施されるような、古典的ホスホラミダイト方法を用いた化学合成により調製されてもよい（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．、２２巻：１８５９〜６９頁［１９８１年］；およびＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、３巻：８０１〜０５頁［１９８４年］参照）。ホスホラミダイト方法に従って、オリゴヌクレオチドが合成される（例えば、自動ＤＮＡ合成装置で、精製され、アニールされ、ライゲートされ、および適当なベクターにクローニングされる）。
したがって、一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドを調製する方法は、（ａ）本明細書に記載された任意のバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたＰＡＬポリペプチドを発現させるステップとを含み得る。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列は、１つまたはいくつかの（例えば、最大３、４、５個、または最大１０個の）アミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を必要に応じて有し得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２１個、１〜２２個、１〜２３個、１〜２４個、１〜２５個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個、または１〜５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を必要に応じて有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を必要に応じて有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を必要に応じて有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換である。
発現された操作されたＰＡＬポリペプチドは、任意の所望の改善された特性または特性の組合せ（例えば、活性、選択性、安定性、酸耐性、プロテアーゼ感受性等）について、本明細書に記載されたアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切なアッセイを用いて評価することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞で発現された操作されたＰＡＬポリペプチドのいずれかが、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製に関する任意の１つまたは複数の周知の手法を用いて、細胞および／または培養培地から回収される。
ＰＡＬポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー法には、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、一部には、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等などの要因に依存し、当業者に明らかとなろう。一部の実施形態では、親和性法は、改善されたＰＡＬ酵素を単離するのに使用され得る。親和性クロマトグラフィー精製のために、目的のＰＡＬポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が用いられ得る。抗体の生成のために、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない様々な宿主動物が、ＰＡＬポリペプチド、またはその断片を含む注射により免疫化される。一部の実施形態では、ＰＡＬポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合されたリンカーを用いてＢＳＡなどの適切な担体に結合される。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、本明細書に記載された操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）を、操作されたＰＡＬポリペプチドの生成をもたらす条件下で培養するステップと、操作されたＰＡＬポリペプチドを細胞および／または培養培地から回収するステップとを含む方法により、宿主細胞において生成される。一部の実施形態では、宿主細胞は、１つを超える操作されたＰＡＬポリペプチドを生成する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される、参照配列、配列番号４、６、８、１０、および／または１２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性、ならびに配列番号４、６、８、１０、および／または１２と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有する操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え細菌細胞を、適切な培養条件下で培養して操作されたＰＡＬポリペプチドの生成を可能にするステップと、必要に応じて操作されたＰＡＬポリペプチドを培養物および／または培養細菌細胞から回収するステップとを含む、操作されたＰＡＬポリペプチドを生成する方法を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、１つを超える操作されたＰＡＬポリペプチドを生成する。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドが、組換え宿主細胞および／または培養培地から回収されると、これらは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によりさらに精製される。一部のさらなる実施形態では、精製されたＰＡＬポリペプチドは、他の成分および化合物と組み合わされて、操作されたＰＡＬポリペプチドを、種々の用途および使用（例えば、医薬組成物）のために必要に応じて含む組成物および製剤を提供する。
組成物：
本発明は、数多くの組成物における使用に適した操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。これらの組成物は、医薬品、食事／栄養サプリメント、食品、飼料、および精密化学生産を含むがこれらに限定されない多くの分野で用いられる。例えば、一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの操作されたＰＡＬバリアントおよび／または少なくとも１つのＰＡＬバリアントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む食品および／または飼料を提供する。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの操作されたＰＡＬバリアントを含む飲料を提供する。
一部の実施形態では、食品、飼料、および／または栄養／食事サプリメント中の操作されたＰＡＬバリアントは、グリコシル化される。さらに、操作されたＰＡＬバリアントは、任意の適切な食用酵素送達マトリックスにおいて用いられる。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬバリアントは、バリアントの摂取時に動物の消化管内でＰＡＬバリアントが迅速に分散するために設計された食用酵素送達マトリックス中に存在する。
本発明はまた、精密化学および他の工業的に重要な化合物の生産における使用に適した操作されたＰＡＬポリペプチドも提供する（例えば、米国特許出願第２０１３／０３４０１１９号、第２０１３／０００５０１２号、および第２００５／０２６０７２４号、ならびにＷＯ２０１２／１２２３３３参照）。
医薬組成物および他の組成物：
本発明は、食事／栄養サプリメントなどの医薬組成物および他の組成物における使用に適した操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。
投与方法に応じて、本発明による操作されたＰＡＬの治療有効量を含むこれらの組成物は、固体、半固体、または液体の形態である。一部の実施形態では、組成物は、希釈剤、緩衝液、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、充填剤、および他の成分などの他の薬学的に許容される成分を含む。製剤化および投与のための手法に関する詳細は当技術分野で周知であり、文献に記載されている。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、経口医薬組成物における使用のために製剤化される。丸剤、錠剤、ジェルタブ、カプセル、ロゼンジ、糖衣錠、粉末、ソフトゲル、ゾル−ゲル、ゲル、エマルジョン、埋込剤、パッチ、噴霧剤、軟膏、リニメント、クリーム、ペースト、ゼリー、塗布剤、エアロゾル、チューイングガム、粘滑剤、スティック、懸濁液（油性懸濁液、水中油型エマルジョン等を含むが、これらに限定されない）、スラリー、シロップ、徐放製剤、座薬等を含むがこれらに限定されない、操作されたＰＡＬポリペプチドの送達において使用するための任意の適切なフォーマットが、本発明において用いられる。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、注射に適したフォーマット（すなわち、注射用製剤）で提供される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、シリカベースの（例えば、オキシシラン）ゾル−ゲルを含む、ゾル−ゲルなどの生体適合性マトリックスにおいて提供される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、カプセル化される。一部の代替の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、ナノ構造（例えば、ナノチューブ、ナノチューブル、ナノカプセル、またはマイクロカプセル、ミクロスフェア、リポソーム等）でカプセル化される。実際に、本発明は、任意の特定の送達製剤および／または送達手段に限定されることを意図するものではない。操作されたＰＡＬポリペプチドは、非経口、経口、局所、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、埋込剤経由等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な手段により投与されることが意図される。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化（すなわち、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］または活性化ＰＥＧ等で修飾される）または他の化合物によって化学的に修飾される（例えば、Ｉｋｅｄａ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２９巻：２８３〜２８７頁［２００５年］；米国特許第７，５３１，３４１号、第７，５３４，５９５号、第７，５６０，２６３号、および第７，５３，６５３号；米国特許出願公開第２０１３／００３９８９８号、第２０１２／０１７７７２２号等参照）。実際に、本発明は、任意の特定の送達方法および／または機構に限定されることを意図するものではない。
一部のさらなる実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、マトリックス安定化酵素結晶を含む製剤で提供される。一部の実施形態では、製剤は、架橋結晶性の操作されたＰＡＬ酵素、および酵素結晶に接着する反応性部分を有するポリマーを含む。本発明はまた、ポリマーの操作されたＰＡＬポリペプチドも提供する。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物は、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、および／またはソルビトール）、デンプン（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物性デンプン）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ガム（例えば、アラビア、トラガント、グアー等）、および／またはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲン等）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の一般に使用される担体化合物を含む。経口製剤における追加の成分には、着色剤およびまたは甘味剤（例えば、グルコース、スクロースおよびマンニトール）および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、および腸溶コーティング（例えば、メタクリレートポリマー、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースフタレート、および／または当技術分野で公知の任意の他の適切な腸溶コーティング）が挙げられ得る。一部の実施形態では、崩壊剤または可溶化剤が含まれる（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩）。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、特に液体製剤における保存剤、懸濁剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸、および／または乳化剤を含むがこれらに限定されない、様々な追加の成分と組み合わされる。
一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、特に液体製剤における保存剤、懸濁剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸、および／または乳化剤を含むがこれらに限定されない、様々な追加の成分と組み合わされる。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、ＫＵＶＡＮ（登録商標）テトラヒドロビオプテリン（ＢｉｏＭａｒｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）、制酸薬（例えば、オメプラゾール、エソメプラゾールおよび他のプラゾール）、および任意の他の適切な化合物を含むがこれらに限定されない、ＰＫＵの処置において使用される他の化合物と組み合わせて対象に投与される。
一部の実施形態では、本発明は、血液、脳脊髄液等などの体液中のフェニルアラニン濃度の減少における使用に適した、操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。血中フェニルアラニンレベルが上昇した患者に投与される操作されたＰＡＬポリペプチドの投与量は、患者の遺伝子型、患者の全身状態、および当業者に公知の他の要因に依存する。一部の実施形態では、血中フェニルアラニンレベルが上昇したＰＫＵ患者は、３６０ｕＭを超える血中フェニルアラニン濃度を有する。しかし、本発明は、より低いフェニルアラニン血中濃度を有する患者で用いられることから、本発明は、３６０ｕＭを超える血中フェニルアラニン濃度を有する患者への投与に限定されることを意図するものではない。一部の実施形態では、組成物は、患者への単回投与または反復投与が意図される。一部の実施形態では、患者に投与される組成物中の操作されたＰＡＬポリペプチドの濃度は、疾患（例えば、ＰＫＵならびに／またはＰＫＵ関連状態、疾患および／もしくは症状）の症状を有効に処置、改善および／または防止するのに十分であることが企図される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、他の医薬および／または食事組成物と組合せて投与される。
一部の実施形態では、ＰＡＬ酵素は、チロシン血症Ｉ型、チロシン血症ＩＩ型、チロシン血症ＩＩＩ型、およびアルカプトン尿症などのチロシン代謝障害を処置するための治療用タンパク質として用いられる。チロシン代謝のこれらの障害は、チロシンの分解に関与する酵素の１つが、対応する遺伝子の変異が原因で部分的に機能性、または非機能性となる常染色体代謝性遺伝障害である。機能性のこの欠如は、血流中のチロシンおよび他のチロシン代謝産物レベルの上昇をもたらす。チロシンは、フェニルアラニンに由来するため、フェニルアラニンおよびチロシン摂取を制限することが、チロシン代謝障害を有する患者にとって有益となる。ＰＡＬ酵素は故に、チロシン代謝障害の有望な処置である。
チロシン代謝障害を有する患者が早期に処置されなければ、高レベルのチロシンおよびその分解生成物の一部が、肝不全および腎不全、肝臓がん、知的障害、ならびにさらには死亡を含む重大な医学的問題を引き起こす可能性がある。
一部の実施形態では、本発明は、チロシン血症およびアルカプトン尿症患者の血液、脳脊髄液等などの体液中のフェニルアラニン濃度の減少における使用に適した、操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。血中チロシンレベルが上昇した患者に投与される操作されたＰＡＬポリペプチドの投与量は、患者の遺伝子型、患者の全身状態、および当業者に公知の他の要因に依存する。一部の実施形態では、組成物は、チロシン血症またはアルカプトン尿症患者への単回投与または反復投与が意図される。一部の実施形態では、患者に投与される組成物中の操作されたＰＡＬポリペプチドの濃度は、疾患（例えば、チロシン血症Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型、またはアルカプトン尿症、疾患および／または症状）の症状を有効に処置、改善および／または防止するのに十分であることが企図される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、ニチシノンまたは他の医薬および／もしくは食事組成物と組合せて、チロシン血症およびアルカプトン尿症患者に投与される。
工業用組成物：
本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、工業用組成物において用いられることが企図される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、食品および／または飼料工業において使用するために製剤化される。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、追加の酵素（例えば、セルラーゼ、ラッカーゼ、およびアミラーゼ）などの動物飼料成分と混合される、顆粒化またはペレット化された生成物において製剤化される。一部の代替の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、液体動物飼料組成物（例えば、水性または油性スラリー）において使用される。故に、一部の実施形態では、本発明の操作されたＰＡＬバリアントは、ペレットおよび他の加工飼料／食品を生産するために使用される処理に耐えるのに十分に熱耐性および熱安定性である。
本発明の操作されたＰＡＬバリアントはまた、フェニルアラニンおよび／またはフェニルアラニン誘導体の生成においても用いられる。
本発明の上述のおよび他の態様は、以下の非限定的な例に関連してより良く理解することができる。例は、例示の目的でのみ提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
実験
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的でのみ提供され、本発明を限定すると解釈されるべきはでない。
以下の実験の開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分（複数可））；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時間（複数可））；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（セ氏温度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＡＵＣ（濃度曲線下面積）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能な、一般に使用される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；ＰＨＥおよびｐｈｅ（フェニルアラニン）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；ＰＫＵ（フェニルケトン尿症）；ＭＨＣ（主要組織適合複合体）；ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）；ＨＬＡ−ＤＲ（６番染色体上のＨＬＡ複合体によってコードされるＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照と比べた倍数改善）；ＬＢ（ルリアブロス）；Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）；ＰｒｏＳｐｅｃ（ＰｒｏＳｐｅｃ Ｔａｎｙ Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｙｏｎｋｅｒｓ、ＮＹ）；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｌ，Ｃｏｒｐ．、Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｈｎｅｒ、ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒｐ．の一部、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）； Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．、Ｄａｖｅｎｔｒｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）；Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；Ｈａｒｌａｎ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）；ＡＢ Ｓｃｉｅｘ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）；ＰｅｔＡｇ Ｉｎｃ．（ＰｅｔＡｇ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＩＬ）；およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が、本発明において用いられる。一部の場合では（以下に示すように）、ポリヌクレオチド配列と、その後にコードされたポリペプチドが続く。
ＷＴ ＡｖＰＡＬのポリヌクレオチド配列（配列番号１）：
Figure 2020505942
 ＷＴ ＡｖＰＡＬのポリペプチド配列（配列番号２）：
Figure 2020505942
 バリアント＃１のポリヌクレオチド配列（配列番号３）
Figure 2020505942
Figure 2020505942
 バリアント＃１のポリペプチド配列（配列番号４）
Figure 2020505942
（実施例１）
ＰＡＬ遺伝子取得および発現ベクターの構築
Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＡｖＰＡＬ）遺伝子配列を、Ｅ．ｃｏｌｉでの最適化された発現のためのコドンを用いて設計し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ１６ｂにクローニングしてｐＥＴ１６ｂ−ＡｖＰＡＬを得、米国特許第９，６１１，４６８号の実施例１に記載されているようにサブクローニングした。プラスミド構築物を、Ｗ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。当業者に一般的に公知の指向性進化法を使用して、このプラスミド構築物から遺伝子バリアントのライブラリー（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号、およびＷＯ２０１０／１４４１０３参照）およびＡｖＰＡＬ誘導体を作製した。一部の実施形態では、抗菌薬耐性マーカーを欠く発現ベクターが用いられる。
（実施例２）
ハイスループット（ＨＴＰ）増殖およびアッセイ
ＰＡＬおよびＰＡＬバリアントのハイスループット（ＨＴＰ）増殖
形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングして選択した。一晩、３７℃でインキュベーション後、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充した１８０μｌ／ウェルＬＢを充填した９６ウェルシャロー平底プレート（ＮＵＮＣ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルにコロニーを入れた。培養物を振とう培養機（２００ｒｐｍ、３０℃、および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）で一晩、１８〜２０時間増殖させた。
一晩増殖試料（２０μＬ）を、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充した３８０μＬのテリフィックブロスを充填したＣｏｓｔａｒ ９６ウェルディーププレートに移した。プレートを、振とう培養機（２５０ｒｐｍ、３０℃、および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）で１３５分間インキュベートした。次いで、滅菌水中４０μＬの１０ｍＭ ＩＰＴＧで細胞を誘導し、振とう培養機（２５０ｒｐｍ、３０℃、および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）で一晩、２０〜２４時間インキュベートした。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分）、上清を捨て、分析の前に細胞を−８０℃で凍結した。
ＨＴＰペレットの溶解
最初に、５００μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍｌ硫酸ポリミキシンＢ）を細胞ペレットに添加した。混合物を室温で１．５〜２時間撹拌し、本明細書に記載された様々なＨＴＰアッセイにおける清澄化溶解物の使用の前に遠心分離した（４０００ｒｐｍ×５分）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるこれらの溶解物の分析は、ＰＡＬの予測ＭＷと一致する、約６０ｋＤａの見かけのＭＷの過剰発現されたタンパク質の存在を明らかにした。
清澄化溶解物の分析
経時的な２９０ｎｍでの吸光度の変化によりケイ皮酸の形成を測定して、ＰＡＬバリアント活性を決定した。このアッセイのために、２００ｍＭトリス／５０ｍＭフェニルアラニン、ｐＨ７．５、または２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニン ｐＨ７．０のどちらか１００μＬ、８０μＬの水、および２０μＬの清澄化溶解物を、ポリアクリレート９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。反応物を簡単に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ ３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを用いて２９０ｎｍでの吸光度を経時的に追跡して（５〜２０分にわたって１２〜２０秒ごと）、活性を決定した。
プロテアーゼで前処置した清澄化溶解物のＨＴＰ分析
ＰＡＬバリアントの活性は、腸管（例えば、腸上部）の環境をシミュレートするためのキモトリプシンおよびトリプシンとのインキュベーション後に決定した。最初に、３０μＬのプロテアーゼミックス（０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌキモトリプシン（Ｃ４１２９ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｔ７４０９ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍＭ ＨＣｌ）、５００ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０中２０ｍＭタウロコール酸ナトリウム０〜３０μＬ、および９０〜１２０μＬの清澄化溶解物を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３７９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。プレートを密封し、分析の前に１時間、振とうしながら（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）振とう培養機ＨＴ Ｉｎｆｏｒｓ ＡＪ１８５、４００ｒｐｍ、１’’振幅）３７℃でインキュベートした。アッセイのために、２００ｍＭトリス／５０ｍＭフェニルアラニン ｐＨ７．５または２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニン ｐＨ７．０のどちらか１００μＬ、および１００μＬのプロテアーゼ処置溶解物を、ポリアクリレート９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。反応物を簡単に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ ３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを用いて２９０ｎｍでの吸光度を経時的に追跡して（５〜２０分にわたって１２〜２０秒ごと）、活性を決定した。結果を以下の表に示す。
高温で貯蔵後のＰＡＬバリアントのＨＴＰ分析
ハイスループットで増殖させたＰＡＬバリアントの溶解物を、６５℃で１時間インキュベートし、不溶性材料をペレット化した（４０００ｒｐｍ×１０分）。上清を新しい９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、凍結し、乾燥粉末に凍結乾燥した。凍結乾燥酵素を、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）ＨＴ振とう培養機（Ｉｎｆｏｒｓ ＡＪ１８５）で４５℃、最大１０日間インキュベートした。その後、凍結乾燥酵素を４００μＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、１０分間の撹拌により混合した。アッセイのために、１００μＬの２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニン ｐＨ７．０、８０μＬのｄｄＨ２Ｏおよび２０μＬの酵素懸濁液を、ポリアクリレート９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。反応物を簡単に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ ３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを用いて２９０ｎｍでの吸光度を経時的に追跡して（５〜２０分にわたって１２〜２０秒ごと）、活性を決定した。
（実施例３）
振とうフラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥溶解物
上記の実施例２に記載のように増殖させた選択ＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。各培養物からの単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む５０ｍｌルリアベルターニ培地に移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間増殖させ、約１：１０の希釈で、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２５０ｍｌのテリフィックブロスに０．２の最終ＯＤ６００まで継代培養した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１３５分間、０．６のＯＤ６００までインキュベートし、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、培養物を４０００ｒｐｍ×１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを３０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した。細胞をペレット化し（１０分間、２８６０×ｇ）、１２ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．５に再懸濁し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ細胞破壊システム（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１７，０００ｐｓｉで溶解した。溶解物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍ×３０分）、上清を凍結し、凍結乾燥して酵素粉末を作製した。
振とうフラスコ培養物からのＰＡＬの精製
選択バリアントを、上記のように振とうフラスコ培養で飽和まで増殖させた。飽和培養物を遠心分離（４０００ｒｐｍ×２０分）によりペレット化し、細胞ペレットを精製の前に−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットを室温で解凍し、細胞１ｇあたり５ｍｌの緩衝液で２０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した。１１０ｐｓｉの圧力設定でマイクロフリュイダイザーを用いて、試料スラリーを溶解した。得られた溶解物は、１０，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離と、その後の０．２μｍ ＰＥＳフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した濾過により清澄化した。
濾過後、得られた溶解物を、１０ｍＭフェニルアラニンの存在下または非存在下、５５〜６５℃で１．５〜２時間加熱した。溶解物を加熱から取り除き、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１時間、遠心分離によって清澄化した。可溶性ＰＡＬを含有する上清を、次いで０．２μｍ ＰＥＳフィルターを通して濾過した。
バルク結晶化を微粒子フリー溶液で行った。濾過濃縮物および逆溶媒（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５ ２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０）を別々に４０℃まで加熱した。逆溶媒を、曇り点が持続するまで少しずつ増量してゆっくり添加した。溶液が曇り点に達した後、少量の既存の結晶を溶液に添加して接触シーディングを達成した（このステップは必須ではない）。溶液を６時間にわたって４０℃から４℃に線形冷却した。定期的に懸濁液を穏やかに混合して、固体を再懸濁した。懸濁液を１２〜２４時間、４℃で維持した。沈殿結晶を保持しながら液体をデカントした。結晶性固体を水で洗浄して残留ＰＥＧを除去した。洗浄した結晶を一晩、凍結乾燥により乾燥した。
（実施例４）
精製ＰＡＬおよびＰＡＬバリアントの特徴付け
この実施例では、野生型およびバリアントＰＡＬを特徴付けるために行われたアッセイを記載する。
貯蔵条件に対する耐性
凍結乾燥酵素バリアントを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）ＨＴ振とう培養機（Ｉｎｆｏｒｓ ＡＪ１８５）で４５℃、１、５、７、または１０日間インキュベートした。凍結乾燥酵素を４００μＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、１０分間の撹拌により可溶化した。アッセイのために、１００μＬの２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニン ｐＨ７．０、８０μＬのｄｄＨ２Ｏおよび２０μＬの再懸濁液を、ポリアクリレート９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。反応物を簡単に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ ３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを用いて２９０ｎｍでの吸光度を経時的に追跡して（５〜２０分にわたって１２〜２０秒ごと）、活性を決定した。
腸液に対する耐性
実施例３に記載のように調製したＰＡＬバリアント試料を、模擬腸液に２ｇ／Ｌで溶解した。４つの模擬腸液：空腹状態模擬腸液（タウロコール酸ナトリウム３ｍＭ、レシチン０．２ｍＭ、マレイン酸１９．１２ｍＭ、水酸化ナトリウム３４．８ｍＭ、塩化ナトリウム６８．６２ｍＭ、ｐＨ６．５）、初期摂食状態模擬腸液（タウロコール酸ナトリウム１０ｍＭ、レシチン３ｍＭ、マレイン酸２８．６ｍＭ、水酸化ナトリウム５２．５ｍＭ、塩化ナトリウム１４５．２ グリセリルモノコール酸塩６．５ｍＭ、オレイン酸ナトリウム４０ｍＭ、ｐＨ６．５）、中期摂食状態模擬腸液（タウロコール酸ナトリウム７．５ｍＭ、レシチン２ｍＭ、マレイン酸４４ｍＭ、水酸化ナトリウム６５．３ｍＭ、塩化ナトリウム１２２．８ｍＭ、グリセリルモノコール酸塩５ｍＭ、オレイン酸ナトリウム３０ｍＭ、ｐＨ５．８）、後期摂食状態模擬腸液（タウロコール酸ナトリウム４．５ｍＭ、レシチン０．５ｍＭ、マレイン酸５８．０９ｍＭ、水酸化ナトリウム７２ｍＭ、塩化ナトリウム５１ｍＭ、グリセリルモノコール酸塩１ｍＭ、オレイン酸ナトリウム０．８ｍＭ、ｐＨ５．４）の各々に、ＰＡＬバリアントを溶解した。ブタトリプシンおよびウシキモトリプシン（各１００ｍｇ）を２ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０に溶解し、各擬似液中１．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。酵素活性を、トリプシンおよびキモトリプシンありおよびなしの各擬似液で経時的に測定した。反応混合物をＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）ＨＴ振とう培養機（Ｉｎｆｏｒｓ ＡＪ１８５）、４００ｒｐｍ（１’’振幅）で、３７℃、１〜２４時間インキュベートした。次いで、２０μＬの反応物を、８０μの水および１００μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭフェニルアラニン ｐＨ７．０と混合した。各溶液を簡単に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ ３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを用いて２９０ｎｍでの吸光度を経時的に追跡して（５〜２０分にわたって１２〜２０秒ごと）、活性を決定した。
（実施例５）
発酵および結晶化によるＰＡＬバリアントの生成
発酵バッチ培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５２ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム二水和物０．５９ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ ７．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．７ｇ／Ｌ、酵母エキス（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）２．０ｇ／Ｌ、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ ２０００）０．３ｍｌ／Ｌ、クエン酸鉄アンモニウム（ＩＩＩ）０．０５ｇ／Ｌ、微量元素ストック溶液５．０ｍｌ／Ｌ（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ２．０ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）６ Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ（Ｈ２ＳＯ４でｐＨ２〜３に調整）））に、約１０ｇ／Ｌの初期濃度でグルコースを補充した。播種後、培養物を３７℃、４５％未満の溶解酸素レベルで制御した。流加供給（グルコース一水和物５００ｇ／Ｌおよび硫酸マグネシウム、無水物５．１ｇ／Ｌ）を、７．００〜７．０５の設定点のｐＨの急上昇により示されるバッチグルコースの枯渇後に初期設定した。グルコース供給を０．４１ｍｌ／分の速度で開始し、指数関数プロファイルを用いて１２時間かけて２．４２ｍｌ／分の最終供給速度まで増加させた。次いで、発酵物の残りについては供給を２．４２ｍｌ／分の定速で保った。
供給液の累積体積０．９４Ｌが発酵槽に供給されたら、温度を３０℃に下げ、１ｍＭの濃度までＩＰＴＧを添加して、ＰＡＬバリアントの発現を誘導した。総供給体積３．８４Ｌが発酵槽に送達されると、発現相が停止した。総誘導時間は約２０時間であった。
細胞を１０分間の遠心分離（３７５２×ｇ）によって回収し、ペレットを直接使用または凍結貯蔵した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０からなる低温緩衝液（４℃）を使用して、元の回収体積までペレットを再懸濁した。再懸濁プロセス中、ｐＨをＮａＯＨで８．０±０．２に調整した。懸濁液を均質化の前に６℃に冷却した。適当な細胞破壊弁が取り付けられた高圧ホモジナイザー（ＡＰＶ １０００）を用いて、細胞内酵素を１１，５００±５００ｐｓｉｇで細胞から放出した。細胞破壊後すぐに、ホモジネートを１５±２℃に冷却し、ホモジネートのｐＨをＮａＯＨを用いて８．０±０．２に調整した。１０％ｗ／ｖ ＳｕｐｅｒＦｌｏｃ Ｃ５８１を細胞ホモジネートに添加した。添加中、ホモジネートおよびＣ５８１混合物を撹拌して完全混合を確保した。懸濁液を撹拌しながら１０±２℃で３０分間インキュベートし、次いで５５℃±２℃に加熱し、５５℃で１時間維持した。熱処理懸濁液を１０±２℃に冷却した。液体画分からの固体の分離は、遠心分離によって達成した。ホモジネートを５０５０×ｇで３５分間遠心分離した。タンパク質濃度を３０ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌにするために、濃縮ステップを行った。濃縮清澄化溶解物を、２つの体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０で透析濾過した。溶液の濃度および緩衝液交換は、ＴａｎｇｅｎＸ ３０ｋＤ ＰＥＳ ＮｏｖａＳｅｔ（商標）−ＬＳカセットを用いて達成した。ＰＥＳ膜を備えた０．２μｍ Ｎａｌｇｅｎｅ（商標）Ｒａｐｉｄ−Ｆｌｏｗ（商標）使い捨てフィルターユニットを通して、濃縮物を濾過滅菌した。
濾過濃縮物および逆溶媒（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５ ２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０）を、別々に４０℃に加熱した。曇り点が持続するまで、逆溶媒をＰＡＬバリアント濃縮物にゆっくり添加した。溶液が曇り点に達した後、少量の結晶を溶液に添加して接触シーディングを達成した。溶液を定期的に穏やかに混合しながら、６時間にわたって４０℃から４℃に線形冷却した。懸濁液を１２〜２４時間、４℃で維持した。液体をデカントし、結晶性固体を水で洗浄して残留ＰＥＧを除去した。洗浄した結晶性固体を次いで一晩、凍結乾燥した。
（実施例６）
スクリーニング結果
バリアント＃１の配列に組み込まれた追加のＦ４５０Ａ変異を有するバリアント＃２（配列番号６）を含む、配列番号４のバリアント（「バリアント＃１）を生成した。バリアントは、バリアント＃２を開始骨格としても用いて生成した。これらのバリアントを、実施例２に記載のように４５℃で０または１０日間、凍結乾燥形態でインキュベーション後、ＰＡＬ活性についてテストした。さらに、フェニルアラニン残基の変異を有するバリアントを０日目のみテストした。陽性対照と比べて対応する倍数改善（ＦＩＯＰ）を伴う活性バリアントのリテストデータを、以下の表６．１に示す。このデータセットでは、陽性対照はバリアント＃２である。
Figure 2020505942
Figure 2020505942
上記の表では、活性倍数改善（ＦＩＯＰ）は、骨格配列番号６（バリアント＃２）と比較され、次のように定義される：「−」＝０．２倍未満の活性；「＋」＝０．２倍を超えるが、１倍未満の活性；「＋＋」＝１倍を超えるが、１．２５倍未満の増加した活性；「＋＋＋」＝１．２５倍を超えるが、１．５倍未満の増加した活性；および「＋＋＋＋」＝１．５倍を超える活性。
（実施例７）
ヒットの確認
上記の表６．１に示した結果に基づき、表７．１（以下の）にリストされたバリアントの活性を、実施例３の説明に従って調製した酵素試料について確認した。
Figure 2020505942
上記の表では、活性倍数改善（ＦＩＯＰ）は、骨格配列番号６（バリアント＃２）と比較され、次のように定義される：「＋」＝０．９５倍を超えるが、１倍未満の増加した活性；「＋＋」＝１倍を超えるが、１．２５倍未満の増加した活性；および「＋＋＋」＝１．２５倍を超える増加した活性。
（実施例８）
追加のバリアントのスクリーニング結果
実施例６に記載のように同定した有益な変異を、配列番号８に組み換え（バリアント番号２３）（表６．１および７．１に示す）、新しいバリアントを、４５℃で０および１０日間、凍結乾燥形態でインキュベーション後、ＰＡＬ活性についてテストした。陽性対照と比べて対応する倍数改善（ＦＩＯＰ）を伴う活性バリアントのリテストデータを、バリアント＃２３を陽性対照として表８．１に示す。これらのアッセイテスト結果は、バリアントに関する配列決定データが得られる前に得られたため、以下の表では、バリアントの一部が同じ置換を含有している（すなわち、重複している（バリアント５２および６１など））。
Figure 2020505942
Figure 2020505942
上記の表では、活性倍数改善（ＦＩＯＰ）は、骨格（配列番号８（バリアント＃２３）と比較され、次のように定義される：「−」＝０．２倍より小さい活性；「＋」＝０．２倍を超えるが、１倍未満の活性；「＋＋」＝１倍を超えるが、１．２５倍未満の増加した活性；「＋＋＋」＝１．２５倍を超える活性であるが、１．５倍未満の増加した活性；および「＋＋＋＋」＝１．５倍を超える活性。
（実施例９）
フェニルアラニン残基の除去
フェニルアラニン残基が、活性の喪失をもたらすことなく変更された（すなわち、活性が中立または有益のどちらかであるフェニルアラニン変異）、配列番号６（バリアント＃２）のバリアントの活性結果を表９．１に示す。表８．１と同様に、これらのアッセイテスト結果は、バリアントに関する配列決定データが得られる前に得られたため、以下の表では、バリアントの一部が同じ置換を含有している。
Figure 2020505942
Figure 2020505942
上記の表では、活性倍数改善（ＦＩＯＰ）は、骨格配列番号６（バリアント＃２）と比較され、次のように定義される：「＋」＝配列番号６（バリアント＃２）または配列番号８（バリアント＃２３）と類似した活性
（実施例１０）
ラウンド９のスクリーニング結果
バリアント＃１２６が、改善された貯蔵安定性およびプロテアーゼ耐性をハイスループットスクリーニングで示したことから、以前の結果の分析に基づき、配列番号１２（バリアント＃１２６）を骨格として用いてコンビナトリアルライブラリーを設計した。バリアント＃１２６（配列番号１１）をコードするポリヌクレオチド配列は、バリアント＃５１（配列番号９）と比べてａ２１ｔ変異を含有する。このバリアントを、実施例４に記載の様々な模擬腸液において野生型ＡｖＰＡＬと比較した。４５℃で凍結乾燥酵素をインキュベーション後Ｔ＝０およびＴ＝１０日に、バリアント＃１２６と比べて活性の対応する倍数改善を伴う活性変異を、以下の表１０．１に示す。実施例の他の表と同様に、これらのアッセイテスト結果は、バリアントに関する配列決定データが得られる前に得られたため、以下の表では、バリアントの一部が同じ置換を含有している。
Figure 2020505942
Figure 2020505942
この表では、活性倍数改善（ＦＩＯＰ）は、骨格配列番号１２（バリアント＃１２６）と比較され、次のように定義される：「−」＝０．２倍未満の活性；「＋」＝０．２倍を超えるが、１倍未満の活性；「＋＋」＝１倍を超えるが、１．２５倍未満の増加した活性；「＋＋＋」＝１．２５倍を超える活性。
（実施例１１）
血漿フェニルアラニンレベル
血漿試料を、フェニルアラニンおよびケイ皮酸について分析した。フェニルアラニンまたはケイ皮酸を５０／５０アセトニトリル：ＤＭＳＯに溶解して内部標準を作製し、次いで５０％アセトニトリル中１０〜４０，０００ｎｇ／ｍｌの作用濃度まで希釈した。これらの試料を、ブランクイヌ血漿（１０μＬ：９０μＬ）に希釈し、次いで３００μＬの内部標準（アセトニトリル中２５０ｎｇ／ｍｌのｄ８−Ｐｈｅまたはｄ７−ＣＡ）で希釈した。動物血漿試料（２０μＬ）をアセトニトリル（８０μＬ）で希釈し、次いで３００μＬの内部標準で希釈した。フェニルアラニン濃度の分析のために、３０μＬの試料を、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、５μｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ／ＣＴＣ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを用いて注射した。０．５％ギ酸、５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、ならびに０．５％ギ酸を含む９０％アセトニトリルおよび１０％水、２．５分間の勾配を用いて試料を溶出し、フェニルアラニンは１．３分で溶出した。
ケイ皮酸の分析のために、３０μＬの試料を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｉｌｉｃａカラム（２．１×１００ｍｍ、５μｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ／ＣＴＣ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを用いて注射した。５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液および９０％アセトニトリル／１０％水、３．５分間の勾配を用いて試料を溶出し、ケイ皮酸は２．３分で溶出した。分析物は、ＥＳＩポジティブモード（フェニルアラニン）またはネガティブモード（ケイ皮酸）でＭＲＭスキャンを行うＡＰＩ−４０００Ｑ−ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて検出した。同位体標識フェニルアラニン誘導体の移行は１６６．２／１２０．０、１７１．２／１２５．１、および１７４．２／１２８．２であった。同位体標識ケイ皮酸の移行は、１４６．８／１０２．９、１５１．９／１０７．９、および１５３．９／１１０．１であった。
（実施例１２）
イヌモデルにおけるバリアント＃１２６の腸の活性
胃腸管を通過するときのＰＡＬバリアントの安定性および活性を評価するために、ビーグル犬に精製酵素バリアントを経管栄養した。イヌの血液中のフェニルアラニンおよびケイ皮酸の濃度に対するこれらのバリアントの効果を測定した。イヌを一晩（１２〜１６時間）、および試験全体を通して酵素投与８時間後まで絶食させた。全てのイヌに、試験開始２時間前および＋３時間で再びファモチジン（４０ｍｇ／イヌ）の経口用量を投与して胃の酸性化を最小化した。試験前血漿試料（約２ｍＬ）を、−２時間（最初のファモチジン投与の直前）、−３０分、および−１０分で採取した（これらの３つの測定値の平均を、投与後値を正規化するのに使用した）。ビヒクルまたはバリアント＃１２６の投与のちょうど５分後、ｔ＝０に、全てのイヌが懸濁液中（４ｍＬ／ｋｇ）粉末化ヤギ乳Ｅｓｂｉｌａｃ（ＰｅｔＡｇ）タンパク質９００ｍｇ／ｋｇ ＰＯ投与を受けた。追加の血漿試料を、処置投与後＋１５分、＋３０分、ならびに＋１、＋２、＋４、＋６、＋８、および＋２４時間で採取した。血漿試料を、実施例１１に記載のようにＰｈｅおよびＣＡについて分析した。
結果を図３、４、および５に示す。図３では、種々の群の相対血中フェニルアラニンレベルが示されている。ビヒクルを投与すると、１．３５倍のフェニルアラニンレベルの増加が観察された。バリアント＃１２６の全ての用量の投与は、この即時のフェニルアラニンの急上昇を抑制し、２００ｍｇ／ｋｇ群をのぞいてｔ＝１時間での血中フェニルアラニンの低下をもたらした。２時間時点では、１２０ｍｇ／ｋｇ群は、血中フェニルアラニンの３４％低下を示した。
図５は、種々の群のケイ皮酸レベルを示す。ビヒクルを除く全ての群が、バリアント＃１２６を投与すると、ケイ皮酸の迅速な出現を示した。ケイ皮酸形成の迅速な発症は、１２０ｍｇ／ｋｇ用量については１５分、ＰＡＬ−６０ｍｇ／ｋｇ用量については３０分、および２００ｍｇ／ｋｇ用量については１時間時点でＣｍａｘに至る。ケイ皮酸は、全ての用量群において１０時間血漿中に検出される。２００ｍｇ／ｋｇ用量群では、ケイ皮酸は、２４時間ベースラインを上回り続ける。
図５では、バリアント＃１２６投与後最初の４時間の間に形成されるケイ皮酸の量を、ＡＵＣとして定量化した。６０、１２０、および２００ｍｇ／ｋｇ群のＡＵＣは、ビヒクル応答とは異なり統計的に有意である。
（実施例１３）
カニクイザルにおけるバリアント＃１２６の腸の活性
カニクイザルを使用して、血漿フェニルアラニンおよびケイ皮酸レベルを測定することにより、フェニルアラニンをケイ皮酸に変換するバリアント＃１２６の有効性を評価した。動物の一部は、バリアント＃１２６の投与の２時間前にファモチジンの用量（サル１匹あたり２０ｍｇ）を受けた。酵素を経管栄養により投与し、続いて５分間後に９００ｍｇ／ｋｇ ヤギ乳Ｅｓｂｉｌａｃ（ＰｅｔＡｇ）タンパク質を投与して試験を開始した（ｔ＝０）。血漿試料を、実施例１１に記載のようにＰｈｅおよびＣＡについて分析した。
図６では、種々の群の相対的血漿フェニルアラニンレベルを、バリアント＃１２６の投与後最初の８時間にわたってプロットしている。ビヒクルの投与は、１時間時点でフェニルアラニンレベルの１．７倍の増加をもたらした。バリアント＃１２６の全ての用量の投与は、このフェニルアラニンの急上昇を抑制し、１〜２時間後に血中フェニルアラニンの低下をもたらした。バリアント＃１２６で処置した全ての群が、ビヒクルと比べて１時間時点で２０％〜３８％の血漿フェニルアラニンの低下を示した。
図７に示すように、フェニルアラニンの相対的低下を、０〜４時間の期間のＡＵＣとして定量化した。バリアント＃１２６を投与された全ての群が、ビヒクル対照と比べて、平均で２２％低いフェニルアラニンのＡＵＣを有した。
図８に示すように、種々の用量群の血漿中の時間依存的ケイ皮酸濃度が示されている。図８（上）は、ファモチジンで前処置された群のケイ皮酸形成を示し、図８（下）は、投与の前にファモチジンで処置されなかった群のそのようなデータを示す。ケイ皮酸レベルは、迅速に上昇して１時間時点でＣｍａｘに達し、次いで４時間までにベースライン近くまで減少した。ケイ皮酸はビヒクル対照群では検出されなかった。
図９に示すように、投与後最初の０〜４時間の間のケイ皮酸の形成を、ＡＵＣとして定量化した。図９（上）は、ファモチジンで前処置された群のＡＵＣを示す。用量の１０倍の増加は、ケイ皮酸生成の２倍未満の増加をもたらした。図９（中）は、ファモチジンで前処置されなかった群のＡＵＣを示す。全ての群が、類似したレベルのケイ皮酸形成を示した。図９（下）は、同量のバリアント＃１２６を投与されたが、どちらかがファモチジンで前処置されている、またはされていない群の直接比較を示す。ファモチジン処置は、統計的に有意な効果を示さなかった。
図６から９に示した結果は、健康なカニクイザルへのバリアント＃１２６の経口投与が、血漿中のフェニルアラニンレベルに対して統計的に有意な効果があることを示している。さらに、カニクイザルにバリアント＃１２６を経口投与すると、フェニルアラニンの約９ｍｇ／ｋｇの除去に相当するケイ皮酸の量が形成される。この量は、健康な個体およびＰＫＵ患者によるフェニルアラニン摂取の文脈において適切である。
（実施例１４）
個々の変異バリアントのスクリーニング結果
全てのアミノ酸変異をバリアント番号１２６（配列番号１２）中に個々に作り、４５℃で０（Ｔ＝０）または１０（Ｔ＝１０）日間、凍結乾燥形態でインキュベーション後、ＰＡＬ活性およびプロテアーゼ安定性についてテストし、各々３通りにテストした。以下の表では、変異およびアッセイ結果を示す。
Figure 2020505942
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上記の表では、活性倍数改善（ＦＩＯＰ）は、配列番号１２（バリアント＃１２６）と比較され、次のように定義される：「−」＝０．２倍未満の活性；「＋」＝０．２倍を超えるが、１倍未満の活性；「＋＋」＝１倍を超えるが、１．２５倍未満の増加した活性；および「＋＋＋」＝１．２５倍を超える活性。
（実施例１５）
追加のバリアントのコンビナトリアルスクリーニング結果
バリアント番号１２６（配列番号１２）において同定された変異を、配列番号２にコンビナトリアル的に加えた。新しいバリアントを、４５℃で０（Ｔ＝０）または７日間（Ｔ＝７）、凍結乾燥形態でインキュベーション後、ＰＡＬ活性およびプロテアーゼの存在下での安定性についてテストした。陽性対照と比べて対応する倍数改善（ＦＩＯＰ）を伴うバリアントのデータを、配列番号１２（バリアント＃１２６）を陽性対照として表１５．１に示す。
Figure 2020505942
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上記の表では、活性倍数改善（ＦＩＯＰ）は、配列番号１２（バリアント＃１２６）のものと比較され、次のように定義される：「−」＝０．２倍未満；「＋」＝０．２倍を超えるが、１倍未満；「＋＋」＝１倍を超えるが、１．２５倍未満の増加した活性；および「＋＋＋」＝１．２５倍を超える活性。
本発明は、特定の実施形態を参照して記載されたが、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセスステップまたはステップに適合するように、様々な変更を行うことができ、同等物で置換することができ、これにより特許請求の範囲から逸脱することなく本発明の利益を達成することができる。
米国における全ての目的のために、本開示に引用されたありとあらゆる刊行物および特許文献は、そのような刊行物または文献の各々が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的および個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、任意のそのような文献が関連する先行技術であることを示すものとして意図するものでも、またはその内容もしくは日付に関する承認となるものでもない。

Claims (55)

  1. 配列番号４、６、８、１０、および／または１２の少なくとも１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列を参照して番号付けされる、操作されたポリペプチド。
  2. １６、１６／１５０、４４／５６、４４／５６／１０２／２３９／２８５／４６９／４７０／４９５、４４／２３９、４４／２３９／２８５／４６９／４９５、４４／２３９／２８５／４７０、４４／２３９／４６９／４７０、４４／２３９／４７０／５４６、４４／２３９／４９５、４４／２３９／４９５／５４６、４４／４６９／４７０、１０２、１０２／４７０、１６２、１６５、１８８、２３９／２８５、２３９／２８５／４６９、２３９／４６９／４７０／４９５、２６４、２６７、２８５／４６９／４７０／４９５、２８５／４７０、２８５／４７０／４９５、３６４、４５５、４６９／４７０、４７２、および４８２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、前記アミノ酸位置が配列番号６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  3. １６、２６４、３６４、４７２、４８２、および／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換を含み、前記アミノ酸位置が配列番号６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  4. ４４／４７／２０４／２０９／２８５、４４／４７／３６４／４７０／４９５、４４／５４／５６／２０４／２３９／２８５／３６４／４９５、４４／５４／５６／２０４／２３９／４７０／４９５、４４／５４／２８５／４７０、４４／１０２／２８５／３６４、４４／２０４／２０９／２８５、４４／２０４／２８５／３６４／４７０／４９５、４４／２０９／２８５／４６０／４９５、４４／２８５／３６４、４７／５４／２０９、４７／２０４／２０９／２３９／２８５／４９５、４７／２０４／２８５／３６４／４９５、４７／２０９／２３９／３６４、４７／２３９／２８５／３６４、４７／４７０、５４、５４／５６、５４／５６／２０４／２０９／４７０、５４／５６／２０４／２０９／４９５、５４／５６／２０４／４９５、５４／５６／２０９／５６２、５４／５６／２８５／３６４／４７０、５４／５６／２８５／４７０、５４／１６５／２０４／２０９／２３９／２８５／４７０／４９５、５４／２３９／４９５、５４／２８５／４７０、５４／４７０、５６、１６５、２０４、２０４／２０９／２３９／２８５／４７０／４９５、２０４／２０９／３６４、２０４／２０９／３６４／４９５、２０４／２３９、２０４／２３９／２８５、２０４／３６４、２０４／４７０、２０９／２８５／３６４／４７０、２０９／２８５／３６４／４７０／４９５、２０９／３６４、２０９／３６４／４９５、２０９／４７０、２３９／３６４、２８５／３６４、２８５／３６４／４９５、３６４、３６４／４７０、４７０、および４９５、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、前記アミノ酸位置が配列番号８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  5. １６、１６／１５０、１６２、１８８、２６４、２６７、３９８、４３４、４７２、および４８２、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、前記アミノ酸位置が配列番号６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  6. ５４／５６／１６２／２０４／２８５、５４／５６／１６２／２０４／３９８、５４／５６／２０４／２８５、５４／５６／２０４／３９８、５４／５６／２０４／３９８／４７２、５４／５６／２８５、５４／５６／３９８、５４／５６／３９８／４７２、５４／１６２／２０４／３９８、５４／１６２／３９８、５４／２０４／２８５／３９８／４７２、５４／２０４／３９８、５４／２８５／３９８、５４／２８５／３９８／４７２、５６／１６２／３９８、５６／２０４／２８５、５６／２０４／３９８、５６／２０４／３９８／４６０、５６／２０４／３９８／４７２、５６／２８５、５６／２８５／３９８／４７２、５６／３９８、５６／３９８／４７２、および２０１／２０４／３９８、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、前記アミノ酸位置が配列番号１２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  7. １６、１８、３９、４７、５４、５９、７３、９１、２０９、２１４、２８５、２９０、３０５、３０７、３６４、４０７、４５０、４７０、５０３、５２１、５２４、および５６５、ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、少なくとも１個の置換または置換のセットを含み、前記アミノ酸位置が配列番号１２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  8. １５／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／１９／２１４／４０７、１６／１８／２３／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４３／４４／５９／２０９／５０３／５６５、１６／１８／３９／４５／４７／５４／５９／７３／９８／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／４９／５４／５９／７３／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３１３／３６４／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／５０３、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／７３／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／９８／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／５９／９１／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／４７／５４／７３／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５４／９１／２１４／２８５／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、１６／１８／３９／４７／５４／２０９／２１４／４０７／５０３／５２４／５６５、１６／１８／３９／４７／５９／７３／９１／２１４／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１、１６／１８／３９／４７／５９／２１４／５０３／５６５、１６／１８／３９／４７／９１／２９０／４０７、１６／１８／３９／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／５４／５９／７３／２０９／２１４／２８５／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／５９／７３／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／７３／９１／２０９／２１０／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／５４／７３／９８／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／７３／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／３９／５４／９１／２１４／２８５／２９０／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／３９／９１／５０３／５２１、１６／１８／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２８５／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５４／５９／７３／９８／２０９／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５４／５９／７３／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５４／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／４７／５９／２８５／４０７／４５０／５６５、１６／１８／４７／７３／９１／２０９／２８５／２９０／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／１８／４７／７３／２１４／３０７／５０３、１６／１８／４７／７３／２９０／４０７／４５０、１６／１８／４７／２０９、１６／１８／４７／２８５／３６４／５０３／５２１、１６／１８／４７／３６４／４０７、１６／１８／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１、１６／１８／５４／５９／２９０／４０７／４５０／５０３／５２４、１６／１８／５４／７３／９１／２１４／２８５／２９０／４０７／５６１、１６／１８／５４／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／１８／５４／４０７、１６／１８／５５／２０９／２８５／３０５、１６／１８／５９／２０９／４５０／５０３／５２４、１６／１８／７３／２０９／２１４／４５０、１６／１８／９１／２０９／４０７／５０３、１６／１８／９１／２１４／４０７／５２１／５２４／５６５、１６／１８／２０９／４５０／５０３、１６／１８／２１４／４０７／４５０／５０３、１６／１８／２８５／２９０／４７０、１６／１８／５０３、１６／２２／２１４／５０３／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／９８／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２１４／２９０／３０５／４０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２０９／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０７／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／４５０／４７０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０５／３６４／４０７／４５０／５０３／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２８５／２９０／３０７／３６４／４０７／４５０／５０３／５２１／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９１／２１４／２９０／３６４／４０７／４５０／４７０／５２４／５６５、１６／３９／４７／５４／５９／７３／９８／２０９／２８５／３０５／３０７／４０７／４５０／４７０／５０３／５２４、１６／３９／４７／５４／５９／７３／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０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２８７／２９０／２９１／３０７／３６４／４０７／４５０／４７０／５２１／５２４、３９／５４／５９／９１／９８／２８５／２９０／５０３／５２１／５２４／５６５、３９／５４／５９／９１／２０９／２１４／２８５／２９０／３０５／３０７／３６４／４０
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  9. 配列番号２、４、６、８、１０、および／もしくは１２、またはその機能的断片に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  10. 請求項１〜８のいずれかに記載された操作されたポリペプチドを含む、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  11. 配列番号２、４、６、８、１０、および／もしくは１２、またはその機能的断片に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９および／または１０に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  12. 表６．１、表７．１、表８．１、表９．１、表１０．１、表１４．１、および／または表１５．１のいずれかに記載されたバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドである、請求項９〜１１のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  13. Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓバリアント酵素である、請求項９〜１２のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  14. 野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより熱安定性である、請求項９〜１３のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  15. 野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼよりタンパク質分解に耐性を示す、請求項９〜１４のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  16. 野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより、少なくとも１つの消化管酵素によるタンパク質分解に耐性を示す、請求項１５に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  17. 野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、および／またはエラスターゼによるタンパク質分解に耐性を示す、請求項１５に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  18. 野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼより酸安定性である、請求項９〜１７のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  19. 精製されている、請求項１〜８のいずれかに記載の操作されたポリペプチド、または請求項９〜１８のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド。
  20. 請求項１〜８、もしくは１９に記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチド、および／または請求項９〜１９のいずれか一項に記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド配列。
  21. 制御配列に作動可能に連結されている、請求項２０に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
  22. 前記ポリヌクレオチドがコドン最適化されている、請求項２０および／または２１に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
  23. 請求項２０〜２２のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチド配列、および少なくとも１つの制御配を含む、発現ベクター。
  24. 前記制御配列がプロモーターを含む、請求項２３に記載の発現ベクター。
  25. 前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項２４に記載の発現ベクター。
  26. 請求項２０〜２２のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および／または請求項２３〜２５のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  27. 前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２６に記載の宿主細胞。
  28. 宿主細胞において操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを生成する方法であって、請求項１〜１９のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチドおよび／もしくはフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、ならびに／または請求項２０〜２２に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、ならびに／または請求項２３〜２５のいずれかに記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドが生成されるように、適切な培養条件下で培養するステップを含む、方法。
  29. 培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを精製するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 請求項１〜１９のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチドおよび／または操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを含む、組成物。
  32. 請求項２０〜２２のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む、組成物。
  33. 医薬組成物である、請求項３１および／または３２に記載の組成物。
  34. 少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む、請求項３２および／または３３に記載の組成物。
  35. フェニルケトン尿症の処置に適している、請求項３１〜３４のいずれかに記載の組成物。
  36. 上昇した血中フェニルアラニンの処置に適している、請求項３１〜３５のいずれかに記載の組成物。
  37. チロシン血症の処置に適している、請求項３１〜３６のいずれかに記載の組成物。
  38. 上昇した血中チロシンの処置に適している、請求項３１〜３７のいずれかに記載の組成物。
  39. 遺伝子治療における使用に適している、請求項３１に記載の組成物。
  40. フェニルケトン尿症、上昇した血中フェニルアラニン、チロシン血症、および／または上昇した血中チロシン血症を処置するための遺伝子治療における使用に適している、請求項３９に記載の組成物。
  41. ｍＲＮＡ治療における使用に適している、請求項３１に記載の組成物。
  42. フェニルケトン尿症、上昇した血中フェニルアラニン、チロシン血症、および／または上昇した血中チロシン血症を処置するためのｍＲＮＡ治療における使用に適している、請求項４１に記載の組成物。
  43. ヒトへの経口投与に適している、請求項３１〜４２のいずれかに記載の組成物。
  44. 丸剤、錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、液体、またはエマルジョンの形態である、請求項３１〜３８、および／または４３のいずれかに記載の組成物。
  45. 前記丸剤、錠剤、カプセル剤、またはゲルキャップが、腸溶コーティングをさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
  46. ヒトへの非経口注射に適している、請求項３１〜４３のいずれかに記載の組成物。
  47. 少なくとも１つの追加の治療有効化合物と共に投与される、請求項３１〜４６のいずれかに記載の組成物。
  48. 少なくとも１つの追加の治療有効化合物を含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 対象におけるフェニルケトン尿症の症状を処置および／または防止する方法であって、フェニルケトン尿症を有する対象を提供するステップと、請求項３１〜４８のいずれかに記載の組成物を前記対象に提供するステップとを含む、方法。
  50. 前記対象の血液中のフェニルアラニン濃度が、前記組成物を前記対象に提供すると低減する、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記対象の血液中のケイ皮酸濃度が、前記組成物を前記対象に提供すると増加する、請求項４９および／または５０に記載の方法。
  52. フェニルケトン尿症の前記症状が改善される、請求項４９〜５１のいずれかに記載の方法。
  53. 前記対象が、請求項１〜１９に記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチドおよび／またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む少なくとも１つの医薬組成物を提供されていない対象に必要とされる食事よりフェニルアラニン含量が少なく制限された食事を摂ることができる、請求項４９〜５２のいずれかに記載の方法。
  54. 前記対象が、乳児、小児、若年成人、または成人である、請求項４９〜５３のいずれかに記載の方法。
  55. 請求項３１〜４８のいずれかに記載された組成物の使用。
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