BR112015026160B1 - Polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase,sequência de polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira transformada, método para produzir um polipeptídeo de pal engenheirado em uma célula hospedeira, composição, e, uso de uma composição - Google Patents

Abstract

?POLIPEPTÍDEO ENGENHEIRADO COM ATIVIDADE DE FENILALANINA AMÔNIA- LIASE, SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO DE PAL ENGENHEIRADO EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO. A presente invenção fornece polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados e composições do mesmo, bem como polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica a prioridade em US Prov. Pat. Appln. Ser. No. 61/813.586, depositado em 18 de abril de 2013, e US Prov. Pat. Appln. Ser. No. 61/897.932, depositado em 31 de outubro de 2013, ambos os quais são aqui incorporados pela referência na íntegra para todos os propósitos.

REFERÊNCIA A UMA "LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS", UMA TABELA, OU UM APÊNDICE DE LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR SUBMETIDO COMO UM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[002] A listagem de sequências registrada em arquivo CX7- 131WO2_ST25.TXT, criada em 15 de abril de 2014, 127,412 bytes, formato de máquina IBM-PC, sistema operacional MS-Windows, é aqui incorporada pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção fornece polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados e composições do mesmo, bem como polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são otimizados para fornecer atividade catalítica intensificada, bem como sensibilidade reduzida à proteólise e maior tolerância aos níveis de pH acídicos. Em algumas modalidades os polipeptídeos de PAL engenheirados são desimunizados. A invenção também se refere ao uso das composições compreendendo os polipeptídeos de PAL engenheirados com propósitos terapêuticos e industriais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004] Fenilalanina amônia-liase (PAL) junto com histidina amônia- liase (HAL) e tirosina amônia-liase (TAL) são elementos da família do aminoácido aromático liase (EC 4.3.1.23-1.25 e 4.3.1.3). Mais especificamente, as enzimas com atividade de PAL (EC 4.3.1.23-1.25 e previamente classificada como EC4.3.1.5) catalisam a desaminação não oxidativa de L-fenilalanina em ácido (E)-cinâmico. PAL é uma enzima não associada a mamífero, que é amplamente distribuída em plantas e também tem sido identificada em fungos e um número limitado de bactérias. As enzimas de PAL podem ser usadas como uma proteína terapêutica para o tratamento do distúrbio metabólico, fenilcetonúria (PKU). PKU é um distúrbio genético metabólico autossômico, no qual a enzima hepática fenilalanina hidroxilase (PAH) ou uma ou mais das enzimas envolvidas na síntese ou reciclagem do cofator tetra-hidrobiopterina é não funcional, devido a uma mutação em um dos genes correspondentes. Esta perda de funcionalidade resulta em altos níveis de fenilalanina na corrente sanguínea. A fenilalanina é convertida em fenilpiruvato (fenilcetona) e outros derivados. Em humanos, se PKU não for tratada é precocemente, altos níveis de fenilalanina e alguns de seus produtos de decomposição podem causar problemas médicos significativos, incluindo incapacidade intelectual, microcefalia e convulsões. Vários estudos têm focado no uso de PAL no tratamento de PKU por substituição de enzima (Ambrus et al., Science 201:837-839 [1978]; Bourget et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 10:57-59 [1984]; e Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]).

[005] Um método para desintoxicar fenilalanina no fluxo sanguíneo contínuo é o uso de PAL e variantes de PAL injetáveis recombinantes modificados por peguilação (PEG-PAL). A peguilação mostrou melhorar a meia vida da enzima e reduzir a resposta antigênica no indivíduo (ver, por exemplo, WO 2008/153776, WO 2011/097335, e US Pat. No. 7,531,341). Variantes de PAL usados nas composições PEG-PAL foram descritos como variantes de Nostoc punctiforme (NpPAL); Anabaena variabilis (AvPAL) e Rhodosporidium toruloides (RtPAL) tipo selvagem. Em particular, variantes de AvPAL tipo selvagem foram descritos, em que os resíduos de cisteína nas posições 64, 318, 503 e 565 foram substituídos com serina (Ver, por exemplo, patentes US: 7.790.433; 7.560.263 e 7.537.923).

[006] Uma via alternativa de administração de PAL como um meio de reduzir a concentração plasmática de L- fenilalanina em indivíduos com PKU é uma formulação não invasiva, tal como uma formulação oral (Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]). Uma vantagem chave de distribuição oral de PAL é a exposição reduzida da enzima ao sistema imune, minimizando desse modo a resposta imune que é observada com PEG-PAL injetável. Entretanto, uma limitação principal para a formulação de PAL oral é a perda de atividade de enzima no estômago e lúmen intestinal. A fim de ser eficiente e funcional, PAL deve resistir à degradação por pHs acídicos e proteases tais como tripsina, quimotripsina, carboxipeptidases e pepsina que normalmente degradam alimentos proteináceos em oligopeptídeos e aminoácidos. Em alguns estudos prévios (Sarkissian, supra), a fim de atingir um efeito significativo para a administração oral de PAL, uma grande quantidade da enzima foi exigida parcialmente devido à degradação enzimática por proteases, e parcialmente devido à atividade específica relativamente baixa em pH 7,0. Vários meios têm sido explorados para suprimir a degradação de PAL mediante digestão (Kim et al., Molec. Therap., 10:220 -224 [2004]; e Shah et al., Int. J. Pharmaceut., 356:61-68 [2008]).

[007] Uma abordagem para aumentar a eficiência de PAL nas condições severas do trato digestivo é fornecer polipeptídeos de PAL engenheirados que são tolerantes às condições inerentemente severas. Kang et al. usaram mutagênese sítio direcionada de um sítio de clivagem de quimotripsina e a peguilação de lisinas de superfície de um AvPAL para reduzir inativação proteolítica (Ver, Kang et al., Mol. Gen. Metabol., 99:4-9 [2010]). Nestes estudos, dez sítios de clivagem foram especificamente mutados e quase dois destes mutantes resultantes (F18A e R94G) perderam mais de 50% da atividade enzimática original. Nenhum dos mutantes mostrou maior atividade e o mutante F18A mostrou um pequeno aumento na resistência à tripsina (Kang et al., supra). Adicionalmente, estudos com PAL, embora efetivos, no geral não têm resultado em uma enzima tradicional. Portanto, a administração oral de PAL mutantes previamente descritos e derivados do mesmo não resulta em tratamento efetivo de PKU.

[008] Apesar do progresso feito com várias formulações de PAL permanece uma necessidade de polipeptídeos de PAL com propriedades melhoradas para a administração oral. Estas propriedades melhoradas incluem, sem limitação, uma maior meia-vida, maior atividade catalítica, maior estabilidade às condições no trato digestivo e agregação reduzida.

[009] Além das aplicações terapêuticas, as enzimas de PAL também podem ser usadas na síntese industrial de L-fenilalanina e outros derivados de L-fenilalanina substituída. Estes derivados podem então ser usados como precursores farmacêuticos (Gloge et al., Chem., 6: 3386-3390 [2000]; Bartsch et al., Prot. Eng. Des. Sel., 23:929-933 [2010]; e Turner, Curr. Opin. Chem. Biol., 234-240 [2011]).

[0010] As enzimas de PAL também podem ser usadas em aplicações agrícolas. PAL desempenha um papel significativo na biossíntese de fenilpropanoides (tais como flavonoides e lignina) em plantas, fungos e bactérias, e podem funcionar como uma enzima relacionada à defesa (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7608-7612 [1994]). A modulação de atividade de PAL usando polipeptídeos recombinantes com atividade de PAL pode levar potencialmente aos herbicidas efetivos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A presente invenção fornece polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados e composições do mesmo, bem como polinucleotídeos codificação os polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são otimizados para fornecer atividade catalítica intensificada, bem como sensibilidade reduzida à proteólise e maior tolerância aos níveis de pH acídicos. Em algumas modalidades os polipeptídeos de PAL engenheirados são desimunizados. A invenção também se refere ao uso das composições compreendendo os polipeptídeos de PAL engenheirados com propósitos terapêuticos e industriais. Em algumas modalidades, a presente invenção é direcionada aos polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados e fragmentos biologicamente ativos, e análogos do mesmo, com melhores propriedades tais como maior tolerância ao pH acídico e/ou sensibilidade reduzida à proteólise.

[0012] A presente invenção refere-se aos polipeptídeos de PAL engenheirados e fragmentos biologicamente ativos e análogos do mesmo com melhores propriedades, quando comparados à uma enzima PAL tipo selvagem ou um polipeptídeo de PAL de referência essencialmente nas mesmas condições. A invenção refere-se adicionalmente aos métodos de usar os polipeptídeos de PAL engenheirados, e fragmentos biologicamente ativos e análogos do mesmo, em composições terapêuticas e/ou industriais e métodos de usar tais composições com propósitos terapêuticos e/ou industriais.

[0013] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase (PAL) engenheirados, em que o polipeptídeo de PAL engenheirado apresenta uma melhor propriedade selecionada do grupo de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii) ou iv) comparado à sequência de referência quando avaliado essencialmente nas mesmas condições. Em algumas modalidades específicas, os polipeptídeos de PAL engenheirados apresentam duas propriedades melhoradas. Em outras modalidades específicas, a propriedade melhorada é sensibilidade reduzida à proteólise, e ainda em outras modalidades específicas, a propriedade melhorada é maior tolerância ao pH acídico.

[0014] Em um segundo aspecto, os polipeptídeos de PAL engenheirados incluem proteínas compreendendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4, ou um fragmento funcional do mesmo e uma diferença no resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde às posições X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394;X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522;X524; e X528, quando alinhado de maneira ideal com o polipeptídeo de SEQ ID NO:4.

[0015] Em algumas modalidades específicas do primeiro e segundo aspectos, os polipeptídeos de PAL engenheirados compreendem pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido de uma ou mais posições de resíduo de aminoácido correspondentes a A39; A91; Y158; S180; K195; T243; I245; A256; L257; N270; N290; H307; E308; I326; L349; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; K522; T524; e P528, quando alinhados de maneira ideal com o polipeptídeo de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades específicas, os polipeptídeos de PAL engenheirados compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, e pelo menos 20 diferenças no resíduo de aminoácidos do polipeptídeo de referência compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4.

[0016] Em outras modalidades específicas do primeiro e segundo aspectos, os polipeptídeos de PAL engenheirados compreendem pelo menos 90%, (pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99%) de identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4. Ainda em modalidades adicionalmente específicas, os polipeptídeos de PAL engenheirados compreendem pelo menos 90%, (pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99%) de identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4, e compreendem uma ou mais das seguintes substituições A39V; A91V; Y158H; S180A; K195E; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; K522Y/F/N; T524S; e P528L.

[0017] Em outras modalidades específicas, os polipeptídeos de PAL engenheirados são derivados de uma PAL tipo selvagem de Anabaena variabilis (tal como ATCC29413; sequência de referência de proteína NCBI YP_324488.1; SEQ ID NO:4).

[0018] Em um terceiro aspecto, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) incluídos pela invenção compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:10, ou um fragmento funcional da mesma.

[0019] Em um quarto aspecto, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) incluídos pela invenção compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:10, ou um fragmento funcional da mesma, e compreende adicionalmente uma diferença no resíduo de aminoácido comparado à SEQ ID NO:10, em uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis mais posições de aminoácido.

[0020] Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma sequência de polinucleotídeo que codifica qualquer um dos polipeptídeos de PAL engenheirados, da maneira aqui descrita.

[0021] Em um sexto aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica ou uma composição industrial compreendendo qualquer dos polipeptídeos de PAL engenheirados, da maneira aqui descrita.

[0022] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma diferença no resíduo de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4 ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii) ou iv) comparado à sequência de referência. Em algumas modalidades, uma ou mais posições de aminoácido são selecionadas de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270;X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; e/ou combinações das mesmas quando alinhadas de maneira ideal com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades adicionais, a propriedade melhorada é selecionada de sensibilidade reduzida à proteólise e/ou maior tolerância ao pH acídico. Ainda em modalidades adicionais, a sequência de referência é uma PAL tipo selvagem derivado de Anabaena variabilis. Em algumas modalidades adicionais, o resíduo de aminoácido da sequência de referência de SEQ ID NO:4 corresponde a A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; I245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; I326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; e/ou P564. Em algumas modalidades, a diferença no resíduo de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; e P564 G/L/M; quando alinhadas de maneira ideal com o polipeptídeo de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menor cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4; e uma diferença no resíduo de aminoácido na posição H307. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4; e uma diferença no resíduo de aminoácido na posição H307. Em algumas modalidades adicionais, a diferença no resíduo de aminoácido é H307G/Q/M. Em algumas modalidades adicionais, a diferença no resíduo de aminoácido é selecionada de uma combinação de um ou mais de A39; A91; Q240; A256; N290; Y304; R305; H307; D353 A394; S399; P404; L407; Q521; K522; e T524.

[0023] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma. Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma.

[0024] Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma.

[0025] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou a 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma. Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma. Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14, ou um fragmento funcional da mesma.

[0026] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, ou um fragmento funcional da mesma, em que o polipeptídeo engenheirado é desimunizado. A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, ou um fragmento funcional da mesma, em que o polipeptídeo engenheirado é desimunizado. Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, ou um fragmento funcional da mesma, em que o polipeptídeo engenheirado é desimunizado. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) é um variante PAL fornecido em qualquer das tabelas 9-1 a 9-7. Em algumas modalidades, o desimunizado engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, e/ou 14.

[0027] A presente invenção também fornece sequências de polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos engenheirados com atividade de PAL aqui fornecidos. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo é operavelmente ligada a uma sequência controle. A presente invenção fornece adicionalmente vetores compreendendo pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de PAL. A presente invenção também fornece células hospedeiras transformadas com pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo engenheirado com atividade de PAL, da maneira aqui fornecida.

[0028] A presente invenção fornece adicionalmente métodos para produzir um polipeptídeo de PAL engenheirado em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar uma célula hospedeira compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo de PAL engenheirado em condições adequadas de cultivo. A presente invenção fornece adicionalmente métodos para produzir um polipeptídeo de PAL engenheirado em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de PAL engenheirado em condições adequadas de cultivo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente recuperar o polipeptídeo de PAL engenheirado a partir do cultivo e/ou células hospedeiras.

[0029] A presente invenção também fornece composições compreendendo pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de PAL, da maneira aqui fornecida. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece adicionalmente o uso destas composições.

[0030] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais identidade de sequência com uma sequência de referência com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado à uma sequência de referência com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado à sequência de referência com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL). Em algumas modalidades, a sequência de referência é uma PAL de procarioto, enquanto em algumas outras modalidades, a sequência de referência é uma PAL de eucarioto. Em algumas modalidades, a sequência de referência é uma PAL de bactérias (por exemplo, PAL de Anabaena variabilis), enquanto em algumas outras modalidades é uma PAL de humano ou outro. Em algumas modalidades adicionais, a sequência de referência é uma sequência tipo selvagem (por exemplo, PAL tipo selvagem de A. variabilis), enquanto em algumas modalidades alternativas, a sequência de referência é uma enzima variante (por exemplo, um polipeptídeo engenheirado com atividade de PAL).

[0031] Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) da presente invenção compreendem: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4, ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado à sequência de referência SEQ ID NO:4.

[0032] Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendem: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4 ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado à sequência de referência SEQ ID NO:4.

[0033] Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) compreende pelo menos uma(s) substituição(s) em uma ou mais das seguintes posições de aminoácido: 20, 24, 27, 39, 43, 45, 47, 54, 58, 59, 62, 70, 73, 80, 82, 91, 94, 98, 104, 105, 110, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,133, 134, 135, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 180, 187, 191, 195, 199, 205, 206, 210, 212, 213, 214, 232, 240, 243, 245, 247, 248, 250, 256, 257, 266, 270, 275, 278, 279, 285, 286, 289, 290, 292, 304, 305, 307, 308, 309, 319, 321, 326, 331, 332, 334, 349, 353, 355, 364, 365, 369, 370, 371, 372, 374, 375, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 387, 389, 394, 396, 399, 400, 403, 404, 407, 417, 418, 425, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 443, 446, 447, 453, 456, 459, 460, 461, 463, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 482, 483, 503, 507, 509, 521, 522, 524, 525,528, 538, 546, 547, 551, 558, 560, 564, 565, e/ou qualquer combinações do mesmo, em que as posições de aminoácido são numeradas com referência à SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido da sequência de referência de SEQ ID NO:4 corresponde a A39, T54, G59, S73, A91, Y158, S180, K195, A112, R134, Q240, T243, I245, A256, L257, N270, N290, Y304, R305, H307, E308, I326, L349, D353, L364, A394, S399, N400, P404, L407, F443, N453, Y459, T460, T463, N474, E509, Q521, K522, T524, P528, S546 e/ou P564. Em algumas modalidades adicionais, a diferença no resíduo de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4 é selecionado de uma ou mais das seguintes substituições A39V, T54K, G59R, S73K, A112C, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, P404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S,P528L, S546R, e P564 G/L/M, quando alinhado de maneira ideal com o polipeptídeo de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4; e uma diferença no resíduo de aminoácido na posição H307. Em algumas modalidades, a diferença no resíduo de aminoácido é H307G/Q/M. Ainda em algumas modalidades adicionais, a diferença no resíduo de aminoácido é selecionada de uma combinação de um ou mais de A39, A91, Q240, A256, N290, Y304, R305, H307, D353, A394, S399, P404, L407, Q521, K522 e T524. Em algumas modalidades adicionais, a propriedade melhorada dos polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) é selecionada de sensibilidade reduzida à proteólise e/ou maior tolerância ao pH acídico.

[0034] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:10 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 ou o fragmento funcional do mesmo em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado a sequência de referência SEQ ID NO:10.

[0035] Em algumas modalidades, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia- liase (PAL) compreendendo: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:10 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado com a sequência de referência SEQ ID NO:10.

[0036] Em algumas modalidades, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia- liase (PAL) compreendendo: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:10 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado com a sequência de referência SEQ ID NO:10.

[0037] Em algumas modalidades, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia- liase (PAL) compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:10 e pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10, e que exibe pelo menos uma melhor propriedade selecionada de atividade catalítica intensificada, sensibilidade reduzida à proteólise, maior tolerância ao pH acídico, agregação reduzida, e/ou imunogenicidade reduzida, comparado com a SEQ ID NO:10.

[0038] Em algumas modalidades, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia- liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10, é selecionado de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q; I27E/V39A/R43L/L214E/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C5 03Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A55 1D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C5 65N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E; I27E/V39A/A112C/L214E; I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/A112C/I285E; I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/ A551D/ C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D; I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q; I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D; I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/P210C/T212S; I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E; I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266H; I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D; I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N; I27E/V105C; I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N; I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E; I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A551D/C565N; I27E/V105C/P266H; I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/L278D/A547D; I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q; I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q; I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q; I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q; I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q; I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D; I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N; I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q; I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/A153R/L214E/L278D/A551D; I27E/Q205T; I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N; I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/P210C/L278D/C503Q; I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D; I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D; I27E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q; I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q; I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N; V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D; V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D; V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/V105C/A153R/P266H/A547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q; V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D; V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N; V39A/V105C/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D; V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q; V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N; V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N; V39A/A153R/C503Q/A547D; V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D; V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D; V39A/P266H; V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D; V39A/C503Q; V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C; V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D; V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q; V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D; V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D; V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; V105C/R134Q/L214E/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q; V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N; V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D; V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N; V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D; V105C/Q205T/L214E/L278D; V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/Q205T/C503Q/A551D; V105C/L214E/P266H/L278D/A547D; V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; V105C/L214E/I285E; V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/L214E/I285E/A547D/C565N; V105C/L278D/C503Q/A551D; V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q; V105C/A547D/A551D; A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D; A112C/L278D/C503Q/A547D; R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; R134Q/Q205T/C503Q; R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D; R134Q/L214E; R134Q/L214E/L278D/C503Q; R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D; R134Q/L214E/I285E/C503Q; R134Q/C503Q; R134Q/C503Q/A547D/A551D; A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D; Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H; L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N; L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D; P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N; L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D; C503Q/A547D/A551D/C565N; C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D; C503Q/A551D/C565N; A547D; e/ou C565N.

[0039] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10, é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; e/ou G135A/A394E.

[0040] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: G20S/I144L; R43S; L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C; Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R; G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E; V159C/H/L/M; M247I; L319M; e/ou Q389K.

[0041] Ainda em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; e/ou S180C/T.

[0042] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N; H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; e/ou S525L.

[0043] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; e/ou A477S.

[0044] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; e/ou A558S.

[0045] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: V39A/K115E/M133R/C565N; V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q; V39A/M133R/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C565N; V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N; V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N; e/ou F472G/C503Q/C565N.

[0046] Ainda em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:10 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição: I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q; I27E/V39A/R43L/L214E/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C5 03Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A55 1D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C5 65N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E; I27E/V39A/A112C/L214E; I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/A112C/I285E; I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/ A551D/ C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D; I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q; I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D; I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/P210C/T212S; I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E; I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266H; I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D; I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N; I27E/V105C; I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N; I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E; I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A551D/C565N; I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/L278D/A547D; I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q; I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q; I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q; I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q; I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q; I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D; I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N; I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q; I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/A153R/L214E/L278D/A551D; I27E/Q205T; I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N; I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/P210C/L278D/C503Q; I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D; I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D; I27E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q; I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q; I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N; V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D; V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D; V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/V105C/A153R/P266H/A547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q; V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D; V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N; V39A/V105C/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D; V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q; V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N; V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N; V39A/A153R/C503Q/A547D; V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D; V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D; V39A/P266H; V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D; V39A/C503Q; V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C; V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D; V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q; V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D; V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D; V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; V105C/R134Q/L214E/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q; V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N; V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D; V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N; V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D; V105C/Q205T/L214E/L278D; V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/Q205T/C503Q/A551D; V105C/L214E/P266H/L278D/A547D; V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; V105C/L214E/I285E; V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/L214E/I285E/A547D/C565N; V105C/L278D/C503Q/A551D; V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q; V105C/A547D/A551D; A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D; A112C/L278D/C503Q/A547D; R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; R134Q/Q205T/C503Q; R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D; R134Q/L214E; R134Q/L214E/L278D/C503Q; R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D; R134Q/L214E/I285E/C503Q; R134Q/C503Q; R134Q/C503Q/A547D/A551D; A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D; Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H; L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N; L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D; P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N; L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D; C503Q/A547D/A551D/C565N; C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D; C503Q/A551D/C565N; A547D; C565N; V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; G135A/A394E; G20S/I144L; R43S; L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C; Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R; G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E; V159C/H/L/M; M247I; L319M; Q389K; P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; S180C/T; R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N; H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; S525L; A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; A477S; A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; A558S; V39A/K115E/M133R/C565N; V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q; V39A/M133R/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C565N; V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N; V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N; e/ou F472G/C503Q/C565N.

[0047] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreendendo: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:26 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:26 ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado com a sequência de referência SEQ ID NO:26.

[0048] Em algumas modalidades, a presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia- liase (PAL) compreendendo: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:26 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:26 ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado com a sequência de referência SEQ ID NO:26.

[0049] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia- liase (PAL) compreendendo: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:26 ou um fragmento funcional da mesma; b) uma sequência de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:26 ou o fragmento funcional da mesma em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida, v) imunogenicidade reduzida, ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii), iv), ou v), comparado com a sequência de referência SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) da presente invenção compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:26, e pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:126, e que exibem pelo menos uma melhor propriedade selecionada de atividade catalítica intensificada, sensibilidade reduzida à proteólise, maior tolerância ao pH acídico, agregação reduzida, e/ou imunogenicidade reduzida, comparado à SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades dos polipeptídeos engenheirados, a diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:26 é selecionada de uma ou mais das seguintes substituições ou conjuntos de substituição A24E/G381L; L127V; A129I/V; S131C/T; H132L/S; R134C/F/H/K; R134H/Y378E/G381L; R134H/Y378E/G381L/V388T; R134H/V388T; A136K; A289S; M372L; H374G/M/Q; G381A/C/F/I/L/M/N/Q/S/T; A383C/M; V388C/T; L431M; e/ou L563M.

[0050] Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção apresenta pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção apresenta pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4, enquanto em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção apresenta pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4, enquanto em algumas modalidades adicionais o polipeptídeo engenheirado apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados compreendem fragmentos funcionais de polipeptídeos (por exemplo, qualquer variante fornecido nas tabelas, aqui) com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção.

[0051] Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção apresenta pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26. Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção apresenta pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26. Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26. Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26, ou um fragmento funcional da mesma. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados compreendem fragmentos funcionais de polipeptídeos (por exemplo, fragmentos funcionais de SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26, bem como qualquer dos variantes fornecidos nas tabelas, aqui) com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) da presente invenção.

[0052] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), em que os polipeptídeos engenheirados são PALs variantes fornecidas em qualquer das tabelas 2-1 a 2-5 e/ou tabelas 9-1 a 9-7.

[0053] Em algumas modalidades, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) é uma enzima de Anabaena variabilis. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) são termoestáveis. Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) são resistentes à proteólise. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) são resistentes à proteólise em pelo menos uma enzima do trato digestivo. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) são resistentes à proteólise por quimotripsina, tripsina, carboxipeptidases e/ou elastases. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) é ácido estável.

[0054] A presente invenção também fornece polipeptídeos engenheirados com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) que são desimunizados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos desimunizados engenheirados compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos desimunizados engenheirados compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26. Em algumas modalidades, os polipeptídeos desimunizados engenheirados compreendem uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26. Em algumas modalidades, os polipeptídeos desimunizados engenheirados compreendem uma sequência de aminoácido com 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e/ou 26.

[0055] Ainda em algumas modalidades adicionais, a presente invenção fornece polipeptídeos engenheirados purificados com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL).

[0056] A presente invenção também fornece sequências de polinucleotídeos que codificam pelo menos um polipeptídeo engenheirado com fenilalanina amônia liase (PAL), da maneira aqui apresentada. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo é operavelmente ligada a uma sequência controle. Em algumas modalidades adicionais, a sequência de polinucleotídeo é otimizada por códon.

[0057] A presente invenção também fornece vetores de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), da maneira aqui fornecida. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende adicionalmente pelo menos uma sequência controle. Em algumas modalidades, a sequência controle é um promotor. Em algumas modalidades adicionais, o promotor é um promotor heterólogo.

[0058] A presente invenção também fornece células hospedeiras transformadas com pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeos engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), e/ou pelo menos um vetor de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) e pelo menos uma sequência controle. Em algumas modalidades, as células hospedeiras compreendem pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) que é otimizado por códon. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli.

[0059] A presente invenção também fornece métodos para produzir pelo menos um polipeptídeo de PAL engenheirado em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar uma célula hospedeira que compreende pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), e/ou pelo menos um vetor de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) e pelo menos uma sequência controle, em condições adequadas de cultivo, de maneira tal que o polipeptídeo de PAL engenheirado seja produzido. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de recuperar pelo menos um polipeptídeo engenheirado com fenilalanina amônia-liase (PAL) a partir do cultivo e/ou das células hospedeiras. Em algumas modalidades adicionais, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de purificar pelo menos um polipeptídeo engenheirado com fenilalanina amônia-liase (PAL).

[0060] A presente invenção também fornece composições compreendendo pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) da maneira aqui fornecida. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição é um suplemento alimentar e/ou nutricional. Em algumas modalidades adicionais, as composições farmacêuticas compreendem adicionalmente pelo menos um excipiente e/ou carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades adicionais, a composição é adequada para o tratamento de fenilcetonúria. Em algumas modalidades adicionais, a composição farmacêutica é adequada para administração oral a um humano. Em algumas modalidades, a composição está na forma de uma pílula, comprimido, cápsula, cápsula em gel, líquido ou emulsão. Ainda em algumas modalidades adicionais, a pílula, comprimido, cápsula, ou cápsula em gel compreende adicionalmente um revestimento entérico. Em algumas modalidades adicionais, a composição farmacêutica é adequada para injeção parenteral em um humano. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é coadministrada com pelo menos um composto terapeuticamente efetivo adicional. Em algumas modalidades adicionais, a composição farmacêutica compreende pelo menos um composto terapeuticamente efetivo adicional. Em algumas modalidades adicionais, a composição farmacêutica está presente em um suplemento alimentar e/ou nutricional.

[0061] A presente invenção também fornece métodos para tratar e/ou prevenir os sintomas de fenilcetonúria em um indivíduo, compreendendo fornecer a um indivíduo com fenilcetonúria, e fornecer pelo menos uma composição aqui fornecida ao indivíduo. Em algumas modalidades, a composição compreende uma composição farmacêutica, embora em algumas modalidades alternativas, a composição compreenda um suplemento alimentar/nutricional. Em algumas modalidades dos métodos, os sintomas de fenilcetonúria são melhorados. Em algumas modalidades adicionais, o indivíduo tratado pode comer uma dieta que é menos restritiva em seus teores de metionina, fenilalanina, e/ou tirosina do que as dietas exigidas pelos indivíduos que exibem os sintomas de fenilalanina. Em algumas modalidades, o indivíduo tratado (isto é, um indivíduo que foi fornecido com pelo menos uma composição compreendendo pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), da maneira aqui fornecida) pode comer uma dieta que é menos restritiva em seu teor de metionina, fenilalanina e/ou tirosina do que as dietas exigidas por indivíduos que tem não foram fornecidos com pelo menos uma composição, da maneira aqui fornecida. Em algumas modalidades, a composição fornecida aos indivíduos compreende uma composição farmacêutica, embora em algumas modalidades alternativas, a composição compreenda um suplemento alimentar/nutricional. A presente invenção também inclui indivíduos tratados, em que o indivíduo foi administrado com pelo menos uma composição e/ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), da maneira aqui fornecida. Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal selecionado de primatas, roedores e lagamorfos. Em algumas modalidades adicionais, o indivíduo é um camundongo. Em algumas modalidades adicionais, o indivíduo é um humano. Ainda em algumas modalidades adicionais, o indivíduo é um humano bebê ou criança, enquanto em algumas modalidades alternativas, o indivíduo é um humano adulto ou adulto jovem.

[0062] A presente invenção também fornece uso das composições compreendendo pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) aqui fornecidas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00063] Figura 1 fornece um alinhamento de sequências de proteína PAL tipo selvagem: PAL de Anabaena variabilis (NCBI YP_ 324488.1 (SEQ ID NO:4)); histidina amônia-liase de Oscillatoria sp. “Osp HAL” (NCBI YP_07108482.1(SEQ ID NO:30); e histidina amônia-liase de Gloeocapsa sp. “GspHAL” (NCBI YP_007127054.1) (SEQ ID NO:31); histidina amônia- liase de Oscillatoria sp. “Osp HAL” (NCBI YP_07108482.1(SEQ ID NO:32); e histidina amônia-liase de Gloeocapsa sp. “GspHAL” (NCBI YP_007127054.1) (SEQ ID NO:33).

[00064] Figura 2A mostra a sensibilidade reduzida à proteólise (expressa como tolerância à quimotripsina e tripsina) comparada à AvPAL tipo selvagem testada em pH 7,0 for Variante No. 22 (SEQ ID NO:8), Variante No. 30 (SEQ ID NO:6) e Variante No. 36 (SEQ ID NO:10) da maneira adicionalmente descrita no exemplo 4.

[00065] Figura 2B fornece um gráfico que exibe uma maior tolerância ao pH acídico comparado à AvPAL tipo selvagem testada em pH 4,0 a 5,2, para Variantes Nos. 22, 30 e 36 da maneira adicionalmente descrita no exemplo 4.

[00066] Figura 3 fornece resultados de KM para PAL tipo selvagem e Variante No. 36.

[00067] Figura 4 fornece dados que exibem a especificidade de aminoácido de PAL tipo selvagem e Variante No.36.

[00068] Figura 5 fornece resultados que exibem a estabilidade relativa de PAL tipo selvagem e Variante No. 36 expostos à quimotripsina e tripsina de humano.

[00069] Figura 6 fornece resultados que exibem a estabilidade relativa de PAL tipo selvagem, e Variantes Nos. 36, 42, e 43 expostos aos extratos pancreáticos de porco.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0070] A presente invenção fornece polipeptídeos de PAL engenheirados, mutantes, fragmentos biologicamente ativos e análogos do mesmo, e composições farmacêuticas e industriais compreendendo os mesmos.

[0071] A invenção fornece polipeptídeos de fenilalanina amônia- liase (PAL) engenheirados e composições do mesmo, bem como polinucleotídeos que codificam o polipeptídeos de fenilalanina amônia-liase engenheirados (PAL). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são otimizados para fornecer atividade catalítica intensificada, bem como sensibilidade reduzida à proteólise e maior tolerância aos níveis de pH acídicos. Em algumas modalidades os polipeptídeos de PAL engenheirados são desimunizados. A invenção também se refere ao uso das composições compreendendo os polipeptídeos de PAL engenheirados com propósitos terapêuticos e industriais.

Abreviações e Definições:

[0072] A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos aqui usados apresentam em geral o mesmo significado, como é comumente entendido pelos versados na técnica, aos quais esta invenção pertence. Em geral, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos de laboratório de cultivo de célula, genética molecular, microbiologia, química orgânica, química analítica e química de ácido nucléico descritos a seguir são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Tais técnicas são bem conhecidas e descritas em vários textos e trabalhos de referência bem conhecidos pelos versados na técnica. As técnicas padrões, ou modificações das mesmas, são usadas para síntese química e análise química. Todas as patentes, pedidos de patente, artigos e publicações aqui mencionados, tanto supra quanto infra, aqui expressamente incorporados pela referência.

[0073] Embora qualquer dos métodos adequados e materiais similares ou equivalente àqueles aqui descritos possam ser usados na prática da presente invenção, alguns métodos e materiais são aqui descritos. Deve-se entender que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares descritos, uma vez que podem variar, dependendo do contexto que são usados pelos versados na técnica. Desta maneira, os termos definidos imediatamente a seguir são mais completamente descritos por referência ao pedido como um todo. Todas as patentes, pedidos de patente, artigos e publicações aqui mencionados, tanto supra quanto infra, são aqui expressamente incorporados pela referência.

[0074] Também, da maneira aqui usada, o singular "um", "uma", "a" e "o" inclui as referências plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra forma.

[0075] As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. Assim, cada faixa numérica aqui descrita é pretendida para incluir cada faixa numérica mais estreita que está em tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressivamente aqui gravadas. Pretende-se também que cada limitação numérica máxima (ou mínima) aqui descrita inclua cada limitação numérica menor (ou maior), como se tais limitações numéricas menores (ou maiores) fossem expressamente aqui gravadas.

[0076] O termo “egtec fg” significa um erro aceitável para um valor particular. Em alguns exemplos “egtec fg” significa 0,05%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de uma dada faixa de valor. Em alguns exemplos, “egtec fg” significa 1, 2, 3, ou 4 desvios padrão de um dado valor.

[0077] Além do mais, os títulos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser realizados por referência à aplicação como um todo. Desta maneira, os termos definidos imediatamente a seguir são mais completamente definidos por referência à aplicação como um todo. No entanto, a fim de facilitar o entendimento da invenção, inúmeros termos são definidos a seguir.

[0078] A menos que de outra forma indicada, ácidos nucleicos são registrados da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; sequências de aminoácido são registradas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente.

[0079] Da maneira aqui usada, o termo “eqorteepfepfq” e seus cognatos são usados em sua percepção inclusiva (isto é, equivalente ao termo “incluindo” e seus cognatos correspondentes).

[0080] Púogtq “GC” refere-se à nomenclatura de enzima da Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB). A classificação bioquímica IUBMB é um sistema de classificação numérico para enzimas com base nas reações químicas que catalisam.

[0081] “ATCC” refere-se ao American Type Culture Collection cuja coleção biorrepositória inclui genes e cepas.

[0082] “NCBI” refere-se a National Center for Biological Information e as bases de dados de sequência que são fornecidas.

[0083] Da maneira aqui usada, o termo “rqnkrgrVífgq fg fepücncpkpc amônia-liase (PAL+” refere-se a uma classe de enzimas na família do aminoácido aromático liase (EC 4.3.1.23, EC 4.3.1.24 e EC4.3.1.25) que também inclui histidina amônia-liase, e tirosina amônia-liase. Os polipeptídeos de PAL são também referidos algumas vezes como fenilalanina/tirosina amônia-liases, em virtude de algumas enzimas de PAL poderem usar tirosina bem como fenilalanina como um substrato. Entretanto, o AvPAL e variantes aqui descritos e reivindicados não usam tirosina como um substrato. Os polipeptídeos de PAL catalisam a conversão de L- fenilalanina em ácido transcinâmico e amônia. A atividade de PAL refere-se à atividade enzimática de polipeptídeos de PAL. Em algumas modalidades preferidas, uma enzima PAL também contém o cofator 3,5-di-hidro-5- metilideno-4H-imidazol-4-ona (MIO). Este cofator pode ser exigido para a atividade catalítica e é formado por ciclização e desidratação de um sítio ativo conservado do segmento tripeptídeo Ala167-Ser168-Gly169.

[0084] “RtqVgipc”. “polipeptídeo”, e “rgptídeo” são usados aqui indiferentemente para mostrar um polímero de pelo menos dois aminoácidos covalentemente ligados por uma ligação de amida, independentemente do tamanho ou modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação).

[0085] “Amipqáekfqu” são aqui referidos tanto por seus símbolos de três letras comumente conhecidos quanto pelos símbolos de uma letra recomendados por IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotídeos, igualmente, podem ser referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos.

[0086] O termo “engenheiradq”, “recombinantg”, “fg qeqttêpekc p«q pcvwtcn” g" “variante”. quando usado com referência a uma célula, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo refere-se a um material ou um material correspondente à forma natural ou nativa do material que foi modificado de uma maneira que pode não existir de outra forma na natureza, ou é idêntico a este, mas é produzido ou derivado de materiais sintéticos e/ou por manipulação usando técnicas recombinantes.

[0087] Da maneira aqui usada, “tipo selvagem” g" “fg" qeqtrência natural” referem-se à forma encontrada na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência de polinucleotídeo tipo selvagem é uma sequência presente em um organismo que pode ser isolado de uma fonte na natureza, e que não foi intencionalmente modificado por manipulação humana.

[0088] “Desimunizado” da maneira aqui usada, refere-se à manipulação de uma proteína para criar um variante que não é tão imunogênico quanto a proteína tipo selvagem ou de referência. Em algumas modalidades, a desimunização é completa, em que a proteína variante não estimula uma resposta imune em pacientes aos quais a proteína variante é administrada. Esta resposta pode ser medida por vários métodos incluindo, mas sem limitação, a presença ou abundância de neutralizante (isto é, anticorpos antidroga), a presença de uma resposta anafilática, ou a prevalência ou intensidade de citocina liberada na administração da proteína. Em algumas modalidades, a proteína variante é menos imunogênica do que a proteína tipo selvagem ou de referência. Em algumas modalidades, a desimunização envolve modificações em proteínas (por exemplo, epítopos) que são reconhecidas por receptores de célula T. Em algumas modalidades, os epítopos de célula T são removidos de uma proteína tipo selvagem ou de referência a fim de produzir uma proteína variante desimunizada. Em algumas modalidades, a proteína desimunizada mostra menores níveis de resposta em preditores bioquímicos e biológicos da célula a partir das respostas imunológicas de humano, incluindo ensaios de ativação de célula dendrítica e célula T, ou ensaios de ligação de peptídeo de antígeno de leucócito humano (HLA).

[0089] “Ugswêpekc fg eqfkfiec>«q” refere-se àquela parte de um ácido nucleico (por exemplo, um gene) que codifica uma sequência de aminoácido de uma proteína.

[0090] O termo “rgrcentual (%) de identidade de sequência” é usado aqui para se referir às comparações entre polinucleotídeos e polipeptídeos, e são determinados comparando duas sequências alinhadas de maneira ideal durante uma janela de comparação, em que a parte da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, intervalos) comparada à sequência de referência para alinhamento ideal das duas sequências. O percentual pode ser calculado determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para render o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para render o percentual de identidade de sequência. Alternativamente, o percentual pode ser calculado determinando o número de posições em que tanto a base de ácido nucleico idêntica ou o resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as sequências, quanto uma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido é alinhado com um intervalo para render o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para render o percentual de identidade de sequência. Os versados na técnica entenderão que existem algoritmos muito estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]), pela busca por método de similaridade de Pearson e Lipman (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]), por implementações computadorizadas destes algoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no pacote GCG Wisconsin Software), ou por inspeção visual, da maneira conhecida na técnica. Exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a identidade percentual de sequência e similaridade de sequência incluem, mas sem limitação, algoritmos BLAST e BLAST 2.0 (ver, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]; e Altschul et al., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977]). Software para realizar a análise BLAST é disponível publicamente através da página da internet National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequência de alta pontuação (HSPs) identificando palavras curtas em tamanho “W” na sequência de entrada, que tanto combina quanto satisfaz alguma pontuação limite validade como positiva “T”, quando alinhado com uma palavra do mesmo tamanho em uma sequência de base de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavra próximo (ver, Altschul et al, supra). Estes acertos de palavras iniciais próximas agem como iniciadores para iniciar pesquisa para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência o mais distante possível, para que a pontuação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros “O” (pontuação prêmio para um par de resíduos combinados; sempre >0) e “N” (pontuação de penalidade para resíduos não combinados; sempre <0). Em relação à sequência de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativo diminui pela quantidade “X” de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai de zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo com pontuação negativa; ou a extremidade de cada sequência é alcançada. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa os parâmetros de tamanho de unidade de informação (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas. Em relação às sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa os parâmetros de tamanho de unidade de informação (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver, por exemplo, Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]). A determinação exemplificativa de alinhamento de sequência e % de identidade de sequência pode emprega os programas BESTFIT ou GAP no pacote de Software GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), usando parâmetros padrões fornecidos.

[0091] “Sequência de referência” refere-se a uma sequência definida usada como uma base para uma comparação de sequência. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, um segmento de uma sequência de tamanho completo de gene ou polipeptídeo sequência. No geral, uma sequência de referência apresenta pelo menos 20 resíduos de nucleotídeo ou aminoácido em tamanho, pelo menos 25 resíduos em tamanho, pelo menos 50 resíduos em tamanho, pelo menos 100 resíduos em tamanho ou o tamanho completo do ácido nucleico ou polipeptídeo. Uma vez que dois polinucleotídeos ou polipeptídeos podem cada qual (1) compreender uma sequência (isto é, uma parte da sequência completa) que é similar entre as duas sequências, e (2) podem compreender adicionalmente uma sequência que é divergente entre as duas sequências, as comparações de sequência entre dois (ou mais) polinucleotídeos ou polipeptídeos são tipicamente realizadas comparando sequências dos dois polinucleotídeos ou polipeptídeos com relação a uma “jcpgnc fg eqopctc>«q” para identificar e comparar similaridade de regiões de sequência local. Em algumas modalidades, woc" “sequência de referência” pode ser com base em uma sequência de aminoácido primária, onde a sequência de referência é uma sequência que pode apresentar uma ou mais alterações na sequência primária. Por exemplo, a htcug"“sequência de referência com base em SEQ ID NO:4 com uma valina no resíduo correspondente a X39”"tghgtg-se a uma sequência de referência em que o resíduo correspondente na posição X39 em SEQ ID NO:4 (por exemplo, uma alanina), foi alterado para valina.

[0092] “Lcpgnc"fg"comparação” refere-se a um segmento conceitual de pelo menos cerca de 20 posições de nucleotídeo contíguo ou resíduos de aminoácidos, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência de pelo menos 20 nucleotídeos ou aminoácidos contíguos, e em que a parte da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, intervalos) de 20 por cento ou menos comparado com a sequência de referência (que não compreende adições ou eliminações) para alinhamento ideal das duas sequências. A janela de comparação pode ser maior que 20 resíduos contíguos e inclui, opcionalmente, 30, 40, 50, 100, ou mais janelas.

[0093] “Correspondente a”. “referência a” e “relativo a” quando usado no contexto da numeração de um dado aminoácido ou sequência de polinucleotídeo refere-se à numeração dos resíduos de uma sequência especificada de referência quando o dado aminoácido ou sequência de polinucleotídeo é comparado à sequência de referência. Em outras palavras, o número de resíduo ou posição de resíduo de um dado polímero é designado em relação à sequência de referência, sem ser pela posição numérica real do resíduo no dado aminoácido ou sequência de polinucleotídeo. Por exemplo, uma dada sequência de aminoácido, tal como aquela de uma PAL engenheirado, pode ser alinhada à uma sequência de referência introduzindo intervalos para otimizar combinações de resíduo entre as duas sequências. Nestes casos, embora os intervalos estejam presentes, a numeração do resíduo no dado aminoácido ou sequência de polinucleotídeo é feito com relação à sequência de referência na qual foi alinhado.

[0094] “Diferença no aminoácido” e “diferença no resíduo” referem-se à uma diferença no resíduo de aminoácido em uma posição de uma sequência de polipeptídeo em relação ao resíduo de aminoácido, em uma posição correspondente em uma sequência de referência. As posições de diferença nos aminoácidos são referidas em geral aqui como “Xn”. onde n refere-se à posição correspondente na sequência de referência na qual a diferença de resíduo é baseada. Por exemplo, umc “fkfetep>c no resíduo na posição X91 comparado a SEQ ID NO:6” refere-se a uma diferença do resíduo de aminoácido na posição de polipeptídeo correspondente à posição 91 de SEQ ID NO:4. Assim, se o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO:4 tem uma alanina na posição 91, então uma “diferença no resíduo na posição X91 comparado à SEQ ID NO: 6” refere-se a uma substituição de aminoácido de qualquer resíduo sem ser alanina na posição do polipeptídeo correspondente à posição 91 de SEQ ID NO:4. Em muitos exemplos aqui, a diferença específica no resíduo de aminoácido em uma posição é indicada como “XnY”. onde “Xn” especifica o resíduo correspondente e posição do polipeptídeo de referência (da maneira descrita anteriormente), e “Y” é o identificador de letra única do aminoácido encontrado no polipeptídeo engenheirado (isto é, o resíduo diferente no polipeptídeo de referência). Em alguns exemplos (por exemplo, nas tabelas nos exemplos), a presente descrição também fornece diferença específica nos aminoácidos determinados pela anotação convencional “AnB”."onde A é o identificador de letra única do resíduo na sequência de referência."“p” é o número da posição de resíduo na sequência de referência, e B é o identificador de letra única da substituição de resíduo na sequência do polipeptídeo engenheirado. Em alguns exemplos, um polipeptídeo da presente descrição pode incluir uma ou mais diferenças nos resíduos de aminoácido em relação a uma sequência de referência, que é indicado por uma lista das posições especificadas, onde as diferenças de resíduo estão presentes em relação à sequência de referência. Em algumas modalidades, onde mais de um aminoácido pode ser usado em uma posição de resíduo específico de um polipeptídeo, os vários resíduos de aminoácido que podem ser usados são separados por wo"“/” (por exemplo, X307G/X307Q ou X307G/Q). A presente descrição inclui sequências de polipeptídeo engenheirado compreendendo uma ou mais diferenças nos aminoácidos que incluem cada/ou ambas as substituições conservativas e não conservativas de aminoácido.

[0095] Os termos “eqpjwpVq fg uwduVkVwk>«q fg coipqáekfq” e “eqpjwpVq fg uwduVkVwk>«q” refere-se a um grupo de substituições de aminoácido em uma sequência de polipeptídeo. Em algumas modalidades, conjuntos de substituição compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais substituições de aminoácido. Em algumas modalidades, um conjunto de substituição refere-se ao conjunto de substituições de aminoácido que está presente em qualquer dos polipeptídeos Variante AvPALs listados em qualquer das tabelas nos exemplos. Por exemplo, o conjunto de substituição presente no variante 36 é A39V/A91V/N290G/H307G/L407V/ T524S, em que as posições de aminoácido são relativas à SEQ ID NO:4.

[0096] “Substituição conservativa de aminoácido” refere-se a uma substituição de um resíduo com um resíduo diferente que apresenta uma cadeia lateral similar, e envolve assim tipicamente a substituição do aminoácido no polipeptídeo com aminoácidos na mesma classe de aminoácidos ou similar definida. A título de exemplo e sem limitação, um aminoácido com uma cadeia lateral alifática pode ser substituído por um outro aminoácido alifático (por exemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina); um aminoácido com cadeia lateral hidroxila é substituído por um outro aminoácido com uma cadeia lateral hidroxila (por exemplo, serina e treonina); um aminoácido com cadeias laterais aromáticas é substituído por um outro aminoácido com uma cadeia lateral aromática (por exemplo, fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina); um aminoácido com uma cadeia lateral básica é substituída com um outro aminoácido com uma cadeia lateral básica (por exemplo, lisina e arginina); um aminoácido com uma cadeia lateral acídica é substituído por um outro aminoácido com uma cadeia lateral acídica (por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutâmico); e um aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico é substituído por um outro aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico, respectivamente.

[0097] “Substituição não conservativa” refere-se à substituição de um aminoácido no polipeptídeo por um aminoácido com propriedades significativamente diferentes na cadeia lateral. Substituições não conservativas podem usar aminoácidos entre, em vez de, os grupos definidos e atingir: (a) a estrutura da parte principal do peptídeo na área da substituição (por exemplo, prolina por glicina); (b) a carga ou hidrofobicidade; e/ou (c) o volume da cadeia lateral. A título de exemplo e sem limitação, substituições não conservativas exemplificativas incluem um aminoácido acídico substituído por um aminoácido básico ou alifático; um aminoácido aromático substituído por um pequeno aminoácido; e um aminoácido hidrofílico substituído por um aminoácido hidrofóbico.

[0098] “Eliminação” refere-se à modificação no polipeptídeo por remoção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência. Eliminações podem compreender a remoção de 1 ou mais aminoácidos, 2 ou mais aminoácidos, 5 ou mais aminoácidos, 10 ou mais aminoácidos, 15 ou mais aminoácidos, ou 20 ou mais aminoácidos, até 10% do número total de aminoácidos, ou até 20% do número total de aminoácidos que constituem a enzima de referência, mantendo ao mesmo tempo a atividade enzimática e/ou mantendo a propriedade melhorada de uma enzima transaminase engenheirada. Eliminações podem ser direcionadas às partes internas e/ou partes terminais do polipeptídeo. Em várias modalidades, a eliminação pode compreender um segmento contínuo ou pode ser descontínua.

[0099] “Inserção” refere-se à modificação no polipeptídeo pela adição de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência. Inserções podem ser nas partes internas do polipeptídeo, ou no terminal carbóxi ou amino. Inserções da maneira aqui usada incluem proteínas de fusão, como é conhecido na técnica. A inserção pode ser um segmento contíguo de aminoácidos ou separado por um ou mais dos aminoácidos no polipeptídeo de ocorrência natural.

[00100] Os termos “fragmento funcional” e “fragmento biologicamente ativo” são usados indiferentemente aqui para se referir a um polipeptídeo que tem uma(s) eliminação(s) aminoterminal e/ou carbóxi-terminal e/ou eliminações internas, mas onde a sequência restante de aminoácido é idêntica às posições correspondentes na sequência para a qual deve ser comparada (por exemplo, uma PAL de comprimento total engenheirado da presente invenção) e que mantém substancialmente todas as atividade do polipeptídeo de tamanho total.

[00101] “Rolipeptídeo isolado” refere-se a um polipeptídeo que é substancialmente separado de outros contaminantes que o acompanham naturalmente (por exemplo, proteína, lipídeos e polinucleotídeos). O termo inclui polipeptídeos que foram removidos ou purificados de se ambiente ou sistema de expressão de ocorrência natural (por exemplo, célula hospedeira ou síntese in vitro). Os polipeptídeos de PAL recombinantes podem estar presentes em uma célula, presentes no meio celular, ou serem preparados em várias formas, tais como lisados ou preparações isoladas. Como tal, em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL recombinantes aqui fornecidos são polipeptídeos isolados.

[00102] “RqnkrgrVífgq uwduVcpekcnogpVg purq” refere-se a uma composição em que a espécie de polipeptídeo é a espécie predominante presente (isto é, em uma base ou peso molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual macromolecular na composição), e é no geral uma composição substancialmente purificada quando a espécie em questão compreende pelo menos cerca de 50 por cento da espécie macromolecular presente por mole ou% em peso. No geral, uma composição de PAL substancialmente pura compreenderá cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, cerca de 95% ou mais, e cerca de 98% ou mais de tosa a espécie macromolecular por mole ou% em peso presente na composição. Em algumas modalidades, a espécie em questão é purificada em homogeneidade essencial (isto é, espécie contaminante não pode ser detectada na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente em uma espécie macromolecular única. Espécie solvente, moléculas pequenas (<500 Daltons), e espécies de íon elementar não são consideradas espécies macromoleculares.Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL isolados recombinantes são composições de polipeptídeo substancialmente puras.

[00103] “Propriedade enzimática melhorada” refere-se a um polipeptídeo de PAL engenheirado que exibe uma melhoria em qualquer propriedade de enzima comparado a um polipeptídeo de PAL de referência, tal como um polipeptídeo de PAL tipo selvagem (por exemplo, AvPAL tipo selvagem com SEQ ID NO:4) ou um outro polipeptídeo de PAL engenheirado. Propriedades melhoradas incluem, mas sem limitação, tais propriedades como maior expressão de proteína, maior termoatividade, maior termoestabilidade, maior atividade de pH, maior estabilidade, maior atividade enzimática, maior especificidade de substrato e/ou afinidade, maior atividade específica, maior resistência ao substrato e/ou inibição do produto final, maior estabilidade química, melhor quimiosseletividade, melhor estabilidade de solvente, maior tolerância ao pH acídico, maior tolerância à atividade proteolítica (isto é, sensibilidade reduzida à proteólise), agregação reduzida, maior solubilidade, imunogenicidade reduzida e perfil de temperatura alterado.

[00104] “Maior cVkxkfcfg gpzkoávkec” e “atividade catalítica intensificada”"referem-se à uma melhor propriedade dos polipeptídeos de PAL engenheirados, que podem ser representados por um aumento na atividade específico (por exemplo, produzido sintetizado/tempo/peso de proteína) e/ou um aumento em conversão percentual do substrato no produto (por exemplo, conversão percentual de quantidade inicial de substrato para produto em um período de tempo especificado, usando uma quantidade especificada de PAL), comparado à enzima PAL de referência (por exemplo, AvPAL tipo selvagem e/ou um outro AvPAL engenheirado). Métodos exemplificativos para determinar a atividade de enzima são fornecidos nos exemplos. Qualquer propriedade relacionada à atividade de enzima pode ser afetada, incluindo as propriedades clássicas de enzima de Km, Vmax ou kcat, cujas alterações podem levar à maior atividade enzimática. Melhorias na atividade de enzima podem ser de cerca de 1,1 vez a atividade enzimática da enzima tipo selvagem, a tanto quanto 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes ou mais atividade enzimática do que o PAL de ocorrência natural ou um outro PAL engenheirado, a partir do qual os polipeptídeos de PAL foram derivados.

[00105] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados tem um kcat de pelo menos 0,1/sec, pelo menos 0,2/sec, pelo menos 0,3/sec, pelo menos 0,5/sec, pelo menos 1,0/sec e em algumas modalidades preferidas maior que 1,0/sec. Em algumas modalidades, o Km está na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 5 mM; na faixa de cerca de 5 μm a cerca de 2 mM; na faixa de cerca de 10 μm a cerca de 2 mM; ou na faixa de cerca de 10 μm a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades específicas, a enzima de PAL engenheirado exibe atividade enzimática melhorada na faixa de 1,5 a 10 vezes, 1,5 a 25 vezes, 1,5 a 50 vezes, 1,5 a 100 vezes ou mais, do que aquela da enzima de PAL referência. Atividade de PAL pode ser medida por qualquer ensaio padrão conhecido na técnica, (por exemplo, pelas alterações de monitoramento em propriedades de espectrofotometria de reagentes ou produtos). Em algumas modalidades, a quantidade de produtos produzido é medida pela separação por cromatografia líquida de alto- desempenho (HPLC) combinada com absorbância de UV ou detecção fluorescente diretamente, ou seguindo a derivação de o-ftaldialdeído (OPA). Em algumas modalidades, comparações de atividades de enzima são realizadas usando uma preparação definida de enzima, um ensaio definido em um conjunto de condição, e um ou mais substratos definidos, da maneira adicionalmente descrita aqui com detalhes. No geral, quando lisados são comparados, os números de células e a quantidade de proteína ensaiada são determinados, contanto use de sistemas de expressão idênticos e células hospedeiras idênticas, a fim de minimizar variações na quantidade de enzima produzida pelas células hospedeiras e presente nos lisados.

[00106] O termo “melhor tolerância ao pH ceífkeq” significa que uma PAL recombinante de acordo com a invenção exibe maior estabilidade (isto é, maior atividade mantida em cerca de pH 7,0, após exposição ao pH acídico por um período de tempo especificado [1 hora, até 24 horas]) comparado a uma PAL de referência.

[00107] “rH fisiológico” da maneira aqui usada significa a faixa de pH no geral encontrada em um intestino delgado do indivíduo (por exemplo, humano). Normalmente existe um pH de gradiente da válvula pilórica para o intestino grosso, na faixa de cerca de 6,0 a 7,5.

[00108] O termo “rJ" ceífkeq” usado com referência à melhor estabilidade às condições de pH acídico ou maior tolerância ao pH acídico significa uma faixa de pH de cerca de 1,5 a 6,8.

[00109] Os termos “cvkxkfcfg"rtqvgqnívkec” g"“rtqvg„nkug”. usados aqui indiferentemente, referem-se à quebra de proteínas em polipeptídeos ou aminoácidos menores. A quebra de proteínas é em geral o resultado da hidrólise da ligação de peptídeo por enzimas protease (proteinase). As enzimas protease incluem, mas sem limitação, pepsina, tripsina, quimotripsina, elastase; carboxipeptidase A e B, e peptidases (por exemplo, amino peptidase, dipeptidase e enteropeptidase).

[00110] As frases “swg tgfwz ugpukdükfcfg à rtqVg„nkug” e “que reduz sensibilidade proteolítica” são usadas aqui indiferentemente e significam que um polipeptídeo de PAL engenheirado de acordo com a invenção apresentará uma maior atividade de enzima, comparado a uma PAL de referência em um ensaio padrão (por exemplo, da maneira descrita nos exemplos) após tratamento com uma ou mais proteases.

[00111] “Agregação” significa aglutinação ou precipitação de um polipeptídeo de PAL. Agregação pode levar à inativação da enzima. O termo “agregação reduzida” significa que um polipeptídeo de PAL engenheirado será menos propenso à agregação, comparado a uma PAL de referência.Métodos para avaliar a agregação são conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, uso de microscopia fluorescente com corantes apropriados (por exemplo, tioflavina T ou Vermelho do Nilo), espalhamento dinâmico de luz, citometria de fluxo com corantes apropriados (por exemplo, Bodipy), filtração e análise por SDS-PAGE, e/ou Western blotting, espectroscopia de correlação fluorescente, e microscopia eletrônica. Existem estojos comercialmente disponíveis para avaliar a agregação (por exemplo, o estojo de ensaio de agregação de proteína ProteoStat® [Enzo]).

[00112] “Conversão” refere-se à conversão enzimática (ou biotransformação) de substrato(s) no(s) produto(s) correspondente(s). “Eqpxgtu«q"rgtegpvwcn” refere-se ao percentual do substrato que é convertido no produto em um período de tempo em condições especificadas. Assim, a “atividade enzioávkec” ou “cVkxkfcfg” de um polipeptídeo de PAL pode ser expressa como “eqpxgtu«q" rgtegpvwcn” do substrato no produto em um período de tempo específico.

[00113] “Ugxgtkfcfg" fg" hibridização” refere-se às condições de hibridização, tais como condições de lavagem, na hibridização de ácidos nucleicos. No geral, as reações de hibridização são realizadas em condições de severidade mais baixa, seguido por lavagens de severidade variada, mas mais elevada. O termo “jkdtkfkzc>«q oqfgtcfcogpVg ugxgtc” refere-se às condições que permitem que o DNA alvo se ligue um ácido nucleico complementar que tem cerca de 60% de identidade, preferivelmente cerca de 75% de identidade, cerca de 85% de identidade com o DNA alvo, com mais de cerca de 90% de identidade com o polinucleotídeo alvo. As condições moderadamente severas exemplificativas são condições equivalentes à hibridização em 50% de formamida, 5* solução de Denhart, 5*SSPE, 0,2% de SDS a 42°C, seguido por lavagem em 0,2*SSPE, 0,2% de SDS, a 42°C. “Jkdtkfkzc>«q fg cnvc ugxgtkfcfg” refere-se no geral às condições que apresentam cerca de 10°C ou menos da temperatura de fusão térmica Tm determinada na condição de solução para uma sequência de polinucleotídeo definida. Em algumas modalidades, uma condição de alta severidade refere-se às condições que permitem hibridização apenas daquelas sequências de ácido nucleico que formam híbridos estáveis em NaCl 0,018M a 65°C (isto é, se um híbrido não for estável em NaCl 0,018M a 65°C, não será estável em condições de alta severidade, da maneira aqui contemplada). As condições de alta severidade podem ser fornecidas, por exemplo, por hibridização em condições equivalentes à 50% de formamida, 5* solução de Denhart, 5*SSPE, 0,2% de SDS a 42°C, seguido por lavagem em 0,1*SSPE, e 0,1% de SDS a 65°C. Uma outra condição de alta severidade é hibridizar em condições equivalentes para hibridizar em 5X SSC contendo 0,1% (p:v) de SDS a 65°C, e lavar em 0,1x SSC contendo 0,1% de SDS a 65°C. Outras condições de hibridização de alta severidade, bem como condições moderadamente severas, são descritas nas referências citadas anteriormente.

[00114] “C„fqp qVkokzcfq” refere-se às alterações nos códons do polinucleotídeo que codifica uma proteína preferivelmente usada em um particular organismo, de maneira tal que a proteína codificada seja expressa mais eficientemente naquele organismo. Embora o código genético seja degenerado, em que a maioria dos aminoácidos é representada por diversos códons, chamados códons “sinônimou” ou “semelhantes”, é bem conhecido que o uso de códon por organismos particulares é não aleatório e tendencioso a favor de tripletes de códon particulares. Esta tendência de uso de códon pode ser maior em referência a um dado gene, genes de função comum ou origem ancestral, proteína altamente expressa versus baixo número de cópias de proteínas, e as regiões de codificação de proteína agregada de um genoma de organismo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam as enzimas de PAL apresentam códon otimizado para a produção ideal do organismo hospedeiro selecionado para expressão.

[00115] “Sequência controle” refere-se aqui à inclusão de todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo e/ou polipeptídeo da presente descrição. Cada sequência controle pode ser natural ou estrangeira à sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Tais sequências controles incluem, mas sem limitação, sequências principais, sequências de poliadenilação, sequências pró-peptídeo, sequências promotoras, sequências de peptídeo sinal, sequências de iniciação e finalizadores de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor, e sinais de parada transcricionais e traducionais. Em algumas modalidades, as sequências controles são fornecidas com ligadores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências controle com a região de codificação da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo.

[00116] “Operavelmente ligado” é aqui definido como uma configuração na qual uma sequência controle é apropriadamente colocada (isto é, em uma relação funcional) em uma posição em relação a um polinucleotídeo de interesse, de maneira tal que a sequência controle direcione ou regule a expressão do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse.

[00117] “Ugswêpekc rtqoqVqtc” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é reconhecida por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo de interesse, tal como uma sequência de codificação. A sequência promotora contém sequências controle transcricionais que medeiam a expressão de um polinucleotídeo de interesse. O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00118] “Eqpfk>õgu fg tgc>«q cfgswcfcu” referem-se àquelas condições na solução de reação de conversão enzimática (por exemplo, faixas de carga de enzima, carga de substrato, temperatura, pH, tampões, cossolventes, etc.) nos quais um polipeptídeo de PAL da presente descrição é capaz de converter um substrato no composto de produto desejado, as “eqpfk>õgu fg tgc>«q cfgswcfcu” exemplificativas são aqui fornecidas (ver os exemplos).

[00119] "Etuic”. Vcn eqoq em “ectic fg composto” ou “ectic fg gpzkoc” refere-se à concentração ou quantidade de um componente em uma mistura de reação no início da reaçãoo “UwduVtcVq”, no contexto de um processo de reação de conversão enzimática, refere-se ao composto ou molécula afetada pelo polipeptídeo de PAL. “RrodwVq”, no contexto de um processo de conversão enzimática, refere-se ao composto ou molécula que resulta da ação do polipeptídeo de PAL no substrato.

[00120] Da maneira aqui usada o termo “ewltivar” refere-se ao crescimento de uma população de células microbianas em condições adequadas, usando qualquer meio adequado (por exemplo, líquido, gel ou sólido).

[00121] Polipeptídeos recombinantes (por exemplo, enzimas Variantes de PAL) podem ser produzidos usando qualquer dos métodos adequados conhecidos na técnica. Por exemplo, existe uma ampla variedade de diferentes técnicas de mutagênese bem conhecidas pelos versados na técnica. Além disso, estojos de mutagênese também estão disponíveis a partir de muitos fornecedores comerciais de biologia molecular. Métodos estão disponíveis para realizar substituições específicas em aminoácidos definido (direcionadas por sítio), mutações específicas ou aleatórias em uma região localizada do gene (região-específica), ou mutagênese aleatória em relação ao gene inteiro (por exemplo, mutagênese por saturação). Vários métodos adequados são conhecidos pelos versados na técnica para gerar enzimas variantes incluindo, mas sem limitação, mutagênese sítio-direcionada de DNA de fita única ou DNA de fita dupla usando PCR, mutagênese de cassete, síntese de gene, PCR propensa ao erro, embaralhamento e mutagênese por saturação química, ou qualquer outro método adequado conhecido na técnica. Exemplos não limitantes de métodos usados para DNA e proteína engenheirada são fornecidos nas patentes a seguir: patente US 6.117.679; patente US 6.420.175; patente US 6.376.246; patente US 6.586.182; patente US 7.747.391; patente US 7.747.393; patente US 7.783.428; e patente US 8.383.346. Após os variantes serem produzidos, estes podem ser selecionados por qualquer propriedade desejada (por exemplo, alta ou maior atividade, ou baixa ou menor atividade, mais atividade térmica, maior estabilidade térmica, e/ou estabilidade ao pH acídico, etc.). Em cniwocu oqfcnkfcfgu. “polipeptídeos de PAL recombipcpVgu” (também referidos aqui como “polipeptídeos de PAL engenheirados”, “gnzkocu de PAL variantes” g “variantes de PAL”) podem ser usados.

[00122] Da maneira aqui usada, um "vetor" é um construto de DNA para introduzir uma sequência de DNA em uma célula. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão que é operavelmente ligado a uma sequência controle adequada capaz de realizar a expressão em um hospedeiro adequado do polipeptídeo codificado na sequência de DNA. Em algumas modalidades, um "vetor de expressão" tem uma sequência promotora operavelmente ligada na sequência de DNA (por exemplo, transgene) para direcionar a expressão em uma célula hospedeira e, em algumas modalidades, também compreende uma sequência finalizadora de transcrição.

[00123] Da maneira aqui usada, o termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução e modificação pós- translacional. Em algumas modalidades, o termo também inclui secreção do polipeptídeo a partir de uma célula.

[00124] Da maneira aqui usada, o termo “rtqfwz” refere-se à produção de proteínas e/ou outros compostos por células. Pretende-se que o termo inclua qualquer etapa envolvida na produção de polipeptídeos incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução e modificação pós-translacional. Em algumas modalidades, o termo também inclui secreção do polipeptídeo a partir de uma célula.

[00125] Da maneira aqui usada, um aminoácido ou sequência de nucleotídeo (por exemplo, uma sequência promotora, peptídeo sinal, sequência finalizadora, etc.) é "heteróloga" a uma outra sequência com a qual é operavelmente ligada se as duas sequências não forem associadas na natureza.

[00126] Da maneira aqui usada, os termos “efinwnc jqurgfgktc” e “cepa jqurgfgktc” referem-se aos hospedeiros adequados para vetores de expressão compreendendo DNA aqui fornecido (por exemplo, umas sequências de polinucleotídeos que codificam pelo menos um variante AvPAL). Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células de procarioto ou eucarioto que foram transformadas ou transfectadas com vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica.

[00127] O termo “cpcn„ikeq” significa um polipeptídeo com mais de 70% de identidade de sequência, mas menos de 100% de identidade de sequência (por exemplo, mais de 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência) com um polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, análogos incluem resíduos de aminoácido de ocorrência não natural incluindo, mas sem limitação, homoarginina, ornitina e norvalina, bem como aminoácidos de ocorrência natural. Em algumas modalidades, análogos também incluem um ou mais resíduos de D-aminoácido e ligações não peptídicas entre dois ou mais resíduos de aminoácido.

[00128] O termo “terapêutieq” refere-se a um composto administrado a um indivíduo que mostra sinais ou sintomas de patologia com efeitos médicos benéficos ou desejáveis.

[00129] O termo “eqorquk>«q fatoceêwVkec” refere-se a uma composição adequada para uso farmacêutico em um indivíduo mamífero (por exemplo, humano) compreendendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de um polipeptídeo de PAL engenheirado incluído pela invenção, e um carreador aceitável.

[00130] O termo “swcntkfcfe efeVkxc” significa uma quantidade suficiente para produzir o resultado desejado. Os versados na técnica podem determinar qual a quantidade efetiva usando experimentação de rotina.

[00131] Os termos “isolado” e “purificado” são usados para se referir a uma molécula (por exemplo, um ácido nucleico isolado, polipeptídeo, etc.) ou outro componente que é removido de pelo menos um outro componente com o qual é naturalmente associado. O termo “rwrifiecfq” não exige pureza absoluta, certamente é pretendido como uma definição relativa.

[00132] O termo “indivíduo” inclui mamíferos tais como humanos, primatas não humanos, gado, animais de estimação e animais de laboratório (por exemplo, roedores e lagamorfos). Pretende-se que o termo inclua fêmeas bem como machos.

[00133] Da maneira aqui usada, o termo “rcciente” significa qualquer indivíduo que está sendo avaliado, tratado, ou está doente.

[00134] O termo “bebê” refere-se a uma criança no período do primeiro mês após o nascimento até aproximadamente um (1) ano de idade. Da maneira aqui usada, o termo “recém-nascidq” refere-se à criança no período do nascimento ao 28° dia de vida. O termo “dedê rrematurq” refere-se a um bebê nascido após a vigésima semana completa de gestação, ainda antes do termo completo, no geral pesando ~500 a ~2499 gramas no nascimento. Um “dedê" com peso no nascimento muito baixo” é um bebê pesando menos de 1500 g no nascimento.

[00135] Da maneira aqui usada, o termo “etkcp>c” refere-se a uma pessoa que não atingiu a idade legal para consentir o tratamento ou procedimentos de pesquisa. Em algumas modalidades, o termo refere-se a uma pessoa entre o período de nascimento e adolescência.

[00136] Da maneira aqui usada, o termo “cfwlto” refere-se a uma pessoa que atingiu a idade legal para a jurisdição relevante (por exemplo, 18 anos de idade nos Estados Unidos). Em algumas modalidades, o termo refere- se a qualquer organismo maduro, completamente crescido. Em algumas modalidades, o termo “cfwlto jovem” refere-se a uma pessoa menor que 18 anos de idade, mas que atingiu a maturidade sexual.

[00137] Da maneira aqui usada, “eqorquk>«q” e “formulação” incluem produtos compreendendo pelo menos uma PAL engenheirado da presente invenção, pretendido para qualquer adequado usado (por exemplo, composições farmacêuticas, suplementos alimentar/nutricional, ração, etc.).

[00138] Os termos “cfokpkuVtc>«q” g “administtcpfq” uma composição significa fornecer uma composição da presente invenção a um indivíduo (por exemplo, a uma pessoa que sofre dos efeitos de PKU).

[00139] O termo “ecttgcfqt” quando usado em referência a uma composição farmacêutica significa qualquer um de carreador farmacêutico padrão, tampões e excipientes, tais como estabilizantes, conservantes e adjuvantes.

[00140] O termo “hctocegwVkecogpVg cegkváxgn” significa um material que pode ser administrado a um indivíduo sem causar nenhum efeito biológico desejável, ou interagir de uma maneira prejudicial com qualquer dos componentes em que está contido e que possui a atividade biológica desejável.

[00141] Da maneira aqui usada, o termo “gzeipiente” refere-se a qualquer aditivo, carreador, diluente, adjuvante ou outro ingrediente farmaceuticamente aceitável, sem ser o ingrediente farmacêutico ativo (API; por exemplo, os polipeptídeos de PAL engenheirados da presente invenção). Excipientes são tipicamente incluídos para propósitos de formulação e/ou administração.

[00142] O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” quando usado em referência aos sintomas de doença/condição refere-se à quantidade e/ou concentração de um composto (por exemplo, polipeptídeos de PAL engenheirados) que melhora, atenua ou elimina um ou mais sintomas de uma doença/condição, ou impede ou atrasa o início do(s) sintoma(s) (por exemplo, PKU). Em algumas modalidades, o termo é usado em referência à quantidade de uma composição que elicita a resposta biológica (por exemplo, médica) por um tecido, sistema, ou indivíduo animal que é procurada pelo pesquisador, médico, veterinário ou outro clínico.

[00143] O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” quando usado em referência a uma doença/condição refere-se à quantidade e/ou concentração de uma composição que melhora, atenua ou elimina a doença/condição.

[00144] Pretende-se que os termos “tratando”. “tratar” e “tratamento” incluam tratamento preventivo (por exemplo, profilático), bem como paliativo.

Polipeptídeos de PAL engenheirados:

[00145] Os polipeptídeos de PAL parentais, a partir dos quais os polipeptídeos de PAL engenheirados da invenção são derivados, incluem cepas de bactéria tais como Anabaena (por exemplo, A. variabilis), Nostoc (por exemplo, N. punctiforme), Rhodosporidium (por exemplo, R. toruloides), Streptomyces (por exemplo, S. maritimus ou S. verticillatus), Oscillatoria sp., Gloeocapsa sp., e Rivularia sp. Enzimas de PAL destas cepas foram identificadas e são bem conhecidas. Sequências homólogas de enzima de Anabaena (A. variabilis) ATCC 29413 e NCBI YP_324488.1; Nostoc (N. punctiforme) ATCC 29133 e NCBI YP_00186563.1; Oscillatoria sp. PCC 6506 e NCBI ZP_ 07108482.1 e Gloeocapsa sp. PCC7428 e NCBI YP_007127054.1 são fornecidas na figura 1. A fenilalanina/histidina amônia liase de Nostoc punctiforme “NpPHAN” (NCBI YP_001865631.1 (SEQ ID NO:30); histidina amônia-liase de Rivularia sp. “RspHAN” (NCBI YP_007056096.1 (SEQ ID NO:31); histidina amônia-liase de Oscillatoria sp. “Osp HAN” (NCBI YP_07108482.1(SEQ ID NO:32); e histidina amônia-liase de Gloeocapsa sp. “GspHAN” (NCBI YP_007127054.1) (SEQ ID NO:33) apresentam mais de 70% de homologia com AvPAL (SEQ ID NO:4).

[00146] Além do mais, quando uma PAL variante particular (isto é, um polipeptídeo de PAL engenheirado) é referido por referência à modificação de resíduos de aminoácido particulares na sequência de uma PAL tipo selvagem ou PAL de referência, entende-se que variantes de um outro PAL modificado na(s) posição(s) equivalente(s) (determinado a partir do alinhamento de sequência de aminoácido opcional entre as respectivas sequências de aminoácidos) são incluídos aqui. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado é derivado de qualquer um dos polipeptídeos listados das cepas de bactéria anteriores (isto é, Nostoc [N. punctiforme], Rhodosporidium [R. toruloides], Streptomyces [S. maritimus ou S. verticillatus], Oscillatoria sp., Gloeocapsa sp e Rivularia sp.). Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo de PAL engenheirado da presente invenção compreende o sítio ativo conservado Ala167- Ser168-Gly169 e compreende pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados compreendem não apenas atividade de PAL, mas são também são ativos nos substratos tirosina e/ou histidina.

[00147] Em algumas modalidades, polipeptídeos de PAL engenheirados são produzidos cultivando um micro-organismo que compreende pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo de PAL engenheirado, em condições que são favoráveis para produzir o polipeptídeo de PAL engenheirado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado é subsequentemente recuperado do meio de cultura resultante e/ou células.

[00148] A presente invenção fornece polipeptídeos de PAL engenheirados com atividade de PAL exemplificativas. Os exemplos fornecem tabelas que exibem a informação de sequência estrutural que correlaciona as características de sequência de aminoácido específico com a atividade funcional dos polipeptídeos de PAL engenheirados. Esta informação de correlação estrutura-função é fornecida na forma de diferença específica no resíduo de aminoácidos em relação ao polipeptídeo engenheirado de referência de SEQ ID NO:4, bem como associado aos dados de atividade experimentalmente determinada para os polipeptídeos de PAL engenheirados exemplificativos.

[00149] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados da presente invenção com atividade de PAL compreendem a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4; b) uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4 em uma ou mais posições de aminoácido; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) de sensibilidade proteolítica reduzida, iii) maior tolerância ao pH acídico, iv) agregação reduzida ou uma combinação de qualquer de i), ii), iii) ou iv) comparado à sequência de referência.

[00150] Em algumas modalidades os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4, e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4, em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 ou mais posições de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4 ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4). Em algumas modalidades, o resíduo diferença comparado à SEQ ID NO:4, em uma ou mais posições inclui pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições conservativas de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado é um polipeptídeo listado nas tabelas fornecidas nos exemplos.

[00151] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4 e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4 em uma ou mais posições de aminoácido é selecionada de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; ou qualquer combinação das mesmas, quando alinhado de maneira ideal com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades a diferença no aminoácido é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ou 20 ou mais posições de aminoácido.

[00152] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85% (pelo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com SEQ ID NO:4 e compreende uma diferença no resíduo de aminoácido na posição H307 e opcionalmente uma diferença no resíduo de aminoácido em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades a diferença no resíduo de aminoácido na posição 307 é H307/G/Q/M.

[00153] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85% (pelo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com SEQ ID NO:4 e compreendem pelo menos uma diferença no resíduo de aminoácido selecionado de uma combinação de um ou mais de A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; I245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; I326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; e/ou P564. Em algumas modalidades adicionais, há diferença no resíduo de aminoácidos em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido.

[00154] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem uma melhor propriedade apresentam pelo menos 85% (pelo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com SEQ ID NO:4 e compreendem uma diferença no resíduo de aminoácido selecionado de uma combinação de um ou mais de A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; e P564 G/L/M, quando alinhado de maneira ideal com SEQ ID NO:4.

[00155] Em algumas modalidades, a diferença no resíduo de aminoácido é selecionada de uma combinação de um ou mais de A39V; A91V; A256G; N290G; A394V; S399N; P404A; L407V; K522Y/F/N; e/ou T524S, quando alinhado de maneira ideal com SEQ ID NO:4.

[00156] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece fragmentos funcionais de polipeptídeos de PAL engenheirados. Em algumas modalidades, fragmentos funcionais compreendem pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da atividade do polipeptídeo de PAL engenheirado a partir do qual foi derivado (isto é, o PAL engenheirado parental). Em algumas modalidades, fragmentos funcionais compreendem pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da sequência parental do PAL engenheirado. Em algumas modalidades o fragmento funcional será truncado em menos de 5, menos de 10, menos de 15, menos de 10, menos de 25, menos de 30, menos de 35, menos de 40, menos de 45, e menos de 50 aminoácidos.

[00157] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece fragmentos funcionais de polipeptídeos de PAL engenheirados. Em algumas modalidades, fragmentos funcionais compreendem pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da atividade do polipeptídeo de PAL engenheirado a partir do qual foi derivado (isto é, o PAL engenheirado parental). Em algumas modalidades, fragmentos funcionais compreendem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da sequência parental do PAL engenheirado. Em algumas modalidades o fragmento funcional será truncado em menos de 5, menos de 10, menos de 15, menos de 10, menos de 25, menos de 30, menos de 35, menos de 40, menos de 45, menos de 50,menos de 55, menos de 60, menos de 65, ou menos de 70 aminoácidos.

[00158] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:6 e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:6, em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:6, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6 e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:6 de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:6.

[00159] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:10, ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado à SEQ ID NO:10, em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:10, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:10. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:10, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:10, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:10.

[00160] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:12 ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:12 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:12, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:12, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:12, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:12.

[00161] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:14 ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:14 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:14, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:14. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:14, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:14, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:14.

[00162] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:16 ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:16 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:16, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:16. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:16, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:16, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:16.

[00163] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:18 ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:18 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:18, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:18, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:18, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:18.

[00164] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:20 ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:20 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:20, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:20. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:20, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:20, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:20.

[00165] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:22 ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:22 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:22, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:22. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:22, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:22, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:22.

[00166] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem pelo menos uma propriedade melhorada apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:24 ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:24 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NO:24, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:24. Em algumas modalidades, os PALs engenheirados compreendem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:24, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NO:24, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado consiste na sequência de SEQ ID NO:24.

Variantes com Sensibilidade reduzida à Proteólise:

[00167] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados da presente invenção apresentam atividade de PAL, exibem sensibilidade reduzida à proteólise, e compreendem: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4; b) uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4 em uma ou mais posições de aminoácido.

[00168] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem sensibilidade reduzida à proteólise apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4 e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4 em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 ou mais posições de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4 ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4).

[00169] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem sensibilidade reduzida à proteólise apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4 e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4, em uma ou mais posições de aminoácido são selecionado de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304,X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404;X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524;X528; X546; X564; ou qualquer combinação dos mesmos, quando alinhado de maneira ideal com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades a diferença no aminoácido é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ou 20 ou mais posições de aminoácido.

[00170] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem sensibilidade reduzida à proteólise apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, e compreendem uma diferença no resíduo de aminoácido na posição X307; X326; X460; X307; e/ou X528 e opcionalmente uma diferença no resíduo de aminoácido a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, a diferença no resíduo de aminoácido é selecionada de Y304H/W; R305L/M; H307G/M/Q; I326F; Q240W; T460G; P528L; e qualquer destas substituições em combinação, quando alinhado com SEQ ID NO:4.

[00171] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem sensibilidade reduzida à proteólise apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com qualquer de SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e/ou 24, ou um fragmento funcional da mesma e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e/ou 24, em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ou mais posições de aminoácido) comparado à SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e/ou 24, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e/ou 24. Em algumas modalidades, o PAL engenheirado compreende pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e/ou 24, e compreendem uma diferença no aminoácido comparado à SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e/ou 24, de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o PAL compreende ou consiste na sequência de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e/ou 24.

[00172] Em algumas modalidades, a sensibilidade proteolítica dos polipeptídeos de PAL engenheirados é reduzida em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, daquela do PAL tipo selvagem (por exemplo, AvPAL com SEQ ID NO:4), ou comparado a um polipeptídeo de PAL de referência, essencialmente nas mesmas condições. A atividade proteolítica pode ser medida usando qualquer dos métodos adequados conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação a aqueles descritos nos exemplos.

[00173] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados com sensibilidade reduzida à proteólise apresentam sensibilidade reduzida à uma composição compreendendo um ou mais proteases, incluindo, mas sem limitação a, pepsina, tripsina, quimotripsina, carboxipeptidase A e B, peptidases (por exemplo, amino peptidase, dipeptidase e enteropeptidase) quando tanto o PAL de referência quanto o PAL engenheirado com a sensibilidade reduzida são comparados e expostos essencialmente à mesma quantidade e tipo de protease, essencialmente nas mesmas condições.

[00174] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado com sensibilidade reduzida à proteólise apresenta níveis de atividade de enzima que são cerca de 1,0 vez, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes ou mais da atividade enzimática do PAL de referência (por exemplo, AvPAL). Em algumas modalidades, os polipeptídeos engenheirados apresentam mais atividade de enzima, comparado a uma PAL de referência, quando a atividade é medida em uma faixa de pH de 4,5 a 7,5; quando a atividade é medida em uma faixa de pH de 4,5 a 6,5; quando a atividade é medida em uma faixa de pH de 5,0 a 7,5; quando a atividade é medida em uma faixa de pH de 5,0 a 6,5; quando a atividade é medida em uma faixa de pH de 5,5 a 7,5; e/ou também quando a atividade é medida em uma faixa de pH de 5,5 a 6,5. Em algumas outras modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados apresentam valores de Km na faixa de 1 μm a 5 mM.

Variantes com Maior tolerância ao pH acídico:

[00175] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados da invenção apresentam atividade de PAL, são tolerantes aos níveis de pH acídicos e compreendem: a) uma sequência de aminoácido com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4, ou um fragmento do mesmo; e b) uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4, em uma ou mais posições de aminoácido.

[00176] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados, que exibem maior tolerância ao pH acídico comparado a tipo selvagem AvPAL e/ou um outro polipeptídeo de referência, apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4 e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4, em uma ou mais posições de aminoácido (tais como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 ou mais posições de aminoácido comparado à SEQ ID NO:4, ou uma sequência com pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4.

[00177] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem maior tolerância ao pH acídico comparado a tipo selvagem AvPAL e/ou um outro polipeptídeo de referência, apresenta pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO:4, e uma diferença no resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4, em uma ou mais posições de aminoácido são selecionado de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; ou qualquer combinação do mesmo quando alinhado de maneira ideal com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades a diferença no aminoácido é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ou 20 ou mais posições de aminoácido.

[00178] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem maior tolerância ao pH acídico comparado a tipo selvagem AvPAL e/ou um outro polipeptídeo de referência apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, e compreendem uma diferença no resíduo de aminoácido na posição X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394;X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509;X521; X522; X524; X528; X546; X564; ou qualquer combinação do mesmo; e opcionalmente uma diferença no resíduo de aminoácido a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades a diferença no resíduo de aminoácido é A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; I245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; I326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; e/ou P564, quando alinhado com SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que exibem maior tolerância ao pH acídico apresentam pelo menos 85%, pelo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, e compreendem uma diferença no resíduo de aminoácido em uma ou mais posições A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; e/ou P564 G/L/M; quando alinhado com SEQ ID NO:4.

[00179] Em algumas modalidades, quando todas as outras condições de ensaio são essencialmente as mesmas, os polipeptídeos de PAL engenheirados com maior tolerância ao pH acídico comparado a um polipeptídeo de PAL de referência apresentam uma maior tolerância em uma faixa de pH entre 1,5 a 6,5; entre 1,5 e 5,0; entre 2,0 a 5,5; entre 3,0 e 6,8; entre 3,0 e 5,5; entre 4,0 e 6,5; entre 4,0 e 4,5; entre 4,5 e entre 5,0; entre 4,5 e 5,5, entre 4,5 e 6,0; entre 4,5 e 6,5; entre 5,0 e 6,5; entre 5,0 e 6,0; entre 5,0 e 5,5; entre 5,5 e 6,0; entre 6,0 e 6,5; e/ou entre 6,5 e 7,0. Em algumas modalidades, a maior tolerância ao pH acídico é exibida em um pH de cerca de 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 e/ou 6,5.

[00180] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados que apresentam maior tolerância ao pH acídico também exibem maior atividade de PAL comparado a uma PAL de referência, quando avaliado por um ensaio padrão. Qualquer ensaio adequado pode ser usado na presente invenção, incluindo, mas sem limitação a aqueles aqui fornecidos.

[00181] Contempla-se adicionalmente que qualquer dos polipeptídeos engenheirados exemplificativos (isto é, Variante No. 1 - Variante No. 1010) são usados como a sequência inicial de aminoácido para sintetizar outros polipeptídeos de PAL engenheirados, por exemplo, por subsequentes ciclos de evolução pela adição de novas combinações de várias diferenças nos aminoácidos a partir de outros polipeptídeos, e outras posições de resíduo aqui descritas. Em algumas modalidades, melhorias adicionais são geradas incluindo diferenças no aminoácido em posições de resíduo que foram mantidas como não alteradas em todos os ciclos de evolução anteriores. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a nenhum método particular para produzir polipeptídeos de PAL engenheirados, uma vez que qualquer método adequado pode ser usado incluindo, mas sem limitação aos métodos aqui fornecidos.

Polinucleotídeos que Codificam Polipeptídeos, Vetores de expressão e Células hospedeiras Engenheirados:

[00182] A presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de PAL engenheirados aqui descritos. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são operavelmente ligados a uma ou mais sequências regulatórias heterólogas que controlam a expressão de gene para criar um polinucleotídeo recombinante capaz de expressar o polipeptídeo. Em algumas modalidades, os construtos de expressão contendo pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o(s) polipeptídeo(s) PAL engenheirado(s) são introduzidos em células hospedeiras apropriadas para expressar o(s) polipeptídeo(s) de PAL correspondente(s).

[00183] Como será evidente aos versados na técnica, a disponibilidade de uma sequência de proteína e o conhecimento dos códons correspondentes aos vários aminoácidos fornece uma descrição de todos os polinucleotídeos capazes de codificar os polipeptídeos em questão. A degeneração do código genético, onde os mesmos aminoácidos são codificados por códons alternativos ou sinônimos, permite um número muito grande de ácidos nucleicos a serem preparados, todos os quais codificam um polipeptídeo de PAL engenheirado. Assim, a presente invenção fornece métodos e composições para a produção de cada e qualquer possível variação de polinucleotídeos PAL que pode ser preparada e que codifica os polipeptídeos de PAL aqui descritos pelas combinações de seleção com base nas possíveis escolhas de códon, e todas tais variações devem ser consideradas especificamente descritas para qualquer polipeptídeo aqui descrito, incluindo a sequência de aminoácidos apresentada nos exemplos (por exemplo, nas várias tabelas).

[00184] Em algumas modalidades, os códons são preferivelmente otimizados para utilização pela célula hospedeira escolhida para produção de proteína. Por exemplo, os códons preferidos usados em bactérias são tipicamente usados para expressão em bactérias. Consequentemente, polinucleotídeos com códon otimizado que codificam os polipeptídeos de PAL engenheirados contêm códons preferidos em cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou maior que 90% das posições de códon na região de codificação de tamanho completo.

[00185] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de PAL codifica um polipeptídeo engenheirado com atividade de PAL com as propriedades aqui descritas, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade com uma sequência de referência selecionada de SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, e/ou 23, ou a sequência de aminoácido de qualquer variante (por exemplo, aquele fornecido nos exemplos), e uma ou mais diferenças no resíduo comparado ao polinucleotídeo de referência de SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e/ou 23, ou a sequência de aminoácido de qualquer variante descrito nos exemplos (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de resíduo de aminoácido). Em algumas modalidades, a sequência de referência é selecionada de SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, e/ou 23.

[00186] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de PAL codifica um polipeptídeo engenheirado com atividade de PAL com as propriedades aqui descritas, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO:4 e um ou mais diferenças no resíduo comparado à SEQ ID NO:4 nas posições de resíduo de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364;X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474;X509; X521; X522; X524; X528; X546; e/ou X564; quando alinhado de maneira ideal com o polipeptídeo de SEQ ID NO:4.

[00187] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos de PAL engenheirados compreendem uma sequência de polinucleotídeo selecionada de uma sequência de polinucleotídeo selecionada de SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, e/ou 23. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PAL engenheirado apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de resíduo de nucleotídeo com SEQ ID NOS:2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, e/ou 23.

[00188] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são capazes de hibridizar, em condições muito severas, em uma sequência de referência de polinucleotídeo selecionado de SEQ ID NOS:2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, e/ou 23, ou um complemento do mesmo, ou uma sequência de polinucleotídeo que codifica qualquer dos polipeptídeos variantes de PAL aqui fornecidos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo capaz de hibridizar em condições muito severas codifica um polipeptídeo de PAL compreendendo uma sequência de aminoácido que apresenta uma ou mais diferenças no resíduo comparado à SEQ ID NO:4, em posições do resíduo selecionadas de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308;X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453;X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; e/ou X564.

[00189] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo isolado que codifica qualquer dos polipeptídeos de PAL engenheirados aqui é manipulado em uma variedade de maneiras para facilitar a expressão do polipeptídeo de PAL. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de PAL compreendem vetores de expressão onde uma ou mais sequências controles está presente para regular a expressão dos polinucleotídeos e/ou polipeptídeos de PAL. A manipulação do polinucleotídeo isolado antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão utilizado. Técnicas para modificar sequências de polinucleotídeos e ácidos nucleicos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as sequências controle incluem entre outros, promotores, sequências principais, sequências de poliadenilação, sequências de pró- peptídeo, sequências de peptídeo sinal e finalizadores de transcrição. Em algumas modalidades, os promotores adequados são selecionados com base na seleção de células hospedeiras. Em relação às células hospedeiras bacterianas, os promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente descrição incluem, mas sem limitação,, promotores obtidos do operon lac de E. coli, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene beta-lactamase de procarioto (Ver, por exemplo, Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75:3727-3731 [1978]), bem como o promotor tac (Ver, por exemplo, DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]). Os promotores exemplificativos para células hospedeiras de fungos filamentosos incluem, mas sem limitação, promotores obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (Ver, por exemplo, WO 96/00787), bem como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa- amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae), e promotores mutantes, truncados e híbdridos dos mesmos. Os promotores de célula de levedura exemplificativos podem ser dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores usados para células hospedeiras de levedura são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]).

[00190] Em algumas modalidades, a sequência controle é também uma sequência finalizadora de transcrição adequada (isto é, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para finalizar a transcrição). Em algumas modalidades, a sequência finalizadora é operavelmente ligada ao terminal 3' da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de PAL. Qualquer finalizador adequado que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção. Finalizadores de transcrição exemplificativos para células hospedeiras de fungos filamentosos podem ser obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum. Os finalizadores exemplificativos para células hospedeiras de levedura podem ser obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros finalizadores usados para células hospedeiras de levedura são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Romanos et al., supra).

[00191] Em algumas modalidades, a sequência controle é também uma sequência principal adequada (isto é, uma região não traduzida de um RNAm que é importante para tradução pela célula hospedeira). Em algumas modalidades, a sequência principal é operavelmente ligada ao terminal 5' da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de PAL. Qualquer sequência principal adequada que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção. As sequências principais exemplificativas para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. As sequências principais adequadas para células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[00192] Em algumas modalidades, a sequência controle é também uma sequência de poliadenilação (isto é, uma sequência operavelmente liga ao terminal 3' da sequência de ácido nucleico e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito). Qualquer sequência de poliadenilação adequada que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção. Sequências de poliadenilação exemplificativas para células hospedeiras de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum e alfa-glucosidase de Aspergillus niger. As sequências de poliadenilação usadas para células hospedeiras de levedura são conhecidas (Ver, por exemplo, Guo e Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995]).

[00193] Em algumas modalidades, a sequência controle é também um peptídeo sinal (isto é, uma região de codificação que codifica uma sequência de aminoácido ligada ao terminal amino de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeo codificado na via secretória da célula). Em algumas modalidades, a extremidade 5' da sequência de codificação da sequência de ácido nucleico contém inerentemente uma região de peptídeo sinal de codificação naturalmente ligada ao quadro de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, em algumas modalidades, a extremidade 5' da sequência de codificação contém uma região de codificação de peptídeo sinal que é estrangeira à sequência de codificação. Qualquer região de codificação de peptídeo sinal adequada que direciona o polipeptídeo expresso na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada para expressão do(s) polipeptídeo(s) engenheirado(s). As regiões de codificação de peptídeo sinal efetivas para células hospedeiras bacterianas que apresentam as regiões de codificação de peptídeo sinal incluem, mas sem limitação, aquelas obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NClB 11837, alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis. Adicionalmente, os peptídeos sinais são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Simonen e Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]). Em algumas modalidades, as regiões de codificação de sinal de peptídeo efetivas para células hospedeiras de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, regiões de codificação de peptídeo sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens e lipase de Humicola lanuginosa. Os peptídeos sinais usados para células hospedeiras de levedura incluem, mas sem limitação, aqueles dos genes para alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae.

[00194] Em algumas modalidades, a sequência controle é também uma região de codificação de pró-peptídeo que codifica uma sequência de aminoácido posicionada no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é referido como woc “pró-gpzkoc”, “pró-polipeptídeo” ou “zimóggpq” Um pró-polipeptídeo pode ser convertido em um polipeptídeo maduro ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A região de codificação do pró-peptídeo pode ser obtida de qualquer fonte adequada incluindo, mas sem limitação, genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e lactase de Myceliophthora thermophila (Ver, por exemplo, WO 95/33836). Onde tanto as regiões de peptídeo sinal quanto de pró-peptídeo estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a região de pró-peptídeo é posicionada seguindo o terminal amino de um polipeptídeo e a região de peptídeo sinal é posicionada seguindo o terminal amino da região de pró-peptídeo.

[00195] Em algumas modalidades, sequências regulatórias são também utilizadas. Estas sequências facilitam a regulação da expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são aqueles que causam a expressão do gene a ser ativado e desativado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Em células hospedeiras de procarioto, as sequências regulatórias adequadas incluem, mas sem limitação, sistemas operacionais lac, tac e trp. Em células hospedeiras de levedura, os sistemas regulatórios adequados incluem, mas sem limitação, sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos, as sequências regulatórias adequadas incluem, mas sem limitação, promotor de TAKA alfa-amilase, promotor glucoamilase de Aspergillus niger e promotor glucoamilase de Aspergillus oryzae.

[00196] Em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um vetor de expressão recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PAL engenheirado, e uma ou mais regiões de regulação de expressão tais como um promotor e um finalizador, uma origem de replicação, etc., dependendo do tipo de hospedeiros nos quais devem ser introduzidos. Em algumas modalidades, as várias sequências de ácido nucleico e controle aqui descritas são associadas juntas para produz vetores de expressão recombinantes que incluem um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir inserção ou substituição da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de PAL em tais sítios. Alternativamente, em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico da presente invenção é expressa inserindo a sequência de ácido nucleico ou um construto de ácido nucleico compreendendo a sequência em um vetor para expressão apropriado. Em algumas modalidades que envolvem a criação do vetor de expressão, a sequência de codificação é localizada no vetor, de forma que a sequência de codificação é operavelmente ligada às sequências controle para expressão apropriadas.

[00197] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor adequado (por exemplo, um plasmídeo ou vírus), que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e proporciona a expressão da sequência de polinucleotídeo de PAL. A escolha do vetor depende tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

[00198] Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor de replicação autônomo (isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossomal, cuja replicação é independente da replicação cromossomal, tal como um plasmídeo, um elemento extracromossomal, um minicromossomo ou um cromossomo artificial). O vetor pode conter qualquer meio para garantir a autorreplicação. Em algumas modalidades alternativas, o vetor é aquele no qual, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado juntamente com o(s) cromossomo(s) no qual foi integrado. Além do mais, em algumas modalidades, um vetor ou plasmídeo único, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, e/ou um transposon são utilizados.

[00199] Em algumas modalidades, o vetor de expressão contém um ou mais marcadores selecionáveis, os quais permitem fácil seleção de células transformadas. Um “marcador selecionável” é um gene, cujo produto fornece resistência a biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia aos auxotróficos e similares. Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos incluem, mas sem limitação, genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibiótico tais como resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, mas sem limitação, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em células hospedeiras de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, amdS (acetamidase; por exemplo, de A. nidulans ou A. orzyae), argB (ornitina carbamoiltransferases), bar (fosfinotricina acetiltransferase; por exemplo, de S. hygroscopicus), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase; por exemplo, de A. nidulans ou A. orzyae), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes dos mesmos. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo de PAL engenheirado da presente invenção, o(s) polinucleotídeo(s) sendo operavelmente ligado(s) a uma ou mais sequências controle para expressão da(s) enzima(s) de PAL engenheirado na célula hospedeira. Células hospedeiras adequadas para uso na expressão dos polipeptídeos codificados pelo vetores de expressão da presente invenção são bem conhecidas na técnica e incluem, mas sem limitação, células bacterianas, tais como células de E. coli, Vibrio fluvialis, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células fúngicas, tais como células de levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris (ATCC Accession No.201178)); células de inseto tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais tais como células CHO, COS, BHK, 293 e melanoma de Bowes; e células de planta. As células hospedeiras exemplificativas também incluem várias cepas de Escherichia coli (por exemplo, W3110 (ΔfhuA) e BL21).

[00200] Desta maneira, em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para produzir os polipeptídeos de PAL engenheirados, onde os métodos compreendem cultivar uma célula hospedeira capaz de expressar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de PAL engenheirado em condições adequadas para expressão do polipeptídeo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente as etapas de isolar e/ou purificar os polipeptídeos de PAL, da maneira aqui descrita.

[00201] Os meios de cultura e as condições de crescimento apropriados para as células hospedeiras são bem conhecidos na técnica. Contempla-se que qualquer método adequado para introduzir polinucleotídeos para expressão dos polipeptídeos de PAL em células poderá ser usado na presente invenção. As técnicas adequadas incluem, mas sem limitação, eletroporação, bombardeamento biolístico de partícula, transfecção mediada por lipossomo, transfecção de cloreto de cálcio e fusão de protoplasto.

[00202] Polipeptídeos de PAL engenheirados com as propriedades aqui descritas podem ser obtidos submetendo o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de PAL de ocorrência natural ou engenheirado a qualquer método adequado de mutagênese e/ou evolução direcionada conhecido na técnica, e/ou da maneira aqui descrita. Uma técnica de evolução direcionada exemplificativa é mutagênese e/ou embaralhamento de DNA (Ver, por exemplo, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 e patente U.S. 6.537.746). Outros procedimentos de evolução direcionada que podem ser usados incluem, entre outros, processos de extensão escalonado (Etapa), recombinação in vitro (Ver, por exemplo, Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998]), PCR mutagênica (Ver, por exemplo, Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]), e mutagênese em cassete (Ver, por exemplo, Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996]).

[00203] Os métodos de mutagênese e evolução direcionada podem ser prontamente aplicados aos polinucleotídeos que codificam PAL para gerar bibliotecas variantes que podem ser expressas, selecionadas e ensaiadas. Qualquer dos métodos de mutagênese e evolução direcionada adequados podem ser usados na presente invenção e são bem conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, patentes US 5.605.793, 5.830.721, 6.132.970, 6.420.175, 6.277.638, 6.365.408, 6.602.986, 7.288.375, 6.287.861, 6.297.053, 6.576.467, 6.444.468, 5.811.238, 6.117.679, 6.165.793, 6.180.406, 6.291.242, 6.995.017, 6.395.547, 6.506.602, 6.519.065, 6.506.603, 6.413.774, 6.573.098, 6.323.030, 6.344.356, 6.72.497, 7.868.138, 5.834.252, 5.928.905, 6.489.146, 6.096.548, 6.387.702, 6.391.552, 6.358.742, 6.482.647, 6.335.160, 6.653.072, 6.355.484, 6.03.344, 6.319.713, 6.613.514, 6.455.253, 6.579.678, 6.586.182, 6.406.855, 6.946.296, 7.534.564, 7.776.598, 5.837.458, 6.391.640, 6.309.883, 7.105.297, 7.795.030, 6.326.204, 6.251.674. 6.716.631. 6.528.311. 6.287.862. 6.335.198. 6.352.859. 6.379.964. 7.148.054, 7.629.170, 7.620.500, 6.365.377, 6.358.740, 6.406.910, 6.413.745, 6.436.675, 6.961.664, 7.430.477, 7.873.499, 7.702.464, 7.783.428, 7.747.391, 7.747.393, 7.751.986, 6.376.246, 6.426.224, 6.423.542, 6.479.652, 6.319.714, 6.521.453, 6.368.861, 7.421.347, 7.058.515, 7.024.312, 7.620.502, 7.853.410, 7.957.912, 7.904.249 e todos os homólogos não US relacionados; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; WO 2009/152336, e patente U.S. 6.537.746, todos os quais são aqui incorporados pela referência).

[00204] Em algumas modalidades, os clones de enzima obtidos seguindo o tratamento de mutagênese são selecionados submetendo as preparações de enzima à uma temperatura definida (ou outras condições de ensaio) e medindo a quantidade de atividade de enzima restante após tratamentos de calor ou outras condições adequadas de ensaio. Clones contendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PAL são então isolados do gene, sequenciados para identificar as alterações de sequência de nucleotídeo (se houver), e usados para expressar a enzima em uma célula hospedeira. Medir a atividade de enzima das bibliotecas de expressão pode ser realizada usando qualquer método adequado conhecido na técnica (por exemplo, técnicas de bioquímica padrões, tal como análise HPLC).

[00205] Em relação aos polipeptídeos engenheirados de sequência conhecida, os polinucleotídeos que codificam a enzima podem ser preparados por métodos padrões de fase sólida, de acordo com métodos sintéticos conhecidos. Em algumas modalidades, fragmentos de até cerca de 100 bases podem ser individualmente sintetizados, então associados (por exemplo, por métodos de processo enzimático ou químico, ou métodos mediados por polimerase) para formar qualquer sequência contínua desejada. Por exemplo, polinucleotídeos e oligonucleotídeos aqui descritos podem ser preparados por síntese química usando o método clássico de fosforamidita (Ver, por exemplo, Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981]; e Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]), como é tipicamente realizado em métodos sintéticos automatizados. De acordo com o método de fosforamidita, oligonucleotídeos são sintetizados (por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados).

[00206] Desta maneira, em algumas modalidades, um método para preparar o polipeptídeo de PAL engenheirado pode compreender: (a) sintetizar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionado da sequência de aminoácido de qualquer variante da maneira aqui descrita, e (b) expressar o polipeptídeo de PAL codificado pelo polinucleotídeo. Em algumas modalidades do método, a sequência de aminoácido codificado pelo polinucleotídeo pode apresentar opcionalmente uma ou diversas (por exemplo, até 3, 4, 5, ou até 10) eliminações, inserções e/ou substituições de resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido tem opcionalmente 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-15, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 130, 1-35, 1-40, 1-45, ou 1-50 eliminações, inserções e/ou substituições de resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido tem opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45, ou 50 eliminações, inserções e/ou substituições de resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido tem opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 eliminações, inserções e/ou substituições de resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, as substituições são substituições conservativas ou não conservativas.

[00207] O polipeptídeo de PAL engenheirado expresso pode ser avaliado por qualquer propriedade melhorada ou combinação de propriedades desejada (por exemplo, atividade, seletividade, estabilidade, tolerância ao ácido, sensibilidade à protease, etc.) usando qualquer ensaio adequado conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, ensaios e condições aqui descritas.

[00208] Em algumas modalidades, qualquer dos polipeptídeos de PAL engenheirados expressos em uma célula hospedeira são recuperados das células e/ou dos meios de cultura usando qualquer uma ou mais das bem conhecidas técnicas para purificação de proteína incluindo, entre outras, tratamento de lisozima, sonicação, filtração, colocar uma camada de sal,ultracentrifugação e cromatografia.

[00209] Técnicas cromatográficas para isolamento dos polipeptídeos de PAL incluem, entre outros, cromatografia de fase reversa, cromatografia líquida de alto-desempenho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por exclusão de tamanho, eletroforese em gel e cromatografia por afinidade. Condições para purificar uma enzima particular dependem, em parte, de fatores tais como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade, peso molecular, forma molecular, etc., e serão evidentes aos versados na técnica. Em algumas modalidades, técnicas de afinidade podem ser usadas para isolar as enzimas de PAL melhoradas. Em relação à purificação por cromatografia de afinidade, qualquer anticorpo que liga especificamente um polipeptídeo de PAL de interesse pode ser usado. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros incluindo, mas sem limitação, coelhos, camundongos, ratos, etc., são imunizados por injeção com um polipeptídeo de PAL, ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL ou fragmento é anexado a um carreador adequado, tal como BSA, por meio de um grupo funcional da cadeia lateral ou ligadores anexados a um grupo funcional de cadeia lateral.

[00210] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado é produzido em uma célula hospedeira por um método que compreende cultivar uma célula hospedeira (por exemplo, uma cepa de E. coli) compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PAL engenheirado, da maneira aqui descrita, nas condições favoráveis à produção do polipeptídeo de PAL engenheirado, e recuperando o polipeptídeo de PAL engenheirado a partir das células e/ou meio de cultura. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz mais que um polipeptídeo de PAL engenheirado.

[00211] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para produzir um polipeptídeo de PAL engenheirado, compreendendo cultivar uma célula bacteriana recombinante que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PAL engenheirado com pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de referências SEQ ID NO:4, e um ou mais diferença no resíduo de aminoácidos comparado à SEQ ID NO:4 selecionado de X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522; X524; e X528, ou combinações do mesmo, quando alinhado de maneira ideal com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4, em condições adequadas de cultivo para permitir a produção do polipeptídeo de PAL engenheirado, e recuperando opcionalmente o polipeptídeo de PAL engenheirado da cultura e/ou células bacterianas cultivadas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz mais que um polipeptídeo de PAL engenheirado.

[00212] Em algumas modalidades, uma vez que os polipeptídeos de PAL engenheirados são recuperados das células hospedeiras recombinantes e/ou meios de cultura, estes são adicionalmente purificados por qualquer do(s) método(s) adequado(s) conhecido(s) na técnica. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos TAL purificados são combinados com outros ingredientes e compostos para fornecer composições e formulações compreendendo o polipeptídeo de PAL engenheirado, de maneira apropriada para diferentes pedidos e usos (por exemplo, composições farmacêuticas).

Composições:

[00213] A presente invenção fornece polipeptídeos de PAL engenheirados adequados para uso em várias composições. Estas composições podem ser usadas em muitos campos incluindo, mas sem limitação, produtos farmacêuticos, suplementos alimentar/nutricional, alimento, ração e produção de produto químico fino. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente invenção fornece alimento e/ou ração compreendendo pelo menos um variante de PAL engenheirado e/ou pelo menos uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um variante de PAL. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece bebidas compreendendo pelo menos uma variante de PAL engenheirado.

[00214] Em algumas modalidades, o variante de PAL engenheirado em alimento, ração, e/ou suplemento nutricional/alimentar é glicosilado. Além do mais, os variantes de PAL engenheirados podem ser usados em qualquer matriz de distribuição de enzima comestível adequada. Em algumas modalidades, os variantes de PAL engenheirados estão presentes em uma matriz de distribuição de enzima comestível determinada para dispersão rápida do PAL variante no trato digestivo de um animal, mediante ingestão do variante.

[00215] A presente invenção também fornece polipeptídeos de PAL engenheirados adequados para uso na produção de produtos químicos finos e outros compostos industrialmente importantes (Ver, por exemplo, patentes US 2013/0340119, 2013/0005012, e 2005/0260724 e WO 2012/122333).

Produto Farmacêutico e Outras Composições

[00216] A presente invenção fornece polipeptídeos de PAL engenheirados adequados para uso em produtos farmacêuticos e outras composições, tais como suplementos alimentar/nutricional.

[00217] Dependendo do modo de administração, uma destas composições compreendendo uma quantidade terapeuticamente ativa de uma PAL engenheirado, de acordo com a invenção, está na forma de um sólido, semissólido ou líquido. Em algumas modalidades, as composições incluem outros componentes farmaceuticamente aceitáveis tais como diluentes, tampões, excipientes, sais, emulsificantes, conservantes, estabilizantes, cargas e outros ingredientes. Os detalhes nas técnicas para formulação e administração são bem conhecidos na técnica e descritos na literatura.

[00218] Em algumas modalidades, os polipeptÌdeos de PAL engenheirados são formulados para uso em composições farmacêuticas orais. Qualquer formato adequado para uso na distribuição dos polipeptídeos de PAL engenheirados pode ser usado na presente invenção incluindo, mas sem limitação pílulas, comprimidos, cápsulas em gel, cápsulas, tabletes, drágeas, pós, géis macios, sol-géis, géis, emulsões, implantes, adesivos, aspersões, emplastros, pomadas, cremes, pastas, geleias, tintas, aerossóis, gomas de mascar, emolientes, adesivos, suspensões (incluindo, mas sem limitação, suspensões a base de óleo, emulsões aquosas em óleo, etc.), lamas, xaropes, formulações de liberação controlada, supositórios, etc. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são fornecidos em um formato adequado para injeção (isto é, em uma formulação injetável). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são fornecidos em matrizes biocompatíveis, tais como sol-géis, incluindo sol-géis a base de sílica (por exemplo, oxissilano). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são encapsulados. Em algumas modalidades alternativas, os polipeptídeos de PAL engenheirados são encapsulados em nanoestruturas (por exemplo, nanotubos, nanotúbulos, nanocápsulas, ou microcápsulas, microesferas, lipossomos, etc.). De fato, não se pretende que a presente invenção seja limitada a nenhuma formulação de distribuição particular e/ou meios de distribuição. Pretende-se que os polipeptídeos de PAL engenheirados sejam administrados por qualquer meio adequado conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, parenteral, oral, tópico, transdérmico, intranasal, intraocular, intratecal, por meio de implantes, etc.

[00219] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são quimicamente modificados por glicosilação, peguilação (isto é, modificados com polietileno glicol [PEG] ou PEG ativados, etc.) ou outros compostos (Ver, por exemplo, Ikeda, Amino acids 29:283-287 [2005]; patentes US 7.531.341, 7.534.595, 7.560.263 e 7.53.653; patentes publicadas US 2013/0039898, 2012/0177722, etc.). De fato, não se pretende que a presente invenção seja limitada a nenhum método e/ou mecanismo de distribuição particular.

[00220] Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos de PAL engenheirados são fornecidos em formulações compreendendo cristais de enzima estabilizados na matriz. Em algumas modalidades, a formulação compreende uma enzima PAL engenheirada reticulada cristalina e um polímero com uma fração reativa que adere aos cristais de enzima. A presente invenção também fornece polipeptídeos de PAL engenheirados em polímeros.

[00221] Em algumas modalidades, composições compreendendo os polipeptídeos de PAL engenheirados da presente invenção incluem um ou mais compostos carreadores comumente usados incluindo, mas sem limitação, açúcares (por exemplo, lactose, sacarose, manitol, e/ou sorbitol), amidos (por exemplo, milho, trigo, arroz, batata, ou outro amido vegetal), celulose (por exemplo, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose, carboximetilcelulose de sódio), gomas (por exemplo, arábica, tragacanto, guar, etc.), e/ou proteínas (por exemplo, gelatina, colágeno, etc.). Os componentes adicionais nas formulações orais podem incluir agentes de coloração e adoçantes (por exemplo, glicose, sacarose e manitol) e agentes lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio), bem como revestimentos entéricos (por exemplo, polímeros de metacrilato, hidroxil propil metil celulose ftalato, e/ou qualquer outro adequado revestimento entérico conhecido na técnica). Em algumas modalidades, os agentes de desintegração ou solubilização são incluídos (por exemplo, polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou sais do mesmo, tal como alginato de sódio). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PAL engenheirado é combinado com vários componentes adicionais incluindo, mas sem limitação, conservantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, agentes de umectação, álcoois, ácidos graxos e/ou emulsificantes, particularmente em formulações líquidas.

[00222] Em algumas modalidades, o polipeptÌdeo de PAL engenheirado deve ser combinado com vários componentes adicionais incluindo, mas sem limitação conservantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, agentes de umectação, álcoois, ácidos graxos e/ou emulsificantes, particularmente em formulações líquidas. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são administrados aos indivíduos em combinação com outros compostos usados no tratamento de PKU incluindo, mas sem limitação KUVAN® tetra-hidrobiopterina (BioMarin Pharmaceutical, Inc., Novato, CA), antiácidos (por exemplo, omeprazol, esomeprazol e outros prazóis), bem como quaisquer outros compostos adequados.

[00223] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece polipeptídeos de PAL engenheirados adequados para uso na diminuição da concentração de fenilalanina em fluidos tais como sangue, fluido cerebroespinhal, etc. A dosagem de polipeptídeo(s) PAL engenheirado(s) administrada a um animal depende da condição ou doença, da condição geral do animal, e outro fatores conhecidos pelos versados na técnica. Em algumas modalidades, as composições são pretendidas para administração única ou múltipla a um animal. Em algumas modalidades, contempla-se que a concentração de polipeptídeo(s) de PAL engenheirado(s) na(s) composição(s) administrada a um animal (por exemplo, um humano com PKU) é suficiente para tratar efetivamente, melhorar e/ou impedir a doença (por exemplo, PKU e/ou condições relacionadas à PKU, doenças e/ou sintomas), Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são administrados em combinação com outras composições farmacêuticas e/ou alimentares.

Composições Industriais

[00224] Contempla-se que os polipeptídeos de PAL engenheirados da presente invenção poderão ser usados em composições industriais. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são formulados para uso nas indústrias de alimento e/ou ração. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PAL engenheirados são formulados em produtos granulados ou precipitados, os quais são misturados com componentes de ração animal tais como enzimas adicionais (por exemplo, celulases, lacases e amilases). Em algumas modalidades alternativas, os polipeptídeos de PAL engenheirados são usados em composições de ração animal líquidas (por exemplo, aquosa ou lamas com base oleosa). Assim, em algumas modalidades, os variantes de PAL engenheirados da presente invenção são suficientemente termotolerantes e termoestáveis para superar o tratamento usado para produzir precipitados e outros alimentos/rações processados.

[00225] Os variantes de PAL engenheirados da presente invenção também podem ser usados na produção de fenilalanina e/ou derivados de fenilalanina.

[00226] Os aspectos anteriores e outros da invenção podem ser mais bem entendidos junto com os seguintes exemplos não limitantes. Os exemplos são fornecidos apenas com propósitos ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção de maneira alguma.

EXPERIMENTAÇÃO

[00227] Os exemplos a seguir, incluindo experimentos e resultados alcançados, são fornecidos apenas com propósitos ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes da presente invenção.

[00228] Na descrição experimental a seguir, as seguintes abreviações se aplicam: ppm (partes por milhão); M (molar); mM (milimolar), uM e μm (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); gm e g (grama); mg (miligramas); ug e μg (microgramas); L e l (litro); ml e mL (mililitro); cm (centímetros); mM (milímetros); um e μm (micrômetros); sec. (segundos); min(s) (minuto(s)); h(s) e hr(s) (hora(s)); U (unidades); MW (peso molecular); rpm (rotações por minuto); psi e PSI (libras por polegada quadrada);°C (graus Centígrados); RT e rt (temperatura ambiente); CDS (sequência de codificação); DNA (ácido desoxirribonucleico); RNA (ácido ribonucleico); E. coli W3110 (cepa de E. coli comumente usada em laboratório, disponível do Coli Genetic Stock Center [CGSC], New Haven, CT); HTP (alto rendimento); HPLC (cromatografia líquida de alto pressão); CFSE (carboxifluoresceina succinimidil éster); IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo); PES (polietersulfona); PHE e phe (fenilalanina); BSA (albumina bovina sérica); PBMC (células mononucleares do sangue periférico); PKU (fenilcetonúria); MHC (complexo de histocompatibilidade principal); HLA (antígeno de leucócito humano); HLA-DR (um receptor de superfície celular MHC de classe II codificado pelo complexo HLA no cromossomo #6); FIOPC (vezes a melhoria sobre o controle positivo); LB (caldo Luria); Athens Research (Athens Research Tecnology, Athens, GA); ProSpec (ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Ram Scientific (Ram Scientific, Inc., Yonkers, NY); Pall Corp. (Pall, Corp., Pt. Washington, NY); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Sistemas, Detroit, MI); Molecular Devices (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Kuhner (Adolf Kuhner, AG, Basel, Suíça); Cambridge Isotope Laboratories, (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, parte de Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (parte de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); Constant Systems (Constant Systems Ltd., Daventry, Reino Unido); Megazyme (Megazyme International, Wicklow, Irlanda); Enzo (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY); GE Healthcare (GE Healthcare BioSciences, Piscataway, NJ); Harlan (Harlan Laboratories, Indianapolis, EM); AB Sciex (AB Sciex, Framingham, MA); e Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

[00229] Os seguintes polinucleotídeo e sequência de polipeptídeos podem ser usados na presente invenção. Em alguns casos (da maneira mostrada a seguir), a sequência de polinucleotídeo é seguida pelo polipeptídeo codificado.

EXEMPLO 1 Aquisição de gene PAL e Construção de Vetores de expressão

[00230] O DNA plasmídico de fenilalanina amônia liase (AvPAL) de Anabaena variabilis foi obtido e um gene sintético que codifica AvPAL teve o códon otimizado para expressão em E. coli e foi clonado no vetor de expressão pET16b de E. coli para fornecer pET16b-AvPAL (SEQ ID NO:1). O quadro aberto de leitura AvPAL (SEQ ID NO:2) foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos: PAL-pCK-F e PAL-pCK-R e subclonado no vetor de expressão pCK100900i (SEQ ID NO: 27).

[00231] Este construto de plasmídeo foi transformado em uma cepa de E. coli derivada de W3110. Técnicas de evolução direcionada em geral conhecidas pelos versados na técnica foram usadas para gerar bibliotecas de gene variantes a partir deste construto de plasmídeo (Ver, por exemplo, patente US 8.383.346 e WO2010/144103).

EXEMPLO 2 Crescimento em Alto-Rendimento (HTP) e Ensaios Crescimento em Alto-Rendimento (HTP) de PAL e Variantes de PAL

[00232] As células transformadas de E. coli foram selecionadas plaqueando em placas de ágar LB contendo 1% de glicose e 30 μg/mL de cloranfenicol. Após incubação por toda a noite a 37°C, as colônias foram colocadas em NUNC™ (Thermo-Scientific), nos poços de placas de base reta rasa de 96 poços preenchidos com 180 μL/poço de LB suplementado com 1% de glicose e 30 μg/mL de cloranfenicol. As culturas cresceram naturalmente por toda a noite por 18 a 20 horas em um agitador (200 rpm, 30°C, e 85% de umidade relativa; Kuhner). As amostras crescidas por toda a noite (20 μL) foram transferidas para placas de 96 poços profundos Costar preenchidos com 380 μL de caldo Terrific suplementado com 30 μg/mL de cloranfenicol. As placas foram incubadas por 135 minutos em um agitador (250 rpm, 30°C, e 85% de umidade relativa; Kuhner). As células foram então induzidas com 40 μL de 10 mM IPTG em água estéril e incubadas por toda a noite por 20-24 horas em um agitador (250 rpm, 30°C, e 85% de umidade relativa; Kuhner). Duas culturas replicadas foram combinadas, as células foram precipitadas (4000 rpm x 20 min), os sobrenadantes foram descartados, e as células foram congeladas a -80°C antes da análise.

Lise de precipitados de HTP

[00233] Primeiro, 500 μL de tampão de lise (20 mM Tris pH 7,5, 1 mM de MgSO4, 1 mg/mL de lisozima e 0,5 mg/mL de sulfato de polimixina B) foram adicionados aos precipitados celulares. A mistura foi agitada por 1,5 hora em temperatura ambiente, e precipitada (4000 rpm x 5 min) antes do uso dos lisados clarificados nos vários ensaios de HTP aqui descritos. A análise destes lisados por SDS-PAGE revelou a presença de uma proteína superexpressa em um MW aparente de ~60 kDa, consistente com o MW esperado de PAL.

Análise de lisados clarificados

[00234] A atividade de PAL variante foi determinada medindo a formação de ácido cinâmico determinado pela alteração na absorbância em 290 nm com o tempo. Para este ensaio, 100 μL de cada 200 mM de Tris/50 mM de fenilalanina, pH 7,5, ou 200 mM de fosfato de sódio/50 mM de fenilalanina pH 7,0, 80 μL de água, e 20 μL de lisado clarificado foram adicionados aos poços de uma placa de poliacrilato de 96 poços (Costar #3635, Corning). As reações foram misturadas rapidamente e a atividade foi determinada rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (a cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices).

Análise HTP de lisados clarificados Pré-tratados com protease

[00235] Variantes de PAL foram desafiados com quimotripsina e tripsina para simular o ambiente do intestino delgado. Primeiro, 30 μL de mistura de protease (0,01 a 100 mg/mL de quimotripsina (C4129 Sigma Aldrich), 0,01 a 100 mg/mL de tripsina (T7409 Sigma Aldrich), 1 mM de CaCl2, e 1 mM HCl), 0- 30μL de 20 mM de taurocolato de sódio em 500 mM de fosfato de sódio pH 7,0, e 90 -120 μL de lisado clarificado foram adicionados aos poços de uma placa de base redondo de 96 poços (Costar #3798, Corning). As placas foram vedadas e incubadas a 37°C, 400 rpm. 3” a 1h antes da análise. Em relação ao ensaio, 100 μL de cada um de 200 mM de Tris/50 mM de fenilalanina pH 7,5 ou 200 mM de fosfato de sódio/50 mM de fenilalanina pH 7,0 e 100 μL do lisado tratado com protease foram adicionados aos poços de uma placa de poliarilato de 96 poços (Costar #3635, Corning). As reações foram misturadas rapidamente e a atividade foi determinada rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são fornecidos nas tabelas a seguir.

Análise HTP de lisados clarificados pré-tratados com ácido

[00236] Neste ensaio, Variantes de PAL foram desafiados em condições acídicas, a fim de simular o ambiente do estômago. Primeiro, 20 μL de citrato de sódio 1M (pH 3,7-4,5) e 30 μL de água ou 50 μL de citrato de sódio 400 mM pH 3,7-4,8, e 50 uL de lisado clarificado foram adicionados aos poços de uma placa de base redonda com 96 poços (Costar #3798, Corning). A placa foi vedada e incubada a 37°C, 400 rpm."3” até 1 hora antes da análise. Para o ensaio, 100 μL de cada 200 mM de Tris, 50 mM de fenilalanina pH 7,5 e 80 μL de 1M Tris pH 7,5 ou 200 mM de fosfato de sódio/50 mM de fenilalanina pH 7,0 e 80μL de 1,0 M de fosfato de sódio pH 7,0, e 20 μL do lisado tratado com ácido foram adicionados aos poços de uma placa de poliacrilato de 96 poços (Costar #3635, Corning). As reações foram misturadas rapidamente, e a atividade foi determinada rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são fornecidos nas tabelas a seguir.

Análise HTP de lisados clarificados pré-tratados com pepsina

[00237] Em ensaios adicionais, variantes de PAL são desafiados com condições acídicas e pepsina para testar adicionalmente os variantes em condições que imitam o ambiente gástrico. Primeiro, 50 μL de pepsina 0,01-100 mg/mL em citrato de sódio 400 mM pH 1,5-4, e 50 μL de lisado clarificado são adicionados aos poços de uma placa de base redonda de 96 poços (Costar #3798, Corning). A placa é vedada e incubada a 37°C, 400 rpm, 3” até 1-12 h antes da análise. Em relação ao ensaio, 100 μL de cada um Tris 200 mM/ fenilalanina 50 mM pH 7,5 e 80 μL de Tris 1M pH 7,5 ou fosfato de sódio 200 mM/fenilalanina 50 mM pH 7,0, e 20 μL de lisado tratado com ácido são adicionados aos poços de uma placa de poliacrilato de 96 poços (Costar#3635, Corning). As reações são misturadas rapidamente, e a atividade é determinada rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices).

EXEMPLO 3 Ensaios para determinar agregação proteica de variantes de PAL

[00238] A propensão dos variantes de PAL para agregar é determinado usando o estojo de ensaio de agregação de proteína ProteoStat® (Enzo), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, PAL purificado em 0-100 μm é misturado com reagente de detecção ProteoStat® (1:2000) e analisada por meio de citometria de fluxo. As amostras são avaliadas por fluorescência, consistente com os padrões de agregação ProteoStat®, da maneira conhecida na técnica (Ver, por exemplo, Bershtein et al., Mol.Cell, 133-144 [2013]).

EXEMPLO 4 Lisados liofilizados de culturas em frasco de agitação (SF)

[00239] Culturas de HTP selecionadas crescidas da maneira descrita anteriormente foram plaqueadas em placas de ágar LB com 1% de glicose e 30 μg/mL de cloranfenicol, e crescidas por toda a noite a 37°C. Uma única colônia de cada cultura foi transferida para 50 mL de LB com 1% de glicose e 30 μg/mL de cloranfenicol. As culturas foram crescidas por 18 h a 30°C, 250 rpm, e subcultivadas em uma diluição de aproximadamente 1:10 em 250 mL de caldo Terrific com 30 μg/mL de cloranfenicol, em uma OD600 final de 0,2. As culturas foram incubadas por 135 minutos a 30üC, 250 rpm, em uma OD600 de 0,6 e induzidas com 1 mM de IPTG. As culturas induzidas foram incubadas por 20 h a 30üC, 250 rpm. Após este período de incubação, as culturas foram centrifugadas 4000 rpm x 10 min. O sobrenadante foi descartado, e os precipitados foram ressuspensos em 30 mL de fosfato de sódio 50 mM pH 7,5. As células foram precipitadas (4000 rpm x 10 min), ressuspensas em 12 mL de fosfato de sódio 50 mM pH 7,5, e lisadas usando um sistema One Shot Cell Disruption (Constant Systems) a 17.000 psi. O lisado foi precipitado (10.000 rpm x 30 min) e o sobrenadante foi congelado e liofilizado para gerar um pó contendo enzima.

Purificação de PAL a partir de culturas de frasco de agitação

[00240] Variante de PAL No. 42 foi crescido em culturas de frasco de agitação até saturação, da maneira descrita anteriormente. As culturas saturadas foram precipitadas por centrifugação (4000 rpm x 20 min) e os precipitados celulares foram armazenados a -80°C antes da purificação. Os precipitados celulares foram descongelados em temperatura ambiente e ressuspensos em Tris 25 mM, pH 8 com NaCl 130 mM em 5 mL de tampão/ g de células. A lama da amostra foi lisada usando um microfluidizador com um ajuste de pressão de 110 psi. O lisado resultante foi clarificado por centrifugação a 10.000 rpm por 1 hora, seguido por filtração através de um filtro de 0,2 μm PES (Millipore).

[00241] Após filtração, o lisado resultante foi aquecido a 70-85°C por 1,5-2 horas na presença ou ausência de 10 mM Phe. O lisado foi removido do calor e clarificado por centrifugação a 10.000 rpm a 4°C por 1 hora. O sobrenadante contendo PAL solúvel foi então filtrado através de um filtro de 0,2 μm PES antes de ser colocado em uma coluna de cromatografia.

[00242] O lisado tratado com calor, filtrado, contendo 80-100 mg de proteína total, foi diluído duas vezes usando Tris 25 mM, pH 8 com sulfato de amônio 1,2 M. A amostra foi colocada em uma coluna HiPrep 16/10 fenil FF (hi sub) (GE Healthcare) pré-equilibrada com o Tris 25 mM, pH 8 com sulfato de amônio 0,6M. Após colocar as amostras, a coluna foi lavada com três volumes de coluna do mesmo tampão, seguido por um gradiente linear de sulfato de amônio 0,6 M - 0 M em Tris 25 mM, pH 8 para um volume de coluna. PAL bem ligado foi eluído da coluna usando uma eluição isocrática com Tris 25 mM, pH 8 para três volumes de coluna. Frações contendo PAL ativo e puro foram agrupadas.

[00243] O PAL purificado da coluna de fenil foi extraído com tampão em Tris 0,5 M, pH 8,5 e concentrado. O PAL concentrado foi analisado por SDS-PAGE e observado como presente em uma banda em ~60 kDa. As amostras purificadas de PAL foram filtradas usando um filtro de 0,45 μm PES e foram armazenadas a -80°C até estarem prontas para uso.

EXEMPLO 5 Caracterização de PAL purificado e variantes de PAL

[00244] Neste exemplo, ensaios realizados para caracterizar PAL tipo selvagem e variantes são descritos.

Tolerância ao pH acídico:

[00245] Pós liofilizados contendo variantes de PAL foram dissolvidos em 2 g/L em fosfato de sódio 20 mM pH 7,0. Então, 50 μL das soluções de enzima foram misturados com 50 μL de ácido cítrico 400 mM (pH 4,0-5,2) ou fosfato de sódio 100 mM e as reações foram incubadas a 37°C por 1h a 400 rpm (por 3”). Então, 20 μL da solução foram misturados rapidamente com 80 μL de fosfato de sódio 1M pH 7,0 e 100 μL de Tris 200 mM / fenilalanina 50 mM pH 7,5. A atividade enzimática em condições acídicas foi determinada rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na figura 2. Como indicado na figura 2, variantes Nos. 30 e 36 mantiveram mais atividade após ser incubados em pHs aproximadamente 4 a 4,8, comparado com o PAL tipo selvagem.

Determinação~de KM:

[00246] Para avaliar se as mutações nos variantes de PAL alteram a afinidade dos variantes de PAL por fenilalanina, a constante de Michaelis para a enzima tipo selvagem e Variante 36 foi determinada. Primeiro, 100 μL de 15 μg/mL de PAL em Tris 100 mM pH 8,0, e 100 μL de fenilalanina 0-32 mM em Tris 100 mM, pH 8,0, foram adicionados aos poços de uma placa de poliacrilato de 96 poços (Costar #3625, Corning). A reação foi misturada rapidamente e as taxas iniciais foram determinadas rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). A KM para cada PAL variante testado foi determinada ajustando os dados em um gráfico de Lineweaver-Burke, da maneira conhecida na técnica. Os resultados são mostrados na figura 3. Da maneira mostrada, o KM foi 74 μm para a enzima tipo selvagem e 60 μm para variante 36.

Especificidade de aminoácido:

[00247] Algumas fenilalanina amônia liases demonstram atividade contra tirosina e/ou histidina, além de fenilalanina. Para avaliar se as mutações presentes em variantes de PAL alteraram a especificidade de variantes de PAL em relação à fenilalanina, as atividades de enzima tipo selvagem e Variante 36 nestes três aminoácidos foram avaliadas. Primeiro, 100 μL de 5g/L de pó liofilizado contendo PAL em fosfato de sódio 10 mM pH 7,0, e 100 μL de fenilalanina ou histidina 50 mM ou tirosina 2,5 mM, em fosfato de sódio 200 mM pH 7,5, foram adicionados aos poços de uma placa de poliacrilato de 96 poços (Costar #3635, Corning). As soluções foram misturadas rapidamente e taxas iniciais foram determinadas rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na figura 4. Da maneira indicada, nenhuma atividade detectável foi observada nem para a enzima WT nem para Variante No. 36, tanto com histidina quanto com tirosina, indicando que estas enzimas são específicas para fenilalanina.

Resistência a proteases de porco e bovino:

[00248] Amostras de PAL variante preparadas como descrito no exemplo 4, foram dissolvidas em 2 g/L em fosfato de sódio 100 mM pH 7,0. As tripsina de porco e quimotripsina bovina (100 mg cada) foram dissolvidas em 2 mL de fosfato de sódio 100 mM pH 7,0, e diluídas em série de 2 vezes por onze vezes em fosfato de sódio 100 mM. Então, 80 μL das soluções de enzima PAL variante foram misturados com 20 μL da solução de tripsina e quimotripsina. As misturas de reação foram incubadas a 37°C por 1h a 400 rpm (por 3”). Então, 20 μL da reação foram misturados com 80 μL de água e 100 μL de fosfato de sódio 100 mM, fenilalanina 50 mM pH 7.0. Cada solução foi misturada rapidamente, e a atividade foi determinada rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na figura 2. Da maneira indicada nesta figura, todos os variantes testados exibiram maior resistência à protease, comparado ao PAL tipo selvagem, com Variante No. 36 sendo o mais estável em relação à proteólise.

Resistência a proteases de humano:

[00249] Da maneira descrita anteriormente, alguns variantes de PAL envolvidos foram selecionados contra tripsina de porco e quimotripsina bovina para avaliar sua resistência a proteólise por enzimas presentes no trato gastrointestinal. Alguns dos variantes de PAL envolvidos também foram testados usando enzimas de humano, para confirmar que são resistentes aos homólogos de humano das enzimas de porco ou bovinas. Nestes ensaios, pós liofilizados de WT PAL e Variante No. 36 (2,4 g/L em fosfato de sódio 100 mM, pH 7,0) foram incubados com quimotripsina de humano (Athens Research) 0-80 BTEE unidades/mL ou tripsina de humano (ProSpec) (010,000 BAEE unidades/mL) a 37°C por 2 h. Então, 100 μL das misturas foram adicionados aos poços de uma placa de poliacrilato de 96 poços (Costar #3635, Corning), seguido pela adição de 100 μL de fenilalanina 50 mM, fosfato de sódio 200 mM pH 7,0. A solução foi misturada rapidamente e taxas iniciais foram determinadas rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min), usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na figura 5. Como mostrado na figura 5, Variante No. 36 foi mais estável que a enzima PAL tipo selvagem.

Resistência aos extratos pancreáticos brutos:

[00250] Os variantes de PAL envolvidos também foram testados para determinar sua resistência às enzimas pancreáticas. Pós liofilizados de WT PAL, pós liofilizados de Variante No. 36, Variante No. 42, e Variante No. 43 (preparados como descrito no exemplo 4; 12 g/L em fosfato de potássio 50 mM pH 6,8) foram misturados 1:1 com pancreatina de porcina (4x Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), e incubados a 37°C com agitação (400 rpm. ror 3”+ por até 23 h. Nos pontos de tempo indicados, uma alíquota de 10 μL das reações foi adicionada a 190 μL de fenilalanina 50 mM, fosfato de sódio 190 mM pH 7,0, nos poços de uma placa de poliacrilato de 96 poços (Costar #3635, Corning). A reação foi misturada rapidamente e taxas iniciais foram determinadas rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando um leitor de absorbância de microplaca SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na figura 6. Como mostrado na figura 6, Variante No. 36, Variante No. 42, e Variante No. 43 mostraram todos estabilidade significativa nestas condições de ensaio, comparado à enzima PAL tipo selvagem.

Impacto de detergentes intestinais:

[00251] Os Variantes de PAL envolvidos também foram testados em relação à sua susceptibilidade à proteólise na presença ou ausência de ácidos de bile intestinal e ácidos graxos, para avaliar se estes ácidos impactam em sua estabilidade. Pós liofilizados contendo Variante No. 36 (preparado como descrito no exemplo 4) foram dissolvidos em 50 μg/mL em taurocolato de sódio 0-16 mM, fosfato de sódio 100 mM, pH 7,0. Tripsina de porco e quimotripsina bovina (80 mg cada) foram dissolvidos em 2 mL de fosfato de sódio 100 mM pH 7,0, e diluídos em série de 2 vezes por onzes vezes em fosfato de sódio 100 mM. Para o ensaio, 50 μL das soluções de PAL foram misturados com 50 μL da solução de protease. As misturas foram incubadas a 37°C por 1 h a 400 rpm (por 3”). Então, 50 μL das misturas foram misturados com 150 μL de fosfato de sódio 200 mM, fenilalanina 50 mM pH 7,0. Cada reação foi misturada rapidamente, e a atividade foi determinada rastreando a absorbância a 290 nm com o tempo (cada 12-20s a 5-20 min) usando leitor de absorbância de microplaca um SpectraMax® Plus384 ou um SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na figura 7. Como mostrado nesta figura, taurocolato de sódio adicional aumenta a susceptibilidade de variante No. 36 à proteólise.

EXEMPLO 6 Estabilidade intestinal de PAL variante

[00252] Para avaliar a estabilidade e atividade de variantes de PAL, uma vez que transitam através de um intestino animal, os camundongos foram submetidos a gavagem com variantes de enzima purificados. Camundongos C57Bl/6 saudáveis, 10-12 semanas e pesando 20-26 g foram mantidos em uma gaiola metabólica e fizeram jejum por 15h. Água foi fornecida ad libitum. Após jejum por toda a noite, os animais foram submetidos a gavagem usando uma agulha de gavagem calibre 21 com uma mistura de 0,3 mL de Tris-HCl 0,5 M pH 8,5, e 8 mg/mL em Tris-HCl 0,5 M pH 8,5, WT PAL (preparado como descrito no exemplo 4) ou 8 mg/mL em Tris-HCl 0,5 M pH 8,5 Variante No. 42 (preparado como descrito no exemplo 4). 0,5, 2, ou 6 horas após a gavagem, os animais foram decapitados, o plasma foi coletado usando tubos de coleta de sangue capilar com o tipo verde (Ram Scientific), e os conteúdos do estômago, duodeno (~1-8 cm do estômago), jejuno (~10-18 cm do estômago), íleo (~8 cm acima do ceco), e cólon (~5 cm abaixo do ceco) foram coletados. O peso destes conteúdos foi registrado e os conteúdos foram armazenados a -80°C antes da análise.

[00253] Os conteúdos do estômago ou do intestino foram diluídos 4X com fosfato de sódio 100 mM pH 7,0, misturados em resumo, e centrifugados a 14.000 rpm x 2 min. Os sobrenadantes foram transferidos para uma placa com filtro 350 μL, 0.45 μm, AcroPrep™ Advanced de 96 poços (Pall Corp), e os particulados foram removidos por meio de filtração a vácuo. O filtrado clarificado foi avaliado em relação à atividade enzimática descritos nos exemplos anteriores e em relação à presença de proteína PAL intacta por SDS-PAGE. Os resultados indicaram que a atividade enzimática no duodeno e jejuno parecem ser maiores para os PAL envolvidos, comparado à enzima PAL tipo selvagem e controle negativo.

EXEMPLO 7 Níveis de fenilalanina de plasma

[00254] As amostras de plasma coletadas dos camundongos descritos no exemplo 6 foram avaliadas para determinar a quantidade de fenilalanina presente na corrente sanguínea dos camundongos testados. O plasma de camundongo (50 μL) foi combinado com 250 μL de acetonitrila contendo 0,6 mM de dl-fenilalanina (anel D5) (isto é, uma versão marcada isotopicamente de fenilalanina compreendendo deutério, sem ser hidrogênio ligado aos carbonos do anel aromático; Cambridge Isotope Laboratories). As amostras foram misturadas em RT por 5 minutos, centrifugadas a 3200 x g por 10 min a 4°C e os sobrenadantes foram transferidos para uma placa para análise da amostra. Para a análise, 10 μL de cada amostra foram injetados em sistema a3200 QTRAP® LC/MS/MS (AB Sciex) através de uma coluna DISCOVERY® C18 (microesferas de 150 x 2,1 mM, 5 μm) (Supelco, agora Sigma-Aldrich), eluindo com 0,1% de ácido fórmico em água (a) e acetonitrila (B). As amostras foram eluídas através de um gradiente de 5 min (t=0, 97% A; 3 min, 50% A; 3,5 min, 5% A; 4 min, 97% A; 5 min, 95% A), procurando uma transição de 166 a 120 para fenilalanina endógena e 171 a 125 para o padrão marcado isotopicamente. Os resultados indicaram que os níveis de fenilalanina no plasma foram menores no ponto de tempo 30 minutos em amostras de camundongos que forneceram o PAL variante envolvido (isto é, Variante No.42), comparado à enzima PAL tipo selvagem e controle negativo.

EXEMPLO 8 Função terapêutica de PAL variante

[00255] Para avaliar se variantes de PAL reduzem níveis séricos de Phe in vivo, um modelo de camundongo de PKU foi usado. Nestes experimentos, as proteínas PAL foram submetidas a gavagem em animais afetados. Primeiro, um nível Phe em linha de base consistente foi estabelecido nos camundongos removendo Phe de suas dietas por três dias, seguido pela injeção de quantidade conhecida de solução contendo Phe. Camundongos homozigotos PAH enu-2 de três a seis meses com um antecedente C57Bl/6 (ver, McDonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1965-1967 [1990]) foram transferidos para uma dieta sem fenilalanina (TD.97152, Harlan) com 0,03 g/L de Phe fornecido em sua água por 72 h. Antes de iniciar o tratamento no período = 0 h, os camundongos foram injetados com 0,15 mg/g de Phe por peso corporal (de uma solução 10 g/L de Phe em água). Cinquenta e cinco minutos após a injeção, aproximadamente 20 μL de sangue foram coletados por punção da veia caudal e manchados em papel de filtro. Subsequentemente, nos períodos 1 h, 3 h, e 5 h após a injeção os camundongos foram submetidos a gavagem com 0,3 mL de 50-100 g/L de WT AvPAL, WT AvPAL e aprotinina, BSA, ou Variante No. 42. Em 6 h, 7 h, e 9 h após a injeção, manchas de sangue adicionais foram coletadas no papel de filtro. Os pontos de sangue foram secos e armazenados a -20°C antes da análise LC-MS/MS para os níveis Phe e Tyr usando métodos conhecidos na técnica (ver, Chase et al., Clin. Chem., 39:66-71 [1993]).

[00256] Os resultados são mostrados na figura 8. Da maneira indicada nesta figura, a gavagem com proteína inativa (BSA) levou ao aumento dos níveis séricos de Phe. Ao contrário, o tratamento com WT AvPAL proteoliticamente susceptíveis resultou em níveis constantes de Phe, embora a mesma proteína, combinada com o inibidor de protease aprotinina tenha resultado em uma queda significativa nos níveis de Phe. Os resultados também mostram que administrar o PAL Variante No. 42 engenheirado resultou em níveis séricos de Phe diminuídos na ausência de inibidores de protease.

EXEMPLO 9 Desimunização de PAL

[00257] Neste exemplo, os experimentos realizados para identificar a diversidade que pode remover epítopos de célula T de PAL são descritos.

Identificação da diversidade de desimunização:

[00258] Para identificar os aminoácidos que, quando mutados, podem remover os epítopos de célula T, métodos computacionais foram usados para identificar sequências PAL previstas para elicitar uma resposta de célula T. Em paralelo, as pesquisas experimentais para mutações permissíveis, não prejudiciais também foram realizadas, particularmente para aminoácidos que mantêm atividade proteica em um ensaio não desafiado (por exemplo, nos ensaios descritos no exemplo 2). Os variantes ativos foram então analisados em relação ao efeito das mutações na imunogenicidade prevista.

Identificação computacional de supostos epítopos de célula T em um AvPAL variante:

[00259] Supostos epítopos de célula T em um AvPAL variante No. 36 foram identificados usando as ferramentas da base de dados Immune Epitope (IEDB; página da internet Immune Epitope Database and Analysis Resource), da maneira conhecida na técnica e ferramentas de análise estatística patenteadas (Ver, por exemplo, iedb.org e Vita et al., Nucl. Acids Res., 38(Database issue):D854-62 [2010]. Epub 2009 Nov 11]). O AvPAL variante foi analisado em todos quadros de análise 15-mer possíveis, com cada quadro se sobrepondo aos últimos 14 aminoácidos. Os quadros de análise 15-mer foram avaliados em relação ao potencial imunogênico pontuando suas regiões principais de 9-mer por ligação prevista a oito alelos comuns de classe II HLA-DR (DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701,DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301, e DRB1*1501) que abrangem coletivamente quase 95% da população humana (Ver, por exemplo, Southwood et al., J. Immunol., 160:3363-3373 [1998]), usando métodos recomendado na página da internet IEDB. Agrupamentos de epítopo de célula T potenciais contidos no variante AvPAL (isto é, sub-regiões contidas no variante AvPAL que apresentam um alto potencial extraordinariamente para imunogenicidade) foram identificados usando ferramentas de análise estatística, como conhecido na técnica. Os agrupamentos de epítopo de célula T identificados foram selecionados contra a base de dados IEDB de epítopos conhecidos e a base de dados de proteína GenBank. Estas peneiras identificaram 10 (dez) supostos epítopos de célula T no variante AvPAL No. 36. Estes epítopos são referidos como TCE- I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, e X a seguir.

Desenho de bibliotecas desimunizados:

[00260] Primeiro, foi desenvolvida uma biblioteca combinatória contendo todas as mutações neutras e benéficas identificadas a partir dos ciclos de evolução direcionada usada para criar variantes AvPAL, nas 10 supostas regiões de epítopo de célula T identificadas da maneira descrita anteriormente. Os efeitos destas mutações na ligação prevista com os oito alelos comuns de Classe II HLA-DR foram analisados. As mutações múltiplas foram previstas para remover ou reduzir TCE-I, II, VI, VII. Estas mutações foram combinadas em uma biblioteca combinatória. As bibliotecas foram então desenhadas usando mutagênese por saturação para realizar mutagênese em cada aminoácido simples nos seis epítopos de célula T restantes (isto é, TCE-III, IV, V, VIII, IX e X). Finalmente, uma biblioteca combinatória foi criada contendo diversidade benéfica identificada de múltiplos ciclos de evolução que alvejaram TCE-I, III, IV, VIII, e X, junto com C503 e C565, dois aminoácidos relatados para impactar o estado de agregação de variantes PAL. Os melhores acertos desta biblioteca foram submetidos adicionalmente à mutagênese por saturação que alveja TCE-III e VIII, e mutagênese alvejada adicional em poucas posições.

Construção e seleção de bibliotecas desimunizadas:

[00261] As bibliotecas de mutagênese combinatória e saturação desenhadas da maneira anteriormente descrita foram construídas por métodos conhecidos na técnica, e testadas em relação à atividade em um ensaio não desafiado, da maneira descrita no exemplo 2. Os variantes ativos foram identificados e sequenciados. Suas atividades e mutações em relação ao variante AvPAL No. 36 e vários variantes AvPALs são fornecidas nas tabelas 9-1 a 9-7, a seguir.

Identificação da diversidade de desimunização:

[00262] Variantes ativos foram analisados em relação aos seus níveis de imunogenicidade avaliando sua ligação com oito alelos comuns de Classe II HLA-DR anteriores. A pontuação de imunogenicidade total e contagem de acerto imunogênico são mostradas nas tabelas 9-1 a 9-7. A pontuação de imunogenicidade total reflete a imunogenicidade total prevista do variante (isto é, uma pontuação maior indica um maior nível da imunogenicidade prevista). C “eqntcigo fg cegrtq” imunogênico indica o número de quadros de análise 15-mer com um alto potencial incomum para imunogenicidade (isto é, uma contagem de acerto maior indica um maior potencial para imunogenicidade). As mutações com uma menor pontuação de imunogenicidade total prevista e/ou uma contagem de acerto imunogênico menor que aquela do variante de referência foram consideradas como “mutações de desimunização” As mutações de desimunização que foram identificadas como sendo as melhores foram recombinadas para gerar inúmeros variantes que são ativos, e previstos para serem significativamente menos imunogênicos que o variante AvPAL inicial de referência. Nas tabelas a seguir, os resultados FIOP são do ensaio sem desafio; em relação à pontuação total de imunogenicidade (TIS) e contagem de acerto imunogênico (IHC), os resultados são indicados para a proteína PAL completa (Tabelas 91, 9-8, e 9-9) ou para o epítopo indicado (Tabelas 9-2 a 9-7).

Teste in vitro de variantes de PAL desimunizados:

[00263] Os variantes de PAL desimunizados são testados em um ensaio de célula T dendrítica para testar empiricamente sua capacidade de elicitar uma resposta de célula T. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) são isoladas de um doador humano usando técnicas padrões. Estas células são usadas como uma fonte de monócitos que são cultivados em meio definido para gerar células dendríticas imaturas. Estas células dendríticas imaturas (DCs) são carregadas com variantes de PAL desimunizados, e são então induzidas em um fenótipo mais maduro cultivando adicionalmente em meio definido para fornecer DCs preparadas com antígeno. PBMCs de doadores com poucas células T CD8+, obtidas das mesmas amostras doadoras como DCs, são marcadas com CFSE e então cultivadas com as DCs preparadas com antígeno por 7 dias, após o que as octuplicatas são testadas. Cada cultivo de célula T-DC inclui um conjunto de controle não tratado (isto é, controle negativo). O ensaio também incorpora controle de antígeno de referência (isto é, controle positivo), compreendendo dois antígenos de proteína completa potente. Ensaios que utilizam células isoladas de 50 doadores humanos com diversos alelos complexos principais de histocompatibilidade de classe II fornecem uma avaliação estatisticamente relevante da capacidade de variantes de PAL em elicitar uma resposta de célula T.

[00264] Embora a invenção seja descrita com referência às modalidades específicas, várias alterações podem ser realizadas e equivalentes podem ser substituídos para adaptar a uma situação particular, material, composição de material, processo, etapa ou etapas de processo, atingindo desse modo benefícios da invenção sem fugir do escopo do qual é reivindicado.

[00265] Em relação a todos os propósitos nos Estados Unidos, cada publicação e documento de patente citado nesta descrição é aqui incorporado pela referência como se cada tal publicação ou documento fosse especificamente e individualmente indicado para ser aqui incorporado pela referência. A citação de publicações e documentos de patente não é pretendida como uma indicação de que qualquer tal documento seja pertinente à técnica anterior, nem continha uma admissão quanto aos seus conteúdos ou datas.

Claims (12)

1. Polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL), caracterizado pelo fato de que consiste em: (i) a) uma sequência de aminoácido como definida pela SEQ ID NO:4; e b) pelo menos uma diferença de resíduo de aminoácido comparado com SEQ ID NO:4; e c) que exibe uma melhor propriedade selecionada de i) atividade catalítica intensificada, ii) sensibilidade reduzida à proteólise, iii) maior tolerância ao pH acídico, ou uma combinação de qualquer um de i), ii) ou iii), comparado com a sequência de referência SEQ ID NO: 4, em que pelo menos uma diferença de resíduo de aminoácido é na posição 307, em que as posições de aminoácidos são numeradas com referência na SEQ ID NO:4, e em que a diferença do resíduo de aminoácido é H307A, H307D, H307E, H307F, H307G, H307I, H307L, H307M, H307N ou H307Y.

2. Polipeptídeo engenheirado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

3. Sequência de polinucleotídeo, caracterizada pelo fato de que codifica pelo menos um polipeptídeo engenheirado como definido na reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeo é como definido na SEQ ID NO: 3 codificando a SEQ ID NO: 4, em que pelo menos uma diferença de resíduo de aminoácido é na posição 307, em que as posições de aminoácidos são numeradas com referência na SEQ ID NO:4, em que a diferença de resíduos de aminoácidos é H307A, H307D, H307E, H307F, H307G, H307I, H307L, H307M, H307N ou H307Y, e, opcionalmente em que dita sequência de polinucleotídeo é operavelmente ligada a uma sequência controle.

4. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de polinucleotídeo como definida em na reivindicação 3, e pelo menos uma sequência controle, opcionalmente que a dita sequência controle é um promotor, em que o dito promotor é um promotor heterólogo.

5. Célula hospedeira transformada, caracterizada pelo fato de que é com pelo menos uma sequência de polinucleotídeo como definida na reivindicação 3, e/ou o vetor como definido na reivindicação 4, em que a dita célula hospedeira é E. coli.

6. Método para produzir um polipeptídeo de PAL engenheirado em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) como definido na reivindicação 1, e/ou pelo menos uma sequência de polinucleotídeo como definida na reivindicação 3, e/ou pelo menos um vetor como definido na reivindicação 4, em condições adequadas de cultivo, de maneira tal que pelo menos um polipeptídeo de PAL engenheirado seja produzido, opcionalmente em que dito método compreende adicionalmente recuperar pelo menos um polipeptídeo engenheirado com fenilalanina amônia-liase (PAL) a partir da cultura e/ou células hospedeiras, em que dito método compreende adicionalmente a etapa de purificar o dito pelo menos um polipeptídeo engenheirado com fenilalanina amônia-liase (PAL) produzido.

7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase (PAL) como definido na reivindicação 1, opcionalmente em que a dita composição: (i) é uma composição farmacêutica, opcionalmente em que compreende adicionalmente pelo menos um excipiente e/ou carreador farmaceuticamente aceitável, e/ou (ii) é adequada para o tratamento de fenilcetonúria.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita composição: (i) é adequada para administração oral a um humano; (ii) está na forma de uma pílula, comprimido, cápsula, cápsula em gel, líquido ou emulsão, opcionalmente em que a dita pílula, comprimido, cápsula, ou cápsula em gel compreende adicionalmente um revestimento entérico; e/ou (iii) é coadmnistrada com pelo menos um composto terapeuticamente eficaz adicional, opcionalmente, em que a dita composição compreende pelo menos um composto terapeuticamente eficaz adicional.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 ou 8(iii), caracterizada pelo fato de que a dita composição é adequada para injeção parenteral em um humano.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento e/ou prevenção dos sintomas de fenilcetonúria em um indivíduo, opcionalmente em que: (i) ditos sintomas de fenilcetonúria são melhorados; (ii) dito indivíduo pode ingerir uma dieta que é menos restritiva em seu teor de metionina, fenilalanina e/ou tirosina do que a dieta exigida por indivíduos que não recebem pelo menos uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) como definido na reivindicação 1; (iii) dito indivíduo é um bebê ou criança. (iv) dito indivíduo é um adulto ou adulto jovem.

12. Uso de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar ou prevenir fenilcetonúria.