KR102573324B1 - 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물을 비롯하여, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 증강된 촉매 활성뿐만 아니라, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도 및 고온에서 저장에 대한 증가된 내성을 제공하도록 최적화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 야생형 PAL 폴리펩티드보다 적은 페닐알라닌 잔기를 함유한다. 본 발명은 또한 치료적 및 산업적 목적을 위해 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 사용하기 위한 방법을 제공한다.

Description

조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드

본 출원은 2017년 9월 29일 출원된 미국 가출원 제62/565,555호, 및 2017년 2월 13일 출원된 미국 가출원 제62/458,232호의 우선권을 청구하며, 이들 둘 모두는 모든 목적을 위해 그들 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.

ASCII 텍스트 파일로서 제출된 "서열목록" 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 관한 참조

기기 형식 IBM-PC, MS-윈도우 운영 체계에서 44 킬로바이트의 크기로 2017년 2월 10일 생성된, 파일명 CX7-159USP1_ST25.TXT로 기재된 서열 목록이 참조로 본 명세서에 편입된다.

발명의 분야

본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물을 비롯하여, 조작된 페닐알라닌암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 증강된 촉매 활성을 비롯하여, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도 및 고온에서 저장에 대해 증가된 내성을 제공하도록 최적화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 페닐알라닌 잔기를 적게 함유한다. 본 발명은 또한 치료적 및 산업적 목적을 위한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

히스티딘 암모니아 리아제 (HAL) 및 티로신 암모니아 리아제 (TAL)와 함께 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL)는 방향족 아미노산 리아제 패밀리의 구성원이다 (EC 4.3.1.23-1.25 및 4.3.1.3). 보다 특히 PAL 활성을 갖는 효소 (EC 4.3.1.23-1.25 및 이전에 EC4.3.1.5로 분류)는 L-페닐알라닌에서 (E)-신남산으로의 비산화적 탈아민화를 촉매한다. PAL은 식물에 광범위하게 분포되어 있고, 또한 진균 및 제한된 수의 박테리아에서도 동정된 비포유동물 효소이다.

PAL 효소는 페닐케톤뇨증 (PKU)으로 더 잘 알려진, 물질대사 장애인 페닐알라닌 히드록실라제 결핍증 (PAHD)의 치료를 위한 치료적 단백질로서 사용될 수 있다. PKU는 간효소 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH), 또는 보조인자 테트라히드로비옵테린의 합성 또는 재순환에 관여하는 하나 이상의 효소가 상응하는 유전자 내 돌연변이로 인해 부분적으로 기능성이거나 또는 비기능성인 상염색체 물질대사 유전 장애이다. 이러한 기능 결핍은 그 결과로 혈류 내에서 페닐알라닌의 상승된 수준을 야기시킨다. 돌연변이의 유형에 따라, PKU 환자의 혈류 내 페닐알라닌의 농도는 전형적으로 > 360 μM이다. 페닐알라닌은 페닐피루베이트 (페닐케톤) 및 다른 유도체로 전환된다. 인간에서, PKU가 조기에 치료되지 않으면, 높은 수준의 페닐알라닌과 일부 이의 분해 산물은 지적 장애, 소두증 및 발작을 포함한 중대한 의학적 문제를 초래할 수 있다. 많은 연구들은 효소 치환에 의한 PKU의 치료에서 PAL의 용도에 집중해 왔었다 (Ambrus et al., Science 201:837-839 [1978]; Bourget et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 10:57-59 [1984]; 및 Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]).

본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물을 비롯하여, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 증강된 촉매 활성을 비롯하여, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도 및 고온에서 저장에 대해 증가된 내성을 제공하도록 최적화된다. 일부 실시형태에서 조작된 PAL 폴리펩티드는 소수의 페닐알라닌 잔기를 함유한다. 본 발명은 또한 치료적 및 산업적 목적을 위한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 증가된 저장 안정성 및/또는 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도와 같은 개선된 특성을 갖는 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체에 관한 것이다.

본 발명은 실질적으로 동일한 조건 하에서 야생형 PAL 효소 또는 기준 PAL 폴리펩티드와 비교시 개선된 특성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성 단편 및 이의 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료적 및/또는 산업적 조성물에서 조작된 PAL 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체를 사용하는 방법 및 치료적 및/또는 산업적 목적을 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12 중 적어도 하나와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 서열의 아미노산 위치는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 기준 서열로서 표시된 다른 아미노산 서열에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12 중 적어도 하나와 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 서열의 아미노산 위치는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 기준 서열로서 표시된 다른 아미노산 서열에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12 중 적어도 하나와 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 서열의 아미노산 위치는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 기준 서열로서 표시된 다른 아미노산 서열에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12 중 적어도 하나와 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 서열의 아미노산 위치는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 기준 서열로서 표시된 다른 아미노산 서열에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12 중 적어도 하나와 적어도 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 서열의 아미노산 위치는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 기준 서열로서 표시된 다른 아미노산 서열에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12 중 적어도 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 서열의 아미노산 위치는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 기준 서열로서 표시된 다른 아미노산 서열에 대해 넘버링된다.

본 발명은 또한

로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 16, 264, 364, 472, 482, 및/또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 16, 16/150, 162, 188, 264, 267, 398, 434, 472, 및 482, 및/또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다.

본 발명은 또한

및/또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 8에 대해 넘버링된다.

본 발명은 또한

및/또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세포를 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 12에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 16, 18, 39, 47, 54, 59, 73, 91, 209, 214, 285, 290, 305, 307, 364, 407, 450, 470, 503, 521, 524, 및 565, 및/또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 12에 대해 넘버링된다.

본 발명은 또한

및/또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 2에 대해 넘버링된다.

일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 아나바에나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis) 변이체 효소이다. 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 조작된 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 더 열안정성이다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 단백질 가수분해에 더 내성이다. 역시 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 적어도 하나의 소화관 효소에 의한 단백질 가수분해에 내성이다. 여전히 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 키모트립신, 트립신, 카르복시펩티다제, 및/또는 엘라스타제에 의한 단백질 가수분해에 더 내성이다. 역시 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 더 산 안정성이다. 여전히 추가 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 정제된다.

본 발명은 또한 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 이의 기능성 단편과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 이의 기능성 단편과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 이의 기능성 단편과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 표 6.1, 표 7.1, 표 8.1, 표 9.1, 표 10.1, 표 14.1, 및/또는 표 15.1 중 어느 하나에 제공되는 변이체 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드이다.

일부 추가의 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 아나바에나 바리아빌리스 변이체 효소이다. 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 더 열안정성이다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 단백질 가수분해에 더 내성이다. 역시 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 적어도 하나의 소화관 효소에 의한 단백질 가수분해에 내성이다. 여전히 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 키모트립신, 트립신, 카르복시펩티다제, 및/또는 엘라스타제에 의한 단백질 가수분해에 더 내성이다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 더 산 안정성이다. 일부 추가 실시형태에서, 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드는 정제된다.

본 발명은 또한 본 명세서에 제공된 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드 및/또는 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 제공하는 조작된 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 제공하는 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 추가의 실시형태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 본 명세서에서 제공하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 추가의 실시형태에서, 발현 벡터는 적어도 하나의 제어 서열을 더 포함한다. 일부 추가의 실시형태에서, 발현 벡터는 제어 서열을 더 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, 제어 서열은 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 이종성 프로모터이다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 본 명세서에서 제공하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된다. 일부 추가의 실시형태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 (E. coli) 세포이다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드가 생성되도록, 적합한 배양 조건 하에서, 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 조작된 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드가 생성되도록, 적합한 배양 조건 하에서, 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양물 및/또는 숙주 세포로부터 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드 및/또는 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, 방법은 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드 및/또는 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 정제하는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에서 제공하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약학 조성물이다. 일부 추가의 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 더 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, 조성물은 페닐케톤뇨증의 치료에 적합한다. 일부 추가의 실시형태에서, 조성물은 상승된 혈액 페닐알라닌의 치료에 적합한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 과페닐알라닌혈증의 치료에 적합하다. 일부 추가의 실시형태에서, 조성물은 티로신혈증의 치료에 적합하다. 일부 추가 실시형태에서, 조성물은 상승된 혈액 티로신의 치료에 적합하다. 일부 실시형태에서, 조성물은 과티로신혈증의 치료에 적합하다. 일부 추가의 실시형태에서, 조성물은 유전자 요법에서 사용에 적합하다. 일부 추가 실시형태에서, 조성물은 페닐케톤뇨증, 상승된 혈액 페닐알라닌, 과페닐알라닌혈증, 티로신혈증, 상승된 혈액 티로신혈증, 및/또는 과티로신혈증을 치료하기 위한 유전자 요법에서 사용을 위해 적합하다. 일부 추가의 실시형태에서, 조성물은 mRNA 요법에서 사용을 위해 적합하다. 일부 추가 실시형태에서, 조성물은 페닐케톤뇨증, 상승된 혈액 페닐알라닌, 과페닐알라닌혈증, 티로신혈증, 상승된 혈액 티로신혈증, 및/또는 과티로신혈증을 치료하기 위한 mRNA 용법에서 사용을 위해 적합하다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인간에 경구 투여를 위해 적합하다. 일부 추가의 실시형태에서, 조성물은 알약, 정제, 캡슐, 젤캡, 액상제, 또는 에멀션의 형태이다. 일부 추가 실시형태에서, 알약, 정제, 캡슐, 또는 젤캡은 장용성 제피를 더 포함한다. 일부 대안적인 실시형태에서, 조성물은 인간에게 비경구 주사에 적합하다. 일부 추가의 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료적으로 유효한 화합물과 공동 투여된다. 일부 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료적으로 유효한 화합물을 포함한다.

본 발명은 또한 대상체에서 페닐케톤뇨증의 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하고, 페닐케톤뇨증을 갖는 대상체를 제공하는 단계, 및 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조성물을 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 혈중 페닐알라닌 농도는 대상체에게 조성물을 제공 시 감소된다. 일부 추가의 실시형태에서, 대상체의 혈중 신남산 농도는 대상체에게 조성물을 제공시 증가된다. 일부 추가 실시형태에서, 대상체에서 페닐케톤뇨증의 증상이 호전된다. 일부 추가의 실시형태에서, 대상체는 본 명세서에서 제공하는 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제를 포함하는 적어도 하나의 약학 조성물이 제공되지 않은 대상체가 요구하는 식사보다 이의 페닐알라닌 함량이 덜 제한적인 식사를 먹을 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 유아인 한편, 일부 다른 실시형태에서, 대상체는 아동이고, 일부 다른 실시형태에서, 대상체는 청소년이고, 일부 추가의 실시형태에서, 대상체는 성인이다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 임의의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공하는 임의의 조성물은 단독이거나 또는 임의의 조합이다. 본 발명은 임의의 특정한 용도에 제한되는 것을 의도하지 않는다.

도 1은 프로테아제가 없는 장액에 대한 AvPAL 및 변이체 #126의 내성을 보여주는 그래프이다. 야생형 AvPAL 및 변이체 # 126의 잔류 PAL 활성은 트립신 및 키모트립신의 부재 하에서 단식 상태 모의된 장액 (FaSSIF), 초기 급식 상태 모의된 장액 (FeSSIF 초기), 중기 급식 상태 모의된 장액 (FeSSIF 중기), 및 후기 급식 상태 모의된 장액 (FeSSIF 후기) 중에서 인큐베이션 후에 도시된다.
도 2는 프로테아제가 있는 장액에 대한 AvPAL 및 변이체 #126의 내성을 도시한 그래프이다. AvPAL 및 변이체 #126의 잔류 PAL 활성은 트립신 및 키모트립신의 존재 하에서 단식 상태 모의된 장액 (FaSSIF), 초기 급식 상태 모의된 장액 (FeSSIF 초기), 중기 급식 상태 모의된 장액 (FeSSIF 중기), 및 후기 급식 상태 모의된 장액 (FeSSIF 후기) 중에 인큐베이션 후에 도시된다.
도 3은 다양한 용량의 변이체 #126으로 처치된 그룹의 비글에서 상대적 혈장 페닐알라닌 수준을 도시하는 그래프이다. 오류 막대는 명확함을 위해 생략된다 (*: p<0.05, **: p<0.01).
도 4는 다양한 용량의 변이체 126으로 처치된 그룹의 비글에서 혈장 CA 수준을 도시한 그래프이다.
도 5는 다양한 용량의 변이체 126으로 처치된 그룹의 비글에서 혈장 중 신남산 수준에 대한 AUC를 도시한 그래프이다. 통계적 유의성이 비히클 대비 각 군에 대해 제공되었다 (*: p< 0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001).
도 6은 다양한 용량의 변이체 126으로 처치된 그룹의 사이노몰거스 원숭이에서 상대적 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준을 도시하는 그래프이다. 일부 그룹은 파모티딘 (-famo)으로 전처리되지 않았다.
도 7은 다양하나 용량의 변이체 126으로 처치된 그룹의 사이노몰거스 원숭이의 혈장 중 상대적 페닐알라닌 (Phe)의 AUC를 도시하는 그래프이다. 파선은 모든 용량 변이체 126에 대한 평균 AUC를 나타낸다 ((**: 비히클 및 조합된 모든 용량 간 t-검정에 대한 p<0.01).
도 8A는 파모티딘으로 전처리되고 다양한 용량의 변이체 126을 투여받은 그룹의 사이노몰거스 원숭이에서 혈장 신남산 (CA) 수준을 도시하는 그래프이다.
도 8B는 파모티딘으로 전처리되지 않은 다양한 변이체 126을 투여받은 그룹의 사이노몰거스 원숭이에서 혈장 신남산 (CA) 수준을 도시하는 그래프이다.
도 9A는 파모티딘 전처리 (상부) 또는 비전처리 (중간) 사이노몰거스 원숭이에서 다양한 용량의 변이체 126으로 처치된 사이노몰거스 원숭이 그룹에 대한 0-4시간 동안 혈장 신남산 (CA) AUC를 도시하는 그래프이다.
도 9B는 파모티딘 전처리되지 않은 사이노몰거스 원숭이에서 다양한 용량의 변이체 126으로 처치된 사이농몰거스 원숭이 그룹에 대한 0-4시간 동안 혈장 신남산 (CA) AUC를 도시하는 그래프이다.
도 9C는 파모티딘으로 전처리하지 않거나 또는 투약 전 2시간에 파모티딘을 투여받은 (하부) 20 및 200 mg/kg 그룹의 직접 비교를 제공하는 그래프이다 (*: p<0.05, **: p<0.01).

본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드, 이의 돌연변이체, 생물학적 활성 단편 및 유도체, 및 이를 포함하는 약학 및 산업 조성물을 제공한다.

본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물을 비롯하여, 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 증강된 촉매 활성을 비롯하여, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도 및 고온 저장에 대해 증가된 내성을 제공하도록 최적화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 소수의 페닐알라닌 잔기를 함유한다. 본 발명은 또한 치료적 및 산업적 목적을 위한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 사용 방법을 제공한다.

혈류 중 페닐알라닌을 해독하는 한 방법은 주사가능한 재조합 PAL 및 PEG화에 의해 변형된 PAL 변이체 (PEG-PAL)의 사용이다. PEG는 효소 반감기를 개선시키고 대상체 항원 반응을 감소시키는 것으로 확인되었다 (예를 들어, WO 2008/153776, WO 2011/097335, 및 미국 특허 제7,531,341호 참조). PEG-PAL 조성물에서 유용한 PAL 변이체는 야생형 노스톡 푼티포르메 (Nostoc punctiforme) (NpPAL); 아나바에나 바리아빌리스 (AvPAL) 및 로도스포리듐 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides) (RtPAL)의 변이체로서 기술되었다. 특히, 야생형 AvPAL의 변이체는 위치 64, 318, 503 및 565에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 것이 기술되었다 (예를 들어, 미국 특허 제7,790,433호; 제7,560,263호; 및 제7,537,923호 참조).

PKU 대상체에서 L-페닐알라닌의 혈장 농도를 감소시키는 수단으로서 대안적인 PAL 투여의 경로는 경구 제제와 같은 비침습성 제제이다 (Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]). PAL의 경구 전달의 핵심 장점은 면역계에 대한 효소의 감소된 노출로서, 그리하여 주사가능한 PEG-PAL에서 관찰된 면역 반응을 최소화시키는 것이다. 그러나, PAL의 경구 제제에 대한 주요 한계는 위 및 장 내강에서 효소 활성의 소실이다. 효과적이고 기능적이기 위해서 PAL은 정상적으로 단백질성 음식을 올리고펩티드 및 아미노산으로 분해시키는 트립신, 키모트립신, 카르복시펩티다제 및 펩신과 같은 프로테아제 및 산성 pH에 의한 분해를 견뎌야만 한다. PAL의 경구 투여를 위해 유의한 효과를 성취하기 위한, 일부 이전의 연구들 (Sarkissian, 상동)에서, 부분적으로 프로테아제에 의한 효소 분해에 기인하고 부분적으로 pH 7.0에서 비교적 낮은 비활성에 기인하여 대량의 효소가 필요하였다. 다양한 수단이 소화 시 PAL 분해를 억제하기 위해 조사되었다 (Kim et al., Molec. Therap., 10:220 -224 [2004]; 및 Shah et al., Int. J. Pharmaceut., 356:61-68 [2008]).

소화관의 혹독한 조건 하에서 PAL의 유효성을 증가시키기 위한 한가지 접근법은 타고난 혹독 조건에 내성인 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공하는 것이다. Kang 등은 단백질 가수분해적 불활성화를 감소시키기 위해 AvPAL의 표면 리신의 PEG화 및 키모트립신 절단 부위의 부위 지정 돌연변이유발법을 사용하였다 (Kang et al., Mol. Gen. Metabol., 99:4-9 [2010] 참조). 이들 연구에서, 10개 절단 부위가 특이적으로 돌연변이되었고 이들 결과로 얻은 돌연변이체 중 2종 (F18A 및 R94G)을 제외한 전부는 50% 초과의 본래 효소 활성을 상실하였다. 어떠한 돌연변이체도 증가된 활성을 보이지 않았고 F18A 돌연변이체는 트립신 내성에서 약간의 증가를 보였다 (Kang et al., 상동). PAL의 추가 연구들은 효과적이지만, 일반적으로 보다 긴 수명의 효소를 얻지는 못하였다. 그러므로, 이전에 문헌에 기술된 PAL 돌연변이체 및 이의 유도체의 경구 투여는 그 결과로 PKU를 효과적으로 치료하지 못하였다.

PAL의 다양한 제제의 진보에도 불구하고, 경구 투여를 위한 개선된 특성을 갖는 PAL 폴리펩티드에 대한 필요성이 여전히 남아있다. 이들 개선된 특성은 제한없이 소화관 내 상태를 비롯한 저장 조건에 대한 개선된 안정성, 및 감소된 응집성을 포함한다.

PAL 효소는 또한 티로신 물질대사의 장애, 예컨대 I형 티로신혈증, II형 티로신혈증, III형 티로신혈증, 및 알캅톤뇨증의 치료를 위한 치료적 단백질로서도 사용될 수 있다. 이들 티로신 물질대사의 장애는 티로신의 분해에 관여하는 효소 중 하나가 상응하는 유전자 내 돌연변이로 인해 부분적으로 기능성이거나 또는 비기능성인 상염색체 물질대사 유전 장애이다. 이러한 기능성의 결여로 인해 혈류에 티로신 및 다른 티로신-대사산물의 수준이 상승된다. 티로신은 페닐알라닌으로부터 유도되기 때문에, 페닐알라닌 및 티로신 흡수를 제한하는 것은 티로신 물질대사 장애를 갖는 환자에게 유리하다. 따라서 PAL 효소는 티로신 물질대사 장애의 잠재적인 치료가 된다.

티로신 물질대사 장애를 갖는 환자가 초기에 치료되지 않으면, 높은 수준의 티로신 및 일부 이의 분해 산물이 간부전 및 신장 부전, 간암, 지적 장애 및 심지어 사망을 포함한 심각한 의학적 문제를 초래할 수 있다.

치료적 적용이외에도 PAL 효소는 또한 L-페닐알라닌 및 다른 치환된 L-페닐알라닌 유도체의 산업적 합성에 사용될 수 있다. 그리고 이들 유도체는 약학 전구체로서 사용될 수 있다 (Gloge et al., Chem., 6: 3386-3390 [2000]; Bartsch et al., Prot. Eng. Des. Sel., 23:929-933 [2010]; 및 Turner, Curr. Opin. Chem. Biol., 234-240 [2011]). PAL 효소는 또한 농업적 적용 분야에서도 사용될 수 있다. PAL은 식물, 진균 및 박테리아에서 페닐프로파노이드 (예컨대 플라보노이드 및 리그닌)의 생합성에서 중요한 역할을 하며 방어 관련 효소로서 작용할 수 있다 (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7608-7612 [1994]). PAL 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 사용한 PAL 활성의 조정은 잠재적으로 효과적인 제초제로 이어질 수 있다.

약어 및 정의:

달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 명명법 및 하기에 기술된 세포 배양, 분자 유전학, 미생물학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학의 실험실 절차는 당분야에 충분히 공지되어 있고 통상적으로 적용된다. 이러한 기술은 당업자에게 충분히 공지된 수많은 교재 및 참고 문헌에 충분히 공지되고 설명되어 있다. 표준 기술, 또는 이의 변형이 화학 합성 및 화학 분석에 사용된다. 상기 및 하기 본 명세서에 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 출판물은 참조로 본 명세서 명백하게 편입된다.

본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 적합한 방법 및 재료가 본 발명의 실시에서 사용되지만, 일부 방법 및 재료를 본 명세서에서 기술한다. 본 발명은 당업자에 의해 그들이 사용되는 상황에 따라서 다양할 수 있으므로, 기술된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약에 국한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 전체로서 본 출원을 참조하여 보다 완전하게 기술된다. 상기 및 하기 본 명세서에서 언급하는 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 출판물은 본 명세서에 참조로 명백하게 편입된다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 단수 "한", "하나" 및 "그"는 문맥에서 명확하게 달리 표시하지 않으면 복수 참조를 포함한다.

수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 개시되는 모든 수치 범위는 그러한 협소한 수치 범위가 모두 명백하게 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 광범위한 수치 범위 내에 속하는 모든 협소한 수치 범위를 포함하고자 한다. 본 명세서에 개시된 모든 최대 (또는 최소) 수치 한계는 그러한 하한 (또는 상한) 수치 한계가 본 명세서에 명백하게 기재된 바와 같이, 모든 하한 (또는 상한) 수치 한계를 포함하고자 한다.

용어 "약"은 특정한 값의 허용되는 오차를 의미한다. 일부 예에서, "약"은 소정 값 범위의 0.05%, 0.5%, 1.0%, 또는 2.0% 이내를 의미한다. 일부 예에서, "약"은 소정 값의 1, 2, 3, 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다.

뿐만 아니라, 본 명세서에서 제공되는 제목은 전체로서 출원을 참조하여 가질 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시형태의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의되는 용어들은 전체로서 출원을 참조하여 보다 완전하게 정의된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 많은 용어들을 하기에 정의하낟.

달리 표시하지 않으면, 개별적으로, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재되고; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카복시 배향으로 기재된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는" 및 이의 동족어는 그들의 포괄적인 의미로 사용된다 (즉, 용어 "포괄하는" 및 이의 상응하는 동족어와 동등).

"EC" 번호는 국제 생화학 및 분자 생물학 연합의 명명법 위원회의 효소 명명법 (Enzyme Nomenclature of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) (NC-IUBMB)을 의미한다. IUBMB 생화학 분류는 그들이 촉매하는 화학 반응을 기반으로 하는 효소에 대한 숫자 분류 체계이다.

"ATCC"는 그의 생물저장소 수집물이 유전자 및 균주를 포함하는 미국 생물 자원 센터 (American Type Culture Collection)를 의미한다.

"NCBI"는 미국 국립 생물 정보 센터 (National Center for Biological Information) 및 그에 제공되는 서열 데이타베이스를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 폴리펩티드"는 히스티딘 암모니아 리아제, 및 티로신 암모니아 리아제를 또한 포함하는 방향족 아미노산 리아제 패밀리 내의 효소 부류 (EC 4.3.1.23, EC 4.3.1.24 및 EC4.3.1.25)를 의미한다. PAL 폴리펩티드는 또한 일부 PAL 효소가 기질로서 페닐알라닌뿐만 아니라 티로신을 사용할 수 있기 때문에 종종 페닐알라닌/티로신 암모니아 리아제라고 한다. 그러나, 본 명세서에 개시되고 청구되는 AvPAL 및 변이체는 기질로서 티로신을 사용하지 않는다. PAL 폴리펩티드는 L-페닐알라닌의 트랜스-신남산 및 암모니아로의 전환을 촉매한다. PAL 활성은 PAL 폴리펩티드의 효소 활성을 의미한다. 일부 바람직한 실시형태에서, PAL 효소는 또한 보조인자 3,5-디히드로-5-메틸리덴-4H-이미다졸-4-온 (MIO)을 함유한다. 이러한 보조인자는 촉매 활성에 필요할 수 있고 보존된 활성 부위 Ala167-Ser168-Gly169 트리펩티드 절편의 고리화 및 탈수에 의해 형성된다.

"단백질", "폴리펩티드", 및 "펩티드"는 길이 또는 번역 후 변형 (예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)과 무관하게, 아미드 결합에 의해 공유적으로 연결된 적어도 2개 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

"폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인 적어도 2개 뉴클레오티드를 포함하는 중합체를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다.

"아미노산"은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 추천하는 그들의 통상적으로 공지된 3-글자 기호 또는 1-글자 기호에 의해 본 명세서에서 언급된다. 유사하게, 뉴클레오티드는 그들의 통상적으로 허용되는 단일 글자 코드로 언급될 수 있다.

세포, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 사용될 때, 용어 "조작된", "재조합", "비천연 발생" 및 "변이체"는 그렇지 않으면 자연계에 존재하지 않는 방식으로 변형되거나 또는 그와 동일하지만 합성 재료로부터 생성 또는 유도되고/되거나 재조합 기술을 사용한 조작에 의해 생성 또는 유도되는 재료 또는 그 재료의 자연적 또는 천연적 형태에 상응하는 재료를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "야생형" 및 "천연 발생"은 자연계에 존재하는 형태를 의미한다. 예를 들어, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연계 공급원으로부터 단리될 수 있고 인간 조작에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체에 존재하는 서열이다.

"코딩 서열"은 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (예를 들어, 유전자)의 일부를 의미한다.

용어 "서열 동일성 백분율 (%)"은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 간 비교를 의미하고자 본 명세서에서 사용되고, 비교창 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정되며, 여기서 비교창 내 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위해서 기준 서열과 비교시에 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함한다. 이 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 존재하는 위치의 개수를 결정하여 일치되는 위치의 개수를 산출하고, 일치되는 위치의 개수를 비교창의 전체 위치 개수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동열성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 대안적으로, 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 존재하거나 또는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 갭과 함께 정렬된 위치의 개수를 결정하여 일치되는 위치의 개수를 산출하고, 일치되는 위치의 개수를 비교창 내 전체 위치 개수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 당업자는 2개 서열을 정렬하기 위해 이용할 수 있는 정착된 많은 알고리즘이 존재한다는 것을 이해한다. 비교를 위한 최적 서열 정렬은 예를 들어 당분야에 공지된 바와 같이, Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]), Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]), Pearson 및 Lipman의 유사성 방법에 대한 검색 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]), 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (예를 들어, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성의 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는 제한없이 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함한다 (예를 들어, 다음의 문헌들을 참조함: Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]; 및 Altschul et al., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977]). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터의 웹사이트를 통해 공공으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬시, 일부 양의값 임계치 점수 "T"를 만족하거나 또는 그와 일치되는, 문의 서열 중 짧은 단어 길이 "W"를 확인함으로써 높은 점수 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 단계를 포함한다. T는 이웃 단어 점수 임계치를 의미한다 (Altschul et al, 상동). 이들 초기의 이웃 단어 히트수는 그들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 씨드로서 작용한다. 그리고 단어 히트수는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양쪽 방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 매개변수 "M" (일치되는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 "N" (불일치 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용해 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 채점 매트릭스를 사용해 누적 점수를 계산한다. 각 방향으로 단어 히트수의 확장은 누적 정렬 점수가 이의 최대 획득값으로부터 "X" 분량만큼 감소되는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음의 점수 잔기 정렬의 축적으로 인해, 0 이하로 가는 경우; 또는 양쪽 서열의 말단에 도달하는 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어 길이 (W), 10의 기대치 (E), M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이 (W), 10의 기대치 (E), 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용한다 (예를 들어, Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989] 참조). 예시적인 서열 정렬 및 서열 동일성의 %의 결정은 제공되는 디폴트 매개변수를 사용하여, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지의 BESTFIT 또는 GAP 프래그램을 적용할 수 있다 (Accelrys, Madison WI).

"기준 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 정의된 서열을 의미한다. 기준 서열은 더 큰 서열의 세브세트, 예를 들어 전체 길이 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 절편일 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 적어도 20개 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 길이, 적어도 25개 잔기의 길이, 적어도 50개 잔기의 길이, 적어도 100개 잔기의 길이 또는 전체 길이의 핵산 또는 폴리펩티드이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 (1) 2개 서열 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 서열의 일부분)을 포함할 수 있고, (2) 2개 서열 간에 분기된 서열을 더 포함할 수 있고, 2개 (또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 간 서열 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 "비교창" 상의 2개 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 비교하여 수행된다. 일부 실시형태에서, "기준 서열"은 1차 아미노산 서열을 기반으로 할 수 있고, 여기서 기준 서열은 1차 서열에 하나 이상의 변화를 가질 수 있는 서열이다. 예를 들어, 어구 "X39에 상응하는 잔기에 발린을 갖는 서열번호 4를 기반으로 하는 기준 서열"은 서열번호 4의 위치 X39의 상응하는 잔기 (예를 들어, 알라닌)가 발린으로 변화된 기준 서열을 의미한다.

"비교창"은 적어도 약 20개의 인접하는 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 잔기의 개념적 절편을 의미하는 것으로서, 여기서 서열은 적어도 20개의 인접하는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 기준 서열과 비교될 수 있고 비교창에서 서열의 일부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교시에 20% 이하의 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창은 20개보다 긴 인접하는 잔기일 수 있고, 경우에 따라 30, 40, 50, 100, 또는 그 이상의 창을 포함할 수 있다.

소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링과 상황에서 사용되는 "∼에 상응하는", "∼를 참조하여" 및 "∼에 대해서"는 소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 비교될 때 명시된 기준 서열의 잔기의 넘버링을 의미한다. 달리 말해서, 소정 중합체의 잔기 번호 또는 잔기 위치는 소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내 잔기의 실제 번호 위치보다는 기준 서열에 대해서 지정된다. 예를 들어, 소정 아미노산 서열, 예컨대 조작된 PAL의 서열은 2개 서열 간에 잔기 일치를 최적화하기 위해 갭을 도입하여 기준 서열에 대해 정렬될 수 있다. 이러한 경우에서, 갭이 존재하지만, 소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 중 잔기의 넘버링은 정렬되는 기준 서열에 대해 만들어진다.

"아미노산 차이" 및 "잔기 차이"는 기준 서열에서 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기에 대해서 폴리펩티드 서열의 위치에서의 아미노산 잔기의 차이를 의미한다. 아미노산 차이의 위치는 일반적으로 본 명세서에서 "Xn"라고 하며, 여기서 n은 잔기 차이를 기반으로 하는 기준 서열 내 상응하는 위치를 의미한다. 예를 들어, "서열번호 4와 비교하여 위치 X91에서 잔기 차이"는 서열번호 4의 위치 91에 상응하는 폴리펩티드 위치에서의 아미노산 잔기의 차이를 의미한다. 따라서, 서열번호 4의 기준 폴리펩티드가 위치 91에서 알라닌을 갖는다면, "서열번호 4와 비교하여 위치 X91에서 잔기 차이"는 서열번호 4의 위치 91에 상응하는 폴리펩티드의 위치에서 알라닌 이외의 임의 잔기의 아미노산 치환을 의미한다. 본 명세서에서 대부분의 예에서, 위치에서 특별한 아미노산 잔기 차이는 "XnY"로 표시되고, 여기서 "Xn"은 상응하는 잔기 및 기준 폴리펩티드의 위치 (상기에 기술한 바와 같음)를 명시하고, "Y"는 조작된 폴리펩티드에 존재하는 아미노산의 단일 글자 식별자 (즉, 기준 폴리펩티드와 상이한 잔기)이다. 일부 예 (예를 들어, 실시예의 표)에서, 본 개시 내용은 또한 통상의 표기 "AnB"로 표시되는 특별한 아미노산 차이를 제공하고 여기서 A는 기준 서열에서 잔기의 단일 글자 식별자이고, "n"은 기줄 서열에서 잔기 위치의 개수이고, B는 조작된 폴리펩티드의 서열에서 잔기 치환의 단일 글자 식별자이다. 일부 예에서, 본 개시 내용의 폴리펩티드는 기준 서열에 대해 잔기 차이가 존재하는 명시된 위치의 목록에 의해 표시되는, 기준 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 특별한 잔기 위치에서 하나 초과의 아미노산이 사용되는 경우에, 사용될 수 있는 다양한 아미노산 잔기는 "/"에 의해 분리된다 (예를 들어, X307G/X307Q 또는 X307G/Q). 본 개시 내용은 보존성 및 비보존성 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 하나 이상의 아미노산 차이를 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 포함한다.

용어 "아미노산 치환 세트" 및 "치환 세트"는 폴리펩티드 서열 내에서 아미노산 치환의 그룹을 의미한다. 일부 실시형태에서, 치환 세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환 세트는 실시예의 임의의 표에 열거된 임의의 변이체 AvPAL 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 치환의 세트를 의미한다.

"보존성 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 상이한 잔기로 잔기의 치환을 의미하며, 따라서 전형적으로 동일하거나 또는 유사하게 정의된 아미노산 부류 내아미노산으로 폴리펩티드의 아미노산의 치환을 포함한다. 비제한적인 예로서, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 다른 지방족 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신)으로 치환될 수 있고; 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산은 히드록실 측쇄를 갖는 다른 아미노산 (예를 들어, 세린 및 트레오닌)으로 치환되고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 방향족 측쇄를 갖는 다른 아미노산 (예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 히스티딘)으로 치환되고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 염기성 측쇄를 갖는 다른 아미노산 (예를 들어, 리신 및 아르기닌)으로 치환되고; 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 산성 측쇄를 갖는 다른 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 치환되고; 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 치환된다. 예시적인 보존성 치환은 표 1에 제공된다.

"비보존성 치환"은 유의하게 상이한 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로 폴리펩티드 내 아미노산의 치환을 의미한다. 비보존성 치환은 정의된 그룹 내에서 보다는 그 사이의 아미노산을 사용할 수 있고 (a) 치환 (예를 들어, 글리신의 경우 프롤린) 영역에서 펩티드 골격의 구조; (b) 전하 또는 소수성; 및/또는 (c) 측쇄의 규모에 영향을 미칠 수 있다. 비제한적인 예로서, 예시적인 비보존성 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환되는 산성 아미노산; 소형 아미노산으로 치환되는 방향족 아미노산; 및 소수성 아미노산으로 치환되는 친수성 아미노산을 포함한다.

"결실"은 기준 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산의 제거에 의한 폴리펩티드의 변형을 의미한다. 결실은 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산, 아미노산의 총 개수의 최대 10%, 또는 효소 활성을 유지하고/하거나 조작된 트랜스아미나제 효소의 개선된 특성을 유지하면서 기준 효소를 구성하는 아미노산의 총 개수의 최대 20%의 제거를 포함할 수 있다. 결실은 폴리펩티드의 내부 부분 및/또는 말단 부분에 대한 것일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 결실은 연속되는 절편을 포함할 수 있거나 또는 불연속적일 수 있다.

"삽입"은 기준 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산의 첨가에 의한 폴리펩티드의 변형을 의미한다. 삽입은 폴리펩티드의 내부 일부분에 존재할 수 있거나, 또는 카복시 또는 아미노 말단에 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 삽입은 당분야에 공지된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다. 삽입은 아미노산의 인접하는 절편일 수 있거나 또는 천연 발생 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산에 의해 분리될 수 있다.

용어 "기능성 단편" 및 "생물학적 활성 단편"은 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실(들) 및/또는 내부 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열은 비교되는 서열 (예를 들어, 본 발명의 전체 길이 조작된 PAL)의 상응하는 위치와 동일하고 전체 길이 폴리펩티드의 활성의 실질적으로 전부를 보유하는 폴리펩티드를 의미하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

"단리된 폴리펩티드"는 천연적으로 이것과 동반되는 다른 오염원 (예를 들어, 단백질, 지질 및 폴리뉴클레오티드)으로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 이 용어는 그들의 천연 발생 환경 또는 발현 시스템 (예를 들어, 숙주 세포 또는 시험관내 합성)으로부터 제거되거나 또는 정제된 폴리펩티드를 포괄한다. 재조합 PAL 폴리펩티드는 세포 내에 존재할 수 있거나, 세포 배지에 존재할 수 있거나, 또는 다양한 형태, 예컨대 용해물 또는 단리된 조제물로 제조될 수 있다. 이와 같이, 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공하는 재조합 PAL 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다.

"실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 폴리펩티드 종이 존재하는 우세한 종 (즉, 조성물 중 임의의 다른 개별 거대분자보다 더 풍부한 것으로 몰 또는 중량 기준)인 조성물을 의미하고, 일반적으로 대상 종이 몰 또는 중량% 기준으로 존재하는 거대분자 종의 적어도 약 50%를 포함할 때 실질적으로 정제된 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 PAL 조성물은 조성물에 존재하는 몰 또는 중량%를 기준으로 모든 거대분자 종의 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 및 약 98% 이상을 포함하게 될 것이다. 일부 실시형태에서, 대상 종은 실질적 균질성으로 정제되고 (즉, 오염종은 통상의 검출 방법으로 조성물에서 검출될 수 없음), 여기서 조성물은 실질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다. 용매 종, 소형 분자 (< 500 달톤), 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로 고려되지 않는다. 일부 실시형태에서, 단리된 재조합 PAL 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다.

"개선된 효소 특성"은 기준 PAL 폴리펩티드, 예컨대 야생형 PAL 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 4를 갖는 AvPAL 야생형) 또는 다른 조작된 PAL 폴리펩티드와 비교하여 효소 특성의 개선을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드를 의미한다. 개선된 특성은 제한없이 증가된 단백질 발현, 증가된 열활성, 증가된 열안정성, 증가된 pH 활성, 증가된 안정성, 증가된 효소 활성, 증가된 기질 특이성 및/또는 친화성, 증가된 비활성, 기질 및/또는 최종 산물 억제에 대한 증가된 내성, 증가된 화학 안정성, 증가된 화학선택성, 개선된 용매 안정성, 산성 pH에 대한 증가된 내성, 단백질가수분해 활성에 대한 증가된 내성 (즉, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도), 감소된 응집, 증가된 가용성, 감소된 면역원성, 및 변경된 온도 프로파일과 같은 특성을 포함한다.

어구 "소수의 페닐알라닌 잔기를 함유하는"은 본 발명에 따른 조작된 PAL 폴리펩티드가 하나 이상의 페닐알라닌 잔기가 임의의 다른 아미노산으로의 돌연변이를 통해서 이의 폴리펩티드 서열로부터 제거된 후 표준 어세이 (예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같음)에서 기준 PAL과 비교했을 때 적어도 활성, 또는 안정성을 보유하게 되는 것을 의미한다.

"증가된 효소 활성" 및 "증강된 촉매 활성"은 기준 PAL (예를 들어, AvPAL 및/또는 다른 조작된 AvPAL)과 비교하여 생성물로 기질의 전환율 (예를 들어, PAL의 특정량을 사용하여 특정 시간 기간 동안 기질 출발량의 생성물로의 전환율)의 증가 및/또는 비활성 (예를 들어, 생성된 생성물/시간/단백질 중량)의 증가로 대표될 수 있는 조작된 PAL 폴리펩티드의 개선된 특성을 의미한다. 효소 활성을 결정하기 위한 예시적인 방법은 실시예에서 제공된다. K _m , V _max 또는 k _cat 의 고전적인 효소 특성을 포함한, 효소 활성과 관련된 임의 특성이 영향받을 수 있고, 이들의 변화는 증가된 효소 활성을 야기시킬 수 있다. 효소 활성의 개선은 상응하는 야생형 효소의 효소 활성의 약 1.1배 내지, 천연 발생 PAL 또는 PAL 폴리펩티드가 유도된 다른 조작된 PAL 보다 상응하는 야생형 효소의 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 25-배, 50-배, 75-배, 100-배, 150-배, 200-배 이상의 효소 활성일 수 있다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 적어도 0.1/초, 적어도 0.2/초, 적어도 0.3/초, 적어도 0.5/초, 적어도 1.0/초, 및 일부 바람직한 실시형태에서 2.0/초 초과의 k _cat 을 갖는다. 일부 실시형태에서, K _m 은 약 1 μM 내지 5 mM의 범위; 약 5 μM 내지 약 2 mM의 범위; 약 10 μM 내지 약 2 mM의 범위; 또는 약 10 μM 내지 약 1 mM의 범위이다. 일부 특정한 실시형태에서, 조작된 PAL 효소는 기준 PAL 효소의 것보다 1.5 내지 10-배, 1.5 내지 25-배, 1.5 내지 50-배, 1.5 내지 100-배 또는 그 이상의 범위의 개선된 효소 활성을 나타낸다. PAL 활성은 당분야에 공지된 임의의 표준 어세이 (예를 들어, 반응물 또는 생성물의 분광광도 특성의 변화 모니터링)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생성된 생성물의 양은 UV 흡광 또는 형광 검출과 조합하거나 또는 o-프탈디알데히드 (OPA) 유도체화가 후속되는 고성능 액상 크로마토그래피 (HPLC) 분리에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 효소 활성의 비교는 본 명세서에서 더욱 상술하는 바와 같이, 효소의 정의된 조제물, 설정 조건 하에서 정의된 어세이, 및 하나 이상의 정의된 기질을 사용하여 이루어진다. 일반적으로, 용해물을 비교할 때, 용해물에 존재하고 숙주 세포에 의해 생성되는 효소량의 변동을 최소화하기 위해서, 동일한 발현 시스템 및 동일한 숙주 세포의 사용을 비롯하여 어세이되는 단백질의 양 및 세포의 수를 결정한다.

본 명세서에서 사용되는 "생리적 pH"는 대상체 (예를 들어, 인간)의 소장에서 일반적으로 존재하는 pH 범위를 의미한다. 보통 유문판에서 대장까지 약 6.0 내지 7.5 범위의 pH 구배가 존재한다.

본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단백질 가수분해적 활성" 및 "단백질 가수분해"는 보다 작은 폴리펩티드 또는 아미노산으로 단백질의 분해를 의미한다. 단백질의 분해는 일반적으로 프로테아제 (프로테이나제) 효소에 의한 펩티드 결합의 가수분해의 결과이다. 프로테아제 효소는 제한없이 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제; 카복시펩티다제 A 및 B, 및 펩티다제 (예를 들어, 아미노 펩티다제, 디펩티다제 및 엔테로펩티다제)를 포함한다.

어구 "단백질 가수분해에 대해 감소된 감도", "감소된 단백질 가수분해 감도" 및 "단백질 가수분해에 대해 증가된 내성"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 본 발명에 따른 조작된 PAL 폴리펩티드가 하나 이상의 프로테아제로 처리 후 표준 어세이 (예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같음)에서 기준 PAL과 비교하여 더 높은 효소 활성을 갖는다는 것을 의미한다.

어구 "고온에서 증가된 저장 안정성"은 본 발명에 따른 조작된 PAL 폴리펩티드가 예를 들어, 동결건조 또는 분무-건조에 의해 건조된 형태로 생성되어, 실온 이상의 온도 (예를 들어, 30℃, 37℃, 45℃, 55℃ 등)에서 수 일 내지 다수 개월 범위의 기간 동안 저장된 후 표준 어세이 (예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같음)에서 기준 PAL과 비교하여 더 많은 활성을 보유하게 되는 것을 의미한다.

"응집"은 PAL 폴리펩티드의 응괴 또는 침전을 의미한다. 응집은 효소의 불활성화를 초래할 수 있다. 용어 "감소된 응집"은 조작된 PAL 폴리펩티드가 기준 PAL과 비교하여 응집되는 경향이 덜 하게 되는 것을 의미한다. 응집을 평가하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 제한없이 적절한 염료 (예를 들어, 티오플라빈 T 또는 나일 레드)를 사용한 형광 현미경의 사용, 동적 광산란법, 적절한 염료 (예를 들어, 보디피)를 사용한 유세포측정법, 여과 및 SDS-PAGE에 의한 분석, 및/또는 웨스턴 블롯팅, 형광 상관 분광법, 및 전자 현미경을 포함한다. 응집을 평가하기 위해 상업적으로 입수가능한 키트 (예를 들어, ProteoStat^® 단백질 응집 어세이 키트 [Enzo])가 존재한다.

"전환"은 상응하는 생성물(들)로 기질(들)의 효소적 전환 (또는 생체내변환)을 의미한다. "전환율"은 특정한 조건 하에서 시간 기간 내에 생성물로 전환되는 기질의 백분율을 의미한다. 따라서, PAL 폴리펩티드의 "효소 활성" 또는 "활성"은 특정한 시간 기간 동안 생성물로의 기질의 "전환율"로서 표시될 수 있다.

"혼성화 엄격도"는 핵산의 혼성화 시 혼성화 조건, 예컨대 세척 조건을 의미한다. 일반적으로, 혼성화 반응은 낮은 엄격도 조건 하에서 수행되고, 그 이후에 다양하지만 더 높은 엄격도의 세척이 후속된다. 용어 "적절하게 엄격한 혼성화"는 표적 DNA와 약 60% 동일성, 바람직하게 약 75% 동일성, 약 85% 동일성을 갖고, 표적-폴리뉴클레오티드에 대해 약 90% 초과의 동일성을 갖는 상응하는 핵산과 표적-DNA의 결합을 허용하는 조건을 의미한다. 예시적인 적절하게 엄격한 조건은 42℃에 50% 포름아미드, 5×덴하르트 용액, 5×SSPE, 0.2% SDS 중에서 혼성화, 이후 42℃에서 0.2×SSPE, 0.2% SDS 중 세척과 동등한 조건이다. "고엄격 혼성화"는 일반적으로 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 용액 조건 하에서 결정되는 열적 용융 온도 (T _m )로부터 약 10℃ 이하인 조건을 의미한다. 일부 실시형태에서, 고엄격 조건은 65℃에서 0.018 M NaCl 중에 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 서열만이 혼성화가 허용되는 조건을 의미한다 (즉, 하이브리드가 65℃에 0.018 M NaCl 중에서 안정하지 않으면, 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 고엄격 조건 하에서 안정하지 않을 것임). 고엄격 조건은 예를 들어 42℃에 50% 포름아미드, 5×덴하르트 용액, 5×SSPE, 0.2% SDS와 동등한 조건에서 혼성화와 이후, 65℃ 중에 0.1×SSPE, 및 0.1% SDS에서 세척을 통해 제공될 수 있다. 다른 고엄격 조건은 65℃에서 0.1% (w:v) SDS를 함유하는 5×SSC 중에서의 혼성화와 동등한 조건에서 혼성화 및 65℃에서 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC에서의 세척이다. 다른 고엄격 혼성화 조건을 비롯하여 적절하게 엄격한 조건은 상기 인용된 참조문헌에 기술되어 있다.

"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 그 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 유전자 코드는 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는 몇개의 코돈으로 표시된다는 점에서 축퇴성이지만, 특정한 유기체에 의한 코돈 용법은 무작위적이지 않고 특정한 코돈 트리플렛에 편중된다. 이러한 코돈 용법 편중성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 저카피수 단백질 대비 고도로 발현되는 단백질, 및 유기체의 게놈의 집합 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 일부 실시형태에서, PAL 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 선택된 숙주 유기체로부터 최적 생성을 위해 코돈 최적화된다. "제어 서열"은 본 명세서에서 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 위해 필요하거나 또는 유리한 모든 성물은 포함하는 것을 의미한다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대해 천연이거나 또는 외래의 것일 수 있다. 이러한 제어 서열은 제한없이, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터 서열, 신호 펩티드 서열, 개시 서열, 및 전사 종결인자를 포함한다. 최소로, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 영역과 제어 서열의 결찰을 촉진하는 특정한 제한효소 부위를 도입시키려는 목적을 위해 링커가 제공된다.

"작동적으로 연결된"은 본 명세서에서 제어 서열이 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하거나 또는 조절하도록 제어 서열이 관심 폴리뉴클레오티드에 대한 위치에 적절하게 (즉, 기능적 관련성으로) 위치된 구성으로서 정의된다.

"프로모터 서열"은 관심 폴리뉴클레오티드, 예컨대 코딩 서열의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식된 핵산 서열을 의미한다. 프로모터 서열은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 절두형 및 하이브리드 프로모터를 포함하여, 선택 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 동종성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.

효소적 전환 반응 과정의 상황에서 "기질"은 PAL 폴리펩티드에 의해 작용되는 화합물 또는 분자를 의미한다. 효소적 전환 과정의 상황에서 "생성물"은 기질에 대한 PAL 폴리펩티드의 작용에 의해 생성되는 화합물 또는 분자를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배양하는"은 임의의 적합한 배지 (예를 들어, 액체, 겔, 또는 고체)를 사용하여 적합한 조건 하에서 미생물 세포의 개체군을 성장시키는 것을 의미한다.

재조합 폴리펩티드 (예를 들어, PAL 효소 변이체)는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 생성될 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 충분히 공지된 광범위하게 다양하고 상이한 돌연변이유발 기술이 존재한다. 또한, 돌연변이유발 키트가 많은 상업적 분자 생물학 공급사로부터 입수가능하다. 정의된 아미노산에서 특이적 치환 (부위-지정), 유전자의 국소 영역 내에서 특이적 또는 무작위 돌연변이 (영역-특이적), 또는 전체 유전자 상에서 무작위 돌연변이유발 (예를 들어, 포화 돌연변이유발)을 만드는 방법이 이용가능하다. 제한없이 PCR을 사용한 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA의 부위 지정 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법, 유전자 합성, 에러-프론 PCR, 셔플링, 및 화학 포화 돌연변이유발법, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 포함하여, 효소 변이체를 생성하기 위한 수많은 적합한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. DNA 및 단백질 조작에 사용되는 방법의 비제한적인 예는 하기 특허들에 제공되어 있다: 미국 특허 제6,117,679호; 미국 특허 제6,420,175호; 미국 특허 제6,376,246호; 미국 특허 제6,586,182호; 미국 특허 제7,747,391호; 미국 특허 제7,747,393호; 미국 특허 제7,783,428호; 및 미국 특허 제8,383,346호. 변이체가 생성된 후에, 그들은 임의의 바람직한 특성 (예를 들어, 높거나 또는 증가된 활성, 또는 낮거나 또는 감소된 활성, 증가된 열적 활성, 증가된 열적 안정성, 및/또는 산성 pH 안정성 등)에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, "재조합 PAL 폴리펩티드" (본 명세서에서 또한 "조작된 PAL 폴리펩티드", "변이체 PAL 효소" 및 "PAL 변이체"라고도 함)가 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 세포로 DNA 서열을 도입시키기 위한 DNA 구성체이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 DNA 서열로 코딩되는 폴리펩티드의 박현을 적합한 숙주에서 실시할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동적으로 연결된 발현 벡터이다. 일부 실시형태에서, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현을 구동시키기 위해 DNA 서열 (예를 들어, 이식유전자)에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 가지며, 일부 실시형태에서, 또한 전사 종결 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "발현"은 제한없이 전사, 전사후 변형, 번역 및 번역후 변형을 포함하는 폴리펩티드의 생성에 관여되는 임의 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 용어는 또한 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 포괄한다.

본 명세서에서 사용되는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 프로모터 서열, 신호 펩티드, 종결 서열 등)은 2개 서열이 천연적으로 관련이 없다면 그것이 작동적으로 연결되는 다른 서열에 대해 "이종성"이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 및 "숙주 균주"는 본 명세서에서 제공되는 DNA (예를 들어, 적어도 하나의 AvPAL 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)를 포함하는 발현 벡터에 적합한 숙주를 의미한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 당분야에 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축된 벡터에 의해 형질전환되거나 또는 형질감염된 원핵생물 또는 진핵생물 세포이다.

용어 "유사체"는 기준 폴리펩티드와 70% 초과의 서열 동일성이지만 100% 미만의 서열 동일성 (예를 들어, 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 유사체는 제한없이 호모아르기닌, 오르니틴 및 노르발린을 포함하는 비천연 발생 아미노산 잔기를 비롯하여, 천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유사체는 또한 하나 이상의 D-아미노산 잔기 및 2개 이상의 아미노산 잔기 사이에 비펩티드 연결을 포함한다.

용어 "치료제"는 유리하거나 또는 바람직한 의학적 효과를 갖는 병상의 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여되는 화합물을 의미한다.

용어 "약학 조성물"은 본 발명에 의해 포괄되는 조작된 PAL 폴리펩티드의 약학적 유효량 및 허용되는 담체를 포함하는 포유동물 대상체 (예를 들어, 인간)에서의 약학적 용도에 적합한 조성물을 의미한다.

"유전자 요법"은 포유동물 대상체 (예를 들어, 인간)에서 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 유전자 (즉, 유전 물질)의 사용과 관련하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 포유동물 대상체의 적어도 일부 세포로 직접 도입된다. 본 발명은 유전자 요법에 유용한 임의의 특별한 방법(들) 또는 조성물(들)에 국한하는 것을 의도하지 않는다.

용어 "mRNA 요법"은 포유동물 대상체 (예를 들어, 인간)에서 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 메신저 RNA (mRNA)의 사용과 관련하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 포유동물 대상체의 적어도 일부 세포에 직접적으로 도입된다. 본 발명은 mRNA 요법에 유용한 임의의 특별한 방법(들) 또는 조성물(들)에 국한하는 것을 의도하지 않는다.

용어 "유효량"은 바람직한 결과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다. 당업자는 통상의 실험을 사용하여 유효량을 결정할 수 있다.

용어 "단리된" 및 "정제된"은 천연적으로 회합된 적어도 하나의 다른 성분으로부터 제거된 분자 (예를 들어, 단리된 핵산, 폴리펩티드 등) 또는 다른 성분을 의미하고자 사용된다. 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하는 것이 아니라, 그 보다는 상대적 정의로서 의도된다.

용어 "대상체"는 포유동물 예컨대 인간, 인간 이외의 영장류, 가축, 반려 동물, 및 실험 동물 (예를 들어, 설치류 및 토끼목)을 포괄한다. 이 용어는 여성과 남성을 포괄하려는 의도이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 질환에 대해 평가 중이거나, 치료 중이거나, 또는 질환을 경험 중인 임의의 대상체를 의미한다.

용어 "유아"는 생후 첫달부터 대략 1세 기간의 어린이를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "신생아"는 출생부터 28일까지의 기간의 어린이를 의미한다. 용어 "조산아"는 임신 20주가 끝난 후이지만, 만삭 전에 태어나고, 일반적으로 태어났을 때 체중이 ∼500 내지 ∼2499 그램인 유아를 의미한다. "저체중아"는 태어났을 때 체중이 1500 g 미만인 유아이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "아동"은 치료 또는 연구 절차에 동의를 위한법정 연령에 도달하지 않은 사람이다. 일부 실시형태에서, 이 용어는 출생 시점 부터 청소년기 사이의 사람을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "성인"은 관련 관할 구역에서 법적 연령에 도달한 사람 (예를 들어, 미국의 경우 18세)을 의미한다. 일부 실시형태에서, 이 용어는 임의의 완전하게 성장한, 성숙한 유기체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 용어 "청소년"은 18세 미만이지만, 성성숙도에 도달한 사람을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "조성물" 및 "제제"는 임의의 적합한 용도 (예를 들어, 약학 조성물, 식이/영양 보충물, 사료 등)에 의도되는, 본 발명의 적어도 하나의 조작된 PAL을 포함하는 생성물을 포괄한다.

용어 "투여" 및 조성물을 "투여하는"은 대상체 (예를 들어, PKU의 효과를 앓는 사람)에게 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

약학 조성물과 관련되어 사용될 때 용어 "담체"는 임의의 표준 약학 담체, 완충제, 및 부형제, 예컨대 안정화제, 보존제 및 보강제를 의미한다.

용어 "약학적으로 허용되는"은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나 또는 함유되어 있는 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 임의의 성분들과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는 대상체에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "부형제"는 활성 약학 성분 (API; 예를 들어 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드) 이외에, 임의의 약학적으로 허용되는 첨가제, 담체, 희석제, 보강제, 또는 다른 성분을 의미한다. 부형제는 전형적으로 제제 및/또는 투여 목적을 위해 포함된다.

질환/병태의 증상과 관련하여 사용시 용어 "치료적 유효량"은 질환/병태의 하나 이상의 증상을 호전, 약화, 또는 제거시키거나 또는 증상(들) (예를 들어, PKU)의 개시를 예방 또는 지연시키는 화합물 (예를 들어, 조작된 PAL 폴리펩티드)의 양 및/또는 농도를 의미한다. 일부 실시형태에서, 이 용어는 연구자, 의사, 수의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 또는 동물 대상체에 의한 생물학적 (예를 들어, 의학적) 반응을 유발시키는 조성물의 양과 관련하여 사용된다.

질환/병태와 관련하여 사용될 때 용어 "치료적 유효량"은 질환/병태를 호전, 약화 또는 제거시키는 조성물의 양 및/또는 농도를 의미한다.

용어 "치료하는", "치료하다" 및 "치료"는 임시방편적 처치를 비롯하여, 예방적 (예를 들어, 예방학적) 처치를 포괄하는 것을 의도한다.

조작된 PAL 폴리펩티드 :

본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드가 유래된 부모 PAL 폴리펩티드는 박테리아 균주 예컨대 아나바에나 (Anabaena) (예를 들어, 에이, 바리아빌리스 (A. variabilis)), 노스톡 (Nostoc) (예를 들어, 엔. 푼티포르메(N. punctiforme)), 로도스포리듐 (Rhodosporidium) (예를 들어, 알. 토룰로이데스 (R. toruloides)), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) (예를 들어, 에스. 마리티무스 (S. maritimus) 또는 에스. 베르티실라터스 (S. verticillatus)), 오실라토리아 (Oscillatoria) 종, 글로에오카프사 (Gloeocapsa) 종, 및 리불라리아 (Rivularia) 종을 포함한다. 이들 균주 유래의 PAL 효소가 동정되었고 충분히 공지되어 있다. 아나바에나 (에이. 바리아빌리스) ATCC 29413 및 NCBI YP_324488.1; 노스톡 (엔. 푼티포르메) ATCC 29133 및 NCBI YP_00186563.1; 오실라토리아 종 PCC 6506 및 NCBI ZP_ 07108482.1 및 클로에오카프사 종 PCC7428 및 NCBI YP_007127054.1 유래의 상동성 효소 서열은 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 공개 특허 출원 제2014/0314843호의 도 1에 제공되어 있다.

뿐만 아니라, 특정한 PAL 변이체 (즉, 조작된 PAL 폴리펩티드)가 야생형 PAL 또는 기준 PAL의 서열 내 특정한 아미노산 잔기의 변형에 대하여 언급될 때, 균등한 위치(들) (개별 아미노산 서열 사이의 선택적 아미노산 서열 정렬로 결정됨)에서 변형된 다른 PAL의 변이체가 본 명세서에 포괄된다는 것을 이해해야 한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 상기 박테리아 균주 (즉, 노스톡 [엔. 푼티포르메], 로도스포리듐 [알. 토룰로이데스], 스트렙토마이세스 [에스. 마리티머스 또는 에스. 베르티실라터스], 오실라토리아 종, 글로에오카프사 종 및 리불라리아 종)로부터 열거된 폴리펩티드 중 어느 하나로부터 유래된다. 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 보존된 활성 부위 Ala167-Ser168-Gly169를 포함하고, 서열번호 4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 PAL 활성을 포함할뿐만 아니라 티로신 및/또는 히스티딘 기질에 대해서도 활성이다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 조작된 PAL 폴리펩티드의 생성을 촉진하는 조건 하에서 적어도 하나의 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 미생물을 배양하여 생성된다. 일부 실시형태에서, 이후에 조작된 PAL 폴리펩티드는 최종 배양 배지 및/또는 세포로부터 회수된다.

본 발명은 PAL 활성을 갖는 예시적인 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다. 실시예는 조작된 PAL 폴리펩티드의 기능적 활성과 특별한 아미노산 특징을 상관지은 서열 구조 정보를 표시한 표를 제공한다. 이러한 구조-기능 상관성 정보는 기준 서열번호 2의 조작된 폴리펩티드에 대한 특별한 아미노산 잔기 차이를 비롯하여, 예시적인 조작된 PAL 폴리펩티드에 대한 연관된 실험적으로 결정된 활성 데이타의 형태로 제공된다.

일부 실시형태에서, PAL 활성을 갖는 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 a) 기준 서열번호 2와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; b) 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열번호 2와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 포함하고, c) 기준 서열과 비교하여 i) 증강된 촉매 활성, ii) 감소된 단백질 가수분해 감도, iii) 감소된 응집성, iv) 고온에 대한 동결건조된 조제물로서 증가된 안정성, v) 이의 1차 구조에서 페닐알라닌 잔기의 감소된 개수, 또는 임의의 i), ii), iii), iv), 또는 v)의 조합으로부터 선택되는 개선된 특성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대, 서열번호 2 또는 서열번호 2와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20개 이상의 아미노산 위치)에서 서열번호 2와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 서열번호 2와 비교하여, 하나 이상의 위치에서 잔기 차이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 실시예에 제공된 표에 열거된 폴리펩티드이다.

일부 실시형태에서, PAL 활성을 갖는 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 a) 기준 서열 서열번호 4와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; b) 서열번호 4와 비교하여 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함하고; c) 기준 서열과 비교하여 i) 증강된 촉매 활성, ii) 감소된 단백질 가수분해 감도, iii) 감소된 응집성, iv) 고온에 대한 동결건조 조제물로서 증가된 안정성, v) 이의 1차 구조에서 페닐알라닌 잔기의 감수된 개수, 또는 임의의 i), ii), iii), iv), 또는 v)의 조합으로부터 선택되는 개선된 특성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20개 이상 아미노산 위치)에서 서열번호 4와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 서열번호 4와 비교하여, 하나 이상의 위치에서 잔기 차이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 실시예에 제공된 표에 열거된 폴리펩티드이다.

일부 실시형태에서, 개선된 특성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 아미노산 위치이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 16, 16/150, 44/239/495, 44/56, 44/56/102/239/285/469/470/495, 44/239, 44/239/285/470, 44/239/285/469/495, 44/239/285/470, 44/239/469/470, 44/239/470/546, 44/239/495/546, 44/469/470, 102, 102/470, 162, 162, 165, 188, 239/285/469, 239/285, 239/469/470/495, 264, 267, 267, 285/470, 285/469/470/495, 285/470/495, 364, 455, 469/470, 472, 및 482, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서, 서열번호 6과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 가지며, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은

으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 아미노산 위치이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 16, 264, 364, 및 472로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열번호 6과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 가지며, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 9에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 F16S, F264H, L364H, F472A, 및 F482N로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 아미노산 위치이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 16, 16/150, 162, 188, 264, 267, 398, 434, 472A/L/V, 및 F482C/N/S로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열번호 8과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 가지며, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환 F16A/E/K/L/M/N/P/R/S/T/V/W, F16K/F150A, F162M/Q/W, F188A/I/N, F264H, F267G/L/Q/S/V, F398H, F434V, F472A/L/V, 및 F482C/N/S로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 6에 대해 넘버링된다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 8과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 아미노산 위치이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 8과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및

으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 서열번호 8과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 가지며, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 8에 대해 넘버링된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은

로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 8에 대해 넘버링된다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 아미노산 위치이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및

로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 서열번호 12와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 가지며, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 12에 대해 넘버링되었다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은

로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 12에 대해 넘버링되었다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및 12로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드의 기능성 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 기능성 단편은 이것이 유래된 조작된 PAL 폴리펩티드 (즉, 조작된 부모 PAL)의 활성의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능성 단편은 조작된 PAL의 부모 서열의 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 포함한다. 일부 실시형태에서 기능성 단편은 5개 미만, 10개 미만, 15개 미만, 10개 미만, 25개 미만, 30개 미만, 35개 미만, 40개 미만, 45개 미만, 및 50개 미만의 아미노산이 절두된다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드의 기능성 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 기능성 단편은 이것이 유래된 조작된 PAL 폴리펩티드 (즉, 조작된 부모 PAL)의 활성의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능성 단편은 조작된 PAL의 부모 서열의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 일부 실시형태에서 기능성 단편은 5개 미만, 10개 미만, 15개 미만, 10개 미만, 25개 미만, 30개 미만, 35개 미만, 40개 미만, 45개 미만, 50개 미만, 55개 미만, 60개 미만, 65개 미만, 또는 70개 미만의 아미노산이 절두된다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 위치 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL은 서열번호 6과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치의 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12의 서열로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4, 또는 이의 기능성 단편과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 4와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL은 서열번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 4와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치의 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4의 서열로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6, 또는 이의 기능성 단편과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 6, 또는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 6과 비교하여 아미노산 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL은 서열번호 6과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 6과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치의 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6의 서열로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 8, 또는 이의 기능성 단편과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 8, 또는 서열번호 8과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 8과 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL은 서열번호 8과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 8과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치의 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 8의 서열로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 10, 또는 이의 기능성 단편과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 10, 또는 서열번호 10과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 10과 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL은 서열번호 10과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 10과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치의 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 10의 서열로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 12 또는 이의 기능성 단편과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 12, 또는 서열번호 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 12와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL은 서열번호 12와 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 12와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치의 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드 서열번호 12의 서열로 이루어진다.

단백질 가수분해에 대해 감소된 감도를 갖는 변이체 :

일부 실시형태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 PAL 활성을 갖고, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도를 나타내며, a) 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12의 기준 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산; b) 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여, 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도를 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20개 이상의 아미노산 위치)에서 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드의 단백질 가수분해 감도는 실질적으로 동일한 조건 하에서 기준 PAL 폴리펩티드와 비교하여 또는 야생형 PAL (예를 들어, 서열번호 2를 갖는 AvPAL)의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 만큼 감소된다. 단백질 가수분해 활성은 제한없이 실시예에 기술된 것을 포함하여, 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도를 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 기준 PAL 및 감소된 감도를 갖는 조작된 PAL 둘 모두를 실질적으로 동일한 조건 하에서 비교하고 본질적으로 동일한 양 및 종류의 프로테아제에 노출시켰을 때, 제한없이 펩신, 트립신, 키모트립신, 카복시펩티다제 A 및 B, 펩티다제 (예를 들어, 아미노 펩티다제, 디펩티다제 및 엔테로펩티다제)를 포함하는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물에 대해 감소된 감도를 갖는다.

일부 실시형태에서, 단백질 가수분해에 대해 감소된 감도를 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 기준 PAL (예를 들어, AvPAL)의 효소 활성의 약 1.0-배, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 25-배, 50-배, 75-배, 100-배, 150-배, 200-배 이상인 효소 활성 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 활성을 4.5 내지 7.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 4.5 내지 6.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 5.0 내지 7.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 5.0 내지 6.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 5.5 내지 7.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 및/또는 또한 활성을 5.5 내지 6.5의 pH 범위에서 측정한 경우, 기준 PAL과 비교하여, 더 많은 효소 활성을 갖는다. 일부 다른 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 1 μM 내지 5 mM 범위의 K_m 값을 갖는다.

고온 저장에 대해 증가된 내성을 갖는 변이체 :

일부 실시형태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 PAL 활성을 갖고, 고온에서 저장에 대해 더 내성이며, a) 기준 서열 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 이의 단편과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 b) 하나 이상의 아미노산 위치에서, 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12과 비교하여 아미노산 잔기 차이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 야생형 AvPAL 및/또는 다른 기준 폴리펩티드와 비교하여 고온에서 저장에 대해 증가된 내성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 4와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다.

일부 실시형태에서, 모든 다른 어세이 조건이 실질적으로 동일한 경우에, 기준 PAL 폴리펩티드와 비교하여 고온에서 저장에 대해 증가된 내성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 약 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃ 등의 온도에서 증가된 내성을 갖는다.

일부 실시형태에서, 고온에서 저장에 대해 증가된 내성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 또한 표준 어세이로 측정 시 기준 PAL과 비교하여 더 큰 PAL 활성을 나타낸다. 제한없이 본 명세서에 제공된 것을 포함하여, 임의의 적합한 어세이가 본 발명에서 사용된다.

소수의 페닐알라닌 잔기를 함유하는 변이체 :

일부 실시형태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 PAL 활성을 갖고, 이의 1차 서열 내에 감소된 개수의 페닐알라닌 잔기를 가지며, a) 기준 서열 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 b) 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 이의 1차 서열 내에 감소된 개수의 페닐알라닌 잔기를 함유하는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 하나 이상의 아미노산 위치 (예컨대 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12, 또는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20개 이상의 아미노산 위치)에서, 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다.

일부 실시형태에서, 이의 1차 서열 내에 감소된 개수의 페닐알라닌 잔기를 함유하는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 6의 아미노산 서열과 최적으로 정렬시, 16, 16/150, 162, 188, 264, 267, 398, 434, 472A/L/V, 및 F482C/N/S 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서, 서열번호 6과 비교하여 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시형태에서 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25개 이상의 아미노산 위치이다.

일부 실시형태에서, 이의 1차 서열 내에 감소된 개수의 페닐알라닌 잔기를 함유하는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 위치 F16, F150, F162, F188, F264, F267, F398, F434, F472, F482에서 아미노산 잔기 차이 및 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 잔기 차이는 F16A/E/K/L/M/N/P/R/S/T/V/W, F16K/F150A, F162M/Q/W, F188A/I/N, F264H, F267G/L/Q/S/V, F398H, F434V, F472A/L/V, 및 F482C/N/S로부터 선택되고, 여기서 아미노산 잔기는 서열번호 6에 대해 넘버링된다.

일부 실시형태에서, 야생형 PAL 보다 적은 페닐알라닌 잔기를 함유하는 조작된 PAL 폴리펩티드는 또한 실질적으로 동일한 조건 하에서 기준 PAL 폴리펩티드와 비교하거나 또는 야생형 PAL (예를 들어, 서열번호 2를 갖는 AvPAL)의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 만큼 감소된 단백질 가수분해 감도를 갖는다. 활성은 제한없이 실시예에 기술된 것을 포함하여, 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 그들 1차 서열 내에 야생형 PAL 보다 적게 페닐알라닌 잔기를 함유하는 조작된 PAL 폴리펩티드는 기준 PAL 및 감소된 페닐알라닌 함량을 갖는 조작된 PAL 둘 모두를 실질적으로 동일한 조건 하에서 비교하고 실질적으로 동일한 양 및 종류의 프로테아제에게 노출시킬 때 제한없이 펩신, 트립신, 키모트립신, 카복시펩티다제 A 및 B, 펩티다제 (예를 들어, 아미노 펩티다제, 디펩티다제 및 엔테로펩티다제)를 포함하는, 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물에 대해 감소된 감도를 갖는다.

일부 실시형태에서, 그들 1차 서열 내에 감소된 개수의 페닐알라닌 잔기를 함유하는 조작된 PAL 폴리펩티드는 기준 PAL (예를 들어, AvPAL)의 효소 활성의 약 1.0-배, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 25-배, 50-배, 75-배, 100-배, 150-배, 200-배 이상인 효소 활성 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 활성을 4.5 내지 7.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 4.5 내지 6.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 5.0 내지 7.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 5.0 내지 6.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 활성을 5.5 내지 7.5의 pH 범위에서 측정한 경우; 및/또는 또한 활성을 5.5 내지 6.5의 pH 범위에서 측정한 경우, 기준 PAL과 비교하여 더 많은 효소 활성을 갖는다. 일부 다른 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 1 μM 내지 5 mM 범위의 K_m 값을 갖는다.

임의의 예시된 조작된 폴리펩티드 (즉, 본 명세서에 기술되고 표에 제공된 모든 변이체)는 예를 들어, 본 명세서에 기술된 다른 폴리펩티드 및 다른 잔기 위치로부터의 다양한 아미노산 차이의 새로운 조합을 첨가하여 후속 진화 회차를 통해, 다른 조작된 PAL 폴리펩티드를 합성하기 위한 출발 아미노산 서열로서 사용된다는 것을 더욱 고려한다. 일부 실시형태에서, 추가의 개선은 초기의 진화 회차 전반에서 변화되지 않은 채로 유지된 잔기 위치에 아미노산 차이를 포함시켜 발생된다. 본 발명은 제한없이 본 명세서에 제공된 방법을 포함하여, 임의의 적합한 방법을 사용하므로, 조작된 PAL 폴리펩티드를 제조하기 위한 임의의 특정 방법에 국한하는 것을 의도하지 않는다.

조작된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주 세포 :

본 발명은 본 명세서에 기술된 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 생성시키도록 유전자 발현을 제어하는 하나 이상의 이종성 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드(들)를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 구성체는 상응하는 PAL 폴리펩티드(들)를 발현하도록 적절한 숙주 세포에 도입된다.

당업자에게 자명해 지는 바와 같이, 단백질 서열의 이용가능성 및 다양한 아미노산에 상응하는 코돈에 대한 지식은 대상 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드의 설명을 제공한다. 동일한 아미노산이 대안 또는 동의 코돈에 의해 코딩되는 유전자 코드의 축퇴성은 모드 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 엄청나게 많은 수의 핵산을 만들 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 가능한 코돈 선택을 기반으로 조합을 선택하여 본 명세서에 기술된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 만들 수 있는 PAL 폴리뉴클레오티드의 각각의 모든 가능한 변이의 생성을 위한 방법 및 조성물을 제공하고, 이러한 모든 변이는 실시예 (예를 들어, 다양한 표)에 제시된 아미노산 서열을 포함하여, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드에 대해 특별하게 개시된 것으로 간주되는 것이다.

일부 실시형태에서, 바람직하게 코돈은 단백질 생성을 위해 선택된 숙주 세포에 의한 활용성에 대해 최적화된다. 예를 들어, 박테리아에서 사용되는 바람직한 코돈이 전형적으로 박테리아에서의 발현에 사용된다. 결과적으로 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드는 전체 길이 코딩 영역에서 코돈 위치의 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과에서 바람직한 코돈을 함유한다.

일부 실시형태에서, PAL 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 특성을 갖는 PAL 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 3, 5, 7, 9, 및/또는 11로부터 선택되는 기준 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 임의 변이체의 아미노산 서열 (예를 들어, 실시예에 제공된 것들), 및 서열번호 3, 5, 7, 9, 및/또는 11의 기준 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 실시예에 개시된 바와 같은 변이체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 잔기 차이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 잔기 위치)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기준 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 및/또는 11로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, PAL 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 특성을 갖는 PAL 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 기준 서열 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교 하여 하나 이상의 잔기 차이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 5, 7, 9, 및/또는 11로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 5, 7, 9, 및/또는 11과 적어도 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 잔기 동일성을 갖는다.

일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 5, 7, 9, 및/또는 11로부터 선택되는 기준 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보체, 또는 본 명세서에서 제공하는 임의의 변이체 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 고엄격 조건 하에서 혼성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고엄격 조건 하에서 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PAL 폴리펩티드를 코딩한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에서 임의의 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 PAL 폴리펩티드의 발현을 촉진하기 위해 다양한 방식으로 조작된다. 일부 실시형태에서, PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 PAL 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위해 하나 이상의 제어 서열이 존재하는 발현 벡터를 포함한다. 벡터로 이의 삽입 전에 단리된 폴리뉴클레오티드의 조작은 이용되는 발현 벡터에 따라서 바람직하거나 또는 필수적일 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변형시키는 기술은 당분야에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 제어 서열은 특히 프로모터, 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결이자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적합한 프로모터는 숙주 세포 선택을 기반으로 선택된다. 박테리아 숙주 세포의 경우, 본 개시 내용의 핵산 구 성체의 전사를 지시하기 위해 적합한 프로모터는 제한없이 이. 콜라이 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜로 (Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자 (dagA), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자 (sacB), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자 (amyL), 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자 (amyQ), 바실러스 리체니포르미스 페니실리나제 유전자 (penP), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵생물 베타-락타마제 유전자 (예를 들어, Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75:3727-3731 [1978] 참조)로부터 수득된 프로모터를 비롯하여, tac 프로모터 (DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983] 참조)를 포함한다. 사상 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 프로모터는 제한없이 아스퍼질러스 오리자에 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나제, 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 아스파질러스 니거 산 안정성 알파-아밀라제, 아스파질러스 니거 또는 아스퍼질러스 아와모리 (Aspergillus awamori) 글루코아밀라제 (glaA), 리조무코르 미에헤이 리파제, 아스퍼질러스 오리자에 알칼리 프로테아제, 아스퍼질러스 오리자에 트리오스 포스페이트 이소머라제, 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 아세타미다제, 및 푸사리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제 (예를 들어, WO 96/00787 참조)에 대한 유전자로부터 수득된 프로모터를 비롯하여, NA2-tpi 프로모터 (아스퍼질러스 니거 중성 알파-아밀라제 및 아스퍼질러스 오리자에 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자 유래 프로모터의 하이브리드), 및 이의 돌연변이체, 절두체 및 하이브리드 프로모터를 포함한다. 예시적인 효모 세포 프로모터는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 에놀라제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 갈락토키나제 (GAL1), 사카로마이세스 세레비지아에 알콜 디히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (ADH2/GAP), 및 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터 유래될 수 있다. 효모 숙주 세포에 유용한 다른 프로모터는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992] 참조).

일부 실시형태에서, 제어 서열은 또한 적합한 전사 종결 서열 (즉, 전사를 종결하도록 숙주 세포가 인식하는 서열)이다. 일부 실시형태에서, 종결 서열은 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동적으로 연결된다. 선택한 숙주 세포에서 기능성인 임의의 적합한 종결인자가 본 발명에서 사용된다. 사상 진균 숙주 세포에 대한 예시적인 전사 종결인자는 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스퍼질러스 니거 알파-글루코시다제, 및 푸사리움 옥시스포럼 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포에 대한 예시적인 종결인자는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제, 사카로마이세스 세레비지아에 사이토크롬 C (CYC1), 및 사카로마이세스 세레비지아에 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다. 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 종결인자는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Romanos et al., 상동 참조).

일부 실시형태에서, 제어 서열은 또한 적합한 리더 서열 (즉, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비전사 영역)이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동적으로 연결된다. 선택 숙주 세포에서 기능성인 임의의 적합한 리더 서열이 본 발명에서 사용된다. 사상 균주 숙주 세포에 대한 예시적인 리더는 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 및 아스퍼질러스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포에 대해 적합한 리더는 사카로마이세스 세레비지아 에놀라제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비지아에 알콜 디히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 수득된다.

일부 실시형태에서, 제어 서열은 또한 폴리아데닐화 서열 (즉, 핵산 서열의 3' 말단에 작동적으로 연결되고, 전사 시에, 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 첨가하기 위한 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되는 서열)이다. 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 적합한 폴리아데닐화 서열이 본 발명에서 사용된다. 사상 진균 숙주 세포에 대한 예시적인 폴리아데닐화 서열은 제한없이 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 푸사리움 옥시스포럼 트립신-유사 프로테아제 및 아스퍼질러스 니거 알파-글루코시다제에 대한 유전자들을 포함한다. 효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 공지되어 있다 (예를 들어, Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995] 참조).

일부 실시형태에서, 제어 서열은 또한 신호 펩티드 (즉, 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하고 세포의 분비 경로로 코딩된 폴리펩티드를 지정하는 코딩 영역)이다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 본래 분리되는 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 절편과 번역 리딩 프레임으로 천연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 함유한다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 코딩 서열의 5' 말단은 코딩 서열에 대해 외래의 것인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유한다. 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 발현된 폴리펩티드를 지정하는 임의의 적합한 신호 펩티드 코딩 영역이 조작된 폴리펩티드(들)의 발현에 사용된다. 박테리아 숙주 세포에 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 제한없이 바실러스 NClB 11837 말로제닉 아밀라제, 바실러스 스테아로써모필러스 알파-아밀라제, 바실러스 리체니포르미스 서브틸리신, 바실러스 리체니포르미스 베타-락타마제, 바실러스 스테아로써모필러스 중성 프로테아제 (nprT, nprS, nprM), 및 바실러스 서브틸리스 prsA에 대한 유전자로부터 수득된 것들을 포함하는 신호 펩티드 코딩 영역이다. 추가의 신호 펩티드는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993] 참조). 일부 실시형태에서, 사상 진균 숙주 세포에 대한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 제한없이 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 중성 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나제, 후미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens) 셀룰라제 및 후미콜라 라누지노사 (Humicola lanuginosa) 리파제에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역을 포함한다. 효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 제한없이 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 인버타제에 대한 유전자 유래의 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치된 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역이다. 최종 폴리펩티드는 "프로효소", "프로폴리펩티드" 또는 "자이모겐"이라고 한다. 프로폴리펩티드는 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 제한없이 바실러스 서브틸리스 알칼리 프로테아제 (aprE), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제 (nprT), 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자, 리조무코어 미에헤이 아스파르트산 프로테이나제 및 마이셀리오프토라 써모필라 (Myceliophthora thermophila) 락타제에 대한 유전자를 포함하는, 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, WO 95/33836 참조). 신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 둘 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우에, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 옆에 위치되고 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 옆에 위치된다.

일부 실시형태에서, 조절 서열이 또한 이용된다. 이들 서열은 숙주 세포의 성장에 대해 폴리펩티드의 발현의 조절을 촉진한다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하여, 화학적 또는 물리적 자극에 대응하여 유전자의 발현을 켜거나 또는 끌수 있는 것들이다. 원핵생물 숙주 세포에서, 적합한 조절 서열은 제한없이 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모 숙주 세포에서, 적합한 조절 시스템은 제한없이 ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템을 포함한다. 사상 진균에서, 적합한 조절 서열은 제한없이 TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제 프로모터, 및 아스퍼질러스 오리자에 글루코아밀라제 프로모턱를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 도입되는 숙주의 유형에 따라서, 하나 이상의 발현 조절 영역 예컨대 프로모터 및 종결인자, 복제 기원 등을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 다양한 핵산 및 제어 서열은 하나 이상의 편리한 제한효소 부위를 포함하여 그러한 부위에서 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 삽입 또는 치환을 가능하게 하는 재조합 발현 벡터를 생성하도록 함께 연결된다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 핵산 서열은 발현을 위한 적절한 벡터로 핵산 서열 또는 서열을 포함하는 핵산 구성체를 삽입시켜 발현된다. 발현 벡터의 생성을 포함하는 일부 실시형태에서, 코딩 서열은 발현에 적절한 제어 서열과 코딩 서열이 작동적으로 연결되도록 벡터에 위치된다.

재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 절차를 수행할 수 있고 PAL 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 일으킬 수 있는 임의의 적합한 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터를 도입시키려는 숙주 세포와 벡터의 상용성에 의존적이다. 벡터는 선형일 수 있거나 또는 닫힌 원형 플라스미드일 수 있다.

일부 실시형태에서, 발현 벡터는 자가 복제 벡터 (즉, 염색체외 독립체로서 존재하고, 이의 복제는 염색체 복제와 독립적인 벡터, 예컨대 플라스미드, 염색체외 엘리먼트, 미니염색체 또는 인공 염색체)이다. 벡터는 자가-복제를 보장하기 위한 임의 수단을 함유할 수 있다. 일부 대안적인 실시형태에서, 벡터는 숙주 세포에 도입시, 게놈에 통합되어 그것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것이다. 뿐만 아니라, 일부 실시형태에서, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 게놈에 도입시키려는 전체 DNA를 함께 함유하는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드, 및/또는 트랜스포존이 이용된다.

일부 실시형태에서, 발현 벡터는 형질전환된 세포의 쉬운 선별을 가능케 하는 하나 이상의 선별 마커를 함유한다. "선별 마커"는 유전자이고, 이의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양요구체에 자가영양성 등을 제공한다. 박테리아 선별 마커의 예는 제한없이 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리체니포르미스 유래의 dal 유전자, 또는 항생제 내성 예컨대 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커를 포함한다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 제한없이 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3을 포함한다. 사상 진균 숙주 세포에서 사용을 위한 선별 마커는 제한없이 amdS (아세타미다제; 예를 들어 에이. 니둘란스 또는 에이. 오리자에 유래), argB (오르니틴 카바모일트랜스퍼라제), bar (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제; 예를 들어, 에스. 히그로스코피커스 (S. hygroscopicus) 유래), hph (히그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD (니트레이트 리덕타제), pyrG (오로티딘-5'-포스페이트 디카복실라제; 예를 들어, 에이. 니둘란스 또는 에이. 오리자에 유래), sC (술페이트 아데닐트랜스퍼라제), 및 trpC (안트라닐레이트 신타제)를 비롯하여, 이의 등가물을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 폴리뉴클레오티드(들)는 숙주 세포에서 조작된 PAL 효소(들)의 발현을 위해 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하는데 사용하기 위해 적합한 숙주 세포는 당분야에 충분히 공지되어 있고 제한없이 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 비브리오 플루비알리스 (Vibrio fluvialis), 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예컨대 효모 세포 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (ATCC 수탁 번호 201178)); 곤충 세포 예컨대 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포 예컨대 CHO, COS, BHK, 293, 및 바우스 골수종 세포; 및 식물 세포를 포함한다. 예시적인 숙주 세포는 또한 다양한 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 (예를 들어, W3110 (ΔfhuA) 및 BL21)를 포함한다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 방법은 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이, PAL 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 더 포함한다.

숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 성장 조건은 당분야에 충분히 공지되어 있다. PAL 폴리펩티드의 발현을 위해 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 임의의 적합한 방법이 본 발명에서 사용될 것이라는 것을 고려한다. 적합한 기술은 제한없이, 전기천공, 생물학적 입자 충격법, 리포솜 매개 형질감염법, 염화칼슘 형질감염법, 및 원형질체 융합법을 포함한다.

본 명세서에 개시된 특성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 천연 발생 또는 조작된 PAL 폴리펩티드를 토딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 당분야에 공지되고/되거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 적합한 돌연변이유발법 및/또는 지정 진화 방법을 수행하여 수득될 수 있다. 예시적인 지정 진환 기술은 돌연변이유발법 및/또는 DNA 셔플링이다 (예를 들어, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 및 미국 특허 제6,537,746호 참조). 사용할 수 있는 다른 지정 진화 방법은 특히 스태거드 확장 방법 (StEP), 시험관내 재조합 (예를 들어, Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998] 참조), 돌연변이유발성 PCR (예를 들어, Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994] 참조), 및 카세트 돌연변이유발법 (예를 들어, Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996] 참조)을 포함한다.

돌연변이유발법 및 지정 진화 방법은 발현, 스크리닝 및 어세이할 수 있는 변이체 라이브러리를 생성시키도록 PAL-코딩 폴리뉴클레오티드에 쉽게 적용될 수 있다. 임의의 적합한 돌연변이유발법 및 지정 진화 방법이 본 발명에서 사용되고 당분야에 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호, 제5,837,458, 제5,928,905호, 제6,096,548호, 제6,117,679호, 제6,132,970호, 제6,165,793호, 제6,180,406, 제6,251,674호, 제6,265,201호, 제6,277,638호, 제6,287,861호, 제6,287,862호, 제6,291,242호, 제6,297,053호, 제6,303,344호, 제6,309,883호, 제6,319,713호, 제6,319,714호, 제6,323,030호, 제6,326,204호, 제6,335,160호, 제6,335,198호, 제6,344,356호, 제6,352,859호, 제6,355,484호, 제6,358,740호, 제6,358,742호, 제6,365,377호, 제6,365,408호, 제6,368,861호, 제6,372,497호, 제6,337,186호, 제6,376,246호, 제6,379,964호, 제6,387,702호, 제6,391,552호, 제6,391,640호, 제6,395,547호, 제6,406,855호, 제6,406,910호, 제6,413,745호, 제6,413,774호, 제6,420,175호, 제6,423,542호, 제6,426,224호, 제6,436,675호, 제6,444,468호, 제6,455,253호, 제6,479,652호, 제6,482,647호, 제6,483,011호, 제6,484,105호, 제6,489,146, 제6,500,617호, 제6,500,639호, 제6,506,602호, 제6,506,603호, 제6,518,065호, 제6,519,065호, 제6,521,453호, 제6,528,311호, 제6,537,746호, 제6,573,098호, 제6,576,467호, 제6,579,678호, 제6,586,182호, 제6,602,986호, 제6,605,430호, 제6,613,514호, 제6,653,072호, 제6,686,515호, 제6,703,240호, 제6,716,631호, 제6,825,001호, 제6,902,922호, 제6,917,882호, 제6,946,296호, 제6,961,664호, 제6,995,017호, 제7,024,312호, 제7,058,515호, 제7,105,297호, 제7,148,054호, 제7,220,566호, 제7,288,375호, 제7,384,387호, 제7,421,347호, 제7,430,477호, 제7,462,469호, 제7,534,564호, 제7,620,500호, 제7,620,502호, 제7,629,170호, 제7,702,464호, 제7,747,391호, 제7,747,393호, 제7,751,986호, 제7,776,598호, 제7,783,428호, 제7,795,030호, 제7,853,410호, 제7,868,138호, 제7,783,428호, 제7,873,477호, 제7,873,499호, 제7,904,249호, 제7,957,912호, 제7,981,614호, 제8,014,961호, 제8,029,988호, 제8,048,674호, 제8,058,001호, 제8,076,138호, 제8,108,150호, 제8,170,806호, 제8,224,580호, 제8,377,681호, 제8,383,346호, 제8,457,903호, 제8,504,498호, 제8,589,085호, 제8,762,066호, 제8,768,871호, 제9,593,326호, 및 모든 관련 미국 및 미국 이외의 대응 특허; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; WO 2009/152336; 및 미국 공개 특허 출원 제2011/0082055호, 제2014/0005057호, 제2014/0214391호, 제2014/0221216호, 제2015/0133307호, 제2015/0134315호, 및 제2015/0050658호 참조; 이들 전부를 참조로 본 명세서에 편입시킴).

일부 실시형태에서, 돌연변이유발 처리 후에 수득된 효소 클론은 효소 조제물에 대해 정해진 온도 (또는 다른 어세이 조건)를 가하고 열처리 또는 다른 적합한 어세이 조건 후 잔존하는 효소의 활성량을 측정하여 스크리닝된다. 그리고 나서, PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 클론을 유전자로부터 단리하고, 서열분석하여 (있다면) 뉴클레오티드 서열 변화를 확인하고, 숙주 세포에서 효소를 발현시키는데 사용한다. 발현 라이브러리로부터 효소 활성의 측정은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법 (예를 들어, 표준 생화학 기술, 예컨대 HPLC 분석)을 사용해 수행할 수 있다.

기지 서열의 조작된 폴리펩티드의 경우, 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 합성 방법에 따라서 표준 고체상 방법으로 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최대 약 100개 염기의 단편을 개별적으로 합성하고, 그 다음으로 연결시켜 (예를 들어, 효소적 또는 화학적 결찰 방법, 또는 중합효소 매개 방법에 의함) 임의의 바람직한 연속 서열을 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 자동화 합성 방법에서 실시되는 바와 같이 고전적인 포스포르아미다이트 방법을 사용한 화학 합성으로 제조될 수 있다 (예를 들어, Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981]; 및 Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984] 참조). 포스포르아미다이트 방법에 따라서, 올리고뉴클레오티드가 합성된다 (예를 들어, 자동화 DNA 합성기에서, 정제, 어닐링, 결찰되어, 적절한 벡터에 클로닝됨).

따라서, 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법은 (a) 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 변이체의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계, 및 (b) 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 PAL 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 경우에 따라 하나 또는 몇개 (예를 들어, 최대 3개, 4개, 5개, 또는 최대 10개)의 아미노산 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 경우에 따라 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개, 1-6개, 1-7개, 1-8개, 1-9개, 1-10개, 1-15개, 1-20개, 1-21개, 1-22개, 1-23개, 1-24개, 1-25개, 1-30개, 1-35개, 1-40개, 1-45개, 또는 1-50개 아미노산 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 임의로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 치환은 보존성 또는 비보존성 치환이다.

발현되는 조작된 PAL 폴리펩티드는 제한없이 본 명세서에 기술된 어세이 및 조건을 포함하여, 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 임의의 바람직한 개선된 특성 또는 특성의 조합 (예를 들어, 활성, 선택성, 안정성, 산 내성, 프로테아제 감도 등)에 대해 평가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 숙주 세포에서 발현되는 임의의 조작된 PAL 폴리펩티드는 특히 리소자임 처리, 초음파 처리, 여과, 탈염, 초-원심분리 및 크로마토그래피를 포함하는 단백질 정제에 대해 충분히 공지된 기술 중 어느 하나 이상을 사용하여 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수된다.

PAL 폴리펩티드의 단리를 위한 크로마토그래피 기술은 특히 역상 크로마토그래피, 고성능 액상 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성-상호작용 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정한 효소를 정제하기 위한 조건은 순전하, 소수성, 친수성, 분자량, 분자 형상 등과 같은 인자들에 부분적으로 의존적이며, 당업자에게 자명하게 될 것이다. 일부 실시형태에서, 친화성 기술은 개선된 PAL 효소를 단리하는데 사용될 수 있다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해서, 관심 PAL 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 항체가 사용될 수 있다. 항체의 생성을 위해서, 제한없이, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함한 다양한 숙주 동물이 PAL 폴리펩티드 또는 이의 단편을 주사하여 면역화된다. 일부 실시형태에서, PAL 폴리펩티드 또는 단편은 측쇄 작용기 또는 측쇄 작용기에 부착된 링커를 통해서, BSA와 같은 적합한 담체에 부착된다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 조작된 PAL 폴리펩티드의 생성을 촉진하는 조건 하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 균주)를 배양하는 단계 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 조작된 PAL 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 숙주 세포에서 생성된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 하나를 초과하는 조작된 PAL 폴리펩티드를 생성한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 조작된 PAL 폴리펩티드의 생성을 허용하는 적합한 배양 조건 하에서 본 명세서에 제공된 바와 같은, 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12의 기준 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성, 및 서열번호 4, 6, 8, 10, 및/또는 12와 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기 차이를 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 박테리아 세포를 배양하는 단계, 및 경우에 따라 배양물 및/또는 배양된 박테리아 세포로부터 조작된 PAL 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 하나를 초과하는 조작된 PAL 폴리펩티드를 생성한다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드가 재조합 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수되면, 그들은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법(들)에 의해 더욱 정제된다. 일부 추가의 실시형태에서, 정제된 PAL 폴리펩티드는 다른 성분 및 화합물과 조합되어 상이한 적용분야 및 용도 (예를 들어, 약학 조성물)에 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 제제를 제공한다.

조성물 :

본 발명은 수많은 조성물에서 사용을 위해 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다. 이들 조성물은 제한없이 약학, 식품/영양 보충물, 식품, 사료 및 정제 화학 생산을 포함한, 많은 분야에서 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 조작된 PAL 변이체 및/또는 적어도 하나의 PAL 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식품 및/또는 사료를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 조작된 PAL 변이체를 포함하는 음료를 제공한다.

일부 실시형태에서, 식품, 사료 및/또는 영양/식이 보충물 중 조작된 PAL 변이체는 글리코실화된다. 뿐만 아니라, 조작된 PAL 변이체는 임의의 적합한 식용 효소 전달 매트릭스에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 변이체는 변이체의 섭취 시 동물의 소화관 내에서 PAL 변이체의 신속한 분산을 위해 디자인된 식용 효소 전달 매트릭스에 존재한다.

본 발명은 또한 정제 화학물 및 다른 산업적으로 중요한 화합물의 생산에서 사용에 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다 (예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2013/0340119호, 제2013/0005012호, 및 제2005/0260724호, 및 WO 2012/122333).

약학 및 다른 조성물:

본 발명은 약학 및 다른 조성물, 예컨대 식이/영양 보충물에서 사용에 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다.

투여 방식에 따라서, 본 발명에 따른 조작된 PAL의 치료적 유효량을 포함하는 이들 조성물은 고체, 반고체 또는 액체의 형태이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 다른 약학적으로 허용되는 성분 예컨대 희석제, 완충제, 부형제, 염, 유화제, 보존제, 안정화제, 충전제 및 다른 성분을 포함한다. 제제 및 투여에 대한 기술의 상세 사항은 당분야에서 충분히 공지되어 있고 문헌에 기술되어 있다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 경구 약학 조성물에서 사용을 위해 제제화된다. 제한없이, 알약, 정제, 겔 탭, 캡슐, 로젠지, 당의정, 분말, 연질 겔, 졸-겔, 겔, 에멀션, 임플란트, 팻치, 스프레이, 연고, 도찰제, 크림, 페이스트, 젤리, 페인트, 에어로졸, 츄잉검, 점활제, 스틱, 현탁제 (제한없이 오일-기반 현탁제, 수중유 에멀션 등 포함), 슬러리, 시럽, 제어 방출 제제, 좌제 등을 포함하는, 조작된 PAL 폴리펩티드를 전달하는데 사용을 위한 임의의 적합한 형태가 본 발명에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 주사에 적합한 형태 (즉, 주사가능한 제제)로 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 생체적합성 매트릭스 예컨대 실리카-기반 (예를 들어, 옥시실란) 졸-겔을 포함한, 졸-겔로 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 캡슐화된다. 일부 대안적인 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 나노구조체 (예를 들어, 나노튜브, 나노세관, 나노캡슐, 또는 미세캡슐, 미세구, 리포솜 등)에 캡슐화된다. 실제로, 본 발명은 임의의 특정한 전달 제제 및/또는 전달 수단에 국한하는 것을 의도하지 않는다. 조작된 PAL 폴리펩티드는 제한없이 비경구, 경구, 국소, 경피, 비내, 안내, 척추강내, 임플란트를 포함하는 당분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 투여하고자 한다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 글리코실화, PEG화 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 [PEG] 또는 활성화된 PEG 등에 의한 변형) 또는 다른 화합물에 의해 화학적으로 변형된다 (예를 들어, Ikeda, Amino Acids 29:283-287 [2005]; 미국 특허 제7,531,341호, 제7,534,595호, 제7,560,263호, 및 제7,53,653호; 미국 공개 특허 출원 제2013/0039898호, 제2012/0177722호 등 참조). 실제로, 본 발명은 임의의 특정한 전달 방법 및/또는 기전에 국한하는 것을 의도하지 않는다.

일부 추가의 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 매트릭스-안정화된 효소 결정을 포함하는 제제로 제공된다. 일부 실시형태에서, 제제는 가교된 결정질의 조작된 PAL 효소 및 효소 결정에 부착되는 반응성 모이어티를 갖는 중합체를 포함한다. 본 발명은 또한 중합체에 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 제한없이 당류 (예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨, 및/또는 솔비톨), 전분 (예를 들어, 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 다른 식물 전분), 셀룰로스 (예를 들어, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시-메틸셀룰로스), 검 (예를 들어, 아라빅, 트라가칸트, 구아르 등), 및/또는 단백질 (예를 들어, 젤라틴, 콜라겐 등)을 포함하는, 하나 이상의 통상적으로 사용되는 담체 화합물을 포함한다. 경구 제제 중 추가의 성분은 착색제 및 또는 감미제 (예를 들어, 포도당, 수크로스 및 만니톨) 및 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트)를 비롯하여 장용성 제피 (예를 들어, 메타크릴레이트 중합체, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트, 및/또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 장용성 제피)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 붕해제 또는 가용화제 (예를 들어, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 나트륨 알기네이트)가 포함된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 특히 액상 제제 중에서, 제한없이 보존제, 현탁제, 증점제, 습윤제, 알콜, 지방산, 및/또는 유화제를 포함한, 다양한 추가 성분과 조합된다.

일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 특히 액상 제제 중에서, 제한없이 보존제, 현탁제, 증점제, 습윤제, 알콜, 지방산, 및/또는 유화제를 포함한, 다양한 추가 성분과 조합된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 제한없이 KUVAN^® 테트라히드로비옵테린 (BioMarin Pharmaceutical, Inc., Novato, CA), 제산제 (예를 들어, 오메프라졸, 에소메프라졸 및 다른 프라졸)를 비롯하여, 임의의 다른 적합한 화합물을 포함하는, PKU의 치료에서 사용되는 다른 화합물과 조합되어 대상체에게 투여된다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 유체 예컨대 혈액, 뇌척수액 등에서 페닐알라닌의 농도를 감소시키는데 사용하기 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다. 혈액 페닐알라닌 수준이 상승된 환자에게 투여되는 조작된 PAL 폴리펩티드(들)의 용량은 환자의 유전자형, 환자의 전신 상태, 및 당분야에 공지된 다른 인자들에 따라 좌우된다. 일부 실시형태에서, 상승된 혈액 페닐알라닌 수준이 상승된 PKU는 360 uM 을 초과하는 혈중 페닐알라닌 농도를 갖는다. 그러나, 본 발명은 더 낮은 페닐알라닌 혈중 농도를 갖는 환자에서 사용되므로, 360 uM 초과의 혈중 페닐알라닌 농도를 갖는 환자의 투여에 국한하는 것을 의도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 환자에게 단일 투여 또는 반복 투여가 의도된다. 일부 실시형태에서, 환자에게 투여되는 조성물(들) 중 조작된 PAL 폴리펩티드(들)의 농도는 질환의 증상 (예를 들어, PKU 및/또는 PKU-관련 병태, 질환 및/또는 증상)을 효과적으로 치료, 호전 및/또는 예방시키는데 충분한 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 다른 약학 및/또는 식이 조성물과 조합하여 투여된다.

일부 실시형태에서, PAL 효소는 티로신 물질대사 장애, 예컨대 I형, 티로신혈증, II형 티로신혈증, III형 티로신혈증, 및 알캅톤뇨증의 치료를 위한 치료적 단백질로서 사용된다. 티로신 물질대사의 이들 장애는 티로신의 분해에 관여되는 효소 중 하나가 상응하는 유전자 내 돌연변이로 인해 부분적으로 기능성이거나 또는 비기능성인 상염색체 물질대사 유전 장애이다. 이러한 기능의 결여는 그 결과로 혈류 중 티로신 및 다른 티로신-대사산물의 수준을 상승시킨다. 티로신은 페닐알라닌으로부터 유도되기 때문에, 페닐알라닌 및 티로신 섭취를 제한하는 것이 티로신 물질대사 장애를 갖는 환자에게 유리하다. 따라서 PAL 효소는 티로신 물질대사의 장애에 대한 잠재적 치료이다.

티로신 물질대사 장애를 갖는 환자를 초기에 치료하지 않으면, 티로신 및 이의 분해 산물 일부의 높은 수준이 간부전 및 신부전, 간암, 지적 장애, 및 심지어 사망을 포함한 심각한 의학적 문제를 초래할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 티로신혈증 및 알캅톤뇨증 환자의 유체 예컨대 혈액, 뇌척수액 등에서 페닐알라닌의 농도를 감소시키는데 사용하기 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다. 혈액 티로신 수준이 상승된 환자에게 투여되는 조작된 PAL 폴리펩티드(들)의 용량은 환자의 유전자형, 환자의 전신 상태, 및 당분야에 공지된 다른 인자들에 따라 좌우된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 티로신혈증 또는 알캅톤뇨증 환자에게 단일 또는 반복 투여가 의도된다. 일부 실시형태에서, 환자에게 투여되는 조성물(들) 중 조작된 PAL 폴리펩티드(들)의 농도는 질환의 증상 (예를 들어, I형, II형, 또는 III형 티로신혈증, 또는 알캅톤뇨증, 질환 및/또는 증상)을 효과적으로 치료, 호전 및/또는 예방시키는데 충분하다고 간주된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 니티시논 또는 다른 약학 및/또는 식이 조성물과 조합하여 티로신혈증 및 알캅톤뇨증 환자에게 투여된다.

산업적 조성물:

본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 산업적 조성물에서 사용하게 되는 것을 고려한다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 식품 및/또는 사료 산업에서 사용을 위해 제제화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 동물 사료 성분 예컨대 추가 효소 (예를 들어, 셀룰라제, 라카제 및 아밀라제)와 혼합되는 과립화 또는 펠렛화 생성물로 제제화된다. 일부 대안적인 실시형태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 액상 동물 사료 조성물 (예를 들어, 수성 또는 오일 기반 슬러리)에서 사용된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 조작된 PAL 변이체는 펠렛 및 다른 가공 사료/식품을 생성시키는데 사용되는 치료를 견디도록 충분히 열내성 및 열안정성이다.

본 발명의 조작된 PAL 변이체는 또한 페닐알라닌 및/또는 페닐알라닌 유도체의 생성에서 사용된다.

본 발명의 전술한 측면 및 다른 양상은 하기 비제한적인 실시예와 함께 더욱 이해될 수 있다. 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공되며 임의 방식으로 본 발명의 범주를 한정하려는 의도가 아니다.

실험

실험 및 획득된 결과를 포함한 하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 해석하려는 것이 아니다.

하기 실험 개시 내용에서, 하기의 약어가 적용된다: ppm (백만분율); M (몰 농도); mM (밀리 몰농도), uM 및 μM (마이크로 몰농도); nM (나노 몰농도); mol (몰수); gm 및 g (그램); mg (밀리그램); ug 및 ㎍ (마이크로그램); L 및 l (리터); ml 및 mL (밀리리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); um 및 ㎛ (마이크로미터); sec. (초); min(s) (분(들)); h(s) 및 hr(s) (시간(들)); U (유닛); MW (분자량); rpm (분당 회전수); psi 및 PSI (평방 인치 당 파운드); ℃ (섭씨 온도); RT 및 rt (실온); CDS (코딩 서열); DNA (데옥시리보핵산); RNA (리보핵산); AUC (곡선 하 면적); E. coli W3110 (Coli Genetic Stock Center [CGSC] (New Haven, CT)에서 입수가능한 통상적으로 사용되는 실험실 이. 콜라이 균주); HTP (고처리량); HPLC (고압 액상 크로마토그래피); CFSE (카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르); IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드); PES (폴리에테르술폰); PHE 및 phe (페닐알라닌); BSA (소 혈청 알부민); PBMC (말초 혈액 단핵 세포); PKU (페닐케톤뇨증); MHC (주요 조직적합성 복합체); HLA (인간 백혈구 항원); HLA-DR (염색체 #6 상의 HLA 복합체에 의해 코딩되는 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체); FIOPC (양성 대조군 대비 배수 개선 (fold improvements over positive control)); LB (루리아 (Luria) 액체 배지); Athens Research (Athens Research Technology, Athens, GA); ProSpec (ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Ram Scientific (Ram Scientific, Inc., Yonkers, NY); Pall Corp. (Pall, Corp., Pt. Washington, NY); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Molecular Devices (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Kuhner (Adolf Kuhner, AG, Basel, Switzerland); Biospringer (Biospringer North America, Milwaukee, WI); Cambridge Isotope Laboratories, (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, part of Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (part of Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); Constant Systems (Constant Systems Ltd., Daventry, United Kingdom); Megazyme (Megazyme International, Wicklow, Ireland); Enzo (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY); GE Healthcare (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ); Harlan (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN); AB Sciex (AB Sciex, Framingham, MA); PetAg Inc. (PetAg, Hampshire, IL); 및 Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

하기의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 본 발명에서 사용된다. 일부 경우 (하기 표시된 바와 같음)에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 코딩되는 폴리펩티드가 후속된다.

WT AvPAL의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열번호 1):

WT AvPAL의 폴리펩티드 서열 (서열번호 2):

변이체 #1의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열번호 3)

변이체 #1의 폴리펩티드 서열 (서열번호 4)

실시예 1

PAL 유전자 획득 및 발현 벡터의 구축

아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제 (AvPAL) 유전자 서열은 이. 콜라이에서 최적 발현을 위한 코돈으로 디자인되었고 이. 콜라이 발현 벡터pET16b에 클로닝되어 pET16b-AvPAL을 제공하였고 미국 특허 제9,611,468호의 실시예 1에 기술된 대로 서브클로닝하였다. 플라스미드 구성체는 W3110으로부터 유래된 이. 콜라이 균주에 형질전환시켰다. 일반적으로 당업자에게 공지된 지정 진화 기술이 이러한 플라스미드 구성체 (예를 들어, 미국 특허 제8,383,346호, 및 WO2010/144103 참조)를 비롯하여, AvPAL 유도체로부터 유전자 변이체의 라이브러리를 생성시키는데 사용되었다. 일부 실시형태에서, 항미생물 내성 마커가 결여된 발현 벡터가 사용된다.

실시예 2

고처리량 (HTP) 성장 및 어세이

PAL 및 PAL 변이체의 고처리량 (HTP) 성장

형질전환된 이. 콜라이 세포는 1% 포도당 및 30 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 프레이팅하여 선별하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션 후, 콜로니는 1% 포도당 및 30 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 180 μl/웰의 LB가 충전된 96-웰 얕은 편평 바닥 플레이트 (NUNC™, Thermo-Scientific)의 웰에 위치시켰다. 배양물은 진탕기 (200 rpm, 30℃, 및 85% 상대 습도; Kuhner)에서 18 내지 20시간 동안 밤새 성장될 수 있게 하였다.

밤샘 성장 샘플 (20 μL)을 30 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 380 μL Terrific 액체 배지가 충전된 Costar 96-웰 딥 플레이트로 옮겼다. 플레이트는 진탕기 (250 rpm, 30℃, 및 85% 상대 습도; Kuhner)에서 135분 동안 인큐베이션시켰다. 다음으로 세포를 멸균수 중 40 μL의 10 mM IPTG로 유도시켰고 진탕기 (250 rpm, 30℃, 및 85% 상대 습도; Kuhner)에서 20 내지 24시간 동안 밤새 인큐베이션시켰다. 세포를 펠렛화시켰고 (4000 rpm x 20분), 상등액을 버리고 세포를 분석 전에 -80℃에서 냉동시켰다.

HTP 펠렛의 용해

먼저, 500 μL의 용해 완충액 (20 mM 인산나트륨 pH 8, 150 mM NaCl, 1 mg/ml 리소자임, 및 0.5 mg/ml 폴리믹신 B 술페이트)을 세포 펠렛에 첨가하였다. 혼합물을 1.5 내지 2시간 동안 실온에서 교반시켰고, 본 명세서에 기술된 다양한 HTP 어세이에서 청정 용해물의 사용 전에 원심분리시켰다 (4000 rpm x 5분). SDS-PAGE에 의한 이들 용해물의 분석은 PAL의 예상 MW와 일관되게, ∼60 kDa의 겉보기 MW에서 과발현된 단백질의 존재를 밝혀주었다.

청정 용해물의 분석

PAL 변이체 활성은 시간 경과에 따라 290 nm에서의 흡광도 변화에 의해 신남산의 형성을 측정하여 결정되었다. 이러한 어세이를 위해서, 100 μL의 200 mM Tris/50 mM 페닐알라닌, pH 7.5, 또는 200 mM 인산나트륨/50 mM 페닐알라닌 pH 7.0, 80 μL의 물, 및 20 μL의 투명한 청정 용해물을 폴리아크릴레이트 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Costar #3635, Corning)의 웰에 첨가하였다. 반응물을 잠시 혼합하였고 활성은 SpectraMax^® Plus 384 또는 SpectraMax^® 190 (Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과 (5-20분 동안 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서의 흡광도를 추적하여 결정하였다.

프로테아제로 전처리된 청정 용해물의 HTP-분석

PAL 변이체의 활성은 장관 (예를 들어, 상부 장)의 환경을 모의하기 위해 키모트립신 및 티립신과 인큐베이션 후에 결정하였다. 먼저, 30 μL의 프로테아제 믹스 (0.01 - 100 mg/ml 키모트립신 (C4129 Sigma Aldrich), 0.01 -100 mg/ml 트립신 (T7409 Sigma Aldrich), 1 mM CaCl₂, 및 1 mM HCl), 500 mM 인산나트륨 pH 7.0 중 0-30 μL의 20 mM 나트륨 타우로콜레이트, 및 90-120 μL의 청정 용해물을 96-웰 둥근 바닥 마이크로타이터 플레이트 (Costar #3798, Corning)의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하였고 분석 전에 1시간 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션하였다 (Thermotron^® 진탕기 HT Infors AJ185, 400 rpm, 1" 쓰로우). 어세이를 위해서, 100 μL의 200 mM Tris/50 mM 페닐알라닌 pH 7.5, 또는 200 mM 인산나트륨/50 mM 페닐알라닌 pH 7.0 및 100 μL의 프로테아제 처치된 용해물을 폴리아크릴레이트 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Costar #3635, Corning)의 웰에 첨가하였다. 반응물을 잠시 혼합하였고 활성은 SpectraMax^® Plus 384 또는 SpectraMax^® 190 (Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과에 따라 (5-20분 동안 12-20초 마다) 290 nm에서의 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과는 하기 표에 제공된다.

고온 저장 후 PAL 변이체의 HTP-분석

고처리량으로 성장된 PAL 변이체의 용해물은 1시간 동안 65℃에서 인큐베이션되었고 불용성 물질을 펠렛화하였다 (4000 rpm x 10분). 상등액은 새로운 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (NUNC™, Thermo-Scientific)로 옮기고, 냉동시키고 건조 분말로 동결건조시켰다. 동결건조된 효소는 최대 10일 동안 Thermotron^® HT 진탕기 (Infors AJ185)에 45℃에서 인큐베이션시켰다. 후속하여 동결건조된 효소는 400 μL의 ddH₂O에 재현탁시켰고 10분 동안 교반하여 혼합하였다. 어세이를 위해서, 100 μL의 200 mM 인산나트륨/50 mM 페닐알라닌 pH 7.0, 80 μL의 ddH₂O 및 20 μL의 효소 현탁액을 폴리아크릴레이트 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Costar #3635, Corning)의 웰에 첨가하였다. 반응물을 잠시 혼합하였고 활성은 SpectraMax^® Plus 384 또는 SpectraMax^® 190 (Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과에 따라 (5-20분 동안 12-20초 마다) 290 nm에서의 흡광도에 따라서 결정하였다.

실시예 3

진탕 플라스크 (SF) 배양 유래 동결건조 용해물

상기 실시예 2에서 기술된 바와 같이 성장된 선별된 HTP 배양물은 1% 포도당 및 30 μg/ml 클로람페니콜이 존재하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하였고 밤새 37℃에서 성장시켰다. 각 배양 유래의 단일 콜로니를 1% 포도당 및 30 μg/ml 클로람페니콜이 존재하는 50 ml의 루리아 버타니 배지로 옮겼다. 배양물을 18시간 동안 30℃, 250 rpm에서 성장시켰고, 대략 1:10의 희석물을 30 μg/ml의 클로람페니콜이 있는 250 ml의 액체 배지에서 0.2의 최종 OD600 까지 계대배양하였다. 배양물을 0.6의 OD600까지 135분 동안 30℃, 250 rpm에서 인큐베이션시켰고, 1 mM의 IPTG로 유도시켰다. 유도된 배양물을 20시간 동안 30℃, 250 rpm에서 인큐베이션시켰다. 이러한 인큐베이션 기간 이후에, 배양물을 4000 rpm x 10분에서 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 펠렛을 30 ml의 20 mM 인산나트륨 pH 8, 150 mM NaCl에 재현탁시켰다. 세포를 2860*g에서 10분 동안 펠렛화하였고, 12 ml의 50 mM 인산나트륨 pH 7.5에 재현탁시켰으며, 원 샷 (One Shot) 세포 파괴 시스템 (Constant Systems)을 사용하여 17,000 psi에서 용해시켰다. 용해물을 펠렛화하였고 (10,000 rpm x 30분), 상등액을 냉동시키고 동결건조하여 효소 분말을 생성시켰다.

진탕 플라스트 배양으로부터 PAL의 정제

선별된 변이체를 상기 기술된 대로 포화까지 진탕 플라스크 배양으로 성장시켰다. 포화된 배양물을 원심분리 (4000 rpm x 20분)에 의해 펠렛화시켰고 세포 펠렛을 정제 전에 -80℃에서 저장하였다. 세포 펠렛을 실온에서 해동시키고 세포 g 당 5 mL의 완충액으로 20 mM 인산나트륨 pH 8, 150 mM NaCl에 재현탁시켰다. 샘플 슬러리는 110 psi의 압력 설정에서 미세유동기를 사용해 용해시켰다. 최종 용해물은 1시간 동안 10,000 rpm에서 원심분리시킨 후, 0.2 μm PES 필터 (Millipore)를 통해 여과시켜 청정화시켰다.

여과 후, 최종 용해물은 10 mM 페닐알라닌의 존재 또는 부재 하에서 1.5-2시간 동안 55-65℃에서 가열하였다. 용해물은 가열로부터 제거하였고 1시간 동안 10,000 rpm 및 4℃에서 원심분리에 의해 청정화시켰다. 가용성 PAL을 함유하는 상등액은 0.2 μm PES 필터를 통해서 여과시켰다.

대규모 결정화는 미립자 무함유 용액으로 수행하였다. 여과된 농축물 및 반-용매 (0.1M HEPES, 0.2M NaCl pH 7.5 25% (w/v) PEG 3350)는 개별적으로 40℃로 가열하였다. 반용매는 운점이 지속될 때까지 소량의 증분량으로 서서히 첨가되었다. 접촉 씨딩은 이의 운점에 도달한 후에 용액에 소량의 현존 결정을 첨가하여 획득되었다 (이러한 단계는 필수적이지 않음). 용액은 6시간 동안 40℃에서 4℃로 선형으로 냉각시켰다. 주기적으로 현탁액을 조심스럽게 혼합하여 고체를 재현탁시켰다. 현탁액은 12 내지 24시간 동안 4℃에서 유지시켰다. 액체는 버려서 안정적인 결정은 유지시켰다. 결정질 고체는 물로 세척하여 잔류 PEG를 제거하였다. 세척된 결정은 밤새 동결건조에 의해 건조시켰다.

실시예 4

정제된 PAL 및 PAL 변이체의 특징규명

이러한 실시예에서, 야생형 및 변이체 PAL을 특징규명하기 위해 수행된 어세이가 기술된다.

저장 조건에 대한 내성

동결건조된 효소 변이체는 Thermotron^® HT shaker (Infors AJ185) 중에 45℃에서 1일, 5일, 7일, 또는 10일 동안 인큐베이션시켰다. 동결건조된 효소는 400μL의 ddH₂O에 재현탁시켰고 10분 동안 교반에 의해 가용화시켰다. 어세이를 위해, 100 μL의 200 mM 인산나트륨/50 mM 페닐알라닌 pH 7.0, 80 μL의 ddH₂O 및 20 μL의 재현탁물을 폴리아크릴레이트 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Costar #3635, Corning)의 웰에 첨가하였다. 반응물을 잠시 혼합하였고 활성은 SpectraMax^® Plus 384 또는 SpectraMax^® 190 (Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과에 따라 (5-20분 동안 12-20초 마다) 290 nm에서의 흡광도를 추적하여 결정하였다.

장액에 대한 내성

실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된 PAL 변이체 샘플은 모의된 장액 중에 2 g/L로 용해시켰다. PAL 변이체는 4가지 모의된 장액 각각에 용해시켰다: 단식 상태 모의된 장액 (나트륨 타우로콜레이트 3 mM, 레시틴 0.2 mM, 말레산 19.12 mM, 수산화나트륨 34.8 mM, 염화나트륨 68.62 mM, pH 6.5), 초기 급식 상태 모의된 장액 (나트륨 타우로콜레이트 10 mM, 레시틴 3 mM, 말레산 28.6 mM, 수산화나트륨 52.5 mM, 염화나트륨 145.2, 글리세릴 모노콜레이트 6.5 mM, 나트륨 올레에이트 40 mM pH, 6.5), 중기 급식 상태 모의된 장액 (나트륨 타우로콜레이트 7.5 mM, 레시틴 2 mM, 말레산 44 mM, 수산화나트륨 65.3 mM, 염화나트륨 122.8 mM 글리세릴 모노콜레이트 5 mM, 나트륨 올레에이트 30 mM pH 5.8), 후기 급식 상태 모의된 장액 (나트륨 타우로콜레이트 4.5 mM, 레시틴 0.5 mM, 말레산 58.09 mM, 수산화나트륨 72 mM, 염화나트륨 51 mM, 글리세릴 모노콜레이트 1 mM, 나트륨 올레에이트 0.8 mM, pH 5.4). 돼지 트립신 및 소 키모트립신 (각각 100 mg)을 2 ml의 100 mM 인산나트륨 pH 7.0에 용해시켰고, 1.5 mg/mL로 각각의 모의된 유체에 희석하였다. 효소 활성은 트립신 및 키모트립신 존재 및 부재 하에서, 시간 경과에 따라 각각의 모의된 유체 중에서 측정되었다. 반응 혼합물은 37℃에서 1-24시간 동안 Thermotron^® HT 진탕기 (Infors AJ185) 중에 400 rpm (1" 쓰로우)에서 인큐베이션시켰다. 다음으로, 20 μL의 반응물을 80 μL의 물 및 100 μL의 100 mM 인산나트륨, 50 mM 페닐알라닌 pH 7.0과 혼합하였다. 각각의 용액을 잠시 혼합하였고, 활성은 SpectraMax^® Plus 384 또는 SpectraMax^® 190 (Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과에 따라 (5-20분 동안 12-20초 마다) 290 nm에서의 흡광도를 추적하여 결정하였다.

실시예 5

발효 및 결정화에 의한 PAL 변이체의 생성

발효 뱃치 배지 ((NH₄)₂SO₄ 0.52 g/L, 나트륨 시트레이트 이수화물 0.59 g/L, K₂HPO₄.3H₂O 7.5 g/L, KH₂PO₄ 3.7 g/L,　 효모 추출물 (Biospringer) 2.0 g/L, 폴리프로필렌 글리콜 (PPG 2000) 0.3 ml/L, 암모늄 철 (III) 시트레이트 0.05 g/L, 미량 원소 스톡 용액 5.0 ml/L (CaCl₂·H₂O 2.0 g/L. ZnSO₄·H₂O 2.2 g/L, MnSO₄·H₂O 0.5 g/L, CuSO₄·H₂O 1.0 g/L, (NH₄)₆ Mo₇O₂₄·H₂O 0.1 g/L, Na₂B₄O₇·0H₂O 0.02 g/L, H₂SO₄ 로 pH 2-3까지 조정)는 대략 10 g/L의 초기 농도로 포도당을 보충하였다. 인큐베이션 후에, 배양을 37℃ 및 45% 이상의 용존 산소 수준으로 제어하였다. 유가식 공급 (포도당 일수화물 500 g/L 및 마그네슘 술페이트, 무수물 5.1 g/L)은 7.00 내지 7.05의 설정점에서 pH의 스파이크로 표시되는 뱃치 포도당의 고갈 후 개시되었다. 포도당 공급은 0.41 ml/분의 속도로 시작되었고 12시간 동안 대수기 프로파일을 사용하여 2.42 ml/분의 최종 공급 속도까지 증가시켰다. 그 다음으로 공급은 발효의 나머지 동안 2.42 ml/분의 일정한 속도로 유지시켰다.

공급 용액의 0.94 L의 누적 부피가 발효기로 공급되면, 온도가 30℃로 감소되었고, PAL 변이체의 발현은 1 mM의 농도까지 IPTG의 첨가에 의해 유도시켰다. 3.84 L의 총 공급 부피가 발효기로 전달되면 발현기를 종료시켰다. 총 유도 시간은 대략 20시간이었다.

세포는 원심분리 (3752 xg)를 통해서 10분 동안 수확하였고 펠렛을 직접 사용하거나 또는 냉동 저장하였다. 20 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl pH 8.0으로 이루어진 차가운 완충액 (4℃)을 사용하여 본래 수확 부피로 펠렛을 재현탁시켰다. 재현탁 과정 동안, pH는 8.0 ± 0.2까지 NaOH를 사용해 조정하였다. 현탁액은 균질화 전에 6℃ 까지 냉각시켰다. 세포내 효소는 11,500 ± 500 psig에서 적절한 세포 파괴 밸브로 맞춰진 고압 균질기 (APV 1000)를 사용해 세포로부터 방출되었다. 세포 파괴 직후에, 균질물은 15 ± 2℃로 냉각시켰고 균질물의 pH는 NaOH를 사용하여 8.0 ± 0.2로 조정하였다. 10% w/v SuperFloc C581은 세포 균질물에 첨가하였다. 첨가 동안, 균질물 및 C581 혼합물은 완전한 혼합을 보장하도록 교반시켰다. 현탁액은 교반하면서 30분 동안 10 ± 2℃에서 인큐베이션시킨 후에, 55℃ ± 2℃로 가열하였고 1시간 동안 55℃에서 유지시켰다. 열-처리된 현탁액을 10 ± 2℃로 냉각시켰다. 액체 분획으로부터 고체의 분리는 원심분리에 의해 수행하였다. 균질물은 35분 동안 5050xg에서 원심분리시켰다. 농축 단계는 30 g/L 내지 40 g/L의 단백질 농도를 얻도록 수행하였다. 농축된 청정된 용해물은 20 mM 인산나트륨/150 mM NaCl pH 8.0의 2 부피로 투석여과되었다. 용액의 농도 및 완충액 교환은 TangenX 30kD PES NovaSet™-LS 카세트로 수행하였다. 농축물은 PES 막이 구비된 0.2 ㎛ Nalgene™ Rapid-Flow™ 일회용 필터 유닛을 통해 필터-멸균되었다.

여과된 농축물 및 반-용매 (0.1 M HEPES, 0.2 M NaCl pH 7.5 25% (w/v) PEG 3350)는 개별적으로 40℃로 가열하였다. 반-용매는 운점이 지속될 때까지 PAL 변이체 농축물에 서서히 첨가되었다. 접촉 씨딩은 운점에 도달한 후에 용액에 소량의 결정을 첨가하여 획득되었다. 용액은 주기적으로 조심스럽게 혼합하면서 6시간 동안 40℃에서 4℃로 선형적으로 냉각되었다. 현탁액은 12시간 내지 24시간 동안 4℃에서 유지시켰다. 액체를 버리고 결정질 고체를 물로 세척하여 잔류 PEG를 제거하였다. 다음으로 세척된 결정질 고체는 밤새 동결건조로 건조시켰다.

실시예 6

스크리닝 결과

변이체 #1의 서열에 도입된 추가적인 F450A 돌연변이를 갖는 변이체 #2 (서열번호 6)를 포함하여, 서열번호 4의 변이체 ("변이체 #1)를 생성시켰다. 변이체는 또한 출발 골격으로서 변이체 #2를 사용하여 또한 생성되었다. 이들 변이체는 실시예 2에 기술된 바와 같이 0일 또는 10일 동안 45℃에서 동결건조된 형태로 인큐베이션 후에 PAL 활성에 대해 시험되었다. 또한, 페닐알라닌 잔기의 돌연변이를 갖는 변이체는 0일에만 시험되었다. 양성 대조군 대비 상응하는 배수 개선 (FIOP)을 갖는 활성 변이체의 재시험 데이타는 하기 표 6.1에 표시되어 있다. 이러한 데이타 세트에서 양성 대조군은 변이체 #2이다.

상기 표에서, 활성 배수 개선 (FIOP)은 골격 서열번호 6 (변이체 #2)과 비교하였고, 다음과 같이 정의된다: "-" = 0.2-배 미만 활성; "+" = 0.2-배 초과지만, 1-배 미만 활성; "++" = 1-배 초과지만, 1.25-배 미만으로 증가된 활성; "+++" = 1.25배 초과지만, 1.5-배 미만으로 증가된 활성; 및 "++++" = 1.5-배 초과 활성.

실시예 7

히트수 확인

상기 표 6.1에 표시된 결과를 기반으로, 표 7.1 (하기)에 열거된 변이체의 활성을 실시예 3의 설명에 따라 제조된 효소 샘플에 대해 확인하였다.

상기 표에서, 활성 배수 개선 (FIOP)은 골격 서열번호 6 (변이체 #2)과 비교하였고, 다음과 같이 정의된다: "+" = 0.95-배 초과이지만, 1-배 미만으로 증가된 활성; "++" = 1-배 초과지만, 1.25-배 미만으로 증가된 활성; 및 "+++" = 1.25-배 초과로 증가된 활성.

실시예 8

추가 변이체에 대한 스크리닝 결과

실시예 6에 기술된 바와 같이 동정된 유리한 돌연변이는 서열번호 8 (변이체 No.23) (표 6.1 및 7.1에 표시됨)에 재조합시켰고, 신규 변이체는 0일 및 10일 동안 45℃에서 동결건조된 형태로 인큐베이션 후 PAL 활성에 대해 시험되었다. 양성 대조군에 대한 상응하는 배수 개선 (FIOP)을 갖는 활성 변이체의 재시험 데이타는 표 8.1에 표시하였고, 변이체 #23이 양성 대조군이다. 하기 표에서, 변이체의 일부는 동일한 치환 (즉, 이중, 예컨대 변이체 52 및 61)을 함유하는데, 그들의 어세이 시험 결과가 변이체에 대한 서열분석 데이타를 얻기 전에 수득되었기 때문이다.

상기 표에서, 활성 배수 개선 (FIOP)은 골격 (서열번호 8 (변이체 #23)과 비교하였고, 다음과 같이 정의된다: "-" = 0.2-배보다 적은 활성; "+" = 0.2-배 초과지만, 1-배 미만 활성; "++" = 1-배 초과지만, 1.25-배 미만으로 증가된 활성; "+++" = 1.25-배 초과 활성이지만, 1.5-배 미만으로 증가된 활성; 및 "++++" = 1.5-배 초과 활성.

실시예 9

페닐알라닌 잔기의 제거

페닐알라닌 잔기가 활성의 소실을 일으키지 않고 변화 (즉, 중성이거나 또는 활성에 유리한 페닐알라닌 돌연변이)된, 서열번호 6 (변이체 #2)의 변이체에 대한 활성 결과가 표 9.1에 표시되어 있다. 표 8.1에서 처럼, 하기 표에서, 변이체의 일부는 동일한 치환을 함유하는데, 이들 어세이 시험 결과가 변이체에 대한 서열분석 데이타를 얻기 전에 수득되었기 때문이다.

상기 표에서, 활성 배수 개선 (FIOP)는 골격 서열번호 6 (변이체 #2)과 비교되었고, 다음과 같이 정의된다: "+" = 서열번호 6 (변이체 #2) 또는 서열번호 8 (변이체 #23)과 유사한 활성.

실시예 10

9회차 스크리닝 결과

변이체 #126이 고처리량 스크리닝에서 프로테아제 내성뿐만 아니라 개선된 저장 안정성을 보였기 때문에, 골격으로서 서열번호 12 (변이체 #126)를 사용하여, 이전 결과의 분석을 기반으로 조합 라이브러리를 디자인하였다. 변이체 #126 (서열번호 11)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 변이체 #51 (서열번호 9)과 비교하여 a21t 돌연변이를 함유한다. 이러한 변이체는 실시예 4에 기술된 바와 같이 다양한 모의된 장액에서 야생형 AvPAL과 비교되었다. 변이체 #126에 대해 45℃에서 동결건조된 효소의 인큐베이션 이후 T=0 및 T=10일에 활성의 상응하는 배수 개선을 갖는 활성 돌연변이를 하기 표 10.1에 표시한다. 실시예의 다른 표에서 처럼, 하기 표에서, 변이체의 일부는 동일한 치환을 함유하는데, 이들 어세이 시험 결과가 변이체에 대한 서열분석 데이타를 얻기 전에 수득되었기 때문이다.

이 표에서, 활성 배수 개선 (FIOP)은 골격 서열번호 12 (변이체 #126)과 비교되었고, 다음과 같이 정의된다: "-" = 0.2-배 미만 활성; "+" = 0.2-배 초과지만, 1-배 미만 활성; "++" = 1-배 초과지만, 1.25-배 미만으로 증가된 활성; 및 "+++" = 1.25-배 초과 활성.

실시예 11

혈장 페닐알라닌 수준

페닐알라닌 및 신남산에 대해 혈장 샘플을 분석하였다. 내부 표준물은 50/50 아세토니트릴:DMSO 중에 페닐알라닌 또는 신남산을 용해시킨 후에, 50% 아세토니트릴 중 10-40,000 ng/ml의 작업 농도로 희석하여 생성시켰다. 이들 샘플은 블랭크 개 혈장으로 희석되었고 (10 μL: 90 μL), 이어서 300 μL의 내부 표준물로 희석되었다 (아세토니트릴 중 250 ng/ml의 d₈-Phe 또는 d₇-CA). 동물 혈장 샘플 (20 μL)을 아세토니트릴 (80 μL)로 희석하고 나서, 300 μL의 내부 표준물로 희석하였다. 페닐알라닌 농도의 분석을 위해서, 30 μL의 샘플을 Luna C18 컬럼 (2.1 x 100 mm, 5 ㎛)이 구비된 Shimadzu HPLC/CTC 오토샘플러를 사용해 주입하였다. 샘플은 0.5% 포름산, 수 중 5 mM 암모늄 아세테이트 및 0.5% 포름산과 90% 아세토니트릴 및 10% 물의 농도 구배를 사용해 2.5분 동안 용리하였고, 1.3분에 페닐알라닌이 용리되었다.

신남산의 분석을 위해서, 30 μL의 샘플을 써모 실리카 컬럼 (2.1 x 100 mm, 5 ㎛)이 구비된 HPLC/CTC 오토샘플러를 사용해 주입하였다. 샘플은 수 중 5 mM 암모늄 아세테이트 및 90% 아세토니트릴/10% 물의 농도 구배를 3.5분 동안 사용하여 용리하였고, 신남산은 2.3분에 용리되었다. 피분석물은 ESI 포지티브 모드 (페닐알라닌) 또는 네거티브 모드 (신남산)로 MRM 스캔을 수행하는, API-4000Q-trap 질량 분광계를 사용해 검출되었다. 동위원소 표지된 페닐알라닌 유도체에 대한 전이는 166.2/120.0, 171.2/125.1, 및 174.2/128.2였다. 동위원소 표지된 신남산의 전이는 146.8/102.9, 151.9/107.9, 및 153.9/110.1이었다.

실시예 12

개 모델에서 변이체 #126의 장 활성

그들이 위장관을 통해서 수송되므로 PAL 변이체의 안정성 및 활성을 평가하기 위해서, 비글개에게 정제된 효소 변이체를 위관영양시켰다. 개의 혈중 페닐알라닌 및 신남산의 농도에 대한 이들 변이체의 효과를 측정하였다. 개는 밤새 (12 내지 16시간) 그리고 효소 투약 후 8시간 까지 실험 전반에서 단식시켰다. 모든 개는 실험 시작 전 2시간 및 다시 +3시간에 위 산성화를 최소화하기 위해 경구 용량의 파모티딘 (40 mg/개)을 투여하였다. 실험전 혈장 샘플 (∼2 mL)은 -2시간 (제1 파모티딘 용량 직전), -30분, 및 -10분 (이들 3회 측정의 평균을 사용하여 용량 후 값을 정규화시켰음)에 채혈하였다. t=0에, 비히클 또는 변이체 #126의 용량 후 정확히 5분에, 모든 개는 현탁액 중 900 mg/kg PO 용량의 분말 염소 우유 에스비락 (PetAg) 단백질 (4 mL/kg)을 투여받았다. 추가의 혈장 샘플은 용량 처치후 +15분, +30분, 및 +1시간, +2시간, +4시간, +6시간, +8시간, 및 +24시간에 채취하였다. 혈장 샘플은 실시예 11에 기술된 바와 같이 Phe 및 CA에 대해 분석되었다.

결과는 도 3, 4, 및 5에 도시되어 있다. 도 3에서, 상이한 그룹에 대한 상대적 혈중 페닐알라닌 수준을 도시한다. 비히클의 투여 시, 페닐알라닌 수준의 1.35-배 증가가 관찰되었다. 200 mg/kg 그룹을 제외하고, 변이체 #126의 모든 용량의 투여는 이러한 즉각적인 페닐알라닌 스파이크를 억제하고 t= 1시간에 혈중 페닐알라닌의 감소를 초래하였다. 2시간 시점에, 120 mg/kg 그룹은 혈중 페닐알라닌의 34% 감소를 보였다.

도 5는 상이한 그룹에 대한 신남산 수준을 도시한다. 비히클을 제외한 모든 그룹은 변이체 #126 투여의 투여 시 신남산의 신속한 출현을 보였다. 신남산 형성의 신속한 개시는 120 mg/kg 용량의 경우 15분에, PAL- 60 mg/kg 용량의 경우 30분에, 그리고 200 mg/kg 용량의 경우 1시간에 C_max 를 야기시켰다. 신남산은 모든 용량 그룹에서 10시간 동안 혈장에서 검출된다. 200 mg/kg 용량 그룹에서, 신남산은 24시간 동안 기준 이상으로 지속되었다.

도 5에서, 변이체 #126 투여 후 처음 4시간 동안 형성된 신남산의 양은 AUC로서 정량되었다. 60, 120, 및 200 mg/kg 그룹에 대한 AUC는 비히클 반응과 통계적으로 유의하게 상이하다.

실시예 13

사이노몰거스 원숭이에서 변이체 #126의 장 활성

사이노몰거스 원숭이가 혈장 페닐알라닌 및 신남산 수준을 측정하여, 페닐알라닌을 신남산으로 전환시키는 변이체 #126의 효능을 평가하는데 사용되었다. 동물들 중 일부는 변이체 #126의 투여 이전 2시간에 파모티딘의 용량 (원숭이 당 20 mg)을 투여받았다. 효소는 위관영양으로 투여되었고 5분 후에 실험을 시작하기 위해서 (t=0) 900 mg/kg 염소 우유 에스비락 (PetAg) 단백질을 후속 투여하였다. 혈장 샘플은 실시예 11에 기술된 바와 같이 Phe 및 CA에 대해 분석되었다.

도 6에서, 상이한 그룹에 대한 상대적 혈장 페닐알라닌은 변이체 #126의 투여 후 처음 8시간 동안 그래프화되었다. 비히클의 투여는 1시간에 페닐알라닌 수준의 1.7-배 증가를 야기시켰다. 변이체 #126의 모든 용량의 투여는 이러한 페닐알라닌 스파이크를 억제시켰고 1시간 내지 2시간 후에 혈중 페닐알라닌의 감소를 야기시켰다. 변이체 #126을 처치한 모든 그룹은 비히클과 비교하여 1시간에 20% 내지 38%의 혈장 페닐알라닌의 감소를 보였다.

도 7에 도시된 바와 같이, 페닐알라닌의 상대적 감소는 0 내지 4시간의 시간 기간 동안 AUC로서 정량되었다. 변이체 #126이 투약된 모든 그룹은 비히클 대조군과 비교하여 페닐알라닌의 경우 평균 22% 더 낮은 AUC를 가졌다.

도 8에 도시된 바와 같이, 상이한 용량 그룹에 대한 혈장 중 시간 의존적 신남산 농도가 도시되어 있다. 도 8 (상부)은 파모티딘으로 전처리된 그룹의 경우 신남산 형성을 보이고; 도 8 (하부)은 투약 전 파모티딘으로 처리되지 않은 그룹에 대한 이러한 데이타를 도시한다. 신남산 수준은 신속하게 상승되어 1시간에 C_max 에 도달하였고, 그 이후에 4시간까지 기준치에 가깝게 약해졌다. 비히클 대조군 그룹에서 신남산은 관찰되지 않았다.

도 9에 도시된 바와 같이, 투여 후 초기 0 내지 4시간 동안 신남산의 형성은 AUC로서 정량되었다. 도 9 (상부)는 파모티딘으로 전처리된 그룹의 AUC를 도시한다. 용량의 10-배 증가는 그 결과로 신남산 생성의 2-배 미만의 증가를 일으켰다. 도 9 (중간)는 파모티딘으로 전처리되지 않은 그룹의 AUC를 도시하고 모든 그룹은 유사한 수준의 신남산 형성을 보였다. 도 9 (하부)는 동일한 양의 변이체 #126가 투여되었지만 파모티딘으로 전처리되거나 또는 그렇지 않은 그룹의 직접 비교를 도시한다. 파모티딘 처치는 통계적으로 유의한 효과를 보이지 않았다.

도 6 내지 9에서 제공된 결과는 건강한 사이노몰거스 원숭이에게 변이체 #126의 경구 투여가 혈장 중 페닐알라닌 수준에 대해 통계적으로 유의한 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 또한, 사이노몰거스 원숭이에게 변이체 #126의 경구 투여 시, 대략 9 mg/kg의 페닐알라닌의 제거에 상응하는 신남산의 양이 형성된다. 이러한 양은 건강한 개체 및 PKU 환자에 의한 페닐알라닌 흡수와 관련하여 상관있다.

실시예 14

개별 돌연변이 변이체에 대한 스크리닝 결과

모든 아미노산 돌연변이는 개별적으로 변이체 No.126 (서열번호 12)로 만들었고 0일 (T=0) 또는 10일 (T=10) 동안 45℃에서 동결건조된 형태로 인큐베이션 이후 PAL 활성, 및 프로테아제 안정성에 대해 시험하였고, 각각은 삼중으로 시험하였다. 하기 표에서, 돌연변이 및 어세이 결과가 제공된다.

상기 표에서, 활성 배수 개선 (FIOP)은 서열번호 12 (변이체 #126)와 비교하였고 다음과 같이 정의된다: "-" = 0.2-배 미만의 활성; "+" = 0.2-배 초과지만, 1-배 미만의 활성; "++" = 1-배 초과지만, 1.25-배 미만으로 증가된 활성; 및 "+++"= 1.25-배 초과의 활성.

실시예 15

추가 변이체에 대한 조합 스크리닝 결과

변이체 No. 126 (서열번호 12)에서 동정된 돌연변이는 서열번호 2에 조합적으로 첨가되었다. 신규한 변이체는 0일 (T=0) 또는 7일 (T=7) 동안 45℃에서 동결건조된 형태로 인큐베이션 이후 PAL 활성을 비롯하여 프로테아제의 존재 하에서 안정성에 대해 시험되었다. 양성 대조군 대비 상응하는 배수 개선 (FIOP)에 의한 변이체의 데이타가 표 15.1에 표시되어 있고, 서열번호 12 (변이체 #126)가 양성 대조군이다.

상기 표에서, 활성 배수 개선 (FIOP)은 서열번호 12 (변이체 #126)와 비교하였고, 하기와 같이 정의된다: "-" = 0.2-배 미만; "+" = 0.2-배 초과지만, 1-배 미만; "++" = 1-배 초과지만, 1.25-배 미만으로 증가된 활성; 및 "+++" = 1.25-배 초과 활성.

본 발명을 특별한 실시형태를 참조하여 설명하였지만, 다양한 변화가 만들어질 수 있고 균등물이 특정한 상황, 재료, 대상 조성물, 방법, 방법의 단계 또는 단계들에 적합화하기 위해 교체될 수 있고, 그리하여 청구된 범주를 벗어나지 않고 본 발명의 이득을 획득할 수 있다.

미국에서 모든 목적을 위해, 본 개시 내용에서 인용하는 각각의 모든 출판물 및 특허 문헌은 각각의 이러한 출판물 또는 문헌이 특별히 개별적으로 본 명세서에서 참조로 편입시킨다고 표시한 바와 같이 참조로 본 명세서에 편입된다. 출판물 및 특허 문헌의 인용은 임의의 이러한 문헌이 종래 기술에 속한다는 암시로서 의도되는 것이 아니거나, 이의 내용 또는 일자에 관한 인정을 구성하는 것이 아니다.

SEQUENCE LISTING <110> CODEXIS, INC. CHNG, CHINPING HALLOWS, WILLIAM CASEY AGARD, NICHOLAS J. ALVIZO, OSCAR DELLAS, NIKKI HUISMAN, GJALT W. NICOLS, JOHN JOSEPH <120> ENGINEERED PHENYLALANINE AMMONIA LYASE POLYPEPTIDES <130> CX7-159USP1 <140> TO BE ASSIGNED <141> 2017-02-13 <160> 12 <210> 1 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anabaena variabilis PAL <400> 1 atgaaaaccc tgagccaggc acagagcaaa accagcagcc agcagtttag ctttaccggc 60 aatagcagcg caaatgtgat tattggtaat cagaaactga ccatcaatga tgttgcacgt 120 gttgcccgta atggcaccct ggttagcctg accaataata ccgatattct gcagggtatt 180 caggccagct gtgattatat caataatgca gttgaaagcg gtgaaccgat ttatggtgtt 240 accagcggtt ttggtggtat ggcaaatgtt gcaattagcc gtgaacaggc aagcgaactg 300 cagaccaatc tggtttggtt tctgaaaacc ggtgcaggta ataaactgcc gctggcagat 360 gttcgtgcag caatgctgct gcgtgcaaat agccacatgc gtggtgcaag cggtattcgt 420 ctggaactga ttaaacgcat ggaaatcttt ctgaatgccg gtgttacccc gtatgtttat 480 gaatttggta gcattggtgc cagcggtgat ctggttccgc tgagctatat taccggtagc 540 ctgattggcc tggacccgag ctttaaagtt gattttaatg gcaaagaaat ggacgcaccg 600 accgcactgc gtcagctgaa tctgagtccg ctgaccctgc tgccgaaaga 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1560 aaaaaaccga gctcagatcg tccgtatatt tggaatgata atgaacaggg tctggatgaa 1620 catattgcac gtattagtgc agatattgca gccggtggtg ttattgttca ggccgttcag 1680 gacattctgc cgccgctgca t 1701 <210> 4 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of PAL from Anabaena variabilis <400> 4 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ser His Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Val Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Ala Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Lys Asp Ile Leu Gln Arg Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Lys Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Val Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly 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acagagcaaa accagcagcc agcagtctag ccataccggc 60 aatagcagcg caaatgtgat tattggtaat cagaaactga ccatcaatga tgttgtacgt 120 gttgcccgta atggcaccgc ggttagcctg accaataata aagatattct gcagcgtatt 180 caggccagct gtgattatat caataatgca gttgaaaaag gtgaaccgat ttatggtgtt 240 accagcggtt ttggtggtat ggcaaatgtt gtaattagcc gtgaacaggc aagcgaactg 300 cagaccaatc tggtttggtt tctgaaaacc ggtgcaggta ataaactgcc gctggcagat 360 gttcgtgcag caatgctgct gcgtgcaaat agccacatgc gtggtgcaag cggtattcgt 420 ctggaactga ttaaacgcat ggaaatcttt ctgaatgccg gtgttacccc gtatgtttat 480 gaatttggta gcattggtgc cagcggtgat ctggttccgc tgagctatat taccggtagc 540 ctgattggcc tggacccgag ctttaaagtt gattttaatg gcaaagaaat ggacgcaccg 600 accgcactga gacagctgaa tctgccgccg ctgaccctgc agccgaaaga aggtctggca 660 atgatgaatg gcaccagcgt tatgaccggt attgcagcaa attgtgttta tgatacccag 720 attctgaccg caattgcaat gggtgttcat gcactggata ttcaggcact gaatggtaca 780 aatcagagct ttcatccgtt tatccataac agcaaaccgc atccgggtca gctgtgggca 840 gcagatcaga tgctaagcct gctggccggt agccagctgg ttcgtgatga actggatggt 900 aaacatgatt atatggatgg tgaactgatc caggatcgtt atagcctgcg ttgtctgccg 960 cagtatctgg gtccgattgt tgatggtatt agccagattg ccaaacaaat cgaaattgag 1020 attaacagcg ttaccgataa cccgctgatt gatgttgata atcaggcaag ctatcatggt 1080 ggtaattttc atggtcagta tgttggtatg ggtatggatc atctgcgcta ttatatcggt 1140 ctgctggcaa aacatctgga tgttcagatt gcactgctgg catcaccgga atttagcaat 1200 ggtctgcctc cgagtctggt gggtaatcgt gaacgtaaag ttaatatggg tctgaaaggt 1260 ctgcagattt gcggtaatag cattatgccg ctgctgacct tttatggtaa tagtattgca 1320 gatcgttttc cgacccatgc cgaacaggca aaccagaata ttaacagcca gggttatacc 1380 agcgcaaccc tggcacgtcg tagcgttgaa atttttcaga attatgttgc cattgccctg 1440 atgtttggtg ttcaggcagt tgatctgcgt acctacaaaa aaaccggtca ttatgatgca 1500 cgtgcccagc tgtcaccggc aaccgaacgt ctgtatagcg cagttcgtca tgttgttggt 1560 aaaaaaccga gctcagatcg tccgtatatt tggaatgata atgaacaggg tctggatgaa 1620 catattgcac gtattagtgc agatattgca gccggtggtg ttattgttca ggccgttcag 1680 gacattctgc cgccgctgca t 1701 <210> 10 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of PAL from Anabaena variabilis <400> 10 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Ser 1 5 10 15 Ser His Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Val Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Ala Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Lys Asp Ile Leu Gln Arg Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Lys Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Val Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Pro Pro Leu Thr Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Leu Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Gly Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Met Asp Gly Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe His Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Val Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Ala Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Glu Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Gln Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Lys Lys Pro Ser Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Pro Leu His 565 <210> 11 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of PAL from Anabaena variabilis <400> 11 atgaaaaccc tgagtcaggc tcagagcaaa accagcagcc agcagtctag ccataccggc 60 aatagcagcg caaatgtgat tattggtaat cagaaactga ccatcaatga tgttgtacgt 120 gttgcccgta atggcaccgc ggttagcctg accaataata aagatattct gcagcgtatt 180 caggccagct gtgattatat caataatgca gttgaaaaag gtgaaccgat ttatggtgtt 240 accagcggtt ttggtggtat ggcaaatgtt gtaattagcc gtgaacaggc aagcgaactg 300 cagaccaatc tggtttggtt tctgaaaacc ggtgcaggta ataaactgcc gctggcagat 360 gttcgtgcag caatgctgct gcgtgcaaat agccacatgc gtggtgcaag cggtattcgt 420 ctggaactga ttaaacgcat ggaaatcttt ctgaatgccg gtgttacccc gtatgtttat 480 gaatttggta gcattggtgc cagcggtgat ctggttccgc tgagctatat taccggtagc 540 ctgattggcc tggacccgag ctttaaagtt gattttaatg gcaaagaaat ggacgcaccg 600 accgcactga gacagctgaa tctgccgccg ctgaccctgc agccgaaaga aggtctggca 660 atgatgaatg gcaccagcgt tatgaccggt attgcagcaa attgtgttta tgatacccag 720 attctgaccg caattgcaat gggtgttcat gcactggata ttcaggcact gaatggtaca 780 aatcagagct ttcatccgtt tatccataac agcaaaccgc atccgggtca gctgtgggca 840 gcagatcaga tgctaagcct gctggccggt agccagctgg ttcgtgatga actggatggt 900 aaacatgatt atatggatgg 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Variant of PAL from Anabaena variabilis <400> 12 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Ser 1 5 10 15 Ser His Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Val Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Ala Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Lys Asp Ile Leu Gln Arg Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Lys Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Val Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Pro Pro Leu Thr Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Leu Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Gly Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Met Asp Gly Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe His Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Val Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Ala Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Glu Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Gln Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Lys Lys Pro Ser Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Pro Leu His 565

Claims (55)

1. 서열번호 6과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 폴리펩티드로서, 상기 조작된 폴리펩티드는,
   (a) F16S, F16A, F16E, F16K, F16L, F16M, F16N, F16P, F16R, F16T, F16V 또는 F16W 치환으로부터 선택되는 16번 아미노산 위치의 치환, 또는
   (b) L364H, L364E, L364S 또는 L364T 치환을 포함하고,
   상기 아미노산 서열의 아미노산 위치는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대해 넘버링된 것인 조작된 폴리펩티드.
2. 제1항에서 제공되는 조작된 폴리펩티드를 포함하는 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드.
3. 제2항에 있어서, 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis) 변이체 효소인 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드.
4. 제2항에 있어서, 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 더 열안정성인 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드.
5. 제2항에 있어서, 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 단백질 가수분해에 더 내성인 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드.
6. 제5항에 있어서, 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 적어도 하나의 소화관 효소에 의한 단백질 가수분해에 내성인 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드.
7. 제5항에 있어서, 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 키모트립신, 트립신, 카르복시펩티다제, 또는 엘라스타제에 의한 단백질 가수분해에 더 내성인 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드.
8. 제2항에 있어서, 야생형 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제보다 더 산 안정성인 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드.
9. 제1항에 있어서, 정제되어 있는 조작된 폴리펩티드.
10. 제1항의 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드, 또는 제2항의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드.
11. 제10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제어 서열에 작동적으로 연결되는 것인 조작된 폴리뉴클레오티드.
12. 제10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된 것인 조작된 폴리뉴클레오티드.
13. 제10항의 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 제어 서열을 포함하는 발현 벡터.
14. 제13항에 있어서, 상기 제어 서열은 프로모터를 포함하는 것인 발현 벡터.
15. 제14항에 있어서, 상기 프로모터는 이종성 프로모터인 발현 벡터.
16. 제10항의 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
17. 제16항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli)인 숙주 세포.
18. 숙주 세포에서 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드가 생성되도록 적합한 배양 조건 하에서, 제1항의 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드 또는 제2항의 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 제어 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 제조 방법.
19. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 배양물 또는 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 더 포함하는 제조 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 정제하는 단계를 더 포함하는 제조 방법.
21. 제1항의 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드 또는 제2항의 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
22. 제10항의 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
23. 제21항에 있어서, 페닐케톤뇨증의 치료에 적합한 조성물.
24. 제21항에 있어서, 상승된 혈중 페닐알라닌의 치료에 적합한 조성물.
25. 제21항에 있어서, 티로신혈증의 치료에 적합한 조성물.
26. 제21항에 있어서, 상승된 혈중 티로신의 치료에 적합한 조성물.
27. 제21항에 있어서, 유전자 요법에서 사용하기에 적합한 조성물.
28. 제27항에 있어서, 페닐케톤뇨증, 상승된 혈중 페닐알라닌, 티로신혈증, 또는 상승된 혈중 티로신혈증을 치료하기 위한 유전자 요법에서 사용하기에 적합한 조성물.
29. 제21항에 있어서, mRNA 요법에서 사용하기에 적합한 조성물.
30. 제29항에 있어서, 페닐케톤뇨증, 상승된 혈중 페닐알라닌, 티로신혈증, 또는 상승된 혈중 티로신혈증을 치료하기 위한 mRNA 요법에서 사용하기에 적합한 조성물.
31. 제21항에 있어서, 인간에게 경구 투여하기에 적합한 조성물.
32. 제21항에 있어서, 알약, 정제, 캡슐, 젤캡, 액상제, 또는 에멀션의 형태인 조성물.
33. 제32항에 있어서, 상기 알약, 정제, 캡슐, 또는 젤캡은 장용성 제피를 더 포함하는 것인 조성물.
34. 제21항에 있어서, 인간에게 비경구 주사하는 데 적합한 조성물.
35. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 치료적으로 유효한 화합물과 공동 투여되는 조성물.
36. 제35항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 치료적으로 유효한 화합물을 포함하는 조성물.
37. 대상체에서 페닐케톤뇨증의 증상을 치료 또는 예방하기 위한, 제1항 의 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드 또는 제2항의 적어도 하나의 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
38. 제37항에 있어서, 상기 대상체의 혈중 페닐알라닌 농도는 상기 약학 조성물을 상기 대상체에게 제공 시 감소되는 것인 약학 조성물.
39. 제37항에 있어서, 상기 대상체의 혈중 신남산 농도는 상기 약학 조성물을 상기 대상체에게 제공 시 증가되는 것인 약학 조성물.
40. 제37항에 있어서, 상기 페닐케톤뇨증의 증상이 호전되는 것인 약학 조성물.
41. 제37항에 있어서, 상기 대상체는, 상기 약학 조성물이 제공되지 않은 대상체에게 요구되는 식사보다 페닐알라닌 함량이 덜 제한적인 식사를 먹을 수 있는 것인 약학 조성물.
42. 제37항에 있어서, 상기 대상체는 유아, 아동, 청소년, 또는 성인인 약학 조성물.
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