CN110573175A - 工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供了工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽及其组合物、以及编码工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽优化以提供增强的催化活性、以及减少的对蛋白水解的敏感性和增加的对在升高的温度储存的耐受性。在一些实施方案中，工程化PAL多肽包含少于野生型PAL多肽的苯丙氨酸残基。本发明还提供了用于使用包含工程化PAL多肽的组合物用于治疗和工业目的的方法。

Description

工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽

本申请要求2017年9月29日提交的美国临时专利申请序号62/565,555和2017年2月13日提交的美国临时专利申请序号62/458,232的优先权，出于所有目的，将这两个专利通过引用以其整体并入。

对作为ASCII文本文件提交的“序列表”、表格、或计算机程序列表附件的引用

文件CX7-159USP1_ST25.TXT中记录的序列表，创建于2017年2月10日，具有44千字节的大小、机器格式IBM-PC、MS-Windows操作系统，特此通过引用并入。

发明领域

本发明提供了工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽及其组合物、以及编码工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽优化以提供增强的催化活性、以及减少的对蛋白水解的敏感性和增加的对在升高的温度储存的耐受性。在一些实施方案中，工程化PAL多肽包含较少的苯丙氨酸残基。本发明还涉及包含工程化PAL多肽的组合物用于治疗和工业目的的用途。

发明背景

苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)连同组氨酸氨裂合酶(HAL)和酪氨酸氨裂合酶(TAL)一起是芳香族氨基酸裂合酶家族(EC 4.3.1.23-1.25和4.3.1.3)的成员。更具体地，具有PAL活性的酶(EC 4.3.1.23-1.25并且先前分类为EC4.3.1.5)催化L-苯丙氨酸非氧化性脱氨基为(E)-肉桂酸。PAL为非哺乳动物酶，其广泛分布于植物中并且还在真菌和有限数目的细菌中被鉴定出。

PAL酶可以被用作用于治疗代谢紊乱，苯丙氨酸羟化酶缺乏症(PAHD)、更广泛地称为苯丙酮尿症(PKU)的治疗性蛋白。PKU是一种常染色体代谢遗传紊乱，其中肝酶苯丙氨酸羟化酶(PAH)或参与辅因子四氢生物蝶呤的合成或再循环的一种或更多种酶，由于对应基因中的突变而部分起作用或不起作用。这种功能的缺乏导致血流中升高水平的苯丙氨酸。取决于突变的类型，PKU患者的血流中的苯丙氨酸浓度通常>360μM。苯丙氨酸被转化为苯丙酮酸盐(苯基酮)和其他衍生物。在人类中，如果PKU未被及早治疗，高水平的苯丙氨酸和其分解产物中的一些可引起显著医学问题，所述医学问题包括智力障碍、小头畸形和癫痫发作。许多研究已经集中在通过酶取代将PAL用于治疗PKU(Ambrus等人，Science 201:837-839[1978]；Bourget等人，Appl.Biochem.Biotechnol.,10:57-59[1984]；和Sarkissian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:2339-2344[1999])。

发明概述

本发明提供了工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽及其组合物、以及编码工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽优化以提供增强的催化活性、以及减少的对蛋白水解的敏感性和增加的对在升高的温度储存的耐受性。在一些实施方案中，工程化PAL多肽包含较少的苯丙氨酸残基。本发明还涉及包含工程化PAL多肽的组合物用于治疗和工业目的的用途。在一些实施方案中，本发明涉及工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽及其生物活性片段和类似物，其具有改进的特性，诸如增加的储存稳定性和/或减少的对蛋白水解的敏感性。

本发明涉及当在基本相同的条件下与野生型PAL酶或参考PAL多肽相比时，具有改进的特性的工程化PAL多肽及其生物活性片段和类似物。本发明还涉及在治疗性和/或工业组合物中使用工程化PAL多肽及其生物活性片段和类似物的方法以及使用这些组合物用于治疗和/或工业目的的方法。

本发明提供了包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12中的至少一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的工程化多肽，其中氨基酸序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2的氨基酸序列或被指定为参考序列的另一个氨基酸序列来编号。在一些实施方案中，本发明提供了包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12中的至少一个具有至少85％或更多序列同一性的氨基酸序列的工程化多肽，其中氨基酸序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2的氨基酸序列或被指定为参考序列的另一个氨基酸序列来编号。在一些实施方案中，本发明提供了包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12中的至少一个具有至少90％或更多序列同一性的氨基酸序列的工程化多肽，其中氨基酸序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2的氨基酸序列或被指定为参考序列的另一个氨基酸序列来编号。在一些实施方案中，本发明提供了包含与SEQID NO:4、6、8、10和/或12中的至少一个具有至少95％或更多序列同一性的氨基酸序列的工程化多肽，其中氨基酸序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2的氨基酸序列或被指定为参考序列的另一个氨基酸序列来编号。在一些实施方案中，本发明提供了包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12中的至少一个具有至少98％或更多序列同一性的氨基酸序列的工程化多肽，其中氨基酸序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2的氨基酸序列或被指定为参考序列的另一个氨基酸序列来编号。在一些实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12中的至少一个的氨基酸序列的工程化多肽，其中氨基酸序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2的氨基酸序列或被指定为参考序列的另一个氨基酸序列来编号。

本发明还提供了包含至少一种取代或取代集合的工程化多肽，所述取代或取代集合位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：16、16/150、44/56、44/56/102/239/285/469/470/495、44/239、44/239/285/469/495、44/239/285/470、44/239/469/470、44/239/470/546、44/239/495、44/239/495/546、44/469/470、102、102/470、162、165、188、239/285、239/285/469、239/469/470/495、264、267、285/469/470/495、285/470、285/470/495、364、455、469/470、472和482，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:6来编号。在一些另外的实施方案中，工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代：16、264、364、472、482和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:6来编号。在一些实施方案中，工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：16、16/150、162、188、264、267、398、434、472和482和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:6来编号。

本发明还提供了包含至少一种取代或取代集合的工程化多肽，所述取代或取代集合位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：44/47/204/209/285、44/47/364/470/495、44/54/56/204/239/285/364/495、44/54/56/204/239/470/495、44/54/285/470、44/102/285/364、44/204/209/285、44/204/285/364/470/495、44/209/285/460/495、44/285/364、47/54/209、47/204/209/239/285/495、47/204/285/364/495、47/209/239/364、47/239/285/364、47/470、54、54/56、54/56/204/209/470、54/56/204/209/495、54/56/204/495、54/56/209/562、54/56/285/364/470、54/56/285/470、54/165/204/209/239/285/470/495、54/239/495、54/285/470、54/470、56、165、204、204/209/239/285/470/495、204/209/364、204/209/364/495、204/239、204/239/285、204/364、204/470、209/285/364/470、209/285/364/470/495、209/364、209/364/495、209/470、239/364、285/364、285/364/495、364、364/470、470和495和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。

本发明还提供了包含至少一种取代或取代集合的工程化多肽，所述取代或取代集合位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：54/56/162/204/285、54/56/162/204/398、54/56/204/285、54/56/204/398、54/56/204/398/472、54/56/285、54/56/398、54/56/398/472、54/162/204/398、54/162/398、54/204/285/398/472、54/204/398、54/285/398、54/285/398/472、56/162/398、56/204/285、56/204/398、56/204/398/460、56/204/398/472、56/285、56/285/398/472、56/398、56/398/472和201/204/398和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:12来编号。在一些实施方案中，工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：16、18、39、47、54、59、73、91、209、214、285、290、305、307、364、407、450、470、503、521、524和565和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:12来编号。

本发明还提供了包含至少一种取代或取代集合的工程化多肽，所述取代或取代集合位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：15/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/19/214/407、16/18/23/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/43/44/59/209/503/565、16/18/39/45/47/54/59/73/98/209/214/285/290/305/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/49/54/59/73/209/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/98/285/290/305/307/364/450/470/503/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/313/364/450/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/450/470/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/450/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/307/364/407/450/470/503/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/285/290/305/307/407/450/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/285/290/307/364/407/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/307/364/407/503、16/18/39/47/54/59/73/91/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521、16/18/39/47/54/59/73/91/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/285/290/305/364/407/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/91/98/209/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/91/209/214/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/91/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/91/214/285/290/305/307/364/450/503/521/524、16/18/39/47/54/59/91/285/290/305/307/364/407/450/503/521/524、16/18/39/47/54/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/470/503/521/565、16/18/39/47/54/73/91/209/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/47/54/73/209/214/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/91/214/285/290/364/407/450/470/503/521、16/18/39/47/54/209/214/407/503/524/565、16/18/39/47/59/73/91/214/290/305/307/364/407/450/470/503/521、16/18/39/47/59/214/503/565、16/18/39/47/91/290/407、16/18/39/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/54/59/73/209/214/285/290/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/54/59/73/214/285/290/305/364/407/450/521/524/565、16/18/39/54/73/91/209/210/285/290/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/54/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/54/73/98/214/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524/565、16/18/39/54/73/209/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524/565、16/18/39/54/91/214/285/290/364/450/470/503/521/524、16/18/39/91/503/521、16/18/47/54/59/73/91/98/285/290/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/47/54/59/73/98/209/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/47/54/59/73/209/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/47/54/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/47/59/285/407/450/565、16/18/47/73/91/209/285/290/450/470/503/521/524、16/18/47/73/214/307/503、16/18/47/73/290/407/450、16/18/47/209、16/18/47/285/364/503/521、16/18/47/364/407、16/18/54/59/73/91/209/285/290/305/307/364/407/450/503/521、16/18/54/59/290/407/450/503/524、16/18/54/73/91/214/285/290/407/561、16/18/54/91/209/214/285/290/307/364/407/450/503/521/524/565、16/18/54/407、16/18/55/209/285/305、16/18/59/209/450/503/524、16/18/73/209/214/450、16/18/91/209/407/503、16/18/91/214/407/521/524/565、16/18/209/450/503、16/18/214/407/450/503、16/18/285/290/470、16/18/503、16/22/214/503/524/565、16/39/47/54/59/73/91/98/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/98/209/214/285/290/307/364/407/450/470/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/450/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/450/503/521、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/307/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/290/305/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/307/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/364/407/450/503/524/565、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/307/364/407/450/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/214/290/364/407/450/470/524/565、16/39/47/54/59/73/98/209/285/305/307/407/4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ID NO:2来编号。

在一些实施方案中，工程化多肽是多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)变体酶。在一些另外的实施方案中，本发明的工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更具有热稳定性。在一些另外的实施方案中，工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更耐受蛋白水解。在又一些另外的实施方案中，工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶对通过至少一种消化道酶的蛋白水解具有耐受性。在仍一些另外的实施方案中，工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶对通过胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶的蛋白水解更具有耐受性。在又一些另外的实施方案中，工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更具有酸稳定性。在仍另外的实施方案中，工程化多肽是纯化的。

本发明还提供了包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10和/或12或其功能片段具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽。在一些实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10和/或12或其功能片段具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10和/或12或其功能片段具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽是表6.1、表7.1、表8.1、表9.1、表10.1、表14.1和/或表15.1中的任一项中提供的变体苯丙氨酸氨裂合酶多肽。

在一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽是多变鱼腥藻变体酶。在一些另外的实施方案中，本发明的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更具有热稳定性。在一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更耐受蛋白水解。在又一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶对通过至少一种消化道酶的蛋白水解具有耐受性。在仍一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶对通过胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶的蛋白水解更具有耐受性。在一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更具有酸稳定性。在一些另外的实施方案中，工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽是纯化的。

本发明还提供了编码本文提供的至少一种工程化多肽和/或苯丙氨酸氨裂合酶多肽的工程化多核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸编码本文提供的至少一种工程化多肽。在一些另外的实施方案中，工程化多核苷酸编码本文提供的至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽。在一些实施方案中，工程化多核苷酸编码本文提供的工程化多肽。在一些另外的实施方案中，工程化多核苷酸编码本文提供的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽。在一些实施方案中，工程化多核苷酸序列被可操作地连接至控制序列。在一些另外的实施方案中，工程化多核苷酸序列是密码子优化的。

本发明还提供了包含本文提供的至少一种工程化多核苷酸序列的表达载体。在一些实施方案中，表达载体包含本文提供的工程化多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，表达载体还包含至少一种控制序列。在一些另外的实施方案中，表达载体还包含控制序列。在一些另外的实施方案中，控制序列包含启动子。在一些实施方案中，启动子是异源性启动子。

本发明还提供了用本文提供的至少一种多核苷酸序列转化的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是用本文提供的多核苷酸序列转化的。在一些另外的实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。

本发明还提供了在宿主细胞中产生工程化多肽的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养宿主细胞，使得产生至少一种工程化多肽，所述宿主细胞包含编码本文提供的至少一种工程化多肽的至少一种多核苷酸、和/或本文提供的至少一种多核苷酸序列、和/或本文提供的至少一种表达载体。在一些实施方案中，本发明还提供了在宿主细胞中产生工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养宿主细胞，使得产生至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，所述宿主细胞包含编码本文提供的至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽的至少一种多核苷酸、和/或本文提供的至少一种多核苷酸序列、和/或本文提供的至少一种表达载体。在一些实施方案中，该方法还包括从培养物和/或宿主细胞回收本文提供的至少一种工程化多肽和/或苯丙氨酸氨裂合酶多肽。在一些另外的实施方案中，该方法还包括纯化本文提供的至少一种工程化多肽和/或苯丙氨酸氨裂合酶多肽的步骤。

本发明还提供了包含本文提供的至少一种工程化多肽的组合物。本发明还提供了包含本文提供的至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽的组合物。本发明还提供了包含本文提供的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽的组合物。

本发明还提供了包含本文提供的至少一种工程化多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，组合物包含本文提供的工程化多核苷酸。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些另外的实施方案中，组合物还包含至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体。在一些另外的实施方案中，组合物适于治疗苯丙酮尿症。在一些另外的实施方案中，组合物适于治疗升高的血液苯丙氨酸。在一些实施方案中，组合物适于治疗高苯丙氨酸血症。在一些另外的实施方案中，组合物适于治疗酪氨酸血症。在一些另外的实施方案中，组合物适于治疗升高的血液酪氨酸。在一些实施方案中，组合物适于治疗高酪氨酸血症。在又一些另外的实施方案中，组合物适于在基因治疗中使用。在一些另外的实施方案中，组合物适于在治疗苯丙酮尿症、升高的血液苯丙氨酸、高苯丙氨酸血症、酪氨酸血症、升高的血液酪氨酸血症和/或高酪氨酸血症的基因治疗中使用。在又一些另外的实施方案中，组合物适于在mRNA治疗中使用。在一些另外的实施方案中，组合物适于在治疗苯丙酮尿症、升高的血液苯丙氨酸、高苯丙氨酸血症、酪氨酸血症、升高的血液酪氨酸血症和/或高酪氨酸血症的mRNA治疗中使用。在一些实施方案中，组合物适于向人类口服施用。在一些另外的实施方案中，组合物呈丸剂、片剂、胶囊、囊形片(gelcap)、液体或乳剂的形式。在一些另外的实施方案中，丸剂、片剂、胶囊或囊形片还包含肠溶包衣。在一些可选择的实施方案中，组合物适于肠胃外注射到人体中。在又一些另外的实施方案中，组合物与至少一种另外的治疗有效的化合物共施用。在一些其他的实施方案中，组合物包含至少一种另外的治疗有效的化合物。

本发明还提供了用于治疗和/或预防受试者中的苯丙酮尿症的症状的方法，所述方法包括提供患有苯丙酮尿症的受试者，并向受试者提供本文提供的至少一种组合物。在一些实施方案中，在向受试者提供组合物后，受试者的血液中的苯丙氨酸浓度减少。在一些另外的实施方案中，在向受试者提供组合物后，受试者的血液中的肉桂酸浓度增加。在一些另外的实施方案中，受试者中的苯丙酮尿症的症状改善。在又一些另外的实施方案中，受试者能够食用比未被提供至少一种药物组合物的受试者需要的膳食更少限制其苯丙氨酸含量的膳食，所述药物组合物包含本文提供的至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶。在一些实施方案中，受试者是婴儿，而在一些其他的实施方案中，受试者是儿童，并且在一些其他的实施方案中，受试者是青年，并且在又一些另外的实施方案中，受试者是成人。

本发明还提供了本文提供的组合物中的任一种的用途。在一些实施方案中，组合物包含至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶。在一些实施方案中，本文提供了单独或以任何组合的任何组合物。不意图将本发明受限于任何特定用途。

附图描述

图1是示出了AvPAL和变体#126对不具有蛋白酶的肠液的耐受性的图。示出了在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的不存在下，野生型AvPAL和变体#126在禁食状态模拟肠液(FaSSIF)、早期进食状态模拟肠液(early fed state simulated intestinal fluids)(FeSSIF早期)、中期进食状态模拟肠液(middle fed state simulated intestinalfluids)(FeSSIF中期)和晚期进食状态模拟肠液(late fed state simulated intestinalfluids)(FeSSIF晚期)中孵育后的残余PAL活性。

图2是示出了AvPAL和变体#126对具有蛋白酶的肠液的耐受性的图。示出了在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的存在下，AvPAL和变体#126在禁食状态模拟肠液(FaSSIF)、早期进食状态模拟肠液(FeSSIF早期)、中期进食状态模拟肠液(FeSSIF中期)和晚期进食状态模拟肠液(FeSSIF晚期)中孵育后的残余PAL活性。

图3是示出了用不同剂量的变体#126处理的组的比格狗(beagles)的相对血浆苯丙氨酸水平的图。为了清楚起见，省略了误差棒(*：p<0.05，**：p<0.01)。

图4是示出了用不同剂量的变体126处理的组的比格狗的血浆CA水平的图。

图5是示出了用不同剂量的变体126处理的组的比格狗的血浆中肉桂酸水平的AUC的图。提供了每组相比于媒介物的统计显著性(*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001)。

图6是示出了用不同剂量的变体126处理的组的食蟹猴(cynomolgus monkey)的相对血浆苯丙氨酸(Phe)水平的图。一些组未被用法莫替丁(-famo)预处理。

图7是示出了用不同剂量的变体126处理的组的食蟹猴的血浆中相对苯丙氨酸(Phe)的AUC的图。虚线表示所有剂量的变体126的平均AUC(**：对于媒介物和组合的所有剂量之间的t检验，p<0.01)。

图8A是示出了用法莫替丁预处理并接受不同剂量的变体126的组的食蟹猴中的血浆肉桂酸(CA)水平的图。

图8B是示出了未用法莫替丁预处理并接受不同剂量的变体126的组的食蟹猴中的血浆肉桂酸(CA)水平的图。

图9A是示出了在用法莫替丁预处理(顶部)或未预处理(中部)的食蟹猴中，用不同剂量的变体126处理的食蟹猴的组在0-4hr内的血浆肉桂酸(CA)AUC的图。

图9B是示出了在未用法莫替丁预处理的食蟹猴中，用不同剂量的变体126处理的食蟹猴的组在0-4hr内的血浆肉桂酸(CA)AUC的图。

图9C是提供在给药前2hr未用法莫替丁预处理或接受法莫替丁的20mg/kg组和200mg/kg组的直接比较的图(底部)(*：p<0.05，**：p<0.01)。

发明描述

本发明提供了工程化PAL多肽及其突变体、生物活性片段和类似物，以及包含所述工程化PAL多肽及其突变体、生物活性片段和类似物的药物组合物和工业组合物。

本发明提供了工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽及其组合物、以及编码所述工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽优化以提供增强的催化活性、以及减少的对蛋白水解的敏感性和增加的对在升高的温度储存的耐受性。在一些实施方案中，工程化PAL多肽包含较少的苯丙氨酸残基。本发明还提供了用于使用包含工程化PAL多肽的组合物用于治疗和工业目的的方法。

除去血流中的苯丙氨酸的一种方法是使用可注射的重组PAL和通过聚乙二醇化修饰的PAL变体(PEG-PAL)。已经证明聚乙二醇化改进酶的半衰期并减少受试者抗原反应(参见例如，WO 2008/153776、WO 2011/097335和美国专利第7,531,341号)。可用于PEG-PAL组合物的PAL变体已经被描述为野生型点状念珠藻(Nostoc punctiforme)(NpPAL)、多变鱼腥藻(AvPAL)和圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(RtPAL)的变体。特别地，已经描述了野生型AvPAL的变体，其中在位置64、318、503和565处的半胱氨酸残基已经被用丝氨酸取代(参见例如，美国专利号：7,790,433；7,560,263和7,537,923)。

作为减少PKU受试者中的L-苯丙氨酸的血浆浓度的方法的PAL施用的替代的途径是非侵入性制剂，诸如口服制剂(Sarkissian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:2339-2344[1999])。口服递送PAL的关键优势是酶对免疫系统的暴露减少，从而使用可注射PEG-PAL观察到的免疫应答最小化。然而，对于PAL口服制剂的主要限制是酶活性在胃和肠腔中的损失。为了有效并起作用，PAL必须耐受酸性pH和蛋白酶的降解，所述蛋白酶诸如通常将蛋白质食物降解为寡肽和氨基酸的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和胃蛋白酶。在一些先前的研究中(Sarkissian，上文)，部分由于通过蛋白酶的酶降解，并且部分由于在pH7.0比活性相对较低，为了实现口服施用PAL的显著效应，需要大量的酶。已经开发了多种方法以抑制消化时的PAL降解(Kim等人，Molec.Therap.,10:220-224[2004]；和Shah等人，Int.J.Pharmaceut,356:61-68[2008])。

增加PAL在消化道的苛刻条件下的效力的一种方法是提供耐受固有的苛刻条件的工程化PAL多肽。Kang等人使用胰凝乳蛋白酶裂解位点的位点特异性诱变和AvPAL的表面赖氨酸的聚乙二醇化以减少蛋白水解失活(参见，Kang等人，Mol.Gen.Metabol.,99:4-9[2010])。在这些研究中，特异性突变了十个裂解位点，并且这些所得突变体中除了两种(F18A和R94G)以外的所有都损失多于50％的原始酶活性。没有突变体显示出增加的活性，并且F18A突变体显示出胰蛋白酶耐受性的轻微增加(Kang等人，上文)。用PAL的另外的研究，虽然有效，但通常未导致较长存活的酶。因此，先前文献中描述的PAL突变体及其衍生物的口服施用未导致对PKU的有效治疗。

尽管PAL的多种制剂取得了进展，对具有改进的特性的用于口服施用的PAL多肽仍存在需求。这些改进的特性包括但不限于较长的半衰期、增加的催化活性、改进的对消化道中的条件以及存储条件的稳定性和减少的聚集。

PAL酶还可以被用作用于治疗酪氨酸代谢紊乱诸如I型酪氨酸血症、II型酪氨酸血症、III型酪氨酸血症和尿黑酸症的治疗蛋白。这些酪氨酸代谢紊乱是常染色体代谢遗传紊乱，其中参与酪氨酸降解的酶中的一种由于相应基因中的突变而部分起作用或不起作用。这种功能的缺乏导致血流中酪氨酸和其他酪氨酸代谢物水平升高。因为酪氨酸衍生自苯丙氨酸，所以限制苯丙氨酸和酪氨酸摄入对具有酪氨酸代谢紊乱的患者是有益的。因此，PAL酶是对酪氨酸代谢紊乱的潜在治疗。

如果具有酪氨酸代谢紊乱的患者未被及早治疗，高水平的酪氨酸及其分解产物中的一些可以导致显著的医学问题，所述医学问题包括肝衰竭和肾衰竭、肝癌、智力障碍以及甚至死亡。

除了治疗应用以外，PAL酶还可以被用于工业合成L-苯丙氨酸和其他取代的L-苯丙氨酸衍生物。然后，这些衍生物可以被用作药物前体(Gloge等人，Chem.6:3386-3390[2000]；Bartsch等人，Prot.Eng.Des.Sel.,23:929-933[2010]；和Turner,Curr.Opin.Chem.Biol.,234-240[2011])。PAL酶还可以被用于农业应用。PAL在植物、真菌和细菌中的苯丙素(phenylpropanoid)(诸如类黄酮和木质素)生物合成中起重要作用，并且可以用作防御相关的酶(Bate等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7608-7612[1994])。通过使用具有PAL活性的重组多肽来调节PAL活性可以潜在地导致有效的除草剂。

缩写和定义：

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文使用的命名法和以下描述的细胞培养、分子遗传学、微生物学、有机化学、分析化学和核酸化学的实验室程序是本领域熟知并通常采用的那些。这些技术是熟知的，并在本领域技术人员熟知的许多教科书和参考文献中进行了描述。标准技术或其修改被用于化学合成和化学分析。本文中上文和下文两者提及的所有专利、专利申请、文章和公布物，特此通过引用明确并入本文。

尽管本发明的实践中可使用类似或等同于本文描述那些的任何合适的方法和材料，本文描述了一些方法和材料。应当理解本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为取决于本领域技术人员使用其的情况，这些可以变化。因此，以下紧接着定义的术语通过参考作为整体的本申请而被更充分地描述。本文中上文和下文两者提及的所有专利、专利申请、文章和公布物，特此通过引用明确并入本文。

此外，如本文使用的，单数“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确指示。

数值范围包括界定该范围的数字。因此，本文公开的每个数值范围意图包括落在这些较宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同这些较窄数值范围在本文中被全部明确书写。还意图本文公开的每个最大(或最小)的数值限制包括每个较低(或较高)的数值限制，如同这些较低(或较高)的数值限制在本文中被明确书写。

术语“约”意指特定值的可接受的误差。在一些情况下，“约”意指在给定值范围的0.05％、0.5％、1.0％或2.0％内。在一些情况下，“约”意指在给定值的1、2、3或4个标准差内。

此外，本文提供的标题不是可以通过参考作为整体的本申请而被具有的本发明的各方面或实施方案的限制。因此，以下紧接着定义的术语通过参考作为整体的本申请而被更充分地定义。尽管如此，为了便于理解本发明，许多术语定义如下。

除非另外指示，分别地，核酸以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。

如本文使用的，术语“包括/包含(comprising)”及其同源词以其包含性含义来使用(即，等同于术语“包括(including)”及其对应的同源词)。

“EC”数字是指生物化学和分子生物学国际联合命名委员会(NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology,NC-IUBMB)的酶命名法。IUBMB生化分类是基于酶催化的化学反应的酶数字分类系统。

“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，其生物保藏收集包括基因和菌株。

“NCBI”是指美国国家生物信息中心(National Center for BiologicalInformation)和在其中提供的序列数据库。

如本文使用的，术语“苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽”是指还包括组氨酸氨裂合酶和酪氨酸氨裂合酶的芳香族氨基酸裂合酶家族(EC 4.3.1.23，EC 4.3.1.24和EC4.3.1.25)内的一类酶。PAL多肽有时也被称为苯丙氨酸/酪氨酸氨裂合酶，因为一些PAL酶可以使用酪氨酸以及苯丙氨酸作为底物。然而，本文公开并要求保护的AvPAL和变体不使用酪氨酸作为底物。PAL多肽催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸和氨。PAL活性是指PAL多肽的酶促活性。在一些优选的实施方案中，PAL酶还包含辅因子3,5-二氢-5-亚甲基-4H-咪唑-4-酮(MIO)。该辅因子可能是催化活性需要的，并通过保守的活性位点Ala167-Ser168-Gly169三肽区段的环化和脱水来形成。

“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，以表示通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不论长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。

“多核苷酸”在本文中用于表示包含至少两个核苷酸的聚合物，其中核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

“氨基酸”通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一字母符号在本文被提及。同样地，核苷酸可以通过其通常公认的一字母代码被提及。

当关于细胞、多核苷酸或多肽使用时，术语“工程化”、“重组”、“非天然存在的”和“变体”是指如下材料或与该材料的天然或自然形式对应的材料：已经以自然界中本来不存在的方式被修饰或与其相同但从合成材料产生或衍生和/或通过使用重组技术操作产生或衍生。

如本文使用的，“野生型”和“天然存在的”是指自然界中存在的形式。例如野生型多肽或多核苷酸序列是生物体中存在的序列，所述序列可以从自然界中的来源分离，并且其尚未被通过人为操作有意改变。

“编码序列”是指编码蛋白的氨基酸序列的核酸的部分(例如，基因)。

术语“序列同一性百分比(％)”在本文用于指多核苷酸和多肽之间的比较，并通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列相比，比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括添加或缺失(即，空位)。百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。可选择地，百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或一个核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。本领域技术人员理解，存在许多可用于比对两个序列的已确立的算法。用于比较的最佳序列比对可以如下进行，例如，如本领域已知的，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482[1981])，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970])，通过Pearson和Lipman的检索相似性方法(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988])，通过这些算法的计算机实现(例如，GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目测。适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例包括但不限于BLAST和BLAST 2.0算法(参见例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.,215:403-410[1990]；和Altschul等人，Nucleic Acids Res.,3389-3402[1977])。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公开获得。这个算法包括首先通过鉴定查询序列中长度“W”的短字(short words)来鉴定高评分序列对(HSP)，所述长度W的短字在与数据库序列中的相同长度的字比对时，匹配或满足某一正值的阈值评分“T”。T被称为相邻字评分阈值(参见，Altschul等人，上文)。这些最初的邻近字击中(word hit)用作启动检索的种子以找到包含它们的更长的HSP。然后，字击中沿每个序列在两个方向上延伸，直至累积比对评分不能增加。对于核苷酸序列，累积评分使用参数“M”(对于匹配残基对的奖励评分；永远＞0)和“N”(对于错配残基的惩罚评分；永远＜0)来计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。当以下情况时，字击中在每个方向上的延伸停止：累积比对评分从其达到的最大值下降了量“X”；由于累积一个或更多个负评分的残基比对，累积评分达到零或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认项(default)：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、和双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认项：字长(W)为3、期望值(E)为10、和BLOSUM62评分矩阵(参见例如，Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915[1989])。序列比对和序列同一性％的示例性确定可以使用所提供的默认参数，采用GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序。

“参考序列”是指用作序列比较的基础的定义的序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段。通常，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基的长度、至少25个残基的长度、至少50个残基的长度、至少100个残基的长度或核酸或多肽的全长。由于两个多核苷酸或多肽可以各自(1)包含两个序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，和(2)还可以包含两个序列之间不同的序列，因此两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗”上比较两个多核苷酸或多肽的序列来进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。在一些实施方案中，“参考序列”可以基于一级氨基酸序列，其中参考序列是可以在一级序列中具有一个或更多个改变的序列。例如，措辞“基于SEQ ID NO:4的在对应于X39的残基处具有缬氨酸的参考序列”是指在SEQ ID NO:4中的位置X39处对应的残基(例如，丙氨酸)已经被改变为缬氨酸的参考序列。

“比较窗”是指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念性区段，其中序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参考序列比较，并且其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，序列在比较窗中的部分可以包含20％或更少的添加或缺失(即，空位)，以获得两个序列的最佳比对。比较窗可以比20个连续残基更长，并且任选地包括30个、40个、50个、100个或更长的窗口。

当在给定氨基酸或多核苷酸序列的编号的上下文中使用时，“对应于”、“参考(reference to)”和“相对于”是指，当将给定氨基酸或多核苷酸序列与指定参考序列相比时，该参考序列的残基的编号。换言之，给定聚合物的残基编号或残基位置针对参考序列指定，而不是由残基在给定氨基酸或多核苷酸序列内的实际数值位置指定。例如，可以通过引入空位将给定氨基酸序列诸如工程化PAL的氨基酸序列与参考序列比对，以优化两个序列之间的残基匹配。在这些情况下，尽管存在空位，但是给定氨基酸或多核苷酸序列中残基的编号针对与其比对的参考序列来进行。

“氨基酸差异”和“残基差异”是指多肽序列的一个位置的氨基酸残基相对于参考序列中对应位置的氨基酸残基的差异。本文中氨基酸差异的位置通常被称为“Xn”，其中n是指在基于其存在残基差异的参考序列中的对应位置。例如，“与SEQ ID NO：4相比，在位置X91的残基差异”是指在对应于SEQ ID NO：4的位置91的多肽位置的氨基酸残基的差异。因此，如果参考多肽SEQ ID NO:4在位置91处具有丙氨酸，则“与SEQ ID NO:4相比在位置X91处的残基差异”是指在对应于SEQ ID NO:4的位置91的多肽位置处除丙氨酸以外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大多数情况下，一个位置处的特定氨基酸残基差异表示为“XnY”，其中“Xn”指定参考多肽的对应残基和位置(如以上描述的)，并且“Y”是工程化多肽中存在的氨基酸的单字母标识符(即，与参考多肽不同的残基)。在一些情况下(例如，在实施例中的表格中)，本公开内容还提供了由常规符号“AnB”表示的特定氨基酸差异，其中A是参考序列中的残基的单字母标识符，“n”是参考序列中残基位置的编号，并且B是工程化多肽序列中残基取代的单字母标识符。在一些情况下，本公开内容的多肽可以包括相对于参考序列的一个或更多个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异由相对于参考序列存在残基差异的指定位置的列表指示。在一些实施方案中，当多于一个氨基酸可以在多肽的特定残基位置中使用时，可以使用的多种氨基酸残基由“/”分开(例如，X307G/X307Q或X307G/Q)。本公开内容包括包含一个或更多个氨基酸差异的工程化多肽序列，所述氨基酸差异包括保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代的任一个/或两者。

术语“氨基酸取代集合”和“取代集合”是指多肽序列内的一组氨基酸取代。在一些实施方案中，取代集合包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，取代集合是指存在于实施例的任一表格中列出的变体AvPAL多肽的任何一个中的氨基酸取代的集合。

“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的不同残基来取代残基，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。通过示例的方式而非限制，具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一种脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代；具有羟基侧链的氨基酸被另一种具有羟基侧链的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)取代；具有芳香族侧链的氨基酸被另一种具有芳香族侧链的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代；具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸和精氨酸)取代；具有酸性侧链的氨基酸被另一种具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代；并且疏水性或亲水性氨基酸分别被另一种疏水性或亲水性氨基酸取代。示例性保守性取代在表1中提供。

“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以使用定义的组之间而不是之内的氨基酸，并且影响：(a)取代区域中的肽骨架的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)；(b)电荷或疏水性；和/或(c)侧链的体积。通过示例的方式而非限制，示例性非保守取代包括酸性氨基酸被碱性或脂肪族氨基酸取代；芳香族氨基酸被小氨基酸取代；以及亲水性氨基酸被疏水性氨基酸取代。

“缺失”是指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸来修饰多肽。缺失可以包括去除1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或20个或更多个氨基酸、高达构成参考酶的氨基酸总数的10％或高达构成参考酶的氨基酸总数的20％，同时保留酶促活性和/或保留工程化转氨酶的改进的特性。缺失可以涉及多肽的内部部分和/或末端部分。在各种实施方案中，缺失可以包括连续的区段，或者可以是不连续的。

“插入”是指通过向参考多肽添加一个或更多个氨基酸来修饰多肽。插入可以在多肽的内部部分，或在羧基或氨基末端。如本文使用的插入包括如本领域已知的融合蛋白。插入可以是连续区段的氨基酸，或由天然存在的多肽中的一个或更多个氨基酸隔开。

术语“功能片段”和“生物活性片段”在本文中可互换使用以指如下多肽：所述多肽具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部缺失，但是其中剩余的氨基酸序列与和它相比较的序列(例如，本发明的全长工程化PAL)中的对应位置相同，并且保留全长多肽的基本上所有的活性。

“分离的多肽”是指与天然伴随多肽的其他污染物(例如，蛋白、脂质和多核苷酸)基本上分离的多肽。该术语包括已经从其天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成)取出或纯化的多肽。重组PAL多肽可以存在于细胞内、存在于细胞培养基中，或以各种形式制备，诸如裂解物或分离的制品。因此，在一些实施方案中，本文提供的重组PAL多肽是分离的多肽。

“基本上纯的多肽”是指其中多肽物质是存在的主要物质的组合物(即，在摩尔或重量的基础上，它比组合物中的任何其它单独大分子物质更丰富)，并且当目标物质按摩尔或重量％计构成存在的大分子物质的至少约50％时，该组合物一般为基本上纯化的组合物。通常，基本上纯的PAL组合物按摩尔或重量％计将构成组合物中存在的所有大分子物质的约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多、以及约98％或更多。在一些实施方案中，将目标物质纯化至基本的均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。溶剂物质、小分子(<500道尔顿)和元素离子物质不被认为是大分子物质。在一些实施方案中，分离的重组PAL多肽为基本上纯的多肽组合物。

“改进的酶特性”是指与参考PAL多肽诸如野生型PAL多肽(例如，具有SEQ ID NO:4的AvPAL野生型)或另一种工程化PAL多肽相比，表现出任何酶特性的改进的工程化的PAL多肽。改进的特性包括但不限于诸如以下的特性：增加的蛋白表达、增加的热活性(thermoactivity)、增加的热稳定性、增加的pH活性、增加的稳定性、增加的酶促活性、增加的底物特异性和/或亲和力、增加的比活性、增加的对底物和/或终产物抑制的耐受性、增加的化学稳定性、改进的化学选择性、改进的溶剂稳定性、增加的对酸性pH的耐受性、增加的对蛋白水解活性的耐受性(即，减少的对蛋白水解的敏感性)、减少的聚集、增加的溶解度、减少的免疫原性、和改变的温度曲线。

措辞“包含较少的苯丙氨酸残基”是指，当一个或更多个苯丙氨酸残基经由突变为任何其它氨基酸而被从其多肽序列去除后，在标准测定(例如，如实施例中描述的)中与参考PAL相比，根据本发明的工程化PAL多肽将至少保持活性或稳定性。

“增加的酶促活性”和“增强的催化活性”是指工程化PAL多肽的改进的特性，其可以被表示为与参考PAL酶(例如，野生型AvPAL和/或另一种工程化AvPAL)相比，比活性(例如，产生的产物/时间/重量蛋白)的增加和/或底物向产物的转化百分比(例如，在指定的时间段使用指定量的PAL，起始量的底物向产物的转化百分比)的增加。确定酶活性的示例性方法在实施例中提供。与酶活性相关的任何特性可以被影响，包括经典的酶特性K_m、V_max或k_cat，其改变可以导致酶促活性的增加。酶活性的改进可以是从对应野生型酶的酶促活性的约1.1倍至比天然存在的PAL或从其衍生PAL多肽的另一种工程化PAL的多达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多的酶促活性。

在一些实施方案中，工程化PAL多肽具有以下的k_cat：至少0.1/sec、至少0.2/sec、至少0.3/sec、至少0.5/sec、至少1.0/sec，并且在一些优选的实施方案中大于2.0/sec。在一些实施方案中，K_m在约1μM至约5mM的范围内；在约5μM至约2mM的范围内；在约10μM至约2mM的范围内；或在约10μM至约1mM的范围内。在一些特定的实施方案中，工程化PAL酶表现出比参考PAL酶的酶促活性大1.5至10倍、1.5至25倍、1.5至50倍、1.5至100倍或更大的范围内的改进的酶促活性。PAL活性可以通过本领域已知的任何标准测定来测量(例如，通过监测反应物或产物的分光光度法特性的改变)。在一些实施方案中，产生的产物的量通过高效液相色谱法(HPLC)分离结合UV吸光度或荧光检测来直接测量或在o-酞二醛(OPA)衍生化后测量。在一些实施方案中，酶活性的比较使用定义的酶制品、在设定条件下用定义的测定和一种或更多种限定的底物进行，如本文进一步详细描述的。通常，当比较裂解物时，确定细胞的数目和测定的蛋白的量，并使用相同的表达系统和相同的宿主细胞以使由宿主细胞产生并存在于裂解物中的酶的量的变化最小化。

如本文使用的“生理pH”意指通常在受试者(例如，人类)的小肠内存在的pH范围。通常从幽门瓣到大肠存在约6.0至7.5的范围内的梯度pH。

本文中可互换使用的术语“蛋白水解活性”和“蛋白水解”是指蛋白分解为较小的多肽或氨基酸。蛋白的分解通常是肽键通过蛋白酶(protease)(蛋白酶(proteinase))的酶水解的结果。蛋白酶包括但不限于，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶；羧肽酶A和B、以及肽酶(例如，氨基肽酶、二肽酶和肠肽酶)。

措辞“减少的对蛋白水解的敏感性”、“减少的蛋白水解敏感性”及“增加的对蛋白水解的耐受性”在本文中可互换使用，意指在用一种或更多种蛋白酶处理后，在标准测定(例如，如实施例中描述的)中，根据本发明的工程化PAL多肽与参考PAL相比具有更高的酶活性。

措辞“增加的在升高的温度储存的稳定性”意指在以干燥形式例如通过冻干或喷雾干燥产生、并在高于室温的温度(例如，30℃、37℃、45℃、55℃等)储存从若干天至多个月的范围的时间段后，在标准测定(例如，如实施例中描述的)中，根据本发明的工程化PAL多肽与参考PAL相比将保持更高的活性。

“聚集”意指PAL多肽的结块或沉淀。聚集可以导致酶的失活。术语“减少的聚集”意指工程化PAL多肽与参考PAL相比将更不易聚集。用于评估聚集的方法是本领域已知的，包括但不限于用适当染料(例如，硫磺素T或尼罗红)的荧光显微术、动态光散射、用适当染料(例如，Bodipy)的流式细胞术、过滤和通过SDS-PAGE的分析、和/或蛋白印迹、荧光相关光谱法以及电子显微术的使用。存在评估聚集的商业上可获得的试剂盒(例如，蛋白聚集测定试剂盒[Enzo])。

“转化”是指底物向对应的产物的酶促转化(或生物转化)。“转化百分比”是指在指定条件下在一定时间段内转化为产物的底物的百分比。因此，PAL多肽的“酶促活性”或“活性”可以表示为在指定的时间段内底物向产物的“转化百分比”。

“杂交严格性”涉及核酸杂交中的杂交条件，诸如洗涤条件。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，随后是不同但严格性更高的洗涤。术语“中度严格性杂交”指允许靶DNA结合互补核酸的条件，所述互补核酸与靶DNA具有约60％同一性、优选地约75％同一性、约85％同一性；与靶多核苷酸具有大于约90％同一性。示例性中度严格条件是相当于在42℃在50％甲酰胺、5×Denhart's溶液、5×SSPE、0.2％SDS中杂交、随后在42℃在0.2×SSPE、0.2％SDS中洗涤的条件。“高严格性杂交”通常指，与在针对指定的多核苷酸序列的溶液条件下确定的热解链温度T_m相差约10℃或更少的条件。在一些实施方案中，高严格性条件是指仅允许在65℃在0.018M NaCl中形成稳定杂合体的那些核酸序列杂交的条件(即如本文设想的，如果杂合体在65℃在0.018M NaCl中不稳定，它在高严格性条件下将不稳定)。高严格性条件可以例如通过在相当于在42℃、50％甲酰胺、5×Denhart's溶液、5×SSPE、0.2％SDS的条件中杂交，然后在65℃、在0.1×SSPE和0.1％SDS中洗涤来提供。另一种高严格性条件是在相当于在65℃、在含有0.1％(w:v)SDS的5×SSC中杂交的条件中杂交，并在65℃、在含有0.1％SDS的0.1×SSC中洗涤。其他高严格性杂交条件以及中等严格性条件在以上引用的参考文献中描述。

“密码子优化”是指编码蛋白的多核苷酸的密码子向特定生物体中优先地使用的密码子的改变，使得所编码的蛋白在该生物体中更有效表达。尽管遗传密码是简并的，因为大多数氨基酸由被称为“同义(synonym)”或“同义(synonymous)”密码子的数个密码子代表，但熟知的是特定生物体的密码子使用是非随机的，并且偏向于特定的密码子三联体。这种密码子使用偏向对于给定基因、具有共同功能或祖先来源的基因、相比于低拷贝数蛋白的高表达蛋白、以及生物体的基因组的密集蛋白编码区可能更高。在一些实施方案中，编码PAL酶的多核苷酸被密码子优化，以用于从所选择用于表达的宿主生物体最佳产生。本文中“控制序列”是指包括对本公开内容的多核苷酸和/或多肽的表达是必要的或有利的所有组分。每个控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列、起始序列和转录终止子。在最小程度上，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。在一些实施方案中，控制序列设有接头，以用于引入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接的特定限制性位点的目的。

“可操作地连接”在本文中定义为控制序列被适当地放置(即，以功能关系)在相对于感兴趣的多核苷酸的位置处的布置，使得控制序列指导或调控编码感兴趣的多肽的多核苷酸的表达。

“启动子序列”是指被宿主细胞识别用于表达感兴趣的多核苷酸(诸如编码序列)的核酸序列。启动子序列包含介导感兴趣的多核苷酸的表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外多肽或细胞内多肽的基因获得。

在酶促转化反应过程的情况下，“底物”是指由PAL多肽作用的化合物或分子。在酶促转化过程的情况下，“产物”是指由PAL多肽对底物的作用产生的化合物或分子。

如本文使用的术语“培养”是指微生物细胞群体使用任何合适的培养基(例如，液体、胶体或固体)在合适的条件下的生长。

重组多肽(例如，PAL酶变体)可使用本领域已知的任何合适的方法来产生。例如，存在本领域技术人员熟知的许多不同的诱变技术。此外，诱变试剂盒还可从许多商业分子生物学供应商获得。可获得方法以进行在指定的氨基酸处的特定取代(位点特异性)、在基因的局部区域中的特定或随机突变(区域特异性)、或在整个基因内的随机诱变(例如，饱和诱变)。许多产生酶变体的适合的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于使用PCR对单链DNA或双链DNA的位点特异性诱变、盒式诱变、基因合成、易错PCR、改组和化学饱和诱变、或本领域已知的任何其他合适的方法。用于DNA和蛋白工程化的方法的非限制性实例在以下专利中提供：美国专利第6,117,679号；美国专利第6,420,175号；美国专利第6,376,246号；美国专利第6,586,182号；美国专利第7,747,391号；美国专利第7,747,393号；美国专利第7,783,428号；和美国专利第8,383,346号。产生变体后，可以对它们筛选任何期望的特性(例如，高或增加的活性、或者低或减少的活性、增加的热活性、增加的热稳定性和/或酸性pH稳定性等)。在一些实施方案中，可使用“重组PAL多肽”(在本文中还称为“工程化PAL多肽”、“变体PAL酶”和“PAL变体”)。

如本文使用的，“载体”是用于将DNA序列引入到细胞中的DNA构建体。在一些实施方案中，载体是被可操作地连接至能够实现DNA序列中编码的多肽在合适宿主中的表达的合适的控制序列的表达载体。在一些实施方案中，“表达载体”具有可操作地连接至DNA序列(例如，转基因)以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列，并且在一些实施方案中，还包含转录终止子序列。

如本文使用的，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还包括多肽从细胞的分泌。

如本文使用的，如果氨基酸或核苷酸序列(例如，启动子序列、信号肽、终止子序列等)与它被可操作地连接的另一个序列在自然界中不是缔合的，则这两个序列为“异源的”。

如本文使用的，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”是指用于表达包含本文提供的DNA(例如，编码至少一种AvPAL变体的多核苷酸序列)的载体的合适的宿主。在一些实施方案中，宿主细胞是已经用使用如本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核细胞或真核细胞。

术语“类似物”意指与参考多肽具有多于70％序列同一性、但少于100％序列同一性(例如多于75％、78％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的多肽。在一些实施方案中，类似物包括非天然存在的氨基酸残基以及天然存在的氨基酸，所述非天然存在的氨基酸残基包括但不限于高精氨酸、鸟氨酸和正缬氨酸。在一些实施方案中，类似物还包括一种或更多种D-氨基酸残基和两个或更多个氨基酸残基之间的非肽键。

术语“治疗剂”是指向显示出病理学迹象或症状的受试者施用的具有有益或期望的医疗效应的化合物。

术语“药物组合物”是指包含药学上有效量的由本发明所包括的工程化PAL多肽和可接受的载体的适于哺乳动物受试者(例如，人类)的药物用途的组合物。

术语“基因治疗”被用于指使用基因(即，遗传物质)来治疗和/或预防哺乳动物受试者(例如，人类)的疾病。在一些实施方案中，遗传物质被直接引入到哺乳动物受试者的至少一些细胞中。不意图本发明受限于可用于基因治疗的任何特定方法或组合物。

术语“mRNA治疗”被用于指使用信使RNA(mRNA)来治疗和/或预防哺乳动物受试者(例如，人类)的疾病。在一些实施方案中，遗传物质被直接引入到哺乳动物受试者的至少一些细胞中。不意图本发明受限于可用于mRNA治疗的任何特定方法或组合物。

术语“有效量”意指足以产生期望的结果的量。本领域一般技术人员可以通过使用常规实验来确定有效量是多少。

术语“分离的”和“纯化的”用于指从与其天然缔合的至少一种其他组分分开的分子(例如，分离的核酸、多肽等)或其他组分。术语“纯化的”不要求绝对纯度，而是其意图作为相对定义。

术语“受试者”包括哺乳动物，诸如人类、非人类灵长目动物、家畜、宠物和实验动物(例如，啮齿动物和兔形目动物)。意图的是该术语包括雌性以及雄性。

如本文所用，术语“患者”意指正在被评估、治疗或正在经历疾病的任何受试者。

术语“婴儿”是指在出生之后第一个月至约一(1)岁的时期内的儿童。如本文使用的，术语“新生儿”是指在从出生至生命的第28天的时期内的儿童。术语“早产婴儿”是指妊娠第二十个完整周之后但在妊娠期满之前出生的婴儿，通常在出生时称重～500至～2499克。“极低出生体重婴儿”是在出生时称重少于1500g的婴儿。

如本文使用的，术语“儿童”是指对于同意治疗或研究程序未达到法定年龄的人。在一些实施方案中，该术语是指在出生之时和青春期之间的人。

如本文使用的，术语“成人”是指对于相关司法权已经达到法定年龄(例如，在美国为18岁)的人。在一些实施方案中，该术语是指任何完全发育成熟的生物体。在一些实施方案中，术语“青年”是指小于18岁但已经达到性成熟的人。

如本文使用的，“组合物”和“制剂”包括意图用于任何适合的用途的包含本发明的至少一种工程化PAL的产物(例如，药物组合物、膳食/营养补充物、饲料等)。

术语“施用(administration)”和“施用(administering)”组合物意指向受试者(例如，患有PKU效应的人)提供本发明的组合物。

当关于药物组合物使用时，术语“载体”意指标准药物载体、缓冲液和赋形剂诸如稳定剂、防腐剂和佐剂中的任一种。

术语“药学上可接受的”意指可以向受试者施用而不引起任何不良生物效应或以有害的方式与在其中它被包含的组分的任何一种相互作用并且拥有期望的生物活性的材料。

如本文使用的，术语“赋形剂”是指任何药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂、佐剂或其他成分，而不是活性药物成分(API；例如，本发明的工程化PAL多肽)。赋形剂通常被包括以用于制剂和/或施用目的。

当关于疾病/状况的症状使用时，术语“治疗有效量”是指改善、减弱或消除疾病/状况的一种或更多种症状或者预防或延缓症状(例如，PKU)的发作的化合物(例如，工程化PAL多肽)的量和/或浓度。在一些实施方案中，该术语被用于指组合物的量，所述组合物的量引发研究者、医师、兽医师或其他临床医师所寻求的组织、系统或动物受试者的生物学(例如，医学)响应。

当关于疾病/状况使用时，术语“治疗有效量”是指改善、减弱或消除该疾病/状况的组合物的量和/或浓度。

意图的是，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括预防性治疗(例如，预防剂)，以及姑息治疗。

工程化PAL多肽：

本发明的工程化PAL多肽所来自的亲本PAL多肽源自包括细菌菌株诸如鱼腥藻属(Anabaena)(例如，多变鱼腥藻(A.variabilis))、念珠藻属(Nostoc)(例如，点状念珠藻(N.punctiforme))、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)(例如，圆红冬孢酵母(R.toruloides))、链霉菌属(Streptomyces)(例如S.maritimus或轮丝链霉菌(S.verticillatus))、颤藻属的种(Oscillatoria sp.)、粘球藻属的种(Gloeocapsa sp.)和胶须藻属的种(Rivularia sp.)。来自这些菌株的PAL酶已经被鉴定并且是熟知的。来自鱼腥藻属(多变鱼腥藻)ATCC 29413和NCBI YP_324488.1；念珠藻属(点状念珠藻)ATCC29133和NCBI YP_00186563.1；颤藻属的种PCC 6506和NCBI ZP_07108482.1；以及粘球藻属的种PCC7428和NCBI YP_007127054.1的同源酶序列在美国专利申请序号2014/0314843的图1中提供，通过引用并入本文。

此外，当特定PAL变体(即，工程化PAL多肽)通过参考野生型PAL或参考PAL的序列中的特定氨基酸残基的修饰被提及时，应当理解的是，本文包括了在等同位置修饰的另一种PAL的变体(如从各自的氨基酸序列之间的任选的氨基酸序列比对所确定的)。在一些实施方案中，工程化PAL多肽源自从以上细菌菌株(即，念珠藻属[点状念珠藻]、红冬孢酵母属[圆红冬孢酵母]、链霉菌属[S.maritimus或轮丝链霉菌]、颤藻属的种、粘球藻属的种和胶须藻属的种)列出的多肽中的任何一种。在一些另外的实施方案中，本发明的工程化PAL多肽包含保守的活性位点Ala167-Ser168-Gly169，并且包含与SEQ ID NO:4至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，工程化PAL多肽不仅包含PAL活性，还具有对酪氨酸和/或组氨酸底物的活性。

在一些实施方案中，工程化PAL多肽通过在有利于产生工程化PAL多肽的条件下培养包含编码至少一种工程化PAL多肽的至少一种多核苷酸序列的微生物来产生。在一些实施方案中，随后将工程化PAL多肽从所得培养基和/或细胞回收。

本发明提供了具有PAL活性的示例性工程化PAL多肽。实施例提供了显示将特定氨基酸序列特征与工程化PAL多肽的功能活性相关联的序列结构信息的表格。该结构-功能相关性信息以相对于参考工程化多肽SEQ ID NO:2的特定氨基酸残基差异、以及与示例性工程化PAL多肽的相关的实验上确定的活性数据的形式来提供。

在一些实施方案中，本发明的具有PAL活性的工程化PAL多肽包含a)与参考序列SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO:2相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异；以及c)与参考序列相比，所述工程化PAL多肽表现出选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性、ii)减少的蛋白水解敏感性、iii)减少的聚集、iv)增加的作为冻干制品对升高的温度的稳定性、v)减少的其一级结构中的苯丙氨酸残基的数目、或者i)、ii)、iii)、iv)或v)的任何组合。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ IDNO:2相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2相比在一个或更多个位置处的残基差异包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化PAL多肽是实施例中提供的表格中列出的多肽。

在一些实施方案中，本发明的具有PAL活性的工程化PAL多肽包含a)与参考序列SEQ ID NO:4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO:4相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异；以及c)与参考序列相比，所述工程化PAL多肽表现出选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性、ii)减少的蛋白水解敏感性、iii)减少的聚集、iv)增加的作为冻干制品对升高的温度的稳定性、v)减少的其一级结构中的苯丙氨酸残基的数目、或者i)、ii)、iii)、iv)或v)的任何组合。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ IDNO:4相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:4相比在一个或更多个位置处的残基差异包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化PAL多肽是实施例中提供的表格中列出的多肽。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:6相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：16、16/150、44/239/495、44/56、44/56/102/239/285/469/470/495、44/239、44/239/285/470、44/239/285/469/495、44/239/285/470、44/239/469/470、44/239/470/546、44/239/495/546、44/469/470、102、102/470、162、162、165、188、239/285/469、239/285、239/469/470/495、264、267、267、285/470、285/469/470/495、285/470/495、364、455、469/470、472和482或其任何组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:6来编号。在一些实施方案中，氨基酸取代选自F16A/E/K/N/R/S/T/V/W、F16K/F150A、N44C/T239A/T495A、N44H/I56V、N44H/I56V/T102Q/T239A/I285L/V469I/D470E/T495A、N44H/T239A、N44H/T239A/I285L/D470E、N44H/T239A/I285R/V469I/T495A、N44H/T239A/I285R/D470E、N44H/T239A/V469I/D470E、N44H/T239A/D470E/S546A、N44H/T239A/T495A/S546A、N44H/V469I/D470E、T102Q、T102Q/D470E、F162Q/W、I165L、F188I、T239A/I285L/V469I、T239A/I285R、T239A/V469I/D470E/T495A、F264H、F267G/V、I285L/D470E、I285L/V469I/D470E/T495A、I285R/D470E/T495A、L364E/H/S/T、N455S、V469I/D470E、F472A和F482C/N，其中氨基酸位置相对于SEQ IDNO:6来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:6相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：16、264、364和472，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:8来编号。在一些实施方案中，氨基酸取代选自F16S、F264H、L364H、F472A和F482N，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:6来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:8相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：16、16/150、162、188、264、267、398、434、472A/L/V和F482C/N/S，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:6来编号。在一些实施方案中，氨基酸取代选自F16A/E/K/L/M/N/P/R/S/T/V/W、F16K/F150A、F162M/Q/W、F188A/I/N、F264H、F267G/L/Q/S/V、F398H、F434V、F472A/L/V和F482C/N/S，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:6来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:8具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:8具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:8相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：44/102/285/364、44/285/364、44/47/204/209/285、44/47/364/470/495、44/54/285/470、44/54/56/204/239/285/364/495、44/54/56/204/239/470/495、44/204/285/364/470/495、44/204/209/285、44/209/285/460/495、47/54/209、47/204/209/239/285/495、47/204/285/364/495、47/209/239/364、47/239/285/364、47/470、54、54/285/470、54/56/204/209/470、54/56/204/209/495、54/56/285/364/470、54/56、54/56/285/470、54/56/204/495、54/56/209/562、54/165/204/209/239/285/470/495、54/239/495、54/470、56、165、204、204/209/239/285/470/495、204/209/364、204/209/364/495、204/239、204/239/285、204/364、204/470，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:8来编号。在一些实施方案中，氨基酸取代选自N44C/T102Q/I285R/L364H、N44C/I285R/L364E、N44H/A47K/R204K/S209P/I285R、N44H/A47K/L364H/D470E/T495A、N44H/K54P/I285R/D470E、N44H/K54P/I56V/R204K/T239A/I285R/L364S/T495A、N44H/K54P/I56V/R204K/T239A/D470E/T495A、N44H/R204K/I285R/L364H/D470E/T495A、N44H/R204K/S209P/I285R、N44H/S209P/I285R/T460G/T495A、A47K/K54P/S209P、A47K/R204K/S209P/T239A/I285R/T495A、A47K/R204K/I285R/L364H/T495A、A47K/S209P/T239A/L364H、A47K/T239A/I285R/L364H、A47K/T239A/I285R/L364H、A47K/D470E、K54E、K54P/I285L/D470E、K54E/I285R/D470E、K54E/I56V/R204K/S209P/D470E、K54E/I56V/R204K/S209P/T495A、K54E/I56V/I285R/L364S/D470E、K54P/I56V、K54P/I56V/I285L/D470E、K54P/I56V/R204K/T495A、K54P/I56V/S209P/I562N、K54P/I165L/R204K/S209P/T239A/I285R/D470E/T495A、K54P/T239A/T495A、K54P/D470E、I56V、I165L、R204K、R204K/S209P/T239A/I285R/D470E/T495A、R204K/S209P/L364E/T495A、R204K/S209P/L364H、R204K/S209P/L364H/T495A、R204K/T239A、R204K/T239A/I285R、R204K/L364H、R204K/D470E、S209P/I285L/L364H/D470E、S209P/I285R/L364E/D470E、S209P/I285R/L364E/D470E/T495A、S209P/I285R/L364H/D470E/T495A、S209P/L364H,S209P/L364H/T495A、S209P/D470E、T239A/L364H、I285R/L364H、I285R/L364H/T495A、L364H、L364H/D470E、D470E和T495A，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:8来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ IDNO:12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQID NO:12相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：54/56/162/204/285、54/56/398/472、54/162/204/398、54/162/398、54/204/398、54/56/162/204/398、54/56/204/285、54/56/204/398、54/56/204/398/472、54/56/285、54/56/398、54/162/398、54/204/285/398/472、54/285/398、54/285/398/472、56/162/398、56/204/285、56/204/398、56/204/398/460、56/204/398/472、56/285、56/285/398/472、56/398、56/398/472和201/204/398，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:12来编号。在一些实施方案中，氨基酸取代选自K54E/I56V/F162W/R204K/L285I、K54E/I56V/F398H/F472L、K54E/F162W/R204K/F398H、K54E/F162W/F398H、K54E/R204K/F398H、K54P/I56V/F162W/R204K/F398H、K54P/I56V/R204K/L285I、K54P/I56V/R204K/F398H、K54P/I56V/R204K/F398H/F472L、K54P/I56V/L285I、K54P/I56V/F398H、K54P/F162W/F398H、K54P/R204K/L285I/F398H/F472L、K54P/L285I/F398H、K54P/L285I/F398H/F472L、I56V/F162W/F398H、I56V/R204K/L285I、I56V/R204K/F398H、I56V/R204K/F398H/T460G、I56V/R204K/F398H/F472L、I56V/L285H、I56V/L285I、I56V/L285I/F398H/F472L、I56V/F398H、I56V/F398H、I56V/F398H/F472L和T201A/R204K/F398H，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:12来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:2、4、8、10和/或12具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽选自SEQ ID NO:4、6、8、10和12。

在一些实施方案中，本发明提供了工程化PAL多肽的功能片段。在一些实施方案中，功能片段包含其所源自的工程化PAL多肽(即，亲本工程化PAL)的活性的至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。在一些实施方案中，功能片段包含工程化PAL的亲本序列的至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。在一些实施方案中，功能片段被截短了少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个、少于35个、少于40个、少于45个和少于50个氨基酸。

在一些实施方案中，本发明提供了工程化PAL多肽的功能片段。在一些实施方案中，功能片段包含其所源自的工程化PAL多肽(即，亲本工程化PAL)的活性的至少约95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，功能片段包含工程化PAL的亲本序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，功能片段被截短了少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个、少于35个、少于40个、少于45个、少于50个、少于55个、少于60个、少于65个或少于70个氨基酸。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6、8、10、12和/或14具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQID NO:4、6、8、10和/或12相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12或者与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，工程化PAL包含与SEQ ID NO:6至少90％的序列同一性，并且包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比在至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸位置处的氨基酸差异。在一些实施方案中，工程化PAL多肽由SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12的序列组成。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:4或其功能片段具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:4相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，工程化PAL包含与SEQ ID NO:4至少90％的序列同一性，并且包含与SEQ ID NO:4相比在至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸位置处的氨基酸差异。在一些实施方案中，工程化PAL多肽由SEQ ID NO:4的序列组成。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6或其功能片段具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:6相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，工程化PAL包含与SEQ ID NO:6至少90％的序列同一性，并且包含与SEQ ID NO:6相比在至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸位置处的氨基酸差异。在一些实施方案中，工程化PAL多肽由SEQ ID NO:6的序列组成。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:8或其功能片段具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:8相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，工程化PAL包含与SEQ ID NO:8至少90％的序列同一性，并且包含与SEQ ID NO:8相比在至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸位置处的氨基酸差异。在一些实施方案中，工程化PAL多肽由SEQ ID NO:8的序列组成。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:10或其功能片段具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:10相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:10或与SEQIDNO:10具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，工程化PAL包含与SEQ ID NO:10至少90％的序列同一性，并且包含与SEQ ID NO:10相比在至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸位置处的氨基酸差异。在一些实施方案中，工程化PAL多肽由SEQID NO:10的序列组成。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:12或其功能片段具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:12相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:12或与SEQ IDNO:12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，工程化PAL包含与SEQ ID NO:12至少90％的序列同一性，并且包含与SEQ ID NO:12相比在至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸位置处的氨基酸差异。在一些实施方案中，工程化PAL多肽由SEQID NO:12的序列组成。

具有减少的对蛋白水解的敏感性的变体：

在一些实施方案中，本发明的工程化PAL多肽具有PAL活性、表现出减少的对蛋白水解的敏感性、并且包含：a)与参考序列SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和b)与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，表现出减少的对蛋白水解的敏感性的工程化PAL多肽与SEQID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12或者与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，在基本相同的条件下，工程化PAL多肽的蛋白水解敏感性与野生型PAL(例如，具有SEQ ID NO:2的AvPAL)或参考PAL多肽的蛋白水解敏感性相比减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。蛋白水解活性可以使用本领域已知的任何合适的方法、包括但不限于实施例中描述的方法来测量。

在一些实施方案中，当将参考PAL和具有减少的敏感性的工程化PAL两者进行比较、并在基本相同的条件下暴露于基本相同的量和种类的蛋白酶时，具有减少的对蛋白水解的敏感性的工程化PAL多肽对包含一种或更多种蛋白酶的组合物具有减少的敏感性，所述蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和B、肽酶(例如，氨基肽酶、二肽酶和肠肽酶)。

在一些实施方案中，具有减少的对蛋白水解的敏感性的工程化PAL多肽具有为参考PAL(例如，AvPAL)的酶活性的约1.0倍、2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多的酶活性水平。在一些实施方案中，在以下情况下工程化多肽与参考PAL相比具有更多的酶活性：当在4.5至7.5的pH范围测量活性时；当在4.5至6.5的pH范围测量活性时；当在5.0至7.5的pH范围测量活性时；当在5.0至6.5的pH范围测量活性时；当在5.5至7.5的pH范围测量活性时；和/或还有当在5.5至6.5的pH范围测量活性时。在一些其他的实施方案中，工程化PAL多肽具有在1μM至5mM的范围内的K_m值。

具有增加的对在升高的温度储存的耐受性的变体：

在一些实施方案中，本发明的工程化PAL多肽具有PAL活性、对在升高的温度储存更具有耐受性、并且包含：a)与参考序列SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12或其功能片段具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和b)与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，与野生型AvPAL和/或另一种参考多肽相比，表现出增加的对在升高的温度储存的耐受性的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:4相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12或者与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，当所有其他测定条件基本相同时，与参考PAL多肽相比具有增加的对在升高的温度储存的耐受性的工程化PAL多肽在约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃等的温度具有增加的耐受性。

在一些实施方案中，当通过标准测定测量时，具有增加的对在升高的温度储存的耐受性的工程化PAL多肽与参考PAL相比还表现出更大的PAL活性。任何合适的测定可用于本发明，包括但不限于本文提供的那些。

包含较少苯丙氨酸残基的变体：

在一些实施方案中，本发明的工程化PAL多肽具有PAL活性，并且其一级序列中苯丙氨酸残基的数目减少，并且包含：a)与参考序列SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和/或b)与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，在其一级序列中包含减少的苯丙氨酸残基数目的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12或者与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，当与SEQ ID NO:6的氨基酸序列最佳比对时，在其一级序列中包含减少的苯丙氨酸残基数目的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO:6相比的氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：116、16/150、162、188、264、267、398、434、472A/L/V和F482C/N/S或其任何组合。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或25个或更多个氨基酸位置。

在一些实施方案中，在其一级序列中包含减少的苯丙氨酸残基数目的工程化PAL多肽与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且包含在F16、F150、F162、F188、F264、F267、F398、F434、F472、F482位置处的氨基酸残基差异，以及任选地包含在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，氨基酸残基差异选自F16A/E/K/L/M/N/P/R/S/T/V/W、F16K/F150A、F162M/Q/W、F188A/I/N、F264H、F267G/L/Q/S/V、F398H、F434V、F472A/L/V和F482C/N/S，其中氨基酸残基参考SEQ ID NO:6来编号。

在一些实施方案中，在基本相同的条件下，比野生型PAL包含更少苯丙氨酸残基的工程化PAL多肽还具有与野生型PAL(例如，具有SEQ ID NO:2的AvPAL)或参考PAL多肽的蛋白水解敏感性相比减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的蛋白水解敏感性。活性可以使用本领域已知的任何合适的方法、包括但不限于实施例中描述的方法来测量。

在一些实施方案中，当将参考PAL和具有减少的苯丙氨酸含量的工程化PAL两者进行比较、并在基本相同的条件下暴露于基本相同的量和种类的蛋白酶时，在其一级序列中包含比野生型PAL更少苯丙氨酸残基的工程化PAL多肽对包含一种或更多种蛋白酶的组合物具有减少的敏感性，所述蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和B、肽酶(例如，氨基肽酶、二肽酶和肠肽酶)。

在一些实施方案中，在其一级序列中包含减少的苯丙氨酸残基数目的工程化PAL多肽具有约为参考PAL(例如，AvPAL)的酶活性的1.0倍、2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多的酶活性水平。在一些实施方案中，在以下情况下工程化多肽与参考PAL相比具有更多的酶活性：当在4.5至7.5的pH范围测量活性时；当在4.5至6.5的pH范围测量活性时；当在5.0至7.5的pH范围测量活性时；当在5.0至6.5的pH范围测量活性时；当在5.5至7.5的pH范围测量活性时；和/或还有当在5.5至6.5的pH范围测量活性时。在一些其他的实施方案中，工程化PAL多肽具有在1μM至5mM的范围内的K_m值。

还设想，示例性工程化多肽中的任一种(即，在表格中提供的和本文描述的所有变体)可被用作用于合成其他工程化PAL多肽的起始氨基酸序列，例如通过随后轮的通过添加来自其他多肽和本文描述的其他残基位置的多种氨基酸差异的新的组合的演化。在一些实施方案中，另外的改进通过在贯穿较早轮的演化维持未改变的残基位置处包括氨基酸差异来产生。不意图本发明受限于用于产生工程化PAL多肽的任何特定方法，因为任何合适的方法都可被使用，包括但不限于本文提供的方法。

编码工程化多肽的多核苷酸、表达载体和宿主细胞：

本发明提供了编码本文描述的工程化PAL多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸被可操作地连接至控制基因表达的一个或更多个异源调控序列，以创建能够表达多肽的重组多核苷酸。在一些实施方案中，将包含编码工程化PAL多肽的至少一种异源多核苷酸的表达构建体引入到适当的宿主细胞中，以表达对应的PAL多肽。

如对技术人员将是明显的，蛋白序列的可获得性和对应于各种氨基酸的密码子的知识提供了能够编码主题多肽的所有多核苷酸的说明。遗传密码的简并性，其中相同的氨基酸由可替代的密码子或同义密码子编码，允许制备极大数目的核酸，所有这些核酸都编码工程化PAL多肽。因此，本发明提供了通过选择基于可能的密码子选择的组合，用于产生编码本文描述的PAL多肽的可以制备的PAL多核苷酸的每种和每一种可能的变体的方法和组合物，并且所有这些变体都应当被认为是针对本文描述的任何多肽、包括实施例中(例如各种表格中)呈现的氨基酸序列具体公开的。

在一些实施方案中，优选地针对用于蛋白产生的选择的宿主细胞的利用来优化密码子。例如，细菌中使用的优选的密码子通常用于在细菌中表达。因此，编码工程化PAL多肽的密码子优化的多核苷酸在全长编码区中的约40％、50％、60％、70％、80％或大于90％的密码子位置处包含优选的密码子。

在一些实施方案中，PAL多核苷酸编码具有本文公开的特性的PAL活性的工程化多肽，其中所述多肽包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9和/或11的参考序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列，或任何变体的氨基酸序列(例如，实施例中提供的那些)，和与SEQ IDNO:3、5、7、9和/或11的参考多核苷酸相比的一个或更多个残基差异，或如实施例中公开的任何变体的氨基酸序列(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸残基位置)。在一些实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:3、5、7、9和/或11。

在一些实施方案中，PAL多核苷酸编码具有本文公开的特性的PAL活性的工程化多肽，其中所述多肽包含与参考序列SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同序列一性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比的一个或更多个残基差异。

在一些实施方案中，编码工程化PAL多肽的多核苷酸包含选自SEQ ID NO：3、5、7、9和/或11的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码工程化PAL多肽的多核苷酸与SEQ IDNO:3、5、7、9和/或11具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％核苷酸残基同一性。

在一些实施方案中，多核苷酸能够与选自SEQ ID NO:3、5、7、9和/或11的参考多核苷酸序列或其互补序列或者编码本文提供的变体PAL多肽中的任一种的多核苷酸序列在高度严格条件下杂交。在一些实施方案中，能够在高度严格条件下杂交的多核苷酸编码PAL多肽，所述PAL多肽包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。

在一些实施方案中，将编码本文的任何工程化PAL多肽的分离的多核苷酸以多种方式操作，以促进PAL多肽的表达。在一些实施方案中，编码PAL多肽的多核苷酸包括表达载体，其中存在一种或更多种控制序列来调控PAL多核苷酸和/或多肽的表达。取决于利用的表达载体，在将分离的多核苷酸插入载体前对分离的多核苷酸的操作可以是期望的或必要的。用于利用重组DNA方法修改多核苷酸和核酸序列的技术是本领域熟知的。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子，以及其他。在一些实施方案中，基于宿主细胞的选择来选择合适的启动子。对于细菌宿主细胞，用于指导本公开内容的核酸构建体的转录的合适的启动子包括但不限于从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、及原核生物β-内酰胺酶基因(参见例如，Villa-Kamaroff等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 75:3727-3731[1978])、以及tac启动子(参见例如，DeBoer等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:21-25[1983])。用于丝状真菌宿主细胞的示例性启动子包括但不限于从以下的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(参见例如，WO96/00787)、以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)、及其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。示例性酵母细胞启动子可以来自以下的基因：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他可用的启动子是本领域已知的(参见例如，Romanos等人，Yeast 8:423-488[1992])。

在一些实施方案中，控制序列还是合适的转录终止子序列(即，由宿主细胞识别以终止转录的序列)。在一些实施方案中，终止子序列被可操作地连接至编码PAL多肽的核酸序列的3'末端。在所选择的宿主细胞中有功能的任何合适的终止子可用于本发明。用于丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的示例性终止子可以从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子是本领域已知的(参见例如，Romanos等人，上文)。

在一些实施方案中，控制序列还是适合的前导序列(即，对宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区)。在一些实施方案中，前导序列可操作地连接至编码PAL多肽的核酸序列的5'末端。在所选择的宿主细胞中有功能的任何合适的前导序列可用于本发明。用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。用于酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

在一些实施方案中，控制序列还是多腺苷酸化序列(即，可操作地连接至核酸序列的3'末端的序列，并且它在转录时被宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多腺苷残基的信号)。在所选择的宿主细胞中有功能的任何合适的多腺苷酸化序列可用于本发明。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多腺苷酸化序列包括但不限于用于以下的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。用于酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列是已知的(参见例如Guo和Sherman,Mol.Cell.Bio.,15:5983-5990[1995])。

在一些实施方案中，控制序列还是信号肽(即，编码连接至多肽的氨基末端的氨基酸序列并将编码的多肽引导到细胞的分泌途径中的编码区)。在一些实施方案中，核酸序列的编码序列的5'末端固有地包含信号肽编码区，所述信号肽编码区与编码分泌多肽的编码区的区段在翻译阅读框中天然连接。可选择地，在一些实施方案中，编码序列的5'末端包含对于编码序列是外源的信号肽编码区。将表达的多肽引导到选择的宿主细胞的分泌途径中的任何合适的信号肽编码区可用于工程化多肽的表达。用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是这样的信号肽编码区，其包括但不限于从以下的基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌NClB 11837麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽是本领域已知的(参见例如，Simonen和Palva,Microbiol.Rev.,57:109-137[1993])。在一些实施方案中，用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区包括但不限于从以下的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽包括但不限于来自以下的基因的信号肽：酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶。

在一些实施方案中，控制序列还是编码定位于多肽的氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽被称为“前酶(proenzyme)”、“前多肽(propolypeptide)”或“酶原(zymogen)”。前多肽可以通过催化或自体催化前肽从前多肽的裂解被转化为成熟活性多肽。前肽编码区可以从任何合适的来源获得，包括但不限于以下的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)乳糖酶(参见例如WO95/33836)。当信号肽区和前肽区二者都存在于多肽的氨基末端时，前肽区临靠多肽的氨基末端定位，而信号肽区临靠前肽区的氨基末端定位。

在一些实施方案中，还利用了调控序列。这些序列促进相对于宿主细胞的生长调控多肽的表达。调控系统的实例是引起基因表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的调控系统。在原核宿主细胞中，合适的调控序列包括但不限于lac、tac和trp操纵子系统。在酵母宿主细胞中，合适的调控系统包括但不限于ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，合适的调控序列包括但不限于TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。

在另一方面，本发明涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含编码工程化PAL多肽的多核苷酸，以及取决于它们将被引入的宿主的类型，一个或更多个表达调控区，诸如启动子和终止子、复制起点等。在一些实施方案中，将本文描述的各种核酸和控制序列连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体包括一个或更多个方便的限制性位点，以允许在这些位点插入或取代编码PAL多肽的核酸序列。可选择地，在一些实施方案中，本发明的核酸序列通过将该核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当的载体中来表达。在涉及创建表达载体的一些实施方案中，编码序列位于载体中，使得编码序列与适当的控制序列可操作地连接用于表达。

重组表达载体可以是任何合适的载体(例如，质粒或病毒)，可以方便地经受重组DNA程序并且引起PAL多核苷酸序列的表达。载体的选择通常取决于载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒。

在一些实施方案中，表达载体是自主复制载体(即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，诸如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体)。载体可以包含用于确保自我复制的任何工具(means)。在一些可选择的实施方案中，载体是当被引入到宿主细胞中时，被整合到基因组中并与其被整合进的染色体一起复制的载体。此外，在一些实施方案中，利用了单个载体或质粒，或共同包含待被引入到宿主细胞的基因组中的全部DNA的两个或更多个载体或质粒、和/或转座子。

在一些实施方案中，表达载体包含一个或更多个可选择的标志物，其允许容易选择转化的细胞。“可选择的标志物”是一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒耐受性、对于重金属的耐受性、对营养缺陷型提供原养型等。细菌的可选择的标志物的实例包括但不限于来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或赋予抗生素耐受性诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素耐受性的标志物。用于酵母宿主细胞的合适的标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的可选择的标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶；例如，来自构巢曲霉或米曲霉)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶；例如，来自吸水链霉菌(S.hygroscopicus))、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶；例如，来自构巢曲霉或米曲霉)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfate adenyltransferase))和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。在另一方面，本发明提供了包含编码至少一种本发明的工程化PAL多肽的至少一种多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸被可操作地连接至一个或更多个控制序列用于在宿主细胞中表达工程化PAL酶。适于在表达由本发明的表达载体编码的多肽中使用的宿主细胞是本领域熟知的，并且包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(ATCC访问号201178))；昆虫细胞，诸如果蝇属(Drosophila)S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、BHK、293和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。示例性宿主细胞还包括各种大肠杆菌菌株(例如W3110(ΔfhuA)和BL21)。

因此，在另一方面，本发明提供了产生工程化PAL多肽的方法，其中该方法包括将能够表达编码工程化PAL多肽的多核苷酸的宿主细胞在适于表达该多肽的条件下培养。在一些实施方案中，该方法还包括如本文描述的分离和/或纯化PAL多肽的步骤。

用于宿主细胞的适当的培养基和生长条件是本领域熟知的。设想用于将表达PAL多肽的多核苷酸引入到细胞中的任何合适的方法将可用于本发明。合适的技术包括但不限于电穿孔、生物射弹微粒轰击、脂质体介导的转染、氯化钙转染和原生质体融合。

具有本文公开的特性的工程化PAL多肽可以通过使编码天然存在的或工程化的PAL多肽的多核苷酸经受任何合适的诱变和/或本领域中已知的和/或如本文描述的定向演化方法来获得。示例性定向演化技术为诱变和/或DNA改组(参见例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767和美国专利6,537,746)。可以使用的其他定向演化程序包括交错延伸过程(StEP)、体外重组(参见例如，Zhao等人，Nat.Biotechnol.，16:258-261[1998])、诱变PCR(参见例如，Caldwell等人，PCR MethodsAppl.,3:S136-S140[1994])和盒式诱变(参见例如，Black等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:3525-3529[1996])，以及其他。

诱变和定向演化方法可以容易地应用于编码PAL的多核苷酸，以产生可以被表达、筛选和测定的变体文库。任何合适的诱变和定向演化方法可用于本发明，并且是本领域熟知的(参见例如，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、5,837,458、5,928,905、6,096,548、6,117,679、6,132,970、6,165,793、6,180,406、6,251,674、6,265,201、6,277,638、6,287,861、6,287,862、6,291,242、6,297,053、6,303,344、6,309,883、6,319,713、6,319,714、6,323,030、6,326,204、6,335,160、6,335,198、6,344,356、6,352,859、6,355,484、6,358,740、6,358,742、6,365,377、6,365,408、6,368,861、6,372,497、6,337,186、6,376,246、6,379,964、6,387,702、6,391,552、6,391,640、6,395,547、6,406,855、6,406,910、6,413,745、6,413,774、6,420,175、6,423,542、6,426,224、6,436,675、6,444,468、6,455,253、6,479,652、6,482,647、6,483,011、6,484,105、6,489,146、6,500,617、6,500,639、6,506,602、6,506,603、6,518,065、6,519,065、6,521,453、6,528,311、6,537,746、6,573,098、6,576,467、6,579,678、6,586,182、6,602,986、6,605,430、6,613,514、6,653,072、6,686,515、6,703,240、6,716,631、6,825,001、6,902,922、6,917,882、6,946,296、6,961,664、6,995,017、7,024,312、7,058,515、7,105,297、7,148,054、7,220,566、7,288,375、7,384,387、7,421,347、7,430,477、7,462,469、7,534,564、7,620,500、7,620,502、7,629,170、7,702,464、7,747,391、7,747,393、7,751,986、7,776,598、7,783,428、7,795,030、7,853,410、7,868,138、7,783,428、7,873,477、7,873,499、7,904,249、7,957,912、7,981,614、8,014,961、8,029,988、8,048,674、8,058,001、8,076,138、8,108,150、8,170,806、8,224,580、8,377,681、8,383,346、8,457,903、8,504,498、8,589,085、8,762,066、8,768,871、9,593,326和所有相关的美国以及非美国的对应专利；Ling等人，Biochem.,254(2):157-78[1997]；Dale等人，Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996]；Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985]；Botstein等人，Science,229:1193-1201[1985]；Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986]；Kramer等人，Cell,38:879-887[1984]；Wells等人，Gene,34:315-323[1985]；Minshull等人，Curr.Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999]；Christians等人，Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999]；Crameri等人，Nature,391:288-291[1998]；Crameri等人，Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997]；Zhang等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997]；Crameri等人，Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996]；Stemmer,Nature,370:389-391[1994]；Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767；WO 2009/152336；以及美国专利申请公布号2011/0082055、2014/0005057、2014/0214391、2014/0221216、2015/0133307、2015/0134315和2015/0050658；所有这些通过引用并入本文)。

在一些实施方案中，诱变处理后获得的酶克隆通过使酶制品经受指定的温度(或其他测定条件)，并测量热处理或其他合适的测定条件之后剩余的酶活性的量进行筛选。然后将包含编码PAL多肽的多核苷酸的克隆与基因分离、测序以鉴定核苷酸序列改变(如果有)、及用于在宿主细胞中表达酶。测量来自表达文库的酶活性可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如，标准生物化学技术，诸如HPLC分析)来进行。

对于已知序列的工程化多肽，编码酶的多核苷酸可以根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备。在一些实施方案中，高达约100个碱基的片段可以被单独合成、然后被连接(例如，通过酶促或化学连接方法或聚合酶介导的方法)以形成任何期望的连续序列。例如，本文公开的多核苷酸和寡核苷酸可以使用经典的亚磷酰胺方法(参见例如，Beaucage等人，Tet.Lett.,22:1859-69[1981]；和Matthes等人，EMBO J.,3:801-05[1984])，如通常在自动化合成方法中所实践的，通过化学合成来制备。根据亚磷酰胺方法，寡核苷酸被合成(例如，在自动DNA合成仪中)、纯化、退火、连接并克隆入适当的载体。

因此，在一些实施方案中，用于制备工程化PAL多肽的方法可以包括：(a)合成编码包含选自如本文描述的任何变体的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，和(b)表达由多核苷酸编码的PAL多肽。在该方法的一些实施方案中，由多核苷酸编码的氨基酸序列可以任选地具有一个或若干个(例如，高达3个、4个、5个或高达10个)氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列任选地具有1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-21个、1-22个、1-23个、1-24个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个或1-50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列任选地具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列任选地具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、18个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，取代为保守取代或非保守取代。

可以使用本领域中已知的任何合适的测定、包括但不限于本文描述的测定和条件，来评估所表达的工程化PAL多肽的任何期望的改进的特性或特性的组合(例如，活性、选择性、稳定性、酸耐受性、蛋白酶敏感性等)。

在一些实施方案中，使用用于蛋白纯化的熟知技术中的任何一种或更多种，将在宿主细胞中表达的工程化PAL多肽的任一种从细胞和/或培养基回收，所述用于蛋白纯化的熟知技术包括溶菌酶处理、超声处理、过滤、盐析、超离心和色谱法以及其他。

用于分离PAL多肽的色谱技术包括反相色谱法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶电泳和亲和色谱法以及其他。用于纯化特定酶的条件部分地取决于因素诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等，并且对本领域技术人员将是明显的。在一些实施方案中，亲和技术可以被用于分离改进的PAL酶。对于亲和色谱纯化，可以使用特异性结合感兴趣的PAL多肽的任何抗体。为了产生抗体，通过用PAL多肽或其片段注射来免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。在一些实施方案中，PAL多肽或片段通过侧链官能团或附接至侧链官能团的接头的方式附接至合适的载体，诸如BSA。

在一些实施方案中，工程化PAL多肽通过包括以下的方法在宿主细胞中产生：将包含编码如本文描述的工程化PAL多肽的多核苷酸序列的宿主细胞(例如，大肠杆菌菌株)在有利于工程化PAL多肽产生的条件下培养，并从细胞和/或培养基回收工程化PAL多肽。在一些实施方案中，宿主细胞产生多于一种工程化PAL多肽。

在一些实施方案中，本发明提供了产生工程化PAL多肽的方法，所述方法包括在适合的培养条件下培养包含编码工程化PAL多肽的多核苷酸序列的重组细菌细胞，以允许产生工程化PAL多肽，并任选地从培养物和/或培养的细菌细胞回收工程化PAL多肽，所述工程化PAL多肽具有与参考序列SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，以及与如本文提供的SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12相比的一个或更多个氨基酸残基差异。在一些实施方案中，宿主细胞产生多于一种工程化PAL多肽。

在一些实施方案中，将工程化PAL多肽从重组宿主细胞和/或培养基回收后，将它们通过本领域已知的任何合适的方法进一步纯化。在一些另外的实施方案中，将纯化的PAL多肽与其他成分和化合物组合，来提供适当时用于不同应用和用途的包含工程化PAL多肽的组合物和制剂(例如，药物组合物)。

组合物：

本发明提供了适于在多种组合物中使用的工程化PAL多肽。这些组合物可用于许多领域，包括但不限于药物、膳食/营养补充物、食品、饲料、和精细化学品生产。例如，在一些实施方案中，本发明提供了食品和/或饲料，所述食品和/或饲料包含至少一种工程化PAL变体和/或编码至少一种PAL变体的至少一种多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种工程化PAL变体的饮料。

在一些实施方案中，食品、饲料和/或营养/膳食补充物中的工程化PAL变体是糖基化的。此外，工程化PAL变体可用于任何合适的可食用的酶递送基质。在一些实施方案中，工程化PAL变体存在于可食用的酶递送基质中，所述可食用的酶递送基质被设计用于摄取变体后PAL变体在动物的消化道内的快速扩散。

本发明还提供了工程化PAL多肽，所述工程化PAL多肽适于在精细化学品和其他工业上重要的化合物的产生中使用(参见例如，美国专利申请号2013/0340119、2013/0005012和2005/0260724以及WO 2012/122333)。

药物组合物和其他组合物：

本发明提供了工程化PAL多肽，所述工程化PAL多肽适于在药物组合物和其他组合物诸如膳食/营养补充物中使用。

取决于施用方式，包含治疗有效量的根据本发明的工程化PAL的这些组合物呈固体、半固体或液体的形式。在一些实施方案中，组合物包括其他药学上可接受的组分，诸如稀释剂、缓冲液、赋形剂、盐、乳化剂、防腐剂、稳定剂、填料和其他成分。用于配制和施用的技术的细节是本领域熟知的，并在文献中被描述。

在一些实施方案中，配制了工程化PAL多肽用于在口服药物组合物中使用。用于在递送工程化PAL多肽中使用的任何合适的形式可用于本发明，所述形式包括但不限于丸剂、片剂、凝胶片(gel tab)、胶囊、锭剂、糖衣丸、粉末、软凝胶、溶胶凝胶、凝胶、乳剂、植入物、贴剂、喷雾剂、软膏剂、搽剂、霜剂、糊剂、凝胶剂、涂剂、气雾剂、口香糖、缓和剂(demulcents)、条状物(sticks)、悬浮液(包括但不限于油基悬浮液、水包油乳剂等)、浆液、糖浆剂、控释制剂、栓剂等。在一些实施方案中，工程化PAL多肽以适于注射的形式来提供(即，以可注射的制剂的形式)。在一些实施方案中，工程化PAL多肽以生物相容性基质诸如溶胶凝胶，包括基于二氧化硅(例如，氧基硅烷(oxysilane))的溶胶凝胶来提供。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽封装。在一些可选择的实施方案中，将工程化PAL多肽封装在纳米结构(例如，纳米管、纳米小管、纳米胶囊、或微胶囊、微球体、脂质体等)中。实际上，不意图本发明受限于任何特定递送制剂和/或递送方式。设想工程化PAL多肽通过本领域已知的任何合适的方式来施用，包括但不限于：肠胃外、口服、局部、经皮、鼻内、眼内、鞘内、经由植入物等。

在一些实施方案中，将工程化PAL多肽通过糖基化、聚乙二醇化(即，用聚乙二醇[PEG]或活化的PEG等修饰)或其他化合物化学修饰(参见例如，Ikeda,Amino Acids 29:283-287[2005]；美国专利号7,531,341、7,534,595、7,560,263和7,53,653；美国专利申请公布号2013/0039898、2012/0177722等)。实际上，不意图本发明受限于任何特定递送方法和/或机制。

在一些另外的实施方案中，工程化PAL多肽在包含基质稳定的酶晶体的制剂中来提供。在一些实施方案中，该制剂包含交联的结晶工程化PAL酶和具有附接至酶晶体的反应部分的聚合物。本发明还以聚合物提供了工程化PAL多肽。

在一些实施方案中，包含本发明的工程化PAL多肽的组合物包括一种或更多种常用的载体化合物，包括但不限于糖(例如，乳糖、蔗糖、甘露糖醇和/或山梨糖醇)、淀粉(例如，玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物淀粉)、纤维素(例如，甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、树胶(例如，阿拉伯胶、黄芪胶、瓜尔胶等)和/或蛋白(例如，明胶、胶原等)。口服制剂中的另外的组分可以包括着色剂和或甜味剂(例如，葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇)及润滑剂(例如，硬脂酸镁)，以及肠溶包衣(例如，甲基丙烯酸酯聚合物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、和/或本领域已知的任何其他合适的肠溶包衣)。在一些实施方案中，包括了崩解剂或增溶剂(例如，交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐，诸如藻酸钠)。在一些实施方案中，特别是在液体制剂中，将工程化PAL多肽与多种另外的组分组合，所述另外的组分包括但不限于防腐剂、悬浮剂、增稠剂、湿润剂、醇类、脂肪酸和/或乳化剂。

在一些实施方案中，特别是在液体制剂中，将工程化PAL多肽与多种另外的组分组合，所述另外的组分包括但不限于防腐剂、悬浮剂、增稠剂、湿润剂、醇类、脂肪酸和/或乳化剂。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽与用于治疗PKU的其他化合物向受试者组合施用，所述用于治疗PKU的其他化合物包括但不限于四氢生物蝶呤(BioMarinPharmaceutical,Inc.,Novato,CA)、抗酸剂(例如奥美拉唑、埃索美拉唑和其他拉唑类)，以及任何其他合适的化合物。

在一些实施方案中，本发明提供了工程化PAL多肽，所述工程化PAL多肽适于在降低流体诸如血液、脑脊液等中的苯丙氨酸浓度中使用。向具有升高的血液苯丙氨酸水平的患者施用的工程化PAL多肽的剂量取决于患者的基因型、患者的一般状况和本领域技术人员已知的其他因素。在一些实施方案中，具有升高的血液苯丙氨酸水平的PKU患者具有大于360uM的血液苯丙氨酸浓度。然而，不意图本发明受限于向具有大于360uM的血液苯丙氨酸浓度的患者施用，因为本发明可用于具有较低的苯丙氨酸血液浓度的患者。在一些实施方案中，意图将组合物向患者单次或重复施用。在一些实施方案中，设想工程化PAL多肽在向患者施用的组合物中的浓度足以有效治疗、改善和/或预防疾病的症状(例如，PKU和/或PKU相关的状况、疾病和/或症状)。在一些实施方案中，工程化PAL多肽与其他药物组合物和/或膳食组合物组合施用。

在一些实施方案中，PAL酶可用作用于治疗酪氨酸代谢紊乱诸如I型酪氨酸血症、II型酪氨酸血症、III型酪氨酸血症和尿黑酸症的治疗蛋白。这些酪氨酸代谢紊乱是常染色体代谢遗传紊乱，其中参与酪氨酸降解的酶中的一种由于相应基因中的突变而部分起作用或不起作用。这种功能的缺乏导致血流中高水平的酪氨酸和其他酪氨酸代谢物。因为酪氨酸衍生自苯丙氨酸，所以限制苯丙氨酸和酪氨酸摄入对具有酪氨酸代谢紊乱的患者是有益的。因此，PAL酶是对酪氨酸代谢紊乱的潜在治疗。

如果具有酪氨酸代谢紊乱的患者未被及早治疗，高水平的酪氨酸及其分解产物中的一些可以导致显著的医学问题，所述医学问题包括肝衰竭和肾衰竭、肝癌、智力障碍以及甚至死亡。

在一些实施方案中，本发明提供了工程化PAL多肽，所述工程化PAL多肽适于在降低酪氨酸血症和尿黑酸症患者的流体诸如血液、脑脊液等中的苯丙氨酸浓度中使用。向具有高血液酪氨酸水平的患者施用的工程化PAL多肽的剂量取决于患者的基因型、患者的一般状况和本领域技术人员已知的其他因素。在一些实施方案中，意图将组合物向酪氨酸血症或尿黑酸症患者单次或重复施用。在一些实施方案中，设想工程化PAL多肽在向患者施用的组合物中的浓度足以有效治疗、改善和/或预防疾病的症状(例如，I型、II型或III型酪氨酸血症或尿黑酸症、疾病和/或症状)。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽与尼替西农或其他药物组合物和/或膳食组合物组合向酪氨酸血症和尿黑酸症患者施用。

工业组合物：

设想本发明的工程化PAL多肽将可用于工业组合物中。在一些实施方案中，配制了工程化PAL多肽用于在食品和/或饲料工业中使用。在一些实施方案中，将工程化PAL多肽配制为粒状或丸状产品，将其与动物饲料组分诸如另外的酶(例如，纤维素酶、漆酶和淀粉酶)混合。在一些可选择的实施方案中，将工程化PAL多肽用于液体动物饲料组合物(例如，基于水或油的浆液)中。因此，在一些实施方案中，本发明的工程化PAL变体是足够热耐受性和热稳定的，以承受用于产生丸剂和其他加工的饲料/食品的处理。

本发明的工程化PAL变体还可用于生产苯丙氨酸和/或苯丙氨酸衍生物。

可以结合以下非限制性实施例更好地理解本发明的前述和其他方面。提供实施例仅用于说明目的并且不意图以任何方式限制本发明的范围。

实验

提供了以下实施例，包括实验和获得的结果，仅用于说明性目的，而不应当被解释为限制本发明。

在以下实验公开内容中，以下缩写适用：ppm(百万分率(parts per million))；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)，uM和μΜ(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；gm和g(克)；mg(毫克)；ug和μg(微克)；L和l(升)；ml和mL(毫升)；cm(厘米)；mm(毫米)；um和μm(微米)；sec.(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；U(单位)；MW(分子量)；rpm(每分钟转数)；psi和PSI(每平方英寸磅数)；℃(摄氏温度)；RT和rt(室温)；CDS(编码序列)；DNA(脱氧核糖核酸)；RNA(核糖核酸)；AUC(曲线下面积)；大肠杆菌W3110(常用的实验室大肠杆菌菌株，可从大肠杆菌遗传资源中心(Coli Genetic Stock Center)[CGSC]，New Haven,CT获得)；HTP(高通量)；HPLC(高压液相色谱)；CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)；IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)；PES(聚醚砜)；PHE和phe(苯丙氨酸)；BSA(牛血清白蛋白)；PBMC(外周血单核细胞)；PKU(苯丙酮尿症)；MHC(主要组织相容性复合物)；HLA(人类白细胞抗原)；HLA-DR(由染色体#6上的HLA复合物编码的MHC II类细胞表面受体)；FIOPC(相对于阳性对照的改进倍数)；LB(Luria肉汤)；Athens Research(Athens Research Technology,Athens,GA)；ProSpec(ProSpec Tany Technogene,East Brunswick,NJ)；Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)；RamScientific(Ram Scientific,Inc.,Yonkers,NY)；Pall Corp.(Pall,Corp.,Pt.Washington,NY)；Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA)；Difco(Difco Laboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI)；Molecular Devices(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA)；Kuhner(Adolf Kuhner,AG,Basel,Switzerland)；Biospringer(Biospringer North America,Milwaukee,WI)；CambridgeIsotope Laboratories,(Cambridge Isotope Laboratories,Inc.,Tewksbury,MA)；Applied Biosystems(Applied Biosystems,Life Technologies,Corp.,Grand Island,NY的一部分),Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)；Thermo Scientific(Thermo Fisher Scientific，Waltham,MA的一部分)；Corning(Corning,Inc.,Palo Alto,CA)；Constant Systems(Constant Systems Ltd.,Daventry,United Kingdom)；Megazyme(Megazyme International,Wicklow,Ireland)；Enzo(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,NY)；GE Healthcare(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)；Harlan(Harlan Laboratories,Indianapolis,IN)；AB Sciex(AB Sciex,Framingham,MA)；PetAg Inc.(PetAg,Hampshire,IL)和Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。

以下多核苷酸和多肽序列可用于本发明。在一些情况下(如以下示出的)，多核苷酸序列随后是所编码的多肽。

WT AvPAL的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

WT AvPAL的多肽序列(SEQ ID NO:2)：

变体#1的多核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：

变体#1的多肽序列(SEQ ID NO:4)：

实施例1

PAL基因获得和表达载体的构建

设计具有用于在大肠杆菌中优化表达的密码子的多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶(AvPAL)基因序列，并克隆到大肠杆菌表达载体pET16b中以提供pET16b-AvPAL，并如美国专利第9,611,468号的实施例1中描述的进行亚克隆。将质粒构建体转化到源自W3110的大肠杆菌菌株中。使用本领域技术人员通常已知的定向演化技术从这个质粒构建体产生基因变体文库(参见例如，美国专利号8,383,346和WO2010/144103)以及AvPAL衍生物。在一些实施方案中，可使用缺乏抗微生物耐受性标志物的表达载体。

实施例2

高通量(HTP)生长和测定

PAL和PAL变体的高通量(HTP)生长

将转化的大肠杆菌细胞通过铺在包含1％葡萄糖和30μg/ml氯霉素的LB琼脂板上来选择。在37℃孵育过夜后，将菌落放置到96孔浅平底板(NUNC^TM，Thermo-Scientific)的孔中，所述孔中填充有180μl/孔的补充有1％葡萄糖和30μg/ml氯霉素的LB。允许培养物在振荡器中过夜生长18-20小时(200rpm、30℃和85％相对湿度；Kuhner)。将过夜生长的样品(20μL)转移到填充有380μL的补充有30μg/ml氯霉素的Terrific肉汤的Costar 96孔深板中。将板在振荡器中孵育135分钟(250rpm、30℃和85％相对湿度；Kuhner)。然后将细胞用40μL无菌水中的10mM IPTG诱导，并在振荡器中过夜孵育20-24小时(250rpm、30℃和85％相对湿度；Kuhner)。使细胞沉淀(4000rpmx 20min)，将上清液弃去，并在分析之前将细胞在-80℃冷冻。

HTP沉淀物的裂解

首先，将500μL裂解缓冲液(20mM磷酸钠、pH8、150mM NaCl、1mg/ml溶菌酶和0.5mg/ml硫酸多粘菌素B)添加到细胞沉淀物中。将混合物在室温搅拌1.5-2h，并离心(4000rpm x5min)，然后在本文描述的多种HTP测定中使用澄清的裂解物。这些裂解物通过SDS-PAGE的分析显示，过表达的蛋白以～60kDa的表观MW存在，与PAL的预计的MW一致。

澄清的裂解物的分析

PAL变体活性通过测量肉桂酸的形成来确定，肉桂酸的形成通过随时间推进的290nm处吸光度来确定。对于该测定，将100μL的pH 7.5的200mM Tris/50mM苯丙氨酸或pH7.0的200mM磷酸钠/50mM苯丙氨酸，80μL水，和20μL澄清的裂解物添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(Costar#3635,Corning)的孔中。将反应物短暂混合，并且通过使用Plus 384或190(Molecular Devices)吸光度酶标仪随时间推进的290nm处吸光度来确定活性(在5-20min内每12-20s一次)。

用蛋白酶预处理的澄清的裂解物的HTP-分析

PAL变体的活性在与胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶一起孵育以模拟肠道(例如，上肠)的环境后来确定。首先，将30μL蛋白酶混合物(0.01-100mg/ml胰凝乳蛋白酶(C4129 SigmaAldrich)、0.01-100mg/ml胰蛋白酶(T7409Sigma Aldrich)、1mM CaCl₂和1mM HCl)、0-30μL的在pH7.0的500mM磷酸钠中的20mM牛磺胆酸钠、和90-120μL澄清的裂解物添加到96孔圆底微量滴定板(Costar#3798,Corning)的孔中。将板密封，并在37℃振荡孵育1h(振荡器HT Infors AJ185，400rpm、1"摆幅)，然后分析。对于该测定，将100μL的pH 7.5的200mM Tris/50mM苯丙氨酸或pH7.0的200mM磷酸钠/50mM苯丙氨酸和100μL蛋白酶处理的裂解物添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(Costar#3635,Corning)的孔中。将反应物短暂混合，并且通过使用Plus 384或190(MolecularDevices)吸光度酶标仪追踪随时间推进的290nm处吸光度来确定活性(在5-20min内每12-20s一次)。结果在以下表中提供。

在升高的温度储存后PAL变体的HTP-分析

将以高通量生长的PAL变体的裂解物在65℃孵育1小时，并使不溶性物质沉淀(4000rpmx 10min)。将上清液转移至新的96孔微量滴定板(NUNC^TM,Thermo-Scientific)，冷冻并冻干成干粉。将冻干的酶在45℃在HT振荡器(Infors AJ185)中孵育多达10天。随后将冻干的酶在400μL ddH₂O中重悬浮，并通过搅拌10min来混合。对于该测定，将100μL的pH7.0的200mM磷酸钠/50mM苯丙氨酸、80μL ddH₂O和20μL酶悬浮液添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(Costar#3635,Corning)的孔中。将反应物短暂混合，并且通过使用Plus 384或190(Molecular Devices)吸光度酶标仪跟踪随时间推进的290nm处吸光度来确定活性(在5-20min内每12-20s一次)。

实施例3

来自摇瓶(SF)培养物的冻干的裂解物

将如以上实施例2描述生长的选择的HTP培养物铺在具有1％葡萄糖和30μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，并在37℃生长过夜。将来自每个培养物的单菌落转移到50ml具有1％葡萄糖和30μg/ml氯霉素的Luria Bertani培养基中。使培养物在30℃、250rpm生长18h，并以约1:10稀释到250ml具有30μg/ml氯霉素的Terrific肉汤中来亚培养，至最终OD600为0.2。将培养物在30℃、250rpm孵育135分钟，至OD 600为0.6，并用1mM的IPTG诱导。将诱导的培养物在30℃、250rpm孵育20h。在该孵育期之后，将培养物以4000rpm x 10min离心。将上清液弃去，并将沉淀物在30ml的pH 8的20mM磷酸钠、150mM NaCl中重悬浮。使细胞沉淀(2860xg10min)，在12ml pH 7.5的50mM磷酸钠中重悬浮，并使用One Shot Cell Disruption系统(Constant Systems)在17,000psi裂解。使裂解物沉淀(10,000rpm x 30min)，并将上清液冷冻及冻干以产生酶粉末。

来自摇瓶培养物的PAL的纯化

如以上描述的，使选择的变体在摇瓶培养中生长至饱和。将饱和的培养物通过离心(4000rpm×20min)沉淀，并在纯化之前将细胞沉淀物在-80℃储存。将细胞沉淀物在室温解冻，并以5mL缓冲液/g细胞在pH 8的20mM磷酸钠、150mM NaCl中重悬浮。样品浆液使用微流化器(microfluidizer)用110psi的压力设定来裂解。将所得裂解物通过以10,000rpm离心1小时、随后过滤通过0.2μm PES滤器(Millipore)来澄清。

过滤后，在10mM苯丙氨酸的存在或不存在下，将所得裂解物在55-65℃加热1.5-2小时。将裂解物从热源移开，并通过在4℃以10,000rpm离心1小时来澄清。然后将包含可溶性PAL的上清液过滤通过0.2μm PES滤器。

大量结晶(bulk crystallization)用无颗粒溶液来进行。将过滤后的浓缩物和抗溶剂(0.1M HEPES、0.2M NaCl、pH 7.5、25％(w/v)PEG 3350)分别加热至40℃。将抗溶剂以小增量缓慢添加，直到浊点持续。接触接种通过在溶液达到其浊点后向溶液添加少量现有晶体来实现(这一步并非必要)。使溶液在6小时内从40℃线性冷却至4℃。将悬浮液定期温和混合以使固体重悬浮。将悬浮液在4℃保持12至24小时。将液体弃去，保留沉淀的晶体。用水洗涤结晶固体以去除残留的PEG。洗涤过的晶体通过冻干过夜来干燥。

实施例4

纯化的PAL和PAL变体的表征

在这个实施例中，描述了为表征野生型和变体PAL进行的测定。

对储存条件的耐受性

将冻干的酶变体在HT振荡器(Infors AJ185)中在45℃孵育1、5、7或10天。将冻干的酶在400μL ddH₂O中重悬浮，并通过搅拌10min来溶解。对于该测定，将100μL的pH 7.0的200mM磷酸钠/50mM苯丙氨酸、80μL dd H₂O和20μL重悬浮物添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(Costar#3635,Corning)的孔中。将反应物短暂混合，并且通过使用Plus 384或190(Molecular Devices)吸光度酶标仪追踪随时间的290nm处吸光度来确定活性(在5-20min内每12-20s一次)。

对肠液的耐受性

将如实施例3中描述制备的PAL变体样品以2g/L溶解于模拟肠液中。将PAL变体溶解到以下四种模拟肠液中的每一种中：禁食状态模拟肠液(牛磺胆酸钠3mM、卵磷脂0.2mM、马来酸19.12mM、氢氧化钠34.8mM、氯化钠68.62mM、pH 6.5)、早期进食状态模拟肠液(牛磺胆酸钠10mM、卵磷脂3mM、马来酸28.6mM、氢氧化钠52.5mM、氯化钠145.2mM、单胆酸甘油酯6.5mM、油酸钠40mM、pH 6.5)、中期进食状态模拟肠液(牛磺胆酸钠7.5mM、卵磷脂2mM、马来酸44mM、氢氧化钠65.3mM、氯化钠122.8mM、单胆酸甘油酯5mM、油酸钠30mM、pH 5.8)、晚期进食状态模拟肠液(牛磺胆酸钠4.5mM、卵磷脂0.5mM、马来酸58.09mM、氢氧化钠72mM、氯化钠51mM、单胆酸甘油酯1mM、油酸钠0.8mM、pH 5.4)。将猪胰蛋白酶和牛胰凝乳蛋白酶(各100mg)溶解于2mL pH 7.0的100mM磷酸钠中，并在每种模拟液体中稀释至1.5mg/mL。在具有和不具有胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的每种模拟液体中测量了随时间推进的酶活性。将反应混合物在37℃在HT振荡器(Infors AJ185)中以400rpm(1"摆幅)孵育1-24h。然后，将20μL反应物与80μL水和100μL pH 7.0的100mM磷酸钠、50mM苯丙氨酸混合。将每种溶液短暂混合，并且通过使用Plus 384或190(MolecularDevices)吸光度酶标仪追踪随时间推进的290nm处吸光度来确定活性(在5-20min内每12-20s一次)。

实施例5

通过发酵和结晶产生PAL变体

发酵分批培养基((NH₄)₂SO₄ 0.52g/L、柠檬酸钠二水合物0.59g/L、K₂HPO₄.3H₂O7.5g/L、KH₂PO₄ 3.7g/L、酵母提取物(Biospringer)2.0g/L、聚丙二醇(PPG 2000)0.3ml/L、柠檬酸铁(III)铵0.05g/L、微量元素储备溶液5.0ml/L(CaCl₂·2H₂O 2.0g/L、ZnSO₄·7H₂O2.2g/L、MnSO₄·H₂O 0.5g/L、CuSO₄·5H₂O 1.0g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1g/L、Na₂B₄O₇·10H₂O 0.02g/L，用H₂SO₄调节至pH 2-3))用初始浓度约10g/L的葡萄糖补充。接种后，将培养物控制在37℃，并且溶解氧水平不少于45％。如通过pH从设定点7.00至7.05的峰值指示的，在分批葡萄糖耗尽后，使补料分批进料(葡萄糖一水合物500g/L和无水硫酸镁5.1g/L)初始化。葡萄糖进料以0.41ml/min的速率起始，并在12小时内使用指数曲线增加至2.42ml/min的最终进料速率。然后，对于发酵的剩余部分，将进料保持在2.42ml/min的恒定速率。

当将0.94L的累积体积的进料溶液进料到发酵器中时，将温度降低至30℃，并且通过添加IPTG至1mM的浓度来诱导PAL变体的表达。当将3.84L的总进料体积递送至发酵器时，表达阶段结束。总诱导时间为约20小时。

细胞通过离心(3752xg)10min来收集，并且沉淀物被直接使用或冷冻保存。使用由pH 8.0的20mM磷酸钠、150mM NaCl组成的冷缓冲液(4℃)将沉淀物重悬浮至原始收获体积。在重悬浮过程期间，用NaOH将pH调节至8.0±0.2。在匀浆前将悬浮液冷却至6℃。使用配有适当的细胞破碎阀的高压匀浆器(APV 1000)以11,500±500psig将细胞内的酶从细胞释放。细胞破碎后，立即将匀浆冷却至15±2℃，并使用NaOH将匀浆的pH调节至8.0±0.2。将10％w/v SuperFloc C581添加至细胞匀浆。在添加期间，搅拌匀浆和C581混合物以确保完全混合。将悬浮液在10±2℃搅拌孵育30分钟，然后加热至55℃±2℃，并在55℃保持1小时。将热处理的悬浮液冷却至10±2℃。通过离心来实现固体与液体级分的分离。将匀浆以5050xg离心35min。进行浓缩步骤以使蛋白浓度在30g/L和40g/L之间。将浓缩的澄清裂解物用两倍体积的pH 8.0的20mM磷酸钠/150mM氯化钠透析过滤(dia-filter)。溶液的浓缩和缓冲液交换通过TangenX 30kD PES NovaSet^TM-LS盒来实现。将浓缩物通过具有PES膜的0.2μmNalgene^TM Rapid-Flow^TM一次性过滤元件过滤灭菌。

将过滤后的浓缩物和抗溶剂(0.1M HEPES、0.2M氯化钠、pH 7.5、25％(w/v)PEG3350)分别加热至40℃。将抗溶剂缓慢添加到PAL变体浓缩物中，直至浊点持续。接触接种通过在溶液达到浊点后向溶液添加少量晶体来实现。在6小时内使溶液从40℃线性冷却至4℃，并定期温和混合。将悬浮液在4℃保持12至24小时。将液体弃去，并用水洗涤结晶固体以去除残留的PEG。然后将洗涤过的结晶固体冻干过夜来干燥。

实施例6

筛选结果

产生了SEQ ID NO:4的变体(变体#1)，包括变体#2(SEQ ID NO:6)，其在变体1的序列中掺入了另外的F450A突变。还使用变体#2作为起始骨架产生了变体。如实施例2中描述的，测试了这些变体在以冻干的形式在45℃孵育0天或10天后的PAL活性。此外，仅在第0天测试了具有苯丙氨酸残基突变的变体。具有对应的相对于阳性对照的倍数改进(FIOP)的活性变体的重测试数据在以下表6.1中示出。在该数据集合中，阳性对照为变体#2。

在以上表中，活性倍数改进(FIOP)为与骨架SEQ ID NO:6(变体#2)的比较，并定义如下：“-”＝少于0.2倍活性；“+”＝大于0.2倍、但少于1倍活性；“++”＝大于1倍、但少于1.25倍增加的活性；“+++”＝大于1.25倍、但少于1.5倍增加的活性；以及“++++”＝大于1.5倍活性。

实施例7

击中(hit)的确认

基于以上表6.1中示出的结果，确认了表7.1(以下)中列出的变体按实施例3中的描述制备的酶样品的活性。

在以上表中，活性倍数改进(FIOP)为与骨架SEQ ID NO:6(变体#2)的比较，并定义如下：“+”＝大于0.95倍、但少于1倍增加的活性；“++”＝大于1倍、但少于1.25倍增加的活性；以及“+++”＝大于1.25倍增加的活性。

实施例8

另外的变体的筛选结果

将如实施例6中描述的鉴定出的有益突变重组为SEQ ID NO:8(变体第23号)(在表6.1和表7.1中示出)，并测试了新变体以冻干的形式在45℃孵育0天和10天后的PAL活性。用变体#23作为阳性对照，具有对应的相对于阳性对照的倍数改进(FIOP)的活性变体的重测试数据在表8.1中示出。在以下表中，一些变体包含相同的取代(即，重复，诸如变体52和变体61)，因为这些测定测试结果是在获得变体的测序数据之前获得的。

在以上表中，活性倍数改进(FIOP)为与骨架SEQ ID NO:8(变体#23)的比较，并定义如下：“-”＝小于0.2倍活性；“+”＝大于0.2倍、但少于1倍活性；“++”＝大于1倍、但少于1.25倍增加的活性；“+++”＝大于1.25倍活性、但少于1.5倍增加的活性；以及“++++”＝大于1.5倍活性。

实施例9

苯丙氨酸残基的去除

其中将苯丙氨酸残基改变而不导致活性的损失(即，对活性是中性或有益的苯丙氨酸突变)的SEQ ID NO:6(变体#2)的变体的活性结果在表9.1中示出。如表8.1中一样，在以下表中，一些变体包含相同的取代，因为这些测定测试结果是在获得变体的测序数据之前获得的。

在以上表中，活性倍数改进(FIOP)为与骨架SEQ ID NO:6(变体#2)的比较，并定义如下：“+”＝与SEQ ID NO:6(变体2)或SEQ ID NO:8(变体23)相似的活性。

实施例10

第9轮筛选结果

基于对先前结果的分析，使用SEQ ID NO:12(变体#126)作为骨架设计了组合文库，因为变体#126在高通量筛选中显示出改进的储存稳定性以及蛋白酶耐受性。与变体#51(SEQ ID NO:9)相比，编码变体#126(SEQ ID NO:11)的多核苷酸序列包含A21T突变。如实施例4中描述的，在多种模拟肠液中将这个变体与野生型AvPAL比较。将冻干的酶在45℃孵育T＝0天和T＝10天后，具有相对于变体#126的对应的活性倍数改进的活性突变在以下表10.1中示出。如实施例中的其他表中一样，在以下表中，一些变体包含相同的取代，因为这些测定的测试结果是在获得变体的测序数据之前获得的。

在这个表中，活性倍数改进(FIOP)为与骨架SEQ ID NO:12(变体#126)的比较，并定义如下：“-”＝少于0.2倍活性；“+”＝大于0.2倍、但少于1倍活性；“++”＝大于1倍、但少于1.25倍增加的活性；以及“+++”＝大于1.25倍活性。

实施例11

血浆苯丙氨酸水平

分析了血浆样品的苯丙氨酸和肉桂酸。内标物通过将苯丙氨酸或肉桂酸溶解于50/50乙腈:DMSO中，并且然后在50％乙腈中稀释至10-40,000ng/ml的工作浓度来生成。将这些样品在空白狗血浆(10μL:90μL)中稀释，并且然后用300μL内标物(乙腈中的250ng/ml的d₈-Phe或d₇-CA)稀释。将动物血浆样品(20μL)用乙腈(80μL)稀释，并且然后用300μL内标物稀释。对于苯丙氨酸浓度的分析，将30μL样品用Luna C18柱(2.1x 100mm，5μm)，使用Shimadzu HPLC/CTC Autosampler注入。将样品使用水中的0.5％甲酸、5mM乙酸铵和90％乙腈及10％水与0.5％甲酸的梯度在2.5分钟内洗脱，且苯丙氨酸在1.3min时洗脱。

对于肉桂酸的分析，将30μL样品用Thermo Silica柱(2.1x 100mm，5μm)使用Shimadzu HPLC/CTC Autosampler注入。将样品使用水中的5mM乙酸铵和90％乙腈/10％水的梯度在3.5分钟内洗脱，且肉桂酸在2.3min时洗脱。分析物使用API-4000Q-trap MassSpectrometer来检测，以ESI正模式(苯丙氨酸)或负模式(肉桂酸)进行MRM扫描。同位素标记的苯丙氨酸衍生物的转变为166.2/120.0、171.2/125.1和174.2/128.2。同位素标记的肉桂酸的转变为146.8/102.9、151.9/107.9和153.9/110.1。

实施例12

变体#126在狗模型中的肠活性

为了评估PAL变体运送通过胃肠道时的稳定性和活性，将比格狗用纯化的酶变体强饲。测量了这些变体对狗血液中苯丙氨酸和肉桂酸的浓度的效应。使狗禁食过夜(12-16小时)，并贯穿研究直至酶给药后8小时。所有狗在研究开始前2小时被施用口服剂量的法莫替丁(40mg/狗)，并且然后在+3小时再次施用，以使胃酸化最小化。研究前血浆样品(～2mL)在-2小时(在临第一法莫替丁剂量之前)、-30min和-10min来采集(使用这三次测量的平均值将给药后的值归一化)。在媒介物或变体#126的给药后精确5分钟，在t＝0时，所有狗接受900mg/kg PO剂量的悬浮液中的山羊奶粉Esbilac(PetAg)蛋白(4mL/kg)。另外的血浆样品在给药处理后15min、+30min、和+1h、+2h、+4h、+6h、+8h、及+24h来采集。如实施例11中描述的分析了血浆样品的Phe和CA。

结果在图3、图4和图5中示出。在图3中，示出了不同组的相对血液苯丙氨酸水平。施用媒介物后，观察到苯丙氨酸水平的1.35倍增加。施用所有剂量的变体#126抑制了这种立即出现的苯丙氨酸峰值，并导致在t＝1hr时除了200mg/kg组以外的血液苯丙氨酸的减少。在2hr时间点，120mg/kg组显示出血液苯丙氨酸的34％减少。

图5示出了不同组的肉桂酸水平。在实施变体#126施用后，除了媒介物以外所有组都显示出肉桂酸的快速出现。肉桂酸形成的快速开始导致120mg/kg剂量在15分钟时的C_max，60mg/kg剂量的PAL在30min时的C_max，以及200mg/kg剂量在1hr时的C_max。在所有剂量组中，持续10小时在血浆中检测到肉桂酸。在200mg/kg剂量组中，肉桂酸持续高于基线24小时。

在图5中，在变体#126施用后的前4hr期间形成的肉桂酸的量按AUC来定量。60mg/kg、120mg/kg和200mg/kg组的AUC与媒介物响应有统计显著的差异。

实施例13

变体#126在食蟹猴中的肠活性

通过测量血浆苯丙氨酸和肉桂酸水平，使用食蟹猴来评估变体#126将苯丙氨酸转化为肉桂酸的效力。动物中的一些在施用变体#126前两小时接受了一个剂量的法莫替丁(每只猴20mg)。将酶通过强饲施用，并且5分钟后用900mg/kg山羊奶Esbilac(PetAg)蛋白开始研究(t＝0)。如实施例11中描述的分析了血浆样品的Phe和CA。

在图6中，绘制了在施用变体#126之后的前8hr内不同组的相对血浆苯丙氨酸水平。施用媒介物导致在1hr时苯丙氨酸水平的1.7倍增加。施用所有剂量的变体#126抑制了这种苯丙氨酸峰值，并导致在1hr至2hr后血液苯丙氨酸的减少。在1小时时与媒介物相比，用变体#126处理的所有组显示出20％和38％之间的血浆苯丙氨酸的减少。

如图7中示出的，苯丙氨酸的相对减少按0hr至4hr时间段的AUC来定量。用变体#126给药的所有组平均具有的苯丙氨酸的AUC比媒介物对照组低22％。

如图8中示出的，不同剂量组的血浆中时间依赖性的肉桂酸浓度被示出。图8(顶部)示出了用法莫替丁预处理的组中的肉桂酸形成；图8(底部)示出了在给药前未用法莫替丁处理的组的这些数据。肉桂酸水平迅速上升，在1hr时达到C_max，并且然后在4hr时减弱至接近基线。在媒介物对照组中未检测到肉桂酸。

如图9中示出的，施用后在初始的0hr至4hr期间肉桂酸的形成按AUC来定量。图9(顶部)示出了用法莫替丁预处理的组的AUC。剂量的10倍增加导致肉桂酸产量的少于2倍增加。图9(中部)示出了未用法莫替丁预处理的组的AUC，并且所有组显示出相似水平的肉桂酸形成。图9(底部)示出了用相同量的变体#126给药但已经用法莫替丁预处理或未用法莫替丁预处理的组的直接比较。法莫替丁处理未显示出统计显著的效应。

图6至图9中提供的结果证明，向健康食蟹猴口服施用变体#126对血浆中的苯丙氨酸水平具有统计显著的效应。此外，向食蟹猴口服施用变体#126后，形成的肉桂酸的量对应于去除约9mg/kg的苯丙氨酸。这个量在健康个体和PKU患者摄入苯丙氨酸的情况下是重要的。

实施例14

单独突变变体的筛选结果

将所有氨基酸突变单独地制备(made)到变体126(SEQ ID NO:12)中，并且以冻干的形式在45℃孵育0天(T＝0)或10天(T＝10)后测试PAL活性，并测试蛋白酶稳定性，每种以一式三份来测试。以下表中提供了突变和测定结果。

在以上表中，活性倍数改进(FIOP)为与SEQ ID NO:12(变体#126)的比较，并定义如下：“-”＝少于0.2倍活性；“+”＝大于0.2倍、但少于1倍活性；“++”＝大于1倍、但少于1.25倍增加的活性；以及“+++”＝大于1.25倍活性。

实施例15

另外的变体的组合筛选结果

将变体第126号(SEQ ID NO:12)中鉴定出的突变组合添加到SEQ ID NO:2中。测试了新变体以冻干的形式在45℃孵育0天(T＝0)或7天(T＝7)后的PAL活性，以及在蛋白酶的存在下的稳定性。用SEQ ID NO:12(变体#126)作为阳性对照，具有对应的相对于阳性对照的倍数改进(FIOP)的变体的数据在表15.1中示出。

在以上表中，将活性倍数改进(FIOP)与SEQ ID NO:12(变体#126)的活性倍数改进(FIOP)比较，并定义如下：“-”＝少于0.2倍；“+”＝大于0.2倍、但少于1倍；“++”＝大于1倍、但少于1.25倍增加的活性；以及“+++”＝大于1.25倍活性。

虽然已经参考具体的实施方案描述了本发明，但是可以做出多种改变并且可以替换等同物，以适应特定的情况、材料、物质的组成、方法、方法一个步骤或多个步骤，从而实现本发明的益处，而不偏离所要求保护的范围。

为了在美国的所有目的，本公开内容中引用的每个和每一个公布物和专利文件通过引用并入本文，如同每个这样的公布物或文件被明确及分别指出以通过引用并入本文一样。对公布物和专利文件的引用不意图作为任何此类文件是相关的现有技术的指示，也不构成对其内容或日期的承认。

序列表

<110> 科德克希思公司

庄静斌

威廉·凯西·哈洛斯

尼古拉斯·J·阿加德

奥斯卡·阿尔维左

尼基·德拉斯

吉伽特·W·哈思曼

约翰·约瑟夫·尼可斯

<120> 工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽

<130> CX7-159USP1

<140> 待指定

<141> 2017-02-13

<160> 12

<210> 1

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 多变鱼腥藻(Anabaena variabilis) PAL

<400> 1

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accagcggtt ttggtggtat ggcaaatgtt gcaattagcc gtgaacaggc aagcgaactg 300

cagaccaatc tggtttggtt tctgaaaacc ggtgcaggta ataaactgcc gctggcagat 360

gttcgtgcag caatgctgct gcgtgcaaat agccacatgc gtggtgcaag cggtattcgt 420

ctggaactga ttaaacgcat ggaaatcttt ctgaatgccg gtgttacccc gtatgtttat 480

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<213> 多变鱼腥藻(Anabaena variabilis) PAL

<220>

<223> 多变鱼腥藻(Anabaena variabilis) PAL

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Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Cys

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<220>

<223> 来自多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL的变体

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<223> 来自多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL的变体

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<223> 来自多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL的变体

<400> 5

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aatagcagcg caaatgtgat tattggtaat cagaaactga ccatcaatga tgttgtacgt 120

gttgcccgta atggcaccgc ggttagcctg accaataata aagatattct gcagcgtatt 180

caggccagct gtgattatat caataatgca gttgaaaaag gtgaaccgat ttatggtgtt 240

accagcggtt ttggtggtat ggcaaatgtt gtaattagcc gtgaacaggc aagcgaactg 300

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 来自多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL的变体

<400> 6

Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe

1 5 10 15

Ser His Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys

20 25 30

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<223> 来自多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL的变体

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<223> 来自多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL的变体

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Asp Ile Leu Pro Pro Leu His

565

Claims (55)

1.一种工程化多肽，所述工程化多肽包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和/或12中的至少一种具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:2的氨基酸序列来编号。

2.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：16、16/150、44/56、44/56/102/239/285/469/470/495、44/239、44/239/285/469/495、44/239/285/470、44/239/469/470、44/239/470/546、44/239/495、44/239/495/546、44/469/470、102、102/470、162、165、188、239/285、239/285/469、239/469/470/495、264、267、285/469/470/495、285/470、285/470/495、364、455、469/470、472和482，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:6来编号。

3.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代：16、264、364、472、482和/或其任何组合，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:6来编号。

4.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：44/47/204/209/285、44/47/364/470/495、44/54/56/204/239/285/364/495、44/54/56/204/239/470/495、44/54/285/470、44/102/285/364、44/204/209/285、44/204/285/364/470/495、44/209/285/460/495、44/285/364、47/54/209、47/204/209/239/285/495、47/204/285/364/495、47/209/239/364、47/239/285/364、47/470、54、54/56、54/56/204/209/470、54/56/204/209/495、54/56/204/495、54/56/209/562、54/56/285/364/470、54/56/285/470、54/165/204/209/239/285/470/495、54/239/495、54/285/470、54/470、56、165、204、204/209/239/285/470/495、204/209/364、204/209/364/495、204/239、204/239/285、204/364、204/470、209/285/364/470、209/285/364/470/495、209/364、209/364/495、209/470、239/364、285/364、285/364/495、364、364/470、470和495和/或其任何组合，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。

5.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：16、16/150、162、188、264、267、398、434、472和482和/或其任何组合，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:6来编号。

6.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：54/56/162/204/285、54/56/162/204/398、54/56/204/285、54/56/204/398、54/56/204/398/472、54/56/285、54/56/398、54/56/398/472、54/162/204/398、54/162/398、54/204/285/398/472、54/204/398、54/285/398、54/285/398/472、56/162/398、56/204/285、56/204/398、56/204/398/460、56/204/398/472、56/285、56/285/398/472、56/398、56/398/472和201/204/398和/或其任何组合，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:12来编号。

7.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：16、18、39、47、54、59、73、91、209、214、285、290、305、307、364、407、450、470、503、521、524和565和/或其任何组合，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:12来编号。

8.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置的至少一种取代或取代集合：15/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/19/214/407、16/18/23/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/43/44/59/209/503/565、16/18/39/45/47/54/59/73/98/209/214/285/290/305/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/49/54/59/73/209/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/98/285/290/305/307/364/450/470/503/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/313/364/450/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/450/470/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/450/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/307/364/407/450/470/503/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/285/290/305/307/407/450/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/209/285/290/307/364/407/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/307/364/407/503、16/18/39/47/54/59/73/91/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521、16/18/39/47/54/59/73/91/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/73/91/285/290/305/364/407/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/73/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/91/98/209/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/47/54/59/91/209/214/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/91/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/59/91/214/285/290/305/307/364/450/503/521/524、16/18/39/47/54/59/91/285/290/305/307/364/407/450/503/521/524、16/18/39/47/54/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/470/503/521/565、16/18/39/47/54/73/91/209/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/47/54/73/209/214/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/39/47/54/91/214/285/290/364/407/450/470/503/521、16/18/39/47/54/209/214/407/503/524/565、16/18/39/47/59/73/91/214/290/305/307/364/407/450/470/503/521、16/18/39/47/59/214/503/565、16/18/39/47/91/290/407、16/18/39/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/54/59/73/209/214/285/290/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/54/59/73/214/285/290/305/364/407/450/521/524/565、16/18/39/54/73/91/209/210/285/290/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/39/54/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/18/39/54/73/98/214/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524/565、16/18/39/54/73/209/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524/565、16/18/39/54/91/214/285/290/364/450/470/503/521/524、16/18/39/91/503/521、16/18/47/54/59/73/91/98/285/290/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/47/54/59/73/98/209/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/47/54/59/73/209/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524/565、16/18/47/54/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/18/47/59/285/407/450/565、16/18/47/73/91/209/285/290/450/470/503/521/524、16/18/47/73/214/307/503、16/18/47/73/290/407/450、16/18/47/209、16/18/47/285/364/503/521、16/18/47/364/407、16/18/54/59/73/91/209/285/290/305/307/364/407/450/503/521、16/18/54/59/290/407/450/503/524、16/18/54/73/91/214/285/290/407/561、16/18/54/91/209/214/285/290/307/364/407/450/503/521/524/565、16/18/54/407、16/18/55/209/285/305、16/18/59/209/450/503/524、16/18/73/209/214/450、16/18/91/209/407/503、16/18/91/214/407/521/524/565、16/18/209/450/503、16/18/214/407/450/503、16/18/285/290/470、16/18/503、16/22/214/503/524/565、16/39/47/54/59/73/91/98/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/98/209/214/285/290/307/364/407/450/470/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/450/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/450/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/450/503/521、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/305/364/407/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/285/290/307/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/290/305/307/364/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/214/290/305/407/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/209/285/290/305/307/364/407/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/307/364/450/470/503/521/524、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/307/450/470/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/305/364/407/450/503/524/565、16/39/47/54/59/73/91/214/285/290/307/364/407/450/503/521/524/565、16/39/47/54/59/73/91/214/290/364/407/450/470/524/565、16/39/47/54/59/73/98/209/285/305/307/4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ID NO:2来编号。

9.一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，所述工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽包含与SEQID NO:2、4、6、8、10和/或12或其功能片段具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

10.一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽包含如权利要求1-8的任一项中提供的工程化多肽。

11.如权利要求9和/或权利要求10所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10和/或12或其功能片段具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。

12.如权利要求9-11中任一项所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽是表6.1、表7.1、表8.1、表9.1、表10.1、表14.1和/或表15.1中的任一项中提供的变体苯丙氨酸氨裂合酶多肽。

13.如权利要求9-12中任一项所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化多肽是多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)变体酶。

14.如权利要求9-13中任一项所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更具有热稳定性。

15.如权利要求9-14中任一项所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶对蛋白水解更具有耐受性。

16.如权利要求15所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶对通过至少一种消化道酶的蛋白水解更具有耐受性。

17.如权利要求15所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶对通过胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶的蛋白水解更具有耐受性。

18.如权利要求9-17中任一项所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述工程化多肽比野生型多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶更具有酸稳定性。

19.如权利要求1-8中任一项所述的工程化多肽或权利要求9-18中任一项所述的工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，其中所述多肽是纯化的。

20.一种工程化多核苷酸序列，所述工程化多核苷酸序列编码至少一种如权利要求1-8或权利要求19的工程化多肽和/或如权利要求9-19中任一项的苯丙氨酸氨裂合酶多肽。

21.如权利要求20所述的工程化多核苷酸序列，其中所述序列被可操作地连接至控制序列。

22.如权利要求20和/或权利要求21所述的工程化多核苷酸序列，其中所述多核苷酸是密码子优化的。

23.一种表达载体，所述表达载体包含至少一种如权利要求20-22中任一项的工程化多核苷酸序列和至少一种控制序列。

24.如权利要求23所述的表达载体，其中所述控制序列包含启动子。

25.如权利要求24所述的表达载体，其中所述启动子是异源性启动子。

26.一种宿主细胞，所述宿主细胞是用至少一种如权利要求20-22中任一项的多核苷酸序列和/或如权利要求23-25中任一项所述的表达载体转化的。

27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

28.一种在宿主细胞中产生工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养宿主细胞，使得产生至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽，所述宿主细胞包含至少一种编码至少一种如权利要求1至19中任一项的工程化多肽和/或苯丙氨酸氨裂合酶多肽的多核苷酸、和/或至少一种如权利要求20-22的多核苷酸序列、和/或至少一种如权利要求23-25中任一项的表达载体。

29.如权利要求28所述的方法，还包括从培养物和/或宿主细胞回收至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽。

30.如权利要求29所述的方法，还包括纯化所述至少一种工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽的步骤。

31.一种组合物，所述组合物包含至少一种如权利要求1至19中任一项的工程化多肽和/或工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽。

32.一种组合物，所述组合物包含至少一种如权利要求20-22中任一项的工程化多核苷酸。

33.如权利要求31和/或权利要求32所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

34.如权利要求32和/或权利要求33所述的组合物，还包含至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体。

35.如权利要求31-34中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于治疗苯丙酮尿症。

36.如权利要求31-35中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于治疗升高的血液苯丙氨酸。

37.如权利要求31-36中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于治疗酪氨酸血症。

38.如权利要求31-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于治疗升高的血液酪氨酸。

39.如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物适于在基因治疗中使用。

40.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物适于在治疗苯丙酮尿症、升高的血液苯丙氨酸、酪氨酸血症和/或升高的血液酪氨酸血症的基因治疗中使用。

41.如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物适于在mRNA治疗中使用。

42.如权利要求41所述的组合物，其中所述组合物适于在治疗苯丙酮尿症、升高的血液苯丙氨酸、酪氨酸血症和/或升高的血液酪氨酸血症的mRNA治疗中使用。

43.如权利要求31-42中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于向人类口服施用。

44.如权利要求31-38和/或权利要求43中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈丸剂、片剂、胶囊、囊形片、液体或乳剂的形式。

45.如权利要求44的组合物，其中所述丸剂、片剂、胶囊或囊形片还包含肠溶包衣。

46.如权利要求31-43中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于肠胃外注射到人体中。

47.如权利要求31-46中任一项所述的组合物，其中所述组合物与至少一种另外的治疗有效的化合物共施用。

48.如权利要求47所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种另外的治疗有效的化合物。

49.一种用于治疗和/或预防受试者中的苯丙酮尿症的症状的方法，所述方法包括提供患有苯丙酮尿症的受试者，并向所述受试者提供如权利要求31-48中任一项所述的组合物。

50.如权利要求49所述的方法，其中在向所述受试者提供所述组合物后，所述受试者的血液中的苯丙氨酸浓度减少。

51.如权利要求49和/或权利要求50所述的方法，其中在向所述受试者提供所述组合物后，所述受试者的血液中的肉桂酸浓度增加。

52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述苯丙酮尿症的症状改善。

53.如权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述受试者能够食用比未被提供至少一种药物组合物的受试者需要的膳食更少限制其苯丙氨酸含量的膳食，所述药物组合物包含至少一种如权利要求1-19中列出的工程化多肽和/或苯丙氨酸氨裂合酶。

54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，其中所述受试者是婴儿、儿童、青年或成人。

55.如权利要求31-48的任一项中提供的组合物的用途。