JP2010536759A - 原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼの組成物、及び、その組成物を用いる癌の治療方法 - Google Patents

原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼの組成物、及び、その組成物を用いる癌の治療方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、原核生物により産生されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)の変異体であって、そのような原核生物PAL変異体は、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有する。本発明は、原核生物PALの組成物、及び生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類縁体、並びに、癌の治療を含む治療目的のそのような組成物の製造方法、精製方法及び使用方法を提供する。
【選択図】図１Ａ−Ｂ

Description

（発明の分野）
本発明は、原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)及びその組成物、並びに、原核生物PALの触媒活性及び／又は安定性を向上させる、そのような組成物の最適化に関し、原核生物PALの免疫原性及び／又はタンパク質分解感受性を低減させる。また、本発明は、癌治療のための、原核生物PALのそのような最適な組成物の使用に関する。
（発明の背景）
PALは、植物［Koukolら, J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961); Hansonら, The Enzymes 7:75-166 (1972); Poppeら, Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003)］、ある真菌類［Raoら, Can. J. Biochem. 4512:1863-1872 (1967); Abellら, Methods Enzymol. 142:242-253 (1987)］、及び、細菌［Bezanson, et al, Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970); Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002); Hillら, Chem. Commun. 1358-1359 (2003)］に広く分布している非哺乳動物酵素であり、大腸菌(Escherichia coli)において組換えにより生産される。
代表的なPALには次のものを含む：Q9ATN7 アガスタシェ・ルゴサ(Agastache rugosa); 093967 Amanita muscaria（ベニテングダケ）; P35510, P45724, P45725, Q9SS45, Q8RWP4 Arabidopsis thaliana （シロイヌナズナ）; Q6ST23 Bambusa oldhamii（ニガタケ）; Q42609 Bromheadia finlaysoniana（ラン）; P45726 Camellia sinensis(チャ); Q9MAX1 Catharanthus roseus（ニチニチソウ）（マダガスカルニチニチソウ）; Q9SMK9 Cicer arietinum（ヒヨコマメ）; Q9XFX5, Q9XFX6 シトラス・クレメンチナ x シトラス・レティキュレート(Citrus Clementina x Citrus reticulate); Q42667 Citrus limon（レモン）; Q8H6V9, Q8H6W0 Coffea canephora（ロブスタ種コーヒーノキ）; Q852S1 Daucus carota（ニンジン）; 023924 Digitalis lanata（キツネノテブクロ）; 023865 Daucus carota（ニンジン）; P27991 Glycine max（ダイズ）; 004058 Helianthus annuus（ヒマワリ）; P14166, Q42858 Ipomoea batatas （サツマイモ）; Q8GZR8, Q8W2E4 Lactuca sativa（チシャ）; 049835, 049836 リトスペルマム・エリスロリゾン(Lithospermum erythrorhizon); P3551 1, P26600 Lycopersicon esculentum（トマト）; P35512 Malus domestica（リンゴ）(マルス・シルベストリス(Malus sylvestris)); Q94C45, Q94F89 Manihot esculenta（キャッサバ）（マニオク）; P27990 Medicago sativa（アルファルファ）; P25872, P35513, P45733 Nicotiana tabacum（タバコ）; Q6T1C9 Quercus suber（コルクガシ）; P14717, P53443, Q7M1Q5, Q84VE0, Q84VE0 Oryza sativa（コメ）; P45727 Persea americana（アボガド）; Q9AXI5 Pharbitis nil（バイオレット）（アサガオ）; P52777 Pinus taeda（タエダマツ）; Q01861, Q04593 Pisum sativum（エンドウ）; P24481, P45728, P45729 Petroselinum crispum（パセリ）(ペトロセリナム・ホルテンス(Petroselinum hortense)); Q84LI2 ファナラエノプシス x ドリタエノプシス・ハイブリッド品種（Phalaenopsis x Doritaenopsis hybrid cultivar）; P07218, P191 42, P19143 Phaseolus vulgaris（インゲンマメ）（フレンチビーン）; Q7XJC3, Q7XJC4 Pinus pinaster（カイガンショウ）; Q6UD65 ポピュラス・バルサミフェラ亜種トリコカルパ x ポピュラス・デルトイデス(Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoides); P45731, Q43052, 024266 Populus kitakamiensis（ヤマナラシ）; Q8H6V5, Q8H6V6 Populus tremuloides（アメリカヤマナラシ）; P45730 Populus trichocarpa（ハコヤナギ）; 064963 Prunus avium（サクラ）; Q94EN0 レーマニア・グルチノサ(Rehmannia glutinosa); P11544 Rhodosporidium toruloides（酵母）(ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）); P10248 Rhodotorula rubra（酵母）(ロドトルラ・ムシラギノサ(Rhodotorula mucilaginosa)); Q9M568, Q9M567 Rubus idaeus（ラズベリー）; P31425, P31426 Solanum tuberosum（ジャガイモ）; Q6SPE8 Stellaria longipes (Longstalk starwort); P45732 Stylosanthes humilis (Townsville stylo); P45734 Trifolium subterraneum（サブタレニアンクローバ）; Q43210, Q43664 Triticum aestivum（コムギ）; Q96V77 Ustilago maydis（黒穂菌）; P45735 Vitis vinifera（ブドウ）;及びQ8VXG7 Zea mays（トウモロコシ）。
多くの研究は、フェニルケトン尿症(PKU)の酵素置換処理のための酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL, EC 4.3.1.5)の利用の焦点を置いていた［Hoskinsら, Lancet l(8165):392-394 (1980); Gilbertら, Biochem. J. 199(3):715-723 (1981); Hoskins, J.A., et al, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 35(2):275-282 (1982); Sarkissianら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):2339-2344 (1999); Liuら, Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 30(4):243-257 (2002); Wiederら, J. Biol. Chem. 254(24): 12579-12587 (1979); Gamezら, Mol. Ther. 11(6):986-989 (2005); Ambrusら, J. Pharmacol. Exp. Ther. 224(3):598-602 (1983); Ambrusら, Science 201(4358):837- 839 (1978); Kalghatgi, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 27(3):551-561 (1980); Ambrus, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 37(l):105-lll (1982); Gilbertら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 131(2):557-563 (1985); Pedersen, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 20(3):559-569 (1978); Marconiら, Biochimie 62(8-9):575-580 (1980); Larueら, Dev. Pharmacol. Ther. 9(2):73-81 (1986); Ambrusら, Ann. Intern. Med. 106(4):53 1-537 (1987); Bourgetら, Appl. Biochem. Biotechnol. 10:57-59 (1984); Bourgetら, FEBS Lett. 180(l):5-8 (1985); Bourgetら, Biochim. Biophys. Acta 883(3):432-438 (1986); Changら, Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 23(1):1-21 (1995); Changら MoI. Biotechnol. 17(3):249-260 (2001); 米国特許第5,753,487号］。
癌治療のためのPALの利用は、癌細胞へのフェニルアラニンの栄養供給の制限、及び、それによる腫瘍の成長を抑制する能力に基づいて示唆されていた［Fritzら, J. Biol. Chem. 251(15):4646-4650 (1976); Robertsら, Cancer Treat. Rep. 60(3):261-263 (1976); Shenら, Cancer Res. 37(4):1051-1056 (1977); Shenら, Cancer Treat. Rep. 63(6):1063-1068 (1979); Wiederら, J. Biol. Chem. 254(24):12579-12587 (1979)］。また、PALを媒介とするフェニルアラニンの低減は、マウスの白血病及び転移性黒色腫の増加を妨げた。しかしながら、静脈内注射されたペグ化(pegylated)PALは、13回目の注射後に循環血液から急速に消去された［Abellら, Cancer Res. 33:2529-2532 (1973); Robertsら, (1976), 前述の箇所; Shenら, (1977), 前述の箇所; Shenら, J. Reticuloendothelial Soc. 23:167-175 (1978)］。
特定の腫瘍細胞又は癌細胞は、高い代謝率、及び、正常細胞よりもフェニルアラニン等の必須アミノ酸を多く必要とする。特定のアミノ酸（例えばフェニルアラニン）の制限又は欠乏は、アミノ酸分解酵素（例えばPAL）の利用を通じて、ヒト癌患者及び動物モデルの特定の腫瘍細胞の増殖を低減し得ることが示唆されている文献で証明されている。例えば、特定の白血病細胞は、グルタミンから必須アミノ酸であるアスパラギンを合成する、酵素アスパラギンシンテターゼを欠き、生存するためにはアスパラギンに依存する。ペグ化L−アスパラギナーゼであるオニカスパー（Oncaspar）（ペガスパルガーゼ、Enzon Pharmaceuticals社製）は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）を治療するのに良好に利用されている［Graham, Adv. Drug Del. Rev. 55:1293-1302 (2003)］。癌治療における酵素欠乏のための潜在的な標的としてのアミノ酸の他の例は、グルタミン（グルタミンデアミナーゼ、Medical Enzymes社製）、アルギニン（アルギニンデイミナーゼ、Phoenix Pharmacologies社製）、及び、メチオニン（メチオニナーゼ、Anticancer社製）を含む（例えば、米国特許第6,312,939号、第6,737,259号及び第5,690,929号参照）。
フェニルアラニンの食事制限は、動物モデルにおける高い侵襲性の転移性黒色腫、並びに、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞の増殖及び転移を阻害し、腫瘍のアポトーシスを促進するが、正常の培養細胞は、腫瘍耐性マウスの生存を増加させ、腫瘍細胞を化学療法剤に対して敏感にし、及び、毒素によって細胞毒性を増大させることが明らかとなっている［Fuら, Nutr. Cancer 3 1:1-7 (1998); Fuら, Cancer Res. 59:758-765 (1999); Fuら, Nutr. Cancer 45:60-73 (2003); Fuら, J. Cell. Physiol. 209:522-534 (2006); Meadowsら, Cancer Res. 42:3056-3063 (1982); Elstadら, Anticancer Res. 13:523-528 (1993); Elstadら, Nutr. Cancer 25:47-60 (1996); Nunezら, Cancer Lett. 236:133-141 (2006)］。
酵母ロドスポリディウム トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)［ロドトルラ グルチニス(Rhodotorula glutinis)としても公知の］からのPAL(RtPAL)を用いるフェニルアラニンの酵素欠乏は、インビトロにおける培養物で［Abellら, Cancer Res. 32:285-290 (1972); Stithら, Cancer Res. 33:966-971 (1973)］及びインビボにおけるマウスで［Abellら, Cancer Res. 33:2529-2532 (1973)］白血病リンパ球の成長を阻害した。しかしながら、マウスへの反復注射後、血漿からのRtPALのクリアランスは、非常に促進された。また、腫瘍耐性マウスにおいては、非腫瘍耐性マウスと比較して、クリアランス率が促進された［Fritzら, J. Biol. Chem. 251:4646-4650 (1976); Shenら, Cancer Res. 37:1051-1056 (1977)］。RtPALの半減期は、抗体力価の増加により、反復投与後、約１時間まで減少した。これは、全身放射が、クリアランスの遅延、及び半減期の増大に必要であり得ることを実証するものであった［Shenら, J. Reticuloendothelial Soc. 23:167-175 (1978)］。
RtPALは、インビボにおける酵素の免疫原性、及びクリアランス率を低減させることを試みて、ペグ化されている［Wiederら, J. Biol. Chem. 254:12579-12587 (1979)］。ラットへの１回の静脈内注射、又は反復静脈内注射後に、血液のペグ化されたRtPALの半減期は、ペグ化されないRtPALよりも長かった。しかしながら、ペグ化されたRtPALは、13回目の静脈内注射後に、依然として、血液から急速に消去された。
PALには、潜在的にさまざまな治療への適用があるが、PALの利用は、低減された比活性及びタンパク質分解不安定性によって制限され得る。他の治療タンパク質と同様に、酵素治療としてのPALの利用は、免疫原性及びタンパク質感受性等の幾つかの欠点が伴う［Vellard, Curr. Opin. Biotechnol. 14:1-7 (2003)参照］。これらのパラメーターの改善に向けた取り組みは、このタンパク質に関する構造及び生化学についての知識の不足により、未だ行われていない。
したがって、癌の治療を含む治療用途のための、強力な触媒活性、長い生物学的半減期、高い生化学的安定性、及び／又は、低減された免疫原性を含む、最適な動力学特性を具備するPAL分子の必要性が残されている。
（発明の概要）
本発明は、原核生物PAL又は細菌PALが癌の効果的な治療に寄与し得るという知見に基づくものである。本発明は、非常に強力な触媒活性、高い生化学的安定性、並びに、治療への適用のための、低減された免疫原性、及び／又は、長い生物学的半減期等の向上された特性を具備する、原核生物PALの組成物、及び、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類縁体を意図するものである。本発明は、原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類縁体、並びに、安定化剤を含んだ医薬として許容し得るキャリアを含む、医薬組成物及び配合物を提供する。また、本発明は、原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類縁体の製造方法及び精製方法、並びに、腫瘍性疾患及び癌の治療を含む治療目的のそのような組成物の使用方法を提供する。
本明細書中で用いられる“細菌PAL”及び“原核生物PAL”は、(1)ストレプトマイセス マリチムス(Streptomyces maritimus)［EncP（配列番号５、図４）としても公知である］、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)［配列番号２（図４）］、アナベナ バリアビリス(Anabaena variabilis)［配列番号４（図４）］、アナシィスティス ニダランス(Anacystis nidulans)［Lofflehardt, Z. Naturforsch. 31(ll-12):693-9 (1976)］、フォトラブダス ルミネセンス(Photorabdus luminescens) TT01［Williamsら, Microbiology 151:2543-2550 (2005)］、及びストレプトマイセス バルチチラタス(Streptomyces verticillatus)［Bezansonら, Can. J. Microbiol. 16(3):147-51 (1970)］を含む、これらに限定されない、原核生物からの野生型PAL；(2)同様の（すなわち、少なくとも50％）フェニルアラニンの触媒活性を保持し、好ましくは、増加された触媒活性、高い生化学的安定性、増大された半減期、及び／又は低減された免疫原性を示す、そのような野生型PAL酵素のフラグメント、突然変異体、変異体又は類縁体；及び、(3)例えば、増大された半減期及び／又は低減された免疫原性等のこれらに限定されない他の有利な効果を奏する他の化学的部位(chemical moieties)に結合している、そのような野生型PAL酵素、又は、そのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体の化学修飾物；と互換的に用いられる。例えば、治療目的の、原核生物PAL、及び、そのフラグメント、突然変異体、変異体、類縁体又は化学修飾物の製造方法及び使用方法に関する文献は、すべてのそのような野生型PAL、又は、そのフラグメント、突然変異体、変異体、類縁体若しくは化学修飾物の製造方法、使用方法、又は配合方法を言及することを意味するものである。
第一の態様において、本発明は、細菌PAL、及び、その生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類縁体、並びに、医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物を提供する。好ましい実施態様は、ノストック パンクチフォルメからの細菌PAL（配列番号２）、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体である。他の好ましい実施態様は、アナベナ バリアビリスからの細菌PAL（配列番号４）、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体である。本発明は、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は低減された免疫原性を有する原核生物PAL変異体を意図するものである。
好ましくは、原核生物PAL変異体は、ロドスポリディウム トルロイデスPAL(RtPAL)、からのPALにおけるSer210、Ala−Ser−Gly三成分系(211−213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500に対応する位置又は、これらの活性部位残基の保存的置換で野生型の活性部位を保持し、該211−213のAla−Ser−Gly三成分系が、フェニルアラニンの結合部位であるとされている。
望ましい原核生物PAL変異体は、タンパク質を含むことができ、１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基によって置換されており、インビボにおいて、低減された酵素活性、増大された免疫原性、及び／又は、低減された生物利用性等の他の不利な影響と関連するタンパク質凝集を低減させ得る。本発明は、原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸によって置換されており、当該置換が、野生型PALと比較して、フェニルアラニン変換活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させる、医薬組成物を意図するものである。
ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基によって置換されている。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。好ましい実施態様においては、原核生物PAL変異体は、アナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)である。より好ましい実施態様においては、AvPAL変異体の１以上のシステイン残基は、位置64、318、503及び565のシステイン残基からなる群より選択されるセリン残基によって置換されている。より好ましい実施態様においては、AvPAL変異体の位置565のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。最も好ましい実施態様においては、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。
望ましい原核生物PAL変異体は、融合タンパク質を含むことができ、該PAL酵素は、半減期を増大させることで当技術分野において公知であるサルベージエピトープ(salvage epitope)を保持する、又は、特定の癌に特異的なタンパク質によって認識されるイムノグロブリン又はそのフラグメントの天然の又は改変された定常領域等の他の異種ポリペプチドに融合されている。
また、本発明は、他の有利な効果を奏する化学的部位に結合している、そのような原核生物PALポリペプチドの化学修飾物を意図するものである。また、例えば、半減期を改善することが当技術分野において公知であるポリペプチドとの水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）の非特異的又は部位特異的な（例えばN末端）結合、及び、化学的部位の結合は、免疫原性を低減させ、及び／又は、プロテアーゼ耐性を改善し得る。
ある実施態様においては、原核生物PAL変異体は、水溶性ポリマーを含む。好ましい実施態様においては、原核生物PAL変異体は、ポリエチレングリコールを含む。より好ましい実施態様においては、原核生物PAL変異体は、アナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)変異体であり、AvPALとポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）である。最も好ましい実施態様においては、原核生物PALは、AvPAL変異体であり、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）であり、かつ、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。
ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基は、リジン残基によって置換されている。原核生物PAL変異体における追加的なリジン残基のペグ化(pegylation)は、低減された免疫原性、増加された触媒活性、及び／又は、改善された生化学的安定性を有する酵素とすることができる。特定の理論に結び付くことなしに、原核生物PALの活性部位（例えば、AvPALの位置78）の／付近のチロシン残基は、酵素活性を低減させるペグ化の部位となり得ると仮定されている。好ましい実施態様においては、酵素活性に必要ではない、原核生物PAL変異体の活性部位の／付近の１以上のアミノ酸は、リジン残基によって置換される。特定の理論に結び付くことなしに、活性部位の／付近の置換されたリジン残基のペグ化は、立体的にチロシン残基（例えば、AvPALの位置78）のペグ化を妨害すると仮定されている。
そのような原核生物PAL変異体は、本発明の方法に従って分離及び精製され、そのために、原核生物PAL酵素を治療で用いることが可能な量存在する。ある実施態様においては、完全な又は野生型原核生物PALのcDNAコード化が用いられる。しかしながら、他の実施態様においては、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類縁体のcDNAコード化を用いることができる。また、本発明は、構造に基づく分子設計技術のアプローチ、及び／又は、PALの化学的に修飾された（例えばペグ化）形態によって得られる最適化された原核生物PALの組成物を提供する。特定の実施態様は、治療用途に適切な、改善された比活性、増大された安定性、低減された免疫原性、及び／又はタンパク質分解感受性を有する原核生物PALの最適な組成物を意図するものである。好ましい実施態様は、改善された比活性、増大された安定性、低減された免疫原性、及び／又はタンパク質分解感受性を有するノストック パンクチフォルメPALのペグ化された形態である。他の好ましい実施態様は、改善された比活性、増大された安定性、低減された免疫原性、及び／又はタンパク質分解感受性を有するアナベナ バリアビリス PALのペグ化された形態である。
ある実施態様においては、本発明による野生型原核生物PALの生物学的に活性のある部位は、PALの動力学特性を最適化することが望まれているように改質することができる。好ましい実施態様においては、改質された原核生物PALは、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に治療被験者の血漿のフェニルアラニン量を低減させるのに十分な活性を有する。他の好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある改質された原核生物PALは、少なくとも約0.1s-1、好ましくは約0.5s-1より高く、より好ましくは1.0s-1より高いkcatである。より好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある改質された原核生物PALは、少なくとも約0.4s-1、好ましくは約2.0s-1より高く、より好ましくは4.0s-1より高いkcatである。他の好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある改質された原核生物PALは、約10μM〜約2000μMのKmである。より好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある改質された原核生物PALは、約10μM〜約1000μMのKmである。さらに、より好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある改質された原核生物PALは、約10μM〜約500μMのKmである。他の好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある改質された原核生物PALは、野生型PALの少なくとも約50％から約10倍超の酵素活性を示す。他の好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある改質された原核生物PALは、野生型PALの少なくとも約50％から約100％超の酵素活性を示す。そのような生物学的な活性のある改質された原核生物PALは、部位特異的突然変異誘発等の当技術分野において周知の方法を用いて形成することができる。
更なる実施態様においては、本発明は、被験者（好ましくはヒト被験者）の癌の予防又は治療のための薬剤の調製においてフェニルアラニンを代謝する（すなわち、フェニルアラニンを他の物質に変換する）原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体、及び、被験者（好ましくはヒト被験者）の癌の予防又は治療での使用のための原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体を含む医薬組成物の使用を意図するものである。ある実施態様においては、薬剤は、ヒト被験者の癌の予防のためのものである。他の実施態様においては、薬剤は、ヒト被験者の癌の治療のためのものである。好ましい実施態様においては、医薬組成物は、高度に精製された細菌由来のPAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体、及び、医薬として許容し得るキャリアを含む。好ましい調製物は、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％又は99.9％より高い純度を有する、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体を含む。本発明に係る原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体の相対的比活性は、好ましくは野生型原核生物PALの比活性の少なくとも50％、より好ましくは野生型原核生物PALの比活性の約110％超である。
第二の態様においては、本発明は、治療目的における原核生物PAL変異体の組成物を用いる新規の方法を特徴とする。本発明は、さまざまな形態の癌を治療する方法を意図するものである。
ある実施態様においては、本発明は、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することによる癌の治療方法であって、原核生物PAL変異体が、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し、かつ、検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に、被験者の血液、血清又は血漿（好ましくは血漿）中のフェニルアラニン濃度を低減させるのに有効である、前記癌の治療方法を意図するものである。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基によって置換されており、当該置換が、野生型PALと比較して、フェニルアラニン変換活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させる。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のシステイン残基は、他のアミノ酸残基によって置換されている。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。好ましい実施態様においては、原核生物PAL変異体は、アナベナ バリアビリス PAL(AvPAL)変異体である。特に好ましい実施態様においては、AvPAL変異体の１以上のシステイン残基は、位置64、318、503及び565のシステイン残基からなる群より選択され、位置565においてセリン残基、又は、位置503及び565においてセリン残基によって置換されている。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体は、水溶性ポリマーを含む。ある実施態様においては、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。好ましい実施態様においては、原核生物PAL変異体が、アナベナ バリアビリス PAL(AvPAL)変異体であり、かつ、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）である。より好ましい実施態様においては、原核生物PAL変異体が、アナベナ バリアビリス PAL(AvPAL)変異体であり、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）であり、かつ、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている。
特に好ましい実施態様においては、本発明は、AvPAL変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することを含む癌の治療方法であって、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており、AvPAL変異体が更に水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３あり、かつAvPAL変異体が、検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に、被験者の血液、血清又は血漿（好ましくは血漿）中のフェニルアラニン濃度を低減させるのに有効である、前記癌の治療方法を提供する。
広い実施態様においては、癌は、癌由来の細胞の増殖及び／又は生存が、フェニルアラニンの制限又は欠乏に感受性を有するものである。好ましい実施態様においては、癌は、肺癌、脳又は中枢神経系癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、又は転移性黒色腫である。他の好ましい実施態様においては、癌は、頭頸部癌、卵巣癌、子宮癌、白血病（例えば、急性骨髄白血病、又は急性リンパ芽球性白血病）、又は骨髄腫である。他の好ましい実施態様においては、癌は、小児癌又は耐性癌（すなわち、癌治療剤又は標的癌治療剤に対して耐性を示す癌）である。
本発明は、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体を投与することを含む被験者の癌の治療方法であって、原核生物PALの投与が、原核生物PALを投与しないものと比較して、被験者の血液、血清又は血漿（好ましくは血漿）中のフェニルアラニン(Phe)濃度を低下させるのに有効である、前記癌の治療方法を提供する。本発明の方法による治療に選択された被験者は、任意の血漿Phe濃度を有することができる。例えば、約40μM〜約2000μM、又は正常な血漿Phe濃度の範囲であり、当該濃度は約40μM〜約80μMの範囲、より典型的には約50μM〜約70μMの範囲、多くのヒトの約55μM〜約65μMの範囲であり得る。治療における被験者の血漿Phe濃度は、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満において低減される。
また、本発明は、タンパク質が制限された（すなわち、フェニルアラニンを含まない）食事を組み合わせて、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することによる癌の治療方法であって、該治療が、組み合わせ投与なしで被験者の血漿Phe濃度を低減させるのに有効である、前記癌の治療方法を意図するものである。治療における被験者の血漿Phe濃度は、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に低減される。
また、他の実施態様においては、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体は、タンパク制限食と組み合わせて投与することができる。本明細書中の方法において投与される当該タンパク制限食は、フェニルアラニン制限食であり、該被験者の全Phe摂取が、１日当たり600mg未満に制限されるものである。他の実施態様においては、タンパク制限食は、フェニルアラニン制限食であり、その全Pheが、１日当たり300mg未満に制限されるものである。さらに、別の実施態様においては、タンパク制限食は、１以上のアミノ酸（例えば、チロシン、バリン、イソロイシン及び／又はロイシン等であるが、これらに限定されない）で補われる。
また、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体、及び、医薬として許容し得るキャリア、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を意図するものである。医薬組成物は、医療的なタンパク質補給物(medical protein supplement)を更に含んでもよい。さらに、別の実施態様においては、タンパク質補給物は、フェニルアラニンを含まない。当該タンパク質補給物は、好ましくは、20mg/100g補給物の濃度のL−チロシン、L−グルタミン、L−カルニチン、40mg/100g補給物の濃度のL−タウリン、及びセレンで強化される。さらに、当該タンパク質補給物は、ミネラル（例えば、カルシウム、リン及びマグネシウム）の推奨される一日量を含んでもよい。さらにまた、当該タンパク質補給物は、L−ロイシン、L−プロリン、L−リジン酢酸塩、L−バリン、L−イソロイシン、L−アルギニン、L−アラニン、グリシン、L−アスパラギン一水和物、L−トリプトファン、L−セリン、L−スレオニン、L−ヒスチジン、L−メチオニン、L−グルタミン酸、及びL−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸の推奨される一日量を含んでもよい。また、当該補給物は、ビタミンA、D及びEの推奨される一日量で強化されてもよい。好ましくは、タンパク質補給物は、当該補給物の少なくとも40％のエネルギーを提供する脂肪含量を有する。そのような補給物は、粉末状補給物、又はプロテインバーの形態で提供されてもよい。
また、本発明は、癌治療剤又は標的癌治療剤を組み合わせて、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することによる癌の治療方法であって、該治療が、組み合わせ投与なしで被験者の血漿フェニルアラニン濃度を低減させるのに有効である、前記癌の治療方法を意図するものである。治療における被験者の血漿Phe濃度は、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に低減される。
好ましい実施態様においては、治療する生物体（好ましくは、哺乳動物又はヒト）が、病徴を効果的に予防又は改善するために必要な用量を最適化することを含む。原核生物PALは、毎日１回投与、毎日複数回投与、毎週１回投与、毎週複数回投与、毎月１回投与、又は、毎月複数回投与で投与することができる。ある実施態様においては、PAL治療は、連続的でなく、むしろ、PALは、被験者の血漿Phe濃度が、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に低減されるまで毎日投与される。好ましくは、当該被験者の血漿Phe濃度は、毎日監視され、かつ血漿中のPhe濃度において10〜20％の増加が観察された場合に、PALが投与される。さらに他の好ましい実施態様においては、週に１回その用量で実行される。本発明は、週当たり、少なくとも0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kgの用量を意図するものであり、0.1mg/kg以下、0.5mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg、12mg/kg以上であってもよい。好ましい用量は１mg／kg／週であり、より好ましい用量は0.1mg／kg／週であり、さらに好ましい用量は0.01mg／kg／週である。
等価用量を実行する、口腔、経皮的、口腔粘膜、肺内（エアゾル化を含む）、筋肉内、皮下、又は、静脈内を含む、さまざまな非経口又は非侵襲的投与経路を意図するものである。また、関節又はCSFへの直接的な急速注入又は静注による投与を特に意図するものであり、鞘内、大脳内、脳室内、腰椎穿刺経由、又は大槽経由等が特に意図される。好ましくは、皮下又は経口的にその用量で実行される。
また、遺伝子治療を含む、ヒト被験者における原核生物PAL活性を増加させる他の手段を意図するものである。原核生物PAL遺伝子の送達は、ウイルスベクター、相同組換、又は直接的なDNA注入を含む、当技術分野において公知のさまざまな手段により可能である。この態様の範囲は、例えば、癌に影響される、癌に近接又は隣接する、血流中で循環する及び／又は癌の部位へ移動する造血性細胞であるが、これらに限定されない、細胞へインビボで投与することができる、すべての又は一部の原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体をコードする核酸配列を特徴とする実施態様である。
第三の態様において、本発明は、細菌PAL、及び、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又はその類縁体、並びに、安定化剤を含んだ医薬として許容し得るキャリアを含む、原核生物PAL変異体の医薬組成物又は配合物を提供する。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、又はその構造類縁体である。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される。ある実施態様においては、安定化剤はL−フェニルアラニンである。ある実施態様においては、安定化剤はtrans−桂皮酸である。ある実施態様においては、安定化剤は安息香酸である。好ましい実施態様においては、本発明は、そのような医薬組成物又は配合物を用いる癌の治療方法を提供する。
特に好ましい実施態様においては、医薬組成物又は配合物は、原核生物PAL変異体、及び医薬として許容し得るキャリアを含み、該原核生物PAL変異体がAvPAL変異体であり、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）であり、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており、かつ、医薬として許容し得るキャリアが安定化剤である。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、又はその構造類縁体である。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される。ある実施態様においては、安定化剤はL−フェニルアラニンである。ある実施態様においては、安定化剤はtrans−桂皮酸である。特に好ましい実施態様においては、本発明は、そのような医薬組成物又は配合物を用いる癌の治療方法を提供する。
第四の態様において、本発明は、酵素を治療で用いることが可能な量の、組換え原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体を製造する方法を特徴とする。本発明は、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ソランギウム(Sorangium)、シュードモナス(Pseudomonas)、並びに、ノストック(Nostoc)及びアナベナ(Anabaena)等のシアノバクテリアを含むが、これらに限定されない、細菌由来のPALを意図するものである。ある実施態様においては、PALは、細菌種ストレプトマイセス マリチムス(Streptomyces maritimus)、ストレプトマイセス ウェルティキラツス(S. verticillatus)、ソランギウム セルロサム(Soragium cellulosum)、ノストック パンクチフォルメ、ノストク トバカム(Nostoc tobacum)、アナベナ バリアビリス又はシュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)由来である。特に好ましい実施態様においては、PALは、シアノバクテリア種のノストック パンクチフォルメ、又はアナベナ バリアビリス由来である。特に好ましい実施態様においては、PALは、アナベナ バリアビリス由来である。他の実施態様においては、原核生物PAL酵素活性は、HAL活性又はPAL−HALモチーフをコードするともされるが、HALとは異なる重要なPAL残基を有する、配列からのcDNA又はDNA配列を用いて生じさせる。
広い実施態様においては、本方法は、すべての又は一部の原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体をコードするcDNA又はDNAを、その発現に適切な細胞に形質転換するステップを含む。好ましい実施態様においては、発現ベクターを用いて、DNAをその発現に適切な細胞又は細胞系に移す。ある特に好ましい実施態様においては、cDNA又はDNAは、大腸菌に形質転換され、組換え細菌PALが、融合タンパク質として随意に過剰発現する。更なる実施態様においては、原核生物PALの製造方法は、次のステップを含む：(a)種培養物(seed culture)を生産するのに適切な密度の適切な増殖培地において、原核生物PALのcDNA又は生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体をコードする、又は、これらのすべてをコードするDNAで形質転換された細胞を増殖させるステップ、(b)バイオリアクターに形質転換された細胞を導入するステップ、(c)バイオリアクターに適切な増殖培地を供給するステップ、及び、(d)酵素を含む培地からトランスフェクトされた細胞を分離するステップ。
好ましい実施態様においては、組換え原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体はN末端標識（例えばオクタヒスチジル標識）を有する又は有しないで、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）等の誘導プロモーターを用い、ベクター、好ましくはpIBX1［Suら, Appl. Environ. Microbiol. 62:2723-2734 (1996)］、又はpET28a（Invitrogen社製）において、大腸菌BLR(DE3)/pLysS（Novagen社製)、又は大腸菌BL21(DE3)/pLysS（Invitrogen社製）細胞において過剰発現される。特に好ましい実施態様においては、原核生物PALの製造方法は、次のステップを含む：(1)バイオリアクター／発酵槽において、振盪フラスコのグリセロールストックからの種培養物を増殖させるステップ；(2)供給バッチモードの制御されたバイオリアクターへそのような種培養物を導入するステップ；(3)当該培養物を、70〜100（〜22−25時間）のOD600の細胞密度になるまで、グルコース補足培地で、pH7.8、20％より高い溶存酸素、1200rpm以内の攪拌、30℃で増殖させるステップ；(4)当該培養物を0.4mM IPTGで誘導するステップ；(5)活性の変化が0.1 IU/mLより低く（約40〜48時間、及び一般に200のOD600）なるまで、22〜26℃の低減された温度で、当該培養物を増殖させるステップ；及び、(6)連続遠心分離で細菌を回収するステップ。好ましい実施態様においては、一般に、細胞培養培地は、酵母エキスタンパク質、ペプトン−トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、トレース塩類及びリン酸緩衝塩類と定義され、これらから構成される。
第五の態様においては、本発明は、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体を精製する方法を特徴とする。第一の実施態様によれば、形質転換された細胞群を増殖させ、残りの粗組換え酵素は破壊される。異物は、カラムの汚損を防止するために、通常粗バルクから分離される。クロマトグラフィー精製は、１又は幾つかのクロマトグラフィー樹脂を用いて行われる。その後、精製されたタンパク質は、長期間にわたって安定した活性を提供するために、設計された緩衝液で調製される。他の好ましい実施態様においては、原核生物PALの精製方法は、次のステップを含む：(a)組換えPALを含む細菌を溶解するステップ；(b)ウィルスを不活性化するために、熱で溶解物を処理するステップ；(c)第二の連続遠心分離ステップ、及び／又は深層ろ過によりこの溶解物を浄化するステップ；(d)炭ろ過ステップにより、浄化された溶解物を通過するステップ；(e)最終的なろ過ステップ（Sartorious Sartopore 0.2μmフィルターで）により、ステップ(d)におけるろ液を通過させるステップ；(f)ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー等の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂で、最終的なろ液を通過するステップ；(g)Qイオン交換カラム等の陰イオンのクロマトグラフィー樹脂で、ステップ(f)における溶出液を通過するステップ；(h)タンジェンシャルフローろ過での緩衝液交換により最終生産物を回収するステップ；及び、(i)最終生産物を滅菌するステップ。当業者であれば、１以上のクロマトグラフィーステップを省略若しくは置き換えること、又は、本発明の範囲内でクロマトグラフィーステップの順序を変更することができるということを容易に認識する。そして、必要であれば、適切な滅菌ステップを行ってもよい。
第六の態様において、本発明は、培養における腫瘍細胞を原核生物PALと接触することにより癌を予防、改善又は治療することができる、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体の同定、及び、原核生物PALが、腫瘍細胞の増殖及び／又は生存を低減させるか否かを判断するためのスクリーニング分析を意図するものである。また、そのようなスクリーニング分析は、インビトロでの変異体のフェニルアラニン変換活性を試験する前に、活性部位［例えば、ロドスポリディウム トルロイデス(RtPAL)からのPALにおけるSer 210、Ala−Ser−Gly三成分系(211-213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500残基と等価である、ストレプトマイセス マリチムスからのEncPにおけるGlyl42、Thr−Ser−Gly三成分系(143-145)、Asp146、Leu147、Asn196、Ile195、Leu192、Leu76、Asn79、Met400、Thr428、Gln432、又は、ノストック パンクチフォルメ又はアナベナ バリアビリス等の他の原核生物PALにおけるそれらの等価物］、該活性部位に隣接する領域、又は該ポリペプチド配列全体に隣接する領域において、保存的又は非保存的置換を含んだ変異体を作製するステップを含む。特定の実施態様においては、方法は、高スループット分析である。好ましい実施態様においては、細菌種の完全なゲノムは、バイオインフォマティクスによるアプローチを用いて、原核生物PAL相同体の存在についてシーケンス及びスクリーニングされる。他の好ましい実施態様においては、そのような相同性のタンパク質生産物のPAL触媒活性が、インビトロでのフェニルアラニンからtrans−桂皮酸への変換能の試験等によって確認される。
第七の態様において、本発明は、癌を含むが、これに限定されない、疾病の診断のための原核生物PALの組成物の使用方法を提供する。ある実施態様においては、原核生物PALを用いて血液、血漿又は血清試料のPhe量を測定する。更なる実施態様においては、本発明は、被験者の血液、血漿又は血清試料のPhe量の監視に使用するための原核生物PALを含む診断キットを意図するものである。
本発明の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明及び特定例は、本発明の好ましい実施態様を示しながらも、説明のためだけに示されるものであることは理解されるべきである。なぜならば、本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び改良は、この詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。
（図面の詳細な説明）
図１Ａは、ノストック パンクチフォルメPALの遺伝子配列である（配列番号１）。 図１Ｂは、ノストック パンクチフォルメPALのタンパク質配列である（配列番号：２）。
図２Ａは、アナベナ バリアビリス PALの遺伝子配列である（配列番号３）。 図２Ｂは、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（配列番号４）。
図３は、原核生物及び真核生物からの芳香族アミノ酸アンモニアリアーゼの相関図である。配列は、GenBankから検索され（アクセッション番号は括弧内に記載）、近隣結合法を用いて、ClustalX(1.83)で整列した。
図４は、ノストック パンクチフォルメPAL（配列番号２）及びアナベナ バリアビリスPAL（配列番号４）のシアノバクテリアの、EncP PAL（配列番号５）及びシュードモナス プチダHAL（配列番号６）とのタンパク質配列の整列である。PAL又はHAL活性に対応する活性部位残基を強調している。
図５Ａは、位置64でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリスのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)のタンパク質配列である（AvPAL_C64S、配列番号７）。 図５Ｂは、位置318でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C318S、配列番号８）。 図５Ｃは、位置503でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C503S、配列番号９）。 図５Ｄは、位置565でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C565S、配列番号10）。 図５Ｅは、位置503及び565でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリスPALのタンパク質配列であり（AvPAL_C565SC503S、配列番号11）、システインからセリンへの置換を太字で強調している。
図６Ａは、37℃でのさまざまな長さでのインキュベーション後のインビトロでのPAL比酵素活性に対する、ペグ化されていないAvPALの位置565での又は位置565及び503でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。 図６Ｂは、37℃でのさまざまな長さでのインキュベーション後のインビトロでのPAL比酵素活性に対する、ペグ化されたAvPALの位置565での又は位置565及び503でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
図７Ａは、変性条件下（左側パネル）又は非変性条件下（右側パネル）でのゲル電気泳動で分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成におけるシステインからセリンへの置換の影響を示す。 図７Ｂは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対するAvPALにおけるシステインからセリンへの置換の影響を示す。
図８は、さまざまなPEG濃度での部位特異的ペグ化に対するAvPALの位置565及び503（dbl突然変異体）のシステインからセリンへの置換の影響を示す。
図９は、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、0.05％ Tween 80又は10mM EDTAでのAvPALの処理の影響を示す。
図１０Ａは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、ジチオトレイトール(DDT)でのAvPALの処理の影響を示す。 図１０Ｂは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、DDT及びN−エチルマレイミド(NEM)によるAvPALの処理の影響を示す。
図１１は、４℃（上段のパネル）、25℃（中段のパネル）及び37℃（下段のパネル）でさまざまな時間（日）で保存された位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S) (rAV−PAL−PEG)の酵素活性に対する、フェニルアラニン(Phe)及びtrans−桂皮酸(t−CA)の影響を示す。
図１２は、４℃（上段のパネル）、25℃（中段のパネル）及び37℃（下段のパネル）でさまざまな時間（日）で保存された位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S) (rAV−PAL−PEG)の酵素活性に対する、１及び５mMでのチロシン(Tyr)の影響を示す。
図１３Ａは、４℃（上段のパネル）及び37℃（下段のパネル）でさまざまな時間（週）で保存された位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S) (rAV−PAL−PEG)の酵素活性に対する、フェニルアラニン(Phe)、安息香酸及びピリドキサミンの単独又は組み合わせの影響を示す。 図１３Ｂは、安息香酸（左）、フェニルアラニン（中央）、及びtrans−桂皮酸（右）の化学構造を図示する。
図１４Ａは、経時（時間）における血漿AvPAL_C565SC503Sレベルに対する、４mg/kg（◆）及び12mg/kg（■）での位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)のカニクイザル(Cynomolgus monkey)への１回の皮下注射の影響を示す。 図１４Ｂは、経時（時間）における血漿AvPAL_C565SC503S（◆）及びフェニルアラニン（■）レベルに対する、４mg/kgでのAvPAL_C565SC503Sのカニクイザルへの１回の皮下注射の影響を示す。
図１５Ａは、経時（時間）における血漿AvPAL_C565SC503Sレベルに対する、１mg/kg（◆）、５mg/kg（■）及び25mg/kg（▲）の位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)のラットへの１回の静脈内注射の影響を示す。 図１５Ｂは、経時（時間）における血漿AvPAL_C565SC503Sレベルに対する、１0mg/kg（◆）、25mg/kg（■）及び250mg/kg（▲）のAvPAL_C565SC503Sのラットへの１回の皮下注射の影響を示す。
図１６Ａは、インビトロにおけるNOMO1急性骨髄白血病(AML)細胞の増殖（ヨウ化プロピジウム染色により測定）に対する、0.01、0.1、１、10及び100μg/mLの位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)の影響を示す。 図１６Ｂは、インビトロにおけるIM9骨髄腫細胞の増殖に対する、0.1、１、10及び100μg/mLでのAvPAL_C565SC503Sの影響を示す。
図１７Ａは、インビトロにおけるSF268（上段）及び498L（下段）脳／CNS腫瘍細胞の増殖（ヨウ化プロピジウム染色により測定）に対する、0.01、0.1、１、10及び100μg/mLの位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)の影響を示す。 図１７Ｂは、インビトロにおけるHT29（上段）及びHCT116（下段）結腸腫瘍細胞の増殖に対する、0.01、0.1、１、10及び100μg/mLでのAvPAL_C565SC503Sの影響を示す。 図１７Ｃは、インビトロにおけるH460（上段）、529L（中段）及び629L（下段）肺腫瘍細胞の増殖に対する、0.01、0.1、１、10及び100μg/mLでのAvPAL_C565SC503Sの影響を示す。 図１７Ｄは、インビトロにおけるLNCAP（上段）、PC3M（中段）及びDU145（下段）前立腺腫瘍細胞の増殖に対する、0.01、0.1、１、10及び100μg/mLでのAvPAL_C565SC503Sの影響を示す。
図１８は、B16黒色腫細胞系異種移植片モデルにおける腫瘍のサイズに対する、位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)の影響を示す。酵素は、40、80又は100mg/kgで皮下注射によって予防的に（上段）、又は治療的に（下段）投与された。
図１９は、SNU398（上段）及びHepG2（下段）肝細胞腫瘍細胞系異種移植片モデルにおける腫瘍のサイズに対する、位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)の影響を示す。酵素は、60mg/kgで皮下注射によって予防的に投与された。
（発明の詳細な説明）
幾つかの細菌PALは、ストレプトマイセス マリチムスからのPAL（EncPとしても公知、配列番号５、図４）、ノストック パンクチフォルメからのPAL/HAL（Nostoc punctiforme ATCC 29133からのアクセッション番号ZP_00105927、2004年10月１日提出、NCBI Microbial Genomes Annotation Project）（配列番号２、図４）、アナベナ バリアビリスからのPAL/HAL（遺伝子ID 3679622, Ava_3988フェニルアラニン／ヒスチジンアンモニアリアーゼ、アナベナ バリアビリス（Anabaena variabilis）ATCC 29413、2006年3月31日）（配列番号４、図４）、光合成原核生物のアナシィスティス ニダランス［Lofflehardt, Z. Naturforsch. 31(1 1-12):693-9 (1976)］、エンテロバクテリア科ファミリーからのグラム陰性細菌、フォトラブダス ルミネセンスTT01［Williamsら, Microbiology 151 :2543-2550 (2005)］、及び、ストレプトマイセス バルチチラタス［Bezansonら, Can. J. Microbiol. 16(3): 147-51 (1970)］を含む、これらに限定されない、HAL/PALファミリーの一部として既に同定されている。また、PALの活性は、ストレプトマイセス マリチムスで評価されている［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］。アナバエナ及びノストック等のシアノバクテリアは、混合ポリケチド−ペプチド生合成経路経由で生成する、それらの生物活性のある天然物の生産に関して研究されている［Moore, Nat. Prod. Rep. 22(5):580-593 (2005); Beckerら, Gene 325:35-42 (2004); Hoffmanら, Gene 3 11:171-180 (2003)］。
PALは、フェニルプロパノイド代謝物質への関与段階における桂皮酸へのフェニルアラニンの非酸化的脱アミノ化を触媒する、遍在の高等植物酵素であるが［Hahlbrockら, Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 40:347-369 (1989)］、PALは、"ストレプトマイセス マリチムス"［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］及びソランギウム セルロサム［Hillら, Chem. Commun. 1358-1359 (2003)］におけるベンゾイル−CoA生合成、並びに、ストレプトマイセス バルチチラタス［Bezansonら, Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970)］におけるシンナムアミドの生合成に関係する少数の細菌でしかみられていない。静菌剤のエンテロシンは、その生合成が多くの独特の機能を含む生合成海洋細菌"ストレプトマイセス マリチムス"の天然生成物である［Hertweckら, Chem. Biol. 11:461-468 (2004); Pielら, Chem. Biol.7:943-955 (2000); Pielら, J. Am. Chem. Soc. 122:5415-5416 (2000); Xiangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15609-15614 (2004)］。これらのうち、ポリケチド合成酵素(PKS)スターターユニットベンゾイル−コエンザイムA(CoA)の形成が希少である。初期の生化学反応は、新規のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL, EC 4.3.1.5)EncP［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］によるアミノ酸L−フェニルアラニンからtrans−桂皮酸への変換を含む。単一の一連のβ酸化前の桂皮酸のそのCoAチオエステルへの活性化は、マロニル−CoAの７つの分子を有する鎖延長のエンテロシンII型PKSを準備する、ベンゾイルCoAを産生する［Hertweckら, Chem. Bio. Chem. 2:784-786 (2001); Hertweckら, Tetrahedron 56:91 15-9120 (2000); Xiangら, J. Bacteriol. 185:399-404 (2003)］。
最初の原核生物PALコード遺伝子(encP)（配列番号５）が特徴付けられ、"ストレプトマイセス マリチムス"のデノボ桂皮酸及びエンテロシン合成におけるその役割が明らかにされた［Kalaitzisら, J. Am. Chem. Soc. 125:9290-9291 (2003); Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］。encP遺伝子は、522アミノ酸タンパク質をコードし、これは原核生物PALよりも200アミノ酸残基程度大幅に小さい。パセリ(Petroselinum crispum)等の植物PALに相同性のある配列であるが［Rtherら, Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002)；CAA57056, 30％が同一、48％が類似］、むしろ、シュードモナス プチダ等の細菌ヒスチジンアンモニアリアーゼ(HALs, EC 4.3.1.3)［Schwedeら, Biochemistry 27:5355-5361 (1999)；A35251, 36％が同一、54％が類似、配列番号６、図４］、及びロドバクター カプスラータ(Rhodobacter capsulatus)のチロシンアンモニアリアーゼ(TAL)［Kyndtら, FEBS Lett. 512:240-244 (2002)、図３］により高い相同性がある。相同性は、4−メチリデンイミダゾール−5−オン(MIO)補欠分子団における改質されたデヒドロアラニン残基の可能的前駆物質である、フェニルアラニン／ヒスチジン／チロシンファミリーのアンモニアリアーゼの保護された活性部位である位置143のセリン残基を含む［Langerら, Adv. Prot. Chem. 58:175-188 (2001); Poppe, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:512-524 (2001); Schwedeら, Biochemistry 27:5355-5361 (1999)］。EncPは、パントエア アグロメランス(Pantoea agglomerans)のアンドリミド生合成に関係する推定されるフェニルアラニンアミノムターゼであり、かつ、ストレプトマイセス グロウビスポラス(Streptomyces globisporus)のチロシンアミノムターゼSgc4［Christensonら, J. Am. Chem. Soc. 125:6062-6063 (2003); Christensonら, Biochemistry 42:12708-12718 (2003)］に関連性がある、AdmH（AAO39102、63％が同一、76％が類似）に最も高い配列相同性を有する。
HAL及びPALは、ヒスチジン及びフェニルアラニンからのアンモニアの化学的に困難な除去のメカニズムを共通してそれぞれ分担することが明らかになった。両酵素での、超求電子補欠分子団である5−メチレン−3,5−ジヒドロイミダゾール−4−オン(MIO)は、芳香環でのフリーデルクラフツ型(Friedel−Crafts−type)反応によって、それぞれの基質の非酸性β水素原子を活性化させる。生成されるシグマ錯体は、酵素の結合ポケットへのアクセスから塩基を排除することによって、芳香環からプロトンの排出を妨げる。環外二重結合の形成は、アンモニア、再芳香族化及びフラグメンテーションの排除において重要である。MIO超求電子補欠分子団は、再生成され、ウロカニン酸塩又は桂皮酸塩が形成する[Poppeら, Angew. Chem. Int. Ed.44:3668-3688 (2005)]。
HALとPAL間の高い相同性のため、HAL及びPALの保護された領域は、HAL/PAL保護領域と呼ばれる。この高い相同性により、ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリスのNCBIデータベースに一覧化されたタンパク質配列などの誤った表示がされた"PAL−HAL"タンパク質の潜在的な酵素活性について、NCBIのようなデータベースで不明瞭となることがある。したがって、PAL酵素の中には、誤った表示をされたHAL酵素がある。PAL及びHALの活性部位は非常に類似しているが、それらは、いくつかの主要な残基が異なると推測されている[Calabreseら, Biochemistry 43(36):1 1403-1 1416 (2004); Xiangら, (2002), 前述の箇所; Williamsら, (2005), 前述の箇所]。特にHALにおいて、シュードモナス プチダからのメチオニン382及びグルタミン414[配列番号：６]は、すべてのHALにおいて高度に保護されているが、リジン及びグルタミンによってそれぞれ、常にこれまでに記載されたすべてのPAL（真核生物又は原核生物）で置換されている（図４）。そのため、"PAL−HAL"領域があり、かつ、リジン382及びグルタミン414との相同性を有するすべてのタンパク質は、PAL活性のあるタンパク質の配列特性を有すると言える。このような比較的新しいPALの特性[Williams, et al, (2005), 前述の箇所]は、HALからPALへいくつかの酵素を適切に分類させ、既存の遺伝子及びタンパク質のデータベースからいくつかの新規のPAL酵素を識別するのに利用することができた。
本発明は、そのような原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類縁体の組成物、並びに、癌の治療を含む治療目的のためのそれらの使用に関する。
[Ａ.定義]
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含めた本出願で用いる次の用語は、以下に示す定義を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「ある(a)」、「ある(an)」及び「該(the)」は、文脈が明らかに他のことを示さなければ、複数の対象を含むことに注意する必要がある。標準的な化学用語の定義は、CareyとSundberg, 上級有機化学(Advanced Organic Chemistry)第３版, A及びB巻(Plenum Press, New York 1992)を含む参考書籍で見出すことができる。本発明の実施には、特に示さなければ、当業者での、合成有機化学、質量分析、クロマトグラフィーの分取及び分析方法、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術、及び薬理学についての従来の方法を用いる。例えば、T.E. Creighton, タンパク質：構造と分子特性(Proteins: Structures and Molecular Properties)(W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, 生化学(Biochemistry)(Worth Publishers, Inc., 第４版, 2004)；Sambrookら, 分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第２版, 1989)；酵素学における方法(Methods In Enzymology)(S. ColowickとN. Kaplan編集, Academic Press, Inc.)；Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)を参照されたい。
本明細書で以前に又は以下に引用されたすべての出版物、特許及び特許出願は、前後にかかわらず、それらの全体において本明細書中に引用により組み込まれる。
次のアミノ酸の略語は、本明細書の全体にわたって用いられる。
Figure 2010536759
“ポリヌクレオチド”とは、ヌクレオチド単位からなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、核酸類縁体の他に、デオキシリボ核酸("DNA")及びリボ核酸("RNA")等の自然発生の核酸を含む。核酸類縁体は、非自然発生の塩基、自然発生のリン酸ジエステル結合以外の他のヌクレオチドと結合するヌクレオチド、又は、リン酸ジエステル結合以外の結合に接続された塩基を含んだものを含む。したがって、核酸類縁体、例えば、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホロトリエステル(phosphorotriester)、ホスホロアミダート(phosphoramidate)、ボラノホスフェート(boranophosphate)、メチルホスホナート(methylphosphonate)、キラルなメチルホスホナート(chiral-methyl phosphonate)、2−O−メチルリボヌクレオチド(2-O-methyl ribonucleotides)、ペプチド核酸(PNA)等であるが、これらに限定されない。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置を利用して合成することができる。用語“核酸”とは、一般に、大きいポリヌクレオチドをいう。用語“オリゴヌクレオチド”とは、一般に、約50以下のヌクレオチドである、短いポリヌクレオチドをいう。ヌクレオチド配列は、DNA配列（すなわちA, T, G, C）により表される場合、"T"が"U"で置換されたRNA配列（すなわちA, U, G, C）もこれに含まれることが理解される。
"cDNA"とは、一本鎖又は二本鎖の形態での、mRNAに相補的か同一であるDNAをいう。
従来の表記法は、ポリヌクレオチド配列について説明するために本明細書中で用いられる。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、5'−端末であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左端方向は、5'−方向と呼ばれる。初期RNA転写物への5'から3'のヌクレオチドの追加の方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、"コード鎖"と呼ばれる。RNA転写物の5'−端末へ位置する5'である、そのDNAから転写されたmRNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列は、“上流の配列”をいう。コードするRNA転写物の3'−端末へ位置する3'である、RNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列は、“下流の配列”をいう。
“相補的”とは、トポロジー適合性、又は２つのポリヌクレオチドの相互作用する表面がともに一致することをいう。したがって、２つの分子は、相補的と説明することができ、さらに、接触表面特性は、互いに相補的である。第一のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第二のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一の場合は、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドに相補的である。したがって、配列が5'−TATAC−3'のポリヌクレオチドは、配列が5'−GTATA−3'のポリヌクレオチドに相補的である。
対象のヌクレオチド配列に相補的な配列が、基準ヌクレオチド配列に実質的に同一である場合は、ヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列に“実質的に相補的”である。
“コードする”とは、明確なヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNA及びmRNA）又は、明確なアミノ酸配列を有する生物学的プロセスでの他のポリマー及び巨大分子の合成のテンプレートとして提供される、遺伝子、cDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定配列の固有特性、並びに、そこから生じる生物特性をいう。したがって、遺伝子により生じるmRNAの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物系でタンパク質を生成する場合は、その遺伝子は、タンパク質をコードする。mRNA配列に同一で、配列表に通常提供されるヌクレオチド配列である、コード鎖、及び、遺伝子又はcDNAの転写のテンプレートとして用いられる、非コード鎖は、コードする遺伝子若しくはcDNAのタンパク質、又は他の生産物をいう。特段の定めがない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの退化したもので、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
“組換えポリヌクレオチド”とは、共に自然に連結されない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅された又は組み立てられた組換えポリヌクレオチドは、適切なベクターに含まれる。また、ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞とは、“組換え宿主細胞”と呼ばれる。遺伝子は、宿主細胞で発現され、例えば“組換えポリヌクレオチド”が産生される。また、組換えポリヌクレオチドは、コードしない機能（例えば、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位等）を提供することができる。
“発現制御配列”とは、動作可能に結合されたヌクレオチド配列の発現（転写及び／又は翻訳）を制御するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をいう。“動作可能に結合された”とは、ある部分の活性（例えば、転写を制御する能力）が、他の部分に対する作用（例えば、配列の転写）で生じる、２つの部分の間の機能的な関係をいう。発現制御配列は、例えば、プロモーターの配列（例えば、誘導性又は構成性）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわちATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むが、これらに限定されない。
“発現ベクター”とは、発現するヌクレオチド配列に動作可能に結合された発現制御配列を含んだ組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のためのシス作用エレメントを十分に含み、他の発現のためのエレメントは、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給することができる。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれた）、及び、組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス等の当技術分野で公知のものを含む。
“増幅”とは、ポリヌクレオチド配列が複製され、多くのポリヌクレオチド分子に拡散される（例えば、逆転写、複製連鎖反応及びリガーゼ連鎖反応による）手段をいう。
“プライマー”とは、設計されたポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズすることができ、相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することができるポリヌクレオチドをいう。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が行われる条件下（すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチドテンプレート、及びDNAポリメラーゼ等の重合のための薬剤の存在下で）で供される場合に生じる。プライマーは、一般に、一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、一般に、デオキシリボ核酸であるが、広範囲の合成の及び自然発生のプライマーは多くの適用で有用である。プライマーは、ハイブリダイズされ、合成開始のための部位として提供されるように設計されている、テンプレートに相補的であるが、そのテンプレートの完全な配列を反映する必要はない。そのような場合においては、テンプレートへのプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に依存する。プライマーは、例えば、色素部位、放射性部位又は蛍光性部位で標識化され、検出可能な部位を用いることができる。
“ポリペプチド”とは、自然発生の構造変異体、及び、ペプチド結合により結合される合成的非自然発生のその類縁体に関連する、並びに、自然発生の構造変異体、及び合成で非自然発生のその類縁体に関連する、アミノ酸残基を含むポリマーをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を利用して合成することができる。用語“タンパク質”とは、一般に、大きいポリペプチドをいう。用語“ペプチド”とは、一般に、短いポリペプチドをいう。
従来の表記法は、ポリペプチド配列を図示するために本明細書中で用いられ、ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。
“保存的置換”とは、アミノ酸のポリペプチドにおける機能的に類似するアミノ酸への置換をいう。次の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(R)、リジン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；及び、
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)
また、アミノ酸は、次のように分類することができる。
(1)疎水性:Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2)中性親水性：Cys, Ser, Thr；
(3)酸性：Asp, Glu；
(4)塩基性：Asn, Gln, His, Lys, Arg；
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly, Pro；及び、
(6)芳香族：Trp, Tyr, Phe
２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈での用語“同一の”又は割合の“同一性”とは、先の共に係属中の米国特許出願第11/230,374号（2005年９月19日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）に記載された配列比較アルゴリズムを用いて、又は、目視検査によって測定され、最大の一致において比較及び整列される場合、同一である若しくは特定の割合のヌクレオチド、又は、同一であるアミノ酸残基を有する２以上の配列又は部分列をいう。
２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈での語句“実質的に相同性がある”又は“実質的に同一の”とは、一般的に、次の配列比較アルゴリズムを用いて、又は目視検査で測定され、最大の一致において比較及び整列される場合、少なくとも40％、60％、80％、90％、95％、98％核酸又はアミノ酸残基と同一である２以上の配列又は部分列をいう。実質的な同一性は、長さにおいて少なくとも約50残基である配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約100残基である配列の領域にわたって、最も好ましくは、少なくとも約150残基において実質的に同一である配列の領域にわたって存在することが好ましい。最も好ましい実施態様においては、配列は、比較生体高分子の一方又は両方のすべての長さにわたって実質的に同一である。
“実質的に純粋”又は“単離された”とは、対象種が優勢種で存在すること（すなわち、モル基準で、組成物での他の個々の巨大分子種よりも豊富である）、及び、実質的に精製された画分が、対象種がすべての存在する巨大分子種の少なくとも約50％（モル基準で）含む組成物であることを意味する。一般的に、実質的に純粋な組成物とは、組成物に存在する巨大分子種の約80％〜90％又はそれより多くが関心を惹く精製された種であることを意味する。対象種は、組成物が単一の巨大分子種から実質的に構成される場合は、実質的に均質に精製される（従来の検出方法では、組成物で汚染種が検出されない）。溶媒種、小分子（＜500ダルトン）、安定化剤（例えばBSA）、及び成分のイオン種は、本定義の目的においては、巨大分子種に考慮されない。ある実施態様においては、本発明の原核生物PAL変異体の組成物は、実質的に純粋であり、あるいは単離される。ある実施態様においては、本発明の原核生物PAL変異体の組成物は、それらの合成に用いる巨大分子の出発物質に関連して、実質的に純粋であり、あるいは単離される。ある実施態様においては、本発明の医薬組成物は、１以上の医薬として許容し得る賦形剤と混合された、実質的に精製又は単離された原核生物PAL変異体を含む。
対象に適用される“自然発生の”とは、対象が自然界で発見することができる事実をいう。例えば、天然資源から分離される生物体（ウイルスを含む）に存在し、研究室で、人間によって故意に改変されていない、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列が、自然発生するというものである。
“野生型”(wt)は、生物体の自然な遺伝型を指す用語である。野生型は、突然変異型（遺伝子突然変異を有する生物体）と区別される。
用語“ポリペプチド”及び“タンパク質”とは、アミノ酸残基のポリマーであり、生産物の最小長が限定されないことをいう。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等がその定義に含まれる。完全長タンパク質及びそのフラグメントが共にその定義に包含される。また、その用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のポリペプチドの発現後修飾を含む。さらに、本発明の目的において、“ポリペプチド”とは、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、固有の配列に対する欠失、付加及び置換等の修飾（一般的に、自然界で保存的）を含むタンパク質をいう。そのようなポリペプチドは、本明細書中では“突然変異体”と呼ばれる。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発でのように、意図的であってもよいし、又は、タンパク質を産生する宿主で若しくはPCR増幅によるエラーで生じる突然変異のように、偶発的であってもよい。
本明細書中で用いられる、“変異体”、“類縁体”、又は“誘導体”は、例えば、ペプチドなどの所定化合物と約70％より高く100％未満の配列相同性を有する化合物、例えばペプチドである。そのような変異体、類縁体、又は誘導体は、自然発生のアミノ酸残基の他に、例えば、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミン及びノルバリンのこれらに限定されない代替として含有する非自然発生のアミノ酸残基からなる化合物であってもよい。また、そのような変異体、類縁体、又は誘導体は、１以上のD−アミノ酸残基からなっていてもよく、２以上のアミノ酸残基間の非ペプチドインターリンケージ(non-peptide interlinkage)を含んでもよい。
本明細書中で用いられる、PALポリペプチド（例えばAvPAL）と、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール又はPEG）との“比”は、PALポリペプチドと水溶性ポリマーとの間の反応条件のモル比をいう。例えば、AvPALとポリエチレングリコールとの約１：３の比（１：３ AvPAL:PEG）は、化学的に修飾されたPALが、ポリエチレングリコール３モル当たり約１モルのAvPALでの反応条件において生成されることを意味する。以下の実施例６に記載する反応条件下で、約１：３の比AvPAL:PEGは、AvPALモノマーのモル当たり約10〜12モルで生じる。
本明細書中で用いられる“治療”又は“治療する”とは、予防的処置、治療的処置、又は診断処置をいう。
“予防的”処置は、疾病又は病状（すなわち癌）の兆候を示さない、又は、病状の進行の危険性を低減させる目的で、初期兆候のみを示す、被験者に施される処置である。本発明の原核生物PALの組成物は、病状（すなわち癌）の進行の可能性を低減させるために、又は、病状が進行した場合に、病状の重症度を最小限にするために、予防的処置として提供することが可能である。
“治療的”処置は、疾病（すなわち癌）の兆候又は症状を低減させる又は除去する目的で、疾病の兆候又は症状を示す被験者に施される処置である。当該兆候又は症状は、生化学的、細胞的、組織学的、機能的、主観的、又は客観的であり得る。本発明の原核生物PALの組成物は、治療的処置又は診断のために提供することが可能である。
“診断”とは、病状（ずなわち癌）の存在又は性質を識別することを意味する。診断方法は、病状の特異性及び選択性で異なる。特定の診断方法は、病状の確定診断を提供し得ないが、当該方法が診断で補助する肯定的な指示を提供する場合は、当該方法で事足りる。
“医薬組成物”とは、ヒト及び哺乳動物を含む被験体動物での医薬的用途に適切な組成物である。医薬組成物は、薬理学的に有効量の原核生物PALポリペプチドを含み、また、医薬として許容し得るキャリアも含む。医薬組成物は、２以上の成分の組み合わせ、複合若しくは凝集から、又は、１以上の成分の分離から、又は、他の型の１以上の成分の反応若しくは相互作用から、直接的若しくは間接的に生じる生成物の他に、キャリアからなる活性成分及び不活性成分を含んだ組成物を包含する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の原核生物PALポリペプチドと医薬として許容し得るキャリアとを混合して製造される組成物を包含する。
“医薬として許容し得るキャリア”とは、標準的な医薬賦形剤、ビヒクル、希釈剤、安定化剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、佐剤、及び／又は、例えば、リン酸塩緩衝食塩水溶液、デキストロースの５％水溶液等のこれらに限定されないキャリア、油／水又は水／油エマルジョン等のエマルジョン、並びに、さまざまな湿潤剤及び／又は佐剤をいう。適切な医薬キャリア及び配合物は、Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)第19版(Mack Publishing Co., Easton, 1995)に記載されている。好ましい医薬キャリアは、活性剤の意図される投与形式に依存する。一般的な投与形式は、腸内投与（例えば経口）、非経口投与（例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、又は腹腔内注射；局所的投与、経皮的投与、又は口腔粘膜投与）を含む。“医薬として許容し得る塩”は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）、及びアンモニア又は有機アミンの塩類を含む、医薬用途の原核生物PAL変異体の組成物に配合することができる塩である。
“医薬として許容し得る”又は“薬理学的に許容し得る”とは、生物学的又は有害でない物質を意味する。すなわち、当該物質は、有害な生物学的作用を生じること、又は、それが含まれる組成物の成分と有害な様式において相互作用することなしに、個体に投与することができる。
本明細書中で用いられる用語“単位剤形”とは、ヒト及び動物の被験者（被験体）の単一用量として適切な物理的に分離したユニットをいい、それぞれのユニットは、医薬として許容し得る希釈剤、キャリア又はビヒクルと関連する所望の効果を奏するのに十分な量で計算された所定量の本発明の原核生物PAL変異体を含む。本発明の新規の単位剤形の仕様は、用いられる特定の原核生物PAL変異体、その達成される効果、及び、宿主のそれぞれの原核生物PAL変異体と関連する薬力学に依存する。
“生理学的なpH”、又は“生理学的な範囲のpH”とは、約7.2〜8.0の包括的な範囲、より一般には、約7.2〜7.6の包括的な範囲のpHを意味する。
本明細書中で用いられる用語“被験者（被験体）”は、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例は、限定されず、哺乳類の種類のメンバーを含む：ヒト、チンパンジー等のヒト以外の霊長動物、並びに、他の類人猿及び猿類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜；ウサギ、イヌ及びネコ等の家庭動物；ラット、マウス及びモルモット等のげっ歯動物などを含む実験動物。非哺乳動物の例は、鳥類、魚類等を含むが、これらに限定されない。当該用語は、特別の年齢や性別を示すものではない。
［Ｂ．原核生物PAL変異体］
特定の巨大分子の信頼できる三次元構造又は構造モデルの解明は、合理的設計が、特異的構造、及び／又は当該巨大分子の機能の最適化のための生産的な方法になることを可能にする。PAL酵素の最適化の三次元構造又は構造モデルを用いる方法は、先の同時係属中の米国特許出願第11/230,374号（2005年９月19日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）に記載される。原核生物PALの高分解能三次元タンパク質結晶構造が、原核生物PALの生化学特性及び生物物理学特性を改善する、及び、原核生物PALのインビボでの治療有効性を増加させる技術に関係する方法で使用することができる。本発明は、野生型原核生物PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は低減された免疫原性を有する原核生物PAL変異体を意図するものである。また、本発明は、野生型原核生物PALと比較して、高い生化学的安定性、及び／又は生化学的半減期を有する原核生物PAL変異体を意図するものである。
（増大された触媒活性を有する原核生物PAL変異体）
本発明による野生型原核生物PALの生物学的に活性のある部位は、PAL最適な動力学特性を最適化することが望まれるように改質することができる。最大半量活性を提供する基質の濃度であるKmは、許容範囲内（すなわち、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満）でのPhe量を維持するPALの治療有効性と密接に関連している。Kmは、基質における酵素の親和性である。親和性を制御することにより、さまざまな濃度で基質に対する酵素の有効性を制限又は制御することができる。例えば、Kmが1000μM（例えば、ロドスポリディウム トルロイデスからのPAL）である場合、酵素活性は、240μMの血液Phe量で約12.5％、及び60μMの血液Phe量で約３％に低減される。Kmが240μMであれば、酵素活性は、240μMの血液Phe量で約50％、及び60μMの血液Phe量で約12％に低減される。好ましい治療対象は、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満で、Phe量を低減させるのに十分な活性を有するだけでなく、治療におけるPhe量を維持する、原核生物PAL酵素を有する。約1000μMのKmを有する酵素は、Phe量が正常な範囲［約55〜60μM、Kaufmann, Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:3160-3164 (1999)参照］に低下し、急速に活性を失い、また、非常に高い濃度又は多い用量である実際的でない投与を必要とする。非常に低いKmを有する酵素は、急速にPheを消費し、癌の処置に有用な検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満で、治療におけるPhe量を維持し得る。
好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、少なくとも約0.1s-1、好ましくは約0.5s-1より高く、より好ましくは約1.0s-1より高いkcatを有する。最も好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、少なくとも約0.4s-1、好ましくは約2.0s-1より高く、より好ましくは約4.0s-1より高いkcatを有する。他の好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約10μM〜約2000μMのKmを有する。より好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約10μM〜約1000μMのKmを有する。さらに、より好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約10μM〜約500μMのKmを有する。他の好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、野生型PALの約50％から約10倍高い酵素活性を示す。他の好ましい実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、野生型PALの約50％から約100％の酵素活性を示す。そのような生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、部位特異的突然変異誘発等の当技術分野で周知の方法を用いて形成することができる。
（低減された免疫原性を有する原核生物PAL変異体）
多くの戦略は、一般にタンパク質免疫原性を低減させるために利用される。免疫反応を最小限にするために導入される改良は、巨大分子の構造、機能又は安定性を損なわないのが好ましい。用いられる有効な戦略は、溶液物性を改良し、抗体エピトープを除去し、化学誘導体化（ペグ化など）、及び／又は、MHCアグリトープを識別及び除去する、ヒト配列（キメラ及び／又は他の‘ヒト化’アプローチ）を含む。注入による治療においては、インビボでの免疫反応性は、改良される合理的な突然変異生成が生じる及び／又は免疫原性のこれらの部位を突然変異させる前に、部位特異的ペグ化［Hershfieldら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7185-7189 (1991); Leongら, Cytokine 16(3): 106-119 (2001); Leeら, Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003)］、又は、タンパク質免疫原性を許容されるレベルに低減させる他の化学誘導体化方法を組み合わせ、エピトープマッピングをすることで解消することができる。抗原表面タンパク質領域の改良は、免疫原性を低減させる［Chirinoら, Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004)］。ある改良方法は、触媒活性（例えば、吸光度分析が活性測定に用いられる）を保持する、非常に小さなサイズのタンパク質の構造を含む。また、ELISAスクリーニングに結び付くプロテインエンジニアリングを用いて、低減された免疫反応性を有する突然変異体の同定をすることができる。他の方法は、ペグ化誘導体化のための追加的な表面リジン部位における点突然変異を導入する。試験酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼで免疫原性を低減させる方法が示されている［Hershfieldら(1991), 前述の箇所］。別の経路は、タンパク質エピトープ領域に位置する残基の突然変異を用いて、免疫原部位を除去する［Yeungら, J. Immunol. 172(1 1):6658-6665 (2004)］。抗体のヒト化(antibody humanization)と類似しているアプローチでは、相同ループ領域、及び／又はヒト抗体からの残基は、相同タンパク質の対応するループ領域に置換される。
タンパク質の溶液物性の改良は、特異的酵素活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させることができる。細菌で発現された組換えタンパク質の一般的な溶液物性は、例えば、鎖間ジスルフィド結合の形成、疎水性相互作用、及び／又は、２価カチオンによるタンパク質凝集体の形成である［Chiら, Pharm.Res.20(9):1325-1336 (2003)］。組換え発現タンパク質の凝集は、免疫反応を高める［Hermelingら, Pharm. Res. 21(6):897-903 (2994); Schellekens, Nephrol. Dial. Transplant. 20(suppl 6):vi3-9 (2005)］。ある改良方法は、他のアミノ酸（例えばセリン）残基を有する表面システイン残基を置換して、鎖間ジスルフィド結合の形成の可能性を最小限にすることを含む。例えば、セリン残基を有する２つの表面システイン残基の置換は、酵素活性に対して若干の影響があるコリスミン酸リアーゼの凝集を低減させた［Holdenら, Biochim. Biophys. Acta 1594(l):160-167 (2002)］。本発明は、他のアミノ酸残基（好ましくはセリン残基）で置換された１以上のシステイン残基を有する原核生物PAL変異体を意図するものである。ある実施態様においては、原核生物PALの１以上のシステイン残基は、他のアミノ酸残基で置換されている。好ましい実施態様においては、原核生物PALはAvPALである。より好ましい実施態様においては、AvPALの１以上のシステイン残基は、システイン残基で置換されている。
［Ｃ．化学的に修飾された原核生物PAL変異体］
巨大分子の化学修飾は、非特異的な方法（誘導された種を混合させる)、部位特異的な方法（野生型巨大分子の反応性誘導体化、及び／又は、部位特異的突然変異誘発と化学修飾を組み合わせて用いる部位選択性変性）、又は、発現タンパク質ライゲーション法［Hofmannら, Curr. Opin.Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)］で行うことが可能である。化学修飾は、免疫原性を低減させるために用いられるのが好ましい。ペグ化は、タンパク質の免疫原性を低減させる実証された方法である［Bhadraら, Pharmazie 57(l):5-29 (2002)］が、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化、酸付加塩類、アミド、エステル、及び、N−アシル誘導体の形成を用いた修飾により、グリコシル化及び他の化学誘導体化方法も可能である［Davis, Science 303:480-482 (2004)］。PALタンパク質のペグ化の方法、及びペグ化の最適度の測定方法は、先の同時係属中の米国特許出願第11/230,374号（2005年９月19日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）に記載されている。本発明は、水溶性ポリマー（すなわち、ポリエチレングリコール又はPEG）を含む原核生物PAL変異体を意図するものである。
本発明は、触媒活性を増加させるため、免疫原性を低減させるため、及び／又は、生化学安定性を改善するために、酵素活性の部位の／付近の他のアミノ酸（例えばチロシン）残基の潜在的なペグ化をブロッキングすることにより、又は、酵素活性に重要なリジン残基の潜在的なペグ化をブロッキングすることにより、一部において、原核生物PAL変異体の活性部位の／付近の１以上のリジン残基を導入することを意図するものである。特定の理論に結び付くことなしに、原核生物PALの活性部位（すなわち、AvPALの位置78又は314）の／付近のチロシン残基は、酵素活性を低減させるペグ化の部位となると仮定されている。ある実施態様においては、酵素活性に必要でない、原核生物PALの酵素活性の部位の／付近の１以上のアミノ酸残基は、リジン残基で置換されている。より好ましい実施態様においては、原核生物PALはAvPALである。より好ましい実施態様においては、位置78又は314のAvPALのチロシン残基は、ペグ化の影響を受けない。また、特定の理論に結び付くことなしに、隣接するリジン残基PAL（すなわち、AvPALの位置413）のペグ化により、通常はペグ化を妨害する原核生物PAL（すなわち、AvPALの位置419）のリジン残基は、基質結合及び／又は触媒活性を低減させるペグ化の活性部位であると仮定されている。ある実施態様においては、原核生物PALの１以上のアミノ酸残基は、ペグ化の影響を受けない酵素の基質結合及び／又は触媒活性において重要なリジン残基のようなリジン残基で置換されている。より好ましい実施態様においては、原核生物PALはAvPALである。より好ましい実施態様においては、位置419のAvPALのチロシン残基は、ペグ化の影響を受けない。
（ペグ化原核生物PAL変異体）
先の同時係属中の米国特許出願第11/451,999号（2006年６月12日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）の実施例７〜９には、ENU2又はBTBRenu2マウスにおけるフェニルアラニン(Phe)量に対する、ロドスポリディウム トルロイデスからのリジン突然変異体R91K PAL(RtPAL)、シアノバクテリア種のノストック パンクチフォルメにより生産されたPAL(NpPAL)、及び、シアノバクテリア種のアナベナ バリアビリスにより生産されたPAL(AvPAL)のペグ化された及びペグ化されていない形態の影響が記載されている。この動物モデルは、動物で重度の高フェニルアラニン血症によって生じる、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子(PAH)の遺伝子座のホモ接合突然変異体である。高い血漿Phe量は、この動物を血漿Pheを低減させるPALの能力を評価するための適切なモデルにする。NpPAL及びAvPALのペグ化形態の投与により、ペグ化されていないNpPAL及びAvPALと比較して、ENU2マウスのPheがそれぞれ大きく低減される。そのような効果は、10週間にわたる毎週の注射でのNpPALにおいて維持される。これらの結果は、シアノバクテリア種である、ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリスからのPALのペグ化が、PKUの影響を受けたマウスのPhe量を低減させるのに不可欠であることを示すものである。
先の同時係属中の米国特許出願第11/451,999号（2006年６月12日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）の実施例１４には、ENU2マウスのPhe量に対する、AvPALポリペプチドにおけるシステイン残基（位置503及び565）のセリンによる置換の影響が記載されている。ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの投与により、ペグ化野生型AvPALで達成されたものと同等に、血漿Pheが低減された。また、抗PAL抗体の抗体力価は、ペグ化野生型AvPALと比較して、ペグ化AvPAL変異体で注入された動物では低かった。これらの結果は、ペグ化AvPAL変異体が、(1)ペグ化野生型AvPALと同等のインビボでのPAL酵素活性を有し、かつ、(2)ペグ化野生型AvPALと比較して、免疫原性を低減させることを示すものである。
［Ｄ．原核生物PAL変異体の治療用途及び投与］
（１．さまざまな形態の癌）
本発明は、単独、又は他の治療的処方（例えば、癌治療剤又は標的癌治療剤であるが、これらに限定されない）と組み合わせた、原核生物PALの組成物の使用を含む方法を具備する癌の治療に関する。特に、原核生物PALの組成物を使用して、任意のレベルのフェニルアラニン(Phe)濃度［例えば、約40μM〜2000μM；ここで、ヒト血漿の正常範囲は、約55μM〜60μMである（Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3160-3164 (1999))］である血液、血清又は血漿の患者を治療し得ることを意図するものである。
本明細書で用いられる“癌治療剤”とは、癌に対して治療効果（すなわち、増殖／生存の阻害）を奏することが明らかである、任意の化合物（例えば、小分子又はペプチド／ポリペプチド）をいう。一般には、癌治療剤は、細胞毒性剤または細胞静止剤である。
本明細書で用いられる“標的癌治療剤”とは、例えば、特定の癌細胞又は組織に対して治療効果（すなわち、増殖／生存の阻害）を奏することが明らかである、小分子、ペプチド／ポリペプチド、ポリペプチド、又は共役ポリペプチドの任意の化合物をいう。一般に、標的癌治療剤は、選択的に標的細胞の表面に結合する、抗体、抗体様ドメインを有するポリペプチド、又は他のポリペプチド（例えば、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン等）である。当該抗体、抗体様ドメインを有するポリペプチド、他のポリペプチドは、癌治療剤に結合しなくても、結合してもよい。当該標的癌治療剤は、特定の癌細胞又は組織に対して治療効果を奏する化合物であり得る。
本発明の原核生物PALの組成物は、Phe制限又は欠乏により、癌の増殖及び／又は生存を阻害し、癌の治療に有用である。本発明の原核生物PALの組成物での治療における癌の確認は、例えば、腫瘍生検体を用いて、又は、公知若しくは実証されたヒト癌の動物モデルにおけるPheの制限若しくは欠乏に対する感受性を有する腫瘍型と比較することで、インビトロでの培養試験（実施例１４参照）、又は、マウスにおけるインビボでのヒト腫瘍異種移植片試験（実施例１５参照）に基づいて行われ得る。好ましい実施態様においては、癌は、肺癌、脳又は中枢神経系癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、又は転移性黒色腫である。他の好ましい実施態様においては、癌は、頭頸部癌、子宮癌、白血病（例えば、急性骨髄白血病、又は急性リンパ芽球性白血病）、又は骨髄腫である。他の好ましい実施態様においては、癌は、小児癌又は耐性癌（すなわち、癌治療剤又は標的癌治療剤に対して耐性を示す癌）である。
本発明の特定の実施態様は、タンパク質が制限された（すなわち、フェニルアラニンを含まない）食事を組み合わせて、原核生物PAL、又は生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体を含む組成物を被験者に投与することによる癌の治療に関し、原核生物PALとタンパク制限食との組み合わせが、組み合わせ投与なしのものと比較して、被験者の血液、血清又は血漿のPhe濃度を低減させるのに有効である。
本発明の方法は、原核生物PALの組成物で治療する個体の血漿Phe濃度の監視を伴うことを意図するものである。患者の血液、血漿又は血清Phe濃度の少なくとも10％低減させるように、原核生物PALの組成物を単独で、癌治療剤若しくは標的癌治療剤等の他の治療的処方を組み合わせて、又は、原核生物PALの処方、及びタンパク質が制限された（すなわち、フェニルアラニンを含まない）食事を組み合わせて投与することにより患者を治療する。好ましくは、当該方法は、血液、血漿又は血清Phe濃度の少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％低減させる。さらに、より好ましくは、当該方法は、個体の血液、血清又は血漿Phe濃度の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％又はそれ以上低減させる（例えば、60μMの血漿Phe濃度である患者が治療されれば、血漿Phe濃度が50％、70％又は90％低減され、それぞれ30μM、18μM又は６μMの血漿Phe濃度となる）。当然、本発明の治療方法は、治療において、患者の血液、血清又は血漿Phe濃度を、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に低減させようと試みるものであることは理解されるべきである。
非経口、経口、又は他の投与及び投薬の標準経路が、標準方法によって達成することができる。
［２．治療における使用のための組成物］
本発明は、癌の治療的介入を意図するものである。そのような介入は、原核生物PALの組成物、医薬組成物及び配合物単独で、癌治療剤若しくは標的癌治療剤等の治療的処方、低タンパク食（すなわち、低フェニルアラニン）と原核生物PALを組み合わせて、又は、原核生物PALの組成物、医薬組成物及び配合物と併せて使用することができる、原核生物PALの組成物、医薬組成物及び配合物の使用に基づくものである。また、原核生物PAL及び／又は食事制限は、更に計画される（例えば、チロシン補給等のこれに限定されない、低フェニルアラニン量をうたう）他の治療的組成物を組み合わせてもよい。本項は、本明細書中で意図される治療で用いられ得る組成物、医薬組成物及び配合物についての考察を提供する。
（原核生物PALの組成物、医薬組成物及び配合物）
一般に、本発明は、本発明に係る治療有効量の原核生物PALの組成物と、１以上の医薬として許容し得る賦形剤、ビヒクル、希釈剤、安定化剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、佐剤、及び／又はキャリアを含む医薬組成物を意図するものである。そのような医薬組成物は、さまざまな緩衝液内容物（例えば、Tris−HCl、リン酸塩）、pH及びイオン強度の希釈剤；洗剤及び可溶化剤（例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、及び充填物質(bulking substance)（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加剤を含む。例えば、Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版 (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) ページ 1435:1712（本明細書中に引用により組み込まれる）を参照されたい。活性成分の有効量は、当業者により、体重、年齢及び治療目的等の要因を考慮して容易に決定することができる、治療上、予防上、又は診断上有効な量である。
本発明の原核生物PALの医薬組成物は、溶液のpHを所望の範囲に維持する緩衝剤を含んでもよい。好ましい緩衝剤は、Tris−HCl、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及び、クエン酸ナトリウムを含む。また、これらの緩衝剤の混合物を用いてもよい。当該組成物に有用な緩衝剤の量は、用いる特定の緩衝剤、及び溶液のpHに非常に依存する。例えば、酢酸塩類は、より少ない量で、pH６よりもpH５で溶液において用いられ得るので、pH６よりも、pH５で効果的な緩衝剤である。より好ましい緩衝剤は、Tris−HClである。本発明の医薬組成物における好ましいpHの範囲は、約pH6.0〜8.5である。本発明の医薬組成物におけるより好ましいpHの範囲は、pH約7.0〜8.0である。本発明の医薬組成物における最も好ましいpHの範囲は、pH約7.0〜7.6である。
本発明の医薬組成物は、溶液を等張にして、注入に適合させるために、更に等張性調節剤(isotonicity-adjusting agent)を含んでもよい。好ましい薬剤は、50〜200mMの範囲の濃度である塩化ナトリウムである。より好ましい薬剤は、100〜150mMの範囲の濃度である塩化ナトリウムである。最も好ましい薬剤は、130〜150mMの範囲の濃度である塩化ナトリウムである。
医薬として許容し得るキャリア又は賦形剤は、本発明の原核生物PALの組成物を安定化させる分子である、安定化剤を含み得る。本明細書中で用いられる“安定化する”とは、例えば、原核生物PAL酵素の有効期間を増加させること、タンパク質分解から原核生物PAL酵素を保護すること、活性形態で原核生物PAL酵素を維持すること、及び、高温での保存において原核生物PAL酵素活性を保護することを含むが、これらに限定されない。
本発明の安定化剤は、trans−桂皮酸(t-CA)、安息香酸、チロシン(Tyr)等のL−フェニルアラニン(Phe)及びその構造類縁体を含む。インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)からの植物PAL(PvPAL)の活性の損失は、アフィニティー精製後のその基質であるL−フェニルアラニンの除去において示された［Da Cunha, Eur. J. Biochem. 178:243-248 (1988)］。また、ロドスポリディウム トルロイデスからの酵母PAL(RtPAL)は、プロテアーゼ不活化から保護されることが示された［Wangら, Mol. Genet. Metab. 86:134-140 (2005); Pilbakら, FEBS J. 273:1004-1019 (2006)］。以下に示すように、Phe及び特定のその構造類縁体は、アナベナ バリアビリスからの原核生物PAL(AvPAL)のPEG:PAL複合体を安定化させる能力がある（実施例１１参照）。特定の理論に結び付くことなしに、原核生物PAL酵素は、酵素基質複合体として非常に安定しており、結合基質Pheは、生産物t−CA、又はt−CAの遷移状態類縁体に変換されると仮定されている。当該t−CAは、高反応性活性部位中心（MIO群）に結合されたままであり、PAL酵素を安定化させる。したがって、当該PAL酵素の基質であるPhe、生産物、t−CA、又はその構造類縁体は、本発明の安定化剤である。
本発明は、原核生物PAL変異体、及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物であって、医薬として許容し得るキャリアが安定化剤を含むことを意図するものである。Phe又はその構造類縁体である。当該安定化剤は、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される。好ましい本発明の安定化剤の範囲は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約0.1〜20モルの安定化剤である。より好ましい本発明の安定化剤の範囲は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約0.5〜10モルの安定化剤である。最も好ましい本発明の安定化剤の範囲は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約１〜10モルの安定化剤である。
ある実施態様においては、医薬組成物は、原核生物PAL変異体、及び医薬として許容し得るキャリアを含み、原核生物PAL変異体が、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し、被験者の血液、血清又は血漿中のPhe濃度を、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に低減させるのに有効であり、かつ、医薬として許容し得るキャリアが安定化剤を含む。ある実施態様においては、安定化剤は、Phe又はその構造類縁体である。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される。
好ましい実施態様においては、医薬組成物は、原核生物PAL変異体、及び医薬として許容し得るキャリアを含み、原核生物PAL変異体がアナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)変異体であり、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており、AvPAL変異体が、ポリエチレングリコールである水溶性ポリマーを更に含み、AvPAL変異体とポリエチレングリコールとの比が約１：３であり、AvPAL変異体が、被験者の血液、血清又は血漿中のPhe濃度を、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に低減させるのに有効であり、かつ、医薬として許容し得るキャリアが安定化剤を含む。ある実施態様においては、安定化剤は、Phe又はその構造類縁体である。好ましい実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される。
本明細書中で用いられるように、原核生物PAL変異体の組成物が意図される場合、用語“治療有効量”とは、癌患者の健康に対して意図される有益な効果を奏するのに有効である量をいう。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の治療有効量は、血液、血漿又は血清（好ましくは血漿）中のL−フェニルアラニン量を低減させ、患者に有益な効果を奏する。当該治療有効量は、ある個体から他の個体で変動し、患者の全体的な健康状態、食事及び病状を含む多くの因子に依存する。治療に用いる原核生物PALの量は、血液、血漿又は血清（好ましくは血漿）中のL−フェニルアラニン量の許容し得る低減を提供し、有益な量［一般には、正常な血液、血漿又は血清（好ましくは血漿）中のL−フェニルアラニンの範囲の約５％未満から約35％〜100％、好ましくは約５％未満から約35％、及び、より好ましくは、約５％未満から約15％］のPAL治療時においてこの値を維持する。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の治療有効量は、治療しない患者と比較して、治療患者において、腫瘍の成長、腫瘍のサイズ、又は全身腫瘍組織量を、約10％、30％、50％、70％、90％、95％、98％又は99％より多く低減させる。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の治療有効量は、治療しない患者と比較して、治療患者において、静状態で腫瘍を維持する。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の治療有効量は、治療しない患者と比較して、治療患者において、生存期間又は疾病が存在しない期間を、少なくとも約10％、20％、50％、100％、２倍、５倍、又は10倍長く増加させる。本発明の原核生物PAL変異体の組成物の治療有効量は、公的に利用可能な物品及び方法を用いて、当業者が簡単に確認することができる。
本発明は、野生型のPALよりも頻度が少ない、原核生物PAL変異体の投与を提供する。投与頻度は、治療される症状に依存して変動するが、一般には、週約１回である。正確に用いられる投与頻度は、さまざまな個体による原核生物PAL変異体に対する反応の変動により、本明細書中で開示される頻度から多少変動してもよいと理解され、用語“約”は、そのような変動を反映することを意図する。原核生物PAL変異体は、週約２回、週約１回、２週毎に約１回、月約１回、又は、月約１回より長い間隔で投与されることを意図するものである。
したがって、本発明は、血液、血漿又は血清のL−フェニルアラニン量を低減させるために使用することができる。血液、血漿又は血清のL−フェニルアラニン量の欠乏が有益とされる、多数の癌に関連する病状は、本発明の原核生物PAL変異体の医薬組成物で治療することができる。
本発明により調製される原核生物PALの医薬組成物は、非経口注入により、静脈内で、腹腔内で、皮下に、筋肉内に、動脈内で、又は鞘内に投与されるのが好ましい。しかしながら、本発明の医薬組成物を用いて、他の送達経路も有効に利用可能であることは、当業者に明らかである。
本明細書で記載される方法は、上述の分子と、１以上の医薬として許容し得る賦形剤、ビヒクル、希釈剤、安定化剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、佐剤、及び／又はキャリアと、任意に他の治療及び／又は予防成分とを含む原核生物PALの医薬組成物を用いる。そのような賦形剤は、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノール、シクロデキストリン、改質シクロデキストリン（すなわち、スルホブチルエーテルシクロデキストリン）等の液体を含む。また、非液体配合物に適切な賦形剤も、当業者に公知である。
医薬として許容し得る塩は、本発明の組成物で用いることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、及び、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩を含む。医薬として許容し得る賦形剤及び塩類の充分な考察は、Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)において有効である。
また、湿潤剤又は乳化剤等の補助剤、生理的緩衝剤、界面活性剤等が、そのようなビヒクルに含まれてもよい。生理的緩衝液は、実質的に、医薬として許容し得、所望のpH（すなわち、生理学的に許容し得る範囲）の配合を提供する溶液である。緩衝液の例は、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、トリス緩衝食塩水、ハンクの緩衝食塩水(Hank's buffered saline)等を含む。
意図される投与形式によって、医薬組成物は、例えば、タブレット、坐剤、ピル、カプセル剤、パウダー、液体、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤等の個体、半個体又は液体剤形であってもよく、好ましくは、正確な用量の１回投与に適している単位剤形である。当該組成物は、治療有効量の原核生物PALと医薬として許容し得るキャリアを含み、これに加えて、医薬的薬剤、佐剤、希釈剤、緩衝剤等を含んでもよい。
一般に、本発明の原核生物PALの医薬組成物は、経口（口腔内及び舌下を含む）、直腸、鼻、局所、肺、膣、非経口（筋肉内、動脈内、鞘内、皮下及び静脈内）投与、又は、吸入又は注入による投与に適している形態に適しているそれらを含む医薬配合物として投与される。好ましい投与方式は、苦痛の程度によって調整することが可能な都合のよい毎日の投与計画を用いた静脈内である。
固形組成物においては、従来の無毒な固体キャリアは、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む。液体医薬として投与し得る組成物は、例えば、本明細書に記載されている原核生物PAL変異体の組成物、及び、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等の賦形剤中の任意の補助薬を溶解、分散すること等で溶液又は懸濁液を形成することにより調製することができる。また、必要であれば、投与される医薬組成物は、少量の無毒な補助剤［湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、張度調整剤（tonicifying agent）等で、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート等］を含んでもよい。そのような剤形の実際の調製方法は、公知であるか、当業者に明らかである（例えば、上述のRemingtonの薬学を参照）。
経口投与においては、当該組成物は、一般に、タブレット、カプセル、又はソフトカプセルの形態をとるか、あるいは、水性若しくは非水性の溶液、懸濁液又はシロップでもよい。タブレット及びカプセルは、経口投与の形式が好ましい。経口用のタブレット及びカプセルは、一般に、１以上の一般的に用いられるラクトース及びコーンスターチ等のキャリアを含む。また、ステアリン酸マグネシウム等の平滑剤も一般に添加される。液体懸濁液が使用される場合、活性剤を乳化剤及び懸濁剤と組み合わせてもよい。必要であれば、香味料、着色剤及び／又は甘味剤も同様に添加してもよい。本明細書中における経口製剤への導入のための他の任意成分は、保存剤、懸濁剤、増粘剤等を含むが、これらに限定されない。
非経口製剤は、液体溶液又は懸濁液、固体又は注入に先駆けて液体において再構成、可溶化若しくは懸濁するのに適切な凍結乾燥の形態、あるいは、エマルジョンの従来の形態において調製することができる。好ましくは、キャリア、分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を用いる当技術分野において公知の方法によって、無菌注入懸濁剤が製剤化される。また、当該無菌注入懸濁剤は、無毒の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶剤における無菌注入溶液、又は懸濁液であってもよい。利用可能な許容し得るビヒクル及び溶剤は、水、リンゲル液、及び等張食塩水である。また、無菌の、不揮発性油、脂肪酸エステル、又は多価アルコールが、溶剤又は懸濁溶媒として従来どおり用いられる。さらに、非経口投与は、一定の用量が維持される持続放出又は徐放システムの使用を含んでもよい。
本明細書中に記載されている本発明の原核生物PALの組成物は、癌を治療するのに治療有効用量で患者に投与することができる。そのような原核生物PALの組成物の毒性及び治療有効性は、例えば、LD50（母集団の50％までの致死用量）及びED50（母集団の50％までの治療有効用量）を測定すること等の細胞培養物、又は実験動物において、標準的な薬学的方法によって測定することができる。毒性と治療効果の間の用量の比は、治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す原核生物PALの組成物が一般に好ましい。
細胞培養分析及び動物実験から得られるデータは、ヒトで使用される一連の用量を公式化するのに用いることができる。好ましくは、用量は、少量又は最小限毒性のED50を含む一連の血中濃度以内である。当該用量は、用いられる剤形、及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動する。治療有効用量又は治療有効量は、細胞培養分析及び動物モデルから測定することができる。
（食事性タンパク質）
癌患者への原核生物PALの組成物の投与に加えて、患者の食事性タンパク質もまた、限定又は変更可能であることが意図される。当業者は、PKUの治療に用いるさまざまな市販のタンパク質配合物を認知している。そのような配合は、MAXIMAID, PHENEX 1, PHENEX 2（Ross Laboratories社製, Liverpool, UK）、LOFENALAC、PHENYL−FREE（Mead-Johnson社製)等を含む。
当業者は、一般に、Phe濃度が存在しない参照されたタンパク質配合物を用い得る。当該タンパク質配合物は、頻繁にPKU患者が不足しているアミノ酸が補給されている。そのようなアミノ酸は、例えば、L−チロシン及びL−グルタミンを含む。
また、ヒトの乳及び他の食料で一般にみられる、L−カルニチン及びタウリンは、タンパク質制限に加えて、補給されるべきものであることが知られている。特定の実施態様においては、L−カルニチンは、100gのタンパク質補給で20mg補給することができる。また、タウリンは、ヒトの乳及び動物起源の食品で一般にみられる十分な量のこれらの因子を補助するために、100gのタンパク質補給で40mg補給することができる。
また、当業者は、食事タンパク質制限に関わらず、他の補給物が提供されるように患者に補給されるべきである、必須ビタミン及びミネラル等の他の成分について、2000年全米科学アカデミー全米研究評議会の食事摂取基準(2000 National Academy of Sciences-National Research Council Dietary Reference Intakes)を参照する。
全タンパク質量及び所定の血漿Phe濃度に関する上述の考察ついては、当業者が、必要な、及び患者の食事を調節する、食事タンパク質制限の量を決定することができる。被験者への原核生物PALの投与において、本発明の方法が有効であるか否かを決定することは、血漿Phe濃度が、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に維持されるように、規則的に患者の血漿Phe濃度を決定することを必要とする。そのような濃度を決定する試験は、以下に記載されている。好ましくは、検出感度以下から約20μM〜60μMの濃度が達成され、より好ましくは、約20μM未満、及び、さらに好ましくは約10μM未満である。
特定の実施態様においては、本発明は、原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することを含む癌の治療方法であって、当該PAL変異体が、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に、被験者の血液、血清又は血漿中のフェニルアラニン濃度を低減させるのに有効であり、かつ、タンパク質が制限された（すなわち、フェニルアラニンを含まない）食事を被験者に投与することを更に含む癌の治療方法を提供する。
本発明の特定の方法は、さまざまな癌の形態の患者に治療帰結をもたらすための原核生物PALと食事タンパク質制限を組み合わた使用を含む。本明細書で意図される組み合わせ治療での適切な治療帰結を達成するために、一般に、被験者に、原核生物PALの組成物、及び、所望の治療帰結をもたらす（すなわち、血漿Phe濃度を、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度以下から最適には約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に低減させること）のに有効な組み合わせ量の制限食を投与するのが好ましい。このプロセスは、原核生物PALの組成物、及び食事タンパク質の治療用組成物を同時に投与することを含んでもよい。これは、食事タンパク質の必要物をすべて含み、また、当該タンパク質配合物で原核生物PALを含む、単一の組成物、又は薬理学的タンパク質配合物を投与することにより達成することができる。あるいは、食事タンパク質（補給物、又は一般のタンパク質食品）を、原核生物PALの薬理学的タンパク質配合物（タブレット、注射又は飲料）とほぼ同時に摂取する。また、原核生物PALは、プロテインバー、又は、摂取に適しているブラウニー、パンケーキ、ケーキ等の他の食品に配合してもよい。
原核生物PALの投与は、（PAHの投与とは異なり）チロシンを生成しないので、そのような治療は、依然として、そのような患者にとっては、チロシンは必須アミノ酸である。したがって、チロシンでの食事補給は、食事タンパク質治療と組み合わせて、原核生物PALを単独で摂取する患者にとって望ましい。
他の代替においては、原核生物PAL治療は、分から時間に及ぶ間隔による食事タンパク質治療に先行するか後続することができる。タンパク質及び原核生物PALの組成物が別々に投与される実施態様においては、PALが常に患者に対して有利な効果を奏することができるように、一般に、重要な期間が、それぞれの送達時間の間に失効しないことが保証されている。そのような場合においては、食事タンパク質の摂取の約２〜６時間以内（前後）に（約１時間のみの遅延時間が最も好ましい）PALを投与することを意図するものである。特定の実施態様においては、PAL治療は、患者にPALを無期限で毎日投与する、連続的な治療である。
［３.併用療法］
また、原核生物PAL及びタンパク質制限食の送達に専ら基づく治療に加えて、本発明の方法は、特に、１以上の癌の症状を標的する組成物との併用療法を意図するものである。そのような組成物は、例えば、癌治療剤及び標的癌治療剤を含むが、これらに限定されない。
（癌治療剤）
本明細書で記載されている方法に従って、癌細胞に対する治療効果（すなわち、増殖及び／又は生存の抑制）を奏する薬剤を、本発明の原核生物PALの組成物を組み合わせて癌治療剤として用いることができる。一般に、当該癌治療剤は、細胞毒性剤又は細胞静止剤である。
当該癌治療剤は、本発明の原核生物PALの組成物と、癌の併用療法で投与することができる。本明細書中で用いられる“癌の併用療法”は、癌治療剤及び原核生物PALの組成物が同時に又は連続して投与され、癌治療剤の後に原核生物PALの組成物、又は、これと逆に投与されることを意味する。
有用な細胞毒性剤の分類は、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合剤(DNA minor groove binder)、DNA複製インヒビター、アルキル化剤［例えば、シスプラチン、モノ(プラチナ)、ビス(プラチナ)及び、トリ核白金錯体、及びカルボプラチン等の白金錯体］、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、ズオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオン透過担体、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、予備成形化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等を含む。
個々の細胞毒性剤は、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルマスティン(BSNU)、CC−1065、クロラムブチル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタセル、ドキソルビシン、エストロゲン、5−フルオロデオキシウリジン、5−フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミン、メルファラン、6−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン（procarbizine）、ストレプトゾトシン、テノポシド（tenoposide）、6−チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP−16、及びVM−26を含む。
ある実施態様においては、癌治療剤は細胞毒性剤である。適切な細胞毒性剤は、例えば、ドラスチン（例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE）、DNA副溝結合剤（例えば、エンジイン及びレキシトロプシン）、ズオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、CC−1065、SN−38、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンA及びB、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン（cemadotin）、マイタンシノイド、ジスコデルモリド、エロイテロビン、並びに、ミトキサントロンを含む。
特定の実施態様においては、細胞毒性剤は、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、マイトマイシンC、又は、エトポシド等の従来の化学療法薬である。また、CC−1065類縁体、カリケアマイシン、マイタンシン、ドラスチン10の類縁体、リゾキシン、及び、パリトキシン等の有効な薬剤を用いることができる。
特定の実施態様においては、細胞毒性剤は、DNA副溝結着剤［例えば、CBI化合物、エンジイン（例えばカリケアマイシン)］である。
特定の実施態様においては、癌治療剤は抗チューブリン剤である。抗チューブリン剤の例は、タキサン［例えば、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタセル）］、T67（Tularik社製）、ビンカアルキロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及び、ビノレルビン）、及び、ドラスチン（例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB）を含むが、これらに限定されない。他のチューブリン剤の例は、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類縁体（例えば、エポチロンA及びB）、ノコダゾール、コルチシン、コルチミド（colcimid）、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ジスコデルモリド、及び、エロイテロビンを含む。
特定の実施態様においては、細胞毒性剤は、マイタンシノイド、他の分類群の抗チューブリン剤（例えば、マイタンシン又はDM−1）である。
特定の実施態様においては、癌治療剤は放射性同位体である。他の特定の実施態様においては、癌治療剤は放射性同位体ではない。
特定の実施態様においては、細胞毒性剤は代謝拮抗物質である。当該代謝拮抗物質は、例えば、プリンアンタゴニスト［例えば、アゾチオプリン（azothioprine）、又はミコフェノール酸モフェチル］、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤（例えば、メトトレキセート）、アシクロビル、ガングシクロビル(gangcyclovir)、ジドブジン、ビダラビン、リバビリン（ribavirin）、アジドチミジン、シチジン・アラビノシッド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ポスカルネト（poscarnet）、又はトリフルリジンであり得る。
他の実施態様においては、細胞毒性剤は、タクロリムス、シクロスポリン、又はラパマイシンである。更なる実施態様においては、細胞毒性剤は、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化二砒素、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、クラドリビン、ダーベポエチンα、デニロイキンジフチトクス、デキスラゾキサン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピルビシン、エポエチンα、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ジェムツツマブオゾガミシン、ゴセレリン、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンα−2a、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、メクロレタミン又はニトロジェンマスタード、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、マイトマイシンC、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオネート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、及び、ゾレドロナートである。
特定の実施態様においては、本発明は、原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することによる癌の治療方法であって、当該PAL変異体が、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に、被験者の血液、血清又は血漿中のPhe濃度を低減させるのに有効であり、かつ、さらに癌治療剤を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む癌の治療方法を提供する。
（標的癌治療剤）
本明細書で記載された方法に従って、本発明の原核生物PALの組成物と組み合わせて標的癌治療剤として、特定の癌細胞（すなわち、増殖及び／又は生存の抑制）に対して治療効果を奏する薬剤を用いることができる。一般に、当該標的癌治療剤は、抗体、又は、特定の型の腫瘍細胞若しくは組織（例えば、抗体様標的ドメインを有することによって、又は、レセプター媒介結合を介してであるが、これらに限定されない）に選択的に結合する酵素若しくはタンパク質である。当該抗体、抗体様標的ドメインを有するポリペプチド、酵素又はタンパク質は、放射性同位体で識別することができる、あるいは、標的細胞若しくは組織に対して細胞毒素若しくは細胞静止作用を及ぼすことが可能な毒素若しくは他の薬剤に結合することができる。あるいは、当該標的癌治療剤は、タンパク質（例えば、特定の型の腫瘍細胞又は組織で優先的に発現された又は活性化された、酵素又はレセプターであるが、これに限定されない）を阻害又は活性化することによって、特定の癌細胞又は組織（すなわち、増殖及び／又は生存の抑制）に対して治療効果を奏する薬剤であり得る。
当該標的癌治療剤は、本発明の原核生物PALの組成物と共に標的癌併用療法として、投与することができる。“標的癌併用療法”は、標的癌治療剤及び原核生物PALの組成物が、同時に又は連続して投与され、標的癌治療剤の後に原核生物PALの組成物、又は、これと逆に投与されることを意味する。
特定の実施態様においては、標的癌治療剤は、ヒト化抗HER2モノクローナル抗体、RITUXAN（リツキシマブ；Genentech社製；キメラ抗CD20モノクローナル抗体）；OVAREX（AltaRex Corporation社製, MA）；PANOREX（Glaxo Wellcome社製, NC；マウスIgG2a抗体）；Cetuximab Erbitux（Imclone Systems社製, NY；抗EGFR IgGキメラ抗体)；Vitaxin（Medlmmune社製, MD；Campath I/H（Leukosite社製, MA；ヒト化IgGl抗体）；Smart MI95（Protein Design Labs社製, CA；ヒト化抗CD33 IgG抗体）；LymphoCide（Immunomedics社製, NJ；ヒト化抗CD22 IgG抗体）；Smart ID10（Protein Design Lab社製, CA；ヒト化抗HLA-DR抗体）；Oncolym （Techniclone社製, CA；放射能標識化マウス抗HLA-DrlO抗体）；Allomune（BioTransplant社製, CA；ヒト化抗CD2 mAb）；Avastin（Genentech社製, CA；抗VEGFヒト化抗体）；Epratuzamab（Immunomedics社製, NJ, 及びAmgen社製, CA；抗CD22抗体）；及び、CEAcide（Immunomedics社製, NJ；ヒト化抗CEA抗体）である。
他の適切な抗体は、次の抗原に対する抗体：CA125、CA 15−3、CA19−9、L6、ルイスY(Lewis Y)、ルイスX、αフェトプロテイン、CA 242、プラセンタアルカリホスファターゼ、前立腺特異性抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、表皮成長因子、MAGE−1、MAGE−2、MAGE−3、MAGE−4、抗トランスフェリンレセプター、p97、MUCl−KLH、CEA、gplOO、MART1、前立腺特異性抗原、IL−2レセプター、CD20、CD52、CD33、CD22、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、CD38、CD40、ムチン、P21、MPG、及び、Neu癌遺伝子産物を含むが、これらに限定されない。
特定の実施態様においては、標的癌治療剤は、酵素、又は、抗体様標的ドメイン、あるいは選択的に特定の細胞若しくは組織に結合する能力を有する他のタンパク質である。一般に、抗体様標的ドメインを有するタンパク質、酵素又は他のタンパク質は、癌治療剤、例えば、化合物若しくは毒素［例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナスエンドトキシン等；Kreitman, AAPS J. 8(3):E532-E551 (2006)］等のペプチド／ポリペプチド、又は、標的細胞若しくは組織に対して細胞毒素若しくは細胞静止作用を及ぼすことが可能な他の薬剤に結合される。
特定の実施態様においては、標的癌治療剤は、癌細胞又は組織（例えば、セリン／スレオニンキナーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、核内受容体アゴニスト、核内受容体アンタゴニスト等）に対して治療効果を奏する化合物（例えば、小分子又はペプチド／ポリペプチド）である。
特定の実施態様においては、本発明は、原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することを含む癌の治療方法であって、当該PAL変異体が、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し、検出感度以下から約20μM〜60μMの範囲、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満に、被験者の血液、血清又は血漿中のフェニルアラニン濃度を低減させるのに有効であり、かつ、標的癌治療剤を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを更に含む癌の治療方法を提供する。
［４.患者集団の確認及び監視］
本明細書の全体にわたって考察されるように、所定の癌患者が、原核生物PAL治療に感受性があるか否かを決定すること、又は、血漿フェニルアラニン(Phe)濃度の低減の観点から治療規制の効果を監視するために、初期及び治療規制の実行時の両方で、患者のフェニルアラニン濃度を測定することが本発明のさまざまな実施態様において必要である。そのような方法の例は、以下に記載されている。
（原核生物PAL治療に対する患者の反応の確認）
本発明の原核生物PALの組成物での治療が有用であり得ることについての患者の確認は、インビトロでの培養試験若しくはマウスでのインビボでのヒト腫瘍異種移植片試験に基づいて、又は、公知若しくは実証されたヒト癌の動物モデルにおけるPheの制限若しくは欠乏に対する感受性を有する腫瘍型と比較することで行うことができる。
（例えば、腫瘍生検体又は臨床穿刺液からの）腫瘍細胞が、原核生物PALの組成物の非存在下若しくは存在下、又はフェニルアラニン欠乏培地の非存在下若しくは存在下で増殖する、インビトロでの培養試験が、当技術分野において公知のプロトコールを用いて行うことができる［例えば、Abellら, Cancer Res. 32:285-290 (1972); Stithら, Cancer Res. 33:966-971 (1973); Fuら, Cancer Res. 59:758-765 (1999); Fuら, J. Cell. Physiol. 209:522-534 (2006); Elstadら, Nutr. Cancer 25:47-60 (1996); Nunezら, Cancer Lett. 236:133-141 (2006)参照、また、実施例１４も参照］。
（例えば、腫瘍生検体又は臨床穿刺液からの）腫瘍細胞が、ヌードマウス又はSCIDマウスに注入され、その後、原核生物PALの組成物の非存在下若しくは存在下、又はフェニルアラニン欠乏食の非存在下若しくは存在下で、野生型ヌードマウス又はSCIDマウスに移植される、マウスにおけるインビボでの腫瘍異種移植片試験は、当技術分野において公知のプロトコールを用いて行うことができる［例えば、Abellら, Cancer Res. 33:2529-2532 (1973); Shenら, Cancer Res. 37:1051-105 (1977); Fuら, Nutr. Cancer 31:1-7 (1998); Fuら, Nutr. Cancer 45:60-73 (2003); Meadowsら, Cancer Res. 42:3056-3063, 1982; Elstadら, Anticancer Res. 13:523-528, (1993)参照、また、実施例１５も参照］。
ヒト癌の動物モデルにおけるPheの制限若しくは欠乏に対する成長、及び感受性においてPheへの公知又は実証された依存性を有する腫瘍型は、例えば、白血病、転移性骨髄腫、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含む［Abellら, (1973), 前述の箇所; Shenら, (1977), 前述の箇所; Fuら, (1998), 前述の箇所; Fuら, (2003), 前述の箇所; Meadowsら, (1982), 前述の箇所; Elstadら, (1993), 前述の箇所］。
実施例１４は、肺癌、脳又は中枢神経系癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、転移性黒色腫、頭頸部癌、子宮癌、白血病（例えば、急性骨髄白血病、又は急性リンパ芽球性白血病）、及び、骨髄腫由来の腫瘍細胞の増殖及び／又は生存が、本発明の原核生物PALの組成物とのインキュベーションにおいてPhe制限に感受性があることを示す。
（フェニルアラニン濃度の測定）
血液、血清、又は血漿中のフェニルアラニン(Phe)濃度の測定方法は、当技術分野において公知であり、そのうちの幾つかは、先の同時係属中の米国特許出願第11/230,374号（2005年９月19日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）に記載されている。患者の血漿Phe量を、治療規制の時間的経過の全体にわたって一定の間隔（例えば、毎日、一日おきに、又は毎週）で監視することが意図される。そのような規則性で血漿Phe量を監視することにより、臨床医は、治療の有効性を評価し、原核生物PAL及び／又は食事タンパク質必要物を調節することができる。
［Ｅ.原核生物PALの製造］
本発明の他の態様は、原核生物PAL、又は生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体の製造方法である。好ましい実施態様においては、N末端標識（例えばオクタヒスチジル標識）を有する又は有しないで、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）等の誘導プロモーターを用いて、ベクター、好ましくはpIBX1［Suら, Appl. Environ. Microbiol. 62:2723-2734 (1996)］、又はpET28a（Invitrogen社製）において、大腸菌BLR(DE3)/pLysS（Novagen社製)、又は大腸菌BL21(DE3)/pLysS（Invitrogen社製）細胞において、組換え原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体が過剰発現される。バイオリアクター／発酵槽において、振盪フラスコのグリセロールストックから、種培養物を増殖させる。その後、そのような種培養物を、供給バッチモードの制御されたバイオリアクターへ導入する。グルコースを補充し、pHを塩基（NH4OH）で調整し、1200rpm以下で攪拌する。O2供給は、20％より高くなるように溶存酸素を維持する。当該細胞を、37℃の温度で、70〜100（〜22〜25時間）のOD600になるまで増殖させ、その後、0.4mM IPTGで誘導する。温度を30℃まで低下させ、0.1 IU/mLより低く（約40〜48時間、及び一般に200のOD600）なるまで増殖させる。細胞培養培地は、一般に、酵母エキスタンパク質、ペプトン−トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、トレース塩類及びリン酸緩衝塩類と定義され、これらから構成される。組換え原核生物PAL生産物、又は生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体は、細胞内で生産され、分泌されない。細菌は、連続遠心分離（αLaval, Carr, Ceba、又はこれらの等価物）により回収される。
［Ｆ. 原核生物PALの精製］
本発明の更なる態様は、原核生物PAL、又は生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体の精製方法を特徴とする。第一の実施態様によれば、形質転換された細胞群を増殖させ、残りの粗組換え酵素は破壊される。異物は、カラムの汚損を防止するために、通常粗バルクから分離される。クロマトグラフィー精製は、１又は幾つかのクロマトグラフィー樹脂を用いて行われる。次いで、精製されたタンパク質は、長期間にわたって安定した活性を提供するために、設計された緩衝液で調製される。他の好ましい実施態様においては、原核生物PAL、又は生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体の精製方法は、(a)圧力ホモジナイザー（但し、滞在的には、ガラスビーズ溶解などの他の物理的手段による）を用いて、組換えPAL、又は生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体を含む細菌を溶解するステップ；(b)熱処理をするステップ；(c)第二の連続遠心分離ステップ、及び／又は深層ろ過（Cuono Zeta Plus、Maximizer、Pall Filtron、Millipore Millistak、又はOpticao filtersで）によりこの溶解物を浄化するステップ；(d)炭ろ過ステップに通過させるステップ（Millipore Millistak 40ACで）；(e)最終的なろ過ステップに通過させるステップ（Sartorious Sartopore 0.2μmフィルターで）；(f)ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーに通過させるステップ（Tosoh Biosciences社製のToyopearl Butyl 650Mで）；(g)Qイオン交換カラムに通過させるステップ（BioRad社製のMacroprep High Qで）；及び、(h)タンジェンシャルフローろ過での緩衝液交換により最終生産物を回収するステップ（Sartorious Hydrosart又はPES 100kDa膜で）。当業者であれば、１以上のクロマトグラフィーステップを省略若しくは置き換えること、又は、本発明の範囲内でクロマトグラフィーステップの順序を変更することができるということを容易に認識する。そして、必要であれば、適切な滅菌ステップを行ってもよい。
さて、本発明を一般的に記載してきたが、それは次の実施例を参照して、より容易に理解することができる。実施例は、説明目的のためだけに提示されるものであり、決して、本発明の範囲を限定する意図のものではない。用いた数値（例えば、量、温度等）に関しては、正確性を担保するように努力をしたが、いくらかの実験誤差又は偏差は、当然のことながら許容されるべきである。
［実施例１ ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリスPALのクローニング］
（DNA操作）
ノストック パンクチフォルメのゲノムDNAをATCC(29133D)から入手した。また、PAL遺伝子(ZP_00105927)を、プライマー
Figure 2010536759
 からPCR増幅した。得られたPCR産物をNdel及びNotlで消化した。また、1.7kbのフラグメントを、N−His標識化又は非標識のためのpET−28a(+)及びpET−30a(+)（Novagen社製）にそれぞれライゲーションした。
アナベナ バリアビリスの細胞をATCC(29413)から入手した。ゲノムDNAを抽出し(Qiagen社製)、PAL遺伝子(YP_324488)を、NheI部位を除去するために、SOE−PCRで増幅した。プライマー１
Figure 2010536759
 及びプライマー２
Figure 2010536759
 を用いて、ヌクレオチド1−1190を増幅した。また、プライマー３
Figure 2010536759
 及びプライマー４
Figure 2010536759
 を用いて、ヌクレオチド1142−1771を増幅した。これらの２つのPCR産物を組み合わせて、プライマー１及び４を有する完全長遺伝子を増幅した。得られたPCR産物をNheIで消化し、Klenow(NEB)で鈍化した後、NheIで消化した。1.7kbのフラグメントをpET−28a(+)及びpET−30a(+)（Novagen社製）にライゲーションした。このプラスミドを3p86−23と命名した。
また、アナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)遺伝子を、pIBX1［Suら, Appl. Environ. Microbiol. 62:2723-2734 (1996)］から誘導されたベクターpIBX7［Tkalecら, Appl. Environ. Microbiol. 66:29-35 (2000)］でクローン化した（実施例７参照）。
（細菌株及び培養条件）
ノストック パンクチフォルメPAL(NpPAL)、大腸菌BL21(DE3)細胞（Stratagene社製）をpGro7（Takara社製）で形質転換した。また、適切なBL21(DE3)pGro7細胞をInoue法［Sambrook及びRussell, 「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」, 第３版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)］により調製した。これらの細胞を、pET−28−NpPALで形質転換し、50mg/Lカナマイシン及び20mg/Lクロラムフェニコール添加25mL LB培地において、37℃で一晩培養した。20mLのこの培養物を、カナマイシン、クロラムフェニコール、及び500mg/L L−アラビノース添加１L LB培地に播き、37℃で増殖させた。0.6のOD600で、当該培養物を氷で冷却した。５分後、当該培養物を0.3mM IPTGで誘導し、20℃で16時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収した。
BL21(DE3)pLysS細胞（Stratagene社製）をAvPALで形質転換し、アラビノース誘導をすることなしに、NpPALと同様に培養した。
pIBX7ベクターでクローン化されたAvPAL（実施例７参照）を、BLR(DE3)/pLysS（Novagen社製）細胞に形質転換することで導入し、50mg/L カナマイシン添加25mL LBにおいて、一晩37℃で培養した。20mLのこの培養物を、カナマイシン添加１L LB培地に播き、37℃で増殖させた。0.6のOD600で、当該培養物を氷で冷却した。５分後、当該培養物を0.3mM IPTGで誘導し、30℃で16時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収した。
［実施例２ NpPAL及びAvPALの精製］
培養物を卓上型遠心分離機(bench-top centrifuge)において、5,000gで20分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞のペレットを、更なる処理に先駆けて、通常は、-70℃で凍結した。解凍において、当該細胞のペレットを、TBS(25mM Tris, 150mM NaCl, pH7.8)中で約80光学濃度ユニット(600nm)に懸濁した。細胞を、APV圧力ホモジナイザーに12〜14,000psiで２回通過させて溶解した。次いで、粗溶解物を55℃で２時間加熱処理した。当該溶解物を10,000gで30分間遠心分離し、上清を保存し、0.2μm真空フィルター（コーニング社製）でろ過した。
PALを、butyl 650Mカラム（Tosoh BioSciences社製）及びMacroPrep High Qカラム（BioRad社製）に連続的に通して、浄化された溶解物から精製した。溶出生産物は、SDS−PAGE及び逆相HPLCにより高純度を示した。
［実施例３ ペグ化PAL変異体の生成］
ロドスポリディウム トルロイデスからのPAL(RtPAL)のペグ化の方法を以下に説明する。原核生物PAL［例えば、ノストック パンクチフォルメ(NpPAL)又は、アナベナ バリアビリス(AvPAL)］のペグ化に用いられる同様の方法が、実施例６に記載されている。
（タンパク質のペグ化）
ペグ化は、文献の方法［Hershfieldら, (1991), 前述の箇所; U.S. Patent No. 6,057,292; Luら, Biochemistry 40(44):13288-13301 (2001); Nektar Therapeutics, 2003 catalog］の改良を用いる。活性化PEGは、線状PEGスクシンイミジルスクシナート（mPEG-SPA、分子量５kDa又は分子量20kDa）及び分岐PEGヒドロスクシンイミド（mPEG2−NHSエステル、分子量10kDa又は分子量40kDa）を含む。両者は、メトキシ基で一端が覆われており、Nektar Therapeutics社から市販されている。また、最適ペグ化タンパク質の試験的測定が一般に求められている［Veroneseら, J. Bioactive Compatible Polymers 12:196-207 (1997)］。最適ペグ化条件は、さまざまなPAL:PEG比（タンパク質単量体当たりのリジンの数に沿ったタンパク質のモル比を考慮する）、さまざまなpH、さまざまな緩衝液、さまざまな温度、及びインキュベーション時間を用いて決定された。野生型PALは、リジンの数が多く［ロドスポリディウム トルロイデス(Rt)単量体当たり29］、非変性PALは、マウスでの反復注射に対し免疫反応性を示し、裸の野生型PALは、プロテアーゼへの暴露で急速に不活性化されるので、高いPALタンパク質：PEG誘導体化の比が必要である。ペグ化反応は、-20℃で凍結することで停止され、試料は、SDS−PAGE、MALDI−TOF質量分析、活性評価、タンパク質分解感受性、及び免疫反応性により分析される。
活性、タンパク質分解、及び免疫評価に先駆けて、過剰な未反応PEGを除去するために、反応を、0.05Mリン酸カリウム(pH8.5)に対して、Tube−O−Dialyzer（GenoTechnology社製）を用いて４℃で一晩透析する。NIタンパク質分析キット（GenoTechnology社製）を用いてタンパク質濃度を測定した後、前述したとおり、標準反応条件で未誘導体化及びPEG誘導体化PAL試料のPAL活性測定を行う。インビトロの特性評価に続いて、PKUマウスモデルを用いて、最も有望なペグ化治療候補物でインビボ試験を行う。
（特性評価）
非変性タンパク質試料及びペグ化タンパク質試料において、280nmのPAL吸光係数（RtPAL及びAvPALにおいてそれぞれ、0.5及び0.75mg mL-1cm-1）を用いて、タンパク質濃度を測定した。また、当該濃度は、正確なタンパク質濃度の測定を妨害する非タンパク質汚染物質を除去する試料処理を含む、NIタンパク質分析キット（GenoTechnology社製）を用いて算出される。
部位特異的ペグ化(LC/ESI−MSD)、及びペグ化の前後に遊離アミン滴定を決定するトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を決定するために、ペプチドマッピング法によってPEG−PAL生産物の特性評価をする。ペプチドマッピング法は、リジンで終端となる多数のトリプシンペプチドで、ペグ化の相対的な占有率を測定するが、サイズ及び多数の隣接したリジントリプシンペプチドにより、この方法を用いて、すべての部位を視覚化することはできない。TNBS分析は、非常に正確に酵素のモル当たりのPEG分子の平均数を決定するが、部位がどれをペグ化するかに関する情報を提供するものではない。このような理由で、両分析を用いて相互に補完した。PEGによるPAL生産物の誘導体化の割合は、SDS−PAGE及び天然ゲル解析によって推定することが可能である。ペグ化前後の比活性を評価し、四量体のPAL構造の損失がないことを証明するために、酵素分析を用いる。
（PAL活性分析）
動力学的モードのCary UV分光光度計(Cary 50)を用いて、PALの活性測定を行う。290nmでの吸光度の増加によってモニターされたtrans−桂皮酸の生成を測定することにより［Hodgins, (1968), 前述の箇所］、L−フェニルアラニン基質でのPALの活性を室温(25℃)で評価した。290nmのtrans−桂皮酸のモル吸光係数は、10,238リットルM-1cm-1である。反応混合物は、100mM Tris−HCl緩衝液(pH8.5)中22.5mMのフェニルアラニンを含んでいた。標準測定においては、最終酵素濃度が0.0035mg/mLであるが、動力学的試験においては、分析での酵素濃度は、分当たりの290nmでの勾配が0.005〜0.02の範囲にあるように、調節される。活性データを比活性(μmol×min-1mg-1)で表される。１ユニットのPALは、室温で分当たり１μモルのtrans−桂皮酸を生成する酵素量と定義される。
[実施例４ インビトロ半減期及び免疫原性の試験]
生化学的特性評価の後、最も有望なPEG−PAL候補物を、３つの異なる補足的方法（ウェスタンブロット、ELISA及び免疫沈降(IP)）を用いて、野生型PAL（ペグ化されていない）を注入したPKUマウスにより産生された抗体に対する免疫反応性のスクリーニングを行った。
ウエスタンブロット分析においては、PAL抗血清（野生型PALを注入したマウスからの)を１:10,000の希釈で用いる。また、陰性対照として、緩衝液で処置されたマウスからの血清も同様の希釈で用いる。二次抗体である、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスIgG（Promega社製）を１:5,000に希釈し、AP基質ウエスタンブルー（Promega社製）を用いて着色した。Nunc/Immuno Maxisorpプレート（Nalge Nunc International社製）を用いて、次いで、リン酸緩衝液中１mg/mLのPALを用い、リン酸緩衝液、0.05％ Tween 20、2％ BSAでブロキングをする標準操作により、ELISA試験を行った。マウス抗血清（野生型PAL暴露マウス）をEBブロック溶液（リン酸緩衝液、0.05％ Tween 20、２％ BSA）で１:10,000に希釈し、HRPヤギ抗マウスIgGを、450nmで検出するのに用いられるTMBと共に、二次抗体として用いる。
免疫沈降をPAL抗体結合試験に用いる。タンパク質試料（PAL又はペグ化PAL）をTTBS緩衝液（0.1％ Tween添加トリス緩衝食塩水）中でインキュベートし、抗体試料添加前のPAL活性を測定する。免疫性がないマウス血清を用いて、それぞれの試料を、陽性対照の抗PAL血清の8倍超で、及び、複製陰性対照反応でインキュベートした。インキュベーション後、ビーズのマウスIgG結合能を考慮して、プロテインGセファロース４(50%, v/v)を過剰に添加し、再度試料を４℃で一晩、回転しながらインキュベートする。遠心分離により上清を回収し、それぞれの試料のPAL活性を当該上清で分析する。ビーズペレットは廃棄せず、ウェスタンブロットによる更なる解析を行った。抗体−ビーズ結合が生じるか確認するために、ウェスタンブロットを用いてビーズのPAL抗原を検出する。PAL結合ステップの後に遠心分離により回収されたビーズを、TTBS及びTBS緩衝液で数回洗浄した。これらの洗浄に続き、SDS−PAGEローディングバッファーをビーズに添加し、試料を95℃で５分間加熱する。その後、PAL抗血清を用いてウェスタンブロットにより試料を分析する。弱い抗体結合を示す酵素変異体は、ウェスタンブロットで検出されたペレット化ビーズ画分で対応する小さなPALを有しており、高い抗体結合を示す野生型の非変性PALと比較して、上清に高い活性が残存することを示した。
［実施例５ プロテアーゼ感受性試験］
ロドスポリディウム トルロイデスからの野生型PALに関するプロテアーゼマッピング試験では、タンパク質分解性の主要部位が示された。そのような部位の除去は、タンパク質分解感受性を低減させ又は除去させ、有用なPKU酵素基質の開発に寄与した。しかしながら、タンパク質分解感受性のためのそのような部位の除去により、酵素活性低減又は失活となるものと考えられた。
プロテインエンジニアリングにより、活性を保持する改良されたPAL（及びPEG−PAL）突然変異体が作製された後、活性の保持（OD290測定による）及び低減されたタンパク質分解（PAGEゲル分析による）のモニタリングの前の、トリプシン／キモトリプシンプロテアーゼ反応混液でのインキュベーションを用いるスクリーニングは、適切なインビトロ特性を有する突然変異体の同定をインビボ試験で用いることを可能にする。
腸内環境に近く、2.3mMトリプシン、3.5mMキモトリプシン、3.05mMカルボキシペプチダーゼA、及び3.65mM カルボキシペプチダーゼBを含むプロテアーゼ反応混液でのインキュベーションによりタンパク質分解の安定性を評価する。タンパク質分解試験は、酵素のインキュベーション、PAL溶液へのプロテアーゼの添加、試験されるさまざまなタンパク質変異体（ペグ化された、ペグ化されていない若しくは他の化学変性による野生型又は突然変異タンパク質）のタンパク質分解感受性の測定、プロテアーゼ暴露後の活性保持及び安定性保持の時間的経過を含む。SDS−PAGE及びMALDI−TOF質量分析マッピング試験を用いて、プロテアーゼ感受性部位の位置を決定した［Kriwacki, R.W.ら, J. Biomol. Tech. 9(3):5-15 (1980)］。これらのマッピング結果は、プロテアーゼ感受性の主要部位（既に同定されている２つの主要部位等）を決定するのに重要であり、すべての主要な感受性部位は、ペグ化の保護、及び／又は、PALアーキテクチャーから感受性領域を除去及び／又は保護する突然変異体を用いて除去することができた。
［実施例６ ペグ化NpPAL及びAvPALの生成］
一般に、NpPAL及びAvPALのペグ化は、タンパク質とSUNBRIGHT ME−200HS 20kDa NHS活性化PEG(NOF)を混合することを含むものであった。
ペグ化のプロトコールである、NHS活性化20kDa線状PEGを用いる標準"HC"方法は、次のとおりである。
1)タンパク質をエンドトキシンの存在のために評価した。
タンパク質溶液(0.1mL)を0.9mLの新鮮なMQ水で希釈し、0.5EU/mLの感受性レベルでエンドトキシンのために携帯型のCharles River社の装置(EndoPTS)で試験した。エンドトキシンが0.5EU/mLより高い場合、エンドトキシンをMustang Eろ過で最初に、次いで、Sterogene Etox樹脂で、好ましくは更にクロマトグラフィー精製により低減させた。低減は制限されるが、pH7.8でDEAE FF（Amersham社製）に通すことで十分に有用であった。
2)タンパク質の濃縮及び緩衝液交換
タンパク質を25mg/mLより高く75mg/mL以下に濃縮し、50mM KPO4(pH8.5)に緩衝液交換した。スピンフィルターを用いてこの濃縮物を調製する場合、最初に、当該フィルターを、緩衝液単独で、低減された速度と時間で（3000rpm、３分）回転することでエンドトキシンの試験をし、次いで、ステップ1)のタンパク質と同様の方法で、エンドトキシンのために保持された緩衝液を試験した。50mM KPO4(pH8.5)の緩衝液バッチの履歴／配合は、水（1/4〜１L）、リン酸カリウム（48.75mM、8.4913g/l）、及びリン酸二水素カリウム(1.25mM、0.17011g/L)であった。溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。濃縮生産物をMustang Eフィルターアクロディスクでゆっくりろ過した（１〜２mL／分）。滅菌TBS(pH7.5)で希釈及びブランクとされた試料を、タンパク質濃度をA280で測定した。吸光係数は、NpPALで0.83、AvPALで0.75であった。
3)NpPAL及びAvPALのペグ化
通常-80℃で保存されたPEGを室温になるまで加温した。KPO4緩衝液をPEGに加え、大きな塊がすべて懸濁されるために、最大速度で攪拌すること、及び、試験管を手で激しく振盪することで再懸濁した。最初に湿らせたPEGのあるよく懸濁されたPEG溶液に、タンパク質を１分以内に加え、非常に穏やかな転移によって混合した。アルミニウムホイルで包まれた試験管を選鉱機の軸に載置し、室温で３時間、非常に穏やかに振動させた。当該試験管をTBS(pH7.5)で充填し、ろ過滅菌した。懸濁液をすぐに配合し、あるいは、配合されるまで４℃で保存した。
4)配合
配合緩衝液の配合／バッチの履歴は、水（1/4〜１L）、トリス系(3.2mM)、Tris−HCl(16.8mM)及び塩化ナトリウムからなり；緩衝溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。当該緩衝溶液を、100MWCO再生化セルロース膜で、Vivaflow 50（小さなロット）又はVivafiow 200（大きなロット）を用いてタンジェンシャルフローろ過にかけた。当該溶液を、MQ水、0.1N NaOH及び200mLの水で再度フラッシングした。当該溶液を50mL／分の直交流でTBS(pH7.5)により平衡化した。透過液のpHを7.5となるようにした。
当該溶液を最初にTBSで約３倍に希釈して緩衝液交換し、少なくとも４時間で元の容積に戻した。直交流は、一般に、Vivaflow 50及び200で180〜200mL／分であった。
最終生産物をMustang Eでろ過した。エンドトキシンの存在は、1.9mLの無菌新鮮水で0.1mLに希釈した後に評価した。エンドトキシンが１EU/mLより高い場合、Sterogene Etoxゲルで低減した。配合された無菌ペグ化NpPAL又はAvPALをバイアルで密封し、-70℃でインビボ試験に供するまで保存した。
［実施例７ AvPAL変異体（システイン変異体）の生成］
細菌で発現され組換えタンパク質に生じる凝集を低減させるために、AvPALポリペプチドにおいてアミノ酸置換を行った。タンパク質凝集は、酵素活性を低減させた、及び／又は、インビボでの免疫原性を増加させた。凝集のそのような形成が鎖間ジスルフィド結合の形成を生じさせた。このような可能性を最小限にするために、さまざまなAvPALのシステイン残基を単独で、あるいは組み合わせて、セリン残基と置換した。
AvPALポリペプチドは、位置64、235、318、424、503及び565の、６個のシステイン残基を有していた（配列番号４）。次のAvPAL単一システイン突然変異体を生成した：AvPAL_C64S（配列番号７）、AvPAL_C318S（配列番号８）、AvPAL_C503S（配列番号９）、及びAvPAL_C565S（配列番号10）。また、AvPAL二重システイン突然変異体である、AvPAL_S565SC503S（配列番号11）も生成した。図５Ａ〜５Ｅは、これらのAvPALシステイン突然変異体のアミノ酸配列を示す。
（クローニング）
フォワードプライマーAvarPALfor
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーAvarPALrev
Figure 2010536759
 を有する、アナベナ バリアビリスゲノムDNA（ATCC 29413-U、Qiagen DNeasyキット）からAvPAL遺伝子を増幅した。得られたPCR産物をTaqで処理した後、pCR2.1 TOPO TA（Invitrogen社製）にライゲーションした。得られたプラスミドを1p40と命名した。
5'NheIサイトを加え、内部NheIサイトをSOE−PCRで除去した。上流AvPALフラグメントをフォワードプライマーN−Nhe−AvPAL
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーNhe−AvPALrev
Figure 2010536759
 を有する1p40から増幅した。また、下流AvPALフラグメントをフォワードプライマーNhe−AvPALfor
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーAvPALrev−r
Figure 2010536759
 を有する1p40から増幅した。１回のPCR反応において、２つのPCR産物をDNAポリメラーゼでアニール化し増長して、完全長のAvPAL遺伝子を生産した後、プライマーN−Nhe−AvPAL及びAvPALrev−rで増幅した。得られたPCR産物をNheIで消化し、Klenow(NEB)で鈍化し、NheIで消化し、pET−28a(+)ベクター（NdeIでの消化、Klenowでの鈍化、及びNotIでの消化により調製した）にライゲーションした。このプラスミドを3p86−23と命名した。
新規の制限サイトをPCRにより加えた。AvPALを、フォワードプライマーAvEcoRIfor
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーAvSmalrev
Figure 2010536759
 を有するプラスミド3p86−23で増幅した。得られたPCR産物をEcoRI及びSmaIで消化し、EcoRI及びSmaI消化pIBX7ベクターにライゲーションした。得られたプラスミドを7p56 Av3と命名した。
（システイン突然変異体）
AvPALポリペプチド位置503及び565に対応する、AvPAL遺伝子の２つのシステインコドンを部位特異的突然変異誘発(QuickChange XL II、Stratagene社製)によってセリンコドンと置換した。位置503のシステインコドンを、フォワードプライマーAv_C503S
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーAv_C503Srev
Figure 2010536759
 でPCRによってプラスミド7p56 Av3のセリンコドンに変換した。セリンコドンに下線を付した。また、有意鎖のGからCの突然変異（非有意鎖のCからGの突然変異）を太字で示した。得られたプラスミドをj282と命名した。位置565のシステインコドンを、フォワードプライマーAv_C565S
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーAv_C565Srev
Figure 2010536759
 でプラスミドj282のセリンコドンに変換した。セリンコドンに下線を付した。また、有意鎖のGからCの突然変異（非有意鎖のCからGの突然変異）を太字で示した。得られたプラスミドをj298aと命名した。
AvPALポリペプチドの位置64、318及び565のAvPAL遺伝子のシステインコドンを、次のプリマーのペアを用いて同様にセリンコドンと置換した：C64S、フォワードプライマーAv_C64S
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーAv_C64Srev
Figure 2010536759
 ；C318S、フォワードプライマーAv_C318S
Figure 2010536759
 及び、リバースプライマーAv_C318Srev
Figure 2010536759
 ;並びに、C565S、フォワードプライマーAv_C565S（配列番号28）、及び、リバースプライマーAv_C565Srev（配列番号29）。セリンコドンに下線を付し、有意鎖のGからCの突然変異、及び非有意鎖のCからGの突然変異を太字で示した。
［実施例８ AvPAL変異体（システイン突然変異体）のインビトロでの酵素活性］
本研究の目的は、インビトロでのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)酵素活性に対するAvPALポリペプチドのさまざまなシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
AvPAL変異体（すなわち、システイン変異体）を、実施例７に記載したとおりにクローニングした。AvPALシステイン突然変異体の発現プラスミドを細菌に形質転換した。また、AvPALシステイン突然変異体ポリペプチドを、実施例１に記載したとおりに発現し、実施例２に記載したとおりに精製した。
実施例３に記載したとおりに、野生型(WT)AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体をインビトロでのPAL酵素活性のために試験した。表１は、ペグ化されていないWT AvPALと比較して、インビトロでのペグ化されていない精製AvPALシステイン突然変異体タンパク質のPAL比活性が、位置64(AvPAL_C64S)のシステイン残基のセリンによる置換によって低減されたが、位置503若しくは565、又は、位置503及び565（それぞれ、AvPAL_C503S、AvPAL_C565S、及びAvPAL_C565SC503S）のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかったことを示す。
Figure 2010536759
セリン残基の導入が、ペグ化AvPALタンパク質の酵素活性に影響を及ぼすか否かを判断するために、WT AvPAL及び二重システイン突然変異体であるAvPAL_C565SC503Sを実施例６に記載したとおりにペグ化した。表１は、ペグ化AvPALタンパク質のインビトロでのPALの比活性が、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかったことを示す。
［実施例９ AvPAL変異体（システイン突然変異体）のインビトロでの生化学特性］
本研究の目的は、(1)促進された安定性、(2)凝集体の形成、及び(3)部位特異的ペグ化に対する、AvPALポリペプチドでのさまざまなシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
（促進された安定性）
インビトロでの安定性に対する、AvPALのシステイン残基のセリンによる置換の影響を、精製AvPALシステイン突然変異体（ペグ化されている又はペグ化されていない）を37℃でさまざまな期間保存した後、実施例３に記載したとおりに、これらのタンパク質のインビトロでのPAL比活性を測定することにより判断した。
野生型AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体（ペグ化されている又はペグ化されていない）を実施例８に記載したとおりに調製した。
図６Ａに示すとおり、ペグ化されていないAvPALタンパク質の比活性は、37℃で少なくとも５日間安定しており、また、位置565、又は位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかった。同様に、図６Ｂに示すとおり、ペグ化AvPALタンパク質の比活性は、37℃で少なくとも６日間安定していた。単一のシステインAvPAL突然変異体であるAvPAL_C565Sは、37℃で６日後に、野生型AvPAL及び二重システインAvPAL突然変異体であるAvPAL_C565SC503Sと比較して、多少低減された安定性を示した。
（凝集体の形成）
溶液中のタンパク質凝集体の形成に対する、システイン残基のセリンによる置換の影響を、ペグ化されていない精製野生型AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体を、変性及び天然ゲル電気泳動又はSEC−HPLCのいずれかによって分離することにより判断した。
精製AvPAL調製物を、変性条件（４〜１２％ NuPAGE Bis−Tris）又は本来の条件［８％ Tris−Gly(pH8.3)］下でゲル電気泳動によって分離した。分離されたAvPALタンパク質をクマシーブルーで染色した。
精製AvPAL調製物をSEC−HPLCによって分離した。AvPALタンパク質を、20mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl(pH6.9)においてTSKゲルカラム［G3000SW×l, 7.8mm×30 cm, 5μm (Tosoh Bioscience社製, LLC)］にロードし、0.5mL／分の流速で溶出した。分離されたAvPALタンパク質をAgilent series 1100分光器で分析した。
凝集体は、ゲル電気泳動（図７Ａ）又はSEC−HPLC（図７Ｂ）で判断されたように、野生型AvPAL調製物、並びにAvPAL_C503S及びAvPAL_C64S調製物に含まれていたが、AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503S調製物には含まれていなかった。
（部位特異的ペグ化）
部位特異的ペグ化に対する、AvPALでのシステイン残基のセリンによる置換の影響を、実施例６に記載したとおりに、野生型AvPAL、及び二重システイン突然変異体AvPAL_C503SC565Sをペグ化し、AvPALリジン残基：K2、KlO、K32、Kl15、K145、K195、K301、K335、K413、K419、K493、K494及びK522での相対的ペグ化を比較することにより判断した。
ペグ化されていない又はペグ化されたAvPALタンパク質の約100μg（10μg/μLで10μL）を８M尿素で変性した。その後、変性タンパク質を、37℃でpH8.2の0.8M 尿素中のトリプシンとの100μLの反応体積で、一晩（〜20時間）消化した。トリプシンに消化されたタンパク質を、１μLの１M DTTと37℃で１時間処理することにより還元し、3μLの15% TFAでクエンチさせた。消化されたタンパク質をCl8逆相カラムで分離した。それぞれのペグ化AvPALペプチドのペグ化の割合を対応するペグ化されていないペプチドのペプチドマッピングを減じるによって算出した。
図８にAvPALタンパク質：PEGの１：３の比で示すとおり、可能性のあるK419を除いて、いずれのリジン(K)残基のペグ化の割合において有意な相違はなかった。また、二重システイン突然変異体C565SC503Sのペグ化の割合は、野生型AvPALと比較して、低かった。しかしながら、AvPALタンパク質：PEGの比を増加することでの二重システイン突然変異体を用いて得られた結果においては、用量反応相関はみられず、比較的小さなペグ化割合であり、これは、K1419の観察された相違が重要でないようであることを示す。したがって、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換は、AvPALの部位特異的ペグ化に影響を受けていないと思われた。
［実施例１０ AvPALタンパク質の凝集メカニズム］
本研究は、細菌で発現されたAvPALタンパク質の凝集メカニズムを調査するために行なわれた。
精製AvPAL生産物を濃縮し、37℃で２時間、濃縮タンパク質溶液をインキュベートし、溶液中で精製AvPALタンパク質の凝集を促進させた。凝集を、SEC−HPLCでAvPALタンパク質を分離することにより検出した。ジスルフィド架橋が凝集の原因であるか否かを判断するために、50mMジチオトレイトール(DTT)を濃縮タンパク溶液に添加し、37℃で２時間、インキュベートした。
実施例２に記載したとおりに、細菌で発現されたAvPALタンパク質を精製し、スピンフィルター(Millipore Biomax−10K NMWL)を用いて濃縮した。タンパク質を、エッペンドルフ遠心分離機5415Cで、約15,000gで数分間回転させた。凝集体を意図するシステイン突然変異体（例えば、AvPAL_C503S及びAvPAL_C64S）においては、タンパク質を約20mg/mLまで濃縮し、37℃で２時間、インキュベートした。凝集に抵抗性のあるシステイン突然変異体（例えば、AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503S）においては、タンパク質を約40mg/mLまで濃縮し、37℃で２時間、インキュベートした。
表２に示すとおり、精製AvPALシステイン突然変異体AvPAL_C64S及びAvPAL_C503Sの調製物は、37℃で２時間のインキュベーションで凝集体を形成した。予想どおり、この凝集は、AvPALタンパク質を37℃で２時間のインキュベーションの前に濃縮した場合、悪影響を及ぼした。凝集は、DTTへの濃縮タンパクの暴露によって阻害され、これは、凝集がジスルフィド架橋によるものであることを示すものである。これに対して、精製AvPALシステイン突然変異体AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503Sの調製物は、37℃で２時間のインキュベーションで凝集体を形成せず、これは、位置565のシステイン残基が、ジスルフィド架橋によってAvPALの凝集に関係することを示すものであった。
Figure 2010536759
システイン残基が遊離スルフヒドリル基として存在するか否かを判断するために、精製AvPAL調製物を8M 尿素の存在下で変性し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、トリプシンで消化し、そして、LC/MSで分析した。AvPALシステイン残基はすべて、ヨードアセトアミドで標識化され、これは、細菌で発現されたAvPALのシステイン残基がすべて、遊離スルフヒドリル基として存在することを示すものであった（データは示さない）。
システイン残基が天然タンパク質の表面で存在するか否かを判断するために、精製AvPAL調製物を最初にN−エチルマレイミド(NEM)で処理し、次いで、8M 尿素の存在下で変性し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、トリプシンで消化し、そして、LC/MSで分析した。位置235及び424のシステイン残基は、NEMによってアルキル化されなかった。また、位置318のシステイン残基は、NEMによって単に部分的にアルキル化されただけであった。これらは、位置64、503及び565のシステイン残基が、天然AvPALの表面にあり、位置318のシステイン残基が、天然AvPALの表面で部分的に暴露されたことを示すものであった（データは示さない）。
システイン残基が鎖間ジスルフィド架橋に関係するか否かを判断するために、精製したペグ化されていない野生型AvPAL調製物の0.7mg/mL溶液の67μLを変性し、20mMヨードアセトアミドを含む8M尿素において、37℃で１時間アルキル化し、次いで、トリプシンで、25℃で一晩（〜17.5時間）、100μLの反応体積において消化した。トリプシンに消化されたタンパク質を分離し、質量分析で分析した。また、推定されたジスルフィドペアに対応するペプチドを、同定し、全イオン数(TIC)として定量した。
表３は、C503−C503、C503−C565、C565−C318及びC565−C565においてジスルフィドペアが検出されたことを示す。位置565の、及び、位置503の少ない程度までの、システイン残基は、精製AvPAL調製物において、ジスルフィドペアでみられた。
Figure 2010536759
本研究は、ジスルフィド架橋に加え、付加的メカニズムがAvPALタンパク質の凝集に関係し得るか否かを判断するために行なわれた。
精製AvPAL調製物を0.05% Tween又は10mM EDTAでインキュベートし、次いで、実施例９に記載したとおりに、SEC−HPLCで分離した。Tweenは、疎水的相互作用によりタンパク質凝集を低減させる。また、EDTAは、２価カチオンの存在によりタンパク質凝集を低減させる。図９に示すように、0.05% Tween又は10mM EDTAへの暴露は、AvPALタンパク質凝集に影響を与えなかった。10mM EDTA処理AvPALにおける10分での追加的なピークは、210nmのEDTAの吸光度によるものであった。
さらにAvPALタンパク質凝集におけるジスルフィド架橋の役割を調査するために、精製AvPALをDTTで処理した後、SEC−HPLCによる分離の前に脱塩した。図１０Ａに示すとおり、AvPALタンパク質凝集は、DTTでの処理により最小限となり、凝集体は、37℃で18時間のインキュベーションの後に再形成された。これに対して、図１０Ｂに示すとおり、AvPAL表面のシステインが、DTT暴露後に（但し、脱塩、及び37℃で18時間のインキュベーション前に）N−メチルマレイミド(NEM)での処理により変性される（すなわち、アルキル化される）と、凝集体は、再形成しなかった。
上述に基づくと、細菌で発現されたAvPALの凝集は、疎水性効果、又は２価カチオンの存在によるものではなく、鎖間ジスルフィド結合の形成単独によるものであると思われる。位置565及び503のシステイン残基は、AvPAL調製物における鎖間ジスルフィド結合の形成に関係している。
［実施例１１ AvPAL変異体（システイン突然変異体）ペグ化形態の液体配合物］
本研究は、本発明の配合物におけるAvPALポリペプチド変異体（例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換）のペグ化形態の促進された安定性に対する、さまざまな添加剤（例えば安定化剤）の影響を調査するために行われた。
実施例７に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565 SC503Sを調製した。
ペグ化AvPAL_C565SC503Sのさまざまな配合物の促進された安定性を、インビトロ活性分析、キュベット分析、又はプレート分析で測定した。キュベット分析においては、精製ペグ化AvPAL_C565SC503SをTBS希釈緩衝液で希釈した後、22.5mMフェニルアラニン(Phe)、100mM Tris−HCl(pH8.5)を含む分析緩衝液に加えた。30℃で２分間のインキュベーションの後、放出されたtrans−桂皮酸(t-CA)量を290nmの吸光度で測定した。プレート分析においては、精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、BSA/Phe/Brij添加TBS希釈緩衝液で希釈した後、22.5mM Phe、100mM Tris−HCl(pH8.5)を含む分析緩衝液に加えた。30℃で10〜20分間のインキュベーションの後、放出されたtrans−桂皮酸(t-CA)量を290nmの吸光度で測定した。PAL活性の１IUは、１μモルのTCA／分と等しい。
第一の促進された安定性についての試験においては、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALであるAvPAL_C565SC503Sの安定性に対するpHの影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、pH４〜９のさまざまなpHで、10mM緩衝液及び140mM NaClにおいてプレフォーミュレーションした。試験された緩衝液は、クエン酸塩(pH4)、酢酸塩(pH5)、ヒスチジン(pH6)、リン酸塩(pH7)、トリス（pH7.5及びpH8）、及びアルギニン(pH9)であった。４℃、25℃又は37℃で30日以内の酵素配合物の保存後、インビトロ活性を測定した。PAL酵素活性のすべての損失をpH４で観察した。pH７〜８の範囲のpHを更なる評価に選択した。
第二の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、pH及びさまざまな賦形剤の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、0.5% EDTA、0.5% アスコルビン酸添加0.5% EDTA、又は５mMメチオニン(Met)添加0.5% EDTAの非存在下又は存在下で、10mM緩衝液及び140mM NaCl（pH７、7.5又は8.0）においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃で60日以内の酵素配合物の保存後、インビトロ活性を測定した。pH7.0及び7.5では、酵素活性の維持において等しく、EDTAは、酵素活性に効果がほとんど又はまったくなかった。また、抗酸化剤のアスコルビン酸及びメチオニンは、酵素活性に悪影響を及ぼした。
同様の促進された安定化についての試験においては、AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sのペグ化の影響を評価した。酵素活性の損失の速度は、ペグ化されていないAvPAL_C565SC503Sとペグ化されたAvPAL_C565SC503Sとの間で類似していた。
第三の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての酵素基質及び生産物の影響を評価した。約12mg/mL(0.2mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、１mM Phe（活性部位モル当たり５モルの基質）、２mM TCA（活性部位モル当たり10モルの生産物）、又は0.05% Tween80（界面活性剤）の非存在下又は存在下で、10mMトリス及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃でさまざまな時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。Phe及びt−CAは、有意に酵素安定性を増加させたが、Tweenは、酵素安定性に効果がなかった。
促進された安定性についての第一、第二及び第三の試験の概要を図１１に示す。
第四の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての低濃度のPhe及びt−CAの影響を評価した。約12mg/mL(0.2mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、0.4mM Phe（活性部位モル当たり２モルの基質）、又は0.4mM TCA（活性部位モル当たり２モルの生産物）の非存在下又は存在下で、10mMトリス及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃でさまざまな時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。低濃度のPhe及びt−CAは、酵素活性の安定化に有効であった。
第五の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての弱い酵素基質、チロシン(Tyr)の影響を評価した。約12mg/mL(0.2mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、１mM又は５mM Tyr（活性部位モル当たりそれぞれ５モル又は25モルの基質）の非存在下又は存在下で、10mMトリス及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃でさまざまな時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。チロシンは、酵素活性に対し、最小限で、非用量依存的な安定効果を有していた（図１２）。
第六の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての求核捕捉剤の影響を評価した。約20mg/mL(0.33mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、１mM Phe（活性部位モル当たり３モルの基質）、２mM求核捕捉剤（活性部位モル当たり６モルの安息香酸又はピリドキサミン）、又は１mM Pheと２mM求核捕捉剤との両方の非存在下又は存在下で、10mM トリス及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、又は37℃でさまざまな時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。安息香酸は、酵素活性の安定化に有効であったが、ピリドキサミンはそうではなかった（図１３Ａ）。Phe及び安息香酸の相加効果はなく、これは、同様の安定化メカニズムであることを示唆するものであった。
安息香酸及びt−CAの安定化効果は、Pheの構造類縁体として機能することを示唆する（図１３Ｂ参照）。
第六の促進された安定性についての試験からのデータは、さまざまな配合物におけるペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの有効期間を推定するために組み合わされた。有効期間を次のように決定した：(1)それぞれの配合物の状態において、最初の速度過程の後、活性減退(kdecay)を決定する；(2)1n(kdecay)υ.１／温度(°K)をプロットする；(3)所定の配合物の状態における活性減退に必要なEa(ΔGdecay)を決定する；(4)算出されたEa、及び所定温度の観察されたkdecayを用いて、４℃のkdecayを推定する；及び、(5)特異的酵素活性が４℃で10％以上低下する時間である、有効期間(T90)を決定する。
表４は、Phe及びt−CAが、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの推定された半減期を増大させることを示す。
Figure 2010536759
要約すると、上述のプレフォーミュレーションについての試験は、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sにおける最適pHが７〜7.5であることを示した。抗酸化剤の存在により、酵素活性の大幅な損失が生じる。フェニルアラニン(Phe)及びtrans−桂皮酸(t−CA)は、促進された条件（25℃及び37℃）下で、rAvPAL−PEGの安定性を50％以上増加させる。rAvPAL−PEG活性部位当たり２倍を超えるPhe又はt−CAは、活性を安定させるのに十分であり、高い濃度によっては、付加的な利点はないものと思われる。弱いPAL基質であるチロシン(Tyr)は、酵素活性を安定させないと思われるが、安息香酸は、その構造類縁体であるPheと同程度に、rAvPAL−PEG活性を安定させる。Pheと組み合わせた場合、付加的な活性安定化は、安息香酸で見られず、これは、共通の活性安定化メカニズムであることを示唆している。
［実施例１２ AvPAL変異体（システイン突然変異体）のペグ化形態の凍結乾燥配合物］
本研究は、本発明のAvPALポリペプチド変異体（例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換での）のペグ化形態の活性に対する、さまざまな固体（例えば、凍結乾燥）の配合物の影響を調査するために行われた。
実施例７に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを調製した。
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを次のように配合した：(Fl)10mg/mLのAvPAL_C565SC5O3S、10mMトリス(pH 7.5)；(F2)10mg/mLのAvPAL_C565SC503S、10mMトリス(pH 7.5)、25mg/mLのマンニトール；又は、(F3)10mg/mLのAvPAL_C565SC503S、10mMトリス(pH7.5)、20mg/mLのマンニトール、5mg/mLのスクロース。配合後、それぞれのPAL酵素活性は、1.7〜1.8U/mgであった。凍結乾燥後、配合物を４℃で26日間まで保存した後、新鮮なろ過滅菌MilliQ水で再懸濁した。実施例１１に記載したとおりに、PAL酵素活性を測定した。表５は、さまざまなAvPAL_C565SC503S配合物の凍結乾燥、保存、又は再懸濁においては、活性の損失がないものとみられたことを示す。
Figure 2010536759
［実施例１３ カニクイザル及びラットにおけるAvPAL変異体（システイン突然変異体）のペグ化形態の毒性／薬動力学的試験］
毒性／薬動力学的試験は、カニクイザル及びラットにおいて、ペグ化形態のAvPALポリペプチド変異体（例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換での）の１回投与量の投与の影響を判断するために行われた。
実施例７に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを調製した。
（カニクイザルの毒性／薬動力学的試験）
本研究では、それぞれ３匹の雄と３匹の雌の４つのサルの群を利用した。第１群には、プラセボ(mL/kg)を与え、第２、３及び４群にはそれぞれ、４、12及び60mg/kgの溶液のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの１回皮下注射をした。血漿試料を、投与前、及び投与後のさまざまな時間（３〜504時間）でのサルから回収した。60mg/kgの投与量では、サルに有毒であることが分かったので、本研究では、第４群については終了した。
図１４Ａは、４及び12mg/kgでの１回皮下注射後のさまざまな時間の血漿中のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。そのデータは、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの単一相の除去を示した。１番目の吸収の単一のコンパートメントモデルは、１回皮下注射後のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの血漿プロファイルを説明するものと思われる。
図１４Ｂは、４mg/kgでの１回皮下注射後のさまざまな時間の血漿中のフェニルアラニン(Phe)及びペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。この用量では、血漿Phe濃度は、24時間以内にGC/MS分析の検出限界以下に低減され、血漿Pheは10日間保持された。
（ラットの毒性／薬動力学的試験）
本研究では、プラセボ群に３匹の雄と３匹の雌の、及び、試験群に６匹の雄と６匹の雌の８つのラットの群を利用した。第１群及び第５群に、プラセボの１回静脈内及び皮下注射をした。第２、３及び４群にはそれぞれ、1、5及び25mg/kgのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの１回静脈内注射をした。第６、７及び８群にはそれぞれ、10、25及び250mg/kgのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの１回皮下注射をした。血液試料を、投与前、及び投与後のさまざまな時間（１〜360時間）でのラットから回収した。それぞれの回収時間で、それぞれの群の３匹のラットから血液を回収した。本研究においては、ラットで毒性はみられなかった。
図１５Ａは、1、5及び25mg/kgでの１回静脈内注射後のさまざまな時間の血漿中のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。そのデータは、１回静脈内注射後において、血漿からのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの単一相の除去を示す。
図１５Ｂは、10、25及び250mg/kgでの１回皮下注射後のさまざまな時間の血漿中のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。１番目の吸収の単一のコンパートメントモデルは、１回皮下注射後のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの血漿プロファイルを説明するものと思われる。
表６は、１回静脈内又は皮下注射後のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの薬動力学パラメーターを示す。
Figure 2010536759
本薬動力学的試験では、性別による相違はないものと思われた。AUCinf及びCmaxは、静脈内及び皮下投与経路の投与量で概ね比例した。
（ラット及びカニクイザルにおける複数回投与毒性）
ラット及びカニクイザルでの反復投与毒性試験におけるペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安全性を評価した。
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを皮下に毎週２回28日間、25mg/kgまでラットに投与したが、毒性を示さなかった。
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを皮下に毎週２回28日間、１mg/kgまでカニクイザルに投与したが、顕著な毒性を示さなかった。血漿Pheの用量依存性の減少が第１回目の投与後にみられたが、第７回目の投与後では、血漿Phe量は、全投与群においてベースラインに戻った。これは、投与された酵素への抗体反応の可能性を示すものであった。28日目で１mg/kgで処置された動物において、最小の抗AvPAL_C565SC503S IgG力価がみられた。28日目では、IgM力価は、いずれの動物においてみられなかった。
［実施例１４ 培養物における腫瘍細胞に対するAvPAL変異体（システイン突然変異体）の影響］
本研究は、インビトロでの培養物における腫瘍細胞の増殖に対する、AvPALポリペプチド変異体（例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換での）からのペグ化の影響を調査するために行われた。
実施例７に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを調製した。
インビトロでの腫瘍細胞の増殖を、Denglerら, Anti-Cancer Drugs 6:522-532 (1995)の記載のとおりに、ヨウ化プロピジウム蛍光測定で測定した。
（血液腫瘍）
14の白血病、５のリンパ腫、及び５の骨髄腫を含む24の血液腫瘍細胞系のパネルについて、インビトロでの腫瘍細胞の増殖に対する、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの影響の評価をした。
血液腫瘍細胞系を、5,000cells/well（０日目）で培養皿に播いた。１日目で、さまざまな濃度（0.01〜100μg/mL）で、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを培養物に加えた。５日目で、細胞を回収し、DNA含量をヨウ化プロピジウム染色により測定した。IC50、IC70及びIC90を測定した。これらの試験をそれぞれの血液腫瘍細胞系で２回又は３回行った。
表７は、ヨウ化プロピジウム染色による幾つかの血液腫瘍細胞系の測定により、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが、インビトロでの増殖を阻害するのに有効であったことを示すものである。
Figure 2010536759
Figure 2010536759
２つの感受性のある血液腫瘍細胞系（NOMO1及びIM9）におけるペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sによる、ヨウ化プロピジウム染色での低減により測定された細胞増殖の用量依存的阻害を、図１４Ａ及び２１Ｂにそれぞれ示す。これらの腫瘍細胞系はそれぞれ、1.0及び10.0μg/mL未満のIC50及びIC70であった。比較において、アスパラギナーゼは、ヒト白血病細胞系において１〜10μg/mLのIC50であった。しかしながら、一般に、血液腫瘍細胞系は、IC70値で判断されるように、固形腫瘍系よりも抵抗性があった（以下を参照）。
（固形腫瘍）
膀胱、脳、結腸、胃、頭頸部、肺、胸、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、及び子宮由来の腫瘍を含む36の固形腫瘍細胞系のパネルについて、インビトロでの細胞の増殖に対する、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの影響の評価をした。固形腫瘍細胞系を、5,000cells/well（０日目）で培養皿に播いた。１日目で、さまざまな濃度（0.01〜100μg/mL）で、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを培養物に加えた。５日目で、DNA含量をヨウ化プロピジウム染色により測定した。IC50、IC70及びIC90を測定した。
表８は、ヨウ化プロピジウム染色による幾つかの固形腫瘍細胞系の測定により、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが、インビトロでの増殖を阻害するのに有効であったことを示すものである。
Figure 2010536759
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脳／CNS、結腸、肺及び前立腺癌由来の腫瘍細胞系におけるペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sによる、ヨウ化プロピジウム染色での低減により測定された細胞増殖の用量依存的阻害を、図１７Ａ〜１７Ｄにそれぞれ示す。
AvPAL_C565SC503Sは、この広い固形腫瘍細胞系のパネルにおいて選択的な抗増殖活性を示し、肺、脳／CNS、結腸、前立腺及び腎臓由来の腫瘍細胞系において、特定の効果（すなわち、0.2〜0.7μg/mLのIC50）があった。また、少なくとも、膀胱、頭頸部、胸、卵巣、及び子宮由来の腫瘍細胞系では、AvPAL_C565SC503Sによる細胞死滅に対して感受性があった。また、幾つかの黒色腫は、AvPAL_C565SC503Sによる細胞死滅に対して感受性があった。
［実施例１５ ヌードマウスにおけるAvPAL変異体（システイン突然変異体）の抗腫瘍活性］
本研究は、インビボでのヌードマウスで増殖させた腫瘍細胞の増殖に対する、AvPALポリペプチド変異体（例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換での）のペグ化形態の影響を調査した。
実施例７に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを調製した。
免疫不全のヌードマウス又SCIDマウスにおけるヒト腫瘍細胞の皮下異種移植片を、癌治療剤、並びに抗体及び毒素複合体［Kerbel, Cancer Biol. Ther. 2(4):Suppl. 1:S134-S139 (2003)参照］等の標的癌治療剤のインビボでの有効性を試験するためのヒト癌モデルとして良好に用いた。
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sのインビボでの抗腫瘍活性を、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞の異種移植片を用いて、単独、癌治療剤若しくは標的癌治療剤と組み合わせて、又はフェニルアラニン制限食と組み合わせて、試験することができる。
ヒト腫瘍の異種移植片を確立するために、ヌードマウスに0.2mLリン酸緩衝液中約５×106個のヒト腫瘍細胞を皮下注射した。平均腫瘍サイズは、時間の経過で増加した。ヒト異種移植片腫瘍を腫瘍耐性ヌードマウスから切除し、約30mm3の腫瘍組織ブロックを調製した。ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sのインビボでの抗腫瘍活性の評価に用いられる野生型のヌードマウスにそれぞれ、一の腫瘍組織ブロックを皮下に移植した。腫瘍発生初期、又は、一群のヌードマウス内の平均腫瘍サイズが約100〜150mm3（予防モデル）である場合、及び／又は、一群のヌードマウス内の平均腫瘍サイズが約500mm3（治療モデル）である場合の腫瘍の確立後に、治療的処置が開始された。
第一のステップにおいて、０近くまで血漿フェニルアラニン(Phe)量を低減させる、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの用量を決定した。先の共に係属中の米国特許出願第11/451,999号（2006年６月12日出願）の実施例７〜９及び１４等のとおりに（ENU2よりヌードマウスを用いる点を除く）、試験を行った。PAL酵素用量、及び投与の頻度をこの初期のステップで決定した。
第二のステップにおいて、患者又は細胞系由来のさまざまなヒト腫瘍異種移植片において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの抗腫瘍活性を評価した。腫瘍モデルは、例えば、中枢神経系(CNS)、結腸、肺、前立腺、転移性黒色腫、及び腎臓癌といった、これらに限定されない、さまざまな癌の型を含んでいた。試験可能な腫瘍及び腫瘍細胞系の非一覧は、表７（血液腫瘍）及び８（固形腫瘍）にて提供した。
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの抗腫瘍活性を評価するために、さまざまなヒト皮下腫瘍異種移植片耐性ヌードマウスを、例えば、約５〜500mg/kgの範囲の３つの異なる用量で、AvPAL_C565SC503Sで皮下的に処置した。この用量は、約0.1〜10 mg/kgのヒトの用量であると考えられた。抗腫瘍活性を、腫瘍体積抑制及び／又は絶対成長遅れとして分析した。また、AvPAL_C565SC503Sの耐性を、死亡率及び／又は体重変化として評価した。
インビボによる腫瘍試験はそれぞれ、少なくとも４群（１つのビヒクル対照群、及び少なくとも３つの原核生物PAL酵素処理群）からなっている。グループの規模は、少なくとも８匹のマウスであり、32匹のマウスが腫瘍皮下移植を受けた。同様のサイズの腫瘍（100〜150mm3）を有するマウスを無作為に用いた（０日目）。
抗腫瘍効果の場合には、腫瘍成長の可能な再開を検出するために、マウスを原核生物PAL酵素処理の終了後追加的に２週間監視した。動物実験のための調整に従って、腫瘍径が1.6cmを超えた場合、マウスを屠殺した。
体重と共に、腫瘍径を２回毎週測定した。公式a*b2/2（式中、'a'は、腫瘍の最大径であり、'b'は、垂直軸である）に従って、腫瘍体積を算出した。０日目（投与最初の日）の値に基づいて、各々の個体の相対的な腫瘍体積及び体重を算出した。腫瘍が約100〜150mm3の体積になったときに、処置を開始した。動物実験のための調整により、腫瘍体積が1600mm3を超えた場合、マウスを屠殺した。
また、試験腫瘍として、ヌードマウスでの連続継代で確立された患者由来腫瘍を用いることができる。一般に、これらの腫瘍は、組織構造及び薬剤感受性を含む元の患者腫瘍の重要な特性を保持する。特定の腫瘍、例えば、一のCNS、及び共に前立腺癌、癌細胞系由来腫瘍が用いられる。
［実施例１６ 例示原核生物PAL配合物］
次の実施例は、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体を含む配合組成物に用いられるパラメーターに関する手引きを提供するものであり、これは、腫瘍性疾患及び癌の治療に有用である。本発明の原核生物PALの組成物に用いられるパラメーターは、pHを維持する緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤の非存在又は存在、賦形剤の非存在又は存在、ビヒクル、及び希釈剤等を含むが、これらに限定されない。
実施例１１では、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、約12〜20mg/mL（約0.2〜0.33mM）の濃度で配合した。好ましい原核生物PAL変異体を、約１〜50mg/mL（約0.016〜0.8mM）、好ましくは約５〜20mg/mL（約0.08〜0.33mM）、及び最も好ましくは約５〜15mg/mL（約0.08〜0.25mM）の範囲の濃度で配合する。最も好ましい本発明の原核生物PAL変異体の組成物は、約10+/-5mg/mL（約0.16+/-0.08mM）のPAL酵素濃度を有する。
実施例１１では、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、10mM Tris−HCl、140mM NaCl（pH7.0、7.5及び8.0)で配合した。好ましい緩衝剤は、５〜50mM、好ましくは５〜20mM、及びより好ましくは５〜15mMの範囲の濃度のTris−HCl、又はその等価物である。本発明の原核生物PALの組成物の最も好ましい配合は、約10+/-5mMのTris−HCl緩衝液の濃度であった。
医薬組成物の好ましいpHは、約6.0〜8.5、好ましくは約7.0〜8.0、及びより好ましくは約7.0〜7.6であった。本発明の原核生物PALの組成物の最も好ましい配合は、約7.3+/-0.3のpHである。
好ましい等張性調節剤は、約100〜200mM、好ましくは約130〜170mM、及びより好ましくは約130〜150mMの範囲の濃度のNaCl、又はその等価物である。本発明の原核生物PALの組成物の最も好ましい配合は、約140+/-10mMのNaClの濃度を有する。
実施例１１に示すとおり、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、フェニルアラニン(Phe)、及び、例えば、trans−桂皮酸(t−CA)及び安息香酸を含むその構造類縁体の存在下で安定化させた。また、チロシン(Tyr)は、PAL酵素に対して最小の安定効果があった。好ましい安定化剤は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約0.1〜20モル、好ましくは、原核生物PALの活性部位のモル当たり約0.5〜10モル、及び、より好ましくは、原核生物PALの活性部位のモル当たり約１〜10モルの範囲のPhe、又はその構造類縁体であった。本発明の原核生物PALの組成物の最も好ましい配合は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約５+/-４モルの安定化剤の濃度であった。
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sは、７より低いpH若しくは7.6より高いpHで、又は、EDTA、アミノグアニジン若しくはTween 80の存在下では有意に安定しなかった。また、抗酸化剤アスコルビン酸及びメチオニンは、PAL酵素を不安定にした（実施例１１、データは示さない）。
本発明の原核生物PALの組成物は、好ましくは液体配合物として調製されるが、固体（例えば、凍結乾燥）の配合物として調製してもよい。そのような場合、賦形剤（例えば、充填剤、マンニトール及び／又はスクロース等）を添加することができる。実施例１２では、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、25mg/mLマンニトールの存在下、又は、5mg/mLスクロース添加20mg/mLマンニトールで、10mM Tris−HCl、140mM NaCl(pH7.5)において配合及び凍結乾燥した。好ましい凍結乾燥配合物は、約１〜５％(w/v)又は10〜50mg/mL、好ましくは約２〜４％、及びより好ましくは２〜３％の濃度のマンニトールを含む。他の好ましい凍結乾燥配合物は、約１〜５％(w/v)又は10〜50mg/mL、好ましくは約１〜３％、及びより好ましくは約1.5〜2.5％のマンニトール濃度、並びに、約0.1〜２％(w/v)又は0.1〜２mg/mL、好ましくは約0.2〜１％、及びより好ましくは約0.3〜0.7％のスクロース濃度である、マンニトール及びスクロースを含む。最も好ましい本発明の原核生物PALの組成物の凍結乾燥配合は、約2.5+/-0.5％マンニトールの濃度、又は、2.0+/-0.5％マンニトール添加0.5+/-0.2％スクロースであった。
したがって、表９に、好ましい本発明の原核生物PALの組成物の例示配合物を示す。
Figure 2010536759
［実施例１７ 癌の治療のための原核生物PAL組成物での臨床的評価］
次の実施例は、本発明の治療方法における、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類縁体を含む組成物の臨床的評価に用いられるパラメーターに関する手引きを提供するものである。本明細書の全体にわたって考察されるとおり、原核生物PALの組成物を癌の治療に用いる。臨床試験が行われ、安全性、薬動力学、並びに、代用薬及び明確な臨床的エンドポイントの初期反応における原核生物PALの経口又は皮下用量の評価を提供する。当該臨床試験は、最小限で行われ、100人の評価可能な患者の十分な安全性情報を収集するのに24週必要であるが、必ずしもこれに限定されない。当該臨床試験の初期用量は、約0.001〜約1.0mg/kg/週で変動する。この用量が、患者血漿フェニルアラニン(Phe)量の低減（例えば、約50μM〜約70μMの正常範囲から、検出感度以下から約30μM未満、好ましくは約20μM未満、より好ましくは約10μM未満の低減）がなされない場合は、当該用量は、必要に応じて増加され、安全性を確立し、更なる有効性を評価するのに24週の、必ずしもこれに限定されない追加的な期間維持される。
安全性の判断は、相違のある、有害事象、アレルギー反応、完全な臨床化学パネル（腎臓及び肝機能）、尿検査、及びCBCを含む。また、血液Phe量の低減、神経心理及び認識機能検査、並びに包括的評価を含む他のパラメーターがモニターされる。さらに、本発明の実施例は、流通における薬剤の薬動力学パラメーター、並びに、一般的な流通及び血液のPALの半減期の判断を意図するものである。これらの手段は、臨床反応に対する用量に関して支援するものと予想される。
（方法）
癌のない対照患者、及び癌の形態と診断された患者は、病歴及び健康診断、神経心理及び認識機能検査、臨床検査（CBC、Panel 20、CH50、UA）の標準セット、尿のプテリン量、ヒドロプテリジン還元酵素(DHPR)量、並びに、血清アミノ酸の血液（血漿）パネルの絶食という、ベースラインを経験する。ベースライン血液、血清又は血漿Phe量が測定される。患者は、病院への毎週の通院で緊密に続く。患者は、治療期間の終了１週間後、完全な評価のために病院に戻る。用量増加が必要であれば、患者は、上述に概説された同様のスケジュールに従う。安全性が試験全体にわたってモニターされる。
（診断、及び包含物／除外基準）
患者は、男性か女性であり、癌の形態について裏付けのある診断を受けることができる。本研究は、過去に手術、化学療法、放射線治療、及び／又は他の抗癌治療を受けており、小康状態（例えば、少なくとも５年間病気にかかっていない）にある癌患者を含むものである。患者が癌の形態の診断を受けているが、ある態様の抗癌治療を経験していなければ、患者は、この初期検査から除外される。
（原核生物PALの安全性）
原核生物PAL治療は、深刻な急性又は慢性の薬物反応が研究時に生じない場合には、安全であると判断される。薬剤の非常に長期的な投与は、深刻な異常が臨床検査、臨床研究所、又は他の適切な研究でみられない場合には、安全であると判断される。
（原核生物PALの有効性）
原核生物PAL治療が、患者の血漿フェニルアラニン(Phe)量を低減させる（例えば、検出感度以下から約50μM〜70μMの正常な範囲から、検出感度以下から約30μM未満、好ましくは約20μM未満、及び、より好ましくは約10μM未満の低減）のに安全で有効であると判断されれば、本発明の原核生物PALの組成物を、過去に手術、化学療法、放射線治療、及び／又は他の抗癌治療を受けており、小康状態（例えば、少なくとも５年間病気にかかっていない）にある癌患者、及び、癌の形態の診断をしたことがあるが、まだ癌治療を経験していない癌患者に試験することができる。
小康状態の癌患者において、原核生物PALは、本発明のPALの組成物が与えられない患者よりも、長期間、PAL治療された患者の小康状態（すなわち、疾病がない）が維持されるか否かを判断するために、単独で、又は特定の形態の癌の標準癌治療と組み合わせて投与される。
癌の活性型を有する癌患者において、原核生物PALは、PAL治療された患者が、本発明の原核生物PALの組成物を与えられない患者よりも癌治療（例えば、長期間疾病がないままである、非常に長い生存時間がある、又は、非常に低い腫瘍成長、腫瘍サイズ又は全身腫瘍組織量）に対する非常によい反応があるか否かを判断するために、単独で、又は特定の形態の癌の標準癌治療と組み合わせて投与される。
原核生物PAL治療は、単独で、又は癌治療剤若しくは標的癌治療剤と組み合わせて、タンパク制限食（すなわち、フェニルアラニンを含まない）と組み合わせて、又は、これらの両方を組み合わせて投与することができる。
［実施例１８ B16黒色腫細胞系異種移植片モデルにおけるAvPAL変異体（システイン突然変異体）の抗腫瘍活性］
実施例７に記載したとおりに調製され、10mM Tris−HCl、140mM NaCl、１mM trans−桂皮酸(t−CA)(pH7.5)中2.86及び7.14mg/mLで配合された、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの予防的投与又は治療的投与の抗腫瘍効果を、B16黒色腫細胞系異種移植片モデルで評価した。予防的処置とは、疾病の兆候を示さない被験者に処置された治療を意味し、治療的処置とは、疾病の兆候を示す被験者に処置された治療を意味する。ペグ化AvPAL変異体での予防的処置又は治療的処置の抗腫瘍効果を、B16黒色腫細胞系異種移植片の増殖の遅れ、及び、マウスの生存期間の増加により測定した。
腫瘍異種移植片を確立するために、96匹の６週齢の雌のB6Jマウスの背脇腹に約1×106個のBl6黒色腫細胞を皮下注射した。注射されたマウスを、予防的処置群と治療的処置群の２つの群に無作為に割り振った。
予防的群に割り振られたマウスを更に４つの群に分け、それぞれの群に毎週２回、ビヒクル［10mM Tris−HCl、140mM NaCl、１mM trans−桂皮酸(t−CA)(pH7.5)］、又はさまざまな投与量（40、80又は100mg/kg）でペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを皮下注射した。図１８（上段）に示すとおり、予防的群の１日目は、Bl6黒色腫細胞をマウスに注射した日を示す。
但し、治療的群では、図１８（下段）に示すとおり、１日目は、マウスに注射したBl6黒色腫が200〜300mm3の体積に達したを日を示す。治療的群に割り振られたマウスの腫瘍が200〜300mm3の体積に達したとき、これらのマウスを更に４つの群に分け、それぞれの群に毎週、ビヒクル［10mM Tris−HCl、140mM NaCl、１mM trans−桂皮酸(t−CA)(pH7.5)］、又はさまざまな投与量（40、80又は100mg/kg）でペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、腫瘍と反対側の脇腹に皮下注射した。
腫瘍が測定可能となるまで、すべてのマウスを毎日触診した。公式(ｌXｗ2)/2（式中、wは、腫瘍の２つの垂直の軸の最短である）を用いて、デジタルノギス測定により、週３回腫瘍体積を測定した。
体重を週３回測定した。また、臨床観察（死亡率、異常、及び、痛み又は苦痛の兆候）を毎日行なった。眼窩後方の鼻腔採取による血液採取を、投与量管理（毎週１日）、48時間の後投与（毎週３日）、及び屠殺時に先駆けて毎週行なった。
腫瘍体積が1500mm3に到達したとき、マウスを36日目で又は個々に屠殺した。屠殺時の腫瘍を回収し、組織学的検査のためにホルマリン固定した。
予防的群の数匹のマウスは、16日目までに1500mm3の腫瘍体積であった［図１８（上段）参照］。治療的群の数匹のマウスは、10日目までに1500mm3の腫瘍体積であった［図１８（下段）参照］。
図１８は、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが、酵素を予防的（上段）又は治療的（下段）に投与した場合に、用量依存的にB16黒色腫細胞系異種移植片の成長を遅らすことができることを示す。
表１０は、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが、酵素を予防的又は治療的に投与した場合に、用量依存的に腫瘍体積が1500mm3未満のマウスの割合により判断された、生存を増加させることができることを示す。
Figure 2010536759
本研究においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを黒色腫のマウスモデルに予防的又は治療的に投与した場合に、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが抗腫瘍効果を奏することを示した。
［実施例１９ 血液腫瘍細胞系異種移植片モデルにおけるAvPAL変異体（システイン突然変異体）の抗腫瘍活性］
実施例７に記載したとおりに調製され、10mM Tris−HCl、140mM NaCl、１mM trans−桂皮酸(t−CA)(pH7.5)中9.1mg/mLで配合された、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの予防的投与の抗腫瘍効果を、２つの血液腫瘍細胞系異種移植片モデルで評価した。予防的処置とは、疾病の兆候を示さない被験者に処置された治療を意味する。ペグ化AvPAL変異体での予防的処置の抗腫瘍効果を、血液腫瘍細胞系異種移植片の増殖の遅れ、及び、マウスの生存期間の増加により測定した。
腫瘍異種移植片を確立するために、20匹の６週齢の雌のB6Jマウスの背脇腹に約1×107個のSNU398血液腫瘍細胞、又は約５×106個のHepG2血液腫瘍細胞を皮下注射した。
SNU398及びHepG2が注射されたマウスをそれぞれ、２つの群に分け、それぞれの群に毎週３回、ビヒクル［10mM Tris−HCl、140mM NaCl、１mM trans−桂皮酸(t−CA)(pH7.5)］、又は60mg/kgのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを皮下注射した。図１９に示すとおり、１日目は、SNU398細胞又はHepG2細胞をマウスに注射した日を示す。
腫瘍が測定可能となるまで、すべてのマウスを毎日触診した。公式(ｌXｗ2)/2（式中、wは、腫瘍の２つの垂直の軸の最短である）を用いて、デジタルノギス測定により、週３回腫瘍体積を測定した。
体重を週３回測定した。また、臨床観察（死亡率、異常、及び、痛み又は苦痛の兆候）を毎日行なった。眼窩後方の鼻腔採取による血液採取を、前試験、７回目の投与の48時間後、及び屠殺時に先駆けて毎週行なった。
腫瘍体積が1500mm3に到達したとき（どれが最初に生じても）、マウスを60日目で又は個々に屠殺した。屠殺時の腫瘍を回収し、組織学的検査のためにホルマリン固定した。
図１９は、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの予防的投与が、SNU398（上段）及びHepG2（下段）血液腫瘍細胞系異種移植片の成長を遅らすことができることを示す。
表１１は、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの予防的投与が、SNU398及びHepG2血液腫瘍細胞系異種移植片の腫瘍体積が1500mm3未満のマウスの割合により判断された、生存を増加させることができることを示す。
Figure 2010536759
これらの研究においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを２つの血液腫瘍のマウスモデルに予防的に投与した場合に、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが抗腫瘍効果を奏することを示した。
当業者であれば、上の実施例で説明したような本発明の多くの改良及び変形を想到するものと考えられる。したがって、添付した特許請求の範囲で開示したような限定のみが本発明に構成されるべきである。

Claims (47)

  1. 原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)変異体、及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物であって、該PAL変異体が、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し、かつ、該医薬として許容し得るキャリアが安定化剤を含む、前記医薬組成物。
  2. 前記PAL変異体の１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基によって置換されており、該置換が、野生型PALと比較して、フェニルアラニン変換活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させる、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 前記PAL変異体の１以上のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項２記載の医薬組成物。
  4. 前記PAL変異体が、アナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)変異体である、請求項３記載の医薬組成物。
  5. 前記AvPAL変異体の位置64、318、503及び565の１以上のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項４記載の医薬組成物。
  6. 前記AvPAL変異体の位置565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項５記載の医薬組成物。
  7. 前記AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項５記載の医薬組成物。
  8. 前記PAL変異体が、更に水溶性ポリマーを含む、請求項１記載の医薬組成物。
  9. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項８記載の医薬組成物。
  10. 前記PAL変異体がAvPAL変異体であり、かつ、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）である、請求項９記載の医薬組成物。
  11. 前記AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項１０記載の医薬組成物。
  12. 前記医薬として許容し得るキャリアが安定化剤を含む、請求項１記載の医薬組成物。
  13. 前記安定化剤が、L−フェニルアラニン、又はその構造類縁体である、請求項１２記載の医薬組成物。
  14. 前記安定化剤がL−フェニルアラニンである、請求項１２記載の医薬組成物。
  15. 前記安定化剤がtrans−桂皮酸である、請求項１２記載の医薬組成物。
  16. 前記安定化剤が安息香酸である、請求項１２記載の医薬組成物。
  17. AvPAL変異体、及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物であって、該AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており（配列番号11）、該AvPAL変異体が、更に水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３であり、かつ、該医薬として許容し得るキャリアが安定化剤である、前記医薬組成物。
  18. 前記安定化剤が、L−フェニルアラニン、又はその構造類縁体である、請求項１７記載の医薬組成物。
  19. 前記安定化剤が、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される、請求項１７記載の医薬組成物。
  20. 前記安定化剤がL−フェニルアラニンである、請求項１９記載の医薬組成物。
  21. 前記安定化剤がtrans−桂皮酸である、請求項１９記載の医薬組成物。
  22. 前記安定化剤が安息香酸である、請求項１９記載の医薬組成物。
  23. PAL変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量を、患者に投与することを含む癌の治療方法であって、
    a)該PAL変異体が、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し；かつ、
    b)該PAL変異体が、該患者の血液、血清又は血漿中のフェニルアラニン濃度を検出感度未満から20μM〜60μMの範囲に低減させるのに有効である、前記方法。
  24. 前記PAL変異体の１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基によって置換されており、該置換が、野生型PALと比較して、フェニルアラニン変換活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させる、請求項２３記載の方法。
  25. 前記PAL変異体の１以上のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項２４記載の方法。
  26. 前記PAL変異体がAvPAL変異体である、請求項２５記載の方法。
  27. 前記AvPAL変異体の位置64、318、503及び565の１以上のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項２６記載の方法。
  28. 前記AvPAL変異体の位置565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項２７記載の方法。
  29. 前記AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項２７記載の方法。
  30. 前記PAL変異体が、更に水溶性ポリマーを含む、請求項２３記載の方法。
  31. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項３０記載の方法。
  32. 前記PAL変異体がAvPAL変異体であり、かつ、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）である、請求項３１記載の方法。
  33. 前記AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項３２記載の方法。
  34. AvPAL変異体及び医薬として許容し得るキャリアを含む医薬組成物の治療有効量を、患者に投与することを含む癌の治療方法であって、
    a)該AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており（配列番号11）；
    b)該AvPAL変異体が、更に水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３であり；
    かつ、該AvPAL変異体が、該患者の血液、血清又は血漿中のフェニルアラニン濃度を検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲に低減させるのに有効である、前記方法。
  35. 前記医薬として許容し得るキャリアが安定化剤を含む、請求項２３又は３４記載の方法。
  36. 前記安定化剤が、L−フェニルアラニン、又はその構造類縁体である、請求項３５記載の方法。
  37. 前記安定化剤が、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
  38. 前記安定化剤がL−フェニルアラニンである、請求項３７記載の方法。
  39. 前記安定化剤がtrans−桂皮酸である、請求項３７記載の方法。
  40. 前記安定化剤が安息香酸である、請求項３７記載の方法。
  41. 前記癌が、肺癌、脳又は中枢神経系癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、転移性黒色腫、頭頸部癌、卵巣癌、子宮癌、急性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、小児癌、及び、耐性癌からなる群より選択される、請求項２３又は３４記載の方法。
  42. 前記癌由来の細胞の増殖及び／又は生存が、フェニルアラニンの制限又は欠乏に感受性を有する、請求項２３又は３４記載の方法。
  43. 更に癌治療剤又は標的癌治療剤を含んだ医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、請求項２３又は３４記載の方法。
  44. 更に前記患者にタンパク制限食を投与することを含む、請求項２３又は３４記載の方法。
  45. 前記患者の血液、血清又は血漿中のフェニルアラニン濃度を、検出感度未満から約20μM未満の範囲に低減させる、請求項２３又は３４記載の方法。
  46. 前記患者の血液、血清又は血漿中のフェニルアラニン濃度を、検出感度未満から約10μM未満の範囲に低減させる、請求項４５記載の方法。
  47. 前記患者がヒトである、請求項２３又は３４記載の方法。
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