JP3320307B2 - フェノール性化合物等の高分子化方法及びその利用 - Google Patents

フェノール性化合物等の高分子化方法及びその利用

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JP3320307B2 JP14420096A JP14420096A JP3320307B2 JP 3320307 B2 JP3320307 B2 JP 3320307B2 JP 14420096 A JP14420096 A JP 14420096A JP 14420096 A JP14420096 A JP 14420096A JP 3320307 B2 JP3320307 B2 JP 3320307B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フェノール性化合
物または芳香族アミン化合物の酵素的高分子化方法及び
その方法で得られる高分子化合物の利用方法に関する。
さらに詳しく言えば、本発明は、アルカリｐＨ域におい
て、ポリフェノール酸化作用を有する酵素をフェノール
性化合物または芳香族アミン化合物に作用させることに
より分子量の増大したフェノール性化合物または芳香族
アミン化合物を製造する方法、及び前記のアルカリ域に
おける酵素の触媒作用を利用するフェノール性化合物ま
たは芳香族アミン化合物の速やかな分子量の増大反応を
利用して得られる、増粘剤、安定剤、凝集剤、乳化剤、
分散剤、保水剤、酸化防止剤、接着剤、コンクリート混
和剤、染色剤、脱臭剤、塗料、石油回収剤、土壌改質
剤、種子吹付表土安定剤、農薬展着剤、飼料のバインダ
ー、殺菌剤、抗菌剤、ウィルス感染阻止剤、生物付着防
止剤、生物忌避剤、殺虫剤、パップ剤、インキ基剤及び
木材処理剤、これら各種剤類の製造方法、廃水処理方
法、脱酸素方法、木材処理方法、コンクリート処理方
法、及び土壌処理方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、フェノール性化合物等が、酵素、
例えば担子菌類や不完全菌類の生産するラッカーゼやポ
リフェノールオキシダーゼを利用して高分子化できるこ
とが知られている（Journal of Biotechnology,13,229-
241,1990など）。しかしながら、菌類の生産するラッカ
ーゼやポリフェノールオキシダーゼはその至適反応ｐＨ
が酸性領域にあるため、これらの酵素を用いて高分子化
反応を触媒・加速するためには、反応を酸性から中性の
ｐＨ域で実施する必要があり、しかもその高分子化反応
の速度は十分に高いものではなかった。また、これらの
酵素が反応できる天然の有機化合物の多くはポリフェノ
ール化合物であり、これらポリフェノール化合物の溶解
度は酸性から中性のｐＨ域において低下するにもかかわ
らず、酵素の至適反応ｐＨが酸性領域にあるため、反応
を酸性から中性のｐＨ域で実施する必要があり、高濃度
のポリフェノール化合物を効率よく高分子化することが
できないという欠点があった。また、多くのポリフェノ
ール化合物はアルカリｐＨ域でその自動酸化が加速され
るにもかかわらず、従来は、酸性から中性のｐＨ域にお
いて酵素的な酸化重合を行っていたため、自動酸化を有
効に利用できないという欠点があった。
【０００３】また、従来よりビリルビンオキシダーゼに
よっても、フェノール性化合物等が高分子化でき、これ
をリグニンの高分子化、綿の染色に利用可能であること
が知られている（WO95-01426号、特開平6-316874号）。
しかしながら、ビリルビンオキシダーゼを用いる先行技
術ではフェノール性化合物等の酵素触媒的な重合を酸性
から中性のｐＨ領域で実施しており、その高分子化反応
の速度は十分に高いものではなく、ビリルビンオキシダ
ーゼによってアルカリｐＨ域でフェノール性化合物の高
分子化反応が加速されることを示唆する記載は全くな
い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、アルカリｐＨ域でフェノール性化合物または芳香族
アミン化合物を高分子化する酵素触媒による方法を提供
することにある。
【０００５】本発明の他の課題は、ポリフェノール酸化
作用を有する酵素を用いて、アルカリｐＨ域においてフ
ェノール性化合物または芳香族アミン化合物を効率よく
高分子化する工程を含む、増粘剤、安定剤、凝集剤、乳
化剤、分散剤、保水剤、酸化防止剤、接着剤、コンクリ
ート混和剤、染色剤、塗料、石油回収剤、土壌改質剤、
種子吹付表土安定剤、脱臭剤、消臭剤、農薬展着剤、飼
料のバインダー、殺菌剤、抗菌剤、ウィルス感染阻止
剤、生物付着防止剤、生物忌避剤、殺虫剤、パップ剤、
インキ基剤及び木材処理剤の製造方法を提供することに
ある。
【０００６】本発明の他の課題は、前記フェノール性化
合物または芳香族アミン化合物を効率よく高分子化して
なる高分子化合物を含む、増粘剤、安定剤、凝集剤、乳
化剤、分散剤、保水剤、酸化防止剤、接着剤、コンクリ
ート混和剤、染色剤、塗料、石油回収剤、土壌改質剤、
種子吹付表土安定剤、脱臭剤、消臭剤、農薬展着剤、飼
料のバインダー、殺菌剤、抗菌剤、ウィルス感染阻止
剤、生物付着防止剤、生物忌避剤、殺虫剤、パップ剤、
インキ基剤及び木材処理剤を提供することにある。
【０００７】また、本発明の他の課題は、前記本発明に
よる高分子化反応を利用してフェノール性化合物や芳香
族アミン化合物を含有する廃水から前記化合物を除去す
る処理方法を提供することにある。また、本発明の課題
は、前記本発明による高分子化反応を利用して溶存酸素
を除去する脱酸素方法を提供することにある。
【０００８】また、本発明の課題は、前記本発明による
高分子化反応を利用した木材の処理方法を提供すること
にある。また、本発明の課題は、前記本発明による高分
子化反応を利用したコンクリート処理方法を提供するこ
とにある。さらに本発明の課題は、前記本発明による高
分子化反応を利用した土壌改質方法を提供することにあ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、フェノー
ル性化合物または芳香族アミン化合物を効率よく高分子
化する方法を開発するため、鋭意研究を行った。そし
て、驚くべきことに、アルカリ域、特にｐＨ８以上のア
ルカリｐＨ域でポリフェノール酸化作用を有する適当な
酵素を用いることにより、フェノール性化合物または芳
香族アミン化合物の高分子化を効率よく達成できること
を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】すなわち本発明は以下のものを提供するも
のである。 １） ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium verr
ucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-14955）または
ミロセシウム・ロリダム（Myrothecium roridum）ＳＤ
３００２（受託番号FERM P-15255）を培養して得られる
ポリフェノール酸化作用を有する酵素を、アルカリｐΗ
域においてフェノール性化合物または芳香族アミン化合
物に作用させ、これを高分子化することを特徴とする分
子量の増大したフェノール性化合物または芳香族アミン
化合物の製造方法。 ２） ｐＨ８以上のアルカリ域において高分子化するこ
とを特徴とする前記１に記載の製造方法。 ３） フェノール性化合物がリグニンもしくはリグニン
誘導体である前記１または２に記載の製造方法。 ４） リグニン誘導体がリグニンスルホン酸である前記
３に記載の製造方法。 ５） 前記１に記載のポリフェノール酸化作用を有する
酵素を、アルカリｐＨ域においてフラボノイドに作用さ
せ、これを高分子化することを特徴とする分子量の増大
したフェノール性化合物の製造方法。 ６） キノン化合物、不飽和脂肪酸、不飽和アルコー
ル、または不飽和アルキル化合物を、単独で、または複
数組み合わせて、フェノール性化合物または芳香族アミ
ン化合物に添加し、前記１に記載のポリフェノール酸化
作用を有する酵素を、アルカリｐＨ域においてフェノー
ル性化合物または芳香族アミン化合物に作用させ、これ
を高分子化することを特徴とする分子量の増大したフェ
ノール性化合物または芳香族アミン化合物の製造方法。 ７） 抗菌性化合物、抗ウィルス性化合物、生物忌避化
合物、殺虫性化合物もしくは金属イオンを共存させた状
態で、前記１に記載のポリフェノール酸化作用を有する
酵素を、アルカリｐΗ域においてフェノール性化合物ま
たは芳香族アミン化合物に作用させ、これを高分子化す
ることを特徴とする分子量の増大したフェノール性化合
物または芳香族アミン化合物の製造方法。 ８） ０〜１００℃の温度で高分子化する前記１乃至７
のいずれかの項に記載の製造方法。 ９） 前記１乃至８のいずれかの項に記載の方法によっ
て、廃水中のフェノール性化合物または芳香族アミン化
合物を高分子化してこれを除去することを特徴とする廃
水の処理方法。
【００１１】１０） フェノール性化合物または芳香族
アミン化合物とミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothec
ium verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-1495
5）またはミロセシウム・ロリダム（Myrothecium rorid
um）ＳＤ３００２（受託番号FERM P-15255）を培養して
得られるポリフェノール酸化作用を有する酵素とを含有
することを特徴とする、アルカリｐΗ域で使用される脱
酸素剤。 １１） ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium ve
rrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-14955）また
はミロセシウム・ロリダム（Myrothecium roridum）Ｓ
Ｄ３００２（受託番号FERM P-15255）を培養して得られ
るポリフェノール酸化作用を有する酵素を、フェノール
性化合物または芳香族アミン化合物と共にコンクリート
に添加し、フェノール性化合物または芳香族アミン化合
物をコンクリート中で高分子化することを特徴とするコ
ンクリート処理方法。 １２） ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium ve
rrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-14955）また
はミロセシウム・ロリダム（Myrothecium roridum）Ｓ
Ｄ３００２（受託番号FERM P-15255）を培養して得られ
るポリフェノール酸化作用を有する酵素を、フェノール
性化合物または芳香族アミン化合物と共に土壌中に添加
し、フェノール性化合物または芳香族アミン化合物を土
壌中で高分子化することを特徴とする土壌処理方法。
【００１２】
【００１３】
【００１４】
【００１５】
【００１６】以下に本発明を詳細に説明する。 ［ポリフェノール酸化酵素］本発明の目的に使用される
酵素は、アルカリｐＨにおいてポリフェノール酸化作用
を有するものであればよい。このような酵素の例とし
て、微生物、例えば真菌または細菌によって産生される
か、もしくは植物によって産生されるカテコールオキシ
ダーゼ、ラッカーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ア
スコルビン酸オキシダーゼ、またはビリルビンオキシダ
ーゼ等のポリフェノール酸化酵素が挙げられる。またこ
れらの酵素の他に、アルカリｐＨにおいてポリフェノー
ル酸化作用を有するものであれば、いかなる酵素蛋白質
も本発明に使用し得る。
【００１７】本発明で使用するアルカリｐＨ域でポリフ
ェノール酸化作用を有する酵素としては、効率の良い高
分子化反応の実施のために、ポリフェノール酸化反応の
至適反応ｐＨがｐＨ7.5以上のアルカリ側にあるものが
望ましい。具体的には、このような酵素は、後述するシ
リンガルダジン（syringaldazine）を用いる活性測定に
おいてｐＨ7.5以上のアルカリ側に至適反応ｐＨを有す
るものであることが望ましい。
【００１８】本発明の目的に使用される酵素を産生する
微生物の例としては以下のものが挙げられる。真菌とし
ては、不完全菌亜門（Deuteromycotina）に属する、ア
スペルギルス（Aspergillus）、ボトリティス（Botryti
s）、ミロセシウム（Myrothecium）、ペニシリウム（Pe
nicillium）、ペスタロチア（Pestalotia）、リゾクト
ニア（R hizoctonia）、トリコデルマ（Tricoderma）、
好ましくはアスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillu
s nidulans）、ボトリティス・シネレア（Botrytis cin
er ea）、ミロセシウム・ロリダム（Myrothecium roridu
m）、ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium verru
caria）、ミロセシウム・プレストニ（Myrotheciu m pre
stonii）、ミロセシウム・ロイコトリカム（Myrotheciu
m leucotrichum）、ペニシリウム・スクレロティオラム
（Penicillium sclerotiorum）、ペニシリウム・ヤンチ
ネルム（Penicillium janthinellum）、ペスタロチア・
パルマラム（Pestalotia palmarum）、リゾクトニア・
プラティコラ（Rhizoctonia pratico la）、トリコデル
マ・レシィ（Tricoderma reesei）、トリコデルマ・ビ
リデ（T ricoderma viride）に属する菌株を含む。これ
らの中で特に好ましいのはミロセシウム・ヴェルカリア
ＳＤ３００１（Myrothecium verrucaria SD3001）(工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-14955として
寄託）またはミロセシウム・ロリダム ＳＤ３００２
（Myrothecium roridum SD3002）（工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM P-15255として寄託）である。
【００１９】他の好ましい真菌は、担子菌亜門（Basidi
omycotina）に属する、プロイロータス（Pleurotus）、
レンティナス（Lentinus）、シゾフィラム（Schizophyl
lum）、アルミラリエラ（Armillariella）、フラムリナ
（Flammulina）、アガリカス（Agaricus）、コプリナス
（Coprinus）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フ
レビア（Phlebia）、レンチテス（Lenzites）、メラノ
ロイカ（Melanoleuca）、フォリオタ（Pholiota）、ス
テレウム（Stereumu）、ポリポラス（Polyporu s）、ポ
リポレルス（Polyporellus）、ミクロポラス（Micropor
us）、フォミトプシス（Fomitopsis）、ピクノポラス
（Pycnoporus）、トラメテス（Trametes）、コリオラス
（Coriolus）、デダレオプシス（Daedaleopsis）、リジ
ドポラス（Rigidoporus）、フォメス（Fomes）、ガノデ
ルマ（Ganoderma）、トラキデルマ（Trachyderma）、ヒ
メノカエテ（Hymenochaete）、イノノタス（Inonotu
s）、好ましくはプロイロータス・コルヌコピエ（Pleur
otus cornucopiae）、プロイロータス・オストレアタス
（Pleurotus osteratus）、レンティナス・エドデス（L
entinus edodes）、シゾフィラム・コミューン（Schizo
phyllum commune）、アルミラリエラ・メレア（Armilla
riella mellea）、フラムリナ・ベルティペス（Flammul
ina velutipes）、アガリカス・ビスポラス（Agaricus
bisporus）、コプリナス・コマタス（Coprinus comatu
s）、コプリナス・シネレウス（Coprin us cinereus）、
コプリナス・コングレガタス（Coprinus congregatu
s）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochae
te chrysosporium）、フレビア・ラジアータ（Phlebia
radiata）、レンチテス・ベツリナ（Lenzites betulin
a）、メラノロイカ・ベルルシペス（Melanoleuca verru
cipes）、フォリオタ・ナメコ（Pholiota nameko）、ス
テレウム・ヒルスタム（Stereumu hirsutum）、ポリポ
ラス・スクアモサス（Polyporus squamosus）、ポリポ
レルス・バディウス（P olyporellus badius）、ミクロ
ポラス・フラベリフォルミス（Microporus flabe llifor
mis）、フォミトプシス・ピニコラ（Fomitopsis pinico
la）、ピクノポラス・コシネウス（Pycnoporus coccine
us）、トラメテス・オリエンタリス（Tram etes orienta
lis）、コリオラス・ヴェルシコラー（Coriolus versic
olor）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutu
s）、デダレオプシス・トリコラー（D aedaleopsis tric
olor）、リジドポラス・ゾナリス（Rigidoporus zonali
s）、フォメス・フォメンタリウス（Fomes fomentariu
s）、ガノデルマ・ルシダム（G anoderma lucidum）、ト
ラキデルマ・ツノダエ（Trachyderma tsunodae）、ヒメ
ノカエテ・ルビギノーサ（Hymenochaete rubiginos
a）、イノノタス・ミカドイ（Inonotus mikadoi）に属
する菌株である。
【００２０】他の好ましい真菌は、子嚢菌亜門（Ascomy
cotina）に属するポドスポラ（Podo spora）、ノイロス
ポラ（Neurospora）、モノシリウム（Monocillium）、
好ましくは、ポドスポラ・アンセリナ（Podospora anse
rina）、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crass
a）、モノシリウム・インディカム（Monocillium indic
um）に属する菌株である。
【００２１】いくつかの好ましい細菌には、アゾスピリ
ウム（Azospirillum）、好ましくはアゾスピリウム・リ
ポフェラム（Azospirillum lipoferum）、または、アク
チノミセタレス目（Actinomycetales）、たとえばスト
レプトミセス（Streptomyces）、好ましくはストレプト
ミセス・アンチビオティカス（Streptomyces antibio ti
cus）、または、アエロバクタ（Aerobacter）、好まし
くはアエロバクタ・アエロゲネス（Aerobacter aerogen
es）に属する菌株が含まれる。
【００２２】他の好ましい細菌は、バチルス・アルカロ
フィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アミ
ロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefacien
s）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチル
ス・ファーマス（Bacillus firm us）、バチルス・リケ
ニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ナ
ットー（Bacillus natto）、バチルス・プミルス（Baci
llus pumilus）、バチルス・スファエリカス（Bacillus
sphaericus）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subti
lis）、好ましくはバチルス・リケニホルミス（Bacillu
s licheniformis）、バチルス・ナットー（Bacillus na
tto）である。
【００２３】本発明で使用する酵素を含有するいくつか
の好ましい植物には、カケノキ（Ac erpseudoplatanu
m）、ヤムノキ（Dioscorea）、オクラ（Abelmoschu
s）、グアバ（Psidium）、ヒマワリ（Helianthus）、ジ
ャガイモ、リンゴ、カボチャ、キュウリ、小麦、アルフ
ァルファなどを含む。
【００２４】［酵素の調製］本発明で使用する酵素は、
前記の微生物、例えば真菌または細菌に属する菌株及び
その変異株を培養して得られるほか、遺伝子操作菌を利
用して調製することも可能である。すなわち、前記酵素
蛋白質をコードするＤＮＡ配列と宿主生物での酵素発現
機能を有する適当なプロモーター、及びオペレーター、
ターミネーターＤＮＡ配列と共に、宿主生物中でベクタ
ーを複製するための複製開始点を有するＤＮＡベクター
に挿入された発現ベクターを用いて形質転換された宿主
細胞、もしくは前記酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列
と宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモータ
ー、及びオペレーター、ターミネーターＤＮＡ配列と共
に、宿主細胞ＤＮＡに組み込むことにより形質転換され
た宿主細胞を、酵素蛋白質の発現できる条件のもとに培
養し、さらに酵素蛋白質を培地から回収する方法によっ
ても生産される。
【００２５】本発明に係る酵素蛋白質をコードするＤＮ
Ａ断片の取得のためには、前記の微生物、例えば真菌ま
たは細菌に属する菌株からのｃＤＮＡまたはゲノムライ
ブラリィを分離源とし、本発明に係る酵素蛋白質のアミ
ノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして目的のＤＮＡ断片を特定するか、または酸
化酵素としての活性を発現するクローンを選択するか、
または前記酵素蛋白質に対する抗体と反応する蛋白質を
生産するクローンを選択するといった常法によって行う
ことができる。
【００２６】本発明に係る酵素蛋白質は、前記の植物由
来の種子、または果実、葉などからの抽出で調製するこ
とも可能である。また、本発明に係る酵素蛋白質を得る
ための真菌または細菌に属する菌株及びその変異株の培
養は、通常用いられる合成培地や有機炭素源及び有機窒
素源を含む栄養培地が使用可能である。培養の場合、Ｃ
ｕ2+イオンを金属塩として0.001ｍＭから１０ｍＭ、好
ましくは0.01ｍＭから１ｍＭの濃度で添加することが望
ましい。
【００２７】本発明に係るポリフェノール酸化酵素が真
菌または細菌の菌体外に分泌される場合は、培地中から
周知の方法でこれを回収することができる。この回収手
順には、遠心分離もしくはろ過、膜分離により培地から
細胞を分離し、例えばイオン交換クロマトグラフィー等
によるクロマトグラフィーを行うという一連の手順を含
む。また、限外ろ過膜を用いる膜濃縮も有効である。酵
素蛋白質が真菌または細菌の菌体内に蓄積される場合や
植物組織内に存在する場合は、菌体組織や植物組織か
ら、周知の方法でこれを回収することができる。この回
収手順には、ホモジナイズによる組織の機械的破壊と、
遠心分離もしくはろ過、膜分離により酵素蛋白質溶液を
分離抽出し、例えばイオン交換クロマトグラフィー等に
よるクロマトグラフィーを行うという一連の手順を含
む。また、限外ろ過膜を用いる膜濃縮も有効である。
【００２８】［活性測定法］本発明においては、ポリフ
ェノール酸化作用を有する酵素蛋白質のポリフェノール
酸化活性の測定は、２０℃において、２０ｐｐｍのシリ
ンガルダジン（syringaldazine）、及び１００ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌバッファーもしくはリン酸カリウムバッ
ファーを含む水溶液中で、至適反応ｐＨでの反応を行
い、５２５ｎｍの吸光度を測定することで行った。そし
て、１分間に１μｍｏｌのシリンガルダジンを酸化する
活性量を１ユニット（以下、Ｕと略す。）と定義した。
【００２９】［高分子化反応方法及びその利用］本発明
方法による分子量の増大したフェノール性化合物または
芳香族アミン化合物の製造における、フェノール性化合
物または芳香族アミン化合物の濃度は0.01〜９０％、好
ましくは１〜８０％である。また、反応温度は０〜１５
０℃、好ましくは０〜１００℃である。さらに、反応の
ｐＨは7.0〜１２、好ましくは7.5〜１０である。また、
使用する酵素活性濃度は１〜10,000Ｕ／リッター、好ま
しくは１０〜2000Ｕ／リッターである。酵素活性濃度
は、目的によって調整することが望ましい。すなわち、
速やかな高分子化およびゲル化または固化を達成したい
場合には高い活性濃度で反応を行えばよい。一方、低い
活性濃度で反応を行えば穏やかな高分子化反応が進行
し、液状物質としてより均一な高分子物溶液を得ること
ができ、さらに反応を続行すると、穏やかなゲル化反応
が反応液全体にわたって進行する。適当な重合度に至っ
た時点での反応の停止は、ＮａＯＨ、ＮＨ3、Ｎａ2ＣＯ
3、ＣａＣＯ3などのアルカリやアルカリ塩の添加、塩
酸、硫酸、硝酸などの酸の添加、既知の酵素阻害剤の添
加、あるいは１００℃、１５分間といった加熱処理によ
って実施できる。
【００３０】また、ゲル化したフェノール性化合物また
は芳香族アミン化合物は、所望により５０〜２３０℃で
加熱することにより、再び溶解させることが可能であ
る。こうした熱溶解性は、分散剤、接着剤、塗料などの
用途に用いるときに有用な性質である。また熱溶解後に
熱水などを添加し、分散・溶解させることで、非常に分
子量の高いフェノール性化合物または芳香族アミン化合
物を、溶液として得ることが可能である。
【００３１】また、加熱による硬化を促進する目的で、
フルフリルアルコールや糖などのポリオールなどを添加
することも可能である。また、高分子化合物に生理活性
物質を含有させ、生理活性物質の固定化物質、あるいは
生理活性物質の徐放性を有する物質を得る目的で、抗菌
性化合物、抗ウィルス性化合物、生物忌避化合物、殺虫
性化合物もしくは金属イオンを共存させて高分子化反応
を行わせるか、または高分子化反応の後に、抗菌性化合
物、抗ウィルス性化合物、生物忌避化合物、殺虫性化合
物もしくは金属イオンを添加することも可能である。こ
の目的で用いる抗菌性化合物、抗ウィルス性化合物、生
物忌避化合物、殺虫性化合物もしくは金属イオンには、
従来知られている多くの物質が使用可能である。
【００３２】本発明による高分子化反応は、ポリフェノ
ール酸化作用を有する酵素を酸化触媒とするものであ
り、空気中の酸素を酸化剤として使用でき、このことは
本発明の広範な利用分野への適用を可能にする。また、
高分子化物を大量に生産する場合には、反応液の機械的
な撹拌や、空気あるいは酸素を反応系に加える操作が有
効である。また、反応液にペルオキシダーゼと過酸化水
素、もしくは過酸化水素の代りに過酸化水素を生成でき
るオキシダーゼとその基質を添加し、酸素を酸化剤とす
る本発明の反応と、過酸化水素を酸化剤とする反応を同
時に進行させることも可能である。
【００３３】［フェノール性化合物または芳香族アミン
化合物］本発明で高分子化する対象であるフェノール性
化合物または芳香族アミン化合物は、本発明で使用する
酵素が酸化できる物質であればいかなる化合物も使用可
能である。このようなフェノール性化合物または芳香族
アミン化合物の具体的な例としては、リグニン、リグニ
ンスルホン酸、フミン酸、ニトロフミン酸、タンニン、
カテキン、没食子酸、ウルシオール、ヘスペリジン、ク
ロロゲン酸、ヒノキチオール、ピロカテコール、ハイド
ロキノン、ｔ−ブチルハイドロキノン、フェニルハイド
ロキノン、トリメチルハイドロキノン、エチル ３，４
−ジヒドロキシケイ皮酸、ピロガロール、ラウリル ガ
レート、オクチル ガレート、シリンギン酸、フェルラ
酸、バニリン、ｏ−バニリン、バニラ酸、バニリルアル
コール、アスコルビン酸、１，２−ジヒドロキシナフタ
レン、２，３−ジヒドロキシナフタレン、６，７−ジヒ
ドロキシ−２−ナフタレンスルホン酸、アンスラロビ
ン、アリザリン、キニザリン、ｏ−フェニレンジアミ
ン、ｐ−フェニレンジアミン、３，４−ジアミノベンゾ
フェノン、ｏ−アニシジン、ｐ−アニシジン、ｏ−アミ
ノフェノール、ｐ−アミノフェノール、１，２−ジアミ
ノアンスラキノン、１，４−ジアミノアンスラキノンで
ある。
【００３４】これらの化合物の他にも本発明で使用する
酵素が酸化できる物質あれば、高分子化物の原料とし
て、あるいは、高分子化反応の触媒として使用可能であ
る。このような化合物の例は、ＡＢＴＳ（２，２′−ア
ゾビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸））、ビリルビン、イソアスコルビン酸、ケルセチ
ン、ルチン、グアイアコール、４−メトキシフェノー
ル、ビフェノール、４，４′−エチレンジアニリン、メ
チルハイドロキノン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル、６−ヒドロキシ−２，４，５−トリアミノピリミジ
ン、４，５，６−トリアミノピリミジン、２，３−ジヒ
ドロキシピリダジン、３，６−ジヒドロキシピリダジ
ン、２，３−ジヒドロキシピリジン、４−ヒドロキシ−
３−メトキシ安息香酸、メチル４−ヒドロキシ−３−メ
トキシ安息香酸、４，５−ジアミノ−６−ヒドロキシ−
２−メルカプトピリミジン、２，３−ジアミノピリジ
ン、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン、
２，５−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ
安息香酸、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−
１，２−ジオン、３−（３，４−ジヒドロキシフェニ
ル）−Ｌ−アラニン、２−アミノ−３−ヒドロキシピリ
ジン、３−アミノ−２−メトキシジベンゾフラン、２，
４−ジメトキシアニリン、２，５−ジメトキシアニリ
ン、３，４−ジメトキシアニリン、２′，５′−ジメト
キシアセトフェノン、３′，４′−ジメトキシアセトフ
ェノン、１，４−ジメトキシベンゼン、ベラトロール、
２，３−ジメトキシ安息香酸、２，５−ジメトキシ安息
香酸、ベラトル酸、３，４−ジメトキシベンジルアルコ
ール、３，４−ジメトキシフェネチルアミン、（３，４
−ジメトキシフェニル）酢酸、（３，４−ジメトキシフ
ェニル）アセトニトリル、４−アリール−２−メトキシ
フェノール、２−メトキシ−４−プロフェニルフェノー
ル、２−メトキシ−５−メチルアニリン、２−メトキシ
−５−ニトロアニリン、４−メトキシ−２−ニトロアニ
リン、３−メトキシサリチル酸、３−メチルカテコー
ル、４−メチルカテコール、メチルガレート、プロピル
ガレート、３，４，５−トリメトキシアニリン、３，
４，５−トリメトキシフェノール、トロポロン、プルプ
ロガリン、サリチルアルドキシム、３−アミノ−５，
６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフトール、１，５−
ジヒドロキシナフタレン、３，５−ジヒドロキシ−２−
ナフトエ酸、４−ヒドロキシ−１−ナフタレンスルホン
酸、プルプリン、２，３−ジヒドロ−９，10−ジヒドロ
キシ−１，４−アントラセンジオン、各種のアゾ系染料
である。また、高分子化物の物性を調節する目的で、こ
れらのフェノール性化合物または芳香族アミン化合物を
複数組み合わせて用いることも可能である。
【００３５】また、本発明によって高分子フェノール性
化合物または芳香族アミン化合物を製造する際に、同様
の反応経路によって高分子化されるキノン化合物を共存
させることもできる。このようなキノン化合物の例は、
アンスラキノン−２−スルホン酸、アンスラキノン−
１，５−ジスルホン酸、アンスラキノン−２，６−ジス
ルホン酸、アンスラキノン−２−カルボン酸、１−アミ
ノアンスラキノン、２−アミノアンスラキノン、アンス
ラルフィン、アミノナフトキノン、１，８−ジヒドロキ
シアンスラキノン、カムフォキノン、デヒドロアスコル
ビン酸、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、イサ
チン、５−ニトロイサチン、各種のアンスラキノン系染
料である。また、オレイン酸、リノール酸などの不飽和
脂肪酸、または、オレイルアルコールなどの不飽和アル
コール、さらには、スクアレンなどの不飽和アルキルと
いった自動酸化される物質を共存させ、酵素反応と同時
に空気酸化、重合を行うことも可能である。
【００３６】本発明によって製造される高分子フェノー
ル性化合物または芳香族アミン化合物の中では、特にリ
グニン、リグニンスルホン酸、フミン酸、ニトロフミン
酸、タンニン、カテキン、没食子酸、ウルシオール、ヘ
スペリジン、ヒノキチオールなどの天然物もしくは天然
物誘導体の高分子化物は、環境や人体への安全性が高い
ため有用性が高く、その高分子化合物の特性を生かし
て、増粘剤、安定剤、凝集剤、乳化剤、分散剤、保水
剤、酸化防止剤、接着剤、コンクリート混和剤、染色
剤、塗料、石油回収剤、土壌改質剤、種子吹付表土安定
剤、脱臭剤、消臭剤、農薬展着剤、飼料のバインダー、
殺菌剤、抗菌剤、ウィルス感染阻止剤、生物付着防止
剤、生物忌避剤、殺虫剤、パップ剤、インキ基剤または
木材処理剤などの様々な用途分野への利用が可能であ
る。なお、これらの用途においては各々の分野で通常使
用されている各種の添加剤成分を併用できる。
【００３７】さらに、これらの用途分野において、本発
明に開示した製造方法で、天然もしくは非天然のフェノ
ール性化合物または芳香族アミン化合物を穏和な反応条
件で高分子化し、粘性、接着性、保水性、水溶性、耐水
性、弾性、強度などの物性や生理作用を調節することに
より、高分子化合物としてのより高機能な用途展開が可
能となる。
【００３８】また、本発明によりポリフェノール酸化作
用を有する酵素をアルカリｐＨ域においてフェノール性
化合物または芳香族アミン化合物を含有する廃水に作用
させることにより、廃水中のフェノール性化合物または
芳香族アミン化合物を高分子化し容易に濃縮できるよう
にして、高分子化したフェノール性化合物または芳香族
アミン化合物を廃水から分離・除去するという廃水処理
方法も可能である。このような利用法が特に有用な産業
分野とその反応基質としては、紙パルプ分野におけるリ
グニンもしくはリグニン誘導体、着色・染色分野におけ
るアゾ系、アンスラキノン系などの染料がある。こうし
た高分子化反応の後に、凝集剤の添加による凝集沈殿処
理や活性炭処理、ろ過処理を行うことで効率よく廃水中
のフェノール性化合物または芳香族アミン化合物を廃水
から濃縮し分離・除去することが可能である。
【００３９】また、本発明によりポリフェノール酸化作
用を有する酵素をアルカリｐＨ域においてフェノール性
化合物または芳香族アミン化合物に作用させ、溶存する
酸素を消費せしめることを利用した脱酸素法あるいは脱
酸素剤の製造も可能である。こうした脱酸素法及び脱酸
素剤においては、天然もしくは非天然の多くのフェノー
ル性化合物または芳香族アミン化合物が利用可能であ
り、溶存酸素濃度を急速に低減化することができ極めて
有用である。
【００４０】また、本発明によりポリフェノール酸化作
用を有する酵素を、フェノール性化合物または芳香族ア
ミン化合物と共に木材に含浸させ、フェノール性化合物
または芳香族アミン化合物、さらには木材中に既に含ま
れているリグニンなどのポリフェノール化合物を木材中
で高分子化することにより、木材含浸処理後の乾燥工程
での作業性の向上、木材蒸煮処理あるいは高温蒸気注入
処理によるリグニン分解で低下した木材強度の向上、乾
燥時あるいは凍結時の木材割れを防止する作用の向上、
木材中の嫌気性環境の維持・向上による微生物の繁殖抑
制が可能となる。
【００４１】また、本発明により、ポリフェノール酸化
酵素が作用できる染料あるいは染料前駆体とポリフェノ
ール酸化酵素を木材に作用させることにより、木材中で
着色物質を生成すること、あるいは着色物質と木材中に
既に含まれているリグニンなどのポリフェノール化合物
を木材中で複合高分子化することが可能となるため、木
材をより強固に染色・着色処理することができる。な
お、上記の木材染色・着色処理において、多くのポリフ
ェノール酸化酵素は木材中の着色物質であるリグニンを
漂白することが知られており、本発明の木材染色・着色
処理は、酵素的な漂白と染色・着色処理を同時に行うこ
とができるため、工程の短縮、色調の向上が図られ極め
て有用である。
【００４２】また、本発明によりポリフェノール酸化作
用を有する酵素を、フェノール性化合物または芳香族ア
ミン化合物と共にコンクリートに添加し、フェノール性
化合物または芳香族アミン化合物をコンクリート中で高
分子化することにより、スランプロスの改善、コンクリ
ート強度の向上、コンクリート中の酸素濃度の低下によ
る鉄筋のサビ抑制が可能である。
【００４３】
【実施例】以下に本発明について代表的な例を示し、さ
らに具体的に説明する。ただし、これらは単なる例示で
あり、本発明はこれらのみに限られるものではない。な
お、以下の例においては高分子化したフェノール性化合
物または芳香族アミン化合物の分子量分析は、溶離液と
して５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ7.0）
もしくは0.1ｍＭの硫酸ナトリウム水溶液、検出器とし
てShodex ＲＩ（示差屈折率検出器）を用い、さらには
カラムとして、Shodex PROTEIN KW-802.5（２連）、も
しくはShodex PROTEIN KW802.5とShodex OHpak SB-804H
Qを結したものを用いるＨＰＬＣによって行った。
【００４４】実施例１：培養及び粗精製、濃縮 ５００ｍｌ容のフラスコを培養装置に用い、0.134％Ｎ
ａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、0.03％ＫＨ2ＰＯ4、１％マル
トース、１％ペプトン、0.1％酵母エキス、0.05％Ｍｇ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、0.1ｍＭ ＣｕＳＯ4、１ｍＭ ＭｎＣ
ｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2を含む１００ｍｌの培地に２０
％Ｎａ2ＣＯ3を加えてｐＨを7.8としたものに、バチル
ス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ＳＤ３
００３（受託番号FERM P-15383）を接種し、５０℃、１
６時間の振とう培養後、培養温度を３５℃に下げ、さら
に３日間の培養を行った。培養後、４℃での遠心分離に
より除菌された培養ブロスを得た。これをさらに精製、
濃縮するためには硫安分画が有効で、２０〜６０％飽和
硫安濃度において大部分のポリフェノールオキシダーゼ
活性を沈澱として回収することができた。得られた硫安
沈澱は１０ｍＭビス・トリスＨＣｌバッファー溶液（ｐ
Ｈ7.0）に対して透析を行い、さらに精製、濃縮するた
めに限外ろ過膜を用い、分子量10,000〜100,000の画範
囲に粗精製濃縮水溶液（0.8Ｕ／ｍｌ）を得た。
【００４５】実施例２：培養及び濃縮 0.5％グルコース及び0.1％ＮａＮＯ3、1.34％Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4１２Ｈ2Ｏ、0.3％ＫＨ2ＰＯ4、0.1％ＮａＣｌ、0.2
％ペプトン、２０ｐｐｍ酵母エキス、0.01％ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ、0.1ｍＭ ＣｕＳＯ4からなる３リッターの
培地に１０％ＮａＯＨを加えてｐＨを８としたものを含
む培養槽にミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium
verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-14955）を
接種し、２８℃、３日間の振とう培養を行った。培養
後、４℃での遠心分離により除菌された培養ブロス2.5
リッターを得た。次に、この培養ブロスの一部を、ミニ
タン・フィルターパケット（CAT.NO.: PTGC0MP04，ミリ
ポア社製）を用いるミニタン限外ろ過システム（ミリポ
ア社製）によって、分子量10,000以上の画分として濃縮
した。これをさらに、２００ｐｐｍ ＮＨ4ＨＣＯ3に対
して透析後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結乾燥物と
して得た。凍結乾燥物のポリフェノールオキシダーゼ活
性は１５Ｕ／ｍｇであった。なお、この凍結乾燥物の水
溶液は、銅含有蛋白質に特有の６００ｎｍ付近での吸収
極大を示した。
【００４６】実施例３：培養及び濃縮 0.5％グルコース及び0.1％ＮａＮＯ3、1.34％Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4・１２Ｈ2Ｏ、0.3％ＫＨ2ＰＯ4、0.1％ＮａＣｌ、0.
2％ペプトン、２０ｐｐｍ酵母エキス、0.01％ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ、0.1ｍＭ ＣｕＳＯ4からなる３リッターの
培地に１０％ＮａＯＨを加えてｐＨを８としたものを含
む培養槽に、ミロセシウム・ロリダム（Myrothecium ro
ridum）ＳＤ３００２（受託番号FERM P-15255）を接種
し、２８℃、３日間の振とう培養を行った。培養後、４
℃での遠心分離により除菌された培養ブロス2.5リッタ
ーを得た。次に、この培養ブロスの一部を、ミニタン・
フィルターパケット（CAT.NO.: PTGC0MP04，ミリポア社
製）を用いるミニタン限外ろ過システム（ミリポア社
製）によって、分子量10,000以上の画分として濃縮し
た。これをさらに、２００ｐｐｍＮＨ4ＨＣＯ3に対して
透析後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結乾燥物として
得た。凍結乾燥物のポリフェノールオキシダーゼ活性は
１０Ｕ／ｍｇであった。なお、この凍結乾燥物の水溶液
は、銅含有蛋白質に特有の６００ｎｍ付近での吸収極大
を示した。
【００４７】実施例４：高分子化反応 実施例１記載の粗精製濃縮水溶液を用いて以下の［４−
１］から［４−３］の高分子化反応を、市販のポリフェ
ノールオキシダーゼ（タカラ（TaKaRa）から入手）を用
いて４−４の高分子化反応を行った。
【００４８】［４−１］：リグニンスルホン酸ナトリウ
ム塩（アルドリッチ・ケミカル・カンパニ（Aldrich Ch
emical Company,Inc.）から入手）を２０％（Ｗ／
Ｖ）、ポリフェノール酸化酵素として粗精製濃縮水溶液
を３００Ｕ／リッターの活性濃度で含有する反応液１ｍ
ｌを調製し、ガラス試験管において、反応温度７０℃、
１００ｒｐｍの振とうを行い反応を実施した。反応液の
ｐＨは微量の硫酸により7.5に調整した。反応開始後、
直ちに反応液の色調は濃くなり、６時間後には顕著な高
分子化の進行が認められ、２０時間後には反応液の大部
分が固化した。
【００４９】［４−２］：また、ポリフェノール酸化酵
素の活性濃度を６０Ｕ／リッターに変えて反応を行った
場合は、反応開始後２０時間では反応液全体が粘性の高
い液状を呈し、粘度の上昇と共に分子量が増大し、さら
に２０時間の反応継続後には、部分的な固化が認められ
た。なお、分子量分析用サンプルは、反応液の一部を抜
き取り、水浴中で約１００℃、１５分間の加熱処理を行
い、反応を停止することで調製した。
【００５０】［４−３］：また、リグニンスルホン酸の
替わりにリグニン（アルカリ）（nacalai tesqueから入
手）を２０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で用い、３００Ｕ／リッ
ターのポリフェノール酸化酵素の活性濃度、ｐＨ7.5で
反応を実施したところ、反応開始の２４時間後には反応
液全体が粘性の高い液状を呈した。
【００５１】［４−４］：なお、リグニンスルホン酸ナ
トリウム塩を２０％（Ｗ／Ｖ）、ポリフェノール酸化酵
素として市販のポリフェノールオキシダーゼを３００Ｕ
／リッターの活性濃度で含有する反応液１００ｍｌを調
製し、５００ｍｌ容フラスコにおいて、反応温度２５
℃、１００ｒｐｍの振とうを行い反応を実施した。ここ
で用いた市販のポリフェノールオキシダーゼは、シリン
ガルダジンを用いる活性測定で、ｐＨ６〜７に至適反応
ｐＨを有する酸性酵素であることが示されたため、高分
子化反応での反応液のｐＨは少量の硫酸を用いて6.5に
調整した。反応開始後、直ちに反応液の色調は濃くなっ
たが、反応液の大部分が固化するためには、約８０時間
の反応時間を要した。
【００５２】実施例５：高分子化反応 実施例２記載の凍結乾燥物を用いて以下の［５−１］か
ら［５−３］の高分子化反応を行った。
【００５３】［５−１］：リグニンスルホン酸ナトリウ
ム塩を２０％（Ｗ／Ｖ）、ポリフェノール酸化酵素とし
て凍結乾燥物を２０ｐｐｍ（３００Ｕ／リッター）の濃
度で含有する反応液１００ｍｌを調製し、５００ｍｌ容
フラスコにおいて、反応温度２５℃、１００ｒｐｍの振
とうを行い反応を実施した。反応液のｐＨはＮａＯＨを
用いて９に調整した。反応開始後、直ちに反応液の色調
は濃くなり、３時間後には顕著な高分子化の進行が認め
られ、１０時間後には反応液の大部分が固化した。ま
た、ポリフェノール酸化酵素の添加量を４ｐｐｍに変え
て反応を行った場合は、反応開始後２０時間では反応液
全体が粘性の高い液状を呈し、さらに２０時間の反応継
続後には、部分的な固化が認められた。なお、分子量分
析用サンプルは、反応液の一部を抜き取り、水浴中で９
０℃、５分間の加熱処理を行い、反応を停止することで
調製した。
【００５４】［５−２］：また、リグニンスルホン酸の
替わりにリグニン（アルカリ）を２０％（Ｗ／Ｖ）の濃
度で用い、３００Ｕ／リッターのポリフェノール酸化酵
素の活性濃度、ｐＨ９、反応温度２５℃で反応を実施し
た。反応開始後、直ちに反応液の色調は濃くなり、高分
子化反応が進行し、２４時間後には反応液の大部分が固
化した。
【００５５】［５−３］：なお、リグニンスルホン酸ナ
トリウム塩を２０％（Ｗ／Ｖ）、３００Ｕ／リッターの
ポリフェノール酸化酵素の活性濃度で、反応液のｐＨを
少量の硫酸を用いて７に調整し、反応温度２５℃で反応
を実施した。反応開始後、直ちに反応液の色調は濃くな
ったが、反応液の固化は認められなかった。
【００５６】実施例６：高分子化反応 実施例３記載の凍結乾燥物を用いて以下の［６−１］か
ら［６−２］の高分子化反応を行った。
【００５７】［６−１］：リグニンスルホン酸ナトリウ
ム塩を２０％（Ｗ／Ｖ）、ポリフェノール酸化酵素とし
て凍結乾燥物を３０ｐｐｍ（３００Ｕ／リッター）の濃
度で含有する反応液１００ｍｌを調製し、５００ｍｌ容
フラスコにおいて、反応温度２５℃、１００ｒｐｍの振
とうを行い反応を実施した。反応液のｐＨはＮａＯＨを
用いて９に調整した。反応開始後、直ちに反応液の色調
は濃くなり、３時間後には顕著な高分子化の進行が認め
られ、１０時間後には反応液の大部分が固化した。
【００５８】［６−２］：また、リグニンスルホン酸の
替わりにリグニン（アルカリ）を２０％（Ｗ／Ｖ）の濃
度で用い、３００Ｕ／リッターのポリフェノール酸化酵
素の活性濃度、ｐＨ９、反応温度２５℃で反応を実施し
た。反応開始後、直ちに反応液の色調は濃くなり、２４
時間後には反応液の大部分が固化した。
【００５９】実施例７：高分子化反応 リグニンスルホン酸ナトリウム塩を２０％（Ｗ／Ｖ）、
ポリフェノール酸化酵素として市販のビリルビンオキシ
ダーゼ（凍結乾燥物）（シグマ（Sigma）社から入手）
を３００Ｕ／リッターの濃度で含有する反応液１００ｍ
ｌを調製し、５００ｍｌ容フラスコにおいて、反応温度
２５℃、１００ｒｐｍの振とうを行い反応を実施した。
ここで用いた市販のビリルビンオキシダーゼは、シリン
ガルダジンを用いる活性測定で、ｐＨ８〜９に至適反応
ｐＨを有する酵素であることが示されたため、高分子化
反応での反応液のｐＨは無調整でのｐＨ8.5でそのまま
実施した。反応開始後、直ちに反応液の色調は濃くな
り、８時間後には顕著な高分子化の進行が認められ、２
４時間後には反応液の大部分が固化した。また、リグニ
ンスルホン酸の替わりにリグニン（アルカリ）を２０％
（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、ｐＨ8.5で反応を実施した
ところ、反応開始の５０時間後には反応液の大部分が固
化した。
【００６０】実施例８：抗菌性 実施例５の［５−１］に記載の高分子化反応と同様の反
応を行うことで得た固形（ゲル状）リグニンスルホン酸
を、さらに小片（１０ｍｍ×１０ｍｍ×３ｍｍ）にスラ
イスしたものを、Ｌアガー・プレートの中央に置き、さ
らにアスペルギルス・オリゼＡＨＵ７１３４（Aspergil
lus oryzae AHU7134）の胞子をプレートの培地面全体に
加え、２８℃で４日間の培養を行ったところ、リグニン
スルホン酸の小片上部および周辺約２ｍｍの範囲内での
菌の生育阻止を認め、抗菌剤として有用であることが示
された。
【００６１】実施例９：抗菌性 ２０％（Ｗ／Ｖ）のリグニンスルホン酸ナトリウム塩の
水溶液に、ヒノキチオール（東京化成工業（株）から入
手）を２００ｐｐｍ相当で添加し、９０℃での加温によ
りヒノキチオールを融解し、さらにボルテックス・ミキ
サーによりヒノキチオールを懸濁させた後、２５℃に冷
却した。こうして得た高分子化反応の原料に、ポリフェ
ノール酸化酵素として実施例２記載の凍結乾燥物を３０
０Ｕ／リッターの活性濃度で添加し、反応温度２５℃、
ｐＨ９で高分子化反応を行いヒノキチオール含有固形
（ゲル状）リグニンスルホン酸を得た。この固形物を小
片（１０ｍｍ×１０ｍｍ×３ｍｍ）にスライスしたもの
を、Ｌアガー・プレートの中央に置き、さらにアスペル
ギルス・オリゼＡＨＵ７１３４（Aspergillus oryzaeAH
U7134）の胞子をプレートの培地面全体に加え、２８℃
で４日間の培養を行ったところ、リグニンスルホン酸の
小片上部および周辺約１０ｍｍの範囲内での菌の生育阻
止を認め、抗菌剤及び抗菌物質保持剤として有用である
ことが示された。また、２０％（Ｗ／Ｖ）のリグニンス
ルホン酸ナトリウム塩の水溶液に、（＋）−カテキン・
Ｈ2Ｏ（Ｓｉｇｍａから入手）を5000ｐｐｍの濃度で添
加し、さらに、ポリフェノール酸化酵素として実施例２
記載の凍結乾燥物を３００Ｕ／リッターの活性濃度で添
加し、反応温度２５℃、ｐＨ９で高分子化反応を行いカ
テキン含有固形（ゲル状）リグニンスルホン酸を得た。
この固形物について、上記実施例と同様にして抗菌性を
みたところ、リグニンスルホン酸の小片上部および周辺
約８ｍｍの範囲内での菌の生育阻止を認め、抗菌剤及び
抗菌物質保持剤として有用であることが示された。
【００６２】実施例１０：コンクリート改質 リグニンスルホン酸ナトリウム塩を２０％（Ｗ／Ｖ）及
びアンスラキノン−２−スルホン酸を１％（Ｗ／Ｖ）、
ポリフェノール酸化酵素として実施例１記載の粗精製濃
縮水溶液を６０Ｕ／リッターの活性濃度で含有する反応
液を調製し、実施例４の［４−２］の記載の高分子化反
応と同様にして反応を行い、得られた水溶性の高分子物
を１／４０量（リグニンスルホン酸として最終濃度0.5
％重量）、砂率（Ｓ／Ａ）３６％重量、セメント４４０
ｇ／リッターで混和したとき、スランプ5.5ｃｍ、減水
率は16.8％であった。なお、高分子化反応を行っていな
いもので上記実施例と同様の試験を行った場合は、スラ
ンプ5.7ｃｍ、減水率12.5％であり、高分子化による減
水効果の向上を認めた。
【００６３】実施例１１：コンクリート改質 リグニンスルホン酸ナトリウム塩を２０％（Ｗ／Ｖ）及
びアンスラキノン−２−スルホン酸を１％（Ｗ／Ｖ）、
ポリフェノール酸化酵素として実施例２記載の凍結乾燥
物を４ｐｐｍの濃度で含有する反応液を調製し、実施例
５の［５−１］記載の高分子化反応と同様にして反応を
行い、得られた水溶性の高分子物を１／４０量（リグニ
ンスルホン酸として最終濃度0.5％重量）、砂率（Ｓ／
Ａ）３６％重量、セメント４４０ｇ／リッターで混和し
たとき、スランプ5.6ｃｍ、減水率は16.9％であった。
なお、高分子化反応を行っていないもので上記実施例と
同様の試験を行った場合は、スランプ5.4ｃｍ、減水率1
2.8％であり、高分子化による減水効果の向上を認め
た。
【００６４】実施例１２：土壌改質 ポリフェノール酸化酵素として実施例１記載の粗精製濃
縮水溶液を６０Ｕ／リッターの活性濃度で含有する反応
液を調製し、実施例４の［４−２］に記載の高分子化反
応と同様にして反応を行い、水溶性の高分子化リグニン
スルホン酸（２０％（Ｗ／Ｖ））を得、水で２倍に希釈
したものを調製した。なお、熱などによる高分子化反応
の停止操作は行わなかった。この高分子化リグニンスル
ホン酸水溶液3.0ｍｌもしくは水3.0ｍｌを、４０ｇ重量
の畑土壌を含む５０ｍｌ容のガラスビーカーにおいて、
土壌表面に噴霧し、２８℃でインキュベートし、乾燥に
よる重量の減少を測定した。６０時間後に、高分子化リ
グニンスルホン酸溶液を噴霧したものは約６ｇ、水を噴
霧したものは約１２ｇの重量の減少を示し、高分子化リ
グニンスルホン酸による保水性の向上が認められた。ま
た、高分子化リグニンスルホン酸溶液を噴霧したもので
は土壌表面の硬度の向上が認められ、土壌改質剤、種子
吹付表土安定剤として有用であることが示された。
【００６５】実施例１３：土壌改質 ポリフェノール酸化酵素として実施例２記載の凍結乾燥
物を４ｐｐｍの濃度で含有する反応液を調製し、実施例
５の［５−１］に記載の高分子化反応と同様にして反応
を行い、水溶性の高分子化リグニンスルホン酸（２０％
（Ｗ／Ｖ））を得、水で２倍に希釈したものを調製し
た。なお、熱などによる高分子化反応の停止操作は行わ
なかった。この高分子化リグニンスルホン酸水溶液3.0
ｍｌもしくは水3.0ｍｌを、４０ｇ重量の畑土壌を含む
５０ｍｌ容のガラスビーカーにおいて、土壌表面に噴霧
し、２８℃でインキュベートし、乾燥による重量の減少
を測定した。６０時間後に、高分子化リグニンスルホン
酸溶液を噴霧したものは約５ｇ、水を噴霧したものは約
１２ｇの重量の減少を示し、高分子化リグニンスルホン
酸による保水性の向上が認められた。また、高分子化リ
グニンスルホン酸溶液を噴霧したものでは土壌表面の硬
度の向上が認められ、土壌改質剤、種子吹付表土安定剤
として有用であることが示された。
【００６６】実施例１４：木材処理 ポリフェノール酸化酵素として実施例２記載の凍結乾燥
物を４ｐｐｍの濃度で含有する反応液を調製し、実施例
５の［５−１］に記載の高分子化反応と同様にして反応
を行い、水溶性の高分子化リグニンスルホン酸（２０％
（Ｗ／Ｖ））を得た。なお、熱などによる高分子化反応
の停止操作は行わなかった。この高分子水溶液を水で１
０倍に希釈した液を木材処理用薬剤とし、樹皮を除去し
た後、６０℃の0.1％ Tween 80水溶液中で１６時間処理
したスギの丸太（直径３ｃｍ、長さ２０ｃｍの生木）に
対して薬剤注入処理を行った。注入処理は７２０ｍｍＨ
ｇの減圧と１０ｋｇ／ｃｍ2の加圧を行うベセル法で行
った。高分子化を行っていないリグニンスルホン酸もし
くは高分子化リグニンスルホン酸のそれぞれで注入処理
した木材（各２本）を、白蟻の巣の周囲約２０ｃｍの土
壌上に設置し、２ヶ月間放置の後、薬剤処理による防蟻
効果を観察したところ、高分子化を行っていないリグニ
ンスルホン酸で処理した木材では僅かながら白蟻による
食害が見られたが、高分子化リグニンスルホン酸で処理
した木材では白蟻による食害は全く見られず、また、木
材表面の均質性（平滑性、つや）も維持されていた。
【００６７】実施例１５：木材処理 １％のｐ−フェニレンジアミン・二塩酸（関東化学
（株）から入手）水溶液を少量のＮａＯＨを用いてｐＨ
９に調製したものに、ポリフェノール酸化酵素として実
施例２記載の凍結乾燥物を0.2ｐｐｍの濃度で添加し、
直ちに、これをナラの板材に塗布した。着色反応は板の
表面及び内部（深さ〜約３ｍｍ）で速やかに進行し、黒
褐色に強固に着色された板材を得た。
【００６８】実施例１６：廃水処理 フェノール性化合物または芳香族アミン化合物を含有す
る廃水のモデルとして、１０ｍＭのｐ−フェニレンジア
ミン・二塩酸水溶液を用いた。この水溶液に、ポリフェ
ノール酸化酵素として実施例２記載の凍結乾燥物を２ｐ
ｐｍの濃度で添加した反応液１００ｍｌを調製し、ｐＨ
８の条件で５００ｍｌ容フラスコにおいて、反応温度２
５℃、６０ｒｐｍの振とうを行い高分子化反応を実施し
た。反応開始後、直ちに反応液の着色が始まり、１時間
後には酸化と高分子化の進行による顕著な着色と高分子
化合物の凝集が認められた。この反応液を、粉末セルロ
ースであるＫＣフロック（日本製紙（株）から入手）を
ろ材として約４０ｃｍ3の体積で含む簡易カラムに通液
したところ、ｐ−フェニレンジアミンに由来する高分子
化合物の大部分を水溶液からろ別することができた。な
お、ポリフェノール酸化酵素として、実施例２記載の凍
結乾燥物２ｐｐｍの替わりに実施例１記載の粗精製濃縮
水溶液を３０Ｕ／リッターの活性濃度で用い、他は上記
実施例と同様にしてｐ−フェニレンジアミンを処理した
ところ、同様に、ｐ−フェニレンジアミンに由来する高
分子化合物の大部分を水溶液からろ別することができ
た。
【００６９】実施例１７：脱酸素剤 フェノール性化合物として５０ｍＭのＬ−アスコルビン
酸・Ｎａを使用し、ｐＨ9.0、温度２５℃において、実
施例２記載の凍結乾燥物を４ｐｐｍの濃度で作用させ、
マノメータで酸素消費速度を測定したところ、反応開始
後１時間目の溶存酸素濃度は、反応開始時の0.05％に減
少しており、高い脱酸素能を有することが示された。な
お、実施例２記載の凍結乾燥物４ｐｐｍの替わりに実施
例１記載の粗精製濃縮水溶液を３０Ｕ／リッターの活性
濃度で用い、他は上記実施例と同様にして酸素消費速度
を測定したところ、反応開始後１時間目の溶存酸素濃度
は、反応開始時の0.2％に減少しており、同様に高い脱
酸素能を有することが示された。
【００７０】
【発明の効果】本発明によれば、フェノール性化合物ま
たは芳香族アミン化合物の効率のよい高分子化反応が達
成され、その高分子化合物を含む増粘剤、安定剤、凝集
剤、乳化剤、分散剤、保水剤、酸化防止剤、接着剤、コ
ンクリート混和剤、染色剤、塗料、石油回収剤、土壌改
質剤、種子吹付表土安定剤、脱臭剤、消臭剤、農薬展着
剤、飼料のバインダー、殺菌剤、抗菌剤、ウィルス感染
阻止剤、生物付着防止剤、生物忌避剤、殺虫剤、パップ
剤、インキ基剤または木材処理剤が効率よく提供され
る。
【００７１】また、本発明を利用することにより、フェ
ノール性化合物または芳香族アミン化合物を高分子化す
る工程を含む、増粘剤、安定剤、凝集剤、乳化剤、分散
剤、保水剤、酸化防止剤、接着剤、コンクリート混和
剤、染色剤、塗料、石油回収剤、土壌改質剤、種子吹付
表土安定剤、脱臭剤、消臭剤、農薬展着剤、飼料のバイ
ンダー、殺菌剤、抗菌剤、ウィルス感染阻止剤、生物付
着防止剤、生物忌避剤、殺虫剤、パップ剤、インキ基剤
または木材処理剤の効率のよい製造方法が提供される。
【００７２】さらに、本発明によれば、フェノール性化
合物または芳香族アミン化合物の高分子化反応を利用し
た廃水処理方法、脱酸素方法、木材処理方法、コンクリ
ート処理方法及び土壌処理方法が提供される。また、本
発明で用いるバチルス・リケニホルミス（Bacillus lic
heniformis）ＳＤ３００３、ミロセシウム・ヴェルカリ
ア（Myrothecium verrucaria）ＳＤ３００１、ミロセシ
ウム・ロリダム（Myrothecium roridum）ＳＤ３００２
は本発明の高分子化物の製造に特に有用である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 13/00 Ａ６１Ｋ 31/765 // Ａ６１Ｋ 31/765 Ｃ０８Ｇ 83/00 Ｃ０８Ｇ 83/00 (Ｃ１２Ｐ 7/22 (Ｃ１２Ｐ 7/22 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ０９Ｋ 101:00 Ｃ０９Ｋ 101:00 Ｂ０９Ｂ 3/00 Ｅ (56)参考文献 特開 平11−299482（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−299483（ＪＰ，Ａ) 特表 平９−503126（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−511943（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 3/00 - 11/00 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothec
    ium verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-1495
    5）またはミロセシウム・ロリダム（Myrothecium rorid
    um）ＳＤ３００２（受託 番号FERM P-15255）を培養し
    て得られるポリフェノール酸化作用を有する酵素を、ア
    ルカリｐΗ域においてフェノール性化合物または芳香族
    アミン化合物に作用させ、これを高分子化することを特
    徴とする分子量の増大したフェノール性化合物または芳
    香族アミン化合物の製造方法。
  2. 【請求項２】 ｐＨ８以上のアルカリ域において高分子
    化することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  3. 【請求項３】 フェノール性化合物がリグニンもしくは
    リグニン誘導体である請求項１または２に記載の製造方
    法。
  4. 【請求項４】 リグニン誘導体がリグニンスルホン酸で
    ある請求項３に記載の製造方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリフェノール酸化作
    用を有する酵素を、アルカリｐＨ域においてフラボノイ
    ドに作用させ、これを高分子化することを特徴とする分
    子量の増大したフェノール性化合物の製造方法。
  6. 【請求項６】 キノン化合物、不飽和脂肪酸、不飽和ア
    ルコール、または不飽和アルキル化合物を、単独で、ま
    たは複数組み合わせて、フェノール性化合物または芳香
    族アミン化合物に添加し、請求項１に記載のポリフェノ
    ール酸化作用を有する酵素を、アルカリｐＨ域において
    フェノール性化合物または芳香族アミン化合物に作用さ
    せ、これを高分子化することを特徴とする分子量の増大
    したフェノール性化合物または芳香族アミン化合物の製
    造方法。
  7. 【請求項７】 抗菌性化合物、抗ウィルス性化合物、生
    物忌避化合物、殺虫性化合物もしくは金属イオンを共存
    させた状態で、請求項１に記載のポリフェノール酸化作
    用を有する酵素を、アルカリｐΗ域においてフェノール
    性化合物または芳香族アミン化合物に作用させ、これを
    高分子化することを特徴とする分子量の増大したフェノ
    ール性化合物または芳香族アミン化合物の製造方法。
  8. 【請求項８】 ０〜１００℃の温度で高分子化する請求
    項１乃至７のいずれかの項に記載の製造方法。
  9. 【請求項９】 請求項１乃至８のいずれかの項に記載の
    方法によって、廃水中のフェノール性化合物または芳香
    族アミン化合物を高分子化してこれを除去することを特
    徴とする廃水の処理方法。
  10. 【請求項１０】 フェノール性化合物または芳香族アミ
    ン化合物とミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium
    verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-14955）ま
    たはミロセシウム・ロリダム（Myrothecium roridum）
    ＳＤ３００２（受託番号FERM P-15255）を培養して得ら
    れるポリフェノール酸化作用を有する酵素とを含有する
    ことを特徴とする、アルカリｐΗ域で使用される脱酸素
    剤。
  11. 【請求項１１】 ミロセシウム・ヴェルカリア（Myroth
    ecium verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-149
    55）またはミロセシウム・ロリダム（Myrothecium rori
    dum）ＳＤ３００２（受託番号FERM P-15255）を培養し
    て得られるポリフェノール酸化作用を有する酵素を、フ
    ェノール性化合物または芳香族アミン化合物と共にコン
    クリートに添加し、フェノール性化合物または芳香族ア
    ミン化合物をコンクリート中で高分子化することを特徴
    とするコンクリート処理方法。
  12. 【請求項１２】 ミロセシウム・ヴェルカリア（Myroth
    ecium verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号FERM P-149
    55）またはミロセシウム・ロリダム（Myrothecium rori
    dum）ＳＤ３００２（受託番号FERM P-15255）を培養し
    て得られるポリフェノール酸化作用を有する酵素を、フ
    ェノール性化合物または芳香族アミン化合物と共に土壌
    中に添加し、フェノール性化合物または芳香族アミン化
    合物を土壌中で高分子化することを特徴とする土壌処理
    方法。
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