DE69731641T2

DE69731641T2 - Verfahren zur herstellung von verbindungen mit hohem molekulargewicht von phenolischen verbindungen usw. und anwendungen derselben

Info

Publication number: DE69731641T2
Application number: DE69731641T
Authority: DE
Inventors: Takashi Chiba-shi ECHIGO; Ritsuko Ohno
Original assignee: SDS Biotech Corp
Current assignee: SDS Biotech Corp
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2017-05-21
Also published as: CA2257551A1; NZ333147A; ATE282709T1; CN1078614C; CN1217752A; EP0919628B1; EP0919628A4; CN1312150A; CN1188258C; AU722571B2; US6190891B1; DE69731641D1; WO1997046694A1; AU2790897A; JP3320307B2; JPH09322784A; EP0919628A1; US20010007762A1; US6537546B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Schützen und Festigen von Holz durch Polymerisation von einer oder mehr phenolischen Verbindungen oder einer oder mehr aromatischen Aminverbindungen mit einem Enzym, das Aktivität zur Oxidation von Polyphenol hat.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Es ist bereits bekannt, dass phenolische Verbindungen usw. unter Verwendung eines Enzyms, wie Laccase oder Polyphenoloxidase, die durch Basidiomycotina oder Deuteromycotina produziert wird in Makromoleküle übergeführt werden können (Journal of Biotechnology, 13, 229–241, 1990 und so weiter). Jedoch haben die durch Fungi produzierten Laccasen oder Polyphenoloxidasen ihren optimalen Reaktions-pH im sauren Bereich, sodass die Reaktion in einem pH-Bereich von sauer bis neutral durchgeführt werden muss, um die Makromolekularisierungs-Reaktion unter Verwendung dieser Enzyme zu katalysieren oder beschleunigen und außerdem ist die Rate der Reaktion der Makromolekularisierung nicht hoch genug. Auch sind die natürlichen organischen Verbindungen, welche mit diesen Enzymen reagieren, hauptsächlich polyphenolische Verbindungen und daher muss die Reaktion in einem pH-Bereich im Gebiet von sauer bis neutral durchgeführt werden, weil der optimale Reaktions-pH des Enzyms im sauren Bereich ist, im Gegensatz zu der Tatsache, dass die polyphenolischen Verbindungen Löslichkeiten haben, die sich im pH-Bereich von sauer bis neutral vermindern, was zu dem Nachteil führt, dass es unmöglich ist, Polyphenol-Verbindungen in hohen Konzentrationen wirksam in Makromoleküle überzuführen. Obwohl die Autoxidation von vielen Polyphenol- Verbindungen im alkalischen pH-Bereich beschleunigt wird, wurde die enzymatische oxidative Makromolekularisierung im pH-Bereich von sauer bis neutral durchgeführt, was zu dem Nachteil führte, dass die Autoxidation nicht wirksam ausgenutzt werden kann.
Es ist außerdem bekannt, dass phenolische Verbindungen usw. auch mit Bilirubinoxidase in Makromoleküle übergeführt werden können und dass diese Reaktion zur Makromolekularisierung von Lignin und zum Färben von Baumwolle benutzt werden kann (WO95-01426 und JP-A-6-316874). Im Stand der Technik, bei dem Bilirubinoxidase verwendet wird, wird jedoch die Enzym-katalysierte Makromolekularisierung von phenolischen Verbindungen usw. in dem pH-Bereich von sauer bis neutral durchgeführt und daher ist die Rate der Makromolekularisierungs-Reaktion nicht hoch genug oder es gibt keine Beschreibung, die nahe legen würde, dass die Reaktion der Makromolekularisierung von phenolischen Verbindungen im alkalischen pH-Bereich durch Bilirubinoxidase beschleunigt wird.
GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Es ist Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zum Behandeln von Holz durch Ausnutzung einer Makromolekularisierungs-Reaktion von phenolischen Verbindungen oder aromatischen Aminverbindungen bereitzustellen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder haben intensive Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zur wirksamen Überführung von phenolischen Verbindungen oder aromatischen Aminverbindungen in Makromoleküle zu entwickeln. Im Ergebnis wurde nun gefunden, dass überraschenderweise die Verwendung eines geeigneten Enzyms mit Aktivität zur Oxidation von Polyphenol im alkalischen Bereich, speziell im alkalischen pH-Bereich von nicht weniger als pH 8 dazu führt, dass die wirksame Makromolekularisierung von phenolischen Verbindungen oder aromatischen Aminverbindungen erreicht wird, wodurch die Erfindung fertig gestellt wurde.
Demnach wird gemäß der vorliegenden Erfindung Folgendes bereitgestellt:

1. Ein Verfahren zum Schützen und Verstärken von Holz durch Polymerisation einer oder mehrerer Phenolverbindungen oder einer oder mehrerer aromatischer Aminverbindungen mit einem Enzym, das eine Polyphenol-oxidierende Aktivität aufweist, wobei das Verfahren umfasst, Imprägnieren von Holz mit einer Kombination, die ein Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität und ein oder mehrere phenolische Verbindungen oder ein oder mehrere aromatische Aminverbindungen aufweist, Polymerisieren lassen der einen oder mehreren phenolischen Verbindungen oder der einen oder mehreren aromatischen Aminverbindungen in dem Holz durch das Enzym bei einem alkalischen pH, und Gewinnen des geschützten und verstärkten Holzes.
2. Verfahren nach dem obigen Punkt 1, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme ist/sind, das/die aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, die aus Catecholoxidase, Laccase, Polyphenoloxidase, Ascorbinsäureoxidase und Bilirubinoxidase besteht.
3. Verfahren nach dem obigen Punkt 1, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren eines Bakteriums erhalten wird, welches zur Gattung Bacillus gehört.
4. Verfahren nach dem obigen Punkt 3, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Bacillus licheniformis oder Bacillus natto erhalten wird.
5. Verfahren nach dem obigen Punkt 4, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Bacillus licheniformis SD3003 (Zugangsnummer FERM BP-5801) erhalten wird.
6. Verfahren nach dem obigen Punkt 1, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren eines zur Gattung Myrothecium gehörenden Pilzes erhalten wird.
7. Verfahren nach dem obigen Punkt 6, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Myrothecium verrucaria oder Myrothecium roridum erhalten wird.
8. Verfahren nach dem obigen Punkt 7, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Myrothecium verrucaria SD 3001 (Zugangsnummer FERM BP-5520) oder Myrothecium roridum SD 3002 (Zugangsnummer FERM BP-5523) erhalten wird.
9. Verfahren nach einem der obigen Punkte 1 bis 8, wobei die Phenolverbindung Lignin oder Lignosulfonsäure ist.
10. Verfahren nach einem der obigen Punkte 1 bis 9, wobei das Holz mit einer Kombination imprägniert wird, die ein Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität, ein oder mehrere phenolische Verbindungen oder ein oder mehrere aromatische Aminverbindungen, sowie ein oder mehrere einer Chinonverbindung, einer ungesättigten Fettsäure, einem ungesättigten Alkohol und einer ungesättigten Alkylverbindung aufweist.
11. Verfahren nach einem der obigen Punkte 1 bis 9, wobei das Holz mit einer Kombination imprägniert wird, die ein Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität, ein oder mehrere phenolische Verbindungen oder ein oder mehrere aromatische Aminverbindungen, sowie ein physiologisch aktives Substrat aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer antimikrobiellen Verbindung, einer antiviralen Verbindung, einer Insektiziden Verbindung und einem biotischen Schutzmittel-Metallion besteht.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Polyphenoloxidase
Die erfindungsgemäß für die Makromolekularisierungs-Reaktion verwendeten Enzyme sind Enzyme mit Polyphenol-oxidierender Aktivität, die durch Kultivieren von Myrothecium verrucaria SD3001 (Zugangsnr. FERM BP-5520), Myrothecium roridum SD3002 (Zugangsnr. FERM BP-5523) oder eines Bakteriums des Genus Bacillus erhalten werden. Es kann jedoch jedes andere Enzym, dessen Aktivität der der oben erwähnten Enzyme äquivalent ist, verwendet werden. Beispiele für ein solches Enzym umfassen Polyphenoloxidasen, wie Catecholoxidase, Laccase, Polyphenoloxidase, Ascorbinsäureoxidase, Bilirubinoxidase, das durch Mikroorganismen, beispielsweise Fungi oder Bakterien oder durch Pflanzen gebildet wird. Neben diesen Enzymen kann für die Zwecke der Erfindung jedes Enzymprotein verwendet werden, das Polyphenol-oxidierende Aktivität bei alkalischen pH-Werten besitzt.
Als erfindungsgemäß zu verwendendes Enzym, das Polyphenol-oxidierende Aktivität im alkalischen pH-Bereich hat, sind Enzyme wünschenswert, deren optimaler Reaktions-pH für die Reaktion zur Oxidation von Polyphenol im alkalischen Bereich von nicht weniger als pH 7,5 liegt, um eine wirksame Makromolekularisierungs-Reaktion durchzuführen. Spezieller ist es wün schenswert, dass diese Enzyme einen optimalen Reaktions-pH im alkalischen Bereich von nicht weniger als pH 7,5 haben, wenn, wie nachstehend beschrieben wird, ihre Aktivität mit Syringaldazin bestimmt wird.
Beispiele für Mikroorganismen, welche die für die Zwecke der Erfindung geeigneten Enzyme produzieren, umfassen Folgende.
Als Pilze können Stämme genannt werden, die zu den Gattungen gehören, die unter Deuteromycotina fallen, d. h. Aspergillus, Botrytis, Myrothecium, Penicillium, Pestalotia, Rhizoctonia, Tricoderma, vorzugsweise Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea, Myrothecium roridum, Myrothecium verrucaria, Myrothecium prestonii, Myrothecium leucotrichum, Penicillium sclerotiorum, Penicillium janthinellum, Pestalotia palmarum, Rhizoctonia praticola, Tricoderma resii und Tricoderma viride. Besonders bevorzugt unter diesen sind Myrothecium verrucaria SD3001 (hinterlegt unter der Zugangsnr. FERM P-14955 bei dem Research Institute of Biotechnological & Industrial Science, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, at 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan, am 29. Mai 1995 und in eine internationale Hinterlegung unter der Zugangsnr. FERM BP-5520 am 24. April 1996 übergeführt) oder Myrothecium roridum SD3002 (hinterlegt unter der Zugangsnr. FERM P-15255 beim Research Institute of Biotechnological & Industrial Science, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, at 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan, am 29. Oktober 1995 und am 24. April 1996 in eine internationale Hinterlegung unter der Zugangsnr. FERM BP-5523 übergeführt).
Andere bevorzugte Pilze umfassen Stämme der Gattungen, die unter Basidiomycotina fallen, d. h., Pleurotus, Lentinus, Schizophyllum, Armillariella, Flammulina, Agaricus, Coprinus, Phanerochaete, Phlebia, Lenzites, Melanoleuca, Pholiota, Stereumu, Polyporus, Polyporellus, Microporus, Fomitopsis, Pycnoporus, Trametes, Coriolus, Daedaleopsis, Rigidoporus, Fomes, Ganoderma, Trachyderma, Hymenochaete und Inonotus, vorzugsweise Pleurotus cornucopiae, Pleurotus osteratus, Lentinus edodes, Schizophyllum commune, Armillariella mellea, Flammulina velutipes, Agaricus bisporus, Coprinus comatus, Coprinus cinereus, Coprinus congregatus, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Lenzites betulina, Melanoleuca verrucipes, Pholiota nameko, Stereumu hirsutum, Polyporus squamosus, Polyporellus badius, Microporus flabelliformis, Fomitopsis pinicola, Pycnoporus coccineus, Trametes orientalis, Coriolus versicolor, Coriolus hirsutus, Daedaleopsis tricolor, Rigidoporus zonalis, Fomes fomentarius, Ganoderma lucidum, Trachyderma tsunodae, Hymenochaete rubiginosa und Inonotus mikadoi.
Andere bevorzugte Pilze umfassen Stämme, die zu den Gattungen gehören, die unter Ascomycotina fallen, d. h., Podospora, Neurospora und Monocillium, vorzugsweise Podospora anserina, Neurospora crassa und Monocillium indicum.
Bevorzugte Bakterien umfassen Stämme von Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus natto, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus und Bacillus subtilis, vorzugsweise Bacillus licheniformis und Bacillus. Besonders bevorzugt unter diesen wird Bacillus licheniformis SD3003 (hinterlegt unter der Zugangsnr. FERM P-15383 bei dem Research Institute of Biotechnological & Industrial Science, Institute of Industrial Science und Technology, Ministry of International Trade und Industry, at 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan, am 28. Dezember 1995 und in eine internationale Hinterlegung unter der Zugangsnr. FERM BP-5801 am 28. Januar 1997 umgewandelt).
Andere bevorzugte Bakterien umfassen Stämme der Gattungen Azospirillum, vorzugsweise Azospirillum lipoferum und Stämme der Gattungen die unter Actinomycetales fallen, beispielsweise Streptomyces, vorzugsweise Streptomyces antibioticus oder Aerobacter, vorzugsweise Aerobacter aerogenes.
Einige bevorzugte Pflanzen, die erfindungsgemäß verwendete Enzyme enthalten, umfassen Acer pseudoplatanum, Dioscorea, Abelmoschus, Psidium, Helianthus, Kartoffel, Apfel, Kürbis, Gurke, Weizen, Alfalfa, usw.
Herstellung der Enzyme
Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme können durch Kultivieren von Stämmen erhalten werden, die zu den vorstehend beschriebenen Mikroorganismen gehören, beispielsweise Fungi oder Bakterien und Varianten dieser. Außerdem können sie auch unter Verwendung von gentechnisch erhaltenen Mikroorganismen hergestellt werden. Das heißt, das Enzym kann hergestellt werden, indem unter Bedingungen, welche die Expression von Enzymproteinen ermöglichen, Wirtszellen, die einen DNA-Vektor enthalten, der ein Replikations-Initiatorcodon für die Replikation eines Vektors in dem Wirtsorganismus aufweist, wobei in den Vektor eine DNA-Sequenz, die für das vorstehend beschriebene Enzymprotein kodiert, zusammen mit geeigneten Promoter-, Operator- und Terminator-DNA-Sequenzen mit der Funktion zur Enzymexpression in dem Wirtsorganismus eingefügt werden oder Wirtszellen kultiviert werden, die transformiert wurden, indem in die DNA der Wirtszelle eine DNA-Sequenz, welche für das vorstehend beschriebene Enzym kodiert, zusammen mit geeigneten Promoter-, Operator- und Terminator-DNA-Sequenzen mit der Funktion zur Expression eines Enzyms in dem Wirtsorganismus eingefügt wurden, wonach das Enzymprotein aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
Die DNA-Fragmente, die für das erfindungsgemäße Enzymprotein kodieren, können mit Hilfe von konventionellen Verfahren erhalten werden, wie einem Verfahren, bei dem cDNA oder eine Genombibliothek aus einem Stamm, der zu den oben beschriebenen Mikroorganismen gehört, zum Beispiel zu Pilzen oder Bakterien, als Isolationsquelle verwendet wird und ein Ziel-DNA-Fragment unter Verwendung als Sonde identifiziert wird, die ein Oligonukleotid ist, das auf Basis der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzymproteins synthetisiert wurde, oder nach einem Verfahren, bei dem ein Klon selektiert wird, der ein Protein produziert, das mit einem Antikörper gegen das vorstehend beschriebene Enzymprotein reagiert.
Es ist möglich, das erfindungsgemäße Enzymprotein durch Extraktion aus den Samen, Früchten, Blättern oder dergleichen der vorstehend beschriebenen Pflanzen herzustellen.
Außerdem kann bei der Kultivierung der Stämme, die zu Pilzen oder Bakterien und Varianten dieser gehören, zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzymproteins synthetisches Medium und Nährmedium eingesetzt werden, das organische Kohlenstoffquellen und organische Stickstoffquellen enthält, die üblicherweise verwendet werden. Im Fall der Kultivierung ist es wünschenswert, dass Cu²⁺-Ionen in Mengen von 0,001 mM bis 10 mM, vorzugsweise 0,01 mM bis 1 mM, als Metallsalz zugesetzt werden.
Wenn die erfindungsgemäße Polyphenoloxidase aus den Zellen der Pilze oder Bakterien nach außen abgeschieden wird, kann sie mit Hilfe einer gut bekannten Methode aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Das Gewinnungsverfahren umfasst eine Reihe von Verfahrensschritten, wie das Entfernen der Zellen aus dem Kulturmedium durch Zentrifugieren, Filtration oder Membrantrennung und Chromatografie, beispielsweise Ionenaustauschchromatografie. Auch die Membrankonzentration mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran wird wirksam angewendet. Wenn es innerhalb der Zellen der Pilze oder Bakterien angereichert wird oder wenn es im Innern der Pflanzengewebe vorliegt, kann das Enzymprotein aus den Mikrobenzellen oder Pflanzengeweben mit Hilfe einer gut bekannten Methode gewonnen werden. Das Gewinnungsverfahren umfasst eine Serie von Verfahrensschritten, wie mechanisches Zerreißen des Gewebes durch Homogenisierung, Isolierung und Extraktion einer Lösung eines Enzymproteins durch Zentrifugieren, Filtration oder Membrantrennung und Chromatografie, beispielsweise Ionenaustauschchromatografie. Auch die Membrankonzentration mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmethode wird wirksam angewendet.
Methode zur Messung der Aktivität
Erfindungsgemäß erfolgte die Messung der Polyphenol-oxidierenden Aktivität des Enzymproteins mit Polyphenol-oxidierender Aktivität, indem die Reaktion in einer wässerigen Lösung, die 20 ppm Syringaldazin und 100 mM Tris-HCl-Puffer oder Kaliumphosphatpuffer enthielt, bei einem optimalen Reaktions-pH und bei 20°C durchgeführt wurde und die Absorption bei 525 nm gemessen wurde. Die Aktivität, bei der 1 p Mol/Minute Syringaldazin oxidiert wird, wurde als 1 Einheit definiert (nachstehend als "U" abgekürzt).
Methode der Makromolekularisierung und ihre Anwendung
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Phenolverbindungen oder aromatischen Aminverbindungen mit erhöhten Molekulargewichten beträgt die Konzentration der Phenolverbindungen oder aromatischen Aminverbindungen 0,01 bis 90%, vorzugsweise 1 bis 80%. Die Reaktionstemperatur ist 0 bis 150°C, vorzugsweise 0 bis 100°C. Außerdem beträgt der Reaktions-pH 7,0 bis 12, vorzugsweise 7,5 bis 10. Die Aktivitäts-Konzentration des zu verwendenden Enzyms beträgt 1 bis 10.000 U/Liter, vorzugsweise 10 bis 2.000 U/Liter. Es ist wünschens wert, dass die Aktivitäts-Konzentration des Enzyms in Abhängigkeit von dem Zweck eingestellt wird. Das heißt, wenn vorgesehen ist, dass eine raschere Herstellung von Makromolekülen und Gelierung oder Verfestigung erreicht werden soll, wird die Reaktion bei höheren Aktivitätskonzentrationen durchgeführt. Wenn andererseits die Reaktion bei niedrigeren Aktivitäts-Konzentrationen vorgenommen wird, erfolgt eine mildere Makromolekularisierung, was zu einer homogeneren Makromolekül-Lösung als flüssige Substanz führt und wenn die Reaktion weiter fortgesetzt wird, schreitet in dem Reaktionsgemisch eine milde Gelierungsreaktion fort. Wenn ein geeigneter Grad der Makromolekularisierung erreicht ist, kann die Reaktion durch Zugabe von Alkali oder Alkalisalzen, wie NaOH, NH₃, Na₂CO₃ und CaCO₃, Zugabe von Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, Zugabe von bekannten Enzyminhibitoren oder durch Wärmebehandlung, wie eine solche bei 100°C während 15 Minuten, beendet werden.
Die gelierten Phenolverbindungen oder aromatischen Aminverbindungen können gegebenenfalls durch Erhitzen auf 50 bis 230°C erneut geschmolzen werden. Es ist auch möglich, Phenolverbindungen oder aromatische Aminverbindungen mit sehr hohen Molekulargewichten in Form einer Lösung zu erhalten, indem heißes Wasser oder dergleichen zugesetzt wird, nachdem diese heiß geschmolzen wurden, um die obigen Verbindungen zu dispergieren oder zu lösen.
Um die thermische Härtung zu beschleunigen ist es außerdem möglich, Polyole, wie Furfurylalkohol, Zucker und dergleichen zuzusetzen. Um zu bewirken, dass eine physiologisch aktive Substanz in der makromolekularen Verbindung enthalten ist und so eine immobilisierte physiologisch aktive Substanz oder eine Substanz, mit geregelter Freisetzung einer physiologisch aktiven Substanz zu erhalten, ist es auch möglich, die Makromolekularisierung in Gegenwart einer antimikrobiellen Verbindung, antiviralen Verbindung, einer als Biorepellent wirksamen Verbindung, einer insektiziden Verbindung oder eines Metallions durchzuführen oder nach der Makromolekularisierung eine antimikrobielle Verbindung, antivirale Verbindung, eine als Biorepellent wirkende Verbindung, eine insektizide Verbindung oder ein Metallion zuzugeben. Als antimikrobielle Verbindung, antivirale Verbindung, Biorepellent, insektizide Verbindung oder Metallion, die für diesen Zweck verwendet werden, können zahlreiche bereits bekannte Substanzen verwendet werden.
Für die erfindungsgemäß angewendete Makromolekularisierungs-Reaktion wird als Oxidationskatalysator ein Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität und als Oxidationsmittel Luftsauerstoff verwendet. Wenn außerdem die Herstellung einer großen Menge an Makromolekülen betrachtet wird, sind Verfahrensschritte, wie das mechanische Rühren des Reaktionsgemisches und Zugabe von Sauerstoff oder Luft zu dem Reaktionssystem wirksam. Es ist außerdem möglich, die erfindungsgemäße Reaktion, bei der Sauerstoff als Oxidationsmittel verwendet wird und die Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel verwendet wird, gleichzeitig unter Zugabe von Peroxidase und Wasserstoffperoxid zu dem Reaktionsgemisch durchzuführen oder anstelle von Wasserstoffperoxid eine Oxidase, die Wasserstoffperoxid bilden kann, und ein Substrat dafür zu verwenden.
Phenolverbindungen oder aromatische Aminverbindungen
Als Phenolverbindungen oder aromatische Aminverbindungen, die erfindungsgemäß in Makromoleküle überführt werden sollen, können beliebige Verbindungen eingesetzt werden, sofern das erfindungsgemäß verwendete Enzym sie oxidieren kann.
Spezifische Beispiele für solche Phenolverbindungen oder aromatische Aminverbindungen umfassen Lignin, Lignosul fonsäure, Huminsäure, Nitrohuminsäure, Tannin, Catechin, Gallensäure, Urushiol, Hesperidin, Chlorogensäure, Hinokitiol, Brenzcatechin, Hydrochinon, t-Butylhydrochinon, Phenylhydrochinon, Trimethylhydrochinon, Ethyl-3,4-dihydroxyzimtsäure, Pyrogallol, Laurylgallat, Octylgallat, Syringasäure, Ferulasäure, Vanillin, o-Vanillin, Vanillinsäure, Vanillylalkohol, Ascorbinsäure, 1,2-Dihydroxynaphthalin, 2,3-Dihydroxynaphthalin, 6,7-Dihydroxy-2-naphthalinsulfonsäure, Anthrarobin, Alizarin, Chinizarin, o-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, 3,4-Diaminobenzophenon, o-Anisidin, p-Anisidin, o-Aminophenol, p-Aminophenol, 1,2-Diaminoanthrachinon und 1,4-Diaminoanthrachinon.
Auch andere Verbindungen als diese können als Ausgangsmaterial für Makromoleküle oder als Katalysator für die Makromolekularisierungs-Reaktion verwendet werden, sofern diese Verbindungen Substanzen sind, welche das erfindungsgemäß verwendete Enzym oxidieren kann. Beispiele für solche Verbindungen umfassen ABTS (2,2'-Azobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)), Bilirubin, Isoascorbinsäure, Quercetin, Rutin, Guaiacol, 4-Methoxyphenol, Bisphenol, 4,4'-Ethylen-dianilin, Methylhydrochinon, 1-Hydroxybenzotriazol, 6-Hydroxy-2,4,5-triaminopyrimidin, 4,5,6-Triaminopyrimidin, 2,3-Dihydroxypyridazin, 3,6-Dihydroxypyridazin, 2,3-Dihydroxypyridin, 4-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure, Methyl-4-hydroxy-3-methoxybenzoat, 4,5-Diamino-6-hydroxy-2-mercaptopyrimidin, 2,3-Diaminopyridin, 2,5-Dihydroxy-1,4-benzochinon, 2,5-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxy-3-cyclobuten-1,2-dion, 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanin, 2-Amino-3-hydroxypyridin, 3-Amino-2-methoxydibenzofuran, 2,4-Dimethoxyanilin, 2,5-Dimethoxyanilin, 3,4-Dimethoxyanilin, 2',5'-Dimethoxyacetophenon, 3',4'-Dimethoxyacetophenon, 1,4-Dimethoxybenzol, Veratrol, 2,3-Dimethoxybenzoesäure, 2,5-Dimethoxybenzoesäure, Veratriumsäure, 3,4-Dimethoxybenzylalkohol, 3,4-Dimethoxyphenethylamin, (3,4-Dimethoxyphenyl)-essigsäure, (3,4-Dimethoxy phenyl)-acetonitril, 4-Allyl-2-methoxyphenol, 2-Methoxy-4-propenylphenol, 2-Methoxy-5-methylanilin, 2-Methoxy-5-nitroanilin, 4-Methoxy-2-nitroanilin, 3-Methoxysalicylsäure, 3-Methylcatechol, 4-Methylcatechol, Methylgallat, Propylgallat, 3,4,5-Trimethoxyanilin, 3,4,5-Trimethoxyphenol, Tropolon, Purpurogallin, Salicylaldoxim, 3-Amino-5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthol, 1,5-Dihydroxynaphthalin, 3,5-Dihydroxy-2-naphthoesäure, 4-Hydroxy-1-naphthalinsulfonsäure, Purpurin, 2,3-Dihydro-9,10-dihydroxy-1,4-anthracendion und verschiedene Azofarbstoffe.
Um die physikalischen Eigenschaften der Makromoleküle zu regeln, ist es auch möglich, mehrere solche Phenolverbindungen oder aromatische Aminverbindungen in Kombination einzusetzen.
Bei der erfindungsgemäßen Herstellung von makromolekularisierten Phenolverbindungen oder aromatischen Aminverbindungen können gleichzeitig Chinonverbindungen vorliegen, die nach einem ähnlichen Reaktionsweg makromolekularisiert werden können. Beispiele für solche Chinonverbindungen umfassen Anthrachinon-2-sulfonsäure, Anthrachinon-1,5-disulfonsäure, Anthrachinon-2,6-disulfonsäure, Anthrachinon-2-carbonsäure, 1-Aminoanthrachinon, 2-Aminoanthrachinon, Anthrarufin, Aminonaphthochinon, 1,8-Dihydroxyanthrachinon, Kampferchinon, Dehydroascorbinsäure, 2-Hydroxy-1,4-naphthochinon, Isatin, 5-Nitroisatin und verschiedene Anthrachinonfarbstoffe. Es ist auch möglich, eine Luftoxidation und Makromolekularisierung gleichzeitig mit einer enzymatischen Reaktion in Gegenwart von autooxidierten Substanzen durchzuführen, z. B. ungesättigte Fettsäuren wie Ölsäure und Rinolsäure oder von ungesättigten Alkoholen, wie Oleylalkohol oder ungesättigten Alkylen, wie Squalen.
Unter den erfindungsgemäß hergestellten makromolekularisierten Phenolverbindungen oder aromatischen Aminverbindun gen sind besonders Makromoleküle aus natürlichen Substanzen oder deren Derivaten, wie Lignin, Lignosulfonsäure, Huminsäure, Nitrohuminsäure, Tannin, Catechin, Gallensäure, Urushiol, Hesperidin und Hinokitiol sehr wertvoll, weil sie äußerst unschädlich gegenüber der Umwelt sowie gegenüber den Menschen sind, sodass ihre Eigenschaften als hochmolekulare Verbindungen am besten ausgenutzt werden können und sie auf dem Gebiet der Holzbehandlungsmittel eingesetzt werden können. Es ist festzuhalten, dass bei dieser Anwendung verschiedene Zusätze, die gewöhnlich auf jedem Gebiet eingesetzt werden, in Kombination verwendet werden können.
Auf diesem Anwendungsgebiet ist es auch möglich, durch Makromolekularisierung von natürlichen oder nicht-natürlichen phenolischen Verbindungen oder aromatischen Aminverbindungen unter milderen Reaktionsbedingungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendungszwecke mit höheren Funktionen der hochmolekularen Verbindungen zu entwickeln, wobei deren physikalische Eigenschaften, wie Viskosität, Haftvermögen, Wasserrückhaltevermögen, Wasserlöslichkeit, Wasserfestigkeit, Elastizität und Festigkeit oder physiologische Effekte zu regeln.
Erfindungsgemäß ermöglicht das Imprägnieren von Holz mit dem Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität zusammen mit phenolischen Verbindungen oder aromatischen Aminverbindungen und Makromolekularisieren der phenolischen Verbindungen oder aromatischen Aminverbindungen in dem Holz und zusätzlich der bereits im Holz vorhandenen Polyphenolverbindungen, wie Lignin, eine Verbesserung der Bearbeitbarkeit in einer Trocknungsstufe nach der Imprägnierbehandlung des Holzes, eine Verbesserung der Festigkeit des Holzes, die durch Ligninzersetzung durch eine Kochbehandlung von Holz oder Hochtemperaturdampf-Behandlung vermindert wurde, und eine Verbesserung der Wirkung des Verhinderns der Rissbildung von Holz beim Trocknen oder Gefrieren, eine Verhütung des Wachstums von Mikroorganis men durch Aufrechterhalten oder Verbesserung der anaeroben Umgebung im Holz zu erreichen.
Erfindungsgemäß ist es durch einwirken lassen von Polyphenoloxidase und einem Farbstoff oder dessen Vorläufer, auf den die Polyphenoloxidase einwirken kann, auf Holz möglich, eine färbende Substanz in dem Holz herzustellen oder die färbende Substanz und Polyphenolverbindungen, wie bereits im Holz vorhandenes Lignin, gemeinsam zu makromolekularisieren, sodass eine beständigere Färbung oder Färbebehandlung des Holzes erreicht werden kann. Bei der vorstehend beschriebenen Färbebehandlung von Holz ist bekannt, dass viele Polyphenoloxidasen Lignin, das eine im Holz enthaltene färbende Substanz ist, bleichen und daher ist die erfindungsgemäße Färbebehandlung oder Farbbehandlung des Holzes sehr nützlich, weil sie das enzymatische Bleichen und eine Färbebehandlung gleichzeitig ermöglicht und somit die Anzahl der Verfahrensstufen vermindert und den Farbton verbessert.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung genauer durch repräsentative Beispiele beschrieben, die jedoch lediglich beispielhaft sind und die vorliegende Erfindung sollte nicht als auf diese begrenzt angesehen werden.
In den folgenden Beispielen wurde die Molekulargewichtsanalyse für makromolekularisierte Phenolverbindungen oder aromatische Aminverbindungen durch HPLC durchgeführt, wobei 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) oder 0,1 mM einer wässerigen Lösung von Natriumsulfat als Elutionsmittel, Shodex RI (Differential-Brechungsindex-Detektor, hergestellt von Showa Denko) als Detektor und Shodex PROTEIN KW-802.5 (Tandem, hergestellt von Showa Denko) oder eine Kombination von Shodex PROTEIN KW802.5 (hergestellt von Showa Denko) mit Shodex OHpak SB-804HQ (hergestellt von Showa Denko) als Säule verwendet wurden.
Beispiel 1: Kultivierung und partielle Reinigung, Konzentration
In einen 500 ml-Kolben als Kultivierungsvorrichtung, der mit 100 ml eines Kulturmediums beschickt war, das 0,134% Na₂HPO₄·12H₂O, 0,03% KH₂PO₄, 1% Maltose, 1% Pepton, 0,1% Hefeextrakte, 0,05% MgSO₄·7H₂O, 0,1 mM CuSO₄, 1 mM MnCl₂ und 2 mM CaCl₂ enthielt und durch Zugabe von 20% Na₂CO₃ auf pH 7,8 eingestellt war, wurde Bacillus licheniformis SD3003 (Hinterlegungsnr. FERM BP-5801) eingeimpft. Nach der Schüttelkultur bei 50°C während 16 Stunden wurde die Kultivierungstemperatur auf 35°C erniedrigt und die Kultivierung erfolgte während 3 Tagen. Nach der Kultivierung wurde die Kulturbrühe bei 4°C zentrifugiert, wobei eine von dem Bacillus befreite Kulturbrühe erhalten wurde. Um diese weiter zu reinigen und zu konzentrieren erfolgte eine Ammoniumsulfat-Fraktionierung und bei einer 20 bis 60%igen Sättigung der Ammoniumsulfat-Konzentration wurde die meiste Polyphenoloxidase-Aktivität als Niederschlag gewonnen. Der erhaltene Ammoniumsulfat-Niederschlag wurde gegen 10 mM Bis-tris/HCl-Pufferlösung (pH 7,0) dialysiert. Zum weiteren Reinigen und Konzentrieren wurde eine Ultrafiltrationsmembran verwendet, wobei eine partiell gereinigte konzentrierte wässerige Lösung (0,8 U/ml) in den Fraktionen erhalten wurde, die Molekulargewichten von 10.000 bis 100.000 entsprachen.
Beispiel 2: Züchtung und Konzentration
In ein Kulturgefäß, das 3 Liter eines Kulturmediums enthielt, das aus 0,5% Glucose, 0,1% NaNO₃, 1,34% Na₂HPO₄·12H₂O, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% NaCl, 0,2% Pepton, 20 ppm Hefeextrakt, 0,01% MgSO₄·7H₂O und 0,1 mM CuSO₄ bestand und durch Zugabe von 10% NaOH auf pH 8 eingestellt war, wurde Myrothecium verrucaria SD3001 (Hinterlegungsnr. FERM BP-5520) eingeimpft und die Kultivierung unter Schütteln erfolgte bei 28°C während 3 Tagen. Nach der Kultivierung erfolgte das Zentrifugieren bei 4°C, wobei 2,5 Liter einer von dem Bacillus befreiten Kulturbrühe erhalten wurden.
Dann wurde ein Teil der Kulturbrühe unter Verwendung eines Minitan-Ultrafiltrationssystems (hergestellt von Millipore Co.) mit einem Minitan-Filterpaket (CAT. Nr.: PTGCOMPO4, hergestellt von Millipore Co.) bis zu einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 10.000 konzentriert.
Nach einer weiteren Dialyse dieser gegen 200 ppm NH₄HCO₃ wurde diese lyophilisiert, wobei ein Rohprodukt als gefriergetrocknetes Produkt erhalten wurde. Das gefriergetrocknete Produkt hatte eine Polyphenoloxidase-Aktivität von 15 U/mg.
Eine wässerige Lösung des gefriergetrockneten Produkts zeigte ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 600 nm, das spezifisch für Kupfer enthaltende Proteine ist.
Beispiel 3: Züchtung und Konzentration
In ein Kulturgefäß, das 3 Liter eines Kulturmediums aus 0,5% Glucose, 0,1% NaNO₃, 1,34% Na₂HPO₄·12H₂O, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% NaCl, 0,2% Pepton, 20 ppm Hefeextrakt, 0,01% MgSO₄·7H₂O und 0,1 mM CuSO₄ enthielt, das durch Zugabe von 10% NaOH auf pH 8 eingestellt war, wurde Myrothecium roridum SD3002 (Hinterlegungsnr. FERM BP-5523) eingeimpft und eine Schüttelkultur wurde während 3 Tagen bei 28°C durchgeführt. Nach der Kultivierung wurde bei 4°C zentrifugiert, wobei 2,5 Liter von dem Bacillus befreiter Kulturbrühe erhalten wurden.
Dann wurde ein Teil der Kulturbrühe unter Verwendung eines Minitan-Ultrafiltrationssystems (hergestellt von Millipore Co.) mit einem Minitan-Filterpaket (CAT. Nr.: PTGCOMPO4, hergestellt von Millipore Co.) bis zu einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von nicht kleiner als 10.000 konzentriert.
Nach der weiteren Dialyse gegen 200 ppm NH₄HCO₃ wurde diese lyophilisiert, wobei ein Rohprodukt als gefriergetrocknetes Produkt erhalten wurde. Das gefriergetrocknete Produkt hatte eine Polyphenoloxidase-Aktivität von 10 U/mg.
Eine wässerige Lösung des gefriergetrockneten Produkts zeigte ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 600 nm, das spezifisch für Kupfer enthaltende Proteine ist.
Beispiel 4: Makromolekularisierungs-Reaktion
Die nachstehend beschriebenen Makromolekularisierungs-Reaktionen [4-1] bis [4-3] wurden unter Verwendung der partiell gereinigten konzentrierten wässerigen Lösung, die in Beispiel 1 beschrieben ist, durchgeführt und die Makromolekularisierungs-Reaktion [4-4] wurde unter Verwendung von handelsüblicher Polyphenoloxidase (erhalten von TaKaRa) durchgeführt.
4-1
1 ml eines Reaktionsgemisches, das 20% (Gew./Vol.) Natriumlignosulfonat (erhalten von Aldrich Chemical Company, Inc.) und die partiell gereinigte konzentrierte wässerige Lösung als Polyphenoloxidase in einer Aktivitätskonzentration von 300 U/Liter enthielt wurde hergestellt und in einem Glas-Reagenzrohr bei einer Reaktionstemperatur von 70°C mit 100 UpM geschüttelt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit einer kleinen Menge Schwefelsäure auf 7,5 eingestellt. Nach dem Start der Reaktion wurde der Farbton des Reaktionsgemisches sofort stärker und nach 6 Stunden wurde ein wesentlicher Fortschritt der Makromolekularisierung erzielt. Nach 20 Stunden war der größte Teil des Reaktionsgemisches verfestigt.
4-2
Auch in dem Fall, in dem die Reaktion mit einer Änderung der Aktivitätskonzentration der Polyphenoloxidase auf 60 U/Liter durchgeführt wurde, war das gesamte Reaktionsgemisch 20 Stunden nach dem Start der Reaktion eine hochviskose Flüssigkeit und das Molekulargewicht des Produkts erhöhte sich entsprechend zu der Erhöhung der Viskosität. Nach weiterem 20-stündigen Fortsetzen der Reaktion wurde eine partielle Verfestigung des Reaktionsgemisches beobachtet. Durch Entnahme eines Teils des Reaktionsgemisches und Erhitzen in einem Wasserbad während 15 Minuten auf etwa 100°C, um die Reaktion zu beenden, wurden Proben für die Molekulargewichtsanalyse hergestellt.
4-3
Auch wenn Lignin (Alkali) (erhalten von Nacalai tesque) in einer Konzentration von 20% (Gew./Vol.) anstelle von Lignosulfonsäure verwendet wurde und die Reaktion bei einer Aktivitätskonzentration der Polyphenoloxidase von 300 U/Liter bei pH 7,5 durchgeführt wurde, wurde das gesamte Reaktionsgemisch 24 Stunden nach dem Start der Reaktion hochviskos.
4-4
100 ml eines Reaktionsgemisches, das 20% (Gew./Vol.) Natriumlignosulfonat und eine handelsübliche Polyphenoloxidase in einer Aktivitätskonzentration von 300 U/Liter enthielt wurde hergestellt und in einem 500 ml-Kolben bei einer Reaktionstemperatur von 25°C und bei 100 UpM geschüttelt, um die Reaktion zu ermöglichen. Da sich zeigte, dass die hier verwendete handelsübliche Polyphenoloxidase ein saures Enzym war, das gemäß der Messung unter Verwendung von Syringaldazin einen optimalen Reaktions-pH von 6 bis 7 hatte, wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches in der Makromolekularisierungs-Reaktion mit einer kleinen Menge an Schwefelsäure auf pH 6,5 eingestellt. Nach Beginn der Reaktion wurde der Farbton des Reaktionsgemisches sofort dunkler, es war jedoch eine Reaktion von etwa 80 Stunden erforderlich, bevor der größte Teil des Reaktionsgemisches verfestigt werden konnte.
Beispiel 5: Makromolekularisierungs-Reaktion
Unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen gefriergetrockneten Produkte wurden die nachstehenden Makromolekularisierungs-Reaktionen [5-1] bis [5-3] durchgeführt.
5-1
100 ml eines Reaktionsgemisches, das 20% (Gew./Vol.) Natriumlignosulfonat und das gefriergetrocknete Produkt als Polyphenoloxidase in einer Konzentration von 20 ppm (300 U/Liter) enthielt wurde hergestellt und bei einer Reaktionstemperatur von 25°C und mit 100 UpM in einem 500 ml-Kolben geschüttelt, um eine Reaktion zu ermöglichen. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit NaOH auf pH 9 eingestellt. Nach dem Start der Reaktion wurde der Farbton des Reaktionsgemisches sofort dunkler und nach 3 Stunden wurde ein wesentlicher Fortschritt der Makromolekularisierung beobachtet und nach 10 Stunden war der größte Teil des Reaktionsgemisches verfestigt. Auch in dem Fall, wenn die Reaktion durch Verändern der Menge der zugesetzten Polyphenoloxidase auf 4 ppm durchgeführt wurde, wurde nach 20 Stunden das gesamte Reaktionsgemisch eine hochviskose Flüssigkeit und nach weiterem 20-stündigen Fortsetzen der Reaktion wurde eine partielle Verfestigung des Reaktionsgemisches beobachtet. Durch Entnahme eines Teils des Reaktionsgemisches und 5 Minuten langes Erhitzen in einem Wasserbad auf 90°C, um die Reaktion zu beenden, wurden Proben für die Molekulargewichtsanalyse hergestellt.
5-2
Auch in dem Fall, in dem Lignin (Alkali) in einer Konzentration von 20% (Gew./Vol.) anstelle von Lignosulfonsäure verwendet wurde, wurde die Reaktion bei einer Aktivitätskon zentration von Polyphenoloxidase von 300 U/Liter bei pH 9 und bei einer Reaktionstemperatur von 25°C durchgeführt. Nach Beginn der Reaktion wurde der Farbton des Reaktionsgemisches sofort dunkler und nach 24-stündigem Fortschreiten der Makromolekularisierungs-Reaktion war das meiste des Reaktionsgemisches verfestigt.
5-3
Unter Verwendung von 20% (Gew./Vol.) Natriumlignosulfonat wurde die Reaktion bei einer Reaktionstemperatur von 25°C mit einer Aktivitätskonzentration von Polyphenoloxidase von 300 U/Liter, wobei der pH des Reaktionsgemisches mit einer kleinen Menge Schwefelsäure auf 7 eingestellt war, durchgeführt. Nach dem Start der Reaktion wurde der Farbton des Reaktionsgemisches sofort dunkler, es wurde jedoch keine Verfestigung des Reaktionsgemisches beobachtet.
Beispiel 6: Makromolekularisierungs-Reaktion
Unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen gefriergetrockneten Produkte wurden die nachstehenden Makromolekularisierungs-Reaktionen [6-1] bis [6-2] durchgeführt.
6-1
100 ml eines Reaktionsgemisches, das 20% (Gew./Vol.) Natriumlignosulfonat und das gefriergetrocknete Produkt als Polyphenoloxidase in einer Konzentration von 30 ppm (300 U/Liter) enthielt wurde hergestellt und bei einer Reaktionstemperatur von 25°C und bei 100 UpM in einem 500 ml-Kolben geschüttelt, um die Reaktion zu ermöglichen. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit NaOH auf pH 9 eingestellt. Nach dem Start der Reaktion wurde der Farbton des Reaktionsgemisches sofort dunkler und nach 3 Stunden wurde ein wesentlicher Fortschritt der Makromolekularisierungs-Reaktion beobachtet und nach 10 Stunden war das meiste des Reaktionsgemisches verfestigt.
6-2
Auch in dem Fall, in dem Lignin (Alkali) in einer Konzentration von 20% (Gew./Vol.) anstelle von Lignosulfonsäure verwendet wurde, wurde die Reaktion bei einer Aktivitätskonzentration von Polyphenoloxidase von 300 U/Liter bei pH 9 und bei einer Reaktionstemperatur von 25°C durchgeführt. Nach Beginn der Reaktion wurde der Farbton des Reaktionsgemisches sofort dunkler und nach 24 Stunden war das meiste des Reaktionsgemisches verfestigt.
Vergleichsbeispiel: Makromolekularisierungs-Reaktion unter Verwendung eines bekannten Enzyms
100 ml eines Reaktionsgemisches, das 20% (Gew./Vol.) Lignin (Alkali) und eine handelsübliche Bilirubinoxidase (gefriergetrocknetes Produkt) (erhalten von Sigma) als Polyphenoloxidase in einer Konzentration von 300 U/Liter enthielt wurde hergestellt und das Reaktionsgemisch wurde bei einer Reaktionstemperatur von 25°C und mit 100 UpM in einem 500 ml-Kolben geschüttelt, um die Reaktion zu ermöglichen. Da sich zeigte, dass die hier verwendete Bilirubinoxidase einen optimalen Reaktions-pH von 8 bis 9, gemessen unter Verwendung von Syringaldazin, hatte, wurde die Makromolekularisierungs-Reaktion bei einem pH-Wert von 8,5 durchgeführt, welches der pH des Reaktionsgemisches ohne Einstellung war. Nach dem Start der Reaktion wurde ein Fortschritt der Makromolekularisierung beobachtet. Es waren jedoch etwa 50 Stunden vom Beginn der Reaktion nötig, um das meiste des Reaktionsgemisches zu verfestigen.
Beispiel 7: Antipilzeigenschaften (beispielhaft)
Feste (gelartige) Lignosulfonsäure, die durch eine Reaktion erhalten wurde, die der in [5-1] in Beispiel 5 beschriebenen Makromolekularisierungs-Reaktion ähnlich war, wurde in kleine Stücke zerschnitten (10 mm × 10 mm × 3 mm), die in die Mitte einer L-Agarplatte gelegt wurden. Dann wurden Sporen von Aspergillus orizae AHU7134 über die gesamte Oberfläche des Kulturmediums der Platte ausgestrichen und 4 Tage lang bei 28°C kultiviert. Als Ergebnis wurde eine Wachstumshemmung des Fungus im Bereich des oberen Teils und etwa 2 mm von dem Umfang jedes der kleinen Stücke von Lignosulfonsäure beobachtet, was anzeigte, dass dieses als Antipilzmittel geeignet war.
Beispiel 8: Antipilzeigenschaften (beispielhaft)
Zu einer 20%igen (Gew./Vol.) wässerigen Lösung von Natriumlignosulfonat wurden 200 ppm Hinokitiol (erhalten von Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) gegeben und das resultierende Gemisch wurde auf 90°C erhitzt, um das Hinokitiol zu schmelzen, wonach Hinokitiol unter Verwendung eines Wirbelmischers suspendiert wurde und die Suspension auf 25°C abgekühlt wurde. Zu dem so erhaltenen Ausgangsmaterial für die Makromolekularisierungs-Reaktion wurde das in Beispiel 2 beschriebene gefriergetrocknete Produkt als Polyphenoloxidase in einer Aktivitätskonzentration von 300 U/Liter gegeben und das Gemisch wurde bei einer Reaktionstemperatur von 25°C und einem pH von 9 der Makromolekularisierungs-Reaktion unterworfen, wobei verfestigte (gelartige) Lignosulfonsäure, die Hinokitiol enthielt, erhalten wurde. Das feste Produkt wurde in kleine Stücke zerschnitten (10 mm × 10 mm × 3 mm), die in die Mitte einer L-Agarplatte gelegt wurden. Dann wurden Sporen von Aspergillus orizae AHU7134 über die gesamte Oberfläche des Kulturmediums ausgestrichen und 4 Tage bei 28°C kultiviert. Als Ergebnis wurde eine Hemmung des Wachstums des Fungus im Bereich des oberen Teils und etwa 10 mm vom Umfang jedes Stückes der Lignosulfonsäure beobachtet, was anzeigte, dass dieses als Antipilzmittel und als Mittel zum Speichern eines Antipilzmittels geeignet war.
Außerdem wurde zu einer 20%igen (Gew./Vol.) wässerigen Lösung von Natriumlignosulfonat (+)-Catechin·H₂O (erhalten von Sigma) in einer Konzentration von 5.000 ppm und das in Beispiel 2 beschriebene gefriergetrocknete Produkt als Polyphenoloxidase in einer Aktivitätskonzentration von 300 U/Liter gegeben. Das Gemisch wurde dann bei einer Reaktionstemperatur von 25°C und einem pH von 9 der Makromolekularisierungs-Reaktion unterworfen, wobei Catechin-enthaltende verfestigte (gelartige) Lignosulfonsäure erhalten wurde. Die Antipilzeigenschaften des festen Produkts wurden in gleicher Weise wie in dem vorher beschriebenen Beispiel getestet und als Ergebnis wurde eine Inhibierung des Wachstums des Pilzes im Bereich des oberen Teils und etwa 8 mm vom Umfang jedes Stückes von Lignosulfonsäure beobachtet, was anzeigte, dass diese als Antipilzmittel und als Mittel zum Speichern des Antipilzmittels geeignet war.
Beispiel 13: Holzbehandlung
Ein Reaktionsgemisch wurde hergestellt, das das in Beispiel 2 beschriebene gefriergetrocknete Produkt als Polyphenoloxidase in einer Konzentration von 4 ppm enthielt und das Reaktionsgemisch wurde in gleicher Weise wie in der in Beispiel 5 beschriebenen Makromolekularisierungs-Reaktion [5-1] reagieren gelassen, wobei wasserlösliche makromolekularisierte Lignosulfonsäure (20% (Gew./Vol.) erhalten wurde. Dabei wurde ein Verfahrensschritt, wie Erhitzen, zum Beenden der Makromolekularisierungs-Reaktion nicht durchgeführt. Eine wässerige Lösung der makromolekularisierten Lignosulfonsäure wurde auf das 10-fache verdünnt. Unter Verwendung der resultierenden Lösung als Holzbehandlungsmittel wurde ein Cryptomeria-Block (unbehandeltes Holz mit einem Durchmesser von 3 cm und einer Länge von 20 cm) einer Injektionsbehandlung mit dem Mittel unterworfen, der nach dem Entfernen der Rinde 16 Stunden lang mit einer 0,1%igen Tween 80-Lösung bei 60°C behandelt worden war. Die Injektionsbehandlung wurde nach dem Bethell-Verfahren durchgeführt, das eine Druckverminderung auf 720 mmHg und eine Druckbehandlung bei 10 kg/cm² einschließt. Die Holzblock-Proben, die der Injektionsbehandlung mit nicht-makromolekularisierter Lignosulfonsäure und mit makromolekularisierter Lignosulfonsäure unterworfen worden waren (zwei in jedem Fall) wurden etwa 20 cm vom Umfang eines Termitennests entfernt, auf die Erde gelegt und 2 Monate lang stehen gelassen. Dann wurde der die Termiten abschreckende Effekt durch die Behandlung mit dem Mittel beobachtet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass bei den Holzblockproben, die mit der nicht-makromolekularisierten Lignosulfonsäure behandelt worden waren, leichter Termitenfraß auftrat, während kein Termitenfraß bei den Holzblockproben beobachtet wurde, die mit der makromolekularisierten Lignosulfonsäure behandelt worden waren, wobei die letzteren Proben (die Homogenität, Glätte, den Glanz) der Holzblockoberfläche beibehielten.
Beispiel 14: Holzbehandlung
Zu einer Zubereitung, die durch Einstellen eines wässerigen 1%igen p-Phenylendiamin-dihydrochlorids (hergestellt von Kanto Kagaku Co., Ltd.) auf pH 9 mit einer kleinen Menge NaOH erhalten wurde, wurde das in Beispiel 2 beschriebene gefriergetrocknete Produkt als Polyphenoloxidase in einer Konzentration von 2 ppm gegeben. Die Zubereitung wurde sofort auf eine Eichenplatte gestrichen. Die Farbreaktion schritt rasch auf der Oberfläche und im Inneren (Tiefe bis etwa 3 mm) der Platte fort, wodurch ein Plattenmaterial erhalten wurde, welches eine beständige Braunfärbung hatte.

Claims

Verfahren zum Schutz und zur Verstärkung von Holz durch Polymerisation einer oder mehrerer Phenolverbindungen oder einer oder mehrerer aromatischer Aminverbindungen mit einem Enzym, das eine Polyphenol-oxidierende Aktivität aufweist, wobei das Verfahren die Schritte aufweist, Imprägnieren von Holz mit einer Kombination, die ein Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität und ein oder mehrere phenolische Verbindungen oder ein oder mehrere aromatische Aminverbindungen aufweist, Polymerisieren lassen der einen oder mehreren phenolischen Verbindungen oder der einen oder mehreren aromatischen Aminverbindungen in dem Holz durch das Enzym bei einem alkalischen pH, und Rückgewinnen des geschützten und verstärkten Holzes.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität eines oder mehrere der Enzyme ist/sind, das/die aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, die aus Catecholoxidase, Laccase, Polyphenoloxidase, Ascorbinsäureoxidase und Bilirubinoxidase besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren eines Bakteriums erhalten wird, welches zur Gattung Bacillus gehört.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Bacillus licheniformis oder Bacillus natto erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Bacillus licheniformis SD3003 (Zugangsnummer FERM BP-5801) erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren eines zur Gattung Myrothecium gehörenden Pilzes erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Myrothecium verrucaria oder Myrothecium roridum erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität ein Enzym ist, das durch Kultivieren von Myrothecium verrucaria SD 3001 (Zugangsnummer FERM BP-5520) oder Myrothecium roridum SD 3002 (Zugangsnummer FERM BP-5523) erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Phenolverbindung Lignin oder Lignosulfonsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Holz mit einer Kombination imprägniert wird, die ein Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität, ein oder mehrere phenolische Verbindungen oder ein oder mehrere aromatische Aminverbindungen, sowie ein oder mehrere einer Chinonverbindung, einer ungesättigten Fettsäure, einem ungesättigten Alkohol und einer ungesättigten Alkylverbindung aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Holz mit einer Kombination imprägniert wird, die ein Enzym mit Polyphenol-oxidierender Aktivität, ein oder mehrere phenolische Verbindungen oder ein oder mehrere aromatische Aminverbindungen sowie ein physiologisch aktives Substrat aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer antimikrobiellen Verbindung, einer antiviralen Verbindung, einer insektiziden Verbindung und einem biotischen Schutzmittel-Metallion besteht.