JP2002520005A - タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 - Google Patents
タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用Info
- Publication number
- JP2002520005A JP2002520005A JP2000558734A JP2000558734A JP2002520005A JP 2002520005 A JP2002520005 A JP 2002520005A JP 2000558734 A JP2000558734 A JP 2000558734A JP 2000558734 A JP2000558734 A JP 2000558734A JP 2002520005 A JP2002520005 A JP 2002520005A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tobacco
- extract
- phenol oxidase
- enzyme
- tobacco material
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
- A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
- A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
- A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
- A24B15/20—Biochemical treatment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
- A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
- A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
- A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
- A24B15/24—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes by extraction; Tobacco extracts
Abstract
Description
をフェノール酸化酵素で処理して改良されたタバコ材料を提供する方法に関する
。
れている。このような総括的な目標を念頭に置きながら、とりわけタンパク質及
びフェノール系化合物、例えばポリフェノールのタバコからの除去に対する努力
が現状払われている。タバコ材料のタンパク質及びポリフェノール含量を低下さ
せるための方法に関連する米国特許第5,601,097号参照のこと。 タバコ葉の中に存在するポリフェノールのうちクロロゲン酸が主要であり、そ
してタバコ葉の中の低レベルのクロロゲン酸はタバコの煙の中の所望されない成
分カテコールのレベルの低下に結びつく。Schlotzhauer W.S.(1992), Journal o
f Analytical and Applied Pyrolysis. Vol22, 頁231−238参照のこと。
のための方法は米国特許第3,561,451号に開示されている。米国特許第
5,601,097号はかかる方法における別の不溶性吸着剤、即ち、ポリビニ
ルポリピロリドン(PVPP)の利用を開示する。しかしながら、これらの方法
は比較的非選択的である点で不利である。
ルモノオキシゲナーゼ、EC 1.14.18.1)、リアーゼ、ヒドロラーゼ
から選ばれる酵素及びかかる酵素の起源を構成する微生物の作用に委ねることに
よりタバコの構造を改変し、その化学組成を改変し、そしてその官能的特徴を改
変する方法に関する。
の方法はタバコ材料をフェノール改変酵素、好ましくはフェノール酸化酵素、そ
して最も好ましくはポリフェノール酸化酵素で処理することを含んで成る。
るための方法を提供し、その方法においてはタバコ材料をフェノール酸化酵素で
処理する。
バコエキスをフェノール酸化酵素で処理することにより達せられる。
の方法はタバコ材料を溶媒で抽出してエキスとタバコ残渣とを供し;そしてこの
エキスをフェノール酸化酵素で処理する工程を含んで成る。
楽しみを、例えば化学組成、フレーバー、芳香、味及び/又は色を改変すること
により改善し、かくして市場でのタバコ製品の多様性を広げる方法に関連する。
酵素の利用に関する。一の態様において、本発明はタバコの処理におけるラッカ
ーゼの利用に関する。
きる、特に得られたタバコ材料に関連する。本発明の最終的なすぐに利用できる
タバコ製品、並びに特許請求項の範囲に記載の任意の方法により処理されたタバ
コ材料の任意のエキスを包括する。このようなタバコ材料は軽減した量のフェノ
ール系化合物を有する。
材料をフェノール酸化酵素で処理する工程を含んで成る。 本明細書において使用する表現「タバコ材料」とは、どのようなタイプ、ソー
ス又は起源を問わず、また本発明の処理にかける前にどのようなその他の種類の
処理にかけられているのかを問わず、本発明における様々な処理のためのタバコ
出発材料を意味する。従って、「タバコ材料」には、限定することなく、ソース
及び等級に関係なく、タバコ固形分及びタバコの任意の固形形態、例えば乾燥タ
バコ(例えばくんせいタバコ);乾燥、熟成、切断、粉砕、精製又は細断タバコ
;タバコスクラップ;エキスパンドタバコ、発酵タバコ;再構築タバコ;並びに
このようなタバコ材料の任意の組合せが含まれる。また、タバコブレンドも含ま
れる。このタバコ材料はタバコ植物の任意の器官、例えば幹、葉脈、スクラップ
及び廃棄タバコ、カッティング等、並びにホール葉及びその一部に由来しうる。
好ましくは、本発明の出発材料として利用するタバコ材料はタバコの葉のラミナ
部分である。好適な態様において、このタバコ材料は乾燥タバコの一部又は全部
である。特に、この表現はタバコの調製又は処理工程にかけるタバコ原材料を包
含する。本発明の特定の態様において、タバコ材料なる語はタバコエキス又は任
意の固形タバコ形態のタバコ抽出混合物を含む。好ましくは、乾燥タバコのエキ
スを使用する。本発明の方法において利用されるタバコ材料は任意のタバコの種
であって、それからタバコ製品を作ることが所望されるものに由来しうる。特に
関心のもたれるのは亜族ニコチアナ・タバカム(Nicotiana taba
cum)由来のタバコである。
に含まれるのは、限定することなく、最終的なすぐに使用できるタバコ製品、並
びにタバコ材料の任意のエキスであり、ここでこのエキスは特許請求の範囲に記
載の任意の方法により処理されたものである。かくして、「タバコ製品」なる語
には、本発明に係る方法が適用された最終製品が含まれ、特にこの語は喫煙のた
めのタバコ製品、例えば紙巻タバコ、葉巻、パイプタバコが含まれるが、その他
の種類のタバコ製品、例えばタバコエキス及びかむためのタバコ、例えばかみタ
バコ及びタバコチューインガムも含まれる。
ノール改変酵素、好ましくはフェノール酸化酵素、そして最も好ましくはポリフ
ェノール酸化酵素で処理する、即ち、それらと接触させる工程を含んで成る方法
を包括する。一の態様において、この酵素はモノフェノールモノオキシゲナーゼ
(EC 1.14.18.1)ではない。
抽出混合物を供し;(iii)この抽出混合物をタバコエキスとタバコ残渣とに分
ける;工程を含んで成り、ここで工程(i)、即ち、フェノール酸化酵素による
処理を工程(ii)の最中又は後、且つ工程(iii)の前に実施するか、又は工程
(iii)の後にこのエキスに対して実施する。
方法は(ii)タバコ材料を溶媒で抽出して抽出混合物を供し;(iii)この抽出
混合物をタバコエキスとタバコ残渣とに分け;(i)このタバコエキスをフェノ
ール酸化酵素で処理して1又は複数種の酸化フェノール系化合物を提供すること
を含んで成る。
れによるとタバコ材料の可溶性フェノール系化合物を抽出混合物の液体部分へと
抽出し、かくしてフェノール酸化酵素の作用を促進する。
、水及び有機溶媒の混合物も、水溶性ではない、又はほんのわずかに水溶性であ
るフェノール成分、例えばリグニン又はその他の疎水性化合物の抽出に使用して
よい。 水性抽出により、タバコ材料の水溶性フェノール系化合物は、とりわけニコチ
ン、可溶性タンパク質、糖、アミノ酸、ペクチン、無機塩、及び適宜使用した界
面活性剤と共に水性エキスの中に分配されるであろう。
50%、好ましくは60%超、より好ましくは75%超、更により好ましくは9
0%超、そして最も好ましくは95%超の水、例えば99%超の水(%は重量パ
ーセントを意味する)を含んで成る水性溶媒を使用してこのタバコ材料を抽出す
る。本発明の一の態様において、このタバコ材料の抽出は100%の水から成る
水性溶媒で実施する。
ノールもしくはメタノール;又はその他の水混和性溶媒、例えばジメチルプロピ
レン尿素、N−メチルピロリドン、アセトン、プロパン−2−オール、プロパン
−1−オール、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールモノ
メチルエーテル、テトラヒドロフラン、1−ブタノール、2−ブタノール、イソ
ブタノール、tert−ブタノール、1,4−ジオキサン、モルホリン、ジメチ
ルホルムアミド、ジエチレングリコール、ジメチルエーテル、ジメチルスルホキ
シド、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコール、ジエチ
レングリコール、スルホラン、グリセロール又はトリエタノールアミンを含んで
成ってよい。
例えばドデシル硫酸ナトリウム及びドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、カ
チオン系、又は非イオン系);酵素、例えばタンパク質分解酵素、例えばNov
o Nordisk A/S,Denmark由来のSavinase(商標)
を含んで成ってよい。
抽出し、水又は水性溶媒において不溶性である又はほんのわずかにしか可溶性で
ない成分を抽出してよい。このタバコ材料の水性溶媒による抽出はこのタバコ材
料の有機溶媒による抽出の前又は後に行ってよい。本発明の一の態様において、
このタバコ材料の抽出は水性溶媒で行う。任意的に、このタバコ材料の有機溶媒
による更なる抽出をタバコ材料の水性抽出の前又は後に実施する。この有機溶媒
は純粋な水混和性有機溶媒、例えばアルコール、例えばエタノールもしくはメタ
ノール、又はその他の水混和性溶媒、例えばジメチルプロピレン尿素、N−メチ
ルピロリドン、アセトン、プロパン−2−オール、プロパン−1−オール、エチ
レングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、テ
トラヒドロフラン、1−ブタノール、2−ブタノール、イソブタノール、ter
t−ブタノール、1,4−ジオキサン、モルホリン、ジメチルホルムアミド、ジ
エチレングリコールジメチルエーテル、ジメチルスルホキシド、ジエチレングリ
コールモノメチルエーテル、エチレングリコール、ジエチレングリコール、スル
ホラン、グリセロール、トリエタノールアミン、又は純粋な水非混合性有機溶媒
、例えばアルコール、アルデヒド、ケトン、エーテル、アルカン、例えばテトラ
ヒドロフラン(THF)、ジエチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ペンタ
ン、ヘキサンもしくはジオキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、シクロヘキサ
ン、リグロイン、石油エーテル、トルエン、キシレン、アニソールであってよい
。
、即ち、タバコ残渣の実質的にない環境は酵素が活性であることができる環境で
あるべきである。通常、これは酵素処理を有機溶媒相ではなく、水性溶媒相で実
施することを要する。タバコ材料の抽出を有機溶媒を用いて実施するなら、水性
抽出工程を有機エキスの液一液抽出として行い、水性相を提供する(この水性相
はタバコ材料の水性エキスなる語の中に包括されるものと理解されるべきである
)。水溶性有機溶媒と水との混合物を使用するなら、有機溶媒の含有量は有機溶
媒の除去のための慣用の方法、例えばエバポレーション又は凍結(冷却)により
減少させてよい。
次いでこのタバコ残渣を有機溶媒で処理して有機溶媒中では可溶性であるが、水
性溶媒では可溶性でないフェノール系化合物を抽出してよい。得られる有機エキ
ス(即ち、タバコ残渣から分離させた液体部分。このタバコ残渣は抽出混合物の
団体部分である)は無視するか、又は好ましくは液一液抽出の後にタバコ材料と
の組合せのための水性相、例えばフェノール酸化酵素処理タバコエキスを供する
ために利用してよい。
条件下で実施することが、必須ではないが好ましい。しかしながら、部分抽出で
さえも、最後タバコ製品中のフェノール系化合物の濃度を究極的に低下させるの
に有用である。適当な抽出条件のいくつかの例を以下に挙げる。一般に、これら
の条件はいずれも条件のマトリックスを樹立し、そしてこのマトリックス中の様
々な点を試験することによりルーチン実験だけで最適化が図れうる。
℃、30〜70℃、45〜70℃、例えば35〜60℃、例えば40〜55℃、
約45〜50℃、典型的には約45℃の温度;3〜10のpH、例えば4〜9、4
〜8、5〜8、5〜7、例えば5〜6のpH;5分〜24時間、1〜24時間、例
えば5分〜10時間、1分〜5時間、5分〜5時間、5分〜1時間、5分〜1/
2時間、典型的には約15分の抽出時間である。好ましくは水性である溶媒を好
都合にはタバコ材料の量(乾燥重量)の5〜200倍、例えば5〜100倍、よ
り好ましくは5〜50倍、最も好ましくは10〜50倍、典型的には約40倍の
量で添加する。この抽出は好都合にはタバコ材料と溶媒とを撹拌しながら、又は
その他の種類の混合を行いながら実施する。
ルスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸ナトリウム、カルボン酸ナトリウムもし
くはカリウム塩、アルキルアリールスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホコハ
ク酸ナトリウム、又は以上の任意の混合物であってよい。特に8〜12個の炭素
原子の炭素長を有する界面活性剤が考えられる。本発明の特定の態様において、
この界面活性剤は1又は複数種のドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンス
ルホン酸ナトリウム及びジオクチルスルホコハク酸ナトリウム(Aerosol
OT(商標))である。この界面活性剤は0.01%〜5%w/vの溶液の濃
度範囲で溶媒に加える。
ール酸化酵素による処理の前又は後(好ましくは前)にエキスから分離させる。
この分離は任意の方法、例えば限定することなく、遠心分離、濾過、沈降、デカ
ンテーションもしくはふるい分け又は任意のそれらの組合せを利用して実施して
よい。特に好適な分離方法は濾過及び遠心分離である。
しくは水性エキスである。これは例えば4℃にまで冷却して界面活性剤を沈澱さ
せる、及び/又は例えば無機カルシウムもしくはマグネシウム塩を利用して沈澱
させ、しかる後例えば遠心分離を行うことにより実施してよい。
は関係ない)、しかる後の液体画分(「タバコエキス」)から分離(例えば濾過
又は遠心分離による)により得られる固体タバコ材料を意味する。このタバコ残
渣はタバコの水不溶性部分を意味する。このタバコ残渣は更なる処理/加工、例
えば乾燥にかけてよい。
、しかる後の固体抽出材料(「タバコ残渣」)からの分離(例えば濾過又は遠心
分離による)により得られる液体画分を意味する。従って、このタバコエキスは
タバコの可溶性成分を含んで成り、そしてタバコ固形分を実質的に含まない。こ
のタバコエキスはその他の添加剤による処理及び/又はその他の加工にかけてよ
い。
物を意味する。この懸濁物は固体画分及び液体画分を含んで成る。
バコ材料をフェノール酸化酵素で処理する。この工程(i)は以下に更に詳細に
説明する。
び近縁物質に対し、好ましくはアクセブターとしての分子性酸素又は過酸化水素
と共に作用する任意のオキシドリダクターゼが含まれる。本発明のフェノール酸
化酵素は少なくとも一種のフェノール系化合物を酸化することのできる任意の酵
素である。
複数個の電子)を失い、アクセプターは電子(即ち、1又は複数個の電子)が増
加する;これらの反応体の一方は酸化され(電子ドナー)、他方の反応体は還元
される(アクセプター)。かかる反応を触媒する酵素をオキシドリダクターゼと
称する。
」なる語は原核又は真核生物、例えば動物、植物又は微生物(例えば細菌又は真
菌、例えば糸状菌及び酵母)に由来するフェノール酸化酵素を包括する。一の態
様において、本発明の方法はタバコ由来のフェノール酸化酵素を利用する。
単離されたものであってよいことを意味する。この場合、この酵素のアミノ酸配
列は天然酵素に対応する。「由来」なる語は酵素が宿主生物において組換的に生
産されたものであってもよい。この組換的に生産した酵素は天然酵素に対して同
一性を有するか、又は改変アミノ酸配列を有してよく、例えば1又は複数個のア
ミノ酸が欠失、挿入及び/又は置換されていてよい。即ち、組換的に生産した酵
素は天然アミノ酸配列の突然変異体及び/又はフラグメントである。天然酵素の
意味の中には天然変異体が含まれる。更に、「由来」なる語には例えばペプチド
合成により合成的に生産した酵素が含まれる。「由来」なる語は例えばin v
ivo 又はin vitroでのグリコシル化、リン酸化により改変された酵
素も包含する。
アミノ酸配列を有することを意味する。この語は、酵素が、それが天然に存在す
る生物から単離されたもの、又は同じもしくは別のタイプの生物において組換的
に発現されたものを包含する。組換的に生産した酵素については、「得られるこ
とができる」又は「由来」なる語は酵素の同一性を意味し、それが組換的に生産
された宿主生物の同一性は意味しない。
生物であろうと、それを天然に生産する生物から得られた酵素又は宿主生物中で
組換的に生産された酵素を意味し、ここでこの組換酵素は天然酵素に対応するア
ミノ酸配列を有する。
微生物、例えば細菌又は真菌(糸状菌及び酵母等)から得られることのできるフ
ェノール酸化酵素(例えば、ラッカーゼ)、フェノール酸化酵素活性を有するそ
の突然変異体、フラグメント又は変異体を包括する。本発明の一の態様はタバコ
から得られることのできるフェノール酸化酵素の利用を含んで成る。
できうる。例えば、フェノール酸化酵素調製品は適当な微生物の発酵、しかる後
の当業界公知の方法による得られる発酵培養液又は微生物からのフェノール酸化
酵素含有調製品の単離により得られうる。好ましくは、このフェノール酸化酵素
調製品は組換DNA技術の利用により得られる。かかる方法は通常、注目のフェ
ノール酸化酵素をコードし、且つその酵素の発現を可能にする条件下で培養培地
の中にフェノール酸化酵素を発現させることをできるようにする適当な発現シグ
ナルに作用可能式に連結されているDNA配列を含んで成る組換DNAベクター
で形質転換された宿主細胞を培養し、そしてこの培養物からこの酵素を回収する
ことを含んで成る。このDNA配列は宿主細胞のゲノムの中に組込んでもよい。
このDNA配列はゲノム、cDNAもしくは合成起源、又はこれらの任意の組合
せであってよく、そして当業界に公知の方法に従って単離又は合成されたもので
あってよい。 フェノール系化合物/フェノール類:
なくとも1個のフェノール系環構造、即ち、芳香環構造、特にベンゼン環構造と
、環C−原子にOH置換基とを含んで成る任意の化合物を意味し、その他の置換
基及び縮合ベンゼン環の数は問わない。この定義には特に(モノ)フェノール類
、並びにポリフェノール類、例えばジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−及びヘキ
サフェノール類が含まれる。
シ基を含んで成る化合物が包括される。 ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−及びヘキサフェノール類なる語はそれぞれ
全部で2,3,4,5又は6個のヒドロキシ基と、1又は複数個の芳香環系とを
含んで成る化合物を包括し、ここでこのヒドロキシ基は同一又は異なる芳香環に
付加されている。
加された2個以上のヒドロキシ基を含んで成る化合物を意味し、ここでこのよう
な化合物を本明細書では「ポリヒドロキシフェノール類」とも呼ぶ。本明細書で
用いる語「ポリフェノール」は少なくとも2個のヒドロキシ基が付加された1個
の芳香環を含んで成る化合物も包括する。本明細書で用いる語「ポリフェノール
」はまたフェノール系モノマーを基礎とするポリマー材料も含み、ここでこのよ
うな化合物を本明細書では「ポリマーフェノール類」とも呼ぶ。このポリマー材
料はフェノール系化合物の重合反応に由来しうる。
ン(またの名をルトシド)、クエルセチン(またの名を2−(3,4−ジヒドロ
キシフェニル)−3,5,7−トリヒドロキシ−4H−1−ベンゾピラン−4−
オン;及び3,3′,4′,5,7−ペンタヒドロキシフラボン)、イソクエル
シトリン(またの名を2−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−3−(β−D−
グリコフラノシルオキシ)−5,7−ジヒドロキシ−4H−ベンゾピラン−4−
オン;及び3,3′,4′,5,7−ペンタヒドロキシフラボン−3−グリコシ
ド;及びクエルセチン−3−グリコシド)、ケムプフェロール(またの名を3,
5,7−トリヒドロキシ−2−(4−ヒドロキシフェニル)−4H−1−ベンゾ
ピラン−4−オン;及び3,4′,5,7−テトラヒドロキシフラボン)、ロビ
ニン(またの名を3−〔[6−0−(6−デオキシ−α−L−マンノピラノシル
)−D−ガラクトピラノシル]オキシ〕−7−〔(6−デオキシ−α−L−マン
ノピラノシル−)オキシ〕−5−ヒドロキシ−2−(4−ヒドロキシフェニル)
−4H−1−ベンゾピラン−4−オン);クマリン、例えばスコポレチン(また
の名を、7−ヒドロキシ−6−メトキシ−2H−1−ベンゾピラン−2−オン及
び7−ヒドロキシ−6−メトキシクマリン)及びスコポリン(またの名をスコポ
レチンー7−グリコシド);及びカフェタニン、例えばカフェオイルキニン酸の
異性体(3−、4−、5−0−カフェオイルキニン酸)が含まれる。本発明の方
法に従うと、クロロゲン酸(またの名を3−0−カフェオイルキニン酸及び3−
〔[3−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−1−オキソ−2−プロペニル]オ
キシ〕1,4,5−トリヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸)、ルチン及びス
コポレチンが特に注目される。ルチン、スコポレチン及びクロロゲン酸の化学構
造は図11〜13に示す。
可能なフェノール系化合物の含有量を下げることにある。特に注目されるのは水
性溶媒中で抽出可能なフェノール系化合物、例えば化合物スコポレチン、ルチン
及びクロロゲン酸である。「抽出可能なフェノール系化合物」なる語は「可溶性
フェノール系化合物」、即ち、溶媒によりタバコ材料から抽出できるフェノール
系化合物を意味する。本発明の一の観点は水溶性フェノール系化合物、即ち、水
性溶媒の利用によりタバコ材料から抽出することのできるフェノール系化合物を
意味する。この水性溶媒は本明細書に定義の通りであり、例えば純水である。一
の態様はタバコ材料中の少なくとも一種のフェノール系化合物の濃度を低下させ
るための本発明の方法に関連し、ここでこのフェノール系化合物は可溶性、好ま
しくは水溶性のフェノール系化合物である。
る。本発明の特定の態様において、低分子量とは約10,000Da未満、好まし
くは、5,000Da未満、例えば2,000Da未満、より好ましくは1,000
Da未満の分子量を有する化合物を意味する。本発明の一の態様において、この語
はフェノール系「モノマー」、例えば低分子量化合物スコポレチン、ルチン及び
クロロゲン酸、即ち、フェノール系モノマーのオリゴマー又はポリマーへと重合
されうるフェノール系化合物を意味する。フェノール系モノマーの重合により、
フェノール系化合物の分子量は増大する。本発明の好適な態様において、重合反
応(フェノール酸化酵素による処理により生ずる)は例えば限外濾過により好ま
しくはエキスの形態でタバコ材料からの分離が可能となるであろう高分子量フェ
ノール系化合物が作られるまで進行する。好適な態様において、このポリマー材
料はとなり、そして沈澱する。
、本発明のフェノール系化合物は溶媒、好ましくは水性溶媒に可溶性な低分子量
フェノール系化合物である。
類の高分子量及び低分子量化合物に作用する酵素の例えば、限定することなく、
ペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7)、ラッカーゼ(EC 1.10.
3.2)、ビリルビンオキシダーゼ(EC 1.3.3.5)、モノフェノール
モノオキシゲナーゼ(EC 1.14.18.1)及びカテコールオキシダーゼ
(EC 1.10.3.1)が挙げられる。 好ましくは、このフェノール酸化酵素はフェノールオキシダーゼ又はペルオキ
シダーゼである。
ール系化合物)が酸化され、分子性酸素がアクセプターとして働く酸化反応を触
媒することにある。
化水素がアクセプターとして働く反応を触媒することを特徴とする。 本発明のフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼは少なくとも一種のフ
ェノール系化合物を酸化できるフェノールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼで
ある。このことを明確にするため、本発明のペルオキシダーゼは「フェノールオ
キシダーゼ」と呼ぶこともある。
移により反応する。ラッカーゼが1−電子酸化を実行するこの酵素グループに含
まれる。これは2−電子酸化を実行するフェノール酸化酵素とは異なる。
合、フェノール系化合物)が1個の電子又は一電子電荷当量の遷移により酸化さ
れることを意味するが、総合的な観点から化合物が更に酸化されることがある。
1−電子酸化において、ラジカルが発生する。即ち、注目の酵素はラジカルの発
生を介してフェノール系化合物を酸化するであろう。フェノール系化合物に関し
ては、これは、まず電子がフェノール系化合物から引き抜かれてフェノキシラジ
カルが生ずることを意味する。これは例えば Yaropolow A.Iら、(1994)、Applie
d Biochemistry and Biotechnology, 49, 頁257−280;及びThurston C.F (1994)
、Microbiology, 140、頁19−26に記載されている。
わず、EPR(電子強磁気共鳴)スペクトル(またの名を、ESR=電子スピン
共鳴スペクトル)により検出されうる。EPRスペクトルは非常に高成度であり
、且つ高度に特異的なラジカル検出方法であり、そして精製や濃縮の如き多労な
サンプル予備処理抜きで複雑なマトリックスを分析するのに利用できる。かかる
分析を実施することは当業者にとって日常的な作業である。ラジカル形成の検出
のより簡単な方法はフェノール酸化酵素を簡単なUV/可視スペクトルにより検
出できる安定なラジカルを形成することで知られる基質、例えばABTS(2,
2′−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ニアンモ
ニウム塩)、PPT(フェノチアジン−10−プロピオン酸)又はHEPO(1
0−(2−ヒドロキシエチル)フェノキサジン)とインキュベーションすること
にある。
.7)、ラッカーゼ(EC 1.10.3.2)、ビリルビンオキシダーゼ(E
C 1.3.3.5)及びカテコールオキシダーゼ(EC 1.10.3.1)
である。 好適なフェノール系オキシダーゼはクラスEC 1,13,−、−;EC 1
.14.−.−(例えばEC 1.14.18.1)及びEC 1.10.3.
−の酵素、特にクラスEC 1.10.3.1−1.10.3.8、即ち、EC
1.10.3.1、EC 1.10.3.2、EC 1.10.3.3、EC
1.10.3.4、EC 1.10.3.5、EC 1.10.3.6、EC
1.10.3.7又はEC 1.10.3.8のいずれかである。
for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUBMB)
、Academic Press, Incに定義されている通りである。
3,−に対応する酵素であり、それはドナーとしてジフェノール類及び近縁物質
に、アクセプターとしての酸素と共に作用する酵素を含んで成る。しかしながら
、モノフェノール類も極めて良好な基質である。これらのクラスの好適な酵素は
カテコールオキシダーゼ(EC 1.10.3.1);ラッカーゼ(別名、ウリ
シオールオキシダーゼ、EC 1.10.3.2);及び0−アミノフェノール
オキシダーゼ(EC 1.10.3.4)である。
名、チロシナーゼ、フェノラーゼ、モノフェノールオキシダーゼ、クレソラーゼ
)を含んで成る。特異的な態様において、本発明に係る方法によるタバコエキス
の処理のためのフェノール酸化酵素はEC 1.14.18.1である。
物から得られることができるフェノールオキシダーゼ及びそれらの任意のフェノ
ール酸化酵素活性変異体、フラグメント又は突然変異体である。その活性は当業
界公知の任意の方法により測定できる。
る。適当な微生物ラッカーゼ酵素は植物、細菌又は真菌(糸状菌及び酵母を含む
)に由来してよく、そして適当な例にはアスペルギルス(Aspergillu
s)、ニューロスポラ(Neurospora)、例えばN.クラッサ(N.c
rassa)、ポドスポラ(Podospora)、ボツリチス(Botryt
is)、コリビア(Collybia)、ホメス(Fomes)、レンチヌス(
Lentinus)、プレウロツス(Pleurotus)、トラメテス(Tr
ametes)、例えばT.ビロサ(T.villosa)(従来はポリポルス
・ピンシトウス(Polyporus pinsitus)と呼ばれていた)及
びT.バーシカラー(T.versicolor)、リゾクトニア(Rhizo
ctonia)、例えばR.ソラニ(R.solani)、コプリヌス(Cop
rinus)、例えばC.プリカチリス(C.plicatilis)及びC.
シネレウス(C.cinereus)、サチレラ(Psatyrella)、マ
イセリオフソラ、例えばM.サーモフィラ(M.thermophila)、シ
タリジウム(Scytalidium)、例えばS.サーモフィルム、ポリポル
ス(Polyporus)、例えばP.ピンシトウス、フレビア(Phlebi
a)、例えばP.ラジタ(P.radita)(WO92/01046)、又は
コリオルス(Coriolus)、例えばC.ハーストウス(C.hirsut
us)(JP2−238885)、ルス(Rhus)、例えばR.バーニシフェ
ラ(R.vernicifera)、ピクノポルス、例えばピクノポルス・シン
ナバリアスの株に由来するラッカーゼ、特にトラメテス、マイセリオフソラ、シ
タリジウム又はポリポルス由来のラッカーゼが含まれる。好適な態様において、
フェノール酸化酵素はタバコ由来のラッカーゼである。
植物又は微生物、例えば細菌又は真菌(糸状菌及び酵母を含む)に由来しうる。
特に注目されるのはタバコ由来のカテコールオキシダーゼ又はモノフェノールモ
ノオキシダーゼである。カテコールオキシダーゼの例にはソラヌム・メロンゲナ
(Phytochemistry,1980,19(8),1597−1600
)又は茶(Phytochemistry,1973,12(8),1947−
1955)由来のカテコールオキシダーゼが含まれる。ポリフェノールオキシダ
ーゼはカビに由来しうる(Hakko Kogaku Zasshi,1970
,48(3),154−160)。哺乳動物モノフェノールモノオキシダーゼ(
チロシナーゼ)が発表されている(Methods Enzymol.,198
7,142,154−165)。その他の適用なモノフェノールモノオキシゲナ
ーゼは茶葉(Prikl.Biokhim.Mikrobiol.,1997,
33(1),53−56)、クロレラ(Chlorella)(Ukr.Bot
.Zh.,1986,43(5),56−59)、又はニューロスポラ・クラッ
サ(Methods Enzymol.,1987,142,165−169)
に由来しうる。
シゲナーゼ(EC 1.14.18.1)ではない。 適当なペルオキシダーゼはクラスEC 1.11.1.−、例えばEC 1.
11.1.7、EC 1.11.1.13及びEC 1.11.1.14のもの
であってよい。好適なペルオキシダーゼはクラスEC 1.11.1.7の酵素
である。グループEC 1.11.1.7は、ドナーが酸化され、過酸化水素が
アクセプターとして働く酸化反応を触媒するペルオキシダーゼを含んで成る。
られることができるペルオキシダーゼ及びその任意のフェノール酸化酵素活性変
異体、フラグメント又は突然変異体である。それらの活性は当業界公知の任意の
方法により測定できる。
は植物(例えば西洋ワサビ、ダイズ又はタバコ)又は微生物、例えば真菌(糸状
菌及び酵母を含む)又は細菌に由来する。いくつかの好適な真菌には、亜門(s
ubdivision)不完全菌類、クラス線菌綱に属する株、例えばフサリウ
ム(Fusarium)、ヒュミコラ(Humicola)、トリコデルマ(T
richoderma)、マイロセシウム(Myrothecium)、バーチ
シルム(Verticillum)、アルトロマイセス(Arthromyce
s)、カルダリオマイセス(Caldariomyces)、ウロクラジウム(
Ulocladium)、アンベリシア(Embellisia)、クラドスポ
リウム(Cladosporium)又はドレシュレラ(Dreschlera
)、特にフサリウム・オキシスポルム(F.oxysporum)(DSM 2
672)、ヒュミコラ・インソレンス(Humicola insolens)
、トリコデルマ・リーシイ(T.resii)、マイロセシウム・バルカナ(M
.verrucana)(IFO 6113)、バーチシリウム・アルボアトル
ム(V.alboatrum)、バーチシリウム・ダリー(V.dahlie)
、アルソロマイセス・ラモスス(A.ramosus)(FERM P−775
4)、カルダリオマイセス・フマゴ(C.fumago)、ウロクラジウム・チ
ャータルム(U.chartarum)、アンベリシア・アリ(A.alli)
又はドレシュレラ・ハロデス(D.halodes)が含まれる。その他の好適
な真菌には亜門担子菌類(Basidiomycotina)、クラス担子菌綱
に属する株、例えばコプリヌス、ファネロシエテ(Phanerochaete
)、コリオルス(Coriolus)又はトラメテス、特にコプリヌス・シネレ
ウス f・マイクロスポルス(microsporus)(IFO 8371)
、コプリヌス・マクロリズス(C.macrorhizus)、ファネロシェテ
・クリソスポリウム(P.chrysosporium)(例えばNA−12)
又はトラメテス(従来はポリオポルスと称されていた)、例えばT.バーシカラ
ー(例えばPR4 28−A)の株が挙げられる。更なる好適な真菌には、亜門
接合真菌類、クラスマイコラセア綱に属する株、例えばリゾプス(Rhizop
us)又はムコール(Mucor)、特にムコール・ヒエマリス(M.hiem
alis)が挙げられる。いくつかの細菌にはアクチノマイセタレス(Acti
nomycetales)目の株、例えばストレプトマイセス・スフェロイデス
(Streptomyces spheroides)(ATCC 23965
)、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス(S.thermoviolac
ens)(IFO 12382)又はストレプトバーチシルム・バーチシリウム
(S.verticillum)種バーチシリウムが挙げられる。その他の好適
な細菌にはバチルス・プミルス(ATCC 12905)、バチルス・ステアロ
サーモフィルス(B.stearothermophilus)、ロドバクター
・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロド
モナス・パルストリ(R.palustri)、ストレプトコッカス・ラクチス
(Streptococcus lactis)、シュードモナス・プロシニア
(Pseudomonas purrocinia)(ATCC 15958)
又はシュードモナス・フロレセンス(P.fluorescens)(NRRL
B−11)が挙げられる。更なる好適な細菌にはマイキソコッカスに属する株
、例えばM.ビレセンスが挙げられる。
92/16634及びWO 94/12621に係るC.マクロリジス又はC.
シネレウス由来のペルオキシダーゼが好ましい。
ク質しか存在しなくてよい。この「その他のタンパク質」は特にその他の酵素を
意味する。本明細書で言う「精製」とは、その他の成分、特にその他のタンパク
質、そして最も特にその他の酵素であって、このフェノール酸化酵素の起源細胞
の中に存在しているものが除かれていることを意味する。好ましくは、この酵素
は純度75%(w/w)以上、より好ましくは純度80,85,90又は更には
95%以上である。更なる好適な態様において、このフェノール酸化酵素は純度
98%以上の酵素タンパク質調製品である。
らかの補助化合物、例えば適当なアクセプター又は補酵素であって反応系にもと
から存在しているもの又は存在していないものが含まれる。
できるようにする安定化剤、アクチベーター、保存剤、金属イオン、緩衝剤、界
面活性剤、凝集剤、キレート化剤及び分散剤等の成分が含まれる。酵素触媒化反
応の最適化は当業者にとって日常的な作業である。「フェノール酸化酵素」なる
語には酵素反応を促進及び/又は加速させるエンハンサー又はメディエーテーも
含まれる。例えば、Faure ら(1995)、Applied and Enviromental Microbiology
, 61(3), 頁1144−1146及びShannon and Pratt(1967), Journal of Food Scienc
e, 32, 頁479−483、並びにWO94/12619,WO95/01426及び
WO96/00179等に記載。
が行われる適当な条件は選定した酵素の特徴との関係で選定され、いくつかの典
型的な条件を以下に挙げる。むろん、一般に任意のこれらの条件は当業界に一般
的な簡単な試行錯誤実験を利用して最適化できる。
〜6、例えば約5.5である。一般に好適な温度は10〜90℃、例えば10〜
80℃、好ましくは10〜70℃、より好ましくは15〜60℃、20〜60℃
、20〜50℃、例えば30〜60℃である。一般に好適な処理時間は1分〜5
時間、例えば5分〜5時間、好ましくは1分〜4時間、好ましくは1分〜3時間
、例えば15分〜3時間、1分〜1時間、更により好ましくは5〜30分である
。
カーゼの利用との関連で)は一般に反応のために重要ではないが、高用量の酵素
では酸素の供給量、従って液体中の酸素の濃度は律連となりうる。しかしながら
、大気からの分子性酸素が通常十分な量で存在し、かくして酸素は表面通気又は
大気による強力な浸水通気により本方法に供給することができる。
素であるか、又は過酸化水素の現場生産のための過酸化水素前駆体であってよい
。従って、本発明の一の態様において、ペルオキシダーゼによる処理は過酸化水
素起源の存在下で実施する。ペルオキシダーゼとの関係で本明細書の中で用いる
語「処理」は、かかる起源が必要である場合、過酸化水素起源の存在を包含する
。「過酸化水素起源」なる語は過酸化水素の起源を意味し、それは過酸化水素自
体であるか、又は過酸化水素の現場生産のための過酸化水素前駆体である。
化水素、(2)過酸化水素前駆体、例えばパーカーボネート又はパーボレート、
(3)過酸化水素発生酵素系、例えばオキシダーゼとその基質、例えばグルコー
スオキシダーゼとグルコース、並びに(4)ペルオキシカルボン酸又はその塩か
ら成る群から選ばれる過酸化水素起源の存在下で実施する。この過酸化水素起源
はこの方法の最初又は最中において、例えば0.001〜25mMのH2O2に相当
する濃度で加えてよい。この過酸化水素起源は過酸化水素の実質的に一定な濃度
を保つために連続的に添加してよい。
係で)は一般に重要ではない。しかしながら、選定のペルオキシダーゼ酵素は過
酸化水素に対して成受性でありうる(活性を失う)。好ましくは、過酸化水素の
濃度範囲は0.010〜10mM、例えば0.020〜8mM、0.05〜5mM、又
は0.100〜2.5mMである。適当な範囲は注目の酵素に依存することがあり
、そして当業者により決定されうる。
0.001〜1000mgの酵素タンパク質、例えば0.001〜500mg、0.
001〜200mg、0.001〜100mg、0.001〜50mg、好ましくは0
.01〜100mg、例えば0.01〜80mg、0.01〜50mg、0.01〜3
0mg、0.01〜20mg、より好ましくは0.1〜20mg/リットルである。タ
バコの乾燥重量当りのフェノール改変酵素タンパク質の用量の限定でない例は1
〜1000μg/g、例えば10〜500μg/g、例えば150μm/gであ
る。このような用量値は好ましくは上述の通りの純度の精製酵素タンパク質を基
準とする。
粒、無塵顆粒、液体、安定化液体、又は保護酵素の形態であってよい。顆粒は例
えば米国特許第4,106,991号及び米国特許第4,661,452号(共
に、Novo Industry AIS)に開示の通りに製造でき、そして任
意的に当業界公知の方法により被覆されていてよい。液体酵素調製品は例えば安
定化剤、例えば糖、糖アルコール又はその他のポリオール、乳酸又はその他の有
機酸を樹立された方法に従って添加することにより安定化できうる。保護酵素は
EP238,216号に開示の方法に従って調製できうる。
酵素で処理することが本質的である。「フェノール酸化酵素」との関係での「処
理」とは、好ましくは水性エキス形態のタバコ材料に有効量のフェノール酸化酵
素を、この酵素がその酸化活性を発揮する、即ち、タバコ材料由来のフェノール
系化合物を酸化して「酸化フェノール系化合物」を供与する条件下で添加するこ
とを意味する。
タバコ材料をフェノール酸化酵素と、当該材料中の少なくとも一種のフェノール
系化合物の濃度の低下をもたらす条件下で接触させることを包含する。「タバコ
材料をフェノール酸化酵素と接触させる」との関係での「接触」とは、フェノー
ル酸化酵素をタバコ材料に添加することを意味する。
a)タバコ材料を溶媒で抽出して抽出混合物を供し;そして(b)この混合物を
タバコエキスとタバコ残渣とに分け、このタバコエキスをフェノール酸化酵素、
例えばフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼと、当該エキス中の少なく
とも一種のフェノール系化合物の濃度が低下する条件下で接触させることを含ん
で成る。一の態様において、この接触は抽出の最中又は後、且つ分離の前に実施
する。
の化合物の量が10%以上、20%以上、50%以上、75%以上、好ましくは
95%、又は更により好ましくは98%以上例えば100%低下したタバコ製品
を提供するために有効な酵素の量である。%低下は下記の通りに計算する。「特
定のフェノール系化合物」なる語は、タバコ材料の酵素処理により、当該材料中
のフェノール系化合物の量の低下が得られるものを包括する。フェノール系化合
物によって%低下は変動しうる。本発明の好適な態様において、各フェノール系
化合物の低下は上述の通り%低下に相当する。本発明によれば、タバコ材料の酵
素処理は当該タバコ材料の少なくとも一種のフェノール系化合物の濃度の低下を
供し、例えば当該タバコ材料中の少なくとも2種類のフェノール系化合物又は少
なくとも3種類のフェノール系化合物の濃度の低下を供する。
のタバコ材料と比較して、クロロゲン酸、ルチン又はスコポレチンのうちの少な
くとも一種の含有量が低下、例えばクロロゲン酸、ルチン又はスコポレチンのそ
れぞれの含有量が5%以上低下、例えば10%以上、20%以上、40%以上、
50%以上、60%以上、75%以上、80%以上、90%以上、好ましくは9
5%以上、又は更により好ましくは98%以上、例えば100%低下している。
この低下は例えばフェノール酸化酵素による処理の前後でのタバコ材料のエキス
のHPLC分析によりモニターできうる。%低下は下記の通りに計算する。
理して前記タバコ材料中の少なくとも一種のフェノール系化合物の酸化を供し、
2)更にこのタバコ材料からの酸化フェノール系化合物を分離する工程、を含ん
で成る)はフェノール系化合物の総含有量の低下したタバコ製品に結びつく。こ
の低下は5%以上の低下、10%以上、20%以上、40%以上、50%以上、
60%以上、75%以上、80%以上の低下、例えば2〜95%、5〜80%、
5〜50%、5〜40%、5〜30%の範囲の低下である。
ある。いくつかの方法は総フェノール含有量を測定し、一方でその他の方法は異
なる分子量を有するフェノール系化合物間で区別し、そして更にその他の方法は
個別の(低分子量)フェノール系化合物の分離、しかる後の定量を可能にする。
好ましくは、個別のフェノール系化合物の分離、しかる後の例えばHPLC(高
圧液体クロマトグラフィー、別名高性能液体クロマトグラフィー)、GLC(気
液クロマトグラフィー、別名ガスクロマトグラフィー)、又はキャピラリー電気
泳動による定量を可能にする分析方法を利用するが、その他の方法も同様に利用
されうる。かかる方法は当業者により、注目の分析課題の要件に合うよう、即ち
、注目のフェノール系化合物を分析するために設計、実施及び最適化できる。
)得られるシグナル(例えばピーク面積又はピーク高、その他)と既知の絶対濃
度の標準から得られるシグナルとの対比による絶対定量、又は2)酵素処理前、
最中及び後の個別のフェノール系化合物により生成される得られるシグナルのサ
イズを比較し、そして個別のフェノール系化合物の相対的(即ち、パーセンテー
ジ)低下を計算するためのシグナルのサイズの展開の利用による相対定量。得ら
れるシグナルのサイズは通常、適当な範囲の濃度を調べたなら、サンプル中にお
いて認められる濃度と相関するであろう(通常、これは利用する濃度範囲が、シ
グナルが濃度と直線状の関係にある範囲であることを意味する)。従って、分析
方法が個別のフェノール系化合物の分離を可能にし、そしてシグナルがその濃度
と相関するなら、任意の標準品を利用することなく酵素処理の効率を計算するこ
とが、処理の前後のシグナルのサイズを比較して%残留フェノール系化合物及び
/又は除去された%フェノール系化合物(%低下)を下記の式を利用して計算す
ることにより求めることが可能である:
法は、タバコ材料であって、酵素処理の前後でのタバコ材料のHPLC分析によ
り、フェノール系化合物に対応するシグナルビークのHPLC分析を介するモニ
ターに従い低下を示す材料を提供する。これは好ましくは5%以上、例えば10
%以上、20%以上、40%以上、50%以上、60%以上、75%以上、80
%以上、90%以上、好ましくは95%以上、又は更により好ましくは98%以
上、例えば100%の低下である。これは「実施例」の章において説明の通りに
測定できうる。好適な態様において、少なくとも一のシグナル(即ち、少なくと
も一種のフェノール系化合物)、例えば少なくとも二のシグナル(即ち、少なく
とも二種のフェノール系化合物)の低下がある。
化合物の濃度を低下するための方法に関連し、この方法はタバコ材料をフェノー
ル改変酵素で処理することを含んで成り、ここでこのタバコ材料は好ましくはタ
バコ材料のエキスの形態にある。好ましくは、この酵素の修飾が改変フェノール
系化合物の除去を促進し、それ故タバコ材料中のフェノール系化合物の総含有量
の低下に結びつく。本発明の一の態様において、このフェノール改変酵素はフェ
ノール酸化酵素である。
しくはタバコエキスから酸化フェノール系化合物を分離する工程(iv)を含んで
成る。この「酸化フェノール系化合物」は本発明に従う酵素による処理により酸
化されたフェノール系化合物を包括する。この酸化フェノール系化合物は好まし
くは重合形態にある。この酸化フェノール系化合物は好ましくは1又は複数種の
形態において、沈澱物、曇り物、溶解又は分散物である。従って、沈澱物/曇り
物がフェノール酸化酵素によるタバコエキスの処理の際に生ずる。酸化重合フェ
ノール系化合物を含んで成るこの沈澱物は好ましくはエキスから分離させる。
遠心分離、濾過、限外濾過、沈降、凝集、逆浸透、デカンテーション又はふるい
分けにより除去できうる。異なる方法及び/又は1又は複数の方法の反復の組合
せも利用してよい。本発明の特定の態様において、吸着はFuller土鉱物、
例えばアタプルジト又はベントナイト、ヒドロキアパタイト(リン酸三カルシウ
ム)、PVPP、アニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、疎水性樹脂及び活性炭
素、又は任意のそれらの組合せから成る群から選ばれる吸着手段により実施する
。一の態様において、本発明の方法はまずベントナイトを利用し、次いでヒドロ
キシアパタイト(リン酸三カルシウム)を利用する工程を含む。好ましくは、特
に溶解又は分散重合酸化フェノール系化合物のため、限外濾過を利用する。
する(工程(vii))。適当な不溶性吸着体の例はヒドロキシアパタイト(リン
酸三カルシウム)及びFuller土鉱物、例えばアタプルジト又はベントナイ
トである。この工程はとりわけ可溶性ポリペプチド、例えば酵素等のタンパク質
、及び工程(i)の重合フェノール系反応生成物の除去を提供する。好適な不溶
性吸着体はベントナイト及びヒドロキシアパタイトである。この吸着体はエキス
の中に簡単に懸濁させることができ、そして例えば遠心分離により分離させるか
、又はエキスを流すカラムの中に含ませてよい。
処理する(工程(viii))。別の態様において、PVPPによる処理を省く。
触させ、次いで必要なら吸着体を除去することを意味し、この吸着体は不溶性吸
着体であることが好ましい。
ール系化合物は本明細書に記載の通りフェノール改変酵素による処理により供さ
れたものである。 本発明の一の態様において、酵素処理を抽出混合物に対して実施する。この酸
化フェノール系化合物は好ましくは抽出混合物、即ち、タバコ固形分(「タバコ
残渣」)及び液体部(「タバコエキス」)から分離させる。この分離はまず粗分
離を例えば濾過により行って、沈澱物及び/又は曇り物を形成しうる溶媒及び酸
化フェノール系化合物をタバコ残渣から分離することにより行う。分離のための
方法の選定は溶媒の中に懸濁したタバコ残渣と酸化フェノール系化合物により形
成されうる固形沈澱物/曇り物との区別ができる限り重要ではない。このように
して分離されたタバコ残渣を水ですすいで更なる酸化フェノール系化合物を除去
する。おそらくは微細な沈殿物及び/又は曇り物として、及び/又はコロイド溶
液中の酸化フェノール系化合物として存在するであろう酸化フェノール系化合物
を含む濾液を更に処理してエキスから酸化フェノール系化合物を除去してよい。
これは前述の如き濾過、遠心分離、限外濾過、沈降、等の分離手段により行って
よい。
酵素の不活化及び/又は変性及び/又は沈澱及び/又は除去に適切な任意の方法
により任意的に不活化(例えば、100℃に加熱し、そしてこの温度に例えば1
0分保つことで)及び/又は除去(例えば、吸着又は沈澱により)してよい。酵
素は例えば酸化フェノール系化合物の除去について説明した通り例えば吸着によ
り沈澱酸化フェノール系化合物と一緒に除去してよい。本発明の一の態様におい
て、酵素の除去のために限外濾過を利用する。従って、一の態様における本発明
の方法はフェノール酸化酵素の不活化及び/又は酵素処理タバコ材料からのその
除去の工程を含んで成り、このタバコ材料は例えばタバコエキスの形態にある。
、これにより本発明の製品が追加のフェノール酸化酵素を実質的に含まないこと
を促進する。酵素の固定のための一般的な技術は当業界において公知であり、そ
して限定することなく、担体材料、例えばイオン交換樹脂、人工ポリマー、例え
ばナイロン、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、メタクリレート、天然バイオ
ポリマー、及びそれらの誘導体、例えばキチン、キトサン、グリセリルキトサン
、セルロース及びその誘導体、例えばDEAE−セルロース、(破砕/粉砕)卵
穀、無機材料、例えばSiO2 、ガラスビーズ、ベントナイト及びその他の不溶
性支持体への吸着、共有結合及び架橋、並びにゲル又はポリマーから作った(マ
イクロ)カプセルへのカプセル化が挙げられる。典型的には、固定化酵素は使用
中に酵素をほとんど又は全く漏らさず、固定化酵素、粒子から分離したときに酵
素が全く又はほとんどない液体画分をもたらす。漏出酵素の量の定量のための高
度に特異的且つ高成度な方法は、固定化の前に例えば14C−ホルムアミドとの反
応によるタンパク質骨格内のリジン残基のメチル化により放射能ラベルした固定
化酵素の利用である。酵素の固定化のいくつかの例がPialis, P.ら(1996), Bio
technology and Bioengineering, 51, 頁141−147; Bhosale S.H.ら(1996), M
icrobiological Reviews, 60(2), 頁280−300; Spagna Gら(1993) Journal of
Chemical Technology and Biotechnology, 57, 頁379−385;Spagna G.ら(1998
), Process Biochemistry, 33(1), 頁57−62;Martino Aら、(1996), Process
Biochemistry, 31(3), 頁281−285;及びMartino Aら(1996), Process Biochem
istry, 31(3)頁287−293に開示されている。
しうる酸化フェノール系化合物を固定化酵素固体及び溶媒から分離する好適な手
段はまず粗分離を例えば濾過により行い、沈殿物及び/又は曇り物を形成しうる
溶媒及び酸化フェノール系化合物を固定化酵素から分離させる。分離のための方
法の選定は溶媒中に懸濁された固定化酵素と酸化フェノール系化合物により形成
されうる固形沈澱物/曇り物との区別ができる限り重要ではない。このようにし
て分離した固定化酵素はその可能な再利用の前に水ですすいで追加の酸化フェノ
ール系化合物を除去してよい。おそらくは微細な沈殿物、曇り物として、及び/
又はコロイド状溶液中に酸化フェノール系化合物として存在するであろう酸化フ
ェノール系化合物を含む濾液を更に処理してエキスを酸化フェノール系化合物か
ら分離させてよい。これは既に本明細書に記載の如き濾過、遠心分離、限外濾過
、沈降、等の分離手段により行ってよい。
含んで成るカラムの中で、このタバコエキスをこのカラムに好ましくは下方流を
利用して通すことにより行う。可能な形成沈澱物によるカラムの詰まりを防ぐた
め、流れの方向を間隔を置いて上方流に変え、任意の形成沈殿物/曇り物を流動
化させ、それを又すすいで除去してよい。別の態様において、固定化酵素を含む
カラム中でのタバコエキスのフェノール酸化酵素処理は固定化酵素粒子及び形成
沈澱物/曇り物の粒径及び密度の相違を利用した流動床の原理を利用して行い、
連続的にエキスを処理し、そして酵素から沈澱物/曇り物形成酸化フェノール系
化合物を分離する。
50%(乾燥質)の固形分含有量にまで濃縮する。このためには、本質的に液体
のみ、好ましくは水溶液を除去する任意の慣用の方法、例えば逆浸透、低分子量
カットオフ値の限外濾過、エバポレーション又は凍結乾燥を利用してよい。しか
しながら、この方法のために所望されるなら、タバコエキスを慣用の乾燥処理、
例えば凍結乾燥、スプレードライ又はエバポレーションにより固体となるまで(
例えば90%〜100%の固形分含有量、例えば100%の乾燥重量を有するま
で)乾燥させてよい。任意的に、まず濃縮工程を液体の濃縮のための通常の手順
により行い、しかる後乾燥工程を通常の手順により行う。
えば乾燥又は有機溶媒による抽出により更に加工又は処理されていることのある
又はないタバコ残渣との最終的な再組合せであり(工程(ix))、これにより改
良タバコ製品が得られる。事実、処理エキスを任意のタバコ固形分と組合せてよ
いが、好都合にはそれは低含有量のフェノール系化合物を有するタバコ固形分、
例えば本明細書に記載の抽出工程により得られるタバコ残渣とする。
的にはタバコ残渣にエキスを戻しスプレーすることにより再度組合せてよいが、
エキスとタバコ固形分とを再度組合せるのに適当な任意の方法を利用することが
できるため、この方法の選定は重要ではない。任意的に、タバコ固形分、例えば
タバコ残渣とタバコエキスとを再度組合せたら、この再組合せタバコを慣用の方
法により乾燥させる。
乾燥タバコ(これはタバコチューインガムのために利用されうる)と組合せるか
、又は処理エキスはグリーンタバコの風味を濃厚にするためグリーンタバコ業に
タバコエキスをスプレーすることにより利用してよい。米国特許第5,845,
647号を参照のこと。
タバコカバーシート、又はタバコ残渣以外の任意のその他の材料であって、後に
タバコ残渣と組合されて最終的なタバコ製品を構成する材料と再度組合せてよい
。他方、もしこのタバコエキスを例えば90〜100%、例えば100%(乾燥
重量)の固体含有量にまで乾燥し、それ故本質的に固体とするなら、乾燥タバコ
エキスをタバコ残渣又はその他の材料、例えばタバコ紙、タバコフィルター、タ
バコカバーシートと、この乾燥タバコエキスと注目の材料との直接配合/混合に
より、必要ならばこの乾燥エキスを上記材料に付着させるための更なる結合剤、
例えばデンプンと混合しながら、再度組合せてよい。
る。工程(x)。 本発明の一の態様において、タバコ材料をまず水性溶媒で酵素抜き(フェノー
ル酸化酵素であろうとタンパク質分解酵素であろうと問わない)、且つ好ましく
は界面活性剤抜きで抽出する。この抽出混合物を分離し、そして水性エキスはフ
ェノール酸化酵素で処理し、一方その残渣はプロテアーゼ及び任意的に界面活性
剤を含んで成る溶媒による更なる抽出にかける。この酵素処理エキス及び残渣を
次に組合せてよい。従って、本発明の方法はタバコ材料又はタバコ残渣を、プロ
テアーゼで処理し、それからフェノール酸化酵素で処理したエキスと組合せる工
程を含んで成りうる。
処理タバコ材料であり、従ってタンパク質含有量の低下したタバコ材料である。
本発明の更なる態様において、抽出のための溶媒はプロテアーゼを含んで成って
よい。 タンパク質分解処理の工程(x)を含ませるなら、本発明の方法は更に注目の
プロテアーゼを実質的に含まないタバコ製品を供するためにプロテアーゼの除去
工程を更に含んで成る。本発明の好適な態様において、ラッカーゼ及びプロテア
ーゼを共にタバコ製品の調製に利用する。
から選ぶのが好ましい。本発明の目的のために最も注目されるのは低価格で購入
できる食品及び洗剤産業における商業的に利用されている酵素である。従って、
Novo Inc.より入手できるSavinase(商標)、Neutras
e(商標)、Enzobake(商標)又はAlcalase(商標)がタバコ
からのタンパク質除去に有効であることが認められた。このタンパク質分解酵素
は0.0001%〜5%w/wの濃度範囲、例えばタバコ材料の重量を基準に0
.1%〜5%w/wで溶液に加える。
する。特に好適な態様において、工程(ii)、しかる後に工程(iii)を下記の
工程のいずれかの前に行う。
ii)、(viii)もしくは(vi)の後に実施してよい。 工程(v)、(vi)、(vii)又は(viii)のいずれかをこの方法に含ませて
よく、順番は問わない。それらは1回又は反復して数回で含ませてよい。しかし
ながら、それらは好ましくは常に工程(ii)及び(iii)に続く。
おいて、工程(viii)は含ませない。含ませるなら、工程(viii)は工程(i)
及び(vii)に続くのが好ましい。別の好適な態様において、工程(v)は含ま
せない。含ませるなら、工程(v)は常に工程(i)に続き、且つ好ましくは工
程(vii)に続く。更なる好ましい態様において、工程(vi)を最終工程にする
。
に含んで成る。 従って、好適な態様において、本発明の方法は以下の工程を表示の順序で含む
:(ii)タバコ材料を溶媒で抽出して抽出混合物を供し;(iii)この抽出混合
物をタバコエキスとタバコ残渣とに分け;(i)このエキスをフェノール酸化酵
素で処理し;(iv)この酸化フェノール系化合物をタバコエキスから分け;(vi
)このエキスを濃縮し;このようにして処理したエキスをタバコ残渣と組合せ;
そしてこの組合せた残渣とエキスとから喫煙用タバコ製品を作る。特定の態様に
おいて、この方法は(v)酵素の除去の工程も、例えば工程(vi)の前に含んで
成る。
するための方法を提供し、この方法はタバコ材料をフェノール酸化酵素で処理す
る工程を含んで成る。特に、タバコ材料中のフェノール系化合物の量を減少させ
るための方法を提供し、それはタバコ材料のエキスをフェノール酸化酵素で処理
することを含んで成る。
。本発明の特定の態様はタバコ製品の調製におけるフェノール酸化酵素の利用で
あって、このフェノール酸化酵素がモノフェノールモノオキシダーゼ(EC 1
,14,18,1)ではない利用に関する。
明の更により好ましい態様はフェノール酸化酵素、好ましくはラッカーゼと、プ
ロテアーゼとの双方のタバコ製品の調製における利用である。
れたタバコ材料に関する。従って、本発明は最終的なすぐに利用できるタバコ製
品、並びに本発明の任意の方法により処理されたタバコ材料の任意のエキスを包
括する。
ェノール系化合物の濃度が低下した改良タバコ製品であり、ここでこの製品はタ
バコ材料をフェノール酸化酵素で処理する、即ちそれと接触させる工程を含んで
成る本明細書に記載の任意の方法により製造されたものである。
消費者に改善された喫煙の楽しみを供する本発明に係るタバコ製品を製造するた
めの方法に関連する。従って、本発明は例えば改変された化学組成、風味、芳香
、味及び/又は色を有するタバコ製品を供するための本発明に係る方法の利用に
関する。
acco)(Imperial Tobacco Ltd.より入手可能)。乾
燥質約85%、4℃に保存。ラッカーゼ :トラメテス・ビロサ・ラッカーゼ(TvL)(従来はポリポルス・
ピンシトウス(Polyporus Pinsitus)ラッカーゼ(PpL)
と呼ばれていた)の液状調整品(Novo Nordisk A/Sより入手可
能)。このラッカーゼはWO96/00290に開示の通りにして調製できる(
pDSY10を有する株からのラッカーゼ酵素、いわゆるlac1)。マイセリ
オフソラ・サーモフィララッカーゼの液状調整品(MtL)(Novo Nor
disk A/Sより入手可能)。酵素は全て純粋な形態のものとした。標準品 :スコポレチン(Aldrich #24,658−1)、クロロゲン酸
(Merck #820319)、ルチン(Aldrich #R230−3)
及びニコチン(Aldrich 24,658−1)。
サンプルの予備処理−固形タバコ」に表記の特別な抽出手順を介する) : フェノール化合物の含有量は下記の手順に従ってHPLCにより分析した: 液体クロマトグラフィーシステム:例えば、Shimadzu SCL−6B
システムコントローラー及び2個のLC−6A液体クロマトグラフィーポンプ又
はWatersモデル600E インジケーター:Shimadzu SIL 6Bオートインジェクター又は
Waters 715 Ultra Wisp。 UVディテクター:Shimadzu SPD−6Aフォトダイオードアレー
UV−VISディテクター又はWaters Model481。 ソフトウェア:CLASS LC10/CLASS−MXA又はMaxima
820。 カラム:Supelcosil(商標)LC−18 25cm×4.6mm(Su
pelco,#5−8298)又はμ Bondpack C198ステンレス
スチールカラム、30cm×4mm(内径)、10μmの粒径。 ガードカラム:なし、又は同じ材料の充填されたWatersのGuard−
Pak。 温度:周囲 移動相流速:1.3ml/min インジェクション容量:20μl 波長:350nm 溶出液:A:KH2PO4(2000mlの脱鉱水中28.4g)及びB:メタノ
ールの二重勾配(線形)混合物(表1及び図1参照のこと)。溶出液は使用前に
0.45μmのフィルターで濾過し、そして脱気しておいた。
いフィルター、例えば除菌Sartorius Minisart 0.45μ
mフィルター(#16555)又はMillipore Millex−GS0
.22μm(#SBGS 0 25 SB)で濾過して、酵素処理中に通常生成
される濁り/沈殿物を除去した。通常、エキス/サンプルの希釈はHPLC分析
前に行わなかった。
5時間乾燥させ、そして40−80メッシュスクリーンでふるった。100〜2
00mgのタバコを隔壁付きの50mlのフラスコの中に正確に秤量した。水及びメ
タノールの1:1の混合物5mlを添加し、そして超音波槽の中で時折撹拌しなが
ら20分抽出した。この超音波槽内の水温をチェックし、そして必要ならば水温
を室温に保つために氷を加えた。その抽出液を0.45μm又はそれより小さい
フィルターで濾過し、これによりフェノール系化合物の分析の用意ができる。
してタバコエキス中の範囲内の比及び濃度で混合した。タバコエキス中のフェノ
ール化合物の半定量化のため、及びこのエキスに含まれる様々な化合物の濃度の
展開の尺度として、酵素添加前のピーク面積に対するピーク面積の減少を利用し
た。この方法の総合的な効率性の尺度として、保持時間Rt>3minでのHPLC
クロマトグラフィーにおける全ピーク(主要ピークだけでなく)の総ピーク面積
の減少度を利用した(「全ピーク」と称する)。 定量測定の場合、下記の標準品を抽出溶液中で作った:クロロゲン酸:20mg
/ml;スコポレチン:1mg/ml;ルチン:0.75mg/ml。
をCORESTA (France, Cooperation Centre for Scientific Research Relative t
o Tobacco)推奨の方法 No.35及び No.37に似かよった連続フロー分析法を
利用して測定した。総糖は加水分解工程を経て得られるが、この方法は還元糖法
と似かよっている。
ルにて抽出した: 1000mlの脱鉱水を45℃に加熱する。30gのタバコ(約25g d.m
.(乾燥質))を加え、そしてこの混合物をマグネチックバー及び時折り棒で撹
拌する。15分後、このタバコ残渣を真空濾過(Whatman ガラスマイク
ロファイバー GF/F 11cm)によりタバコエキスから分離した。その濾過
エキスを少なくとももう1回、又はそれが完全に透明となるまで真空濾過する。
収量は約900mlのタバコエキスである。水性タバコエキスは赤茶液として、タ
バコ独特の臭いを伴って出現する。タバコエキスのpHは5.4〜5.5の範囲に
あり、そしてそれは良好な緩衝能を有し、なぜならpHはこの処理の際及びその後
の酵素処理の間非常に安定であるからである。従って、どの実験でもバッファー
は含ませない。エキスのd.m.含量は約2.1%であった。
実験室スケールで実施した: タバコエキス(典型的には50〜100ml)をガラスビーカーに注ぎ入れ、そ
してマグネチックバーを入れた。PH調整は行わず、バッファーも加えなかった。
このタバコエキスは加熱プレート及びサーモスタットにより酵素処理の間ずっと
55℃に加熱して管理しておいた。金属シンター(HPLCに通常利用される金
属吸引フィルター)によりこのエキスの中に外気を吹き込むことによって大量の
水中通気を適用した。注目の酵素(TvL又はPpL)を所望の濃度で加えた。
ラッカーゼを添加してからすぐに、タバコエキスの色はこげ茶から黒となり、そ
して経時的に液体は曇りはじめ、沈殿物が形成しはじめた。この液体をHPLC
分析のために間隔を置いてサンプリングした。
ゼの作用 材料タバコ構成成分 :ニコチン、クロロゲン酸、ルチン及びスコポレチン。酵素 :トラメテス・ビロサ由来の精製ラッカーゼTvL。装置 :HP8452 UV/Visダイオードアレー光度計、1cm石英キュベッ
ト。バッファー :酢酸ナトリウム(Merck)。方法 : 10mMの酢酸バッファーを酢酸ナトリウムから調製し、硫酸でpH5.0に調整
した。96%エタノール中の0.50mg/mlのストック溶液をニコチン、クロロ
ゲン酸、ルチン及びスコポレチンから調製した。0.31mgの酵素タンパク質/
mlのラッカーゼ脱鉱水溶液のストック溶液を調製した。HPダイオードアレー光
度計を製造者の仕様書に従って作動させた。1cmの石英キュベットを使用した。
ブランクとして50μlの96%のエタノールと混合した950μlのバッファ
ーを使用した。1cmの石英キュベットの中で900μlの10mMの酢酸バッファ
ーと50μlの注目の化合物のストック溶液を混合した。「天然」化合物のスペ
クトルを190〜700nmの範囲で記録した。50μlのTvLストック溶液を
加え、そして慎重に混合し、そして190〜700nmの範囲におけるスペクトル
を5分間、20秒毎に記録した。これは下記の測定条件をもたらす:9mMのNa
−酢酸バッファーpH5.0;4.8%のエタノール;0.025mg/mlのタバコ
構成成分;0.016mg/mlのラッカーゼ。
ーク位置及びピーク相対高)は認められず、クロロゲン酸、ルチン及びスコポレ
チンをラッカーゼで処理すると有意なスペクトル変化が認められた。これは後者
の化合物がラッカーゼのための基質であることを意味する。
mlの濃度で加えた。酵素処理の前、最中及び後のタバコエキスのHPLC分析は
、フェノール系化合物ルチン、スコポレチン及びクロロゲン酸がタバコエキスの
中に、表2に記載の様々なその他の化合物に加えて存在することを示した。酵素
処理の前、最中及び後のタバコエキスのHPLCクロマトグラフィー図、並びに
HPLC標準品の混合物のクロマトグラフィー図を図6,7,8及び9に示す。
処理でピーク数及びピーク面積の有意な減少が認められ、即ち、これらの化合物
の含有量の減少が起きている。
た。このエキスを周囲温度(約20℃)に酵素処理の間ずっと保った。TvL酵
素を約1.6μg/mlの濃度で加えた。PH7に調整したタバコエキスを除き、液
体は酵素を添加してから経時的に曇り、そして沈殿物が形成されはじめた。その
結果を表3に示す。表3から、全てのピークについてピーク面積の有意な減少が
得られることが明らかである。総合的な観点から、利用した条件での至適pHはpH
5〜6の範囲内にある。
常に良く合う。タバコ原材料の緩衝能はかなり良好と思われ、なぜならpHは全試
験中0.1単位超で変化することがなかったからである。
TvL処理 酵素処理:TvL酵素を約1.6μg/mlの濃度又は約7.8μg/mlの濃度
で添加した。結果を表4及び5に示す。1.6μg/mlのTvLの投与量を利用
すると、7.8μg/mlの投与量を利用した場合に比べ、フェノール化合物の同
程度の減少を得るにはより長い処理時間を要することが明らかである。
MtL処理 酵素処理:MtL酵素を約0.63μg/ml又は約6.3μg/mlの濃度で加
えた。結果を表6及び7に示す。MtLもフェノール系化合物を除去するのに使
用できることが明らかである。0.63μg/mlの投与量を利用すると、6.3
μg/mlの投与量を利用した場合に比べ、フェノール系化合物の同程度の減少を
得るにはより長い処理時間を要すること、そして約0.63μg/mlの投与量で
ほぼ完全な除去が得られうることが明らかである。
な濃度で加えた。20分という固定の処理時間を利用した。ラッカーゼの添加後
、時間と共に液体は曇り、そして沈殿物が生成した(但し、適用した投与量で異
なる)。結果を表8に示す。MtLの投与量を増やすとフェノール系化合物を除
去するのに必要な処理時間が短くなり、そして20分未満でほぼ完全な除去が得
られることが明らかである。
測定し、そして金属シンター(HPLCのために通常利用される金属吸引フィル
ター)を介してエキスに大気及び/又はN2 を吹き込むことにより所望のレベル
に管理した。MtL酵素を約3.8μg/mlの濃度で加えた。20分という固定
の処理時間を利用した。ラッカーゼの添加後、液体は曇り、そして沈澱物が生成
した(但し、pO2 のレベルに依存して)。結果を表9に示す。利用条件で、p
O2 の上昇に伴い効率も上昇することが明らかである。利用条件では、酸素はp
O2 <90%のとき律速となる。
を使用した。1Lの容器を使用した。4200rpm (約5000g)で10分、
室温で作動させた。 凍結乾燥:Heto SICC CD40。エキスを−45℃で凍結し、そし
て温度を3mbarでの乾燥中に徐々に20℃に上昇させた。 手順:どのサンプルが調製されたかを示すフローチャートを図10に示す。
脱鉱水を45〜46℃に加熱する。450gのタバコ(約380g d.m.)
を加え、そしてこの混合物を棒で手動撹拌する。15分後、タバコ残渣を真空濾
過により水性タバコエキスから分離させる。タバコ残渣を凍結乾燥し、そして「
2:フリードライズ抽出タバコ残渣」と表示する。
物を除く。収量は約13.5リットルとなる。水性タバコエキスは赤茶液であり
、タバコ独特の臭いを有する。タバコエキスのpHは5.5であり、そしてそれは
かなり良好な緩衝能を有し、なぜならそのpHはこの処理の最中及びその後の酵素
処理の後極めて安定だからである。酵素処理前にpH調整は行わず、ハッファーも
添加しなかった。タバコエキスのd.m.含量は約1.4%であった(少なくと
も120s、一定の重量となるまで約10gのタバコエキスを120℃で乾燥)
、タバコエキスのサンプルをHPLCにより分析した。1.5Lのタバコエキス
を凍結乾燥し、そして「3:タバコエキス」と表示した。
に加熱して管理した。外気を液体にシリコーンチューブ(直径12mm)を介して
吹き込んだ。そのシリコーンチューブには多数の小穴を、設けるよう針で穴が開
けられている。通気は、液体に吹き込まれる空気が効率的な混合へと結びついて
更なる混合を要しないよう十分な量とした。MtLを約7.5μg/mlの最終濃
度にて加えた。30分後、サンプルを集め、そしてHPLCにより分析した。
した。その上清液をデカンテーションにより集め、そして完全に透明となった。
サンプルをHPLCにより分析した。d.m.含量は約1.5%であった(少な
くとも120s、一定の重量となるまで約10gのエキスを120℃で乾燥)、
その上清液を凍結乾燥し、そして「4:沈澱物から分離した酵素処理タバコエキ
ス」と表示した。
鉱水に浮遊させ、そして容器から回収し、そして凍結乾燥し、そして「5:酵素
処理タバコエキスからの沈殿物」と表示した。
8,523−4)で処理した。3gのベントナイトを約200mlの「酵素処理エ
キス」に懸濁させた。このエキス/ベントナイトスラリーを残留酵素処理エキス
と再度組合せ、そして撹拌しながら50〜55℃で15分インキュベーションし
た。15分後、サンプルをHPLCにより分析した。
遠心分離した。その上清液をデカンテーションにより回収し、そして完全に透明
であった。上清液のサンプルをHPLCにより分析した。上清液のd.m.含量
は約1.5%であった(少なくとも120s、一定の重量となるまで約10gの
エキスを120℃で乾燥)。この上清液を凍結乾燥し、そして「6:沈殿物及び
ベントナイトから分離した酵素−及びベントナイト処理タバコエキス」と表示し
た。
材料)を脱鉱水に懸濁し、そして容器から回収し、凍結乾燥し、そして「7:酵
素−及びベントナイト処理タバコエキスからの沈殿物」と表示した。
。
ナライザー分析の結果を示す。
のオートアナライザー分析の結果を示す。
とが明らかである。更に、還元糖、全糖及びニコチンの大半は抽出手順によりタ
バコから抽出され、それ故タバコエキスの中にあることが明らかである。しかし
ながら、これらの化合物のいずれもエキスの酵素処理及び/又はベントナイト処
理によっては有意な影響を受けず、それ故処理エキスの中で完全なままであり続
け、そして再度組合せることでタバコにもどすことができる。
cpi)で切断)を100リットルの水に60〜65℃で15分抽出した。この
エキスを「タバコ残渣」から分離し、そして大型タンクに集めた。抽出温度は5
5℃とし、そして処理の間に40℃にまでゆっくりと下降させた。MtLを4.
1μg/mlの最終濃度で加えた。この混合物に反応時間中大量に通気せしめた。
サンプルを間隔を置いて回収し、そしてHPLCによりクロロゲン酸(CA)、
ルチン(R)及びスコポレチン(S)について分析した。各サンプルの一部を凍
結乾燥し、そして固形残渣をオートアナライザーにより糖及びニコチンについて
分析した。その結果を表13に示す。
結果を表14に示す。 タバコエキスのフェノール含量は20分間の処理を経て最小値にまで減少する
ことが明らかである。更に、還元糖及び全糖並びにニコチンの大半がこの抽出手
順によりタバコから抽出され、それ故タバコエキスの中にあることが明らかであ
る。しかしながら、これらの化合物のいずれもエキスの酵素処理により有意な影
響を受けず、そして「酵素処理タバコエキス」の中で完全なままであり続け、そ
して再度組合せることでタバコ残渣にもどすことができる。 この実験を6.0kgのタバコ及び200リットルの水で60〜65℃で繰り返
した。似たような結果が200リットルのバッチと100リットルのバッチとで
得られた。この結果を表15及び16に示す。
MtLで20分、55℃にて大量通気及び4.1μg/mlに相当するMtL濃度
で処理した。酵素処理後、ベントナイトを1g/Lの濃度にて、ラッカーゼ処理
した後のエキスの温度(50℃)で10分加えておいた。スラリーを連続遠心分
離を利用して1L/min の流速で浄化した。この酵素処理した浄化エキスを逆浸
透及びエバポレーションにより40倍に濃縮した。次いでこの濃縮物を「タバコ
残渣」と、そのエキスをタバコ残渣の上にスプレーすることにより再度組合せ、
そして最後に乾燥し、「再組合せタバコ材料」を得た。
てオートアナライザーによりニコチン、還元糖及び全糖について分析し、そして
前述の方法に従ってHPLCによりクロロゲン酸、ルチン及びスコポレチンにつ
いて分析した。MtL及びベントナイト処理前後のタバコエキスを前述の方法に
従ってHPLCによりクロロゲン酸、ルチン及びスコポレチンについて分析した
。得られた結果を表17及び18に示す。
していることが明らかである。更に、還元糖及び全糖含有量は影響されておらず
、そしてニコチン含有量が若干減少していることが明らかである。
を参照のこと。
Cクロマトグラフィー図。2枚のクロマトグラフィー図はスケールを除き同じで
ある。実施例2参照。
はスケールを除き同じである。実施例2参照。
Cクロマトグラフィー図。2枚のクロマトグラフィー図はスケールを除き同じで
ある。実施例2参照。
の一連のHPLCクロマトグラフィー図。2組のクロマトグラフィー図はスケー
ルを除き同じである。実施例2参照。
の一連のHPLCクロマトグラフィー図。2組のクロマトグラフィー図はスケー
ルを除き同じである。実施例2参照。
ート。実施例8参照。
ート。実施例8参照。
Claims (45)
- 【請求項1】 タバコ製品の調製のための方法であって、 (i)タバコ材料をフェノール酸化酵素で処理する工程; を含んで成る方法であって、ここで当該フェノール酸化酵素がモノフェノールモ
ノオキシゲナーゼ(EC 1,14,18,1)であることを除く、方法。 - 【請求項2】 更に、 (ii)タバコ材料を溶媒で抽出して抽出混合物を供し;そして (iii)この抽出混合物をタバコエキスとタバコ残渣とに分ける; 工程を含んで成り、前記工程(i)を工程(ii)の間又はその後に行う、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項3】 タバコ製品の調製のための方法であって、 (ii)タバコ材料を溶媒で抽出して抽出混合物を供し; (iii)この抽出混合物をタバコエキスとタバコ残渣とに分け; (i)このタバコエキスをフェノール酸化酵素で処理して1又は複数の酸化フ
ェノール系化合物を生成する; 工程を含んで成る方法。 - 【請求項4】 (iv)前記酸化フェノール系化合物を前記タバコエキスから
分離する工程を更に含んで成る請求項2又は3に記載の方法。 - 【請求項5】 前記分離が遠心分離、濾過、限外濾過、沈降、逆浸透、沈降
、吸着、デカンテーションもしくはふるい分け、又は上記の任意の組合せにより
達成される、請求項4記載の方法。 - 【請求項6】 前記フェノール酸化酵素を不活性及び/又は除去する工程を
更に含んで成る、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項7】 (vi)前記エキスを濃縮する工程を更に含んで成る、請求項
2〜6のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項8】 更に (vii)前記エキスを不溶性吸着体で処理する;及び/又は (viii)前記エキスをポリビニルポリピロリドン(PVPP)で処理する; ことを含んで成る、請求項2〜7のいずれか1項記載の方法。
- 【請求項9】 下記の工程を下記の順序で含んで成る請求項3記載の方法: (ii)タバコ材料を溶媒で抽出して抽出混合物を供し; (iii)この抽出混合物をタバコエキスとタバコ残渣とに分け; (i)このエキスをフェノール酸化酵素で処理し; (vii)このエキスを不溶性吸着体で処理し;そして (vi)このエキスを濃縮する。
- 【請求項10】 下記の工程を下記の順序で含んで成る請求項3記載の方法
: (ii)タバコ材料を溶媒で抽出して抽出混合物を供し; (iii)この抽出混合物をタバコエキスとタバコ残渣とに分け; (i)このエキスをフェノール酸化酵素で処理して1又は複数の酸化フェノー
ル系化合物を生成し; (iv)この酸化フェノール系化合物をこのタバコエキスから分離し;そして (vi)このエキスを濃縮する。 - 【請求項11】 更に前記酵素処理したタバコエキスをタバコ材料と組合せ
る工程を含んで成る、請求項2〜10のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項12】 更に(ix)前記酵素処理したタバコエキスを前記タバコ残
渣と再度組合せる工程を含んで成る、請求項2〜10のいずれか1項記載の方法
。 - 【請求項13】 更にタンパク質分解酵素により処理する工程を含んで成る
、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項14】 タバコ材料又はタバコ残渣をプロテアーゼで処理してから
前記エキスの組合せを行う、請求項11〜13のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項15】 前記タバコ製品が喫煙用タバコ製品である、請求項1〜1
4のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項16】 前記溶媒が水性溶媒である、請求項2〜15のいずれか1
項記載の方法。 - 【請求項17】 前記溶媒がプロテアーゼを含んで成る、請求項16記載の
方法。 - 【請求項18】 前記溶媒が界面活性剤を含んで成る、請求項2〜17のい
ずれか1項記載の方法。 - 【請求項19】 前記フェノール酸化酵素がフェノールオキシダーゼである
、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項20】 前記フェノールオキシダーゼがカテコールオキシダーゼ、
ラッカーゼ及びO−アミノフェノールオキシダーゼから成る群から選ばれる、請
求項19記載の方法。 - 【請求項21】 前記フェノールオキシダーゼがラッカーゼ、例えばタバコ
に由来するラッカーゼである、請求項20記載の方法。 - 【請求項22】 前記ラッカーゼがトラメテス(Trametes)、例え
ばトラメテス・ビロサ(Trametes villosa)、マイセリオフソ
ラ(Myceliophthora)、例えばマイセリオフソラ・サーモフィラ
(M.thermophila)、コプリヌス(Coprinus)、例えばコ
プリヌス・シネレウス(C.cinereus)、リゾクトニア(Rhizoc
tonia)、例えばリゾクトニア・ソラニ(R.solani)、ピクノポル
ス(Pycnoporus)、例えばピクノポルス・シンナバリアス(P.ci
nnabarious)、又はタバコ種に由来する、請求項21記載の方法。 - 【請求項23】 前記フェノール酸化酵素がペルオキシダーゼである、請求
項1〜18のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項24】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼ、ダ
イズペルオキシダーゼ、タバコペルオキシダーゼ、又はコプリヌス、例えばコプ
リヌス・シネレウス、コプリヌス・マクロリズス(C.macrorhizus
)、バチルス(Bacillus)、例えばバチルス・プミルス(B.pumi
lus)、又はマイキソコッカス(Myxococcus)、例えばマイキソコ
ッカス・ビレセンス(M.virescens)由来のペルオキシダーゼである
、請求項23記載の方法。 - 【請求項25】 前記フェノール酸化酵素がその基質と単一の電子遷移によ
り反応する、請求項1〜24のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項26】 前記フェノール酸化酵素がタバコに由来する、請求項1〜
25のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項27】 前記フェノール酸化酵素がモノフェノールモノオキシゲナ
ーゼ(EC 1.14.18.1)ではない、請求項1〜26のいずれか1項記
載の方法。 - 【請求項28】 少なくとも一種のフェノール系化合物の濃度が低下したタ
バコ製品を調製する方法であって、タバコ材料をフェノール酸化酵素で処理する
工程を含んで成る方法。 - 【請求項29】 タバコ製品を調製するための方法であって、タバコ材料を
フェノール酸化酵素で処理したフェノール系化合物の濃度が低下したタバコ製品
を供する工程を含んで成り、この低下が当該タバコ材料中の当該フェノール系化
合物の濃度の5%以上、10%以上、20%以上、40%以上、50%以上、6
0%以上、75%以上、80%以上、95%以上、98%以上又は100%の低
下である、方法。 - 【請求項30】 前記フェノール系化合物がクロロゲン酸である、請求項2
9記載の方法。 - 【請求項31】 前記フェノール系化合物がルチンである、請求項29記載
の方法。 - 【請求項32】 前記フェノール系化合物がスコポレチンである、請求項2
9記載の方法。 - 【請求項33】 タバコ製品を調製するための方法であって、タバコ材料を
フェノール酸化酵素で処理することで酵素処理工程前のタバコ材料と比較してH
PLC分析によりシグナル(ピーク)の低下を示すタバコ製品を供することを含
んで成り、ここで当該シグナルはフェノール系化合物に対応し、ここで当該低下
は5%以上、10%以上、20%以上、40%以上、50%以上、60%以上、
75%以上、80%以上、95%以上、98%以上、又は100%の低下である
、方法。 - 【請求項34】 請求項1〜27に規定の1又は複数の工程を含んで成る、
請求項28〜33のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項35】 前記タバコ材料がタバコエキスである、請求項28〜33
のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項36】 タバコ材料中の少なくとも一種のフェノール系化合物の濃
度を低下するための方法であって、タバコ材料のエキスをフェノール酸化酵素で
処理することを含んで成る方法。 - 【請求項37】 請求項1〜36のいずれか1項に記載のタバコ材料中の少
なくとも一種のフェノール系化合物の濃度を低下するための方法であって、前記
フェノール系化合物が低分子量フェノール系化合物である、方法。 - 【請求項38】 タバコ材料中の少なくとも一種のフェノール系化合物の濃
度を低下するための方法であって、タバコ材料のエキスをフェノール改変酵素で
処理することを含んで成る方法。 - 【請求項39】 タバコエキスの処理におけるフェノール酸化酵素の利用。
- 【請求項40】 タバコ製品の調製におけるフェノール酸化酵素の利用であ
って、当該フェノール酸化酵素がモノフェノールモノオキシゲナーゼ(EC 1
,14,18,1)ではない、利用。 - 【請求項41】 タバコ製品の調製におけるラッカーゼの利用。
- 【請求項42】 タバコ製品の調製におけるラッカーゼ及びプロテアーゼの
利用。 - 【請求項43】 請求項1〜38のいずれか1項記載の方法により得られる
ことのできるタバコ材料。 - 【請求項44】 少なくとも一種のフェノール系化合物の濃度がそれの由来
するタバコ材料のそれと比較して低下した改変タバコ製品であって、タバコ材料
をフェノール酸化酵素で処理することにより製造されるタバコ製品。 - 【請求項45】 前記製品が請求項1〜27のいずれかに規定の1又は複数
の工程を更に含んで成る方法により製造されたものである、請求項44記載の改
変タバコ製品。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK199800905 | 1998-07-08 | ||
DKPA199800905 | 1998-07-08 | ||
PCT/DK1999/000389 WO2000002464A1 (en) | 1998-07-08 | 1999-07-07 | Use of a phenol oxidising enzyme in the treatment of tobacco |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010172149A Division JP2011010656A (ja) | 1998-07-08 | 2010-07-30 | タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002520005A true JP2002520005A (ja) | 2002-07-09 |
Family
ID=8098853
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000558734A Withdrawn JP2002520005A (ja) | 1998-07-08 | 1999-07-07 | タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 |
JP2010172149A Withdrawn JP2011010656A (ja) | 1998-07-08 | 2010-07-30 | タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 |
JP2013272447A Withdrawn JP2014057603A (ja) | 1998-07-08 | 2013-12-27 | タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010172149A Withdrawn JP2011010656A (ja) | 1998-07-08 | 2010-07-30 | タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 |
JP2013272447A Withdrawn JP2014057603A (ja) | 1998-07-08 | 2013-12-27 | タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1094724B1 (ja) |
JP (3) | JP2002520005A (ja) |
AT (1) | ATE225612T1 (ja) |
AU (1) | AU761885B2 (ja) |
BR (1) | BR9911909B1 (ja) |
CA (1) | CA2316249C (ja) |
DE (1) | DE69903430T2 (ja) |
WO (1) | WO2000002464A1 (ja) |
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006046517A1 (ja) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Japan Tobacco Inc. | 喫煙時の刺激・辛みを低減させたタバコ材、香喫味剤、再生タバコ材、タバコ材の製造方法、および香喫味剤の製造方法 |
WO2007125831A1 (ja) | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Japan Tobacco Inc. | タバコ刻およびタバコ処理方法 |
JP2011522558A (ja) * | 2008-06-13 | 2011-08-04 | ブリティッシュ アメリカン タバコ (インヴェストメンツ) リミテッド | タバコの処理方法 |
JP2013507104A (ja) * | 2009-10-09 | 2013-03-04 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 酸化防止剤と酸化防止剤スカベンジャーとを使用するタバコ抽出物の組合せ処理 |
JP2013524813A (ja) * | 2010-04-21 | 2013-06-20 | アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー | タバコ種子由来成分および材料 |
WO2015129098A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ原料の製造方法 |
WO2015129680A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | 日本たばこ産業株式会社 | 香喫味成分の抽出方法及び嗜好品の構成要素の製造方法 |
JP2015530078A (ja) * | 2012-07-19 | 2015-10-15 | アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー | タバコ植物を酵素で処理するための方法 |
JP2015530082A (ja) * | 2012-08-03 | 2015-10-15 | ブリティッシュ アメリカン タバコ (インヴェストメンツ) リミテッドBritish Americantobacco (Investments) Limited | タバコ抽出物、その調製 |
WO2016063775A1 (ja) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ原料の製造方法 |
CN106028844A (zh) * | 2014-02-26 | 2016-10-12 | 日本烟草产业株式会社 | 芳香味成分的提取方法和嗜好品的构成要素的制造方法 |
WO2019131579A1 (ja) | 2017-12-27 | 2019-07-04 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ抽出物、たばこ抽出物の製造方法、およびたばこ抽出物を用いた非燃焼型香味吸引器 |
WO2020031447A1 (ja) * | 2018-08-10 | 2020-02-13 | 日本たばこ産業株式会社 | 蛍光指紋分析による試料の評価・推定方法、プログラム、及び装置 |
JPWO2020031448A1 (ja) * | 2018-08-10 | 2021-05-13 | 日本たばこ産業株式会社 | クロロフィルと、ポリフェノールまたはテルペノイドの少なくとも一方とを含む植物に由来する材料の区分を判別する基準の作成方法、プログラム、および装置 |
WO2022137745A1 (ja) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ成分濃縮液及びその製造方法、並びに香味生成物品及びその製造方法 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201108860D0 (en) | 2011-05-26 | 2011-07-06 | British American Tobacco Co | Tobacco treatment |
US9420825B2 (en) * | 2012-02-13 | 2016-08-23 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Whitened tobacco composition |
GB201221210D0 (en) | 2012-11-26 | 2013-01-09 | British American Tobacco Co | Treatment of tobacco material |
GB201221199D0 (en) * | 2012-11-26 | 2013-01-09 | British American Tobacco Co | Treatment of tobacco material |
US9155334B2 (en) | 2013-04-05 | 2015-10-13 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Modification of bacterial profile of tobacco |
US9980509B2 (en) | 2013-04-05 | 2018-05-29 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Modification of bacterial profile of tobacco |
CN105451580B (zh) * | 2013-08-27 | 2019-03-08 | 日本烟草产业株式会社 | 烟草原料及其制造方法、以及烟草制品 |
CN103932378B (zh) * | 2014-04-29 | 2016-02-24 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 造纸法再造烟叶烟草原料提取液中含渣率的检测方法 |
KR20170074898A (ko) | 2014-10-02 | 2017-06-30 | 디지레츠 인코포레이티드 | 일회용 탱크 전자 담배, 제조 방법 및 사용 방법 |
EP3231420A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-10-18 | G.L. Pharma GmbH | Abuse-deterrent pharmaceutical compositions |
EP3210596A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-08-30 | G.L. Pharma GmbH | Abuse-deterrent pharmaceutical composition |
EP3210630A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-08-30 | G.L. Pharma GmbH | Abuse-deterrent pharmaceutical compositions |
US10813383B2 (en) | 2016-12-12 | 2020-10-27 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Dehydration of tobacco and tobacco-derived materials |
EP3643184A4 (en) * | 2017-08-02 | 2021-05-05 | Japan Tobacco, Inc. | METHOD FOR MANUFACTURING TOBACCO FLAVOR LIQUID AND TOBACCO FLAVOR LIQUID |
US11278050B2 (en) | 2017-10-20 | 2022-03-22 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Methods for treating tobacco and tobacco-derived materials to reduce nitrosamines |
CN112120266B (zh) * | 2020-08-26 | 2022-01-21 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种三类或四类卷烟叶组配方的加工方法 |
CN112120265B (zh) * | 2020-08-26 | 2022-01-21 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种含久龄烟叶的叶组配方的加工方法 |
CN115606830A (zh) * | 2022-08-17 | 2023-01-17 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种烟草香型调控剂及其在调控烟草香型中的应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3599645A (en) * | 1969-03-18 | 1971-08-17 | Research Corp | Treatment of tobacco to reduce polyphenol content |
JPS5070500A (ja) * | 1973-10-23 | 1975-06-11 | Nippon Oil Co Ltd | |
GB2069814A (en) * | 1980-02-27 | 1981-09-03 | Inst Przemyslu Fermentacyjnego | Microbiological treatment of tobacco and forming reconstituted tobacco or substitute |
JPH0310667A (ja) * | 1989-05-30 | 1991-01-18 | R J Reynolds Tobacco Co | タバコ材加工方法 |
JPH07505521A (ja) * | 1991-12-31 | 1995-06-22 | イマスコ・リミテッド | タバコの処理 |
JPH09206071A (ja) * | 1996-01-29 | 1997-08-12 | Novo Nordisk As | バクテリア由来の酸化酵素 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5231959B2 (ja) * | 1973-10-27 | 1977-08-18 | ||
US4347324A (en) * | 1979-09-24 | 1982-08-31 | Leaf Proteins, Inc. | Process for isolation of proteins from plant leaves |
JPS6045908B2 (ja) * | 1982-12-09 | 1985-10-12 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ原料の改質処理方法 |
JPH04126037A (ja) * | 1990-09-14 | 1992-04-27 | Lotte Co Ltd | 酵素処理によるカカオニブおよびその加工品の香味改良方法 |
JP3320307B2 (ja) * | 1996-06-06 | 2002-09-03 | 株式会社エス・ディー・エス バイオテック | フェノール性化合物等の高分子化方法及びその利用 |
-
1999
- 1999-07-07 DE DE69903430T patent/DE69903430T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-07 AU AU47698/99A patent/AU761885B2/en not_active Ceased
- 1999-07-07 CA CA2316249A patent/CA2316249C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-07 WO PCT/DK1999/000389 patent/WO2000002464A1/en active IP Right Grant
- 1999-07-07 BR BRPI9911909-9A patent/BR9911909B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-07-07 AT AT99931028T patent/ATE225612T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-07 EP EP99931028A patent/EP1094724B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-07 JP JP2000558734A patent/JP2002520005A/ja not_active Withdrawn
-
2010
- 2010-07-30 JP JP2010172149A patent/JP2011010656A/ja not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-12-27 JP JP2013272447A patent/JP2014057603A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3599645A (en) * | 1969-03-18 | 1971-08-17 | Research Corp | Treatment of tobacco to reduce polyphenol content |
JPS5070500A (ja) * | 1973-10-23 | 1975-06-11 | Nippon Oil Co Ltd | |
GB2069814A (en) * | 1980-02-27 | 1981-09-03 | Inst Przemyslu Fermentacyjnego | Microbiological treatment of tobacco and forming reconstituted tobacco or substitute |
JPH0310667A (ja) * | 1989-05-30 | 1991-01-18 | R J Reynolds Tobacco Co | タバコ材加工方法 |
JPH07505521A (ja) * | 1991-12-31 | 1995-06-22 | イマスコ・リミテッド | タバコの処理 |
JPH09206071A (ja) * | 1996-01-29 | 1997-08-12 | Novo Nordisk As | バクテリア由来の酸化酵素 |
Cited By (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2006046517A1 (ja) * | 2004-10-27 | 2008-05-22 | 日本たばこ産業株式会社 | 喫煙時の刺激・辛みを低減させたタバコ材、香喫味剤、再生タバコ材、タバコ材の製造方法、および香喫味剤の製造方法 |
WO2006046517A1 (ja) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Japan Tobacco Inc. | 喫煙時の刺激・辛みを低減させたタバコ材、香喫味剤、再生タバコ材、タバコ材の製造方法、および香喫味剤の製造方法 |
WO2007125831A1 (ja) | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Japan Tobacco Inc. | タバコ刻およびタバコ処理方法 |
US8001979B2 (en) | 2006-04-25 | 2011-08-23 | Japan Tobacco Inc. | Shredded tobacco and method of treating tobacco |
JP4766709B2 (ja) * | 2006-04-25 | 2011-09-07 | 日本たばこ産業株式会社 | タバコ刻およびタバコ処理方法 |
JP2011522558A (ja) * | 2008-06-13 | 2011-08-04 | ブリティッシュ アメリカン タバコ (インヴェストメンツ) リミテッド | タバコの処理方法 |
JP2013507104A (ja) * | 2009-10-09 | 2013-03-04 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 酸化防止剤と酸化防止剤スカベンジャーとを使用するタバコ抽出物の組合せ処理 |
JP2013524813A (ja) * | 2010-04-21 | 2013-06-20 | アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー | タバコ種子由来成分および材料 |
US10709166B2 (en) | 2012-07-19 | 2020-07-14 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Method for treating tobacco plants with enzymes |
JP2015530078A (ja) * | 2012-07-19 | 2015-10-15 | アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー | タバコ植物を酵素で処理するための方法 |
JP2015530082A (ja) * | 2012-08-03 | 2015-10-15 | ブリティッシュ アメリカン タバコ (インヴェストメンツ) リミテッドBritish Americantobacco (Investments) Limited | タバコ抽出物、その調製 |
WO2015129098A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ原料の製造方法 |
JPWO2015129098A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2017-03-30 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ原料の製造方法 |
CN106028844A (zh) * | 2014-02-26 | 2016-10-12 | 日本烟草产业株式会社 | 芳香味成分的提取方法和嗜好品的构成要素的制造方法 |
CN106028843A (zh) * | 2014-02-26 | 2016-10-12 | 日本烟草产业株式会社 | 香烟原料的制造方法 |
CN106061295A (zh) * | 2014-02-26 | 2016-10-26 | 日本烟草产业株式会社 | 芳香味成分的提取方法和嗜好品的构成要素的制造方法 |
JP6101860B2 (ja) * | 2014-02-26 | 2017-03-22 | 日本たばこ産業株式会社 | 香喫味成分の抽出方法及び嗜好品の構成要素の製造方法 |
JPWO2015129680A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2017-03-30 | 日本たばこ産業株式会社 | 香喫味成分の抽出方法及び嗜好品の構成要素の製造方法 |
US11039639B2 (en) | 2014-02-26 | 2021-06-22 | Japan Tobacco Inc. | Producing method of tobacco raw material |
JPWO2016063775A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2017-04-27 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ原料の製造方法 |
KR101851090B1 (ko) | 2014-02-26 | 2018-04-20 | 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤 | 담배 원료의 제조 방법 |
US11064726B2 (en) | 2014-02-26 | 2021-07-20 | Japan Tobacco Inc. | Extraction method of flavor constituent and manufacturing method of composition element of favorite item |
US10750774B2 (en) | 2014-02-26 | 2020-08-25 | Japan Tobacco Inc. | Extraction method of flavor constituent and manufacturing method of composition element of favorite item |
US10624387B2 (en) | 2014-02-26 | 2020-04-21 | Japan Tobacco Inc. | Producing method of tobacco raw material |
WO2015129680A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | 日本たばこ産業株式会社 | 香喫味成分の抽出方法及び嗜好品の構成要素の製造方法 |
WO2016063775A1 (ja) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ原料の製造方法 |
WO2019131579A1 (ja) | 2017-12-27 | 2019-07-04 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ抽出物、たばこ抽出物の製造方法、およびたばこ抽出物を用いた非燃焼型香味吸引器 |
WO2020031447A1 (ja) * | 2018-08-10 | 2020-02-13 | 日本たばこ産業株式会社 | 蛍光指紋分析による試料の評価・推定方法、プログラム、及び装置 |
JPWO2020031447A1 (ja) * | 2018-08-10 | 2021-05-13 | 日本たばこ産業株式会社 | 蛍光指紋分析による試料の評価・推定方法、プログラム、及び装置 |
JPWO2020031448A1 (ja) * | 2018-08-10 | 2021-05-13 | 日本たばこ産業株式会社 | クロロフィルと、ポリフェノールまたはテルペノイドの少なくとも一方とを含む植物に由来する材料の区分を判別する基準の作成方法、プログラム、および装置 |
JP7021755B2 (ja) | 2018-08-10 | 2022-02-17 | 日本たばこ産業株式会社 | 蛍光指紋分析による試料の評価・推定方法、プログラム、及び装置 |
WO2022137745A1 (ja) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 日本たばこ産業株式会社 | たばこ成分濃縮液及びその製造方法、並びに香味生成物品及びその製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1094724B1 (en) | 2002-10-09 |
ATE225612T1 (de) | 2002-10-15 |
DE69903430T2 (de) | 2003-06-05 |
CA2316249C (en) | 2012-11-27 |
WO2000002464A1 (en) | 2000-01-20 |
AU4769899A (en) | 2000-02-01 |
BR9911909A (pt) | 2001-03-27 |
CA2316249A1 (en) | 2000-01-20 |
DE69903430D1 (de) | 2002-11-14 |
JP2014057603A (ja) | 2014-04-03 |
JP2011010656A (ja) | 2011-01-20 |
BR9911909B1 (pt) | 2009-01-13 |
AU761885B2 (en) | 2003-06-12 |
EP1094724A1 (en) | 2001-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2002520005A (ja) | タバコの処理におけるフェノール酸化酵素の利用 | |
US6298859B1 (en) | Use of a phenol oxidizing enzyme in the treatment of tobacco | |
Zimmermann et al. | Light-induced changes of enzyme activities in parsley cell suspension cultures: Purification and some properties of phenylalanine ammonia-lyase (EC 4.3. 1.5) | |
Bilal et al. | Purification and biochemical characterization of extracellular manganese peroxidase from Ganoderma lucidum IBL-05 and its application | |
JP2010510786A (ja) | テアフラビン富化茶製品の調製方法 | |
EP0876403B1 (en) | Enzymatic gelling of polymeric materials | |
Cloughley | The effect of temperature on enzyme activity during the fermentation phase of black tea manufacture | |
Ibrahim et al. | Oxygen supply to bacterial suspensions of high cell densities by hydrogen peroxide | |
Ziegenhagen et al. | Degradation of humic acids by manganese peroxidase from the white‐rot fungus Clitocybula dusenii | |
Šušla et al. | Implication of Dichomitus squalens manganese-dependent peroxidase in dye decolorization and cooperation of the enzyme with laccase | |
Jordan et al. | Detection and quantification of oxalic acid from the brown-rot decay fungus, Postia placenta | |
JP6133268B2 (ja) | リグニン誘導体の製造方法 | |
Nutsubidze et al. | Consecutive polymerization and depolymerization of kraft lignin by Trametes cingulata | |
JPH09238650A (ja) | γ−アミノ酪酸を多量に含有する食品素材およびその製造方法 | |
Robins et al. | α-acid degradation by suspension culture cells of Humulus lupulus | |
GB2501671A (en) | Smoking article | |
JP2004049145A (ja) | 麦茶飲料および麦茶抽出液の製造方法 | |
Jha et al. | Biopulping of sugarcane bagasse using manganese peroxidase from Penicillium oxalicum isolate-1 | |
WO1993025702A1 (en) | Process for producing substance lowering cholesterol level | |
Yazbik et al. | Fast and efficient purification of chloroperoxidase from C. fumago | |
Dahiya et al. | Characterisation of laccase produced by Coniothyrium minitans | |
WO1993023477A1 (en) | Production of a lignin solution or gel, of a binder and of a wood composite | |
BE1013340A6 (fr) | Procede pour la fabrication de tanins oenologiques. | |
DE19928158C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von aromatischen Carbonylverbindungen aus Styrolen | |
Calvo et al. | Pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry characterization of wheat straw alkaline-cooking effluents after biological treatment with the fungi Phanerochaete chrysosporium and Ganoderma australe |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060706 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090310 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090609 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090616 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090910 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100330 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20100629 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100629 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100730 |
|
A072 | Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073 Effective date: 20100928 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20101129 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20101209 |