BE1013340A6

BE1013340A6 - Procede pour la fabrication de tanins oenologiques.

Info

Publication number: BE1013340A6
Application number: BE2000/0174A
Authority: BE
Original assignee: Robert Stiernon S A Nv Ets
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2001-12-04
Also published as: US7396549B2; AU4037801A; AU783972B2; US20030054056A1; ZA200206695B; WO2001064830A1; EP1287110A1

Abstract

L'invention a pour objet une composition enzymatique comprenant principalement des enzymes de la classe des cellulases, ainsi qu'un bain aqueux pour l'extraction de tanins oenologiques, comprenant une activité endocellulase, une activité xylanase, une activité Beta-mannanase, une activité Beta-glucosidase et une activité alpha-amylase. L'invention a également pour objet un procédé de transformation enzymatique des tanins oeologiques, comportant une étape de mise en contact des tanins avec un bain aqueux comportant la composition suivant l'invention, dans le but de modifier les propriétés organoleptiques de ces tanins.

Description


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   PROCEDE POUR LA FABRICATION DE TANINS OENOLOGIQUES
La présente invention concerne une composition enzymatique et un bain aqueux pour l'extraction de tanins à usage oenologique et leur transformation dans le but de modifier leurs propriétés organoleptiques, ainsi qu'un procédé utilisant cette composition enzymatique et ce bain. 



   Selon le Codex oenologique international, le tanin oenoligique est retiré soit de la noix de galle, soit d'un bois riche en tanin (châtaignier, écorce de chêne), soit des pépins de raisin, etc. Le tanin est composé d'un mélange de glucosides, d'acide ellagique, d'acide gallique, de catéchol, etc. 



  ETAT DE LA TECHNIQUE
L'extraction de tanins d'un support végétal se passe généralement de la façon suivante : réduit en copeaux après un éventuel traitement thermique (chauffe et/ou brûlage léger à fort), le support végétal subit une extraction aqueuse ou hydro-alcoolique à une température comprise entre 20 et 100  C. Cette infusion est ensuite concentrée puis lyophilisée ou atomisée. La lyophilisation est généralement préférée afin de mieux préserver les propriétés organoleptiques. 



  DESCRIPTION DE L'INVENTION
La présente invention a pour but de fournir un procédé d'extraction et de transformation des tanins par voie enzymatique, afin d'augmenter les rendements d'extraction, et de transformer enzymatiquement certaines molécules ayant des caractères astringents ou amers en des molécules gustativement plus acceptables. 



   L'invention a pour objet une composition enzymatique comprenant principalement des enzymes de la classe des 

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 cellulases, ainsi qu'un bain aqueux pour l'extraction de tanins oenologiques, comprenant une activité endocellulase, une activité xylanase, une   activité P-mannanase,   une activité   ss-glucosidase   et une activité a-amylase. 



   L'invention a également pour objet un procédé de transformation enzymatique des tanins oenologiques, comportant une étape de mise en contact des tanins avec un bain aqueux comportant la composition suivant l'invention. 



   La composition enzymatique peut comprendre des enzymes de type exocellulaire ou endocellulaires. Les enzymes peuvent être d'origine bactérienne, fongique ou de toute autre origine possible. 



  DESCRIPTION DETAILLE DE L'INVENTION
Le support végétal à traiter (noix de galle, chêne,   châtaignier, etc. ) est mis dans un bain contenant de l'eau   ou tout autre solvant approprié et des quantités variables d'enzymes de la classe des hydrolases (classe 3 de l'union internationale de biochimie IUB), de préférence choisis parmi les enzymes de type glucosidase (sous-classe 3.2) et/ ou les enzymes de type lipases (sous-classe 3.1), et les mélanges de ces enzymes. Les enzymes de la sous-classe 3.2 sont également connues sous le nom de cellulases.

   Parmi les glucosidases utilisables pour la présente invention, on peut notamment citer les cellobiohydrolases, les endoglucanases,   les p-glucosidases,   les hemicellulases, les a-amylases, les xylanases, etc., sans perdre de vue que ces enzymes présentent souvent des activités secondaires à coté de leur activité principale. 



   En fonction de l'utilisation de cellulases neutres ou acides, le pH est ajusté entre 3 et 8, de préférence entre 4 et 7. La température du bain est maintenue constante entre 20 et 90  C, de préférence entre 40 et 60  C. Après ce 

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 traitement par immersion pouvant durer de 5 minutes à 2 semaines, de préférence entre 1 heure et 24 heures, en fonction du support choisi, du volume à traiter, du volume du bain, de la température et du pH, l'extrait est filtré puis lyophilisé. 



   Une alternative à ce traitement consiste à solubiliser des tanins obtenus par la méthode classique d'extraction et de les traiter en phase aqueuse avec la composition enzymatique. 



   Il s'est avéré que le procédé suivant l'invention permet une hydrolyse des ellagitanins solubles, naturellement présents dans le bois, ainsi que d'une partie des ellagitanins liés aux polysaccharides pariétaux, et de diverses molécules aromatiques telles l'acide digallique ou les coumarines hétérosidiques. 



   Le procédé suivant l'invention permet donc d'améliorer l'impression gustative des extraits de bois en éliminant une partie significative des composés indésirables (comme certains composés phénoliques) et en hydrolysant des formes jugées amères ou astringentes. 



   L'invention a pour objet une composition enzymatique comprenant principalement des enzymes de la classe des cellulases, ainsi qu'un bain aqueux comportant cette composition. La composition enzymatique suivant l'invention comprend une activité endocellulase comprise entre 1. 10' et 100. 10" ECU (de préférence entre 3. 10" et 30.   10b ECU)   par tonne de sciure à traiter, une activité xylanase comprise entre 0,6.   10"   et 60. 10' BXU (de préférence entre 2.   10"   et 20.   101, BXU)   par tonne de sciure à traiter, une activité   ss-mannanase   comprise entre 0,4. 10" et 40. 10" MNU (de préférence entre 1. 10" et 10.   10" MNU)   par tonne de sciure à traiter et une activité a-amylase comprise entre 1. 10" et 

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 100.

   10" aTU (de préférence entre 3. 106 et 30.   106   aTU) par tonne de sciure à traiter. 



  MATERIEL ET METHODE 1. Origine des échantillons de bois
Les échantillons sont obtenus à partir de bois de coeur duraminisé. Les échantillons à traiter par la composition enzymatique selon l'invention sont simplement séchés au séchoir (1 mois, 400 C, avec ventilation). Les différents échantillons pris au hasard sont rabotés puis réduits en sciure par broyage dans l'azote liquide, avant d'être tamisés pour ne conserver que les particules de dimension inférieure à 250 pm. Les échantillons sont conservés après lyophilisation pour être analysés dans un délai de 2 mois. 



  2. Réalisation des extraits et contrôle de leur composition
1 g de sciure (250 pm) est soumis à extraction par 1QO ml de solvant (acétone/eau 7 : 3 en volume) pendant 12 h à température ambiante sur table d'agitation ; l'extrait obtenu est ensuite filtré sur membrane, lyophilisé et pesé. 



   100   pg   d'extrait lyophilisé sont utilisés pour l'identification des ellagitanins majoritaires par un spectromètre de masse LSIMS. 



   1 mg de l'extrait est repris par du méthanol/eau (6 : 4) pour être analysée par HPLC couplée à un détecteur UV et à un spectromètre de masse LSIMS, selon le dispositif mis au point par Vivas et al. (1995). La méthode de séparation HPLC est décrite dans le paragraphe suivant. 



  3. Dosage des composés phénoliques 3.1. Coumarines
Les coumarines sont quantitativement extraites à l'éther diéthylique à partir de 20 ml d'un extrait de bois. 



  La phase organique est évaporée à sec et le résidu repris 

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 par du méthanol. L'analyse HPLC est réalisée par un Varian 5060 couplé avec un détecteur spectrofluorimètre (Kontron   SFM23/B)   et colonne Ultrasphère ODS. Les coumarines pures ont été fournies par Extrasynthèse (aesculine, aesculétine, scopolétine, ombelliférone, methyl-ombelliférone) et Sigma (sporalen). On observe les coumarines en fluorescence (excitation 425 nm et émission 325 nm). 



  3.2. Ellagitanins 3.2. 1. Produits de référence
La vescalagine et la castalagine sont isolées et purifiées à partir du duramen de Q. robur, dans les conditions décrites par Vivas et al. (1995). Les différentes roburines (A-E) et la grandinine proviennent de Scalbert (INA/INRA Thierval-Grignon). 



  3.2. 2. Séparation et dosage des ellagitanins par HPLC
La technique chromatographique de séparation et de dosage des ellagitanins est conforme à la méthode mise au point par Scalbert et al. (1990). Les extraits de bois sont analysés par HPLC sur colonne Ultrasphère ODS. La détection est conduite à   k=280   nm. 



  3.2. 3. Dosage des ellagitanins totaux Estimation du taux de composés phénoliques totaux
L'estimation de la richesse des extraits de bois en composés phénoliques totaux est réalisée soit par la méthode utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu, soit par la mesure de l'absorbance à 280 nm des extraits dilués au 1/100 (Vivas et al., 1993). Ces deux méthodes donnent des résultats comparables mais non spécifiques des ellagitanins. 

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  Réaction d'oxydation à l'acide nitreux
Dans cette méthode proposée par Bate-Smith (1972), les esters de l'acide hexahydroxyphénique et du glucose sont oxydés par l'acide nitreux sous azote. La réaction conduit à une coloration bleue que l'on mesure à 600 nm. Les résultats sont estimés en mg/g d'équivalent castalagine   (go", :   983   g'").   



  Dégradation acide
La méthode proposée est adaptée de celle mise au point par Peng et al. (1991). Elle est basée sur l'hydrolyse acide des ellagitanins, suivi d'un dosage par HPLC de l'acide ellagique libéré. Les résultats sont exprimés en mg/g d'équivalent castalagine, en considérant qu'une mole de castalagine donne dans ces conditions une mole d'acide ellagique (Peng et al., 1991). 



  4. Extraction et dosage des polysaccharides 4.1. Etude de la fraction polysaccharide des échantillons témoins et traités 4.1. 1. Extraction des polysaccharides
139 g de sciure sèche sont mis à macérer 72 h dans de l'eau, sur table d'agitation à température ambiante. La solution est ensuite filtrée puis centrifugée. L'extrait est alors concentré jusqu'à 500 ml. 



  4.1. 2. Isolement des polysaccharides
Les extraits subissent 3 précipitations (une à 1 : 9 d'eau/éthanol à 95      vol., deux à 1 : 5 du même mélange). La précipitation est conduite à 30 C pendant 12 h. Ensuite les fractions sont lyophilisées. 

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  4.1. 3. Caractérisation partielle
Le précipité présente un aspect floconneux de couleur très pâle, légèrement gris, qui est probablement un complexe avec les ellagitanins dont il est difficile d'isoler la fraction polysaccharidique. 



  4.1. 4. Dosage par méthode chimique Dosage des polysaccharides neutres (Pn)
Les polysaccharides neutres sont dosés par la méthode au phénol sulfurique. La densité optique est lue à 490 nm et les résultats sont exprimés en mg/l d'équivalent glucose. 



  Dosage des polysaccharides acides (Pa)
Les polysaccharides acides sont dosés par la méthode au métaphénylphénol. La densité optique est mesurée à 520 nm et les résultats sont exprimés en   mg/1   d'équivalent acide galacturonique. 



  4.2. Extraction et dosage des polysaccharides du bois 
1 g de copeaux est mis à macérer 24 h dans l'eau à   20    C sur table d'agitation. La solution est collectée par filtration et centrifugée. La sciure récupérée est alors séchée et mise à macérer une nouvelle fois dans une solution de soude à   5'Il   dans les mêmes conditions. La solution alcaline est également collectée par filtration et centrifugée. Puis les deux catégories d'extrait (eau et soude) sont supplémentés en éthanol à   95 su   à raison 1 : 5 en volume. Les polysaccharides sont alors collectés par centrifugation et repris par de l'eau distillée à 60  C. Le dosage des Pn est réalisé au phénol sulfurique et les Pa au métaphénylphénol.

   Les solutions de référence sont respectivement une solution aqueuse à 100 mg/l de glucose et 50 mg/l d'acide galacturonique pour Pn et Pa. 

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  EXEMPLES Exemple 1
Dans une cuve contenant 1.000 kg de sciure de chêne, on ajoute 5.000 1 d'eau et 5 kg de composition enzymatique selon l'invention. On ajuste le pH à 5,0 avec de l'acide citrique et on élève la température à 60  C. Après un traitement de 24 h, la cuve est vidée et le liquide est filtré puis lyophilisé. 



   Après ce traitement, les principaux groupes de composés ont été fractionnés et les différentes fractions ont été comparées par rapport à un témoin non traité. 



   Pour réaliser ce fractionnement, l'extrait du bois de chêne est évaporé à sec. L'extrait sec obtenu est repris par un volume d'eau, sous agitation pendant 2 heures à   300 C.   La fraction insoluble obtenue comporte les lignines. 



  La fraction soluble est à nouveau évaporée à sec. L'extrait sec obtenu est alors repris par un volume d'un mélange éthanol/eau (9 : 1 en volume) et conservé 12 h à 4  C. La fraction insoluble obtenue comporte les polysaccharides. La fraction soluble quant à elle comporte les ellagitanins. 



  Dans la sciure traitée, l'extrait sec est de 4,   2   en poids par rapport au bois, contre 12,   3   en poids pour le témoin de bois non traité. Les pourcentages en poids de chacune des trois fractions par rapport à l'extrait sec sont repris dans le tableau I. 



  Tableau I 
 EMI8.1 
 
<tb> 
<tb> Ellagitanins <SEP> Polysaccharides <SEP> Lignines
<tb> Témoin <SEP> 60 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> Traité <SEP> suivant <SEP> 35 <SEP> n <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 0
<tb> l'invention
<tb> 
 
Cet essai a permis de mettre en évidence une hydrolyse des ellagitanins, parallèlement avec une augmentation relative de la teneur en polysaccharides, dans l'extrait sec. 

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   Ces différentes fractions ont ensuite été soumises à des dosages plus précis, mettant en évidence une diminution des matières sèches extractibles, des ellagitanins, des proanthocyanidines, et des coumarines glucosylées (voir tableau II). 



  Tableau II 
 EMI9.1 
 
<tb> 
<tb> Résultats <SEP> en <SEP> mg/g <SEP> de <SEP> Témoin <SEP> Traité <SEP> suivant
<tb> sciure <SEP> l'invention
<tb> Extrait <SEP> sec <SEP> 123 <SEP> 42
<tb> Ellagitanins <SEP> 54 <SEP> 21
<tb> Proanthocyanidines <SEP> 0,62 <SEP> 0,12
<tb> Coumarines <SEP> :
<tb> glucosylées <SEP> (aesculine <SEP> +
<tb> scopoline) <SEP> 5,7 <SEP> 1,4
<tb> aglucones <SEP> (aesculétine <SEP> +
<tb> scopolétine) <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 6,8
<tb> 
 
Une augmentation substantielle des polysaccharides a également été constatée dans un autre essai où le dosage a permis de distinguer entre les polysaccharides Pn et Pa (voir tableau III). 



  Tableau III 
 EMI9.2 
 
<tb> 
<tb> Polysaccharides <SEP> solubles
<tb> (mg/g <SEP> de <SEP> sciure)
<tb> Neutres <SEP> (Pn) <SEP> Acides <SEP> (Pa)
<tb> Témoin <SEP> 370 <SEP> 25
<tb> Traité <SEP> suivant
<tb> l'invention <SEP> 625 <SEP> 48
<tb> 
 
Le traitement permet donc d'éliminer certaines substances jugées indésirables de par leur caractère 

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 astringent (comme la castalagine) ou amer (comme l'aesculine) et de les transformer en molécules gustativement neutres (comme l'acide gallique, l'acide ellagique et dans une moindre mesure l'aesculétine), ainsi que d'augmenter la teneur en polysaccharides (ce qui tendra à donner plus de rondeur et de gras au vin élevé en présence de cet extrait de bois). 



   Une série de tests de dégustation ont également été réalisés (voir tableau IV). Ceux-ci confirment les expériences précédentes dans le sens où la quantité d'extrait de bois nécessaire pour percevoir les caractères amers ou astringents sont beaucoup plus élevées dans le cas de sciure traitée enzymatiquement selon l'invention par rapport à la sciure non traitée. 



  Tableau IV 
 EMI10.1 
 
<tb> 
<tb> Comparaison <SEP> des <SEP> seuils <SEP> gustatifs <SEP> de <SEP> perception <SEP> en <SEP> fonction
<tb> du <SEP> mode <SEP> de <SEP> traitement, <SEP> indiquant <SEP> le <SEP> seuil <SEP> de <SEP> perception
<tb> gustatif <SEP> (S50%)* <SEP> en <SEP> mg/l <SEP> de <SEP> solution <SEP> modèle <SEP> de <SEP> vin
<tb> Astringence <SEP> Amertume
<tb> Sciure <SEP> non <SEP> traitée <SEP> 130 <SEP> 110
<tb> Sciure <SEP> traitée
<tb> Selon <SEP> l'invention <SEP> 420 <SEP> 350
<tb> 
 *   b   concentration a partir de laquelle une substance est perçue par   50'6 des   dégustateurs. 



  Exemple 2
On remplace 1.000 kg de sciure de chêne par 1.000 kg de sciure de châtaignier et on procède de la façon décrite à l'exemple 1. 



   Des extraits de châtaignier (riches en acide digallique issu de l'hydrolyse des gallotanins) de diverses provenances ont été soumis (voir tableau V) à une hydrolyse enzymatique par la préparation enzymatique selon l'invention. 

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   Il en ressort une hydrolyse quasi totale de l'acide digallique en acide gallique, ainsi qu'une forte diminution des coumarines glucosylées (les coumarines aglucones étant insipides). 



   Ces résultats revêtent une grande importance car ils montrent la possibilité de valoriser une essence peu employée à ce jour. Le châtaignier présente en effet toutes les qualités requises en oenologie, mais est très peu employé à cause de l'amertume importante qu'il présente. 



   Le traitement enzymatique réduit très fortement cette amertume et permet d'envisager une utilisation plus importante du châtaignier, pour des usages particuliers où le chêne n'est pas approprié. Ainsi, pour l'élevage d'alcools blancs, le châtaignier est tout indiqué parce que ne possédant pas d'ellagitanins, il modifiera peu le goût de fruit de l'alcool, et ne possédant pas de pigments, il ne colorera pas non plus l'alcool à traiter. 



  Tableau V 
 EMI11.1 
 
<tb> 
<tb> Valorisation <SEP> du <SEP> châtaignier <SEP> par <SEP> l'utilisation <SEP> de <SEP> la
<tb> préparation <SEP> enzymatique <SEP> suivant <SEP> l'invention
<tb> Résultats <SEP> en <SEP> mg/g <SEP> de <SEP> Témoin
<tb> sciure <SEP> Acide <SEP> Coumarines
<tb> digallique <SEP> glucosylées
<tb> Châtaignier <SEP> Dordogne <SEP> 10,2 <SEP> 8,3
<tb> Châtaignier <SEP> Dauphiné <SEP> 9,3 <SEP> 5,7
<tb> Châtaignier <SEP> Gironde <SEP> 4,6 <SEP> 10, <SEP> 2
<tb> Traité <SEP> suivant <SEP> l'invention
<tb> Acide <SEP> Coumarines
<tb> digallique <SEP> glucosylées
<tb> Châtaignier <SEP> Dordogne <SEP> < <SEP> 0,1 <SEP> 2,3
<tb> Châtaignier <SEP> Dauphiné <SEP> 0,4 <SEP> 1, <SEP> 7
<tb> Châtaignier <SEP> Gironde <SEP> 0,8 <SEP> 3, <SEP> 5
<tb>

Claims

EMI12.1

R E V E N D I C A T I O N S REVENDICATIONS 1.-Composition enzymatique pour la fabrication de tanins oenologiques à partir de sciure de bois, comprenant principalement des enzymes de la classe des cellulases, présentant une activité endocellulase comprise entre 1. 10" et 100. 10" ECU, de préférence entre 3. 10" et 30. 10" ECU, par tonne de sciure à traiter, une activité xylanase comprise entre 0,6. 10" et 60. 10b BXU, de préférence entre 2. 10' et 20. 10c BXU, par tonne de sciure à traiter, une activité ss-mannanase comprise entre 0,4. 106 et 40. 106 MNU, de préférence entre 1. 10b et 10. 10b MNU, par tonne de sciure à traiter et une activité a-amylase comprise entre 1. 10 et 100. 10" aTU, de préférence entre 3. 10" et 30.

10" aTU, par tonne de sciure à traiter.
2.-Procédé de fabrication de tanins oenologiques à partir de sciure de bois, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de mise en contact par immersion de la sciure de bois avec un bain comprenant principalement une composition enzymatique essentiellement de la classe des cellulases, présentant une activité endocellulase comprise entre 1. 106 et 100. 10 ECU, de préférence entre 3. 106 et 30. 10" ECU, par tonne de sciure à traiter, une activité xylanase comprise entre 0,6. 106 et 60. 10" BXU, de préférence entre 2. 10" et 20. 10" BXU, par tonne de sciure à traiter, une activité ss-mannanase comprise entre 0,4. 106 et 40. 10" MNU, de préférence entre 1. 10" et 10.

1010 MNU, par tonne de sciure à traiter et une activité a-amylase comprise entre 1. 106 et 100. 10' aTU (de préférence entre 3. 10" et 30. 106 aTU) par tonne de sciure à traiter. <Desc/Clms Page number 13>
3.-Procédé suivant la revendication 2 caractérisé en ce que la mise en contact de la sciure avec le bain est effectuée par immersion durant une période, variant de 5 min à 2 semaines.
4.-Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le pH du bain est compris entre 3 et 8.
5.-Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la température du bain est comprise entre 20 et 900 C.