JP7212001B2 - 竜舌蘭ベースのスピリッツ由来のエネルギー飲料及び他の栄養補助材料 - Google Patents

Description

［関連出願］
本出願は、２０１４年９月１６日に出願された米国仮出願６２／０７１，１７９号、及び２０１５年７月１０日に出願された米国仮出願６２／２３１，５９２の利益を主張する。これらの出願の内容は、それらの全体が引用によって本願に組み込まれる。

本発明は、竜舌蘭ベースのスピリッツ、特に種々のテキーラのノンアルコールバージョンに関連し、これらの飲料に含まれるモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害剤によって多種多様な状態を処置することに有用なものに関連する。

竜舌蘭（agave）由来の蒸留スピリッツの調製に関連する広範囲にわたる文献が存在する。例えば、ロイヒテンベルギア・プリンキピス（agave cactus）からのテキーラの調製についての詳細な記載は、引用文献１（Tequila Processing and Flavor, Pedro A. Vazquez-Landaverde and Miriam G. Rodriguez-Olvera, Centro de Investigacion en Ciencia Aplicada y Tecnologfa Avanzada del Instituto Politecnico Nacional Unidad Querretaro, Cerro Blanco 141 Colinas del Cimatario, Queretaro, Qro., Mexico 76090; 2012 American Chemical Society; on the World Wide Web at //pubs.acs.org, 発行日 (ウェブ): ２０１２年７月１６日 doi: 10.1021/bk-2012-1104.ch015）、引用文献２（Flavor Chemistry of Wine and Other Alcoholic Beverages; Qian, M., et al.; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC, 2012）において提供される。これら文献の記載は、その竜舌蘭を出発材料とした処理、発酵、蒸留及び熟成の記載に関して引用によって本願に組み込まれる。手短に言うと、ロイヒテンベルギア・プリンキピスの幹を加熱して複合糖（complex sugars）を加水分解し、そしてシュレッド（寸断）及びクラッシュ（圧壊）してシロップを放出させる。次に、酵母の植菌に適した希釈率をもたらすようにシロップを水で希釈する。発酵の後に、発酵培養液を蒸留して蒸留物を取得する。蒸留物は、テキーラの種々のブランド（銘柄）として販売され、多種のものが存在する。しかしながら、蒸留物はパッケージ及び販売の前に熟成させることができる。

上記の引用文献の特徴的な記載は以下のようである。

１０６～１１６℃でのオーブン（４８時間）又はオートクレーブ（１２時間）ベーキング（焼き処理）を容易にするために、外皮を剥いだ（stripped）成熟した竜舌蘭の葉（「ピフィア：pifia」と称される）を、半分に、１／４に又はより細かくカットする。この加熱処理は、イヌリン及びデンプンのような複合糖を加水分解して、発酵が容易なグルコース及びフルクトースを取得するためのものである。糖は、主にエタノール生成をもたらし、多くの他の化合物がこの基質の発酵から生じる。ピフィアの加熱処理の結果として、主に、フラン類、ピラン類、アルデヒド類、窒素及び硫黄化合物などのメイラード関連化合物が生成される。最も豊富なメイラード化合物は、メチル－２－フロアート（methyl-2-furoate）、２，３－ジヒドロキシ－３，５－ジヒドロ－６－メチル－４（Ｈ）－ピラン－４－オン、及び５－ヒドロキシメチルフルフラールである。ピラジンもメイラード反応に由来する化学化合物の重要な基である。最も豊富に見出されるピラジンは、２，５－ジメチルピラジン及びトリメチルピラジンである。

他の熱関連ブレイクダウン生成物はベーキング（焼き処理）ステップの間に生じる。短い及び長い炭素鎖の遊離脂肪酸が焼き処理したピフィアにおいて見出されており、おそらくアシルグリセロールの加水分解に起因する。β－シクロシトラール及びβ－ダマセノンはカロテノイドのデグラデーション生成物であると思われるが、その一方で４－メチル－５－（２－ヒドロキシエチル）－チアゾールは、アミノ酸チアミンのブレイクダウン生成物である。ｐ－クレゾール及び４－エチルフェノールなどのフェノール類は、フェノール酸のブレイクダウン生成物である。

一度、ピフィアが焼き処理されると、それらはシュレッドミル及びクラッシャに供され、そこで高い濃度の糖及び大多数の化合物を含む全てのシロップを放出する。結果として生じる竜舌蘭の汁液（mash）は、しばしば糖抽出を改善するために洗浄される。

竜舌蘭の処理において、発酵が最も重要であり、かつ複雑な段階であることに疑いはない。１００％竜舌蘭又は混合シロップ（mixto syrups）は、１２～１４°ＢＲＩＸ（糖の８０～１００ｇ／Ｌ）に到着するまで水で希釈される。いくつかのプロセスは室温で実行されるが、発酵は、３０℃に温度調節されたタンク（thermostatized tanks）内で実行される。室温はその年のシーズンに依存して変化し得る。発酵は、全体的に酵母の代謝に依存し、乳酸菌及び酢酸菌の代謝は少ない。多くの酵母のストレインは、竜舌蘭のマスト（発酵前／中の汁）内で見出されており、サッカロミセス・セレビシエ及びクロエケラ・アフリカーナが最も重要なものである。酵母は、炭水化物、アミノ酸、脂肪酸及び他の有機化合物を代謝して、それらをエタノール、グリセロール、二酸化炭素、そして「発酵バイプロダクト」、「コンジナー」と称される少量のアルデヒド、ケトン、高級アルコール、有機酸及びエステルに変換する。高級アルコールは、それらの麦芽の入ったような（malty）そして焦げた（burnt）風味に起因して「フーゼルアルコール」とも称され、ケト酸（２－オキソ酸）を介したアミノ酸の分解によって生成される。最も重要なものは、１－プロパノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－ブタノール、３－メチル－ブタノール及び２－フェニルエタノールであり、後者はバラに似た芳香を有する。酵母細胞内での脂肪酸の合成は、主に、４～１８の偶数個の炭素原子を有する飽和直鎖脂肪酸を生じ、低いレベルでの奇数の炭素数を有する脂肪酸及び不飽和脂肪酸の出現は発酵条件に依存する。脂肪酸は、アルコールとエステルを形成するように結合させることができる。

発酵は、３０～３５℃で１８～２４時間進行する。３５℃の温度での処理は、３０℃よりもより多い揮発性化合物を生成する。また、窒素源の添加は、使用される窒素源に依存して効果が異なるが、酵母による発酵の間の化合物の生成を変化させることが観察されている。２０種のアミノ酸の混合物の添加によって、クロエケラ・アフリカーナのストレインであるＫｌは、より高いエタノール濃度をもたらすることができるし、その濃度に対する耐性を有するが、その一方で、いくつかのエステル、アルコール、アセトアルデヒド及びα－テルピネオールの生成が増加する。硫酸ナトリウム及びアミノ酸を添加したマスト内でサッカロミセス・セレビシエを使用した時には、アミルアルコール及びイソブタノールの濃度が減少する一方でプロパノール及びアセトアルデヒドが増加する。

一度発酵が完了し、アルコール含有量が約１５％ｖ／ｖに到達すると、蒸留のための時になる。発酵した汁液（マッシュ）は、銅製又はステンレス鋼製のやかんの中で、アルコールが蒸発するように７８～８０℃で加熱される。蒸気は冷却したコイルの中で凝縮され、蒸留物が収集される。第１の蒸留物は、～２５％ｖ／ｖのアルコール濃度に到達し、～５５％ｖ／ｖのエタノールに到達するために精溜と称される第２の蒸留を必要とする。次に液体は、３８～４０％ｖ／ｖのアルコールに水で調節される。大多数の化合物は揮発性であるため、それらは蒸留の間にエタノールと一緒に蒸発する。蒸留の間に、揮発物の異なるフラクションを分離するないしは「カット」することが可能である。初期カット（head cut）は、アセトアルデヒド及び酢酸エチルのような高い揮発性の化合物を含むが、その一方で終期カット（tail cut）は、長鎖脂肪酸のエチルエステルなどのより高い沸点の化学物を有する。これら両方の分画は望ましくないため、それらは中期カット（heart cut）から除去することができる。メタノールは、その低い沸点にもかかわらず終期分画において取得される。乳酸エチル、酢酸及びフルフラールも終期分画において蒸留される。イソブチル及びイソミルアルコールは、初期産物としての挙動を示し、ｎ－プロピルアルコールはハート（カット）において見出され、フェニルエチルアルコールは終期産物としての挙動を示す。

熱は、蒸留の間に化合物を生成する上で重要な役割を果たす。これによって、いくつかのブレイクダウン反応が行われて、アルデヒド、ケトン、フラン、硫黄化合物、ピラジン、及びフェノールの生成が行われる。

エタノール含有量が水で４０％に調節された精留蒸留物は、オーク樽の中で２ヶ月間～３年間熟成させることができる。アルデヒドは蒸発する、そして／又は、アセタールを生成する。木製樽の中での熟成によって、バニリン、グアヤコール、オイゲノール、クレゾール及び他のフェノール類などの揮発性化合物は、木材から蒸留物へ移動し、風味をまろやかにする。エチルエステルは発酵の間のみならず、熟成の間においても生成される。脂肪酸と高い濃度のエタノールのエステル化によって、エステルが後に熟成プロセスの間に生成され得ることが報告されている。

上述の記載は、上述の引用文献において見出される。竜舌蘭抽出物及び／又はそれらから調製されたスピリッツの構成要素である広範囲にわたりかつ多様な化合物が同定されている。

Pedro A. Vazquez-Landaverde and Miriam G. Rodriguez-Olvera, ACS Symposium Series, Vol. 1104, Chapter 15, pp. 237-276 M. C. Qian and T. H. Shellhammer, ACS Symposium Series, Vol. 1104

しかしながら、出願人の知るところでは、テキーラとして一般的に販売されている飲料又は竜舌蘭に由来するその他の飲料がＭＡＯ阻害活性を有することは、認識されていない。ＭＡＯ阻害剤は、気分高揚剤、抗うつ剤、パーキンソン病を含む種々の他の病気の処方剤として使用することができることは既知であるので、これらの飲料のアルコールフリーの構成要素（複数）を含むノンアルコール性の「エネルギー飲料」は、これらの文脈において有用である。
上述のように、本発明は、竜舌蘭抽出物から調製されたスピリッツにおけるＭＡＯ阻害剤の存在の利点を採用する。ＭＡＯ阻害剤は、初めから抽出物に存在するか、又は発酵の間に生成されるか、又は蒸留あるいは熟成の間に生成されるし、それらの組み合わせであり得る。特に、出願人は、これらの商業的に入手可能なスピリッツからアルコールを真空（バキューム）を施すことによって除去することはＭＡＯ阻害活性の少なくともいくらかを破壊することを示している。従って、本発明の組成物は、これらのスピリッツからこれらの揮発性の構成要素（components）を保存するプロセスによって調製されなければならない。これらのプロセスは、逆浸透処理、スピニングコーンカラム処理及び揮発性化合物を喪失させない他の方法を含む。

従って、１つの視点において、本発明は、竜舌蘭由来のアルコール飲料を逆浸透処理又は他の揮発性の構成要素を保存するプロセスに供することによって調製される組成物に向けられる。１つの実施形態において、竜舌蘭由来のアルコール飲料は、ロイヒテンベルギア・プリンキピス（agave cactus）の幹を加熱して複合糖を加水分解すること；加熱した幹をシュレッド及びクラッシュしてシロップを放出させること；該シロップを水で１２～１４ＢＲＩＸレベルまで希釈して、酵母を植菌すること；植菌した希釈シロップを発酵させて発酵産物を取得すること；及び発酵産物を蒸留して蒸留物（distillate）を取得すること；によって調製されている。

また、本発明は、ＭＡＯの過剰活性によって特徴付けられる状態を処置する方法であって、そのような処置の必要がある被験者に対して有効量の本発明の組成物を投与する方法にも向けられる。これは、特に鬱病又はパーキンソン病の場合に適する。

更に、本発明は、エタノールの存在下におけるＭＡＯ阻害活性をアッセイする方法に向けられる。有意な量のエタノールは、アッセイを妨げる。従って、アルコールの存在に関して考慮していない通常のアッセイは、誤解を生じさせる結果をもたらすだろう。

つまり、他の視点において、本発明は、エタノールの存在下におけるＭＡＯ阻害剤に関してアッセイする方法に向けられ、該方法はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びアルコールデヒドロゲナーゼをアッセイに加えることを含む。より詳細には、アッセイは、分析されるサンプルに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びアルコールデヒドロゲナーゼと共に、基質－有効量（substrate-effective）のキヌラミンジヒドロブロミドを添加すること；ＭＡＯ Ａ又はＭＡＯ Ｂを添加すること；３７℃でインキュベートすること；強塩基で反応を停止すること；及び３１０ｎｍの励起波長及び４０５ｎｍの発光波長で結果を評価することを含む。

図１は、通常の市販のアッセイキットによって評価した場合の、様々な熟成度合いにおけるテキーラ内のＭＡＯ阻害活性の評価の結果を示す。

図２は、キヌラミンを基質として使用した、種々のテキーラのブランド及び熟成度のＭＡＯ阻害活性の評価の結果を示す。

図３は、種々のフラクションへのテキーラの分画の後の、キヌラミンを基質として用いたＭＡＯ阻害アッセイの結果を示す。

図４は、キヌラミンアッセイに基づく種々のカラムフラクションのＭＡＯ阻害活性を示すグラフである。

図５は、逆浸透処理に供したテキーラのサンプルにおけるＭＡＯ阻害アッセイの結果を示し、濃縮物における活性とろ過液における活性とを比較する。

竜舌蘭植物の抽出物から作られたアルコール飲料のノンアルコール形態は、本発明の主題である。これらのアルコール飲料は、プルケ、テキーラ、メスカル、ソトル（sotol）、バカノラ又は竜舌蘭植物由来の糖から作られた他の発酵物を含む。本発明において、アルコールは、他の揮発性化合物が保持される条件下で除去されている。

これらの組成物は、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害性の特性を有し、気分高揚剤、抗うつ剤としての使用に関して有用であり、又は、パーキンソン病などのある種の病気（複数）の処置に有用である。本発明は、異なる抽出物を等級（グレード）付け及び調製、又は混合して、アルコールの存在下におけるＭＡＯ活性を評価することによって、エネルギー飲料及び／又は気分高揚剤として使用するための、所望の生理学的刺激物又は抗うつ剤の効果を選択する方法にも関連する。本発明の等級付け／評価ツールとしての視点において、異なる竜舌蘭ベースの飲料が、ＭＡＯ、Ａ＋Ｂの各形態に関して、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害のレーティング（rating）を受け、それは、阻害剤が存在しないコントロールに対する相対的なパーセント阻害として表現される。メスカル、テキーラ、バカノラ、ソトル及びプルケに関するレーティングの例は、実施例６に示される。実施例７は、逆浸透処理によって取得したフラクションを解析した場合の同様の結果を示す。

本願に示すように、種々の竜舌蘭由来の飲料を、それらのＭＡＯ Ａ及びＭＡＯ Ｂ阻害剤の含有量に関して直接的に解析することができる。これは、特定の飲料に関する結果をラベル表記に含ませ得るような、レーティングシステムを可能にする。例えば、種々の飲料は、同一の飲料の他のブランドとの比較においてそれらの含有量に基づくスケールの上でランク付けすることができるだろう。ＭＡＯ Ａ及びＭＡＯ Ｂの両方の阻害剤の組み合わせに関するもの、又は各々の個々に関するものであり得る。従って、１～１０のスケール（１０が最良のレーティングであり、そして１が最悪のレーティングである）に関して、同一のアッセイにおいてライバルブランドによって示される４０％阻害と比較したＭＡＯ Ａの８０％阻害を示す飲料には、９ｖｓ５（より低い活性の飲料について）が与えられ得る。特定のスケールでの阻害の相関関係は、消費者に有益な情報をもたらすように設定され得る。もちろん、使用されるスケール又は選択されるレーティングは、１～１０である必要は無く、Ａ～Ｆなどの恣意的に選択され得るいずれかの他のスケールであり得る。

パーセント阻害を測定するために使用されるＭＡＯアッセイにおいては、高い濃度のエタノールを有するサンプルが容認される。本発明のアッセイ方法は、ＭＡＯ活性の阻害を正確に測定することが必要であり、等級付けされる目的のサンプルの主要な構成要素である４０％を上回るエタノールを有するサンプルが許容（tolerate）されなければならない。蒸留した竜舌蘭スピリッツが典型的に有するアルコールの範囲は、プルケの６％からいくつかのテキーラ及びメスカルの約６０％までであるが、より一般的に出くわすサンプルは４０％アルコール（８０プルーフ）を有するであろう。竜舌蘭ベースの飲料に由来するＭＡＯ阻害剤のいくつか（ただし、全てでは無い）の揮発性に起因して、減圧下において又は大気圧における蒸留によってサンプルからエタノールを蒸発させないことが特に重要である。

本発明の組成物は、食品補助・添加物（supplement）として使用すること及び／又は食品あるいは医薬品に含ませること、又は鬱病、パーキンソン病又は全身倦怠感を処置することに使用することができる。組成物は、コーヒー又は脱カフェイン製品の付属物又は置換物としても使用することができる。組成物は、医薬的に又は栄養学的に許容可能な２以上の担体、賦形剤及び／又は希釈液と混合することもできる。従って、一般的には、本発明の組成物は、コーラ又はフルーツフレーバーのソーダなど、ジュース又は他のソフトドリンクに含まれ得るし、又は直接的に消費することができる。組成物は、例えばサラダドレッシングのような調理されていない液状物などの食品にも含ませることができ、サラダの固体の構成要素と一緒に消費されることができる。消費される又は被験者に対して投与される組成物の量は、処置される状態の性質、並びに組成物それ自身において決定されたＭＡＯ阻害剤の濃度に高く依存する。種々の医療上の指示に関する有用なＭＡＯ阻害剤のレベルは、本発明の技術分野において知られているし、そしてこれらのガイドラインに従うことができる。食品補助・添加物としての使用に関しては、これは栄養士又は他の医師の判断次第である。

従って、本発明は、所望の生理学的な効果を有するのに有効な量の本発明の組成物を含む食品及び飲料を含む。

飲料出発材料からエタノールを除去する１つの成功裏の方法は、逆浸透処理（reverse osmosis：ＲＯ）である。１００ダルトンの分子量カットオフを有するＲＯメンブレンは、微生物によって生成されるか又は蒸留の間に生成されるＭＡＯの阻害剤、又は出発材料において自然に生じ得る阻害剤からエタノールを分離する。ＭＡＯ阻害剤の単離は、減圧又は蒸留を使用しないで達成される。従って、本発明の組成物は、最終の所望のエタノール濃度に依存して、例えば、０．７５リットルのテキーラ（又は他の蒸留した竜舌蘭飲料）を７．５～７５リットルの体積まで蒸留水で希釈することによって調製することができる。例えば、８０プルーフ（体積で４０％アルコール）の０．７５リットルのテキーラは、７．５リットルまで希釈され、その点において希釈した材料は体積で４％アルコールである。希釈したテキーラは、～１００ダルトンの分子量カットオフを有するメンブレン（Tangent Membranes, Inc., RO MINI）を装着した逆浸透ユニットの中を循環させられ、ここで希釈した材料は０．７５リットルの体積まで濃縮して戻される。更なるエタノールの減少は、材料を再度７．５リットルに又はより大きく希釈し、そしてＲＯユニットを介した循環を継続することによって達成される。本発明のエネルギー飲料などの組成物の生成のために、希釈及びその後の循環は、産物がノンアルコール性であると認められるまで継続することができる。その際に活性なＭＡＯ阻害剤は、ノンアルコール性の部分である濃縮物に含まれ、そして所望であればビタミン、無機質、アミノ酸、タンパク質又はカフェインを添加することができ、そして上記のように他の食品又は飲料調製物に含ませることができる。

本発明の組成物の生成において、いくつかのＭＡＯ阻害剤が揮発性化合物であり、そして、例えば、加熱蒸留によって又は減圧下で組成物がエタノールの蒸発によって生成される場合には、必要不可欠なＭＡＯ阻害剤のロスが生じることは重要な視点である。

以下の実施例は、例示のために提供され、本発明を限定するものではない。

実施例１
商業的に利用可能なアッセイを使用した種々のテキーラのアッセイ
異なる商業的に利用可能なテキーラ又はメスカルのテストサンプルであるＳ１、Ｓ１ＤＷ、Ｓ２及びＳ３に対して、市販のＭＡＯ活性キットを採用した。キットは、シグマ－アルドリッチから購入した（Cat. No. MAK136 Monoamine oxidase activity kit）。該キットは既知のＭＡＯ阻害剤化合物であるクロルジリン及びパージリンをコントロールとして、そしてチラミンを酵素基質として含む。ホースラディッシュペルオキシダーゼもこのキットに含まれ、包含ラベルであるAmplex（登録商標） redと反応するためにチラミンの酸化から生成される過酸化水素と相互作用する。ＭＡＯ Ａ及び／又はＢの作用は蛍光発光として結果的に生じるイベントのカスケードをもたらす。Ｓ１及びＳ３はテキーラであり、Ｓ１はＳ３の熟成バージョンであり、Ｓ１ＤＷはアルゴンの流れの下での乾燥後に蒸留水で再構成させたＳ１のサンプルである。Ｓ２はメスカルのサンプルであり、青色竜舌蘭以外の竜舌蘭のバージョンから生成されたものである。ＤＷは蒸留水である。蛍光データは、バッファコントロール（阻害剤無し）に対して相対的なパーセント阻害に関して計算される。既知のＭＡＯ Ａの阻害剤であるクロルジリン及び既知のＭＡＯ Ｂの阻害剤であるパージリンはコントロールとして含まれる。図１に示すようにＭＡＯ Ａ又はＢの選択的な阻害がサンプルに依存して達成される。

実施例２
キヌラミンのみのアッセイを使用しての種々のテキーラのテスト
この実施例においては、キヌラミンのみが基質かつアッセイラベルである異なるアッセイが使用される。このアッセイは、キヌラミンをＭＡＯ基質として使用し、そしてそれは、ＭＡＯ Ａ及びＢの両方の基質である。つまり、ペルオキシダーゼに対する影響及びスペクトル干渉が除かれているので、より望ましい方法である。キヌラミンの酸化は、３６０ｎｍ及び３２０ｎｍにおけるＯＤ変化を生じる。産物も蛍光物質であり、３２０ｎｍの励起波長での４００ｎｍの発光輝度の増加によって検出することができる。

アッセイは、クリアなポリスチレン９６－ウェルプレートにおいて、以下のプロトコルに従ってセットアップした：ウェルにリン酸バッファ（２０５μｌ／１００ｍＭ／ｐＨ７．２）、次に、２０μｌの各抽出サンプル、そして１０μＭのコントロール阻害剤であるクロルジリン（ＭＡＯ Ａに関して）及びパージリン（ＭＡＯ Ｂに関して）を加えた。組み換えヒトＭＡＯ Ａ及びＭＡＯ Ｂ（０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質）をコーニング（登録商標）から購入し、そして各アッセイに３μｇのこのタンパク質を供給した。いくつかのアッセイを、同様にコ―ニング（登録商標）から供給されるコントロールとしてのヌル（null）タンパク質で実行した。阻害剤（単数又は複数）、バッファ及びタンパク質は、３７℃にセットしたパワーウェーブ（商標）光学密度読取プレートリーダーにおいて１０分間プレインキュベートできるようにした。次にキヌラミン基質を、各ウェルに加え、そしてプレートを３７℃で３０分間更にインキュベートした。プレートをＯＤ３６０ｎｍで読み、０分から３０分までの吸光度における変化を計算して、％阻害に変換した。サンプルＳ４０、Ｓ４１、Ｓ４２は、それぞれブランコ（blanco）、レポサド（reposado）、アネホ（anejo）であり、熟成の０、１及び２ステージにおける同一の製造者由来のテキーラである。Ｓ１、Ｓ３は、実施例１と同様にテキーラであり及びＳ２はメスカルである。パーセント阻害は、０分～３０分の３６０ｎｍにおける光学密度の変化から計算される。

結果は、図２に示される。
（４０％エタノールを含むサンプル（ＤＪ１９４２）として使用した１つのテキーラは、アルコールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ無しでアッセイに対する干渉効果に関してテストし、干渉を示した。）

実施例３
熟成の影響
キヌラミンアッセイを、３つの異なる熟成度（０、１、２ステージ）のテキーラ、Ｓ４０、Ｓ４１、Ｓ４２をテストすることに使用し、これらのサンプルの水抽出物及びメチレンクロリド抽出物を比較した。熟成したテキーラは、図３に示すように、より若い蒸留物に対して増加したＭＡＯ阻害性活性を示す。

実施例４
ＭＡＯ阻害活性の分画化
テキーラ（１７５０ｍｌ）を脱イオン水で５０００ｍｌまで希釈して、３つのポーションに分画し、そして各ポーションをジクロロメタン（４×１００ｍｌ）で抽出した。抽出物を、組み合わせて脱イオン水（２×１００ｍｌ）で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。サンプルは回転蒸発器を使用する溶媒の蒸発乾燥によって１０ｍｌの体積まで減量させ、次に乾燥シリカを加えて溶媒を室温で除去した。サンプル－吸着シリカを５０ｍｌのベッド量のシリカカラムに乾式でロードし、ヘキサン：酢酸エチルのステップ勾配（１００％ヘキサン、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、１００％酢酸エチル）を実行した。カラムから７ｍｌ流出する毎にフラクションを収集した。サンプルは、以下のようにアッセイした。

Ａ及びＢに関するＭＡＯアッセイは、黒いThermo Scientific（商標）９６－ウェルプレート（＃７２０５）にセットアップし、各アッセイはＤＭＳＯ中に溶解した１μｌのサンプル、８７μｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．４）、３μｌの０．７５ｍＭキヌラミンのストック溶液を含む。ＤＭＳＯ単独を有するコントロールのセット（０阻害剤）、１μｌの５０μＭクロルジリンＤＭＳＯ溶液（ＭＡＯ Ａ阻害コントロールとして）、そして１μｌの５０μＭパージリンＤＭＳＯ溶液（ＭＡＯ Ｂ阻害コントロールとして）、を各プレートに加えた。アッセイを最適化するときに、タンパク質無しのセットをしばしばプレートに含ませた。

各アッセイそれぞれに関して、９μｌのバッファに溶解した７５０ｎｇのタンパク質の量で、組み換えヒトＭＡＯ Ａ及びＭＡＯ Ｂ（コーニング（登録商標）、SUPERSOMES（商標））を、ウェルに加えた。

プレートを３７℃で３０分間インキュベートして、次に、１００μｌの２Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに加えた。プレートは、励起波長３１０ｎｍ及び発光波長４０５ｎｍで蛍光分光光度計において読んだ。

カラムフラクションにおける阻害活性を同定するために、２５μｌの各フラクションを１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブの中に注ぎ、Savant（商標）SpeedVac（商標）において乾燥状態まで蒸発させた。ＤＭＳＯ（５μｌ）を各チューブに加え、１μｌを上記の方法に従ってＭＡＯ Ａ及びＢの阻害活性に関してアッセイした。図４は、収集したフラクションにわたるＭＡＯ Ａ及びＢ阻害活性を示す。

顕著なＭＡＯ阻害がフラクション６～１３において見出される。

実施例５
ＭＡＯ阻害剤を含む油の調製
テキーラ（１００ｍｌ）を脱イオン水で２００ｍｌに希釈し、そしてジクロロメタン（３×５０ｍｌ）で抽出した。抽出物を組み合わせて、無水硫酸ナトリウムのカラムを通過させた。溶媒を回転蒸発器を使用して蒸発させて、３０ｍｇの油分を取得した。この油分のサンプルは、ＭＡＯ Ａを７５％まで、ＭＡＯ Ｂを８７％まで阻害した。

テキーラ（１００ｍｌ）を脱イオン水で２００ｍｌに希釈し、ジクロロメタン（３×５０ｍｌ）で抽出した。抽出物を組み合わせて、無水硫酸ナトリウムのカラムを通過させた。７０℃の水浴で温めたKuderna Danish装置において蒸発乾燥によって溶媒を除去して、結果的に１７ｍｇの油を生じさせた。油のサンプルは、５５％ＭＡＯ Ａ阻害及び８８％ＭＡＯ Ｂ阻害を示した。

実施例６
種々のテキーラ サンプルそれ自体のアッセイ
上述のように、ＭＡＯ阻害活性を有するサンプルは減圧下において蒸発させてはならず、さもなくば化合物はエタノールと一緒に蒸発するだろう。つまり、ＭＡＯ阻害化合物の損失を減少させるため、及び、解析される生成物のＭＡＯ阻害活性を正確に等級付けするために、サンプルはエタノールの蒸発乾燥なしでアッセイするべきである。アッセイは、黒いThermo Scientific（商標）９６－ウェルプレート（＃７２０５）において以下のようにセットアップした。

各アッセイは、５μｌのサンプル、０．９７５μｇのキヌラミンジヒドロブロミド、０．７５μモルのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を、９３μｌの総体積中に、１００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）と共に含んだ。

アルコールデヒドロゲナーゼを０．２５ユニット／ｍｌに希釈して、３μｌをウェルに加えた。プレートを２５～３７℃で１５分間インキュベートした。

５ｍｇ／ｍｌで供給されるヒト組み換えＭＡＯ Ａ及びＢ（コ―ニング）を、２０μｌずつにバイアル中に分注し、アッセイのために２４６μｌのバッファで希釈し、次に４μｌの各ＭＡＯをそのウェルの各々に加えた。

プレートを３７℃で３０分間インキュベートして、２Ｎ ＮａＯＨ（１００μｌ）を加え、プレートを励起波長３１０ｎｍ及び発光波長４０５ｎｍで読んだ。

このアッセイを使用して、種々のテキーラサンプルをテストした。結果は表１に示される。
表１
種々の竜舌蘭由来の飲料の評価

実施例７
逆浸透処理（ＲＯ）の影響
～１００ｍｗｃｏフィルタに張り付けたTangent Membranes, Inc.社のＲＯミニを使用して、ＭＡＯ阻害化合物を保持しつつテキーラからのエタノールを分離した。ここでは、１．５リットルのアネホテキーラ（ＤＪＡ）を蒸留水で１５リットルに希釈して、体積が１．５リットルに減量して戻るまでＲＯミニの中を循環させた。１０、２０、３０及び４０μｌの濃縮したサンプル及びろ過液のＭＡＯ阻害活性を評価した（図５）。

図５に示すように、濃縮物はＭＡＯ Ａ及びＢ阻害剤を保持したが、その一方で、ＭＡＯ阻害剤はろ過液には存在せず、希釈したサンプルからのエタノール及び水のみを含んだ。

表２は、種々の飲料、並びに、希釈したテキーラ出発材料（希釈したＲＯコントロールとしてラベルされる）、第１ＲＯ濃縮物、第２ＲＯ濃縮物、第１ＲＯろ過液及び第２ＲＯろ過液に関する結果を示す。ＭＡＯ阻害アッセイにおいて、ろ過液はほとんど阻害活性を有さないことを示し、その一方でほとんどの活性が濃縮物に残る。
表２

なお本発明は、以下の好ましい形態のようにも記載される。
（形態１）
エタノール以外の揮発性化合物を保持する処理によって竜舌蘭に由来するアルコール飲料からエタノールを除去して調製されるモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害性化合物を含む組成物。
（形態２）
アルコール飲料が蒸留物であることを特徴とする形態１に記載の組成物。
（形態３）
前記処理が逆浸透処理であることを特徴とする形態１に記載の組成物。
（形態４）
アルコール飲料が、以下のステップによって調製された蒸留物であることを特徴とする形態１に記載の組成物：
ａ）ロイヒテンベルギア・プリンキピスの幹を加熱して複合糖を加水分解するステップ；ｂ）加熱した幹をシュレッド及びクラッシュしてシロップを放出させるステップ；
ｃ）前記シロップを水で１２－１４ＢＲＩＸレベルまで希釈して、酵母を植菌するステップ；
ｄ）植菌した希釈シロップを発酵させて発酵産物を取得するステップ；及び
ｅ）発酵産物を蒸留して蒸留物を取得するステップ。
（形態５）
ステップａ）がオートクレーブ処理によって実行されることを特徴とする形態４に記載の組成物。
（形態６）
ステップｂ）がシュレッドミル及びクラッシャにおいて実行されることを特徴とする形態４に記載の組成物。
（形態７）
ステップｄ）のプロセスが、サッカロミセス・セレビシエ及びクロエケラ・アフリカーナの存在下において、室温と３０℃の間での発酵を含むことを特徴とする形態４に記載の組成物。
（形態８）
蒸留物が少なくとも３８－４０％ｖ／ｖのエタノール濃度に到達するまで、ステップｅ）が実行されることを特徴とする形態４に記載の組成物。
（形態９）
形態１に記載の組成物を含む食品又は飲料。
（形態１０）
形態２に記載の組成物を含む食品又は飲料。
（形態１１）
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の過剰活性によって特徴付けられる状態を処置する方法であって、
そのような処置の必要がある被験者に対して、有効量の形態１に記載の組成物を投与することを含む方法。
（形態１２）
前記状態が、鬱病又はパーキンソン病であることを特徴とする形態１１に記載の方法。
（形態１３）
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の過剰活性によって特徴付けられる状態を処置する方法であって、
そのような処置の必要がある被験者に対して、有効量の形態９に記載の食品又は飲料を投与することを含む方法。
（形態１４）
エタノール存在下でのＭＡＯ阻害剤についてアッセイする方法であって、
前記アッセイにおいてアルコールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤを含む方法。
（形態１５）
以下のステップを含むことを特徴とする形態１４に記載の方法：
ａ）解析されるサンプルに対して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びアルコールデヒドロゲナーゼと共に、基質有効量のキヌラミンジヒドロブロミドを添加するステップ；
ｂ）ＭＡＯ Ａ及び／又はＭＡＯ Ｂを添加するステップ；
ｃ）３７℃でインキュベートするステップ；
ｄ）強塩基で反応を停止するステップ；及び
ｅ）３１０ｎｍの励起波長及び４０５ｎｍの発光波長で結果を評価するステップ。
（形態１６）
竜舌蘭由来のアルコール飲料に関するレーティングシステムであって、
各飲料が、そのＭＡＯ Ａ阻害剤又はＭＡＯ Ｂ阻害剤、あるいはその両方の含有量に基づいて、品質のスケール上の位置に位置付けられるシステム。

Claims (7)

1. 竜舌蘭由来のノンアルコール飲料に関するレーティング方法であって、
   各飲料を、そのＭＡＯ Ａ阻害剤又はＭＡＯ Ｂ阻害剤、あるいはその両方の含有量に基づいて、品質のスケール上の位置に位置付けるステップを含む方法。
2. エタノールが除去されている飲料に適用される、請求項１に記載のレーティング方法。
3. エタノールが除去されている飲料が、エタノール以外の揮発性化合物を保持する処理によって、竜舌蘭由来の蒸留アルコール飲料からのエタノールの除去によって調製される、請求項２に記載のレーティング方法。
4. 前記処理が、逆浸透処理又はスピニングコーンカラム処理である、請求項３に記載のレーティング方法。
5. 各飲料の品質が、ＭＡＯ Ａ阻害剤の含有量のみに基づいて位置付けられる、請求項１～４のいずれか１項に記載のレーティング方法。
6. 各飲料の品質が、ＭＡＯ Ｂ阻害剤の含有量のみに基づいて位置付けられる、請求項１～４のいずれか１項に記載のレーティング方法。
7. 各飲料の品質が、ＭＡＯ Ａ阻害剤及びＭＡＯ Ｂ阻害剤の両方の含有量に基づいて位置付けられる、請求項１～４のいずれか１項に記載のレーティング方法。

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