FR2736359A1 - Beta-glucosidase de champignons filamenteaux, et ses utilisations - Google Patents
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Abstract
L'invention est relative à une bêta-glucosidase susceptible d'être obtenue à partir de champignons filamenteux, stable en milieu acide, très peu sensible à l'inhibition par le glucose. La bêta-glucosidase conforme à l'invention peut être utilisée en particulier dans la préparation de jus de fruits et dans le cadre de procédés d'hydrolyse enzymatique de la cellulose.
Description
La présente Invention est relative à une ss-glucosidase d'origine fongique dont l'activité est faiblement inhibée en présence de fortes teneurs en glucose, ainsi qu'à son procédé d'obtention, et à ses utilisations.
Les 5-D-glucosides glucohydrolases, (EC 3.2.1.21) couramment dénommées ss-glucosidases catalysent l'hydrolyse des alkyl- et aryl ss-D-glucosides, ainsi que celle du cellobiose. L'utilisation de ces enzymes a été proposée dans différents domaines.
I1 a par exemple été proposé d'utiliser les 5-glucosidases pour l'hydrolyse de précurseurs glycosidiques non-odorants de molécules odorantes. En effet, dans un grand nombre de fruits comme le raisin [WILLIAMS et al., American Chemical Society, Washington,
D.C., 35-48, (1989), GUNATA et al., J. Chromatogr., 331, 83-90, (1985)] l'abricot, la pêche, la pomme, le fruit de la passion [KRAMMER et al., J. Agric. Food Chem., 39, 778-781, (1991)], une part très importante des molécules responsable de l'arôme (terpénols, les norisoprénoïdes en
C13, les phénols) sont liées à des sucres, sous forme non-odorante.
D.C., 35-48, (1989), GUNATA et al., J. Chromatogr., 331, 83-90, (1985)] l'abricot, la pêche, la pomme, le fruit de la passion [KRAMMER et al., J. Agric. Food Chem., 39, 778-781, (1991)], une part très importante des molécules responsable de l'arôme (terpénols, les norisoprénoïdes en
C13, les phénols) sont liées à des sucres, sous forme non-odorante.
La partie sucre de ces glycosides a par exemple été décrite dans le cas de la baie de raisin [WILLIAMS et al., Phytochemistry, 21, 2013-2030, (1982)];
VOIRIN et al., J. Chromatogr. 592, 269-281 (1992)]. On y trouve des B-D-glucosides, des rutinosides (6-O-a-L-rhamnopyranosyl-ss-D-glucopyranosides), des 6-O-a-L-arabinofuranosyl-ss-D-glucopyranosides et des 6-O-ss-D-apiofuranosyl-ss-D-glucopyranosides. Dans le raisin, ainsi que dans d'autres fruits, l'aglycone est toujours lié au glucose, qu'il s'agisse de mono- ou de diglycosides.
VOIRIN et al., J. Chromatogr. 592, 269-281 (1992)]. On y trouve des B-D-glucosides, des rutinosides (6-O-a-L-rhamnopyranosyl-ss-D-glucopyranosides), des 6-O-a-L-arabinofuranosyl-ss-D-glucopyranosides et des 6-O-ss-D-apiofuranosyl-ss-D-glucopyranosides. Dans le raisin, ainsi que dans d'autres fruits, l'aglycone est toujours lié au glucose, qu'il s'agisse de mono- ou de diglycosides.
Les précurseurs glycosidiques constituent une part importante du potentiel aromatique chez les fruits, car la proportion d'arôme lié aux sucres est souvent supérieure à la proportion d'arôme libre correspondante [GUNATA et al., J. Chromatogr. 331, 83-90, (1985) KRAMMER et al., J. Agric. Food Chem. 39, 778-781, (1991)].
Des travaux antérieurs réalisés par l'équipe des Inventeurs au Laboratoire des Arômes et des
Substances Naturelles de l'institut des Produits de la
Vigne, INRA de Montpellier, ont permis d'élucider le mécanisme d'hydrolyse enzymatique des précurseurs glycosidiques d'arôme de la baie de raisin. Les diglycosides terpéniques sont hydrolysés en deux étapes dans une première étape, une a-L-rhamnopyranosidase, ou une a-L-arabinofuranosidase, ou une ss-D-apiofuranosidase, coupe la liaison osidique (1-4) et libère le monoglucoside correspondant. Une ss-D-glucopyranosidase intervient ensuite pour libérer l'aglycone à partir des monoglucosides formés.Dans le cas où le substrat ne renferme que des monoglucosides, on effectue directement l'hydrolyse sans passer par la première étape.
Substances Naturelles de l'institut des Produits de la
Vigne, INRA de Montpellier, ont permis d'élucider le mécanisme d'hydrolyse enzymatique des précurseurs glycosidiques d'arôme de la baie de raisin. Les diglycosides terpéniques sont hydrolysés en deux étapes dans une première étape, une a-L-rhamnopyranosidase, ou une a-L-arabinofuranosidase, ou une ss-D-apiofuranosidase, coupe la liaison osidique (1-4) et libère le monoglucoside correspondant. Une ss-D-glucopyranosidase intervient ensuite pour libérer l'aglycone à partir des monoglucosides formés.Dans le cas où le substrat ne renferme que des monoglucosides, on effectue directement l'hydrolyse sans passer par la première étape.
La connaissance de ce mécanisme et des propriétés des enzymes concernées ont permis la mise au point d'un procédé d'obtention d'arômes à partir de leurs précurseurs glycosidiques, qui fait l'objet de la demande de Brevet EP 9001545, et l'obtention de préparations enzymatiques d'origine fongique (particulièrement
Aspergillus niger) capables de libérer des molécules aromatiques à partir des glycosides [GUNATA et al.,
Progress in Flavour Precursor Studies, SCHREIR, P.,
WINTERHALTER, P., Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993) ; GUNATA et al., J. Inter. Sci. Vigne
Vin, 24, 3, 133-143, (1990)].
Aspergillus niger) capables de libérer des molécules aromatiques à partir des glycosides [GUNATA et al.,
Progress in Flavour Precursor Studies, SCHREIR, P.,
WINTERHALTER, P., Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993) ; GUNATA et al., J. Inter. Sci. Vigne
Vin, 24, 3, 133-143, (1990)].
L'utilisation de -glucosidase peut également permettre d'apporter d'autres améliorations aux qualités organoleptiques des produits dérivés des fruits : c'est le cas des jus d'agrumes, dont l'amertume est attribuée en partie à un glycoside (naringin=naringenine-7 rhamnosylglucoside). L'hydrolyse par l'action successive d'une a-rhamnosidase et d'une ss-glucosidase permet d'éliminer cette amertume.
Cependant, l'activité -glucosidase d'origine fongique comme celle d'A. niger est fortement inhibée par le glucose [WOODWARD et WISEMAN, Enzyme Microbio.
Technol. 4, 73-79, (1982) ; GUNATA et al., Progress in
Flavour Precursor Studies ; SCHREIER, P., WINTERHALTER,
P., Eds, Allured : Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)].
Flavour Precursor Studies ; SCHREIER, P., WINTERHALTER,
P., Eds, Allured : Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)].
Ceci en limite l'utilisation pour le traitement de produits contenant du glucose, comme les jus de fruits, ou certains vins (les vins doux naturels, par exemple ) .
Des applications des ss-glucosidases dans d'autres domaines, comme par exemple le recyclage de la cellulose ont également été envisagées.
La cellulose est présente dans la paroi cellulaire des tissus végétaux, soit sous forme libre, soit sous forme de lignocellulose ou d'hémicellulose ; elle représente une part très importante des déchets des industries qui utilisent des matières premières d'origine végétale.
Le recyclage de la cellulose provenant de déchets d'origine végétale fait intervenir deux étapes successives et distinctes une première étape est constituée par la saccharification, c'est-à-dire la production de glucose, qui est métabolisable par les micro-organismes industriels ce qui permet dans la deuxième étape la bioconversion du glucose en source d'énergie, comme l'éthanol, ou en biomasse protéique destinée à l'alimentation du bétail.
Les procédés enzymatiques de saccharification sont préférés aux procédés chimiques ; cependant, pour que le procédé soit rentable, le rendement de la conversion de la cellulose en glucose doit être élevé.
Or, lors de la saccharification, l'accumulation dans le milieu du cellobiose, disaccharide formé sous l'action des cellulases (exo- et endo-1,4-B-D-glucanases) à partir de la cellulose, inhibe ces dernières enzymes.
L'hydrolyse du cellobiose par une ss-glucosidase au fur et à mesure de sa formation, évite son accumulation dans le milieu, et permet d'augmenter le taux de saccharification.
Parmi les micro-organismes, le Trichoderma reesei est le plus utilisé pour la production de cellulases. La production de ss-glucosidase par ce champignon étant toutefois très faible, son complexe enzymatique est supplémenté par une ss-glucosidase d'origine fongique [WOODWARD et WISEMAN, Enzyme
Microbiol. Technol., 4, 73-79, (1982) ; WILHEM et SHAM,
Acta Biotechnol, 6, 2, 115-121, (1986)]. Cependant, l'inhibition de la ss-glucosidase par son produit de réaction, le glucose, diminue considérablement l'efficacité du procédé.
Microbiol. Technol., 4, 73-79, (1982) ; WILHEM et SHAM,
Acta Biotechnol, 6, 2, 115-121, (1986)]. Cependant, l'inhibition de la ss-glucosidase par son produit de réaction, le glucose, diminue considérablement l'efficacité du procédé.
L'utilisation de complexes enzymatiques d'origine bactérienne [ROMANIEC et al., Enzyme Microb.
Technol., 9, 474-478, (1987)] a été aussi envisagée pour la saccharification de la cellulose. Cependant le problème de l'inhibition par le glucose de l'activité 5-glucosidase se pose également dans ce cas [WOODWARD et
WISEMAN, Enzyme Microbiol. Technol. 4, 73-79, (1982)
WILHELM et SHAM, Acta Biotechnol, 6, 2, 115-121, (1986)
KWON et al., FEMS Microbiology Letters, 149-154, (1992)].
WISEMAN, Enzyme Microbiol. Technol. 4, 73-79, (1982)
WILHELM et SHAM, Acta Biotechnol, 6, 2, 115-121, (1986)
KWON et al., FEMS Microbiology Letters, 149-154, (1992)].
L'hydrolyse par la 5-glucosidase constitue donc une étape limitante des procédés de saccharification enzymatique.
I1 serait donc souhaitable, pour toutes ces applications, de disposer d'une ss-glucosidase active en présence du glucose, afin d'être utilisable dans les milieux riches en glucose.
Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence chez des champignons filamenteux, comme A. niger et
A. oryzae, une ss-glucosidase dont l'activité n'est que très faiblement inhibée par le glucose, et sont parvenus à produire, purifier, et caractériser cette enzyme, afin d'en utiliser les propriétés.
A. oryzae, une ss-glucosidase dont l'activité n'est que très faiblement inhibée par le glucose, et sont parvenus à produire, purifier, et caractériser cette enzyme, afin d'en utiliser les propriétés.
La présente Invention a pour objet une préparation purifiée de ss-glucosidase d'origine fongique, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une ss-glucosidase exocellulaire, dénommée BGII, susceptible d'être obtenue à partir de champignons filamenteux, dont la masse moléculaire estimée par chromatographie d'exclusion est d'environ 30 000, le pH optimum est compris entre 4,5 et 6,0, la constante d'inhibition (Ki) pour le glucose est d'environ 950 mM, et qui conserve la totalité de son activité après 24 heures d'incubation à pH 3,0 et à 20'C.
La ss-glucosidase BGII obtenue conformément à l'Invention est également moins inhibée que d'autres 5-glucosidases par la 6-gluconolactone.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la 5-glucosidase BGII est susceptible d'être obtenue à partir d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par A. niger et
A. oryzae. Ces champignons filamenteux sont GRAS (Generally Recommanded As Safe)
La ss-glucosidase BGII est stable dans une large gamme de pH et de température, et peut donc être utilisée dans des milieux très divers. Elle possède un large spectre d'activité et permet l'hydrolyse de ss-D-glucosides de nature différente. De plus, elle est exocellulaire, ce qui facilite sa production.
A. oryzae. Ces champignons filamenteux sont GRAS (Generally Recommanded As Safe)
La ss-glucosidase BGII est stable dans une large gamme de pH et de température, et peut donc être utilisée dans des milieux très divers. Elle possède un large spectre d'activité et permet l'hydrolyse de ss-D-glucosides de nature différente. De plus, elle est exocellulaire, ce qui facilite sa production.
Du fait de ces caractéristiques l'utilisation de la 5-glucosidase BGII peut être envisagée dans tous les cas où l'on souhaite procéder à l'hydrolyse de ss-D-glucosides dans des milieux renfermant du glucose, comme par exemple
- pour augmenter l'arôme dans des jus de fruits, grâce à l'hydrolyse des précurseurs glycosidiques d'arôme
- pour améliorer le procédé de désamérisation des jus d'agrumes, en augmentant l'efficacité de l'hydrolyse plus efficace de la naringine
- pour améliorer le procédé d'hydrolyse enzymatique de la cellulose et de ses dérivés.
- pour augmenter l'arôme dans des jus de fruits, grâce à l'hydrolyse des précurseurs glycosidiques d'arôme
- pour améliorer le procédé de désamérisation des jus d'agrumes, en augmentant l'efficacité de l'hydrolyse plus efficace de la naringine
- pour améliorer le procédé d'hydrolyse enzymatique de la cellulose et de ses dérivés.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de production, purification et d'utilisation de la ss-glucosidase conforme à l'Invention.
I1 doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : PRODUCTION DE LA ss-GLUCOSIDASE :
Les champignons A. niger 55465 et A. oryzae 12559 proviennent de la collection du Centraalbureau Voor
Schimmel Cultures (CBS, Pays-Bas). La deuxième souche d'A. niger utilisée provient de la collection du laboratoire. Les champignons sont conservés sur un milieu "Potatoes Dextrose Agar".
Les champignons A. niger 55465 et A. oryzae 12559 proviennent de la collection du Centraalbureau Voor
Schimmel Cultures (CBS, Pays-Bas). La deuxième souche d'A. niger utilisée provient de la collection du laboratoire. Les champignons sont conservés sur un milieu "Potatoes Dextrose Agar".
Le milieu de base pour la production de l'enzyme contient les composés suivants (%P/V) (NH4)2HPo4 . 0,3 ; (NH4)2So4 0,8 ; KH2PO4 0,1 MgCl216H2O 0,1, Tween 80 : 0,15. Ce milieu est stérilisé 25 minutes à 120-C.
D'autre part, les milieux renfermant les sources de carbone à tester (rutine, quercétine, cellobiose) sont stérilisés (120-C, 25 minutes) à part, puis mélangés avec le milieu de base à une concentration finale de 0,3% (P/V).
Les cultures, après ensemencement par le champignon choisi, sont réalisées à 30C, sous agitation (120 tours/minute). A différents moments de culture, on effectue des prélèvements afin de suivre la production de l'enzyme. Le milieu de culture prélevé et d'abord centrifugé (5000 g, 10 minutes, 5'C). Le surnageant obtenu, après dialyse, est utilisé pour le dosage de l'activité B-glucosidase.
Le dosage de l'activité B-glucosidase s'effectue par incubation pendant 20 minutes à 40 C, d'l volume de l'échantillon enzymatique avec 1 volume de 5-D-glucoside de p-nitrophénol (PNPG) (4 mM dans du tampon acétate 100 mM, pH 4,4). La quantité de PNP (p-nitrophénol) libéré est estimée par l'ajout de 6 volumes de Na2CO3 0,1 M, et suivie de la lecture de l'absorbance à 400 nm. L'activité enzymatique s'exprime en nanokatals par ml (nkat/ml) de solution enzymatique.
Un nanokatal correspond au nombre de nanomoles de PNP libérées par seconde dans les conditions précitées.
Différents milieux de culture ont été réalisés, en faisant varier la souche de champignons filamenteux GRAS et la source de carbone. La production de la 5-glucosidase exocellulaire, estimée par l'hydrolyse du PNPG, a été suivie lors du développement du champignon. Lorsque le maximum de production d'enzyme a été atteint, le milieu de culture a été centrifugé et le surnageant a été concentré sur une cellule AMICONX (seuil de coupure 10 000).
La chromatographie d'exclusion sur ULTROGELS
AcA 44 a permis de séparer, deux pics d'activité ss-glucosidase bien distincts, désignés par : BGI et BGII (Figure 1). Dans le cas de tous les milieux de culture, les volumes d'élution de BGI et BGII ont été identiques.
AcA 44 a permis de séparer, deux pics d'activité ss-glucosidase bien distincts, désignés par : BGI et BGII (Figure 1). Dans le cas de tous les milieux de culture, les volumes d'élution de BGI et BGII ont été identiques.
Dans le tableau I ci-dessous sont données les proportions de la BGI et de la BGII obtenues à partir de 3 souches de champignons différentes cultivées sur la quercétine, utilisée comme source de carbone. Le pourcentage d'activité ss-glucosidase est calculé à partir de fractions de BGI et BGII rassemblées après chromatographie sur ULTROGELS AcA44.
Le Tableau II illustre l'influence de la source de carbone sur la production de la BGI et de la
BGII par A. oryzae.
BGII par A. oryzae.
TABLEAU I
<tb> Souches <SEP> BGI(%) <SEP> BGII(%) <SEP>
<tb> A. <SEP> niger <SEP> (INRA) <SEP> 96 <SEP> 4
<tb> A. <SEP> niger <SEP> (CBS,55465) <SEP> 97 <SEP> 3
<tb> A. <SEP> oryzae <SEP> (CBS, <SEP> 12559) <SEP> 90 <SEP> 10
<tb>
La BGII est produite par les trois souches, la souche A. oryzae ayant cependant un rendement plus élevé.
<tb> A. <SEP> niger <SEP> (INRA) <SEP> 96 <SEP> 4
<tb> A. <SEP> niger <SEP> (CBS,55465) <SEP> 97 <SEP> 3
<tb> A. <SEP> oryzae <SEP> (CBS, <SEP> 12559) <SEP> 90 <SEP> 10
<tb>
La BGII est produite par les trois souches, la souche A. oryzae ayant cependant un rendement plus élevé.
TABLEAU II
<tb> Source <SEP> de <SEP> C <SEP> BGI <SEP> et <SEP> BGII <SEP> BGI <SEP> (%) <SEP> BGII <SEP> (%)
<tb> <SEP> (nkat/l)*
<tb> Cellobiose <SEP> 820 <SEP> 99 <SEP> <SEP> i <SEP>
<tb> Rutine <SEP> 746 <SEP> 98 <SEP> 2
<tb> Quercétine <SEP> 620 <SEP> 91 <SEP> 9
<tb>
* dans un milieu de culture.
<tb> <SEP> (nkat/l)*
<tb> Cellobiose <SEP> 820 <SEP> 99 <SEP> <SEP> i <SEP>
<tb> Rutine <SEP> 746 <SEP> 98 <SEP> 2
<tb> Quercétine <SEP> 620 <SEP> 91 <SEP> 9
<tb>
* dans un milieu de culture.
Parmi les sources de carbone utilisées, c'est la quercétine qui permet le maximum de production de BGII par rapport à BGI.
Dans la suite du travail, A. oryzae cultivé sur quercétine a été choisi pour la production de la BGII et pour l'étude des propriétés de l'enzyme.
EXEMPLE 2 : PURIFICATION ET CARACTERISATION DE LA 5-GLUCOSIDASE BGII
Le milieu de culture (3 litres), obtenu après d'A. oryzae sur la quercétine, puis concentré, a subi successivement deux étapes de purification chromatographie d'exclusion et chromatographie d'échange d'ions.
Le milieu de culture (3 litres), obtenu après d'A. oryzae sur la quercétine, puis concentré, a subi successivement deux étapes de purification chromatographie d'exclusion et chromatographie d'échange d'ions.
- Chromatoarachie d'exclusion
Le milieu de culture (3 litres), récolté après culture dA. oryzae sur la quercétine, est d'abord concentré sur une cellule AMICONX (seuil de coupure 10 000). Il est ensuite chargé sur une colonne (1,6 x 90 cm) garnie d'ULTROGELS AcA44 (IBF), et préalablement équilibrée avec un tampon phosphate-citrate 100 mM, pH 7,0, à 4-C. L'élution est réalisée avec le même tampon à un débit de 7 ml/heures On effectue le dosage d'activité ss-glucosidase et l'estimation des protéines à 280 nm sur les fractions recueillies. Les fractions correspondant au deuxième pic d'activité ss-glucosidase (BGII) sont regroupées.
Le milieu de culture (3 litres), récolté après culture dA. oryzae sur la quercétine, est d'abord concentré sur une cellule AMICONX (seuil de coupure 10 000). Il est ensuite chargé sur une colonne (1,6 x 90 cm) garnie d'ULTROGELS AcA44 (IBF), et préalablement équilibrée avec un tampon phosphate-citrate 100 mM, pH 7,0, à 4-C. L'élution est réalisée avec le même tampon à un débit de 7 ml/heures On effectue le dosage d'activité ss-glucosidase et l'estimation des protéines à 280 nm sur les fractions recueillies. Les fractions correspondant au deuxième pic d'activité ss-glucosidase (BGII) sont regroupées.
- Chromatoarachie d'échanae d'ions
Les fractions de BGII regroupées à l'issue de la chromatographie d'exclusion sont dialysées contre le tampon imidazole 25 mM, pH 7,4 et déposé sur une colonne (1,6 x26 cm) DEAE SEPHAROSEX CL6B (PHARMACIA), préalablement équilibrée avec ce même tampon. Un gradient linéaire de NaCl de 0 à 0,5 M dans le même tampon est réalisé. Le débit est de 30 ml/heures Les fractions renfermant la BGII sont rassemblées.
Les fractions de BGII regroupées à l'issue de la chromatographie d'exclusion sont dialysées contre le tampon imidazole 25 mM, pH 7,4 et déposé sur une colonne (1,6 x26 cm) DEAE SEPHAROSEX CL6B (PHARMACIA), préalablement équilibrée avec ce même tampon. Un gradient linéaire de NaCl de 0 à 0,5 M dans le même tampon est réalisé. Le débit est de 30 ml/heures Les fractions renfermant la BGII sont rassemblées.
RéSULTATS
La chromatographie d'exclusion sur ULTROGELS
AcA44 a montré deux pics d'activité ss-glucosidase bien distincts, BGI et BGII (Figure 1).
La chromatographie d'exclusion sur ULTROGELS
AcA44 a montré deux pics d'activité ss-glucosidase bien distincts, BGI et BGII (Figure 1).
La chromatographie d'échange d'ions sur une colonne de DEAE SEPHAROSEX CL6B des fractions riches en
BGII a permis d'isoler la BGII de la BGI. La BGII a été éluée à une concentration en NaCl de 0,17 M, suivie par la BGI qui est éluée à 0,21 M de NaCl (Figure 2)
- Estimation de la masse moléculaire
Des protéines de masse moléculaire connue sont injectées successivement sur la colonne ULTROGELS AcA44 afin de calibrer la colonne cytochrome C(12 500), chymotrypsine (25 000), ovalbumine (45 000), sérum ovalbumine (68 000), lipoxygénase (100 000). Le volume mort de la colonne est déterminé par l'injection d'une solution de Bleu Dextran.
BGII a permis d'isoler la BGII de la BGI. La BGII a été éluée à une concentration en NaCl de 0,17 M, suivie par la BGI qui est éluée à 0,21 M de NaCl (Figure 2)
- Estimation de la masse moléculaire
Des protéines de masse moléculaire connue sont injectées successivement sur la colonne ULTROGELS AcA44 afin de calibrer la colonne cytochrome C(12 500), chymotrypsine (25 000), ovalbumine (45 000), sérum ovalbumine (68 000), lipoxygénase (100 000). Le volume mort de la colonne est déterminé par l'injection d'une solution de Bleu Dextran.
La masse moléculaire de la BGII, estimée par chromatographie d'exclusion et à l'aide des protéines de masses moléculaires connues, est située autour de 30 000 (la BGI est exclue du domaine de fractionnement du gel utilisé, ce qui indique qu'elle doit avoir une masse moléculaire supérieure à 130 000). I1 est à noter que la masse moléculaire de la plupart des ss-glucosidases d'origine fongique connues est souvent supérieure à 80 000. Des masses moléculaires assez faibles, à savoir 48 000 pour la ss-glucosidase de C. guilliermondii et 41 000 pour celle de A. fumigatus ont toutefois été signalées [WOODWARD et WISEMAN, Enzyme Microbiol.
Technol., 4, 73-79. (1982)].
- DH d'activité optimale
La solution enzymatique est incubée 20 minutes à 40 C dans une gamme de tampon phosphate-citrate 100 mM de pH variant de 2,5 à 8, en présence de PNPG. L'activité enzymatique est dosée selon le protocole décrit précédemment.
La solution enzymatique est incubée 20 minutes à 40 C dans une gamme de tampon phosphate-citrate 100 mM de pH variant de 2,5 à 8, en présence de PNPG. L'activité enzymatique est dosée selon le protocole décrit précédemment.
L'enzyme a un pH optimum compris entre 4,5 et 6,0 (Figure 4), proche des valeurs des -glucosidases fongiques connues [GUNATA et al., Progress in Flavour
Precursor Studies ; SCHREIER, P., WINTERHALTER, P., Eds,
Allured . Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)].
Precursor Studies ; SCHREIER, P., WINTERHALTER, P., Eds,
Allured . Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)].
L'enzyme, comme les B-glucosidases d'origine fongique connues, conserve environ 10% de son activité maximale à pH 3.0.
- Stabilité en fonction du DH
La solution enzymatique est mise à incuber pendant 24 heures à 20'C dans des solutions de tampon phosphate-citrate aux pH respectifs de . 3,0 ; 6,0 et 7,0. Les milieux d'incubation sont ensuite dialysés contre du tampon acétate 100 mM pH 4,4. Les mesures d'activité, en utilisant le PNPG comme substrat, sont réalisées comme décrit ci-dessus.
La solution enzymatique est mise à incuber pendant 24 heures à 20'C dans des solutions de tampon phosphate-citrate aux pH respectifs de . 3,0 ; 6,0 et 7,0. Les milieux d'incubation sont ensuite dialysés contre du tampon acétate 100 mM pH 4,4. Les mesures d'activité, en utilisant le PNPG comme substrat, sont réalisées comme décrit ci-dessus.
Les glycosidases connues des champignons filamenteux, comme par exemple celle d'A. niger, se distinguent par une très bonne stabilité au pH acide du moût de raisin (environ 3,0), alors que celles de
S. cerevisiae, de C. wickerhamii et de raisin perdent rapidement leur activité à ce pH [GUNATA et al., Progress in Flavour Precursor Studies ; SCHREIER, P.,
WINTERHALTER, P., Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993); DELCROIX et al., Am. J. Enol. Vitic., 45, 3, p. 291-296, (1994)].
S. cerevisiae, de C. wickerhamii et de raisin perdent rapidement leur activité à ce pH [GUNATA et al., Progress in Flavour Precursor Studies ; SCHREIER, P.,
WINTERHALTER, P., Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993); DELCROIX et al., Am. J. Enol. Vitic., 45, 3, p. 291-296, (1994)].
La préparation de BGII issue de chromatographie d'échange d'ions, peut être maintenue pendant 24 heures à 20'C, dans un tampon phosphatecitrate 100 mM à chacun des pH 3,0, 6,0 et 7,0, en restant stable et sans aucune perte d'activité.
De même, l'enzyme BGII rajoutée dans un moût de raisin à pH 2.9 et laissée à 20'C, garde encore la majeure partie de son activité une semaine après.
Inhibition car le alucose ou la & aluconolactone
Le milieu réactionnel renfermant une solution enzymatique à tester (BGI, BGII. ou 5-glucosidase d'A. niger purifiée à partir de la préparation enzymatique KLERZYMEX (GIST-BROCADES, SECLIN, FRANCE), qui hydrolyse des glycosides terpéniques lors de la vinification du vin sec [GUNATA et al., J. Inter. Sci.
Le milieu réactionnel renfermant une solution enzymatique à tester (BGI, BGII. ou 5-glucosidase d'A. niger purifiée à partir de la préparation enzymatique KLERZYMEX (GIST-BROCADES, SECLIN, FRANCE), qui hydrolyse des glycosides terpéniques lors de la vinification du vin sec [GUNATA et al., J. Inter. Sci.
Vigne Vin, 24, 3, p. 133-143, (1990)] et qui est utilisée ici à titre de comparaison) et une solution de PNPG à 4 mM est additionnée d'une solution de glucose ou de la gluconolactone à différentes concentrations. L'activité enzymatique résiduelle est estimée après incubation du mélange 20 minutes à 40 C.
La constante d'inhibition pour le glucose de l'activité des BGI, BGII et B-glucosidase de KLERZYMEX, et le type d'inhibition, sont déterminés par la représentation de Lineweaver-Burk.
RéSULTATS
- Inhibition car le alucose
A l'issue de la chromatographie d'exclusion, l'étude de l'inhibition par le glucose de l'activité BGI et BGII (en utilisant le PNPG comme substrat), montre une différence notable entre ces deux enzymes.
- Inhibition car le alucose
A l'issue de la chromatographie d'exclusion, l'étude de l'inhibition par le glucose de l'activité BGI et BGII (en utilisant le PNPG comme substrat), montre une différence notable entre ces deux enzymes.
La BGI, comme pratiquement toutes les ss- glucosidases de champignons filamenteux [WOODWARD et
WISEMAN, Enzyme Microbiol. Technol., 4, p. 73-79, (1982)
ARYAN et al., Am. J. Enol. Vitic., 38, p. 182-188, (1987) ; SHOSEYOV et al., Phytochem., 27, 7, p. 19731976, (1988) ; GUNATA et al., Progress in Flavour
Precursor Studies ; SCHREIER, P., WINTERHALTER, P., Eds,
Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)] est fortement inhibée par le glucose
En présence de 25 g/l de glucose, il ne reste environ que 15% de l'activité de la BGI et 10% de celle issue de KLERZYMEQ, alors que la BGII garde encore environ 80% de son activité. Cette dernière enzyme n'est inhibée que de 57% en présence de 100 g/l de glucose1 teneur maximale dans un moût de raisin à destination technologique, alors que la BGI et la ss-glucosidase du KLERZYMEX sont presque totalement inhibées à 50 g/l du glucose (Figure 3).
WISEMAN, Enzyme Microbiol. Technol., 4, p. 73-79, (1982)
ARYAN et al., Am. J. Enol. Vitic., 38, p. 182-188, (1987) ; SHOSEYOV et al., Phytochem., 27, 7, p. 19731976, (1988) ; GUNATA et al., Progress in Flavour
Precursor Studies ; SCHREIER, P., WINTERHALTER, P., Eds,
Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)] est fortement inhibée par le glucose
En présence de 25 g/l de glucose, il ne reste environ que 15% de l'activité de la BGI et 10% de celle issue de KLERZYMEQ, alors que la BGII garde encore environ 80% de son activité. Cette dernière enzyme n'est inhibée que de 57% en présence de 100 g/l de glucose1 teneur maximale dans un moût de raisin à destination technologique, alors que la BGI et la ss-glucosidase du KLERZYMEX sont presque totalement inhibées à 50 g/l du glucose (Figure 3).
A l'issue de la chromatographie d'échange d'ions, les valeurs d'inhibition par le glucose de la
BGII sont du même ordre que celles obtenues après la chromatographie d'exclusion.
BGII sont du même ordre que celles obtenues après la chromatographie d'exclusion.
Les constantes d'inhibition (Ki) pour le glucose des activités de BÇZ, de BGII, et de la 5-glucosidase du KLERZYMEX ont été respectivement calculées vis-à-vis du PNPG d'après la représentation de LINEWEAVER BURK. Le glucose se comporte dans les trois cas, comme un inhibiteur compétitif. Les constances d'inhibition sont de 3,2, 3,5, 953 mM respectivement pour les ss-glucosidases de KLERZYMEX, de BGI. et de BGII.Les valeurs obtenues pour les deux premières enzymes sont proches de celles trouvées pour la plupart des ss-glucosidases de champignons filamenteux [GUNATA et al.,
Progress in Flavour Precursor Studies, SCHREIR, P.,
WINTERHALTER, P., Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993) ; KWON et al., FEMS Microbiology Letters, p.149-154, (1992)].
Progress in Flavour Precursor Studies, SCHREIR, P.,
WINTERHALTER, P., Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993) ; KWON et al., FEMS Microbiology Letters, p.149-154, (1992)].
Par contre, une valeur de Ki aussi élevée que celle obtenue pour la BGII n'a jamais été signalée. Des valeurs nettement inférieures ont été respectivement trouvées chez la ss-glucosidase du raisin, de l'amande douce et de Candida wickerhamii, 170, 210, 230 mM [GUNATA et al., (1993) précité].
- Inhibltlon car la ~-aluconolactone
La gluconolactone, produite à partir du glucose par l'action de la glucose-oxydase des champignons développés sur la baie de raisin, est connue comme un inhibiteur encore plus puissant que le glucose, de l'activité ss-glucosidase [GUNATA et al., Progress in
Flavour Precursor Studies, SCHREIR, P., WINTERHALTER, P.,
Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)]. La concentration de la gluconolactone peut atteindre jusqu'à 2 g/l dans les moûts de raisin obtenus à partir des vendanges attaquées par des champignons, comme le
Botrytis cinerea.
La gluconolactone, produite à partir du glucose par l'action de la glucose-oxydase des champignons développés sur la baie de raisin, est connue comme un inhibiteur encore plus puissant que le glucose, de l'activité ss-glucosidase [GUNATA et al., Progress in
Flavour Precursor Studies, SCHREIR, P., WINTERHALTER, P.,
Eds, Allured Wheaton (ETATS-UNIS), 219-234, (1993)]. La concentration de la gluconolactone peut atteindre jusqu'à 2 g/l dans les moûts de raisin obtenus à partir des vendanges attaquées par des champignons, comme le
Botrytis cinerea.
La BGI, et la ss-glucosidase de KLERZYMEX sont déjà presque totalement inhibées à une concentration de 1 g/l en gluconolactone. Par contre, la BGII garde encore plus de 30% de son activité à 1 g/l de gluconolactone, et 20% de son activité à 10 g/l de ce composé.
- Spectre d'activité:
L'activité de l'enzyme BGII vis-à-vis du cellobiose, de la naringine, et des 5-D-glucosides de géraniol, nérol, linalol, alcool benzylique, alcool phényl-éthylique est étudiée dans un milieu tamponné (tampon acétate, 100 mM, pH 4,4) incubé à 40 C. La concentration finale de chaque substrat est de 2 mM dans le milieu réactionnel.
L'activité de l'enzyme BGII vis-à-vis du cellobiose, de la naringine, et des 5-D-glucosides de géraniol, nérol, linalol, alcool benzylique, alcool phényl-éthylique est étudiée dans un milieu tamponné (tampon acétate, 100 mM, pH 4,4) incubé à 40 C. La concentration finale de chaque substrat est de 2 mM dans le milieu réactionnel.
L'hydrolyse des substrats a été estimée par chromatographie sur couche mince (CCM). La chromatographie est réalisée sur gel de silice avec le mélange de solvants suivant acétate d'éthyle=65, isopropanol=30, eau=10 V/V/V. La révélation des composés se fait à 110-C après l'application d'une solution de naphtorésorcinal à 0,2% dans une solution d'éthanol-acide sulfurique (19/1 V/V).
L'hydrolyse, par la BGII et par la ss-glucosidase du KLERZYMEX, du ss-D-glucoside de géraniol (1,5 mM) dans un milieu tamponné (tampon acétate, 100 mM, pH 4,4) en présence de 100 g/l du glucose, ainsi que celle des 5-D-glucosides de linalol, nérol et géraniol incorporés (0,15 mM de chacun) dans un moût de raisin (UGNI BLANC), par ces deux mêmes enzymes ont été estimées par Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP).
Une colonne de silice greffée C18,5 WM (220 x 4,6 mM ; Brownlee), et un mélange acétonitrile/eau (30/70 V/V) en isocratique, avec un débit de 1 ml/minute, ont été utilisés respectivement comme phase stationnaire et comme phase mobile. L'échantillon est injecté directement sur la colonne sans traitement préalable. La détection est faite à 200 nm.
RESULTATS
La BGII catalyse l'hydrolyse des différents substrats qui ont été testés, à savoir des aryl-(PNPG), et des alkyl-glucosides (B-D-glucosides de géraniol, nérol, linalol, alcool benzylique, alcool phényl éthylique), et un diglucoside (cellobiose), et se comporte donc comme les ss-glucosidases de champignons filamenteux [WOODWARD et WISEMAN, Enzyme Microbiol.
La BGII catalyse l'hydrolyse des différents substrats qui ont été testés, à savoir des aryl-(PNPG), et des alkyl-glucosides (B-D-glucosides de géraniol, nérol, linalol, alcool benzylique, alcool phényl éthylique), et un diglucoside (cellobiose), et se comporte donc comme les ss-glucosidases de champignons filamenteux [WOODWARD et WISEMAN, Enzyme Microbiol.
Technol., 4 p. 73-79, (1982)].
Par ailleurs, l'hydrolyse du glucoside de géraniol (1.5 mM = 474 mg/l) dans un milieu tamponné (tampon acétate, pH 4.4, 100 mM) en présence de 100 g/l de glucose, par la BGII (1.5 nkat/ml), et, à titre de comparaison, par la ss-glucosidase de KLERZYMEX (1.5 nkat/ml) a été étudiée. Après 24 heures d'incubation à 20'C, les milieux sont analysés par CLHP. La moitié du substrat a été hydrolysé par la BGII, alors que seulement 9% du glucoside a disparu par l'action de la ss-glucosidase du KLERZYME.
Afin de comparer l'efficacité de ces deux enzymes dans un milieu naturel, un moût neutre (UGNI blanc, pH 2.9, 90 g/l glucose), pauvre en monoglucosides terpéniques, mais préalablement enrichi en ss-D-glucosides de linalol, nérol, géraniol (0.15 mM de chacun) a été additionné soit de BGII (0.6 nkat/ml), soit de ss-glucosidase du KLERZYMES (0.6 nkat/ml). La teneur en monoglucosides rajoutés dans le moût dépasse 10 fois les teneurs rencontrées dans les moûts des cépages les plus riches en ces composés. Les milieux ont été analysés par
CLHP après une semaine d'incubation à 20'C. Dans ces conditions, la ss-glucosidase du KLERZYMEX n'a eu aucun effet sur les substrats, alors que sous l'action de la
BGII, environ 50% des glucosides de nérol et de géraniol et 90% du glucoside de linalol avaient disparu.
CLHP après une semaine d'incubation à 20'C. Dans ces conditions, la ss-glucosidase du KLERZYMEX n'a eu aucun effet sur les substrats, alors que sous l'action de la
BGII, environ 50% des glucosides de nérol et de géraniol et 90% du glucoside de linalol avaient disparu.
L'hydrolyse de la naringine (naringenin-7rhamnoglucoside) a été aussi étudiée par chromatographie sur couche mince. I1 est connu que l'hydrolyse complète de la naringine nécessite l'action successive d'une a-rhamnosidase et d'une ss-glucosidase.
Comme prévu, la BGII seule n'a donc pas eu d'action sur la naringine. Le milieu réactionnel a alors été additionné d'une a-rhamnosidase isolée d'une préparation enzymatique (GUNATA et al. 1988), qui a coupé la liaison interosidique, et libéré le monoglucoside de naringenine. Ce monoglucoside a ensuite été hydrolysé complètement par la BGII.
Claims (6)
1) Préparation purifiée de B-glucosidase, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une 5-glucosidase exocellulaire, dénommée BGII, susceptible d'être obtenue à partir de champignons filamenteux, dont la masse moléculaire estimée par chromatographie d'exclusion est d'environ 30 000, le pH optimum est compris entre 4,5 et 6,0, la constante d'inhibition (Ki) pour le glucose est d'environ 950 mM, et qui conserve la totalité de son activité après 24 heures d'incubation à pH 3,0 et à 20'C.
2) Préparation de ss-glucosidase selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par A. niger et A. oryzae.
3) Utilisation de la ss-glucosidase BGII, telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 2, pour l'hydrolyse enzymatique d'un ss-D-glucoside,ou d'un mélange de B-D-glucosides.
4) Procédé d'hydrolyse de ss-D-glucosides précurseurs d'arôme dans des jus de fruits, caractérisé en ce que l'on utilise la ss-glucosidase BGII, telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 2.
5) Procédé de désamérisation des jus d'agrumes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on hydrolyse le monoglucoside de naringenine résultant de l'action préalable d'une a-rhamnosidase sur la naringine présente dans ledit jus d'agrume, par la ss-glucosidase BGII telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 2.
6) Procédé d'hydrolyse enzymatique de la cellulose et de ses dérivés caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on hydrolyse le cellobiose, résultant de l'action préalable d'au moins une cellulase, par la B-glucosidase BGII, telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 2.
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Non-Patent Citations (8)
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Also Published As
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|---|---|
| EP0871717A1 (fr) | 1998-10-21 |
| AU709427B2 (en) | 1999-08-26 |
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| NZ313210A (en) | 1999-10-28 |
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