CN106834255A - 一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活突变内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用。通过定向进化及定点突变技术对来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的内切木聚糖酶XynB进行分子改造得到高比活木聚糖酶NPWXynB。其氨基酸序列中的第58位用F替代Y，第78位用Y替代M，第94位用S替代Y，第143位用L替代V，第145位用R替代E，第182位用R替代D。本发明提供的内切木聚糖酶突变体NPWXynB在37℃条件下的比活为11500U/mg，比原始内切木聚糖酶XynB的比活提高82.5％。本发明构建的含NPWXynB基因的重组工程菌最大酶活可达153000U/mL，极大的降低了生产成本。

Description

一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活突变内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用。

背景技术

木聚糖作为一种五碳糖，是半纤维素的重要组成部分，广泛的存在于自然界。木聚糖几乎占地球上可更新有机碳含量的三分之一，是仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖。木聚糖在裸子植物中占干物质重量的7％-12％，在被子植物中占干物质重量的15％-30％，同时木聚糖也广泛存在于饲料原料中如小麦、玉米等。木聚糖作为一种非淀粉多糖具有很强的抗营养作用，主要表现为：单胃动物难以消化吸收木聚糖；木聚糖可结合大量的水，增加动物消化道内食糜的体积和粘度从而阻碍营养物质的消化和吸收，降低了饲料的利用率。

木聚糖酶是指能够将木聚糖降解为低聚木糖和木糖这一类酶的总称，主要包括内切β-1,4木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中内切β-1,4木聚糖酶在这一类酶中发挥主要作用。来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的内切木聚糖酶XynB由于其良好的酶学特性，使其在饲料、造纸等行业具有很大的应用潜力。为了使瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum内切木聚糖酶XynB广泛应用到众多工业领域中，提高其比活力及表达水平，降低生产成本是急需解决的问题。本发明通过结合定向进化和定点突变技术，提高了瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum内切木聚糖酶XynB的比活力，大大降低了其生产成本，为其进一步工业化应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的是通过对来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的内切木聚糖酶XynB进行分子改造，使改造后的内切木聚糖酶具有更高的比活，降低生产成本，符合工业化大生产的要求。

本发明的目的是提供一种高比活的突变内切木聚糖酶NPWXynB及其基因。

本发明的再一目的是提供包含上述的高比活突变内切木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述的高比活突变内切木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种表达突变高比活内切木聚糖酶NPWXynB的方法。Neocallimastix patriciarum内切木聚糖酶XynB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明采用易错PCR及定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.1所示的内切木聚糖酶XynB进行分子改造，经过高通量筛选得到高比活内切木聚糖酶NPWXynB，本发明的高比活内切木聚糖酶NPWXynB和原有的Neocallimastix patriciarum内切木聚糖酶XynB相比，有5个氨基酸的差异，突变位点由+78M,+94Y,+143V,+145E,+182D,突变成+78Y,+94S,+143L,+145R,+182R,突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本发明还提供了上述高比活内切木聚糖酶NPWXynB的基因序列，其碱基序列如SEQID NO.3所示：

本发明还提供了包含上述高比活内切木聚糖酶的重组载体，将本发明的高比活木聚糖酶基因NPWXynB连接到酵母表达载体pPICzαA和pPIC9K。上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-NPWXynB和pPIC9K-NPWXynB。

本发明还提供了包含上述高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33和GS115。

本发明还提供了表达上述高比活内切木聚糖酶NPWXynB的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)重组菌株进行发酵，诱导重组木聚糖酶的表达；

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的木聚糖酶NPWXynB。

具体地，将重组表达质粒pPICzαA-NPWXynB和pPIC9K-NPWXynB线性化后，转化到毕赤酵母X33和GS115中，用高浓度的抗生素平板筛选转化子，将筛选到的转化子，首先在摇瓶培养条件下进行比较分析。将摇瓶培养筛选出来的的高酶活转化子，再在50L的发酵罐中进行发酵，发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行木聚糖酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到153000U/mL，比出发菌的酶活提高56.1％，实现了重组内切木聚糖酶NPWXynB的高效表达。将重组内切木聚糖酶NPWXynB进行分离重化，测定其在37℃的比活为11500U/mg，相比重组木聚糖酶XynB的比活(6300U/mg)，突变后的重组木聚糖酶NPWXynB比活提高了82.5％。

本发明通过定点突变技术和高通量筛选技术对瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum内切木聚糖酶XynB进行分子改造。突变后的内切木聚糖酶NPWXynB的比活比XynB提高82.5％。含有突变基因NPWXynB的重组工程菌在50L发酵罐培养条件下的平均发酵酶活为153000U/mL。因此，本发明的突变内切木聚糖酶NPWXynB及重组工程菌，大大降低了发酵生产成本，使其在众多工业领域中显示出巨大的应用潜力。

附图说明

图1为内切木聚糖酶XynB和NPWXynB的比活比较图。

图2为pPICzαA-NPWXynB酵母菌株在50升发酵罐中的发酵情况。

图3为pPIC9K-NPWXynB酵母菌株在50升发酵罐中的发酵情况。

图4为内切木聚糖酶XynB和NPWXynB在不同pH值环境下的相对酶活曲线图。

图5为内切木聚糖酶XynB和NPWXynB在不同温度下的相对酶活曲线图。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzαA，pGAPzαA,Zeocin购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25ug/mL Zeocin。

酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/L zeocin)。

酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。

PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。

实施例1、瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum内切木聚糖酶XynB基因合成及克隆

将已公布的瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum内切木聚糖酶XynB基因(Genebank：AF123252)，进行合成。

根据合成的基因分别在5’端和3’端设计PCR引物含EcoRI和NotI酶切酶位点，起引物序列如下：

5’端引物NPWXynB-F1：GTAGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCAGCTT

3’端引物NPWXynB-R1：ACTGCGGCCGCAGCTGAACTACAGAAACTTTG以合成基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pGAPzαA上，得到重组载体pGAPzαA-XynB。

实施例2、基因易错PCR随机突变

以上述pGAPzαA-XynB为模板，进行易错PCR随机突变扩增，具体地扩增方法是：

第一轮扩增：以载体启动子引物NPWXynB-F1和NPWXynB-R1为引物进行PCR扩增，反应体系如下：

反应程序如下：

回收第一轮PCR产物，去1uL稀释50-100倍用作第二轮PCR的模板。第二轮易错PCR同样以特异性引物NPWXynB-F1及NPWXynB-R1进行PCR反应。

取第二轮的产物用EcoRI和NotI进行双酶切，连接至pGAPzαA载体上的。连接产物转化毕赤酵母X33，在YPDZ琼脂糖平板培养筛选突变菌株。

实施例3、高通量筛选高比活突变菌株

从实施例2易错PCR平板上挑取突变单菌落，将重组转化子用牙签逐个挑至24孔板，每个孔中加入1mL含有YPD培养基，30℃，220rpm培养48左右，离心取上清。将上述上清液分别取出200μL至96孔板，进行木聚糖酶酶活测定。木聚糖酶酶活检测参照中华人民共和国国家标准《GB/T 23874-2009》进行测定。将酶活提高的7个阳性突变克隆，一一提取基因组DNA，进行目的基因PCR扩增，确定突变位点。

测序结果确定氨基酸突变位点，克隆1的突变位点为+78M替换为+78Y；克隆2的突变点为+94Y替换为+94S；克隆3的突变点为+143V替换为+143L；克隆4的突变点为+145E替换为+145R；克隆5的突变点为+182D替换为+182R。通过定点突变将这些突变位点一一进行结合，通过筛选最终得到一条高比活的木聚糖突变基因NPWXynB。NPWXynB和XynB相比，有5个氨基酸的差异，突变位点由+78M,+94Y,+143V,+145E,+182D,突变成+78Y,+94S,+143L,+145R,+182R。

实施例4、内切木聚糖酶XynB及NPWXynB的比活分析

对改良前内切木聚糖酶XynB及改良后内切木聚糖酶NPXWXynB的比活分析如图1所示，由图1可知，木聚糖酶NPXWXynB在37℃的比活为11500U/mg，相比重组木聚糖酶XynB的比活(6300U/mg)，突变后的重组木聚糖酶NPWXynB比活提高了82.5％。

实施例5、木聚糖酶NPWXynB表达载体的构建及工程菌株的筛选

用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切纯化含有NPWXynB基因的DNA片段，连接到pPICzaA和pPIC9K载体得到表达载体pPICzaA-NPWXynB和pPIC9K-NPWXynB。将表达载体pPICzaA-NPWXynB和pPIC9K-NPWXynB线性化，电击转入酵母X33和GS115，将转化产物分别涂布固体培养平板，30℃培养2-3d。

实施例6、摇瓶及50L发酵罐培养

将平板上的酵母转化子，接种于含有50mL BMGY培养基的500mL三角瓶中，30℃，250r/min振荡过夜培养至OD600达到2～6。离心收集菌体，再将其重悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD600为1.0，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为0.75％进行诱导表达，同时测定木聚糖酶酶活。

将摇瓶培养筛选出来的重组工程菌，接种于100mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20h。以1：50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD600＝5，用以接种发酵罐。国产50L发酵罐，加入20L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至5.0，加入PTMl(4.35mL/L)，接入种子菌(1：10)。发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵分为三个阶段：生长期，从加入种子菌，培养约16-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTMl，1 2mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTMl，12mL/L)，流速从1mL/L·h经15h线性升至4mL/L·h，持续120h。

发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到153000U/mL，含NPWXynB基因的X33及GS115重组工程菌的发酵过程曲线如图2和图3所示。

实施例7、内切木聚糖酶XynB及NPWXynB的性质分析

对改良前内切木聚糖酶XynB及改良后内切木聚糖酶NPWXynB的最适pH如图2所示，由图4可知，XynB及NPWXynB的最适pH均为为5。对改良前内切木聚糖酶XynB及改良后内切木聚糖酶NPWXynB的最适反应温度如图5所示，由图5可知，XynB及NPWXynB的最适反应温度均为60℃。

<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司

<120> 一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用

<160> 3

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

QSFCSSASHS GQSVKVTGNK VGTIGGVGYE LWADSGNNSA TFYSDGSFSC TFQNAGDYLC 60

RSGLSFDSTK TPSQIGRMKA DFKLVKQNSS NVGYSYVGVY GWTRSPLVEY YIVDNWLSPF 120

PPGDWVGNKK HGSFTIDGAQ YTVYENTRTG PSIDGDTTFN QYFSIRQQAR DCGTIDISAH 180

FDQWEKLGMT MGKLHEAKVL GEAGNVNGGA SGTADFPYAK VYIGD 225

<210> 2

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

QSFCSSASHS GQSVKVTGNK VGTIGGVGYE LWADSGNNSA TFYSDGSFSC TFQNAGDFLC 60

RSGLSFDSTK TPSQIGRYKA DFKLVKQNSS NVGSSYVGVY GWTRSPLVEY YIVDNWLSPF 120

PPGDWVGNKK HGSFTIDGAQ YTLYRNTRTG PSIDGDTTFN QYFSIRQQAR DCGTIDISAH 180

FRQWEKLGMT MGKLHEAKVL GEAGNVNGGA SGTADFPYAK VYIGD 225

<210> 3

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caaagtttct gtagttcagc ttctcactct ggacaaagtg taaaggaaac cggcaacaag 60

gttggaacta ttggtggtgt tggttacgaa ttatgggctg atagtggtaa taacagtgct 120

actttctatt ctgatggttc cttctcatgt actttccaaa atgctgggga tttcttatgt 180

cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tttcaaggct 240

gatttcaaac ttgtcaaaca aaatatttcc aatgttggta gttcctatgt tggtgtttac 300

ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccatcc 360

ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420

tacactctct atagaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtaatac caccttcaaa 480

caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540

tttagacaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600

ggtgaagccg gtaacggtaa cggtggtgtc agtggtactg ctgatttccc atacgcaaag 660

gtttacattg gtgattag 678

Claims (8)

1.一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB，其特征在于，编码权利要求1所述的内切木聚糖酶。

3.如权利要求2所述的高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种提高内切木聚糖酶XynB比活的方法，其特征在于，所述方法在包括步骤：定点突变氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内切木聚糖酶XynB的氨基酸位点：第58位用F替代Y，第78位用Y替代M，第94位用S替代Y，第143位用L替代V，第145位用R替代E，第182位用R替代D。

5.包含权利要求2或3所述的高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPICzαA-NPWXynB或pPIC9K-NPWXynB。

7.包含权利要求2或3所述的高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB的重组菌株。

8.一种表达权利要求1所述高比活内切木聚糖酶NPWXynB的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求6所述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)重组菌株进行发酵，诱导重组内切木聚糖酶的表达；

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的高比活内切木聚糖酶NPWXynB。