CN114645035A - 木聚糖酶变体和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及变体木聚糖酶及其用途。本发明涉及变体木聚糖酶、编码变体木聚糖酶的多核苷酸、生产变体木聚糖酶的方法和使用变体木聚糖酶的方法。还描述了本发明的变体木聚糖酶在动物饲料工业中的用途。本发明还涉及包含一种或多种本发明的变体木聚糖酶的组合物。
Description
发明领域
本发明涉及变体木聚糖酶、编码变体木聚糖酶的多核苷酸、生产变体木聚糖酶的方法和使用变体木聚糖酶的方法。还描述了本发明的变体木聚糖酶在动物饲料工业中的用途。本发明还涉及包含一种或多种本发明的变体木聚糖酶的组合物。
发明背景
木聚糖是复杂的杂多糖，由在糖苷键和酯键的帮助下交织在一起的不同的单糖诸如L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和有机酸诸如乙酸、阿魏酸、葡糖醛酸组成。木聚糖的分解由于其异质性而受到限制并且可以通过能够切割异质β-1,4-糖苷键的木聚糖酶克服。木聚糖酶在自然界(例如，软体动物、昆虫和微生物)中大量存在，并且多种微生物诸如细菌、真菌、酵母和藻类广泛用于生产木聚糖酶。(Bhardwaj N.et al.Bioresources andBioprocessing(2019)6:40,1-36，在此通过引用整体并入)
天然木聚糖酶，例如真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶，已经添加到动物饲料中以提高消化和营养物吸收的效率。在消化饲料谷物(诸如小麦和大麦)期间，非淀粉多糖(包括木聚糖)在不添加外源性酶的情况下增加了消化物的黏度。这干扰了消化酶向饲料的扩散以及随后的营养物吸收。高黏性消化物增加了黏性粪便的发生，从而增加疾病的可能性并导致污水径流问题。饲料中木聚糖酶的添加分解了木聚糖并降低了消化物的黏度，从而提高难降解饲料(诸如大麦和小麦)的可消化性和营养价值。(美国专利US7,060,482B1，美国专利申请公开US2008/0020088A1，在此通过引用整体并入)。
为了针对有害细菌例如沙门氏菌(Salmonella)进行灭菌，动物饲料通常在高温下造粒。通过用100至140℃的蒸汽加热饲料固体并使它们穿过挤出机/造粒机以形成饲料团粒然后在储料仓中冷却，来进行饲料造粒。在团粒形成之前、期间和之后，固体内总体产生温度达到约70-95℃，持续长达30min。需要在饲料造粒期间添加木聚糖酶。这将为饲料配方设计师省去添加液体木聚糖酶的额外步骤，该添加液体木聚糖酶的额外步骤是不方便的并且可能将微生物污染引入到饲料中。作为单独的步骤添加固体木聚糖酶的选择也是不合需要的，因为固体不会均匀混合(美国专利US7,060,482B1，在此通过引用整体并入)。然而，这种饲料造粒期间的高温通常使酶失活。
Selle和Ravindran规定了理想饲料酶的特性，即；1)每单位蛋白质的高比活，2)饲料加工期间良好的热稳定性，3)动物肠道的典型pH范围内的高活性，4)对胃蛋白酶的抗性，和5)在环境温度下的良好稳定性。(SELLE,P.H.and RAVINDRAN,V.(2007)Microbialphytase in poultry nutrition.Animal Feed Science and Technology 135:1–41，在此通过引用整体并入)。尽管目前可用的酶有利于用作饲料添加剂，但也需要展现出高活性和对热处理和/或肠道低pH的抗性的新酶。
本发明的目的是提供具有增加的总活性、比活、温度活性、pH活性、总稳定性、热稳定性和/或pH耐受性的木聚糖酶活性的木聚糖酶变体，以及编码木聚糖酶变体的多核苷酸以及在动物饲料工业中使用木聚糖酶变体的方法。
发明概要
因此，本发明提供了(变体)木聚糖酶以及生产和使用它们的方法。本发明的氨基酸序列编号和核酸序列编号列于表1。
表1.氨基酸序列编号和核酸序列编号
| 木聚糖酶G1P(野生型)蛋白 | SEQ ID NO:1 |
| 木聚糖酶G2P蛋白 | SEQ ID NO:3 |
| 木聚糖酶G3P蛋白 | SEQ ID NO:5 |
| 编码木聚糖酶G1P(野生型)蛋白的核酸 | SEQ ID NO:2 |
| 编码木聚糖酶G2P蛋白的核酸 | SEQ ID NO:4 |
| 编码木聚糖酶G3P蛋白的核酸 | SEQ ID NO:6 |
在一方面，本发明提供了包含变体木聚糖酶的组合物，该变体木聚糖酶与SEQ IDNO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。
在进一步的方面，本发明提供了包含变体木聚糖酶的组合物，该变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的活性：约75℃下的总活性、约80℃下的总活性、约85℃下的总活性、约90℃下的总活性和约95℃下的总活性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。
在另一方面，本发明提供了包含变体木聚糖酶的组合物，该变体木聚糖酶与SEQID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的活性：针对pH2.5的耐受性、针对pH3.0的耐受性、针对pH3.5的耐受性、针对pH4.0的耐受性、针对pH4.5的耐受性、针对pH5.0的耐受性、针对pH5.5的耐受性、针对pH6.0的耐受性和针对pH6.5的耐受性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。
在进一步的方面，本发明提供了包含变体木聚糖酶的组合物，该变体木聚糖酶展现出与SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在另一方面，本发明提供了包含如本发明所述与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代的变体木聚糖酶的组合物，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的1处、在所述位置中的2处、在所述位置中的3处、在所述位置中的4处、在所述位置中的5处、在所述位置中的6处、在所述位置中的7处、在所述位置中的8处、在所述位置中的9处、在所述位置中的10处或在所述位置中的11处。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本发明所述与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代的变体木聚糖酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：Q1H,Q1P,S2K,S5I,S5K,S5R,S6H,S6K,S6T,S8C,S8H,S8R,Q12L,Q12T,K15H,K15R,K15T,K15V,G18S,K20C,K20S,K20V,T23S,G25E,G26C,G26N,G26R,G26T,V27I,V27W,G28D,S35R,N38Y,T51C,T51E,T51Q,T51R,T51S,F52W,N54D,N54G,G56H,G56K,G56R,G56T,G56Y,K86T,S89A,S89C,S89T,S89V,S90A,S90C,S90E,S90F,S90H,S90I,G93L,V99A,V99G,S105D,S105H,S105I,S105N,P119Q,F120D,F120H,F120S,F120Y,P121G,P121R,H131F,H131P,S133D,S133K,S133L,S133T,S133R,T135S,T149R,N160K,N160Q,N160R,Q168S,Q168A,S178T,E185K,T190H,T190P,L194M,G201L,G224K,G224L,G224M,G224T和D225Y.。
在另一方面，本发明提供了包含如本发明所述与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代的变体木聚糖酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：S5I,T51C,K15T,G25E,S5K,T51E,K20C,T51R,Q1P,T51Q,S8C,K20V,Q12T,G26C,S8H,K20S,K15R,Q12L,S6K,Q1H,S8R,K15H,S5R,G26T,G26N,K15V,S6T,S6H,G26R,V27W,T149R,G224K,D225Y,N160Q,T190P,G224L,G224M,G224T,Q168S,N160K,T190H,N160R,S105D,G56R,S90I,F120Y,N54D,S89C,F120H,G56T,S90C,S105H,V99A,G56H,S89V,S133L,S90E,V99G,S133T,S90A,S90F,S133K,N54G,S89A,G93L,F120D,S89T,S105I,S105N,H131F,P121G,F120S,H131P,G56K/P119Q,G56K/F120Y/S133D,G56K/S178T,T51S/S133D,V27I/G56K/N160K,P121R/S133D/N160K,G18S/V27I/G56K/N160K/L194M,G18S/N160K,G18S/G28D,G56K/P119Q/P121R/S133D/L194M,G18S/G56K/F120Y,V27I/N160K,T51S/P119Q/S133D/N160K/S178T,G18S/T23S/G56K/P119Q/F120Y/P121R/S133D,T51S/F120Y,G56K/S133D/N160K,T51S/G56K/F120Y/S178T,G56K/N160K,T51S/G56K/S133D/N160K,T51S/P119Q/F120Y/N160K,Q1P/S8R/K20V/T51C/S89C/S90H,Q1P/S8H/K20V,Q1P/K15T/K20C/V27W/V99A,S8C/K20V/V27W/H131F,S8H/H131F,V27W/H131F,Q1P/K20C/V27W,K15T/K20V/V27W,K20C/V27W/S89V/S90H,Q1P/S8H/K15T/V27W/H131F,Q1P/S8C/K15T/K20V/V27W/S89T/H131F,Q1P/S8H/K15H/V27W/H131F,Q1P/S8H/V27W/S89T,Q1P/S8R/S89A/S90H/H131F,K20V/V27W/T51C/S89C/S90H/H131F,Q1P/H131F,K15H/K20V/V27W/H131F/G224K,Q1P/S8R/K15T/K20V/V27W/S89A/S90H/V99A/H131F/G224L,Q1P/S8H/T51C/H131F,Q1P/K20V/V27W/V99A/H131F,Q1P/S8R/K20V/V27W/T51C/G224L,Q1P/S8R/K15T/K20C/V27W/S89A/H131F,K15T/K20V/V27W/H131F,Q1P/S8R/K20C/V27W,S8H/K20V/V27W,Q1P/S8H/K15H/K20V/V27W/S89C/S90H/V99A/H131F,Q1P/S8R/K15H/V27W/V99A,K15H/V27W,S90E/H131F,Q1P/K15H/K20V/V27W/T51C/S90H/H131F,K15T/K20C/V27W/H131F,V27W/G224L,K20V/V27W/H131F,K15T/K20V/V27W/T51C/G224L,Q1P/S8C/H131F,Q1P/S8R/K15H/K20V/V27W/T51C/S90E,Q1P/S8R/V27W,Q1P/S8C/V27W/T51C/H131F,Q1P/S8H,K15T/K20C/V27W/S90H/H131F,K15T/V27W/S90H,Q1P/K20V/H131F,K15T/V27W,Q1P/H131F/G224L,S8C/K15T/K20V/V27W/T51C/S90H,Q1P/K15T/K20C/V27W/T51C/S89C/S90H/H131F,Q1P/S8H/K20C/V27W,Q1P/S90H/N160K/T190H,Q1P/S5K/G26N/V27W/F120Y/Q168S/T190H,Q12T/K20C/G26T/S89C/H131F/Q168S,
S5I/K20S/S89T/V99A/F120D/H131F/Q168S/T190H,Q1P/S5K/K20S/S89C/F120Y,S6H/G56K/V99A/Q168S/T190H,S8R/K20V/T190H,K15T/G26T/G56K/H131F/N160K/T190H,S8H/K20C/S105N/H131F/N160Q/Q168S,Q1H/S5R/K15V/G56K/Q168S,K20S/G56K/F120Y/N160Q/T190H,S8R/H131F/T190H,G26N/V27W/G56K/S90H/H131F/Q168S/T190H,S89V/H131F/Q168S,S5R/Q12L/K15T/G26N/V27W/G56K/F120Y/H131F,S6H/S8R/K20S/S89A/V99A,Q1P/S5R/G26T/S90C/H131F/Q168S/T190H,S8H/K20C/T51R/S89A/P121R/N160K/T190H,Q1P/S5R/Q12T/K15V/G26T/V27W/S90E/H131F/G224K,Q1P/S5R/K20S/G56K/S89C/H131F/N160K/Q168S/T190H,Q1H/S5K/Q12L/S90H/S105N/T190H,S8C/K20C/T51C/S89A/Q168S,G26N/V27W/S105N/Q168S/G224L,S5I/S90H/S105N/F120Y/P121R/H131F/Q168S/G224K,S6H/S8C/K20S/T51S/F120Y/P121R/T190H,S5K/V99G/T190H,S5K/K20V/G56K/H131F/Q168S,S8R/T51R/S89T/H131F/T190H,Q1P/S5R/S8R/V99A/N160Q,S8R/T51C/F120D/Q168S/G224L,Q1P/V27W,Q1P/Q12T/K20V/G56K/S105N/N160Q/T190H/G224K,Q1H/S5I/Q12L/K15R/H131F,S89C/F120D/H131F/N160Q/G224L,K20C/P121R,K20S/V27W/T51Q/S105N/F120D/P121R/N160Q/T190H/G224M,Q1H/S8C/K20V/G56K/S89A/H131F/T190H/G224L,S8H/G26T,S6H/S8C/K20S/S89C/T190H,K20S/T51C/S89V/T190H,Q1H/Q12L/K15R/V27W/G56K/V99A/N160K/T190H,S8C/K15R/S105N/H131F/T190H,Q1H/S5R/Q12L/K20C/G56K/H131F/T190H,Q1H/S5I/Q12T/K15V/G26T/G56K/S90E/S105N/Q168S,S6H/K20C/S89T,Q1H/S5R/K15R/G26N/G56K/H131F/T190H/G224K,S89V/V99G/T190H,Q1H/S5I/Q12L/K15T/Q168S,Q12L/K15R/S90H/H131F/Q168S/T190H,Q1H/S5I/T190H,Q1P/S8H/K20V/T51Q/S89T/V99A/F120D/T190H,S8R/K20S/G56K/K86T/S89A/V99A/H131F,S8C/Q12T/K15V/G56K/T190H,K20S/S89C/F120Y/H131F/T190H,Q1P/K20V/G56K/S90E/S105N/H131F,S5I/K20S/G26N/V27W/G56K/S90H/S105N/Q168A/T190H,Q1P/S2K/S6H/S8R/S105N/Q168S/G224K,S8H/K20C/T51R/S89A/N160K/Q168S,Q1H/S5R/Q12T/K15R/G26N/S89A/V99G/F120D/P121R/T190H/G224M,S8C/K20S/G56K/S89C/V99G/F120D/P121R/T190H,S6H/S8H/K20C/T51R/S89A/P121R/T190H,Q1P/S5K/T51Q/V99G,Q1P/S5I/S89V/S105N/H131F/Q168S,S8H/K15V/K20C/T51Q/S89A/S105N/Q168S,Q1P/S5I/K15R/G26T/S89C/V99G/F120Y/N160Q/T190H/G224K,S89C/H131F/Q168S/T190H,Q1P/S5K/Q12L/K20C/T51Q/S89V/F120Y/N160K/Q168S/T190H,Q1H/S5K/G56K/F120D/P121R/Q168S,T51E/V99A/P121R/H131F/N160Q/Q168S/T190H/G224K,Q1P/S5R/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/S90C/S105N/T190H,S6H/S8R/K20C/T51C/F120D/T190H,S8R/K20S/F120D/P121R,S5R/S105N/Q168S/T190H,Q1H/S5R/K15V/G26N/V27W/H131F/Q168S/T190H,Q1H/S5R/Q12L/K15T/S90E/S105N/H131F/Q168S,K20V/S89V/V99A/N160K/Q168S/G224K,S90C/S105N/H131F,S6H/S8H/K20V/T190H,S8H/T51E/V99G/Q168S/T190H,S5R/Q12L/K20V/S89C/Q168S/T190H,Q1P/S5K/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/S89C/H131F,K15R/G56K/T190H,Q1H/S5K/Q12T/K15T/G26T/G56K/S89C/H131F/N160K/Q168S,S6H/S8R/K20V/T51E/S90H/S105N/H131F/T135S/Q168S/T190H,Q1P/S5K/Q12L/K15R/G56K/S89T/F120D,Q12L/H131F/N160K/T190H,Q1H/S5R/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/H131F,Q1P/S5K/Q12T/G56K/S105N/H131F/Q168S/T190H/G224L,V27W/S90C/V99G/S105N/F120Y/N160K/Q168S,G56K/S90C/H131F/Q168S/T190H,Q1P/S5R/G26T/G56K/S105N/H131F/Q168S/T190H,S8C/T51E/S89A/V99A/H131F/Q168S/T190H,S5K/K15H/G26T/S90H/H131F,G26N/G56K/S89T/H131F/Q168S/T190H/G224K,Q1P/Q12L/K15T/G26N/V27W/S90H/S105N/H131F/T190H,G56K/S90C,K20S/S89V/V99G/S105N/T190H,S5I/G26N/G56K/V99G/S105N,Q1P/S5R/G56K/H131F/N160K/T190H,Q1H/S5I/K20V/S89C,K20C/T51Q/S89C/V99G/F120D/P121R/T190H,S8R/Q12T/K15V/T51E/S89A/V99A/F120D/P121R/T190H,G26N/V27W/S105N/H131F/Q168S,S6H/S89T/V99A/F120D/P121R/N160Q/Q168S/T190H,T51Q/H131F,Q1P/S5R/Q12L/K15V/V27W/G56K/V99A/S105N/F120D/N160Q/Q168S,Q1P/S5R/G26N/G56K/S90H/S105N/F120D/P121R/T190H,S5R/Q12T/K20V/G56K/F120Y,S105N/F120D/P121R/T190H,S8R/K20C/G26N/V27W/G56K/H131F/T190H,Q1H/V27W/G56K/S90C,G56K/S90C/H131F/Q168S/T190H,Q12L/K15R/V27W/G56K/S90E,Q1H/S105N/T190H,G56K/S89T/S105N/P121R/H131F/Q168S/G224K,K20S/S89A/V99G/S105N/N160Q/T190H,Q1P/P121R/H131F/N160Q/T190H,K15V/T51Q/S89V/H131F/G224K,Q1P/K20S/N160K/T190H,S8H/G56K/S89V/F120Y/P121R/N160Q/Q168S/T190H,Q1H/S5K/V27W/G56K/Q168S/T190H,F120D/P121R/Q168S,S8H/K20V/T51S/V99A/T190H,S8R/T51E/S89T/V99G/N160K/T190H,K20S/S89C/T190H,K20S/S90E/G224M,K15V/G56K/S89T/T190H,S6H/S8R/Q12L/K15V/G26T/V27W/G56K/Q168S,Q1P/S5I/K20S/G56K/S90E/H131F/Q168S,S6H/F120Y/T190H,S8H/K20V/T51S,S105N/H131F,S5I/Q12T/K15H/G26T/V27W/G56K/S90H/S105N/H131F/N160K/T190H,Q1H/S5R/G26T/G56K/S105N/H131F/G224K,S5I/S89C/S105N/H131F/Q168S,Q1P/S5R/Q12L/K15R/G56K/S90H/F120D/P121R/H131F/N160K,S105N/H131F/Q168S,S6H/S8R/K20V/G56K/F120D/P121R/H131F/T190H,Q1P/S5I/G26N/V27W/S90E/H131F/Q168S/G224M,G56K/T190H,S8R/K20C/T51E/S89V/Q168S/G224M,S8C/K20S/S89A/F120Y/P121R/N160Q,S5R/S89T/F120Y/P121R/T190H,G26N/V27W/G56K/S105N/H131F/Q168S,S6H/S8R/S89A/F120Y,Q1P/S5R/Q12L/K15R/G26T/S90H/Q168S/T190H,K20C/H131F,K20C/V27W/H131F,K15H/K20C/H131F,K15H/K20V/V27W/S89A/H131F,K15H/S89C/H131F,K15H/V27W/H131F,K15R/K20C/H131F,K15R/K20C/S89A/H131F,K15R/K20C/S89C/H131F,K15R/K20C/S89V/H131F,K15R/K20V/H131F,K15R/S89A/H131F,K15R/S89C/H131F,K15R/S89V/H131F,K20C/H131F,K20C/S89T/H131F,K20C/V27W/S89T/H131F/E185K,K20V/H131F,K20V/S89C/H131F,K20V/S89T/H131F,K20V/S89V/H131F,S89A/H131F,S89C/H131F,S8C/K15H/K20C/S89T/H131F,S8C/K20C/H131F,S8C/K20V/S89C/H131F,S8C/K20V/S89T/H131F,S8H/K15R/K20C/S89T/H131F,S8H/K20C/S89T/H131F,S8H/K20C/V27W/H131F,S8H/K20V/H131F,S8H/K20V/S89C/H131F,S8H/K20V/V27W/S89T/H131F,S8R/K15H/K20V/S89C/H131F,S8R/K15R/K20C/H131F,S8R/K20C/S89C/H131F,V27W/S89C/H131F,V27W/S89T/H131F,G26T/V27W/H131F,V27W/S89A/H131F,V27W/H131F/S133T,G26T/V27W/S89A/H131F,G26T/V27W/H131F/S133T,V27W/S89A/H131F/S133T,G26T/V27W/S89A/H131FS/S133T,G26T/V27W/S35R/S89A/H131FS/S133R,和V27W/N38Y/F52W/G56Y/H131F/G201L。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述变体木聚糖酶的组合物，其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本发明所述与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代的变体木聚糖酶的组合物，其中所述氨基酸取代是H131F。
在另一方面，本发明提供了包含如本发明所述与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代的变体木聚糖酶的组合物，其中所述氨基酸取代是V27W/H131F。
在进一步的方面，本发明提供了包含变体木聚糖酶的组合物，该变体木聚糖酶包含氨基酸取代H131F，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：Q1H,Q1P,S2K,S5I,S5K,S5R,S6H,S6K,S6T,S8C,S8H,S8R,Q12L,Q12T,K15H,K15R,K15T,K15V,G18S,K20C,K20S,K20V,T23S,G25E,G26C,G26N,G26R,G26T,V27I,V27W,G28D,S35R,N38Y,T51C,T51E,T51Q,T51R,T51S,F52W,N54D,N54G,G56H,G56K,G56R,G56T,G56Y,K86T,S89A,S89C,S89T,S89V,S90A,S90C,S90E,S90F,S90H,S90I,G93L,V99A,V99G,S105D,S105H,S105I,S105N,P119Q,F120D,F120H,F120S,F120Y,P121G,P121R,S133D,S133K,S133L,S133T,S133R,T135S,T149R,N160K,N160Q,N160R,Q168S,Q168A,S178T,E185K,T190H,T190P,L194M,G201L,G224K,G224L,G224M,G224T和D225Y。
在进一步的方面，本发明提供了包含变体木聚糖酶的组合物，该变体木聚糖酶包含氨基酸取代V27W/H131F，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：Q1H,Q1P,S2K,S5I,S5K,S5R,S6H,S6K,S6T,S8C,S8H,S8R,Q12L,Q12T,K15H,K15R,K15T,K15V,G18S,K20C,K20S,K20V,T23S,G25E,G26C,G26N,G26R,G26T,G28D,S35R,N38Y,T51C,T51E,T51Q,T51R,T51S,F52W,N54D,N54G,G56H,G56K,G56R,G56T,G56Y,K86T,S89A,S89C,S89T,S89V,S90A,S90C,S90E,S90F,S90H,S90I,G93L,V99A,V99G,S105D,S105H,S105I,S105N,P119Q,F120D,F120H,F120S,F120Y,P121G,P121R,S133D,S133K,S133L,S133T,S133R,T135S,T149R,N160K,N160Q,N160R,Q168S,Q168A,S178T,E185K,T190H,T190P,L194M,G201L,G224K,G224L,G224M,G224T和D225Y。
在另一方面，本发明提供了编码如本文所述变体木聚糖酶的核酸。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中所述核酸经密码子优化用于宿主生物体，用于在所述生物体中如本文所述变体木聚糖酶的表达。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的序列具有至少80％序列同一性的序列。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的序列。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述核酸的表达载体。
在另一方面，本发明提供了包含如本文所述核酸的宿主细胞。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞组成的组。
在进一步的方面，本发明提供了制造变体木聚糖酶的方法，其包括：a)在表达所述变体木聚糖酶的条件下培养如本文所述的宿主细胞；和b)回收所述变体木聚糖酶。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含如本文所述变体木聚糖酶并进一步包含动物饲料。
在进一步的方面，本发明提供了适合动物食用的配制剂，其中所述配制剂包含如本文所述的变体木聚糖酶和一种或多种可食用组分。
在进一步的方面，本发明提供了制备动物饲料的方法，其包括将如本文所述的变体木聚糖酶添加到所述动物饲料中以产生木聚糖酶-动物饲料组合，并将所述木聚糖酶-动物饲料组合加热灭菌。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的制备动物饲料的方法，其中所述动物饲料是家禽或猪饲料。
附图简述
图1A-1N显示了如实施例3-5中所述的木聚糖酶变体的pH5.5和低pH活性，以及低pH和90℃稳定性。将木聚糖酶变体描述为与G1P木聚糖酶的比较：--指示0.8倍或更少(不利影响)，-指示0.8-1.1倍(中性影响)，+指示1.1-1.6倍(积极影响)和++指示>1.6倍(非常积极的影响)。对于CL00118607-CL00123961(CL00122441除外)，在pH2.5下筛选低pH活性，在pH3下筛选所有其他。对于热稳定性实验中的CL00118607-CL00135705、CL00128404、CL00131244和CL00131369，这些变体在90℃下温育15min，而所有其他变体温育5min。留空的值指示这些变体未在该条件下进行测定。
图2显示了如实施例3-5中所述的木聚糖酶变体的pH5.5和pH3活性以及90℃热稳定性。将变体描述为与G2P木聚糖酶的比较：--指示0.8倍或更少(不利影响)，-指示0.8-1.1倍(中性影响)，+指示1.1-2.5倍(积极影响)和++指示>2.5倍(非常积极的影响)。所有变体在pH3下测定低pH活性，并在90℃下温育5min以进行热稳定性测定。
图3A和3B按位置展示了木聚糖酶G1P的特定变体，其在低pH活性、pH5.5活性、低pH稳定性或热稳定性上显示出有益的特性，如图1和2所示。
图4A提供了木聚糖酶G1P(野生型)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，以及编码木聚糖酶G1P(野生型)蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:2)。图4B提供了木聚糖酶G2P蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和编码木聚糖酶G2P蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:4)。图4C提供了木聚糖酶G3P蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)和编码木聚糖酶G3P蛋白的核酸序列(SEQ IDNO:6)。这些变体的性能改善显示在图1和图2中。
发明详述
I.导言
木聚糖形成植物生物质中半纤维素的主要组分。木聚糖是用经由糖苷键和酯键交织在一起的单糖诸如L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和有机酸诸如乙酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸取代的杂多糖。木聚糖的主链由β-1,4-连接的木吡喃糖苷残基链组成。木聚糖的分解由于其异质性而受到限制，并且可以通过能够切割异质β-1,4-糖苷键的木聚糖酶克服(Bhardwaj N.et al.Bioresources and Bioprocessing(2019)6:40,1-36；美国专利申请公开US 2008/0020088 A1，在此通过引用整体并入)。
木聚糖酶通过破坏饲料成分阿糖基木聚糖、降低非淀粉多糖的含量和降低原料黏度而在动物饲料中发挥重要作用。因此，木聚糖酶改善存在于饲料中的蛋白质和淀粉的利用，并提高难降解饲料诸如大麦和小麦的可消化性和营养价值(Bhardwaj N.etal.Bioresources and Bioprocessing(2019)6:40,1-36；美国专利US 7,060,482 B1；美国专利申请公开US 2008/0020088 A1，在此通过引用整体并入)。
越来越多地，通过用100至140℃的蒸汽加热饲料固体在高温下灭菌并使它们通过挤出机/造粒机以形成饲料团粒然后在储料仓中冷却，使动物饲料形成团粒。在团粒形成之前、期间和之后，固体内总体产生温度达到约70-95℃(美国专利US 7,060,482 B1，在此通过引用整体并入)。因此，本文希望并提供在生理pH和温度下或附近展现出热稳定性和/或高活性的变体木聚糖酶。
II.定义
本文的“蛋白质”是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基基团通常包含天然存在的氨基酸和肽键。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、PEG化、环状排列(circular permutation)、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质域的融合、以及肽标签或标记物的添加。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用，“位置”是指蛋白质序列中的位置。在大多数情况下，除非另有说明，位置编号(其在下文中更充分地讨论)是相对于成熟木聚糖酶(例如，排除信号肽)的第一个氨基酸的。
短语“成熟多肽”意指处于其最终形式的多肽，其不包括信号肽以及随后的翻译和任何翻译后修饰，例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等。
短语“成熟多肽编码序列”是指编码具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
如本文所用，“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。例如，丝氨酸133(也称为Ser133或S133)是木聚糖酶G1P亲本酶中位置133处的残基。
术语“野生型”木聚糖酶是指如在自然界(诸如自然界中发现的软体动物、昆虫和微生物中)存在的木聚糖酶的典型形式的序列。
如本文所用，“亲本多肽”是指随后经修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。在本申请的情况下，一些实施方案利用如SEQ ID NO:1中所列的木聚糖酶G1P(野生型)蛋白作为亲本多肽。
术语“亲本”或“亲本木聚糖酶”是指作出改变以产生本发明的变体木聚糖酶的木聚糖酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。在一些实施方案中，本发明的亲本多肽是SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，本发明的亲本多肽是SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，本发明的亲本多肽是SEQ ID NO:5。
术语“变体”是指具有木聚糖酶活性并且在一个或多个(例如，几个)位置包含改变或修饰(例如取代、插入和/或缺失)的多肽。取代是指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；缺失是指去除占据一个位置的氨基酸；插入是指在占据一个位置的氨基酸附近并紧接其后添加氨基酸。
如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物、或编码它的氨基酸序列。优选地，与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比约1到约20个氨基酸修饰，优选约1到约11个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽是野生型序列。如下文进一步讨论的，本文的蛋白质变体序列将优选地展现出与亲本蛋白质序列至少约90％的序列同一性，最优选地至少约95％的序列同一性，更优选地至少约96％、97％、98％或99％的序列同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物或编码它的DNA序列。因此，本文的“变体木聚糖酶”或“木聚糖酶变体”是指与亲本木聚糖酶相比在氨基酸序列中具有至少一个氨基酸修饰的新木聚糖酶。如本文所讨论，在一些情况下，亲本木聚糖酶是第二代或更高代的变体木聚糖酶，诸如木聚糖酶G2P蛋白(SEQ ID NO:3)或G3P蛋白(SEQ ID NO:5)。除非另有说明或从上下文中显而易见，通常将本发明的变体木聚糖酶与G1P序列(SEQ ID NO:1)进行比较。另外，除非另有说明，本发明的变体木聚糖酶具有酶活性，即，使用以下实施例中描述的木聚糖酶测定法，存在可检测的木聚糖酶活性。
本文的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是与蛋白质连接的碳水化合物或PEG结构改变。本文中的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代针对不天然存在于特定位置处(不天然存在于生物体内或任何生物体中)的氨基酸。例如，取代G28D是指变体多肽，在此种情况下为木聚糖酶，其中28位的甘氨酸用天冬氨酸替换。多个突变由斜杠标记(“/”)分隔，例如，“G56K/F120Y/S133D”表示分别在位置56、120和133处的取代(在某些情况下可以使用“+”)。为清楚起见，已经工程化改造以改变核酸编码序列但不改变原始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但若蛋白质具有在其开始的特定位置处相同的氨基酸，则它不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-133E或133E表示在133位后和134位前插入谷氨酸。此外，-133ADE或133ADE表示在133位后和134位前插入AlaAspGlu。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”是指在亲本多肽序列中的特定位置处除去氨基酸序列。例如，Q12-或Q12#、Q12()或Q12del表示第12位谷氨酰胺的缺失。另外，QSV12-或QSV12#表示第12位开始的序列GlnSerVal的缺失。
术语“片段”意指具有一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽，其不存在于成熟多肽的氨基和/或羧基端。本文中的“木聚糖酶片段”意指保持木聚糖酶活性的本文所述氨基酸序列的一部分。在一方面，木聚糖酶片段含有成熟木聚糖酶多肽的至少50、至少100、至少150、至少200、至少210或至少220个氨基酸残基，该成熟木聚糖酶多肽具有根据本发明的零个、一个或多个取代。
如本文所用，“非天然存在的修饰”是指在野生型酶中未发现的氨基酸修饰。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”描述。出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Riceet al.,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选版本5.0.0或以后的版本中执行。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并如以下计算：
(相同残基x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
可以通过使用几种计算机程序使用其相应的默认参数比对多个多肽序列来测定另一种木聚糖酶中相应的氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值(log-expectation)的多重序列比较；版本3.5或以后的版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或以后的版本；Katoh andKuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059-3066；Katoh et al.,2005,Nucleic AcidsResearch 33:51 1-518；Katoh and Toh,2007,Bioinformatics 23:372-374；Katoh etal.,2009,Methods in Molecular Biology 537:39-64；Katoh and Toh,2010,Bioinformatics 26:1899-1900)、采用ClustalW的EMBOSS EMMA (1.83或以后的版本；Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)、和采用Clustal Omega的EMBL-EBI(Sievers and Higgins,2014,Methods Mol Biol.2014；1079:105–16)。
当另一种酶与SEQ ID NO:1的多肽趋异，使得传统的基于序列的比较未能检测到它们的关系(Lindahl and Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)时，可以使用其他成对序列比较算法。可以使用利用多肽家族(概况)的概率呈现内搜索数据库的搜索程序来获得基于序列的搜索的更大灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程生成概况，并且能够检测远程同源物(Atschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。若多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个呈现，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序诸如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffinand Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对概况和溶剂化电位)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，可以使用Gough et al.,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法来将未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，并且可以使用为此目的而开发的多种工具来评估此类模型的准确性。
对于已知结构的蛋白质，几种工具和资源可用于检索和生成结构比对。例如，已经在结构上比对SCOP蛋白质超家族，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm and Sander,1998,Proteins33:88-96)或组合扩展(Shindyalovand Bourne,1998,Protein Engineering 11:739-747)来比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的执行可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如Holm and Park,2000,Bioinformatics 16:566-567)。
在描述本发明的变体时，下面描述的命名法为了便于参考而改编。采用标准公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写并显示在表2中。
对于氨基酸取代，本文中使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，用天冬氨酸取代28位甘氨酸命名为“Gly28Asp”或“G28D”。多个突变由斜杠标记(“/”)分隔，例如“G56K/F120Y/S133D”表示分别在位置56、120和133处取代。
表2：20个氨基酸的三字母缩写、单字母缩写和名称。
术语“木聚糖酶”(“xylanase”或“xylanases”)是指一种或多种选自下组的酶：内切-1,4-β-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、α-葡糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、p-香豆酸酯酶(3.1.1.B10)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)，其参与将木聚糖解聚成简单的单糖和低聚木糖。出于本发明的目的，根据本文实施例中描述的程序确定木聚糖酶活性，例如，实施例3-5中确定木聚糖酶活性的木聚糖酶酶学测定法。
术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接指定变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，它以起始密码子诸如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密码子诸如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”意指表达编码本发明木聚糖酶的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是原生的(即，来自相同的基因)或外来的(即，来自不同的基因)或者彼此是原生的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导物、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最低程度下，控制序列包括启动子、转录和翻译终止信号。控制序列可以与接头一起提供，为了引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特定限制性位点。
术语“表达”包括涉及产生本文所述的多肽、蛋白质或前蛋白的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“前蛋白”是指蛋白质前体，其是无活性蛋白质或肽并且含有信号肽序列。前蛋白可以通过翻译后修饰诸如切除信号肽而转化为活性形式的蛋白质。
术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，其包含编码如本文所述的多肽、蛋白质或前蛋白的多核苷酸，并且与提供用于其表达的控制序列可操作地连接。
术语“子序列”是指具有一个或多个(例如，几个)核苷酸的多核苷酸，其不存在于成熟多肽编码序列的5'-和/或3'-末端；其中子序列编码具有木聚糖酶活性的片段。
本文中的“重组酶”是指通过重组技术产生酶，并且编码本发明的变体酶的核酸与至少一个外源性(例如对于亲本植酸酶非天然的)序列可操作地连接，该序列包括例如，启动子、终止子、信号序列等，如下文更全面地概述。
术语“宿主细胞”是指任何细胞类型，其对用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等易感，并且其允许该酶表达。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何后代。在许多实施方案中，本发明的木聚糖酶(包括本文所述的木聚糖酶和变体酶)不在内源性宿主中产生。
术语“改善的特性”是指与本文所述的变体木聚糖酶相关的与亲本木聚糖酶相比有所改善的特征。木聚糖酶的此类改善特性包括但不限于，增加的总活性、增加的比活(例如催化活性、其与木聚糖结合的能力和/或其分解纤维素/水解活性)、增加的温度活性(例如,增加的在广泛温度范围(包括高温)的活性)、增加的pH活性(例如，增加的在广泛pH范围(包括低pH)的活性)、增加的总稳定性、增加的温度稳定性(例如，增加的针对广泛温度范围(包括高温)的稳定性)、增加的pH稳定性(例如，增加的针对在广泛pH范围(包括低pH)的稳定性)、配制剂稳定性(包括液体、固体和团粒)、蛋白酶稳定性、饲料造粒过程中的性能、在动物和/或动物饲料中的性能和/或蛋白酶稳定性等。
术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然存在的基因中分离的或以下述方式修饰以含有核酸区段，该核酸区段在其它情况中不会存在于自然界中或者是合成的并且包含一个或多个控制序列。
术语“可操作连接”是指将构建体序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得控制序列指导、允许或促进编码序列的表达的构造。
术语“分离的”是指以在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其被至少部分地从与其天然相关联的天然存在的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)相对于自然界中发现的物质，经人为修饰的任何物质；或(4)通过增加所述物质相对于与其天然相关联的其他成分的量来修饰的任何物质(例如，多个拷贝的编码该物质的基因；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子等)。具体关于本发明的分离的木聚糖酶，分离的木聚糖酶通常是以下任意一种：a)从通常与之相关联的其他蛋白质中纯化出来；b)当酶处于未发现于自然界的浓度中时，或c)当酶在非内源性宿主细胞中产生时。
在本文核酸序列的情况下，“外源性”意指外源性元件通常不与自然界中的第二元件相关联，并因此是人工或合成构建体。本文中的“外源性构建体序列”意指通常不与编码木聚糖酶的核酸相关联的构建体序列(无论氨基酸或核酸序列，尽管正如通过使用该术语的上下文所理解的，通常是指核酸序列)。在许多实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其包含与外源性构建体序列(诸如外源性启动子)连接的木聚糖酶编码序列。为了清楚起见，通常对“外源性”的提及是关于木聚糖酶而不是宿主细胞。例如，如果宿主细胞是黑曲霉细胞，与木聚糖酶基因可操作地连接的启动子可以相对于黑曲霉是内源性的，但相对于木聚糖酶是外源性的。因此，在一些实施方案中，本发明提供了编码木聚糖酶(无论野生型或变体)的核酸构建体，该木聚糖酶与外源性构建体核酸序列可操作地连接。本文中的“外源性构建体序列”意指通常不与编码木聚糖酶的核酸相关联的构建体序列(无论氨基酸或核酸序列，尽管正如通过使用该术语的上下文所理解的，通常是指核酸序列)。
可以包含在染色体外或整合表达载体中的合适构建体序列包括但不限于，可选择标志物、纯化标签、复制起点和调节序列，该调节序列包括但不限于启动子(诱导型和组成型)、增强子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子、Shine-Dalgarno序列等。
本文中的“选择标志物”或“可选择标志物”或“选择蛋白”是指引入宿主细胞的蛋白质，其赋予宿主细胞生长期间适合人工选择的性状，使得只有含有可选择标志物的那些细胞生长。因此，可选择标志物是基因，该基因的产物提供了杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等等。下面概述了选择标志物的实例。相应地，“选择基因”是编码选择蛋白的核酸。
本文中的“染色体外表达载体”(通常也称为“质粒”)意指携带感兴趣的基因的自我复制表达载体(通常为质粒)，其保留在细胞内并且不整合到宿主细胞基因组中。
本文中的“整合表达载体”意指设计为插入到宿主细胞基因组中的载体，有时称为“附加体”。
III.本发明的木聚糖酶
本发明提供了热活性的、热稳定的和/或pH稳定和活性的木聚糖酶用于动物饲料应用。本发明提供了使用与SEQ ID NO:1中所列的野生型木聚糖酶相比包含至少一个氨基酸取代的变体木聚糖酶的组合物和方法，如下文更全面地描述。
IV.本发明的变体木聚糖酶
因此，本发明提供了具有改善特性的变体木聚糖酶，其可用于动物饲料应用。
通常，本发明的变体木聚糖酶与来自Neocallimastix patriciarum的亲本木聚糖酶或“G1P”(如图4A中显示的SEQ ID NO:1中所列)相比具有经修饰的、改善的生物化学特性。可在本文中改善的变体木聚糖酶的生物化学特性包括但不限于以下中的一种或多种：总活性、比活、温度活性、pH活性、总稳定性、热稳定性、pH耐受性、酸稳定性、配制剂稳定性(特别是制粒稳定性)、蛋白酶稳定性、饲料制粒过程中的性能、在动物和/或动物饲料中的性能和/或蛋白酶稳定性(特别是在非反刍动物胃中发现的胃蛋白酶稳定性)等。
本发明的变体木聚糖酶与G1P相比具有一种或多种改善的特性。本文中“改善的”是指至少一种生物化学特性的需要的变化。“改善的功能”可被测量为对于需要的特性(例如总活性、热活性、热稳定性和pH耐受性)的增加或不需要的特性(例如蛋白酶敏感性)的降低的情况下，特定活性的百分比增加或减少，或“倍数”变化。也就是说，变体木聚糖酶可以具有与G1P相比10％的总活性增加，或10％的蛋白酶敏感性降低。或者，变体木聚糖酶可以具有pH耐受性、热活性或蛋白酶敏感性等的至少1.1倍增加。通常，使用百分比变化来描述小于100％的生物化学活性变化，并且使用倍数变化来描述大于100％的生物化学活性变化(与亲本酶相比，在许多情况下为G1P)。在本发明中，可以实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％的生化活性的百分比变化(通常增加)。在本发明中，“倍数增加”(或降低)被测量为与起始酶或亲本酶相比。例如，如图1D所示，木聚糖酶变体G2P(集落追踪号：CL00122441)与G1P相比具有大于1.6倍的在低pH的总活性增加、至少1.1倍的在pH5.5的总活性增加，至少1.1倍的在低pH的稳定性增加、至少1.1倍的90℃热稳定性提高。这通过[(变体的活性)/(亲本的活性)]来计算。在许多实施方案中，改善是至少一又十分之一倍(1.1倍)、一倍半(1.5倍)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍，或10倍或更高。
本发明的变体木聚糖酶可以在许多生物化学特性中的一种或多种中具有改善，包括但不限于总活性、比活、温度活性、pH活性、总稳定性、温度稳定性、pH耐受性、配制剂稳定性(包括液体、固体和团粒)、蛋白酶稳定性、饲料造粒过程中的性能、在动物和/或动物饲料中的性能、和/或蛋白酶稳定性等。在一些实施方案中，改善被测量为与G1P酶相比。在一些实施方案中，改善被测量为与G2P酶相比。一般而言，使用如下所述的木聚糖酶酶测定法，改善被测量为与亲本酶相比。
A.木聚糖酶酶测定法以确定总活性
在一些实施方案中，采用木聚糖酶酶测定法来确定木聚糖酶总活性，诸如实施例3-5中描述的。具体地，将含有根据实施例2生产的亲本木聚糖酶和/或木聚糖酶变体的板解冻。将上清液稀释175倍至0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中，用于在pH5.5的活性测定。将上清液稀释20-80倍(取决于板)到0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH3.0)中，用于测量木聚糖酶的pH3活性的测定，或稀释到pH2.5 HCl溶液(89mmol NaCl,6.6mmol KCl)。
通过将1.00g木聚糖(玉米芯，上海源叶生物科技有限公司，供应商#S25540)和0.320g氢氧化钠溶解在50mL去离子水中，然后搅拌同时加热至100℃直到木聚糖完全溶解来制备1％木聚糖溶液。随后将木聚糖底物调整至需要的pH值。用乙酸至pH5.5，或用HCl至pH3.0和pH2.5，然后分别利用0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5)、0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH3.0)、或pH2.5 HCl溶液调整体积至100mL。
对于所有测定，低pH和pH5.5，将各自的1％木聚糖底物溶液添加到96孔PCR板(35μL/孔)。如实施例3中所述，通过将35μL的在低pH或pH5.5缓冲液中稀释的酶添加到含有相同pH的1％木聚糖溶液的板上来启动反应。然后将板密封，在37℃下以200rpm摇动温育2小时。温育后，通过添加80μLDNS(二硝基水杨酸)试剂淬灭反应。通过将3.15g 3,5-二硝基水杨酸添加到500mL水中，同时搅拌并加热至45℃来制备DNS试剂。接下来，将100mL的200g/L氢氧化钠溶液缓慢添加到搅拌中的溶液中，直至完全透明。透明后，将91.0g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚硫酸钠添加到搅拌中的溶液中，然后添加300mL水。将溶液冷却至室温并将体积调整至1000mL，过滤并在使用前在不透明瓶中贮存7天。
将添加DNS试剂后的板密封，使用热循环仪加热至95℃持续5min，冷却至4℃持续2min，颠倒5-6次混合，然后以1000rpm离心30s。将测定板开封，将来自每孔的100μL转移到含有100μL水的新透明底板并彻底混合。在540nm处测量每个孔的吸光度，并且吸光度值指示每个孔中的酶活性。将在特定pH值例如低pH(pH2.5或3)或pH5.5的变体酶活性与相同pH的WT(G1P)或G2P酶进行比较，以确定在各个pH下的活性改善。
在一些实施方案中，亲本木聚糖酶是SEQ ID NO:1的多肽。在一些实施方案中，亲本木聚糖酶是SEQ ID NO:3的多肽。
因此，如图1和2中所示，本发明的许多变体木聚糖酶在低pH(pH2.5或3)、pH5.5和/或90℃下展现出增加的总活性。
B.pH耐受性
在许多实施方案中，本发明的变体木聚糖酶在较低pH具有增加的pH稳定性，以解决非反刍动物的胃和胃肠道的较低pH。也就是说，许多木聚糖酶具有的pH概况对于动物中期望有活性的较低pH环境而言是亚最佳的。在此背景中“增加的pH稳定性”或“增加的pH耐受性”意指变体酶在相同pH挑战条件下比亲本木聚糖酶(例如G1P和/或G2P)更稳定。也就是说，在相同条件下，变体的活性高于亲本酶的活性(通常使用如实施例3-5中所示的木聚糖酶酶测定法)。
因此，在一些实施方案中，变体木聚糖酶与亲本木聚糖酶(特别是G1P和/或G2P)相比具有增加的pH稳定性，在pH2.0附近持续至少30分钟、在pH2.5附近持续至少30分钟、pH3.0附近持续至少30分钟、pH3.5附近持续至少30分钟、pH4.0附近持续至少30分钟、pH4.5附近持续至少30分钟、pH5.0附近持续至少30分钟、pH5.5附近持续至少30分钟、在pH6.0附近持续至少30分钟、或在pH6.5附近持续至少30分钟。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与亲本木聚糖酶(特别是G1P和/或G2P)相比具有增加的pH稳定性，在pH2.0附近持续至少100分钟、在pH2.5附近持续至少100分钟、在pH3.0附近持续至少100分钟、在pH3.5附近持续至少100分钟、在pH4.0附近持续至少100分钟、在pH4.5附近持续至少100分钟、在pH5.0附近持续至少100分钟、在pH5.5附近持续至少100分钟、在pH6.0附近持续至少100分钟、或在pH6.5附近持续至少100分钟。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与亲本木聚糖酶(特别是G1P和/或G2P)相比具有增加的pH稳定性，在pH2.0附近持续至少120分钟、在pH2.5附近持续至少120分钟、在pH3.0附近持续至少120分钟、在pH3.5附近持续至少120分钟、在pH4.0附近持续至少120分钟、在pH4.5附近持续至少120分钟、在pH5.0附近持续至少120分钟、在pH5.5附近持续至少120分钟、在pH6.0附近持续至少120分钟或在pH6.5附近持续至少120分钟。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与亲本木聚糖酶(特别是G1P和/或G2P)相比具有增加的pH稳定性，在pH2.0附近持续约120分钟、在pH2.5附近持续约120分钟、在pH3.0附近持续约120分钟、在pH3.5附近持续约120分钟、在pH4.0附近持续约120分钟、在pH4.5附近持续约120分钟、在pH5.0附近持续约120分钟、在pH5.5附近持续约120分钟、在pH6.0附近持续约120分钟或在pH6.5附近持续约120分钟。
如图1和2所示，本发明的许多变体木聚糖酶展现出增加的针对低pH(pH2.5或3)和/或pH5.5的耐受性。
C.热稳定性
在许多实施方案中，本发明的变体木聚糖酶具有增加的热稳定性，特别是在用于生产动物饲料的条件下，例如在造粒过程期间经常使用高温持续一段在传统上使野生型木聚糖酶失活的时间的条件下。在此背景中的“热稳定性”意指变体酶在相同的热挑战条件下比亲本木聚糖酶(例如G1P或G2P)更稳定，即变体的活性在相同条件下高于亲本木聚糖酶的活性(通常使用如本文概述并如实施例5中所示的木聚糖酶热稳定性测定法)。
合适的热稳定性测定法如下。将解冻的根据实施例2产生的亲本和/或变体木聚糖酶的板稀释4.5倍到96孔PCR板中的0.1M pH5.5乙酸钠缓冲液中。在热循环仪中，将剩余的以4.5倍稀释的酶在90℃下温育持续15min或5min，然后冷却至4℃持续2分钟。将热挑战的酶稀释20倍到新的96孔板中的0.1MpH5.5醋酸钠缓冲液中。然后如实施例3所述将稀释的酶(35μL)添加到含有35μL 1％木聚糖底物(pH5.5)的分离的96孔PCR板中。然后将板密封，在37℃下以200rpm摇动温育2个小时。温育后，如实施例3中所述，通过添加80μLDNS试剂来淬灭反应。添加DNS后，将板密封，加热至95℃持续5min，冷却至4℃持续2min，通过5-6次倒置混合，然后以1000rpm离心30秒。在540nm处测量每个孔的吸光度以指示酶活性。在相同条件下将木聚糖酶变体的活性与亲本酶进行比较以确定热稳定性的改善。
在一个实施方案中，当暴露于50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和/或95℃的温度持续一段时间(通常范围为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10分钟或更长，这取决于使用变体木聚糖酶的最终条件)时，(一些实施方案利用5分钟至10分钟、5分钟至15分钟、5分钟至30分钟、10分钟至30分钟、5分钟到60分钟、10分钟到60分钟的热挑战时间，都可用于本发明)，变体木聚糖酶比亲本木聚糖酶更稳定。在一些实施方案中，使用70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃的挑战。
因此，如图1和2中所示，本发明的许多变体木聚糖酶展现出增加的针对高温(90℃)的耐受性。
D.比活测定法
在一些实施方案中，本发明的变体木聚糖酶与亲本木聚糖酶，特别是G1P和/或G2P相比，具有增加的比活。本文中的“比活”意指每酶量(重量)的活性，通常通过将样品的酶活性除以木聚糖酶的量来测定，通常如本领域所已知的进行测定。
E.蛋白酶敏感性
在一些实施方案中，本发明的变体木聚糖酶在相同条件下比亲本酶对蛋白酶降解的敏感性更小。在某些情况下，在生产宿主生物中产生变体木聚糖酶的过程中，由宿主生物体产生的蛋白酶导致的蛋白酶降解可以是问题，因此导致活性酶的较低产率。类似地，取决于变体酶的用途，这里可能有可以降解木聚糖酶的存在于原始底物中的其他蛋白酶或组合使用的其他酶。
这通常如本领域已知的那样测定，例如通过允许蛋白水解降解，然后对所得片段进行N端测序以测定切割位点进行。在一些情况下，取决于变体和宿主生产生物体，可以没有显著的蛋白水解降解。
根据需要，如本领域技术人员将理解，可以进行的特定突变将取决于宿主生物体产生的内源性蛋白酶，并且还通常发生在因此可与蛋白酶接近的表面暴露的环结构或转角中。
V.具体的变体木聚糖酶
本发明提供了变体木聚糖酶，其与亲本木聚糖酶相比在对应于以下位置的一个或多个(例如若干)位置处包含一个或多个氨基酸取代：位置1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225。在一些情况下，变体酶可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个在这些位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体展现出与亲本木聚糖酶至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。在一些实施方案中，变体木聚糖酶展现出与亲本木聚糖酶至少95％、96％、97％、98％或99％，但小于100％的序列同一性。在一个实施方案中，亲本木聚糖酶是SEQ ID NO:1。在另一个实施方案中，亲本木聚糖酶是SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体酶与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性并且其中该变体木聚糖酶具有木聚糖酶活性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体酶与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性并且其中该变体木聚糖酶具有木聚糖酶活性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:5相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体酶与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性并且其中该变体木聚糖酶具有木聚糖酶活性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ IDNO:1相比具有至少1.1倍的更好的活性：在约75℃的总活性、在约80℃的总活性、在约85℃的总活性、在约90℃的总活性和在约95℃的总活性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ IDNO:1相比具有至少1.1倍的更好的活性：针对pH2.5的耐受性、针对pH3.0的耐受性、针对pH3.5的耐受性、针对pH4.0的耐受性、针对pH4.5的耐受性、针对pH5.0的耐受性、针对pH5.5的耐受性、针对pH6.0的耐受性和针对pH6.5的耐受性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQID NO:1具有至少90％同一性。在一些实施方案中，如本文所述的变体木聚糖酶与SEQ IDNO:1具有至少95％同一性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:3相比具有至少1.1倍的更好的活性：在约75℃的总活性、在约80℃的总活性、在约85℃的总活性、在约90℃的总活性和在约95℃的总活性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，如本文所述的变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:3相比具有至少1.1倍的更好的活性：针对pH2.5的耐受性、针对pH3.0的耐受性、针对pH3.5的耐受性、针对pH4.0的耐受性、针对pH4.5的耐受性、针对pH5.0的耐受性、针对pH5.5的耐受性、针对pH6.0的耐受性和针对pH6.5的耐受性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，如本文所述的变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:5相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:5相比具有至少1.1倍的更好的活性：在约75℃的总活性、在约80℃的总活性、在约85℃的总活性、在约90℃的总活性和在约95℃的总活性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性。在一些实施方案中，如本文所述的变体木聚糖酶与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:5相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:5相比具有至少1.1倍的更好的活性：针对pH2.5的耐受性、针对pH3.0的耐受性、针对pH3.5的耐受性、针对pH4.0的耐受性、针对pH4.5的耐受性、针对pH5.0的耐受性、针对pH5.5的耐受性、针对pH6.0的耐受性和针对pH6.5的耐受性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性。在一些实施方案中，如本文所述的变体木聚糖酶与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与亲本木聚糖酶相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的1处、在所述位置中的2处、在所述位置中的3处、在所述位置中的4处、在所述位置中的5处、在所述位置中的6处、在所述位置中的7处、在所述位置中的8处、在所述位置中的9处、在所述位置中的10处、在所述位置中的11处、在所述位置中的12处、在所述位置中的13处、在所述位置中的14处或在所述位置中的15处。在一个实施方案中，亲本木聚糖酶是SEQ ID NO:1。在另一个实施方案中，亲本木聚糖酶是SEQID NO:3。在进一步的实施方案中，亲本木聚糖酶是SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：Q1H、Q1P、S2K、S5I、S5K、S5R、S6H、S6K、S6T、S8C、S8H、S8R、Q12L、Q12T、K15H、K15R、K15T、K15V、G18S、K20C、K20S、K20V、T23S、G25E、G26C、G26N、G26R、G26T、V27I、V27W、G28D、S35R、N38Y、T51C、T51E、T51Q、T51R、T51S、F52W、N54D、N54G、G56H、G56K、G56R、G56T、G56Y、K86T、S89A、S89C、S89T、S89V、S90A、S90C、S90E、S90F、S90H、S90I、G93L、V99A、V99G、S105D、S105H、S105I、S105N、P119Q、F120D、F120H、F120S、F120Y、P121G、P121R、H131F、H131P、S133D、S133K、S133L、S133T、S133R、T135S、T149R、N160K、N160Q、N160R、Q168S、Q168A、S178T、E185K、T190H、T190P、L194M、G201L、G224K、G224L、G224M、G224T和D225Y。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：S5I、T51C、K15T、G25E、S5K、T51E、K20C、T51R、Q1P、T51Q、S8C、K20V、Q12T、G26C、S8H、K20S、K15R、Q12L、S6K、Q1H、S8R、K15H、S5R、G26T、G26N、K15V、S6T、S6H、G26R、V27W、T149R、G224K、D225Y、N160Q、T190P、G224L、G224M、G224T、Q168S、N160K、T190H、N160R、S105D、G56R、S90I、F120Y、N54D、S89C、F120H、G56T、S90C、S105H、V99A、G56H、S89V、S133L、S90E、V99G、S133T、S90A、S90F、S133K、N54G、S89A、G93L、F120D、S89T、S105I、S105N、H131F、P121G、F120S、H131P、G56K/P119Q、G56K/F120Y/S133D、G56K/S178T、T51S/S133D、V27I/G56K/N160K、P121R/S133D/N160K、G18S/V27I/G56K/N160K/L194M、G18S/N160K、G18S/G28D、G56K/P119Q/P121R/S133D/L194M、G18S/G56K/F120Y、V27I/N160K、T51S/P119Q/S133D/N160K/S178T、G18S/T23S/G56K/P119Q/F120Y/P121R/S133D、T51S/F120Y、G56K/S133D/N160K、T51S/G56K/F120Y/S178T、G56K/N160K、T51S/G56K/S133D/N160K、T51S/P119Q/F120Y/N160K、Q1P/S8R/K20V/T51C/S89C/S90H、Q1P/S8H/K20V、Q1P/K15T/K20C/V27W/V99A、S8C/K20V/V27W/H131F、S8H/H131F、V27W/H131F、Q1P/K20C/V27W、K15T/K20V/V27W、K20C/V27W/S89V/S90H、Q1P/S8H/K15T/V27W/H131F、Q1P/S8C/K15T/K20V/V27W/S89T/H131F、Q1P/S8H/K15H/V27W/H131F、Q1P/S8H/V27W/S89T、Q1P/S8R/S89A/S90H/H131F、K20V/V27W/T51C/S89C/S90H/H131F、Q1P/H131F、K15H/K20V/V27W/H131F/G224K、Q1P/S8R/K15T/K20V/V27W/S89A/S90H/V99A/H131F/G224L、Q1P/S8H/T51C/H131F、Q1P/K20V/V27W/V99A/H131F、Q1P/S8R/K20V/V27W/T51C/G224L、Q1P/S8R/K15T/K20C/V27W/S89A/H131F、K15T/K20V/V27W/H131F、Q1P/S8R/K20C/V27W、S8H/K20V/V27W、Q1P/S8H/K15H/K20V/V27W/S89C/S90H/V99A/H131F、Q1P/S8R/K15H/V27W/V99A、K15H/V27W、S90E/H131F、Q1P/K15H/K20V/V27W/T51C/S90H/H131F、K15T/K20C/V27W/H131F、V27W/G224L、K20V/V27W/H131F、K15T/K20V/V27W/T51C/G224L、Q1P/S8C/H131F、Q1P/S8R/K15H/K20V/V27W/T51C/S90E、Q1P/S8R/V27W、Q1P/S8C/V27W/T51C/H131F、Q1P/S8H、K15T/K20C/V27W/S90H/H131F、K15T/V27W/S90H、Q1P/K20V/H131F、K15T/V27W、Q1P/H131F/G224L、S8C/K15T/K20V/V27W/T51C/S90H、Q1P/K15T/K20C/V27W/T51C/S89C/S90H/H131F、Q1P/S8H/K20C/V27W、Q1P/S90H/N160K/T190H、Q1P/S5K/G26N/V27W/F120Y/Q168S/T190H、Q12T/K20C/G26T/S89C/H131F/Q168S、S5I/K20S/S89T/V99A/F120D/H131F/Q168S/T190H、Q1P/S5K/K20S/S89C/F120Y、S6H/G56K/V99A/Q168S/T190H、S8R/K20V/T190H、K15T/G26T/G56K/H131F/N160K/T190H、S8H/K20C/S105N/H131F/N160Q/Q168S、Q1H/S5R/K15V/G56K/Q168S、K20S/G56K/F120Y/N160Q/T190H、S8R/H131F/T190H、G26N/V27W/G56K/S90H/H131F/Q168S/T190H、S89V/H131F/Q168S、S5R/Q12L/K15T/G26N/V27W/G56K/F120Y/H131F、S6H/S8R/K20S/S89A/V99A、Q1P/S5R/G26T/S90C/H131F/Q168S/T190H、S8H/K20C/T51R/S89A/P121R/N160K/T190H、Q1P/S5R/Q12T/K15V/G26T/V27W/S90E/H131F/G224K、Q1P/S5R/K20S/G56K/S89C/H131F/N160K/Q168S/T190H、Q1H/S5K/Q12L/S90H/S105N/T190H、S8C/K20C/T51C/S89A/Q168S、G26N/V27W/S105N/Q168S/G224L、S5I/S90H/S105N/F120Y/P121R/H131F/Q168S/G224K、S6H/S8C/K20S/T51S/F120Y/P121R/T190H、S5K/V99G/T190H、S5K/K20V/G56K/H131F/Q168S、S8R/T51R/S89T/H131F/T190H、Q1P/S5R/S8R/V99A/N160Q、S8R/T51C/F120D/Q168S/G224L、Q1P/V27W、Q1P/Q12T/K20V/G56K/S105N/N160Q/T190H/G224K、Q1H/S5I/Q12L/K15R/H131F、S89C/F120D/H131F/N160Q/G224L、K20C/P121R、K20S/V27W/T51Q/S105N/F120D/P121R/N160Q/T190H/G224M、Q1H/S8C/K20V/G56K/S89A/H131F/T190H/G224L、S8H/G26T、S6H/S8C/K20S/S89C/T190H、K20S/T51C/S89V/T190H、Q1H/Q12L/K15R/V27W/G56K/V99A/N160K/T190H、S8C/K15R/S105N/H131F/T190H、Q1H/S5R/Q12L/K20C/G56K/H131F/T190H、Q1H/S5I/Q12T/K15V/G26T/G56K/S90E/S105N/Q168S、S6H/K20C/S89T、Q1H/S5R/K15R/G26N/G56K/H131F/T190H/G224K、S89V/V99G/T190H、Q1H/S5I/Q12L/K15T/Q168S、Q12L/K15R/S90H/H131F/Q168S/T190H、Q1H/S5I/T190H、Q1P/S8H/K20V/T51Q/S89T/V99A/F120D/T190H、S8R/K20S/G56K/K86T/S89A/V99A/H131F、S8C/Q12T/K15V/G56K/T190H、K20S/S89C/F120Y/H131F/T190H、Q1P/K20V/G56K/S90E/S105N/H131F、S5I/K20S/G26N/V27W/G56K/S90H/S105N/Q168A/T190H、Q1P/S2K/S6H/S8R/S105N/Q168S/G224K、S8H/K20C/T51R/S89A/N160K/Q168S、Q1H/S5R/Q12T/K15R/G26N/S89A/V99G/F120D/P121R/T190H/G224M、S8C/K20S/G56K/S89C/V99G/F120D/P121R/T190H、S6H/S8H/K20C/T51R/S89A/P121R/T190H、Q1P/S5K/T51Q/V99G、Q1P/S5I/S89V/S105N/H131F/Q168S、S8H/K15V/K20C/T51Q/S89A/S105N/Q168S、Q1P/S5I/K15R/G26T/S89C/V99G/F120Y/N160Q/T190H/G224K、S89C/H131F/Q168S/T190H、Q1P/S5K/Q12L/K20C/T51Q/S89V/F120Y/N160K/Q168S/T190H、Q1H/S5K/G56K/F120D/P121R/Q168S、T51E/V99A/P121R/H131F/N160Q/Q168S/T190H/G224K、Q1P/S5R/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/S90C/S105N/T190H、S6H/S8R/K20C/T51C/F120D/T190H、S8R/K20S/F120D/P121R、S5R/S105N/Q168S/T190H、Q1H/S5R/K15V/G26N/V27W/H131F/Q168S/T190H、Q1H/S5R/Q12L/K15T/S90E/S105N/H131F/Q168S、K20V/S89V/V99A/N160K/Q168S/G224K、S90C/S105N/H131F、S6H/S8H/K20V/T190H、S8H/T51E/V99G/Q168S/T190H、S5R/Q12L/K20V/S89C/Q168S/T190H、Q1P/S5K/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/S89C/H131F、K15R/G56K/T190H、Q1H/S5K/Q12T/K15T/G26T/G56K/S89C/H131F/N160K/Q168S、S6H/S8R/K20V/T51E/S90H/S105N/H131F/T135S/Q168S/T190H、Q1P/S5K/Q12L/K15R/G56K/S89T/F120D、Q12L/H131F/N160K/T190H、Q1H/S5R/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/H131F、Q1P/S5K/Q12T/G56K/S105N/H131F/Q168S/T190H/G224L、V27W/S90C/V99G/S105N/F120Y/N160K/Q168S、G56K/S90C/H131F/Q168S/T190H、Q1P/S5R/G26T/G56K/S105N/H131F/Q168S/T190H、S8C/T51E/S89A/V99A/H131F/Q168S/T190H、S5K/K15H/G26T/S90H/H131F、G26N/G56K/S89T/H131F/Q168S/T190H/G224K、Q1P/Q12L/K15T/G26N/V27W/S90H/S105N/H131F/T190H、G56K/S90C、K20S/S89V/V99G/S105N/T190H、S5I/G26N/G56K/V99G/S105N、Q1P/S5R/G56K/H131F/N160K/T190H、Q1H/S5I/K20V/S89C、K20C/T51Q/S89C/V99G/F120D/P121R/T190H、S8R/Q12T/K15V/T51E/S89A/V99A/F120D/P121R/T190H、G26N/V27W/S105N/H131F/Q168S、S6H/S89T/V99A/F120D/P121R/N160Q/Q168S/T190H,T51Q/H131F、Q1P/S5R/Q12L/K15V/V27W/G56K/V99A/S105N/F120D/N160Q/Q168S、Q1P/S5R/G26N/G56K/S90H/S105N/F120D/P121R/T190H、S5R/Q12T/K20V/G56K/F120Y、S105N/F120D/P121R/T190H、S8R/K20C/G26N/V27W/G56K/H131F/T190H、Q1H/V27W/G56K/S90C、G56K/S90C/H131F/Q168S/T190H、Q12L/K15R/V27W/G56K/S90E、Q1H/S105N/T190H、G56K/S89T/S105N/P121R/H131F/Q168S/G224K、K20S/S89A/V99G/S105N/N160Q/T190H、Q1P/P121R/H131F/N160Q/T190H、K15V/T51Q/S89V/H131F/G224K、Q1P/K20S/N160K/T190H、S8H/G56K/S89V/F120Y/P121R/N160Q/Q168S/T190H、Q1H/S5K/V27W/G56K/Q168S/T190H、F120D/P121R/Q168S、S8H/K20V/T51S/V99A/T190H、S8R/T51E/S89T/V99G/N160K/T190H、K20S/S89C/T190H、K20S/S90E/G224M、K15V/G56K/S89T/T190H、S6H/S8R/Q12L/K15V/G26T/V27W/G56K/Q168S、Q1P/S5I/K20S/G56K/S90E/H131F/Q168S、S6H/F120Y/T190H、S8H/K20V/T51S、S105N/H131F、S5I/Q12T/K15H/G26T/V27W/G56K/S90H/S105N/H131F/N160K/T190H、Q1H/S5R/G26T/G56K/S105N/H131F/G224K、S5I/S89C/S105N/H131F/Q168S、Q1P/S5R/Q12L/K15R/G56K/S90H/F120D/P121R/H131F/N160K、S105N/H131F/Q168S、S6H/S8R/K20V/G56K/F120D/P121R/H131F/T190H、Q1P/S5I/G26N/V27W/S90E/H131F/Q168S/G224M、G56K/T190H、S8R/K20C/T51E/S89V/Q168S/G224M、S8C/K20S/S89A/F120Y/P121R/N160Q、S5R/S89T/F120Y/P121R/T190H、G26N/V27W/G56K/S105N/H131F/Q168S、S6H/S8R/S89A/F120Y、Q1P/S5R/Q12L/K15R/G26T/S90H/Q168S/T190H、K20C/H131F、K20C/V27W/H131F、K15H/K20C/H131F、K15H/K20V/V27W/S89A/H131F、K15H/S89C/H131F、K15H/V27W/H131F、K15R/K20C/H131F、K15R/K20C/S89A/H131F、K15R/K20C/S89C/H131F、K15R/K20C/S89V/H131F、K15R/K20V/H131F、K15R/S89A/H131F、K15R/S89C/H131F、K15R/S89V/H131F、K20C/H131F、K20C/S89T/H131F、K20C/V27W/S89T/H131F/E185K、K20V/H131F、K20V/S89C/H131F、K20V/S89T/H131F、K20V/S89V/H131F、S89A/H131F、S89C/H131F、S8C/K15H/K20C/S89T/H131F、S8C/K20C/H131F、S8C/K20V/S89C/H131F、S8C/K20V/S89T/H131F、S8H/K15R/K20C/S89T/H131F、S8H/K20C/S89T/H131F、S8H/K20C/V27W/H131F、S8H/K20V/H131F、S8H/K20V/S89C/H131F、S8H/K20V/V27W/S89T/H131F、S8R/K15H/K20V/S89C/H131F、S8R/K15R/K20C/H131F、S8R/K20C/S89C/H131F、V27W/S89C/H131F,V27W/S89T/H131F、G26T/V27W/H131F、V27W/S89A/H131F、V27W/H131F/S133T、G26T/V27W/S89A/H131F、G26T/V27W/H131F/S133T、V27W/S89A/H131F/S133T、G26T/V27W/S89A/H131FS/S133T、G26T/V27W/S35R/S89A/H131FS/S133R和V27W/N38Y/F52W/G56Y/H131F/G201L。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是H131F。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是V27W/H131F。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体木聚糖酶，其中所述变体木聚糖酶包含氨基酸取代H131F，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：Q1H、Q1P、S2K、S5I、S5K、S5R、S6H、S6K、S6T、S8C、S8H、S8R、Q12L、Q12T、K15H、K15R、K15T、K15V、G18S、K20C、K20S、K20V、T23S、G25E、G26C、G26N、G26R、G26T、V27I、V27W、G28D、S35R、N38Y、T51C、T51E、T51Q、T51R、T51S、F52W、N54D、N54G、G56H、G56K、G56R、G56T、G56Y、K86T、S89A、S89C、S89T、S89V、S90A、S90C、S90E、S90F、S90H、S90I、G93L、V99A、V99G、S105D、S105H、S105I、S105N、P119Q、F120D、F120H、F120S、F120Y、P121G、P121R、S133D、S133K、S133L、S133T、S133R、T135S、T149R、N160K、N160Q、N160R、Q168S、Q168A、S178T、E185K、T190H、T190P、L194M、G201L、G224K、G224L、G224M、G224T和D225Y。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体木聚糖酶，其中所述变体木聚糖酶包含氨基酸取代V27W/H131F，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：Q1H、Q1P、S2K、S5I、S5K、S5R、S6H、S6K、S6T、S8C、S8H、S8R、Q12L、Q12T、K15H、K15R、K15T、K15V、G18S、K20C、K20S、K20V、T23S、G25E、G26C、G26N、G26R、G26T、G28D、S35R、N38Y、T51C、T51E、T51Q、T51R、T51S、F52W、N54D、N54G、G56H、G56K、G56R、G56T、G56Y、K86T、S89A、S89C、S89T、S89V、S90A、S90C、S90E、S90F、S90H、S90I、G93L、V99A、V99G、S105D、S105H、S105I、S105N、P119Q、F120D、F120H、F120S、F120Y、P121G、P121R、S133D、S133K、S133L、S133T、S133R、T135S、T149R、N160K、N160Q、N160R、Q168S、Q168A、S178T、E185K、T190H、T190P、L194M、G201L、G224K、G224L、G224M、G224T和D225Y。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶包含一种或多种选自图1和2的变体。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶是分离的变体木聚糖酶。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含在位置1处的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q1H。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q1P。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置2处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S2K。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置5处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S5I。在一些实施方案中，氨基酸取代是S5K。在一些实施方案中，氨基酸取代是S5R。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置6处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S6H。在一些实施方案中，氨基酸取代是S6K。在一些实施方案中，氨基酸取代是S6T。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比在位置8处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S8C。在一些实施方案中，氨基酸取代是S8H。在一些实施方案中，氨基酸取代是S8R。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置12处的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q12L。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q12T。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置15处的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K15H。在一些实施方案中，氨基酸取代是K15R。在一些实施方案中，氨基酸取代是K15T。在一些实施方案中，氨基酸取代是K15V。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置18处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G18S。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置20处的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K20C。在一些实施方案中，氨基酸取代是K20S。在一些实施方案中，氨基酸取代是K20V。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置23处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T23S。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置25处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G25E。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置26处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G26C。在一些实施方案中，氨基酸取代是G26N。在一些实施方案中，氨基酸取代是G65R。在一些实施方案中，氨基酸取代是G26T。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置27处的缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸,和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V27I。在一些实施方案中，氨基酸取代是V27W。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置28处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G28D。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置35处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S35R。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置38处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N38Y。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置51处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T51C。在一些实施方案中，氨基酸取代是T51E。在一些实施方案中，氨基酸取代是T51Q。在一些实施方案中，氨基酸取代是T51R。在一些实施方案中，氨基酸取代是T51S。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置52处的苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F52W。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置54处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N54D。在一些实施方案中，氨基酸取代是N54G。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置56处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G56H。在一些实施方案中，氨基酸取代是G56K。在一些实施方案中，氨基酸取代是G56R。在一些实施方案中，氨基酸取代是G56T。在一些实施方案中，氨基酸取代是G56Y。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置86处的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即天冬酰胺、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K86T。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置89处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S89A。在一些实施方案中，氨基酸取代是S89C。在一些实施方案中，氨基酸取代是S89T。在一些实施方案中，氨基酸取代是S89V。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置90处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S90A。在一些实施方案中，氨基酸取代是S90C。在一些实施方案中，氨基酸取代是S90E。在一些实施方案中，氨基酸取代是S90F。在一些实施方案中，氨基酸取代是S90I。在一些实施方案中，氨基酸取代是S90H。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置93处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G93L。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置99处的缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸,和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V99A。在一些实施方案中，氨基酸取代是V99G。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置105处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S105D。在一些实施方案中，氨基酸取代是S105H。在一些实施方案中，氨基酸取代是S105I。在一些实施方案中，氨基酸取代是S105N。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置119处的脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P119Q。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置120处的苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F120D。在一些实施方案中，氨基酸取代是F120H。在一些实施方案中，氨基酸取代是F120S。在一些实施方案中，氨基酸取代是F120Y。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置121处的脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P121G。在一些实施方案中，氨基酸取代是P121R。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置131处的组氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是H131F。在一些实施方案中，氨基酸取代是H131P。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置133处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S133D。在一些实施方案中，氨基酸取代是S133K。在一些实施方案中，氨基酸取代是S133L。在一些实施方案中，氨基酸取代是S133T。在一些实施方案中，氨基酸取代是S133R。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置135处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T135S。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置149处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T149R。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置160处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N160K。在一些实施方案中，氨基酸取代是N160Q。在一些实施方案中，氨基酸取代是N160R。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置168处的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q168S。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q168A。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置178处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S178T。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置185处的谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是E185K。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置190处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即谷氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T190H。在一些实施方案中，氨基酸取代是T190P。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置194处的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L194M。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置201处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G201L。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置224处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G224K。在一些实施方案中，氨基酸取代是G224L。在一些实施方案中，氨基酸取代是G224M。在一些实施方案中，氨基酸取代是G224T。
在一些实施方案中，变体木聚糖酶与野生型木聚糖酶(SEQ ID NO:1)成熟蛋白相比包含位置225处的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是用任何其他19种天然存在的氨基酸，即甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D225Y。
在一些实施方案中，本发明的变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQID NO:5具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，变体木聚糖酶是SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:5。
除了本文所述的具体的取代之外可能存在的氨基酸变化可以是次要性质的，其为不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；小的氨基或羧基端延伸，诸如氨基端甲硫氨酸残基；多达约20至约25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其他功能促进纯化的小延伸，诸如多组氨酸束、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例在以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且描述于，例如H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New York。常见的取代有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、LeuA al、Ala/Glu和Asp/Gly。
在一些实施方案中，本发明涉及具有改善的热特性，诸如热稳定性、加热稳定性(heat-stability)、pH稳定性、蒸汽稳定性、酸稳定性和活性和/或造粒稳定性的木聚糖酶变体，以及具有在许多实施方案中具有特别用途的对高温的高耐受性和对低pH的高耐受性的变体酶。
在一些实施方案中，本发明涉及具有改善的造粒稳定性和/或改善的酸稳定性的木聚糖酶变体。
因此，本发明的组合物和方法涉及具有改善的pH耐受性概况(profile)的木聚糖酶变体。
因此，本发明的组合物和方法涉及具有改善的蛋白酶稳定性，特别是非反刍动物胃中发现的胃蛋白酶稳定性的木聚糖酶变体。
因此，本发明的组合物和方法涉及具有改善的在动物饲料中的性能(例如改善的木聚糖酶释放和/或降解)的木聚糖酶变体。
VI.本发明的核酸
本发明另外提供了编码本发明的变体木聚糖酶的核酸。如本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，可以制备极大量的核酸，它们都编码本发明的变体木聚糖酶。因此，鉴定出特定的氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过简单地以不改变蛋白质氨基酸序列的方式修饰一个或多个密码子的序列来制备任何数目的不同核酸。因此，提供氨基酸序列允许产生非常大量的编码蛋白质的不同核酸序列。
在一些实施方案中，特定变体木聚糖酶由特定核酸序列编码，如图4中所列。
如本领域已知的，如本领域已知并且根据用于产生本发明的异二聚体抗体的宿主细胞，可以将编码本发明组分的核酸掺入表达载体中。通常，核酸与任何数目的调节元件(启动子、复制起点、选择标志物、核糖体结合位点、诱导物等)可操作连接。表达载体可以是染色体外或整合载体。
然后，将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域公知的任何数目的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，细菌和真菌可用于许多实施方案。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述变体木聚糖酶的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述变体木聚糖酶的核酸，其中该核酸经针对宿主生物体的密码子优化用于变体木聚糖酶在所述生物体中的表达。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的核酸，其中该核酸包含与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6的序列具有至少80％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的核酸，其中该核酸包含SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6的序列。
A.变体的制备
可以使用本领域已知的任何诱变程序制备编码本发明变体木聚糖酶的核酸，例如定点诱变和合成基因构建是本领域公知的。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，例如Tianet al.(2004,Nature 432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术以及类似技术，其中合成寡核苷酸并且在光可编程的微流体芯片上组装。一种优选的技术是
i.调节序列
本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以以多种方式操作多核苷酸以提供变体的表达。根据表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在本领域中是公知的。
控制序列可以是启动子，即为了表达多核苷酸而被宿主细胞识别的多核苷酸。启动子含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变体启动子、截短的启动子和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)植酸酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、腐皮镰孢菌(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、腐皮镰孢菌Daria(WO 00/56900)、腐皮镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导物已经由来自曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导物替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导物已经由来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导物替换；和其突变体启动子、截短启动子和杂合启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得。Romanoset al.,1992,Yeast 8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。
控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3’端可操作连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的终止子获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉植酸酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
在一些实施方案中，用于酵母宿主细胞的终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。Romanoset al.,1992，见上文描述了用于酵母宿主细胞的其他有用终止子。
控制序列也可以是增加基因表达的启动子下游且基因编码序列上游的mRNA稳定区。
合适的mRNA稳定区的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)crylllA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hueet al.,1995,Journal ofBacteriology 177:3465-3471)获得。
控制序列也可以是前导物，即对于由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导物序列与编码变体的多核苷酸的5’端可操作连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导物。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的前导物是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
在一些实施方案中，从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得酵母宿主细胞的合适前导物。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即与变体编码序列的3’端可操作连接的序列，并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉植酸酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。
Guo and Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端连接并指导表达的变体木聚糖酶进入细胞的分泌途径的信号肽。多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码变体木聚糖酶的编码序列片段天然连接的信号肽编码序列。或者，编码序列的5’端可以含有对于编码序列外源的信号肽编码序列。当编码序列天然不含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。或者，外源信号肽编码序列可以简单地替换天然信号肽编码序列以增强变体木聚糖酶的分泌。然而，可以使用将表达的变体导入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉植酸酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、高温毛壳霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶、和米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。
在存在信号肽和前肽序列两者的情况下，前肽序列位于变体的N端附近，并且信号肽序列位于前肽序列的N端附近。
还可以期望添加相对于宿主细胞生长调节变体表达的调节序列。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操作基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在一些实施方案中，酵母是酿酒酵母。在丝状真菌中，例如，可以使用黑曲霉木聚糖酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作连接。
1.表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的合适载体中来表达多核苷酸。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与适合于表达的控制序列可操作连接。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述核酸的表达载体。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA程序并且可以导致多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与待导入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并且与已经整合有它的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。涵盖用于本发明方法的载体包括整合载体和非整合载体两者。
在一些实施方案中，载体含有一个或多个允许容易选择经转化的、经转染的、经转导的或类似细胞的选择性标志物。选择性标志物是下述基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。
用于酵母宿主细胞的合适标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。对于在曲霉细胞中使用优选的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
在一些实施方案中，载体含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或载体在细胞中不依赖于基因组的方式自主复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置处整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是任何介导在细胞中发挥功能的自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gemset al.,1991,Gene98:61-67；Cullenet al.,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将超过一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。可以通过如下获得多核苷酸的拷贝数的增加：将至少一个额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或与多核苷酸一起纳入可扩增选择标志物基因，其中含有扩增拷贝的选择标志物基因和因此多核苷酸的额外拷贝的细胞可以通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上)。
2.密码子优化
密码子优化可以与本发明的任何变体木聚糖酶多肽一起使用，以优化使用的宿主细胞中的表达。此类方法在本领域中是公知的，并且记载于例如WO 2007/142954。在异源表达系统中，优化步骤可以改善宿主产生期望变体木聚糖酶多肽的能力。蛋白质表达受许多因子控制，包括影响转录、mRNA加工和稳定性以及翻译起始的因子。多核苷酸优化步骤可以包括改善宿主产生外源蛋白质的能力的步骤以及协助研究人员有效设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括例如翻译起始区域的修饰、mRNA结构元件的改变、以及使用不同的密码子偏倚。以下段落讨论可以导致异源蛋白质表达降低的潜在问题以及可以克服这些问题的技术。
在一些实施方案中，减少的异源蛋白质表达源自罕见的密码子诱导的翻译暂停。罕见的密码子诱导的翻译暂停包括在宿主生物中很少使用的感兴趣多核苷酸中密码子的存在由于它们在可用的tRNA库中的缺乏而可以对蛋白质翻译具有负面影响。改善宿主生物体中最佳翻译的一种方法包括进行密码子优化，其可以导致在合成多核苷酸序列中修饰罕见的宿主密码子。
在一些实施方案中，减少的异源蛋白质表达源自交替的翻译起始。交替的翻译起始可以包括合成的多核苷酸序列，其无意地含有能够作为核糖体结合位点(RBS)发挥功能的基序。这些位点可以导致从基因内部位点起始截短的蛋白质的翻译。一种降低产生截短蛋白质(其在纯化期间可以难以除去)的可能性的方法包括从优化的多核苷酸序列修饰推定的内部RBS序列。
在一些实施方案中，通过重复诱导的聚合酶滑动发生减少的异源蛋白质表达。重复诱导的聚合酶滑动涉及核苷酸序列重复，已经显示其引起DNA聚合酶的滑动或延宕(stuttering)，这可以导致移码突变。此类重复也可以引起RNA聚合酶的滑动。在具有高G+C含量偏好的生物体中，可以存在由更高程度的G或C核苷酸重复组成的重复。因此，一种降低诱导RNA聚合酶滑动的可能性的方法包括改变G或C核苷酸的延伸重复。
在一些实施方案中，通过干扰二级结构发生减少的异源蛋白质表达。二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子并且与蛋白质表达的降低相关。茎环结构也可以参与转录暂停和减弱。优化的多核苷酸序列可以含有核苷酸序列的RBS和基因编码区中的最小的二级结构以允许改善的转录和翻译。
在一些实施方案中，限制性位点可以实现异源蛋白质表达。通过修饰可以干扰转录单元随后亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点，可以优化多核苷酸序列。
优化DNA序列可以负面或正面影响基因表达或蛋白质。例如，用更常见的密码子修饰不太常见的密码子可以通过引入干扰信息翻译的二级结构来影响mRNA的半衰期或改变其结构。因此，在某些情况下，可以有必要改变优化的信息。
可以优化AUG或基因的一部分。在一些实施方案中，通过优化基本上整个基因来实现表达的期望调节。在其他实施方案中，将通过优化部分而不是整个基因来实现期望的调节。
可以调节任何编码序列的密码子选择以实现期望的性质，例如特定细胞类型中的高水平表达。此类优化的开始点可以是具有100％常见密码子的编码序列，或含有常见和非常见密码子的混合物的编码序列。
可以产生并测试两种或更多种在其密码子选择上不同的候选序列以确定它们是否拥有期望的性质。候选序列可以通过使用计算机来评估调控元件诸如沉默子或增强子的存在并且寻找编码序列的区域的存在来评估，所述编码序列的区域可以通过密码子选择的改变而转换成此类调控元件。另外的标准可以包括特定核苷酸，例如A、C、G或U的富集、特定氨基酸的密码子偏好、或特定mRNA二级或三级结构的存在或缺乏。可以基于许多此类标准来对候选序列进行调整。
构建有希望的候选序列，然后通过实验评估。多个候选物可以彼此独立评估，或者该过程可以是迭代的，其通过使用最有希望的候选物作为新的开始点，或者通过组合两个或更多个候选物的区域来产生新的杂合物来进行。可以包括进一步的修改和评估轮次。
修改候选序列的密码子选择可以导致正或负元件的创建或破坏。一般地，正元件是指任何下述元件，其改变或从候选序列的除去可以导致治疗性蛋白质表达的减少或其创建可以导致治疗性蛋白质表达的增加。例如，正元件可以包括增强子、启动子、下游启动子元件、正调节物(例如转录激活物)的DNA结合位点或负责赋予或修饰mRNA二级或三级结构的序列。负元件是任何下述元件，其改变或从候选序列的除去可以导致治疗性蛋白质表达增加或其创建会导致治疗性蛋白质表达的减少。负元件包括沉默子、负调节子(例如转录阻遏子)的DNA结合位点、转录暂停位点或负责赋予或修饰mRNA二级或三级结构的序列。一般地，负元件比正元件更频繁出现。因此，导致蛋白质表达增加的密码子选择的任何变化更可能源自负元件的破坏而非正元件的创建。另外，与创建正元件相比，候选序列的改变更有可能破坏负元件。在一些实施方案中，选择和修饰候选序列以增加治疗性蛋白质的产生。可以例如通过顺序改变密码子或通过随机改变候选序列中的密码子来修饰候选序列。然后通过测定所得治疗性蛋白的表达水平或通过评估另一个参数(例如与表达水平相关的参数)来评估经修饰的候选序列。选择与未改变的候选序列相比产生增加水平的治疗性蛋白质的候选序列。
在一些实施方案中，可以例如在不参考蛋白质或信息结构的情况下修饰一个或一组密码子并测试。或者，可以在信息水平特性上选择一个或多个密码子，例如预先确定的，例如高或低GC含量的区域中的位置、具有诸如增强子或沉默子的结构的区域中的位置、可以经修饰以引入诸如增强子或沉默子的结构的区域、在具有或预测具有二级或三级结构的区域中的位置，例如链内配对、链间配对、缺乏或预测缺乏二级或三级结构的区域中的位置，例如链内或链间配对。若产生期望的结果，则选择特定的经修饰的区域。
系统性产生候选序列的方法是有用的。例如，可以将合成核酸序列的各个位置处的一个或一组，例如连续的一段密码子用常见的密码子(或者若例如起始序列已经经优化，则用非常见密码子)修饰，并且评估所得的序列。可以通过优化(或去优化)序列中给定的密码子“窗”以产生第一候选物，然后将窗移动到序列中的新位置，以及优化(或去优化(de-optimizing))窗下的新位置中的密码子以提供第二候选物。候选物可以通过测定它们提供的表达水平或通过评估另一个参数(例如与表达水平相关的参数)来评估。可以通过检查或以计算方式来评估一些参数，例如其拥有或缺乏高或低GC含量；序列元件，如增强子或沉默子；二级或三级结构，例如链内或链间配对。
在一些实施方案中，优化的核酸序列可以以由尚未优化的核酸序列表达的水平的至少110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％或甚至10,000％的水平表达本发明的变体木聚糖酶多肽。
以变体木聚糖酶的氨基酸序列开始，可以设计候选DNA序列。在合成DNA序列的设计期间，可以将密码子选择的频率与宿主表达生物体的密码子选择比较，并且可以在合成序列中修饰稀有的宿主密码子。另外，可以修饰合成候选DNA序列以除去不期望的酶限制性位点并添加或改变任何期望的信号序列、接头或非翻译区。可以对合成的DNA序列分析可能干扰翻译过程的二级结构的存在，诸如G/C重复和茎环结构。在合成候选DNA序列之前，可以检查经优化的序列设计以验证序列正确编码期望的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技术，如本领域已知的技术合成候选DNA序列。
在一些实施方案中，可以利用宿主生物体中的一般密码子选择(诸如本文所述的那些)来优化宿主生物体中异源多核苷酸序列的表达。可以评估在宿主表达系统中很少被认为是特定氨基酸优选的密码子的百分比和分布。可以使用5％和10％选择的数值作为确定稀有密码子的截留值。
VII.宿主细胞和生产菌株
如本领域技术人员将理解的，存在用于重组生产本发明的变体木聚糖酶的极其多种生产宿主生物体，包括但不限于细菌细胞和包括酵母的真菌细胞。此外，虽然亲本木聚糖酶是未糖基化的，但通过在酵母和真菌中产生的糖基化不会不利地影响木聚糖酶活性。
本发明还涉及包含编码本发明的变体木聚糖酶的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸与指导本发明变体的产生的一个或多个控制序列可操作连接。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞中，使得构建体或载体作为染色体整合体或作为自身复制的染色体外载体维持，如前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码变体的基因及其来源。在一些实施方案中，宿主细胞展现变体木聚糖酶的瞬时表达。在一些实施方案中，宿主细胞是稳定转染的宿主或稳定(即永久)表达变体木聚糖酶的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是生产宿主细胞。
宿主细胞可以是用于重组生产变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。此类宿主细胞包括但不限于细菌、真菌和酵母细胞。宿主细胞也可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌纲(Ascomycota)，担子菌纲(Basidiomycota)，壶菌亚门(Chytridiomycota)和接合菌亚纲(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂真菌(mitosporic fungi)(如Hawksworthet al.,于Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来发生变化，为了本发明的目的，酵母的定义应当如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,and Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)所述定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括亚门真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门的所有丝状形式(如Hawksworthet al.,1995，同上所定义)。丝状真菌的特征通常在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，并且碳分解代谢是专门需氧的。相反，酵母诸如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽并且碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、金小孢子属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、云芝(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新丽鞭毛菌(Neocallimastix)、脉孢菌(Neurospora))、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、脉射菌属(Phlebia)、单鞭毛菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂折菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、Thielavia、梭孢壳属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。适用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的方法记载于EP 238023,Yeltonet al,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474和Christensenet al.,1988,BiolTechnology 6:1419-1422。适合于转化镰孢菌物种的方法由Malardieret al.,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由Becker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology,Volume 194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Itoet al.,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnenet al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920描述的程序转化酵母。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述核酸的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述表达载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述核酸的宿主细胞，其中宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述表达载体的宿主细胞，其中宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
VIII.组合物
本发明还提供了包含如本文所述变体木聚糖酶的组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包含动物饲料。在一些实施方案中，组合物包含载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类变体木聚糖酶多肽。术语“富含”表示组合物的木聚糖酶活性已经增加，例如富集因子至少为1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特征，例如低色、低臭和可接受的储存稳定。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的变体木聚糖酶多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。在一些实施方案中，组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶和/或转谷氨酰胺酶。
IX.生产方法
本发明还涉及生产变体木聚糖酶多肽的方法，其包括：(a)在表达所述变体木聚糖酶多肽的条件下培养如本文所述的本发明的宿主细胞；并且(b)任选地回收变体木聚糖酶多肽。
使用本领域已知的方法在适于产生变体木聚糖酶多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或在合适的培养基中和在允许变体表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞。使用本领域已知的程序在含有碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生培养。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若将变体木聚糖酶多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收变体木聚糖酶多肽。若不分泌变体，则可以从细胞裂解物中回收它。
可以使用本领域已知的对变体特异的方法来检测变体木聚糖酶多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定法来测定变体木聚糖酶多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法回收变体木聚糖酶多肽。例如，可以通过包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规程序从营养培养基中回收变体木聚糖酶多肽。
可以通过本领域已知的多种程序纯化变体，所述程序包括但不限于层析(例如离子交换、亲和力、疏水性、层析聚焦和大小排阻)、电泳程序(例如制备性等电聚焦)、差异SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification，Janson和Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)以获得基本上纯的变体。
在备选的方面，不回收变体，而是使用表达变体的本发明的宿主细胞作为变体的来源。在一个具体的实施方案中，不回收本发明的木聚糖酶变体，并且宿主细胞是酵母宿主细胞。具体地，酵母是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔斯伯氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁维酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母细胞。在一些实施方案中，酵母是酿酒酵母。
X.木聚糖酶制剂和用途
如本文所讨论的，木聚糖酶可以破坏饲料组分阿糖基木聚糖，降低非淀粉多糖的含量并降低原料黏度。因此，在动物饲料中使用木聚糖酶具有许多益处，包括提高难降解饲料(如大麦和小麦)的消化率和营养价值，以及改善饲料中存在的蛋白质和淀粉的利用度。
在一些实施方案中，将本发明的变体木聚糖酶配制并添加到饲料中或可以作为饲料的组分制备。在前一种情况下，木聚糖酶的原料添加可以通过在载体饲料如小麦粉上配制木聚糖酶来完成。
在一些实施方案中，本发明提供了适合于动物食用的配制剂，其中所述配制剂包含如本文所述的变体木聚糖酶和一种或多种可食用组分。
如本领域技术人员将理解的，本发明的变体木聚糖酶的配制剂取决于其最终用途和相关条件。本发明变体木聚糖酶的合适配制剂包括液体配制剂、干燥配制剂(包括喷雾干燥配制剂)、粉末配制剂、颗粒配制剂和造粒(pelleted)配制剂。
在一些实施方案中，本发明的酶组合物(即多肽组合物)可以为任何适合于使用的形式，诸如例如，除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或没有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物或宿主细胞作为酶的来源。
在一些实施方案中，酶组合物可以是干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定液体或稳定的受保护的酶。例如，液体酶组合物可以根据已建立的方法通过添加稳定剂诸如糖、糖醇或其他多元醇和/或乳酸或另一种有机酸来稳定。
在一些实施方案中，本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件可以基于本领域已知的方法确定。
上述组合物适用于液化、糖化和/或发酵过程。
在一些实施方案中，上述组合物用于动物饲料应用。在一个实施方案中，将木聚糖酶添加到动物饲料中并造粒，如本领域已知，使得饲料与木聚糖酶一起在其中形成。在其他实施方案中，木聚糖酶可以喷雾或以液体形式定量到动物饲料中。
在一些实施方案中，本发明提供了制备动物饲料的方法，其包括将如本文所述的变体木聚糖酶添加到所述动物饲料中以产生木聚糖酶-动物饲料组合，并且将所述木聚糖酶-动物饲料组合加热灭菌。在一些实施方案中，动物饲料是家禽或猪饲料。
实施例
XI.实施例1：木聚糖酶集合的设计和构建。
来自Neocallimastix patriciarum的野生型木聚糖酶或G1P通过来自GeneWiz(https://www.genewiz.com/)的基因合成获得。为了进一步改善活性、pH稳定性、热稳定性和低pH活性，基于序列和结构分析设计了多个变体集合。设计包括每个变体的一到多个特定突变。随后使用标准定点诱变方法构建变体集合，并随后将其克隆到pESC-URA载体(Agilent Technologies：目录号217454)中。
XII.实施例2：在HTP中由酿酒酵母产生的木聚糖酶的制备。
将来自酿酒酵母INVSc1菌株(ThermoFisher Scientific,USA：目录#V8251-20)的单菌落的重组木聚糖酶编码基因接种到96孔板中具有2％葡萄糖且无尿嘧啶补充剂的350μL合成基本培养基中。诱导后，将板在30℃、85％湿度下温育过夜，同时以200rpm摇动。测定过夜培养物的OD600，并将所有培养物稀释至0.4的最终OD600到新鲜的96孔板中，该板含有总体积为300μL的补充有1％半乳糖和0.5％棉子糖的SC选择性培养基。将诱导板在30℃、85％湿度下温育，同时以200rpm摇动72h，在此之后通过以4000rpm离心15分钟同时冷却至4℃使板细胞形成片状沉淀。将上清液转移到新鲜的96孔板中，盖上，并在-20℃下贮存直至进一步使用。
XIII.实施例3：酶测定法以确定在HTP中酿酒酵母产生的木聚糖酶WT和变体在37℃的pH5.5或低pH活性。
将含有根据实施例2产生的木聚糖酶WT和/或变体的板解冻。将上清液稀释175倍至0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中，用于在pH5.5的活性测定。将上清液稀释20-80倍(取决于板)到0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH3.0)中，用于测量木聚糖酶的pH3活性的测定，或稀释到pH2.5 HCl溶液(89mmol NaCl,6.6mmol KCl)中。
通过将1.00g木聚糖(玉米芯，上海源叶生物科技有限公司，供应商#S25540)和0.320g氢氧化钠溶解在50mL去离子水中，然后搅拌同时加热至100℃直到木聚糖完全溶解来制备1％木聚糖溶液。随后将木聚糖底物调节至所需的pH值。使用乙酸至pH5.5，或用HCl至pH3.0和pH2.5，然后利用0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5)、0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH3.0)或pH2.5 HCl溶液分别调整体积至100mL。
对于所有测定，低pH和pH5.5，将各自的1％木聚糖底物溶液添加到96孔PCR板(35μL/孔)。如该实施例中所述，通过将在低pH或pH5.5缓冲液中的35μL稀释的酶添加到含有相同pH的1％木聚糖溶液的板上来启动反应。然后将板密封，在37℃以200rpm摇动温育2小时。温育后，通过添加80μLDNS(二硝基水杨酸)试剂淬灭反应。
通过将3.15g 3,5-二硝基水杨酸添加到500mL水中，同时搅拌并加热至45℃来制备DNS试剂。接下来，将100mL的200g/L氢氧化钠溶液缓慢添加到搅拌中的溶液中，直至完全透明。透明后，将91.0g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚硫酸钠添加到搅拌中的溶液中，然后添加300mL水。将溶液冷却至室温并将体积调整至1000mL，过滤并在使用前在不透明瓶中贮存7天。
将添加DNS试剂后的板密封，使用热循环仪加热至95℃持续5min，冷却至4℃持续2min，颠倒5-6次混合，然后以1000rpm离心30秒。将测定板开封，将来自每个孔的100μL转移到含有100μL水的新透明底的板中并彻底混合。在540nm处测量每个孔的吸光度，并且吸光度值指示每个孔中的酶活性。将在低pH(pH2.5或3)或pH5.5的变体酶活性与在相同pH的WT(G1P)或G2P酶进行比较，以确定在各个pH的活性改善。结果如图1和图2中所示。
XIV.实施例4：酶测定以确定在HTP中酿酒酵母生产生的木聚糖酶WT和变体的pH 3稳定性。
将含有根据实施例2产生的木聚糖酶WT和/或变体的板解冻。将基于G1P的变体的上清液板稀释10、20或30倍至在非结合聚苯乙烯96孔板(Corning Inc.产品#3641)中的具有100μL每孔的总体积的0.1M pH 3.0柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中。将在pH 3.0的板在37℃下温育2h同时以200rpm摇动。完成温育后，将酶进一步稀释2.5倍至在96孔PCR板中的0.25M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中至35μL的总体积。通过添加35μL/孔的pH5.5的1％木聚糖溶液(如实施例3中所述制备的)来启动反应。然后将板密封，在37℃以200rpm摇动温育2小时。
将基于G2P的变体的上清液板稀释20倍至在非结合聚苯乙烯96孔板(CorningInc.产品#3641)中的具有100μL每孔的总体积的0.1M pH3.0柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中。将在pH3.0的板在37℃下温育2h同时以200rpm摇动。完成温育后，将酶进一步稀释8倍至在新的96孔板中的0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中。在第二次稀释后，通过从每孔转移35μL到含有pH5.5的35μL/孔的1％木聚糖溶液(如实施例3中所述制备的)的96孔PCR板中来启动反应。然后将板密封，在37℃以200rpm摇动温育2小时。
温育后，如实施例3中所述通过添加80μL DNS试剂淬灭关于G1P和G2P两者的比较的反应。一旦淬灭，将反应板密封，加热至95℃持续5min，冷却至4℃持续2min，颠倒5-6次混合，然后以1000rpm离心30秒。将测定板开封，将来自每个孔的100μL转移到含有100μL水的新透明底的板并彻底混合。在540nm处测量每个孔的吸光度，并且吸光度值指示每个孔中的酶活性。将低pH温育后的变体酶活性与WT(G1P)或G2P进行比较，以确定低pH稳定性改善。结果如图1和图2中所示。
XV.实施例5：酶测定法以确定在HTP中酿酒酵母产生的木聚糖酶WT和变体在90℃持续15分钟的热稳定性。
将根据实施例2产生的WT和/或变体木聚糖酶的解冻板稀释4.5倍至在96孔PCR板中的0.1M pH 5.5乙酸钠缓冲液中。在热循环仪中，将剩余的稀释4.5倍的酶在90℃下温育持续15min或5min，然后冷却至4℃持续2分钟。将热挑战酶稀释20倍至在新的96孔板中的0.1M pH5.5醋酸钠缓冲液中。
然后将稀释的酶(35μL)添加到分离的96孔PCR板中，该板含有35μL的如实施例3中所述制备的1％木聚糖底物(pH5.5)。然后将板密封，在37℃以200rpm摇动温育2小时。温育后，如实施例3中所述，通过添加80μL DNS试剂淬灭反应。
添加DNS后，将板密封，加热至95℃持续5min，冷却至4℃持续2min，颠倒5-6次混合，然后以1000rpm离心30秒。在540nm处测量每个孔的吸光度，指示酶活性。
将热稳定性挑战后的变体酶与相同pH的WT(G1P)或G2P酶进行比较，以确定在各个pH下的活性改善。结果如图1和图2中所示。
提供上述所列实施例以向本领域普通技术人员给出如何制备和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认作他们的发明的范围。对本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。说明书中提到的所有专利和出版物都表明了本发明所属领域技术人员的技术水平。本公开中引用的所有参考文献以相同的程度通过引用并入，以相同的程度每个参考文献已通过引用整体单独并入一样。
所有标题和节名称仅用于清楚和引用目的，不应被认为是以任何方式进行限制。例如，本领域技术人员将理解根据本文描述的本发明的精神和范围酌情组合来自不同标题和节的各个方面的有用性。
本文中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文并且出于所有目的以相同的程度，就好像将每个单独的出版物或专利或专利申请都明确地和单独地指示为出于所有目的通过引用整体并入本文一样。
可以对本申请进行许多修改和变化而不脱离其精神和范围，正如对于本领域技术人员所显而易见的。此处描述的具体实施方案和实施例仅作为示例提出。
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<223> 合成序列_木聚糖酶G1P(野生型)蛋白
<400> 1
Gln Ser Phe Cys Ser Ser Ala Ser His Ser Gly Gln Ser Val Lys Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Val Gly Thr Ile Gly Gly Val Gly Tyr Glu Leu Trp
20 25 30
Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Asp Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Cys Thr Phe Gln Asn Ala Gly Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly Leu
50 55 60
Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr Pro Ser Gln Ile Gly Arg Met Lys Ala
65 70 75 80
Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Asn Ser Ser Asn Val Gly Tyr Ser Tyr
85 90 95
Val Gly Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile
100 105 110
Val Asp Asn Trp Leu Ser Pro Phe Pro Pro Gly Asp Trp Val Gly Asn
115 120 125
Lys Lys His Gly Ser Phe Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Thr Val Tyr
130 135 140
Glu Asn Thr Arg Thr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asp Thr Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp
165 170 175
Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly
180 185 190
Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly
195 200 205
Gly Ala Ser Gly Thr Ala Asp Phe Pro Tyr Ala Lys Val Tyr Ile Gly
210 215 220
Asp
225
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_编码木聚糖酶G1P(野生型)蛋白的核酸
<400> 2
caaagtttct gtagttcagc ttctcactct ggacaaagtg taaaggtaac cggcaacaag 60
gttggaacta ttggtggtgt tggttacgaa ttatgggctg atagtggtaa taacagtgct 120
actttctatt ctgatggttc cttctcatgt actttccaaa atgctgggga ttacttatgt 180
cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tatgaaggct 240
gatttcaaac ttgtcaaaca aaatagttcc aatgttggtt attcctatgt tggtgtttac 300
ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360
ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420
tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480
caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540
tttgatcaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600
ggtgaagccg gtaacgttaa cggtggtgcc agtggtaccg ctgatttccc atacgcaaag 660
gtttacattg gtgattag 678
<210> 3
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_木聚糖酶G2P蛋白
<400> 3
Gln Ser Phe Cys Ser Ser Ala Ser His Ser Gly Gln Ser Val Lys Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Val Gly Thr Ile Gly Gly Val Gly Tyr Glu Leu Trp
20 25 30
Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Asp Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Cys Thr Phe Gln Asn Ala Gly Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly Leu
50 55 60
Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr Pro Ser Gln Ile Gly Arg Met Lys Ala
65 70 75 80
Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Asn Ser Ser Asn Val Gly Tyr Ser Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp
165 170 175
Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly
180 185 190
Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly
195 200 205
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210 215 220
Asp
225
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<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_编码木聚糖酶G2P蛋白的核酸
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actttctatt ctgatggttc cttctcatgt actttccaaa atgctgggga ttacttatgt 180
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ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360
ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag tttggttctt tcactattga tggtgctcaa 420
tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480
caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540
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<210> 5
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_木聚糖酶G3P蛋白
<400> 5
Gln Ser Phe Cys Ser Ser Ala Ser His Ser Gly Gln Ser Val Lys Val
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Asp Gly Ser Phe
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50 55 60
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85 90 95
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115 120 125
Lys Lys Phe Gly Ser Phe Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Thr Val Tyr
130 135 140
Glu Asn Thr Arg Thr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asp Thr Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp
165 170 175
Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly
180 185 190
Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly
195 200 205
Gly Ala Ser Gly Thr Ala Asp Phe Pro Tyr Ala Lys Val Tyr Ile Gly
210 215 220
Asp
225
<210> 6
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_编码木聚糖酶G3P蛋白的核酸
<400> 6
caaagtttct gtagttcagc ttctcactct ggacaaagtg taaaggtaac cggcaacaag 60
gttggaacta ttggtggttg gggttacgaa ttatgggctg atagtggtaa taacagtgct 120
actttctatt ctgatggttc cttctcatgt actttccaaa atgctgggga ttacttatgt 180
cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tatgaaggct 240
gatttcaaac ttgtcaaaca aaatagttcc aatgttggtt attcctatgt tggtgtttac 300
ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360
ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag tttggttctt tcactattga tggtgctcaa 420
tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480
caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540
tttgatcaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600
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gtttacattg gtgattag 678
Claims (25)
1.组合物，其包含变体木聚糖酶，所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。
2.组合物，其包含变体木聚糖酶，所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比在选自下组的条件下具有至少1.1倍的更好的活性：在约75℃的总活性、在约80℃的总活性、在约85℃的总活性、在约90℃的总活性和在约95℃的总活性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。
3.组合物，其包含变体木聚糖酶，所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1、2、5、6、8、12、15、18、20、23、25、26、27、28、35、38、51、52、54、56、86、89、90、93、99、105、119、120、121、131、133、135、149、160、168、178、185、190、194、201、224和225，其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1相比在选自下组的条件下具有至少1.1倍的更好的活性：针对pH2.5的耐受性、针对pH3.0的耐受性、针对pH3.5的耐受性、针对pH4.0的耐受性、针对pH4.5的耐受性、针对pH5.0的耐受性、针对pH5.5的耐受性、针对pH6.0的耐受性和针对pH6.5的耐受性；并且其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述变体木聚糖酶展现出与SEQ IDNO:1至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的1处、在所述位置中的2处、在所述位置中的3处、在所述位置中的4处、在所述位置中的5处、在所述位置中的6处、在所述位置中的7处、在所述位置中的8处、在所述位置中的9处、在所述位置中的10处或在所述位置中的11处。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：Q1H,Q1P,S2K,S5I,S5K,S5R,S6H,S6K,S6T,S8C,S8H,S8R,Q12L,Q12T,K15H,K15R,K15T,K15V,G18S,K20C,K20S,K20V,T23S,G25E,G26C,G26N,G26R,G26T,V27I,V27W,G28D,S35R,N38Y,T51C,T51E,T51Q,T51R,T51S,F52W,N54D,N54G,G56H,G56K,G56R,G56T,G56Y,K86T,S89A,S89C,S89T,S89V,S90A,S90C,S90E,S90F,S90H,S90I,G93L,V99A,V99G,S105D,S105H,S105I,S105N,P119Q,F120D,F120H,F120S,F120Y,P121G,P121R,H131F,H131P,S133D,S133K,S133L,S133T,S133R,T135S,T149R,N160K,N160Q,N160R,Q168S,Q168A,S178T,E185K,T190H,T190P,L194M,G201L,G224K,G224L,G224M,G224T和D225Y。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：S5I,T51C,K15T,G25E,S5K,T51E,K20C,T51R,Q1P,T51Q,S8C,K20V,Q12T,G26C,S8H,K20S,K15R,Q12L,S6K,Q1H,S8R,K15H,S5R,G26T,G26N,K15V,S6T,S6H,G26R,V27W,T149R,G224K,D225Y,N160Q,T190P,G224L,G224M,G224T,Q168S,N160K,T190H,N160R,S105D,G56R,S90I,F120Y,N54D,S89C,F120H,G56T,S90C,S105H,V99A,G56H,S89V,S133L,S90E,V99G,S133T,S90A,S90F,S133K,N54G,S89A,G93L,F120D,S89T,S105I,S105N,H131F,P121G,F120S,H131P,G56K/P119Q,G56K/F120Y/S133D,G56K/S178T,T51S/S133D,V27I/G56K/N160K,P121R/S133D/N160K,G18S/V27I/G56K/N160K/L194M,G18S/N160K,G18S/G28D,G56K/P119Q/P121R/S133D/L194M,G18S/G56K/F120Y,V27I/N160K,T51S/P119Q/S133D/N160K/S178T,G18S/T23S/G56K/P119Q/F120Y/P121R/S133D,T51S/F120Y,G56K/S133D/N160K,T51S/G56K/F120Y/S178T,G56K/N160K,T51S/G56K/S133D/N160K,T51S/P119Q/F120Y/N160K,Q1P/S8R/K20V/T51C/S89C/S90H,Q1P/S8H/K20V,Q1P/K15T/K20C/V27W/V99A,S8C/K20V/V27W/H131F,S8H/H131F,V27W/H131F,Q1P/K20C/V27W,K15T/K20V/V27W,K20C/V27W/S89V/S90H,Q1P/S8H/K15T/V27W/H131F,Q1P/S8C/K15T/K20V/V27W/S89T/H131F,Q1P/S8H/K15H/V27W/H131F,Q1P/S8H/V27W/S89T,Q1P/S8R/S89A/S90H/H131F,K20V/V27W/T51C/S89C/S90H/H131F,Q1P/H131F,K15H/K20V/V27W/H131F/G224K,Q1P/S8R/K15T/K20V/V27W/S89A/S90H/V99A/H131F/G224L,Q1P/S8H/T51C/H131F,Q1P/K20V/V27W/V99A/H131F,Q1P/S8R/K20V/V27W/T51C/G224L,Q1P/S8R/K15T/K20C/V27W/S89A/H131F,K15T/K20V/V27W/H131F,Q1P/S8R/K20C/V27W,S8H/K20V/V27W,Q1P/S8H/K15H/K20V/V27W/S89C/S90H/V99A/H131F,Q1P/S8R/K15H/V27W/V99A,K15H/V27W,S90E/H131F,Q1P/K15H/K20V/V27W/T51C/S90H/H131F,K15T/K20C/V27W/H131F,V27W/G224L,K20V/V27W/H131F,K15T/K20V/V27W/T51C/G224L,Q1P/S8C/H131F,Q1P/S8R/K15H/K20V/V27W/T51C/S90E,Q1P/S8R/V27W,Q1P/S8C/V27W/T51C/H131F,Q1P/S8H,K15T/K20C/V27W/S90H/H131F,K15T/V27W/S90H,Q1P/K20V/H131F,K15T/V27W,Q1P/H131F/G224L,S8C/K15T/K20V/V27W/T51C/S90H,Q1P/K15T/K20C/V27W/T51C/S89C/S90H/H131F,Q1P/S8H/K20C/V27W,Q1P/S90H/N160K/T190H,Q1P/S5K/G26N/V27W/F120Y/Q168S/T190H,Q12T/K20C/G26T/S89C/H131F/Q168S,S5I/K20S/S89T/V99A/F120D/H131F/Q168S/T190H,Q1P/S5K/K20S/S89C/F120Y,S6H/G56K/V99A/Q168S/T190H,S8R/K20V/T190H,K15T/G26T/G56K/H131F/N160K/T190H,S8H/K20C/S105N/H131F/N160Q/Q168S,Q1H/S5R/K15V/G56K/Q168S,K20S/G56K/F120Y/N160Q/T190H,S8R/H131F/T190H,G26N/V27W/G56K/S90H/H131F/Q168S/T190H,S89V/H131F/Q168S,S5R/Q12L/K15T/G26N/V27W/G56K/F120Y/H131F,S6H/S8R/K20S/S89A/V99A,Q1P/S5R/G26T/S90C/H131F/Q168S/T190H,S8H/K20C/T51R/S89A/P121R/N160K/T190H,Q1P/S5R/Q12T/K15V/G26T/V27W/S90E/H131F/G224K,Q1P/S5R/K20S/G56K/S89C/H131F/N160K/Q168S/T190H,Q1H/S5K/Q12L/S90H/S105N/T190H,S8C/K20C/T51C/S89A/Q168S,G26N/V27W/S105N/Q168S/G224L,S5I/S90H/S105N/F120Y/P121R/H131F/Q168S/G224K,S6H/S8C/K20S/T51S/F120Y/P121R/T190H,S5K/V99G/T190H,S5K/K20V/G56K/H131F/Q168S,S8R/T51R/S89T/H131F/T190H,Q1P/S5R/S8R/V99A/N160Q,S8R/T51C/F120D/Q168S/G224L,Q1P/V27W,Q1P/Q12T/K20V/G56K/S105N/N160Q/T190H/G224K,Q1H/S5I/Q12L/K15R/H131F,S89C/F120D/H131F/N160Q/G224L,K20C/P121R,K20S/V27W/T51Q/S105N/F120D/P121R/N160Q/T190H/G224M,Q1H/S8C/K20V/G56K/S89A/H131F/T190H/G224L,S8H/G26T,S6H/S8C/K20S/S89C/T190H,K20S/T51C/S89V/T190H,Q1H/Q12L/K15R/V27W/G56K/V99A/N160K/T190H,S8C/K15R/S105N/H131F/T190H,Q1H/S5R/Q12L/K20C/G56K/H131F/T190H,Q1H/S5I/Q12T/K15V/G26T/G56K/S90E/S105N/Q168S,S6H/K20C/S89T,Q1H/S5R/K15R/G26N/G56K/H131F/T190H/G224K,S89V/V99G/T190H,Q1H/S5I/Q12L/K15T/Q168S,Q12L/K15R/S90H/H131F/Q168S/T190H,Q1H/S5I/T190H,Q1P/S8H/K20V/T51Q/S89T/V99A/F120D/T190H,S8R/K20S/G56K/K86T/S89A/V99A/H131F,S8C/Q12T/K15V/G56K/T190H,K20S/S89C/F120Y/H131F/T190H,Q1P/K20V/G56K/S90E/S105N/H131F,S5I/K20S/G26N/V27W/G56K/S90H/S105N/Q168A/T190H,Q1P/S2K/S6H/S8R/S105N/Q168S/G224K,S8H/K20C/T51R/S89A/N160K/Q168S,Q1H/S5R/Q12T/K15R/G26N/S89A/V99G/F120D/P121R/T190H/G224M,S8C/K20S/G56K/S89C/V99G/F120D/P121R/T190H,S6H/S8H/K20C/T51R/S89A/P121R/T190H,Q1P/S5K/T51Q/V99G,Q1P/S5I/S89V/S105N/H131F/Q168S,S8H/K15V/K20C/T51Q/S89A/S105N/Q168S,Q1P/S5I/K15R/G26T/S89C/V99G/F120Y/N160Q/T190H/G224K,S89C/H131F/Q168S/T190H,Q1P/S5K/Q12L/K20C/T51Q/S89V/F120Y/N160K/Q168S/T190H,Q1H/S5K/G56K/F120D/P121R/Q168S,T51E/V99A/P121R/H131F/N160Q/Q168S/T190H/G224K,Q1P/S5R/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/S90C/S105N/T190H,S6H/S8R/K20C/T51C/F120D/T190H,S8R/K20S/F120D/P121R,S5R/S105N/Q168S/T190H,Q1H/S5R/K15V/G26N/V27W/H131F/Q168S/T190H,Q1H/S5R/Q12L/K15T/S90E/S105N/H131F/Q168S,K20V/S89V/V99A/N160K/Q168S/G224K,S90C/S105N/H131F,S6H/S8H/K20V/T190H,S8H/T51E/V99G/Q168S/T190H,S5R/Q12L/K20V/S89C/Q168S/T190H,Q1P/S5K/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/S89C/H131F,K15R/G56K/T190H,Q1H/S5K/Q12T/K15T/G26T/G56K/S89C/H131F/N160K/Q168S,S6H/S8R/K20V/T51E/S90H/S105N/H131F/T135S/Q168S/T190H,Q1P/S5K/Q12L/K15R/G56K/S89T/F120D,Q12L/H131F/N160K/T190H,Q1H/S5R/Q12T/K15H/G26N/V27W/G56K/H131F,Q1P/S5K/Q12T/G56K/S105N/H131F/Q168S/T190H/G224L,V27W/S90C/V99G/S105N/F120Y/N160K/Q168S,G56K/S90C/H131F/Q168S/T190H,Q1P/S5R/G26T/G56K/S105N/H131F/Q168S/T190H,S8C/T51E/S89A/V99A/H131F/Q168S/T190H,S5K/K15H/G26T/S90H/H131F,G26N/G56K/S89T/H131F/Q168S/T190H/G224K,Q1P/Q12L/K15T/G26N/V27W/S90H/S105N/H131F/T190H,G56K/S90C,K20S/S89V/V99G/S105N/T190H,S5I/G26N/G56K/V99G/S105N,Q1P/S5R/G56K/H131F/N160K/T190H,Q1H/S5I/K20V/S89C,K20C/T51Q/S89C/V99G/F120D/P121R/T190H,S8R/Q12T/K15V/T51E/S89A/V99A/F120D/P121R/T190H,G26N/V27W/S105N/H131F/Q168S,S6H/S89T/V99A/F120D/P121R/N160Q/Q168S/T190H,T51Q/H131F,Q1P/S5R/Q12L/K15V/V27W/G56K/V99A/S105N/F120D/N160Q/Q168S,Q1P/S5R/G26N/G56K/S90H/S105N/F120D/P121R/T190H,S5R/Q12T/K20V/G56K/F120Y,S105N/F120D/P121R/T190H,S8R/K20C/G26N/V27W/G56K/H131F/T190H,Q1H/V27W/G56K/S90C,G56K/S90C/H131F/Q168S/T190H,Q12L/K15R/V27W/G56K/S90E,Q1H/S105N/T190H,G56K/S89T/S105N/P121R/H131F/Q168S/G224K,K20S/S89A/V99G/S105N/N160Q/T190H,Q1P/P121R/H131F/N160Q/T190H,K15V/T51Q/S89V/H131F/G224K,Q1P/K20S/N160K/T190H,S8H/G56K/S89V/F120Y/P121R/N160Q/Q168S/T190H,Q1H/S5K/V27W/G56K/Q168S/T190H,F120D/P121R/Q168S,S8H/K20V/T51S/V99A/T190H,S8R/T51E/S89T/V99G/N160K/T190H,K20S/S89C/T190H,K20S/S90E/G224M,K15V/G56K/S89T/T190H,S6H/S8R/Q12L/K15V/G26T/V27W/G56K/Q168S,Q1P/S5I/K20S/G56K/S90E/H131F/Q168S,S6H/F120Y/T190H,S8H/K20V/T51S,S105N/H131F,S5I/Q12T/K15H/G26T/V27W/G56K/S90H/S105N/H131F/N160K/T190H,Q1H/S5R/G26T/G56K/S105N/H131F/G224K,S5I/S89C/S105N/H131F/Q168S,Q1P/S5R/Q12L/K15R/G56K/S90H/F120D/P121R/H131F/N160K,S105N/H131F/Q168S,S6H/S8R/K20V/G56K/F120D/P121R/H131F/T190H,Q1P/S5I/G26N/V27W/S90E/H131F/Q168S/G224M,G56K/T190H,S8R/K20C/T51E/S89V/Q168S/G224M,S8C/K20S/S89A/F120Y/P121R/N160Q,S5R/S89T/F120Y/P121R/T190H,G26N/V27W/G56K/S105N/H131F/Q168S,S6H/S8R/S89A/F120Y,Q1P/S5R/Q12L/K15R/G26T/S90H/Q168S/T190H,K20C/H131F,K20C/V27W/H131F,K15H/K20C/H131F,K15H/K20V/V27W/S89A/H131F,K15H/S89C/H131F,K15H/V27W/H131F,K15R/K20C/H131F,K15R/K20C/S89A/H131F,K15R/K20C/S89C/H131F,K15R/K20C/S89V/H131F,K15R/K20V/H131F,K15R/S89A/H131F,K15R/S89C/H131F,K15R/S89V/H131F,K20C/H131F,K20C/S89T/H131F,K20C/V27W/S89T/H131F/E185K,K20V/H131F,K20V/S89C/H131F,K20V/S89T/H131F,K20V/S89V/H131F,S89A/H131F,S89C/H131F,S8C/K15H/K20C/S89T/H131F,S8C/K20C/H131F,S8C/K20V/S89C/H131F,S8C/K20V/S89T/H131F,S8H/K15R/K20C/S89T/H131F,S8H/K20C/S89T/H131F,S8H/K20C/V27W/H131F,S8H/K20V/H131F,S8H/K20V/S89C/H131F,S8H/K20V/V27W/S89T/H131F,S8R/K15H/K20V/S89C/H131F,S8R/K15R/K20C/H131F,S8R/K20C/S89C/H131F,V27W/S89C/H131F,V27W/S89T/H131F,G26T/V27W/H131F,V27W/S89A/H131F,V27W/H131F/S133T,G26T/V27W/S89A/H131F,G26T/V27W/H131F/S133T,V27W/S89A/H131F/S133T,G26T/V27W/S89A/H131FS/S133T,G26T/V27W/S35R/S89A/H131FS/S133R,和V27W/N38Y/F52W/G56Y/H131F/G201L。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述变体木聚糖酶与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸取代是H131F。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸取代是V27W/H131F。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其包含氨基酸取代H131F，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：Q1H,Q1P,S2K,S5I,S5K,S5R,S6H,S6K,S6T,S8C,S8H,S8R,Q12L,Q12T,K15H,K15R,K15T,K15V,G18S,K20C,K20S,K20V,T23S,G25E,G26C,G26N,G26R,G26T,V27I,V27W,G28D,S35R,N38Y,T51C,T51E,T51Q,T51R,T51S,F52W,N54D,N54G,G56H,G56K,G56R,G56T,G56Y,K86T,S89A,S89C,S89T,S89V,S90A,S90C,S90E,S90F,S90H,S90I,G93L,V99A,V99G,S105D,S105H,S105I,S105N,P119Q,F120D,F120H,F120S,F120Y,P121G,P121R,S133D,S133K,S133L,S133T,S133R,T135S,T149R,N160K,N160Q,N160R,Q168S,Q168A,S178T,E185K,T190H,T190P,L194M,G201L,G224K,G224L,G224M,G224T和D225Y。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其包含氨基酸取代V27W/H131F，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：Q1H,Q1P,S2K,S5I,S5K,S5R,S6H,S6K,S6T,S8C,S8H,S8R,Q12L,Q12T,K15H,K15R,K15T,K15V,G18S,K20C,K20S,K20V,T23S,G25E,G26C,G26N,G26R,G26T,G28D,S35R,N38Y,T51C,T51E,T51Q,T51R,T51S,F52W,N54D,N54G,G56H,G56K,G56R,G56T,G56Y,K86T,S89A,S89C,S89T,S89V,S90A,S90C,S90E,S90F,S90H,S90I,G93L,V99A,V99G,S105D,S105H,S105I,S105N,P119Q,F120D,F120H,F120S,F120Y,P121G,P121R,S133D,S133K,S133L,S133T,S133R,T135S,T149R,N160K,N160Q,N160R,Q168S,Q168A,S178T,E185K,T190H,T190P,L194M,G201L,G224K,G224L,G224M,G224T和D225Y。
13.核酸，其编码权利要求1-12中任一项所述的变体木聚糖酶。
14.权利要求13所述的核酸，其中所述核酸经用于宿主生物体的密码子优化，用于所述变体木聚糖酶在所述生物体中的表达。
15.权利要求13或权利要求14所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的序列具有至少80％序列同一性的序列。
16.权利要求13-15中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的序列。
17.表达载体，其包含权利要求13-16中任一项所述的核酸。
18.宿主细胞，其包含权利要求13-16中任一项所述的核酸。
19.宿主细胞，其包含权利要求17所述的表达载体。
20.权利要求18或权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞组成的组。
21.生成变体木聚糖酶的方法，其包括：a)在表达所述变体木聚糖酶的条件下培养权利要求18-20中任一项所述的宿主细胞；和b)回收所述变体木聚糖酶。
22.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其进一步包含动物饲料。
23.适合动物食用的配制剂，其中所述配制剂包含权利要求1至12中任一项所述的变体木聚糖酶和一种或多种可食用组分。
24.制备动物饲料的方法，其包括将权利要求1至12中任一项所述的变体木聚糖酶添加到所述动物饲料中以产生木聚糖酶-动物饲料组合，以及将所述木聚糖酶-动物饲料组合加热灭菌。
25.权利要求24所述的方法，其中所述动物饲料是家禽或猪饲料。
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