CN111699252A - 内切葡聚糖酶组合物和方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明涉及新的内切葡聚糖酶变体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年1月16日提交的美国临时专利申请号62/793,065的优先权，其通过引用以其整体明确地并入。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2020年1月13日，名称为114095-5009_ST25.txt，且大小为34千字节。
发明领域
本发明涉及(变体)内切葡聚糖酶、编码(变体)内切葡聚糖酶的多核苷酸、产生(变体)内切葡聚糖酶的方法以及使用(变体)内切葡聚糖酶的方法。还描述了本发明的内切葡聚糖酶在纺织、洗涤剂和纸浆和造纸工业中的用途。本发明还涉及包含一种或多种本发明的(变体)内切葡聚糖酶的组合物。
发明背景
纤维素是高等植物的主要结构组分，并且以几乎纯净的形式天然存在于棉纤维中。它为植物细胞提供了高抗张强度，帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素是通过β-1.4连结连接的葡萄糖残基的线性多糖。
纤维素分解酶水解纤维素，并由多种细菌和真菌产生。纤维素酶是工业上重要的酶。在纺织工业中，纤维素酶用于粗斜纹棉布整理中，以在生物石磨过程中在粗斜纹棉布布料中形成时髦的石洗外观，并且其还用于例如清洁细毛(fuzz)并防止棉衣服的表面上形成球粒(pill)。在洗涤剂工业中，纤维素酶用于增亮颜色并防止衣服泛灰和起球。纤维素酶还用于食品工业和动物饲料制造中，并且它们在纸浆和造纸工业中具有巨大的潜力，例如在脱墨以从纤维表面释放油墨和改善纸浆排水方面。
本发明的内切葡聚糖酶是指分类为E.C.3.2.1.4的酶，并且是纤维素生物转化为葡萄糖通常需要的一类纤维素酶。内切葡聚糖酶切割内部的β-1,4-葡萄糖苷键，而纤维二糖水解酶从纤维素聚合物链的末端切割二糖纤维二糖，并且β-1,4-葡萄糖苷酶将纤维二糖和其他短的纤维糖寡糖水解为葡萄糖。一些天然存在的内切葡聚糖酶具有纤维素结合结构域，而其他则没有。内切葡聚糖酶也广泛用于纺织、洗涤剂、纸浆和造纸工业。例如，如美国专利号7,256,032、美国专利号6,001,639、WO 2004/053039、美国专利号5,958,082、美国专利号5,948,672中所述的内切葡聚糖酶，其全部在此通过引用以其整体并入。
然而，本领域仍然需要具有增加的总活性、比活性、温度活性、pH活性、总稳定性、温度稳定性和pH耐受性的内切葡聚糖酶变体。本发明满足了这一需求，并提供了与亲本内切葡聚糖酶相比具有改善的特性的内切葡聚糖酶变体。
本发明的目的是提供具有内切葡聚糖酶活性的(变体)内切葡聚糖酶和编码(变体)内切葡聚糖酶的多核苷酸，以及在各种过程中使用(变体)内切葡聚糖酶的方法。
发明概述
因此，本发明提供了(变体)内切葡聚糖酶以及产生和使用它们的方法。本发明的氨基酸序列号和核酸序列号列于表1中。
表1.氨基酸序列号和核酸序列号。
在一方面，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代处于选自下组位置编号：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在进一步的方面，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代处于选自下组位置编号：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的总活性：在约30℃下的总活性、在约40℃下的总活性、在约50℃下的总活性、在约60℃下的总活性和在约70℃下的总活性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在另外的方面，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代处于选自下组位置编号：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的pH耐受性：针对pH 3.0的耐受性、针对pH 3.5的耐受性、针对pH 4.0的耐受性、针对pH 4.5的耐受性、针对pH 5.0的耐受性、针对pH 5.5的耐受性、针对pH 6.0的耐受性、针对pH 6.5的耐受性、针对pH 7.0的耐受性、针对pH 7.5的耐受性和针对pH 8.0的耐受性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述内切葡聚糖酶变体表现出与SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代发生在一个所述位置、两个所述位置、三个所述位置、四个所述位置、五个所述位置、六个所述位置、七个所述位置、八个所述位置、九个所述位置、十个所述位置、十一个所述位置或十二个所述位置处。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S、G25D、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、G25S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E、K212E和N218S。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：G25D/A161G/M172K/H182Q/M194L/K212N、N12S/G25D/Q65G/S160A/A161G/V171I/Y184F/M194L/K212N、G25D/N138T/V171I/W175F/H182Q/Y184F、G25D/N138T/I139V/M194L、H182Q/K212N、G25D/A161G/T214S、N12S/G25D/A161G/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、G25D/N138T/H182Q/K212N、N12S/G25D/A44S/I139V、G25D/N138T/K212N、G25D/V171I/W175F/M194L/K212N、G25D/A161G/K212N、V171I/Y184F、G25D/A44S/A161G、G25D/M172K/H182Q、G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N、G25D/V171I/M172K/H182Q/M194L、H182Q/M194L、G25D/K212N、N12S/G25D/N138T/A161G/K212N、G25D/H182Q/Y184F/M194L/K212N、N12S/G25D/N40S/I139V/V171I/M172K/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、N12S/G25D/H182Q/K212N、G25D/N40S/A44S/N138T/A161G/V171I/W175F/Y184F/M194L/K212N、N12S/N40S/Y184F/T214S、N12S/G25D/A44S/Q65G、G25D/A161G/M194L/T214S、A44S/N138T/I139V/V171I/H182Q/Y184F/M194L/K212N、G25D/Y184F/M194L/K212N、N12S/G13P/D55P/M172K/R205P/K212N、N12S/G25D/D55P/V171I/M172K/S187P、G25D/S187P、G13P/G25D/D55P/A161P/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P、N12S/R133P/A161P/V171I/S187P/K212N、N12S/G25D、G13P/G25D/D55P/V171I/S187P/R205P、G13P/G25D/V171I/M172K/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P/R205P、G25D/V171I/M172K、G25D/R133P、N12S/G25D/V171I/M172K、N12S/G25D/H182Q/R205P、N12S/G25D/A161P/S187P/K212N、G25D/D55P/V171I/M172K/R205P、D55P/R205P、N12S/R205P、N12S/G25D/T69P/R133P/V171I/M172K/R205P/K212N、T179Y/R205Y、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126S/T136Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/P80G/G126I/T136M/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/T165Y/T179L/R205P、N12E/G25S/D55P/P80G/G126T/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/G126N/T136Y/T165Y/T179Y/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/P80G/G126R/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126T/T165Y/R205P、N12E/G25S/D55I/G126K/T165D/R205P、N12E/G25S/D55P/G126I/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126K/T136Y/T179Y/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/G126R/R205P、N12E/G25S/D55P/G126N/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/P80G/E145A/R205P/T207E、G25D/D55P/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126R/T136Y/T165Y/R205P、N12E/G25D/D55P/P80G/R205P、G25D/D55I/G126K/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126R/R205P/T207E、G25D/D55P/G126T/T136Y/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55P/G126N/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/R205P、N12E/G25D/D55P/T165D/R205Y、N12E/G25D/D55I/P80G/G126R/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126K/T165D/R205P、G25D/D55P/G126V/T136Y/R205P/T207E、G25D/D55P/T179L/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/R205P/N218S、G25S/D55P/G126R/T136M/E145A/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126V/E145A/T179Y/R205P、N12E/G25S/D55P/G126T/T165Y/R205P、G25S/D55P/G126R/R205P/N218S、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55I/G126R/T136M/T165Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/G126S/T136M/T165Y/R205Y、N12D/G25D/D55P/S86A/E145M/I164T/D173P/R205P/T207E、N12E/G25D/A44D/D55P/S86H/Q128F/R205P、G25S/D55P/G126I/D173N/R205P/T207E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/T152Q/R176H/S187N/R205P/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/Q128R/E145A/D173E/R205P、N12D/G25D/A44D/D55P/S86A/E145A/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/T136Y/G169T/R176H/R205P/K212E、N12E/G25D/D55P/S86Q/A104D/G126T/E145A/D173E/R205P/K212E、G25D/A44D/D55P/I164T/R205P、N12T/G25D/D55P/S86A/A104D/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E/N218S、N12D/G25D/D55P/P80G/S86A/Q128R/I164T/D173E/R205P/K212E、N12D/G25S/D55P/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E、N12G/G25D/A44D/D55P/Q128R/I164T/D173E/R205P、N12T/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/D173E/R205P、G25D/A44D/D55P/Q128R/R205P/T207E、G25S/D55P/G126S/T165D/G169S/T179Y/R205P/K212E、G25S/A44D/D55P/P80G/S86A/G126K/Q128R/R205P/K212E、G25S/D55P/P80G/G126T/R205P、N12T/G25D/D55I/P80G/G126S/T152Q/S187N/R205P、G25S/D55P/G126K/T136R/T152Q/R176H/T179Y/R205P/K212E、G25D/D55P/G126T/T165Y/R176H/R205P、N12D/G25D/D55P/S86Q/A104D/E145A/R205P/T207E/N218S、G25D/A44D/D55P/A104D/Q128R/E145A/T165D/R176H/R205P/K212E、G25D/D55P/R205P/K212N、N12E/G25S/D55R/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/V17I/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/V35I/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/V127I/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/G42S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/Y124F/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/S78T/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R176H/S187N/R205P/T207E、N12T/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/S86Q/G126T/T136Y/T165Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25S/S28N/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/S39Y/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N、N12T/G25S/A44D/D55P/S86Q/G126N/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136M/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/A104D/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12T/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/A104D/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/D173L/R176H/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/A44D/D55P/G126S/T136Y/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E和N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126K/T136Y/D173E/R176H/S187N/R205P/T207E。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21和SEQ ID NO:23具有至少95％序列同一性。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是G25D/K212N。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12S/G25D/H182Q/K212N。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是G25D/D55P/R205P。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N12S、N40S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、W175F、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代G25D/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代N12S/G25D/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、Y184F、M194L、T214S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代G25D/D55P/R205P，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、T207E、K212E和N218S。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、K212E和N218S。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N和N218S。
在另外的方面，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代处于选自下组位置编号：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在进一步的方面，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代处于选自下组位置编号：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:9相比具有至少1.1倍更好的总活性：在约30℃下的总活性、在约40℃下的总活性、在约50℃下的总活性、在约60℃下的总活性和在约70℃下的总活性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在另外的方面，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代处于选自下组位置编号：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:9相比具有至少1.1倍更好的pH耐受性：针对pH 3.0的耐受性、针对pH 3.5的耐受性、针对pH 4.0的耐受性、针对pH 4.5的耐受性、针对pH 5.0的耐受性、针对pH 5.5的耐受性、针对pH 6.0的耐受性、针对pH 6.5的耐受性、针对pH 7.0的耐受性、针对pH 7.5的耐受性和针对pH 8.0的耐受性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述内切葡聚糖酶变体表现出与SEQ ID NO:9至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代发生在一个所述位置、两个所述位置、三个所述位置、四个所述位置、五个所述位置、六个所述位置、七个所述位置、八个所述位置、九个所述位置、十个所述位置或十一个所述位置处。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S、R14P、S25D、N40S、G44S、Q65G、T92I、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L和Q212N。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S/R14P/S25D/T92I、T92I/Y184F、R14P/S25D/T92I/S138T/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F/Q212N、N12S/I139V、T92I/I139V/H182Q/Y184F、N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/V171I/Y184F、N12S/S138T/I139V/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F、S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/S160A/Y184F、N12S/S25D/N40S/G44S/S138T/I139V/H182Q、N12S/R14P/S25D/Q65G/V171I/M172K/W175F/H182Q/Y184F、N12S/R14P/S25D/G44S/T92I/S138T/I139V/S160A/A161G/W175F、S160A/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/A161G/Y184F、R14P/T92I/A161G/V171I/W175F/Y184F、T92I/A161G/H182Q/Y184F、R14P/A161G/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K、N12S/A161G/H182Q/Y184F、N12S/R14P/T92I/A161G/V171I/Y184F、S25D/N40S/T92I/S138T/S160A/A161G/V171I/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S、Y184F、N12S/R14P/S25D/T92I/S138T/A161G、N12S/R14P/G44S/T92I/M194L、R14P/S25D/N40S/S138T/Q212N、N12S/S25D/N40S/G44S/Q65G、S25D/G44S/S138T/I139V、S25D/H182Q、R14P/S25D/G44S、N12S/S25D/N40S/G44S/T92I/M172K/H182Q/Q212N、R14P/S25D/N40S/G44S/A161G/V171I/Y184F、N12S/R14P/S25D/A161G/M172K/W175F/Y184F和N12S/R14P/S25D/N40S/G44S/T92I/I139V。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K。
在另外的方面，如本文所述，本发明提供了编码所述内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代。
在进一步的方面，如本文所述，本发明提供了编码所述内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中可以针对宿主生物体对所述核酸进行密码子优化，以在所述生物体中表达内切葡聚糖酶变体。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中核酸包含与选自下组的序列具有至少70％序列同一性的序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其包含选自下组的序列：SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸的表达载体。
在另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸的宿主细胞。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
在进一步的方面，本发明提供了制备内切葡聚糖酶变体的方法，其包括：a)在表达所述内切葡聚糖酶变体的条件下培养如本文所述的宿主细胞；b)回收所述内切葡聚糖酶变体。
在另外的方面，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中成熟蛋白质是如本文所述的内切葡聚糖酶变体。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中信号肽具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中信号肽是外源的。
在另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸的表达载体。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸的宿主细胞。
在另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
在另外的方面，本发明提供了制备内切葡聚糖酶变体的方法，其包括：a)在表达所述内切葡聚糖酶变体的条件下培养如本文所述的宿主细胞；b)回收所述内切葡聚糖酶变体。
在进一步的方面，本发明提供了核酸构建体，其包含与外源构建体序列可操作地连接的编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的核酸。
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的核酸构建体，其中所述外源构建体序列是外源启动子。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸构建体，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:10的序列。
在另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸构建体的表达载体。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸构建体的宿主细胞。
在另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
在另外的方面，本发明提供了制备内切葡聚糖酶的方法，其包括：a)在表达所述内切葡聚糖酶的条件下培养如本文所述的宿主细胞；b)回收所述内切葡聚糖酶。
在进一步的方面，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中前蛋白与外源启动子可操作地连接，并且其中成熟蛋白质具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:9。
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中信号肽具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中成熟蛋白质具有SEQ IDNO:1，并且信号肽具有SEQ ID NO:17。
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中成熟蛋白质具有SEQ IDNO:9，并且信号肽具有SEQ ID NO:18。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中信号肽是外源的。
在另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸的表达载体。
在进一步的方面，本发明提供了包含如本文所述的核酸的宿主细胞。
在另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
在另外的方面，本发明提供了制备内切葡聚糖酶的方法，其包括：a)在表达所述内切葡聚糖酶的条件下培养如本文所述的宿主细胞；b)回收所述内切葡聚糖酶。
在进一步的方面，本发明提供了生物石磨(biostone)的方法，其包括使如本文所述的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶变体与含棉织物或衣服接触的步骤。
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的生物石磨的方法，其中含棉织物或衣服是粗斜纹棉布(denim)。
在进一步的方面，本发明提供了生物整理(biofinish)的方法，其包括使内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶变体与纺织材料接触的步骤
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的生物整理的方法，其中纺织材料选自下组：织物、衣服和纱线。
在进一步的方面，本发明提供了洗涤剂组合物，其包含如本文所述的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶变体。
在另外的方面，本发明提供了如本文所述的洗涤剂组合物，其进一步包含至少一种表面活性剂(surface active agent)和任选地至少一种辅助成分.
在进一步的方面，本发明提供了处理含有纤维素纤维的纺织材料的方法，其包括使所述纺织材料与如本文所述的洗涤剂组合物接触。
在另外的方面，本发明提供了处理木材衍生的纸浆或纤维的方法，其包括使如本文所述的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶变体与木材衍生的机械或化学纸浆或次级纤维接触的步骤。
附图简要说明
图1提供了在微量滴定板上评估由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产生的25种内切葡聚糖酶的结果。
图2显示了EG140和EG185的氨基酸序列比对。对应于氨基酸1-16的信号肽区域为粗体和斜体。催化结构域(CD)对应于氨基酸30-234。(注意：编号从信号肽区域开始)。
图3A-3F提供了EG140 G1变体在pH4.5和pH 6.5的改善数据。注意：PF是关于(w.r.t.)EG140 G1P(菌落追踪号：CL00078795，野生型)的G1变体的性能因子(PerformanceFactor)；AA突变是关于(w.r.t.)EG140 G1P(菌落追踪号：CL00078795，野生型)的G1变体中的突变，其中编号从成熟区域开始。
图4A-4D提供了EG140 G2变体在pH4.5和pH 6.5的改善数据。注意：PF是关于(w.r.t.)EG140 G2P(菌落追踪号：CL00098799)的G2变体的性能因子；AA突变是关于(w.r.t.)EG140 G1P(菌落追踪号：CL00078795，野生型)的G2变体中的突变，其中编号从成熟区域开始。
图5A和5B提供了EG140 G3变体在pH4.5和pH 6.5的改善数据。注意：PF是关于(w.r.t.)EG140 G3P(菌落追踪号：CL00111817)的G3变体的性能因子；AA突变是关于(w.r.t.)EG140 G1P(菌落追踪号：CL00078795，野生型)的G3变体中的突变，其中编号从成熟区域开始。
图6A和6B提供了EG185 G1变体在pH4.5和pH 6.5的改善数据。注意：PF是关于(w.r.t.)EG185 G1P(菌落追踪号：CL00066590，野生型)的G1变体的性能因子；AA突变是关于(w.r.t.)EG185 G1P(菌落追踪号：CL00066590，野生型)的G1变体中的突变，其中编号从成熟区域开始。
图7A和7B提供了EG140和EG185 G1变体的总结。如本文所述，这些可以以任何组合与如本文概述的变体组合。
图8A提供了EG140 G1P蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，编码EG140G1P蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:2)，EG140 G1V1变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，编码EG140G1V1变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:4)和EG140 G1V2变体蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:5)。图8B提供了编码EG140G1V2变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:6)，EG140 G1V3变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)，编码EG140 G1V3变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:8)和EG185 G1P蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。图8C提供了编码EG185 G1P蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:10)，EG185 G1V1变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)，编码EG185 G1V1变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:12)和EG185G1V2变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。图8D提供了编码EG185 G1V2变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:14)，EG185 G1V3变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)，编码EG185 G1V3变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:16)，EG140信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)，和EG185信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)，和EG140 G2P变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。图8E提供了编码EG140 G2P变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:20)，EG140 G3P变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)，编码EG140G3P变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:22)和EG140 G4P变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)；并且图8F提供了编码EG140 G4P变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:24)。**代表双终止密码子TAATAG。
发明详述
I.引言
在纺织工业中，近年来，“石洗外观”或磨损外观一直是粗斜纹棉布生产商的兴趣所在。传统上，通过使用将浮石添加到洗涤桶中以磨损衣服的工艺局部去除靛蓝染料来实现石洗。粗斜纹棉布织物上这种传统的“石洗”整理降低织物的强度，给洗衣机器增加负担，并造成废水污染。趋势是朝着称为“生物石磨”的环保工艺发展，该过程使用酶(如纤维素酶)洗涤/生物石磨粗斜纹棉布，从而产生所期望的磨损外观而不损害机器或环境。受控的酶处理导致节省成本并改善质量，而无需处置石头。
另外，纺织工业在生物整理中使用纤维素酶，即为了产生永久改善的去球粒性(depilling)和改善的抗起球性，通过减少细毛而使表面结构清晰，改善纺织品手感，如柔软性、光滑性和丝滑感，改善的悬垂性和纺织品的颜色更鲜艳和改善的吸湿性。
内切葡聚糖酶，作为纤维素生物转化为葡萄糖通常需要的一类纤维素酶，在纺织、洗涤剂以及纸浆和造纸工业中具有广泛的应用。
然而，许多利用内切葡聚糖酶的工业过程在很宽的温度范围，例如，20-60℃和很宽的pH范围，例如pH 4-6.5内运行；因此，本文期望并提供了有活性的、温度和pH稳定的内切葡聚糖酶。
II.定义
在本文的核酸序列的上下文中，“外源的”是指外源元件在自然界中通常不与第二元件关联，因此是人工或合成的构建体。本文的“外源构建体序列”是指通常不与编码内切葡聚糖酶的核酸关联的构建体序列(无论是氨基酸还是核酸序列，尽管如通过使用该术语的上下文将理解，通常是指核酸序列)。在许多实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其包含与外源构建体序列如外源启动子连接的内切葡聚糖酶的编码序列。为清楚起见，通常提及“外源”是指内切葡聚糖酶而不是宿主细胞。例如，如果宿主细胞是黑曲霉(A.niger)细胞，则与内切葡聚糖酶基因可操作地连接的启动子可以对于黑曲霉是内源的，但是对内切葡聚糖酶是外源的(例如，来自黑曲霉α-淀粉酶的启动子可以与本发明的内切葡聚糖酶连接)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了编码与外源构建体核酸序列可操作地连接的内切葡聚糖酶(无论是野生型还是变体)两者的核酸构建体。本文的“外源构建体序列”是指通常不与编码内切葡聚糖酶的核酸关联的构建体序列(无论是氨基酸还是核酸序列，尽管如通过使用该术语的上下文将理解，通常是指核酸序列)。
可以包括在染色体外或整合表达载体中的合适构建体序列包括但不限于可选择标志物、纯化标签、复制起点和调节序列，包括但不限于启动子(诱导型和组成型)、增强子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子、Shine-Dalgarno序列等。
本文中的“选择标志物”或“可选择标志物”或“选择蛋白质”是指引入宿主细胞中的蛋白质，其赋予在宿主细胞生长期间适于人工选择的性状，使得仅含有可选择标志物的那些细胞生长。因此，可选择标志物是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。下文概述选择标志物的实例。因此，“选择基因”是编码选择蛋白质的核酸。
本文中的“染色体外表达载体”(通常也称为“质粒”)是指携带感兴趣基因的自我复制表达载体(通常是质粒)，其保留在细胞内并且不整合到宿主细胞的基因组中。
本文中“整合表达载体”是指设计为插入宿主细胞基因组中的载体，有时称为“附加体”。
本文的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代针对不天然存在于特定位置处，不是天然存在于生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代G25D是指变体多肽，在此种情况下为下述内切葡聚糖酶，其中位置25处的甘氨酸用天冬氨酸替换。多个突变以正斜杠标记(“/”)分开，例如“G25D/N138T/K212N”，分别代表位置25、138和212处的取代(在一些情况下，可以使用“+”)。为清楚起见，已经工程化改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但若蛋白质在其开始的特定位置处具有相同的氨基酸，则它不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233后且位置234前插入谷氨酸。此外，-233ADE或A233ADE表示在位置233后且位置234前插入AlaAspGlu。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”是指在亲本多肽序列中的特定位置处除去氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del1表示位置233处谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示位置233处开始的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用，“亲本多肽”是指随后经修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。在本情况下，一些实施方案利用EG140(菌落追踪号：CL00078795)或EG185(菌落追踪号：CL00066590)作为亲本多肽。
如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物、或编码它的氨基酸序列。优选地，与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比约1至约70个氨基酸修饰，且优选约1至约11个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽是野生型序列。如下文进一步讨论的，本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白质序列拥有至少约80％的同一性，最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-96-97-98-99％的同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物或编码它的DNA序列。因此，本文的“内切葡聚糖酶变体”是指与亲本内切葡聚糖酶相比在氨基酸序列中具有至少一个氨基酸修饰的新的内切葡聚糖酶。如本文所讨论，在一些情况下，亲本内切葡聚糖酶是第二代或更高代的内切葡聚糖酶变体。除非另有说明或从上下文中显而易见，通常将本发明的内切葡聚糖酶变体与G1P序列(EG140或EG185)进行比较。另外，除非另有说明，本发明的内切葡聚糖酶变体有酶活性，即，使用下文实施例中所述的内切葡聚糖酶测定法可检测到内切葡聚糖酶活性。
如本文所用，“蛋白质”在本文中是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基基团通常包含天然存在的氨基酸和肽键。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、PEG化、循环排列(circular permutation)、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。
如本文所用，“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。例如，甘氨酸25(也称为Gly25或G25)是EG140 G1P亲本酶中位置25处的残基。
如本文所用，“非天然存在的修饰”是指在野生型酶中未发现的氨基酸修饰。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用，“位置”是指蛋白质序列中的位置。在大多数情况下，除非另有说明，位置编号(其在下文中更充分地讨论)相对于成熟内切葡聚糖酶序列(例如，排除信号肽)的第一个氨基酸。
术语“内切葡聚糖酶”或称为“1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶”是分类为E.C.3.2.1.4的酶，并且是纤维素生物转化为葡萄糖通常需要的一类纤维素酶。内切葡聚糖酶切割内部的β-1,4-葡萄糖苷键，而纤维二糖水解酶从纤维素聚合物链的末端切割二糖纤维二糖，并且β-1,4-葡萄糖苷酶将纤维二糖和其他短的纤维糖寡糖水解为葡萄糖。一些天然存在的内切葡聚糖酶具有纤维素结合结构域，而其他则没有。为了本发明的目的，根据本文实施例中所述的规程，例如，实施例3中用于测定内切葡聚糖酶活性的CMC(羧甲基纤维素)测定法来测定内切葡聚糖酶活性。
术语织物或衣服的“生物石磨”是指代替浮石或除了浮石之外，还使用酶来处理织物或衣服，特别是粗斜纹棉布，以提供“石洗外观”或磨损外观。“石洗外观”或称为“磨损外观”或“破旧外观”是指织物或衣服(尤其是粗斜纹棉布)在其通过纤维素酶或石头或两者处理后的外观，其由于不均匀去除染料的处理导致染色区域以及去除了染料的区域之间形成对比。在酶促石洗或生物石磨中，用浮石的磨损得以完全或部分消除，并且添加了酶以促进靛蓝染料从纤维表面的磨损。本发明的内切葡聚糖酶特别可用于提供磨损外观并最小化生物石磨中的回染。术语“回染”是指释放的染料重新沉积在织物纤维表面上的趋势。用本发明的内切葡聚糖酶处理可以完全代替用浮石的传统处理。然而，当期望产生严重磨损的饰面(finish)时，可以将内切葡聚糖酶处理与浮石处理组合。与本发明相关的“粗斜纹棉布”是指粗斜纹棉布织物，通常是粗斜纹棉布衣服，特别是牛仔裤。有利地，粗斜纹棉布是靛蓝染色的粗斜纹棉布。粗斜纹棉布也可以用靛蓝、用靛蓝的衍生物处理或者是用靛蓝与其他一些染料一起染色的粗斜纹棉布，例如带有硫磺底的靛蓝染色粗斜纹棉布。
生物石磨通常在约pH 3.0-8.0，且优选在pH 4.0-6.5下进行。反应温度的范围可以为约20℃至70℃，且优选在45-55℃或20-30℃之间。液体比(每重量织物的液体的体积的比率)的范围可以为约3:1至20:1，优选5:1至10:1。处理时间的范围可以为15分钟-90分钟，且优选为30分钟-60分钟。应该强调的是，酶用量在很大程度上取决于织物的类型、机器、过程条件(pH、温度、液体比、处理时间、粗斜纹棉布负荷、过程规模)和酶制剂的类型等。
术语“生物整理”(也称为去球粒、去细毛或生物抛光)是指以永久地防止起球、改善织物手感如柔软性和光滑性、通过减少起毛而使表面结构清晰的方式在纤维素纤维的受控水解中使用酶来修饰织物或纱线表面，其导致颜色澄清、改善织物的悬垂性、改善吸湿性，其还可以改善可染性。
生物整理通常在约pH 4.0-6.5下进行。反应温度的范围可以为约20℃至70℃，且优选在45-60℃或20-30℃。液体比(每重量织物的液体的体积的比率)的范围可以为约3:1至20:1，优选5:1至10:1。温育时间通常为15至90分钟，优选30至60分钟。酶用量在很大程度上取决于织物的类型、机器、过程条件(pH、温度、液体比、处理时间、粗斜纹棉布负荷、过程规模)和酶制剂的类型等。
术语“编码序列”是指直接规定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“洗涤剂”是指可以含有表面活性剂(阴离子、非离子、阳离子和两性表面活性剂)以及任选地其他辅助成分如抗再沉积和污垢悬浮剂、荧光增白剂、漂白剂、染料和颜料以及水解酶的清洁剂。在美国专利号5,433,750(在此通过引用以其整体并入)中给出了合适的洗涤剂的含量的列表。在美国专利号3,664,961(在此通过引用以其整体并入)中给出了合适的表面活性剂的列表。
术语“控制序列”意指表达编码本发明的内切葡聚糖酶的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列可以对于编码变体的多核苷酸是天然的(即，来自相同的基因)或外来的(即，来自不同的基因)或彼此天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导物、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。为了引入特定的限制性位点，可以给控制序列提供接头，从而促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接。
术语“表达”包括参与产生本文所述的多肽、蛋白质或前蛋白的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“前蛋白”是指蛋白质前体，其是无活性的蛋白质或肽并含有信号肽序列。可以通过翻译后修饰，如切割信号肽，将前蛋白转变为活性形式的蛋白质。
术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，其包含编码如本文所述的多肽、蛋白质或前蛋白的多核苷酸并且与提供其表达的控制序列可操作地连接。
术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽。“内切葡聚糖酶片段”在本文中是指维持内切葡聚糖酶活性的本文所述的氨基酸序列的部分。在一方面，内切葡聚糖酶片段含有成熟内切葡聚糖酶多肽的至少50、至少100、至少150、至少200或至少210个氨基酸残基，所述成熟内切葡聚糖酶多肽具有零个、一个或多个根据本发明的取代。在一些方面，片段含有如图2中所示的根据本发明的催化结构域的全部或部分，其具有零个、一个或多个取代。
术语“宿主细胞”是指对用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等易感，并且允许表达酶的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。在许多实施方案中，本发明的内切葡聚糖酶(包括本文所述的内切葡聚糖酶和变体酶两者)不在内源宿主中产生。
术语“改善的特性”是指与亲本内切葡聚糖酶相比改善的与本文所述的内切葡聚糖酶变体相关的特征。此类内切葡聚糖酶的改善的特性包括但不限于增加的总活性、增加的比活性(例如催化活性，其与纤维素材料结合的能力和/或其纤维素分解/水解活性)、增加的温度活性(例如在广泛的温度范围内增加的活性)、增加的pH活性(例如，在广泛的pH范围内增加的活性)、增加的总稳定性、增加的温度稳定性(例如，针对广泛的温度范围的稳定性)和增加的pH耐受性(例如，针对广泛的pH范围的稳定性)。进一步改善的特性包括但不限于在织物处理和传统上使用纤维素酶的其他领域中的效率或效果的改善，例如，在生物石磨和/或生物整理过程中改善的效率或效果。
术语“分离的”是指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分从与其在自然界中关联的一种或多种或所有天然存在组分取出的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的物质人为修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质量来修饰的任何物质(例如，编码物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子等)。具体参考本发明的分离的内切葡聚糖酶，分离的内切葡聚糖酶通常是：a)从与其通常相关的其他蛋白质纯化出来；b)当酶处于自然界中未找到的浓度时，或c)当酶在非内源的宿主细胞中产生时。
术语“成熟多肽”是指翻译和任何翻译后修饰，如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等后的最终形式的多肽。
短语“成熟多肽编码序列”是指编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离或以下述方式修饰以含有核酸区段，其在其他情况中不会存在于自然界中或者是合成的，并且包含一个或多个控制序列。
术语“可操作地连接”是指将构建体序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得控制序列指导、允许或促进编码序列的表达的构造。
术语“亲本”或“亲本内切葡聚糖酶”是指进行改变以产生本发明的内切葡聚糖酶变体的内切葡聚糖酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。本发明的示例性亲本多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9。
通过参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)测定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Riceet al.,2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序中所实施，优选5.0.0版或更新版。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并如下计算：
(相同残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
术语“亚序列”是指在成熟多肽编码序列的5’和/或3’末端不存在一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性的片段。在一方面，亚序列至少编码如图2中所示的根据本发明的具有零个、一个或多个取代的内切葡聚糖酶的催化结构域。
术语“变体”是指具有内切葡聚糖酶活性并且在一个或多个(例如几个)位置处包含改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代是指将占据位置的氨基酸替换为不同氨基酸；缺失是指除去占据位置的氨基酸；并且插入是指在占据位置的氨基酸附近和紧随其后加入氨基酸。
术语“野生型”内切葡聚糖酶是指出现在天然存在的微生物中的内切葡聚糖酶的典型形式的序列，所述微生物如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌。
III.本发明的内切葡聚糖酶
本发明提供了用于多种应用的热活性、热稳定和/或pH稳定和活性的内切葡聚糖酶，包括在纺织、洗涤剂和纸浆和造纸工业中。本发明提供了使用具有SEQ ID NO:1或SEQID NO:9的内切葡聚糖酶及其变体的组合物和方法，如下文所更充分描述的。
IV.本发明的内切葡聚糖酶变体
因此，本发明提供了具有改善特性的内切葡聚糖酶变体，其可以用于多种应用中，包括在纺织、洗涤剂和纸浆和造纸工业中。
通常，与亲本内切葡聚糖酶或“G1P”(例如，如图8中所示，如本文中SEQ ID NO:1中所示的EG140 G1P或如SEQ ID NO:9中所示的EG185 G1P)相比，本发明的内切葡聚糖酶变体具有经修饰的、改善的生化特性。可以在本文中改善的内切葡聚糖酶变体的生化特性包括但不限于总活性、比活性、温度活性、pH活性、总稳定性、温度稳定性、pH耐受性、配制剂稳定性(包括液体、固体和颗粒)、蛋白酶稳定性、在生物石磨、生物整理等过程中的性能。
本发明的内切葡聚糖酶变体与G1P相比具有一种或多种改善的特性。本文中的“改善”是指至少一种生化特性的期望的变化。可以将“改善的功能”测量为特定活性的增加或减少的百分数，或者作为“倍数”变化，以期望的性质(例如，总活性和pH耐受性)的增加或不期望的性质(例如，蛋白酶敏感性)的减少。也就是说，与G1P相比，内切葡聚糖酶变体的总活性可以增加10％，蛋白酶敏感性可以减少10％。或者，内切葡聚糖酶变体的pH耐受性可以增加2倍，或者蛋白酶敏感性减少3倍。通常，百分比变化用于描述小于100％的生化活性的变化，且倍数变化用于描述大于100％的生化活性的变化(与亲本酶相比，所述亲本酶在许多情况下为G1P)。在本发明中，可以实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％的生化活性的百分比变化(通常为增加)。在本发明中，与起始或亲本酶相比，“倍数增加”(或减少)得以测量。例如，如图3A中所示，与EG140 G1P相比，EG140G1V1的总活性增加了1.36倍，并且pH耐受性得到了改善：这是通过[(变体的活性)/(亲本的活性)]计算的。在许多实施方案中，改善为至少一又十分之一倍(1.1)、一又二分之一倍(1.5)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更高。
本发明的内切葡聚糖酶变体可以改善许多生物化学特性中的一种或多种，包括但不限于总活性、比活性、温度活性、pH活性、总稳定性、温度稳定性、pH耐受性、配制剂稳定性(包括液体、固体和颗粒)、蛋白酶稳定性、在生物石磨、生物整理等过程中的性能。通常，使用内切葡聚糖酶活性测定法与G1P酶相比测量改善，如下所概述。
A.CMC测定法以测定总活性
在一些实施方案中，采用CMC测定法以测定内切葡聚糖酶的总活性，如在实施例部分中所述的。具体而言，在PCR板中，将50μL的溶于100mM乙酸钠，pH5.5缓冲液(目录号C5678)的1.8％低粘度羧甲基纤维素(CMC)添加到板中。然后将10μL的上清液酶添加到相同的板中，并在台式摇床上摇动约1分钟。然后将板在50℃下温育30分钟，并以4,000rpm离心2分钟。将90μL的DNS溶液添加到板中并密封板。将板放入Thermocycler，并选择“95DNS”程序，其不带加热盖选项且“95DNS”程序设置：在95℃下5分钟，并冷却至4℃2分钟。温育后，将板翻转几次，然后以4,000rpm将板离心3分钟。向透明底板中加入100μL的水，并转移100μL的DNS反应物。摇动板并在540nm处读数用于内切葡聚糖酶活性。在相同条件下将内切葡聚糖酶变体的活性与亲本内切葡聚糖酶进行比较，以测定在50℃下的总活性改善(通常使用如实施例6和7中所示的内切葡聚糖酶测定法)。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的多肽。
因此，如图3、4、5和6中所示，本发明的许多内切葡聚糖酶变体在pH4.5、50℃和/或pH6.5、50℃下表现出增加的总活性。
B.pH耐受性
在许多实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，本发明的内切葡聚糖酶变体具有改变的pH耐受性。在该上下文中，“增加的pH耐受性”是指在相同的pH攻击条件下，变体酶比亲本内切葡聚糖酶(例如G1P)更稳定，也就是说，在相同的条件下，变体的活性高于G1P的活性(通常使用如实施例6和7中所示的内切葡聚糖酶测定法)。例如，取决于原始底物和反应条件，可以在多种pH下进行生物石磨或生物整理加工。
综上所述，在50℃下的一段时间内(通常范围为约10分钟至3小时)，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9相比，本发明的内切葡聚糖酶变体可以表现出对pH6.5的增加的耐受性。
因此，如图3、4、5和6中所示，本发明的许多内切葡聚糖酶变体在50℃下表现出针对pH 6.5的增加的耐受性。
C.热稳定性
在许多实施方案中，本发明的内切葡聚糖酶变体具有增加的热稳定性，特别是在生物石磨或生物整理过程中使用的高温条件下。在该上下文中，“热稳定性”是指在相同的热攻击条件下，变体酶比亲本内切葡聚糖酶(例如G1P)更稳定，也就是说，在相同的条件下，变体的活性高于G1P的活性(通常使用如本文所概述的内切葡聚糖酶测定法)。
合适的热稳定性测定法如下。将来自裂解物板的50μl的酶添加到96孔Biorad PCR板中，并在30-70℃得以攻击10分钟。将对照反应在室温下放置相同的时间。热攻击后，使用对照反应测定残余活性。在相同条件下将内切葡聚糖酶变体的活性与亲本进行比较以测定热稳定性改善。
综上所述，在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、66℃、70℃、75℃、80℃和/或85℃下一段时间内(通常范围为约10分钟至3小时)，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9相比，本发明的内切葡聚糖酶变体可以表现出增加的热稳定性。
D.比活性测定法
在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶，特别是G1P相比，本发明的内切葡聚糖酶变体具有增加的比活性。在本文中，“比活性”是指每一定量的酶的活性，通常通过将样品的酶活性(有时以“内切葡聚糖酶单位”测量)除以内切葡聚糖酶的量来测定，通常如本领域已知的来测定。
E.蛋白酶易感性
在一些实施方案中，在相同条件下，本发明的内切葡聚糖酶变体比亲本酶对蛋白酶降解较不易感。在一些情况下，在生产宿主生物体中生产内切葡聚糖酶变体期间，由宿主生物体产生的蛋白酶引起的蛋白酶降解可能是一个问题，从而导致活性酶的产量较低。类似地，取决于变体酶的用途，在原始底物中可以存在其他蛋白酶或组合使用可以降解内切葡聚糖酶的其他酶。
这通常如本领域中已知的来测定，例如通过允许蛋白水解降解，然后对所得片段进行N端测序以确定切割位点。在一些情况下，取决于变体和宿主生产生物体，可能没有明显的蛋白水解降解。
如需要，如本领域技术人员将理解的，可以进行的具体突变将取决于宿主生物体产生的内源蛋白酶，并且通常还发生在表面暴露的环结构或因此蛋白酶可接近的转角中。
V.特定内切葡聚糖酶变体
本发明提供了与亲本内切葡聚糖酶相比，在对应于位置12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和/或218的一个或多个(例如几个)位置处包含一个或多个氨基酸取代的内切葡聚糖酶变体。在一些情况下，变体酶可以在这些位置处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体表现出与亲本内切葡聚糖酶至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体表现出与亲本内切葡聚糖酶至少95％、96％、97％、98％或99％，但小于100％的序列同一性。在一个实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是SEQ ID NO:1。在另一个实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下的总活性、在约40℃下的总活性、在约50℃下的总活性、在约60℃下的总活性和在约70℃下的总活性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的活性：针对pH 3.0的耐受性、针对pH 3.5的耐受性、针对pH 4.0的耐受性、针对pH 4.5的耐受性、针对pH 5.0的耐受性、针对pH 5.5的耐受性、针对pH 6.0的耐受性、针对pH 6.5的耐受性、针对pH 7.0的耐受性、针对pH 7.5的耐受性和针对pH 8.0的耐受性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:9相比具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下的总活性、在约40℃下的总活性、在约50℃下的总活性、在约60℃下的总活性和在约70℃下的总活性热稳定性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:9相比具有至少1.1倍更好的活性：针对pH 3.0的耐受性、针对pH 3.5的耐受性、针对pH4.0的耐受性、针对pH 4.5的耐受性、针对pH 5.0的耐受性、针对pH 5.5的耐受性、针对pH 6.0的耐受性、针对pH 6.5的耐受性、针对pH 7.0的耐受性、针对pH 7.5的耐受性和针对pH 8.0的耐受性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与亲本内切葡聚糖酶相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代发生在一个所述位置、两个所述位置、三个所述位置、四个所述位置、五个所述位置、六个所述位置、七个所述位置、八个所述位置、九个所述位置、十个所述位置、十一个所述位置或十二个所述位置处。在一个实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是SEQ ID NO:1。在另一个实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S、G25D、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、G25S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E、K212E和N218S。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：G25D/A161G/M172K/H182Q/M194L/K212N、N12S/G25D/Q65G/S160A/A161G/V171I/Y184F/M194L/K212N、G25D/N138T/V171I/W175F/H182Q/Y184F、G25D/N138T/I139V/M194L、H182Q/K212N、G25D/A161G/T214S、N12S/G25D/A161G/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、G25D/N138T/H182Q/K212N、N12S/G25D/A44S/I139V、G25D/N138T/K212N、G25D/V171I/W175F/M194L/K212N、G25D/A161G/K212N、V171I/Y184F、G25D/A44S/A161G、G25D/M172K/H182Q、G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N、G25D/V171I/M172K/H182Q/M194L、H182Q/M194L、G25D/K212N、N12S/G25D/N138T/A161G/K212N、G25D/H182Q/Y184F/M194L/K212N、N12S/G25D/N40S/I139V/V171I/M172K/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、N12S/G25D/H182Q/K212N、G25D/N40S/A44S/N138T/A161G/V171I/W175F/Y184F/M194L/K212N、N12S/N40S/Y184F/T214S、N12S/G25D/A44S/Q65G、G25D/A161G/M194L/T214S、A44S/N138T/I139V/V171I/H182Q/Y184F/M194L/K212N、G25D/Y184F/M194L/K212N、N12S/G13P/D55P/M172K/R205P/K212N、N12S/G25D/D55P/V171I/M172K/S187P、G25D/S187P、G13P/G25D/D55P/A161P/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P、N12S/R133P/A161P/V171I/S187P/K212N、N12S/G25D、G13P/G25D/D55P/V171I/S187P/R205P、G13P/G25D/V171I/M172K/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P/R205P、G25D/V171I/M172K、G25D/R133P、N12S/G25D/V171I/M172K、N12S/G25D/H182Q/R205P、N12S/G25D/A161P/S187P/K212N、G25D/D55P/V171I/M172K/R205P、D55P/R205P、N12S/R205P、N12S/G25D/T69P/R133P/V171I/M172K/R205P/K212N、T179Y/R205Y、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126S/T136Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/P80G/G126I/T136M/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/T165Y/T179L/R205P、N12E/G25S/D55P/P80G/G126T/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/G126N/T136Y/T165Y/T179Y/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/P80G/G126R/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126T/T165Y/R205P、N12E/G25S/D55I/G126K/T165D/R205P、N12E/G25S/D55P/G126I/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126K/T136Y/T179Y/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/G126R/R205P、N12E/G25S/D55P/G126N/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/P80G/E145A/R205P/T207E、G25D/D55P/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126R/T136Y/T165Y/R205P、N12E/G25D/D55P/P80G/R205P、G25D/D55I/G126K/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126R/R205P/T207E、G25D/D55P/G126T/T136Y/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55P/G126N/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/R205P、N12E/G25D/D55P/T165D/R205Y、N12E/G25D/D55I/P80G/G126R/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126K/T165D/R205P、G25D/D55P/G126V/T136Y/R205P/T207E、G25D/D55P/T179L/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/R205P/N218S、G25S/D55P/G126R/T136M/E145A/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126V/E145A/T179Y/R205P、N12E/G25S/D55P/G126T/T165Y/R205P、G25S/D55P/G126R/R205P/N218S、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55I/G126R/T136M/T165Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/G126S/T136M/T165Y/R205Y、N12D/G25D/D55P/S86A/E145M/I164T/D173P/R205P/T207E、N12E/G25D/A44D/D55P/S86H/Q128F/R205P、G25S/D55P/G126I/D173N/R205P/T207E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/T152Q/R176H/S187N/R205P/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/Q128R/E145A/D173E/R205P、N12D/G25D/A44D/D55P/S86A/E145A/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/T136Y/G169T/R176H/R205P/K212E、N12E/G25D/D55P/S86Q/A104D/G126T/E145A/D173E/R205P/K212E、G25D/A44D/D55P/I164T/R205P、N12T/G25D/D55P/S86A/A104D/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E/N218S、N12D/G25D/D55P/P80G/S86A/Q128R/I164T/D173E/R205P/K212E、N12D/G25S/D55P/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E、N12G/G25D/A44D/D55P/Q128R/I164T/D173E/R205P、N12T/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/D173E/R205P、G25D/A44D/D55P/Q128R/R205P/T207E、G25S/D55P/G126S/T165D/G169S/T179Y/R205P/K212E、G25S/A44D/D55P/P80G/S86A/G126K/Q128R/R205P/K212E、G25S/D55P/P80G/G126T/R205P、N12T/G25D/D55I/P80G/G126S/T152Q/S187N/R205P、G25S/D55P/G126K/T136R/T152Q/R176H/T179Y/R205P/K212E、G25D/D55P/G126T/T165Y/R176H/R205P、N12D/G25D/D55P/S86Q/A104D/E145A/R205P/T207E/N218S、G25D/A44D/D55P/A104D/Q128R/E145A/T165D/R176H/R205P/K212E、G25D/D55P/R205P/K212N、N12E/G25S/D55R/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/V17I/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/V35I/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/V127I/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/G42S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/Y124F/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/S78T/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R176H/S187N/R205P/T207E、N12T/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/S86Q/G126T/T136Y/T165Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25S/S28N/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/S39Y/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N、N12T/G25S/A44D/D55P/S86Q/G126N/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136M/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/A104D/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12T/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/A104D/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/D173L/R176H/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/A44D/D55P/G126S/T136Y/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E和N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126K/T136Y/D173E/R176H/S187N/R205P/T207E。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是G25D/K212N。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12S/G25D/H182Q/K212N。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是G25D/D55P/R205P。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、N40S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、W175F、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含G25D/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含N12S/G25D/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、Y184F、M194L、T214S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含G25D/D55P/R205P，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、T207E、K212E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、K212E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N和N218S。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S、R14P、S25D、N40S、G44S、Q65G、T92I、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L和Q212N。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S/R14P/S25D/T92I、T92I/Y184F、R14P/S25D/T92I/S138T/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F/Q212N、N12S/I139V、T92I/I139V/H182Q/Y184F、N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/V171I/Y184F、N12S/S138T/I139V/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F、S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/S160A/Y184F、N12S/S25D/N40S/G44S/S138T/I139V/H182Q、N12S/R14P/S25D/Q65G/V171I/M172K/W175F/H182Q/Y184F、N12S/R14P/S25D/G44S/T92I/S138T/I139V/S160A/A161G/W175F、S160A/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/A161G/Y184F、R14P/T92I/A161G/V171I/W175F/Y184F、T92I/A161G/H182Q/Y184F、R14P/A161G/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K、N12S/A161G/H182Q/Y184F、N12S/R14P/T92I/A161G/V171I/Y184F、S25D/N40S/T92I/S138T/S160A/A161G/V171I/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S、Y184F、N12S/R14P/S25D/T92I/S138T/A161G、N12S/R14P/G44S/T92I/M194L、R14P/S25D/N40S/S138T/Q212N、N12S/S25D/N40S/G44S/Q65G、S25D/G44S/S138T/I139V、S25D/H182Q、R14P/S25D/G44S、N12S/S25D/N40S/G44S/T92I/M172K/H182Q/Q212N、R14P/S25D/N40S/G44S/A161G/V171I/Y184F、N12S/R14P/S25D/A161G/M172K/W175F/Y184F和N12S/R14P/S25D/N40S/G44S/T92I/I139V。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：R14P、N40S、G44S、Q65G、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、W175F、H182Q和Q212N。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、R14P、N40S、G44S、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K和W175F。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：G44S、Q65G、T92I、S138T、I139V、V171I、W175F、H182Q、Y184F、M194L和Q212N。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体包含一个或多个选自图3、图4、图5或图6的变体。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体是分离的内切葡聚糖酶变体。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置12处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N12S。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置25处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G25D。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置40处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N40S。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置44处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A44S。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置65处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q65G。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置138处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N138T。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置139处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I139V。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置160处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S160A。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置161处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A161G。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置171处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V171I。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置172处包含甲硫氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是M172K。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置175处包含色氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是W175F。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置182处包含组氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是H182Q。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置184处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y184F。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置194处包含甲硫氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是M194L。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置212处包含赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K212N。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置214处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T214S。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置12处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N12D、N12E、N12G或N12T。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置25处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G25S。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置44处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A44D。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置55处包含天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D55I或D55P。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置80处包含脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P80G。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置86处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S86A、S86H或S86Q。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置104处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A104D。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置126处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T或G126V。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置128处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q128F或Q128R。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置136处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T136M、T136R或T136Y。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置145处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是E145A或E145M。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置152处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T152Q。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置164处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I164T。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置165处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T165D或T165Y。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置169处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G169S或G169T。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置173处包含天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D173E、D173N或D173P。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置176处包含精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R176H。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置179处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T179L或T179Y。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置181处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N181S。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置187处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S187N。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置205处包含精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R205P或R205Y。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置207处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T207E。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置212处包含赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K212E。
在一些实施方案中，与EG140 G1P(SEQ ID NO:1)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置218处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N218S。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置12处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N12S。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置14处包含精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R14P。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置25处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S25D。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置40处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N40S。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置44处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G44S。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置65处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q65G。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置92处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T92I。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置138处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S138T。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置139处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I139V。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置160处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S160A。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置161处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A161G。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置171处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V171I。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置172处包含甲硫氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是M172K。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置175处包含色氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是W175F。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置182处包含组氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是H182Q。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置184处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y184F。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置194处包含甲硫氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是M194L。
在一些实施方案中，与EG185 G1P(SEQ ID NO:9)成熟蛋白质相比，内切葡聚糖酶变体在位置212处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用任何其他19个天然存在的氨基酸进行取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案未利用半胱氨酸(由于可能形成二硫化物)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q212N。
在一些实施方案中，本发明的变体酶与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，变体酶是SEQ IDNO:5。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，本发明的变体酶与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:15。
除本文所述的特定取代外，可能存在的氨基酸变化可能属于次要性质，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；至多约20至约25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其他功能(如多组氨酸段、抗原表位或结合结构域)促进纯化的小延伸。
保守氨基酸的实例在下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如描述于H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New York。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、LeuAal、Ala/Glu和Asp/Gly。
A.亲本内切葡聚糖酶
亲本内切葡聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；(b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长补码；或(c)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。对于杂交方法和条件，参见例如，Sambrooket al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有内切葡聚糖酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差至多19个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有内切葡聚糖酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:9的成熟多肽相差至多19个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是野生型内切葡聚糖酶。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是SEQ IDNO:9。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些方面，亲本内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在其他方面，亲本内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ IDNO:24的成熟多肽编码序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:24的核酸序列。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的核酸序列。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是宇田川曲霉(Aspergillus udagawae)内切葡聚糖酶，例如SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶。
在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是Aspergillus lentulus内切葡聚糖酶，例如SEQ ID NO:9的内切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，当暴露于20℃、25℃、30℃、40℃、45℃、50℃、52℃、55℃、56℃、58℃、60℃、65℃、66℃、70℃、75℃、80℃和/或85℃的温度一段时间(通常范围为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟或更长时间)时，内切葡聚糖酶变体比亲本内切葡聚糖酶更稳定，取决于使用内切葡聚糖酶变体的最终条件，其中发现一些利用5分钟至10分钟、5分钟至15分钟、5分钟至60分钟、10分钟至180分钟的热攻击时间的实施方案全部用于本发明中。在一些实施方案中，使用了50℃和3h的攻击。
因此，在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶，特别是G1P相比，内切葡聚糖酶变体在50℃下至少180分钟具有增加的总活性。
此外，对pH 6.5的耐受性也可以考虑用于改善。因此，在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，内切葡聚糖酶变体具有增加的对pH 6.5的耐受性。在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，内切葡聚糖酶变体在50℃下至少3小时具有增加的对pH 6.5的耐受性。
因此，如图3、4、5和6中所示，本发明的许多内切葡聚糖酶变体表现出增加的总活性以及对pH 6.5和pH 4.5的耐受性。
B.核酸组合物
本发明还提供了包含本发明的内切葡聚糖酶变体编码核酸的组合物。此类内切葡聚糖酶变体多肽编码核酸可以编码本申请(包括以上“本发明的内切葡聚糖酶变体”部分)中所述的任何内切葡聚糖酶变体。在一些实施方案中，组合物包含选自下组的核酸：SEQ IDNO:2至16、20至24的偶数编号序列。
在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:2的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:4的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:6的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:8的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:10的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:12的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:14的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:16的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:20的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:22的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:24的核酸。
在一些实施方案中，内切葡聚糖酶变体多肽编码核酸包含SEQ ID NO:2至16、20至24的任何偶数编号序列的经密码子优化的形式或变体。
在一些实施方案中，本发明提供了编码内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218、并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在一些实施方案中，本发明提供了编码内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下的总活性、在约40℃下的总活性、在约50℃下的总活性、在约60℃下的总活性和在约70℃下的总活性热稳定性；并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在一些实施方案中，本发明提供了编码内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、25、40、44、65、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194、212、214、55、80、86、104、126、128、136、145、152、164、165、169、173、176、179、181、187、205、207和218，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有至少1.1倍更好的活性：针对pH 3.0的耐受性、针对pH 3.5的耐受性、针对pH 4.0的耐受性、针对pH4.5的耐受性、针对pH 5.0的耐受性、针对pH 5.5的耐受性、针对pH 6.0的耐受性、针对pH6.5的耐受性、针对pH 7.0的耐受性、针对pH 7.5的耐受性和针对pH 8.0的耐受性；并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1至少90％相同。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述内切葡聚糖酶变体表现出与SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代发生在一个所述位置、两个所述位置、三个所述位置、四个所述位置、五个所述位置、六个所述位置、七个所述位置、八个所述位置、九个所述位置、十个所述位置、十一个所述位置或十二个所述位置处。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S、G25D、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、G25S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E、K212E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代选自下组：G25D/A161G/M172K/H182Q/M194L/K212N、N12S/G25D/Q65G/S160A/A161G/V171I/Y184F/M194L/K212N、G25D/N138T/V171I/W175F/H182Q/Y184F、G25D/N138T/I139V/M194L、H182Q/K212N、G25D/A161G/T214S、N12S/G25D/A161G/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、G25D/N138T/H182Q/K212N、N12S/G25D/A44S/I139V、G25D/N138T/K212N、G25D/V171I/W175F/M194L/K212N、G25D/A161G/K212N、V171I/Y184F、G25D/A44S/A161G、G25D/M172K/H182Q、G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N、G25D/V171I/M172K/H182Q/M194L、H182Q/M194L、G25D/K212N、N12S/G25D/N138T/A161G/K212N、G25D/H182Q/Y184F/M194L/K212N、N12S/G25D/N40S/I139V/V171I/M172K/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、N12S/G25D/H182Q/K212N、G25D/N40S/A44S/N138T/A161G/V171I/W175F/Y184F/M194L/K212N、N12S/N40S/Y184F/T214S、N12S/G25D/A44S/Q65G、G25D/A161G/M194L/T214S、A44S/N138T/I139V/V171I/H182Q/Y184F/M194L/K212N、G25D/Y184F/M194L/K212N、N12S/G13P/D55P/M172K/R205P/K212N、N12S/G25D/D55P/V171I/M172K/S187P、G25D/S187P、G13P/G25D/D55P/A161P/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P、N12S/R133P/A161P/V171I/S187P/K212N、N12S/G25D、G13P/G25D/D55P/V171I/S187P/R205P、G13P/G25D/V171I/M172K/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P/R205P、G25D/V171I/M172K、G25D/R133P、N12S/G25D/V171I/M172K、N12S/G25D/H182Q/R205P、N12S/G25D/A161P/S187P/K212N、G25D/D55P/V171I/M172K/R205P、D55P/R205P、N12S/R205P、N12S/G25D/T69P/R133P/V171I/M172K/R205P/K212N、T179Y/R205Y、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126S/T136Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/P80G/G126I/T136M/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/T165Y/T179L/R205P、N12E/G25S/D55P/P80G/G126T/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/G126N/T136Y/T165Y/T179Y/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/P80G/G126R/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126T/T165Y/R205P、N12E/G25S/D55I/G126K/T165D/R205P、N12E/G25S/D55P/G126I/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126K/T136Y/T179Y/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/G126R/R205P、N12E/G25S/D55P/G126N/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/P80G/E145A/R205P/T207E、G25D/D55P/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126R/T136Y/T165Y/R205P、N12E/G25D/D55P/P80G/R205P、G25D/D55I/G126K/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126R/R205P/T207E、G25D/D55P/G126T/T136Y/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55P/G126N/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/R205P、N12E/G25D/D55P/T165D/R205Y、N12E/G25D/D55I/P80G/G126R/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126K/T165D/R205P、G25D/D55P/G126V/T136Y/R205P/T207E、G25D/D55P/T179L/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/R205P/N218S、G25S/D55P/G126R/T136M/E145A/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126V/E145A/T179Y/R205P、N12E/G25S/D55P/G126T/T165Y/R205P、G25S/D55P/G126R/R205P/N218S、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55I/G126R/T136M/T165Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/G126S/T136M/T165Y/R205Y、N12D/G25D/D55P/S86A/E145M/I164T/D173P/R205P/T207E、N12E/G25D/A44D/D55P/S86H/Q128F/R205P、G25S/D55P/G126I/D173N/R205P/T207E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/T152Q/R176H/S187N/R205P/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/Q128R/E145A/D173E/R205P、N12D/G25D/A44D/D55P/S86A/E145A/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/T136Y/G169T/R176H/R205P/K212E、N12E/G25D/D55P/S86Q/A104D/G126T/E145A/D173E/R205P/K212E、G25D/A44D/D55P/I164T/R205P、N12T/G25D/D55P/S86A/A104D/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E/N218S、N12D/G25D/D55P/P80G/S86A/Q128R/I164T/D173E/R205P/K212E、N12D/G25S/D55P/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E、N12G/G25D/A44D/D55P/Q128R/I164T/D173E/R205P、N12T/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/D173E/R205P、G25D/A44D/D55P/Q128R/R205P/T207E、G25S/D55P/G126S/T165D/G169S/T179Y/R205P/K212E、G25S/A44D/D55P/P80G/S86A/G126K/Q128R/R205P/K212E、G25S/D55P/P80G/G126T/R205P、N12T/G25D/D55I/P80G/G126S/T152Q/S187N/R205P、G25S/D55P/G126K/T136R/T152Q/R176H/T179Y/R205P/K212E、G25D/D55P/G126T/T165Y/R176H/R205P、N12D/G25D/D55P/S86Q/A104D/E145A/R205P/T207E/N218S、G25D/A44D/D55P/A104D/Q128R/E145A/T165D/R176H/R205P/K212E、G25D/D55P/R205P/K212N、N12E/G25S/D55R/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/V17I/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/V35I/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/V127I/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/G42S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/Y124F/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/S78T/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R176H/S187N/R205P/T207E、N12T/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/S86Q/G126T/T136Y/T165Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25S/S28N/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/S39Y/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N、N12T/G25S/A44D/D55P/S86Q/G126N/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136M/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/A104D/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12T/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/A104D/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/D173L/R176H/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/A44D/D55P/G126S/T136Y/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E和N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126K/T136Y/D173E/R176H/S187N/R205P/T207E。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是G25D/K212N。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是N12S/G25D/H182Q/K212N。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是G25D/D55P/R205P。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、N40S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、W175F、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代G25D/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代N12S/G25D/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、Y184F、M194L、T214S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代G25D/D55P/R205P，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、T207E、K212E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、K212N、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、K212E和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N和N218S。
在一些实施方案中，本发明提供了编码内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在一些实施方案中，本发明提供了编码内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:9相比具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下的总活性、在约40℃下的总活性、在约50℃下的总活性、在约60℃下的总活性和在约70℃下的总活性热稳定性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ IDNO:9至少90％相同。
在一些实施方案中，本发明提供了编码内切葡聚糖酶变体的核酸，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：12、14、25、40、44、65、92、138、139、160、161、171、172、175、182、184、194和212，其中所述内切葡聚糖酶变体在选自下组的条件下与SEQ ID NO:9相比具有至少1.1倍更好的活性：针对pH 3.0的耐受性、针对pH 3.5的耐受性、针对pH 4.0的耐受性、针对pH4.5的耐受性、针对pH 5.0的耐受性、针对pH 5.5的耐受性、针对pH 6.0的耐受性、针对pH6.5的耐受性、针对pH 7.0的耐受性、针对pH 7.5的耐受性和针对pH 8.0的耐受性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9至少90％相同。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述内切葡聚糖酶变体表现出与SEQ ID NO:9至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代发生在一个所述位置、两个所述位置、三个所述位置、四个所述位置、五个所述位置、六个所述位置、七个所述位置、八个所述位置、九个所述位置、十个所述位置或十一个所述位置处。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S、R14P、S25D、N40S、G44S、Q65G、T92I、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L和Q212N。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S/R14P/S25D/T92I、T92I/Y184F、R14P/S25D/T92I/S138T/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F/Q212N、N12S/I139V、T92I/I139V/H182Q/Y184F、N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/V171I/Y184F、N12S/S138T/I139V/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F、S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/S160A/Y184F、N12S/S25D/N40S/G44S/S138T/I139V/H182Q、N12S/R14P/S25D/Q65G/V171I/M172K/W175F/H182Q/Y184F、N12S/R14P/S25D/G44S/T92I/S138T/I139V/S160A/A161G/W175F、S160A/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/A161G/Y184F、R14P/T92I/A161G/V171I/W175F/Y184F、T92I/A161G/H182Q/Y184F、R14P/A161G/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K、N12S/A161G/H182Q/Y184F、N12S/R14P/T92I/A161G/V171I/Y184F、S25D/N40S/T92I/S138T/S160A/A161G/V171I/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S、Y184F、N12S/R14P/S25D/T92I/S138T/A161G、N12S/R14P/G44S/T92I/M194L、R14P/S25D/N40S/S138T/Q212N、N12S/S25D/N40S/G44S/Q65G、S25D/G44S/S138T/I139V、S25D/H182Q、R14P/S25D/G44S、N12S/S25D/N40S/G44S/T92I/M172K/H182Q/Q212N、R14P/S25D/N40S/G44S/A161G/V171I/Y184F、N12S/R14P/S25D/A161G/M172K/W175F/Y184F和N12S/R14P/S25D/N40S/G44S/T92I/I139V。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的内切葡聚糖酶变体的核酸，其中所述氨基酸取代是R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：R14P、N40S、G44S、Q65G、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、W175F、H182Q和Q212N。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：N12S、R14P、N40S、G44S、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K和W175F。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸：G44S、Q65G、T92I、S138T、I139V、V171I、W175F、H182Q、Y184F、M194L和Q212N。
“经密码子优化的”在此上下文中就特定宿主生物体及其通常优选的氨基酸密码子而言完成；也就是说，宿主生产生物体，例如曲霉物种与酵母生产生物体相比可以使用曲霉优选的密码子产生更高的翻译和/或分泌。
在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类内切葡聚糖酶变体编码核酸。术语“富含”指示从组合物获得的内切葡聚糖酶活性已经增加，例如富集因子是至少1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特征，如低色、低臭和可接受的储存稳定性。
1.变体的制备
一般可以使用公知的技术通过编码蛋白质序列的构建基因制备变体，所述公知技术包括亲本基因的定点诱变和合成基因构建。
i.调节序列
本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。控制序列可以包括启动子，即为了表达多核苷酸而被宿主细胞识别的多核苷酸。启动子含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变体启动子、截短的启动子和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：曲霉物种基因，如本领域中已知的，包括构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉和米曲霉(A.oryzae)及根毛霉(Rhizomucor)物种基因，如米黑根毛霉(R.miehei)，木霉(Trichoderma)物种基因，包括里氏木霉(T.reesei)，镰孢(Fusarium)物种基因，包括镰孢霉(F.venenatum)。包含启动子的酵母控制序列也是从酿酒酵母公知的。
来自这些物种的合适的启动子序列(以及其他控制序列)包括如本领域已知的来自淀粉酶(特别是α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶等的启动子。另外，对于密码子优化，可能期望使用对宿主生产菌株内源的启动子(和其他控制序列)，其与编码内切葡聚糖酶变体的核酸可操作地连接。在许多实施方案中，可操作地附接至编码序列的启动子不是天然的启动子序列。
控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3’端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的终止子(和其他控制序列如启动子)获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
在一些实施方案中，用于酵母宿主细胞的终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。
控制序列也可以是增加基因表达的启动子下游且基因编码序列上游的mRNA稳定区。
合适的mRNA稳定区的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)crylllA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hueet al.,1995,Journal ofBacteriology 177:3465-3471)获得。
控制序列也可以是前导物，即对于由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导物序列与编码变体的多核苷酸的5’端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导物。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的前导物是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
在一些实施方案中，从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得酵母宿主细胞的合适前导物。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即与变体编码序列的3’端可操作地连接的序列，并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端连接并指导表达的内切葡聚糖酶变体进入细胞的分泌途径的信号肽。在一些情况中，信号序列是图2中描述的信号序列，即EG140 G1P或EG185 G1P信号肽序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶、和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。Romanos等,1992，同上描述了其他有用的信号肽编码序列。
在存在信号肽和前肽序列两者的情况下，前肽序列位于变体的N端附近，并且信号肽序列位于前肽序列的N端附近。
还可以期望添加相对于宿主细胞生长调节变体表达的调节序列。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操作基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用子囊菌门(Ascomycota)如曲霉菌属(Aspergillus)的Gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中成熟蛋白质可以是如本文所述的任何内切葡聚糖酶变体，并且其中信号肽可以是内源的或外源的。在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中成熟蛋白质是如本文所述的内切葡聚糖酶变体，并且与内源或外源构建体序列可操作地连接。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中信号肽与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，信号肽具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
在一些实施方案中，本发明提供了编码具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的内切葡聚糖酶的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中成熟蛋白质具有与外源构建体序列可操作地连接的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中信号肽与外源构建体序列可操作地连接，并且其中成熟蛋白质具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，信号肽是内源的。在一些实施方案中，信号肽是外源的。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中信号肽与外源构建体序列可操作地连接，并且其中成熟蛋白质具有与外源构建体序列可操作地连接的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中成熟蛋白质具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9，并且其中信号肽与SEQID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，信号肽具有SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的核酸，其中外源构建体序列是外源启动子。
2.表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的合适载体中来表达多核苷酸。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与适合于表达的控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA规程并且可以导致多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并且与已经整合有它的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。涵盖用于本发明方法的载体包括整合载体和非整合载体两者。
在一些实施方案中，载体含有一个或多个允许容易选择经转化的、经转染的、经转导的或类似细胞的可选择标志物。可选择标志物是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。
用于酵母宿主细胞的合适标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。对于在曲霉细胞中使用优选的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
在一些实施方案中，载体含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或载体在细胞中不依赖于基因组的方式自主复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置处整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是任何介导在细胞中发挥功能的自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gemset al.,1991,Gene98:61-67；Cullenet al.,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将超过一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生，包括在载体中使用编码内切葡聚糖酶变体的多个基因，将多个载体转化到细胞中，或者将载体对基因组中的多次整合。可以通过如下获得多核苷酸的拷贝数的增加：将至少一个额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或与多核苷酸一起纳入可扩增可选择标志物基因，其中含有扩增拷贝的可选择标志物基因和因此多核苷酸的额外拷贝的细胞可以通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上)。
C.特定构建体
为了在酵母中表达，一个实施方案利用酿酒酵母INSCV1菌株(ThermoFisherScientific,USA:目录号V8251-20)和pESC-URA载体(Agilent Technologies,SantaClara,California,目录号217454)。两者都是可商购的并且也在下文的实施例中讨论。
1.密码子优化
密码子优化可以与本发明的任何内切葡聚糖酶变体一起使用，以优化使用的宿主细胞中的表达。此类方法在本领域中是公知的，并且记载于例如WO 2007/142954。在异源表达系统中，优化步骤可以改善宿主产生期望内切葡聚糖酶变体的能力。蛋白质表达受许多因子控制，包括影响转录、mRNA加工和稳定性以及翻译起始的因子。多核苷酸优化步骤可以包括改善宿主产生外源蛋白质的能力的步骤以及协助研究人员有效设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括例如翻译起始区域的修饰、mRNA结构元件的改变、以及使用不同的密码子偏倚。
在一些实施方案中，通过干扰二级结构发生减少的异源蛋白质表达。二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子并且与蛋白质表达的降低相关。茎环结构也可以参与转录暂停和减弱。优化的多核苷酸序列可以含有核苷酸序列的RBS和基因编码区中的最小的二级结构以允许改善的转录和翻译。
在一些实施方案中，限制性位点可以实现异源蛋白质表达。通过修饰可以干扰转录单元随后亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点，可以优化多核苷酸序列。
在一些实施方案中，经优化的核酸序列可以以下述水平表达本发明的内切葡聚糖酶变体，所述水平是尚未优化的核酸序列表达的水平的至少110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％或甚至10,000％。
D.宿主细胞和生产菌株
如本领域技术人员将理解的，存在用于重组生产本发明的内切葡聚糖酶变体的极其多种生产宿主生物体，包括但不限于细菌细胞和包括酵母的真菌细胞。
本发明还涉及包含编码本发明的内切葡聚糖酶变体的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸与指导本发明变体的产生的一个或多个控制序列可操作地连接。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得构建体或载体作为染色体整合体或作为自身复制的染色体外载体维持，如前所述。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码变体的基因及宿主生产生物体产生高蛋白质滴度的表达和/或分泌蛋白的能力。在一些实施方案中，宿主细胞展现内切葡聚糖酶变体的瞬时表达。在一些实施方案中，宿主细胞是稳定转染的宿主或稳定(即永久)表达内切葡聚糖酶变体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是生产宿主细胞。用包含本发明的内切葡聚糖酶变体的编码区的表达载体对宿主细胞进行转化和/或转染是如本领域中所公知的(参见Sambrook,同上)。
宿主细胞可以是用于重组生产变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。此类宿主细胞包括但不限于细菌、真菌和酵母细胞。宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)，壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有丝分孢子真菌(mitosporic fungi)(如Hawksworthet al.,于Ainsworthand Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,UniversityPress,Cambridge,UK所定义)。在许多情况下，宿主细胞包括曲霉物种，包括构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉，以及根毛霉物种如米黑根毛霉、木霉物种，包括里氏木霉和镰孢物种基因，包括镰孢霉。
丝状真菌宿主细胞可以是丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、射脉革菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓孔菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射状射脉革菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长柔毛栓孔菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
在一些实施方案中，真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)细胞如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
E.蛋白质组合物
本发明还提供了包含本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类内切葡聚糖酶变体。术语“富含”表示组合物的内切葡聚糖酶活性已经增加，例如富集因子至少为1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特征，例如低色、低臭和可接受的储存稳定。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的内切葡聚糖酶变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。
在一些实施方案中，根据最终用途，组合物可以包含一种或多种另外的酶，包括但不限于氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、内切葡聚糖酶、异淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶，并且进一步包含其他纤维素酶，如酸和/或中性纤维素酶。在一些实施方案中，组合物包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶，并且进一步包含酸性、中性和/或碱性蛋白酶。在另一个实施方案中，组合物包含根据本发明的内切葡聚糖酶变体和酶混合物，所述酶混合物包括α-淀粉酶、蛋白酶、肽酶、脂肪酶、纤维素、胰酶等。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶，并且进一步包含不一定全部由相同宿主产生的其他大分子(例如，其他酶如内切葡聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶和/或氧化酶，如漆酶和过氧化物酶)或可以增强所期望的酶组合物的性能、稳定性或缓冲性的化学物。
在一些实施方案中，包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶的组合物进一步包含表面活性剂，其可以是阴离子、非离子、阳离子、两性或这些类型的混合物，特别是当用作洗涤剂组合物时。有用的洗涤剂组合物描述于，例如WO94/07998、美国专利号5,443,750和美国专利号3,664,961中，其全部通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，可以根据常规条件，如提取、沉淀、色谱、亲和色谱、电泳等，进一步纯化期望的酶。
F.内切葡聚糖酶变体的配制剂
在一些实施方案中，可以根据本领域已知的方法制备组合物，并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以是颗粒或微粒的形式。在一些实施方案中，可以将无尘颗粒包衣。可以根据本领域已知的方法来稳定本发明的(变体)内切葡聚糖酶，例如，可以根据已建立的方法通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，或氯化钠来稳定液体酶组合物。(参见美国专利号7,256,032，通过引用以其整体并入)。可以如EP 238,216中所述制备酶组合物的保护形式，其通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，本发明的酶组合物(即多肽组合物)可以为任何适合于使用的形式，如例如，除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或没有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物或宿主细胞作为酶的来源。
在一些实施方案中，酶组合物可以是干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定液体或稳定的受保护的酶。例如，液体酶组合物可以根据已建立的方法通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇和/或乳酸或另一种有机酸来稳定。
在一些实施方案中，本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件可以基于本领域已知的方法确定。
G.生产方法
本发明还涉及生产内切葡聚糖酶变体的方法，其包括：(a)在适合于表达内切葡聚糖酶变体多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)任选地回收内切葡聚糖酶变体多肽。
使用本领域已知的方法在适于产生内切葡聚糖酶变体多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或在合适的培养基中和在允许变体表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞。使用本领域已知的规程在含有碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生培养。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若将内切葡聚糖酶变体多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收内切葡聚糖酶变体多肽。若不分泌变体，则可以从细胞裂解物中回收它。
可以使用本领域已知的对变体特异的方法来检测内切葡聚糖酶变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定法来测定内切葡聚糖酶变体多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法回收内切葡聚糖酶变体多肽。例如，可以通过包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规规程从营养培养基中回收内切葡聚糖酶变体多肽。
可以通过本领域已知的多种规程纯化变体，所述规程包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳规程(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification，Janson和Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)以获得基本上纯的变体。
在备选的方面，不回收变体，而是使用表达变体的本发明的宿主细胞作为变体的来源。
H.使用内切葡聚糖酶变体的方法
本发明的内切葡聚糖酶具有有价值的特性，允许用于多种工业应用，如在纺织、洗涤剂以及纸浆和造纸工业中。本发明的新的(变体)内切葡聚糖酶具有在酸性和中性pH值下具有活性的优点，它们在纺织品生物石磨和生物整理应用以及洗涤剂和其他应用中具有高度改善的性能。
随着本发明的内切葡聚糖酶效率的改善，酶的使用明显更经济。当需要较少量的酶产品时，在酶产品的物流和储存方面也获得了其他优势。此外，本发明的新的内切葡聚糖酶作用更快，提供了时间和成本有效的处理规程并节省了设备和处理设施。
在一些实施方案中，可以基于本领域已知的方法来确定本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
1.纺织工业中
本发明的(变体)内切葡聚糖酶具有广泛的纺织品应用。例如，用粗斜纹棉布制成的织物或衣服(如牛仔裤)是世界上最受欢迎的服装之一。传统上，“石洗外观”是通过使用将浮石添加到洗涤桶中以磨损衣服的过程局部去除靛蓝染料而实现的。粗斜纹棉布上这种传统的“石洗”整理实际上损坏了机器，并造成了废水污染。称为生物石磨的新的环保工艺使用酶来对粗斜纹棉布进行洗涤/生物石磨，产生受损外观，而不损害机器或环境。粗斜纹棉布的生物石磨可以节省成本并改善质量，并且被许多粗斜纹棉布制造商所使用(请参阅Agrawalet al.,Current Trends in Biomedical Engineering&Biosciences.2017.3(3):1-3，在此通过引用以其整体并入)。
本发明的(变体)内切葡聚糖酶在产生“石洗外观”或“磨损外观”方面表现出高效率，并且在含纤维素的纺织材料，特别是粗斜纹棉布的生物石磨处理中使回染最小化。在一些实施方案中，本发明提供了生物石磨的方法，其包括使如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶与含棉的织物或衣服如粗斜纹棉布接触的步骤。
在棉织物中，细毛(微纤维)从表面出现，在加工期间可能缠结，从而形成球粒。酶削弱从表面上升的微纤维和处理的剪切力，然后将其去除(美国专利号7,256,032，在此通过引用以其整体并入)。本发明的(变体)内切葡聚糖酶特别在纺织工业中用于织物或衣服的生物整理，例如去球粒、去细毛、澄清颜色、降低粗糙度、产生不同的饰面(例如桃皮(peach skin)、破旧、砂洗(sand washed)或水洗或仿古(antique look)效果)和用于纱线的生物整理，例如减少毛羽并改善光滑度和/或柔软度。
在一些实施方案中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶在生物整理过程中表现出高效率以使纺织材料去球粒、去细毛或降低粗糙度。在一些实施方案中，本发明提供了生物整理的方法，其包括使如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶与纺织材料，如织物、衣服、纱线等接触的步骤。
2.洗涤剂工业中
本发明的(变体)内切葡聚糖酶的另外的用途包括其在洗涤剂组合物中的用途，以通过抗起球、抗泛灰、颜色澄清和软化来改善织物护理特性，并改善织物的清洁效果，例如去除污垢。在一些实施方案中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以用于在洗涤剂工业中增亮颜色并防止泛灰和起球。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物。在另外的实施方案中，本发明提供了包含本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物，并且其进一步包含至少一种表面活性剂和任选地至少一种辅助成分。表面活性剂包括但不限于阴离子、非离子、阳离子和两性表面活性剂。其他辅助成分包括但不限于助洗剂、抗再沉积和污垢悬浮剂、荧光增白剂、漂白剂、染料和颜料以及水解酶。在美国专利号5,433,750(在此通过引用以其整体并入)中给出了合适的洗涤剂的含量的列表。在美国专利号3,664,961(在此通过引用以其整体并入)中给出了合适的表面活性剂的列表。有用的洗涤剂组合物描述于，例如WO94/07998、美国专利号5,443,750和美国专利号3,664,961中，其全部通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，本发明提供了处理含纤维素纤维的纺织材料的方法，其包括使所述纺织材料与包含如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物接触。
3.纸浆和造纸工业中
在纸浆和造纸工业中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以用于例如使具有中性或碱性pH的不同再生纸和纸板的纤维脱墨或改性，以改善纤维质量或增加纸张制造的排水。如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的用途的其他实例包括在纺织品印花之后去除印花浆料增稠剂和过量的染料，以及作为动物饲料的处理。例如，如果意图的应用是改善机械纸浆的强度，则本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以提供一种或多种这些蛋白质以增强或促进纤维素纤维结合在一起的能力。以类似的方式，在纸浆精制的应用中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以增强或促进此类溶胀的水平提供一种或多种这些蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶用于脱墨以从纤维表面释放墨并且用于改善纸浆和造纸工业中的纸浆排出。
在一些实施方案中，本发明提供了处理木材衍生的纸浆或纤维的方法，其包括使如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶与木材衍生的机械或化学纸浆或次级纤维接触的步骤。
VI.实施例
实施例1：内切葡聚糖酶基因合成和克隆
基于生物信息学分析选择了26种新的内切葡聚糖酶，并由GeneWiz(https://www.genewiz.com/en/)合成。将合成的基因克隆到pESC-URA载体(Agilent Technologies,Santa Clara,California,目录号217454)中。
实施例2：在微量滴定板中制备由酿酒酵母产生的内切葡聚糖酶
将来自单个菌落的含有编码重组内切葡聚糖酶的基因的酿酒酵母INSCV1菌株(ThermoFisher Scientific,USA:目录号V8251-20)接种到96孔板的各个孔中，所述孔含有300μl具有2％葡萄糖且不补充尿嘧啶的合成最低限度培养基(SC)。培养物在30℃，200rpm和85％湿度下生长过夜。将获得OD600为0.4所需的每个孔的适当过夜培养物的体积添加到含有350μl的诱导培养基(含2％半乳糖的SC选择性培养基)的新96孔板的相应孔中。然后将板在30℃，250rpm和85％湿度下温育48小时。然后在4℃下以4000rpm离心10分钟使细胞沉淀。将上清液转移至圆底板，并在活性测定法之前储存在-20℃。基于本文的规程，总共生长了26种内切葡聚糖酶候选物。
实施例3：评估酿酒酵母产生的内切葡聚糖酶活性的CMC测定法
在PCR板中，添加50μL的溶于100mM乙酸钠，pH5.5缓冲液(目录号C5678)的1.8％低粘度CMC。然后将10μL的上清液酶添加到相同的板中，并在台式摇床上摇动约1分钟。将板在50℃下温育30分钟。30分钟后，以4,000rpm将板离心2分钟。向板中添加90μL的DNS溶液并密封板。将板放入Thermocycler，并选择“95DNS”程序，其不带加热盖选项。“95DNS”程序设置：在95℃下5分钟，并冷却至4℃ 2分钟。温育后，将板翻转几次，然后以4,000rpm将板离心3分钟。向透明底板中加入100μL的水，并转移100μL的DNS反应物。摇动板并在540nm处读数用于活性。根据本文中的规程，总共评估了25种内切葡聚糖酶候选物，结果如图1中所示。
鉴定出一种新的内切葡聚糖酶，即来自Aspergillus lentulus的CL00066590(登录号A0A0S7DSS1，标注为EG185)，其具有高活性，并被选择用于进一步改善。基于其与CL00066590的紧密％序列同一性，还选择了另一种内切葡聚糖酶，来自宇田川曲霉的CL00078795(登录号A0A0K8LET0，标注为EG140)以进行进一步改善。EG140和EG185的序列比对如图2中所示。EG140和EG185彼此90％相同。
实施例4：EG140和EG185变体集合的设计和构建
起始的野生型内切葡聚糖酶EG140和EG185用作第1代改善的亲本(G1P)。最佳的EG140 G1变体用作第2代改善的亲本(G2P)。最佳的EG140 G2变体用作第3代改善的亲本(G3P)。为了改善内切葡聚糖酶在生物石磨相关条件下(如50℃，pH6.5)的活性和稳定性，基于蛋白质序列、计算模型和实验确定的突变概况，针对EG140第1-3代改善和EG185第1代改善设计了多个变体集合。该设计包括每变体一个至多个特定突变。使用标准的定点诱变方法构建变体集合，并随后将其克隆到pESC-URA载体(Agilent Technologies,Santa Clara,California,目录号217454)中。
实施例5：在微量滴定板中制备由酿酒酵母产生的EG140和EG185变体
将来自单个菌落的含有编码重组内切葡聚糖酶的基因的酿酒酵母INSCV1菌株(ThermoFisher Scientific,USA:目录号V8251-20)接种到96孔板的各个孔中，所述孔含有300μl具有2％葡萄糖且不补充尿嘧啶的合成最低限度培养基(SC)。培养物在30℃，200rpm和85％湿度下生长过夜。将获得OD600为0.4所需的每个孔的适当过夜培养物的体积添加到含有350μl的诱导培养基(含2％半乳糖的SC选择性培养基)的新96孔板的相应孔中。然后将板在30℃，250rpm和85％湿度下温育48小时。然后在4℃下以4000rpm离心10分钟使细胞沉淀。将上清液转移至圆底板，并在HTP筛选之前储存在-20℃。
实施例6：在50℃，pH4.5和pH6.5下对EG140变体的HTP筛选
在以下条件下筛选所有EG140变体。使用100mM乙酸钠，pH4.5或100mM磷酸盐缓冲液，pH6.5将上清液稀释至3x。在PCR板中，加入50μL的1.6％低粘度CMC(目录号C5678)。将10μL经稀释的上清液酶添加到相同的板中，并在台式摇床上摇动约1分钟。将板在50℃下温育3小时。3小时后，以4,000rpm将板离心2分钟。向板中添加90μL的DNS溶液并密封板。将板放入Thermocycler，并选择“95DNS”程序，其不带加热盖选项。“95DNS”程序设置：在95℃下5分钟，并冷却至4℃ 2分钟。温育后，将板翻转几次，然后以4,000rpm将板离心3分钟。向透明底板中加入100μL的水，并转移100μL的DNS反应物。摇动板并在540nm处读数用于活性。
经鉴定具有改善的总活性和对pH 6.5的耐受性的G1、G2和G3变体分别显示在图3、4和5中。
实施例7：在50℃，pH4.5和pH6.5下对EG185变体的HTP筛选
在以下条件下筛选所有EG185变体以进行1级分析。使用100mM乙酸钠，pH4.5或100mM磷酸盐缓冲液，pH6.5将上清液稀释至3x。在PCR板中，加入50μL的1.6％低粘度CMC(目录号C5678)。将10μL经稀释的上清液酶添加到相同的板中，并在台式摇床上摇动约1分钟。将板在50℃下温育3小时。3小时后，以4,000rpm将板离心2分钟。向板中添加90μL的DNS溶液并密封板。将板放入Thermocycler，并选择“95DNS”程序，其不带加热盖选项。“95DNS”程序设置：在95℃下5分钟，并冷却至4℃ 2分钟。温育后，将板翻转几次，然后以4,000rpm将板离心3分钟。向透明底板中加入100μL的水，并转移100μL的DNS反应物。摇动板并在540nm处读数用于活性。
经鉴定具有改善的总活性和对pH 6.5的耐受性的G1变体显示在图6中。
提供上述实施例是为了给本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和描述，并不旨在限制发明人认为其发明的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的，用于实施本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。说明书中提到的所有专利和出版物指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用的方式并入，就如同每个参考文献已单独通过引用以其整体并入。
所有标题和部分名称仅出于清楚和参考目的而使用，并且不应被视为以任何方式进行限制。例如，本领域技术人员将认识到根据本文描述的本发明的精神和范围适当组合来自不同标题和部分的各个方面的有用性。
本文所引用的所有参考文献均在此通过引用以其整体并入本文，并且就所有目的而言，其程度与表明每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地出于所有目的通过引用以其整体并入相同。
如本领域技术人员将显而易见的，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出本申请的许多修改和变型。本文所述的特定实施方案和实施例仅通过示例的方式提供。
序列表
<110> 福尼亚生物处理股份有限公司
<120> 内切葡聚糖酶组合物和方法
<130> 114095-5009
<150> US 62/793,065
<151> 2019-01-16
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成内切葡聚糖酶 (野生型, CL00078795 EG140 G1P)
<400> 1
Gln Thr Leu Cys Asn Gln Tyr Gly Thr Tyr Ser Asn Gly Arg Tyr Thr
1 5 10 15
Val Asn Asn Asn Leu Trp Gly Gln Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gln Cys
20 25 30
Thr Tyr Val Asp Ser Ile Ser Asn Ser Gly Val Ala Trp His Thr Thr
35 40 45
Trp Thr Trp Ser Gly Gly Asp Asn Gln Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ser
50 55 60
Gln Val Ala Leu Thr Lys Lys His Val Ser Gln Ile Gly Ser Ile Pro
65 70 75 80
Thr Thr Val Gln Trp Ser Tyr Asp Asn Thr Asn Ile Arg Ala Asp Val
85 90 95
Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Ile Asn His Val Thr Tyr Ser
100 105 110
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Gly Val Gln
115 120 125
Pro Ile Gly Ser Arg Ile Gly Thr Ala Asn Ile Ala Gly His Thr Trp
130 135 140
Glu Leu Trp Tyr Gly Gly Ser Thr Gln Lys Thr Tyr Ser Phe Val Ser
145 150 155 160
Ala Thr Pro Ile Thr Ser Phe Ser Gly Asp Val Met Asp Phe Trp Arg
165 170 175
Tyr Leu Thr Asn Asn His Gly Tyr Pro Ala Ser Ser Gln Tyr Leu Ile
180 185 190
Asn Met Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly Arg Ala Thr Met
195 200 205
Lys Val Ser Lys Phe Thr Ala Ser Val Asn
210 215
<210> 2
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成内切葡聚糖酶 (野生型, CL00078795 EG140 G1P)
<400> 2
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ctctggggtc agggctccgg ctccggctcc caatgcacct acgttgatag catctccaac 120
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<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00085835 EG185 G1V2)
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<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00085835 EG185 G1V2)
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<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00098799 EG140 G1V4 G2P)
<400> 19
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<220>
<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00098799 EG140 G1V4 G2P)
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tacgccaact cgcaggtcgc ccttaccaag aagcatgtca gccagatcgg cagtatccca 240
accaccgtgc agtggagcta cgataacacc aacattcgtg cggacgtagc gtacgatctg 300
ttcacagctg cggatatcaa ccatgtaacc tacagcgggg attatgaact gatgatttgg 360
ctcgcccgct acggtggcgt ccagcccatc ggctcgcgga ttggcactgc caatattgcc 420
ggccatacgt gggagctgtg gtacggcggc agtacccaga agacgtacag ctttgtctct 480
gccaccccga tcacctcatt cagtggagat gtcatggact tttggcgcta tctgaccaac 540
aaccatggct accctgcttc gagccagtac ctgatcaata tgcaattcgg gactgagccg 600
ttcactggcg gtcctgccac catgaaagtg tcgaagttca ctgccagtgt aaactaatag 660
<210> 21
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00111817 EG140 G2V1 G3P)
<400> 21
Gln Thr Leu Cys Asn Gln Tyr Gly Thr Tyr Ser Glu Gly Arg Tyr Thr
1 5 10 15
Val Asn Asn Asn Leu Trp Gly Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Cys
20 25 30
Thr Tyr Val Asp Ser Ile Ser Asn Ser Gly Val Ala Trp His Thr Thr
35 40 45
Trp Thr Trp Ser Gly Gly Pro Asn Gln Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ser
50 55 60
Gln Val Ala Leu Thr Lys Lys His Val Ser Gln Ile Gly Ser Ile Pro
65 70 75 80
Thr Thr Val Gln Trp Ser Tyr Asp Asn Thr Asn Ile Arg Ala Asp Val
85 90 95
Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Ile Asn His Val Thr Tyr Ser
100 105 110
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Thr Val Gln
115 120 125
Pro Ile Gly Ser Arg Ile Gly Tyr Ala Asn Ile Ala Gly His Thr Trp
130 135 140
Glu Leu Trp Tyr Gly Gly Ser Thr Gln Lys Thr Tyr Ser Phe Val Ser
145 150 155 160
Ala Thr Pro Ile Thr Ser Phe Ser Gly Asp Val Met Asp Phe Trp Arg
165 170 175
Tyr Leu Thr Asn Asn His Gly Tyr Pro Ala Ser Ser Gln Tyr Leu Ile
180 185 190
Asn Met Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly Pro Ala Glu Met
195 200 205
Lys Val Ser Lys Phe Thr Ala Ser Val Asn
210 215
<210> 22
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00111817 EG140 G2V1 G3P)
<400> 22
caaaccctct gtaaccagta tggcacctac agcgaaggcc ggtatacagt caacaacaac 60
ctctggggtc agtcctccgg ctccggctcc caatgcacct acgttgatag catctccaac 120
tccggcgtgg cgtggcacac gacctggacg tggtctggcg gccctaacca ggtcaagagc 180
tacgccaact cgcaggtcgc ccttaccaag aagcatgtca gccagatcgg cagtatccca 240
accaccgtgc agtggagcta cgataacacc aacattcgtg cggacgtagc gtacgatctg 300
ttcacagctg cggatatcaa ccatgtaacc tacagcgggg attatgaact gatgatttgg 360
ctcgcccgct acggtaccgt ccagcccatc ggctcgcgga ttggctatgc caatattgcc 420
ggccatacgt gggagctgtg gtacggcggc agtacccaga agacgtacag ctttgtctct 480
gccaccccga tcacctcatt cagtggagat gtcatggact tttggcgcta tctgaccaac 540
aaccatggct accctgcttc gagccagtac ctgatcaata tgcaattcgg gactgagccg 600
ttcactggcg gtcctgccga aatgaaagtg tcgaagttca ctgccagtgt aaactaatag 660
<210> 23
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00118596 EG140 G3V1 G4P)
<400> 23
Gln Thr Leu Cys Asn Gln Tyr Gly Thr Tyr Ser Glu Gly Arg Tyr Thr
1 5 10 15
Val Asn Asn Asn Leu Trp Gly Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Cys
20 25 30
Thr Tyr Val Asp Ser Ile Ser Asn Ser Gly Val Ala Trp His Thr Thr
35 40 45
Trp Thr Trp Ser Gly Gly Pro Asn Gln Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ser
50 55 60
Gln Val Ala Leu Thr Lys Lys His Val Ser Gln Ile Gly Ser Ile Pro
65 70 75 80
Thr Thr Val Gln Trp Ser Tyr Asp Asn Thr Asn Ile Arg Ala Asp Val
85 90 95
Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Ile Asn His Val Thr Tyr Ser
100 105 110
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Thr Val Gln
115 120 125
Pro Ile Gly Ser Arg Ile Gly Tyr Ala Asn Ile Ala Gly His Thr Trp
130 135 140
Glu Leu Trp Tyr Gly Gly Ser Thr Gln Lys Thr Tyr Ser Phe Val Ser
145 150 155 160
Ala Thr Pro Ile Thr Ser Phe Ser Gly Asp Val Met Asp Phe Trp Arg
165 170 175
Tyr Leu Thr Asn Asn His Gly Tyr Pro Ala Ser Ser Gln Tyr Leu Ile
180 185 190
Asn Met Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly Pro Ala Glu Met
195 200 205
Lys Val Ser Asn Phe Thr Ala Ser Val Asn
210 215
<210> 24
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成内切葡聚糖酶 (CL00118596 EG140 G3V1 G4P)
<400> 24
caaaccctct gtaaccagta tggcacctac agcgaaggcc ggtatacagt caacaacaac 60
ctctggggtc agtcctccgg ctccggctcc caatgcacct acgttgatag catctccaac 120
tccggcgtgg cgtggcacac gacctggacg tggtctggcg gccctaacca ggtcaagagc 180
tacgccaact cgcaggtcgc ccttaccaag aagcatgtca gccagatcgg cagtatccca 240
accaccgtgc agtggagcta cgataacacc aacattcgtg cggacgtagc gtacgatctg 300
ttcacagctg cggatatcaa ccatgtaacc tacagcgggg attatgaact gatgatttgg 360
ctcgcccgct acggtaccgt ccagcccatc ggctcgcgga ttggctatgc caatattgcc 420
ggccatacgt gggagctgtg gtacggcggc agtacccaga agacgtacag ctttgtctct 480
gccaccccga tcacctcatt cagtggagat gtcatggact tttggcgcta tctgaccaac 540
aaccatggct accctgcttc gagccagtac ctgatcaata tgcaattcgg gactgagccg 600
ttcactggcg gtcctgccga aatgaaagtg tcgaacttca ctgccagtgt aaactaatag 660
Claims (64)
1.包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：K212N、N12S、G25D、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、G25S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E、K212E和N218S，其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体具有内切葡聚糖酶活性。
2.权利要求1的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：G25D/A161G/M172K/H182Q/M194L/K212N、N12S/G25D/Q65G/S160A/A161G/V171I/Y184F/M194L/K212N、G25D/N138T/V171I/W175F/H182Q/Y184F、G25D/N138T/I139V/M194L、H182Q/K212N、G25D/A161G/T214S、N12S/G25D/A161G/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、G25D/N138T/H182Q/K212N、N12S/G25D/A44S/I139V、G25D/N138T/K212N、G25D/V171I/W175F/M194L/K212N、G25D/A161G/K212N、V171I/Y184F、G25D/A44S/A161G、G25D/M172K/H182Q、G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N、G25D/V171I/M172K/H182Q/M194L、H182Q/M194L、G25D/K212N、N12S/G25D/N138T/A161G/K212N、G25D/H182Q/Y184F/M194L/K212N、N12S/G25D/N40S/I139V/V171I/M172K/H182Q/Y184F/M194L/K212N/T214S、N12S/G25D/H182Q/K212N、G25D/N40S/A44S/N138T/A161G/V171I/W175F/Y184F/M194L/K212N、N12S/N40S/Y184F/T214S、N12S/G25D/A44S/Q65G、G25D/A161G/M194L/T214S、A44S/N138T/I139V/V171I/H182Q/Y184F/M194L/K212N、G25D/Y184F/M194L/K212N、N12S/G13P/D55P/M172K/R205P/K212N、N12S/G25D/D55P/V171I/M172K/S187P、G25D/S187P、G13P/G25D/D55P/A161P/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P、N12S/R133P/A161P/V171I/S187P/K212N、N12S/G25D、G13P/G25D/D55P/V171I/S187P/R205P、G13P/G25D/V171I/M172K/S187P/R205P/K212N、G25D/D55P/R205P、G25D/V171I/M172K、G25D/R133P、N12S/G25D/V171I/M172K、N12S/G25D/H182Q/R205P、N12S/G25D/A161P/S187P/K212N、G25D/D55P/V171I/M172K/R205P、D55P/R205P、N12S/R205P、N12S/G25D/T69P/R133P/V171I/M172K/R205P/K212N、T179Y/R205Y、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126S/T136Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/P80G/G126I/T136M/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/T165Y/T179L/R205P、N12E/G25S/D55P/P80G/G126T/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/G126N/T136Y/T165Y/T179Y/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/P80G/G126R/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126T/T165Y/R205P、N12E/G25S/D55I/G126K/T165D/R205P、N12E/G25S/D55P/G126I/T136Y/R205P、G25D/D55P/G126K/T136Y/T179Y/N181S/R205P、N12E/G25D/D55I/G126R/R205P、N12E/G25S/D55P/G126N/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/P80G/E145A/R205P/T207E、G25D/D55P/T136Y/T165Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126R/T136Y/T165Y/R205P、N12E/G25D/D55P/P80G/R205P、G25D/D55I/G126K/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126R/R205P/T207E、G25D/D55P/G126T/T136Y/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55P/G126N/R205P、N12E/G25D/D55P/G126K/R205P、N12E/G25D/D55P/T165D/R205Y、N12E/G25D/D55I/P80G/G126R/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126K/T165D/R205P、G25D/D55P/G126V/T136Y/R205P/T207E、G25D/D55P/T179L/N181S/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/T165Y/R205P/N218S、N12E/G25D/D55I/G126V/T136M/R205P/N218S、G25S/D55P/G126R/T136M/E145A/R205P、N12E/G25D/D55I/G126T/T136M/R205Y、N12E/G25S/D55P/G126V/E145A/T179Y/R205P、N12E/G25S/D55P/G126T/T165Y/R205P、G25S/D55P/G126R/R205P/N218S、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55I/G126R/T136M/T165Y/R205P/T207E/N218S、N12E/G25S/D55P/G126S/T136M/T165Y/R205Y、N12D/G25D/D55P/S86A/E145M/I164T/D173P/R205P/T207E、N12E/G25D/A44D/D55P/S86H/Q128F/R205P、G25S/D55P/G126I/D173N/R205P/T207E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/T152Q/R176H/S187N/R205P/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/Q128R/E145A/D173E/R205P、N12D/G25D/A44D/D55P/S86A/E145A/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/T136Y/G169T/R176H/R205P/K212E、N12E/G25D/D55P/S86Q/A104D/G126T/E145A/D173E/R205P/K212E、G25D/A44D/D55P/I164T/R205P、N12T/G25D/D55P/S86A/A104D/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E/N218S、N12D/G25D/D55P/P80G/S86A/Q128R/I164T/D173E/R205P/K212E、N12D/G25S/D55P/Q128R/T165Y/R176H/R205P/K212E、N12G/G25D/A44D/D55P/Q128R/I164T/D173E/R205P、N12T/G25D/D55P/G126K/E145A/T165D/D173E/R205P、G25D/A44D/D55P/Q128R/R205P/T207E、G25S/D55P/G126S/T165D/G169S/T179Y/R205P/K212E、G25S/A44D/D55P/P80G/S86A/G126K/Q128R/R205P/K212E、G25S/D55P/P80G/G126T/R205P、N12T/G25D/D55I/P80G/G126S/T152Q/S187N/R205P、G25S/D55P/G126K/T136R/T152Q/R176H/T179Y/R205P/K212E、G25D/D55P/G126T/T165Y/R176H/R205P、N12D/G25D/D55P/S86Q/A104D/E145A/R205P/T207E/N218S、G25D/A44D/D55P/A104D/Q128R/E145A/T165D/R176H/R205P/K212E、G25D/D55P/R205P/K212N、N12E/G25S/D55R/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/V17I/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/V35I/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/V127I/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/G42S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/Y124F/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/S78T/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R176H/S187N/R205P/T207E、N12T/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12D/G25S/D55P/S86Q/G126T/T136Y/T165Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25S/S28N/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/S39Y/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N、N12T/G25S/A44D/D55P/S86Q/G126N/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136M/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/A104D/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12T/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/R176H/S187N/R205P/T207E/K212E、N12D/G25S/A44D/D55P/S86Q/A104D/G126T/T136Y/R205P/T207E、N12E/G25D/D55P/S86Q/G126T/T136M/D173L/R176H/R205P/T207E、N12D/G25D/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E/K212E、N12E/G25D/A44D/D55P/G126S/T136Y/S187N/R205P/T207E、N12D/G25D/A44D/D55P/G126T/T136Y/S187N/R205P/T207E和N12D/G25D/A44D/D55P/S86Q/G126K/T136Y/D173E/R176H/S187N/R205P/T207E。
3.根据权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与选自下组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N。
5.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是G25D/K212N。
6.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是N12S/G25D/H182Q/K212N。
7.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是G25D/D55P/R205P。
8.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E。
9.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N。
10.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其包含氨基酸取代G25D/A44S/V171I/M172K/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N12S、N40S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、W175F、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
11.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其包含氨基酸取代G25D/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
12.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其包含氨基酸取代N12S/G25D/H182Q/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、Y184F、M194L、T214S、A44D、D55I、D55P、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、R205P、R205Y、T207E和N218S。
13.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其包含氨基酸取代G25D/D55P/R205P，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：K212N、N12S、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、N12D、N12E、N12G、N12T、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、G126I、G126K、G126N、G126R、G126S、G126T、G126V、Q128F、Q128R、T136M、T136R、T136Y、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、T207E、K212E和N218S。
14.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其包含氨基酸取代N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：K212N、N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N、K212E和N218S。
15.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其包含氨基酸取代N12E/G25S/D55P/G126T/T136Y/R205P/T207E/K212N，并且进一步包含至少一个选自下组的氨基酸取代：N40S、A44S、Q65G、N138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L、T214S、A44D、P80G、S86A、S86H、S86Q、A104D、Q128F、Q128R、E145A、E145M、T152Q、I164T、T165D、T165Y、G169S、G169T、D173E、D173N、D173P、R176H、T179L、T179Y、N181S、S187N和N218S。
16.包含内切葡聚糖酶变体的组合物，所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S、R14P、S25D、N40S、G44S、Q65G、T92I、S138T、I139V、S160A、A161G、V171I、M172K、W175F、H182Q、Y184F、M194L和Q212N，其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:9具有至少95％序列同一性；并且其中所述内切葡聚糖酶变体具有内切葡聚糖酶活性。
17.权利要求16的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：N12S/R14P/S25D/T92I、T92I/Y184F、R14P/S25D/T92I/S138T/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F/Q212N、N12S/I139V、T92I/I139V/H182Q/Y184F、N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/V171I/Y184F、N12S/S138T/I139V/A161G/M172K/W175F/H182Q/Y184F、S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/S160A/Y184F、N12S/S25D/N40S/G44S/S138T/I139V/H182Q、N12S/R14P/S25D/Q65G/V171I/M172K/W175F/H182Q/Y184F、N12S/R14P/S25D/G44S/T92I/S138T/I139V/S160A/A161G/W175F、S160A/Q212N、N12S/R14P/S25D/S138T/A161G/Y184F、R14P/T92I/A161G/V171I/W175F/Y184F、T92I/A161G/H182Q/Y184F、R14P/A161G/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K、N12S/A161G/H182Q/Y184F、N12S/R14P/T92I/A161G/V171I/Y184F、S25D/N40S/T92I/S138T/S160A/A161G/V171I/H182Q/Y184F、R14P/S25D/N40S/G44S、Y184F、N12S/R14P/S25D/T92I/S138T/A161G、N12S/R14P/G44S/T92I/M194L、R14P/S25D/N40S/S138T/Q212N、N12S/S25D/N40S/G44S/Q65G、S25D/G44S/S138T/I139V、S25D/H182Q、R14P/S25D/G44S、N12S/S25D/N40S/G44S/T92I/M172K/H182Q/Q212N、R14P/S25D/N40S/G44S/A161G/V171I/Y184F、N12S/R14P/S25D/A161G/M172K/W175F/Y184F和N12S/R14P/S25D/N40S/G44S/T92I/I139V。
18.根据权利要求16或权利要求17的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性。
19.根据权利要求16-18中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是N12S/S25D/T92I/M172K/Y184F/M194L。
20.根据权利要求16-18中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是S25D/Q65G/T92I/H182Q/Y184F/M194L/Q212N。
21.根据权利要求16-18中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代是R14P/S25D/N40S/G44S/S160A/A161G/M172K。
22.核酸，其编码权利要求1-21中任一项的所述内切葡聚糖酶变体。
23.权利要求22的核酸，其中针对宿主生物体对所述核酸进行密码子优化以在所述生物体中表达所述内切葡聚糖酶变体。
24.权利要求22或权利要求23的核酸，其包含与选自下组的序列具有至少70％序列同一性的序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。
25.权利要求22-24中任一项的核酸，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:16。
26.表达载体，其包含权利要求22-25中任一项的核酸。
27.宿主细胞，其包含权利要求22-25中任一项的核酸。
28.宿主细胞，其包含权利要求26的表达载体。
29.权利要求27或权利要求28的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
30.制备内切葡聚糖酶变体的方法，其包括：a)在其中表达所述内切葡聚糖酶变体的条件下培养权利要求27-29中任一项的宿主细胞；和b)回收所述内切葡聚糖酶变体。
31.编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中所述成熟蛋白质是权利要求1-21中任一项的内切葡聚糖酶变体。
32.权利要求31的核酸，其中所述信号肽具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
33.权利要求31的核酸，其中所述信号肽是外源的。
34.表达载体，其包含权利要求31-33中任一项的核酸。
35.宿主细胞，其包含权利要求31-33中任一项的核酸。
36.宿主细胞，其包含权利要求34的表达载体。
37.权利要求35或权利要求36的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
38.制备内切葡聚糖酶变体的方法，其包括：a)在其中表达所述内切葡聚糖酶变体的条件下培养权利要求35-37中任一项的宿主细胞；和b)回收所述内切葡聚糖酶变体。
39.核酸构建体，其包含与外源构建体序列可操作地连接的编码SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:9的核酸。
40.权利要求39的核酸构建体，其中所述外源构建体序列是外源启动子。
41.权利要求39或权利要求40的核酸构建体，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:10的序列。
42.表达载体，其包含权利要求39-41中任一项的核酸构建体。
43.宿主细胞，其包含权利要求39-41中任一项的核酸构建体。
44.宿主细胞，其包含权利要求42的表达载体。
45.权利要求43或权利要求44的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
46.制备内切葡聚糖酶的方法，其包括：a)在其中表达所述内切葡聚糖酶的条件下培养权利要求43-45中任一项的宿主细胞；和b)回收所述内切葡聚糖酶。
47.编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白与外源启动子可操作地连接，并且其中所述成熟蛋白质具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9。
48.权利要求47的核酸，其中所述信号肽具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
49.权利要求47或权利要求48的核酸，其中所述成熟蛋白质具有SEQ ID NO:1，并且所述信号肽具有SEQ ID NO:17。
50.权利要求47或权利要求48的核酸，其中所述成熟蛋白质具有SEQ ID NO:9，并且所述信号肽具有SEQ ID NO:18。
51.权利要求47的核酸，其中所述信号肽是外源的。
52.表达载体，其包含权利要求47-51中任一项的核酸。
53.宿主细胞，其包含权利要求47-51中任一项的核酸。
54.宿主细胞，其包含权利要求52的表达载体。
55.权利要求53或权利要求54的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
56.制备内切葡聚糖酶的方法，其包括：a)在其中表达所述内切葡聚糖酶的条件下培养权利要求53-55中任一项的宿主细胞；和b)回收所述内切葡聚糖酶。
57.生物石磨(biostoning)的方法，其包括使权利要求1-21中任一项的内切葡聚糖酶与含棉织物或衣服接触的步骤。
58.根据权利要求57的生物石磨的方法，其中所述含棉织物或衣服是粗斜纹棉布(denim)。
59.生物整理(biofinishing)的方法，其包括使权利要求1-21中任一项的内切葡聚糖酶与纺织材料接触的步骤。
60.根据权利要求59的生物整理的方法，其中所述纺织材料选自下组：织物、衣服和纱线。
61.洗涤剂组合物，其包含权利要求1-21中任一项的内切葡聚糖酶。
62.权利要求61的洗涤剂组合物，其进一步包含至少一种表面活性剂和任选地至少一种辅助成分。
63.处理含有纤维素纤维的纺织材料的方法，其包括使所述纺织材料与权利要求61或权利要求62的洗涤剂组合物接触。
64.处理木材衍生的纸浆或纤维的方法，其包括使权利要求1-21中任一项的内切葡聚糖酶与木材衍生的机械或化学纸浆或次级纤维接触的步骤。
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