CN113151235A - 一种重组l-阿拉伯糖异构酶lpai及其构建方法和应用 - Google Patents

一种重组l-阿拉伯糖异构酶lpai及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组L‑阿拉伯糖异构酶LPAI及其构建方法和应用。在本发明中，利用基因工程手段，构建了重组L‑阿拉伯糖异构酶LPAI；所述重组L‑阿拉伯糖异构酶LPAI能以D‑半乳糖为底物制备D‑塔格糖中的应用，有效解决D‑塔格糖生产过程中存在的转化效率低下、成本高昂等问题。

Description

一种重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI及其构建方法和应用。
背景技术
D-塔格糖，是一种低热量甜味剂，分子式为C6H12O6，其具有低热量、抗氧化性、抗龋齿性等一系列生理功效，被广泛应用在果汁、乳酸菌饮料、口香糖、减肥食品等食品领域的生产中。并且在医药领域，D-塔格糖还能够应用于生产咳嗽糖浆、口腔消毒剂等。然而D-塔格糖难以进行工业化大规模生产。
目前，D-塔格糖的生产主要是化学法和生物法两种。化学法主要是将D-半乳糖在可溶性碱金属盐或碱土金属盐催化剂的作用下与金属氢氧化物发生异构反应，然后用酸或者CO2与氢氧化物结合后形成碳酸钙释放D-塔格糖，再进一步纯化结晶。该方法产生的副产物多、纯化复杂且污染大，难以进行工业化生产。生物法利用L-阿拉伯糖异构酶将D-半乳糖异构化为D-塔格糖，尽管制备成本较低，但需要将Co2+和Mn2+等重金属离子作为辅助因子，生产的D-塔格糖得不到食品安全性的保障，无法作为食品药品添加剂。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI及其构建方法和应用。在本发明中，利用基因工程手段，构建了重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI，所述重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI能够有效解决D-塔格糖生产过程中存在的转化效率低下、成本高昂等问题。
本发明中首先提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
本发明中还提供编码所述重组L-阿拉伯糖异构酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示。
本发明中，还提供了上述重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的构建方法，具体包括如下步骤：
（1）重组L-阿拉伯糖异构酶重组子的构建：
PCR扩增合成目的基因araA，然后利用无缝克隆技术将目的基因整合到表达载体pANY1的多克隆位点上，将产物用化学转化法转入大肠杆菌E.coli BL21感受态中，经孵育后涂布抗性平板进行过夜培养，筛选阳性克隆子、PCR扩增验证、提取质粒验证及测序验证成功获得重组L-阿拉伯糖异构酶重组子E.coli BL21/ pANY1-araA；
（2）重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的表达和纯化：
将得到的E.coli BL21/ pANY1-araA在LB培养基里培养，然后加入诱导剂IPTG，低温低速下培养过夜，接着收集细胞经超声破碎释放重组蛋白，利用Ni2+-NTI柱纯化，获得纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI。
进一步的，步骤（1）中，所述PCR的反应参数为：预变性98℃ 3 min；变性98℃ 10s；退火55℃ 10 s；延伸72℃ 25s；终延伸72℃ 5 min；32个循环。
进一步的，步骤（2）中，所述E.coli BL21/ pANY1-araA在LB培养基里培养的条件为37 ℃、200 rpm振荡培养至OD为0.4。
进一步的，步骤（2）中，所述IPTG在培养基中的终浓度为1mM。
进一步的，步骤（2）中，所述低温低速下培养过夜为在25 ℃、120 rpm下培养过夜。
进一步的，步骤（2）中，所述Ni2+-NTI柱大小为1.0×10.0 mm。
本发明中还提供了上述重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI在以D-半乳糖为底物制备D-塔格糖中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明中，构建了E.coli BL21/ pANY1-araA重组子，实现了L-阿拉伯糖异构酶LPAI在大肠杆菌里高效表达，获得了大量的L-阿拉伯糖异构酶LPAI。
（2）本发明构建重组的L-阿拉伯糖异构酶LPAI来源于类布氏乳杆菌，其最适pH为6.7，有利于转化得到的D-塔格糖的积累，能够有效解决D-塔格糖生产过程中存在的转化效率低下、成本高昂等问题，是实现D-塔格糖工业化生产的良好酶源。
（3）本发明中所述重组的L-阿拉伯糖异构酶LPAI最佳金属辅助因子为Ca2+，能够在保证食品安全的情况下高效转化D-半乳糖为D-塔格糖。
（4）本发明所述重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI，在pH 6.7、45℃且含有3mM Ca2+的环境下能够高效的将D-半乳糖用来转化生产D-塔格糖，转化率为91%，高于目前相同功能酶。
附图说明
图1为PCR扩增类布氏乳杆菌的araA基因电泳图，其中M为marker，1和2均为扩增得到的DNA片段。
图2为重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的表达及纯化，其中1为marker，2为未添加诱导剂的样品，3为经过诱导的样品，4为经Ni2+-NTI柱纯化后的样品。
图3为不同温度下重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的酶活。
图4为不同温度下重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的热稳定性。
图5为不同pH下重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的酶活。
图6为不同pH下重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的稳定性。
图7为添加不同金属离子下重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的酶活。
图8为添加不同浓度Ca2+后重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的酶活。
图9为重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的底物特异性。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
在本发明中，实施例中所涉及的L-阿拉伯糖异构酶LPAI酶活性单位被定义为：在pH6.7和45℃下催化每分钟生成1µmol D-塔格糖的酶量。测定方法如下：以0.5M的含有3mMCa2+的pH为6.7的D-半乳糖为底物溶液，加入0.5mg的LPAI，在最佳温度45℃下反应1h后向反应混合液中加入0.5M的HCl以终止反应；取10μL反应液补加蒸馏水至1mL，加入6mL硫酸溶液后立即加入0.2mL半胱氨酸盐酸盐溶液，激烈摇匀后，加入0.2mL咔唑酒精溶液，摇匀，60℃保温10min，冷却后在560nm处测定吸光值，计算酶活力。
实施例1：重组子E.coli BL21/ pANY1-araA的构建
（1）以Genbank数据库公开的类布氏乳杆菌（Lactobacillus parabuchneri）的编码L-AI的araA基因序列（NCBI 登录号：NZ_CP029256.1）为模板，结合载体pANY1（来自沈阳农业大学）上多克隆位点及同源臂的特征，利用生物信息学Snapgene软件设计合成上游引物F:
5’- GGGGGATCCACTAGTAGGCCTATGTTACAAGTACCTGATTA-3’ 和下游引物R: 5’- CA GGAGCTCCCATGGAGGCCTCTACTTGATGTCGTCAATG-3’（下划线部分分别为StuI酶切位点，波浪线部分为与pANY1质粒同源的上下游同源臂）。
（2）以类布氏乳杆菌基因组DNA为模板，利用CWBIO Pfx高保真聚合酶（来自江苏康为世纪生物科技股份有限公司）PCR扩增目的基因araA，PCR反应参数：预变性：98℃、3 min，变性：98℃、10 s，退火：55℃、10 s，延伸：72℃、25 s，终延伸：72℃、5 min，32个循环。
（3）所得的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1500bp的电泳条带，如图1所示，将PCR产物利用产物纯化试剂盒获得纯化的araA基因。
（4）pANY1质粒经StuI酶（来自南京诺维赞生物科技股份有限公司）切线性化后利用切胶纯化获得线性化质粒，按照一步克隆试剂盒的方法将步骤3中的araA基因与线性化质粒进行重组质粒构建；通过化学转化方法将重组质粒转化于E.coli BL21（购自武汉淼灵生物科技有限公司）中，通过PCR验证、提取质粒验证以及测序验证筛选转化成功的阳性克隆子，保存并命名为E.coli BL21/pANY1-araA。
实施例2：重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的诱导表达及纯化
将重组子E.coli BL21/pANY1-araA接种于LB液体培养基(酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、氯化钠20g/L)中，37℃、200rpm振荡培养至OD为0.4左右，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导，25 ℃、150 rpm低速过夜诱导表达LPAI，利用SDS-PAGE检测DTE-CM的表达情况，以不加IPTG诱导的重组菌为空白对照，然后将表达成功的LPAI利用Ni2+-NTI柱纯化，如图2所示，泳道1是marker，泳道2是未添加诱导剂的样品，泳道3是经过诱导表的样品，泳道4是经Ni2+-NTI柱纯化后的样品，一条大小为55kDa的单一纯净的蛋白条带，保存纯酶样品，命名为LPAI，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示：
MLQVPDYEFWFVTGSQHLYGEEQLKSVEKDAKDMVDKLNASGKLPYPIVFKMVATTADSITQLMKDVNYNDKVAGIITWMHTFSPAKNWIRGTKLLQKPLLHLATQYLDHIPYDTIDFDYMNLNQSAHGDREYGFINARLQKHNKIVYGYWGDPEVQDEIADWEDVAVAYDESFKIKVARFGDNMRNVAVTEGDKVEAQIQFGWTVDYYALGDLVESVNAVSESDIDAKYKELQDKYEFVQGDNDKDKYEHSVRYQIREYFGIKNFLDKGNYSAFTTNFEDLYGLEQLPGLAAQLLMAEGYGFGAEGDWKTAALGRLVKIMTHNQATAFMEDYTLELQKGKEAILGSHMLEVDPGIASDKPRVEVHPLDIGGKADPARLVFTGREGDAMDITISDFGTEYRMIGYAVTGNKAPKETPHLPVAKQMWTPKAGLKAGATQWIHDGGGHHTVLTFSASETQIQDLATMFGLPFDDIK。
编码所述重组L-阿拉伯糖异构酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示：atgttacaagtacctgattatgaattttggtttgttactggtagtcaacatctttacggagaagaacaattaaaatccgttgaaaaagacgccaaggatatggttgataagttaaatgcttcaggcaaattaccttacccaatcgtattcaagatggttgcaaccactgcagatagcatcactcagttaatgaaagatgttaactacaatgataaagttgctggtattatcacttggatgcacacattctcacctgctaagaactggatccgtggaactaagttacttcaaaagccattacttcacttggcaactcagtacttggatcacattccatatgacaccattgacttcgactacatgaaccttaaccaaagtgctcatggtgaccgtgaatacggctttatcaatgcgcgtcttcaaaagcacaacaagattgtttacggctactggggtgatccagaagtccaagacgaaattgctgactgggaagatgttgcagttgcttatgacgaaagcttcaagatcaaagttgcacgtttcggtgacaacatgcgtaatgttgcggttactgaaggtgacaaagttgaagctcaaatccaatttggctggaccgttgattactacgcacttggcgacttggtagaatcagttaacgctgtttctgaaagcgatattgatgctaagtacaaagaattacaagacaaatatgaatttgttcaaggcgataacgacaaagacaagtacgaacattcagtacgttaccaaatccgtgaatacttcggaatcaagaacttcttggacaaaggcaactactcagcattcacaaccaacttcgaagacctttatggtttggaacaattacctggcctggctgcacaattgcttatggctgaaggttatggcttcggtgctgaaggtgactggaagacagctgctcttggccgcttagttaaaatcatgactcataatcaggctactgcattcatggaagactacactcttgaattacaaaagggtaaggaagctatccttggatcacatatgcttgaagttgaccctggtattgccagtgacaaacctcgtgttgaagttcacccattggacattggtggcaaagcagaccctgctcgtttggtatttactggacgcgaaggcgacgcaatggacatcacgatttcagacttcggtactgaataccggatgattggctacgccgttacaggtaacaaggcacctaaggaaacaccacatctgccagttgctaaacaaatgtggactccaaaggctggcttgaaggccggtgctactcaatggatccatgatggtggcggacaccacacggttcttacattctctgctagtgaaactcaaatccaagaccttgcaacaatgtttggtttaccatttgacgacatcaagtag。
实施例3：
为了探讨重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI酶学性质，本实施例中分别研究了其在不同金属离子及浓度、不同温度、pH环境下的酶活情况。
（1）温度对LPAI酶活性的影响：
设置多组试验，将LPAI加入到D-半乳糖底物溶液中，分别于30，35，40，45, 50,55, 60和 65℃下进行1h的反应，通过测定不同温度下的酶活力，比较得出该酶最适温度。如图3所示，随着温度的升高，酶活也越来越高，当温度为45℃时，酶活达到最高。之后温度再升高，酶活逐渐降低。
将上述试验组中的LPAI孵育两个小时后测定其残余酶活力，从而获得LPAI的温度稳定性。测定结果如图4所示，在45℃孵育2小时后LPAI残余酶活力约为80%。以上结论表明，LPAI具有适宜的最适温度以及良好的热稳定性。
（2）pH对LPAI酶活性的影响：
设置多组试验，将LPAI加入到D-半乳糖底物溶液中，分别于pH4-10, 45℃下进行1h的反应，通过测定不同温度下的酶活力，比较得出该酶最适温度。如图5所示，
LPAI的最适pH为6.7，pH小于6.7时，酶活力随pH的增大而变大；pH大于6.7时，酶活力随pH的增大而减小。
将上述试验组中的LPAI孵育两个小时后测定其残余酶活力，从而获得LPAI的pH稳定性。测定结果如图6所示，LPAI在pH6.7时具有较好的稳定性，24小时后残余酶活力约为90%，以上结论表明，LPAI在弱酸环境下具有最佳酶活力以及良好稳定性。
（3）不同金属离子对LPAI酶活性的影响：
设置多组试验，将LPAI加入到D-半乳糖底物溶液中，分别加入1mM的FeCl2, ZnCl2,CoSO4, MnCl2, NiCl2, CaCl2, CuCl2, MgCl2，于pH值为6~7, 45℃下进行1h的反应，通过测定不同温度下的酶活力，比较得出该酶最适温度。如图7所示，Ca2+、Ni2+、Fe2+对LPAI的酶活力具有促进作用，而Cu2+、Mn2+、Co2+对LPAI的酶活力具有抑制作用，其中Ca2+的促进作用最为明显。
基于上述试验的基础上，本实施例在浓度0-10 mM的范围内探讨了Ca2+离子的浓度对LPAI的酶活性的影响。图8为不同浓度Ca2+离子环境下LPAI的酶活性，从图中可以看出在0-3 mM之间酶活性随着Ca2+浓度的增加而增加，浓度为3 mM时活性最大，当Ca2+离子浓度在3~10 mM 时酶活性逐渐下降，可见，Ca2+的最适浓度为3mM。
根据（1）~（3）中所述最佳数据测定LPAI在最佳酶活条件下的酶活力，经计算，其最佳酶活为15.52 U/mg。
实施例4：
配制含有相同浓度的不同的底物溶液，分别是D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖，添加一定量的LPAI进行反应后测定酶活力，得出该酶的底物特异性；结果如图9所示，以D-半乳糖为底物时，相对酶活最高。结果表明LPAI是以D-半乳糖为适宜底物，转化生成D-塔格糖的良好酶源。
本实施例中还研究了最适条件下LPAI的动力学常数，通过配制0-500mM的一系列的D-半乳糖，分别研究最适条件下的该酶的动力学常数，结果显示，当以D-半乳糖为底物时，Km, Vmax和Kcat/Km 分别为5.4 mM, 35.5 U/mg 和 2.8 mM-1min-1。表1为现有技术中的L-阿拉伯糖异构酶的动力学常数。
表1.L-阿拉伯糖异构酶的动力学常数
Figure 102474DEST_PATH_IMAGE001
将本发明中制备的LPAI与表1中其他现有技术中L-阿拉伯糖异构酶相比，LPAI对D-半乳糖的催化效率更高。
实施例5：
配制100mM的pH为6.7且含3mM Ca2+的D-半乳糖溶液，添加0.5mg纯酶进行转化D-半乳糖生产D-塔格糖12h，利用高效液相色谱法测定反应液中D-塔格糖的浓度，计算LPAI转化D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率，结果显示约为91%。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI及其构建方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttacaag tacctgatta tgaattttgg tttgttactg gtagtcaaca tctttacgga 60
gaagaacaat taaaatccgt tgaaaaagac gccaaggata tggttgataa gttaaatgct 120
tcaggcaaat taccttaccc aatcgtattc aagatggttg caaccactgc agatagcatc 180
actcagttaa tgaaagatgt taactacaat gataaagttg ctggtattat cacttggatg 240
cacacattct cacctgctaa gaactggatc cgtggaacta agttacttca aaagccatta 300
cttcacttgg caactcagta cttggatcac attccatatg acaccattga cttcgactac 360
atgaacctta accaaagtgc tcatggtgac cgtgaatacg gctttatcaa tgcgcgtctt 420
caaaagcaca acaagattgt ttacggctac tggggtgatc cagaagtcca agacgaaatt 480
gctgactggg aagatgttgc agttgcttat gacgaaagct tcaagatcaa agttgcacgt 540
ttcggtgaca acatgcgtaa tgttgcggtt actgaaggtg acaaagttga agctcaaatc 600
caatttggct ggaccgttga ttactacgca cttggcgact tggtagaatc agttaacgct 660
gtttctgaaa gcgatattga tgctaagtac aaagaattac aagacaaata tgaatttgtt 720
caaggcgata acgacaaaga caagtacgaa cattcagtac gttaccaaat ccgtgaatac 780
ttcggaatca agaacttctt ggacaaaggc aactactcag cattcacaac caacttcgaa 840
gacctttatg gtttggaaca attacctggc ctggctgcac aattgcttat ggctgaaggt 900
tatggcttcg gtgctgaagg tgactggaag acagctgctc ttggccgctt agttaaaatc 960
atgactcata atcaggctac tgcattcatg gaagactaca ctcttgaatt acaaaagggt 1020
aaggaagcta tccttggatc acatatgctt gaagttgacc ctggtattgc cagtgacaaa 1080
cctcgtgttg aagttcaccc attggacatt ggtggcaaag cagaccctgc tcgtttggta 1140
tttactggac gcgaaggcga cgcaatggac atcacgattt cagacttcgg tactgaatac 1200
cggatgattg gctacgccgt tacaggtaac aaggcaccta aggaaacacc acatctgcca 1260
gttgctaaac aaatgtggac tccaaaggct ggcttgaagg ccggtgctac tcaatggatc 1320
catgatggtg gcggacacca cacggttctt acattctctg ctagtgaaac tcaaatccaa 1380
gaccttgcaa caatgtttgg tttaccattt gacgacatca agtag 1425
<210> 2
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Leu Gln Val Pro Asp Tyr Glu Phe Trp Phe Val Thr Gly Ser Gln
1 5 10 15
His Leu Tyr Gly Glu Glu Gln Leu Lys Ser Val Glu Lys Asp Ala Lys
20 25 30
Asp Met Val Asp Lys Leu Asn Ala Ser Gly Lys Leu Pro Tyr Pro Ile
35 40 45
Val Phe Lys Met Val Ala Thr Thr Ala Asp Ser Ile Thr Gln Leu Met
50 55 60
Lys Asp Val Asn Tyr Asn Asp Lys Val Ala Gly Ile Ile Thr Trp Met
65 70 75 80
His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Asn Trp Ile Arg Gly Thr Lys Leu Leu
85 90 95
Gln Lys Pro Leu Leu His Leu Ala Thr Gln Tyr Leu Asp His Ile Pro
100 105 110
Tyr Asp Thr Ile Asp Phe Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His
115 120 125
Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Phe Ile Asn Ala Arg Leu Gln Lys His Asn
130 135 140
Lys Ile Val Tyr Gly Tyr Trp Gly Asp Pro Glu Val Gln Asp Glu Ile
145 150 155 160
Ala Asp Trp Glu Asp Val Ala Val Ala Tyr Asp Glu Ser Phe Lys Ile
165 170 175
Lys Val Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Val Thr Glu
180 185 190
Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Gln Phe Gly Trp Thr Val Asp Tyr
195 200 205
Tyr Ala Leu Gly Asp Leu Val Glu Ser Val Asn Ala Val Ser Glu Ser
210 215 220
Asp Ile Asp Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gln Asp Lys Tyr Glu Phe Val
225 230 235 240
Gln Gly Asp Asn Asp Lys Asp Lys Tyr Glu His Ser Val Arg Tyr Gln
245 250 255
Ile Arg Glu Tyr Phe Gly Ile Lys Asn Phe Leu Asp Lys Gly Asn Tyr
260 265 270
Ser Ala Phe Thr Thr Asn Phe Glu Asp Leu Tyr Gly Leu Glu Gln Leu
275 280 285
Pro Gly Leu Ala Ala Gln Leu Leu Met Ala Glu Gly Tyr Gly Phe Gly
290 295 300
Ala Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Ala Leu Gly Arg Leu Val Lys Ile
305 310 315 320
Met Thr His Asn Gln Ala Thr Ala Phe Met Glu Asp Tyr Thr Leu Glu
325 330 335
Leu Gln Lys Gly Lys Glu Ala Ile Leu Gly Ser His Met Leu Glu Val
340 345 350
Asp Pro Gly Ile Ala Ser Asp Lys Pro Arg Val Glu Val His Pro Leu
355 360 365
Asp Ile Gly Gly Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Thr Gly Arg
370 375 380
Glu Gly Asp Ala Met Asp Ile Thr Ile Ser Asp Phe Gly Thr Glu Tyr
385 390 395 400
Arg Met Ile Gly Tyr Ala Val Thr Gly Asn Lys Ala Pro Lys Glu Thr
405 410 415
Pro His Leu Pro Val Ala Lys Gln Met Trp Thr Pro Lys Ala Gly Leu
420 425 430
Lys Ala Gly Ala Thr Gln Trp Ile His Asp Gly Gly Gly His His Thr
435 440 445
Val Leu Thr Phe Ser Ala Ser Glu Thr Gln Ile Gln Asp Leu Ala Thr
450 455 460
Met Phe Gly Leu Pro Phe Asp Asp Ile Lys
465 470

Claims (9)

1.一种重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.编码权利要求1所述重组L-阿拉伯糖异构酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
3.权利要求1所述的一种重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）重组L-阿拉伯糖异构酶重组子的构建：
PCR扩增合成目的基因araA，然后将目的基因整合到表达载体pANY1的多克隆位点上，将产物转化大肠杆菌E.coli BL21感受态中，经孵育后涂布抗性平板进行过夜培养，筛选阳性克隆子、PCR扩增验证、提取质粒验证及测序验证成功获得重组L-阿拉伯糖异构酶重组子E.coli BL21/ pANY1-araA；
（2）重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的表达和纯化：
将得到的E.coli BL21/ pANY1-araA在LB培养基里培养，然后加入诱导剂IPTG，在低温低速下培养过夜，接着收集细胞经超声破碎释放重组蛋白，利用Ni2+-NTI柱纯化，获得纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI。
4.根据权利要求3所述的重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述PCR的反应参数为：预变性98℃ 3 min；变性98℃ 10s；退火55℃ 10 s；延伸72℃ 25s；终延伸72℃ 5 min；32个循环。
5.根据权利要求3所述的重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述E.coli BL21/ pANY1-araA在LB培养基里培养的条件为37 ℃、200 rpm振荡培养至OD为0.4。
6.根据权利要求3所述的重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述IPTG在培养基中的终浓度为1mM。
7.根据权利要求3所述的重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述低温低速下培养过夜为在25 ℃、120 rpm下培养过夜。
8.根据权利要求3所述的重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述Ni2+-NTI柱为1.0×10.0 mm。
9.权利要求1所述重组L-阿拉伯糖异构酶LPAI在以D-半乳糖为底物制备D-塔格糖中的应用。
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