CN113528416B - 一种产d-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种产D‑塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，利用基因工程的手段，在E.coli BL21的基础上构建了联合表达L‑阿拉伯糖异构酶(L‑AI)和β‑半乳糖苷酶(β‑gal)的基因工程菌，并将该基因工程菌用于转化乳清粉制备D‑塔格糖，D‑塔格糖的产量达到70～120g/L。

Description

一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
D-塔格糖是一种天然己酮糖，分子式为C6H10O6，其是一种低热量甜味益生元，具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、抗龋齿、治疗贫血等功效。2001年，美国FDA批准其为普遍公认安全食品(GRAS)，因此可代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域，同时还被广泛应用于医药行业。
目前，D-塔格糖的生产主要有化学法和生物法两种，其中化学法存在着能耗高、副产物多、纯化烦琐和污染大等缺点，不利于工业化生产。与化学法相比，生物法合成D-塔格糖具有环境友好、特异性高、副产物少、条件温和等优势，是未来D-塔格糖工业化生产的必然趋势。生物法通常以D-半乳糖为底物，利用L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase，L-AI)将其异构化为D-塔格糖，但由于D-半乳糖作为底物不够廉价且转化率不足等局限性。
近年来，研究者们逐渐将目光转向以更加廉价易得的工农业副产物乳清粉或商业化乳糖为底物制备D-塔格糖，即利用β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)水解乳糖生成D-葡萄糖和D-半乳糖后，生成的D-半乳糖再经L-AI制备D-塔格糖。目前关于乳清粉或乳糖制备D-塔格糖已有少量研究，但目前的研究报道中存在着利用昂贵的商业化β-半乳糖苷酶、关键酶来源不安全或性质不适宜、全细胞法存在细胞需求量大、异构化热力学平衡引起的D-塔格糖产量不高等问题。因此，基于过表达来源安全的β-gal和L-AI构建的基因工程菌，探索如何有效降低生产成本并提高D-塔格糖的产量是实现由廉价底物乳清粉生产D-塔格糖的工业化的必经之路。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明中，利用基因工程的手段，在E.coli BL21的基础上构建了联合表达L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)和β-半乳糖苷酶(β-gal)的基因工程菌，并将该基因工程菌用于转化乳清粉制备D-塔格糖。
本发明首先提供了一种用于生产D-塔格糖的基因工程菌，记为E.coli BL21/β-gal-L-AI，其通过在E.coli BL21上构建表达L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)和β-半乳糖苷酶(β-gal)而得到。
本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)工程菌的构建：
PCR扩增来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CY.6)中的L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)基因，使用无缝克隆技术克隆至表达载体pANY1中，得到重组质粒pANY1-araA，经过将重组质粒转化至E.coli DH5α、筛选阳性克隆、测序得到E.coli DH5α/L-AI，然后将E.coli DH5α/L-AI培养、抽提重组质粒，并将重组质粒转化至E.coli BL21感受态中，得到L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)工程菌，记为E.coli BL21/L-AI；
(2)β-半乳糖苷酶(β-gal)工程菌的构建：
PCR扩增来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri ATCC 53608)中的β-半乳糖苷酶(β-gal)基因，使用无缝克隆技术克隆至表达载体pFXZ02中，得到重组质粒pFXZ02-lacLM，经过将重组质粒转化至E.coli DH5α、筛选阳性克隆以及测序得到E.coli DH5α/β-gal，然后将E.coli DH5α/β-gal培养、抽提重组质粒，并将重组质粒转化至E.coli BL21感受态中，得到β-半乳糖苷酶(β-gal)工程菌，记为E.coli BL21/β-gal；
(3)基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI的构建：
利用CaCl2法制备E.coli BL21/β-gal感受态细胞，并将重组质粒pANY1-araA热激法转化入E.coli BL21/β-gal感受态细胞中，涂布于含Kan-Cl-LB双抗平板上，经阳性克隆子的筛选与验证，获得基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI。
其中，步骤(1)和(2)不分先后顺序。
进一步的，步骤(1)中PCR反应的条件为：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、45s，终延伸：72℃、10min，35个循环。
进一步的，步骤(2)中PCR反应的条件为：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、85s，终延伸：72℃、10min，35个循环。
本发明中还提供了上述基因工程菌在制备D-塔格糖应用。
一种制备D-塔格糖的全细胞转化方法，具体包括如下步骤：
(1)制备同时含过表达β-gal与L-AI的重组静息细胞：
将上述基因重组菌E.coli BL21/β-gal-L-AI接种于Kan-Cl-LB双抗培养基中，向其中加入IPTG诱导表达，获得表达成功的E.coli BL21/β-gal-L-AI，将表达成功的E.coliBL21/β-gal-L-AI低温离心，然后用含Triton-x-100的磷酸钠缓冲液室温处理离心后的细胞，接着再次离心，收集细胞，洗涤，得到同时含过表达β-gal与L-AI的重组静息细胞；
(2)分批补料乳清粉制备D-塔格糖：
将步骤(1)中制得的重组静息细胞加入乳清粉溶液混合反应，并采取分批补料乳清粉的方式进行转化以制备D-塔格糖。
进一步的，步骤(1)中，所述IPTG的终浓度为1mM；所述含Triton-x-100的磷酸钠缓冲液中Triton-x-100的含量为2％(按体积分数计)。
进一步的，步骤(2)中，所述乳清粉溶液中重组静息细胞干重的质量浓度为20～30g/L；所述乳清粉溶液由100mM pH 5.5～7.0、含4～12mM MnSO4的磷酸钠缓冲液配制，其中含100g/L-150g/L乳糖。
进一步的，所述混合反应的条件为在50～60℃、100～200rpm条件下反应。
进一步的，所述分批补料乳清粉的方式为每反应5h和12h向反应液中补充终浓度为50-60g/L乳糖的乳清粉，共补料4～6次，补料结束后继续反应至D-塔格糖浓度不增加为止。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明开发了双酶共表达制备单一基因工程菌进行生物转化制备D-塔格糖的策略，一定程度上克服了单独表达双酶的基因工程菌静息细胞转化法一直存在的对细胞要求量大且转化体系中细胞负载大的弊端，有效简化了工艺步骤以降低反应成本并提高了产物产量。
本发明中过表达的两种酶来源均为益生菌，β-gal的来源菌为罗伊氏乳杆菌，L-AI的来源为植物乳杆菌，有效克服了目前研究报道中存在的关键酶来源为非安全菌株的问题。
本发明中开发的基因工程菌静息细胞转化乳清粉制备D-塔格糖的反应条件较适应于工业化生产，其中反应最适温度适宜、最适pH为酸性环境等特征有利于提高D-塔格糖的产量并有效减少副反应的发生。
本发明探索了基于底物及静息细胞补料制备D-塔格糖的最佳补料策略，利用半连续补料乳清粉的手段有效解决了底物及中间产物抑制问题，使得反应持续高效进行，有效积累了产物，最终D-塔格糖的产量达到70～120g/L。
附图说明
图1 为本发明所述lacLM和araA的PCR扩增产物图。
图2 为本发明所述β-gal和L-AI基因工程菌的SDS-PAGE图，其中，Lane M：已知大小的蛋白marker；Lane 1：IPTG诱导的E.coli BL21；Lane 2：IPTG诱导的E.coli BL21/β-gal；Lane 3：IPTG诱导的E.coli BL21/L-AI；Lane 4：IPTG诱导的E.coli BL21/β-gal-L-AI。
图3 为分批补料乳清粉全细胞转化制备D-塔格糖。
图4 为不同β-gal和L-AI基因工程菌组合生物转化制备D-塔格糖。
图5 E.coli BL21/β-gal-L-AI全细胞转化乳清粉制备D-塔格糖反应条件研究，其中，(a)反应pH的影响；(b)反应温度的影响；(c)Mn2+浓度的影响；(d)细胞浓度的影响；(e)初始乳糖含量的影响；(f)转化时间的影响。
图6不同分批补料策略制备D-塔格糖的研究，其中(a)每5h补料乳清粉；(b)每5h补料乳清粉和新鲜静息细胞；(c)每12h补料乳清粉；(d)每12h补料乳清粉和新鲜静息细胞。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均以首次表明的内容相同。
本发明中，所述表达载体pANY1由沈阳农业大学安迎峰教授赠送，改造方法参考文献(Gao H,Qi X,Hart D J,et al..Journal of Agricultural&Food Chemistry,2018:acs.jafc.8b01960.)；表达载体pFXZ02是将pANY1中pUC ori和卡那霉素抗性基因分别替换为p15A ori和氯霉素抗性基因而得。
实施例1.过表达重组β-gal及L-AI基因工程菌的构建与双酶表达：
(1)araA基因的获得：
根据Genbank中公开的植物乳杆菌编码L-AI的araA基因(GenBankNo.CP055123.1)序列和载体pANY1同源臂的特征，利用生物信息学软件设计合成上游引物5'-taactttaagaaggagatatacatATGTTATCAGTACCTGATTATGAG-3'(SEQ ID NO.1)和下游引物5'-aggagctcccatggaggTTACTTTAAGAATGCCTTAGTCAT-3'(SEQ ID NO.2)，前半部分为与pANY1质粒同源的上下游同源臂。
(2)以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CY.6，筛选方法参考文献Zhang G,Zabed H M,J Yun,et al.Bioresource Technology,2020,305:123010.)基因组DNA为模板，利用步骤(1)中合成的上游引物和下游引物来PCR扩增目的基因araA，其中PCR反应参数：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、45s，终延伸：72℃、10min，35个循环。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物经质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.5Kb的电泳条带，如图1所示，Lane 2为PCR扩增得到的产物，其与预期得到的目的基因araA大小一致，然后将PCR扩增产物利用产物纯化试剂盒纯化，获得纯化的araA基因。
(4)根据罗伊氏乳杆菌的编码β-gal的lacLM基因序列(GenBank No.LN906634.1)和载体pFXZ02的特征，利用生物信息学软件设计合成上游引物5'-taactttaagaaggagatatacatATGGATGCAGATATCAAATGGC-3'(SEQ ID NO.3)和下游引物5'-aggagctcccatggaggTTATTTTGCATTCAATACAAACG-3'(SEQ ID NO.4)，引物前半部分为与pFXZ02质粒同源的上下游同源臂。
(5)以罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ATCC 53608基因组DNA为模板，利用步骤(4)中合成的上游引物和下游引物来PCR扩增目的基因lacLM，其中PCR反应参数：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、45s，延伸：72℃、85s，终延伸：72℃、10min，35个循环。
(6)将步骤(5)得到的PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为2.8Kb的电泳条带，如图1所示，Lane 1为PCR扩增的产物，其与预期目的基因lacLM大小一致，然后将PCR扩增产物利用产物纯化试剂盒进行纯化，获得纯化的lacLM基因。
(7)以pANY1和pFXZ02质粒为模板，利用P1：5'-taactttaagaaggagatatacat-3'(SEQ ID NO.5)和P2：5'-aggagctcccatggagg-3'(SEQ ID NO.6)引物进行反向PCR以获得线性化质粒，进而按照一步克隆试剂盒的方法，分别将线性化pANY1和araA基因片段，pFXZ02和lacLM基因片段进行混合并构建重组质粒pANY1-araA和pFXZ02-lacLM。
将重组质粒pANY1-araA和pFXZ02-lacLM通过热激法化至E.coli DH5α(CICC:20547)感受态中，孵育1h后分别涂布于含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基(酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、氯化钠20g/L)和含终浓度10mg/L氯霉素的LB培养基上过夜培养，次日分别挑选阳性克隆子，并通过PCR验证、提取质粒验证以及测序验证筛选转化成功的阳性克隆子，保存并命名为E.coli DH5α/L-AI和E.coli DH5α/β-gal。
(8)分别接种E.coli DH5α/L-AI和E.coli DH5α/β-gal于LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h后利用质粒小提试剂盒抽提重组质粒pANY1-araA和pFXZ02-lacLM，然后将重组质粒通过热激法转化至E.coli BL21(Stratagene,USA)感受态中，接着分别涂布于含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基(酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、氯化钠20g/L)和含终浓度10mg/L氯霉素的LB培养基中过夜培养、验证，将验证成功的菌命名为E.coli BL21/L-AI和E.coli BL21/β-gal。
(9)利用CaCl2法制备E.coli BL21/β-gal感受态细胞，并将重组质粒pANY1-araA激法转化入E.coli BL21/β-gal感受态细胞中，涂布于含Kan-Cl-LB双抗平板上(Kan和Cl的终浓度分别为50mg/L和10mg/L)，经阳性克隆子的筛选与验证，获得含双质粒的基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI。
分别培养基因工程菌E.coli BL21/L-AI，E.coli BL21/β-gal和E.coli BL21/β-gal-L-AI，待OD为0.6～0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导物，25℃、120rpm低速过夜诱导β-gal和L-AI表达，利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况，结果如图2所示，以IPTG诱导的E.coliBL21为空白对照(Lane 1)，可知β-gal和L-AI在E.coli BL21中成功实现了分别表达(Lane2和Lane 3)，也成功实现了β-gal和L-AI联合表达(Lane 4)。
实施例2.乳清粉分批补料生产D-塔格糖：
(1)将基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI接种于Kan-Cl-LB中，37℃、200rpm摇床振荡培养至生长对数期，制备成种子液；再将种子液按体积分数为1％的接种量接种于Kan-Cl-LB中并培养至OD 0.6～0.8之间时，加入诱导剂IPTG使其终浓度为1mM，然后在25℃、120rpm的条件下过夜诱导β-gal和L-AI联合表达。
(2)将成功表达双酶的菌液在8000rpm、4℃下冷冻离心10min后收集菌体，利用2％Triton-x-100(按体积分数计)的100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)室温处理30min，然后离心收集菌体后利用pH7.0、100mM的磷酸钠缓冲液洗涤菌体两次后离心收集细胞，获得共表达β-gal和L-AI的静息细胞。
(3)利用100mM、pH5.5、12mM MnSO4的磷酸钠缓冲液制备含100g/L乳糖的粗乳清粉底物溶液；将步骤(2)中制备的静息细胞以细胞干重终浓度为25g/L加入到反应底物溶液，吹打重悬菌体使其混合均匀，置于55℃、150rpm条件下静息细胞转化5h后，向反应液中补充使转化液终浓度为50g/L乳糖的乳清粉，随后每转化5h补料一次乳清粉，共补料4次，即转化液中乳糖的总量为300g/L；每次补料前吸出2ml样品经HPLC监测转化液中各组分含量，补料结束后在相同条件下继续转化，并每隔5h取样测定转化液组分含量。以不同时间点取出的样品中各组分的含量绘制时间-产量曲线，如图3所示，结果表明D-塔格糖的产量在60h时达到63.0g/L后缓慢上升，并于95h时达到68.0g/L后反应体系维持热力学平衡，此时乳糖水解得到的D-半乳糖到D-塔格糖的转化率为45.53％。此外，转化液中D-半乳糖的残留量约为80g/L，积累的D-葡萄糖的含量约为140g/L。
实施例3.单酶表达与双酶共表达系统全细胞生产D-塔格糖的比较：
(1)分别接种E.coli BL21/L-AI，E.coli BL21/β-gal和E.coli BL21/β-gal-L-AI于Kan-LB，Cl-LB和Kan-Cl-LB中，37℃、200rpm摇床振荡培养至OD为0.6～0.8时，分别加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，25℃、120rpm低速过夜诱导β-gal和L-AI的分别表达以及共表达。
(2)在8000rpm、4℃下分别冷冻离心诱导表达后的菌液10min收集细胞，根据实施例2中步骤(2)的方法分别处理菌体细胞，制得分别含胞内酶β-gal和L-AI的重组静息细胞，以及同时含双酶的重组静息细胞。
(3)以pH7.0、100mM的磷酸钠缓冲液配制含100g/L乳糖的乳清粉底物溶液，按照静息细胞浓度相同的原则，以步骤(2)获得的三种静息细胞设置不同的细胞比例，研究分别过表达关键酶β-gal和L-AI以及在同一工程菌中联合过表达双酶的生产性能。具体分组为：System 1为E.coli BL21/β-gal和E.coli BL21/L-AI的双菌混合转化，E.coli BL21/β-gal和E.coli BL21/L-AI的比例为1：3，即分别添加5g/L的E.coli BL21/β-gal和15g/L E.coliBL21/L-AI到底物溶液中混匀转化；System 2为E.coli BL21/β-gal和E.coli BL21/L-AI的双菌混合转化，双菌的比例为1：1，即分别添加10g/L的E.coli BL21/β-gal和10g/L E.coliBL21/L-AI到底物溶液中混匀转化；System 3为20g/L E.coli BL21/β-gal-L-AI重组静息细胞，即仅添加共表达β-gal和L-AI的重组静息细胞到底物溶液中进行转化。
将以上3组样品在50℃、150rpm条件下转化24h后经HPLC分别测定D-塔格糖的产量，结果如图4显示，System 3D-塔格糖的产量最高，为19.28g/L，System 1次之，D-塔格糖的产量为17.00g/L，System 2D-塔格糖的产量为13.84g/L。以上结果表明，在相同浓度的细胞干重及相同反应条件下，共表达双酶的重组静息细胞可生产更多的D-塔格糖，具备更佳的生产优势。
实施例4.E.coli BL21/β-gal-L-AI静息细胞转化反应参数对D-塔格糖产量的影响
本实施例是为了在共表达双酶的E.coli BL21/β-gal-L-AI重组静息细胞进行转化反应制备D-塔格糖的基础上，对转化过程中重要的反应参数进行优化，分别研究了反应pH、温度、Mn2+浓度、细胞干重浓度、初始乳糖含量和反应时间对D-塔格糖产量的影响。
采用单因素优化策略，初始条件设定为：pH 7.0、温度50℃、0mM Mn2+、20g/L细胞干重、反应时间24h、乳糖浓度60g/L或100g/L，在优化某一条件时，保持其他条件不变。首先，设置反应pH的梯度为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，结果如图5(a)所示，pH5.5条件下D-塔格糖的产量最高；设置转化温度为30℃、40℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、60℃和70℃，结果如图5(b)所示，结果显示55℃为最佳反应温度；设置Mn2+离子浓度为0、4、8、12、16和20mM，结果如图5(c)显示，相较于不添加Mn2+离子的反应体系，加入Mn2+有助于增加L-AI的酶活，从而提高D-塔格糖的产量，其中12mM为最佳Mn2+浓度；设置细胞干重浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L，结果如图5(d)显示，可知细胞干重从5g/L增加到25g/L时，D-塔格糖的产量随之增加，但当细胞干重增加至30g/L时，D-塔格糖的浓度有所下降，原因可能是过多的细胞导致反应体系内分子间扩散困难，阻碍底物与酶的结合，从而不利于D-塔格糖的产生；初始乳糖的含量对D-塔格糖产量具有显著影响，设置含不同浓度的乳糖的乳清粉溶液作为底物，结果如图5(e)所示，可知随着乳糖浓度从60g/L到100g/L D-塔格糖的浓度有明显提高，但大于100g/L时D-塔格糖的产量增加较为缓慢，并伴随着乳糖到D-塔格糖及D-半乳糖到D-塔格糖转化率的逐渐降低，这是由于过高的乳糖造成了中间产物D-半乳糖的快速积累，从而形成的底物抑制不利于D-塔格糖的生产；最后，不同转化时间下D-塔格糖产量的不同如图5(f)所示，结果显示反应在前12h时D-塔格糖积累较快，生产强度较高，但反应12h后D-塔格糖的生产强度明显降低，D-塔格糖的浓度呈现缓慢增加的趋势并最终趋于平稳，造成后期生产强度下降的原因可能是酶活降低及底物浓度的下降。
综上，基于双酶表达系统E.coli BL21/β-gal-L-AI静息细胞法转化乳清粉生产D-塔格糖的最佳参数条件为：pH 5.5、温度55℃、12mM Mn2+、25g/L细胞干重、初始乳糖浓度为100g/L。
实施例5.不同间隔时间下底物和全细胞补料策略生产D-塔格糖的比较：
本实施例是基于优化后全细胞转化法的参数条件，为了防止底物与中间产物抑制作用及静息细胞所包含的双酶的酶活力降低等问题，基于β-gal和L-AI共表达的基因工程菌开发了4种分批补料生物转化技术，有效提升了D-塔格糖的产量。
(1)分批补料乳清粉：
扩大体系进行全细胞转化反应，初始条件为细胞干重25g/L，乳清粉制备的含乳糖100g/L的底物溶液，向其中加入终浓度为12mM的Mn2+，并调节体系的pH值为5.5，然后在55℃下150rpm均匀振荡转化。转化5h和12h后分别采集样品分析转化液各组分含量，补料乳清粉使转化液乳糖含量为50g/L，每5h和12h分别重复采样和补料乳清粉，共采样及补料4次，使反应体系中乳糖的总含量为300g/L。补料结束后持续反应并采样以监测转化体系中各组分的含量。
结果如图6(a)、6(c)所示，每隔5h进行4次补料乳清粉的策略下，D-塔格糖在反应68h时达到65.13g/L，而每隔12h进行补料时，D-塔格糖在反应96h时达到53.22g/L。因此，每隔5h向反应体系中补充底物更有利于D-塔格糖的积累，并且缩短了反应的时间，降低了反应成本。
(2)分批补料乳清粉和静息细胞：
扩大体系进行全细胞转化反应，初始条件为细胞干重25g/L，乳清粉制备的含乳糖100g/L的底物溶液，向其中加入终浓度为12mM的Mn2+，并调节体系的pH值为5.5，然后在55℃下150rpm均匀振荡转化。转化5h和12h后分别采集样品分析转化液各组分含量，补料乳清粉使转化液乳糖含量为50g/L，同时补料新鲜静息细胞使转化体系中新鲜细胞干重浓度为5g/L，每5h和12h分别重复采样和补料乳清粉及细胞，共采样及补料4次，使反应体系中乳糖的总含量为300g/L，静息细胞干重为45g/L。
结果如图5所示，以5h为间隔时间的情况下，与仅补充乳清粉相比，补充新鲜静息细胞不能提高D-塔格糖的产量，反而在反应68h时D-塔格糖的产量仅为58.83g/L(图6(b))，造成上述结果的原因可能是过多的静息细胞存在于反应体系中，会造成体系内组分扩散困难，从而导致底物与酶的结合难以完成，最终导致不能提高产物D-塔格糖的产量。但是，在以12h为补料间隔时间的条件下，D-塔格糖的产量在同时补充乳清粉和新鲜细胞的条件下较高，在反应96h后达到了58.05g/L(图6(d))，这是因为12h的间隔时间使得每次补充的新鲜细胞具有更多时间进行生物转化，从而提高了产量，但相较于5h为间隔时间补料而言，12h情况下D-塔格糖的产量和生产强度均不具备优势。综上，每隔5h补料乳清粉为最佳的补料策略。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taactttaag aaggagatat acatatgtta tcagtacctg attatgag 48
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggagctccc atggaggtta ctttaagaat gccttagtca t 41
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taactttaag aaggagatat acatatggat gcagatatca aatggc 46
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggagctccc atggaggtta ttttgcattc aatacaaacg 40
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taactttaag aaggagatat acat 24
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggagctccc atggagg 17

Claims (8)

1. 一种用于生产D-塔格糖的基因工程菌，记为E.coli BL21/β-gal-L-AI，其特征在于，其通过在E.coli BL21上构建表达L-阿拉伯糖异构酶和β-半乳糖苷酶而得到；所述用于生产D-塔格糖的基因工程菌的构建方法，包括：
(1)L-阿拉伯糖异构酶工程菌的构建：
PCR扩增来源于植物乳杆菌中的L-阿拉伯糖异构酶基因，使用无缝克隆技术克隆至表达载体pANY1中，得到重组质粒pANY1-araA，经过将重组质粒转化至E.coli DH5α、筛选阳性克隆、测序得到E.coli DH5α/L-AI，然后将E.coli DH5α/L-AI培养、抽提重组质粒，并将重组质粒转化至E.coli BL21感受态中，得到L-阿拉伯糖异构酶工程菌，记为E.coli BL21/L-AI；
(2)β-半乳糖苷酶工程菌的构建：
PCR扩增来源于罗伊氏乳杆菌中的β-半乳糖苷酶基因，使用无缝克隆技术克隆至表达载体pFXZ02中，得到重组质粒pFXZ02-lacLM，经过将重组质粒转化至E.coli DH5α、筛选阳性克隆以及测序得到E.coli DH5α/β-gal，然后将E.coli DH5α/β-gal培养、抽提重组质粒，并将重组质粒转化至E.coli BL21感受态中，得到β-半乳糖苷酶工程菌，记为E.coli BL21/β-gal；
(3)基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI的构建：
利用CaCl 2 法制备E.coli BL21/β-gal感受态细胞，并将重组质粒pANY1-araA热激法转化入E.coli BL21/β-gal感受态细胞中，涂布于含Kan-Cl-LB双抗平板上，经阳性克隆子的筛选与验证，获得基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI；
其中，步骤(1)和(2)不分先后顺序。
2.根据权利要求1所述的用于生产D-塔格糖的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增的条件为：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、45s，终延伸：72℃、10min，35个循环。
3.根据权利要求1所述的用于生产D-塔格糖的基因工程菌，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的条件为：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、85s，终延伸：72℃、10min，35个循环。
4.权利要求1所述的用于生产D-塔格糖的基因工程菌在制备D-塔格糖中的应用。
5.一种分批补料乳清粉产D-塔格糖的方法，其特征在于，具体包括：
(1) 制备同时含过表达β-gal与L-AI的重组静息细胞：
将权利要求1所述基因重组菌E.coli BL21/β-gal-L-AI接种于Kan-Cl-LB双抗培养基中，向其中加入IPTG诱导表达，获得表达成功的E.coli BL21/β-gal-L-AI，将表达成功的E.coli BL21/β-gal-L-AI低温离心，然后用含Triton-x-100的磷酸钠缓冲液室温处理离心后的细胞，接着再次离心，收集细胞，洗涤，得到同时含过表达β-gal与L-AI的重组静息细胞；
(2) 分批补料乳清粉制备D-塔格糖：
将步骤(1)中制得的重组静息细胞加入乳清粉溶液混合反应，并采取分批补料乳清粉的方式进行转化以制备D-塔格糖；
所述分批补料乳清粉的方式为在反应5h或12h后向反应液中补充终浓度为50-60g/L乳糖的乳清粉，共补料4～6次，补料结束后继续反应至D-塔格糖浓度不增加为止。
6.根据权利要求5所述的分批补料乳清粉产D-塔格糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述IPTG的终浓度为1mM；所述含Triton-x-100的磷酸钠缓冲液中Triton-x-100的体积分数为2％。
7.根据权利要求5所述的分批补料乳清粉产D-塔格糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乳清粉溶液中重组静息细胞干重的质量浓度为20～30g/L；
所述乳清粉溶液由100mM pH 5.5～7.0、含4～12mM MnSO 4 的磷酸钠缓冲液配制，其中含100g/L-150g/L乳糖。
8.根据权利要求5所述的分批补料乳清粉产D-塔格糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合反应的条件为在50～60℃、100～200rpm条件下反应。
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