CN110643647B - 地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成中的应用 - Google Patents

地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，公开了地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ‑谷氨酸合成中的应用。本发明通过基因组上定点突变的方式，将来源于地衣芽胞杆菌WX‑02(Baclicus lincheniformis WX‑02，中谷氨酸脱氢酶RocG的第277位丝氨酸突变为色氨酸，显著提高了谷氨酸脱氢酶催化活力，解决了目前聚γ‑谷氨酸合成过程中谷氨酸供给不足的问题，突变菌株聚γ‑谷氨酸产量相较于对照菌株至少提高了12%以上。本发明为聚γ‑谷氨酸的高效生产提供了一种新策略。

Description

地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成 中的应用
技术领域
本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成中的应用。
背景技术
聚γ-谷氨酸是由α-氨基和γ-羧酸基团之间的酰胺键连接的D/L-型谷氨酸残基构成的阴离子多肽。因其生物结构特征，使它具有很多优良的性质。聚γ-谷氨酸作为水溶性、生物可降解性、生物相容性、可食用性、无毒性的生物可降解材料，可广泛用于食品、农业、医药、化妆品、环保等领域。因此，聚γ-谷氨酸具有广泛的应用前景。
目前，聚γ-谷氨酸的商业化生产主要依赖于微生物发酵法，但是由于需要添加聚γ-谷氨酸合成前体物和发酵副产物过多，导致葡萄糖向聚γ-谷氨酸的转化率偏低。从目前报道看，聚γ-谷氨酸的商业生产菌株几乎完全依赖于芽胞杆菌属，如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等。根据营养要求，这些聚γ-谷氨酸生产菌株可分为L-谷氨酸依赖型和L-谷氨酸非依赖型。L-谷氨酸依赖型菌株在商业生产上增加了生产成本。L-谷氨酸非依赖型菌株虽然是潜在的低生产成本的细胞工厂，但是其生产力却受到了极大的限制。谷氨酸脱氢酶是聚γ-谷氨酸合成途径中关键酶，负责催化α-酮戊二酸形成谷氨酸，随后通过聚γ-谷氨酸合成酶进一步反应生成终产物聚γ-谷氨酸。由于胞内谷氨酸的合成积累是聚γ-谷氨酸高效合成的必要条件，谷氨酸脱氢酶也是聚γ-谷氨酸生物合成的关键酶。
来源于地衣芽胞杆菌的谷氨酸脱氢酶RocG是一类辅酶依赖型脱氢酶，能够催化α-酮戊二酸与谷氨酸之间的相互转化。目前地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶RocG的蛋白结构和催化特性并未研究和解析，其催化核心区域也尚未解析和阐明，因此无法对其进行相应改造。因此，谷氨酸脱氢酶位点改造对于其催化特性及聚γ-谷氨酸生物合成的影响也是未知的。
发明内容
本发明的目的在于提供了地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W聚γ-谷氨酸合成中的应用，所述的谷氨酸脱氢酶突变体S277W的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
谷氨酸脱氢酶突变体S277W在生物发酵生产聚γ-谷氨酸中的应用，包括将编码该突变蛋白的基因转化进地衣芽胞杆菌中，发酵生产聚γ-谷氨酸，所述的突变体S277W的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的应用中，优选的，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为能生产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌。
以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02。
以上所述的应用中，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：
葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO3 0～10g/L，NH4Cl10g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0-0.15g/L，CaCl2 1g/L；
或甘油20-40g/L，谷氨酸钠30g/L，柠檬酸钠10g/L，NaNO3 10g/L，NH4Cl 10g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0.15g/L，CaCl2 1g/L。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过基因组突变的方式，将谷氨酸脱氢酶第277位丝氨酸突变为色氨酸(本发明命名为突变体S277W)，显著提高了谷氨酸脱氢酶的催化活性，解决了目前聚γ-谷氨酸合成过程中谷氨酸供应不足的问题，改造后的菌株合成聚γ-谷氨酸显著提高，其聚γ-谷氨酸合成水平相较于对照菌株至少提高了12％。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实验材料和试剂
1、菌株：地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02，保藏号为CCTCCNO.M208065，菌株E.coli DH5α购自于北京全式金生物技术有限公司。
2、酶类及其它生化试剂：高保真Taq酶购自武汉擎科生物技术有限公司公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶等分子生物学试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)LB培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min后使用。
(2)发酵培养基：葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO30～10g/L，NH4Cl 0～5g/L，K2HPO4·3H2O 0～1g/L，MgSO4·7H2O 0～1g/L，ZnSO4·7H2O 0～1g/L，MnSO4·H2O 0～0.15g/L，CaCl2 0.5～1g/L；
或：甘油20-60g/L，谷氨酸钠30g/L，柠檬酸钠10g/L，NaNO3 10g/L，NH4Cl 10g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0.15g/L，CaCl2 1g/L
所述发酵的pH为6.5～7.2，115℃灭菌20min后使用。
实施例1：
谷氨酸脱氢酶基因突变的地衣芽胞杆菌WX-rocGS277W的构建：
1、根据地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA序列通过基因合成rocGS277W(SEQ ID NO.2所示)；以地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA为模板，PCR扩增出rocG基因的上游同源臂(引物为T2-F1和T2-R1)和rocGS277W基因的下游同源臂(引物为T2-F2和T2-R2)；
T2-F1:AGAGCGGCTGATGAAGGT
T2-R1:GCTCCATTTTTTCTAGCGTATGCACTAACAGGCACGCCAAAAG
T2-F2:TCGCTCAGGGAGTCGTTTAATCACCTGGAAGTCTTAGCG
T2-R2:ATCAAAAACAGAAGGGGGAGGA
2、通过重叠延伸PCR将rocG基因的上游同源臂、合成的rocGS277W基因和rocG基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：rocG基因的上游同源臂-合成的rocGS277W基因-rocG基因的下游同源臂；
3、采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-Ori进行双酶切得到线性质粒片段；
4、将步骤3得到的酶切目的片段和步骤3得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶连接，验证正确后得到质粒T2(2)-rocGS277W；
5、将质粒T2(2)-rocGS277W转入地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02中，经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证；
6、将步骤4得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和rocGS277W-R为引物进行菌落PCR检测单交换菌株；
T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA
rocGS277W-R：AGACATAGCCGTCCCATTCGCTGCAGGCCACCACC
7、将步骤5得到的菌株和步骤6得到的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为T2-KYF和T2-KYR)。得到阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的rocGS277W菌株(即地衣芽胞杆菌WX-rocGS277W)。
T2-KYF:GAGATTATTCGTAAAGCCGAGATG
T2-KYR:CTGTCTCCCGTGTCTTTACCCG
实施例2：
谷氨酸脱氢酶基因rocGS277W突变株在提高聚γ-谷氨酸发酵产量中的应用：
发酵产物分析
将实施例1获得的重组菌株接种到LB培养基中，37℃，培养14h；向500mL三角瓶中装入50mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)接种至发酵培养基中。培养条件为转速230r/min，温度37℃，发酵周期36小时。
本实施例，针对不同的发酵培养基配方，考察了地衣芽胞杆菌WX-rocGS277W对聚γ-谷氨酸合成水平的影响(同时也在这24种培养基中接种地衣芽胞杆菌WX-02作为对照)，24组培养基配方具体如表1所示：
表1发酵培养基配方
Figure BDA0002273954850000041
Figure BDA0002273954850000051
以上培养基成分单位均为g/L。
采用干重法测量聚γ-谷氨酸产量，具体操作步骤如下：取一定体积的发酵液样品，使用6mol/L HCl将pH调至3.0，12000r/min离心10min，菌体沉淀80℃烘箱烘干，测菌体干重。取上清，用6mol/L NaOH将上清液pH调至中性，加入3倍体积乙醇沉淀聚γ-谷氨酸，离心收集聚γ-谷氨酸絮状沉淀，将沉淀在80℃烘箱烘干，测干重。根据干重法计算生产发酵的菌液中聚γ-谷氨酸产量(见表2)。
表2发酵试验聚γ-谷氨酸的产量
Figure BDA0002273954850000052
Figure BDA0002273954850000061
Figure IDA0002275995880000011
Figure IDA0002275995880000021
Figure IDA0002275995880000031
Figure IDA0002275995880000041

Claims (5)

1.谷氨酸脱氢酶突变体S277W在生物发酵生产聚γ-谷氨酸中的应用，所述的突变体S277W的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的生物发酵为能生产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌发酵。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的生物发酵为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02发酵。
5.根据权利要求1所述的应用，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：
葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO3 0～10g/L，NH4Cl 10g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0-0.15g/L，CaCl21g/L；
或甘油20-40g/L，谷氨酸钠30g/L，柠檬酸钠10g/L，NaNO3 10g/L，NH4Cl 10g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0.15g/L，CaCl2 1g/L。
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