CN110894504A - 强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用 - Google Patents

强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及地衣芽胞杆菌基因工程改造和蛋白高效表达领域，公开了强化表达葡萄糖6‑磷酸脱氢酶Zwf的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，本发明通过基因工程的方法强化表达了地衣芽胞杆菌WX‑02中葡萄糖6‑磷酸脱氢酶基因zwf，成功得到了基因zwf强化表达的地衣芽胞杆菌WX‑02‑zwf，在此基础上转入胰蛋白酶SgT游离表达质粒pHY‑AprE、纳豆激酶表达载体pP43SacCNK、碱性蛋白酶游离表达载体pHY‑AprE。相对于对照菌株，本发明所构建得到的工程菌株在上述蛋白酶酶活提升方面效果显著，酶活均提高了28%以上。

Description

强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生 产中的应用
技术领域
本发明涉及地衣芽胞杆菌基因工程改造和蛋白高效表达领域，尤其是强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用。
背景技术
芽胞杆菌是异源蛋白高效表达的良好宿主，地衣芽胞杆菌是目前异源蛋白尤其是蛋白酶高效工业化生产的常用宿主菌株。蛋白酶是目前应用最为广泛的酶制剂产品，广泛应用于食品、医药、化学工业、废物处理等领域。异源蛋白表达是提高目的蛋白表达水平的有效策略。近年来，越来越多的策略被开发用于提高目的蛋白的合成水平。然而，地衣芽胞杆菌中存在着众多与外源蛋白表达的合成与分泌息息相关的基因，蛋白产量与哪些基因相关仍然是个未知数，通过对相关基因改造的方式得到高产蛋白工程菌也有待进一步研究。
葡萄糖6-磷酸脱氢酶(Zwf)是碳代谢途径中的关键酶，其作为磷酸戊糖途径的第一个酶，表达水平的高低对磷酸戊糖途径的代谢流分布具有十分重要的作用。然而，Zwf的表达水平与异源蛋白表达是否有联系并未解析，也不可预知。
本发明通过在地衣芽胞杆菌中强化表达Zwf，达到了异源蛋白产量提高的技术效果，说明强化表达Zwf是提高异源蛋白生产水平的有效策略。
发明内容
本发明的目的在于提供强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，所述的葡萄糖6-磷酸脱氢酶的序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一个目的在于提供了强化表达了葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌的发酵培养基。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶(本发明或简称为zwf)的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，包括利用本发明的常规方法，将地衣芽胞杆菌中Zwf进行整合过表达，得到强化表达zwf的地衣芽胞杆菌，然后将异源蛋白表达载体转入进行蛋白表达，所述的zwf基因为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的应用中，优选的，所述异源蛋白为胰蛋白酶、纳豆激酶或碱性蛋白酶；
以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02；
以上所述的应用中，优选的，所述的强化表达Zwf的地衣芽胞杆菌菌株构建，包括下述步骤：
(1)以地衣芽胞杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增出zwf基因(含启动子、目的基因和终止子)，及用于整合表达zwf的上游同源臂A和下游同源臂B；
(2)通过重叠延伸PCR将用于整合Zwf的上游同源臂A、zwf基因和用于整合Zwf的下游同源臂B连接到一起，构成目的基因片段；
(3)采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
(4)准备质粒T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到基因整合表达质粒T2(2)-zwf；
(6)将基因整合表达质粒T2(2)-zwf转入地衣芽胞杆菌中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
(7)将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到用于整合表达zwf的上游同源臂A或用于整合表达zwf的下游同源臂B与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
(8)挑选用于整合表达zwf的上游同源臂A与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与用于整合表达zwf的下游同源臂B与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到Zwf强化表达的地衣芽胞杆菌。
以上所述的应用中，当采用Zwf强化表达的地衣芽胞杆菌在胰蛋白酶、或纳豆激酶或碱性蛋白酶的异源蛋白生产时，所使用的发酵培养基的配方包括：10-20g/L葡萄糖、5-13g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆，7-11g/L酵母粉，8-12g/L氯化钠，2-5g/L K2HPO4和4-8g/L(NH4)2SO4；或5-10g/L骨蛋白胨、5-10g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆、7-11g/L酵母粉、8-12g/L氯化钠、2-5g/L K2HPO4和4-8g/L(NH4)2SO4。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明人首次尝试在地衣芽胞杆菌整合过表达Zwf，成功得到了zwf基因强化表达的地衣芽胞杆菌异源蛋白表达宿主菌株，经过转入胰蛋白酶、纳豆激酶和碱性蛋白酶游离表达载体，发酵结果表明，强化表达zwf显著提高了蛋白表达水平，与相应对照菌株相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌的异源蛋白产量均提高了28％以上。本发明为地衣芽胞杆菌蛋白高效表达提供了一种新策略。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
本发明以三种蛋白(胰蛋白酶、纳豆激酶、碱性蛋白酶)为例，说明本发明技术方案的优越性；但在实际操作过程中，并不局限于这三种蛋白。
实施例1：
葡萄糖6-磷酸脱氢酶(本发明简称为Zwf)强化表达的地衣芽胞杆菌WX-02-zwf菌株的获得：
1、根据地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA序列中的zwf基因序列，设计zwf基因的扩增引物(zwf-F、zwf-R)，同时根据地衣芽胞杆菌整合位点序列，设计用于整合Zwf的上游同源臂A扩增引物(A-F、A-R)和下游同源臂B扩增引物(B-F、B-R)；并以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别以zwf基因的扩增引物、用于整合Zwf的上游同源臂A扩增引物(A-F、A-R)和下游同源臂B扩增引物(B-F、B-R)进行PCR扩增得到zwf基因、用于整合Zwf的上游同源臂片段A和用于整合Zwf的下游同源臂片段B(zwf基因为2079bp；用于整合Zwf的上游同源臂A片段为502bp；用于整合Zwf的下游同源臂B片段为555bp)；
其中，A-F、A-R、zwf-F、zwf-R、B-F、B-R的序列为：
A-F：CGGGATCCTGAGGCGATGGATGTTCT
A-R：CATCCGTTGCATTGAAGCTTTTAGTTGACGAACCGTATCCGC
zwf-F：GCGGATACGGTTCGTCAACTAAAAGCTTCAATGCAACGGATG
zwf-R：TTTGCTCTTACCGTTTGCTGAGTGTGCGCATTGGTATGAAATTCTCTG
B-F：CAGAGAATTTCATACCAATGCGCACACTCAGCAAACGGTAAGAGCAAA
B-R：GCTCTAGATGTCAAACGCTCCGGTGG
2、以用于整合Zwf的上游同源臂片段A、zwf基因片段和用于整合Zwf的下游同源臂片段为模板，上游同源臂引物A-F、下游同源臂引物B-R为引物，通过重叠延伸PCR将用于整合Zwf的上游同源臂A、zwf基因和用于整合Zwf的下游同源臂B连接到一起，得到目的基因片段；
3、采用XbaI和BamHI限制性内切酶对步骤2中的目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
4、并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
5、将步骤3的酶切基因片段和步骤4的线性质粒片段经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在3286bp处出现电泳条带，说明整合表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：整合表达载体T2(2)-zwf)；
6、将整合表达载体T2(2)-zwf转入地衣芽胞杆菌WX-02中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在3286bp处出现电泳条带，证明：整合表达载体T2(2)-zwf成功转入地衣芽胞杆菌WX-02中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了整合表达载体T2(2)-zwf的地衣芽胞杆菌WX-02)；
其中，T2-F和T2-R的序列为:
T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA、
T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC；
7、将步骤6得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和zwf-KYR为引物(或以T2-R与zwf-KYF为引物)进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1243bp或3397bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，zwf-KYF和zwf-KYR的序列为:
zwf-KYF：AGCTTCAATGCTACCCAAGCAGC
zwf-KYR：GCCTTGTCTGAAATACATATA
8、将步骤7得到的PCR检测出现1243bp条带的单交换菌株和步骤7)得到的PCR检测出现3397bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为zwf-KYF和zwf-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在1309bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌WX-02；在3388bp处出现电泳条带时，说明WX-02的基因组上成功整合表达了zwf基因，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的zwf强化表达菌株(即地衣芽胞杆菌WX-02-zwf)。
实施例2：
三种外源蛋白表达载体的获得：
胰蛋白酶表达载体pHY-SGT的构建：
1.基因合成灰链霉菌ATCC 10137中的胰蛋白酶基因序列(如SEQ ID NO.2所示，包括启动子、sgT基因和终止子)，得到sgT基因大小为1660bp；
2.采用EcoRI和XbaI对得到的sgT基因进行酶切，得到双酶切片段；
3.采用EcoRI和XbaI对芽胞杆菌表达载体pHY300PLK进行双酶切，得到双酶切载体片段；
4.将步骤2和3得到的双酶切片段和双酶切载体经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1912bp处出现电泳条带，说明表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：表达载体pHY-SGT)；
SGT-F CGGAATTCCCCGGGCATCGCCCGCCGCAGCC
SGT-R GCTCTAGACCCGGGCAGGAGTTCGCCTGGCAC
pHY-F GTTTATTATCCATACCCTTAC
pHY-R CAGATTTCGTGATGCTTGTC。
纳豆激酶表达载体pP43SacCNK的获得：
纳豆激酶表达载体来源于申请人之前构建的表达载体(一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌，ZL201410417443.0)
碱性蛋白酶游离表达质粒pHY-AprE的构建：
1.以地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA为模板，设计引物AprE-F/AprE-R扩增碱性蛋白酶基因aprE的基因表达框(SEQ ID NO.3所示，包括启动子、aprE基因和终止子)，得到aprE基因序列1740bp；
2.采用EcoRI和XbaI对得到的aprE基因进行酶切，得到双酶切片段；
3.采用EcoRI和XbaI对芽胞杆菌表达载体pHY300PLK进行双酶切，得到双酶切载体片段；
4.将步骤2和3得到的双酶切片段和双酶切载体经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1992bp处出现电泳条带，说明表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：表达载体pHY-AprE)；
AprE-F CGGAATTCTGATCTCATAAAATAAATGAATAGT
AprE-R GCTCTAGAGGGGTCATCTCTTTCGCGTCGT
pHY-F GTTTATTATCCATACCCTTAC
pHY-R CAGATTTCGTGATGCTTGTC。
实施例3：
三种表达外源蛋白基因工程菌的构建及应用：
将胰蛋白酶游离表达载体pHY-SGT、纳豆激酶表达载体pP43SacCNK和碱性蛋白酶游离表达质粒pHY-AprE分别电转入地衣芽胞杆菌WX-02-zwf中，以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选，以pHY-F和pHY-R作为验证引物，PCR验证得到阳性转化子，获得胰蛋白酶表达菌株地衣芽胞杆菌WX-02-zwf/pHY-SGT、纳豆激酶表达菌株WX-02-zwf/pP43SacCNK、碱性蛋白酶表达菌株地衣芽胞杆菌WX-02-zwf/pHY-AprE；
本实施例，将胰蛋白酶游离表达载体pHY-SGT、纳豆激酶表达载体pP43SacCNK和碱性蛋白酶游离表达质粒pHY-AprE分别电转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以上述相同的方法筛选出胰蛋白酶表达菌株地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-SGT、纳豆激酶表达菌株WX-02/pP43SacCNK、碱性蛋白酶表达菌株地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-AprE作为对照。
本实施例通过向15种不同的发酵培养基中，分别接种上述六种外源蛋白基因工程菌，以考察不同的培养基对目标产物的影响，以验证强化表达zwf基因的地衣芽胞杆菌确实能提高外源蛋白的表达量。所用的15种发酵培养基配方如表1所示。
种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；
生产发酵的具体步骤为：
向500mL三角瓶中装入50mL的发酵培养基，然后将种子培养的菌液(OD600 4.0-5.0)以接种量为2％(体积百分比)接入，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。
以上所述的种子发酵培养基和发酵培养基的配方相同，如表1所示。
表1
Figure BDA0002328623870000061
Figure BDA0002328623870000071
15种培养基中其他成分均为：10g/L玉米浆，10g/L酵母粉，10g/L氯化钠，3g/LK2HPO4，6g/L(NH4)2SO4，pH7.0～7.2。
胰蛋白酶酰胺酶酶活测定：
利用相应酰胺物质作为底物，在410nm下测定胰蛋白酶催化酰胺底物生成的产物的吸光系数，利用吸光系数在10min内的变化率来反映胰蛋白酶的酶活大小。具体测定方法为：将43.5mg底物先溶解于1mL二甲基甲酰胺中，之后再将该混合体系溶解于50mM，pH8.0Tris-HCl缓冲液(10mM CaCl2)中，此即为胰蛋白酶酰胺酶酶活测定的底物溶液，测定过程为：在37℃下，测定100μL粗酶液同900μL底物溶液在光径0.5cm的反应池中，在410nm下10min内的吸光值变化，得到ΔA410nm/min。酶活定义为：在37℃下，10min内ΔA410nm/min升高0.1即为胰蛋白酶1个酰胺酶酶活单位(U)，通过公式计算获得胰蛋白酶酰胺酶酶活。
纳豆激酶的检测方法：
采用平板法测定发酵液中纳豆激酶的酶活。先将发酵液10000rom离心5min取上清，倒纤维蛋白原平板，待平板凝固后用微量打孔器打孔，后取10ul发酵上清液点孔，37℃条件下培养10-12h，使用游标卡尺来计算平板上透明圈的直径并与标准液相比较从而得到纳豆激酶的酶活(FU)。
碱性蛋白酶酶活测定：
酶活测定参照中华人民共和国国家标准中所描述的福林酚法进行。
一个单位酶活(U)定义为：一定温度、一定pH条件下，蛋白酶液在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。
其中标准曲线的测定：将标准酪氨酸溶液配置成等梯度的溶液(10、20……80、90、100μg/mL)，进行上述文献中的反应。
样品的蛋白酶活力计算公式＝A×4×N/10
A—样品在分光光度计660nm处测得的数值经标准曲线计算而得的酪氨酸微克数；
N—蛋白酶原液经稀释的倍数；
10—蛋白酶液与酪蛋白的反应时间(min)。
根据上述方法分别计算出WX-02/pHY-SGT和WX-02-zwf/pHY-SGT发酵菌液中胰蛋白酶活差异(见表2)；WX-02/pP43SacCNK和WX-02-zwf/pP43SacCNK发酵菌液中纳豆激酶酶活差异(见表3)；WX-02/pHY-AprE和WX-02-zwf/pHY-AprE发酵菌液碱性蛋白酶活差异(见表4)。
表2胰蛋白酶酶活数据统计
Figure BDA0002328623870000081
Figure BDA0002328623870000091
表3纳豆激酶酶活数据统计
Figure BDA0002328623870000092
表4碱性蛋白酶酶活数据统计
Figure BDA0002328623870000101
从表2-4可看出，在相同的发酵条件下，采用本发明的地衣芽胞杆菌WX-02-zwf/pHY-SGT、WX-02-zwf/pP43SacCNK和WX-02-zwf/pHY-AprE的发酵液中蛋白酶活较对照菌均有大幅提升，均提高了28％以上。说明本发明中的基因工程改造方法在提高地衣芽胞杆菌异源蛋白生产方面具有重要的应用价值。
序列表
<110> 武汉茵慕生物科技有限公司
<120> 强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2079
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctaaaagctt caatgcaacg gatgtgacat tcctcgtttt tgcggggatg cccgctcccg 60
ttcctaaaaa taataactcc aatatccttt cctcctgcta aaaacttcat ctatcacaag 120
catacaggaa gtcttggaaa aaagaaacgc cggcctcgcg tcgggctatg caactaaata 180
ccctgaccgt tttcagtaaa gttttcatac gattcgatct caaatgtttg ctttaaggga 240
ttattagctt taaaatgaag aaaataaact tatgcttcga ataaagtgag gtacgtttaa 300
ttgaaaaaag atcaaatgga accaaaagca gttatcgtaa tatttggcgc aacaggggat 360
ttggcaaaac gaaaactata tccttctatc cacaggctct acgaaaacgg acaaatcggg 420
aatgaattcg cggttgtcgg agtcggcaga cgcccttgga caaatgaaga ctttcgcagt 480
accgtacagc aatcggtttc gaagtttccg ttaaacgaaa aggatgtgga cgagtttaca 540
tctcacttct actatcatcc ttttgatgtt acaaattccg gctcataccg ggaattaaac 600
gaacttatag agaagctgga aagtacatat gatattccga ataaccggat gttttactta 660
gcgatggctc ctgaattttt cggaacgatt gcaaagttcc taaaatcaga gggtgtcact 720
tcaacaacag gctggtcaag gctcgttatc gaaaagcctt tcgggcatga tctgccgagc 780
gcaaaagcct tgaaccagga aatccgtgaa gcttttacag aagatcaaat ttatcggatt 840
gaccattatc taggaaagca aatggtgcag aacatcgaag tcatccgctt tgccaacgcg 900
atttttgagc cgctttggac aaacagatac atctcgaaca ttcaaattac gtcaagtgaa 960
gatttgggtg tggaagacag agcgagatat tatgaaaaat cgggtgcgct tagagacatg 1020
gtgcaaaacc acattcttca aatggtggcg ctgcttgcga tggaaccgcc gatcaagctg 1080
aacacggaag agatccgcag cgaaaaagtg aaggttctca gagcccttcg tccgattcaa 1140
aaagacgatg tcgaccaatt ttttgtgcgc ggccagtatg acgcaggagt cgtcgacgaa 1200
aaacatgttc cggcttatcg cgatgagcaa aacgtagcaa aagattcgaa tacggaaacg 1260
ttcgttgccg gcaaactgct gatcgacaac ttcagatggg ccggtgtgcc gttctacatc 1320
cggacaggca aacggatgca gaaaaaatca acgcagattg tcgtccaatt taaagacatt 1380
ccgatgaatc tttattacgg aaacggcaac acgatgcacc ctaatctgct ggtgattcat 1440
attcagccgg atgaaggcat cacccttcat ttaaacgcaa ggaagcttgg aggcggcact 1500
tttgcccagc cgatcaagct cgactactgc cataactgcg gggacggcat caacacgcct 1560
gaagcttatg aaaagctgat tttggactgc ttgcacggag acgcgacaaa ctttgcccac 1620
tgggatgaag ttgcgctttc ctggagtttt gttgatgcga tttctcaaaa ctgggaggaa 1680
aacaaaaccc tttcccctaa ctataaggcg ggctccatgg ggccgaaagc ttctgacgac 1740
ctgctcgcaa aagacggctt tcattggtgg ccgctttaat aaaaaaacag ccttcacaat 1800
tgaaggctgt ttttttatgc tttcaaggcc tgcatctctt ccggatggct tttgtcccgc 1860
ttccacatca gctgaaggac gaacagcaga aggaatatgc cgaggccgat catatcggaa 1920
tagccttctg gataaatcag cagaagaccg ctggcagccg ccagtattct ttcaaaccag 1980
aacacttttc tcatccagaa tccgatcatg ccagcgccga tggcgatcat tccggacaat 2040
gcggtaaaga ccacccagag aatttcatac caatgcgca 2079
<210> 2
<211> 1660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccgggcatc gcccgccgca gccgcaacat ctacgccccg ccctgcgtcc gctggtgcca 60
gccccttcgg ccgttgttcc cggtcctcgt cgcccgggcg gcccgccgcg aactgcgcgc 120
ccgccccagc cgggaactgt ccgcgcccgt cgaggtcctg ggggccggag ggcgagccga 180
ctggagctcc taccgggcct cccgctccgg ccctccggca gacgggtagg gcggcccgcc 240
ccctctgccg ggtgtccggc gctcccccgc ggcggcggtc ccgcacggcg tacgtgacac 300
gaccgctccc agccgtacgg ggtcgttccg ggcggcgcgt ccccggtccg cgtgacccgg 360
gcggtcctgg aggggcggtg gtggcgcgta cgagcttggc cgaaatgtgc gccttgtggc 420
agcggccacc cgttcgtcga caatcgcagc atcttgacgg gtgcatgacc atgccgtcgc 480
gccccgtcgg ggttcccaca gcgacccccc acgaaagaag gcaatccgtg aagcacttcc 540
tgcgtgcgct gaagagatgc tccgtcgccg tcgccaccgt cgccatcgcg agtcgtcggc 600
ctccagcccg tcaccggcct cggccgcccc caacccgcgt cgtcggcgga acccgcgcgg 660
cccagggcga gttccccttc atggtccggc tctccatggg ctgcggcggc gccctctacg 720
cccaggacat cgtcctcacc gcggcccact gcgtgagcgg atcgggcaac aacacctcga 780
tcacggccac cggcggcgtc gtcgacctcc agtcgtccag cgccgtcaag gtccgctcca 840
ccaaggtcct ccaggccccc ggctacaacg gcaccggcaa ggactgggcg ctcatcaagc 900
tcgcccagcc catcaaccag cccacgctga agatcgccac caccaccgcc tacaaccagg 960
gcacgttcac cgtcgccggc tggggcgcca accgcgaggg cggcagccag cagcgctacc 1020
tgctcaaggc caacgtcccg ttcgtctccg acgccgcctg ccgctccgcg tacggcaacg 1080
agctcgtggc caacgaggag atctgcgccg gataccccga caccggtggc gtcgacacct 1140
gccagggtga ctccggcggc ccgatgttcc gcaaggacaa cgccgacgag tggatccagg 1200
tcggcatcgt cagctggggc tacggctgcg cccggcccgg ctacccgggt gtctacaccg 1260
aggtctcgac cttcgcttcc gccatcgcct cggccgcccg cacgctctga cggcacgtac 1320
cggcacccgg ccgctcccgg gtgatcaccc ctgatcagcg ccggggggcg tccgtcttct 1380
cgggcgcccc ccgcgcttcg tgcccgccgc cccctcgggc tcagccgaac aggtcgaggt 1440
agtgctgcgc gtggaccggg tggtagtcac cgaagtcgac ggatgccggg tcaccaccgg 1500
tctcggcgac gacgagccgg tcgaggtagt agtcccagcc ggggccgacc ccgcccgcca 1560
tggccgggtc gtcgccgacg gactggctga acgtgagcgt ggtgacgccc tcgtgctcga 1620
cgagcgtgag ggtcatgtgc caggcgaact cctgcccggg 1660
<210> 3
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgatctcata aaataaatga atagtatttt cataaaatga atcagatgga gcaatctcct 60
gtcattcgcg gccctcggga cctctttccc tgccaggctg aagcggtcta ttcatacttt 120
cgaactgaac atttttctaa aacagttatt aataaccaaa aaattttaaa ttggtcctcc 180
aaaaaaatag gcctaccata taattcattt tttttctata ataaattaac agaataattg 240
gaatagatta tattatcctt ctatttaaat tattctgaat aaagaggagg agagtgagta 300
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttcatgct cgtgttcacg 360
atggcattca gcgattccgc ttctgctgct caaccggcga aaaatgttga aaaggattat 420
attgtcggat ttaagtcagg agtgaaaacc gcatctgtca aaaaggacat catcaaagag 480
agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 540
aaagaagcgc ttaaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcat 600
gtggcccatg ccttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 660
gtgcaggctc aaggctttaa gggagcgaat gtaaaagtag ccgtcctgga tacaggaatc 720
caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 780
tataacaccg acggcaacgg acacggcaca catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 840
aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 900
aattcaagcg gaagcggatc atacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 960
aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 1020
caggcagtcg acaatgcata tgcaaaaggg gttgtcgttg tagctgcagc agggaacagc 1080
ggatcttcag gaaacacgaa tacaattggc tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 1140
gttggtgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 1200
gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 1260
ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1320
aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1380
ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1440
catattctaa caaatagcat atagaaaaag ctagtgtttt tagcactagc tttttcttca 1500
ttctgatgag ggttgttcaa tattttgaat ccgttccatg atcgtcggat ggccgtattt 1560
aaaaatcttg acgagaaacg gcgggtttgc ctcgctcagc ccggcttttg agagctcttg 1620
aaacgtcgaa accgctgcat cgctgttttg cgtcagttca atcgcatact ggtcagcagc 1680
tttttcctga tgcctcgaaa ctgcgttcgt aaatggagac gacgcgaaag agatgacccc 1740
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggatcctg aggcgatgga tgttct 26
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catccgttgc attgaagctt ttagttgacg aaccgtatcc gc 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcggatacgg ttcgtcaact aaaagcttca atgcaacgga tg 42
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttgctctta ccgtttgctg agtgtgcgca ttggtatgaa attctctg 48
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagagaattt cataccaatg cgcacactca gcaaacggta agagcaaa 48
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctctagatg tcaaacgctc cggtgg 26
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgtgataac tcggcgta 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcaagcagca gattacgc 18
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcttcaatg ctacccaagc agc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gccttgtctg aaatacatat a 21
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cggaattccc cgggcatcgc ccgccgcagc c 31
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctctagacc cgggcaggag ttcgcctggc ac 32
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtttattatc cataccctta c 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagatttcgt gatgcttgtc 20
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cggaattctg atctcataaa ataaatgaat agt 33
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gctctagagg ggtcatctct ttcgcgtcgt 30
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtttattatc cataccctta c 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagatttcgt gatgcttgtc 20

Claims (5)

1.强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，所述的葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的异源蛋白为胰蛋白酶、纳豆激酶或碱性蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括下述步骤：
（1）以地衣芽胞杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增出zwf基因，及用于整合表达zwf的上游同源臂A和用于整合表达zwf的下游同源臂B；
（2）通过重叠延伸PCR将用于整合表达Zwf的上游同源臂A、zwf基因和用于整合表达Zwf的下游同源臂B连接到一起，构成目的基因片段；
（3）采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（4）准备质粒 T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到基因整合表达质粒T2(2)-zwf；
（6）将基因整合表达质粒T2(2)-zwf转入地衣芽胞杆菌中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（7）将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到用于整合表达zwf的上游同源臂A或用于整合表达zwf的下游同源臂B与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（8）挑选用于整合表达zwf的上游同源臂A与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与用于整合表达zwf的下游同源臂B与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到Zwf强化表达的地衣芽胞杆菌；
以上所述的Zwf为葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因。
5.根据权利要求2所述的应用，当采用葡萄糖6-磷酸脱氢酶强化表达的地衣芽胞杆菌在胰蛋白酶、或纳豆激酶或碱性蛋白酶的异源蛋白生产时，所使用的发酵培养基的配方包括：10-20g/L葡萄糖、5-13g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆，7-11g/L酵母粉，8-12g/L氯化钠，2-5g/L K2HPO4和4-8g/L(NH4)2SO4；或5-10g/L骨蛋白胨、5-10g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆、7-11g/L酵母粉、8-12g/L氯化钠、2-5g/L K2HPO4和4-8g/L(NH4)2SO4。
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