JP4926049B2 - ポリアミノ酸を形成または分解するバシラス・リケニホルミス由来の新規遺伝子産物およびそれに基づく改良された生物工学的生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）由来の５種または４種の新規遺伝子およびその遺伝子産物、ならびに十分に類似した遺伝子およびタンパク質に関するもので、それらはポリアミノ酸の形成、修飾および／または分解にin vivoで関与し、この目的のために、かつそれに基づいて、これらの遺伝子の不活性化または活性化を特徴とする微生物により改良された生物工学的生産方法にそれらを使用することができる。

本発明は、生物工学の分野、具体的には対象とする生製品を形成することができる微生物の発酵による生製品の製造におけるものである。これには、例えば、低分子量化合物、例えば栄養補助食品または医薬関連化合物の製造、あるいはその多様性のために産業的用途に関する広範な分野が存在するタンパク質の製造が含まれる。第１の場合では生製品を製造するために該当する微生物の代謝特性を利用および／または修飾し、第２の場合では、目的とするタンパク質の遺伝子を発現する細胞を使用する。したがって、どちらの場合も、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）が主として関係する。

微生物の発酵についての、特に産業規模でも広範な従来技術が存在し、それは、発酵槽の技術設計を介して生成速度および栄養利用に関しての該当する株の最適化から、該当する細胞自体および／または発酵培地からの価値のある生成物の単離にまで及ぶ。遺伝学と微生物学の両方、ならびにプロセス工学および生化学の手法がそれに適用される。本発明の目的は、使用する微生物の共通の特性に関して、特に使用する株の遺伝的特性のレベルで実際の発酵工程の障害となるこの方法を改良することである。

工業的な生物工学的生産では、該当する微生物を、その代謝特性に適するように設計された発酵槽中で培養する。培養の間、その微生物は提供された基質を代謝し、実際の生成物に加えて、通常は対象とならず、かつ／または、下記で説明するように、通常、発酵または後処理における問題につながる可能性がある多数の他の物質を形成する。

発酵は、通常非常に複雑な方法であり、多数の異なるパラメーターを調整し、モニターしなければならない。したがって、例えば使用する微生物に発酵の間中酸素を十分に供給しなければならない（通気速度の調節）ことを意味する好気的方法が非常にしばしば使用される。そのようなパラメーターのさらなる例は、反応装置の外形、栄養培地の連続して変化する組成、ｐＨまたはＣＯ_２形成速度である。経済性の点からも、方法管理自体に関しても特に重要なパラメーターは、例えば、確実に反応装置の内容物ができるだけ完全に混合されるようにする撹拌システムを通して必要なエネルギー導入量である。さらに、基質の分配に加えて、生物への酸素の十分な供給も確実になされる。

発酵終了後、生成用生物の除去に加えて、いわゆる発酵槽スラリーから価値のある対象生成物を精製および／または濃縮することが通常必要である。後処理方法は、例えば、様々なクロマトグラフィーおよび／または濾過の工程を含み得る。したがって、価値のある生成物の含有量に加えて、発酵槽スラリーの生物物理学的特性、特に発酵終了直後のその粘性も全体的な後処理方法の成功に決定的に重要である。

望ましくない効果も起こり得るので、その特性はまた、選択した微生物の代謝活性によっても影響を受ける。これには、例えば、発酵中における栄養培地の粘性の頻繁な増大がある。これは混合の妨害となり、それによって物質の輸送および反応装置内の酸素供給が損なわれる。粘性の増大が例えば濾過工程の効率を大幅に損なうので、大部分の問題が続く後処理の間で生じる。

バシラス属の種が、本質的に、該当するγペプチド結合を介して連結されたポリアミノ酸を意味するポリγ−グルタミン酸（ＰＧＡ）および／またはポリγ−アスパラギン酸を含む粘液を産生することが特に知られている。枯草菌（Bacillus subtilis）に対する科学的研究では、それは主に３種の遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｔＡおよびｙｗｔＢならびにそれに由来する遺伝子産物であり、それらはポリγ−グルタミン酸の産生に関係し、ｙｗｔＤの遺伝子産物は分解に関与する。遺伝子の一般表記「ｙｗｔ」は、同じ機能について通常使用される略語「ｃａｐ」および「ｐｇｓ」とこの関係において同義である。これは下記で説明する。

Ｍ．Ａｓｈｉｕｃｈｉらによる、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２６８巻、５３２１〜５３２８ページにある文献「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｏｌｙ ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ」（２００１）では、枯草菌由来の３種のサブユニットＰｇｓＢ、ＰｇｓＣおよびＰｇｓＡからなるＰｇｓＢＣＡ（ポリγ−グルタミン酸合成酵素複合体ＢＣＡ）酵素複合体について記載されている。この複合体は、文献によれば、非定型アミドリガーゼであり、グルタミン酸のＤとＬの光学異性体をどちらも対応するポリマーに転換する。この文献によれば、それに記載されている遺伝子破壊実験は、この複合体が枯草菌中のこの反応を触媒する唯一のものであるという証拠としてみなされる。

Ｙ．Ｕｒｕｓｈｉｂａｔａらは、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１８４巻、３３７〜３４３ページにある文献「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｙｗｓＣ ｇｅｎｅ，ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｇａｍｍａ−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」（２００２）中で、とりわけ３種の遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｔＡおよびｙｗｔＢの欠失突然変異により、枯草菌におけるＰＧＡの産生に関与する３種の遺伝子産物は、これら３種の遺伝子によってコードされることを示している。それらは、この順序で、それに続く遺伝子ｙｗｔＣとともに、この微生物中で可干渉性オペロンを形成する。

ＰＧＡの代謝に関連するさらなる遺伝子が、それ自体のオペロンにおけるｙｗｔＣの下流にある枯草菌のゲノムに位置することは、文献「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｙｗｔＤ ｇｅｎｅ，ｗｈｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｇａｍｍａ−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」（２００３）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１８５巻、２３７９〜２３８２ページ中で、Ｔ．ＳｕｚｕｋｉおよびＹ．Ｔａｈａｒａによって示されている。この遺伝子は、ＰＧＡを加水分解することができるＤＬ−エンドペプチダーゼをコードしており、そのためγ−ＤＬ−グルタミルヒドロラーゼと呼ぶことができる。

これらの酵素の最新の概説は、Ｍ．ＡｓｈｉｕｃｈｉおよびＨ．Ｍｉｓｏｎｏによる、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第５９巻、９〜１４ページ、２００２にある論文「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｐｏｌｙ−ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」によってさらに提供されている。ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡと相同であり、炭疽菌（B.anthracis）におけるＰＧＡ合成酵素複合体をコードする遺伝子は、その中でｃａｐＢ、ｃａｐＣおよびｃａｐＡと呼ばれている。下流に位置する遺伝子は、この論文によれば、炭疽菌では（「Ｄ−ＰＧＡ脱重合酵素」の）ｄｅｐ、枯草菌では（「ＰＧＡ脱重合酵素」の）ｐｇｄＳと呼ばれる。

その当技術分野の現在の状況では、これらの酵素活性は、主として、ポリγ−グルタミン酸を、例えば化粧品で使用する原材料として製造するためにすでに積極的に使用されているが、その正確なＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、特にバシラス・リケニホルミス由来のものは今まで知られていない。したがって、例えば、出願ＪＰ０８３０８５９０Ａは、ＰＧＡ産生株自体の、すなわち枯草菌やバシラス・リケニホルミスなどのバシラス種の発酵によるＰＧＡの製造について開示しており、培地からのこの原材料の単離についても記載されている。枯草菌変種ｃｈｕｎｋｏｏｋｊａｎｇは、出願ＷＯ０２／０５５６７１Ａ１によれば、それに特に適した微生物である。

このように、一部の発酵では、発酵によって生成される価値のある生成物としてＧＬＡに関心がもたれている。

しかし、他のすべての発酵における関心事は、価値のある他の生成物の製造にあり、この関係から、ポリアミノ酸の形成は、上記した理由で、否定的な副作用を意味する。その形成に起因する発酵培地の粘性の増大を克服する通常の手順は、撹拌器の速度を上げることである。しかし、これはエネルギー導入量に影響を及ぼす。さらにその結果、発酵微生物は、微生物にとってはかなり大きなストレス要因となる剪断力の増大にさらされる。結局、非常に高い粘性は、それによっても克服することはできないので、結果として粘性が高くなければ産生を継続できるとはいえ、発酵の成熟前に終了が必要となり得る。

したがって、多数の発酵方法の否定的な副作用としての粘液形成は、様々な理由で、発酵の全体的な結果に対して否定的な作用を及ぼす可能性がある。栄養培地の粘性の増大に関わらず連続発酵の継続に成功するための従来の方法は、特にそれでは原因の制御とならないため、不十分であるとしかいえない。

したがって、より差し迫った問題は、微生物の発酵中に、粘液、特にポリγ−グルタミン酸などのポリγ−アミノ酸に起因する粘液の望ましくない形成をできる限り抑制することであった。それは特に、原因の制御を示す解決策を見出すことを意図するものであった。この問題のさらなる側面は、ＧＬＡ合成遺伝子産物の積極的利用、ならびにその分解および／または修飾のための該当する遺伝子の供給である。

ポリアミノ酸の形成または分解に関与する下記の各タンパク質は、各場合で、この問題に対して基本的に等価な部分的な解決策となる：
−配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｓＣによってコードされるＹｗｓＣ（ＣａｐＢ、ＰｇｓＢ）；
−配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８３％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｓＣ’によってコードされるＹｗｓＣ’（ＹｗｓＣの切断型変異体）；
−配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８２％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｔＡによってコードされるＹｗｔＡ（ＣａｐＣ、ＰｇｓＣ）；
−配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７２％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｔＢによってコードされるＹｗｔＢ（ＣａｐＡ、ＰｇｄＡ）；および
−配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも６７％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｔＤによってコードされるＹｗｔＤ（Ｄｅｐ、ＰｇｄＳ）。

例えば、言及したＵｒｕｓｈｉｂａｔａらによる文献から明らかなように、ＧＬＡ形成に関与する４種または３種の遺伝子は、枯草菌において、同じオペロン上に連続して存在する。ｙｗｔＤは、その直接下流に位置する。in vivoで複合体として一緒に作用するこれらの構成成分、およびそれによって形成されたポリアミノ酸に対して作用する下流の構成成分からなるこの機構が、特にバシラス属の多数の別の微生物でも見出されることが考えられる。したがって、共通の生化学的機能に加えて、本発明の統一性をもたらす局面が遺伝子レベルでも存在する。

さらなる部分的な解決策は、該当する核酸ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡ、ｙｗｔＢおよびｙｗｔＤ、ならびに、それに基づく、微生物の発酵中にポリアミノ酸に起因する粘液の形成を低下させるための該当する核酸の使用、ならびに対応する微生物の発酵方法によって示される。本発明に従った、遺伝子レベルでの粘液形成の低下では、遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡまたはｙｗｔＢの少なくとも１つを機能的に不活性化し、かつ／あるいはｙｗｔＤの活性を亢進する。さらに、ポリγ−グルタミン酸の製造、修飾または分解のためにこれらの遺伝子または誘導遺伝子産物が積極的に使用されている。

原則として、発酵性微生物すべてに対し、特にバシラス属の微生物に対して適用可能な本発明により、ポリアミノ酸、特にＧＬＡの形成を遺伝子レベルで防止するか、または直ちにそれをまた分解させて、ポリアミノ酸以外の価値のある生成物、特に薬学上重要な低分子量化合物またはタンパク質の発酵生産に使用される微生物をもたらす。一方では、これは培養培地の粘性、さらには混合性、酸素導入量および費やされるエネルギーに対して有利な効果を有し、他方では、対象とする生成物の後処理が大幅に促進される。さらに、使用する原材料、例えばＮ源の大部分は、目的としない生成物には転換されないため、その結果、全体的に高い発酵収率が期待される。

本発明のさらなる態様によれば、前記遺伝子は、具体的には生物工学的に生産され、産生細胞中に、またはそれとは無関係に触媒として適当な反応混合物中に導入され、得られた誘導タンパク質のＹｗｓＣ、ＹｗｓＣ’、ＹｗｔＡ、ＹｗｔＢおよび／またはＹｗｔＤにより、ＧＬＡ合成遺伝子産物の積極的使用に、あるいはその分解および／または修飾に現在利用可能である。

第１の部分的な解決策は、タンパク質ＹｗｓＣ（ＣａｐＢ、ＰｇｓＢ）であって、それはポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｓＣによってコードされる。

この特定の酵素は、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムの分析から得られた（実施例１を参照）。このタンパク質は、本出願の配列番号１および２で示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列により再現性よく利用可能できる（実施例１を参照）。

これは、緒言で言及した文献情報に一致して、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体のサブユニットの形態をとる。当技術分野の現段階で知られ、それに最も類似したタンパク質は、枯草菌由来の相同体ＹｗｓＣであることが判明しており、それはＧｅｎＢａｎｋデータベース（米国国立衛生研究所の国立生物工学情報センターＮＣＢＩ、米国メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に受入番号ＡＢ０４６３５５．１で示され、核酸レベルで同一性７５．４％の相同性を有するが、その一致はアミノ酸レベルで同一性８６．１％である（実施例２を参照）。これらの有意な一致から、同じ生化学的機能だけでなく、特許請求の範囲内にある、同じ機能を有する多数の関連タンパク質の存在も示唆され、それもまた、本出願によって付与される保護の中に含まれる。

下記の実施態様は、この第１の部分的な解決策に割り当てられる：
−配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる任意の対応するタンパク質ＹｗｓＣ。これは、配列の一致が高いことから導き出される結論は、機能、および遺伝子レベルでの相互の置換性における一致が大きいためである。
−ポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を示し、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する任意のタンパク質ＹｗｓＣ（ＣａｐＢ、ＰｇｓＢ）。

本出願に関して、「少なくともＸ％」という形式の表現は、「極端な値Ｘおよび１００、ならびにその間にあるすべての整数および非整数の百分率を含めたＸ％〜１００％」を意味する。

バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から得られた特定のタンパク質が各場合で最も好ましい。この理由は、本出願で具体的に記載されており、１００％の再現性で利用できるためである。

第２の部分的な解決策は、タンパク質ＹｗｓＣ’（ＹｗｓＣの切断型変異体である）であって、該タンパク質は、ポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８３％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｓＣ’によってコードされる。

この特定の酵素は、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムの分析から得られた（実施例１を参照）。このタンパク質は、本出願において配列番号３および４で示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列により再現性よく利用可能である（実施例１を参照）。

実施例１でさらに説明するように、図６に示すバシラス・リケニホルミスと枯草菌に由来するＹｗｓＣ間の配列比較から、バシラス・リケニホルミスに由来するＹｗｓＣの最初の１６個のアミノ酸が、ポリγ−グルタミン酸合成酵素複合体のサブユニットＣとしてのその機能にとって重要でないことが示唆される。したがって、本発明は、この切断型変異体でも実施される。

本出願に関して言及される、「５種または４種の遺伝子」とは、本発明に従って、ｙｗｓＣおよびｙｗｓＣ’を２種の遺伝子として扱い、その得られるタンパク質を２種のタンパク質として扱うことを意味する。その一方で、おそらく、これらの「遺伝子」の両方が、各場合で該当する生物中にin vivoで存在するのではなく、各場合でその１つだけが存在し、その結果、対応する遺伝子産物ＹｗｓＣまたはＹｗｓＣ’の１つだけがやはり存在する可能性が高いことが想定される。したがって、第１および第２の部分的な解決策は、ある程度は、同じ対象の２つの側面を表すものである。しかし、２つの部分的な解決策に分けることは、アミノ酸レベルでは違いがあるため妥当であると思われる。

当技術分野の現段階で知られ、それに最も類似したタンパク質はまた、枯草菌由来の相同体ＹｗｓＣであることが判明しており、それはＧｅｎＢａｎｋデータベースに受入番号ＡＢ０４６３５５．１で示され、核酸レベルで同一性７８．５％の相同性を有し、アミノ酸レベルでの一致は、同一性８９．６％である（実施例２を参照）。

上記の記載に従って、下記の実施態様は、この第２の部分的な解決策に割り当てられる：
−配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる任意の対応するタンパク質ＹｗｓＣ’。
−ポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を示し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する任意のタンパク質ＹｗｓＣ’（ＹｗｓＣの切断型変異体である）。

本出願で具体的に記載されており、１００％の再現性で利用できるため、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から得られた特定のタンパク質が各場合で最も好ましい。

第３の部分的な解決策は、タンパク質ＹｗｔＡ（ＣａｐＣ、ＰｇｓＣ）であり、それはポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８２％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｔＡによってコードされる。

この特定の酵素は、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムの分析から得られた（実施例１を参照）。このタンパク質は、本出願において配列番号５および６で示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列により再現性よく利用できる（実施例１を参照）。

これは、緒言で言及した文献情報と一致して、ポリγ−グルタミン酸合成酵素複合体の別のサブユニットの形態をとる。当技術分野の現段階で知られ、それに最も類似したタンパク質は、枯草菌由来の相同体ＹｗｓＡであることが判明しており、それはＧｅｎＢａｎｋデータベースに受入番号ＡＢ０４６３５５．１で示され、核酸レベルで同一性７７．８％の相同性を有するが、その一致は、アミノ酸レベルで同一性８９．９％である（実施例２を参照）。これらの有意な一致から、同じ生化学的機能だけでなく、特許請求の範囲内にある、同じ機能を有する多数の関連タンパク質の存在も示唆され、それもまた、本出願によって付与される保護の中に含まれる。

下記の実施態様は、この第３の部分的な解決策に割り当てられる：
−配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる任意の対応するタンパク質ＹｗｔＡ。
−ポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を示し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する任意のタンパク質ＹｗｔＡ（ＣａｐＣ、ＰｇｓＣ）。

本出願で具体的に記載され、１００％の再現性で利用できるので、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から得られた特定のタンパク質が各場合で最も好ましい。

第４の部分的な解決策は、タンパク質ＹｗｔＢ（ＣａｐＡ、ＰｇｓＡ）であり、それはポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７２％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｔＢによってコードされる。

この特定の酵素は、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムの分析から得られた（実施例１を参照）。このタンパク質は、本出願において配列番号７および８で示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列により再現性よく利用できる（実施例１を参照）。

これは、緒言で言及した文献情報に一致して、ポリγ−グルタミン酸合成酵素複合体の第３のサブユニットの形態をとる。当技術分野の現段階で知られ、それに最も類似したタンパク質は、枯草菌由来の相同体ＹｗｓＡであることが判明しており、それはＧｅｎＢａｎｋデータベースに受入番号ＡＢ０４６３５５．１で示され、核酸レベルで同一性６７．１％の相同性を有するが、その一致は、アミノ酸レベルで同一性６５．８％である（実施例２を参照）。これらの有意な一致から、同じ生化学的機能だけでなく、特許請求の範囲内にある、同じ機能を有する多数の関連タンパク質の存在も示唆され、それもまた、本出願によって付与される保護の中に含まれる。

下記の実施態様は、この第４の部分的な解決策に割り当てられる：
−配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる任意の対応するタンパク質ＹｗｔＢ。
−ポリアミノ酸の形成に関与し、配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を示し、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する任意のタンパク質ＹｗｔＢ（ＣａｐＡ、ＰｇｓＡ）。

本出願で具体的に記載され、１００％の再現性で利用できるので、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から得られた特定のタンパク質が各場合で最も好ましい。

第５の部分的な解決策は、タンパク質ＹｗｔＤ（Ｄｅｐ、ＰｇｄＳ）であって、それはポリアミノ酸の分解に関与し、配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも６７％の同一性を示すヌクレオチド配列ｙｗｔＤによってコードされる。

この特定の酵素は、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムの分析から得られた（実施例１を参照）。このタンパク質は、本出願において配列番号９および１０で示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列により再現性よく利用できる（実施例１を参照）。

これは、緒言で言及した文献情報に一致して、γ−ＤＬ−グルタミルヒドロラーゼ、Ｄ−ＰＧＡ脱重合酵素またはＰＧＡ脱重合酵素の形態をとる。当技術分野の現段階で知られ、それに最も類似したタンパク質は、枯草菌由来の相同体ＹｗｔＤであることが判明しており、それはＧｅｎＢａｎｋデータベースに受入番号ＡＢ０８０７４８で示され、核酸レベルで同一性６２．３％の相同性を有し、アミノ酸レベルでの一致は、同一性５７．３％である（実施例２を参照）。これらの有意な一致から、同じ生化学的機能だけでなく、特許請求の範囲内にある、同じ機能を有する多数の関連タンパク質の存在も示唆され、それもまた、本出願によって付与される保護の中に含まれる。

下記の実施態様は、この第５の部分的な解決策に割り当てられる：
−配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる任意の対応するタンパク質ＹｗｔＤ。
−ポリアミノ酸の分解に関与し、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも６２％の同一性を示し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する任意のタンパク質ＹｗｔＤ（Ｄｅｐ、ＰｇｄＳ）。

本出願で具体的に記載され、１００％の再現性で利用できるので、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から得られた特定のタンパク質が各場合で最も好ましい。

各場合において、これらの中で、ポリアミノ酸の形成または分解に関与し、微生物によって、好ましくは細菌によって、特に好ましくはグラム陽性細菌によって、これらの中で好ましくはバシラス属の１つによって、それらの中で特に好ましくはバシラス・リケニホルミス種の１つによって、その中で極めて特に好ましくはバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３によって天然に産生される前記した本発明のタンパク質が各場合に優先される。

これは、この問題に従って、これらの中で特にグラム陽性細菌に由来する細菌を、特に、バシラスのような、産生した価値のある産物およびタンパク質を分泌することができるものを頻繁に使用する、微生物の発酵の改良に関心があったからである。さらに、これに関して豊富な臨床経験が存在する。さらに、言及した通り、バシラス・リケニホルミスの、具体的にはバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３の配列表で示されるタンパク質を検出することが可能であった。該当する生物の関係の程度が大きくなることが、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の一致の程度が大きくなること、即ちその交換可能性に結びつくことが予想される。

これまでの記載に従って、各場合で該当する下記の核酸は、記載した部分的な解決策に対する本発明の別の表現として割り当てられる：
−ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｓＣ（ｃａｐＢ、ｐｇｓＢ）；
−配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する、対応する核酸ｙｗｓＣ；
−ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８３％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｓＣ’ （ｙｗｓＣの切断型変異体である）；
−配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する、対応する核酸ｙｗｓＣ’；
−ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８２％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｔＡ（ｃａｐＣ、ｐｇｓＣ）；
−配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する、対応する核酸ｙｗｔＡ；
−ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７２％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｔＢ（ｃａｐＡ、ｐｇｓＡ）；
−配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する、対応する核酸ｙｗｔＢ；および
−ポリアミノ酸の分解に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも６７％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｔＤ（ｄｅｐ、ｐｇｄＳ）；および
−配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を示しその順に好ましさも大きくなるが、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する、対応する核酸ｙｗｔＤ。

本明細書とともに提供される核酸は、該当するタンパク質の活性の不活性化または亢進についてそれ自体知られている分子生物学の方法により使用することができる。したがって、不活性化は、例えば、適当な欠失ベクターを介して可能であり（下記を参照）、活性の亢進は、有利には過剰発現によって起こり、それは発現ベクターの助けを借りて実現することができる（下記を参照）。したがって、提起された問題は、ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡおよび／またはｙｗｔＢの不活性化、ならびに／あるいはｙｗｔＤ遺伝子活性の亢進により、これらの核酸を介して果たされる。

各場合で示される相同性の範囲内にある対応する遺伝子は、対象とする生物から、例えば、プローブの助けを借りて得ることができ、そのプローブは、配列１、３、５、７、または９に基づいて調製することができる。これらの完全な遺伝子は、ＰＣＲプライマーを作製するためのモデルとして使用することもでき、そのプライマーを介して、該当する遺伝子を、対応する全ＤＮＡ調製物から利用することもできる；これらの遺伝子は、前記のタンパク質を提供することができる。これに関する成功率は、該当する株とプローブまたはＰＣＲプライマーの構築に使用した株、したがってこの場合ではバシラス・リケニホルミスの関係が近くなるとともに通常大きくなる。

各場合において、これらの中で、微生物中に、好ましくは細菌中に、特に好ましくはグラム陽性細菌中に、これらの中で好ましくはバシラス属の１つの中に、それらの中で特に好ましくはバシラス・リケニホルミス種の１つの中に、その中で極めて特に好ましくはバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３中に天然に存在する本発明の核酸が各場合で優先される。

上記した通り、かかる微生物の発酵にこれらの遺伝子を利用することに特定の関心がもたれている。その一方で、本発明は、本明細書に記載した遺伝子および／またはタンパク質を介して、ポリアミノ酸の、特にγグルタミン酸の代謝を、少なくとも一部分で、それが合成、修飾および／または分解されるときに調整することができる可能性にも関連する。これについての成功率は一般的に、特に適当なトランスジェニック宿主細胞において、該当する遺伝子と天然の細胞の遺伝子との一致の程度に従い高くなる。

さらに、原則として全ての天然の生物から容易に別の実施態様の遺伝子およびタンパク質を単離することが可能である。

本発明のさらなる実施態様は、上記した本発明のタンパク質をコードするすべての核酸である。

したがって、特に関連性が薄い種間では、それぞれのアミノ酸をコードする同義コドン頻度に違いがあり、タンパク質生合成装置も例えば利用可能な数の適当な担持ｔＲＮＡを介してそれに適合する。関連性が低い種への前記遺伝子の１つの移入は、それがコドンに関して適切に最適化されている場合、例えば、該当するタンパク質の欠失突然変異または合成に特にうまく使用することができる。ＤＮＡレベルでは高い割合であるが、アミノ酸レベルでの結果に影響しない違いを導入することが可能である。この理由から、そのような核酸も本発明の実施態様に相当する。

本発明はさらに、前記に示した本発明の核酸領域を含むベクターに関する。

これは、本発明に関連する核酸を取り扱うため、即ち具体的には本発明のタンパク質生成用に調製するために、それらがベクター中に適切に連結されるからである。そのようなベクターおよび関連する操作方法は、従来技術において詳細に記載されている。ベクターは、クローニング用でも発現用でも様々な範囲で多数市販されている。これには、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスに由来するベクター、あるいは殆どの合成ベクターが含まれる。それらのベクターはまた、細胞型の性質に従って区別され、その細胞型の中でそれらは、例えば、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母または高等真核生物用のベクターへとそれら自体を確立することができる。それらは、例えば分子生物学的検討および生化学的検討、ならびに該当する遺伝子または関連するタンパク質の発現に適した開始点を形成する。これらは、関連の従来技術から明らかであるように、特に欠失または発現亢進用の構築物の調製には事実上不可欠である。

これらの中で好ましいベクターは、上記した本発明の核酸を２つ以上含むものである。

これは、さらに一方では該当する遺伝子を同時に保存できるか、または同じプロモーターの制御下で発現させることができるからである。他の適用によれば、本発明の遺伝子の完全なコピーを２つ以上同時に含むベクターは、複数のこれらの遺伝子で同時に欠失した欠失突然変異体を生かしておく（救済する）ように機能できる。次いで、このベクターの標的を定めた除去により、この複数の遺伝子が同時に停止する。

他の実施態様では、本発明のベクターはクローニングベクターである。

これは、クローニングベクターが、対象とする遺伝子の貯蔵、生物学的増幅または選択のほかに、その分子生物学的特徴付けに適しているからである。同時に、それらは輸送可能かつ貯蔵可能な形の特許請求の範囲に係る核酸であり、細胞に関連しない、例えばＰＣＲやin vitro突然変異生成法などの分子生物学的技術の開始点でもある。

本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。

これは、そのような発現ベクターが、生物学的生成系において対応する核酸を提供することで、該当するタンパク質を生成する基礎となるからである。本発明のこの対象の好ましい実施態様は、発現に必要な遺伝エレメント、例えば最初からこの遺伝子の前に位置する天然のプロモーター、または異なる生物由来のプロモーターによる発現ベクターである。これらのエレメントは、例えばいわゆる発現カセットの形で配置することができる。別の可能性は、１つまたはすべての制御エレメントがそれぞれの宿主細胞によっても提供されるべきであることである。発現ベクターは、例えば、選択した発現系、特に宿主細胞に整合する最適なコピー数などのさらなる特性に関して特に好ましい（下記を参照）。

レプリコンとして存在するベクターに基づいて完全な遺伝子産物を形成する可能性は、上記した救済および特定の遺伝子の停止に特に重要である。逆に、発現ベクターを提供することは、本発明のタンパク質の形成を亢進させ、それによって該当する活性を上昇させる最良の可能性である。

遺伝子修飾後、上記に示した本発明の核酸を１つ含む細胞は、本発明の別個の対象となる。

これは、本発明のタンパク質を合成するための遺伝情報をこれらの細胞が含むためである。これらは、具体的には、自体既知の方法によって本発明の核酸を用いてもたらされた細胞、またはそのような細胞から誘導された細胞を意味する。この目的に適するように選択された宿主細胞は、比較的簡単に培養し得る、かつ／または高い産生収率を提供できるものである。

ヒト胚性幹細胞を特許の保護下に置くことができない国では、原則として、本発明のそのようなヒト胚性幹細胞を、付与される保護から除外することが必要である。

本発明の細胞により、例えば、対応する遺伝子の増幅が可能となるが、それらに突然変異を誘発させ、またはそれらを転写かつ翻訳し、該当するタンパク質を最終的に生物工学的に生産することも可能となる。この遺伝情報は、細菌の場合ではプラスミド中に位置するという意味で別個の遺伝エレメントとして染色体外で存在することもでき、あるいは、染色体中に組み込むこともできる。適切な系の選択は、例えば、遺伝子または生物の性質および貯蔵期間や、突然変異生成または選択の性質などの問題に依存する。

これらには、特にＹｗｔＤを過剰発現する細胞のほかに、特に、トランス位にあるベクターを介して遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡおよびｙｗｔＢの１つを含み、それによって対応する欠失に使用することができるものである（下記を参照）。

これは、前記核酸が、そのような細胞中のベクターの、具体的には前記したベクターの一部である好ましい実施態様を説明するものである。

細菌である宿主細胞がこれらの中では好ましい。

これは、細菌が、世代時間が短く、培養条件に対する要求が低いことを特徴とするからである。費用効率の高い方法を確立することがそれによって可能である。さらに、細菌の発酵においての豊富な経験が存在する。グラム陰性またはグラム陽性の細菌は、個々の場合で実験的に確認されるべきである多様な理由で、例えば栄養源、生成物形成速度、必要とする時間などの特定の生成に適する可能性がある。

好ましい実施態様は、グラム陰性細菌、特に大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）、シュードモナス（Pseudomonas）またはザントモナス（Xanthomonas）属の１つ、特に大腸菌（E.coli）Ｋ１２、大腸菌Ｂまたはクレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）株、特に好ましいものは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌ＲＶ３０８、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＸＬ−１またはクレブシエラ・プランチコラ（Ｒｆ）株の派生株を含む。

これは、多数のタンパク質が、例えば大腸菌などのグラム陰性細菌の細胞周辺腔中に分泌されるからである。これは、特定の適用に有利となる可能性がある。出願ＷＯ０１／８１５９７Ａ１も、グラム陰性細菌による発現タンパク質の排出を実現する方法を開示している。好ましいものとして言及したグラム陰性細菌は、商業的にまたは菌株の公的収集機関を通じてという意味で通常容易に入手可能であり、例えば、多数入手可能であるようなベクターなどの他の構成成分と関連して特定の調製条件に対して最適化することができる。

別の同様に好ましい実施態様は、グラム陽性細菌、特にバシラス、ブドウ球菌（Staphylococcus）またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属の１つ、特に好ましいものはバシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニホルミス、バシラス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、枯草菌、バシラス・グロビジイ（B.globigii）またはバシラス・アルカロフィラス（B. alcalophilus）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）あるいはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）種の１つ、これらの中で極めて特に好ましくはバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３の派生株を含む。

これは、グラム陽性細菌が、細胞の周囲にある栄養培地中に分泌タンパク質を直ちに放出し、必要に応じて本発明の発現タンパク質を栄養培地から直接精製することができるグラム陰性細菌との基本的な違いを有するからである。さらに、それらは、産業上重要な酵素の起源である殆どの生物と関連しているか、またはそれと同一であり、殆どそれら自身で同等の酵素を産生し、その結果それらは類似したコドン頻度を示し、そのタンパク質合成装置は自然と適切に形成される。バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３の派生株は極めて特に好ましい、これは、一方ではその派生株は当技術分野の現段階で生物工学生産株としても広く使用されており、そして他方では本出願は本発明の当該遺伝子およびタンパク質をバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から入手可能することができ、その結果本発明の実施態様がかかる株において成功する可能性が最も高いことを理由とする。

本発明のさらなる実施態様は、上記した１つまたは複数の遺伝子産物ＹｗｓＣ、ＹｗｓＣ’、ＹｗｔＡ、ＹｗｔＢおよびＹｗｔＤを調製する方法によって形成される。

これには、上記した本発明のタンパク質を調製する任意の方法、例えば化学合成法が含まれる。しかし、方法に関しては、個々の態様において上記で論じ、当技術分野の現段階で確立されている、分子生物学、微生物学および生物工学の調製法すべてが好ましい。その目的としては、主に、例えばポリ−γ−グルタミン酸の合成、修飾または分解のための適切な用途に利用できるようにするために、本発明のタンパク質を得ることである。

これに関して好ましい方法は、上記に示した本発明の核酸を使用して行い、好ましくは上記に示した本発明のベクターを使用して行い、特に好ましくは上記に示した本発明の細胞を使用して行うものである。

これは、前記核酸、特に配列番号１、３、５、７および９として配列表中に示した核酸が、それに対応する好ましい遺伝情報を、微生物学的に利用可能な形態において、すなわち遺伝子的産生方法において利用できるように為すためである。宿主細胞によって特にうまく利用することができるベクターに、またはそのような細胞自体にそれを提供することがより好ましい。該当する生成方法は、当業者にそれ自体知られている。

本発明の実施態様は、該当する核酸配列に基づいて、タンパク質生合成がin vitroで再現される無細胞発現系でもよい。本発明のタンパク質を調製するために、すでに言及した全てのエレメントと新規な方法とを組み合わせることもできる。方法工程の可能な多数の組合せが本発明の各タンパク質についてさらに考えられる、その結果特定の個々の場合について最適な方法を実験的に確認することが必要となる。

そのようなタイプの本発明の方法は、ヌクレオチド配列が１つまたは、好ましくは、複数のコドンにおいて宿主株のコドン頻度に適合しているときにさらに好ましい。

これは、上記内容に従って、関連性が低い種への前記遺伝子の１つの移入が、コドン頻度に関してそれが適当に最適化されている場合、該当するタンパク質を合成するために特にうまく使用することができるためである。

本発明のさらなる表現は、微生物中でそれぞれ該当する遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡまたはｙｗｔＢを機能的不活性化のための、上記した本発明の核酸ｙｗｓＣ、上記した本発明の核酸ｙｗｓＣ’、上記した本発明の核酸ｙｗｔＡ、上記した本発明の核酸ｙｗｔＢ、または上記した本発明のタンパク質の１つをコードする対応する核酸、あるいは各場合におけるそれらの一部の使用である。

本出願に関して、機能的不活性化とは、ポリアミノ酸の形成に関与する酵素、またはそのような酵素のサブユニットである該当するタンパク質の機能が抑制される任意の型の修飾または突然変異を意味する。これには、事実上完全であるが不活性なタンパク質が形成される実施態様、そのようなタンパク質の不活性な部分が細胞中に存在する実施態様、該当する遺伝子がもはや翻訳されず、またはそれがまさに完全に欠失した場合の可能性までが含まれる。したがって、この実施態様におけるこれらの因子または遺伝子の特定の「使用」は、該当する細胞中でその自然な形でもはや正確には作用しないものからなる。これは、本発明の対象に従って、該当する遺伝子を停止することによって遺伝子レベルで実現される。

遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡまたはｙｗｔＢを不活性化する別の実施態様は、微生物中で該当する遺伝子ｙｗｔＤの活性を上昇させるための、上記した本発明の核酸ｙｗｔＤまたは上記した本発明のタンパク質の１つをコードする対応する核酸の使用である。

これは、緒言に記載したように、この酵素のin vivoでの機能がＧＬＡを分解するためである。したがって、この活性の亢進は、培養培地中のポリアミノ酸の濃度低下につながり、本発明に従って、該当する微生物の産業的発酵に対するプラスの効果を示す。この活性の亢進は、有利には遺伝子レベルで行われる。これに関する方法はそれ自体知られている。例えば、発現ベクターへのこの遺伝子の移入について言及することができる。そのようなベクターは、発酵に使用する細胞に形質転換により導入し、適当な場合に特定条件下で活性化することができ、その結果、次いで誘導タンパク質が内因的に形成されたＹｗｔＤに加えて作用する。

好ましい実施態様では、どちらの使用も、活性の機能的な不活性化または上昇が、微生物の発酵中に行われるものであり、好ましくはポリアミノ酸に起因する粘液が５０％に、特に好ましくは２０％未満に、極めて特に好ましくは５％未満に低下し、また中間にある整数または端数の百分率はすべて、適当に好ましい程度で理解されるものである。

これらの値を決定するために、処理していない株の細胞および処理した株の細胞を、それ以外は同一の条件下で発酵させ、それぞれの培地の粘度を発酵期間中に適切に決定する。株以外は同一であるので、粘度の違いは、ポリアミノ酸の含量が異なることに起因する。粘性のあらゆる低下が本発明に従って所望される。両方の発酵物から試料を採取し、自体既知の方法によってポリアミノ酸を含む粘液の含量を決定することにより、百分率として比較可能な値が得られる。本発明の試料中で決定することができる値が、定常増殖期への移行期で、比較する発酵物に対応する値の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満であり、特に好ましいものは１％未満であることがより好ましい。

これは、この問題に関する意図が、生物工学的生産に使用する微生物の発酵を改良することであったからである。したがって、研究室規模で、適当な場合には単に中間段階に相当する宿主細胞上での該当する分子生物学的構築物、例えば大腸菌における欠失ベクターの構築を実施することは価値があり、また、特に複数の遺伝子が影響を受ける場合にそれは通常必要である。しかし、本発明によれば、遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡまたはｙｗｔＢの不活性化が、特に発酵の間に期待される効果を示すことが所望される。ｙｗｔＤ遺伝子の活性の上昇は、例えば該当する導入遺伝子に関するものであり、例えば誘導性プロモーターを介して調節することができる。したがって、発酵の間に適切と思われる時点で誘導因子を加えることによって、この遺伝子の活性を意図的に誘導することができる。それに対する別法として、ストレスシグナルに、例えば粘液によって遮断された発酵槽中で混合が不十分であるときにも起こる過度に低い酸素含量に反応するプロモーターにこの遺伝子を結合することもできる。

さらに好ましい実施態様では、本発明のこれらの使用は、遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡおよびｙｗｔＢの２、３または４つが不活性化され、それに従い好ましさも大きくなるが、好ましくはｙｗｔＤ遺伝子によって媒介される活性の亢進と組合せて、不活性化されるように行われる。

該当する生物のin vivoでは、おそらくｙｗｓＣとｙｗｓＣ’の両方の遺伝子が同時に存在できないが、各場合にその１つだけは存在し得ることが、この点で想起できる。これらの場合では、最大で前記遺伝子の３つを不活性化することが可能であり、結果としてこの点で最も好ましい実施態様となる。

この実施態様は、万が一これらの遺伝子の１つの不活性化に選択した分子生物学的な形の不活性化が不完全であり、細胞が依然として対応する残存活性を有する場合に保護的手段として役立つ。これは、特に枯草菌以外の宿主細胞に適用し、Ａｓｈｉｕｃｈｉらによれば（上記を参照）、これらの遺伝子が各場合で１コピーしか存在しないことが示されている。原則として作用が異なる２つの系がこうして一緒に組み合わせられるために、欠失の手法をｙｗｔＤによって媒介される活性の亢進の手法と組み合わせることは特に価値があるように思われる。

１つまたは複数の遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡおよびｙｗｔＢの機能的不活性化のための使用に関する一実施態様では、不活性タンパク質をコードし、点突然変異を有する核酸が使用される。

この型の核酸は、それ自体知られている点突然変異生成の方法によって作製することができる。そのような方法は、例えば、Ｆｒｉｔｓｃｈ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９のものなど、該当する手引書の中に記載されている。さらに、市販されている多数の構築キット、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国Ｌａ ＪｏｌｌａのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）キットが現在その方法に利用できる。その原理は、一交換を有するオリゴヌクレオチド（ミスマッチプライマー）を合成し、一本鎖型の遺伝子とそれをハイブリダイズさせるものであり、続くＤＮＡ重合により、対応する点突然変異体がもたらされる。この目的のために、それぞれの種特異的なこれらの遺伝子の配列を使用することが可能である。相同性が高いので、本発明に従って、配列番号１、３、５および７によって提供される配列に基づいてこの反応を実施することが可能であり、特に有利である。これらの配列は、図６〜１０および１〜５のアラインメント中で特に同定し得る可能な保存領域に特に基づいて、関連する種に適したミスマッチプライマーの設計に使用することもできる。

この使用の一実施態様では、各場合において、好ましくは各場合でタンパク質をコードする領域の少なくとも７０〜１５０個の核酸の位置を含む境界配列を含む、欠失突然変異または挿入突然変異を有する核酸を、機能的不活性化に使用する。

これらの方法はまた、当業者にそれ自体よく知られている。したがって、制限エンドヌクレアーゼを介して適当な形質転換ベクター上の該当する遺伝子の一部を切り取り、その後そのベクターで対象とする宿主を形質転換することによって、１つまたは複数の因子ＹｗｓＣ、ＹｗｓＣ’、ＹｗｔＡおよびＹｗｔＢの形成を防止することが可能であり、その宿主では、その時までに依然起こり得る相同組換えを介して活性のある遺伝子が活性のないコピーに置換される。挿入突然変異に関する実施態様では、遮断するように完全な遺伝子を、または遺伝子部分の代わりに他の遺伝子、例えば選択マーカーを単に導入することも可能である。突然変異事象の表現型の確認は、こうしてそれ自体知られている方法において行い得る。

各場合に、細胞中に導入された欠陥遺伝子と、内因的に存在する例えば染色体上に存在する完全な遺伝子のコピーとの間で必要であるこれらの組換え事象を可能にするには、現状の知識によれば、各場合で、間にある重要でない部分と一致しない部分に対して、各場合で２つの境界配列において、少なくとも７０〜１５０個の連結した核酸位置の一致があることが必要である。したがって、好ましい実施態様は、これらのサイズの少なくとも１つを有する２つのフランキング領域しか含まないものである。

この使用に関する別の実施態様では、各場合で少なくとも７０〜１５０の核酸位置を含んでいる、したがって少なくとも部分的に、好ましくは完全に、タンパク質をコードする領域の両側にある合計で２つの核酸セグメントを有する核酸を使用する。それ自体知られている方法により、例えば外向きのＰＣＲプライマーおよび鋳型であるゲノムＤＮＡの調製物の助力により（アンカーＰＣＲ）、これに関連して、既知の配列から開始してフランキング領域を確認することができる。これは、相同組換えにより２つの遺伝子コピーを交換することを可能にするために、タンパク質をコードするそのセグメントが必須でないからである。本発明に従って、配列番号１、３、５および７に基づいて、これに必要なプライマーを設計することが可能であり、またグラム陽性細菌の他の種用に、それらの中でも特にバシラス属の種用に設計することも可能である。この実験的手法の代替として、少なくとも部分的には多数のこれらの遺伝子をコードしていないそのような領域を、関連する種から、例えば枯草菌のデータベース・エントリーから、例えばパスツール研究所（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ）、フランスＰａｒｉｓのＳｕｂｔｉＬｉｓｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｇｉ）から選ぶことが可能である。

さらなる好ましい実施態様は、本発明に従って記載した使用の１つを含み、ｙｗｔＤ遺伝子によって媒介される活性の前記亢進のために発現ベクターを、好ましくはこの遺伝子を制御する核酸セグメントとともにこの遺伝子を含むベクターを使用する。

すでに上記で記載したように、この遺伝子の活性の上昇、したがってその誘導タンパク質の活性の上昇は、こうして外部から意図的に制御することができ、または発酵培地中で優勢である条件を介してポリアミノ酸濃度低下に対する必要性を自動的に適合させる。ｙｗｔＤをコードする記載した本発明の核酸を、特に好ましくは配列番号９に従ったものをここで使用すると特に有利である。

本発明はまた、遺伝子修飾された微生物の形でも実施され、上記したようなものにも相応じであてはまる。

これらは、極めて一般的には、遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡまたはｙｗｔＢの少なくとも１つが機能的に不活性化され、またはｙｗｔＤの活性が亢進した微生物である。

これらは、好ましくは、遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡまたはｙｗｔＢの２、３または４つが不活性化され、この順に好ましさも大きくなるが、好ましくはｙｗｔＤ遺伝子によって媒介される活性の亢進と組合せて不活性化される微生物である。

これらは、好ましくは、細菌の形態での微生物である。

これらの中で、これまでの記載に従って好ましい微生物は、グラム陰性細菌、特に大腸菌、クレブシエラ、シュードモナスまたはザントモナス属のもの、特に大腸菌Ｋ１２、大腸菌Ｂまたはクレブシエラ・プランチコラ株、特に好ましいものは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌ＲＶ３０８、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＸＬ−１またはクレブシエラ・プランチコラ（Ｒｆ）株の派生株である。

これまでの記載に従って同様に好ましい微生物は、グラム陽性細菌、特にバシラス、ブドウ球菌またはコリネバクテリウム属のもの、特に好ましいものはバシラス・レンタス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・アミロリケファシエンス、枯草菌、バシラス・グロビジイまたはバシラス・アルカロフィラス、スタフィロコッカス・カルノサスあるいはコリネバクテリウム・グルタミカム種のもの、これらの中で特に好ましいものはバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３である。

本出願が基礎とする課題によれば、この目的は、主に工業的発酵方法を改良することであった。したがって、本発明は、特に本発明の対応する発酵方法において実施される。

これらは、極めて一般には、上記した本発明の微生物の発酵のための方法である。

これまでの記載に従って、こうして特徴付けられた方法が相応に好ましい。これには、特に１つまたは複数の遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡもしくはｙｗｔＢが機能的に不活性化され、またはｙｗｔＤの活性が亢進した実施態様、特にその２つの手法の組合せた実施態様が含まれる。この目的のために、特に好ましくは上記した本発明の核酸、特に配列番号１、３、５、７、または９で示されたものを手段として用いる。これは、それぞれの発酵に適するように選択された種に相応じて適用される。上記に従って、これらの中でより好ましいものは、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３との関係性の程度が高いものであるが、これは記載した核酸の使用に対する成功の見込みがその関係性の程度によって高くなるからである。

本発明の発酵方法の中で、価値のある生成物を製造する方法、特に低分子量化合物またはタンパク質を製造する方法が好ましい。

これは、これが産業的発酵の適用に関して最も重要な分野であることを理由とする。

これらは、低分子量化合物が天然物、栄養補助食品または医薬関連化合物である場合に好ましい方法である。

このように、例えば特に栄養補助食品として使用されるアミノ酸またはビタミンが生産される。医薬関連化合物は、医薬物の前駆体または中間体であっても、あるいはその後者自体でもよい。これらのすべての場合で、微生物の代謝特性を全体的または少なくとも個々の工程において、精巧な化学合成に代えて利用できることから、生体内変換という用語も使用される。

このように生産されたタンパク質は酵素であって、特にα−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼおよびヘミセルラーゼの群の酵素である対応する方法も同様に好ましい。

かかる方法によって製造される工業用酵素は、例えば食品産業で使用される。したがって、α−アミラーゼは、例えばパンが固くなるのを防ぎ、または果汁を清澄化するのに使用される。プロテアーゼは、タンパク質の分解に使用される。これらすべての酵素は、界面活性剤および洗浄剤組成物での使用について記載されているが、特にグラム陽性細菌によって天然に産生されるサブチリシンプロテアーゼはその突出した位置を占める。それらは、特に繊維産業および皮革産業で、天然原材料の加工に使用される。さらに、これらすべての酵素が、化学反応の触媒として、生体内変化に関して使用されることも可能である。

これらの酵素の多くは、本来バシラス種から得られ、そのためグラム陽性生物、特に多くの場合でバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３の派生株も含むバシラス属の生物において、特にうまく産生される。特に、配列番号１、３、５、７および９で示される配列がまさにこの生物から得られるので、特にこれらの微生物系に基づく生産方法を本発明の助力に従って改良することができる。

最後に、本出願で利用できる因子を、その天然の機能についてという意味で、ポリγ−グルタミン酸の標的化した製造、修飾または分解に関するという意味で積極的に使用することもできる。

したがって、一実施態様が、ポリγ−グルタミン酸の製造、修飾または分解のための微生物による方法によって形成され、本発明の核酸ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡ、ｙｗｔＢおよび／またはｙｗｔＤ、あるいは上記した本発明のタンパク質をコードする対応する核酸の１つを導入遺伝子として使用して、好ましくは上記した本発明の対応するタンパク質を形成する。

これらの中で好ましい方法は、バシラス属由来の微生物、特に枯草菌またはバシラス・リケニホルミスを使用する方法である。

したがって、例えば出願ＪＰ０８３０８５９０ＡまたはＷＯ０２／０５５６７１Ａ１に記載のように、ＧＬＡを微生物により、具体的には枯草菌およびバシラス・リケニホルミス中で生産することが可能である。本出願で利用可能となったＤＮＡ配列を利用して、例えば適当な細胞中でのそれぞれの遺伝子の活性を上昇させ、それによってその収率を高めることができる。

それに対する別法として、ポリアミノ酸の形成に関与する上記した本発明の遺伝子産物ＹｗｓＣ、ＹｗｓＣ’、ＹｗｔＡ、ＹｗｔＢおよび／またはＹｗｔＤを含む、好ましくは上記した本発明の対応する核酸を使用した、ポリ−γ−グルタミン酸の製造、修飾または分解のための無細胞法も現在可能である。

したがって、これらの因子を、例えばバイオリアクター中で反応させることができる。そのような酵素のバイオリアクターに関する設計は、従来技術から既知である。

これらの中で特に好ましいこの型に対応する方法は、前記遺伝子産物または核酸のうち２種、好ましくは３種、特に好ましくは４種の異なるものを使用する方法である。

これは、特に因子ＹｗｓＣ、ＹｗｔＡおよびＹｗｔＢが、緒言で記載したように、凝集複合体を通常形成し、その結果、結合活性について言及する必要があるからである。同時またはその後のＹｗｔＤ活性は、例えば、形成されたポリアミノ酸の生物物理学的特性に影響を及ぼすように機能し、例えば化粧品での使用に適合させることができる。

下記の実施例は、本発明をさらに説明するものである。

分子生物学的作業工程はすべて、例えば、Ｆｒｉｔｓｃｈ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓによる手引書「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９の中で示される標準的な方法、または同等の該当作業に従っている。酵素、構築キットおよび機器は、それぞれの製造業者の説明書に従って使用した。

実施例１
バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３からの遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡ、ｙｗｔＢおよびｙｗｔＤの同定
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）から誰でも入手可能である株バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から、標準的な方法によってゲノムＤＮＡを調製し、それを機械的に分画化し、０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分画化した。小さな断片のショットガンクローニングでは、サイズが２〜２．５ｋｂの断片をアガロースゲルから溶出させ、それを脱リン酸化し、平滑末端断片としてベクターｐＴＺ１９Ｒ−ＣｍのＳｍａＩ制限切断部位へと連結した。これは、プラスミドｐＴＺ１９Ｒのクロラムフェニコール耐性を付与する誘導体であり、それはＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ）から入手可能である。小さな断片の遺伝子ライブラリーをこうして得た。第２のショットガンクローニングとして、酵素ＳａｕＩＩＩａＩによる部分制限消化によって得られたゲノム断片を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国Ｌａ ＪｏｌｌａのＳｕｐｅｒＣｏｓ１ベクター系（「コスミドベクターキット」）中に連結し、圧倒的に大きな断片に対する遺伝子ライブラリーが得られた。

該当する遺伝子ライブラリーでの形質転換により入手可能な細菌である大腸菌ＤＨ５α（Ｄ．Ｈａｎｎａｈａｎ（１９８３）：「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１６６巻、５５７〜５８０ページ）から、該当する組換えプラスミドを単離し、その配列を決定した。ダイターミネーション法（ダイターミネーター化学）をこの場合に使用し、自動配列決定機ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００／４０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）によってそれを実施した。

このように、とりわけ本出願の配列表中に示される配列番号１、３、５、７および９の配列が得られ、それらは、この配列において、遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’（ｙｗｓＣの切断型変異体である）、ｙｗｔＡ、ｙｗｔＢおよびｙｗｔＤを表すものであった。それから得られたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、４、６、８および１０における対応する配列中に示される。切断型変異体ｙｗｓＣ’（またはＹｗｓＣ’）は、遺伝子またはタンパク質のｙｗｓＣ（またはＹｗｓＣ）を表しており、これは図６で示すような枯草菌中の相同なタンパク質についてのアミノ酸配列の比較から、Ｎ末端で１６アミノ酸短いがそれ以外は非常に高い相同性を有し、従って同等の活性を有するポリペプチドであることを示しているからである。

再現性
これらの遺伝子および遺伝子産物は、現在では、記載した配列決定を再現することを必要とせずに、これらの配列に基づいて標的を定めた方法で、それ自体既知の方法により人工的に合成することができる。それに対するさらなる別の方法として、バシラス株、特にＤＳＭＺから入手可能な株バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から、ＰＣＲを介して該当する遺伝子を単離することが可能であり、プライマーの合成には配列表中に示されるそれぞれの境界配列を使用することが可能である。さらなる株を使用する場合、各場合においてその株に対する遺伝子相同物が得られ、ＰＣＲの成功率は、選択した株とバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３の関係が近くなるに従って高くなるが、理由として、これはプライマー結合領域内でも配列の一致が大きいことと関連している傾向が高いためである。

実施例２
配列相同性
実施例１と同様にしてＤＮＡおよびアミノ酸の配列を確認した後、各場合で今までに開示されている最も類似した相同体を、データベースＧｅｎｂａｎｋ（米国国立衛生研究所の国立生物工学情報センターＮＣＢＩ、米国メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）およびパスツール研究所、フランスＰａｒｉｓのＳｕｂｔｉｌｉｓｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／Ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｇｉ）の検索によって確認した。

図１〜１０に示したアラインメントを介して、確認したＤＮＡおよびアミノ酸配列を互いに比較し、これに使用したコンピュータプログラムは、Ｉｎｆｏｍａｘ Ｉｎｃ、米国Ｂｅｔｈｅｓｄａから入手可能なＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）セット第７版であった。この場合、ＤＮＡ配列の比較用という意味で、このプログラムの標準的なパラメーターを使用した：Ｋ−タプルサイズ：２；最良のダイアゴナル数：４；ウィンドウサイズ：４；ギャップペナルティー：５；ギャップ開始ペナルティー：１５およびギャップ伸長ペナルティー：６．６６。下記の標準的なパラメーターは、アミノ酸配列の比較に用いた：Ｋ−タプルサイズ：１；最良のダイアゴナル数：５；ウィンドウサイズ：５；ギャップペナルティー：３；ギャップ開始ペナルティー：１０およびギャップ伸長ペナルティー：０．１。これらの配列比較の結果を下記の表１でまとめるが、示した受入番号はＮＣＢＩデータベースからのものである。

見出された遺伝子およびそれらから得られた遺伝子産物が新規の遺伝子およびタンパク質であり、これまでに開示された従来技術とは明確な違いを有することが明らかである。

実施例３
バシラス・リケニホルミス中での１つまたは複数の遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡおよびｙｗｔＢの機能的不活性化
欠失ベクターの調製の原理
これらの各遺伝子は、例えばいわゆる欠失ベクターによって機能的に不活性化することができる。この手順は、例えば、Ｊ．Ｖｅｈｍａａｎｐｅｒａら（１９９１）により、刊行物「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ」；Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１９巻、２２１〜２４０ページにそれ自体記載されている。

これに適したベクターはｐＥ１９４であり、それはＴ．Ｊ．Ｇｒｙｃｚａｎらによる刊行物「Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥ１９４ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ」（１９８２）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５２巻、７２２〜７３５ページの中で特徴付けられている。この欠失ベクターの利点は、それが温度依存的な複製起点を有することである。ｐＥ１９４は、３３℃で、形質転換細胞中で複製することができ、その結果、形質転換の成功のための最初の選択がこの温度で行われる。その後、ベクターを含む細胞を４２℃でインキュベートする。欠失ベクターは、この温度ではもはや複製せず、選択圧は、予め選択した相同領域を介した染色体へのプラスミドの組み込みに対して発揮される。次いで、第２の相同領域を介した第２の相同組換えにより、ベクターが完全な遺伝子コピーと一緒に染色体から切除され、それによって染色体中に位置する遺伝子をin vivoで欠失させる。第２の組換えとしての他の可能性は、染色体外のベクターの組換えを意味する、組み込みと逆の反応であり、結果として染色体の遺伝子は完全なままである。したがって、それ自体知られている方法によって、例えば適切な酵素を用いた染色体ＤＮＡの制限後のサザンブロットにおいて、または増幅した領域のサイズに基づくＰＣＲ技術の助力によって遺伝子欠失を検出しなければならない。

即ち、それぞれが各場合で７０塩基対を含む、欠失させる遺伝子の２つの相同領域、例えば選択した遺伝子の５’領域および３’領域を選択することが必要である。これらが不活性なタンパク質をコードする部分の両側にあるように、または中間にある領域を省略して直接連続するように、これらをベクター中にクローニングする。欠失ベクターは、こうして得られる。

本明細書で考慮される遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡおよびｙｗｔＢの欠失
本発明の欠失ベクターは、これらの遺伝子４種または３種のうち１種の５’領域および３’領域をＰＣＲ増幅することによって構築される。配列表中に示される配列番号１、３、５および７の配列は、適切なプライマーの設計に利用可能であって、バシラス・リケニホルミスに由来する、しかし予想される相同性から、他の種、特にバシラス属の種にも適するのが当然である。

その２つの増幅領域は、これらの後処理に有用なベクター上で、例えば大腸菌におけるクローニング工程に適しているベクターｐＵＣ１８上で、直接連続する形で適切に中間クローニングを受ける。

次の工程は、欠失用に選択したベクターｐＥ１９４へのサブクローニング、および例えばＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ（１９７９；「Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ」；Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）、第１６８巻、１１１〜１１５ページ）に従った原形質体形質転換の方法による枯草菌ＤＢ１０４への形質転換である。すべての作業工程は、確実にベクターの複製が行われるために、３３℃で実施しなければならない。

次の工程では、中間クローニングを受けたベクターで、原形質体形質転換の方法によって、所望の宿主株、この場合ではバシラス・リケニホルミスを同様に形質転換する。このようにして得られ、従来の方法（プラスミドの耐性マーカーによる選択；プラスミドの調製による確認および挿入物についてのＰＣＲ）により陽性と確認された形質転換体を、その後、エリスロマイシンの添加によるプラスミドの存在についての選択圧下で、４２℃で培養した。欠失ベクターは、この温度では複製することができず、残存する細胞は、ベクターが染色体中に組み込まれたものだけであり、この組み込みは、最もおそらくは相同なまたは同一の領域で起こる。次いでエリスロマイシンの選択圧がない状態のもとに３３℃で培養することにより、欠失ベクターの切除をその後に誘導することができ、染色体によりコードされた遺伝子が染色体から完全に欠失する。その後、適切な酵素を用いた染色体ＤＮＡの制限後のサザンブロット法により、またはＰＣＲ技術の助けを借りて欠失の成功を確認する。

該当する遺伝子が欠失したそのような形質転換体は、ＧＬＡ形成が制限されることによって、またはＧＬＡ形成が完全にできないことによってもさらに区別される。

（図面の簡単な記載）
図１：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｓＣ（配列番号１）（Ｂ．ｌ．ｙｗｓＣ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ｙｗｓＣ）のアラインメント。
図２：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｓＣ’（配列番号３）（Ｂ．ｌ．ｙｗｓＣ’）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ｙｗｓＣ）のアラインメント。
図３：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｔＡ（配列番号５）（Ｂ．ｌ．ｙｗｔＡ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｔＡ（Ｂ．ｓ．ｙｗｔＡ）のアラインメント。
図４：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｔＢ（配列番号７）（Ｂ．ｌ．ｙｗｔＢ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｔＢ（Ｂ．ｓ．ｙｗｔＢ）のアラインメント。
図５：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｔＤ（配列番号９）（Ｂ．ｌ．ｙｗｔＤ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｔＤ（Ｂ．ｓ．ｙｗｔＤ）のアラインメント。
図６：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｓＣ（配列番号２）（Ｂ．ｌ．ＹｗｓＣ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ＹｗｓＣ）のアラインメント。
図７：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｓＣ’（配列番号４）（Ｂ．ｌ．ＹｗｓＣ’）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ＹｗｓＣ）のアラインメント。
図８：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｔＡ（配列番号６）（Ｂ．ｌ．ＹｗｔＡ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｔＡ（Ｂ．ｓ．ＹｗｔＡ）のアラインメント。
図９：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｔＢ（配列番号８）（Ｂ．ｌ．ＹｗｔＢ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｔＢ（Ｂ．ｓ．ＹｗｔＢ）のアラインメント。
図１０：バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｔＤ（配列番号１０）（Ｂ．ｌ．ＹｗｔＤ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｔＤ（Ｂ．ｓ．ＹｗｔＤ）のアラインメント。

バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｓＣ（配列番号１）（Ｂ．ｌ．ｙｗｓＣ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ｙｗｓＣ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｓＣ’（配列番号３）（Ｂ．ｌ．ｙｗｓＣ’）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ｙｗｓＣ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｔＡ（配列番号５）（Ｂ．ｌ．ｙｗｔＡ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｔＡ（Ｂ．ｓ．ｙｗｔＡ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｔＢ（配列番号７）（Ｂ．ｌ．ｙｗｔＢ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｔＢ（Ｂ．ｓ．ｙｗｔＢ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の遺伝子ｙｗｔＤ（配列番号９）（Ｂ．ｌ．ｙｗｔＤ）と枯草菌由来の相同な遺伝子ｙｗｔＤ（Ｂ．ｓ．ｙｗｔＤ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｓＣ（配列番号２）（Ｂ．ｌ．ＹｗｓＣ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ＹｗｓＣ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｓＣ’（配列番号４）（Ｂ．ｌ．ＹｗｓＣ’）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｓＣ（Ｂ．ｓ．ＹｗｓＣ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｔＡ（配列番号６）（Ｂ．ｌ．ＹｗｔＡ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｔＡ（Ｂ．ｓ．ＹｗｔＡ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｔＢ（配列番号８）（Ｂ．ｌ．ＹｗｔＢ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｔＢ（Ｂ．ｓ．ＹｗｔＢ）のアラインメントを示す図である。 バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来のタンパク質ＹｗｔＤ（配列番号１０）（Ｂ．ｌ．ＹｗｔＤ）と枯草菌由来の相同なタンパク質ＹｗｔＤ（Ｂ．ｓ．ＹｗｔＤ）のアラインメントを示す図である。

Claims (8)

1. 改変された活性を有する少なくとも１つの遺伝子を有する微生物であって、該少なくとも１つの遺伝子が以下：
   （ａ）機能的に不活性化されたｙｗｓＣ遺伝子、
   （ｂ）機能的に不活性化されたｙｗｓＣ’遺伝子、
   （ｃ）機能的に不活性化されたｙｗｔＡ遺伝子、および
   （ｄ）機能的に不活性化されたｙｗｔＢ遺伝子
   からなる群から選択され、ここで、
   （ａ）による遺伝子が、ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｓＣ（ｃａｐＢ、ｐｇｓＢ）を含み、
   （ｂ）による遺伝子が、ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｓＣ’（ｙｗｓＣの切断型変異体である）を含み、
   （ｃ）による遺伝子が、ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｔＡ（ｃａｐＣ、ｐｇｓＣ）を含み、
   （ｄ）による遺伝子が、ポリアミノ酸の形成に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｔＢ（ｃａｐＡ、ｐｇｓＡ）を含む、
   微生物。
2. 遺伝子ｙｗｓＣ、ｙｗｓＣ’、ｙｗｔＡまたはｙｗｔＢの少なくとも１つが、ｙｗｔＤ遺伝子によって媒介される活性の亢進と組合せて不活性化され、ここで、
   ｙｗｔＤ遺伝子が、ポリアミノ酸の分解に関与する遺伝子産物をコードし、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｔＤ（ｄｅｐ、ｐｇｄＳ）を含む、請求項１に記載の微生物。
3. 細菌である、請求項１または２に記載の微生物。
4. グラム陽性細菌である、請求項３に記載の微生物。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の微生物を発酵させる方法。
6. 低分子量化合物またはタンパク質を製造するための、請求項５に記載の方法。
7. 低分子量化合物が天然物、栄養補助食品または医薬関連化合物である、請求項６に記載の方法。
8. タンパク質が酵素である、請求項６に記載の方法。

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