ES2603984T3 - Nuevos productos génicos de Bacillus licheniformis que forman o que degradan poliaminoácidos y procedimientos de producción biotecnológicos mejorados basados en los mismos - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para reducir moco atribuible a poli-gamma-glutamato, caracterizado por impedir la función de la proteína YwtB (CapA, PgsA) codificada por el gen ywtB con una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos el 90 % con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO. 8, como una enzima implicada en la formación de poliaminoácidos o como subunidad de una enzima de este tipo.
Description
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Entonces los vectores de clonación son adecuados además de para el almacenamiento, la amplificación biológica o la selección del gen de interés para su caracterización por biología molecular. Al mismo tiempo, representan las formas transportables y almacenables de los ácidos nucleicos reivindicados y son también puntos de partida para técnicas de biología molecular, que no están unidos a células, tales como por ejemplo la PCR o los procedimientos de mutagénesis in vitro.
Preferentemente, en el caso de los vectores se trata de vectores de expresión.
Entonces, los vectores de expresión de este tipo son la base para realizar los ácidos nucleicos correspondientes en sistemas de producción biológicos y con ello producir las proteínas correspondientes. Se prefieren Vectores de expresión que portan los elementos genéticos necesarios para la expresión, por ejemplo el promotor natural, localizado originalmente antes de este gen o un promotor de otro organismo. Estos elementos pueden estar dispuestos por ejemplo en forma de un denominado casete de expresión. Como alternativa pueden proporcionarse elementos de regulación individuales o todos los elementos de regulación también por la célula huésped respectiva. De manera especialmente preferente los vectores de expresión están adaptados en cuanto a propiedades adicionales, tales como por ejemplo el número de copias óptimo, en el sistema de expresión seleccionado, en particular la célula huésped (véase más adelante).
Además se divulgan células que tras una modificación por ingeniería genética contienen uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente.
Entonces estas células contienen la información genética para la síntesis de una proteína. Entre estas quieren decirse en particular aquellas células que de acuerdo con procedimientos en sí conocidos se han dotado de los ácidos nucleicos, o que se derivan de células de este tipo. Para ello se seleccionan de manera adecuada aquellas células huésped que pueden cultivarse de manera relativamente sencilla y/o proporcionan altos rendimientos de producto.
En principio, para países, en los que no pueden ponerse bajo protección de patente las células madre embrionarias humanas, se exceptúan del alcance de protección aquellas células madre embrionarias humanas de acuerdo con la invención.
Las células permiten, por ejemplo, la amplificación de los genes correspondientes, pero también su mutagénesis o transcripción y traducción y, por último, la producción biotecnológica de las proteínas en cuestión. Esta información genética puede encontrarse o bien de manera extracromosómica como elemento genético propio, es decir, en el caso de bacterias en una localización plasmídica o estar integrada en un cromosoma. La elección de un sistema adecuado depende de cuestiones tales como por ejemplo el tipo y la duración del almacenamiento del gen, o del organismo o el tipo de mutagénesis o selección.
Entre estas figuran en particular aquellas células que contienen el gen ywtB a través de un vector en trans y por lo tanto pueden usarse para deleciones correspondientes (véase más adelante).
Preferentemente, en una célula de este tipo, el ácido nucleico mencionado es parte de un vector, en particular de un vector descrito anteriormente.
Preferentemente entre estas se prefieren células huésped en cuyo caso se trata de bacterias.
Entonces las bacterias se caracterizan por cortos tiempos de generación y bajos requisitos en cuanto a las condiciones de cultivo. De esta manera pueden establecerse procedimientos económicos. Además, en el caso de las bacterias en la técnica de fermentación, se dispone de una amplia experiencia. Para una producción especial pueden ser adecuadas bacterias Gram negativas o Gram positivas por los más diversos motivos, que deben determinarse experimentalmente en el caso individual, tales como fuentes de nutrientes, tasa de formación de producto, tiempo necesario, etc.
Preferentemente se trata de una bacteria Gram negativa, en particular de una de los géneros Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, en particular de cepas de E. coli K12, E. coli Bo Klebsiella planticola,y muy especialmente de derivados de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).
Entonces en el caso de las bacterias Gram negativas, tales como por ejemplo E. coli, se secreta una pluralidad de proteínas en el espacio periplasmático. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. En la solicitud WO 01/81597 A1 se divulga un procedimiento, según el cual se consigue que también bacterias Gram negativas expulsen las proteínas expresadas. Las bacterias Gram negativas mencionadas como preferentes se encuentran por regla general fácilmente accesibles, es decir comercialmente disponibles o accesibles a través de colecciones de cultivos públicas y pueden optimizarse en cuanto a las condiciones de producción específicas junto con el resto de componente que se encuentran disponibles en gran número tales como, por ejemplo, vectores.
No de forma menos preferente, se trata de una bacteria Gram positiva, en particular una de los géneros Bacillus, Staphylococcus o Corynebakterium, muy especialmente de las especies Bacillus lentus, B. licheniformis, B.
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amiloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalophilus, Staphylococcus camosus o Corynebacterium glutamicum, y entre estas a su vez de manera muy especialmente preferente se trata de un derivado de B. licheniformis DSM 13.
Entonces, las bacterias Gram positivas tienen frente a las Gram negativas la diferencia fundamental de desprender proteínas secretadas de inmediato en el medio nutriente que rodea las células, a partir del que, cuando se desea, pueden purificarse las proteínas expresadas directamente a partir del medio nutriente. Además están relacionadas con la mayoría de los organismos de origen para enzimas técnicamente importantes o son idénticas y forman en la mayoría de los casos enzimas en sí comparables, de modo que disponen de una utilización de codón similar y su aparato de síntesis de proteína está adaptado de manera correspondiente según su naturaleza. Se prefieren muy especialmente preferente derivados de B. licheniformis DSM 13, porque están ampliamente extendidos, por un lado así mismo en el estado de la técnica como cepas de producción biotecnológicas y porque, por otro lado, con la presente solicitud se ponen a disposición exactamente los genes y las proteínas de B. licheniformis DSM 13, de modo que la realización de la presente invención será satisfactoria de la forma más probable en cepas de este tipo.
Además se divulgan procedimientos para la producción de un producto génico YwtB descrito anteriormente.
A estos pertenecen cualquier procedimiento para la producción de una proteína descrita anteriormente, por ejemplo procedimientos de síntesis química. En cambio se prefieren sin embargo todos procedimientos de producción de biología molecular, de microbiología o biotecnológicos establecidos en el estado de la técnica, mencionados ya anteriormente en aspectos individuales. Su objetivo consiste en primer lugar en obtener las proteínas para ponerlas a disposición de aplicaciones correspondientes, por ejemplo para la síntesis de poli-gamma-glutamato.
Preferentemente, a este respecto se trata de procedimientos que tienen lugar con el uso de uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, preferentemente con el uso de un vector descrito anteriormente y de manera especialmente preferente con el uso de una célula descrita anteriormente.
Entonces, mediante los ácidos nucleicos mencionados, en particular el ácido nucleico indicado en el protocolo de secuencias bajo la SEQ ID NO. 7 se pone a disposición la información genética preferida de manera correspondiente en forma microbiológicamente aprovechable, es decir para procedimientos de producción de ingeniería genética. Cada vez más preferentemente es la provisión en un vector aprovechable de manera especialmente satisfactoria por la célula huésped o de tales células en sí. Los procedimientos de producción en cuestión son en sí conocidos por el experto.
La base de las secuencias de ácido nucleico correspondientes pueden ser también sistemas de expresión sin células, en los que la biosíntesis de proteínas se comprende in vitro. Todos los elementos expuestos ya anteriormente pueden combinarse también para dar nuevos procedimientos, para producir proteínas. A este respecto, para cada proteína es concebible una pluralidad de posibilidades de combinación de etapas de procedimiento, de modo que deben determinarse experimentalmente los procedimientos óptimos para cada caso individual concreto.
Además se prefieren aquellos procedimientos de este tipo en los que la secuencia de nucleótido se ha adaptado en uno o preferentemente varios codones a la utilización de codón de la cepa huésped.
Entonces, conforme a lo dicho anteriormente, la transferencia de uno de los genes mencionados a una especie menos relacionada puede usarse entonces especialmente de manera satisfactoria para la síntesis de la proteína en cuestión, cuando esta está optimizada de manera correspondiente en cuanto al uso de los codones.
Además, se divulga el uso de un ácido nucleico ywtB descrito anteriormente o de un ácido nucleico correspondiente, que codifica para una de las proteínas descritas anteriormente o en cada caso partes de la misma, para la inactivación funcional del gen ywtB correspondiente en cada caso en un microorganismo.
Por la inactivación funcional se entiende en el sentido de la presente solicitud cualquier tipo de modificación o mutación, según la cual se impide la función de la proteína en cuestión como una enzima implicada en la formación de poliaminoácidos o como subunidad de una enzima de este tipo. A esta pertenece la forma de realización, que se forma una proteína prácticamente completa, pero inactiva, que partes inactivas de una proteína de este tipo están presentes en la célula, hasta las posibilidades de que el gen correspondiente ya no se traduzca o incluso esté completamente delecionado. Por lo tanto un "uso" especial de estos factores o genes de acuerdo con esta forma de realización consiste en que estos en la célula en cuestión justo ya no surten efecto en su forma natural. Esto, según este objeto de la invención se consigue a nivel genético porque el gen en cuestión se desconecta.
En formas de realización preferidas, en el caso de ambos usos se trata de aquellos en los que tiene lugar la inactivación funcional o el aumento de actividad durante la fermentación del microorganismo, preferentemente con una reducción del moco atribuible a poliaminoácidos hasta el 50%, de manera especialmente preferente hasta menos del 20%, de manera muy especialmente preferente hasta menos del 5%, entendiéndose a su vez todos los valores de porcentaje enteros o fraccionarios entremedias en escalonamiento preferido de manera correspondiente.
Para determinar estos valores se fermentan células de una cepa no tratada y de una cepa tratada en condiciones por lo demás idénticas y se determina de manera adecuada durante la fermentación la viscosidad del medio
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respectivo. Dado que las cepas son idénticas por lo demás, las diferencias de viscosidad pueden atribuirse a los diferentes contenidos en poliaminoácidos. A este respecto, de acuerdo con la invención se desea cualquier disminución de la viscosidad. Se obtienen valores porcentualmente comparables tomando muestras de ambas fermentaciones y determinando según métodos en sí conocidos el contenido en moco que contiene poliaminoácidos. Se prefiere cada vez más cuando el valor determinable en la muestra de acuerdo con la invención en la transición a la fase de crecimiento estacionaria asciende a menos del 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% y muy especialmente a menos del 1% del valor correspondiente de la fermentación comparativa.
Para el uso para la inactivación funcional del gen ywtB puede emplearse un ácido nucleico que codifica para una proteína no activa con una mutación puntual.
Los ácidos nucleicos de este tipo pueden generarse a través de procedimientos en sí conocidos para la mutagénesis puntual. Estos se describen por ejemplo en manuales especializados tales como el de Fritsch, Sambrook y Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York, 1989. Además, se encuentran disponibles para ello entre tanto numerosos sistemas modulares comerciales, por ejemplo el kit QuickChange® de la empresa Stratagene, La Jolla, EE.UU. Su principio consiste en que se sintetizan oligonucleótidos con cambios individuales (Mismatch-Primer) y se hibridan con el gen presentado monocatenario; la posterior polimerización del ADN da como resultado entonces mutantes puntuales correspondientes. Para ello pueden usarse las secuencias propias de las especies respectivas de estos genes. Debido a las altas homologías es posible y especialmente ventajoso de acuerdo con la invención, llevar a cabo esta reacción por medio de la secuencia puesta a disposición con la SEQ ID NO. 7. Esta secuencia puede servir también para proyectar Mismatch-Primer correspondientes para especies relacionadas, en particular por medio de las regiones conservadas identificables en los alineamientos de las Figuras 1 y 2.
De acuerdo con una forma de realización de este uso para la inactivación funcional se emplea en cada caso un ácido nucleico con una mutación por deleción o inserción, que comprende preferentemente las secuencias borde que comprenden en cada caso al menos de 70 a 150 posiciones de ácido nucleico de la región que codifica para la proteína.
También estos procedimientos son en sí familiares para el experto. Por lo tanto es posible impedir la formación de un factor YwtB mediante la célula huésped porque se corta una parte del gen en cuestión en un vector de transformación correspondiente a través de endonucleasas de restricción y el vector se transforma a continuación en el huésped de interés, donde a través de la recombinación homóloga, hasta el momento aún posible, se cambia el gen activo por la copia inactiva. En la forma de realización de la mutación por inserción puede insertarse únicamente el gen intacto de manera ininterrumpida o en lugar de una parte de gen de otro gen, por ejemplo un marcador de selección. A través de esto puede comprobarse fenotípicamente de manera en sí conocida el acontecimiento de mutación.
Para permitir estos acontecimientos de recombinación necesarios en cada caso entre el gen defectuoso introducido en la célula y la copia de gen intacta presente de manera endógena por ejemplo en el cromosoma, es necesario, según el conocimiento actual, una coincidencia en, en cada caso, al menos de 70 a 150 posiciones de ácido nucleico continuas, en cada caso en las dos secuencias de borde con la parte no coincidente, no dependiendo de la parte entremedias. De manera correspondiente se prefieren aquellas formas de realización que comprenden únicamente dos regiones flanqueantes con al menos estos tamaños.
Para el uso pueden emplearse ácidos nucleicos con, en total dos secciones de ácido nucleico, que comprenden en cada caso al menos de 70 a 150 posiciones de ácido nucleico y por lo tanto flanquean al menos parcialmente, preferentemente por completo, la región que codifica para la proteína. Las regiones flanqueantes pueden determinarse (PCR anclada) a este respecto a partir de las secuencias conocidas a través de métodos en sí conocidos, por ejemplo con ayuda de cebadores de PCR dirigidos hacia fuera y una preparación de ADN genómico como matriz. Entonces para permitir solo el cambio de las dos copias de gen a través de recombinación homóloga, no necesita tratarse a este respecto forzosamente de secciones codificantes de proteína. De acuerdo con la presente invención pueden concebirse los cebadores necesarios para ello por medio de la SEQ ID NO. 7 también para otras especies de bacterias Gram positivas y entre estas en particular para aquellas del género Bacillus. Como alternativa a este planteamiento experimental pueden deducirse regiones de este tipo, al menos en parte no codificantes, para muchos de estos genes de especies relacionadas, por ejemplo de entradas de bancos de datos de B. subtilis, por ejemplo del banco de datos SubtiList del Institute Pasteur, París, Francia (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi).
La presente invención se realiza también en forma de microorganismos modificados por ingeniería genética, a los que se aplica correspondientemente lo dicho anteriormente.
De manera muy general son microorganismos en los que el gen ywtB está funcionalmente inactivado.
Preferentemente estos son microorganismos en los que se trata de bacterias.
Entre estos se prefieren aquellos microorganismos en los que se trata de bacterias Gram negativas, en particular aquellos de los géneros Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, en particular de las cepas de E.
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coli K12, E. coli Bo Klebsiella planticola, y muy especialmente de derivados de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).
No son menos preferidos los microorganismos en los que se trata de bacterias Gram positivas, en particular aquellas de los géneros Bacillus, Staphylococcus o Corynebacterium, muy especialmente de las especies Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amiloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalophilus, Staphylococcus camosus o Corynebacterium glutamicum y entre estas muy especialmente se trata de B. licheniformis DSM 13.
De acuerdo con el objetivo en el que se basa la presente solicitud deben mejorarse en primer lugar los procedimientos de fermentación técnicos. Por consiguiente, la invención se realiza en particular en procedimientos de fermentación de acuerdo con la invención correspondientes.
A este respecto se trata muy en general de procedimientos para la fermentación de un microorganismo de acuerdo con la invención, descrito anteriormente.
De manera correspondiente a las realizaciones hasta el momento, los procedimientos caracterizados por esto se prefieren de manera correspondiente. A esto pertenece en particular, inactivar funcionalmente el gen ywtB. De manera especialmente preferente, se recurre para ello a los ácidos nucleicos descritos anteriormente, sobre todo los indicados bajo la SEQ ID NO. 7. Esto es válido de manera correspondiente también para las especies seleccionadas como adecuadas para la fermentación respectiva. De manera correspondiente a lo dicho anteriormente entre estas se prefieren cada vez más aquellas que presentan una cantidad creciente de parentesco con B. licheniformis DSM13, porque con ello aumentan las perspectivas de éxito con el uso de los ácidos nucleicos indicados.
Entre los procedimientos de fermentación de acuerdo con la invención se prefieren aquellos para la producción de un material reciclable, en particular para la producción de un compuesto de bajo peso molecular o de una proteína.
Entonces este es el campo de aplicación más importante para fermentaciones a escala industrial.
Se prefieren procedimientos, en los que en el caso del compuesto de bajo peso molecular se trata de un material natural, un complemento alimentario o de un compuesto farmacéuticamente relevante.
De esta manera se producen por ejemplo aminoácidos o vitaminas que se usan especialmente como complementos alimentarios. En el caso de compuestos farmacéuticamente relevantes puede tratarse de etapas previas o intermedias para dar medicamentos o incluso de estas mismas. En todos estos casos se habla también de biotransformación, según la cual se aprovechan las propiedades metabólicas de los microorganismos para sustituir la síntesis química por lo demás costosa por completo o al menos en etapas individuales.
No menos preferentes son procedimientos correspondientes en los que en el caso de la proteína formada de esta manera se trata de una enzima, en particular de una del grupo de las α-amilasas, proteasas, celulasas, lipasas, oxidorreductasas, peroxidasas, lacasas, oxidasas y hemicelulasas.
Enzimas industriales, que se producen con procedimientos de este tipo, se usan por ejemplo en la industria alimentaria. De este modo las α-amilasas sirven por ejemplo para impedir el endurecimiento del pan o para aclarar zumos de frutas. Las proteasas se usan para romper proteínas. Todas estas enzimas se describen para el uso en agentes de lavado y de limpieza, ocupando un lugar prominente en particular las proteasas de subtilisina producidas ya naturalmente por bacterias Gram positivas. En particular en la industria textil y del cuero sirven para el procesamiento de las materias primas naturales. Así mismo, todas estas enzimas pueden emplearse a su vez en el sentido de la biotransformación como catalizadores para reacciones químicas.
Muchas de estas enzimas proceden originalmente de especies de Bacillus y se producen por lo tanto de manea especialmente satisfactoria en organismos Gram positivos, en particular aquellos del género Bacillus, entre estos en muchos casos también derivados de B. licheniformis DSM13. En particular procedimientos de producción, que se basan en estos sistemas microbianos, pueden mejorarse con ayuda de la presente invención, porque en particular la secuencia indicada en la SEQ ID NO. 7 procede justo de este organismo.
Por último, los factores puestos a disposición con la presente solicitud también pueden emplearse positivamente, es decir, en el sentido de su función natural, es decir, en relación con una producción dirigida de poli-gamma-glutamato.
Se divulgan por lo tanto procedimientos microbianos para la producción de poli-gamma-glutamato, en el que uno de los ácidos nucleicos ywtB descritos anteriormente o un ácido nucleico correspondiente, que codifica para una proteína descrita anteriormente, se usa de forma transgénica, preferentemente con la formación de la proteína descrita anteriormente correspondiente.
Entre estos se prefieren procedimientos, en los que se usa un microorganismo del género Bacillus, en particular B. subtilis o B. licheniformis.
De este modo es posible, tal como se describe por ejemplo en las solicitudes JP 08308590 A o WO 02/055671 A1, producir GLA de manera microbiana, concretamente en B. subtilis y B. licheniformis. Las secuencias de ADN puestos a disposición con la presente solicitud pueden usarse por ejemplo para elevar en células correspondientes,
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caso más similares.
Las secuencias de ADN o secuencias de aminoácidos determinadas se confrontaron entre sí a través de los alineamientos representados en las Figuras 1 a 10; para ello se usó el programa informático Vector NTI® Suite Versión 7, que puede obtenerse de la empresa Informax Inc., Bethesda, EE.UU. En este caso se emplearon los parámetros convencionales de este programa, es decir, para la comparación de las secuencias de ADN: K-tuple size: 2; Number of best Diagonals: 4; Window size: 4; Gap penalty: 5; Gap opening penalty: 15 y Gap extension penalty: 6,66. Para la comparación de las secuencias de aminoácidos sirvieron los siguientes parámetros convencionales: K-tuple size: 1; Number of best Diagonals: 5; Window size: 5; Gap penalty: 3; Gap opening penalty: 10 y Gap extension penalty: 0,1. Los resultados de estas comparaciones de secuencias están reunidos en la siguiente Tabla 1, estando indicados como números de acceso los del banco de datos NCBI.
Tabla 1: Genes o proteínas más similares a los genes y proteínas determinados en el Ejemplo 1.
- Gen o proteína hallado en B. licheniformis / SEQ ID NO.
- Gen o proteína más relacionado Entrada en el banco de datos del gen o proteína más próximo Homología en % de identidad
- ywsC / 1
- ywsC de B. subtilis AB046355.1 75,4
- ywsC’ l 3
- ywsC de B. subtilis AB046355.1 78,5
- ywtA l 5
- ywsA de B. subtilis AB046355.1 77,8
- YwtB / 7
- ywsB de B. subtilis AB046355.1 67,1
- ywtD / 9
- ywtD de B. subtilis AB080748 62,3
- YwsC / 2
- YwsC de B. subtilis AB046355.1 86,1
- YwsC’ / 4
- YwsC de B. subtilis AB046355.1 89,6
- YwtA / 6
- YwsA de B. subtilis AB046355.1 89,9
- YwtB / 8
- YwsB de B. subtilis AB046355.1 65,8
- YwtD / 10
- YwsD de B. subtilis AB080748 57,3
Ejemplo 3
Inactivación funcional de uno o varios de los genes ywsC, ywsC’, ywtA y ywtB en B. licheniformis
Principio de la producción de un vector de deleción
Cada uno de estos genes puede inactivarse funcionalmente por ejemplo por medio de un denominado vector de deleción. Este modo de proceder se describe en sí por ejemplo por J. Vehmaanperä et al. (1991) en la publicación "Genetic manipulation of Bacillus amiloliquefaciens"; J. Biotechnol., volumen 19, páginas 221 -240.
Un vector adecuado para ello es pE194, que está caracterizado en la publicación "Replication and incompatibility properties of plasmid pE194 in Bacillus subtilis" de T.J. Gryczan et al. (1982), J. Bacteriol., volumen 152, páginas 722 -735. La ventaja de este vector de deleción consiste en que tiene un origen de replicación dependiente de la temperatura. A 33°C, pE194 puede replicarse en la célula transformada, de modo que a esta temperatura se selecciona en primer lugar a una transformación satisfactoria. A continuación se incuban a 42°C las células que contienen el vector. A esta temperatura ya no se replica el vector de deleción, y se ejerce una presión de selección sobre la integración del plásmido a través de una región homóloga seleccionada previamente en el cromosoma. Una segunda recombinación homóloga a través de una segunda región homóloga lleva entonces a la escisión del vector junto con la copia de gen intacta del cromosoma y con ello a la deleción del gen localizado cromosómicamente in vivo. Sería posible también como segunda recombinación la reacción inversa a la integración, es decir, una recombinación del vector a partir del cromosoma, de modo que el gen cromosómico permanecía intacto. La deleción de gen debe detectarse de acuerdo con métodos en sí conocidos, por ejemplo en la transferencia de tipo Southern tras la restricción del ADN cromosómico con enzimas adecuadas o con ayuda de la técnica de PCR por medio del tamaño de la región amplificada.
Es decir, es necesaria también la elección de dos regiones homólogas del gen que va a delecionarse, que comprenderán en cada caso al menos respectivamente 70 pares de bases, por ejemplo la región en 5’ y la región en 3’ del gen seleccionado. Estos se clonan en el vector de modo que flanquean de manera directamente sucesiva una parte que codifica para una proteína no activa u omitiendo la región entremedias. Para ello se obtiene el vector de deleción.
Deleción de los genes ywsC, ywsC’, ywtA y ywtB considerados en este caso
Para la construcción de un vector de deleción de acuerdo con la invención se amplificaron las regiones en 5’ y las regiones en 3’ de uno de estos cuatro o tres genes por medio de PCR. Para la construcción de cebadores adecuados se proporcionan las secuencias SEQ ID NO. 1, 3, 5 y 7 indicadas en el protocolo de secuencias, que proceden de B. licheniformis, serán adecuadas debido a las homologías a esperar pero también para otras especies, en particular del género Bacillus.
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