CN1340104A - 葡萄糖脱氢酶融合蛋白及其在表达系统中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有一种具有葡萄糖脱氢酶的生物活性的蛋白序列作为其组分之一的新的重组融合蛋白,并涉及其简单的和有效的在SDS－PAGE凝胶中检测任何类型的蛋白/多肽以及快速优化能够表达上述蛋白/多肽的表达系统的应用。

Description

葡萄糖脱氢酶融合蛋白及其在表达系统中的用途
本发明涉及包括一种具有葡萄糖脱氢酶(GlcDH)的生物活性的蛋白序列作为一种成分的新重组蛋白，并且涉及其用于简单的和有效的检测任何优选地作为融合伙伴的蛋白/多肽的应用，以及快速优化能够表达所说的蛋白/多肽的表达系统的用途。
在这方面，GlcDH或具有GlcDH的生物活性的序列承担标记物或检测器蛋白的作用。此酶的一个特别的特征是对诸如SDS的变性剂的异常的稳定性。GlcDH作为标记物或检测蛋白，甚至在还原和变性条件的SDS-PAGE之后表现不减少的酶活性。因此，使用一种基于这一令人惊讶之行为的敏感性酶反应，可以检测包括GlcDH的融合蛋白。因此，以GlcDH作为标记物，快速地、低成本地和有效地检测所要求的表达蛋白是可能的。
在许多情况下，GlcDH-蛋白/多肽融合蛋白以比没有GlcDH更高的产量和稳定性表达，也是可能的，特别是在E.coli中。因此，相应的蛋白本身可被用于获取和制备蛋白/多肽。
重组蛋白的体内表达在生物技术中发挥的作用正在不断增加。从诸如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞的原核和真核表达系统获取、纯化和检测所克隆的基因的产物的能力，也经常被用于蛋白结构和功能的研究，蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用的研究，以及抗体生产和突变。借助于DNA重组技术特异性地修饰天然蛋白从而改善或改变其功能是可能的。重组蛋白在被连续地深入发展的，并且在此系统中许多不同地方可以被优化的表达系统中合成。
重组蛋白合成的总过程可被分成两部分。在第一步中有该基因的分子生物学分离和该靶蛋白的表达，在第二步中有从重组细胞或其生长培养基检测和纯化。在分子水平上，将蛋白的基因克隆到为此目的所提供的表达载体中，然后插入宿主细胞(原核或真核细胞)并在其中表达。细菌细胞在此线路中被证明是提供高产量的简单的和有成本效益的表达系统。最常使用的宿主细胞是革兰氏阴性细菌E.coli。
外源基因在E.coli中表达的目标是获得最大可能量的生物活性重组蛋白，这被称为超量表达。已知真核外源蛋白在此期间可能通过聚集，作为包函体，通过不正确的折叠或蛋白水解性降解，失去其生物活性。避免这些经常出现的困难的一种可能，是所表达的蛋白作为分泌蛋白从细胞排出，或者使用所谓的融合蛋白，通过它不溶性重组蛋白可以可溶性形式存在于细胞中。
为了研究蛋白的功能和其对此功能重要的相互作用伙伴的功能，通常在真核细胞中表达蛋白。对此功能重要的翻译后修饰，和正确的区室作用可以在其中进行。此外，存在对正确折叠和加工重要的其它蛋白。
真核表达系统也适合于表达相对大的蛋白和正确折叠要求诸如S-S桥形成、糖基化和磷酸化等转录后修饰的蛋白。因为这些系统通常是复杂而昂贵的，并且表达速率低于E.coli的表达速率，所以拥有一个快速、可靠、敏感和价格合理的检测系统特别重要。
存在众多检测已经通过重组形成的，并且其生物功能未知的外源蛋白的基因融合系统。在这些中，所表达的融合蛋白经由功能已知的融合蛋白部分来检测。
为了确定正确的表达、所表达的量、分子量和所形成的融合蛋白的功能活性，一种敏感的检测系统是必要的。功能未知的蛋白的数量正在快速地增加，为其开发快速和有成本效益的检测系统正变得越来越重要。对于多数基因融合系统，使用了诸如酶联免疫吸附试验(ELISA)或Western印迹的免疫学方法，其中通过重组形成的融合蛋白借助于特异性抗体检测。
然而，相应的融合蛋白不仅有所述的优点，即外源蛋白可容易地间接检测和分析；相反地，在许多情况下，他们允许所要求的蛋白以比没有其融合伙伴之情形更高的产量表达。每一种融合伙伴都有优点，在一个特别的表达系统中，不是不常见能够将其转移给另一种融合伙伴。因此，例如，一些蛋白对蛋白水解性[sic]降解的敏感性，当它是融合蛋白之形式[sic]时，可被降低。与单个成分比较，融合蛋白还常常具有比单个成分更良好的溶解性和分泌特性。
因此，有许多在异源宿主中进行基因融合表达重组蛋白的原因。这些原因有：提高外源蛋白的溶解性，提高可溶性外源蛋白的稳定性，将外源蛋白定位在细胞的特定部分，利用已简化的纯化策略快速分离外源蛋白，融合蛋白被特异性切除的可能性，快速检测来自未纯化的细胞提取物的外源蛋白。
当前，有许多借助于基因融合系统测试重组蛋白表达的功能测试。这些包括通常使得从未纯化的细胞提取物的直接检测成为可能的简单测试。然而，测试系统在花费的时间、处理量和敏感性上有相当的差异。
就上述目的而言，区别两种类型的融合蛋白是可能的。在一方面，融合蛋白由所要求的蛋白和一个通常短的寡肽所组成。这种寡肽(“标记”)起所要求的蛋白的标记物或识别序列的作用。另外，标记可简化纯化。
标记的主要用途首先在于表达的测试，其次在于蛋白纯化。其中一个实例是由有6个连续的组氨酸残基并被直接连接到重组蛋白上的一条肽所组成的所谓的组氨酸标记(His tag)。借助于所结合的组氨酸残基，在金属亲和柱(Smith等，1988)上纯化融合蛋白是容易地可能的。这种组氨酸标记简单地借助于高度特异性单克隆抗体His-1(Pogge v.Strandmann等，1995)检测。另一种在融合蛋白中使用的标记物是GFP，一种从水母Aequorea victoria衍生而来，并在各种生物技术应用中用做生物发光蛋白(Kendall和Badminton，1998；Chalfie等，1994；Inouye等，1994)的绿色荧光蛋白(GFP)。它可利用其在活细胞、凝胶、甚至活动物中的自身荧光容易地检测。
标记的进一步的实例，是链亲合素-标记(Strep-tag)系统(Uhlen等，1990)或myc表位标记(Pitzurra等，1990)，这些将不会被进一步解释。
由重组蛋白和功能性活性蛋白所组成的融合蛋白的主要用途，除了以上所述的检测之外，在于所表达的蛋白的简化的纯化。在这些当中，各种系统是公知的，其中一些在下文中将会被简要地论及。
在GST系统中，融合载体使得表达与谷胱甘肽S-转移酶融合的完整基因或基因片段成为可能。GST融合蛋白可以通过在谷胱甘肽-Sepharose上进行亲和层析容易地从细胞裂解物中纯化(Smith，Johnson，1988)。生化或免疫学检测是可以利用的。MBP系统中的麦芽糖结合蛋白是一种来自E.coli、涉及运输麦芽糖和麦芽糖糊精通过细菌膜的周质蛋白(Kellermann等，1982)。它已被特别用于表达和在交联的直链淀粉柱上纯化碱性磷酸酶。内蛋白子(intein)系统特别适合靶蛋白的快速纯化。内蛋白子基因具有内蛋白子几丁质结合结构域(intein chitin binding domain)(CBD)的序列，通过它可以使融合蛋白直接从细胞提取物结合到几丁质柱上，并因此被纯化(Chong等，1997)。
葡萄糖脱氢酶(GlcDH)在Bacillus megaterium中孢子形成的早期是一种关键酶(Jany等，1984)。它以NAD+或NADP+作为辅酶，特异性催化β-D-葡萄糖到D-葡糖酸内酯的氧化。除了细菌孢子之外，此酶还存在于哺乳动物的肝。在B.megaterium M1286中存在两种相互独立的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)(Heimann等，1988)。GdhA和gdhB在核苷酸序列上有相当的差异，但是GlcDH-A和GlcDH-B尽管在蛋白序列上有差异，却有大致相同的底物特异性。也会被发现进一步的信息和相应的DNA和氨基酸序列，例如，在EP-B0290768中。
以上所描述的检测通过重组形成的并且其生物功能未知或不充分公知的外源蛋白的系统，通常是复杂和费时的。这意味着表达条件的改善和优化经常不能足够快地或者简单地完成。
因此，已经开发了一种使得融合蛋白的更快检测成为可能的，并且没有在现有技术的状况中所描述的可以比较的系统的缺点的融合蛋白伙伴，这是一项巨大的进步。
现在已经发现，包括GlcDH或[lancuna]GlcDH的生物活性的序列的融合蛋白，突出地适合于检测任何所要求的“外源或靶蛋白”，比使用所述的现有技术的方法更加快速、简单，并因此更加有效。这个特性基于一个令人惊讶的发现—在其它酶失活的条件下GlcDH保留其酶活性(例如，进行SDS-PAGE)。
在固定化的染料上，例如Cibachron Blue 3G或者其它由于其结构因而与NAD+辅酶相似的并且同样能结合所有的脱氢酶的类似NAD的化合物，例如氨己基-AMP，纯化脱氢酶的可能性是公知的。
因此，作为融合蛋白的部分，葡萄糖由于其对，例如，固定在凝胶上，并且可商品化获得的染料的亲和性，促进了融合蛋白在一步中纯化。通过将酶反应与一个敏感的颜色反应偶联，检测作为融合蛋白的成分的GlcDH也是可能的，优选地用碘代苯基-硝基苯基-苯四唑盐(INT)或氮蓝四唑(NBT)(在规定的条件下)，这些进一步简化了外源蛋白的间接检测。另外染色作为标记酶的GlcDH的方法，具有不妨碍在相同凝胶上使用诸如考马斯染料或银染色的习惯性蛋白染色的优点。
在本发明的一个实施方案中，除GlcDH和外源蛋白之外，融合蛋白也含有一种可用于结合此标记肽的蛋白的额外鉴定的标记肽。例如，通过聚组氨酸标记进行鉴定，此聚组氨酸标记作为抗原被特异性抗体识别。此后检测所产生的抗原-抗体复合物，例如，使用一种过氧化物酶(POD)标记的抗体经由本身公知的方法进行。结合的过氧化物酶在加入一种合适的底物(例如ECL系统，Western曝光化学发光检测系统，获自Amersham)之后，产生一种使用适合于该目的之膜可以被检测的化学发光产物。然而，免疫检测也能够利用一种本身公知的技术，通过一种特异性抗体标记进行，例如myc标记。聚组氨酸标记，单独或与myc标记联合，另外具有融合蛋白可以通过结合金属螯合柱被纯化的优点。
然而，GlcDH融合蛋白也能够直接利用亲和层析，在一种已经，例如，被固定于诸如琼脂糖的层析凝胶上的特异性抗-GlcDH抗体上，被纯化和分离。
本发明的另一个优点是GlcDH能够以可溶性形式高产量地表达，优选地在E.coli中利用公知的表达系统(见上文)。因此，已经成功地在E.coli中表达了来自Bacillus megaterium M1286的具有高的酶活性的重组葡萄脱氢酶(Heilmann 1988)。其它真核基因在E.coli中表达，经常被多肽链在细菌宿主中的不稳定性限制。不正确的折叠可导致聚集(“包函体”)，降低或缺乏生物活性，以及蛋白水解性降解。一种相应的融合基因，其中GlcDH基因或具有GlcDH之生物活性的片段已经连接到所要求的蛋白的基因上，现在可以根据本发明，以与没有融合伙伴的GlcDH基因相比较实际上没有改变的表达速率和产量转变成融合蛋白。当外源蛋白的单独表达在本身上不可能，或者可能仅在以降低的产量或仅在以不正确的折叠状态或仅在通过使用另外的技术才可能的时候，这也可进行。因此，利用随后的标记蛋白GlcDH的消除或者靶蛋白的消除，例如使用内切蛋白酶，获得所要求的外源蛋白是可能的。
根据本发明的，能够作为融合蛋白与GlcDH一起在E.coli中成功表达的一个实例是tridegin。Tridegin是血液凝集因子VIIIa的极其有效的肽抑制剂，由水蛭Haementeria ghilianii衍生而来(66AA，7.6kD；Finnery等，1997)。
然而，根据本发明，关于所使用的外源蛋白的特性和属性，没有限制要被提及。
本发明不是仅仅限定于根据本发明的融合蛋白在E.coli中表达。相反地，这样的蛋白也能够使用本身公知的方法和合适的稳定载体构建体(例如借助于人巨细胞病毒(CMV)启动子)在哺乳动物细胞，酵母或昆虫细胞以良好的表达速率有利地合成。
从上文的描述在下列的和在权利要求书中所说明的总结中，说明本发明的特征是可能的：
因此，本发明涉及一种由至少第一和第二氨基酸序列所组成的重组融合蛋白，第一序列具有葡萄糖脱氢酶的生物活性。本发明特别涉及一种相应的在其中所说的第二序列是任何重组蛋白/多肽X或代表其部分的重组融合蛋白。
根据本发明的融合蛋白可以另外包括识别序列，特别是标记序列。因此，本发明进一步涉及一种相应的可以另外具有至少一种适合于检测的其它标记序列或识别序列的融合蛋白。
根据本发明的融合蛋白具有广泛的可能用途。在此方面，具有其属性的葡萄糖脱氢酶发挥至关紧要的作用。因此，本发明涉及葡萄糖脱氢酶作为在一种所说的融合蛋白中的任何重组蛋白/多肽X的检测器蛋白的用途。本发明进一步涉及葡萄糖脱氢酶在作为一种相应的重组融合蛋白之成分的重组蛋白/多肽X表达的检测系统中的用途。本发明进一步涉及GlcDH检测蛋白-蛋白相互作用的用途，在这里一种伙伴(partner)对应于如上文和下文所定义的重组蛋白/多肽X。最后，根据本发明GlcDH可作为任何不是此融合蛋白的成分但是能够结合所说的融合蛋白中的蛋白/多肽X的第二序列的第三蛋白/多肽的检测器蛋白。GlcDH可进一步在ELISA系统，Western印迹和相关系统中用做伙伴的标记蛋白。
因为本发明使用重组技术，它当然也包括相应的载体，宿主细胞和表达系统。本发明不仅涉及如此这些载体和宿主细胞本身，还涉及在一种重组的制备方法中相应的表达载体在优化重组蛋白/多肽X的表达中的用途，以及在这样一种制备方法中相应的宿主细胞在优化重组蛋白/多肽X表达中的用途。
本发明还涉及一种利用凝胶电泳，特别是SDS-PAGE凝胶电泳，快速检测任何重组蛋白/多肽X的方法，在这里相应的融合蛋白利用凝胶电泳制备和分级分离，并且通过葡萄糖脱氢酶的酶活性在凝胶中显示所要检测的重组蛋白/多肽。
根据本发明在此方面中被用来检测葡萄糖脱氢酶的酶活性的是一种以四唑盐为基础的颜色反应，特别是碘代苯基硝基苯-苯四唑盐(INT)，或氮蓝四唑盐(NBT)，随后若需要根据现有技术的一种普通的蛋白染色在所说的颜色反应已经发生之前或之后合适的地方进行[sic]是可能的。
附图简要解释如下：
图1.载体pAW2的构建流程图。此载体含有GlcDH的序列。完整序列在序列1中描述。
图2.载体pAW3的构建流程图。
图3.载体pAW4的构建流程图。此载体含有GlcDH和tridegin的序列。完整序列在序列3中描述。
图4.GlcDH在SDS-PAA凝胶上染色。染色方法在实施例中详细地描述。1：Rainbow标准参考物；2：0.1μg GlcDH；3：0.05μg GlcDH；4：0.001μg GlcDH；5：HC11细胞的裂解物；6：预先染色的SDS标准参考物。
图5.表达的GlcDH酶的检测(15％SDS-PAA凝胶，INT染色)；1：Rainbow标准参考物；2：0.2μg天然GlcDH；3：10μl细胞提取物/1ml克隆2悬液；4：10μl细胞提取物/1ml克隆1悬液；5：预先染色的SDS标准参考物；细胞提取物体积：100μl。
图6.pAW2表达的系列稀释(15％SDS-PAA凝胶，INT染色)；1：Rainbow标准参考物；2：10μl细胞提取物/100μl悬液；3：10μl细胞提取物/1∶5稀释；4：10μl细胞提取物/1∶10稀释；5：10μl细胞提取物/1∶20稀释；6：0.5μg GlcDH；7：广范围SDS标准参考物；8：预先染色的SDS-标准参考物；细胞提取物体积：100μl。
图7.表达的tridegin/GlcDH融合蛋白检测(10％SDS-PAA凝胶，INT/CBB)；1：广范围SDS标准参考物；2：1μg GlcDH；3：0.5μg GlcDH；4：0.1μg GlcDH；5：500μl细胞提取物；6：200μl细胞提取物；7：100μl细胞提取物；8：500μl细胞提取物(pAW2表达)；细胞提取物体积：100μl。
图8.tridegin/His和tridegin/His/GlcDH融合蛋白的免疫检测(来自10％SDS-PAA凝胶，ECL检测)并与tridegin/His/GlcDH(10％SDS-PAA凝胶，INT-CBB染色)比较；1：广范围标准参考物；2：1ml细胞裂解物(pAW2表达)；3：100μl细胞提取物(pST106表达)；4：200μl细胞提取物(pST106表达)；5：300μl细胞提取物(pAW4表达)；6：2.5μg calin-His阳性对照；7：广范围标准参考物；8：100μl[lacuna](pAW4表达)；细胞提取物体积：100μl。
图9.解释GlcDH检测的敏感性的SDS-凝胶。1，5，10，25和50ngGlcDH和分子量标准参考物(左栏)作图。在上文和下文使用的缩写解释如下：A           腺嘌呤Ax         在x nm处的吸收Ab          抗体Amp         氨苄青霉素AP          碱性磷酸酶APS         过硫酸铵AA          氨基酸bla          β-内酰胺酶基因BIS          N，N′-亚甲双丙烯酰胺bp           碱基对BSA          牛血清白蛋白C            胞嘧啶cDNA         拷贝(互补)DNACBB          考马斯亮蓝CIP          牛小肠磷酸酶dNTP         2′-脱氧(核糖)核苷[sic]5′-三磷酸ddNTP        2′，3′-脱氧(核糖)核苷[sic]5′-三磷
         酸DMF          二甲基甲酰胺DMSO         二甲亚砜DNA          脱氧核糖核酸dsDNA        双链DNADTT          二硫苏糖醇ECL          ExposureTM化学发光EDTA         乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，2钠盐ELISA        酶联免疫吸附测定EtBr         溴化乙锭EtOH         乙醇f.c.         最终浓缩FACS         荧光激活细胞分类术G            鸟嘌呤GFP          绿色荧光蛋白GlcDH        葡萄糖脱氢酶(蛋白)gdh         葡萄糖脱氢酶(基因)GST         谷胱甘肽S-转移酶His         组氨酸残基HRP         辣根过氧化物酶IB          包函体(inclusion body)IgG         免疫球蛋白GINT         碘代硝基四唑紫kb          千碱基对kD          千道尔顿mA          毫安m-RNA       信使RNAMBP         麦芽糖结合蛋白MCS         多克隆位点Mr          相对分子量NAD(P)      烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)，游离酸Odx         在x nm处的光密度OmpA        外膜蛋白Aori         复制起点PAA         聚丙烯酰胺PAGE        聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR         聚合酶链式反应POD         过氧化物酶PVDF        聚偏[二]氟乙烯RNA         核糖核酸RNAse       核糖核酸酶rpm         每分钟转数rRNA         核糖体RNART           室温SDS          十二烷基硫酸钠ssDNA        单链DNAStrep        链亲合素T            胸腺嘧啶Tm           解链温度(DNA双链)t-RNA        转运RNATaq          Thermophilus[sic]aquaticusTCA          三氯乙酸TEMED        N，N，N′，N′-四甲基乙二胺Tet          四环素Tris         三(羟甲基)氨基甲烷U            酶活性的单位U            尿嘧啶UV           紫外线ON           过夜V            伏特VIS          可见的w/v          体积/重量
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Uhlen & Moks(1990)，出于表达目的的基因融合：一个介绍(GeneFusions for the Purposes of Expression：A Introduction)[12]。酶学方法(Methods in Enzymology)185，129-143
Uhlen等(1983)，基因(Gene)23，369
除非另外说明，本发明使用的方法和技术对应于充分公知的和已在相关文献中描述的方法和过程。特别地，上述公开和专利申请的内容，特别是Sambrook等和Harlow & Lane的，和EP-B-0290768，被包括在本发明中。根据本发明所使用的质粒和宿主细胞通常是示例性的，并且原则上可被已经修饰的或者具有不同结构的载体构建体，或者其它宿主细胞替换，只要他们仍然具有规定是本发明所必需的成分。这样的载体构建体的制备，以及合适的宿主细胞的转染和所要求的蛋白的表达与纯化对应于已充分公知的和可能根据本发明在广泛的限制之内被改进的标准技术。
本发明在下文中被进一步描述。进一步的细节在实施例中解释。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GlcDH结构基因用质粒pJH115作为模板通过PCR进行修饰(EP0290768)。被扩增的片段(0.8kb)，在一个末端有一个Pst I识别序列，并且在另一末端有一个Eco47III识别序列，此片段被这些酶消化并克隆到细胞质(pRG45)或细胞周质(pST84)E.coli表达载体(图1和2)中。所产生的质粒，pAW2和pAW3，现在具有编码一个大约30kD(261AA)的蛋白并且定位于强Tet启动子下游的GlcDH基因。细胞质pAW2表达载体具有一个大约4kb的大小。细胞周质pAW3分泌载体稍微更大，并且与pAW2的区别仅仅在于具有一条在多克隆位点(MCS)上游并且使得重组蛋白被分泌到细胞周质成为可能的omp A信号肽序列。两个载体都另外具有一个具有12个不同的限制性切割位点的MCS，这些限制性切割位点使得具有以下之组氨酸标记的符合阅读框的克隆成为可能。聚组氨酸(6His)标记使得重组蛋白在一种金属亲合柱上被纯化成为可能。载体pAW4最终包括利用MCS连接到一起的tridegn基因和GlcDH基因，和被连接到GlcDH基因下游的聚组氨酸(6His)标记。各构建体在图1，2和3中描述。然而，所选择的质粒构建体仅仅作为实例，并不限制本发明。他们可以被其它合适的含有所提到的DNA序列的构建体替换。载体与克隆的制备以及此蛋白的表达在实施例中被进一步说明。
在还原性SDS凝胶上进行了[sic]天然GlcDH的活性染色的敏感性。就此目的而言，用天然GlcDH(c＝1mg/ml；A＝200U/ml)制备了系列浓度，并且制备了一种阴性对照。SDS-PAGE以及使用INT进行活性染色产生了图3中所描述的SDS凝胶。使用该测试检测小到50ng浓度的GlcDH是可能的。阴性对照，不含有GlcDH，正如所预期的一样没有显示条带。
使用标准参照蛋白并且借助于校准曲线，可以确定天然GlcDH的确切分子量。为此，测定了标准参考蛋白的相对迁移距离，并且对于他们各自的对数分子量作图。
所实施的表达过程如流程图中所描述(表1)：
表1
    GlcDH表达载体转化入W3110细胞↓在37℃和LB(Amp)培养基中预培养(12h)↓细胞在37℃和主培养中诱导生长(5h)↓离心以获得生物量↓
    细胞悬浮在1xSDS加样缓冲液中↓细胞在95℃破碎5min↓细胞提取物可直接用于SDS-PAGE(1h)↓GlcDH在SDS凝胶上之活性染色(30min)↓凝胶条带分析
质粒pAW2/克隆9(pAW2/K9)转化感受态E.coli表达菌株W3110，并使用两个来自于所产生的转化平板的克隆接种5ml预培养。在主培养接种后2小时，用无水四环素进行诱导。表达总体上持续了5h，并且克隆1在1.65的OD处而克隆2在1.63处使表达终止。在SDS-PAGE和GlcDH活性染色后，来自1ml细胞悬液之各个克隆都可以检测到一条强的GlcDH条带(大约35kD)。
当SDS-PAGE在还原性条件和非还原性条件下进行时，在所产生的GlcDH条带之间没有差异变得明显。就此目的而言，在各种情况下通过使用INT进行GlcDH活性染色，在SDS凝胶上研究了500到100μl的细胞悬液。
为了说明与考马斯染色比较的GlcDH活性染色的敏感性，制备了100μl细胞悬液，和1/5，1/10以及1/20稀释的细胞悬液的样品。各稀释的最终体积同样是100μl。在GlcDH活性染色之后，所产生的SDS凝胶被用于考马斯染色从而进一步显示的蛋白条带。由此产生的SDS凝胶在图4中描述。使用GlcDH活性染色，在1/20稀释处一条不同的条带仍然是明显的，而现在考马斯染色的条带几乎不可检测。
使用质粒pST106作为模板，利用PCR修饰了具有偶联的组氨酸标记的Haementeria ghilianii tridegin结构基因。扩增的片段(0.25kb)，在其侧翼是一个Cla I识别序列和一个Pst I识别序列，用这些酶消化该片段，并将其克隆到细胞质E.coliGlcDH融合载体pAW2。所产生的质粒pAW4现在有了编码一个大约44kD的蛋白并定位于强Tet启动子下游的tredegin-His-GlcDH融合蛋白基因。利用SDS-PAGE和GlcDH活性染色分析了来自于包括细胞质pAW4质粒的E.coli菌株W3110的细胞提取物。随之，检测在35，37，40和43kD红-紫染色的数个条带是可能的。43kD条带包括所要求的tridegin-His-GlcDH融合蛋白，尽管它的分子量略微低于44kD的理论值。剩余的可以检测的条带可能是融合蛋白在E.coli中蛋白水解性降解所产生的，因为35kD的最小染色条带大约对应于GlcDH的大小。在大小比较的基础上，鉴定作为His-GlcDH降解产物所形成的35kD条带是可能的。
进行[sic]表达动力学揭示，所形成的融合蛋白的蛋白水解性降解在用无水四环素诱导Tet启动子之后2小时开始，那就是说，在此时间之后，另外的条带利用活性染色在SDS凝胶上可被检测。所形成的融合蛋白对E.coli蛋白酶不稳定，这由相对快的蛋白降解说明。通过使用构建的细胞周质GlcDH融合载体pAW3从而避免融合蛋白在细胞中蛋白水解性降解是可能的，因为在这种情形下所表达的融合蛋白将会被分泌到在E.coli细胞之间的周质间隙。已经发现E.coli细胞蛋白酶主要在细胞质。
GlcDH融合蛋白检测的敏感性和特异性使得快速和简单地筛选重组蛋白成为可能。使用天然的GlcDH，测定了GlcDH检测系统的敏感性。在SDS-PAA凝胶上，天然的GlcDH活性的检测在大约30-35kD产生了一条被染成红-紫色的条带。
利用pAW2在E.coli菌株W3110中细胞质表达的重组GlcDH显示了相同的分子量。通过比较条带强度，天然GlcDH和重组GlcDH之间的敏感性比较是可能的。
开发的测试系统(见实施例)另外使得进行SDS凝胶的双染色成为可能。在第一次染色中有GlcDH条带的特异性检测。在背景染色之后可以进行常规的蛋白染色，例如剩余蛋白的考马斯染色。根据本发明，在还原性条件下存在SDS时，GlcDH令人惊讶地保留其完整的活性，这使得在SDS凝胶上快速检测成为可能。
根据本发明，通过使用氮蓝四唑盐(NBT)作为GlcDH的底物，提高GlcDH活性检测的敏感性是进一步可能的。然而，使用INT，GlcDH检测的反应速率，可通过使用Triton X-100(1％最终溶液)或加入NaCl(1M最终溶液)进一步提高。
重组融合蛋白tridegin/His和tridegin/His/GlcDH，可通过pST106和pAW4质粒的表达而获得(图1和2)。细胞在相关的表达混合物中破碎之后，利用SDS-PAGE使样品分级分离，并转移到一张膜上。在Western印迹中，通过使用一种抗RGS.-组氨酸抗体，经由存在于其中的组氨酸标记，tridegin-His-GlcDH融合蛋白可以被免疫检测。所使用的对照是纯化的具有末端组氨酸标记的重组calin(水蛭蛋白)，和表达的无组氨酸标记的重组GlcDH的细胞提取物。此抗-RGS.组氨酸抗体能够检测一个在大约37kD的条带和另一个在大约43kD的重组tridegin/His/GlcDH融合蛋白的条带(图6)。所获得的条带与在SDS-凝胶上活性染色之后所获得条带的大小比较证明43kD条带代表tridegin-His-GlcDH融合蛋白而37kD条带代表完整融合蛋白的His-GlcDH降解产物。calin/组氨酸标记蛋白在大约26kD产生了一个条带。略微更小的重组tridegin/组氨酸标记蛋白在大约23kD产生了一个条带，加上证明组氨酸抗体结合到其它被表达的蛋白的进一步的条带。因此，用抗-RGS.组氨酸抗体进行免疫检测证明，在43kD检测到的蛋白与在37kD检测到的蛋白含有一个组氨酸标记。此外，后一蛋白的大小大约对应于偶联了组氨酸标记的GlcDH蛋白的理论大小(36.5kD)。
除了检测重组tridegin的表达之外，在使用pAW4的特定情形之下，研究了tridegin作为tridegin-GlcDH融合蛋白之成分的生物活性。本测试基于天然水蛭腺体匀浆和纯化的tridegin对因子VIIIaa的抑制(Finnery等，1997)。改进的测试在实施例中描述。作为对照，用pST106表达了融合蛋白并用pAW2表达了GlcDH蛋白。此酶活性与不是作为GlcDH-tridegin融合蛋白就是作为tridegin-组氨酸标记在E.coli表达中表达的重组tridegin比较，揭示了可以忽略的差异。另外，来自两个不同表达的重组tridegin蛋白显示了可与天然的水蛭腺体匀浆比较的生物活性。由此可以得出结论：与GlcDH融合对于共表达的外源基因的生物活性毫无妨碍效应。
Tridegin自身(也就是说不是作为融合蛋白)在E.coli中表达之后没有活性，并且以包函体形式形成。GlcDH在E.coli中表达产生了一种具有高比活和稳定性的可溶形式的酶。在表达实验中已证明了，在E.coli中表达具有高溶解能力的蛋白，当他们与外源蛋白融合时，提高了外源蛋白表达的溶解能力(LaVallie，1995)。在此情形中，tridegin与GlcDH的融合也提高了tridegin的溶解性，因为可能利用一种tridegin抑制因子VIIIa的生物检测，来检测tridegin作为tridegin-His-GlcDH融合蛋白E.coli表达之后的活性。GlcDH融合蛋白以高产量在E.coli中表达。
所克隆的基因作为含有一种大小和生物功能已知的蛋白的融合蛋白表达的可能性，显著地简化该基因产物的检测。因为这个原因，正如在介绍中所提到的一样，已经用各种检测策略开发了众多融合表达系统。
公知的系统与根据本发明的E.coli中的GlcDH融合系统的比较见表2。在一些系统中，N-末端融合蛋白可从C-末端靶或外源蛋白切除(Collins-Racie等，1995)。
表2：
标记/融合伙伴 分子量(kD) 检测 优点
GlcDH 30 在SDS凝胶中功能测试 在SDS凝胶中快速和低成本，直接的检测
组氨酸标记(Pogge v.Strandmann等，1995) 1-7 Western印迹 小
链亲合素-标记(Uhlen等，1990) 13 Western印迹 小
Myc表位(Pitzurra等，1990；Gazitt等，1992) 1-2 Western印迹，ELISA 小
IgG蛋白，Fc(Moks等，1987；Ettinger等，1996) 2-5 Western印迹，ELISA 小，细胞的选择(FACS)
GFP(Chlife等，1994；Inouye等，1994) 27 荧光，Western印迹 细胞甚至在培养皿中选择，可同时检测数种(FACS)
Intein(Chong等，1997) 48 Western印迹 融合伙伴可以删除
GST(Smith，John，1988；Gosh等1995) 26 Western印迹，在溶液中比色检测 融合伙伴可以删除
MBP(Chu di Guan等，1988；Kellermann等，1982) 40 Western印迹 融合伙伴可以删除
方法 前提 花费的时间 处理量 敏感性 信息
GlcDH检测 GlcDH功能上有活性 大约3小时 中-高 50ng 蛋白量+蛋白大小
ELISA 2种抗体 大约1天 高 pg-ng 蛋白量
Western印迹 1-2种抗体在蛋白上标记 1-2天 低 ng 蛋白大小+蛋白量
根据本发明的GlcDH检测系统的一个非常巨大的优点是它不要求，例如对于Western印迹检测，任何抗体或其它材料，例如膜，印迹装置，显影机器和胶卷，微量滴定板和滴定板读出器等。这意味着使用GlcDH系统，进行重组融合蛋白的检测顺利和快速地多。借助于GlcDH检测，确定不仅关于所表达的蛋白的量的信息，而且关于直接在SDS-PAA凝胶上没有转移到膜上的融合蛋白的相应的大小是可能的。如果GlcDH活性在融合蛋白中可以检测，那么融合伙伴通常也应该是功能上有活性的。GlcDH不妨碍融合伙伴的折叠。根据本发明的GlcDH融合蛋白系统的优点，通过从文献中选择一种有效的分离和检测在E.coli中获得的融合蛋白的方法，显示于下文中的一项比较(下文的表3)。
根据本发明的GlcDH融合蛋白系统又特别适合于提高作为包函体形成的，特别是在E.coli中，并因此使得此后的蛋白纯化变得困难和费代价的蛋白的溶解性。通常必须通过麻烦的方法，将作为包函体形成的蛋白转变成它们的天然状态。在根据本发明的融合蛋白的使用上，这是没有必要的。
总之，根据本发明作为GlcDH检测系统付诸使用的融合蛋白的优点如下：
·在SDS和还原性(变性)条件下稳定
·敏感的GlcDH特异性酶颜色测试
·达到至少50ng的敏感性
·直接在SDS凝胶上快速的检测，确定融合伙伴的分子量
·另外的蛋白染色的可能性
·廉价的材料和少的设备花费
·在E.coli中良好的表达，包括保留生物活性的靶蛋白的良好表达
·避免外源/靶蛋白的包函体或其它由不正确的折叠所产生的聚集体的可能性
·通过亲合层析，例如在染料上(Cibacron Blue 3G)纯化融合蛋白的可能性
表3
    蛋白A/GFP融合载体的构建/转化↓细胞在37℃，LB琼脂平板上生长(1天)↓细胞在25℃生长(3天)↓细胞在缓冲液中悬浮(pH8.0)↓细胞破碎并通过离心除去细胞碎片↓SDS-PAGE分离蛋白(1h)↓蛋白转移到硝酸纤维素膜上(1h)↓封闭反应(1h)↓抗体反应(1h)在蛋白A-GFP工作缓冲液中温育(20min)↓紫外线辐射(365nm)/印迹的分析   GlcDH/tridegin融合载体的构建/转化↓在37℃，LB(Amp)培养基上预培养(12h)↓在37℃，主培养中诱导细胞生长↓细胞在SDS加样缓冲液中悬浮↓在95℃SDS细胞破碎5min↓用细胞提取物SDS-PAGE(1h)↓GlcDH在SDS-凝胶上活性染色(30min)↓SDS凝胶分析测定分子量
以下实施例不限制本发明地进一步说明本发明。实施例1：
引物 序列    长度         用途
GlcDH#1 5-GCGCGAATTCATGTATACAGATTTAAAAAGAT-3′   32碱基   PCR引物(结合gdh的5′末端并引进一个EcoR I切割位点)
GlcDH#2   5′-GCGCTTCGAACTATTAGCCTCTTCCTGCTTG-3′   31碱基   PCR引物(结合gdh的3′末端并引进一个Sfu I切割位点)
GlcDH#3 5′-GCGCCTGCAGATGTATACAGATTTAAAAGAT-3′   31碱基   PCR引物(结合gdh的5′末端并引进一个Pst I切割位点)
GlcDH#4   5′-GCGCAGCGCTCTATTAGCCTCTTCCTGCTTG-3′   31碱基   PCR引物(结合gdh的3′末端并引进一个Eco47III切割位点)
Tridegin#1   5′-GCGCATCGATATGAAACTATTGCCTTGCAAA-3′   31碱基   PCR引物(结合tridegin的5′末端并引进一个Cla I切割位点)
Tridegin#2   5′-GCGCCTGCAGGTGATGGTGATGGTGATGCGA-3′   31碱基   PCR引物(结合tridegin的3′末端并引进一个Pst I切割位点)
  pASK  75UPN   5′-CCATCGAATGGCCAGATGATTA-3′   22碱基   测序引物(在5′末端IRD 41标记，结合于在pRg45和pST84的tet p/o)
  pASK  75RPN   5′-TAGCGGTAAACGGCAGACAAA-3′   21碱基   测序引物(5′IRD41标记，结合于pRG45和pST84的lpp)
  T7    Seq.s   5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′   20碱基   测序引物(5′IRD标记，结合pcDNA3.1/myc-HisA，B，C的T7引发位点)
  RevSeq.as   5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′   18碱基   测序引物(5′IRD41标记，结合pcDNA3.1/myc-HisA，B，C的BGH反向引发位点)
根据本发明使用了以上核苷酸(表4)。下面的表5总结了所使用的微生物。所有这些微生物来衍生自E.coilK12，并属于危险组1。
菌株 属/种  基因型 文献
 Top10F′OneShotTM细胞 E.coli  F′(lacIqTn10(TetR))mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZΔM15ΔlacX74deoR    recA1    araD139Δ(ara-leu)7697 galU galKrpsL(StrR)endA1 nupG 来自Invitrogen的Top10F′OneShotTM试剂盒
 EpicurianColiXLl-BlueMRF′细胞 E.coli  Δ(mcrA)183     Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)    173    endA1supE44    thi-1    recA1gyrA96    relAl    lac(F’proABlacIqZΔM15Tn10(TetI)) stratagene的感受态细胞
 top10OneShotTM细胞 E.coli  F-   mcrA   Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZΔM15    ΔlacX74recA1 deoR recA1 araD139Δ(ara-leu ) 7697  galU  galKrpsL  (StrR)  endA1  nupG 来自Invitrogen的topO TACloning试剂盒(Version C)
 W 3110 E.coli  F-λ-WT E.coli B. Bachmann，细菌学评论(Bacteriol.Rev.)36(72)525-557
供体微生物：21.10.96的M7037表达菌株(E.coli N 4830/pJH115)(由Merck提供)
pJH 115：pUC衍生物，5.9kb，OLPL启动子，gdh，to(终止子)，galk(半乳糖苷酶基因)，bla(β-内酰胺酶基因)，ori(复制起点)，2个HindIII，2个BamH I和各一个EcoR I和Cla I切割位点。
实施例2：
质粒转化入感受态E.coli细胞：
SOC培养基：20g细菌用胰蛋白胨，5g细菌用酵母提取物，0.5gNaCl，0.2g KCl和11dd H2O，高压灭菌。使用前，加0.5ml 1MMgCl2/1M MgSO4(过滤除菌)，1ml 1M葡萄糖(过滤除菌)
LB(Amp)琼脂平板：11 LB培养基(没有氨苄青霉素)和15g琼脂-琼脂混合在一起，高压灭菌，冷却至大约60℃，和1ml氨苄青霉素溶液(100mg/ml)。步骤：混合物：        1-5μl    连接产物或质粒DNA(5-50
                      μg/μl)
            50μl     感受态细胞
            450μl    SOC培养基·在冰上解冻感受态细胞10分钟·向感受态细胞中加入DNA·在冰上温育30分钟·热击：在42℃(水浴)30秒·将细胞置于冰上2分钟·加450μl预先加温的SOC培养基·在37℃以220rpm温育1小时·将100μl的小部分混合物划线到预先加温的平板上·平板在37℃过夜温育
实施例3：
TOPO-TA-Cloning和连接
TOPO-TA-Cloning是用Taq聚合酶扩增的PCR产物的5分钟克隆方法。
由Invitrogen提供的TOPO-TA-Cloning试剂盒(版本C(VersionC))是为PCR产物的直接克隆而开发的。此系统利用在PCR(3′突出端)中，在所有双链分子的3′末端加上单个脱氧腺嘌呤核苷的耐热聚合酶的性质。借助于这些3′A-突出端将PCR产物直接连接到具有3′-T突出端的载体上是可能的。该试剂盒提供就此目的特异性开发的PCR2.1-TOPO载体。此载体大小是3.9kb，并具有一个用于蓝/白筛选的lacZ基因，和氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因。克隆位点通过单个EcoR I切割位点在两边的侧翼。
连接混合物：2μl 新鲜的PCR产物1μl PCR-TOPO载体2μl 无菌水5μl 总体积·仔细混合此混合物并在室温温育5分钟·简单地离心并将管子置于冰上·立即在OneShotTM转化中使用连接产物
5μl没有PCR产物并且仅含有载体和水的混合物被用做对照。利用如下的方法进行One-ShotTM转化：
加2μl 0.5Mβ-巯基乙醇到50μl在冰上融化的One-ShotTM TOP10感受态细胞；
每管感受态细胞加2μl TOPO-TA-Cloning连接；在冰上温育30分钟；热击：在42℃30秒；在冰上冷却2分钟；加250μl的SOC培养基(室温)；在37℃和220rpm温育各管30分钟；将100μl各转化混合物划线到预先加温到37℃的平板上；在37℃过夜温育平板；
用合适的酶在分析性限制性消化中分析小量制备(3.2.2.1)后产生的转化子。实施例4：基因在E.coli中表达步骤概述如下：·从成功测序的克隆分离此质粒，并转化表达菌株W3110·从转化平板挑选一个克隆并用来制备一个5ml ON预培养·将预培养划线到LB(Amp)平板上，并将来自于该平板的克隆用来接种以后要进行的表达。·此后用1ml预培养接种50ml主培养(比例1∶50)，并测定OD600(参考测量用未接种的LB(Amp)培养基)·主培养(在一个200ml Erlenmeyer瓶中)在37℃以220rpm温育·每30分钟测定OD600·一旦OD达到0.5，就用每50ml细胞悬液10μl无水四环素(1mg/ml)诱导细胞(f.c，每毫升细胞悬液0.2μg无水四环素)，并且再次测定OD(0值)。·每小时测定OD，并且在诱导时刻之后3小时终止生长·将1ml彻底混合的细菌悬液被置于一个试管中，并以600rpm离心5分钟(如果必要，也可使用更少的悬液)·吸去上清，并在100μl 1 x red.样品缓冲液中将沉淀匀浆。·将匀浆煮沸5分钟，在冰上冷却并简单离心；·将10μl样品加样到SDS凝胶的各孔并进行电泳(3.2.16)；·此凝胶利用考马斯蓝染色和/或利用实施例5的方法染色细胞破碎：
来自50ml过夜培养的细胞以3500rpm在4℃离心15分钟。所产生的上清被倾弃，并将细胞重新悬浮在40ml 100mM Tris/HCl(pH8.5)中。被悬浮的细胞使用弗氏压碎器在1英寸的圆筒中在18,000psi下被破碎。这必需细胞被强迫通过一个狭窄的孔(＜1mm)并遭受一个突然的压力下降。一旦通过此孔，细胞因为压力差异而破碎。在此期间，细胞蛋白的结构被保持。为了避免所要求的蛋白的蛋白水解性降解的在细胞破碎后应该立即加入一种蛋白酶抑制剂。就此目的而言，1片无EDTA的CompleteTM蛋白酶-抑制剂Cocktail(Roche)被加入各40ml的蛋白溶液并在室温溶解。此后以6000rpm离心20分钟除去细胞碎片和大部分的DNA和RNA。此后将样品在-20℃冰冻。实施例5：GlcDH条带在SDS凝胶上活性染色：
使用氯化碘代苯基硝基苯基-苯四唑(INT)，能够在SDS凝胶上特异性地检测葡萄糖脱氢酶条带，这是仅仅因为SDS处理不破坏G1cDH活性因而是可能的。
GlcDH利用一种颜色反应检测。这引起在反应中形成的氢被转移给四唑盐INT，产生一种紫甲(violet formazan)。吩嗪硫酸甲酯作为电子转移试剂。预温育缓冲液(0.1M Tris/HCl，pH7.5)15.76g Tris/HCl加11dd H2O，用NaOH调节到pH7.5反应缓冲液(0.08％INT，0.005％吩嗪硫酸甲酯，0.065％NAD，5％Glc的1M Tris/HCl溶液，pH7.5)0.8g  氯化碘代苯基硝基苯基四唑(INT)0.05g methylphenazinium methosulfate(吩嗪硫酸甲酯
  (phenanz ine methosulfate))0.65g NAD50g   D-(+)一水葡萄糖加110.1M Tris/HCl(pH7.5)GlcDH贮存缓冲液：26.5  EDTA15g   Na2HPO4加11，pH7.0(NaOH)
样品制备：
·在标准缓冲液中稀释样品和标准参考物(marker)
·在水浴中煮沸3分钟并在冰上冷却，离心
SDS凝胶电泳按照标准方法。
活性染色：
·在37℃，预温育缓冲液中温育具有已分级的蛋白条带的SDS凝胶，同时轻柔地摇动5分钟
·倾弃缓冲液并用足够量的反应缓冲液(RT)覆盖，在37℃温育同时轻柔地摇动(换缓冲液至少1x)
·温育大约30分钟后，有GlcDH的条带被染成红-紫色。
·在预温育缓冲液中洗涤凝胶，照相并干燥
·如果要求的话，进行随后的考马斯染色并在此后干燥凝胶
实施例6：
使用ECL系统进行免疫检测(Western ExposureTM化学发光检测系统)：
偶联组氨酸标记的蛋白使用两种抗体间接地检测。使用的第一抗体是检测标记了6xHis的蛋白的抗-RGS.组氨酸抗体(QIAGEN)。此后使用过氧化物酶(POD)标记的AffiniPure羊抗小鼠IgG(H+L)抗体检测所产生的抗原-抗体复合物。在加入ECL底物混合物后，结合的过氧化物酶产生一种能够使用高性能的化学发光胶卷检测的化学发光底物。
丽春红S溶液(0.5％丽春红，7.5％TCA)1.25g  丽春红S18.75g TCA用双蒸水补到250ml10×PBS缓冲液pH7.414.98g  磷酸氢二钠×2H2O2.13g   磷酸二氢钾87.66g  氯化钠补足到11，检查pH是7.4使用1x缓冲液浓度。Biometra印迹缓冲液25mM    Tris150mM   甘氨酸10％    甲醇封闭缓冲液5％     脱脂奶粉在1xPBS缓冲液中溶解洗涤缓冲液0.1％NonidetTM P-40(Sigma)在1xPBS缓冲液中溶解检测如下进行：·剪一块PVDF膜(Imobilon P，Millipore)和凝胶大小的6x印迹滤纸
·在甲醇并然后在Biometra印迹缓冲液中平衡此PVDF膜15秒钟，并对SDS凝胶和滤纸应用相同的步骤
·印迹构建：在印迹槽中安装3层滤纸，膜，凝胶，3层滤纸(在各层之间的气泡必须被赶出来，否则在这些地方没有转移发生)
·印迹：凝胶1-1.5mA/cm2 1小时
·检查蛋白转移：
·在印迹之后，通过使用丽春红S染色检测转移到PVDF膜上的蛋白：在平皿中用0.5％的丽春红S溶液温育此膜同时摇动至少2分钟。倾弃染色(可重复使用)并在流动的去离子水下对使此膜脱色。在这种情形下，仅仅强的蛋白条带被染色。分子量标准参考物用一支圆珠笔做标记。
·印迹的显影
所有的温育应该在平皿中在Celloshaker上，并在roller cabinet中在50ml Falcon管中进行，因为在以下步骤期间此膜永远不能干。
(1)饱和
在37℃，在一个roller cabinet中30分钟，使用PBS/5％脱脂奶粉
(2)第1抗体：用PBS/5％脱脂奶粉(体积大约7ml/膜)1∶2000稀释，在37℃温育1小时
(3)洗涤：大量使用洗涤溶液PBS/0.1％NP40洗涤膜，洗涤3×5分钟
(4)POD-标记的抗体：用PBS/0.5％脱脂奶粉1∶1000稀释，在37℃温育1小时
(5)洗涤：大量使用洗涤溶液PBA/0.1％NP-40洗涤，洗涤3×5分钟
(6)显影：充分旋转此膜(不允许干)并置于塑料片上，用ECL显影液(Amersham)完全覆盖1分钟，旋转此膜并置于成双的片中，将偏振片Hyperfilm置于上层并显影
实施例7：
利用因子XIIIa的抑制的tridegin检测(Finney等的方法，根据本发明做了修改)：
代替因子XIIIa的天然底物，即氨基酸的含有氨基的侧链，合成胺也被掺入到合适的蛋白底物中。这些合成胺有使检测成为可能的分子内标记。胺掺入测试是固相测试。滴定板用酪蛋白包被。底物生物素酰氨基戊胺被因子XIIIa掺入到此酪蛋白中。酪蛋白-生物素酰氨基戊胺可被链亲合素-碱性磷酸酶融合蛋白(strep/AP)检测。这个三明治反应通过使用对-硝基苯磷酸检测磷酸酶活性来进行[sic]。这涉及以下反应：
4-硝基苯酚盐[sic]的形成通过在405nm的光度测定来确定，并直接与AP活性成比例。生物素和链亲合素之间的高亲合性相互作用意味着磷酸酶活性同样与因子XIIIa活性成比例，也就是说，更强的吸收(呈黄色)意味着更高的因子XIIIa活性(Janowski，1997)。EDTA是因子XIIIa的非常不特异性的抑制剂，其辅因子Ca2+在一种螯合复合物中被EDTA结合。因为这个原因，使用的蛋白样品不应含有任何EDTA，并用无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物预处理(Boehringer)。洗涤缓冲液：100mM Tris/HCl，pH8.5溶液A：     在洗涤缓冲液中溶解0.5％脱脂奶粉溶液B：     在洗涤缓冲液中溶解0.5mM生物素酰氨基戊
        胺，10mM DTT，5mM CaCl2溶液C：     在洗涤缓冲液中溶解200mM EDTA溶液D：    在溶液A中溶解1.7μg/ml链亲合素-碱性磷酸
       酶溶液E：    在洗涤缓冲液中溶解0.01％(w/v)Triton
       X-100溶液F：    在洗涤缓冲液中溶解1mg/ml对-硝基苯磷酸，
       5mM MgCl2
包被：
·根据样品的数目，在一块滴定板上各孔中分发200μl溶液A，
在37℃摇动30分钟(Thermoshaker)
洗涤：
·每孔用300μl洗涤缓冲液洗涤两次
掺入反应：
·每孔分发10-150μl样品，并加入5μl因子XIIIa/孔和200μl溶液B/孔
在37℃下振摇30分钟
终止：
·用300μl溶液C(因子XIIIa抑制)/孔洗两次
·用300μl洗涤缓冲液/孔洗两次
Strep/Ap结合(特异性的)：
·每孔加入250μl溶液D
·在室温温育60分钟
洗涤：
·每孔用300μl溶液E洗涤(使没有共价结合的蛋白脱落)
·每孔使用300μl洗涤缓冲液洗涤4次
底物：
·每孔加50μl溶液F+每孔200μl洗涤缓冲液
·在室温温育30分钟
用计算机辅助的评价，在微量滴定板读数器上在405nm测量
实施例8：GlcDH检测的敏感性
将规定量的已纯化的GlcDH置于SDS凝胶上。在电泳跑完之后，此SDS凝胶在预温育缓冲液中37℃温育5分钟。弃去此缓冲液，并在37℃反应缓冲液中摇动此凝胶。在进一步的步骤中用考马斯蓝染色此凝胶。
1升反应缓冲液：
0.1M Tris/HCl，pH7.5
0.5M NaCl
0.2％Triton X-100
0.8g碘代苯基硝基苯基四唑氯化物
0.05g methylphenazinium methosulfate
0.65g NAD
50g D-(+)-一水葡萄糖
预温育缓冲液：
0.1M Tris/HCl，pH7.5
0.5M NaCl

Claims (17)

1.由至少一种第一和第二氨基酸序列所组成的重组融合蛋白，特征在于第一序列具有葡萄糖脱氢酶的生物活性。
2.根据权利要求1的重组融合蛋白，特征在于第二序列是任何重组蛋白/多肽X或代表其部分。
3.根据权利要求2的重组融合蛋白，特征在于它可以另外地具有至少一个适合于检测的其它识别序列(“标记物序列”)。
4.DNA，特征在于它编码根据权利要求1-3的一种融合蛋白。
5.表达载体，特征在于它包括根据权利要求4的一种DNA。
6.表达重组蛋白/多肽的宿主细胞，特征在于它包括根据权利要求5的一种表达载体。
7.葡萄糖脱氢酶在根据权利要求1到3的一种融合蛋白中作为任何重组蛋白/多肽X的检测器蛋白的用途。
8.葡萄糖脱氢酶在作为根据权利要求1到3的一种融合蛋白的成分的一种重组蛋白/多肽X的表达的检测系统中的用途。
9.葡萄糖脱氢酶用于检测蛋白-蛋白相互作用的用途，其中一个伙伴对应于权利要求1到3的重组蛋白/多肽X。
10.葡萄糖脱氢酶在根据权利要求1-3的一种融合蛋白中作为不是根据权利要求1-3的融合蛋白的一种成分，并且能够结合到所说的融合蛋白中的蛋白/多肽X的第二序列的任何第三蛋白/多肽的检测器蛋白的用途。
11.根据权利要求5的一种表达载体在一种重组制备方法中在最优化一种重组蛋白/多肽X的表达中的用途。
12.根据权利要求6的一种宿主细胞在一种重组的制备方法中在最优化一种重组蛋白/多肽X的表达中的用途。
13.通过凝胶电泳(gellectrophoresis)快速检测任何重组蛋白/多肽X的方法，特征在于制备根据权利要求1到4的一种融合蛋白和利用凝胶电泳分级分离，并且通过葡萄糖脱氢酶的酶活性使要在凝胶中被检测的重组蛋白/多肽可见。
14.根据权利要求13的方法，特征在于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)被用做凝胶电泳方法。
15.根据权利要求13的方法，特征在于基于四氮唑盐的一种颜色反应被用来检测葡萄糖脱氢酶的酶活性。
16.根据权利要求15的方法，特征在于碘代苯基硝基苯基-苯四唑盐(INT)或氮蓝四唑盐(NBT)被用做四氮唑盐。
17.根据权利要求13或16的方法，特征在于葡萄糖脱氢酶的特异性染色之后进行一个普通的蛋白染色。
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