JPS63230098A - 酵素の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔概　要〕 未精製の酵素試料を電気泳動法により分離し、その後、
分析を目的とする酵素の存在する部分のみをその酵素活
性に基づいて発色させる。この発色にもとづいて、酵素
の定性、定量あるいは活性測定を行う。本発明によれば
、未精製の酵素試料を予め分離又は精製することなく、
簡単な電気泳動法でもって容易に酵素の分析を行うこと
ができる。

〔産業上の利用分野〕

本発明は酵素の分析方法に関する。本発明は、さらに詳
しく述べると、ＮＡＤ　にコチンアミドアデニンジヌク
レオチド）を補酵素とする脱水素酵素を電気泳動法によ
り分離、検出し、かつその酵素活性を測定する方法に関
する。本発明方法は、未精製の酵素液、複数の生物種に
由来する酵素の混合液など（以下、これらを総称して「
未精製の酵素試料」と記す）を分析するのに有用である
。

〔従来の技術〕

従来、未精製の酵素試料を用いて、電気泳動によって特
定の酵素分子を検出する場合、例えばＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法のようなゲル電気泳動法、等電
点電気泳動法、密度勾配法などの一次元電気泳動法によ
って、目的とする酵素の明瞭なバンドを得ることが難し
いので、通常はこれらの方法を組み合わせた二次元電気
泳動法が用いられている。

また、今日、有用な酵素を大量に得るための手段として
、遺伝子組換え技術が広く利用され、大腸菌内に異種遺
伝子由来の酵素を得ることが可能となっている。しかし
、このように遺伝子組換えによって酵素を生産する場合
、導入した異種遺伝子の発現量やその遺伝子を由来とす
る酵素の産生量を調べる必要が生じ、また、かかる調査
を行うに当って、組換え体株の細胞中には外来遺伝子に
由来する酵素Ａの他に宿生細胞に由来する酵素Ａも混在
するという問題も存在する。

従来、上記のような組換え体株の細胞抽出液を用いて外
来遺伝子に由来する酵素Ａ分子の検出や活性測定を行う
場合には、また、一般的には、複数の生物種に由来する
酵素Ａの混合液（例えば大腸菌の酵素Ａと高度斉熱菌の
酵素Ａの混合液）中の１つの生物種の酵素への活性のみ
を測定する場合には、酵素Ａの混合液から目的とする生
物種の酵素Ａを分離、精製し、この精製酵素試料を用い
て、従来常用の酵素活性測定法によって活性を測定する
という方法がとられている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記したような従来の酵素分析方法には、それぞれ解決
されなければならない問題点がある。例えば、未精製の
酵素試料の分析の場合には、それに用いられる二次元電
気泳動法が、操作が煩雑なうえに時間もかかるので、未
精製の試料をそのま＼用いて、しかも容易に電気泳動に
よる酵素分子の検出を行い得る方法を提供することが望
まれている。

また、複数の生物種に由来する酵素Ａの混合液の分析の
場合には、同一の酵素であっても、生物種によってタン
パク質の一次構造に多少の違いがあり、分子量や電気的
性質も異なる反面、進化上類縁関係にある生物種間では
これらの値に大きな差がみられないことも多く、したが
って、このような関係にある生物種の酵素Ａの混合液か
ら１つの生物種の酵素Ａのみを分離するのは困難も大で
ある。

これらの問題点を解決して、未精製の酵素試料を用いて
、目的とする酵素分子の検出を容易に行うための、ある
いは２種以上の生物由来の酵素の混合液を試料として用
いて、その試料を精製せずに各生物由来の酵素の活性を
測定するための酵素分析方法を提供することが、本発明
の目的である。

〔問題点を解決するための手段〕

上記した目的は、本発明によれば、未精製の酵素試料を
電気泳動法により分離し、得られた泳動担体と反応液と
の接触により酵素反応を行わせ、酵素活性に基づ（発色
を行わせることにより、酵素の定性及び／又は定量ある
いは活性測定を行うことを特徴とする、酵素を分析する
方法によって達成することができる。

本発明方法において、酵素試料の分離に用いることので
きる電気泳動法は、この技術分野において一般的に用い
られているもの、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳
動法のようなゲル電気泳動法、等電点電気泳動法、その
他である。

電気泳動法による泳動担体と反応液との間の酵素反応は
、両者を接触せしめることによって、例えば泳動担体の
反応液中における浸漬、泳動担体と反応液含浸媒体との
密着、その他によって行うことができる。効率等の面か
ら、密着法の使用が特に推奨され、また、その際、含浸
媒体として例えば口紙などの吸収性材料を使用し、これ
に反応液を吸収させることが好ましい。

酵素反応に関与させるために使用する反応液は、所望の
酵素反応のタイプ、所望とする結果等に応じているいろ
な組成をとることができる。−例を示すと、ＮＡＤを補
酵素とする脱水素酵素を含む未精製の酵素試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分画する場合、次の
ような物質を含む反応液を使用することができる： ＮＡＤ”　　（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド） 目的とする酵素に対する基質となる物質ＮＢＴ　にトロ
ブルーテトラゾリウム）ＰＭＳ　　（フェナジンメトサ
ルフェート）ここでは、ＮＡＤを補酵素として酵素反応
を行うことの結果、該反応によって生成したＮＡＤＨ（
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が発色
反応に関与せしめられる。具体的には、ＰＭＳ及びＮＢ
ＴがＮＡＤＨによって順次還元せしめられて発色反応が
進行する。発色は、目的とする酵素の存在する部分のみ
において、その酵素活性に基°づいて行われる。

〔作　用〕

本発明方法における酵素反応及び発色反応は、原理的に
説明すると、次の通りである：先ず、ゲル上の局所に存
在する脱水素酵素が反応液中のＮＡＤ”及び基質と反応
して基質を酸化し、ＮＡＤＨを生成する０次いで、この
ＮＡＤＨによって、ＰＭＳ及びＮＢＴが順次還元される
。このような一連の酸化還元反応によってＮＢＴ　（還
元型）が生成する。このＮＢＴが重合すると不溶性ホル
マザンとなり、ゲル上の当該酵素の存在する部分に紫色
の沈殿となって析出する。

ＮＡＤを補酵素とする脱水素酵素はゲル上に多種類が存
在する可能性があるけれども、反応液中に存在する基質
に特異的な脱水素酵素のみがＮＡＤを還元するので、１
種類の脱水素酵素のみを検出することができる。

また、試料中に複数の生物に由来する脱水素酵素が含ま
れている場合でも、それぞれの酵素の易動度に基づいて
、別々のバンドとして検出することができる。従って、
発色後のゲルをデンシトメータにかけるか、バンドを切
り出して特定の波長における吸光度を測定するなどして
、各生物由来の脱水素酵素の活性を測定することもでき
る。

〔実施例〕

本例では、大腸菌と、高度好熱菌のβ−イソプロピルリ
ンゴ酸脱水素酵素の本発明方法による検出について説明
する。

試料として、大腸菌のに１２株の菌体抽出液、そして高
度好熱菌の遺伝子を導入した組換え体に１２株の菌体抽
出液を調製した。組換え体に１２株は、高度好熱菌のイ
ソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の構造遺伝子を保持して
おり、大腸菌のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素以外に
この高度好熱菌のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素も産
生ずることが判っている。

大腸菌及び組換え体大腸菌を液体培地中で培養し、その
完了後に集菌して、バッファ中で超音波粉砕した。引き
続いて、遠心分離により上清を採り、少量のグリセロー
ル及びトリス−塩酸バッファ（ｐＨ６，７）を添加して
最終濃度６２ｍＭとなし、７．５％のポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動した。泳動の完了後、ゲルを、１ｍ
ＭのＮＡＤ“、１１のβ−イソプロピルリンゴ酸（基質
）　、０．８１２ＴＩＩＭのＮ　Ｂ　Ｔ、　０．２１６
　ｍＨのＰＭＳ、　１００　ｍＭのトリス−塩酸バッフ
ァ（ｐＨ８，０）　、１ｍＭのＭｇＣ１ｔ、そして１０
０　ｍＭのＫＣｌからなる反応液を浸み込ませた口紙に
はさみ込み、そのま＼の状態で３７℃で２０分間にわた
ってインキュベートした。第１図に示すような結果が得
られた。

第１図は、インキュベーション後の脱水素酵素の電気泳
動の写真を図面におこしたもので、レーン１には、高度
好熱菌のβ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子組
換え大腸菌の抽出液を泳動したものが、また、レーン２
には、大ＩＩ！閉の抽出液を泳動したものが、それぞれ
示されている。この電気泳動図から、レーン１では大腸
菌のβ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（ａ）と高度
好熱菌のβ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（ｂ）の
２つのバンドが、一方、レーン２では大腸菌のβ−イソ
プロピルリンゴ酸脱水素酵素（ａ）の１つのバンドだけ
が、それぞれ認められる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、未精製の酵素試料や、複数の生物由来
の酵素の混合液を用いて、目的とする酵素分子を明瞭な
バンドとして容易かつ高感度に検出することができ、ま
た、従来の電気泳動後の染色のようにタンパク質すべて
を染色することは不必要である。また、本発明によれば
、形成されたバンドの特定波長における吸光を測定する
ことにより、酵素の定量や活性の測定を行うことができ
る。

本発明によれば、さらに、電気泳動を行うための試料を
予め分離、精製することを省略することができ、しかも
１回の、すなわち、−次元の電気泳動で非常に明瞭なバ
ンドを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、大腸菌と、高度好熱菌のβ−イソプロピルリ
ンゴ酸脱水素酵素の電気泳動を示した図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、未精製の酵素試料を電気泳動法により分離し、得ら
   れた泳動担体と反応液との接触により酵素反応を行わせ
   、酵素活性に基づく発色を行わせることにより、酵素の
   定性及び／又は定量あるいは活性測定を行うことを特徴
   とする、酵素を分析する方法。 ２、前記酵素反応をＮＡＤを補酵素として行い、該反応
   によって生成したＮＡＤＨを発色に関与させる、特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記ＮＡＤＨによりフェナジンメトサルフェート及
   びニトロブルーテトラゾリウムを順次還元させて発色を
   行わせる、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、前記泳動担体を反応液中に浸漬することによって酵
   素反応を行わせる、特許請求の範囲第１項〜第３項のい
   ずれか１項に記載の方法。 ５、前記泳動担体を反応液含浸媒体と密着させることに
   よって酵素反応を行わせる、特許請求の範囲第１項〜第
   ３項のいずれか１項に記載の方法。 ６、前記媒体がロ紙であり、これに反応液が吸収せしめ
   られている、特許請求の範囲第５項に記載の方法。