KR20010103017A - 글루코스 데히드로게나제 융합 단백질 및 발현계에서의그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 그의 구성성분 중 하나로서 글루코스 데히드로게나제의 생물학적 활성을 갖는 단백질 서열을 함유하는 신규한 재조합 융합 단백질, 및 SDS-Page 겔 중 임의의 유형의 단백질/폴리펩티드의 간단하고 효과적인 검출 및 상기 언급된 단백질/폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 발현계의 빠른 최적화를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

글루코스 데히드로게나제 융합 단백질 및 발현계에서의 그의 용도{GLUCOSE DEHYDROGENASE FUSION PROTEINS AND THEIR UTILIZATION IN EXPRESSION SYSTEMS}
본 발명은 하나의 구성성분으로서 글루코스 데히드로게나제 (GlcDH) 의 생물학적 활성을 갖는 단백질 서열을 함유하는 신규한 재조합 융합 단백질, 및 바람직하게는 융합 파트너로서 작용하는 임의의 단백질/폴리펩티드의 간단하고 효율적인 검출 및 상기 단백질/폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 발현계의 빠른 최적화를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
이와 같은 견지에서, GlcDH 또는 GlcDH 의 생물학적 활성을 갖는 서열은 마커 또는 검출자 단백질의 역할을 맡는다. 상기 효소의 특별한 특성은 SDS 와 같은 변성제에 탁월하게 안정한 것이다. 마커 또는 검출자 단백질로서 GlcDH 는 심지어 SDS-PAGE 겔의 환원 및 변성 조건 후에도 효소 활성이 감소되지 않음을 나타낸다. 따라서 GlcDH 를 함유하는 융합 단백질은 상기 놀라운 거동을 토대로 한 감응성 효소 반응을 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 이에 따라, 목적하는 발현된 단백질을 마커로서 GlcDH 를 사용하여 저비용 및 효율적으로 빠르게 검출하는 것도 가능하다.
또한, 특히 대장균 내에서는, 많은 경우에 GlcDH-단백질/폴리펩티드 융합 단백질을 GlcDH 를 사용하지 않을 때보다 고수율로 안정하게 발현시키는 것이 가능하다. 이에 따라, 해당하는 융합 단백질이 단백질/폴리펩티드를 수득 및 제조하기위하여 그대로 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 생체내 발현은 생물 공학에서 매우 많은 역할을 수행한다. 또한, 예를 들어 균, 효모, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 원핵 및 진핵 발현계로부터 클론된 유전자 생성물을 수득, 정제 및 검출하는 능력이 단백질의 구조 및 기능, 단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호작용, 및 항체 생성 및 돌연변이의 연구에 빈번하게 사용된다. DNA 재조합 기술을 사용하여 천연 단백질을 변형시키는 것, 구체적으로는 그의 기능을 개선시키거나 바꾸는 것이 가능하다. 재조합 단백질은 계속적으로 더욱 발전되고 계 내 많은 다른 지점에서 최적화될 수 있는 발현계에서 합성된다.
재조합 단백질 합성의 전체적인 공정은 두 부분으로 나누어질 수 있다. 제 1 단계는, 유전자의 분자 생물학적 단리 및 표적 단백질의 발현이고, 그 다음 단계는, 재조합 세포 또는 그의 성장 매질로부터의 검출 및 정제이다. 분자 수준에서, 단백질의 유전자를 이러한 목적으로 제공된 발현 벡터로 클로닝시킨 후 숙주 세포 (원핵 또는 진핵 세포) 에 삽입하고 그 안에서 발현시킨다. 상기 관계에서 균 세포는 고수율로 이끄는 간단하고 비용-효율적인 계인 것이 증명된다. 가장 빈번하게 사용되는 숙주 세포는 그람-음성 대장균이다.
대장균 내에서의 외래 유전자 발현의 목적은, 과발현으로 불리우는, 생활성 (bioactive) 재조합 단백질을 가능한 다량으로 얻는 것이다. 진핵 외래 단백질은 부정확한 접힘 (folding) 또는 단백질가수분해를 통해, 봉입체로서, 응집을 통해 이러한 발현 동안 생물학적 활성을 손실할 수 있다는 것이 알려져 있다. 상기 빈번하게 발생하는 난점을 피하는 한 가지 가능성은 발현된 단백질을 분비 단백질로서 세포로부터 배출시키거나, 또는 그밖에 소위 융합 단백질을 사용하는 것으로, 이러한 융합 단백질을 통해 불용성 재조합 단백질이 세포 내에서 불용성 형태로 존재할 수 있다.
단백질 및 기능상 중요한 그의 상호작용 파트너의 기능을 조사하기 위해, 단백질은 통상 진핵 세포에서 발현된다. 기능상 중요한 후-전사 변형, 및 정확한 구획화가 그 안에서 일어날 수 있다. 또한, 정확한 접힘 및 프로세싱 (processing) 에 중요한 다른 단백질이 존재한다.
진핵 발현계는 또한 비교적 거대한 단백질, 및 정확한 접힘을 위해 예를 들어 S-S 브릿지 (bridge) 형성, 글리코실화, 인산화 등과 같은 후-전사 변형을 요구하는 단백질을 발현시키는데 적절하다. 상기 계가 통상적으로 복잡하고 고가이며, 대장균보다 발현율이 낮기 때문에, 빠르고, 신뢰할 수 있고, 감도있고 합리적인 비용이 드는 검출계를 갖는 것이 특히 중요하다.
수많은 유전자 융합계가, 재조합으로 형성되고 생물학적 기능이 알려지지 않은 외래 단백질을 검출하기 위해 존재한다. 여기서, 발현된 융합 단백질은 그 기능이 알려진 융합 단백질의 일부를 통하여 검출된다.
정확한 발현, 발현된 양, 형성된 융합 단백질의 분자량 및 기능적 활성을 측정하기 위하여 감응적인 검출계가 필요하다. 미지 기능의 단백질 수가 빠르게 증가하고 있고, 그에 대한 빠르고 비용-효율적인 검출계를 개발하는 것이 더욱 중요해지고 있다. 대부분의 유전자 융합계를 사용하는 경우에는, 예를 들어 효소결합면역흡착분석법 (ELISA) 또는 웨스턴 블롯과 같은 면역학적 방법이 사용되고, 여기서 재조합에 의하여 형성된 융합 단백질은 특정 항체를 사용하여 검출된다.
그러나, 해당하는 융합 단백질은 외래 단백질이 용이하게 검출되고 간접적으로 분석될 수 있다는 기재된 이점이 있을 뿐만 아니라; 많은 경우에서 이들은 목적 단백질이 그의 융합 파트너가 없는 경우보다 고수율로 발현되게 한다. 각 융합 파트너는, 특히 발현계에서, 다른 파트너로 통상적으로 전이시킬 수 있는 이점을 갖는다. 따라서, 예를 들어, 융합 단백질 형태인 경우 단백질가수분해에 대한 몇몇 단백질의 감도가 감소될 수 있다. 또한 융합 단백질은 빈번하게 개개의 성분보다 더욱 바람직한 용해도 및 분비 성질을 갖는다.
따라서, 이종 숙주에서 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 유전자 융합을 수행할 충분한 이유가 있다. 이는: 외래 단백질의 용해도를 증가시킴, 가용성 외래 단백질의 안정성을 증가시킴, 세포의 특정 부분에서 외래 단백질을 국부화시킴, 간략화된 정제술에 의하여 외래 단백질을 빠르게 단리시킴, 융합 단백질이 특이적으로 절단될 가능성, 미정제 세포 추출물로부터의 외래 단백질의 빠른 검출의 가능성이다.
현재 유전자 융합계를 사용하여 재조합 단백질의 발현을 테스트하기 위한 많은 기능성 테스트가 있다. 이들은 통상적으로 미정제 세포 추출물로부터 직접적인 검출을 가능하게 하는 간단한 테스트를 포함한다. 그러나, 테스트 시스템들은 소요 시간, 효율 및 감도에 있어서 상당히 다르다.
상기 언급된 목적을 위하여, 두 가지 유형의 융합 단백질을 구별하는 것이가능하다. 한편으로, 목적 단백질 및 통상적인 짧은 올리고펩티드로 이루어진 융합 단백질. 상기 올리고펩티드 ("표지") 는 목적 단백질에 대한 인식 서열 또는 마커로서 기능한다. 표지는 정제를 더욱 간단히할 수 있다.
표지의 주된 용도는 우선 발현을 테스트하는 것이고 다음으로는 단백질 정제에 있다. 그의 한 예는 6 개의 연속된 히스티딘 잔기를 갖는 펩티드 서열로 이루어져 있고, 재조합 단백질에 직접 연결되어 있는 소위 His 표지이다. 부착된 His 잔기를 사용하여, 금속 친화성 컬럼 상에서 융합 단배질을 쉽게 정제할 수 있다 [Smith et al., 1988]. 상기 His 표지는 매우 특이적인 단일클론성 항체 His-1 를 사용하여 간단히 검출된다 [Pogge v. Strandmann et al., 1995]. 융합 단백질에서 사용되는 또 다른 마커는 GFP, 즉 해파리 아에쿠오레아 빅토리아 (Aequorea victoria) 로부터 유래하고 각종 생물공학적 응용에서 생물발광성 단백질로서 사용되는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP) 이다 [Kendall and Badminton, 1998]; [Chalfie et al., 1994]; [Inouye et al., 1994]. GFP 는 살아있는 세포, 겔 및 심지어 살아있는 동물에서도 그의 자가형광에 의하여 용이하게 검출될 수 있다.
자세히 설명되지 않을, 표지의 또 다른 예는 Strep-표지계 [Uhlen et al, 1990] 또는 myc 에피토프 표지 [Pitzurra et al, 1990] 이다.
상기 기재된 검출 외에 재조합 단백질 및 기능적으로 활성인 단백질로 이루어진 융합 단백질의 주된 용도는 발현된 융합 단백질의 간단화된 정제에 있다. 이 중에서, 다양한 계가 공지되어 있고, 이 중 몇몇은 하기에서 간단하게 언급될것이다.
GST 계에서는, 융합 벡터는 글루타민 S-트랜스페라제와의 융합물에서 유전자 단편 또는 완전한 유전자를 발현시키는 것을 가능하게 한다. GST 융합 단백질은 글루타티온-세파로스 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의하여 세포 용해질로부터 용이하게 정제될 수 있다 [Smith, Johnson, 1988]. 생화학적 및 면역학적 검출이 사용가능하다. MBP 계의 말토스-결합 단백질은 말토스 및 말토덱스트린을 균의 막을 통하여 운반시키는데 수반되는 대장균으로부터의 원형질막 단백질이다 [Kellermann et al., 1982]. 이것은 특히 가교결합된 아밀로스 컬럼 상에서 알칼리성 포스파타제를 정제하고 발현시키는데 사용되어 왔다. 인테인 (intein) 계는 구체적으로는 표적 단백질의 빠른 정제에 적절하다. 인테인 유전자는 인테인 키틴 결합 영역 (CBD) 에 대한 서열을 갖는데, 이를 통해 융합 단백질이 세포 추출물로부터 키틴 컬럼으로 직접 결합되어 정제될 수 있다 [Chong et al., 1997].
글루코스 데히드로게나제 (GlcDH) 는 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 에서의 포자형성 초기 단계 동안의 핵심 효소이다 [Jany et al., 1984]. 이것은 구체적으로는 조효소로서 작용하는 NAD+또는 NADP+와 함께, β-D-글루코스의 D-글루코노락톤으로의 산화를 촉매한다. 균 포자와는 별개로, 또한 상기 효소는 포유류의 간에서 발생한다. 두 개의 서로 독립적인 글루코스 데히드로게나제 유전자 (gdh) 가 비. 메가테리움 (B. megaterium) M1286 에 존재한다 [Heilmann et al., 1988]. GdhA 및 gdhB 는 뉴클레오티드 서열에 있어서 상당히다른 반면, GlcDH-A 및 GlcDH-B 는 단백질 서열에서의 차이에도 불구하고, 대략 동일한 기질 특이성을 갖는다. 추가적인 정보 및 해당하는 DNA 및 아미노산 서열을 또한 예를 들어 EP-B 0290 768 에서 찾을 수 있다.
재조합으로 형성되고, 그의 생물학적 기능이 미지이거나 부적절하게 알려져 있는 외래 단백질을 검출하기 위한 상기 기재된 시스템들은 통상적으로 복잡하고 시간-소비적이다. 이는 발현 조건의 개선 및 최적화가 종종 충분히 빠르거나 또는 간단하게 이루어질 수 없음을 의미한다.
따라서 융합 단백질의 검출을 더욱 빠르게 할 수 있고, 유사한 시스템에 대하여 종래 기술에 기술된 단점을 갖지 않는 융합 단백질 파트너를 개발하는 것은 대단한 진척이다.
이제 GlcDH 의 생물학적 활성을 갖는 서열 또는 GlcDH 를 함유하는 융합 단백질이 당업계에서 사용하던 것보다 임의의 목적 "외래 또는 표적 단백질" 을 더욱 빠르고 간단하고, 따라서 효율적으로 검출하는데 매우 적절하다는 것을 발견해냈다. 상기 성질은 GlcDH 가 그의 효소 활성을 다른 효소가 불활성화되는 조건 하에서 (예를 들어 SDS-PAGE) 유지한다는 놀라운 발견을 토대로 한 것이다.
그의 구조로 인해 NAD+조효소 등과 유사하며 마찬가지로 모든 데히드로게나제에 결합하는, Cibachron Blue 3 G 와 같은 고정화 염료 또는 아미노헥실-AMP 와 같은 다른 NAD-유사체 화합물 상에서 데히드로게나제를 정제하는 가능성이 공지되어 있다.
따라서, 융합 단백질의 일부로서, 글루코스 데히드로게나제는 예를 들어 겔 상에서 고정되고 시판되는 염료에 대한 그의 친화력으로 인하여 한 단계로 융합 단백질의 정제를 수월하게 한다. 또한 효소 반응을, 바람직하게는 요오도페닐니트로페닐-페닐테트라졸륨 염 (INT) 또는 니트로 블루 테트라졸륨 염 (NBT) 과 함께 감응성 비색 반응에 커플링하여 (정해진 조건 하에서) 융합 단백질의 구성성분으로서 GlcDH 를 검출하는 것도 가능하여, 외래 단백질의 간접 검출을 더욱 간단하게 한다. 마커 효소로서의 GlcDH 를 염색시키는 방법은 또한 예를 들어 Coomassie 염료를 사용한 단백질의 통상적인 염색 또는 동일한 겔에서의 은 염색을 방해하지 않는다는 이점을 갖는다.
본 발명의 한 구현예에서, 융합 단백질은 GlcDH 및 외래 단백질 외에, 또한 표지 펩티드에 결합한 단백질의 부가적인 특성화에 사용될 수 있는 표지 펩티드로 구성된다. 예를 들어 폴리히스티딘 표지를 통하여 특성화되고, 이는 특정 항체에 의하여 항원으로서 인식된다. 이어서, 생성된 항체-항원 착체를, 예를 들어 그 자체로 공지된 방법으로 퍼옥시다제 (POD)-라벨된 항체를 사용하여 검출한다. 적절한 기질의 첨가 후 (예를 들어 ECL 시스템, Western Exposure Chemiluminescent Detection System, Amersham), 결합된 퍼옥시다제는 상기 목적에 적절한 막을 사용하여 검출될 수 있는 화학발광 생성물을 생성한다. 그러나, 면역 검출 또한 예를 들어 myc 표지와 같은 특정 항체 표지를 통하여 그 자체로 공지된 기술에 의하여 수행될 수 있다. 단독으로 또는 myc 표지와 조합되어, 폴리히스티딘 표지는 추가적으로 융합 단백질이 금속 킬레이트 컬럼에 결합되어 정제될 수 있다는 이점을 갖는다.
그러나, GlcDH 융합 단백질은 또한 예를 들어 아가로스와 같은 크로마토그래피 겔 상에서 고정된 특정 항-GlcDH 항체 상에서 직접적으로 친화 크로마토그래피에 의해 단리되고 정제될 수 있다.
본 발명의 또 다른 이점은 GlcDH 가 공지된 발현계 (상기 참조) 에 의하여 바람직하게는 대장균에서 고수율로 가용성 형태로 발현될 수 있다는 것이다. 이에 따라, 바실루스 메가테리움 M1286 으로부터의 재조합 글루코스 데히드로게나제가 대장균에서 높은 효소 활성으로 성공적으로 발현되어 왔다 [Heilmann 1988]. 대장균에서의 다른 진핵 유전자의 발현은 종종 균 숙주 내 폴리펩티드 사슬의 불안정성에 의하여 제한된다. 부정확한 접힘은 응집 ("봉입체"), 감소되거나 또는 사라진 생물학적 활성 및 단백질가수분해를 일으킨다. GlcDH 유전자 또는 GlcDH 의 생물학적 활성을 갖는 단편이 목적 외래 단백질의 유전자에 결찰되어 있는 해당하는 융합 유전자는 이제 본 발명에 따라 융합 파트너가 없는 GlcDH 유전자와 비교하여 실질적으로 변화되지 않은 발현율 및 수율을 갖는 융합 단백질로 전환될 수 있다. 이는 또한 그 자신에서의 외래 단백질의 발현이 그 자체로 가능하지 않거나 또는 단지 감소된 수율로 또는 단지 부정확한 접힘 상태로 또는 단지 부가적인 기술을 사용하여 가능한 경우 발생할 수 있다. 따라서, 예를 들어 엔도프로테아제를 사용하여 목적 단백질 또는 마커 단백질 GlcDH 를 후속 제거하여 목적 외래 단백질을 수득하는 것이 가능하다.
대장균에서 GlcDH 와 함께 융합 단백질로서 성공적으로 발현될 수 있는 표적단백질의 본 발명에 따른 예는 트리데진 (tridegin) 이다. 트리데진은 혈액 응고 인자 ⅩⅢa 에 대한 매우 효과적인 펩티드 억제제이고, 거머리 해멘테리아 길리아니이 (Haementeria ghilianii) (66AA, 7.6 kD; [Finney et al., 1997]) 로부터 유래한다.
그러나, 사용되는 외래 단백질의 특성 및 성질과 관련하여 본 발명에 따라 언급될 제한은 없다.
본 발명은 대장균에서의 본 발명에 따른 융합 단백질의 발현에만 한정적인 것은 아니다. 반대로, 그러한 단백질은 또한 유리하게는, 포유류, 효모 또는 곤충 세포에서 우수한 발현율로, 그 자체로 공지되어 있는 방법 및 적절한 안정한 벡터 구축물 (예를 들어 인간의 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터) 을 사용하여 합성될 수 있다.
상기 설명으로부터, 하기되고 청구항에서 지시된 바와 같이, 본 발명을 요약하여 특성화시키는 것이 가능하다.
이에 따라 본 발명은 적어도 제 1 및 제 2 아미노산 서열로 구성된 재조합 융합 단백질에 관한 것으로서, 제 1 서열은 글루코스 데히드로게나제의 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명은 특히 상기 제 2 서열이 임의의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 이거나 또는 그의 일부를 나타내는, 해당하는 재조합 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 추가적으로 인식 서열, 특히 표지 서열을 함유할 수 있다. 이에 따라 본 발명은 또한 검출에 적절한 하나 이상의 다른 표지서열 또는 인식 서열을 추가로 가질 수 있는 해당하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 광범위한 가능한 용도를 갖는다. 상기 관계에서, 글루코스 데히드로게나제와 그의 성질은 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명은 상기 융합 단백질 중 하나에서 임의의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 에 대한 검출자 단백질로서 글루코스 데히드로게나제의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 해당하는 융합 단백질의 구성성분으로서의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 의 발현을 위한 검출계에서의 글루코스 데히드로게나제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 GlcDH 의 용도에 관한 것이고, 여기서 하나의 파트너는 이전 및 이하에서 정의되는 바와 같은 재조합 단백질/폴리펩티드 X 에 해당한다. 최종적으로, GlcDH 는 본 발명에 따라 융합 단백질의 구성성분은 아니지만 상기 융합 단백질 내의 단백질/폴리펩티드 X 의 제 2 서열에 결합할 수 있는 임의의 제 3 단백질/폴리펩티드에 대한 검출자 단백질로서 작용할 수 있다. GlcDH 는 또한 ELISA 시스템, 웨스턴 블롯 및 관련된 시스템에서 파트너에 대한 마커 단백질로서 사용될 수 있다.
본 발명은 재조합 기술을 사용하므로, 해당하는 벡터, 숙주 세포 및 발현계도 물론 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 벡터 및 숙주 세포뿐만 아니라 재조합 제조 과정 중 재조합 단백질/폴리펩티드 X 의 발현을 최적화시키는데 있어서 해당하는 발현 벡터의 용도, 및 그러한 제조 과정 중 재조합 단백질/폴리펩티드 X 의 발현을 최적화시키는데 있어서 해당하는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 겔 전기영동, 특히 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의한 임의의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 의 빠른 검출 방법에 관한 것이고, 여기서 해당하는 융합 단백질은 제조되어 겔 전기영동에 의하여 분획화되고, 검출될 재조합 단백질/폴리펩티드는 겔 안에서 글루코스 데히드로게나제의 효소 활성을 통하여 가시화된다.
상기 관계에서 글루코스 데히드로게나제의 효소 활성을 검출하기 위해 본 발명에 따라 사용되는 것은 테트라졸륨 염, 특히 요오도페닐니트로페닐-페닐테트라졸륨 염 (INT) 또는 니트로 블루 테트라졸륨 염 (NBT) 에 기초한 비색 반응으로서, 상기 비색 반응이 일어나기 적절한 전 또는 후 당업계에 따른 통상적인 단백질 염색이 가능하다.
이하에서 도면을 간략하게 설명한다.
도. 1:벡터 pAW2 의 구축도. 벡터는 GlcDH 의 서열을 함유한다. 완전한 서열을 서열 번호 1 에 나타내었다.
도. 2:벡터 pAW3 의 구축도.
도. 3:벡터 pAW4 의 구축도. 벡터는 GlcDH 및 트리데진의 서열을 함유한다. 완전한 서열을 서열 번호 3 에 나타내었다.
도. 4:SDS-PAA 겔 상에서의 GlcDH 의 염색. 염색법은 실시예에서 상세하게 설명하였다. 1 : Rainbow 마커; 2 : GlcDH 0.1 ㎍; 3 : GlcDH 0.05 ㎍; 4 : GlcDH 0.001 ㎍; 5 : HC11 세포의 용해질; 6 : 예비염색된 SDS 마커.
도. 5:발현된 GlcDH 효소의 검출 (15 % SDS-PAA 겔, INT 염색); 1 : Rainbow 마커; 2 : 천연 GlcDH 0.2 ㎍; 3 : 세포 추출물 10 ㎕/클론 2 현탁액 1 ml; 4 : 세포 추출물 10 ㎕/클론 1 현탁액 1 ml; 5 : 예비염색된 SDS 마커; 세포 추출물 부피:100 ㎕.
도. 6:pAW2 발현으로부터의 연속 희석물 (15 % SDS-PAA 겔, INT 염색); 1 : Rainbow 마커; 2 : 세포 추출물 10 ㎕/현탁액 100 ㎕; 3 : 세포 추출물 10 ㎕/1:5 희석액; 4 : 세포 추출물 10 ㎕/1:10 희석액; 5 : 세포 추출물 10 ㎕/1:20 희석액; 6 : GlcDH 0.5 ㎍; 7 : 광범위한 SDS 마커; 8 : 예비염색한 SDS 마커; 세포 추출물 부피: 100 ㎕.
도. 7:발현된 트리데진/GlcDH 융합 단백질의 검출 (10 % SDS-PAA 겔, INT/CBB); 1 : 광범위한 SDS 마커; 2 : GlcDH 1 ㎍; 3 : GlcDH 0.5 ㎍; 4 : GlcDH 0.1 ㎍; 5 : 세포 추출물 500 ㎕; 6 : 세포 추출물 200 ㎕; 7 : 세포 추출물 100 ㎕; 8 :세포 추출물 500 ㎕ (pAW2 발현); 세포 추출물 부피: 100 ㎕.
도. 8:트리데진/His 및 트리데진/His/GlcDH 융합 단백질의 면역검출 (10 % SDS-PAA 겔, ECL 검출) 및 트리데진/His/GlcDH 와의 비교 (10 % SDS-PAA 겔, INT-CBB 염색); 1 : 광범위한 마커; 2 : 세포 추출물 1 ml (pAW2 발현); 3 : 세포 추출물 100 ㎕ (pST106 발현); 4 : 세포 추출물 200 ㎕ (pST106 발현); 5 : 세포 추출물 300 ㎕ (pAW4 발현); 6 : 칼린-His 양성 대조구 2.5 ㎍; 7 : 광범위한 마커; 8 : 100 ㎕ (pAW4 발현); 세포 추출물 부피: 100 ㎕.
도. 9:GlcDH 의 검출의 감응도를 설명하는 SDS 겔. GlcDH 1, 5, 10, 25 및 50 ng 및 분자량 마커 (왼쪽 컬럼) 를 플롯팅하였다.
이전 및 이하에서 사용되는 약어를 하기에 설명하였다.
A 아데닌
Axx nm 에서의 흡광도
Ab 항체
Amp 앰피실린
AP 알칼리성 포스파타제
APS 암모늄 퍼옥소디술페이트
AA 아미노산
bla β-락타마제 유전자
BIS N,N'-메틸렌비스아크릴아미드
bp 염기쌍
BSA 소 혈청 알부민
C 시토신
cDMA 복제 (상보) DNA
CBB Coomassie Brilliant Blue
CIP 송아지 장의 포스파타제
dNTP 2'-데옥시리보뉴클레오시드 5'-트리포스페이트
ddNTP 2',3'-데옥시리보뉴클레오시드 5'-트리포스페이트
DMF 디메틸포름아미드
DMSO 디메틸술폭시드
DNA 데옥시리보핵산
dsDNA 이중-가닥 DNA
DTT 디티오트레이톨
ECL ExposureTMChemiluminescence
EDTA 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산, 이나트륨염
ELISA 효소결합면역흡착분석법
EtBr 에티듐 브로마이드
EtOH 에탄올
f.c. 최종 농도
FACS 형광-활성 세포 분류
G 구아닌
GFP 녹색 형광 단백질
GlcDH 글루코스 데히드로게나제 (단백질)
gdh 글루코스 데히드로게나제 (유전자)
GST 글루타티온 S-트랜스퍼라제
His 히스티딘 잔기
HRP 허스래디시 (horseradish) 퍼옥시다제
IB 봉입체
IgG 면역글로불린 G
INT 요오도니트로테트라졸륨 바이올렛
kb 킬로 염기쌍
kD 킬로달톤
mA 밀리암페어
m-RNA 전령 RNA
MBP 말토스-결합 단백질
MCS 다중 클로닝 부위
Mr상대적 분자량
NAD(P) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트), 유리산
Odxx nm 에서의 광학 밀도
ompA 외부 막 단백질 A
ori 복제의 근원
PAA 폴리아크릴아미드
PAGE 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
PCT 폴리머라제 사슬 반응
POD 퍼옥시다제
PVDF 폴리비닐리덴 디플루오라이드
RNA 리보핵산
RNAse 리보뉴클레아제
rpm 분 당 회전수
rRNA 리보솜 RNA
RT 실온
SDS 나트륨 도데실 술페이트
ssDNA 단일 가닥 DNA
Strep 스트렙타비딘
T 티민
Tm용융점 (DNA 이중복합체)
t-RNA 운반 RNA
Taq 테르모필루스 아쿠아티쿠스 (Thermophilus aquaticus)
TCA 트리클로로아세트산
TEMED N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민
Tet 테트라사이클린
Tris 트리스(히드록시메틸)아미노메탄
U 효소 활성 단위
U 우라실
UV 자외선 복사
ON 하룻밤동안
V 볼트
VIS 가시성
w/v 부피당 중량
참고문헌:
달리 구체화되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 방법 및 기술은 충분히 잘 알려지고 관계 문헌에 기재되어 있는 방법 및 공정에 해당한다. 특히, [Sambrook et al. and Harlow & Lane] 에 의한 상기 언급된 공고 및 특허 출원의 기재 내용 및 EP-B-0290 768 은 본 발명에 포함되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 숙주 세포 및 플라스미드는 대체로 전형적인 것들이고, 본 발명에 필수적인 구성성분을 여전히 갖는 한 변형되거나 또는 다른 구조를 갖는 벡터 구축물, 또는 다른 숙주 세포로 원칙적으로 대체될 수 있다. 상기 벡터 구축물의 제조, 및 적절한 숙주 세포의 트랜스펙션 및 목적 단백질의 발현 및 정제는, 실질적으로 잘 공지되어 있고 또한 넓은 범위 안에서 본 발명에 따라 변형될 수 있는 표준 기술에 해당한다.
본 발명이 하기에서 더욱 설명된다. 더욱 상세한 것은 실시예에서 설명한다.
바실루스 메가테리움 GlcDH 구조 유전자를, 주형으로서 작용하는 플라스미드 pJH115 (EP 0290 768) 를 사용한 PCR 로 변형시켰다. 한쪽 말단에 PstI 인식 서열을 갖고, 다른 쪽에 Eco47III 인식 서열을 갖는 증폭된 단편 (0.8 kb) 을 상기효소들로 절단하고, 세포질 (pRG45) 또는 주변세포질 (pST84) 대장균 발현 벡터내로 클로닝한다 (도. 1, 2). 생성된 플라스미드, pAW2 및 pAW3, 은 이제 약 30 kD (261 AA) 의 단백질을 코딩하고 강한 Tet 프로모터의 하류에 위치한 GlcDH 유전자를 갖게 된다. 세포질 pAW2 발현 벡터는 약 4 kb 의 크기를 갖는다. 주변세포질 pAW3 분비 벡터는 다소 더 크고, pAW2 와는 단지 다중 클로닝 부위 (MCS) 의 상류에 있고 재조합 단백질을 주변세포질에 분비할 수 있게 하는 omp A 신호 서열만 다르다. 부가적으로 양 벡터 모두 하기 His 표지를 사용한 프레임 내 (in-frame) 클로닝을 가능하게 하는 12 개의 다른 제한 절단 부위를 갖는 MCS 를 갖는다.폴리히스티딘 (6His)표지는 재조합 단백질이 금속 친화성 컬럼 상에서 정제될 수 있게 한다. 최종적으로 벡터 pAW4 는 트리데진 유전자 및 GlcDH 유전자를 함유하고, 이는 MCS, 및 GlcDH 유전자의 하류에 결찰되어 있는 폴리히스티딘 (6His) 표지에 의해 함께 연결된다. 개별적인 구축물들을 도 1, 2 및 3 에 나타내었다. 그러나, 선택된 플라스미드 구축물은 단지 예시를 위한 것으로, 본 발명을 제한하지는 않는다. 이들은 언급된 DNA 서열을 함유하는 다른 적절한 구축물로 대체될 수 있다. 벡터 및 클론의 제조 및 단백질의 발현은 실시예에서 더욱 구체화된다.
활성 염색의 감도는 환원된 SDS 겔에서 천연 GlcDH 에 대하여 수행된다. 상기 목적을 위해, 일련의 농도로 천연 GlcDH 를 제조하고 (c = 1 mg/ml; A = 200 U/ml), 음성 대조구를 제조하였다. INT 를 사용한 활성 염색 및 SDS-PAGE 의 결과는 도 3 에 나타낸 SDS 겔과 같다. 상기 사용된 테스트로 50 ng 미만의 농도의 GlcDH 를 검출하는 것이 가능하다. GlcDH 를 함유하지 않는 음성 대조구는 예상한 바와 같이 밴드를 나타내지 않는다.
천연 GlcDH 의 정확한 분자량을 마커 단백질 및 눈금측정 플롯을 사용하여 측정할 수 있다. 이를 위해, 마커 단백질의 상대적인 이동 거리를 측정하고, 그의 각각의 로그 분자량에 대해 플롯팅하였다.
수행된 발현 과정은 도표에 나타낸 바와 같다 (표 1):
GlcDH 발현 벡터를 W3110 세포 내로 형질 전환시킴37 ℃ 의 LB(Amp) 배지에서의 예비배양 (12 시간)유도와 함께 37 ℃ 의 주 배지에서의 세포 성장 (5 시간)생물량을 수득하기 위한 원심분리
1×SDS 로딩 완충액 중 세포의 현탁95 ℃ 에서 5 분간 세포 파괴세포 추출물이 SDS-PAGE 에서 직접 사용될 수 있다 (1 시간)SDS 겔에서 GlcDH 의 활성 염색 (30 분)겔 밴드 분석
플라스미드 pAW2/클론 9 (pAW2/K9) 를 콤피텐트 대장균 발현 주 W3110 내로 형질전환시키고, 생성된 형질전환 플레이트로부터의 두 개의 클론을 사용하여 5 ml 예비 배지를 접종하였다. 주 배지 접종 2 시간 후 무수테트라사이클린으로 유도시켰다. 전체적인 발현이 5 시간 지속되었고, 클론 1 은 1.65 의 OD 에서, 클론 2 는 1.63 의 OD 에서 정지시켰다. SDS-PAGE 및 GlcDH 활성 염색 후, 강한 GlcDH 밴드 (약 35 kD) 가 세포 현탁액 1 ml 로부터의 각 클론으로부터 검출가능하였다.
SDS-PAGE 가 환원 및 비-환원 조건 하에서 수행될 때, 생성된 GlcDH 밴드 간에 차이가 없음이 분명해졌다. 상기 목적을 위하여, 각 경우에서 세포 현탁액 500 내지 100 ㎕ 를 INT 로의 GlcDH 활성 염색에 의하여 SDS 겔에서 조사하였다.
Coomassie 염색과 비교하여 GlcDH 활성 염색의 감도를 설명하기 위하여, 세포 현탁액 100 ㎕ 의 샘플, 및 세포 현탁액의 1/5, 1/10 및 1/20 희석액을 제조하였다. 희석액의 최종 부피를 100 ㎕ 로 하였다. 생성된 SDS 겔을, GlcDH 활성 염색 후 Coomassie 염색하여 단백질 밴드를 더욱 가시화하였다. 이로부터 생성된 SDS 겔을 도 4 에 나타내었다. GlcDH 활성 염색을 사용한 1/20 희석액에서는 선명한 밴드가 여전히 존재하는 반면, Coomassie-염색된 밴드는 이제 거의 검출되지 않는다.
His 표지가 커플링된 해멘테리아 길리아니이 트리데진 구조 유전자를 주형으로서 작용하는 플라스미드 pST106 을 사용하여 PCR 에 의해 변형시켰다. ClaI 인식 서열 및 PstI 인식 서열로 플랭크된 증폭된 단편 (0.25 kb) 를 상기 효소로 절단하고, 세포질 대장균 GlcDH 융합 벡터 pAW2 내로 클로닝하였다. 이제 생성된 플라스미드 pAW4 는 약 44 kD 의 단백질을 코딩하고, 강한 Tet 프로모터의 하류에 위치하는 트리데진-His-GlcDH 융합 단백질 유전자를 갖게 되었다. 세포질 pAW4 플라스미드를 함유하는 대장균 주 W 3110 으로부터의 세포 추출물을 SDS-PAGE 및 GlcDH 활성 염색으로 분석하였다. 이로써 35, 37, 40 및 43 kD 에서 적-보라색으로 염색된 몇 개의 밴드를 검출하는 것이 가능하다. 분자량이 44 kD 의 이론치보다 다소 적음에도 불구하고, 43 kD 밴드는 목적하는 트리데진-His-GlcDH 융합 단백질을 함유하였다. 35 kD 의 가장 작은 염색된 밴드가 대략 GlcDH 의 크기에 해당하므로, 잔류하는 검출가능한 밴드는 대장균 내에서 융합 단백질의 단백질 가수분해에 의하여 생성된 것으로 추측된다. 크기 비교를 토대로 His-GlcDH 분해 생성물로서 형성된 35 kD 밴드를 확인하는 것이 가능하다.
발현 동력학을 수행하여, 형성된 융합 단백질의 단백질 가수분해가 무수테트라사이클린을 사용한 Tet 프로모터 유도 2 시간 후 시작되었다는 것, 즉, 상기 시간 후 추가적인 밴드가 활성 염색에 의한 SDS 겔에서 검출될 수 있다는 것이 나타났다. 형성된 융합 단백질은 대장균 프로테아제에 대해 안정하지 않았고, 이는 그의 비교적 빠른 단백질 분해에 의해 나타난다. 구축된 주변세포질 GlcDH 융합 벡터 pAW3 을 사용하여, 세포 내 융합 단백질의 단백질 가수분해를 피하는 것이 가능한데, 이는 상기의 경우, 발현된 융합 단백질이 대장균 세포들간의 주변세포질 공간으로 분비되기 때문이다. 대장균 프로테아제는 주로 세포질에서 발견된다.
GlcDH 융합 단백질 검출의 감도 및 특이성은 재조합 외래 단백질이 빠르고 간단하게 스크리닝되는 것을 가능하게 한다. GlcDH 검출계의 감도는 천연 GlcDH 를 사용하여 측정된다. 천연 GlcDH 활성을 측정한 결과 SDS-PAA 겔에서 약 30-35 kD 에서 적-보라색으로 염색된 밴드를 생성하였다.
pAW2 로부터의 재조합 GlcDH 의 대장균 주 W 3110 에서의 세포질 발현은 동일한 분자량을 나타내었다. 천연 GlcDH 및 재조합 GlcDH 간의 감도 비교는 밴드의 강도를 비교함으로써 가능하다.
개발된 테스트 시스템 (실시예를 참조) 은 또한 SDS 겔의 이중 염색 수행을가능하게 한다. 제 1 염색에서는, GlcDH 밴드가 특이적으로 검출된다. 배경 염색 후 통상적인 단백질 염색, 예를 들어 잔류 단백질의 Coomassie 염색이 뒤따를 수 있다. GlcDH 는 놀랍게도 SDS 의 존재 하의 환원 조건에서 본 발명에 따라 그의 완전한 활성을 유지하고 이는 SDS 겔 내에서 빠른 검출을 가능하게 한다.
또한 본 발명에 따라 GlcDH 의 기질로서 니트로 블루 테트라졸륨 염 (NBT) 을 사용하여 GlcDH 활성 검출의 감도를 증가시키는 것이 가능하다. 그러나, INT 를 사용한 GlcDH 검출에 대한 반응 속도는 Triton X-100 (1 % 최종 용액) 을 사용하거나 또는 NaCl (1 M 최종 용액) 을 첨가함으로써 증가될 수 있다.
pST106 및 pAW4 플라스미드를 발현시켜서 재조합 융합 단백질 트리데진/His 및 트리데진/His/GlcDH 를 수득하였다 (도 1, 2). 적절한 발현 혼합물에서의 세포 파괴 후, SDS-PAGE 로 샘플을 분획화하고 막으로 이동시켰다. 웨스턴 블롯에서 항-RGS.His 항체를 사용하여 그 안에 존재하는 His 표지를 통해 트리데진-His-GlcDH 융합 단백질의 면역학적 검출이 가능하였다. 사용되는 대조구는 말단 His 표지를 갖는 정제된 재조합 칼린 (거머리 단백질), 및 His 표지를 갖지 않는 발현된 재조합 GlcDH 의 세포 추출물이었다. 항-RGS.His 항체는 재조합 트리데진/His/GlcDH 융합 단백질에 대하여 약 37 kD 에서 하나의 밴드, 및 약 43 kD 에서 또 다른 밴드를 검출할 수 있었다 (도 6). SDS 겔에서의 활성 염색 후 수득한 밴드를 사용하여 수득한 밴드간의 크기 비교는, 43 kD 밴드가 트리데진-His-GlcDH 융합 단백질을 나타내고, 37 kD 밴드가 완전한 융합 단백질의 His-GlcDH분해 생성물을 나타냄을 가리킨다. 칼린/His 표지 단백질은 약 26 kD 에서 밴드를 생성하였다. 다소 작은 재조합 트리데진/His 표지 단백질은 약 23 kD 에서의 밴드, 및 또한 다른 발현 단백질에 대한 His 항체의 결합을 가리키는 또 다른 밴드를 생성하였다. 이에 따라 항-RGS.His 항체를 사용한 면역학적 검출은, 43 kD 및 37 kD 에서 검출된 단백질이 His 표지를 함유한다는 것을 증명한다. 또한, 후자의 단백질의 크기는 대략 His 표지가 커플링된 GlcDH 단백질의 이론적 크기 (36.5 kD) 에 해당한다.
재조합 트리데진의 발현 검출과 더불어, pAW4 로부터의 특정 경우에서 트리데진-GlcDH 융합 단백질의 구성성분으로서 트리데진의 생물학적 활성을 조사하였다. 상기 테스트는 천연 거머리 선 균질화물 및 정제된 트리데진에 의한 인자 ⅩⅢa 의 억제를 토대로 한 것이다 [Finney et al., 1997]. 변형된 테스트를 실시예에 기재하였다. 대조구로서, pST106 로부터의 해당하는 융합 단백질 및 pAW2 로부터의 GlcDH 단배질을 발현시켰다. 대장균 내에서 GlcDH-트리데진 융합 단백질 또는 트리데진-His 표지로서 발현된 재조합 트리데진을 사용한 효소 활성의 비교는 사소한 차이를 나타내었다. 또한, 두 가지 다른 발현으로부터의 재조합 트리데진 단백질은 천연 거머리 선 균질화물에 상당하는 생물학적 활성을 나타내었다. 이로부터, GlcDH 과의 융합은 공발현된 외래 유전자의 생물학적 활성에 대해 방해 효과를 전혀 갖지 않는다는 것으로 결론지을 수 있다.
트리데진 그 자체 (즉 융합 단백질이 아님) 는 대장균 발현 후 활성이 없고,봉입체로서 형성된다. 대장균 내 GlcDH 의 발현으로 높은 특이적 활성 및 안정성을 갖는 가용성 형태의 효소가 생성된다. 발현 실험에서, 대장균 내 발현시 높은 용해도 용량을 갖는 단백질은, 이들이 외래 단배질에 융합될 경우 외래 단백질 발현의 용해도 용량을 증가시킨다는 것이 증명되었다 [LaVallie, 1995]. 또한, 상기 경우에서 트리데진과 GlcDH 의 융합은 트리데진의 용해도를 증가시켰는데, 이는 트리데진이 인자 ⅩⅢa 를 억제한다는 생물학적 검출에 의하여 대장균 발현 후 트리데진-His-GlcDH 융합 단백질로서 트리데진의 활성을 검출하는 것이 가능했기 때문이다. GlcDH 융합 단백질은 대장균 내에서 고수율로 발현된다.
클로닝된 유전자의 공지된 크기 및 생물학적 기능의 단백질을 함유하는 융합 단백질로서의 발현 가능성은 유전자 생성물의 검출을 현저히 간단하게 한다. 이러한 이유로, 도입부에서 언급하였듯이, 수많은 융합 발현계가 각종 검출 전략으로 개발되어왔다.
대장균에서 본 발명에 따른 대장균에서 GlcDH 융합계와 공지된 시스템 간의 비교를 표 2 에 나타내었다. 몇 개의 시스템에서는, N-말단 융합 단백질이 C-말단 표적 또는 외래 단백질로부터 절단 제거될 수 있다 [Collins-Racie et al., 1995].
표지/융합 파트너 MW (kD) 검출 이점
GlcDH 30 SDS 겔에서의 기능 테스트 빠르고 저비용, SDS 겔에서 직접 검출
His 표지 [Pogge v. Strandmann et al., 1995] 1-7 웨스턴 블롯, ELISA 작다
Strep-표지 [Uhlen et al., 1990] 13 웨스턴 블롯 작다
myc 에피토프 [Pitzurra et al., 1990]; [Gazitt et al., 1992] 1-2 웨스턴 블롯, ELISA 작다
IgG 부분, Fc [Moks et al, 1987]; [Ettinger et al., 1996] 2-5 웨스턴 블롯, ELISA 작다,세포의 선택 (FACS)
GFP [Chalfie et al., 1994]; [Inouye et al., 1994] 27 형광, 웨스턴 블롯 배양 접시에서도 선택, 동시에 여러 개를 검출가능함 (FACS)
인테인 [Chong et al., 1997] 48 웨스턴 블롯 융합 파트너가 제거될 수 있음
GST [Smith Johnson, 1988]; [Gosh et al., 1995] 26 웨스턴 블롯,용액 내 비색적 검출 융합 파트너가 제거될 수 있음
MBP [Chu di Guan et al., 1988]; [Kellermann et al., 1982] 40 웨스턴 블롯 융합 파트너가 제거될 수 있음
방법 예비 조건 소요 시간 생산량 감도 정보
GlcDH 검출 GlcDH기능적으로 활성 약 3 시간 적절히 높음 50 ng 단백질량 +단백질 크기
ELISA 2 개의 항체 약 1 일 높음 pg-ng 단백질량
웨스턴 블롯 1-2 개의 항체 단백질 상의 표지 1 내지 2 일 낮음 ng 단백질 크기 + 단백질량
본 발명에 따른 GlcDH 검출계의 매우 큰 이점은, 이것이 예를 들어 웨스턴 블롯 검출을 위하여와 같이, 예를 들어 막, 블롯 기구, 필름과 현상 기계, 미량역가 플레이트, 역가 판독기 등과 같은 다른 물질 또는 임의의 항체를 필요로 하지 않는다는 사실이다. 이는 GlcDH 시스템을 사용한 재조합 융합 단백질의 검출이 더욱 더 바람직하고 빠르다는 것을 의미한다. GlcDH 검출을 사용하여 발현된 융합 단백질의 양뿐 아니라 융합 단백질의 해당하는 크기에 대한 정보를 막으로 옮기지 않고 SDS-PAA 겔에서 직접 구축하는 것이 가능하다. GlcDH 활성이 융합 단백질에서 검출가능한 경우, 융합 파트너는 또한 대체로 기능적으로 활성이어야 한다. GlcDH 는 융합 파트너의 접힘을 방해하지 않는다. 본 발명에 따른 GlcDH 융합 단백질 시스템의 이점을 대장균에서 수득한 융합 단백질을 단리하고 검출하는 효율적인 방법을 문헌으로부터 선택하여 이하에서 비교하여 나타내었다 (하기 표 3).
본 발명에 따른 GlcDH 융합 단백질 시스템은 또한 특히 대장균에서 봉입체로서 형성되어 따라서 후속하는 단백질 정제를 어렵고 비용이 들도록 하는 단백질의 용해도를 증가시키기에 특히 적절하다. 통상적으로, 봉입체로서 형성된 단백질을 정교한 방법에 의하여 그의 천연 상태로 전환시키는 것이 필요하다. 이는 본 발명에 따른 융합 단백질의 사용시에는 불필요하다.
요약하여, GlcDH 검출계로서 사용되는 본 발명에 따른 융합 단백질의 이점은 하기와 같다.
ㆍSDS 및 환원 (변성) 조건 하에서의 안정성
ㆍ감응적인 GlcDH-특이성 효소의 비색 테스트
ㆍ50 ng 이상의 감도
ㆍ융합 파트너의 분자량 검출과 더불어 SDS 겔에서의 직접적인 빠른 검출
ㆍ추가적인 단백질 염색의 가능성
ㆍ저비용 재료, 기구 상에서의 지출이 거의 없음
ㆍ생물학적 활성을 유지하고 있는 표적 단백질의 발현을 포함하는, 대장균 내에서의 우수한 발현
ㆍ외래/표적 단백질의 봉입체 또는 부정확한 접힘에 의하여 생성되는 다른응집물을 피할 가능성
ㆍ예를 들어 염료 (Cibacron Blue 3 G) 상에서 친화성 크로마토그래피를 통한 융합 단백질의 정제 가능성
단백질 A/GFP 융합 벡터의 구축/형질변환37 ℃ 의 LB 아가 플레이트 상에서의 세포 성장 (1 일)25 ℃ 에서의 세포 성장 (3 일)완충액 (pH 8.0) 중 세포의 현탁원심분리에 의한 세포 파괴 및 세포 파편의 제거단백질 분리를 위한 SDS-PAGE (1 시간)니트로셀룰로스 막으로의 단백질 이동 (1 시간)블로킹 반응 (1 시간)항체 반응 (1 시간)단백질 A-GFP 작업 완충액에서의 인큐베이션 (20 분)UV 복사 (365 nm)/블롯의 분석 GlcDH/트리데진 융합 벡터의 구축/형질변환37 ℃ 의 LB(Amp) 배지에서의 예비 배양 (12 시간)유도와 함께 37 ℃ 의 주 배지에서의 세포 성장 (5 시간)SDS 로딩 완충액 중 세포의 현탁95 ℃ 에서 5 분간 SDS 세포 파괴세포 추출물을 사용한 SDS-PAGE (1 시간)SDS 겔에서의 GlcDH 활성 염색 (30 분) 분자량 측정과 함께 SDS 겔의 분석
하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으면서 더욱 설명한다.
실시예 1:
프라이머 서열 길이 용도
GlcDH#1 5'-GCGCGAATTCATGTATACAGATTTAAAAAGAT-3' 32 개의 염기 PCR 프라이머 (gdh 의 5' 말단에 부착하고 EcoRI 절단 부위를 도입함)
GlcDH#2 5'-GCGCTTCGAACTATTAGCCTCTTCCTGCTTG-3' 31 개의 염기 PCR 프라이머 (gdh 의 3' 말단에 부착하고 SfuI 절단 부위를 도입함)
GlcDH#3 5'-GCGCCTGCAGATGTATACAGATTTAAAAGAT-3' 31 개의 염기 PCR 프라이머 (gdh 의 5' 말단에 부착하고 PstI 절단 부위를 도입함)
GlcDH#4 5'-GCGCAGCGCTCTATTAGCCTCTTCCTGCTTG-3' 31 개의 염기 PCR 프라이머 (gdh 의 3' 말단에 부착하고 Eco47III 절단 부위를 도입함)
트리데진 #1 5'-GCGCATCGATATGAAACTATTGCCTTGCAAA-3' 31 개의 염기 PCR 프라이머 (트리데진 의 5' 말단에 부착하고 ClaI 절단 부위를 도입함)
트리데진 #2 5'-GCGCCTGCAGGTGATGGTGATGGTGATGCGA-3' 31 개의 염기 PCR 프라이머 (트리데진 의 3' 말단에 부착하고 PstI 절단 부위를 도입함)
pASK 75 UPN 5'-CCATCGAATGGCCAGATGATTA-3' 22 개의 염기 서열화 프라이머 (pRG 45 및 pST84 의 tet p/o 에 부착하는, 5' 말단에 라벨된 IRD 41)
PASK 75 RPN 5'-TAGCGGTAAACGGCAGACAAA-3' 21 개의 염기 서열화 프라이머 (pRG 45 및 pST84 의 lpp 에 부착하는, 라벨된 5' IRD 41)
T7 Seq.s 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' 20 개의 염기 서열화 프라이머 (pcDNA3.1/ myc-His A, B, C 의 T7 프라이밍 부위에 부착하는, 라벨된 5'IRD 41)
Rev Seq.as 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3' 18 개의 염기 서열화 프라이머 (pcDNA3.1/ myc-His A, B, C 의 BGH 역 프라이밍 부위에 부착하는, 라벨된 5' IRD 41)
상기 뉴클레오티드가 본 발명에 따라 사용되었다 (표 4).
하기 표 5 는 사용된 미생물을 요약한다. 모든 미생물은 대장균 K12 로부터 유래하고, 위험 군 1 에 속한다.
주 속/종 유전자형 문헌
Top10F' One ShotTMCells 대장균 F'(lacIqTn10(TetR))mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1 nupG Invitrogen으로부터의 Top10F' OneShotTMKit
Epicurian ColiXL1-Blue MRF' Cells 대장균 Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac(F'proAB lacIqZΔM15Tn10(TetI)) Stratagene's Competent Cells
TOP10 OneShotTMCells 대장균 F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG Invitrogen으로부터의 TOPO TA CloningKit (Version C)
W 3110 대장균 F-λ-WT 대장균 B. Bachmann, Bacteriol. Rev. 36(72) 525-557
공여 유기체: 21.10.96 의 M 7037 발현주 (대장균 N 4830/pJH 115) (Merck 에 의해 공급됨).
pJH 115: pUC 유도체, 5.9 kb, OLPL프로모터, gdh, (종결제) 에 대한, galk (갈락토시다제 유전자), bla (β-락타마제 유전자), ori (복제의 근원), 2 HindIII, 2 BamHI 및 각각 하나의 EcoRI 및 ClaI 절단 부위.
실시예 2:
플라스미드의 콤피텐트 대장균 세포 내로의 형질전환:
SOC 매질:Bacto 트립톤 20 g, Bacto 효모 추출물 5 g, NaCl 0.5 g, KCl 0.2 g 및 1 ℓddH2O, 오토클레이브. 사용 전, 하기를 첨가한다: 0.5 ml 의 1 M MgCl2/1 M MgSO4(멸균-여과됨), 1 M 글루코스 1 ml (멸균-여과됨)
LB (Amp) 아가 플레이트:LB 매질 (앰피실린이 없음) 1 ℓ 및 아가-아가 15g 을 함께 혼합, 오토클레이브, 약 60 ℃ 로 냉각시키고 앰피실린 용액 (100 mg/ml) 1 ml. 과정:
혼합물1-5 ㎕ 의 결찰 생성물 또는 플라스미드 DNA (5-50 ng/㎕)
50 ㎕ 의 콤피텐트 세포
450 ㎕ 의 SOC 매질
ㆍ얼음 상의 콤피텐트 세포를 10 분간 녹이고
ㆍDNA 를 콤피텐트 세포에 첨가하고
ㆍ얼음 상에서 30 분간 인큐베이션시키고
ㆍ열 쇼크: 42 ℃ 에서 30 초 (수조)
ㆍ얼음 상에서 2 분간 세포를 놓아두고
ㆍ예비가온된 SOC 매질 450 ㎕ 를 첨가하고
ㆍ37 ℃ 및 220 rpm 에서 1 시간 동안 인큐베이션시키고
ㆍ혼합물을 100 ㎕ 씩 예비가온된 Lb(Amp) 플레이트에 스트리킹시키고
ㆍ37 ℃ 에서 하룻밤동안 플레이트를 교반시킨다.
실시예 3:
TOPO-TA-Cloning및 결찰
TOPO-TA-Cloning은 Taq 폴리머라제로 증폭시킨 PCR 생성물을 위한 5 분 클로닝 방법이다.
PCR 생성물의 직접 클로닝을 위하여 Invitrogen 에 의하여 공급된 TOPO-TA-Cloning키트 (C 버젼) 가 개발되었다. 시스템은 PCR 에서의 모든 이중 분자의 3' 말단에서의 단일 데옥시아데노신 (3'-A 오버행) 에 부착하는 열안정성 폴리머라제의 성질을 사용한다. 상기 3'-A 오버행을 사용하여 3'-T 오버행을 갖는 벡터에 직접적으로 PCR 생성물을 연결시키는 것이 가능하다. 키트는 상기 목적을 위하여 특별히 개발된 pCR2.1-TOPO 벡터를 제공한다. 벡터는 3.9 kb 의 크기이고 청색/백색 선택용 lacZ 유전자, 및 앰피실린- 및 카나마이신-내성 유전자를 갖는다. 클로닝 부위는 단일 EcoRI 절단 부위에 의하여 양쪽에서 플랭킹된다.
결찰 혼합물:
2 ㎕ 의 신선한 PCR 생성물 (10 ng/㎕)
1 ㎕ 의 pCR-TOPO 벡터
2 ㎕ 의 멸균수
5 ㎕ 의 총 부피
ㆍ혼합물을 조심스럽게 혼합하고 RT 에서 5 분간 인큐베이션하고
ㆍ간단히 원심분리하고 튜브를 얼음 상에 위치시키고
ㆍ결찰 생성물을 One ShotTM형질변환에 즉시 사용한다.
PCR 생성물이 없고 단지 벡터 및 물로만 구성된 5 ㎕ 혼합물을 대조구로서 사용한다.
One-ShotTM형질변환을 하기 방법에 따라 수행한다:
0.5 M β-메르캅토에탄올 2 ㎕ 를 얼음 상에서 녹인 OneShotTMTOP10 콤피텐트 세포 50 ㎕ 에 첨가하고;
콤피텐트 세포 바이알 당 TOPO-TA-Cloning결찰물 2 ㎕ 를 첨가하고;
얼음 상에서 30 분간 인큐베이션시키고
열 쇼크: 42 ℃ 에서 30 초간;
얼음 상에서 2 분간 냉각시키고;
SOC 매질 250 ㎕ 를 첨가하고 (RT);
바이알을 37 ℃ 및 220 rpm 에서 30 분간 인큐베이션시키고;
각 형질변환 혼합물을 37 ℃ 로 예비가온된 LB(Amp) 플레이트 100 ㎕ 에 스트리킹시키고;
37 ℃ 에서 하룻밤동안 플레이트를 인큐베이션시키고;
분석적 제한 절단에서 적절한 효소를 사용하여 미니프렙 (3.2.2.1) 후 생성된 형질변환체를 분석한다.
실시예 4:
대장균 세포에서의 유전자 발현
과정을 하기와 같이 약술할 수 있다:
ㆍ플라스미드를 성공적으로 서열화된 클론으로부터 단리하여 발현 주 W3110 내 형질변환시키고
ㆍ형질변환 플레이트로부터 클론을 취하여 5 ml ON 예비배양액을 제조하는데사용하고
ㆍ예비배양액을 LB(Amp) 플레이트 상에 스트리킹시키고, 상기 플레이트로부터의 클론을 사용하여 후에 수행될 발현액에 접종하고
ㆍ이어서 예비배양액 1 ml 를 사용하여 주 배양액 50 ml 에 접종하고 (1:50 의 비), OD600를 측정하고 (비접종 LB(Amp) 배지를 사용하여 참조 측정)
ㆍ주 배양액 (200 ml Erlenmeyer 플라스크) 을 37 ℃ 및 220 rpm 에서 인큐베이션하고
ㆍOD600를 매 30 분 마다 측정하고
ㆍOD 가 0.5 에 도달하면, 세포 현탁액 50 ml 당 무수테트라사이클린 (1 mg/ml) 10 ㎕ 를 사용하여 세포를 유도시키고 (f.c. 세포 현탁액 1 ml 당 무수테트라시클린 0.2 ㎍), OD 를 다시 측정하고 (0 값)
ㆍOD 를 매시간 측정하고 유도 시간 3 시간 후 성장을 멈추게 하고
ㆍ완전히 혼합된 균 현탁액 1 ml 를 튜브에 넣어서 6000 rpm 으로 5 분간 원심분리시키고 (필요할 경우 더 적은 양의 현탁액도 사용될 수 있음)
ㆍ상층액을 흡인 제거하고, 펠렛을 1 ×red. 샘플 완충액 100 ㎕ 에서 균질화시키고;
ㆍ균질화물을 5 분간 비등시키고, 얼음 상에서 냉각시키고 간단히 원심분리시키고;
ㆍ샘플 10 ㎕ 를 SDS 겔의 각 웰에 로딩하여 전기영동 (3.2.16) 을 수행하고;
ㆍ겔을 Coomassie blue 염색 및/또는 실시예 5 의 방법에 의하여 염색시킨다.
세포 파괴:
50 ml 의 하룻밤 배양액으로부터의 세포를 3500 rpm 및 4 ℃ 에서 15 분간 원심분리시킨다. 생성된 상층액을 부어 버리고, 세포를 100 mM Tris/HCl (pH 8.5) 40 ml 에 재현탁시킨다. 현탁된 세포를 18,000 psi 하의 1 인치 실린더에서 French 압력을 사용하여 파괴시킨다. 이는 세포가 좁은 구멍 (< 1 mm) 으로 힘을 받게 하고 압력이 갑자기 떨어지게 한다. 세포는 구멍으로 통과하는 압력차에 의해 터진다. 이 동안 세포 단백질의 구조는 유지된다. 목적 단백질의 단백질가수분해를 피하기 위하여, 세포 파괴 직후 프로테아제 억제제가 첨가되어야 한다. 이를 위하여, EDTA 가 없는 CompleteTMProtease-Inhibitor Cocktail (Roche) 1 정제가 각 40 ml 의 단백질 용액에 첨가되고 RT 에서 용해된다. 이어서 6000 rpm 에서 20 분간의 원심분리로 세포 파편 및 대부분의 DNA 및 RNA 가 제거된다. 이어서, 샘플을 -20 ℃ 에서 동결시킨다.
실시예 5:
SDS 겔에서의 GlcDH 밴드의 활성 염색:
글루코스 데히드로게나제 밴드가 요오도페닐니트로페닐-페닐테트라졸륨 클로라이드 (INT) 를 사용하여 SDS 겔에서 특이적으로 검출될 수 있다. 이는 단지SDS 처리가 GlcDH 의 활성을 파괴하지 않기 때문에만 가능하다.
GlcDH 는 비색 반응에 의해 검출된다. 이는 반응에서 형성된 수소가 테트라졸륨 염 INT 로 옮겨져서 보라색 포르마잔이 생성되도록 한다. 페난진 메토술페이트는 전자 전달제로서 작용한다.
예비인큐베이션 완충액(0.1 M Tris/HCl, pH 7.5)
Tris/HCl 15.76 g
NaOH 를 사용하여 pH 7.5 가 되게 함, 1 ℓ가 되도록 ddH2O.
반응 완충액(0.08 % INT, 0.005 % 페난진 메토술페이트, 0.065 % NAD, 0.1 M Tris/HCl 중 5 % Glc (pH 7.5),
0.8 g 의 요오도페닐니트로페닐테트라졸륨 클로라이드 (INT)
0.05 g 의 메틸페나지늄 메토술페이트 (페난진 메토술페이트)
0.65 g 의 NAD
50 g 의 D-(+)-글루코스 모노히드레이트 (Glc)
1 ℓ 가 되도록 0.1 M Tris/HCl (pH 7.5)
GlcDH 에 대한 저장 완충액:
26.5 g 의 EDTA
15 g 의 Na2HPO4
1 ℓ가 되도록, pH 7.0 (NaOH)
샘플 제조:
ㆍ샘플 및 마커를 샘플 완충액에 희석시킨다.
ㆍ수조에서 3 분간 비등시키고, 얼음 상에서 냉각시키고, 원심분리한다.
표준 방법에 의한SDS 겔 전기영동.
활성 염색:
ㆍ5 분간 부드럽게 진탕시키면서 37 ℃ 에서 예비인큐베이션 완충액에서 분획화된 단백질 밴드를 갖는 SDS 겔을 인큐베이션시키고
ㆍ완충액을 부어 버리고 충분량의 반응 완충액으로 덮고 (RT), 37 ℃ 에서 부드럽게 진탕시키면서 인큐베이션시키고 (1 ×이상 완충액을 바꾸어줌)
ㆍ약 30 분간 인큐베이션 후, GlcDH 를 갖는 밴드를 적-보라색으로 염색시키고
ㆍ예비인큐베이션 완충액 내의 겔을 세척하고, 사진을 찍고 건조시키고
ㆍ필요하다면, 이어서 Coomassie 염색을 수행한 후 겔을 건조시킨다.
실시예 6:
ECL 시스템을 사용한 면역학적 검출 (Western ExposureTMChemiluminescent Detection System):
His 표지에 커플링된 단백질을 두 개의 항체를 사용하여 간접적으로 검출한다. 사용된 첫번째 Ab 는 6 ×His-표지된 단백질을 검출하기 위한항-RGS.His 항체 (QIAGEN) 이다. 이어서, 생성된 항원-항체 착체를 퍼옥시다제 (POD)-라벨된 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG (H+L) 항체를 사용하여 검출한다. ECL 기질 혼합물 첨가 후, 결합한 퍼옥시다제가 고성능 화학발광 필름을 사용하여 검출될 수 있는 화학발광 생성물을 생성한다.
Ponceau S 용액(0.5 % Ponceau S, 7.5 % TCA)
1.25 g 의 Ponceau S
18.75 g 의 TCA
이중-증류수를 사용하여 250 ml 로 만든다.
10 ×PBS 완충액 pH 7.4
14.98 g 의 인산수소이나트륨 ×2 H2O
2.13 g 의 인산이수소칼륨
87.66 g 의 염화나트륨
1 ℓ 로 만들고, pH 가 7.4 인지를 체크한다.
1 ×농도 완충액을 사용한다.
Biometra 블롯 완충액
25 mM Tris
150 mM 글리신
10 % 메탄올
블로킹 시약
5 % 탈지유 분말
1 ×PBS 완충액에 용해시킨다.
세척 완충액
0.1 % NonidetTMP-40 (Sigma)
1 ×PBS 완충액에 용해시킨다.
하기와 같이 검출을 수행한다:
ㆍPVDF 막 (Immobilon P, Millipore) 및 6 ×블롯팅 여과지를 겔의 크기로 자르고
ㆍ메탄올에서, 이어서 Biometra 블롯 완충액에서 15 초간 PVDF 막을 평형화시키고, 동일한 과정을 SDS 겔 및 여과지에 적용시키고
ㆍ블롯 구축: 3 층의 여과지가 블롯실 (blot chamber) 에 있도록 하여 3 층의 여과지, 막, 겔을 모으고 (층간의 공기 버블이 없어져야 한다. 그렇지 않으면 이 지점에서 단백질 이동이 일어나지 않음)
ㆍ블롯팅:1 시간 동안 1-1.5 mA/cm2의 겔
ㆍ단백질 이동을 체크:
ㆍ블롯팅 후, PVDF 막으로의 단백질 이동을 Ponceau S 로의 염색에 의해 체크하고: 2 분 이상 부드럽게 진탕하면서 접시에서 0.5 % Ponceau S 용액과 함께 막을 인큐베이션시킨다. 염료 (재사용가능함) 를 부어 버리고, 흐르는 탈이온수 하에서 막을 탈색시킨다. 상기 경우에서, 단지 강한 단백질 밴드만 염색된다. 분자량 마커를 볼펜으로 표시한다.
ㆍ블롯의 현상:
막이 하기 단계 동안 절대 건조되어서는 안되므로 모든 인큐베이션은 Celloshaker 상의 접시 및 50 ml Falcon 튜브 내의 롤러 캐비넷에서 수행되어야 한다.
(1) 포화
PBS/5 % 탈지유 분말로 37 ℃ 의 롤러 캐비넷에서 30 분간
(2) 제 1 항체: PBS/5 % 탈지유 분말 (약 7 ml/막 의 부피) 에서 1:2000 으로 희석시켜 1 시간 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션시킴
(3) 세척: PBS/0.1 % NP-40 세척 용액으로 3 ×5 분간 막을 충분히 세척함
(4) POD-라벨된 Ab: PBS/5 % 탈지유 분말에서 1:1000 으로 희석시켜 (새로운 튜브) 1 시간 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션시킴
(5) 세척: PBS/0.1 % NP-40 세척 용액으로 3 ×5 분간 막을 충분히 세척함
(6) 현상: 막을 충분히 회전시키고 (건조시키지 않음) 플라스틱 판에 놓고, 1 분간 ECL 전개 용액 (Amersham) 으로 완전히 덮고, 막을 회전시키고 이중 시트에 놓고, 상부에 폴라로이드 Hyperfilm 을 놓아서 현상시킴.
실시예 7:
인자 ⅩⅢa 의 억제에 의한 트리데진 검출 ([Method of Finney et al., 1997], 본 발명에 따라 변형됨):
인자 ⅩⅢa 의 천연 기질, 즉 아미노산의 아미노-함유 측쇄 대신에, 합성 아민을 또한 적절한 단백질 기질에 혼입시킨다. 상기 합성 아민은 검출이 가능한 분자내 마커를 갖는다. 아민 혼입 테스트는 고체상 테스트이다. 역가 플레이트를 카세인으로 코팅한다. 기질 바이오틴아미도펜틸아민을 인자 ⅩⅢa 에 의하여 상기 카세인에 혼입시킨다. 카세인-바이오틴아미도펜틸아민 생성물을 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 융합 단백질 (strep/AP) 에 의하여 검출할 수 있다. 상기 샌드위치는 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 포스파타제 활성을 검출함으로써 일어날 수 있다. 이는 하기 반응을 수반한다:
4-니트로페놀레이트의 형성은 405 nm 에서의 광도 측정에 의하여 측정되고, AP 활성에 직접 비례한다. 바이오틴과 스트렙타비딘의 고-친화 상호작용은 포스파타제 활성 또한 인자 ⅩⅢa 의 활성에 비례한다는 것을 의미하고, 즉, 흡수가 더욱 강할수록 (황색 변색) 더욱 높은 인자 ⅩⅢa 의 활성을 의미한다 (Janowski, 1997). EDTA 는 인자 ⅩⅢa 의 매우 비특이적인 억제제이고, 그의 공인자 Ca2+는 킬레이트 착체 내의 EDTA 에 의하여 결합된다. 이러한 이유로, 사용되는 단백질 샘플은 어떠한 EDTA 도 함유해서는 안되고, EDTA 가 없는 프로테아제 억제제 칵테일로 예비처리된다 (Boehringer).
세척 완충액:100 mM Tris/HCl, pH 8.5
용액 A:세척 완충액에 0.5 % 탈지유 분말을 용해시킴
용액 B:0.5 mM 바이오틴아미도펜틸아민, 10 mM DTT, 5 mM CaCl2를 세척 완충액에 용해시킴
용액 C:200 mM EDTA 를 세척 완충액에 용해시킴
용액 D:1.7 ㎍/ml 의 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제를 용액 A 에 용해시킴
용액 E:0.01 % (w/v) Triton X-100 를 세척 완충액에 용해시킴
용액 F:1 mg/ml p-니트로페닐 포스페이트, 5 mM MgCl2를 세척 완충액에 용해시킴
코팅:
ㆍ샘플의 수에 따라 200 ㎕ 의 용액 A 를 역가 플레이트의 각 웰에 분배함. 37 ℃ 에서 30 분간 진탕시킴 (Thermoshaker).
세척:
ㆍ웰 당 300 ㎕ 의 세척 완충액으로 2 회씩 세척함
혼입 반응:
ㆍ웰 당 10-150 ㎕ 의 샘플을 분배하고 웰 당 5 ㎕ 의 인자 ⅩⅢa 및 200 ㎕ 의 용액 B 를 첨가함
37 ℃ 에서 30 분간 진탕시킴.
정지:
ㆍ웰 당 300 ㎕ 의 용액 C (인자 ⅩⅢa 억제) 로 2 회 세척함
ㆍ웰 당 300 ㎕ 의 세척 완충액으로 2 회 세척함
스트렙/Ap 결합 (특이적):
ㆍ웰 당 250 ㎕ 의 용액 D 를 첨가함
ㆍRT 에서 60 분간 인큐베이션시킴
세척:
ㆍ웰 당 300 ㎕ 의 용액 E 로 세척함 (공유 결합하지 않은 단백질을 분리시킴)
ㆍ웰 당 300 ㎕ 의 세척 완충액으로 4 회 세척함
기질:
ㆍ웰 당 50 ㎕ 의 용액 + 웰 당 200 ㎕ 의 세척 완충액을 첨가함
ㆍRT 에서 30 분간 인큐베이션시킴
405 nm 에서 미량역가 판독기에서 컴퓨터-원조 평가로 측정함
실시예 8: GlcDH 검출의 감도
정제된 GlcDH 의 정량을 SDS 겔 상에 놓는다. 실행 후, SDS 겔을 37 ℃ 의 예비인큐베이션 완충액에서 5 분간 인큐베이션시킨다. 완충액을 버리고, 겔을 37 ℃ 의 반응 완충액에서 진탕시킨다. 그 다음 단계에서 겔을 Coomassie blue 로 염색시킨다.
1 ℓ 의 반응 완충액:
0.1 M Tris/HCl, pH 7.5
0.5 M NaCl
0.2 % Triton X-100
0.8 g 의 요오도페닐니트로페닐테트라졸륨 클로라이드
0.05 g 의 메틸페나지늄 메토술페이트
0.65 g 의 NAD
50 g 의 D-(+)-글루코스 모노히드레이트
예비인큐베이션 완충액:
0.1 M Tris/HCl, pH 7.5
0.5 M NaCl

Claims (17)

  1. 제 1 서열이 글루코스 데히드로게나제의 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 적어도 제 1 및 제 2 아미노산 서열로 이루어진 재조합 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 2 서열이 임의의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 이거나, 또는 그의 일부를 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서, 검출에 적절한 하나 이상의 다른 인식 서열 ("표지 서열") 을 추가로 가질 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  5. 제 4 항에 따른 DNA 를 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제 5 항에 따른 발현 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질/폴리펩티드 발현용 숙주 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 중 임의의 재조합단백질/폴리펩티드 X 에 대한 검출자 단백질로서 글루코스 데히드로게나제의 용도.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 구성성분으로서의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 의 발현에 대한 검출계에서 글루코스 데히드로게나제의 용도.
  9. 하나의 파트너가 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 에 해당하는, 단백질-단백질 상호작용 검출을 위한 글루코스 데히드로게나제의 용도.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 구성성분이 아니고 상기 융합 단백질 중 단백질/폴리펩티드 X 의 제 2 서열에 결합할 수 있는 임의의 제 3 단백질/폴리펩티드에 대한 검출자 단백질로서 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 내의 글루코스 데히드로게나제의 용도.
  11. 재조합 제조 방법에서 재조합 단백질/폴리펩티드 X 의 발현을 최적화시키는데 있어서 제 5 항에 따른 발현 벡터의 용도.
  12. 재조합 제조 방법에서 재조합 단백질/폴리펩티드 X 의 발현을 최적화시키는데 있어서 제 6 항에 따른 숙주 세포의 용도.
  13. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질이 제조되고 겔 전기영동에 의해 분획화되고, 겔에서 검출될 재조합 단백질/폴리펩티드가 글루코스 데히드로게나제의 효소 활성을 통하여 가시화되는 것을 특징으로 하는, 겔 전기영동에 의하여 임의의 재조합 단백질/폴리펩티드 X 를 빠르게 검출하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 이 겔 전기영동 방법으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 테트라졸륨 염에 기재한 비색 반응이 글루코스 데히드로게나제의 효소 활성을 검출하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 요오도페닐니트로페닐-페닐테트라졸륨 염 (INT) 또는 니트로 블루 테트라졸륨 염 (NBT) 이 테트라졸륨 염으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 데히드로게나제의 특이적 염색에 이어 통상적인 단백질 염색이 뒤따르는 것을 특징으로 하는 방법.
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