SK11742001A3 - Glukózové dehydrogenázové fúzne proteíny a ich použitie v expresných systémoch - Google Patents

Glukózové dehydrogenázové fúzne proteíny a ich použitie v expresných systémoch Download PDF

Info

Publication number
SK11742001A3
SK11742001A3 SK1174-2001A SK11742001A SK11742001A3 SK 11742001 A3 SK11742001 A3 SK 11742001A3 SK 11742001 A SK11742001 A SK 11742001A SK 11742001 A3 SK11742001 A3 SK 11742001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
protein
glcdh
recombinant
polypeptide
fusion protein
Prior art date
Application number
SK1174-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Winfried Linxweiler
Christa Burger
Oliver Poschke
Uwe Hofmann
Andrea Wolf
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of SK11742001A3 publication Critical patent/SK11742001A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka rekombinantných fúznych proteínov, známych ako zložka sekvencie proteínov majúca biologickú aktivitu glukózovej dehydrogenázy (GlcDH) a ich použitia na jednoduchú a účinnú detekciu akýchkoľvek proteínov/polypeptidov, ktoré s výhodou slúžia ako fúzne partneri a na rýchlu optimalizáciu expresných systémov, ktoré sú schojné expresovať uvedené proteíny/polypeptidy.
Doterajší stav techniky
Z tohto hľadiska zaujíma GlcDH alebo jeho sekvencie majúce biologické pôsobenie GlcDH úlohu markéru alebo detektoru proteínu. Zvláštnou vlastnosťou tohto enzýmu je mimoriadna stabilita voči denaturačným činidlom, ako je SDS. GlcDH ako markér alebo detektor proteínu vykazuje nezmenšenú enzymatickú i aktivitu i po redukčných a denaturačných podmienkach gélov SDS-PAGE. Fúzne proteíny obsahujúce GlcDH môžu preto byť zisťované pomocou citlivej enzymatickej reakcie založenej na tomto prekvapivom správaní. Je teda tiež s GlcDH ako markérom možná rýchla, účinná a lacná detekcia požadovaného expresovaného proteínu.
Je dfalej možné v rade prípadov, aby boli fúzne proteíny (GlcDH-proteín/polypeptid) expresované vo vysokom výťažku a stabilite najmä v E. coli, potom bez GlcDH. Zodpovedajúce fúzne proteíny je teda možné použiť na získanie a na prípravu proteínov/polypeptidov.
Expresia in vivo rekombinantných proteínov má stále vzrastajúcu úlohu v biotechnológii. Schopnosť získať, izolovať a detekovať produkty klonovaných génových produktov z proka2 ryotických a eukaryotických expresných systémov, ako sú napríklad bakteriálne, kvasinková, hmyzie alebo cicavčie bunky, sa tiež často používa pri štúdiách štruktúry a funkcie, vzájomného pôsobenia proteín-proteín a proteín-DNA a produkcie protilátok a mutagenézy. Pomocou techniky rekombinácie DNA je možné modifikovať prírodní proteíny najmä na zlepšenie alebo na zmenu ich funkcie. Rekombinantné proteíny sa syntetizujú v expresných systémoch, ktoré sa neustále ďalej vyvíjajú, a ktoré môžu byť optimalizované v mnohých rozdielnych bodoch v systéme.
Celkový proces rekombinantnej syntézy proteínov je možné rozdeliť do dvoch sekcií. V prvom kroku ide o molekulárne biologickú izoláciu génu a expresiu cieľového proteínu (target proteín”) a v druhom kroku ide o detekciu a izoláciu od rekombinantných buniek alebo ich rastového média. Na molekulárnej úrovni sa gén proteínu klonuje na expresný vektor poskytnutý na tento účel a potom sa začlení do hostiteľskej bunky (prokaryotickej alebo eukaryotickej bunky) a ňou sa expresuje. Bakteriálne bunky v tejto súvislosti preukazujú, že sú jednoduchými a cenovo výhodnými systémami poskytujúcimi vysoké výťažky. Najčastejšie používanou hostiteľskou bunkou je gramnegatívna baktéria E. coli.
Zámerom expresie cudzích génov v E. coli je získať čo najväčšie množstvo bioaktívnych rekombinantných proteínov, čo sa označuje ako nadmerná expresia (”overexpression). Je známe, že eukaryotické cudzie proteíny môžu strácať svoju biologickú aktivitu počas agregácie, ako inkluzné telesá, nesprávnym vinutím alebo proteolytickou degradáciou. Jednou z možností, ako sa vyhnúť týmto často sa vyskytujúcim obťažím je pre vypudzované expresované proteíny z bunky ako sekrétované proteíny alebo pre používané takzvané fúzne proteíny, aby boli nerozpustné rekombinantné proteíny obsiahnuté v rozpustnej forme v bunke.
f r ŕ '
- 3 Na skúmanie funkcie proteínov a ich interakčných partnerov, ktoré sú dôležité pre ich funkciu, sa proteíny zvyčajne expresujú v eukaryotických bunkách. Môže v nich dôjsť k posttranskripčnej modifikácii, ktorá je dôležitá pre funkciu, a na ich správne začlenenie. Okrem toho sú obsiahnuté ostatné proteíny významné pre správne vinutie (folding) a spracovanie.
Eukaryotické expresné systémy sú tiež vhodné pre expresiu pomerne velkých proteínov a proteínov, vyžadujúcich posttranskripčné modifikácie, ako je napríklad vytváranie mostíkov S-S, glykozylácie a fosforylácie na správne vinutie. Pretože sú tieto systémy zvyčajne zložité a nákladné, a rýchlosť expresie je nižšia ako pri E. coli, je osobitne významné mať detekčný systém, ktorý je rýchly, spolahlivý, citlivý a za rozumnú cenu.
Na detekciu cudzích proteínov existujú početné systémy génovej fúzie, ktoré boli vytvorené rekombináciou a ktorých biologická funkcia je neznáma. V nich je detekcia expresovaného fúzneho proteínu zaisťovaná cestou fúzie proteínového podielu, ktorého funkcia je známa.
Citlivý detekčný systém je nutný na to, aby bola určená správna expresia, expresované množstvo, molekulová hmotnosť a funkčná aktivita vytváraného fúzneho proteínu. Počet proteínov neznámej funkcie rýchlo narastá a stále vzrastajúcou mierou sa stáva dôležité vyvinúť na to rýchly a cenovo výhodný detekčný systém. Pri väčšine systémov génovej fúzie sa používajú imunologické metódy, ako je napríklad enzýmom riadený imunosorbentový test (ELISA) alebo Western blot, v ktorých dochádza k detekcii fúznych proteínov, vytvorených rekombináciou pri pomoci špecifických protilátok.
Avšak zodpovedajúce fúzne proteíny nie len že majú opísanú výhodu, že k detekcii a nepriamej analýze cudzích proteínov je možné lahko dôjsť, ale tiež naopak umožňujú v mnohých prípadoch expresiu požadovaného proteínu vo vyššom výťažku, ako akého by bolo možné dosiahnuť bez fúzneho partnera. Každý fúzny partner má prednosť, že je nezvyčajne neschopný transferu do iného partnera v zvláštnom expresnom systéme. Tak môže byť napríklad znížená citlivosť niektorých proteínov voči proteolytickej [sic] degradácii, keď je [sic] vo forme fúzneho proteínu. Fúzne proteíny majú často výhodnejšiu rozpustnosť a sekrečné vlastnosti ako jednotlivé zložky.
Pre uskutočňovanie fúzií génov na expresiu rekombinantných proteínov v heterogénnych hostiteloch je teda vela dôvodov. Sú to: zvýšenie rozpustnosti cudzích proteínov, zvýšenie stálosti rozpustných cudzích proteínov, umiesťovanie cudzích proteínov do špecifických sekcií bunky, rýchla izolácia cudzích proteínov zjednodušeným izolačným spôsobom, schopnosť špecifického odštepovania fúznych proteínov, schopnosť rýchlej detekcie cudzích proteínov zo zvyšných bunkových extraktov.
V súčasnosti je veía funkčných skúšok na testovanie expresie rekombinantných proteínov pomocou génových fúznych systémov. Patria k nim jednoduché testy, ktoré zvyčajne umožňujú priamu detekciu z nečistených bunkových extraktov. Testovacie systémy sa však líšia významne časom, výťažkom a citlivosťou.
Pre uvedené účely je možné rozlišovať dva typy fúznych proteínov. Jednak fúzne proteíny, ktoré sa skladajú z požadovaného proteínu a zvyčajne krátkeho oligopeptidu. Tento oligopeptid (tag) funguje ako markér alebo poznávacia sekvencia pre požadovaný proteín. Tak môže prídavné zjednodušovať izoláciu.
Hlavným použitím tágu je predovšetkým testovanie expresie a izolácia proteínu. Jedným jeho príkladom je takzvaný His tag, ktorý sa skladá z peptidovej sekvencie, ktorá má šesť po sebe nasledujúcich histidínových zvyškov a je priamo napojená na rekombinantný proteín. Pri pomoci pripojeného His zvyšku je možné lahko izolovať fúzny proteín na stĺpci s afinitou ku kovu (Smith a kol. Journal of Biological Chemistry 263, č. 15, str. 7211 až 7215, 1988). Tento His tag je detekovaný pomocou vysoko špecifickej monoklonálnej protilátky His-1 (Pogge V. Strandmann a kol. Protein engineering 8, č. 7, str. 733 až 735, 1995). Iným markérom, používaným pri fúznych proteínoch, je GFP, zelene fluoreskujúci proteín (GFP), ktorý je odvodený od medúzy Aequorea victoria a používa sa ako bioluminiscentný proteín v rôznych biotechnologických aplikáciách (Kendall a Badminton, 1998; Chalfie a kol., Science 263, str. 802 až 805, 1994; Inouye a kol., FEBS Letters 341, str. 277 až 280, 1994). Detekcia je lahká vďaka jeho autofluorescencii v živých bunkách, géloch a dokonca v živých živočíchoch.
Ďalšími príkladmi tagov, ktoré nebudú ďalej vysvetľované, je Strep-tag systém (Uhlén a kol., Gene 23, str. 369, 1983) alebo myc epitope tag (Pitzzura a kol., Journal of Immunological Methods 135, str. 71 až 75, 1990).
Hlavným použitím fúznych proteínov, skladajúcich sa z rekombinantných proteínov a funkčne aktívnych proteínov, je popri hore opísanej detekcii, zjednodušená izolácia expresovaných fúznych proteínov. Z nich sú známe rôzne systémy, o ktorých bude ďalej krátka zmienka.
V systéme GST fúzne vektory umožňujú expresovať úplné gény alebo fragmenty génov vo fúzii s glutatiónovou S-transferázou. Fúzny proteín GST môže byť lahko izolovaný z bunkových lyzátov afinitnou chromatografiou na glutatiónovej sefaróze (Smith & Johnson, Gene 67, str. 31 až 40, 1988) Biochemická a imunologická detekcia je k dispozícii. Proteín viažuci maltózu v systéme MBP je periplazmický proteín z E. coli, ktorý sa účastní transportu maltózy a maltózových dextrínov bakteriálnou membránou (Kellermann & Ferenci, Methods in Enzymology 90, str. 459 až 463,1982). Bol použitý predovšetkým na • r
- 6 expresiu a na izoláciu alkalickej fosfatázy na stĺpci zositenej amylózy. Inteínový systém je špecificky vhodný na rýchlu izoláciu cielového proteínu. Inteínový gén má sekvenciu pre inteínovú doménu viažucu chitín (CBD), ktorým prostredníctvom môžu byť fúzne proteíny priamo viazané z bunkového extraktu na chitínový stĺpec a tak izolované (Chong S.a kol., Gene 192, str. 271 až 281, 1997).
Glukózová dehydrogenáza (GlcDH) je klúčový enzým počas počiatočnej fázy sporulácie v Bacillus megaterium (Jany a kol., FEBS Letters 165, č.l, str.6 až 10, 1984). Špecificky katalyzuje oxidáciu β-D-glukózy na D-glukonolaktón, s NAD+ alebo NADP+ pôsobiacich ako koenzým. Popri bakteriálnych spórach sa enzým vyskytuje tiež v pečeni cicavcov. Dva vzájomné nezávislé glukózové dehydrogenázové gény (gdh) existujú v B. megaterium M1286 (Heilmann a kol., Biochimica et Biophysica Acta 1076, str. 298 až 304 1988). GdhA a gdhB sa značne odlišujú v nukleotidovej sekvencií, zatial čo GlcDH-A a GlcDH-Β majú, cez rozdiely v sekvencií proteínov, približne rovnakú substrátovú špecifickosť. Ďalšie informácie a zodpovedajúca DNA a sekvencie aminokyselín sú tiež opísané v patentovej literatúre (napríklad EP-B 0 290768).
Hore opísané systémy na detekciu cudzích proteínov, ktoré boli vytvorené rekombináciou a ktorých biologická funkcia je buď neznáma alebo známa nedostatočne, sú zvyčajne zložité a časovo náročné. To znamená, že zlepšenie a optimalizácia expresných podmienok nemôže byť často vykonaná rýchlo a dostatočne jednoducho.
Je preto pokrokom, že bol vyvinutý partner fúzneho proteínu, ktorý umožňuje rýchlejšiu detekciu fúznych proteínov a nemá nevýhody opísané v stave techniky pre porovnateľné systémy.
Teraz bolo zistené, že fúzne proteíny, ktoré obsahujú GlcDH alebo sekvencie [lacuna] sú mimoriadne vhodné na rýchlejšiu detekciu každého požadovaného cudzieho alebo delového proteínu jednoducho a preto účinnejšie ako pri použití opísaného stavu techniky. Táto vlastnosť je založená na prekvapivom poznatku, že GlcDH si zachováva svoju enzymatickú aktivitu za podmienok, za ktorých sú ostatné enzýmy inaktivované (napríklad sa SDS-PAGE).
Možnosť, čistenia dehydrogenáz v imobilizovaných farbivách, ako je modrosť Cibachrom Blue 3G alebo v iných NAD-analogických zlúčeninách, ako je aminohexyl-AMP, ktoré sú podobné svojou štruktúrou koenzýmu NAD+ a podobne viažu všetky dehydrogenázy j e známa.
Ako časť fúznych proteínov ulahčuje preto glukózová dehydrogenáza, vďaka svojej afinite k farbivám, ktoré sú napríklad imobilizované na géli, a ktoré sú obchodne dostupné, izoláciu fúzneho proteínu v jednom stupni. Ďalej je možné zisťovať GlcDH ako zložku fúzneho proteínu spojením enzymatickej reakcie s reakciou citlivou na farbivo, s výhodou s jodofenylnitrofenylfenyltetrazóliovou solou (INT) alebo nitro modrou tetrazóliovou solou (NBT) (za stanovených podmienok), čo ďalej zjednodušuje nepriamu detekciu cudzieho proteínu. Spôsob vyfarbovania GlcDH ako markéru enzýmu má prídavné prednosť, že neprekáža obvyklému vyfarbovaniu proteínov, používajúceho napríklad Coomassiové farbivá alebo vyfarbovanie striebrom v rovnakom géli.
V jednom rozpracovaní tohto vynálezu sa fúzny proteín skladá, popri GlcDH a cudzieho proteínu, tiež z tag peptidu, ktorý je možné použiť na prídavnú charakterizáciu proteínov viazaných na tag peptid. K charakterizácii dochádza napríklad cez polyhistidínový tag, ktorý je rozoznávaný ako antigén špecifickými protilátkami. Dochádza potom k detekcii výsledného komplexu antigénu a protilátky, napríklad použitím peroxidázou (POD) značenej protilátky známymi spôsobmi. Viazaná peroxidáza vytvára po pridaní vhodného substrátu (napríklad systému ECL, Western Exposure Chemiluminescent Detection Systém od Amershama) chemiluminiscenčný produkt, ktorý môže byt detekovaný použitím filmu vhodného na tento účel. K imunologickej detekcii môže však tiež dochádzať známym spôsobom prostredníctvom špecifického protilátkového tágu, napríklad myc tágu. Polyhistidínový tag samotný alebo v kombinácii s myc tágom má prídavné prednosť, pretože fúzny proteín môže byť izolovaný napojením na metalchelátový stĺpec.
Fúzny proteín GlcDH môže byť tiež čistený a izolovaný afinitnou chromatografiou priamo na špecifickú anti-GlcDH protilátku, ktorá bola imobilizovaná napríklad na chromatografickom géli, akým je agaróza.
Ďalšou prednosťou vynálezu je, že GlcDH môže byť expresovaná v rozpustnej forme vo vysokom výťažku, s výhodou E. coli známymi expresnými systémami (pozri hore). Tak bola s úspechom expresovaná rekombinantná glukózová dehydrogenáza z Bacillus megaterium M1286 s vysokou enzymatickou aktivitou v E. coli (Heilmann a kol., Biochimica et Biophysica Acta 1076, str. 298 až 304 1988). Expresia iných eukaryotických génov v E. coli je často obmedzovaná nestabilitou polypeptidového reťazca v bakteriálnom hostitelovi. Nesprávne vinutie môže viesť k zhlukovaniu (inclusion bodies), k zníženej alebo chýbajúcej biologickej aktivite a k proteolytickej degradácii. Zodpovedajúci fúzny gén, v ktorom bol gén GlcDH alebo fragment majúci biologickú aktivitu GlcDH viazanú na gén pre požadovaný cudzí proteín, môže byť teraz premenený podlá vynálezu na fúzny proteín s virtuálne nezmenšenou rýchlosťou a výťažkom expresie v porovnaní s génom GlcDH bez fúzneho partnera. To môže tiež nastať, keď nie je možná expresia cudzieho proteínu na seba samotnú alebo je možná iba v znížených výťažkoch alebo len v nesprávne vinutom stave alebo iba použitím prídavných techník. Je teda možné získať požadovaný cudzí proteín postupnou elimináciou markérového proteínu GlcDH alebo delového proteínu, napríklad s endoproteázami.
Príkladom delového proteínu podlá vynálezu, ktorý môže byť s úspechom expresovaný ako fúzny proteín spolu s GlcDH v E. coli je tridegin. Tridegin je mimoriadne účinný peptidový inhibítor krvného koagulačného faktoru XlIIa a je odvodený z pijavice Haementeria ghilianii (66 AA, 7,6 kD, Finney a kol., Biochem. J. 324, str. 797 až 805, 1997).
Nie sú však uvádzané žiadne obmedzenia podlá vynálezu v závislosti od povahy a vlastností použitého cudzieho proteínu.
Vynález nie je obmedzený práve na expresiu fúznych proteínov podlá vynálezu v E. coli. Naopak môžu byť také proteíny tiež syntetizované s výhodou pri použití známych spôsobov a vhodných stabilných vektorových konštruktov (napríklad s pomocou ludského cytomegalovírusu (CMV) promotoru) v cicavčích, kvasinkových alebo hmyzích bunkách s dobrými rýchlosťami expresie.
Podlá uvedeného opisu je možné súhrne charakterizovať vynález takto:
Podstata vynálezu
Rekombinantný fúzny proteín, skladajúci sa z aspoň prvej a z druhej sekvencie aminokyselín, spočíva podlá vynálezu v tom, že prvá sekvencia má biologickú aktivitu glukózovej dehydrogenázy.
Vynález sa čiže týka rekombinantného fúzneho proteínu skladajúceho sa z aspoň prvej a z druhej sekvencie aminokyselín, pričom prvá sekvencia má biologickú aktivitu glukózovej dehydrogenázy. Predovšetkým sa vynález týka zodpovedajúceho rekombinantného fúzneho proteínu, v ktorom druhou sekvenciou
Cŕ · · >·r * r »r • »·r f'
-loje akýkoľvek rekombinantný proteín/polypetid X alebo predstavuje ich časti.
Fúzne proteíny podľa vynálezu môžu prídavné obsahovať rozlišovacie sekvencie, najmä tag sekvencie. Vynález sa teda týka ďalej zodpovedajúceho fúzneho proteínu, ktorý môže mať prídavné aspoň jednu inú tag sekvenciu alebo rozlišovaciu sekvenciu vhodnú na detekciu.
Fúzne proteíny podľa vynálezu majú veľmi rozmanité možné použitie. V tejto súvislosti má rozhodujúcu úlohu glukózová dehydrogenáza. Vynález sa teda týka použitia glukózovej dehydrogenázy ako detektoru proteínu pre akýkoľvek rekombinantný proteín/polypetid X v jednom z uvedených fúznych proteínov. Vynález sa ďalej týka použitia glukózovej dehydrogenázy v detekčných systémoch na expresiu rekombinantného proteínu/polypetidu X ako zložky zodpovedajúceho fúzneho proteínu. Ďalej sa vynález týka použitia GlcDH na detekciu interakcií proteínproteín, kde jeden partner korešponduje s rekombinantným proteínom/polypetidom X ako je uvedené hore a ďalej. Konečne môže GlcDH slúžiť podľa vynálezu ako detektor proteínu pre akýkoľvek tretí proteín/polypetid, ktorý nie je zložkou fúzneho proteínu, je ale schopný viazať sa na druhú sekvenciu proteín/ polypetid X v uvedenom fúznom proteíne. GlcDH môže byť ďalej použitý ako markérový proteín pre partnera v systémoch ELISA, Western blot a v podobných systémoch.
Pretože vynález používa rekombinantné techniky, zahŕňa tiež zodpovedajúce vektory a hostiteľské bunky ako také, avšak tiež použitie zodpovedajúcich expresných vektorov optimalizujúcich expresiu rekombinantného proteínu/polypetidu X v rekombinantných prípravných procesoch a použitie zodpovedajúcej hostiteľskej bunky v takých prípravných procesoch.
Vynález sa týka tiež spôsobu rýchlej detekcie akéhokoľvek rekombinantného proteínu/polypetidu X gélovou elektroforézou, r
- 11 predovšetkým gélovou elektroforézou SDS-PAGE, pričom sa pripraví zodpovedajúci fúzny proteín a frakcionuje sa gélovou elektroforézou a rekombinant proteín/polypetid, ktorý má byť detekovaný, sa zviditeľní v géli prostredníctvom enzymatickej aktivity glukózovej dehydrogenázy.
Podľa vynálezu sa v tejto súvislosti používa na detekciu enzymatickej aktivity glukózovej dehydrogenázy farebná reakcia založená na tetrazóliových soliach, najmä na jodofenylnitrofenylfenyltetrazóliovej soli (ONT) alebo nitro modrej tetrazóliovej soli (NBT) a je možné na všeobecné vyfarbenie proteínov podľa stavu techniky sledovať [sic], kde došlo k príslušnej farebnej reakcii pred alebo po nej.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je konštrukčná schéma vektoru pAW2. Vektor obsahuje sekvenciu pre GlcDH. Úplná sekvencia je na sekvenčnom identifikačnom čísle 1. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 2 je konštrukčná schéma vektoru pAW3. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 3 je konštrukčná schéma vektoru pAW4. Vektor obsahuje sekvenciu pre GlcDH a tridegin. Úplná sekvencia je na sekvenčnom identifikačnom čísle 3. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 4 je vyfarbenie GlcDH na géli SDS-PAA. Spôsob vyfarbenia je podrobne opísaný v príkladoch. 1: dúhový markér, 2: 0,1 μg GlcDH, 3j 0,05 μg GlcDH, 4: 0,001 gg GlcDH, 5: lyzát buniek HC11, 6: predbežne vyfarbený markér SDS. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 5 je detekcia expresovaného enzýmu GlcDH (15% gél SDSPAA, INT vyfarbenie), 1: dúhový markér, 2: 0,2 gg natívneho
GlcDH, 2: 10 gg bunkového extraktu/1 ml suspenzia klonu 2, 4.:
pg bunkového extraktu/1 ml suspenzie klonu 1, 5: predbežne vyfarbený markér SDS; objem bunkového extraktu: 100 μΐ. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 6 sú sériové zriedenie z expresie pAN2 (15% gél SDSPAA, INT vyfarbenie): 1: dúhový markér, 2: 10 μΐ bunkového extraktu/100 μΐ suspenzie, 3_: 10 μ-l bunkového extraktu zriedenia 1:5, 4: 10 μΐ bunkového extraktu zriedenia 1:10, 5:10 μΐ bunkového extraktu zriedenia 1:20, 6: 0,5 μg GlcDH, 7: široký rozsah markéru SDS, 8: predbežne vyfarbený markér SDS; objem bunkového extraktu: 100 μΐ. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 7 je detekcia expresovaného fúzneho proteinu tridegin/GlcDH (10% gél SDS-PAA, INT/CBB), 1: široký rozsah markéru SDS, 2: 1 μg GlcDH, 3: 0,5 μg GlcDH, 4: 0,1 μg GlcDH, 5: 500 μΐ bunkového extraktu, 6: 200 μΐ bunkového extraktu, 7: 100 μΐ bunkového extraktu, 8: 500 μΐ bunkového extraktu, (expresia pAW2); objem bunkového extraktu: 100 μΐ. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 8 je imunodetekcia fúzneho proteinu tridegin/His a tridegin/His/GlcDH (z 10% gélu SDS-PAA, detekcia ECL) a porovnanie s gélom tridegin/His/GlcDH (10% gél SDS-PAA, INT-CBB vyfarbenie), 1: široký rozsah markéru, 2: 1 ml bunkového extraktu (expresia pAW2), 2^ 100 μΐ bunkového extraktu (expresia pST106), 4: 200 μΐ bunkového extraktu (expresia pST106), 5: 300 μΐ bunkového extraktu (expresia pAW4), 6: 2,5 μg calin-His pozitívne kontroly, 7: široký rozsah markéru, 8: 100 μΐ [lacuna] (expresia pAW4); objem bunkového extraktu: 100 μΐ. [(náhradný list (pravidlo 26)]
Na obr. 9 je gél SDS vysvetľujúci citlivosť detekcie GlcDH. 1, 5, 10, 25 a 50 ng GlcDH a sú vynesené molekulárne hmotnosti markérov (ľavý stĺpec).
r r
- 13 Zoznam skratiek
A adenín
Αχ Ab absorpcia pri x nm protilátka
Amp AP ampicilín alkalická fosfatáza
APS peroxodisulfát amónny
AA aminokyselina
bla gén β-laktamázy
BIS N, N'-metylénbisakrylamid
bp BSA páry báz albumín hovädzieho séra
C cytozín
cDNA kópia (komplementárna) DNA
CBB brilantná Coomassiová modrosť
CIP teľacia intestinálna fosfatáza
dNTP 2'-deoxyribonukleozidový [sic]-5'trifosfát
ddNTP 2',3'-deoxyribonukleozidový [sic]-5'trifosfát
DMF dimetylformamid
DMSO dimetylsulfoxid
DNA deoxyribonukleová kyselina
dsDNA dvojpramenná DNA
DTT ditiotreitol
ECL expozičná™ chemiluminiscencia
EDTA dvojsodná soí etyléndiamín-Ν,Ν,Ν',N'-tetraoctovej kyseliny
ELISA enzýmom riadená imunosorbentová skúška
EtBr etídiumbromid
EtOH etanol
f .C. konečná koncentrácia
FACS fluorescenciou aktivované [sic] triedenie buniek
G guanín
GFP zelene fluoreskujúci proteín
GlcDH glukózová dehydrogenáza (proteín)
gdh glukózová dehydrogenáza (gén)
t * ♦ * e e
GST glutatión S-transferáza
His histidínový zvyšok
HRP chrenová peroxidáza
IB inklúzne teliesko
IgG INT imunoglobulín G jodonitrotetrazóliová violet
kb páry kilobáz
kD kilodalton
mA mi1iampér
m-RNA mediátorová DNA
MBP maltózu viažujuci proteín
MCS viacnásobne klonujúce miesto
Mr NAD(P) relatívna molekulová hmotnosť nikotínamidadeníndinukleotid(fosfát), volná kyselina
Odx ompA ori optická hustota pri x nm proteín A vonkajšej membrány pôvodná replikácia
PAA polyakrylamid
PAGE elektroforéza polyakrylamidového gélu
PCR polymerázová reťazová reakcia
POD peroxidáza
PVDF polyvinylidéndifluorid
RNA kyselina ribonukleová
RNAza ribonukleáza
rpm rRNA otáčky za minútu ribozomálna RNA
RT teplota miestnosti
SDS dodecylsulfát sodný
ssDNA jednopramenná DNA
Strep T streptavidín tymín
T m t-RNA teplota topenia (DNA duplex) transférová DNA
Taq TCA Thermophilus [sic] aquaticus trichlóroctová kyselina
t ·
TEMED
Tet
Tris
U
U
UV ON V
N,N,N',N'-tetrametyletyléndiamín tetracyklín tris(hydroxymetyl)aminometán jednotka enzymatickej aktivity uracil ultrafialové žiarenie
VIS w/v cez noc volt viditelne hmotnosť na objem
Zoznam literatúry
Aoki a kol., FEBS Letters 384, str. 193 až 197, (1996);
Banauch a kol., Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., zv. 13, str. 101 až 107, (1975);
Bertram & Gassen Gentechnische Methoden, Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen fur das molekularbiologische Labor. Nakladateľstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, Jena, New York (1991);
Brewer & Sassenfeld, Trends in Biotechnology 3, č. 5, str.
119 až 122 (1985);
Brown, T.A., Gentechnologie fur Einsteiger: Grundlagen, Methoden, Anwendungen. Nakladatelství Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford;
Casadaban a kol., Methods in Enzymology 100, str. 293 (1990);
Chalfie a kol., Science 263, str. 802 až 805 (1994);
Chong, S. a kol., Gene 192, str. 271 až 281 (1997); Collins-Racie a kol., Biotechnology 13, str. 982 až 987 (1995); Di Guán a kol., Gene 67, str. 21 až 30. (1988);
Ettinger a kol., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, str. 13102 až
13107 (1996);
Finney a kol., Biochem.J. 324, str. 797 až 805 (1997);
Gazitt a kol., Journal of Immunological Methods 148, str. 159 až 169 (1992);
Ghosh a kol., Analytical Biochemistry 225, str. 376 až 378 (1995) ;
Goeddel a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, str. 106 až 110, (1979);
Hafner & Hoff, Genetik, nové prepracované vydanie SchrodelVerlag, Hanover (1984);
Harlow & Lane, A Laboratory Manual, nakladateľstvo Cold Spring Harbor (1988);
Harris & Angal, Protein purification applications: a practical approach. Oxford University Press Oxford, New York, Tokyo (1990);
Heilmann a kol., Biochimica et Biophysica Acta 1076, str. 298 až 304 (1988);
Ibelgaufts H., Gentechnologie von A bis Z. Rozšírené vydanie, nakladatelstvo VCH-Verlag, Weinheim (1990);
Inouye a kol., FEBS Letters 341, str. 277 až 280 (1994);
Itakura a kol., Science 198, str. 1056 až 1063 (1977);
Jany a kol., FEBS Letters 165, č.l, str.6 až 10 (1984) Kellermann & Ferenci, Methods in Enzymology 90, str. 459 až 463 (1982);
Laemmli, Náture 227, str. 680 až 685 (1970);
La Vallie & McCoy, Curr. Opin. Biotechnol. 6, str.501 až 506, (1995);
Makino a kol., Journal of Biological Chemistry 264, č. 11,
Str. 6381 až 6385 (1989);
Marston, Biochem.J. 240, str. 1 až 12 (1986);
Moks a kol., Biochemistry 26, str. 5239 až 5244 (1987);
Okorokov a kol., Protein Expr. Purif. 6, str. 472 až 480 (1995);
Pharmacia Biotech 1: From Cells to Sequences, A Guide to PCR analysis of nucleic acids;
Pharmacia Biotech 2: The Recombinant Protein Handbook, Principles and Methods;
Pitzurra a kol., Journal of Immunological Methods 135, str.
až 75 (1990);
Pogge V. Strandmann a kol., Proteín engineering 8, č. 7, str. 733 až 735 (1995);
Sambrook a kol., Molecular Cloning. A Laboratory Manual 1, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989);
Sanger a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, str. 5463 až 5467 (1977);
Schein Bio/Technology 7, str. 1141 až 1149 (1989); Scopes Protein purification; principles and practice, 3. vydanie, Springer Verlag, New York, Berlin, Heidelberg (1994); Smith & Johnson, Gene 67, str. 31 až 40 (1988);
Smith a kol., Journal of Biological Chemistry 263, č.15, str. 7211 až 7215 (1988);
Uhlén & Moks, Gene Fusion for Purpose of Expression: An Introduction [12]. Methods in Enzymology 185, str. 129 až 143 (1990);
Uhlén a kol., Gene 23, str. 369 (1983).
Pokial to nie je uvedené inak, zodpovedajú metódy a techniky tu použité metódam a procesom dostatočne dobre známym a opísaným v príslušnej literatúre. Predovšetkým sú zahrnuté objavné obsahy citovaných publikácií a prihlášok vynálezov, najmä autorov Sambrook a kol. a Harlow & Lane a európskeho patentového spisu číslo EP-B-0290768. Plazmidy a hostiteľské bunky, použité podlá vynálezu, sú spravidla tolko príkladné a môžu byť v zásade nahradené vektorovými konštruktmi, ktoré sú modifikované a majú odlišnú štruktúru alebo inými hostiteľskými bunkami, pokial majú stanovené zložky nezbytné pre vynález. Príprava takých vektorových konštruktov a transfekcia vhodných hostiteľských buniek a expresia a čistenie požadovaných proteínov zodpovedajú štandardným technikám, ktoré sú v podstate dobre známe a môžu byť ľubovoľne modifikované podľa vynálezu v širokých medziach. Vynález je ďalej podrobne opísaný v opisnej časti a vysvetlený v príkladoch.
Štruktúrny gén Bacillus megaterium GlcDH je modifikovaný PCR plazmidom pJH115 (EP 0290 768) pôsobiacim ako matrica. Zosilnený fragment (0,8 kb), ktorý má poznávaciu sekvenciu Pst I na jednom konci a poznávaciu sekvenciu Eco47III na druhom, sa digeruje s týmito enzýmami a klonuje sa do cytoplazrnového (pRG45) alebo periplazrnového (pST84) expresného vektoru E. coli (obr. 1 a 2). Výsledné plazmidy, pAW2 a pAW3 majú gén GlcDH, ktorý kóduje proteín s približne 30 kD (261 AA) a je umiestnený v smere so silným promotorom Tet. Cytoplazmový expresný vektor pAW2 má veíkosť približne 4 kb. Periplazmový sekrečný vektor pAW3 je mierne väčší a od pAW2 sa líši iba signálnou sekvenciou omp A, ktorá je proti smeru násobného klonovacieho miesta (MCS) a umožňuje, aby rekombinantný proteín bol sekrétovaný do periplazmy. Obidva vektory majú prídavné MCS s 12 rôznymi reštrikčnými štepnými miestami, ktoré umožňujú klonovanie v rámci s nasledujúcim His tágom. Polyhystidinový (6His) tag umožňuje, aby bol rekombinantný proteín izolovaný na stĺpci s afinitou ku kovu. Vektor pAW4 nakoniec má trideginový gén a GlcDH gén, ktoré sú spolu spojené MCS a polyhistidínový (6His) tag, ktorý je viazaný v smere na gén GlcDH. Jednotlivé konštrukty sú vyznačené na obr. 1, 2 a 3. Avšak híadané plazmidové konštrukty sú uvedené iba ako príklad a vynález neobmedzujú. Môžu byť nahradené inými vhodnými konštruktmi obsahujúcimi uvedené sekvencie DNA. Príprava vektorov, klonov a expresie proteínov sú d’alej špecifikované v príkladoch
Citlivosť a aktivita vyfarbenia sa vykonáva [sic] pre natívnu GlcDH v redukovanom géli SDS. Na tento účel sa pripraví rad koncentrácií s natívnou GlcDH (c=l mg/ml; A=200 U/ml) a pripraví sa negatívna kontrola. Výsledkom SDS-PAGE a aktivity vyfarbenia pomocou INT je gél SDS obr. 3. Pomocou testu je možná detekcia GlcDH až do koncentrácie 50 ng. Negatívna kontrola, ktorá GlcDH neobsahuje nevykazuje podía očakávania žiadny pruh.
Presnú molekulovú hmotnosť natívnej GlcDH je možné stanoviť pomocou markérových proteínov a pomocou kalibračného vynesenia. Na to sa určia relatívne migračné vzdialenosti markérových proteínov a vynesú sa v závislosti od logaritmov ich vzájomných molekulárnych hmotností.
Postup realizovaných expresii je vyznačený schematicky v tabulke I.
Tabulka I
Transformácia expresných vektorov GlcDH do buniek W3110
Predbežná kultúra v médie LB(Amp) pri teplote 37 C (12 h)
Rast buniek pri teplote 37’C v hlavnej kultúre s indukciou (5 h)
Odstredenie na získanie biomasy
Suspenzia buniek v lx.SDS plniacom tlmivom roztoku Roztrhanie buniek pri teplote 95’C počas 5 minút Bunkový extrakt je možné získať priamo v SDS-PAGE (1 h) Aktivita vyfarbenia GlcDH v géli SDS (30 minút) Analýza gélových pruhov
Plazmidový pAW2/klon 9 (pAW2/K9) sa transformuje na kompetentný expresný kmeň E. coli W3110 a dvoch klonov z výslednej transformačnej doštičky sa použije na naočkovanie 5 ml predbežnej kultúry. Na indukciu anhydrotetracyklínu dôjde 2 hodiny po naočkovaní hlavnej kultúry. Celková expresia trvá hodín a ukončí sa pri OD 1,65 pre kloň 1 a 1,63 pre kloň 2. Po vyfarbení aktivity SDS-PAGE a GlcDH je možné zistiť silný pruh GlcDH (približne 35 kD) pre každý kloň od 1 ml bunkovej suspenzie. Medzi výslednými pruhmi GlcDH sa neprejavuje žiadny rozdiel, keď bola vykonaná SDS-PAGE za redukovaných a neredukovaných podmienok. Na tento účel sa skúma v každom prípade 500 až 100 μΐ bunkovej suspenzie v géli SDS vyfarbením aktivity GlcDH s INT.
Na znázornenie citlivosti vyfarbenia aktivity GlcDH v porovnaní s vyfarbením Coomassie sa pripravia vzorky 100 μΐ bunkovej suspenzie a zriedenia 1/5, 1/10 a 1/20 bunkovej suspenzie. Konečný objem zriedení je 100 μΐ. Použije sa výsledný gél SDS po vyfarbení aktivity GlcDH na vyfarbenie Coomassie na zviditeľnenie ďalších proteínových pruhov. Z toho vyplývajúci gél SDS je vyznačený na obr. 4. Výrazný pruh je stále patrný pri zriedení 1/20 pri použití vyfarbenia aktivity GlcDH, zatiaľ čo pruhy vyfarbené Coomassie sú sotva patrné.
Trideginový štrukturálny gén Haementeria ghilianii, kopulovaný s His tágom, je modifikovaný PCR s plazmidom pST106 pôsobiacim ako matrica. Zosilnený fragment (0,25 kb), ktorý je obklopený rozlišovacou sekvenciou Clal a rozlišovacou sekvenciou PstI sa digeruje s týmito enzýmami a klonuje do cytoplazmového fúzneho vektoru pAW2 GlcDH E. coli. Výsledný plazmid pAW4 má teraz fúzny proteínový gén tridegin-His-GlcDH, ktorý kóduje proteín s približne 44 kD a je umiestnený v smere silného promotoru Tet. Bunkový extrakt z kmeňa W3110 E. coli, ktorý obsahuje cytoplazmový plazmid pAW4, sa analyzuje SDS-PAGE a vyfarbením aktivity GlcDH. Tým je umožnená detekcia niekoľkých pruhov vyfarbených červenofialovo pri 35, 37, 40 a 43 kD. Pruh 43 kD obsahuje požadovaný fúzny proteín tridegin-His-GlcDH, hoci je jeho molekulová hmotnosť trocha menšia ako teoretická hodnota 44 kD. Ostatné zistiteľné pruhy sú podľa domnenia produkované proteolytickou degradáciou fúzneho proteínu v E. coli, pretože najmenší sfarbený pruh 35 kD zodr r r r
- 21 povedá približne velkosti GlcDH. Na základe porovnania velkostí je možné identifikovať pruh 35 kD, ktorý sa vytvoril ako produkt degradácie His-GlcDH.
Pri vykonávaní [sic] expresie ukázala kinetika, že proteolytická degradácia vytvoreného fúzneho proteínu začína 2 hodiny po indukcii promotoru Tet anhydrotetracyklínom, čiže po tomto čase, kečt boli dodatočné pruhy zistitelné v géli SDS vyfarbením aktivity. Vytvorený fúzny proteín nie je stály voči proteázam E. coli, čo sa prejavuje pomerne rýchlou degradáciou proteínu. Je možné pomocou vykonštruovaného periplazrnového GlcDH fúzneho vektoru pAW3 zabrániť proteolytickej degradácii fúzneho proteínu v bunke, pretože v tom prípade by bol expresovaný fúzny proteín sekrétovaný do periplazrnového priestoru medzi bunkami E. coli. Proteázy E. coli sa nachádzajú hlavne v cytoplazme.
Citlivosť a špecifickosť detekcie fúzneho proteínu GlcDH umožňuje, aby rekombinantné cudzie proteíny boli testované rýchlo a jednoducho. Citlivosť detekčného systému GlcDH je podmienená použitím natívnej GlcDH. Detekcia aktivity natívnej GlcDH sa prejavuje pruhom zafarbeným červenofialovo pri približne 30 až 35 kD v géli SDS-PAA.
Cytoplazmová expresia v kmeni E. coli W 3110 rekombinantná GlcDH od pAW2 vykazuje rovnakú molekulovú hmotnosť. Porovnanie citlivosti medzi natívnou GlcDH a rekombinantnou GlcDH je možné porovnaním intenzít pruhov.
Vyvinutý testovací systém (pozri príklady) umožňuje okrem toho vykonávať dvojité vyfarbovanie v géloch SDS. V prvom vyfarbení dochádza k špecifickej detekcii pruhov GlcDH. Vyfarbenie pozadia je možné sledovať bežným proteínovým vyfarbovaním, napríklad Coomassiovým vyfarbovaním zostávajúcich proteínov. GlcDH si s prekvapením udržuje podlá vynálezu za re22 dukčních podmienok v prítomnosti SDS svoju úplnú aktivitu, čo umožňuje rýchlu detekciu v géli SDS.
Podlá vynálezu je ďalej možné zvyšovať citlivosť detekcie aktivity GlcDH pomocou nitro modrej tetrazoliovej soli (NBT) ako substrátu pre GlcDH. Rýchlosť reakcie pre detekciu GlcDH pomocou INT sa však zvyšuje ďalej pomocou Triton X-100 (1% finálny roztok) alebo pridaním chloridu sodného (IM finálny roztok).
Rekombinantný fúzny proteíny tridegin/His a tridegin/ His/GlcDH sa získajú expresiou plazmidov pST106 a pAW3 (obr. 1 a 2). Po roztrhaní buniek v príslušnej expresnej zmesi sa vzorky frakcionujú SDS-PAGE a transferujú sa na membránu. Fúzny proteín tridegin-His-GlcDH je detekovatelný imunologický prostredníctvom obsiahnutého His tag pomocou protilátky antiRGGHis vo Western blote. Použité kontroly sa čistia rekombinantným calinom (proteín pijavice), ktorý má koncový His tag a bunkovým extraktom expresovanej rekombinantnej GlcDH, ktorá nemá žiadny His tag. Protilátka antiRGSHis je schopná detekovať pruh s približne 37 kD a iný pruh s približne 43 kD pre rekombinantný fúzny proteín tridegin-His-GlcDH (obr. 6). Porovnanie velkostí získaných pruhov s pruhmi získanými po vyfarbení aktivity v géli SDS ukazuje, že pruh 43 kD predstavuje fúzny proteín tridegin-His-GlcDH a pruh 37 kD predstavuje degradačný produkt His-GlcDH úplného fúzneho proteínu. Proteín calin/His tag vytvára pruh s približne 26 kD. Trocha menší rekombinantný proteín tridegin/His tag vytvára pruh pri približne 23 kD plus ďalšie pruhy indikujúce väzbu His protilátky na ďalšie expresované proteíny. ImunoRPC logická detekcia s protilátkou antiHis teda dokladá, že proteín detekovaný pri 43 kD a proteín detekovaný pri 37 kD obsahovali His tag. Okrem toho zodpovedá velkosť proteínu detekovaného pri 37 kD približne teoretickej veľkosti (36,5 kD) proteínu GlcDH s kopulovaným His tágom.
Okrem detekcie expresie rekombinantného trideginu sa skúmala biologická aktivita trideginu ako zložky fúzneho proteínu tridegin/GlcDH, v špecifickom prípade z pAW4. Tento test je založený na inhibícii faktoru XlIIa natívneho homogenátu pijavicovej žlazy a čistí sa trideginom (Finney a kol. Biochem. J. 324, str. 797 až 805, 1997). Modifikovaný test je opísaný v príkladoch. Ako kontrola sa expresuje zodpovedajúci fúzny proteín z pST106 a proteín GlcDH z pAW2. Z porovnaní enzýmovej aktivity s rekombinantným trideginom expresovaným buď fúzným proteínom GlcDH-trideginu alebo tridegin-His tágom v E. coli vyplynuli zanedbateľné rozdiely. Popri tom vykazujú rekombinantné trideginové proteíny z dvoch rôznych expresii porovnateľné biologické aktivity s homogenátom pijavicovej žlazy. Preto sa predpokladá, že fúzia s GlcDH nemá vôbec žiadny interferujúci účinok na biologickú aktivitu spoločne expresovaného cudzieho génu.
Tridegin samotný (čiže nie ako fúzny proteín) nemá žiadnu aktivitu po expresii E. coli a je vytváraný ako inkluzné teleso. Výsledkom expresie GlcDH v E. coli je enzým s vysokou špecifickou aktivitou a stálosťou v rozpustnej forme. V expresných pokusoch sa ukázalo, že proteíny, ktoré majú velkú rozpúštaciu kapacitu na expresiu v E. coli zvyšujú rozpúšťaciu kapacitu expresie cudzieho proteínu, keď sú k nemu fúzované (La Vallie & McCoy, Curr. Opin. Biotechnol. 6, str. 501 až 506, 1995). Fúzia trideginu na GlcDH zvyšuje v tomto prípade rozpustnosť trideginu, pretože je možné biologickou detekciou, pri ktorej tridegin inhibuje faktor XlIIa, detekovať aktivitu trideginu po expresii E. coli ako fúzneho proteínu tridegin/His/GlcDH. Fúzny proteín GlcDH je expresovaný vo vysokom výťažku v E. coli.
Možnosť expresie klonovaných génov ako fúznych proteínov, obsahujúcich proteín so známou velkosťou a biologickou funkciou, výrazne zjednodušuje detekciu génového produktu. Na to bolo vyvinutých, ako už je uvedené v úvode, vela fúznych expresných systémov s rôznou detekčnou stratégiou.
Porovnanie známych systémov s fúznym systémom GlcDH podlá vynálezu v E. coli je uvedené v tabulke II. V niektorých systémoch môže byť N-terminálový fúzny proteín odštiepený od C-terminálového ciela alebo cudzieho proteínu (Collins-Racie a kol., Biotechnology 13, str. 982 až 987, 1995).
Tabulka II
Tag/fúzny partner MW (kD) Detekcia Výhoda
GlcDH 30 funkčný test v géli SDS rýchla a lacná detekcia v géli SDS
His tag (Pogge v. Strandmann a kol. 1995) 1-7 Western blot ELISA malá
Strep-tag (Uhlén a kol. 1990) 13 Western blot malá
nyc epitop 1-2 Western blot malá
(Pitzurra a kol. ELISA
1990; Gazitt a kol.
1992)
IgG časti, Fc 2-5 (Moks a kol.1987, Ettinger a kol.1996) Western blot ELISA malá selekcia buniek (FACS)
GFP (Chalfie 27 a kol; Inouye a kol. 1994) fluorescencia Western blot selekcia buniek i v kultivačnej miske niekolko detekovatelných súčasne (FACS)
Inteín (Chong a kol. 1997) 48 Western blot fúzny partner môže byť vypustený
GST (Smith, Johnson, 1988, Gosh a kol. 1995) 26 Western blot kalorimetrická detekcia v roztoku fúzny partner môže byť vypustený
MBP (Chu di Guán a kol.1988, Keller- 40 Western blot fúzny partner môže byť vypustený
mann a kol. 1982).
Spôsob Prekondiciácia Trvanie Výťažok Citlivosť Informácia
GlcDH detekcia GlcDH funkčne aktívna pribi. 3 hod. stredne vysoký 50 ng množstvo proteínu veľkosť proteínu
ELISA 2 protilátky pribi. 1 deň vysoký pg-ng množstvo proteínu
Western blot 1-2 protilátky Tag na proteíne - 1-2 dni nízky ng množstvo proteínu veľkosť proteínu
Veľmi veľkou prednosťou detekčného systému GlcDH podľa vynálezu je skutočnosť, že nevyžaduje ako napríklad na detekciu Western blot žiadne protilátky alebo iné materiály ako sú napríklad membrány, prístroj blot, vyvolávači stroj s filmami, mikrotitrové doštičky, čítacie zariadenie titračnej doštičky. To znamená, že na detekciu rekombinantných fúznych proteínov dochádza pomocou systému GlcDH oveľa výhodnejšie a rýchlejšie. Pomocou detekcie GlcDH je možné nielen získať informáciu o množstve expresovaného fúzneho proteínu, ale tiež o zodpovedajúcej veľkosti fúzneho proteínu priamo v géli SDS-PAA bez transferu na membránu. Keď je aktivita GlcDH zistiteľná vo fúznom proteíne, mal by byť fúzny partner spravidla tiež funčne aktívny. GlcDH neinterferuje so zavinutím fúzneho partnera. Prednosti systému fúzneho proteínu GlcDH podľa vynálezu sú uvedené ďalej v porovnaní (tabuľka III) výberom z literatúry ako účinného spôsobu izolácie a detekcie fúzneho proteínu získaného v E. coli. Systém fúzneho proteínu GlcDH podľa vynálezu je dalej osobitne výhodný na zvyšovanie rozpustnosti proteínov, ktoré sa tvoria, predovšetkým v E. coli ako inkluzné telesá, a preto robí následné izolácie proteínov obťažné a nákladné. Normálne je nutné premeniť vytvorené proteíny ako inkluzné telesá do ich natívneho stavu zložitými spôsobmi. To nie je nutné pri použití fúznych proteínov podľa vynálezu.
Súhrnne je možné prednosti fúznych proteínov podľa vynálezu, ktoré sa používajú ako detekčný systém GlcDH vyjadriť takto:
- stabilita za SDS a redukčných (denaturačných) podmienok,
- citlivý enzymatický farebný test špecifický pre GlcDH,
- citlivosť až aspoň 50 ng,
- rýchla detekcia priamo v géli SDS s určením molekulovej hmotnosti fúzneho partnera,
- možnosť prídavného vyfarbovania proteínov,
- lacné materiály, malé náklady na prístroje,
- dobrá expresia v E. coli, vrátane cieľového proteínu so zachovaním biologickej aktivity,
- možnosť vyhnúť sa inkluzným telesom cudzieho/cieľového proteínu alebo iných agregátom vzniknutých nesprávnym vinutím, ♦ · *· * r · r ŕ
* r
- možnosť vyčistenia fúzneho proteínu afinitnou chromatografiou napríklad na farbivách (Cibacron Blue 3G)
Tabuľka III
Konštrukcia/transformácia fúzneho vektoru proteín A/GFP rast buniek na LB agarových doskách pri 37°C deň rast buniek pri 25’C (3 dni) suspenzia buniek v tlmivom roztoku (pH 8,0) rozpad a odstránenie buniek odstredením zvyškov
SDS-PAGE na oddelenie proteínu (lh)
Transfer proteínu k nitrocelulózovej membráne (lh) blokovacia reakcia (lh) protilátková reakcia (lh)
Konštrukcia/transformácia fúzneho vektoru GlcDH/tridegin predbežná kultivácia v LB (amp) médie pri 37’C (12 hodín) rast buniek pri 37eC v hlavnej kultúre s indukciou (5 hodín) suspenzia buniek v SDS plniacom tlmivom roztoku rozpad SDS buniek pri 95C počas 5 minút
SDS-PAGE (1 hodina) bunkovým extraktom vyfarbenie aktivity GlcDH v géli SDA (30 minút) inkubácia v proteín A-GFP pracovnom tlmivom roztoku (20 minút)
UV ožiarenie (365 nm/analýza blotu) analýza gélu SDS so stanovením molekulovej hmotnosti
Vynález objasňujú, žiadnym spôsobom však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Prajmer Sekvencia Dĺžka Použitie
GlcDH#1 5' 32 báz PCR prajmer (pripojenie ku
GCGCGAATTCATGTATA koncu 5' gdh a zavedenie
CAGATTTAAAAAGAT-3 * EcoRI štepného miesta)
GlcDH#2 5' 31 báz PCR prajmer (pripojenie ku
GCGCTTCGAACTATTAG koncu 3' gdh a zavedenie
CCTCTTCCTGCTTG-3' Sful štepného miesta)
GlcDH#3 5' 31 báz PCR prajmer (pripojenie ku
GCGCCTGCAGATGTATA koncu 51 gdh a zavedenie
CAGATTTAAAAGAT-3' PstI štepného miesta)
GlcDH#4 5’ 31 báz PCR prajmer (pripojenie ku
GCGCAGCGCTCTATTAG koncu 3' gdh a zavedenie
CCTCTTCCTGCTTG-3' Eco47III štepného miesta)
Tridegin 5· 31 báz PCR prajmer (pripojenie ku koncu 5' trideginu a zavedenie stepného miesta Clal)
#1 GCGCATCGATATGAAAC TATTGCCTTGCAAA-3'
Tridegin 5· 31 báz PCR prajmer (pripojenie ku
#2 GCGCCTGCAGGTGATGG koncu 3' trideginu a
TGATGGTGATGCGA-3' zavedenie štepného miesta PstI)
pASK 75 5' 22 báz Sekvencia prajmeru (IRD 41
UPN CCATCGAATGGCCAGAT značeného na konci 5'
• GATTA-3' pripojenia v tet p/o pRG 45 a pST84)
PASK 75 5' 21 báz Sekvencia prajmeru
RPN TAGCGGTAAACGGCAGA (5'IRD41 značeného
CAAA-3' pripojenia v lpp pRG 45 a pST84)
T 7 5' 20 báz Sekvencia prajmeru
Seq.s TAATACGACTCACTATA (5'IRD41 značeného
GGG-3' pripojenia k T7 prajming miestu pcDNA3.1/myc-His A,B,c
Rev 5' 18 báz Sekvencia prajmeru
Seq.as TAGAAGGCACAGTCGAG (5'IRD41 značeného
G-3' pripojenia k BGH revers prajming miestu pcDNA3.1/myc-His A,B,C
Uvedené nukleotidy sa použijú podľa vynálezu (tabuľka IV).
Tabuľka V zahŕňa použité mikroorganizmy. Všetky mikroorganizmy sú odvodené od E. coli K12 a patria do rizikovej skupiny
1.
Tabuľka V
Kmeň Rod/ druh Genotyp Literatúra
ToplOF' E. coli F'(lacI^Tnl0(TetR))mcrA ToplOF' bunky
bunky delta(mrr-hsdRMS-mcrBC) One Shot™
One fí801acZdeltaM15deltalac kit od
Shot™ X74 deoR recAl araD139 delta(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)endAl nupG InvitrogenR
Epiku- E. coli delta(mcrA183 dela(mcrCB- Stratagen
rejské hsdDMR-mrr) 173 endAl kompetentné
ColiRXĽI modré MRF' bunky supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac(F'proAB lacI^ZdeltaMlSTnlOÍTet1)) bunky
TOP10 E. coli F' mcrA delta(mrr-hsdRMS- TOPO TA
bunky mcrBC) CloningR Kit
One f1801acZdeltaM15 deltalacX74 (verzia C) od
Shot™ recAl deoR recAl araD139 delta(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endAl nupG InvitrogenR
W3110 E. coli F'lambda WT E. coli B.Bachmann Bacteriol. Rev 36(72) 525-557
Donorový organizmus: M 7037 expresný kmeň (E. coli N 4830/pJH 115) z 21.10.96 (spoločnosť Merck).
pJH 115: pUC derivát, 5,9 kb, OLPL promotor gdh, k (terminátoru), galk (gén galaktozidázy), bla (β-gén laktamázy), ori (počiatok replikácie), 2 HindlII, 2 BamHI a jeden z každej EcoRI a Clal stepného miesta.
Príklad 2
Transformácia plazmidov do kompetentných buniek E. coli.
Médium SOC: 20 g Bacto tryptonum, 5 g Bacto kvasnicového extraktu, 0,5 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného a 1 1 dvakrát destilovanej vody, autokláv. Pred použitím sa pridá: 0,5 ml IM chloridu horečnatého/1 M síranu horečnatého (sterilné sfiltrovaného), 1 ml 1 M glukózy (sterilné sfiltrovanej).
LB (Amp) agarové dosky: zmieša sa 1 1 média LB (bez ampici lánu) a 15 g agar-agaru, autokláv, ochladenie na teplotu pri-
blížne 60°C a 1 ml
Zmes 1-5 μΐ
50 μΐ
450 μΐ
roztoku ampicilínu (100 mg/ml). Postup: ligačného produktu alebo plazmidu DNA (5-50 ng/μΐ) kompetentných buniek média SOC.
roztopiť kompetentné bunky na lade 10 minút, pridať DNA do kompetentných buniek, inkubovať na íade 30 minút, tepelný šok: 30 sekúnd pri teplote 42°C (vodný kúpel), dať bunky na lad na 2 minúty, pridať 450 μΐ predhriateho média SOC, inkubovať pri teplote 37C a 220 otáčkach za minútu 1 h, naniesť 100 μΐ dávky zmesi na predhriatu LB/Amp dosku, inkubovať dosky cez noc pri teplote 37C.
Príklad 3
TOPO-TA CloningR a ligácia TOPO-TA CloningR je 5-minútový spôsob klonovania pre produkty PCR zosilnené polymerázou Taq.
Súprava TOPO-TA CloningR kit (verzia C) od spoločnosti Invitrogen bola vyvinutá na priame klonovanie produktov PCR. Systém využíva vlastnosti tepelne stabilných polymeráz, ktoré napadajú samotný deoxyadenozín na 3' konci všetkých duplexných molekúl v PCR (previs 3'-A). Pomocou týchto 3'-A previsov je možné navádzať produkty PCR priamo na vektor, ktorý má previsy 3'-T. Kit poskytuje vektor pCRR2.1-TOPO, ktorý bol špeciálne vyvinutý na tento účel. Vektor má veľkosť 3,9 kb a má gén lacZ na selekciu modrá/biela a gény odolné k ampicilínu a kanamycínu. Klonovacie miesto je z obidvoch strán obklopené jedným
štepným miestom EcoRI.
Ligačná zmes:
2 μΐ čerstvého produktu (10 ng/μΙ)
1 μΐ pCRR-TOPO vektoru
2 μΐ sterilnej vody
5 μΐ celkový objem
starostlivo zmiešať zmes a inkubovať pri teplote miestnosti počas 5 minút
- krátko odstrediť a skúmavku uložiť na ľad
- použiť ligačné produkty bezprostredne v transformácii One Shot.
Ako kontrolná sa použije 5 μΐ zmes bez produktu PCR, ktorá sa skladá iba z vektoru a vody.
Transformácia One Shot™ sa uskutočňuje týmto spôsobom:
Pridajú sa 2 μΐ 0,5M β-sulfanyletanolu do 50 μΐ kompetentných buniek One Shot™ TOPO roztopených na lade.
Pridajú sa 2 μΐ ligácie TOPO-TA CloningR na liekovku kompetentných buniek.
Inkubuje sa na lade 30 minút.
Tepelný šok: 30 sekúnd pri teplote 42“C.
Ochladenie na lade 2 minúty.
Pridá sa 250 μΐ média SOC (teplota miestnosti).
Liekovky sa inkubujú pri teplote 37’C a pri 220 otáčkach za minútu počas 30 minút.
Nanesie sa 100 μΐ každej transformačnéj zmesi na dosky LB/Amp predhriate na teplotu 37“C.
Dosky sa inkubujú pri teplote 37C cez noc.
Analyzujú sa výsledné produkty transformácie po minipríprave (3.2.2.1) vhodnými enzýmami v analytickej reštrikčnej digescii.
Príklad 4
Expresia génov v bunkách E. coli
Spôsob sa vykonáva takto:
- izoluje sa plazmid z úspešne sekvenovaných klonov a transformuje sa do expresného kmeňa W3110,
- kloň sa zoberie z transformačnej dosky a použije sa na prípravu 5 ml predkultúry ON,
- predkultúra sa nanesie na dosku LB/Amp a klony z tejto dosky sa použijú na naočkovanie expresii vykonaných neskoršie,
- 1 ml predkultúry sa potom použije na naočkovanie 50 ml hlavnej kultúry (pomer 1:50) a stanoví sa Οϋςθθ (referenčné meranie s nenaočkovaným médiom LB (Amp),
- hlavná kultúra (v 200 ml Erlenmeyerových bankách) sa inkubuje pri teplote 37’C a pri 220 otáčkach za minútu,
- každých 30 minút sa stanoví OD600,
- ako náhle OD dosiahne 0,5, indukujú sa bunky 10 μΐ anhydrotetracyklínu (1 mg/ml) do 50 ml bunkovej suspenzie (f.c. 0,2 μg anhydrotetracyklínu na ml bunkovej suspenzie) a stanoví sa opäť OD (0 hodnota),
- OD sa stanoví každú hodinu a rast sa zastaví 3 hodiny po čase indukcie,
- 1 ml dôkladne premiešanej bakteriálnej suspenzie sa vnesie do skúmavky a odstreďuje sa 5 minút pri 6000 otáčkach za minútu (prípadne sa môže použiť i menej suspenzie),
- supernatant sa odsaje a peleta sa homogenizuje v 100 μΐ lx riedeného vzorkového tlmivého roztoku,
- homogenát sa varí 5 minút, ochladí sa na ľade a krátko sa odstredí,
- 10 μΐ vzorky sa vnesie do každej jamky gélu SDS a urobí sa elektroforéza (3.2.16),
- gél sa ofarbí Coomassiovou modrosťou a/alebo spôsobom podlá príkladu 5.
Roztrhanie buniek:
Bunky z 50 ml kultúry, kultivované cez noc sa odstreďujú pri 3500 otáčkach za minútu pri teplote 4“C počas 15 minút. Výsledný supernatant sa odleje a bunky sa resuspendujú v 40 ml 100 mM tris/HCl (pH 8,5). Suspendované bunky sa roztrhajú pri použití Frenchova lisu vo valci s priemerom 25,4 mm za tlaku 124200 kPa. Bunky sa pretlačia úzkym otvorom (<1 mm) a podrobia sa náhlemu poklesu tlaku. Vďaka tlakovému rozdielu pri priechode otvorom bunky rozpraskajú. Počas tejto operácie zostáva štruktúra bunkových proteínov zachovaná. Aby sa zabránilo degradácii požadovaného proteínu, má sa pridať inhibítor proteázy bezprostredne po roztrhaní buniek. Na tento účel sa do každých 40 ml proteínového roztoku pridá 1 tableta EDTA presiateho prostredia Complete™ Protease-Inhibítor Cocktail (Roche) a rozpustí sa pri teplote miestnosti. Následným odstredením pri 6000 otáčkach za minútu počas 20 minút sa odstránia bunkové úlomky a veľké časti DNA a RNA. Vzorky sa potom zmrazia na teplotu -20°C.
• r • e· ·· r
- 35 Príklad 5
Aktívne vyfarbenie pruhu GlcDH v géli SDS:
Na špecifickú detekciu glukózového dehydrogenázového pruhu v géli SDS dochádza pri použití jódfenylnitrofenylfenyltetrazóliumchloridu (INT). To je možné iba pretože spracovanie SDS nezničí aktivitu GlcDH. K detekcii GlcDH dochádza pomocou farebnej reakcie. Ta zahŕňa uvolňovanie vodíka tvoriaceho sa pri reakcii pri prevode na tetrazóliovú sol INT, vytvárajúcej fialový formazán. Fenanzínmetosulfát slúži ako elektrón transferové činidlo.
Preinkubačný tlmivý roztok (0,1 M Tris/HCl, pH 7,5) 15,76 g Tris/HCl do 1 1 ddH2O, pH 7,5 s NaOH
Reakční tlmivý roztok (0,008 % INT, 0,005 % fenanzínmetosulfátu, 0,065 % NAD, 5 % Glc v 0,lM Tris/HCl (pH 7,5) 0,8 g jódfenylnitrofenyltetrazóliunchloridu (INT) 0,05 g netylfenazíniummetosulfátu (fenanzínmetosulfát) 9,65 g NAD g monohydrátu D-(+)-glukózy (Glc) a 1 1 0,1 M Tris/HCl (pH 7,5)
Rezervný tlmivý roztok pre GlcDH:
26,5 g EDTA
15,0 g Na2HPO4 do 1 1, pH 7,0 (NaOH)
Príprava vzorky
- rozpustí sa vzorky a markéry vo vzorkovom tlmivom roztoku,
- varí sa vo vodnom kúpeli 3 minúty, ochladí sa na lade a odstredí sa.
SDS gélová elektroforéza štandardnými spôsobmi
Aktivačné vyfarbenie:
- Inkubuje sa SDS gél s frakcionovanými proteínovými pruhmi v preinkubačnom tlmivom roztoku pri teplote 37’C za mierneho pretrepávania počas 5 minút.
- Vleje sa tlmivý roztok a pokryje sa dostatočným množstvom reakčného tlmivého roztoku (pri teplote miestnosti) a inkubuje sa pri teplote 37’C za mierneho pretrepávania (tlmivý roztok sa vymení najmenej raz).
- Po inkubácii počas približne 30 minút sa pruhy s GlcDH zafarbia červenofialovo.
- premyje sa v preinkubačnom tlmivom roztoku, vyfotografuje sa a vysuší.
- v prípade potreby sa vykoná postupné vyfarbenie Coomassiovým vyfarbením a gél sa potom vysuší.
Príklad 6
Imunologická detekcia pomocou systému ECL (Western Exposure™ Chemiluminescent Detection Systém):
Proteíny, kopulované na His tag, sa detekujú nepriamo pomocou dvoch protilátok. Prvou použitou Ab je protilátka anti-RGSHis (QIAGEN) na detekciu 6xHis-taggovaných proteínov. Výsledný antigén-protilátkový komplex sa potom detekuje pomocou peroxidáz (POD)-značená protilátka AffiniPure kozí anti-myší IgG (H+L). Po pridaní zmesi ECL substrátu viazaná peroxidáza vedie k chemiluminiscenčnému produktu, ktorý môže byť detekovaný pomocou vysoko výkonného chemiluminiscenčného filmu.
Roztok Ponceau S (0,5 % Ponceau S, 7,5 % TCA)
1,25 g Ponceau S
18,75 g TCA doplnenie na 250 ml dvakrát destilovanou vodou.
lOx PBS tlmivý roztok pH 7,4
14,98 g hydrogenfosfátu disodného x 2 H2O
2,13 g hydrogenfosfátu draselného
87,66 g chloridu sodného doplnenie na 1 1, kontrola pH 7,4.
Použije sa jednonásobná koncentrácia tlmivého roztoku.
Biometra blot tlmivého roztoku mM Tris
150 mM glycínu
10% metanolu
Blokujúce reakčné činidlo
5% práškového odstredeného mlieka rozpustené v tlmivom roztoku lx PBS
Premývací tlmivý roztok
0,1% Nonidet™ P-40 (Sigma) rozpustené v tlmivom roztoku lx PBS Detekcia sa uskutočňuje takto:
- membrána PVDF (Immobilon P. Millipore) a 6x blottingové filtračné papiere sa ustrihnú na rozmer gélu,
- membrána PVDF sa vyrovná 15 sekúnd v metanole a potom v blottlmivom roztoku Biometra a vloží sa rovnakým spôsobom na gél SDS a filtračné papiere,
- Blot konštrukcia: navrstvia sa 3 vrstvy filtračného papieru, membrány, gélu, 3 vrstvy filtračného papieru v komôrke blot (vzduchové bubliny medzi vrstvami sa musia vypudiť, inak by v tých miestach nedošlo k transferu proteínu),,
- Blotovanie: 1 až 1,5 mA/cm2 gélu počas 1 hodiny
- Kontrola transferu proteínu:
- po blotovaní sa skontroluje transfer proteínu na membráne PVDF zafarbením Ponceau S: membrána sa inkubuje s 0,5% roztokom Ponceau S v miske pri jemnom potrepávaní počas najmenej 2 minút. Odlieva sa farbivo (opätovne použitelné) a odfarbuje sa membrána v tekúcej deionizovanej vode. V tomto prípade sa zafarbia iba silné proteínové pruhy. Markér molekulovej hmotnosti sa označí guľôčkovou tužkou.
- Vyvolanie blotu:
Všetky inkubácie je potrebné vykonávať v miske na trepačke Celloshaker a v odvalovacej komôrke v 50 ml Falkonových skúmavkách, pretože membrána nesmie počas nasledujúcich krokoch nikdy vyschnúť.
(1) Nasýtenie minút pri teplote 37’C v odvalovacej komôrke s PBS/5 % práškového odstredeného mlieka (2) 1ST protilátka: inkubácia v zriedení 1:2000 v PBS/5 % práškového odstredeného mlieka (objem približne 7 ml/membránu) 1 hodinu pri teplote 37’C (3) Premytie: Membrána sa premýva opakovane premývacím roztokom PBS/0,1% NP-40 premytie 3x5 minút (4) POD-značené Ab: inkubácia v zriedení 1:1000 v PBS/5 % práškového odstredeného mlieka (nová skúmavka) 1 hodinu pri teplote 37’C (5) Premývanie: Membrána sa premýva opakovane premývacím roztokom PBS/0,1 NP-40 premytie 3x5 minút (6) Vyvolávanie: membrána sa rozvíri dôkladne (nenechať vyschnúť) a položí sa na plastový list, pokryje sa úplne roztokom vývojky ECL (Amersham) 1 minútu, membrána sa víri a položí sa na dvojitý list, navrch sa priloží polaroidový Hyperfilm a vyvolá sa.
Príklad 7
Detekcia Trideginu inhibíciou faktoru XlIIa (metóda Finney a kol. 1997, modifikovaná podlá vynálezu):
Miesto prírodného substrátu faktoru XlIIa, menovito aminoskupiny obsahujúcich vedľajších reťazcov aminokyselín, sú do vhodných proteínových substrátov tiež začlenené syntetické amíny. Tieto syntetické amíny majú intramolekulárne markéry, r * * ŕ
- 39 ktoré detekciu umožňujú. Test začlenenia amínu je test pevnej fázy. Titračné dosky sa potiahnu kazeínom. Substrát biotínamidopentylamínu sa začlení do tohto kazeínu faktorom XlIIa. Kazeínbiotínamidopentylamínový produkt môže byť detekovaný fúznym proteínom streptavidín-alkalická fosfatáza (strep/AP). Tento sendvič sa môže prejaviť [sic] detekciou fosfatázovej aktivity pomocou p-nitrofenylfosfátu. To zahŕňa nasledujúcu reakciu:
4-Nitrofenylfosfát + H20 AP fosfát + 4-nitrofenolát [sic]
Vytváranie 4-nitrofenolátu [sic] je určované fotometriou pri 405 nm a je priamo úmerné aktivite AP. Vysoká afinitná interakcia biotínu a streptavidínu znamená, že aktivita fosfatázy je pravdepodobne priamo úmerná aktivite faktoru XlIIa, čo znamená, že silnejšie absorpcie (žlté zafarbenie) znamená vyšší faktor XlIIa aktivity (Janowski, 1997). EDTA je veľmi nešpecifický inhibítor faktoru XlIIa, ktorého kofaktor Ca2+ je viazaný EDTA v chelátovom komplexe. Z toho dôvodu nesmejú mať použité proteínové vzorky žiadnu EDTA a spracujú sa predbežne koktailom inhibítorov proteázy bez EDTA (Boehringer). Premývací tlmivý roztok: 100 mM Tris/HCl, pH 8,5;
roztok A: rozpustí sa 0,5% práškového odstredeného mlieka v premývacom tlmivom roztoku;
roztok B: rozpustí sa 0,5 mM biotínamidopentylamínu, 10 mM DTT, 5 mM CaCl2 v premývacom tlmivom roztoku;
roztok C: rozpustí sa 200 mM EDTA v premývacom tlmivom roztoku;
roztok D: rozpustí sa 1,7 gg/ml streptavidín-alkalická fosfatáza v roztoku A;
roztok E: rozpustí sa 0,01% /w/v Triton X-100 v premývacom tlmivom roztoku;
roztok F: rozpustí sa 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu,
mM chloridu horečnatého v premývacom tlmivom roztoku.
Poťahovanie:
- Rozdelí sa 200 μΐ roztoku A do každej jamky na titračnej doske, v závislosti od počtu vzoriek. Pretrepáva sa pri teplote 37’C počas 30 minút (Thermoshaker).
Premývanie:
- Premýva sa dvakrát 300 μΐ premývacieho tlmivom roztoku na jamku.
Začleňovacia reakcia:
- Rozdelí sa 10 až 150 μΐ na jamku a pridá sa 5 μΐ faktoru XlIIa na jamku a 200 μΐ roztoku B na jamku. Pretrepáva sa 30 minút pri teplote 37’C.
Ukončenie:
- Premyje sa dvakrát 300 μΐ roztoku C (faktor XlIIa inhibície) na jamku.
- Premyje sa dvakrát 300 μΐ premývacieho tlmivého roztoku na jamku.
Väzba Strep/Ap (špecifická)
- Pridá sa 250 μΐ roztoku D na jamku.
- Inkubuje sa 60 minút pri teplote miestnosti.
Premývanie:
- Premyje sa 300 μΐ roztoku E na jamku (oddelia sa proteíny, ktoré nie sú kovalentne viazané).
- Premyje sa 4 krát 300 μΐ premývacieho tlmivého roztoku na jamku.
Substrát:
- Do každej jamky sa pridá 50 μΐ roztoku F + 200 μΐ premývacieho tlmivého roztoku na jamku.
- Inkubuje sa 30 minút pri teplote miestnosti.
Merí sa s vyhodnotením s počítačovou asistenciou čítacím zariadením mikrotitračnej dosky pri 405 nm.
Príklad 8
Citlivosť detekcie GlcDH
Určené množstvo vyčistenej GlcDH sa vnesie na gél SDS. Po prebehnutí sa gél SDS inkubuje v preinkubačnom tlmivom roztoku 5 minút pri teplote 37'C. Tlmivý roztok sa odloží a gél sa pretrepáva v reakčnom tlmivom roztoku pri teplote 37’C. V ďalšom stupni sa gél vyfarbí Coomassiovou modrosťou. Reakčný tlmivý roztok na 1 liter:
0,IM Tris/HCl, pH 7,5
0,5M chloridu sodného
0,2% Tritonu X-100
O/θ 9 jódfenylnitrofenyltetrazóliumchloridu '
0,05 g metylfenazíniummetosulfátu
0,65 g NAD g monohydrátu D (-(+)-glukózy Predinkubačný tlmivý roztok:
0,lM Tris/HCl, pH 7,5
0,5 M chloridu sodného.
Priemyselná využiteľnosť
Rekombinantné fúzne proteíny na jednoduchú a rýchlu detekciu akýchkoľvek proteínov/polypeptidov, ktoré s výhodou slúžia ako fúzne partneri a na rýchlu optimalizáciu expresných systémov, ktoré sú schopné expresovať uvedené proteíny/ polypeptidy.
Ii2Zoznam. sekvencií
Merck Patent GmbH <120> Glukózové dehydrogenázové fúzne proteíny a ich použitie v expresných systémoch <130> 9906920-Bz-mi <140>
<141>
<160> 16 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3992 <212> DNA <213> Bacillus megaterium <220>
<221> CDS <222> (186)..(968) <223> Glukózové dehydrogenáza z Bacillus magaterium <220>
<221> CDS <222> (978)..(1010) <223> Poly-histidín tag <220>
<221> gén <222> (1)..(3992) <223> Plazmid PAW2 <400> 1 ______ . ----ccatcgaatg gccagatcat zaattcctaa tttttcttga tactctatca ttgatagact 60 tattétacca ctccctatca gtgatagaca aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct 120 acataacgag gccaarcgat gaa::cgacc zzggzazzzg gggazcczzz qacczcgazz 13C
tccac at g ca z aca ga t r: a aaa c= z aaa gca gz r sca ar t aca gg τ gca 230
Me = -y z Thr Asp Ls iu lys As z Ly ’s Val Va 1 Val 11 e Th ir Gly Gly
1 3 ΐ 0 t -
cca aca gg: cca cca CCC qca acg * 9~- ege ::c 995 caa gaa caa 273
Ser Thr Gly Leu GÍy Arg .-1b ••ta· * · « val Arg Phe Gly Gin Glu Glu
20 i; 30
gca aaa get att aac CaX cac aac caa caa gaa get cca cat 326
Ála Lys Val Val * ?.sr. Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Ala Leu As?
25 40 45
9=9 aaa aaa gaa gta gaa aaa aca 99= gga caa gca atc are ζζ* caa 374
Ala Lys Lys Glu Val Glu Čiu Ala Gly Gly Gir. Λ 1 n — a íle íle Val Gin
50 55 60
gac Gly gat gta aca Thr aaa Lys gaa aaa Glu Glu 70 gac Asp gtc gta. aaz cct Asn Leu 75 get Val caa aca get 422
Aso 65 Val Val Val Gin Thr Als
att aaa gaa ctt g?“ aca tta gac gta atg att aac aac get gge get 470
íle Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Mez íle Asn Asn Ala Gly Val
80 85 90 95
gaa aac cca get cct cct cat gag cta ret cta gat aac tgg aac aaa 518
Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys
100 105 110
gtt att gac aca aac tza aca ggt gca tzc cca gga age cgt gaa gca 566
Val Zle Aso Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala
115 120 125
atc aaa tac tec gtc gaa aac gac att aaa gga aat gtt acc aac atg 614
Zle Lys Tyr Phe Val Glu Asn Aso Zle Lvs Gly Asn Val lle Asn Met
130 * 125 140
cct acc gtt cac gaa acg att cct CuS cca tta ttt gtt cac tac gca 662
Ser Ser Val His Glu Met íle Pro Pro Leu Phe Val His Tyr Ála
145 150 155
gca agt aaa gcc ggc atg aaa cz a atg acg gaa aca ttg get cct gaa 710
Ala Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Ma ζ T^.r Glu Thr Leu Ala Leu Glu
160 165 170 1“5
cat ccg cca aaa gg~ atc ege gta aat aat atc gga cca gg“ gcg atg - 758
Tyr Ala Pro Lys Gly íle Arg Val Asn Asr. Zle Gly Pro Glv Ala Mez
180 185 190
aac aca' cca att aac gca gag aaa zzz gca gat cca gaa caa cgt gca 806
Asn Thr Pro íle Asn Au. a Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gin Arg Ala
195 200 205
gac gca gaa acc acc acz cca atg Tí- tac atc $?z aaa cca caa gaa 854
Aso /Val Glu Ser Met Zle Pro Met Gly Tyr Zle Gly Lys Pro Glu ^· ··
210 215 220
g-a gca gca gtc gca gca zzc tza g= cca cca caa cca age gca 902
Val Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Glr. Aia Ser Tvr Val
225 230 235
aca ggc atc aca X* a zzz cca cac ccc gg- «3 acg aaa cac cct tcz 950
Thr Gly Zle Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Mec Thr Lys Tyr Pro Ser
240 245 ' 250 255
ccc caa gca gga aca ggc zaa zaga gc g cz a zg aga gga t: tg cat cí sc cat 1001
Phe Gin Ala Gly Gly Ä la Met A rg G ly Ser Hjls E: Ls His
260 2 éô
cac cac cac caa tagaagc tzga cczg zg aagcg aaaaa tg gcgcacac 1CÔ0
His His His
270 tgtgcgacat ttzzcctgzc tgccgttzac cgczaczgcg tcacggacct ccacgcgccc 1110 tatagcggcg caccaagcgc zzzgggzgzg gcggzzaccc gcagcgtgac cgctacaczt 1170 x
gccagcgccc tagcgcccgc tcctctcgcc ttctcccctt cczttczcgc cacgctcccc 1230
ggctttcccc gccaagctcz aaazcggggg czccczztag ggzzzcgatc tagzgczzza 1290
cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtz cacgtagtgg gccatcgccc 1350
tgatagacgg Etztccgccc tczgacgttg gagzccacgz zcztcaazag tggaczcttg 1410
tzccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtccatt czzzcgattt ataagggatt 1470
ttgccgattr cggcctazzg gztaaaaaat gagctgazzz aacaaaaatt taacgcgaat 1530
tttaacaaaa • tattaacgct tacaatEEca ggcggcaccz ttcggggaaa tgzgcgcgga 1590
acccctattt gtxxatzttt czaaatacat tcaaacatgt azccgcccaz gagacaataa 1650
ccccgacaaa tgcttcaata ataztgaaaa aggaagagza tgaczattca acaztzccgz 1713
gccgccctta ttccctcttt zgcggcactz zgcozzccz g tztzzgctca cccagaaacg 1770
ctggzgaaag taaaacatgc tgaagatcag zzgggzgcac cagzgggzza catcgaactg 1830
gaúcccaaca gcgguaagaz cctzgagagz tzzcccszsg aagaacgztt tccaatgazg 1890
agcactttta aagztctgcz azgzggcgcg gtattazccc gzatzgacgc cgggcaagag 1950
caactcggzc gccgcataca ztattztcag aazgaczzgg tzgactactc accagzcaca 2010
gaaaagcatc ťcaccgatgg catgacagta agagaatcat gcagtgczgc cataaccatg 2070
agzcataaca czgcggccaa czzaczzczg acaczga^og gacgaccgaa ggagccaacc 2130
gcctczzzgc ecaacatgcg ggazcatgca aczcczzzzg atcgztgcga accggagczg 2190
aazgaagcca taccaaacca sgagcgzgac accacgatgc czgcagcaat ggcaacaacg 2250
ttgcgcaaac // tattaacrgg cgaaztaczz se:zzagzzz cccggcaaca aztgazagac 2310
tgcatgcagc cggataaagz zzzaggacza r· “ r **** U - - — 4.^*»^ W «. cggcczctcc ggccggczgg 2370
tzzaztgczg ataaazctgc agzcggzgag zgzggczczz ccggzatcaz zgcagcaczg 2430
cggccagatg gzaagcczzz ccgzazzgca gzzazczaca cgacggggaa tcaggcaact 2490
azggatgaac gaaacagaca gatcgczgac azagczgccz caczgattaa qcattgczag 2 = 50
gaattaatga tgtctcgzzz ägacaaaagz ôäSCCCäCCd acagcgcatz agagczgccz 2610
aacgaggtcg aaatcgaagg zzzaazaazz cgzsdactcg czcagaagcz agczgtagag 2670
cagcctacat tgcaztggca tgzaaaaaat aaccgggcxt tgczcgacgc cczacccatz 2730
gagatgttag ataggcacca zaczcacczz C C CCC ta úCf aaggcgaaag ctggcaagar 2790
tttzzacgta azaacgczaa aaczzzzaga ta«^x^cC\.uac zaagtcazcg cgazggagca 2850
aaagtacatt taggtacazg gcc'acagaa aäaCaCXBC^ aaaczczcga aaatcaacta 2910
gcctztzzat gecaacaagg ztztzzazza gacaacgcat zazacgcact cagcgcagtg 2970
gggcatccta ctttaggttg cgtatzggaa gatcaagagc atcaagccgc taaagaagaa 3030
aggcaaacac ctactaccga cagcacgccg ccactactac gacaagctar cgaartattt 3090
gatcaccaag gtgcagagcc agccttccca tzcggccttg aatxgaccat atgcggatca 3150
gaaaaacaac ttaaatgtga aagcgggtcc caaaagcagc ataacctctz tccgtgacgg 3210
taactccact agtctaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatcz catgaccaaa 3270
atccčtraác gtgagttttc gttccactga ccgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3330
tcttcctgag atcctctttr tccgcgcgta acctgczgcz tgcaaacaaa aaaaccaccg 3390
ctaccagcgg tggttcgttt gccggaccaa gagctaccaa ctctctcccc gaaggtaacs 3450
ggczccagca gagcgcagac accaaatacc gtccttctag zgtagccgua gttaggccan 3510
cactccaaga actczgtagc accgcctaca tacctcgctc cgctaatccz gzzaccagtg 3570
gctgctgcca gtggcgacaa * gtcgsgccct accgggrtgg aczcaagacg aeagetaerg 3630
gataaggcgc agcggtcggc ctgaaccggg ggctcgzgca cacagcccag cztggaccca 3690
acgacctaca ccgaactgag atacccacag egugagetat gagaaagcgc cacgctzccc 3750
gaagggagaa agg=ggacag gtatccgcta agcgccacgc tcggaacagg agagcgcacg 3810
aggcagctzc caggcggaaa cgcctggtat ctctazaczc ctgrcgggct tcgccacczc 3B70
zgacctgagc gtcgatcttz gtgatgctcg -caggggggc ggagcctatc gaaaaacgcc 3930
agcaacgcgc cezcxtzacg gctcccggcc ctzzgczggc czztcgctca catgacccga 3990
ca. 3992
<210> 2 <211> 272 <212> PRT <213> Bacillus magaterium (GlcDH-polytag fúzny proteín) <400> 2
Me“. Tyr ΐϊ* Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val íle Thr Gly GLv Ser
1 e 1C 15
Thr Gly Leu Gly Arg Aia Met Ala Val Arg Phe Gly Gin Glu Glu Ala
2Č 25 30
Lvs Val Val íle Asn Tyr Asn Asn Glu GLu Glu Ala Leu Asp Ala
35 4C 45
Lys Lvs Glu Val Glu Glu Ale Gly Gly Gin * · a m—o Zie íle Val Gin Gly
50 • 55 60
Asn Val Thr Lys Glu Glu Asp Val VaÁ Asn Leu Val Gin Thr Ala Íle
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met 2Le Asn Asn Ala Gly Val Glu
95 9C 95
r ♦
J?
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys Val
100 105 110
íle Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala íle
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp íle Lys Gly Asn Val íle Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Met íle Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
e 165 170 175
Ala Pro Lvs Gly íle Arg Val Asn Asn íle Gly Pre Gly Ala Met Asn
180 135 190
Thr Pro íle Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gin Arg Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met íle Pro Met Gly Tyr íle Gly Lys Pro Glu Glu Val
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gin Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly íle Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe
245 25C 255
Gin Ala Gly Arg Gly Ala Met Arg Gly Ser His His His His His His
260 265 270
<210> 3 <211> 4193 <212> DNA <213> Bacillus magaterium + Heamenteria ghilianii fúzny gén <220>
<221> gén <222> (1)..(4193) <223> Plazmid PAW4 <220>
<221> CDS <222> (141)..(344) <223> Tridegin <220>
<221> CDS <222> (387)..(1169) <223> Glukózová dehydrogenáza <220>
<221> CDS <222> (1179)..(1211) <223> Poly-histidín tag
<400> 3 ccatcgaatg gccacatgat taattcctaa tttttgttga cactctatca ttgatagagt 60 tattctacca ctccctatca gtgacagaga aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct 120 agataacgag ggcaatcgat atg aaa cta ttg ccz tgc aaa gaa tgg cat caa 173 Met Lys Leu Leu Pro Cys Lvs Glu Trp His Gin
5 * 10
ggt att cct aac cct agg tgc tgg tgt 999 get gat cta gaa tgc gca 221
Gly Zle Pro Asn Pro Arg Cys Trp Cys Gly Ala Asp Leu Glu Cys Ala
15 20 25
caa gac caa tac tgt gcc ttc aca cct caa “U“ aga cca aga t sa gaa 269
Gin Asp čln Tyr Cvs Ala Phe Zle Pro Gin Cys Arg Pro Arg Ser Glu
30 35 40
ctg att aaa cct atg gat gat ata tac caa* aga cca gtc gag ttt cca 317
Leu Zle Lys Pro Met Asp Aso XL* Tyr Gin Arg Pro Val Glu Phe Pro
45 50 55
aac cct cca tta aaa cct agg gag gaa agcgctatga gacgatcgca 364
Asn Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu Glu
60 65
416 tcaccatcac catcacctgc ag atg cat aca gat t ta aaa gat aaa cta get Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val 70 75
gta att aca ggt gga tca aca ggt tta gga ege gca atg get gtt cgt 464
Val Zle Thr Gly Gly Ser Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Are
80 35 90
ttc ggt caa gaa caa gca aaa gtt gtt Btt aac tat tac aac aat gaa 512
Phe Gly Gin Glu Glu Ala Lys Val Val Iie Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu
95 10C 105 11C
gaa gaa get cta gat gcg aää aaa gaa gta gaa gaa gca ggc ega caa 560'
Git/ <Glu Ala Leu Aso Ala Lys Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Gin
115 120 125
gca atc atc gtt caa ggc cat gta aca aaa gaa gaa cac gtt gta aat 608
Ala · a Zle Val Gin Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn
130 13= 140
ctt get caa aca get att aaa gaa ttt cct aca cca gac gta atg att 656
Leu Val Gin Thr Ala Zle Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Zle
145 250 155
aac aac get ggt gtt gaa aac cca gtt CCC tcc cat «ag cta V» W te * cta 704
Asn Asn Ala Gly Val Glu As.. Pre Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu
160 165 170
gat aac tgg aac aaa M a:: gat aca aac tta aca ggt gca ttc tta 752
Aso Asn Trp Asn Lys Val Zle Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu
175 180 185 130
gga agc cgt gaa gca att aaa tac ttc gtt gaa aac gac att aaa 800
Gly Ser Arg Glu Ala Zle Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Zle Lys Gly
ŕ·.J.3 IXe L.ys ·/· sr.ic non nju ne
195 200 ’ 205 w sr
aat gtt atc aac atg tet age 9=t cac gaa atg att cct tgg cca tta 848
Asn Val íle Asn Met Ser Ser Val His Glu Met íle Pro Pro Leu
210 215 220
ttt gcc cac tac gca gca agt aaa ggc gg- atg aaa cca atg acg gaa 896
Phe Val Ex s Tyr Ala Ala Ser Lvs Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu
225 230 235
aca rtg get ctt gaa tat gcg cca aaa ggt att ege gta aat aat att 944
Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly íle Arg Val Asn Asn Zle
240 245 250
gga cca ggt gcg atg aac aca cca att aac cca gag aaa vw t gca gat 992
Gly Pro Giy Ala Met Asn Thr Pro Zle Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp
255 260 265 270
cca gaa caa cgt gca gac gta gaa age atg att cca acg tac atc 1040
Pro Glu Gin Arg Ala Asp Val Glu Ser Met íle Pro Met Gly Tyr íle
275 2'80 285
ggt aaa cca gaa gaa gta gca gca ctt cca gca -£3 tta get tC8 cca 1088
Gly Lys Pro Glu Glu val Ala Ala Val Ala Phe Leu Ala Ser Ser
290 295 3J0
caa gca age taz ota aca ggt att aca tza t U t gca gac ege ggt atg 1136
Gin Ala Ser Tyr Val Thr Gly íle Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met
305 310 315
acg aaa tac cez tet ztc caa gca gga aga gcc taatagagc get atg aga 1187
Thr Lys Tyr Pro Ser Phe Gin Ala Gly Arg Gly - Ala Met Arg
320 325 330
gga tcg c'at cac cat cac cat cac taatacaagc ztgaectgtg aaatgaaaaa 1241
Gly Ser Hxs Hl s His Hl s His His
335 34G
zggcgcacat tgtgcgacaz ttzttztgzc tcccgttcac cgccaczgcc ccacggatcz 13C1 ccátgcgccc zgtagcsgcg catzaagcgc ggcgggtgzg gtggztacgc gcaccgcgac 1351 cgctacactt gccagccccc tagcccccgc tccttzcgct ttczzccctt cctttctcgc 1421 cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagcrct aaatcggggg ctccctttag ggztccgatt 1481 tagtgcttta cggcacctcc accccaaaaa acctgatzag ggtgatggtt cacgtagtgg 1541 gccatcgccc tgacagacgg tzttzcgccc tttgacgttg gactccacgt ccctzaatag 1S01 tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccczatc tcggtctatt cttttgatzt 1661 araagggatt ttgccgattt cggcctaczg gctaaáaaat gagctgatrt aacaaaaatt 1721 taacgcgaat tctaacaaaa tattaacgct tacaatttca ggtggcactt zzcggggaaa 1731tgtgcgcgga acccctattz gtttactttt ctaaatecac tcaaatatgt atccgctcac 1841 gagacaataa ccctgataaa zccttcaata atatccaaaa aggaagagta tgagtattca 1901 acattzccgr gtcgccccta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgczca 1961
cccagaaacg ccggtgaaag taaaagatgc tgaagaccag czgggtgcac gagcgggcca 2021
cazcgaacig gaccecaaca gccgtaaca c zzzzsagacz ccccgccccg aagaacgczt 2081
tccaatgatg agcactztca aagztctgct atgtagcgcg gcactatccc gtattgacgc 2141
cgggcaacag caactcggtc gccgcacaca ctatzctcag aacgacctgg ttgagtactc 2201
accagtcaca gaaaagcacc Ecacggacgg cazgacagca agagaacta“ gcagcgctgc 2261
cataaccatg agtgacaaca ctgcggccaa ctcactzccg acaacgatcg gaggacegaa 2321
gcagctaacc gcctccccgc acaacatgcg ggatcacgza aczcgccccg accgtzggga 2381
accggagctg aatgaaccca taccaaacga cgagcgcgac accaegatgc ccgcagcaac 2441
ggcaacaacg tcgcgcaaac cactaaccgc ccaactaczz aczctagccz cccggcaaca 2501
atcgatagac tggacggagg cggataaagt cgcaggacca cccccgcgct cggccctccc 2561
ggczggczgg tttaccgccg azaaazczcc agccsgcgag cgzggczczc gcggtaccat 2621
zgcagcaczg ggaccagacg gcaagccctc ccgcaccgta gccacccaca cgacggggag 2681
Ecacgcaacz atggatgaac gaaacagaca gatcsccgag ataggtgcc’ cactgattaa 2741
gcazzggzag gaazzaazga zgzczcqzzz agataaaagt aaagtgazza acagcgcatz 2801 agagczgctt aatgaggccg gaatcgaagg zztaacaacc cgtaaactcg cccagaagcc 2861
acgcgtagag cagcczacac tgcatcgcca zccaaaaaac aagcgggccx tgcccgaccc 2921
cctagccat: gagatgtcag ataggcacca cacccacstc tgccccccac aaggggaaag 2951
ctggcaagat ctzccacgza a ~ a a cg c c a a aagctaga tgzgczttac taagtcaccg 3041
cgatggagca aaagzacac; zaggtacacg gcccacacaa aaacagtacg aaaczcccga 3101
aaaccaacca /,> gccczcccac gccaacaagg zzzzccacca gagaacgcac cacacgcacz 3161
ÍZ cagcgcagtg gggcazztca ctrzaggzzg cgcac^ggaa cazcaagaac atcaagcccc 3221
caaagaacaa acggaaacac ccaczaccga zagcaccccc czazzazzae gacaacczat 3281
cgaatcattc gazcaccaag gcgcagagcc agcctzczza zzzqgcczzg áactgatcat 3341
atgcggacta gaaaaacaac ccaaacgtga aagtgcgzcz taaaagcagc acaaccztcc 3401
zccgtgacgg zaacczcacz agrtzaaaac gatccagccg aagatcctzc zcgacaatcc 3461
catgaccaaa atcccttaac gtgagtzzzc gzzccaczga gcgccagacc ccgzagaaaa 3521
gatcaaagga zczcczcgag acccccxz-c tczgcccgta atccgctccE gcaaacaaa 3581
aaaaccaccg ccaccagcgc zggzzzgzzz gccggazcaa gagccaccaa ccctzzzccc 3641
gaaggtaacc gcczxcagca cagcccagaz accaaatact gcccztccag zgcagccgca 3701
gtzaggccac cacttcaaga accccczaca zaccccgctc tgctaaccct 3761
gtzaccagcg actgctgcca gcggcgazas gxcgc^bC.w accgggczgg actcaagacg 3821
7,
atagttaccg gataaggcgc agcggccggg ctgaacgggg ggttcgtgea cacagcccag 3381
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacccacag cgtgagctat eagaaagcgo 3941
cacgcttccc gaagggaaaa aggcggacag gtateoggta agcggcaggg tcggaacagg 4001
agagcgcaeg aggcagcttc cagcgggaaa cgcctggtat cnttaractc ctgtcgcgtt 4061
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt tcaggggggc ggagcctatg 4121
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gzccctggcc ttttgctggc cttttcctca 4181
catgacccga ca 4193
<210> 4 <211> 340 <212> PRT <213> Bacillus magaterium + Beamenteria ghilianii fúzny gén
_* — — —
Met Lys Leu Leu Pre Cys Lys Glu TrD His Gin Glv íle Pro Asn Pro
1 5 10 15
Arg Cys Trp Cys Glv Ala Asp Leu Glu Cys Ala Gin Asp Gin Tyr Cys
20 25 30
Ala Phe íle Pro Gin Cys Arg Pro Are Ser Glu Leu íle Lys Pro Met
35 40 45.
Asp Asp íle Tyr Gin Arg Pro Val Glu Phe Pro Asn Leu Pro Leu Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Met TU - Asp Leu Lys Asp Lys Val Val
65 70 *5
Val íle Thr Gly Gly Ser Th * Glv Leu Gly Ar; Ala Met Ala Val Are
80 w J 9C
í7 Phe Gly Gin Glu Glu Ala Lys Val Val lle Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu
95 100 .-2= 110
Glu Glu Ala Leu Asn Ala Lys Lvs Glu Val Glu Glu Ala Gly Glv Gin
115 120 125
Ala íle íle Val Gin Gly Asp Val Thr Lvs Glu Glu Asp Val Val Asn
130 • .-3= 140
Leu Val Gin Thr Ala íle Lys Glu Phe Gly Thr Leu Aso Val Njft r íle
145 150 155
Asn Asn Ala Gly Val Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu
160 165 7C
Asp Asn Trp Asn Lys Val íle Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu
175 180 18 = 190
Gly Ser Arg Glu Ala íle Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp íle Lys Gly
195 200 205
kC
Asn Val íle Asn Met Ser Ser Val His Glu Met íle Pro Trp Pro Leu
210 215 220
Phe Val His Tyr Ala Ala Ser Lvs Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu
««ď 230 235
Thr Leu Ala Leu Glu 7y · Ala Pro Lys Gly íle Arg Val Asn Asn íle
240 245 250
Gly Pro Gly Ala Met Asn Thr Pro íle Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asd
255 260 265 270
Pro Glu Gin Arg Ala Asp Val Glu Ser Met Zle Pro Met Gly Tyr Zle
275 280 285
Gly Lys Pro Glu Glu v'al Ala Ala Vai Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser
290 295 300
Gin Ala Ser Tyr Val • ··— Gly íle Thr L'eu Phe Ala Asp Gly Gly Met
305 310 315
Lys Tyr Pro Ser Phe Gin Ala Gly Arg Gly Ala Met Arg Gly Ser
320 325 330
His His His His His His
335 340 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221> prajmerová väzba <222> (1)..(32) <223> Prajmer 1, GlcDH <220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer
<400> 5 gcgcgaattc atgzatacag atttaaaaac ac <210> 6 ...... <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia 32
<220> <221> prajmerová väzba <222> (1)..(31) <223> Prajmer 2, GlcDH
<220> <223> Opis umelej sekvencie: prajmer t
<400> 6 ccgcttcgaa ctattagtcc cttcctgctt g 31
52.
<210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer <400>_7 gcgcctgcag atgracacag atttaaaaga “ <210> 8 <211> 31 <212> DNA i <213> Umelá sekvencia <220>
<221> prajmerová väzba <222> (1)..(31) <223> Prajmer.4, GlcDH . .
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer <400> 8 gcgcagcgct ctattagcct czteczgcrt g <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> ’ <221> prajmerová väzba <222> (1)..(31) <223> Prajmer 5, Tridegin <220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer <400> 9 gcgcaúcgac atgaaactat -gcctzgcaa a <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221> prajmerová väzba <222> (1)..(31) ' <223> Prajmer 6, Tridegin · <220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer %
_ <400> 10 gcgcccccag gtgacggtga tggzgacgcg a <210> 11 <211> 22 . <212> DNA . .
<213> Umelá sekvencia <220>
- <221> prajmercvá väzba <222> (1)..(22) <223> Prajmer 7, pASK 75OPN <220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer <400> 11 ceatcgaatg gccagacgac ca <210> 12 <211> 21<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221> prajmercvá väzba <222> (1)..(21) . . <223> pASK 75RPN <220>
' <223> Opis umelej sekvencie: prajmer <400> 12 .....
cagcgccaaa ccgcagacaa a <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221> prajmerová väzba <222> (1)..(20) <223> Prajmer 9, T7 Seq.
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer <400> 13 caacacgact caccacaggg <210> ’ΐϊ <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>.
<221> prajmerová väzba <222> (1)..(28) <223> Rev. Seq.
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: prajmer <400> 14 tagaagg'các agtegagg fľ 'Ι'.ψ-ϊ—φΟ'} r · r r ·* r r · - r * r r r r * *

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Rekombinantný fúzny proteín, skladajúci sa z aspoň prvej a druhej sekvencie aminokyselín, vyznačujúci sa t ý m, že prvá sekvencia má biologickú aktivitu glukózovej dehydrogenázy.
  2. 2. Rekombinantný fúzny proteín podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že druhou sekvenciou je akýkolvek rekombinantný proteín/polypeptid X alebo jeho reprezentatívne časti.
  3. 3. Rekombinantný fúzny proteín podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že môže mať prídavné aspoň jednu rozpoznávaciu sekvenciu (tag sekvenciu”) vhodnú na detekciu.
  4. 4. DNA, vyznačujúca sa tým, že kóduje fúzny proteín podlá nároku 1 až 3.
  5. 5. Expresný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje DNA podlá nároku 4.
  6. 6. Hostiteľská bunka na expresiu rekombinantných proteínov/polypeptidov, vyznačujúca sa tým, že obsahuje expresný vektor podlá nároku 5.
  7. 7. Použitie glukózovej dehydrogenázy ako detektoru akéhokoľvek rekombinantného proteínu/polypeptidu X vo fúznom proteíne podlá nároku 1 až 3.
  8. 8. Použitie glukózovej dehydrogenázy v detekčnom systéme na expresiu rekombinantného proteínu/polypeptidu X ako zložky fúzneho proteínu podľa nároku 1 až 3.
  9. 9. Použitie glukózovej dehydrogenázy na detekciu interakcií proteín-proteín, kde jeden partner zodpovedá rekombinantnému proteínu/polypeptidu X podlá nároku 1 až 3.
  10. 10. Použitie glukózovej dehydrogenázy vo fúznom proteíne podlá nároku 1 až 3 ako detektoru proteínu pre ktorýkolvek tretí proteín/polypeptid, ktorý nie je zložkou fúzneho proteínu podlá nároku 1 až 3 a je schopný viazať sa na druhú sekvenciu proteínu/polypeptidu X v uvedenom fúznom proteíne.
  11. 11. Použitie expresného vektoru podlá nároku 5 na optimalizáciu expresie rekombinantného proteínu/polypeptidu X v rekombinantnom procese prípravy.
  12. 12. Použitie hostitelskej bunky podlá nároku 6 pri optimalizácii expresie rekombinantného proteínu/polypeptidu X v rekombinantnom procese prípravy.
  13. 13. Spôsob na rýchlu detekciu akéhokolvek rekombinantného proteínu/polypeptidu X gélovou elektroforézou, vyznačujúci sa tým, že fúzny proteín podlá nároku 1 až 4 je pripravený a frakcionovaný gélovou elektroforézou a rekombinantný proteín/polypetid, určený na detekciu v géli, je zviditeľnený emzymatickou aktivitou glukózovej dehydrogenázy.
  14. 14. Spôsob podlá nároku 13,vyznačujúci sa tým, že ako gélový elektroforézny spôsob je použitá SDSpolyakrylamidová gélová (SDS-PAGE) elektroforéza.
  15. 15. Spôsob podlá nároku 13,vyznačujúci sa tým, že na detekciu enzymatickej aktivity glukózovej dehydrogenázy je použitá farebná reakcia založená na tetrazóliových soliach.
  16. 16. Spôsob podlá nároku 15,vyznačujúci sa tým, že ako tetrazóliová sol je použitá jodofenylnitrofenylfenyltetrazóliová sol (INT) alebo nitro modrá tetrazóliová sol (NBT).
  17. 17. Spôsob podlá nároku 13 až 16, vyznačuj úci sa t ý m, že špecifické zafarbenie glukózovej dehydrogenázy je nasledované celkovým vyfarbením proteínu.
SK1174-2001A 1999-02-19 2000-02-08 Glukózové dehydrogenázové fúzne proteíny a ich použitie v expresných systémoch SK11742001A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19906920 1999-02-19
PCT/EP2000/000978 WO2000049039A2 (de) 1999-02-19 2000-02-08 Glucose-dehydrogenase-fusionsproteine und ihre verwendung in expressionssystemen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK11742001A3 true SK11742001A3 (sk) 2002-03-05

Family

ID=7897979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1174-2001A SK11742001A3 (sk) 1999-02-19 2000-02-08 Glukózové dehydrogenázové fúzne proteíny a ich použitie v expresných systémoch

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20050112744A1 (sk)
EP (1) EP1155130A2 (sk)
JP (1) JP2002538782A (sk)
KR (1) KR20010103017A (sk)
CN (1) CN1340104A (sk)
AR (1) AR022630A1 (sk)
AU (1) AU771320B2 (sk)
BR (1) BR0008370A (sk)
CA (1) CA2368461A1 (sk)
CZ (1) CZ20012739A3 (sk)
HU (1) HUP0200285A2 (sk)
NO (1) NO20014011L (sk)
PL (1) PL350574A1 (sk)
SK (1) SK11742001A3 (sk)
WO (1) WO2000049039A2 (sk)
ZA (1) ZA200107686B (sk)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1458866B1 (de) * 2001-12-21 2008-03-26 Curacyte AG Modifizierte tridegine, ihre herstellung und verwendung als transglutaminase-inhibitoren
MXPA06001719A (es) 2003-08-11 2006-05-19 Codexis Inc Polipeptidos de glucosa deshidrogenasa mejorados, y polinucleotidos relacionados.
EP2010649B1 (en) * 2006-04-13 2017-03-08 Roche Diabetes Care GmbH Improved mutants of pyrroloquinoline quinone dependent soluble glucose dehydrogenase
CN110894504A (zh) * 2019-12-20 2020-03-20 武汉茵慕生物科技有限公司 强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60141299A (ja) * 1983-12-28 1985-07-26 Wako Pure Chem Ind Ltd 脱水素酵素の活性度測定法
JPS63230098A (ja) * 1987-03-18 1988-09-26 Fujitsu Ltd 酵素の分析方法
DE3711881A1 (de) * 1987-04-08 1988-10-27 Merck Patent Gmbh Verfahren zur herstellung von glucosedehydrogenase aus bacillus megaterium
DE69731317T2 (de) * 1997-02-07 2006-02-23 Kaneka Corp. Neue carbonyl-reduktase, gene welche diese kodieren und methoden zu deren verwendung
US6399859B1 (en) * 1997-12-10 2002-06-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant uridine diphosphate-glucose dehydrogenase genes, proteins, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200107686B (en) 2002-12-18
AR022630A1 (es) 2002-09-04
WO2000049039A2 (de) 2000-08-24
NO20014011D0 (no) 2001-08-17
KR20010103017A (ko) 2001-11-17
CZ20012739A3 (cs) 2001-11-14
HUP0200285A2 (hu) 2002-05-29
CA2368461A1 (en) 2000-08-24
NO20014011L (no) 2001-10-02
US20050112744A1 (en) 2005-05-26
BR0008370A (pt) 2001-11-06
AU2546800A (en) 2000-09-04
WO2000049039A3 (de) 2000-12-14
AU771320B2 (en) 2004-03-18
EP1155130A2 (de) 2001-11-21
JP2002538782A (ja) 2002-11-19
CN1340104A (zh) 2002-03-13
PL350574A1 (en) 2002-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002330756B2 (en) System for detecting protease
Sanders et al. Transport of cytochrome c derivatives by the bacterial Tat protein translocation system
Chen et al. Expression hierarchy in the Yersinia type III secretion system established through YopD recognition of RNA
Gründling et al. Dimerization between the holin and holin inhibitor of phage λ
Francetic et al. Signal recognition particle-dependent inner membrane targeting of the PulG pseudopilin component of a type II secretion system
Smith et al. Purification and biochemical characterization of the lambda holin
KR20190013627A (ko) 재조합 콜라겐의 수산화를 제어하기 위한 효모 균주 및 방법
KR102579209B1 (ko) 단백질 발현 및 전달을 위한 조성물 및 방법
JPH08507686A (ja) 遺伝子操作酵素及びそれらの診断アッセイ用結合体
EP2216414B1 (en) Cell-free translation system
SK11742001A3 (sk) Glukózové dehydrogenázové fúzne proteíny a ich použitie v expresných systémoch
US20080193921A1 (en) Methods to identify agents that bind the flap-tip helix of RNA polymerase
CN111269324A (zh) 高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白及其应用
Dellis et al. Protein interactions among the vaccinia virus late transcription factors
WO2017130610A1 (ja) 融合タンパク質及びそれを用いた抗原の検出方法
CA2452849C (en) Method for monitoring and modulating protein folding
US20210163899A1 (en) Fusion proteins for the detection of apoptosis
Wang et al. A unique approach for high level expression and production of a recombinant cobra neurotoxin in Escherichia coli
WO2015106067A2 (en) Lucigen yellow (lucy), a yellow fluorescent protein
MXPA01008380A (en) Glucose dehydrogenase fusion proteins and their utilization in expression systems
Coutard et al. Green fluorescent protein and factorial approach: an effective partnership for screening the soluble expression of recombinant proteins in Escherichia coli
JP5487570B2 (ja) 抗体と蛋白質との融合蛋白質の製造方法
EP1181377A2 (de) Proteinkonjugate auf basis von lumazinsynthase, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
Sakono et al. Preparation of Luciferase-fused Peptides for Immunoassay of Amyloid Beta
Ojima-Kato et al. Nascent MSKIK peptide prevents or releases translation arrest in Escherichia coli