KR102579209B1 - 단백질 발현 및 전달을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 향상된 단백질 발현 및/또는 폴딩을 촉진하는 환경을 제공하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위를 포함하는 가공된 열안정성 페리틴 조립체를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 야생형 페리틴 소단위내에 존재하는 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여하고 있으며 여기서 가공된 조립체는 야생형 페리틴 조립체보다 더 낮은 염 농도에서 안정하다. 본 발명은 초고온성 아르카에오글로부스 풀기두스로부터 기원하는 페리틴 조립체에 의해 예시된다. 또한 폴리펩타이드를 캡슐화하고, 상기 가공된 페리틴 조립체를 대상체에게 전달 및 투여하기 위한 핵산, 조성물, 키트 및 방법이 청구되어 있다.

Description

단백질 발현 및 전달을 위한 조성물 및 방법

발명의 분야

본 발명은 향상된 단백질 발현 및/또는 폴딩(folding)을 촉진하는 환경을 제공하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 폴리펩타이드 및 핵산을 캡슐화(encapsulating)할 수 있는 가공된 열안정성 페리틴 조립체(ferritin assembly)를 제공한다. 본 발명은 또한 단백질 치료제의 전달을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

발명의 배경

신생(nascent) 폴리펩타이드로부터 기능성 단백질 구조까지의 경로는 목적 생성물의 성공적인 폴딩에 유리한 일부 작업, 및 이에 대한 많은 인자의 균형에 의해 측정된다(Hartl, F.U. and Hayer-Hartl, M., Nat. Struct. Mol. Biol.16, 574-581 (2009); Daggett, V. and A. Fersht, A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.4, 497-502 (2003)). 천연 샤페론(chaperone)은 폴딩되지 않거나 부분적으로 폴딩된 중간체의 응집(aggregation)을 방지하고, 생산적인 에너지 경로를 따라 폴딩을 편향시키는 특이적인 상호작용을 겪으며, 광범위한 시간 규모의 폴딩 공정을 수용하는 동적 효과를 발휘한다(Hartl, F.U. et al., Nature. 475, 324-332 (2011); Kim, Y.E. et al., Annu. Rev. Biochem.82, 323-355 (2013)). 재조합 단백질 발현은 기본 및 응용 생물학 둘 다에 대한 근간이다. 그러나, 폴딩되지 않은 중간체의 응집을 방지하면서 허용되는 폴딩 환경을 제공하기 위한 방법은 중심적인 도전으로 남아있다.

130 내지 300개 카피(copy)의 추가의 스캐폴드 단백질(scaffold protein) 외에, 코트 단백질(coat protein)의 420개의 카피로부터 조립된 P22 VLP 박테리오파지를 사용한 연구는 내부 표면 내에서 재조합 단백질의 격리(sequestration)를 나타내었다(Patterson, D.P. et al. Chem. Commun. (Camb). 49, 10412-10414 (2013)). 그러나, 캡시드로부터 단백질의 회수는 채택된 가혹한 조건으로 인하여 보다 도전적이고 단백질에게 해롭다(Comellas-Aragones, M. et al., Nat Nanotechnol.2, 635-639 (2007)).

따라서, 단백질 발현을 향상시키는 허용할 수 있는 폴딩 환경을 제공하는 방법에 대해 유의적으로 충족되지 않은 요구가 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 부분적으로, 신생 폴리펩타이드를 24개 소단위(subunit)로 제조된 가공된 페리틴 조립체(가공된 페리틴 조립체)인, 가공된 나노캡슐화제(nanoencapsulator: NE) 쉘(shell)로 둘러싸는 것에 의한 기능성 폴리펩타이드 발현 방법의 개발을 기반으로 한다. 본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 기능성 폴리펩타이드의 생성을 위한 전도성 나노환경을 동시에 제공하면서 세포내 응집으로부터 캡슐화된 폴리펩타이드를 보호한다. 이론에 얽메이지 않고, 내부화된 기질에 대한 단단한 입체적 및 정전기적 상보성은 정확하게 폴딩된 3차 구조를 안정화시키면서 폴딩 공정 동안에 응집을 방지한다. 더욱이, NE는 광범위한 변성제에 대해 보호성이며 향상된 열안정성을 제공한다. 발현 숙주(예컨대, 이. 콜라이(E. coli))를 사용하여, 가용성의 목적한 단백질(protein-of-interest: POI)-NE 복합체를 정제하여 이황화물 산화, 단백질분해성 퇴화(proteolytic degradation)로부터의 보호, 및 예컨대, 이. 콜라이 세포질 속에서는 정상적으로 획득할 수 없었던, 봉입체 형성(inclusion body formation)의 예방과 같은 기능을 수행하도록 수성 완충액 속에서 조작할 수 있다. 본원에서 또한 입증된 바와 같이, 가공된 페리틴 조립체는 캡슐화된 폴리펩타이드의 조절된 방출을 위해 설계될 수 있다. 또한, 가공된 페리틴 조립체를 사용하여 캡슐화된 폴리펩타이드를 표적 세포내로 전달할 수 있다. 가공된 페리틴 조립체를 또한 사용하여 핵산 또는 소 분자를 캡슐화하여 전달할 수 있다.

신생 폴리펩타이드의 나노환경을 조정하기 위한 플랫폼(platform)으로서, 나노캡슐화를 단백질 폴딩의 기본 연구 및 단백질 생산 내의 응용된 용도 둘 다에서 적용할 수 있다. 열안정성 쉘 내에서 단일 폴리펩타이드를 캡슐화하는 능력은 나노기술, 치료학적 단백질 전달, 및 효소 및 다른 기능성 단백질의 일반적인 조작에 대한 관련성을 가질 수 있다.

본 발명의 변화는 핵산을 가공된 나노캡슐화제(NE) 쉘로 둘러싸는 것을 포함한다.

도면의 간단한 설명
도 1a 내지 도 1c는 나노캡슐화제(NE) 쉘의 가공을 나타낸다. 도 1a. 외부 쉘, 4개의 ~4.5 nm 세공(pore) 중 하나, 및 디지털 방식으로 제거된 6개의 소단위를 지닌 대안적 시각화 및 쉘의 수성 용적 내부의 서양고추냉이 퍼옥시다제 동종효소 C(HRPC)의 제공된(rendered) 표면을 나타내는 24-소단위 AfFtn 조립체의 표면 묘사. 도 1b. C-말단 절단(C-terminus truncation)의 안정화 효과의 동적 광 산란. 도 1c. 안정화된 절단을 사용한, pH-적정가능한 조립체 및 분해체(dissembly)를 생산한 추가의 F 내지 H 돌연변이. 표는 7개의 재조합적으로 발현된 쉘 및 가공된 돌연변이체에 대한 요약 데이타를 나타낸다. WT = 야생형, △C = C-말단 절단 돌연변이체, (+) = 순 양성 내부(net positive interior)를 지닌 돌연변이체, (-) = 순 음성 내부를 지닌 돌연변이체, "(+/-)" = 순 중성 내부를 지닌 돌연변이체, F116H = pH 민감성 돌연변이체. 모든 pH-적정가능한 쉘은 상응하는 △C 돌연변이체로부터 기원한다.
도 2a 내지 2d는 POI의 가용성 발현에 있어서 NE 쉘의 효과를 나타낸다. 도 2a. 기술용어의 도식도. 도 2b. His-태그된 단백질로서 발현된 GFPuv, NE 쉘과 함께 동시 발현된 His태그된 GFPuv (NE 소단위[링커]에 융합되지 않음), 양성, 중성, 및 음성 내부 쉘과 함께-동시발현된-NE 소단위에 대한 융합 단백질로서 NE 소단위이지만 쉘이 없는, His-태그된 GFPuv에 대한 융합 단백질(O.D.₆₀₀=0.8에서 유도됨)의 SDS 겔. 상응하는 웨스턴 블롯(Western blot)은 POI: GFPuv, HRPC, 및 루시퍼라제의 C말단에서 가공된 cMyc- 에피토프(epitope)에 대해 지시된 항체를 사용하여 링커 및 쉘의 존재하에서만의 가용성 발현을 입증한다. 도 2c. 정제된 복합체의 크기-배제 프로파일로서, 여기서 POI는 GFPuv, HRPC, 및 루시퍼라제이다. 모든 경우에, His-태그된 소단위는 조립체를 나타내는 NE 쉘과 함께 동시-정제한다. 도 2d. h6NE-POI 및 NE 소단위의 밴드를 나타내는 정제된 GFPuv, HRPC, 및 루시퍼라제의 SDS 겔.
도 3a 내지 3f는 POI의 기능성 발현에 대한 NE 쉘의 효과를 나타낸다. 도 3a. 형광분석법(여기: 395 nm 및 방출: 415-600 nm)에 의한 GFPuv 발현의 기능성 분석. 도 3b. D-루시페린, ATP, 및 Mg²⁺를 사용한 3개의 케이지(cage)(500 nM) 중에서 루시퍼라제 활성의 비교. 재조합 루시퍼라제(600 pM) 및 AfFtn△C(-)(500 nM)를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 재조합 루시퍼라제(도 3c) 및 h6NE-루시퍼라제(+/-)에 대한 루시퍼라제 활성의 동역학(도 3d). 동적 매개변수 Km 및 Vmax를 측정하였다. 도 3e. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 450 nm에서 HRPC 활성을 측정함에 의한 HRPC 발현의 기능성 분석. 도 3f. NE 내부에서 HRPC 활성에 대한 보조인자/첨가제의 효과. HRPC 활성은 보조인자인 칼슘 및 헤민 및 첨가제(산화제 및 환원제)의 존재하에서 동일한 조건 하에 가공된 세포 분해물로부터 평가하였다(n=3, 오차 바(error bar)는 ± S.D.를 나타낸다).
도 4a 내지 4c는 내부화된 펩타이드의 기능성 수율에 대한 tES 변이체의 효과를 나타낸다. 도 4a는 시험관내(in vitro) 폴딩을 사용한 GFPuv 활성에 있어서 tES(+) 소단위 대 tES-GFPuv의 상이한 몰 비의 효과를 나타낸다. 도 4b는 형광성, 흡광도, 및 발광성 각각의 측정에 의한 tES의 존재 및 부재하에서 시험관내 폴딩된 GFPuv, HRPC, 및 rLuc의 기능성 분석을 나타낸다. 도 4c는 형광성, 흡광도, 및 발광성 각각에 의해 측정한 동시-발현 조건의 조합 하에서 GFPuv, HRPC, 및 rLuc의 분석을 나타낸다(도 1b에 상세히 나타냄).
도 5a 내지 5e는 NE 쉘로부터 활성 단백질의 내부화 및 회수를 나타낸다. 도 5a. pH 8.0 및 5.8에서 F116HNE-GFPuv(+) 및 F116HNE-HRPC(+)의 크기 배제 크로마토그래피. 각각의 분획을 GFPuv 및 HRPC 활성에 대해 분석하고 데이타를 크로마토그램 위에 겹쳤다. 피크 2는 방출된 h6NE-GFPuv 및 h6NE-HRPC를 나타낸다. 도 5b. GFP 및 HRP의 내부화를 연구하기 위한 ELISA-기반 에피토프 보호 검정. 피크 2 분획을 사용한 ELISA 판독은 피크 1 분획과 비교하여 더 높았으며, POI가 쉘 내에서 발현됨을 나타낸다. 도 5c. TEV 프로테아제를 사용한 프로테아제 보호 검정으로서, 여기서 h6NE-GFPuvTEV(+) 및 h6NEGFPuvTEV는 TEV프로테아제로 처리하였다. 웨스턴 블롯팅은 프로테아제가 h6NE-GFPuvTEV를 절단하지만 h6NE-GFPuvTEV(+)를 절단하지 않음을 나타내며 GFPuv의 내부화를 설명한다. 도 5d. 항-c-Myc 항체를 사용한 동시-면역침전. h6NE-루시퍼라제(+/-), AfFtn△C-(+)(음성 대조군) 및 h6NE-루시퍼라제(양성 대조군)을 사용한 SDS 겔. 'FT' 및 'E'는 유동 통과(flow through) 및 용출물을 각각 나타낸다. 상응하는 웨스턴 블롯(하부)은 유동 통과 및 용출물 각각에서 h6NE-루시퍼라제(+/-) 및 h6NE-루시퍼라제에 대한 루시퍼라제 밴드를 나타낸다. 도 5e. NE. F116HNE-GFPuv(+), F116HNE-HRPC(+) 및 F116HNE-rLuc(+)로부터 활성 단백질의 회수물을 pH 5.8에서 케이지 브레이크(cage break)에 적용시켰다. 방출된 POI를 FXa로 단백질분해하여 GFPuv, HRPC 및 rLuc를 단리하였다. 웨스턴 블롯팅은 NE(+)로부터 POI의 단리를 확인하였다.(n=3, 오차 바(error bar)는 ± S.D.를 나타낸다).
도 6은 캡슐화된 POI(HRPC 또는 rLuc)의 안정성에 대한 tES의 효과를 나타낸다. (a) POI는 캡슐화의 존재 및 부재하에서 투석 완충액 속에서 안정하다. tES의 존재는 (b) 0.4% 트립신, (c) 20% 메탄올, (d) 8 M 우레아, 및 (e) 30% 아세토니트릴 속에서 tES-POI의 안정성을 향상시켰다. (f) tES(+)F116H/tES-POI는 15분의 열 변성에 대해 내성이다. (g) tES(+)F116H/tES-rLuc는 반복된 열순환처리(80℃ x 5 min x 10회 주기)에 대해 고도로 내성이며 rLuc와 비교하여 3자릿수 더 높은 활성을 나타낸다.
도 7a 내지 7f는 제한 부위를 지닌 다양한 작제물(construct)의 개략적인 묘사를 나타낸다. 도 7a. 조립하는 경우[AfFtn△C(-)] 순 음성 내부에 기여하는 절단된 C-말단을 지닌 AfFtn. 도 7b. 조립되는 경우[AfFtn△C(+)] 순 양성 내부에 기여하는 절단된 C-말단 및 4개의 점 돌연변이(E65K, E128K, E131K, 및 D138A)를 지닌 AfFtn. 도 7c. 조립되는 경우 [AfFtn△C(+/-)] 순 중성 내부에 기여하는 절단된 C-말단 및 2개의 점 돌연변이(E65Q 및 D138A)를 지닌 AfFtn. 도 7d. 케이지 조립[F116H(+)]에 있어서 pH의 효과를 연구하기 위한 절단된 C-말단, 양성 내부, 및 F116H 돌연변이를 지닌 AfFtn. 도 7a 내지 도 7d에서의 작제물을 pRSF1b 벡터 내에서 클로닝(cloning)하였다. 도 7e. AfFtn과 절단된 C-말단 및 POI의 융합(GFP/HRP/루시퍼라제). N-말단 His-tag 및 C-말단 c-Myc 에피토프는 강조한다[h6NE-POI]. 도 7f. AfFtn과 이들 사이에 프로테아제 부위(TEV 또는 FXa)를 지닌 절단된 C-말단 및 POI. N-말단 His-태그 및 C-말단 c-Myc 에피토프를 강조한다[h6NE-POI-프로테아제]. 작제물 도 7e 및 7f 둘 다를 pBAD/HisB 벡터 내에서 클로닝하였다.
도 8a 내지 8c는 절단된 C-말단[AfFtn△C](PDB 수탁 코드 1SQ3)을 지닌 AfFtn의 12개의 소단위를 제공하는 분자 표면을 나타낸다. 도 8a. 음성 내부 표면을 지닌 야생형. 도 8b. 양성 내부 표면을 지닌 AfFtn△C(+). 총 48개의 돌연변이(소단위당 4개: E65K, E128K, E131K, 및 D138A)를 강조한다. 도 8c. 중성 내부 표면을 지닌 AfFtn△C(+/-). 총 24개의 돌연변이(소단위당 2개: E65Q 및 D138A)를 강조한다. 가시적인 명확성을 위하여, 12개의 소단위를 제거하여 쉘의 내부를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9f는 가공된 AfFtn 케이지의 특성을 나타낸다. 도 9a, 9b, 9c, 9d, 및 9e는 AfFtn△C(+), AfFtn△C(+/-), F116HAfFtn△C(+), F116HAfFtn△C(+/-) 및 h6NE-GFP(+)를 사용한 동적 광 산란 연구를 나타낸다. 도 9f. 3개의 가공된 AfFtn 케이지의 발현 수준을 나타내는 SDS 겔(O.D.₆₀₀=0.8에서 유도됨).
도 10a 및 도 10b는 철 검정(iron assay)의 결과를 나타낸다. 도 10a는 양성 대조군으로서 말 비장(horse spleen) 페리틴으로 검정한 3개의 가공된 AfFtn 케이지의 철 농도(1.6mg/ml 농도)를 나타낸다. 가공된 케이지 속의 철 함량은 양성 대조군과 비교하는 경우 무시할 정도였다. 도 10b는 황산암모늄철을 사용한 페리틴 쉘의 철 흡수 연구를 나타낸다. 야생형 Afu 페리틴과 비교시, 가공된 tES 쉘은 보다 낮은 철 흡수를 나타내었다. 모든 실험은 n=3에서 수행하였다(오차 바는 ±S.D.를 나타낸다).
도 11a 내지 11c는 20℃ 내지 90℃에서 가공된 AfFtn 케이지를 사용한 열 언폴 연구(thermal unfolding study)를 나타낸다. α-나선 구조의 대표적인 208nm 및 224nm에서 최소 및 195nm에서 최대의 강도를 나타내는 케이지의 원거리 자외선(Far-UV) CD 스펙트럼(도 11a AfFtn△C(+); 도 11b. AfFtn△C(-); 도 11c. AfFtn△C(+/-)). 단백질 샘플(0.1mg/ml)을 10mM 인산염 완충액 속에 용해시키고 측정을 0.1 cm 경로 길이의 마개처리된 큐베트(stoppered cuvette)를 사용한 키라스캔 원평광 이색성 분광계(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)를 사용하여 기록하였다. 단백질의 열-유도된 변성은 1℃/min의 속도에서 열 단백질 용액을 사용하여 수행하였고, 스펙트럼은 1℃ 변화마다 수집하였다.
도 12a 내지 12i는 케이지 해체시 F116H 돌연변이의 효과를 나타낸다. 모든 크기 배제 크로마토그래피 실험을 25mM 트리스-시트레이트, pH 8.0 및 5.8 완충액 을 사용하여 수행하였다. h6NE-GFPuv(+) 및 F116HNE-GFPuv(+)의 경우, 분획을 형광성 판독(여기 파장 395nm, 방출 파장 509nm)을 위해 분석하고 크로마토그램에 플롯팅하였다. 도 12a. AfFtn의 전체적인 구조(PDB 수탁 코드 1SQ3). 나선형은 녹색 원기둥으로 나타낸다. 116번째 위치에서 3개의 페닐알라닌을 나타내는 삼량체성 인터페이스(trimeric interface)(자홍색)를 강조하였다. 도 12b 및 도 12c는 pH 8.0 및 pH 5.8 각각에서 AfFtn△C(+)의 크로마토그램을 나타낸다. 도 12d 및 12e는 pH 8.0 및 pH 5.8 각각에서 F116HAfFtn△C(+)의 크로마토그램을 나타낸다. pH 5.8에서, NE 쉘은 피크 2로 나타낸 바와 같이 이의 작은 소단위로 해체된다. 도 12f 및 12g는 pH 8.0 및 pH 5.8 각각에서 h6NE-GFPuv(+)의 크로마토그램을 나타낸다. 도 12h 및 12i는 pH8.0 및 pH 5.8 각각에서 F116HNE-GFPuv(+)의 크로마토그램을 나타낸다. pH 5.8에서, NE 쉘은 피크 2 및 3에 의해 나타낸 바와 같이 이의 보다 작은 소단위로 해체된다. 피크 2는 h6NE-GFPuv의 용리를 나타내고 피크 3은 NE 소단위의 용리를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13d는 GFP의 기능성 발현에 대한 L-아라비노즈의 효과를 나타낸다. 도 13a는 0.01% L-아라비노즈를 나타낸다. 도 13b는 0.1% L-아라비노즈를 나타낸다. 도 13c는 1% L-아라비노즈를 나타낸다. 10-mg의 세균성 펠렛(pellet)을 1ml의 분해 완충액(50mM 트리스-HCl pH 7.4, 300mM NaCl, 0.1% 트윈-20) 속에 용해하고, 초음파처리하고, 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층액(200μl)을 96-웰(well) 블랙 폴리스티렌 플레이트에 놓고 방출 스캔(emission scan)을 415 내지 600nm에서 수행하였다. 여기 파장은 395nm에서 고정시켰다. 도 13d. 3개의 상이한 L-아라비노즈 농도에서 발현된 GFPuv 변이체 중에서 509nm에서 최대 형광성의 비교. 모든 실험은 n=4에서 수행하였다(오차 바는 ± S.D.를 나타낸다).
도 14는 써라노스틱 실험 흐름(theranostic experimental flow)의 개관을 나타낸다. 이러한 시도는 전환제(캡슐화된 효소)를 표적에 우선 결합시키고, 이는 결국 양성 전구약물(benign prodrug)을 독성 생성물로 전환시키는 다단계 공정이다. 이는 이후에 처리하는 화학치료제가 치료 표적 기관 또는 종양의 부위 근체에서 우선적으로 합성되므로 매우 높은 치료학적 지수를 지닌 치료 지수를 야기한다.
도 15a 및 15b는 MDA-MB-231 암 세포에 의한 나노케이지 흡수(nanocage uptake)의 공초점 영상을 나타낸다. GE11 및 D4는 EGFR를 결합시키는 펩타이드이며, 이는 암 세포 위에서 과발현된다. NP = 나노 입자.
도 16a 및 도 16b는 시험관내에서 천연의 HRPC 캡슐화에 대한 상이한 몰 비 및 전하의 tES 소단위의 효과를 나타낸다. 도 16a는 tES(+)F116H 소단위의 증가하는 몰 농도의 효과를 나타내고 도 16b는 천연의 HRPC 캡슐화에 대한 tESF116H 소단위의 전하 및 HRPC 활성(OD₄₅₀)을 사용하여 측정된 폴딩을 나타낸다. +ve 대조군은 tES(+)F116H:tES-HRPC(1μM) 및 tES(-)F116H:tES-HRPC(1μM)이다.
도 17a 내지 도 17d는 시험관내에서 HRPC 폴딩에 대한 상이한 농도의 tES 소단위의 효과를 나타낸다. 도 17a는 tES(+)F116H 소단위 및 HRPC의 상이한 몰 비를 사용한 tES(+)F116H:HRPC의 크기-배제 프로파일을 나타낸다. 모든 경우에서, 히스티딘-태그된 소단위는 tES와 함께 동시 정제되며, 이는 tES 조립체 내부에서 이의 캡슐화(encapsulation)를 나타낸다. 크기 배제 크로마토그래피의 각각의 분획을 시험한 모든 몰 비에서 이의 HRPC 활성에 대해 분석하였다. 도 17b는 60:10 및 60:8 몰 비의 tES 소단위 및 HRPC를 사용한 tES(+)F116H:HRPC 및 tES(-)F116H:HRPC의 크기-배제 프로파일을 나타낸다. 크기 배제 크로마토그래피의 각각의 분획을 시험한 모든 몰 비에 대해 이의 HRPC 활성에 대해 분석하였으며 이는 tES(-)F116H가 순(net) 전하 유사성으로 인하여 HRPC를 캡슐화하는데 성공적이지 않았음을 나타내었다. 도 17c는 상이한 몰 비의 tES(+)F116H 소단위 및 HRPC를 사용한 tES(+)F116H:HRPC의 열 이동 검정(thermal shift assay)을 나타낸다. HRPC의 양이 증가함에 따라, tES(+)F116H의 변성 온도도 증가한다. 도 17d는 tES(+)F116H:HRPC(60:10 몰 비) 및 tES(-)F116H:HRPC(60:10 몰비)의 열 이동 검정을 나타낸다. 60:10의 tES(-)F116H:HRPC에 대한 변성 온도에 있어서의 무시할만한 변화는 tES(+)F116H와 비교하여 tES(-)F116H 내에서 HRPC의 성공적이지 않은 캡슐화를 나타낸다.
도 18a 내지 도 18d는 시험관내에서 천연의 GFPuv 캡슐화에 있어서 tES 소단위의 상이한 몰 비 및 전하의 효과를 나타낸다. 도 18a는 증가하는 몰 농도의 tES(+)F116H 소단위(60:1 내지 60:10)의 효과를 나타내고 도 18b는 천연의 GFPuv 캡슐화 및 GFPuv 형광성(508 nm)을 사용하여 측정된 폴딩에 있어서 tESF116H 소단위(60:8 내지 60:10에서)의 전하의 효과를 나타낸다. 도 18c는 상이한 몰 비의 tES 소단위 및 GFPuv를 사용한 tES(+)F116H:GFPuv의 열 이동 검정을 나타낸다. 증가하는 양의 GFPuv를 사용하면, tES(+)F116H의 변성 온도가 상승한다. 도 18d는 tES(+)F116H:GFPuv(60:10의 몰 비) 및 tES(-)F116H:GFPuv(60:10의 몰 비)의 열 이동 검정을 나타낸다. 60:10 tES(-)F116H:GFPuv에 대한 변성 온도에 있어서 무시할만한 변화는 tES(+)F116H와 비교하여 tES(-)F116H 내에서 GFPuv의 성공적이지 못한 캡슐화를 나타낸다. 도 18a에서 +ve 대조군은 tES:tES- GFPuv(0.5 μM)이고; -ve 대조군은 GFPuv이다. 도 18b에서 +ve 대조군은 tES(+)F116H:tES-GFPuv 및 tES(-)F116H:tES- GFPuv이다.
도 19는 rLuc 발광성을 사용하여 측정된 시험관내에서의 천연의 rLuc 캡슐화 및 폴딩에 대한 상이한 몰 비의 tES(+)F116H 소단위의 효과를 나타낸다. +ve 대조군은 tES:tES-rLuc(1μM)이고; -ve 대조군은 rLuc이다.
도 20은 목적 단백질(POI)의 시험관내 폴딩의 프로토콜을 나타낸다. tES-POI를 6 M GuHCl 속에 용해하고 60℃로 가열하여 이의 완전한 변성을 보증하였다. 변성 후, tES-POI를 pH 5.8에서 고정된 몰 비에서 tES 소단위와 혼합하였다. pH를 서서히 8로 변화시켜 tES(+)F116H 내부로 변성된 단백질의 캡슐화를 보증하였다. POI를 tES(+)F116H내에서 이의 폴딩을 위해 25 mM 트리스 완충액, pH 8을 사용한 투석에 적용하였다.
도 21a 및 도 21b는 시험관내 네이키드(naked) ssDNA 캡슐화에 대한 상이한 몰 비의 tES(+)F116H 소단위의 효과를 나타낸다. 도 21a는 DNAse I 분해로부터 ssDNA의 캡슐화 및 보호에 대한 tES(+)F116H 소단위를 증가시키는 몰 농도(10:1 내지 60:1)의 효과를 나타낸다. 'B'로 표시된 레인(lane)은 DNAse I의 부재이고; 'A'로 표시된 레인은 DNAse I 분해된 것이다. 레인 1은 크기 마커를 포함하고 레인 2 및 3은 네이키드 ssDNA 대조군이다. 도 21b는 tES(+)F116H 캡슐 단백질의 꼬마지에-염색된 겔을 나타낸다.
도 22a 및 도 22b는 플라스미드 첨가의 존재 및 부재하에서 tES(+)F116H의 투과 전자 현미경 사진이다. 도 22a는 pRSF 플라스미드의 첨가 후 환형 패턴(박스로 나타낸 영상 참고)을 형성하는 tES(+)F116H를 나타내며, pRSF 플라스미드에 대한 tES(+)F116H의 부착을 강력하게 나타낸다. tES(+)F116H 및 pRSF 플라스미드를 1:1000의 캡슐화 혼합물 속에서의 몰 비를 사용하여, tES(+)F116H 소단위에 의한 pRSF 플라스미드 DNA의 시험관내 캡슐화 후 1000:1의 몰 비로 혼합하였다. 우측 패널은 좌측 패널의 확대된 사진이다. 도 22b는 플라스미드가 첨가되지 않은 tES(+)F116H를 나타낸다. 환형 패턴은 관찰되지 않았다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 예시적인 구현예의 설명은 다음과 같다.

본 발명은 부분적으로 신생 단백질 가닥(strand), 핵산 또는 소 분자와 같은 카고 분자(cargo molecule)를 나노캡슐화제 쉘을 사용하여 가공된, 수성 구멍(aqueous cavity)내로 캡슐화하기 위한 방법의 개발을 기반으로 한다. 본원에 기술된 바와 같이, 초고온성 세균 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)(AfFtn)로부터의 열안정성 페리틴 조립체가 선택되어(도 1a) 주변 용질에 대한 확산하는 접근성을 허용하는 이의 능력 및 밀접하게 관련된 폴딩되지 않은 단백질의 변성 효과를 견디는 이의 구조적 안정성을 입증하였다.

본원에 사용된, 용어 "함유하는" 또는 "포함하는"은 지칭된 것으로서 기술된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 구체화하는 것으로 해석되어야 하나, 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 성분, 또는 이의 그룹의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는다. 그러나, 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "포함하는" 또는 "함유하는"은 또한 "로 이루어진"을 포함한다. "포함하다(comprise 및 comprises)"와 같은 단어 "포함하는(comprising)", 및 "함유하다(include 및 includes)"와 같은 "함유하는(including)"은 상응하게 변화된 의미를 갖는다.

천연의 AfFtn 조립체는 각각 ~20 kDa이고 4개의 나선형 다발 구조 모티프(motif)를 함유하는 24 소단위를 포함한다. 조립체는 12 nm의 외부 치수 및 8nm의 내부 케이지를 갖는다(Johnson, E. Structure.13, 637-648 (2005)). AfFtn는 대표적인 8면체(4-3-2) 대칭이 사면체(2-3) 대칭 대신 교환되어 4개의, 대략 4.5 nm인, 조립체의 내부와 외부를 교통하는 삼각형 윈도우/세공(window/pore)을 생성한다는 점에서 다른 페리틴과는 상이하다(Sana, B. J. Biol. Chem. 288, 32663-32672 (2013)). 조립체는 매우 안정하며, 90℃까지의 열 및 8 M과 같이 높은 우레아 농도에 견딘다(Liu, X. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.100, 3653-3658 (2003)). 그러나, 천연의 AfFtn은 저 염 농도에서 해체된다(Johnson, E. Structure.13, 637-648 (2005))(도 1b).

본원에 기술된 나노캡슐화제(NEs)는 심지어 낮은 염 농도 속에서도 매우 안정하며 순 양성, 중성, 또는 음성으로 하전된 내부 환경을 사용하여 가공한다. 본원에 입증된 바와 같이, NEs를 사용하여, 4개의 목적한 단백질-녹색 형광성 단백질, 개똥벌레 루시퍼라제, 라밀라(Ramilla) 루시퍼라제, 및 서양고추냉이 퍼옥시다제 동종효소 C―의 기능성 발현은 이. 콜라이(E. coli)내에서 증가되었다. 본원에 기술된 NEs를 또한 가공하여 pH-의존적 방식으로 해체 및 조립하며, 이는 캡슐화된 단백질의 조절된 방출을 촉진하였다.

페리틴 조립체 조성물

일 국면에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위(ferritin subunit)를 포함하는 가공된 열안정성 페리틴 조립체가 본원에 제공되며, 여기서 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 야생형 페리틴 소단위가 지니는 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여하고 있으며, 여기서 조립체는 야생형 페리틴 조립체보다 더 낮은 염 농도에서 안정하다.

본원에 사용된 바와 같이, "페리틴 조립체"는 24 소단위(페리틴 소단위)를 포함하고, 각각의 소단위가 규정된 크기(예컨대, AfFtn의 경우 ~20 kDa) 및 구조적 모티프(예컨대, AfFtn에 대해 4개의 나선형 다발 구조적 모티프)를 갖는, 당해 분야의 공지된 구조인, 페리틴과 동의어로 사용된다. 천연의 페리틴 조립체는 규정된 외부 직경(예컨대, AfFtn의 경우 12 nm) 및 규정된 내부 케이지(예컨대, AfFtn의 경우 8 nm)를 갖는다. 페리틴은 당해 분야에 잘 특성화되어 있다(예컨대, Johnson, E. Structure.13, 637-648 (2005)).

본원에 사용된 바와 같이, 페리틴 소단위는 상기 나타낸 바와 같이, 페리딘 조립체를 형성하는 24개의 소단위 중 하나를 지칭한다. 페리틴 조립체의 소단위는 4개의 나선형 다발 모티프를 포함하는 규정된 구조를 갖는다. AfFtn에서, 각각의 소단위는 ~20kDa이고 4개의 나선형 다발 구조 모티프를 함유한다.

본원에 사용된 바와 같이, "변형된 페리틴 소단위"는 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여한 페리틴 소단위을 지칭한다. 즉, 변형된 페리틴 소단위는 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열의 결실을 추가로 포함한다. 변형된 페리틴 소단위는 때때로 "Ftn-소단위△C"(페리틴 소단위 C-결실의 경우)로서 일반적으로 지칭된다.

본원에 사용된 바와 같이, "가공된 페리틴 조립체"는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위와 함께 형성된 페리틴 조립체를 지칭한다. 가공된 페리틴 조립체는 때때로 "나노쉘" 또는 "나노케이지" 또는 "나노캡슐화제" 또는 "NE" 또는 "열안정성 엑소쉘(thermostable exoshell)" 또는 "tES"로서 지칭된다. AfFtn△C는 구체적으로 C-결실 아르카에오글로부스 풀기두스 페리틴 소단위로 형성된 가공된 아르카에오글로부스 풀기두스 페리틴 조립체를 지칭된다.

특정의 구현예에서, 야생형 페리틴 소단위는 열안정성 페리틴 조립체의 부분이다. 특정의 구현예에서, 야생형 페리틴 소단위은 예컨대, 아르카에오글로부스 풀기두스 및 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)와 같은 초고온성 세균으로부터 기원하는 열안정성 페리틴 조립체의 일부이다. 특정의 구현예에서, 열안정성 페리틴 조립체는 이러한 조립체의 내부와 외부를 연통(communicating)시키는 윈도우/세공을 갖는다. 특정의 구현예에서, 세공은 너비가 약 2 nm 내지 약 4.5 nm이다. 보다 바람직한 구현예에서 세공은 너비가 약 4.5 nm이다. 특정의 구현예에서, 야생형 페리틴 소단위는 AfFtn의 서열 번호 1에 설정된 서열을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "구조화되지 않은 카복시-말단 서열"은 장애가 있는 구조(예컨대, 나선 구조를 가지지 않는)를 가진 것으로 공지된 야생형 페리딘 소단위내 잔기의 C-말단 끝 스트레치(C-terminal end stretch)를 지칭한다. 야생형 페리틴 소단위내 잔기의 이러한 스트레치는 당해 분야에 공지되어 있으며, 당해 분야의 기술자는 구조화되지 않은 영역이 시작되고 끝나는 부위를 확인할 수 있다. 예를 들면, "구조화되지 않은" 서열은 일반적으로 x-선 결정학과 같은 방법을 사용하여 가시화될 수 없다. 다른 예로서, 분자 동적 모델링을 사용하여 2 초과의 b-인자를 수득하는 잔기 또는 잔기의 세트는 "구조화되지 않은" 또는 "장애가 있는" 것으로 확인될 수 있다. AfFtn 소단위에서, 구조화되지 않은 카복시-말단 서열은 서열 번호 1의 잔기 165 내지 173번(FTPPAEEEK)을 포함한다. 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 서열 번호 1의 잔기 1 내지 164번, 또는 1 내지 165번, 또는 1 내지 166번, 또는 1 내지 167번, 또는 1 내지 168번, 또는 1 내지 169번, 또는 1 내지 170번, 또는 1 내지 171번, 또는 1 내지 172번을 포함한다. 잔기 1 내지 164번을 포함하는 변형된 페리틴 소단위는 서열 번호 2에 제시되어 있다. 당해 분야의 기술자가 인식할 수 있는 바와 같이, 잔기는 예컨대, 가공된 페리틴 조립체 기능에 영향을 미치지 않는, 클로닝 부위로부터 생성된 변형된 페리틴 소단위내 마지막 잔기 이후에 존재할 수 있다. 예를 들면, 표 1에 나타낸 바와 같이, 구조화되지 않은 C-말단이 절단된 AfFtn 소단위는 클로닝 플라스미드내에 클로닝 부위(제한 부위)로부터 생성된 잔기 "TS"를 포함한다. 표 1은 본원에 기술된 서열을 요약한다. 구조화되지 않은 카복시-말단 서열의 제거는 가공된 페리틴 조립체 내부의 공간을 확보할 뿐 아니라 저 염 농도(예컨대, 30 mM NaCl 만큼 낮은 농도)에서 조립체에 대해 안정성을 부여한다.

가공된 페리틴 조립체는 대안적으로 소단위의 화학적 가교결합에 의해 저 염 농도에서 안정화될 수 있다.

[표 1]

변형된 페리틴 소단위는 이의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 추가의 변형(예컨대, 아미노산 치환)을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 적어도 하나의 페리틴 소단위는 변형되어 페리틴 조립체의 내부 표면의 전하(예컨대, 양성, 음성, 또는 중성)에 기여할 수 있다. 페리틴 소단위 내에서 어느 잔기가 변형되어 양성, 음성, 또는 중성 내부 전하를 지니는 페리틴 조립체를 달성하는지를 측정하는 방법이 본원에 기술된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다.

특정의 구현예에서, 페리틴 소단위는 변형되어 페리틴 조립체가 순 양성 내부 전하(net positive interior charge)를 지니도록 할 수 있다. 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 AfFtn 소단위의 서열 번호 1의 E65, E128, E131, 및 D138로부터 선택된 임의의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 E65K, E128K, E131K, 및 D138A로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환을 포함하며; 이의 예는 서열 번호 3에 제시되어 있다.

특정의 구현예에서, 페리틴 소단위는 변형되어 페리틴 조립체가 중성 내부 전하를 지니도록 할 수 있다. 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 AfFtn 소단위의 서열 번호 1의 E65 또는 D138, 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 치환 E65Q 또는 D138A, 또는 둘 다를 포함하며; 이의 예는 서열 번호 4에 제시되어 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 천연의 AfFtn 페리틴 소단위 트렁케이션으로부터 형성된 가공된 페리틴 조립체는 순 음성 전하를 지닌다. 그러나, 특정의 구현예에서, 페리틴 소단위는 변형되어 페리틴 조립체가 순 음성 전하를 지니도록 할 수 있는데, 예컨대, 다른 돌연변이가 돌연변이체 음성 잔기에 대해 하나 이상의 음성 잔기를 치환할 수 있다. 이러한 변형은 천연의 서열에 의한 철 격리(iron sequestering)를 감소시키는데 바람직할 수 있다. 순 음성 내부 전하에 기여하는 천연의 잔기를 확인하는 방법 및 또한 천연 잔기를 다음 음성 잔기로 치환하는 방법은 당해 분야에 알려져 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 페리틴 소단위를 본 발명의 방법에 따라 변형시킬 수 있다. 당해 분야의 기술자는 24개의 소단위 중 임의의 수를 본 방법에 따라 변형시켜 융합된 폴리펩타이드의 효율적인 발현 및/또는 폴딩을 가능하도록 하는 가공된 페리틴 조립체를 형성할 수 있음을 인식할 수 있다. 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 모든 소단위를 본 방법에 따라 변형시켜 융합된 폴리펩타이드의 효율적인 발현 및/또는 폴딩을 가능하도록 하는 가공된 페리틴 조립체를 형성할 수 있다. 당해 분야의 기술자가 인식할 수 있는 바와 같이, 본 방법에 따라 변형된 소단위의 임의의 조합을 사용하여 융합된 폴리펩타이드의 효율적인 발현 및/또는 폴딩을 가능하도록 하는 가공된 페리틴 조립체를 형성할 수 있다.

특정의 구현예에서, 페리틴 소단위는 본원에 기술된 바와 같이 변형시켜 예컨대, 가공된 페리틴 케이지 용적을 최대화하고/하거나 제공된 폴리펩타이드의 최적의 발현에 적합한 것으로, 순 양성/음성/중성 내부 케이지를 제공함으로써 융합된 폴리펩타이드의 발현을 위한 최적의 환경을 제공한다. 바람직하게는, 가공된 페리틴 케이지는 순 양성 내부 전하, 또는 순 중성 전하를 지닌다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 제공된 폴리펩타이드의 발현에 적합한 것으로서 채택될 수 있다.

특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 폴리펩타이드에 융합된다. 본원에 사용된 바와 같이, "융합된"은 변형된 페리틴 소단위를 목적한 폴리펩타이드에 프레임내(in-frame)로 결합시켜 변형된 페리틴 소단위 및 폴리펩타이드가 연결되어 융합체를 형성하도록 함을 지칭하며, 여기서 융합은 변형된 페리틴(예컨대, 페리틴 조립체내로 조립하는 이의 능력) 또는 폴리펩타이드의 형성 또는 기능을 파괴하지 않는다. 특정의 구현예에서, 폴리펩타이드는 변형된 페리틴 소단위의 카복시-말단에 융합된다. 융합 분자를 가공하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.

특정의 구현예에서, 폴리펩타이드는 결합 서열(joining sequence)을 통해 변형된 페리틴 소단위에 융합된다. 특정의 구현예에서, 결합 서열은 프로테아제 인식 서열, 링커 서열, 공지된 에피토프(예컨대, 상응하는 c-myc 유전자 생성물로부터 기원하는 Myc 에피토프-myc-태그), 절단 서열, 자가-절단 서열, 특이적인 화학적 변형 및/또는 가교결합을 가능하도록 하는 서열, 클로닝 부위(예컨대, 제한 효소 인식 서열)로부터 생성된 서열, 화학적 링커 또는 바이오틴 스트렙타비딘과 같은 비-공유결합 링커, 또는 이의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된다. 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 TEV프로테아제/FXa 및/또는 트롬빈을 포함하는, 당해 분야에 공지된 다양한 적합한 프로테아제 인식 서열을 사용할 수 있다. 예컨대, 글리신/세린-계 링커를 포함하는, 당해 분야에 공지된 다양한 링커 서열을 사용할 수 있다. 이러한 서열을 포함하도록 결합 영역을 설계하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 길이 또는 해독후 변형(예컨대, 글리코실화 또는 포스포릴화)에 상관없이, 아미드 결합에 의해 공유결합으로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 중합체를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어 "단백질"은 천연적으로 발생하는 및 인공의(예컨대, 가공된 또는 변이체) 완전한 길이의 단백질 뿐만 아니라 단백질의 기능성 단편도 포함한다.

용어 "기능성 단편"은 예컨대, 다른 단백질 또는 핵산에 결합하고/하거나 상호작용하거나 조절하는 능력과 같이, 완전한 길이의 단백질의 활성 또는 기능(예컨대, 효소 활성과 같은 생물학적 활성 또는 기능) 중 일부 또는 모두를 보유한 단백질의 일부를 지칭한다. 기능성 단편은 임의의 크기일 수 있으며 단, 단편은 예컨대, 다른 단백질 또는 핵산에 결합하여 이와 상호작용하는 능력을 보유한다.

본원에 기술된 바와 같은, 폴리펩타이드는 가공된 페리틴 조립체 내에 캡슐화된다. 즉, 변형된 페리틴 소단위는, 가공된 페리틴 조립체를 형성하는 경우 폴리펩타이드를 둘러싸는 케이지를 형성한다. 특정의 구현예에서, 폴리펩타이드에 융합된 변형된 페리틴 소단위는 다른 융합되지 않은 변형된 페리틴 소단위와 조립하여 폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체를 형성한다. 특정의 구현예에서, 폴리펩타이드에 융합된 하나의 변형된 페리틴 소단위는 23개의 다른 융합되지 않은 변형된 페리틴 소단위와 함께 조립되어 하나의 폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체를 형성한다.

본원에 기술된 바와 같이, 가공된 페리틴 조립체는 캡슐화된 폴리펩타이드의 조절된 방출을 위해 설계될 수 있다. 특정의 구현예에서, 변형된 페리틴 소단위는 AfFtn의 서열 번호 1의 위치 F116에서의 치환, 또는 비-AfFtn 페리틴 소단위내 동일한 위치에서의 치환을 포함한다. 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 치환 F116H를 포함하며; 이의 예는 서열 번호 5에 제시되어 있다. F116H 돌연변이를 지닌 가공된 페리틴 조립체는 본원에서 산성 pH(즉, pH 7.0 미만), 바람직하게는 약 pH 4.0, 보다 바람직하게는 약 pH 5.8에서 가역적으로 분해되며, 염기성 pH(즉, 약 pH 7.0 초과), 바람직하게는 약 pH 8.0에서 안정하게 재조립된다.

특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 치환 F116H 및 순 양성 내부 전하를 포함하며; 이의 예는 서열 번호 8에 제시되어 있다.

특정의 구현예에서, F116에서의 치환은 가공된 페리틴 조립체가 공유결합으로 결합된 변형제에 따라 조립되고/되거나 해체되기 쉽도록 한다.

가공된 페리틴 조립체를 사용하는 방법

일 국면에서, 본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 폴리펩타이드의 발현을 향상시키는 방법에 사용된다. 폴리펩타이드를 캡슐화하는 방법은 세포 내로 a) 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여하고 있는 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 제1 서열; 및 b) 폴리펩타이드에 융합된, 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여한 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 제2 서열을 포함하는 핵산을 도입함을 포함한다. 즉, 제1 서열은 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열의 결실을 포함하는 변형된 페리틴 소단위(Ftn-소단위△C로 지칭됨)를 암호화하는 반면, 제2 서열은 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열의 결실을 포함하는 변형된 페리틴 소단위, 및 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드의 융합을 암호화한다. 이러한 방법은 제1 및 제2 서열을 발현시키는 단계 및 폴리펩타이드를 캡슐화하는 페리틴 조립체를 형성시킴으로써 폴리펩타이드의 발현을 향상시키는 단계를 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, 야생형 페리틴 소단위는 서열 번호 1에 제시된 서열을 포함한다. 특정의 구현예에서, 변형된 페리틴 소단위는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 8을 포함하는 그룹 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다.

본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 폴리펩타이드의 효율적인 폴딩을 가능하도록 하여 기능성 폴리펩타이드의 전체적인 생산을 증가시킨다. 가공된 페리틴 조립체는 캡슐화된 폴리펩타이드의 기능성 구조로의 폴딩을 향상시키는 최적의 환경을 제공한다. 가공된 페리틴 조립체는 가공된 페리틴 조립체에 의한 캡슐화없이 발현되는 경우 폴리펩타이드내에서 또한 발생될 수 있는 미스폴딩(misfolding) 및/또는 응집을 방지하거나 최소화한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "발현을 향상시키는"은 기능성 폴리펩타이드(예컨대, 이의 의도된 생물학적 기능을 수행하는 폴리펩타이드)의 증가된 생산을 야기하는, 향상된 폴딩, 감소된 응집, 증가된 발현, 또는 다른 공정, 또는 이의 조합을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 다수의 뉴클레오타이드 단량체(예컨대, 리보뉴클레오타이드 단량체 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 단량체)를 포함하는 중합체를 지칭한다. "핵산"은 예를 들면, 게놈성 DNA, cDNA, RNA, 및 DNA-RNA 하이브리드 분자를 포함한다. 핵산 분자는 천연적으로 발생하거나, 재조합체, 또는 합성일 수 있다. 또한, 핵산 분자는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥일 수 있다. 특정의 구현예에서, 핵산 분자는 변형될 수 있다. 이중 가닥 중합체의 경우, "핵산"은 분자의 하나의 가닥 또는 둘 다를 지칭할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 핵산은 가공된 페리틴 조립체 속에 캡슐화될 수 있다. 즉, 변형된 페리틴 소단위는, 가공된 페리틴 조립체를 형성하는 경우, 핵산을 둘러싸는 케이지를 형성한다. 특정의 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 핵산에 융합된다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 분해에 대한 캡슐화된 핵산의 내성을 제공할 수 있다. 핵산과 단백질 사이의 화학적 가교-결합의 방법은 잘 알려져 있는 것으로 이해될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은, 소 분자는 가공된 페리틴 조립체 내에 캡슐화될 수 있다. 즉, 샘플 속의 변형된 페리틴 소단위는 가공된 페리틴 조립체를 형성하는 경우, 샘플속에 존재하는 하나 이상의 소 분자를 둘러싸는 케이지를 형성한다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 분해에 대해 캡슐화된 소 분자의 내성을 증가시키고/시키거나 이의 조절된 방출을 제공할 수 있다.

특정의 구현예에서, 캡슐화된 폴리펩타이드 또는 핵산은 상기 폴리펩타이드 또는 핵산이 캡슐화되지 않은 경우와 비교하여 변성에 대해 내성이 증가되어 있다.

핵산과 관련하여, 용어 "뉴클레오타이드 서열"은 인 연결(예컨대, 포스포디에스테르, 알킬 및 아릴-포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르 결합), 및/또는 비-인 연결(예컨대, 펩타이드 및/또는 설파메이트 결합)과 같은 공유 연결에 의해 결합된 연속된 일련의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정의 구현예에서, 예컨대, 국제화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 이종 서열(예컨대, 상이한 종 또는 세포형 기원인 유전자)이다.

용어 "뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오타이드 단량체"는 천연적으로 발생하는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 단량체, 및 또한 비-천연적으로 발생하는 이의 유도체 및 유사체를 지칭한다. 따라서, 뉴클레오타이드는 예를 들면, 천연적으로 발생하는 염기(예컨대, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 이노신, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 또는 데옥시사이티딘)를 포함하는 뉴클레오타이드 및 당해 분야에 공지된 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

당해 분야의 기술자에게 인식될 바와 같이, 특정의 구현예에서, 핵산은 플라스미드 서열을 추가로 포함한다. 플라스미드 서열은 예를 들면, 프로모터 서열, 선택 마커 서열, 또는 유전자자리-표적화 서열 중 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 핵산 조성물을 세포 내로 도입하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.

특정의 구현예에서, 핵산은 시험관내에서 세포 내로 도입된다. 특정의 구현예에서, 핵산은 생체내(in vivo)(예컨대, 유전적으로 변형되고/되거나 바이러스-형질전환된 동물의 기관에서; 전체 곤충의 맥락에서 세포에서)에서 세포 내로 도입된다.

특정의 구현예에서, 세포는 세균 세포, 식물 세포, 포유동물 세포, 또는 곤충 세포이다.

특정의 구현예에서, 제1 및 제2 서열은 별도의 플라스미드 상의 세포 내로 도입된다. 다양한 적합한 플라스미드가 당해 분야에서 용이하게 이용가능하고 알려져 있다. 특정의 구현예에서, 제1 및 제2 서열은 단일의 플라스미드 상의 세포 내에 도입되며, 여기서 제1 및 제2의 서열은 별도의 프로모터 하에서 발현된다.

특정의 구현예에서,

a) 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여하는 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 서열; 및/또는

b) 폴리펩타이드에 융합된, 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여하는 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 플라스미드 또는 벡터 핵산이 제공된다.

특정의 구현예에서, 단리된 플라스미드 또는 벡터는 본 발명의 임의의 국면에 따른 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위를 암호화한다. 특정의 구현예에서, 단리된 플라스미드 또는 벡터는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 8을 포함하는 그룹 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위를 암호화한다.

특정의 구현예에서, 제1 서열은 과량의 제2 서열 내에서 발현된다. 예를 들면, 제1 및 제2 서열은 (제1 : 제2) 약 23:1, 약 11:1, 약 7:1, 약 5:1, 약 19:5, 약 3:1, 약 17:7, 약 2:1, 약 5:3, 약 7:5, 약 13:11, 또는 약 1:1의 비에서 발현된다. 따라서, 융합되지 않은 변형된 페리틴 소단위는 일반적으로 폴리펩타이드에 융합된 과량의 변형된 페리틴 소단위로 발현된다. 당해 분야의 기술자에게 인식될 수 있는 바와 같이, 이러한 비는 예컨대, 융합된 폴리펩타이드의 특성(예컨대, 폴리펩타이드 크기)를 포함하는 다수의 인자의 따라 변할 것이다. 따라서, 하나 이상의 폴리펩타이드가 가공된 페리틴 조립체내에서 캡슐화될 수 있다. 특정의 구현예에서, 하나의 폴리펩타이드는 가공된 페리틴 조립체(예컨대, 제1 : 제2의 비가 약 23:1인 조립체로부터 생성되는) 내에서 캡슐화된다.

본원에 사용된 바와 같은, 가공된 페리틴 조립체는 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열의 결실을 포함하는 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위를 포함한다. 따라서, 당해 분야의 기술자는 가공된 페리틴 조립체가 다양한 길이의 변형된 페리틴 소단위(예컨대, 서열 번호 1의 잔기 1 내지 164번, 1 내지 165번, 1 내지 166번, 1 내지 167번, 1 내지 168번, 1 내지 169번, 1 내지 170번, 1 내지 171번, 또는 1 내지 172번)에 의해 형성될 수 있다. 특정의 구현예에서, 가공된 페리틴 조립체는 폴리펩타이드에 융합되는 변형된 페리딘 소단위를 제외하고는, 균일한 길이의 변형된 페리틴 소단위에 의해 형성되며, 이는 폴리펩타이드 및 임의의 결합 서열과 연합된 여분의 잔기를 포함한다. 예를 들면, 가공된 페리틴 조립체는 본원에 사용된 바와 같은, 폴리펩타이드에 대한 융합 없이 서열 번호 1의 1 내지 164번 잔기, 및 폴리펩타이드에 융합된 서열 번호 1의 1 내지 164번 잔기를 포함하는 23개의 소단위을 사용하여 형성시킬 수 있다. 캡슐화된 폴리펩타이드(POI)의 세포 생산은 변형된 페리틴 소단위에 대한 폴리펩타이드의 연결을 필요로 함이 본원에서 밝혀졌다.

단백질의 시험관내 폴딩을 보조하는 tES의 능력이 시험되었다. tES(+)F116H 조립체는 PBS 대조군과 비교하여, 8 M 우레아 또는 6 M 구아니디늄 하이드로클로라이드(GnHCl)로 처리한 후 SEC 상에서 유사한 용출 프로파일에 의해 입증된 바와 같이, pH 8.0에서 매우 안정하다. 유사하게, tES(+)F116H는 관찰가능한 침전물없이 pH 적정을 가역적으로 연합시키거나 해리할 수 있다. 이후에, 본 발명자들은 tES가 POI를 변성시킬 수 있는 조건 하에서 기질 단백질을 기능적으로 캡슐화할 수 있다고 가정하였다. tES 융합 단백질은 동시-발현된 tES의 부재하에서 봉입체(inclusion body)로서 발현된다. 따라서, tES(+)F116H를 사용하여, 본 발명자들은 쉘의 조립체를 유도하기 위한 5.8로부터 8.0으로 이동하는 pH를 사용하여 tES 대 tES-POI의 비를 시험하였다. tES-GFPuv에 대한 tES(+)F116H의 첨가는 기능성 수율에 있어서 ~100-배 증가를 야기하였으며, 이는 90:1 비의 tES(+)F116H 소단위 대 tES-GFPuv에서 최대이었다. 특정의 구현예에서, 시험관내 캡슐화 및 폴딩은 적어도 20:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1, 적어도 60:1, 적어도 70:1, 적어도 80:1, 적어도 90:1의 tES(+)F116H: tES-POI 몰 비로 달성된다.

POI 또는 핵산을 tES 소단위에 부착하기 위한 링커의 필요없이 세포-유리된 시스템내에서 가공된 페리틴 조립체내에 폴리펩타이드(POI) 또는 핵산을 캡슐화하는 것이 가능함이 본원에서 유리하게 밝혀졌다. 그러나, 효율적인 캡슐화를 위해서는 POI가 tES 소단위에 연결되는 경우보다 tES에 비하여 보다 더 많은 POI가 요구된다. 특정의 구현예에서, 페리틴 조립체는 tESF116H 소단위를 포함한다. 특정의 구현예에서, 페리틴 조립체는 tES(+)F116H 소단위를 포함한다. 특정의 구현예에서, tESF116H 소단위는 서열 번호 5 또는 서열 번호 8에 제시된 서열을 포함한다. 특정의 구현예에서, tESF116H 소단위는 산성 pH(즉, pH 7.0 미만), 바람직하게는 약 pH 4.0, 보다 바람직하게는 약 5.8에서 POI와 혼합되어 동시-항온처리된 후, 혼합물의 pH는 염기성 pH(즉 pH 7.0 초과), 바람직하게는 약 pH 8로 조절되어 POI의 페리틴 조립체 및 캡슐화를 구동시킨다. 특정의 구현예에서, tESF116H 소단위는 과량의 POI와 혼합된다. 예를 들면, tESF116H 소단위 및 POI 분자는 적어도 60:1, 적어도 60:3, 적어도 60:5, 적어도 60:8, 적어도 60:10, 적어도 60:12, 적어도 60:15, 적어도 60:30, 또는 임의의 적합한 비로 혼합된다.

특정의 구현예에서, 이러한 방법은 본원에 사용된 바와 같은, 폴리펩타이드를 캡슐화하는 페리틴 조립체를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 본원에 사용된 바와 같은 폴리펩타이드를 단리하는 단계(예컨대, 융합 결합 서열을 절단하여 변형된 페리딘 소단위로부터 폴리펩타이드를 단리하는 단계)를 추가로 포함한다.

다른 국면에서, 본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체를 세포에 전달함으로써 폴리펩타이드를 세포 내로 전달하는 방법에서 사용된다. 가공된 페리틴 조립체를 세포 내로 전달하는 방법은 세포를 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위를 포함하는 가공된 페리틴 조립체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 페리틴 소단위는 야생형 페리틴 소단위가 지닌 구조화되지 않은 카복시-말단 서열을 결여하며, 여기서 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 폴리펩타이드에 융합된다. 본원에 사용된 바와 같은, 가공된 페리틴 조립체는 폴리펩타이드를 캡슐화한다.

특정의 구현예에서, 세포는 질환이 있는 세포이다. 특정의 구현예에서, 질환이 있는 세포는 예컨대, 질환이 있는 심장 세포, 질환이 있는 간 세포, 질환이 있는 뉴우런, 또는 질환이 있는 면역 세포이다. 특정의 구현예에서, 질환이 있는 세포는 암 세포이다.

특정의 구현예에서, 가공된 페리틴 조립체는 예컨대, 가공된 페리틴 조립체의 표면 위에 세포 표적화 모이어티(moiety)를 포함한다. 특정의 구현예에서, 세포 표적화 모이어티는 질환이 있는 세포 상의 분자(예컨대, 수용체 또는 리간드)에 결합한다. 세포 표적화 모이어티에 의해 결합된 분자의 예는 예컨대, EGFR 및 세포 부착 분자(예컨대, 인테그린 및 향상된 투과성 및 보유(EPR) 효과와 같은 기관 수준의 선택성)를 포함한다.

당해 분야의 기술자는 다양한 분자(예컨대, 이의 펩타이드, 수용체, 리간드, 및 단편)를 표적에 대한 표적화 모이어티로서 사용하여 분자를 질환이 있는 세포에 결합시킬 수 있다. 특정의 구현예에서, 세포 표적화 모이어티는 서열 번호 6(YHWYGYTPQNVI) 또는 서열 번호 7(LARLLT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.

특정의 구현예에서, 표적화 모이어티는 페리틴 조립체 표면에 가교결합된다. 분자(예컨대, 펩타이드)를 다른 분자와 가교결합시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같은, 가교결합제, 예컨대, 설포-SMCC를 사용하여 표적화 모이어티를 가공된 페리틴 조립체의 표면에 부착시킬 수 있다.

특정의 구현예에서, 폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체를 가공된 페리틴 조립체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물 또는 제형 속의 세포 내로 전달(예컨대, 생체내 전달)시킬 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 전형적으로 제제 또는 핵산과 상호작용하지 않는 불활성 성분을 함유할 것이다. 비경구 투여용으로 적합한 약제학적 담체는 예를 들면, 멸균수, 생리학적 염수, 정균성 염수(bacteriostatic saline)(약 0.9% mg/ml 벤질 알코올을 함유하는 염수), 인산염-완충된 염수, 행크스 용액(Hank's solution), 링거 락테이트(Ringer's lactate) 등을 포함한다. 제형은 또한 활성 성분의 효능을 향상시키는 물질(예컨대, 유화제, 가용화제, pH 완충제, 습윤제)을 소량 포함할 수 있다. 조성물의 캡슐화 방법(예를 들면, 경질 젤라틴 또는 사이클로덱스트린의 코팅에서와 같이)은 당해 분야에 알려져 있다. 흡입을 위해, 제제를 가용화시켜 투여용으로 적합한 디스펜서(dispenser)(예컨대, 분무기(atomizer 또는 nebulizer) 또는 가압 에어로졸 디스펜서) 내로 부하(loading)할 수 있다.

폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체를 중성 화합물 또는 염 또는 에스테르로서 세포 내로 도입할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산 또는 타르타르산으로부터 기원하는 것들과 같은 유리 아미노 그룹으로 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 기원하는 것들과 같은 유리 카복실 그룹으로 형성된 것들을 포함한다. 아민 또는 다른 염기성 그룹을 함유하는 화합물의 염은 예를 들면, 염화수소, 브롬화수소, 아세트산, 과염소산 등과 같은, 적합한 유기 또는 무기 산과 반응시켜 수득할 수 있다. 4급 암모늄 그룹을 지닌 화합물은 또한 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 퍼클로레이트 등과 같은 대음이온(counteranion)을 함유한다. 카복실산 또는 다른 산성 기능성 그룹을 함유하는 화합물의 염은 적합한 염기, 예를 들면, 수산화물 염기와 반응시켜 제조할 수 있다. 산성 작용성 그룹의 염은 나트륨 또는 칼륨과 같은 중화작용(counteraction)을 함유한다.

특정의 구현예에서, 폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 세포내 도입시킬 수 있다. 조합 치료요법으로 투여하는 경우, 폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체를 다른 치료요법 전, 후 또는 이와 동시에 투여할 수 있다. 동시에(예컨대, 함께) 공-투여하는 경우, 폴리펩타이드 및 다른 치료요법을 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체는 별도의 제형 또는 동일한 제형 속에 존재할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드 및 다른 치료요법을 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체는 별도의 조성물로서 숙련된 임상의가 결정한 바와 같은 적절한 시간 간격(time frame) 내에(예컨대, 치료요법의 약제학적 효과의 중첩을 허용하기에 충분한 시간), 연속적으로 투여될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 대상체에서 질환의 치료에 사용하기 위해 조성물 또는 조합물 속에 포함된다. 특정의 구현예에서, 질환은 암이다.

특정의 구현예에서, 가공된 페리틴 조립체를 포함하는 조성물 또는 조합물의 유효량이 이를 필요로 하는 대상체의 치료 또는 예방 방법에 사용된다. 특정의 구현예에서, 조성물 또는 조합물은 치료요법을 위한 전구약물의 전환용 효소를 포함한다.

특정의 구현예에서, 가공된 페리틴 조립체를 포함하는 조성물 또는 조합물은 백신이다.

본 개시내용의 다른 국면에서, 가공된 열안정성 페리틴 조립체 내에 폴리펩타이드 또는 핵산의 캡슐화를 위한 키트(kit), 또는 키트의 용도가 제공되며, 이러한 키트는 본 발명의 임의의 국면에 따른 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 페리틴 소단위는 가공된 조립체가 pH 또는 공유결합된 변형제에 의존적으로 조립 및/또는 해체하도록 할 수 있는 서열 번호 1의 F116번 위치에서의 치환을 포함한다.

다른 국면에서, 본원에 기술된 가공된 페리틴 조립체는 대상체에서 질환의 치료용 의약의 제조시 사용된다. 특정의 구현예에서, 질환은 암이다.

생체내 전달을 위해, 폴리펩타이드를 캡슐화하는 가공된 페리틴 조립체는 이를 필요로 하는 대상체에게 예를 들면, 투여의 경구, 식이요법, 국소, 경피, 또는 비경구(예컨대, 동맥내, 정맥내, 근육내, 피하주사, 피내 주사) 경로를 포함하는 다양한 투여 경로에 의해 전달될 수 있다. 투여는 국소 또는 전신계일 수 있다. 가공된 페리틴 조립체 및 치료 요법에 의해 캡슐화된 치료학적 폴리펩타이드의 실제 용량은 치료되는 상태의 특성, 및 환자의 특징을 고려하여, 숙련된 주치의에 의해 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 단수("a" 또는 "an")는 내용으로부터 달리 또는 또한 명백하게 나타내지 않는 한 하나보다는 하나 이상을 의미할 수 있다.

내용 및 당해 분야의 통상의 기술자의 이해로부터 달리 나타내거나 달리 명백하지 않는 한, 범위로 나타낸 값은 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, 이러한 범위의 하한치의 단위의 1/10까지, 다양한 구현예에서 기술된 범위내 임의의 구체적인 값 또는 소범위로 추정될 수 있다. 수치 값을 참고로 "약"은 내용으로부터 달리 기재되거나 달리 명백하지 않는 한 일반적으로 이러한 값의 ±10% 내에 속하는 값의 범위, 일부 구현예에서 ±5%, 일부 구현예에서 ±1%, 일부 구현예에서 ±0.5%의 범위를 지칭한다. 수치 앞에 "약"이 오는 임의의 구현예에서, 정확한 값이 인용된 구현예가 제공된다. 수치 앞에 "약"이 오지 않는 구현예가 제공되는 경우, 수치 앞에 "약"이 오는 구현예가 또한 제공된다. 범위 앞에 "약"이 오는 경우, 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, "약"은 이러한 범위의 하한치 및 상한치에 적용되거나 하한치 또는 상한치에 적용된다. "적어도", "까지", "이하", 또는 유사한 어구와 같은 어구가 일련의 수치를 선행하는 경우, 이는 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 이러한 어구가 다양한 구현예에서 목록내 각각의 수에 적용되는 것으로 이해되어야 한다(내용에 따라, 값의 100%인 것으로 이해되는데, 예컨대, 퍼센트로 나타낸 값은 상한치일 수 있다). 예를 들면, "적어도 1, 2, 또는 3"은 다양한 구현예에서 "적어도 1, 적어도 2, 또는 적어도 3"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 임의의 및 모든 충분한 하한치 및 상한치는 명확하게 고려되는 것으로 이해될 것이다.

이제 본 발명이 일반적으로 기술되어 있으며, 이는 설명하기 위해 제공되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 다음의 실시예를 참고로 보다 용이하게 이해될 것이다.

실시예

당해 분야에 공지되고 구체적으로 기술되지 않은 표준 분자생물학 기술은 일반적으로 문헌 'Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2001)'에 기술된 바에 따랐다.

실시예 1: 물질 및 방법

플라스미드 및 적격 세포(competent cell)

pRSF1b 발현 벡터(Merck) 및 pBAD/HisB(Life Technologies)를 클로닝(cloning)에 사용하였다. 화학적으로 적격인 XL1 블루(Blue) 이. 콜라이 세포(Simply Science) 및 BL21(DE3) 이. 콜라이 세포(Simply Science)를 형질전환에 사용하였다.

시약 및 항체

다음의 시약을 사용하였다: 제한 효소 NcoI, EagI, 및 SpeI(New England BioLabs), Expresslink T4 DNA 리가제(Life Technologies), 루리아-버타니(Luria-Bertani: LB) 아가(Axil Scientific), 가나마이신(ThermoFisher), 암피실린(Axil Scientific), 오메가 바이오-텍(Omega bio-tek) 플라스미드 미니 키트 및 겔 추출 키트(Simply Science), Q5® 부위-지시된 돌연변이유발 키트(New England BioLabs), 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드, IPTG(Axil Scientific), L-아라비노즈(Sigma), 트리스-HCl pH8.0(Sigma), 염화나트륨, NaCl(Sigma), 트리톤-X 100 (Sigma), 염화칼슘, CaCl₂(Sigma), 헤민(Sigma), β-머캅토에탄올(Sigma), 이미다졸(Sigma), 산화된 L-글루타티온(Sigma), 질산(Merck), 바토페난트롤린 디설폰산(Sigma), 디티오나이트(Sigma), 포스페이트 완충된 염수, PBS(Sigma), 트윈-20(ThermoFisher), 화학발광성 HRP 기질(Millipore), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, TMB 기질(ThermoFisher), 황산, H₂SO₄(Sigma), D-루시페린 칼륨 염(ThermoFisher), 염화마그네슘, MgCl₂(Sigma), 블롯팅-등급 차단제(blotting-grade blocker)(Bio-Rad), 에틸렌디아민테트라아세트산, EDTA(Sigma), 아데노신 트리포스페이트, ATP(ThermoFisher), 소 혈청 알부민, BSA(ThermoFisher), 재조합 루시퍼라제(ThermoFisher), 소 FXa(Axil Scientific), TEV프로테아제(Sigma), Thermo Scientific^TM Pierce^TM c-Myc Tag IP/Co-IP 키트(제품 번호 23620). 다음의 항체를 사용하였다: c-Myc(9E10) HRP 마우스 모노클로날 IgG1(Axil Scientific), His-프로브(H-3) HRP 마우스 모노클로날 IgG1(Axil Scientific), 토끼 모노클로날 GFP 항체(Life Technologies), HRP-접합된 항-토끼 IgG 항체(Life Technologies), 및 접합된 개똥벌레 루시퍼라제 염소 폴리클로날 항체 HRP(Abcam).

클로닝

AfFtn 유전자를 GenBank AF_RS04235에서의 서열을 기반으로 선택하였다. C-말단 절단에 대한 돌연변이 뿐만 아니라 변경된 변화를 지닌 유전자를 GenScript로부터 합성하였다. 돌연변이된 유전자를 NcoI 및 SpeI 제한 효소로 분해하고 발현링크 T4 DNA 리가제를 사용하여 pRSF1b 발현 벡터내로 클로닝하였다. 연결 반응물을 화학적으로 적격(competent) XL1 블루 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시키고 50mg/ml 가나마이신이 들어있는 LB 아가 플레이트(agar plate) 내에서 배양하였다. 플라스미드 DNA를 오메가 바이오-텍 플라스미드 미니 키트 및 겔 추출 키트에 의해 분리하고 핵산 서열분석으로 서열을 확인하였다. 가공된 AfFtn 유전자를 사용하여 Q5® 부위-지시된 돌연변이유발 키트로 F116H 돌연변이를 생성하였다. POI의: GFPuv(3개의 돌연변이 F99S, M153T, 및 V163A를 지닌 야생형 GFP 서열 P42212를 기반으로 함), HRPC(P00433), 및 루시퍼라제(P08659)에 대한 유전자를 Genscript로부터 합성하고, SpeI 및 EagI 제한 효소를 사용하여 분해하고, 수득되는 단편을 발현링크 T4 DNA 리가제를 사용하여 pBAD/HisB와 연결하였다. 가공된 AfFtn에 대한 유전자를 POI에 대한 유전자를 함유하는 pBAD/HisB에 연결하였다. 연결 반응물을 화학적으로 적격 XL1 블루 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열분석하였다. 공-발현을 위해, pRSF1b(T7 프로모터 플라스미드 및 복제의 상보성 RSF 오리진(origin)을 지님) 및 pBAD/HisB(L-아라비노즈 프로모터 및 pBR322 복제 오리진을 지님) 작제물을 BL21(DE3) 이. 콜라이 세포 내로 공-형질전환시키고 50mg/ml 가나마이신 및 100mg/ml 암피실린이 들어있는 LB 아가 플레이트 위에서 성장시켰다. 분리시 유도된 쉘 성분은 이. 콜라이 분해물 속에서 모든 단백질의 50%까지 잘 발현하였다. 프로테아제 부위(TEV프로테아제/FXa)를 6xHis-가공된 AfFtn과 POI 유전자 사이에 Q5® 부위-지시된 돌연변이유발 키트를 사용하여 혼입시켰다.

단백질 발현 및 정제

단일 양성 콜로니를 새로이 형질전환된 플레이트로부터 선택하여 15ml LB 브로쓰(broth) 속에서 밤새 37℃에서 성장시켰다. 암피실린(100mg/ml) 및 가나마이신(50mg/ml)을 각각 단일 플라스미드 작제물 pBAD/HisB 및 pRSF1b의 발현에 사용하였다. 이중 형질전환된 작제물의 경우 항생제 둘 다를 사용하였다. 500ml 용적의 LB 브로쓰에 출발 배양물 12.5ml를 접종하고 흡광도(O.D.₆₀₀)가 0.4-0.5에 이를 때까지 성장하도록 하였다. 단백질 발현을 0.5mM IPTG(pRSF1b 작제물의 경우) 또는 0.1% L-아라비노즈(pBAD/HisB 작제물의 경우) 또는 둘 다(이중 형질전환된 작제물의 경우)로 유도하였다. GFPuv를 사용하여 캡슐화된 POI의 엄격하게 조절된 상대적인 발현의 역활을 시험하기 위해, 본 발명자들은 POI의 기능성 발현에 대한 L-아라비노즈(0.001%, 0.01%, 0.1%, 및 1%)의 효과를 평가하였다. 37℃에서 4시간 항온처리 후, 세포를 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 분해 완충액(GFP 및 루시퍼라제의 경우, 25mM 트리스-HCl pH 8.0, 300mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100; HRP의 경우, 25mM 트리스-HCl pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM CaCl2, 2.5μM 헤민, 10mM β-머캅토에탄올) 속에 재현탁시키고, 초음파처리하고, 원심분리하여 세포 부스러기를 단리하였다. 수득된 상층액을 25mM 인산염 pH 8.0, 300mM NaCl을 함유하는 완충제로 평형화시킨 Ni2+- 니트릴로아세트산-아가로즈(Expedeon) 컬럼 위에 주입하였다. 결합된 단백질을 25mM 인산염 pH 8, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸을 함유하는 용출 완충액으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 농축시키고 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 슈퍼덱스(Superdex) S-200 10/300 GL 컬럼(GE healthcare) 및, HRP의 경우 25mM 트리스-HCl pH 8.0, 5mM CaCl₂, 산화된 0.3mM L-글루타티온 및 GFP 및 루시퍼라제의 경우 25mM 트리스-HCl pH 8.0을 함유하는 완충액을 사용하여 정제하였다. SEC 분획의 순도는 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다.

이. 콜라이내에서 단백질 발현

각각의 클론의 발현을 위하여, 단일의 양성 콜로니(single positive colony)를 새로이 형질전환된 플레이트로부터 선택하여 가나마이신(50 μg/mL, pRSF1b 벡터 상의 단백질 유전자의 경우), 암피실린(100 μg/mL, pBAD/HisB 벡터 상의 단백질 유전자의 경우), 또는 선택 마커로서 사용된 둘 다(공-형질전환)가 들어있는 100 mL LB 브로쓰 속에서 성장시켰다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 12.5 mL의 출발 배양물을 사용하여 500 mL의 LB 브로쓰에 접종하고 흡광도(OD600)가 0.4-0.5에 도달할 때까지 성장하도록 하였다. 이후에, 단백질 발현을 0.4 mM IPTG(pRSF 벡터), 0.1% L-아라비노즈(pBAD 벡터), 또는 둘 다(공-형질전환)를 사용하여 유도하였다. 본 발명자들은 GFPuv의 기능성 발현에 대한 L-아라비노즈(0.01%, 0.1%, 및 1%)의 효과를 평가함으로써 캡슐화된 POI의 엄격하게 조절된 상대적인 발현의 역활을 시험하였다. 37℃에서 4시간 항온처리 후, 세포를 13,750 xg에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 분해 완충액(25mM 트리스-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5) 속에 재현탁시키고, 초음파처리하고, 원심분리하여 세포 부스러기를 단리하였다. 수득된 상층액을 2-단계 크로마토그래피 과정을 사용하여 정제하였다. pRSF 클론을 HiPrepTM 페닐 FF(low sub) 16/10(GE healthcare)을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 이어서, Superdex S-200 10/300 GL 컬럼(GE healthcare)을 사용하여 SEC에 적용하였다. pBAD 클론을 Ni-NTA(Expedeon) 컬럼 크로마토그래피에 이어 SEC에 적용하였다. 융합 단백질을 Ni-NTA 및 SEC를 사용하여 정제하였다. SEC 분획의 순도를 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석하였다. 사용된 완충액은 다음과 같았다: HIC: 완충액 A, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH 7.5; 완충액 B, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5; Ni-NTA 크로마토그래피: 완충액 A, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5; 완충액 B, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 7.5; SEC: 25 mM 트리스-HCl, pH 8; 모든 완충액은 분해, 정제에 사용하였고, HRPC 클론의 검정(assay)은 5 mM CaCl₂ 및 2.5 μM 헤민(40 mM의 원료 용액은 25 mg의 헤민을 1 mL의 1.4 N 수산화암모늄 속에 용해하여 제조하였다)으로 보충하였다.

봉입체(Inclusion body) POI 발현, 가용화, 및 정제

각각의 POI의 발현 후, 세포를 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 분해 완충액(1.5% 트리톤 X-100, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5-8) 속에 재현탁시키고, 초음파처리하고, 원심분리하여 세포 펠렛을 단리하였다. 세포 펠렛을 세척 완충액(0.5% 트리톤 X-100, 25 mM 트리스-HCl, 200 mM NaCl, pH 8 및 25 mM 트리스-HCl, 0.5 M NaCl, 2 M 우레아, pH 8) 속에 재현탁시키고 원심분리하여 세포 펠렛을 단리하였다. 펠렛을 가용화 완충액(25 mM 트리스-HCl, 6 M GuHCl, 0.5 M NaCl, pH 8) 속에 재현탁시켜 봉입체를 가용화시킨 후 세포 부스러기의 단리를 위해 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 수득된 상층액을 완충액 A로 평형화된 Ni2+-NTA 컬럼을 사용하여 정제하였다. 결합된 단백질을 완충액 B로 용출시켰다. 용출된 분획의 순도는 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다.

tES의 경우, 상층액은 2 단계 크로마토그래피 과정을 사용하여 정제하였다. pRSF 클론을 HiPrepTM 페닐 FF(low sub) 16/10(GE Healthcare)을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 이어서 Superdex S-200 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare)을 사용하는 SEC에 적용하였다. pBAD 클론를 Ni-NTA(Expedeon) 컬럼 크로마토그래피에 이어 SEC에 적용시켰다. 융합 단백질을 Ni-NTA 및 SEC를 사용하여 정제하였다. SEC 분획의 순도를 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석하였다. 사용된 완충액은 다음과 같았다:

HIC: 완충액 A, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 M (NH4)2SO4, pH 7.5; 완충액 B, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5.

Ni-NTA 크로마토그래피: 완충액 A, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5; 완충액 B, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 7.5.

SEC: 25 mM 트리스-HCl, pH 8.

HRPC 클론의 분해, 정제, 및 검정을 위해 사용된 모든 완충액을 5 mM CaCl₂ 및 2.5 μM 헤민(40 mM의 원료 용액은 25 mg의 헤민을 1 mL의 1.4 N 수산화암모늄 속에 용해시켜 제조하였다)으로 보충하였다.

단백질 농도, 철 검정, 및 크기 측정

단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도를 Nanodrop (DeNovix) 및 몰 흡광 계수를 사용하여 측정함으로서 비어-램버트 방정식(Beer-Lambert's equation)으로 측정하였다. 가공된 NE 속의 총 철 함량은 분광광도계적으로 측정하였다(Sana, B. et al., J. Biol. Chem. 288, 32663-32672 (2013)). 요약하면, 단백질 샘플을 50mM 질산으로 처리하여 변성시키고 10mM 바토페난트롤린 디설폰산, 20mM 디티오나이트, 및 250mM 트리스 완충액, pH 8.0과 혼합하였다. 혼합물을 밤새 항온처리하고 철 농도를 538 nm(ε538 = 22.1 mM-1 cm-1)에서 복합체의 흡광도로부터 측정하였다. 가공된 NE 및 WT AfFtn의 입자 크기 측정은 1회용 큐베트(cuvette) 속에서 제타사이저(zetasizer) (Nano-ZS90, Malvern)를 사용하는 동적 광 산란(DLS) 기술에 의해 수행하였고, 평균 유체 역학적 직경은 10회 작동의 산술 평균을 취함으로써 측정하였다. 측정은 25℃에서 100μM의 단백질 농도로 수행하였다.

웨스턴 블롯 분석

샘플(정제된 단백질 또는 세포 분해물)을 12% SDS 겔 속에 용해하고 i 블롯 장치(Life Technologies)를 사용하여 니트로셀룰로즈 막 위에 이전시켰다. 막을 1X PBS로 세척하고, 밤새 PBST(0.05% 트윈-20이 들어있는 PBS) 속에서 5% 블롯팅-등급 차단제로 차단하였다. 블록을 제거하고 막을 항체(c-Myc (9E10) HRP, 마우스 모노클로날 IgG1 또는 His-프로브(H-3) HRP, 마우스 모노클로날 IgG1, 1:500 희석)와 함께 항온처리하였다. 록커(rocker) 위에서 30분 항온처리 후, 막을 PBST로 3회 세척하고 블롯을 화학발광성 HRP 기질로 전개시켜 단백질 밴드를 검출하였다.

열적 비폴딩 연구

원거리(far)-UV CD 스펙트럼(260-190nm)을 키라스캔 원평광 이색성 분광기(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)(Applied Photophysics)를 사용하여 기록하였다. 단백질 샘플(0.1mg/ml)을 10mM 인산염 완충액 속에 용해하고, 측정을 실온에서 0.1cm 길이의 마개처리된 큐베트를 사용하여 수행하였다. 열-유도된 단백질의 변성은 단백질 용액을 1℃/min의 속도로 가열함으로써 수행하고, 스펙트럼은 1℃ 변화마다 기록하였다. 다른 시험에서, 0.5 μM tES(+)F116H/tES-HRPC 또는 tES(+)F116H/tES rLuc, 50 μM HRPC, 및 80 μM rLuc 단백질 샘플을 검정 완충액(25 mM 트리스-HCl pH-8.0) 속에서 21.5, 37, 55, 65, 및 75℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 샘플을 냉각시키고 이들의 활성을 평가하였다. 열 쇼크 시험(heat-shock test)을 위해, 0.5 μM tES(+)F116H/tES-rLuc 및 80 μM rLuc 단백질 샘플을 25 mM 트리스-HCl(pH 8) 속에서 80℃에서 5분 동안 항온처리한 후, 단백질 샘플을 0℃에서 5분 동안 냉각시켰다. 이러한 공정을 5 및 10회 주기로 반복한 후 단백질 활성을 평가하였다.

트립신 분해

0.5 μM tES(+)F116H/tES-HRPC 또는 tES(+)F116H/tES-rLuc, 50 μM HRPC, 및 80 μM rLuc 단백질 샘플을 0.4% 트립신-EDTA 용액으로 37℃에서 0, 30, 60, 90, 120, 및 150분 동안 처리한 후 이들의 활성을 분석하였다.

우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 아세토니트릴, 및 메탄올 안정성 시험

단백질 안정성에 대한 우레아, GuHCl, ACN, 및 MeOH의 효과는 0.5 μM tES(+)F116H/tES HRPC 또는 tES(+)F116H/tES-rLuc, 50 μM HRPC, 및 80 μM rLuc 단백질 샘플을 8 M 우레아, 6 M GuHCl, 30% ACN, 및 20% MeOH 각각을 함유하는 검정 완충액(pH 8)으로 21.5℃(MeOH의 경우 45℃)에서 0, 10, 20, 30, 40, 및 50분 동안 처리함으로써 평가하였다. 항온처리 후, 단백질 샘플을 검정 완충액으로 완충액 교환하고 이들의 활성을 평가하였다.

시험관내 검정 개발

GFP, 및 HRPC 및 rLuc 활성을 세포 분해물 및 정제된 단백질 둘 다로부터 둘 다 형광성, 비색계 및 발광성 검정 각각을 통해 측정하였다. GFP의 경우, tES(+)F116H/tES-GFPuv, tES-GFPuv, 및 GFPuv의 형광성을 508 nm에서 96-웰의 검정색 폴리스티렌 플레이트(Fisher Scientific) 속에서 395nm에서 고정된 여기 파장을 사용하여 판독을 수행하거나 형광성을 10-mg 세균 펠렛(0.8 OD에서 유도시키고 24시간 동안 배양함)으로부터의 상층액을 사용하여 96-웰 검정색 폴리스티렌 플레이트(Fisher Scientific) 속에서 508nm에서 판독하였다. tES(+)F116H/tES-HRPC, tES-HRPC, 및 HRPC의 활성을 TMB 기질을 사용하여 96-웰 결정-선명한 폴리스티렌 플레이트(Greiner Bio-One) 속에서 평가하였다. 요약하면, 분획을 25mM 트리스-HCl pH-8.0, 5mM CaCl₂, 2.5μM 헤민을 함유하는 검정 완충액 속에서 5분 동안 항온처리하였다. TMB 기질을 발색을 위해 가하고 반응을 2M H₂SO₄을 사용하여 5분 후에 중지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 기록하였다. 모든 루시퍼라제 반응이 백색 내부를 지닌 96-웰 플레이트 내에서 주위 온도(24 내지 27℃)에서 일어났으며 적어도 3회 수행하였다. 크로마토그래피 정제 후, 등몰 농도(500 nM)의 정제된 h6NE-루시퍼라제(+), h6NE루시퍼라제(-), 및 h6NE-루시퍼라제(+/-)를 루시퍼라제 활성에 대해 기질로서 D-루시페린 칼륨 염을 사용하여 평가하였다. 반응을 D-루시페린 칼륨 염(최종 농도 200μM), 50mM 트리스-Cl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 2mM EDTA, 100μM ATP, 0.1% BSA를 함유하는 50μl의 완충액을, 50μl의 단백질 샘플에 주입하여 개시하였다. 정제된 tES(+)F116H/tES-rLuc, tES-rLuc, 및 rLuc를 제조업자의 지시사항에서 일부 변형된 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 키트(Promega)를 사용하여 평가하였다. 반응은 50 μL 레닐라 루시퍼라제 검정 시약(검정 완충액 중 1:1,000 희석의 코엘렌트라진)을 주입함으로써 개시하였다. 신호(signal)를 1분 동안 2 s 지연과 통합하고 발광성을 상대적인 광 단위(Relative Light Units : RLU)로 측정하였다. 루시페린-함유 완충액은 튜브를 알루미늄 호일로 덮어서 모든 시간에서 광으로부터 보호하였다. 재조합 루시퍼라제(10nM) 및 AfFtn△C(-)를 양성 및 음성 대조군으로서 각각 사용하였다. 효소 동적 연구(enzyme kinetic study)를 위해, 반응을 50mM 트리스-Cl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 2mM EDTA, 100μM ATP, 0.1% BSA를 함유하는 완충액 속에서 수행하였다. h6NE-루시퍼라제(+/-) 및 재조합 루시퍼라제에 대한 정상 상태 개시속도, V0, (RLU/sec)는 반응을 상이한 농도의 D-루시페린 칼륨 염으로 개시함으로써 측정하였다. 신호를 1분 동안 2초 지연과 통합시키고 RLU로 기록하였다. 미카엘리스 상수(Michaelis constant), Km을 계산하기 위해, 그래파드 소프트웨어 패키지(Graphpad software package)(윈도우용 GraphPad Prism 5.01)를 사용하였다. 모든 판독치를 퍼킨 엘머 플레이트 판독기(Perkin Elmer Plate reader) 상에 기록하였다. 실험을 3회 반복하고 결과를 평균 ± SEM(n=3)으로 나타내었다. 적절한 대조군을 각 경우에 사용하여 배경을 최소화하였다.

케이지 파괴 연구 및 기능성 단백질의 방출

POI―GFP, rLuc 및 HRP를 함유하는 가공된 pH-반응성 NEF116H 쉘을 앞서 기술한 바와 같이 정제하였다. 정제된 단백질을 케이지 해체를 위해 25mM 트리스-시트레이트 완충액, pH 5.8 속에서 30분 동안 산성화시켰다. 샘플을 25mM 트리스-시트레이트 완충액 pH 5.8을 사용하는 SEC(Superdex S-200, 10/300 GL 컬럼)에 이어서, SDS-PAGE 분석에 적용시켰다. 각각의 분획의 GFP, rLuc 및 HRP 활성을 앞서 기술한 바와 같이 분석하였다. NE 소단위로부터 기능성 POI의 방출은 소(bovine) FXa/TEV 프로테아제로 절단함으로써 연구하였다. 요약하면, SEC에서 h6NE-POI의 용출에 상응하는 케이지 파괴 분획을 FXa 절단에 37℃에서 4 시간 동안(34℃에서 5시간 동안 TEV 절단) 적용시켰다. 반응 혼합물을 SDS 겔에 이동시키고 단리된 POI 밴드를 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다.

tES(+)F116H 쉘 속에서 융합된 POI의 시험관내 폴딩

POI 샘플(1 μM)을 60℃에서 30분 동안 가열한 후, 이의 pH를 6 M GuHCl을 사용하여 5.8로 조절하였다. POI를 tES(+) 소단위(25 mM 트리스-HCl 중)의 존재하에서, 90:1, 60:1, 30:1, 20:1, 10:1, 및 0:1의 소단위 대 POI 비로 항온처리하였다. 혼합물의 pH를 8로 조절하고 샘플을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 혼합물을 재폴딩 완충액(25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 8; HRPC: 25 mM 트리스-HCl, 0.6 M GuHCl, 0.35 mM 산화된 글루타티온, 0.044 mM DTT, 7% 글리세롤, 5 mM CaCl2, 20 μM 헴(heme), pH 8.5) 속에서 Slide-A-Lyzer® 투석 카세트 G2(Thermo Scientific)를 사용하여 투석하였다. 재폴딩된 단백질을 Ni-NTA 크로마토그래피에 이어서 상기 기술한 바와 같은 SEC를 이용하여 정제하였다. 용출된 피크 주변의 분획을 수집하고 이들의 활성을 분석하여 POI를 함유하는 분획을 확인하였다.

tESF116H 쉘 속에서 융합되지 않은 POI의 세포-유리된 캡슐화

봉입체 정제 프로토콜은 본원에 기술된 바와 동일하다. POI 샘플(HRPC, GFPuv 또는 rLuc(레닐라 루시퍼라제; 씨 판시(sea pansy), 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)로부터의 36kDa 단백질)를 60℃에서 30분 동안 가열한 후, 이의 pH를 6 M GuHCl을 사용하여 5.8로 조절하였다. POI를 tES(+)F116H 소단위(25 mM 트리스-HCl 중)의 존재하에서, 60:15, 60:12, 60:10, 60:8, 60:5, 60:3 및 60:1의 소단위 대 POI의 비로 항온처리하였다. POI를 또한 tES(-)F116H 소단위(25 mM 트리스-HCl 중)의 존재하에서 60:10 및 60:8의 소단위 대 POI의 비로 항온처리하였다. 혼합물의 pH를 8로 조절하고 샘플을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 혼합물을 재폴딩 완충액(25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 8; HRPC: 25 mM 트리스-HCl, 0.6 M GuHCl, 0.35 mM 산화된 글루타티온, 0.044 mM DTT, 7% 글리세롤, 5 mM CaCl₂, 20 μM 헴, pH 8.5) 속에서 Slide-A-Lyzer® 투석 카세트 G2(Thermo Scientific)를 사용하여 투석하였다. 재폴딩된 단백질을 상기 기술된 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 용출된 피크 주변의 분획을 수집하고 이들의 활성을 분석하여 POI를 함유하는 분획을 확인하였다.

tESF116H 쉘 속에서 융합되지 않은 핵산의 세포-유리된 캡슐화

ssDNA 캡슐화의 경우, 110 nM의 ssDNA(프라이머 서열 - 5'/5Phos/TAT GCT GGC GGG CCC GCA GAT GCA TGG TAC TAG TTC CAT GGT GGT GAA AAT TTG CGG CAT TAA AAG CCT GGA AGA ACT GGA AAT TGT GGA AAA ACA TG -3')를 tES(+)F116H 소단위(25 mM 트리스-HCl, pH 5.8 중)와 함께, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 및 1:60의 ssDNA 대 tES(+)F116H 몰 비로 항온처리하였다. 혼합물의 pH를 8로 조절하고 샘플을 4℃에서 30분 동안 항온처리한 후, 이를 사용할 때까지 빙상에 저장하였다. ssDNA로 재조립된 tES(+)F116H를 2 단위의 DNase I(New England Biolabs로부터 입수)과 함께 37℃에서 15분 동안 처리한 후, 50 mM EDTA(5 mM의 최종 농도로)를 가하여 반응을 중지시켰다. 동일한 양의 네이키드(naked) ssDNA를 대조군으로서 사용하였다. 모든 샘플을 이어서 DNA-로딩 완충액과 함께 항온처리하고 2% 아가로즈 겔 상에 로딩하였다. ssDNA에 대해 영상화한 후, 동일한 겔을 꼬마지에 블루 용액(Coomassie blue solution)과 함께 항온처리하여 쉘 단백질을 검출하였다.

플라스미드 캡슐화를 위해, pRSF 플라스미드를 tES(+)F116H 소단위(25 mM 트리스-HCl, pH 5.8 중)와 함께, 1:1000의 ssDNA 대 tES(+)F116H 몰 비로 항온처리하였다. 혼합물의 pH를 8로 조절하고 및 샘플을 4℃에서 30분 동안 저장한 후, 이를 사용할 때까지 빙상에 저장하였다. 동일한 양의 tES(+)F116H를 대조군으로서 사용하였다. 샘플 둘 다는 투과 전자 현미경(TEM) 하에서 관찰하였다.

POI의 내부화

ELISA-기반 에피토프 보호 검정, TEV 프로테아제 검정, 및 항-c-Myc 항체를 사용한 공-면역침전을 수행하여 NE 쉘 내 POI의 내부화를 연구하였다.

tES(+)F116H 쉘의 글루타르알데하이드-가교결합

글루타르알데하이드(1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.05%)를 PBS 완충액, pH 7.4 중 정제된 tES(+)F116H (tES(+)F116H 농도: 5 mg/ml)에 가하고 샘플을 6시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 과량의 글루타르알데하이드를 이어서 illustra^TM NAP^TM 5 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 제거하였다. 이후에 tES(+)F116H를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 Superdex^TM S-200 10/300 GL 컬럼(GE healthcare)(SEC 완충액-PBS, pH 7.4)을 사용하여 정제하였다. 1 ml의 분획을 6.8 내지 16.8 ml의 SEC 용출물로부터 수집하고 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다.

ELISA-기반 에피토프 보호 검정

요약하면, 96-웰 플레이트를 마우스 항-cMyc 항체(블록 용액[0.05% PBST 중 4% BSA] 속에서 1:500 희석)로 코팅하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBS로 2회 플레이트 세척기를 사용하여 세척하고 블록 용액으로 처리하였다. 1시간 후, 블록 용액을 제거하고 단백질 분획(pH 8.0 및 pH 5.8 분획)을 노출된 항원 결합을 위해 가하였다. 마이크로 플레이트 진탕기 상에서 1000 rpm에서 실온으로 5분 항온처리 후, 웰을 PBS로 3회 세척하고 HRP 활성을 TMB 시약을 사용하여 정량화하였다. GFP를 사용하여, 결합된 항원을 토끼 모노클로날 GFP 항체(블록 용액 속에서 1:2000 희석됨)에 이어서 제2 항체 HRP-접합된 항-토끼 IgG 항체(블록 용액 속에서 1:5000 희석됨)로 처리하였다.

TEV프로테아제-기반 에피토프 보호 검정

요약하면, h6NE-GFPTEV(+) 및 h6NE-GFPTEV를 TEV프로테아제 절단에 34℃에서 2시간 동안 적용시켰다. 프로테아제 대 단백질의 비는 1:2이었다. 항온처리 후, 반응 혼합물을 SDS-PAGE 위에서 단리하고 단백질 밴드를 앞서 기술한 바와 같이 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였다.

항-c-Myc 항체를 사용한 공-면역침전

페리틴 케이지 내에 루시퍼라제를 감금하는 것은 Thermo Scientific^TM Pierce^TM c-Myc 태그 IP/Co-IP 키트(제품 번호 23620)를 사용하여 확인하였다. 요약하면, 1μM h6NE-루시퍼라제(+/-)를 10μl의 항-c-Myc 아가로즈 슬러리와 4℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 슬러리를 0.05% 트윈 20(TBS-T)으로 3회 세척하고 유동 통과물(flow through)을 수집하였다. 항-c-Myc 결합된 단백질을 30uL의 용출 완충액을 첨가하여 용출시켰다. h6NE-루시퍼라제 및 AfFtn△C(+)을 양성 및 음성 대조군으로서 각각 사용하였다. h6NE-루시퍼라제(+/-), -AfFtn△C(+), 및 h6NE-루시퍼라제에 대한 유동 통과물 및 용출물 분획을 15% SDS 겔 위에서 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 접합된 개똥벌리 루시퍼라제 염소 폴리클로날 항체 HRP를 표준 프로토콜 하에서 사용하였다.

시험관내 세포 표적화를 위한 NE 쉘의 표면 변형

요약하면, NE 쉘을 10 mg/ml(최종 농도) 설포-SMCC 및 10uM(최종 농도) Atto647 염료와 함께 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 설포-SMCC 및 Atto647 둘 다를 NE 쉘에 1차 아민을 통해 이의 표면에 연결하였다. 설포-SMCC- 및 Atto647-태그된 NE 쉘을 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 과량의 결합하지 않은 설포-SMCC 및 Atto647을 제거하였다. 정제된 단백질을 농축시키고 GE11 또는 D4 펩타이드(펩타이드는 이의 C-말단에서의 시스테인과 가교결합제 설포-SMCC 사이에 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 NE 쉘의 표면에 커플링시킬 수 있다)와 함께 추가로 항온처리하였다. 펩타이드-커플링된 NP 쉘을 크기 배출 크로마토그래피로 단리하였다. GE11 및 D4 펩타이드 둘 다는 유의적인 유사분열유발인자 활성(mytogenic activity)없이 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 것으로 알려져 있다(Zarschler, et al., Nanoscale 6:6046-6056 (2014)). EGFR는 암 세포 상에서 과발현되며 종양 부위에 대해 선택적인 효율적인 표적화 모이어티(moiety)인 것으로 고려된다(Konho, et al., Eur J Cancer. 47:773-783 (2011)).

세포 흡수 연구

EGFR을 과발현하는 것으로 알려진 3중 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 사용하여 NE 흡수를 연구하였다. 요약하면, 세포를 Chambered Nunc Borosilicate #1 커버글래스(coverglass) 위에서 완전 배지의 존재하에 성장시켰다. 24시간 후, 배지를 분배하고, 세포를 PBS로 세척하고, 1uM의 GE11-NP 또는 D4-NP를 함유하는 신선 배지와 함께 3시간 동안 항온처리하였다. 세포를 공초점 현미경 하에서 관찰하였다.

결과

실시예 2: 열안정성 엑소쉘(thermostable exoshell)(tES)의 가공

AfFtn 조립체의 내부를 가공하여 케이지 용적을 최대화하고 내부화된 단백질의 폴딩 요건을 수용하였다. 야생형(WT) AfFtn의 1차 서열 및 결정 구조의 조사 결과, 소단위 계면 잔기가 주로 소수성이며 내부 속의 잔기가 음으로 하전되어 있음을 나타내었다(Johnson, E. et al., Structure. 13,637-648 (2005)). 종합하면, ~25kDa 및 72 음성 전하는 WT 소단위의 구조화되지 않은 C-말단으로부터 AfFtn 조립체의 내부 용적에 기여한다. 본원에 기술된 가공된 NE는 잔기 164번에서 C-말단 절단된 돌연변이체이다(도 7a 내지 도 7f). 절단된 AfFtn과 WT AfFtn의 크기 배제 프로파일 사이의 비교는 C-말단 절단이 나노케이지 조립체에 영향을 미치지 않았음을 입증하였다. 놀랍게도, 분석적 광 산란 연구는 심지어 저 염 농도에서도 C-말단의 제거가 조립체를 안정화시켰음을 나타내었다(도 1b).

조립체를 추가로 가공하여 단백질 발현 및 폴딩에 대한 나노환경내 전하의 효과를 시험하였다. 친수성 매칭(matching)은 이에 의해 단백질이 내부 하전된 잔기에 대해 외부를 규정하는 메카니즘으로 제안되어 왔다(Seebeck, F.P. et al., K.J. J. Am. Chem. Soc. 128, 4516-4517 (2006)). 매크로글로불린 폴딩에 대한 전하 상보성 시도를 시험하기 위해, 내부에 면하고 있는 잔기를 돌연변이시켜 내부 강(internal cavity)에서 순 양성, 음성, 및 중성 전하를 제공하였다(도 7a 내지 도 7f 및 도 8a 내지 도 8c). 양성 쉘은 각각 tES(+), tES(+/-), 및 tES(-)에 대해 412, 402, 및 237 mg/L(ImageJ 소프트웨어를 사용한 농도측정법에 의해 평가된 전체 세균 단백질의 각각 대략 36%, 35.23%, 및 20.76%)의 평가된 수율로 중성 및 음성 쉘보다 더 높은 발현을 나타내었다. 그러나, 모든 NE는 유사한 유체역학적 직경을 나타내었다(도 9a 내지 도 9f).

실시예 3: tES의 철 흡수 품질

천연의 AfFtn 쉘은 생리학적 철-저장 단백질이다; 따라서 본 발명자들은 tES 변이체가 본 발명자들의 정제된 제제 속에서 또는 시험관내 철 로딩 프로토콜에 노출되는 경우 또한 철을 보유하는지를 시험하였다(Macara IG, et al., The Biochemical journal 126, 151-162 (1972)). 등몰량(1 μM)의 tES(+), tES(-), tES(+/-), 및 시판되는 말 비장 페리틴을 비교하고 본 발명자들은 정제된 tES 변이체에서 검출가능한 철 코어(iron core)가 없음을 관찰하였다(도 10a)(Johnson, E. et al., Structure. 13,637-648 (2005)). 이후에, 철 흡수를 등몰량(1 μM)의 야생형 AfFtn, tES(+), tES(-), tES(+/-), tES(+)F116H, tES(+)F116H/tES-GFPuv, tES(+)F116H/tES-HRPC, 및 tES(+)F116H/tES-rLuc를 사용하여 시험하였다. 야생형 AfFtn은 최대의 시험관내 철 흡수를 나타내었지만, 빈 tES 쉘은 페록시다제 중심(E128 및 E131) 근처에서 아미노산 치환으로 인하여 주목할만 하나, 보다 낮은 철 축적을 가졌다(Klenk HP, et al. Nature 390, 364-370 (1997)). tES(+) 및 tES(+)F116H 철 흡수이 비교는 정성적으로 유사하였으며, 이는 F116H 돌연변이가 철 흡수에서 효과가 거의 없었음을 나타내었다. 모든 3개의 tES(+)F116H/tES-POI는 야생형 AfFtn 및 빈 tES 변이체와 비교하는 경우 현저히 감소된(~1-2%) 철 흡수를 가졌다(도 10b).

실시예 4: 쉘 조립체에 대한 F116H 돌연변이의 효과

NE 쉘 조립체의 높은 안정성을 고려하여(도 11a 내지 도 11c), 온화한 pH 적정을 통해 내부화된 카고(cargo)를 캡슐화하여 방출할 수 있는 반응성 쉘을 생성하였다. NE는 온화한 산성 조건(5-6) 하에서 안정하다(도 12a 내지 도 12i). 서열 번호 1의 116번째 위치에서 페닐알라닌은 중요한 소단위내 접촉부로 확인되었으며 히스티딘으로 치환되었다(도 12a). 3회 폴딩 대칭 축내 이의 위치로 인하여, F116H 돌연변이를 예측하여 pH 5.8에 적용되는 경우 계면에서 상호 반발하는 상호작용을 생성하였다. 수득되는 쉘, tES(+)F116H, tES(-)F116H, 및 tES(+/-)F116H는 pH 5.8에서 거의 완전한 해체를 나타내었으며, pH 8에서는 안정하고 가역성인 조립체였다(도 1c 및 도 12a 내지 도 12i). 이러한 6개의 변이체를 사용하여, 나노규모 열안전성 쉘로 재조합 단백질을 둘러싸는 것이 내부화된, 기능성 단백질의 개선된 가용화, 기능성 폴딩, 및 조절된 방출을 생성할 수 있는지를 측정하였다.

실시예 5: 플라스미드 발현 시스템을 사용한 단백질의 캡슐화

개념의 증명으로서, 4개의 융합 단백질을 다중 단백질 기질을 사용하여 생성시켰다(도 2a). 캡슐화된 융합 단백질 대 쉘 성분의 화학량론은 1:23인 것으로 예측된다. 따라서, 2개의 플라스미드 시스템을 사용하여 주변 쉘 성분의 전반적인 과발현외에, 융합 단백질의 미세하게 적정가능한 발현을 달성하였다. 캡슐화를 위해, 다음의 폴리펩타이드를 선택하였다: (1) GFPuv(28kDa) ― 자외선에 의한 여기에 대해 최적화된 녹색 형광성 단백질 변이체 - 이는 이. 콜라이 내에서 매우 다양한 천연 발현을 나타내므로 전체 분해물 속에서 용이하게 검정되며, 형광단을 생성하기 위한 고유의 인자를 필요로 하지 않는다(Penna, T.C.V. et al., African J. Biotechnol. 3,105-111 (2004)); (2) 이의 활성에 대해 도메인간 알로스테릭 상호작용(allosteric interaction)을 필요로 하는 상대적으로 큰 효소를 시험하기 위한 개똥벌레 루시퍼라제(61kDa)―광-방출성, 아데닐레이크-형성 효소(Branchini, B.R. et al., J. Am. Chem. Soc.133,11088-11091 (2011); (3) 이. 콜라이내에서 보고된 가용성 발현을 가지지 않으므로, 4개의 이황화물 결합(이의 정확한 쌍화(pairing)는 이의 활성에 필수적이다)을 함유하고, 배합그룹(prosthetic group)으로서 헴을 필요로 하는 보다 도전적인 POI로서, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 동위효소 C (HRPC, 36kDa) ― 광범위하게 사용된 산업용 효소(Krainer, F.W. and Glieder, A. Appl. Microbiol. Biotechnol.99, 1611-1625 (2015); Ren, G. and Bardwell, J.C. Antioxid. Redox. Signal.14, 2399-2412 (2011)); 및 (4) 시험관내 재폴딩에 있어서 성공적인 앞서의 보고의 부재, 이의 비교적 높은 열 불안정성, 및 생발광성 리포터 효소로서 기능성 검정의 용이성으로 인한 레닐라 루시퍼라제(rLuc, 36 kDa). NE의 계산된 내부 용적(8 nm³)은 캡슐화의 경우 ~120 kDa의 상한치에 상응하며, 구체 마크로글로불(macroglobule)로 추정된다(Erickson, H. Biol Proced Online.15, 32-51 (2009)).

이. 콜라이 내에서, GFPuv는 조기 대수 성장 상(O.D.₆₀₀=0.4)에서 유도되는 경우 용이하게 검출가능한 발현을 나타내지만, 말기 지수 상(O.D.₆₀₀=0.8)에서 유도되는 경우 매우 낮은 발현을 나타낸다. 말기 지수 상에서 유도되는 경우, His-태그된(h6GFPuv), 및 단일의 NE 소단위에 융합된 GFPuv(h6NE-GFPuv)는 웨스턴 블롯팅에 의해 프로브되는(probed) 바와 같은 검출가능한 가용성 단백질을 생산하지 않았다. 그러나, 융합 단백질이 양성, 중성, 또는 음성 내부 전하의 NE(페리틴 소단위)와 함께 공-발현되는 경우, 웨스턴 및 꼬마지에-염색된 SDS 겔에서 명백한 밴드에 의해 명백한 바와 같이, 가용성 발현이 유의적으로 증가하였다(도 2b, 우측 및 좌측 패널 각각). h6NE-GFPuv(+)는 최대의 가용성 발현을 나타내었다. 유사한 결과가 HRPC 및 루시퍼라제(이. 콜라이 내에서 가용성 발현을 생성하는 것으로 이미 보고된 rLuc는 제외)로 관찰되었으며, 태그되거나 융합된 형태에 대해 검출가능한 가용성 발현은 없었고 선명한 밴드가 NE 공-발현의 존재하에서 관찰되었다. 융합 단백질 캡슐화의 중요성을 구체적으로 시험하기 위해, NE를 융합되지 않은 POI[h6POI + NE(+)]와 공-발현시켰으며, 이는 또한 무시할만한 발현을 나타내었다(도 2b; 우측 패널, 제2 레인). NE 소단위와 융합 NE-POI의 조립체는 Ni²⁺-친화성 크로마토그래피에 의해 추가로 뒷받침되며, 여기서 융합 소단위 상의 N-말단 His-태그는 비--His-태그된 쉘 소단위를 끌어당겨 조립체가 480kDa의 예측된 분자량에서 크기 배제 크로마토그래피 상에 공-용출되도록 하고 NE 및 NE-POI 소단위와 일치하는 SDS 겔에서 정제된 밴드를 입증한다(도 2c 및 2d).

실시예 6: POI는 기능성으로 발현된다.

POI의 기능성 발현에 대한 NE의 효과를 평가하였다. GFPuv 형광성은 관찰된 발현과 일치하였지만 h6GFPuv, h6NE-GFPuv, 및 h6GFPuv + NE(+)에 대한 분해물에서 유의적인 형광성은 없었다. 적정가능한 L-아라비노즈 프로모터 시스템, 및 에로서 GFPuv를 사용하여, POI의 기능성 발현에 대한 L-아라비노즈의 효과를 평가하였다(도 13a 내지 도 13d). 0.01% L-아라비노즈를 사용하여, 캡슐화된 GFPuv에 대해 최대 형광성을 관찰하였으며, NE(+)는 최대 활성을 나타내었다(도 3a). 양성, 중성, 및 음성 NE에서 등몰 농도의 정제된 루시퍼라제를 기질로서 D-루시페린을 사용하여 루시퍼라제 활성에 대해 평가하였다. h6NE-루시퍼라제(+/-)는 음성 및 양성 케이지(각각 >10-배 및 100-배)보다 더 높은 활성을 나타내었다(도 3b). NE(+) 쉘은 가용성 생성물의 최대 상대적인 농도를 생성하였으며, ImageJ 소프트웨어를 사용한 농도측정에 의해 분석된 바와 같이, GFPuv, HRPC, 및 rLuc 각각은 79.5, 74, 및 57 mg/L의 수율을 나타내었다. 본 발명자들은 이것이 POI의 순 음성 표면 전하와 NE(+) 내부 표면의 순 양성 전하 사이의 전하 보완성에 기인할 수 있다는 가설을 세웠다. tES(+)/tES-POI의 조립체는 히스티딘-태그된 융합 소단위에 이은 크기-배출 크로마토그래피(SEC)에 의해 쉘 성분을 끌어당켜 확인함으로써 tES/tES-POI 조립체를 확인하였다. 캡슐화 tES 소단위에 대한 tES-GFP, tES-HRP 및 tES-rLuc의 비는 정제된 단백질 분획의 겔 농도측정에 의해 평가된 바와 같이 1:23(각각 1:32, 1:19, 및 1:20)의 예측된 값과 거의 일치하였다.

따라서, h6NE-루시퍼라제(+/-) 촉매된 광-방출 반응의 동력학을 연구하고 이를 재조합 루시퍼라제의 것과 비교하였다(도 3c 및 3d). 동력학적 매개변수 Km 및 Vmax는 유리 루시퍼라제의 경우 각각 8.1±0.15μM 및 14943±3889μM/s이었으며 h6NE-루시퍼라제(+/-)의 경우 각각 16.21±0.819μM 및 2412±295μM/s이었다. Vmax에 있어서의 감소(6-배) 및 Km에 있어서의 증가(2-배)는 주변 케이지를 둘러쌈에 의해 부여된 생성물 및 기질의 확산 제한과 잠재적으로 관련되어 있다. 또한, NE의 제한된 공간내 효소의 구조적 유연성에 있어서의 구속은 이러한 변화에 기여할 수 있었다(Sundlov, J.A. et al., Biochemistry 51,6493-6495 (2012)).

HRPC는 이. 콜라이의 환원 환경이 이황화물 결합의 형성을 허용하지 않지만, 이. 콜라이내 천연 헴 발현은 과발현된 단백질을 공급하기에 충분하지 않을 수 있다는 점에서 복합체 챌린지를 나타낸다. 이. 콜라이 내에서 HRPC의 기능성 발현은 이전에 보고되지 않았다. NE를 사용하여, 이. 콜라이 내에서 HRPC의 기능성 발현을 보충적 산화 및 공지된 보조인자, 칼슘 및 헴을 첨가하여 달성하였다(도 3e). 특히, 모든 발현 후 HRPC 첨가는 8M 우레아를 사용하는 앞서 기술된 봉입체 재폴딩 프로토콜과는 대조적으로, 수성 완충액 속에서 수행하였다. HRPC 활성에 대한 보조인자/첨가제의 효과는 NE 쉘 내에서 평가되었다. HRPC 활성은 보조 인자 칼슘 및 헤민과 첨가제(산화제 및 환원제)의 존재하에서 동일한 조건 하에 가공된 세포 분해물로부터 평가하였다. 활성은 환원 조건 하에서 최소이었고 산화된 글루타티온 또는, 산화된 글루타티온과 환원된 글루타티온의 1:1 혼합물 중의 어느 하나를 가하는 경우 최대이었다. 유사하게, 최대 활성 만을 보조인자 둘 다의 존재하에서 수득할 수 있었다(도 3f).

실시예 7: 시험관내 폴딩에 대한 상이한 tES:tES-GFPuv 비의 효과

단백질의 시험관내 폴딩을 보조하는 tES의 능력을 시험하였다. tES(+)F116H 조립체는 PBS 대조군과 비교하여, 8 M 우레아 또는 6 M 구아니디늄 하이드로클로라이드(GuHCl)로 처리한 후 SEC에서 유사한 용출 프로파일에 의해 입증된 바와 같이 pH 8.0에서 매우 안정하다. 유사하게, tES(+)F116H는 검출가능하지 않은 침전물을 사용하지 않은 pH 적정으로 가역적으로 연합되고 해리될 수 있다. 이후에, 본 발명자들은 tES가 POI를 변성시킬 수 있는 조건 하에서 기질 단백질을 기능적으로 캡슐화할 수 있다고 가설을 세웠다. tES 융합 단백질은 공-발현된 tES의 부재하에서 봉입체로서 발현한다. 따라서, tES(+)F116H를 사용하여, 본 발명자들은 5.8로부터 8.0까지의 pH 이동을 사용하여 tES 대 tES-POI의 비를 시험함으로써 쉘의 조립체를 유도하였다. tES-GFPuv에 대한 tES(+)F116H의 첨가는 기능성 수율에 있어서 ~100-배 증가를 생성하였으며, 이는 90:1 비의 tES(+)F116H 소단위 대 tES-GFPuv에서 최대이었다(도 4a). 본 발명자들은 봉입체 현탁액을 6 M GuHCl 및 10 μM β-머캅토에탄올의 존재하에서 60℃로 가열하는 것이 최대 최종 수율을 위해 중요하였음을 발견하였다.

실시예 8: 기능성 시험관내 단백질 폴딩을 위한 tES의 요건

pH 적정 결과(도 4a)를 기반으로 하여, 본 발명자들은 pH 5.8에서 6 M GuHCl 속에서 모든 성분으로 출발하여 60:1 비의 tES(+)F116H:tES-POI를 사용한 표준 프로토콜을 개발하였다. 단백질-특이적인, 해독 후 필요한 제제를 가한 후 용액을 pH 8.0에서 GuHCl-유리된 완충액에 대해 투석하였다(도 20). 이러한 프로토콜을 사용하여, 본 발명자들은 tES-GFPuv, tES-rLuc, 및 tES-HRPC의 기능성 시험관내 폴딩을 위한 tES의 거의 절대적인 요건을 입증한다. 동일한 프로토콜 하에서, GFPuv, HRPC, 또는 rLuc의 매우 적거나 비 기능성인 수율이 tES의 부재하에서 관찰되었다(도 4b). 단백질 활성의 유사한 양식이 이. 콜라이내에서 가용성 단백질로서 발현되는 것으로 알려진, rLuc를 제외하고는 이. 콜라이 분해물 속에서 관찰되었다(도 4c)(Lorenz WW, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88, 4438-4442 (1991)).

실시예 9: POI의 내부화

pH-적정가능한 NE 쉘을 사용하여, 내부화된 POI의 에피토프를 숨기고 이를 단백질분해로부터 보호하는 NE의 능력을 나타냄으로써 POI의 내부화를 입증하였다. POI를 아마도 내부안에서 잔기에 융합시키는, E 나선형의 강(cavity)을 면하고 있는 C-말단에 융합시킨다. 모든 시험한 조립체는 동일한 확산 직경(~12nm)을 가졌으며(도 9a 내지 도 9e), pH 8.0에서, 모든 조립체는 POI-캡슐화된 NE의 것과 동일한 예측된 유체역학적 직경을 지닌 피크로서 용출하였다(도 9a 내지 도 9e). GFPuv 및 HRPC 활성 둘 다는 이러한 피크에서 관찰될 수 있었다. pH 5.8에서, 단백질 활성은 조립체에 대한 것으로부터 명백한 피크로 및 융합 단백질의 예측된 분자량으로 이동하였다(도 5a). POI의 내부화를 시험하기 위하여, 에피토프 보호 검정을 POI에 대해 특이적인 항체를 사용하여 개발하였다. pH-적정가능한 NE를 사용하면, 유의적으로 더 높은 신호가 조립된 형태로 적용된 동일한 샘플에 대해 케이지 해체 후 관찰되었다(도 5b). GFPuv의 추가의 검정은 캡슐화를 사용하여 프로테아제를 보호하나 단리된 융합 단백질로서는 그렇지 않음을 입증하였다(도 5c). 끌어당김 검정(pull-down assay)을 사용하여 루시퍼라제 캡슐화를 연구하였으며, h6NE-루시퍼라제의 특이적인 끌어당김(유동 통과로부터의 부재 및 용출물 속에서의 존재)을 나타내었지만, h6NE-루시퍼라제(+/-)는 끌어당김으로부터 보호되었고 유동 통과물 속에서 명확하게 가시적이었다(도 5d). 융합체로부터 POI를 단리시켜 독립적으로 폴딩된 및 가용화된 단백질을 생산하는 능력을 또한 시험하였다. 웨스턴 블롯 분석은 천연의 POI와 일치하는 밴드를 생산하기 위한 POI의 성공적인 단백질분해적 단리(GFPuv 및 HRPC)를 입증하였다(도 5e).

실시예 10: 가공된 페리틴 조립체의 세포 표적화

도 15는 MDA-MB-231 암 세포주에 의한 가공된 페리틴 조립체(나노쉘)의 효율적인 세포 표적화 및 흡수를 나타낸다. 이러한 연구에서, 폴리펩타이드는 나노쉘 내로 캡슐화되지 않았다. 내부화된 입자의 소낭 및 세포질성 국재화가 관찰된다.

실시예 11: tES(HRPC 또는 rLuc)를 사용한 POI의 안정화

본 발명자들은 내부화된 단백질에 열안정성 품질을 부여하는 tES의 능력을 시험하였다. GFPuv는 이의 천연 형태에서 매우 안정하다. 따라서, 본 발명자들은 rLuc 및 HRPC 대 캡슐화되지 않은 대조군을 시험하여 tES 캡슐화의 안정화 효과를 측정하였다. rLuc 및 HRPC 둘 다의 경우, tES는 0.4% 트립신, 30% 아세토니트릴, 20% 메탄올, 8 M 우레아, 6 M GuHCl, 및 열 변성으로부터 보호성이었다(도 6a 내지 도 6g).

실시예 12: tESF116H 쉘 내에서 융합되지 않은 POI의 세포-유리된 캡슐화

본 발명자들은 tES(+)F116H 내에서 천연의 HRPC(34 kDa)의 캡슐화 및 폴딩 가능성을 시험관내 폴딩 프로토콜을 사용하여 시험하였으며, 여기서 NE 소단위는 변성된 HRPC와 60:1, 60:3, 60:5, 60:8, 60:10, 60:12 및 60:15의 고정된 몰 비로 혼합하였다. 증가하는 HRPC 농도를 사용하여, 활성 및 열 이동 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이 보다 많은 HRPC가 tES(+)F116H 내부로 캡슐화되고 폴딩되었음이 관찰되었다(도 16a, 도 17a 및 도 17c). 그러나, 60:10 비 이후, tES(+)F116H 내에서 캡슐화된 HRPC의 양은 일정하게 남았다. 이는 가능하게는 이러한 농도에서, 모든 NE가 HRPC로 채워지고 단백질을 캡슐화하기 위한 빈 NE 소단위가 남아있지 않기 때문이다. HRPC는 활성 및 열 이동 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이 60:8 및 60:10의 보다 높은 몰 비를 사용하는 경우에서도 tES(-)F116H 내에서 성공적으로 캡슐화되지 않았다(도 17b, 및 도 17d). 이는 HRPC가 순 음성 전하를 가짐으로써 tES(-)F116H가 전하 유사성으로 인하여 이를 캡슐화할 수 없음에 기인할 수 있다. 유사한 관찰이 GFPuv(27 kDa)(도 18a 내지 도 18d) 및 rLuc(도 19)의 경우에 수득되었다.

실시예 13: tESF116H 쉘 내에서 융합되지 않은 핵산의 세포-유리된 캡슐화

본 발명자들은 시험관내 캡슐화 프로토콜을 사용함으로써 tES(+)F116H 내에서 ssDNA (98개 염기)의 캡슐화 가능성을 시험하였으며, 여기서 tES(+)F116H 소단위를 ssDNA와 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 및 60:1의 고정된 몰 비로 혼합하였다. 'A'로 표시된 레인에서 알 수 있는 바와 같이(도 21a), 소단위 대 DNA의 모든 비는 핵산을 캡슐화하였으며 DNAse 분해로부터 이를 보호하였음이 관찰되었다. 본 발명자들은 또한 전하 상호보완적인 효과를 통한 플라스미드에 대한 페리틴의 부착 가능성을 시험하였다. pRSF 플라스미드(4113개 염기 쌍)을 특수한 실험을 위해 사용하였다. tES(+)F116H 소단위를 플라스미드와 1000:1의 고정된 비에서 혼합하였다. tES(+)F116H는 플라스미드와 혼합되는 경우 환형 양식으로 응집함이 관찰되었다(도 22b). 그러나, 환형 양식은 플라스미드가 첨가되지 않은 동일한 농도의 tES(+)F116H 나노케이지의 경우 관찰되지 않았다(도 22a). 이는 전하 상호보완적인 효과에 의해 유발된 pRSF 플라스미드 주변의 tES(+)F116H의 부착을 강력하게 제안한다.

요약

신생 폴리펩타이드로부터 기능성 단백질 구조로의 경로는 인자들의 균형에 의해 측정되며, 이들 중 일부는 최종 생성물의 성공적인 폴딩을 위해 작업하고 많은 것은 성공적인 폴딩에 반하여 작업한다. 천연의 샤페론은 폴딩되지 않거나 부분적으로 폴딩된 중간체의 응집을 방지하며, 생산적 에너지 경로를 따라 폴딩을 편향되게 하는 특이적인 상호작용을 겪으며, 광범위하게 변하는 시간 규모의 폴딩 공정을 수용하는 동적 효과를 발휘한다. 재조합 발현의 설정에 있어서, 이. 콜라이 세포내에서 고유의 샤페론 수준은 대량의 신생의 폴딩되지 않은 재조합 단백질에 의해 압도될 수 있다. 이러한 가설을 뒷받침하여, Hsp70 및 GroEL/GroES 복합체와 같은 천연의 샤페론의 과발현은 재조합 단백질 발현을 보조하였다(Saibil H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nature reviews Molecular cell biology 14, 630-642 (2013)). 샤페론 과발현은 DnaJ, DnaK, 및 GrpE과 HRP의 공-발현이 숙주 세포의 성장을 억제하였으므로, 이의 적용에서 제한을 나타내어 왔으며(Kondo A, et al., Journal of bioscience and bioengineering 90, 600-606 (2000)), GFP의 DnaK-보조된 발현은 표적 단백질의 감소된 수율 및 보다 낮은 구조적 품질을 생성하였다(Martinez-Alonso M, Vera A, Villaverde A. FEMS microbiology letters 273, 187-195 (2007); Garcia-Fruitos E, et al., Journal of molecular biology 374, 195-205 (2007)).

P22 VLP 박테리오파아지를 사용한 연구는 내부 표면 안에서 재조합 단백질의 격리(sequestration)를 나타내었다. 그러나, ~450 코트 단백질(coat protein)의 요건, 추가의 스캐폴드 단백질, 및 캡시드를 해리시키는데 요구되는 가혹한 조건은 재조합 발현시 제한된 P22 용도를 갖는다(Marta Comellas-Aragons HE, et al., Nature Nanotechnology 2, 635-639 (2007)).

내부화된 단백질 주변에 보호성 쉘을 형성시키기 위한 단일의 열안정성 소단위의 23개 카피를 사용함으로써, 본 발명자들은 tES가 발현, 시험관내 폴딩, 및 생성물 안정화를 개선시킬 수 있음을 보고한다. tES(+)F116H는 온화한 pH 적정(pH 5.8-6.0) 하에서 캡슐화된 단백질을 방출할 수 있으며 가용성 단백질 융합체는 선택적으로 단백질분해되어 단량체성 단백질 생성물을 생성할 수 있다.

본 발명자들은 또한 단백질과 tES 소단위 사이에 융합/링커가 세포 생산 및 캡슐화에 요구되지만, 목적한 단백질이 적합한 소단위 : 단백질 비 및 pH 8에서의 조립에서 tESF116H 소단위를 사용함에 의해 세포-유리된 환경에서 tES내에 캡슐화될 수 있음을 입증하였다. 이론에 얽메이는 것을 원하지는 않지만, tES의 내부 전하는 링커를 사용하지 않는 경우 매우 중요하며, 이에 의해 캡슐내 전하는 POI의 전하에 대해 반대이거나 중성일 필요가 있다.

이러한 연구의 발명 특허권 보호 신청은, 본 발명자들이 폴딩을 위한 대용으로서 단백질 기능을 사용하였다는 것이다. 따라서, 단백질 기질의 폴딩에 대한 나노환경 가공의 정밀한 효과를 이해하기 위해서는, 차등 주사 열량계, 중수소 교환, 및 극저온 전자 현미경과 같은 추가의 연구가 필요할 수 있다. 각각의 POI 기질은 tES를 통해 다른 폴딩되지 않은 단백질로부터 물리적으로 단리되므로, 본 발명자들은 응집없이 고 농도에서 폴딩 연구를 수행할 수 있다고 가설을 세웠다.

진핵 세포 게놈에서 해독된 단백질의 ~80%가 80 kDa 이하이지만, tES의 사용은 보다 큰 내부 용적을 지닌 변이체로 확장될 수 있다. 이는 최적의 활성을 위해 다량체화가 필요한 POI의 경우 특히 중요할 것이다. tES 내에서 열불안정성 기질을 안정화하는 능력은 세포 효소 흡수의 매개인자로서 쉘을 사용하여, 폴딩하기 어려운 단백질의 생산, 및 산업적 셋팅에서 tES 기질의 안정화된 품질의 이용을 포함하는, 생물나노기술 및 합성 생물학에서 다양한 응용에 도움이 될 수 있다.

본원에 인용된 모든 특허, 공개된 특허원 및 참고문헌의 교시내용은 이의 전문이 참고로 포함된다.

본 발명은 이의 실시예 구현예를 참고로 특별하게 나타내고 기술되었지만, 형태 및 세부사항에 있어서 다양한 변화가 첨부된 청구범위에 포함된 본 발명의 영역으로부터 벗어나지 않고 본원에서 이루어질 수 있음이 당해 분야의 기술자에게 이해될 것이다.

참고 문헌

본 명세서에서 명확하게 선행-공개된 문헌의 임의의 목록 또는 논의는 이러한 문헌이 최신 기술의 일부이거나 공통의 일반적인 지식이라는 인정으로서 필수적으로 고려되지 않아야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROTEIN EXPRESSION AND DELIVERY <130> IPA190514-SG <150> US 62/405,613 <151> 2016-10-07 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 173 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 1 Met Ala Ser Ile Ser Glu Lys Met Val Glu Ala Leu Asn Arg Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Leu Ser Met Ala Ser Tyr 20 25 30 Phe Asp Ser Ile Gly Leu Lys Gly Phe Ser Asn Trp Met Arg Val Gln 35 40 45 Trp Gln Glu Glu Leu Met His Ala Met Lys Met Phe Asp Phe Val Ser 50 55 60 Glu Arg Gly Gly Arg Val Lys Leu Tyr Ala Val Glu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Glu Trp Asp Ser Pro Leu Ala Ala Phe Glu His Val Tyr Glu His Glu 85 90 95 Val Asn Val Thr Lys Arg Ile His Glu Leu Val Glu Met Ala Met Gln 100 105 110 Glu Lys Asp Phe Ala Thr Tyr Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu 115 120 125 Gln Val Glu Glu Glu Ala Ser Ala Leu Asp Ile Val Glu Lys Leu Arg 130 135 140 Leu Ile Gly Glu Asp Lys Arg Ala Leu Leu Phe Leu Asp Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Gln Phe Thr Pro Pro Ala Glu Glu Glu Lys 165 170 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AfFtn subunit with truncation of unstructured C-terminus <400> 2 Met Ala Ser Ile Ser Glu Lys Met Val Glu Ala Leu Asn Arg Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Leu Ser Met Ala Ser Tyr 20 25 30 Phe Asp Ser Ile Gly Leu Lys Gly Phe Ser Asn Trp Met Arg Val Gln 35 40 45 Trp Gln Glu Glu Leu Met His Ala Met Lys Met Phe Asp Phe Val Ser 50 55 60 Glu Arg Gly Gly Arg Val Lys Leu Tyr Ala Val Glu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Glu Trp Asp Ser Pro Leu Ala Ala Phe Glu His Val Tyr Glu His Glu 85 90 95 Val Asn Val Thr Lys Arg Ile His Glu Leu Val Glu Met Ala Met Gln 100 105 110 Glu Lys Asp Phe Ala Thr Tyr Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu 115 120 125 Gln Val Glu Glu Glu Ala Ser Ala Leu Asp Ile Val Glu Lys Leu Arg 130 135 140 Leu Ile Gly Glu Asp Lys Arg Ala Leu Leu Phe Leu Asp Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Gln Thr Ser 165 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AfFtn net positive variant subunit with truncation of unstructured C-terminus <400> 3 Met Ala Ser Ile Ser Glu Lys Met Val Glu Ala Leu Asn Arg Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Leu Ser Met Ala Ser Tyr 20 25 30 Phe Asp Ser Ile Gly Leu Lys Gly Phe Ser Asn Trp Met Arg Val Gln 35 40 45 Trp Gln Glu Glu Leu Met His Ala Met Lys Met Phe Asp Phe Val Ser 50 55 60 Lys Arg Gly Gly Arg Val Lys Leu Tyr Ala Val Glu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Glu Trp Asp Ser Pro Leu Ala Ala Phe Glu His Val Tyr Glu His Glu 85 90 95 Val Asn Val Thr Lys Arg Ile His Glu Leu Val Glu Met Ala Met Gln 100 105 110 Glu Lys Asp Phe Ala Thr Tyr Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Lys 115 120 125 Gln Val Lys Glu Glu Ala Ser Ala Leu Ala Ile Val Glu Lys Leu Arg 130 135 140 Leu Ile Gly Glu Asp Lys Arg Ala Leu Leu Phe Leu Asp Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Gln Thr Ser 165 <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AfFtn net neutral variant subunit with truncation of unstructured C-terminus <400> 4 Met Ala Ser Ile Ser Glu Lys Met Val Glu Ala Leu Asn Arg Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Leu Ser Met Ala Ser Tyr 20 25 30 Phe Asp Ser Ile Gly Leu Lys Gly Phe Ser Asn Trp Met Arg Val Gln 35 40 45 Trp Gln Glu Glu Leu Met His Ala Met Lys Met Phe Asp Phe Val Ser 50 55 60 Gln Arg Gly Gly Arg Val Lys Leu Tyr Ala Val Glu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Glu Trp Asp Ser Pro Leu Ala Ala Phe Glu His Val Tyr Glu His Glu 85 90 95 Val Asn Val Thr Lys Arg Ile His Glu Leu Val Glu Met Ala Met Gln 100 105 110 Glu Lys Asp Phe Ala Thr Tyr Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu 115 120 125 Gln Val Glu Glu Glu Ala Ser Ala Leu Ala Ile Val Glu Lys Leu Arg 130 135 140 Leu Ile Gly Glu Asp Lys Arg Ala Leu Leu Phe Leu Asp Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Gln Thr Ser 165 <210> 5 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AfFtn subunit with truncation of unstructured C-terminus and F116H mutation <400> 5 Met Ala Ser Ile Ser Glu Lys Met Val Glu Ala Leu Asn Arg Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Leu Ser Met Ala Ser Tyr 20 25 30 Phe Asp Ser Ile Gly Leu Lys Gly Phe Ser Asn Trp Met Arg Val Gln 35 40 45 Trp Gln Glu Glu Leu Met His Ala Met Lys Met Phe Asp Phe Val Ser 50 55 60 Glu Arg Gly Gly Arg Val Lys Leu Tyr Ala Val Glu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Glu Trp Asp Ser Pro Leu Ala Ala Phe Glu His Val Tyr Glu His Glu 85 90 95 Val Asn Val Thr Lys Arg Ile His Glu Leu Val Glu Met Ala Met Gln 100 105 110 Glu Lys Asp His Ala Thr Tyr Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu 115 120 125 Gln Val Glu Glu Glu Ala Ser Ala Leu Asp Ile Val Glu Lys Leu Arg 130 135 140 Leu Ile Gly Glu Asp Lys Arg Ala Leu Leu Phe Leu Asp Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Gln Thr Ser 165 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide #1 <400> 6 Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Arg Gln Thr Ser 165

Claims (39)

1. 야생형 아카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) 페리틴 조립체 소단위(ferritin assembly subunit) 유래의 변형된 페리틴 소단위를 포함하는 가공된 열안정성 페리틴 조립체로서,
   변형된 페리틴 소단위는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만, 변형된 페리틴 소단위는 서열 번호 1의 구조화되지 않은 카복시-말단 서열 잔기 165-173이 결여되어 있고, 서열 번호 1의 E65K, E65Q, F116H, E128K, E131K 및 D138A로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 0 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
   가공된 열안정성 페리틴 조립체는 조립체의 내부와 외부를 연통(communicating)하는 세공(pore)을 포함하고,
   조립체는 상기 야생형 페리틴 조립체보다 더 낮은 염 농도에서 안정한 가공된 열안정성 페리틴 조립체.
2. 제1항에 있어서, 조립체는 순 양성 내부 전하(net positive interior charge) 또는 순 중성 내부 전하를 보유하는 가공된 페리틴 조립체.
3. 제2항에 있어서,
   i) 서열 번호 1의 아미노산 치환 E65K, E128K, E131K 및 D138A는 조립체가 순 양성 내부 전하를 보유하도록 하거나; 또는
   ii) 서열 번호 1의 아미노산 치환 E65Q 및 D138A는 조립체가 순 중성 내부 전하를 보유하도록 하는 가공된 페리틴 조립체.
4. 제1항에 있어서, 변형된 페리틴 소단위는 가공된 조립체가 pH에 의존적으로 조립 및 해체할 수 있도록 하는 서열 번호 1의 F116H 치환을 포함하는 가공된 페리틴 조립체.
5. 제1항에 있어서, 변형된 페리틴 소단위는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 8을 포함하는 그룹에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 가공된 페리틴 조립체.
6. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드, 핵산 또는 소 분자가 페리틴 조립체 내에 캡슐화되는 가공된 페리틴 조립체.
7. 제1항에 있어서, 변형된 페리틴 소단위는 폴리펩타이드 또는 핵산에 융합되고 상기 폴리펩타이드 또는 핵산은 페리틴 조립체 내에 캡슐화되는 가공된 페리틴 조립체.
8. 제7항에 있어서, 폴리펩타이드는 결합 서열(joining sequence)을 통해 변형된 페리틴 소단위에 융합되는 가공된 페리틴 조립체.
9. 제1항에 있어서, 낮은 염 농도에서의 상기 안정성은 소단위의 화학적 가교결합에 의해 제공되는 가공된 페리틴 조립체.
10. 변형된 페리틴 소단위를 포함하는 가공된 열안정성 페리틴 조립체를 형성하는 시험관내(in vitro) 방법으로서, 상기 방법은 제4항의 변형된 페리틴 소단위를 포함하는 샘플의 pH를 산성 pH로부터 염기성 pH로 조절하는 단계를 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 변형된 페리틴 소단위는 서열 번호 5 또는 서열 번호 8에 제시된 서열을 포함하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 가공된 열안정성 페리틴 조립체는 순 양성 내부 전하 또는 순 중성 내부 전하를 보유하는 방법.
13. 제10항에 있어서, 샘플 내에 폴리펩타이드 또는 핵산을 추가로 포함함으로써 상기 폴리펩타이드 또는 핵산이 샘플의 염기성 pH에서 가공된 페리틴 조립체에 의해 캡슐화되는 방법.
14. 제10항에 있어서, 샘플 내 산성 pH는 5.8이고, 샘플 내 염기성 pH는 8.0인 방법.
15. 제13항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 핵산은 변형된 페리틴 소단위에 융합되는 방법.
16. 제13항에 있어서, 샘플 내 변형된 페리틴 소단위:폴리펩타이드의 몰 비는 60:1 내지 60:30인 방법.
17. 가공된 열안정성 페리틴 조립체 내에 폴리펩타이드를 캡슐화하는 시험관내 방법으로서,
    1) 세포 내로
    a) 야생형 페리틴 소단위가 보유하는 구조화되지 않은 카복시-말단 서열이 결여된 제1 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 제1 서열; 및
    b) 폴리펩타이드에 융합된 야생형 페리틴 소단위가 보유하는 구조화되지 않은 카복시-말단 서열이 결여된 제2 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 제2 서열
    을 포함하는 핵산을 도입하는 단계;
    2) 제1 및 제2 서열을 발현시키는 단계; 및
    3) 폴리펩타이드를 캡슐화하는 페리틴 조립체를 형성시키는 단계
    를 포함하고,
    제1 및 제2 변형된 페리틴 소단위 중 적어도 하나는 제1항에 정의된 방법.
18. 제17항에 있어서, 세포는 세균 세포, 식물 세포, 포유동물 세포, 또는 곤충 세포인 방법.
19. 제17항에 있어서, 별도의 플라스미드 상의 제1 및 제2 서열이 세포 내로 도입되는 방법.
20. 세포와 제1항의 페리틴 조립체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 가공된 열안정성 페리틴 조립체를 세포 내로 전달하는 시험관내 방법.
21. 제20항에 있어서, 페리틴 조립체는 세포 표적화 모이어티(moiety)를 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 세포 표적화 모이어티는 질환이 있는 세포 상의 분자에 결합하는 방법.
23. a) 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 서열; 또는
    b) 폴리펩타이드에 융합된 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 서열
    을 포함하고,
    변형된 페리틴 소단위는 제1항에 정의되는 단리된 핵산.
24. 제23항에 있어서, 제1항의 변형된 페리틴 소단위를 암호화하는 단리된 핵산.
25. 대상체에서 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제1항의 적어도 하나의 가공된 열안정성 페리틴 조립체를 포함하는 조성물.
26. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 가공된 열안정성 페리틴 조립체는 전구약물(prodrug)의 전환을 위한 효소를 포함하는 조성물.
27. 제25항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 조성물.
28. 제25항에 있어서, 백신인 조성물.
29. 가공된 열안정성 페리틴 조립체 내에 폴리펩타이드 또는 핵산을 캡슐화하기 위한 키트(kit)로서,
    a) 제1항의 변형된 페리틴 소단위, 또는
    b) 제23항의 핵산을 포함하는 키트.
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