CN112094861B

CN112094861B - 一种绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用

Info

Publication number: CN112094861B
Application number: CN202011151848.6A
Authority: CN
Inventors: 张瑜; 孙金苗; 杨冰燕; 董亦馨; 李迅; 王飞
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112094861A

Abstract

本发明公开了一种绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用，绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法，包括如下步骤：(1)重组蛋白表达工程菌的构建；(2)重组蛋白的表达和收获；(3)重组蛋白的分离纯化。本发明提供的绿藻植物铁蛋白安全，无毒副作用，还具有良好的补铁效果，在自然界中分布广泛；本发明所得的绿藻植物铁蛋白作为一种新的载体具有很好的应用前景，拓宽了铁蛋白的研究范围；将黄酮类化合物包封在蛋白质内部极大地提高了非水溶性生物活性物质的水溶性、稳定性、生物利用度，提高了生物活性物质在食品，医疗，保健等方面的应用。

Description

一种绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用，属于植物铁蛋白技术领域。

背景技术

黄酮类化合物在自然界中分布广泛，具有多种生物活性，存在于大多数植物体内，对于植物的生长、开花、结果、以及抑菌治病方面起重要的作用。此外，黄酮类化合物还有一定的药用价值，在降血脂、降胆固醇、预防老年高血压、脑溢血、治疗冠心病、抗肿瘤、抗氧化自由基活性等方面具有重大意义。近几年来，随着分离提取工艺的进步和完善，越来越多的新型黄酮类化合物被开发利用，吸引了越来越多人的关注。然而，由于黄酮类化合物水溶性差，对光、热、pH的敏感性导致其稳定性下降，生物利用度降低，限制了其在食品，医药等方面的广泛应用。因此，如何提高黄酮类化合物的水溶性和稳定性，以提高其生物利用度是亟需解决的问题。

铁蛋白广泛存在于动物、植物、微生物中，是一种贮铁蛋白，几乎存在于所有植物的体细胞中。成熟植物铁蛋白N端的一段EP螺旋肽可以维持铁蛋白整体的稳定性，也参与蛋白质内部矿物质核的形成和铁的释放。此外，来源于植物型的铁蛋白是一种良好的补铁试剂，安全、无毒、补铁效果好。植物铁蛋白由24个亚基自组装形成一个中空笼状结构，外部直径12nm，内部直径8nm，呈4-3-2重轴对称，植物铁蛋白中只有H型亚基，H-1和H-2型亚基拥有80％同源性，在极端酸性/碱性条件下容易发生解聚，在中性条件下聚合。目前，动物铁蛋白已经得到广泛深入的研究，但对植物铁蛋白的研究尚浅，植物铁蛋白无毒，补铁效果好，因此开发一种新型的植物铁蛋白是必不可少的。

发明内容

本发明提供一种绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用，所得绿藻重组植物蛋白为新型笼状铁蛋白，可用于生物活性物质的装载，拓宽了铁蛋白的研究范围；此外，在蛋白笼的保护下，解决了黄酮类化合物水溶性低、不稳定等难题，提高黄酮化合物的生物利用度以及稳定性。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法，包括如下步骤：

(1)重组蛋白表达工程菌的构建：

将绿藻铁蛋白的基因序列亚克隆至质粒载体中，即得到含有目的基因的质粒，将该质粒热激转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性单克隆转化子，将阳性单克隆转化子热激转化至大肠杆菌中，挑取单菌落获得重组蛋白表达工程菌；

(2)重组蛋白的表达和收获：

将步骤(1)所得的重组蛋白表达工程菌接种于含氨苄青霉素的TB培养基中培养，当OD600＝2时，加入IPTG诱导，离心收菌；

(3)重组蛋白的分离纯化：

将步骤(2)得到的菌体超声破碎后离心取上清，采用亲和层析法对目的蛋白和其余杂蛋白进行分离纯化，柱上酶切去除GST标签后，再通过体积排阻色谱对重组的目的蛋白进一步纯化，最终得到绿藻重组植物蛋白。

本发明采用的方法包括采用pGEX表达系统，以E.coli BL21(DE3)为表达菌株，表达出带GST标签的可溶性蛋白，标签切除得到最终目的蛋白等步骤。通过本发明制备的重组蛋白可以应用于生物活性化合物、抗肿瘤药物的装载等方面以提高非水溶性化合物的溶解度、生物利用度及靶向性。

上述步骤(1)中，绿藻植物铁蛋白的编码基因的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.1：

1GCACAGGAAGTGACCGGCATGGTGTTTCAGCCGTTTAGCGAAGTTCAGGGCGAACTGTCT

61ACCGTGACCCAGGCGCCGGTTACCGATAGCTATGCCCGCGTGGAATATCATATTGAATGT

121GAAGCAGCCATTAATGAACAGATTAATATTGAATATACCATTAGTTATGTGTATCATGCC

181CTGCATAGCTATTTTGCACGCGATAATGTTGGCTTACCGGGCTTTGCCAAATTTTTTAAAG

241AAGCCTCTGATGAAGAACGCGAACATGCACACATGCTGATGGATTATCAGACCAAACGC

301GGCGGTCGCGTGGAACTGAAACCGCTGGCCGCCCCGGAAATGGAATTTGCCAATGATGAT

361AAAGGTGAAGCACTGTATGCAATGGAACTGGCCCTGTCTTTAGAAAAACTGAATTTTCAG

421AAATTACAGGCCTTACAGGCCATTGCCGATAAACATAAAGATGCAGCCTTATGTGATTTT

481GTTGAAGGTGGTCTGCTGAGCGAACAGGTTGATGCCGTTAAAGAACATGCAGTGTATGTG

541AGTCAGTTACGTCGTGTGGGCAAAGGTGTTGGCGTTTATCTGCTGGATCAGGAATTAGGC

601GAAGAAGAAGCA

绿藻植物铁蛋白的编码蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.2：

上述绿藻为孔石莼。

步骤(1)中，大肠杆菌优选E.coli BL21(DE3)菌株。

为了提高得率，上述步骤(2)为，将步骤(1)所得的重组蛋白表达工程菌以1±0.2％的比例接种于含氨苄青霉素的TB培养基中，37±3℃震荡培养约4±0.5h，当OD600＝2时，加入IPTG诱导，离心收菌。

为了提高诱导效率，步骤(2)中，IPTG的终浓度为1±0.1mM，诱导温度为25±3℃，时间为12±2h。

为了提高得率和纯度，上述步骤(3)包括：

(31)将步骤(2)得到的菌体沉淀用结合/清洗缓冲液进行重悬，将菌体超声破碎，离心后收集上清；

(32)将上清过0.45μm滤膜后与GST琼脂糖树脂结合，用结合/清洗缓冲液重复清洗除去杂蛋白；

(33)将凝血酶(thrombin)溶于PBS缓冲液中，缓慢摇晃后与步骤(32)所得树脂结合，室温孵育4±0.5小时后，流出液中包含目的蛋白和凝血酶；

(34)将步骤(33)中的流出液超滤浓缩后，通过体积排阻色谱进一步纯化，即得到绿藻重组植物蛋白。

上述绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法所得绿藻重组植物蛋白，可作为生物活性物质的载体，用于黄酮类化合物的装载。

上述黄酮类化合物装载的方法，包括如下步骤：

A、将黄酮类化合物溶于无水乙醇制备成母液；

B、在步骤(3)得到的绿藻重组植物蛋白中添加尿素避光孵育2±0.3h，得蛋白溶液；

C、步骤A的母液加入到步骤B所得的蛋白溶液中，4℃条件下避光搅拌搅拌约30±5min，然后将溶液转移至透析袋中，透析除去尿素和未结合的分子，离心后，得到的澄清透明浅黄色溶液为绿藻重组植物蛋白-黄酮类复合物，绿藻重组植物蛋白与黄酮类化合物的摩尔浓度比为1:(500±50)。

上述利用本发明得到的中空笼状结构的绿藻植物铁蛋白装载黄酮类化合物，利用铁蛋白变性复性这一可逆自组装性质，将黄酮类化合物包封在蛋白笼的内部，形成分布单一、尺寸均一，稳定的复合物，该蛋白笼水溶性好，分散均一，稳定性高，可以极大地提高生物活性物质如黄酮类化合物的稳定性、水溶性及生物利用度。来源于孔石莼的绿藻铁蛋白的开发与应用拓宽了植物铁蛋白的研究方向，为生物活性物质的装载提供了新型的载体，在生物材料和生物医学上具有很好的应用前景。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

本发明绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法，提供的绿藻植物铁蛋白安全，无毒副作用，还具有良好的补铁效果，在自然界中分布广泛；本发明提供的绿藻植物铁蛋白作为一种新的载体具有很好的应用前景，拓宽了铁蛋白的研究范围；将黄酮类化合物包封在蛋白质内部极大地提高了非水溶性生物活性物质的水溶性、稳定性、生物利用度，提高了生物活性物质在食品，医疗，保健等方面的应用；后续研究也可对绿藻铁蛋白进行表面修饰，装载抗肿瘤、抗炎等生物活性物质，拓宽了植物铁蛋白在生物医学方向的应用。

附图说明

图1为绿藻铁蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)(泳道1为ProteinMarker，泳道2为酶切除标签后的蛋白，泳道3为纯化后的蛋白)；

图2为绿藻铁蛋白的透射电镜图(TEM)(标尺为100nm)；

图3为绿藻铁蛋白包封汉黄芩素的液相色谱图；

图4为水溶性比较图(左图为汉黄芩素的水溶液，右图为绿藻铁蛋白装载汉黄芩素后的水溶液)；

图5为铁蛋白-汉黄芩素复合物在不同温度下的储存稳定性。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

一种绿藻植物铁蛋白，源于孔石莼，其编码基因的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其编码蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

上述绿藻植物铁蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)重组蛋白表达工程菌的构建：

将Protein Data Bank中的孔石莼绿藻铁蛋白(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)的基因编码序列插入到pGEX-2T质粒的BamHI/EcoRI之间，即得到含有目的基因的质粒；将该质粒热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞中，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性单克隆转化子，该阳性质粒热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落获得重组蛋白表达工程菌。

(2)重组蛋白的表达和收菌：

将所得重组蛋白表达工程菌按照1％接种量加入到5mL TB培养基中，210r/min，37℃震荡培养约4h，当OD600＝2时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃，180r/min条件下培养12h。取2mL菌液，4℃，8000×g(约为8500rpm)离心5min得到菌体沉淀。

(3)重组蛋白的纯化：

将步骤(2)得到的菌体沉淀用200μL结合/清洗缓冲液(0.14M NaCl，0.0027M KCl，0.01M Na₂HPO₄，0.018M KH₂PO₄，1％TritonX-100，pH＝7.4)进行重悬，将菌体超声破碎(超声条件：480W，超1s，间隔2s，时长35min)，8000×g，离心30min后收集上清；

1mL琼脂糖预装柱用5mL的灭菌水清洗两次，加入5倍柱体积的结合/清洗缓冲液平衡柱子，将含有目的蛋白的上清液过0.45μm滤膜后与GST树脂结合，放置于旋转培养器上结合8h，用5-10倍柱体积的结合/清洗缓冲液冲洗树脂清洗除去杂蛋白，重复清洗步骤，测量在280nm吸光度，直到洗出液值达到基线值，此时带有GST标签的目的蛋白已经结合在树脂上。取20μL的凝血酶和980μL的PBS(pH＝7.4)制备混合液，将混合液加入树脂中，封柱，置于旋转培养器中室温(22-25℃)孵育4小时，流出液中包含目的蛋白和凝血酶。将流出液用10kDa超滤管进行超滤后，用FPLC纯化得到纯绿藻重组植物蛋白，如图1-2所示，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和透射电镜(TEM)对目的蛋白进行表征，确定其分子量为26kDa，与理论值一致。透射电镜结果表明该蛋白为中空笼状结构。

(4)装载黄酮类化合物，以装载汉黄芩素为例：

准确称取1mg汉黄芩素溶于500μL无水乙醇中制备成母液，铁蛋白与汉黄芩素的终摩尔浓度比是1:500。将步骤(3)所得的绿藻重组植物蛋白的溶液(0.76μmol，pH＝7.4，3mL)置于10mL离心管中，加入45μL的1M尿素至尿素终浓度为15mM，室温避光孵育2h，得蛋白溶液。接着，将制备的母液缓慢加入到蛋白溶液中，4℃条件下避光搅拌约30min。将溶液转移至透析袋(10kDa)中，用0.1M PBS(pH＝7.4)缓冲液4℃层析柜中透析24h，隔6h更换一次缓冲液，充分除去尿素和未结合的汉黄芩素分子。最后，将溶液离心5min除去残余的未结合分子，过0.22μm滤膜后得到澄清透明的浅黄色溶液。

如图3液相色谱图所示，出峰时间为7.19min，与汉黄芩素分子的出峰位置相同。根据汉黄芩素标准曲线方程计算出可以绿藻铁蛋白装载了78个汉黄芩素分子。

对汉黄芩素和汉黄芩素-铁蛋白复合物的水溶性进行比较，如图4左图所示，汉黄芩素在水溶液中几乎不溶，而被装载进入铁蛋白笼后，得到澄清透明的浅黄色溶液，如图4右图所示，亲水性的绿藻铁蛋白极大地提高了汉黄芩素的水溶性。

铁蛋白是中空笼状结构，对内部包封的汉黄芩素具有一定的保护作用，形成了水溶性的汉黄芩素-铁蛋白复合物后其储存稳定性如图5所示，由图可知，包封在铁蛋白内部的汉黄芩素在不同温度下(4℃，20℃，37℃)储存14天内释放均不超过20％。储存温度越高，汉黄芩素的释放越多。在4℃条件下，汉黄芩素的释放最少，铁蛋白-汉黄芩素复合物最稳定。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用

<130> 2020

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 612

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

gcacaggaag tgaccggcat ggtgtttcag ccgtttagcg aagttcaggg cgaactgtct 60

accgtgaccc aggcgccggt taccgatagc tatgcccgcg tggaatatca tattgaatgt 120

gaagcagcca ttaatgaaca gattaatatt gaatatacca ttagttatgt gtatcatgcc 180

ctgcatagct attttgcacg cgataatgtt ggcttaccgg gctttgccaa attttttaaa 240

gaagcctctg atgaagaacg cgaacatgca cacatgctga tggattatca gaccaaacgc 300

ggcggtcgcg tggaactgaa accgctggcc gccccggaaa tggaatttgc caatgatgat 360

aaaggtgaag cactgtatgc aatggaactg gccctgtctt tagaaaaact gaattttcag 420

aaattacagg ccttacaggc cattgccgat aaacataaag atgcagcctt atgtgatttt 480

gttgaaggtg gtctgctgag cgaacaggtt gatgccgtta aagaacatgc agtgtatgtg 540

agtcagttac gtcgtgtggg caaaggtgtt ggcgtttatc tgctggatca ggaattaggc 600

gaagaagaag ca 612

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<213> 2

<400> 2

Ala Gln Glu Val Thr Gly Met Val Phe Gln Pro Phe Ser Glu Val Gln

1 5 10 15

Gly Glu Leu Ser Thr Val Thr Gln Ala Pro Val Thr Asp Ser Tyr Ala

20 25 30

Arg Val Glu Tyr His Ile Glu Cys Glu Ala Ala Ile Asn Glu Gln Ile

35 40 45

Asn Ile Glu Tyr Thr Ile Ser Tyr Val Tyr His Ala Leu His Ser Tyr

50 55 60

Phe Ala Arg Asp Asn Val Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Phe Phe Lys

65 70 75 80

Glu Ala Ser Asp Glu Glu Arg Glu His Ala His Met Leu Met Asp Tyr

85 90 95

Gln Thr Lys Arg Gly Gly Arg Val Glu Leu Lys Pro Leu Ala Ala Pro

100 105 110

Glu Met Glu Phe Ala Asn Asp Asp Lys Gly Glu Ala Leu Tyr Ala Met

115 120 125

Glu Leu Ala Leu Ser Leu Glu Lys Leu Asn Phe Gln Lys Leu Gln Ala

130 135 140

Leu Gln Ala Ile Ala Asp Lys His Lys Asp Ala Ala Leu Cys Asp Phe

145 150 155 160

Val Glu Gly Gly Leu Leu Ser Glu Gln Val Asp Ala Val Lys Glu His

165 170 175

Ala Val Tyr Val Ser Gln Leu Arg Arg Val Gly Lys Gly Val Gly Val

180 185 190

Tyr Leu Leu Asp Gln Glu Leu Gly Glu Glu Glu Ala

195 200

Claims

1.一种绿藻植物铁蛋白的应用，其特征在于：绿藻植物铁蛋白的表达纯化方法，包括如下步骤：

（1）重组蛋白表达工程菌的构建：

（2）重组蛋白的表达和收获：

将步骤（1）所得的重组蛋白表达工程菌接种于含氨苄青霉素的TB培养基中培养，当OD600=2时，加入IPTG诱导，离心收菌；

（3）重组蛋白的分离纯化：

将步骤（2）得到的菌体超声破碎后离心取上清，采用亲和层析法对目的蛋白和其余杂蛋白进行分离纯化，柱上酶切去除GST标签后，再通过体积排阻色谱对重组的目的蛋白进一步纯化，最终得到绿藻重组植物蛋白，包括如下步骤：

（31）将步骤（2）得到的菌体沉淀用结合/清洗缓冲液进行重悬，将菌体超声破碎，离心后收集上清；

（32）将上清过0.45μm滤膜后与GST琼脂糖树脂结合，用结合/清洗缓冲液重复清洗除去杂蛋白；

（33）将凝血酶溶于PBS缓冲液中，摇晃后与步骤（32）所得树脂结合，室温孵育4±0.5小时后，流出液中包含目的蛋白和凝血酶；

（34）将步骤（33）中的流出液超滤浓缩后，通过体积排阻色谱进一步纯化，即得到绿藻重组植物蛋白；

步骤（3）制得的绿藻植物铁蛋白用于汉黄芩素的装载，汉黄芩素的装载方法，包括如下步骤：

A、将汉黄芩素溶于无水乙醇制备成母液；

B、在步骤（3）得到的绿藻重组植物蛋白中添加尿素避光孵育2±0.3h，得蛋白溶液；

C、步骤A的母液加入到步骤B所得的蛋白溶液中，4℃条件下避光搅拌搅拌30±5min，然后将溶液转移至透析袋中，透析除去尿素和未结合的分子，离心后，得到的澄清透明浅黄色溶液为绿藻重组植物蛋白-黄酮类复合物，绿藻重组植物蛋白与汉黄芩素的摩尔浓度比为1:（500±50）；

步骤（1）中，绿藻植物铁蛋白的编码基因的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的绿藻植物铁蛋白的应用，其特征在于：步骤（1）中，绿藻植物铁蛋白的编码蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的绿藻植物铁蛋白的应用，其特征在于：绿藻为孔石莼。

4.如权利要求1或2所述的绿藻植物铁蛋白的应用，其特征在于：步骤（1）中，大肠杆菌为E.coli BL21（DE3）菌株。

5.如权利要求1或2所述的绿藻植物铁蛋白的应用，其特征在于：步骤（2）为，将步骤（1）所得的重组蛋白表达工程菌以1±0.2%的比例接种于含氨苄青霉素的TB培养基中，37±3℃震荡培养4±0.5h，当OD600=2时，加入IPTG诱导，离心收菌。

6.如权利要求1或2所述的绿藻植物铁蛋白的应用，其特征在于：步骤(2)中，IPTG的终浓度为1±0.1mM，诱导温度为25±3℃，时间为12±2h。