CN103509100A - 一种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体地,本发明公开了五种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体、其制备方法和用途。本发明公开的白细胞介素-1受体拮抗剂突变体具有与白介素-1受体亲和力更高、生物活性更好的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,更具体地,本发明公开了一种生物受体拮抗剂突变体。
背景技术
白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)是一种存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂,通过结合白细胞介素-1(IL-1)受体,特异性地封闭IL-1的活性。美国食品和药物管理局(FDA)在2001年11月批准Amgen公司的IL-1Ra(商品名Kineret)上市,治疗常规药物无效的顽固性类风湿关节炎。这是继美国Immunex公司的重组肿瘤坏死因子受体(商品名Enbrel)上市后,第二个上市的治疗类风湿关节炎的基因工程药物。
1990年,美国Synergen公司的Eisenberg等人在英国Nature杂志首次报道了克隆IL-1Ra的全长cDNA的结果,发现IL-1Ra与IL-1在结构上有同源性,在基因定位上与IL-1的2个亚型基因连锁,并且重组IL-1Ra能够特异性抑制IL-1的活性,这是第一个被发现的内源性细胞因子受体拮抗剂,为治疗炎症性疾病提供了新的途径。由于IL-1Ra的广谱抗炎作用,它还有可能在多种炎症性疾病的治疗中发挥疗效。例如,动物实验证明,IL-1Ra能有效治疗狗的骨关节炎、大鼠脑缺血再灌损伤、大鼠肠炎模型、豚鼠哮喘模型、小鼠肺纤维化、大鼠肾小球肾炎、小鼠移植物抗宿主反应等。我国学者发表的论文也证实IL-1Ra能有效治疗小鼠急性肺损伤、兔的严重角膜烧伤、大鼠角膜移植免疫排斥反应、大鼠实验性肝纤维化等。因而,IL-1Ra具有广阔的临床应用前景。目前,IL-1Ra开发的一个主要障碍是它的临床应用剂量很大,治疗类风湿关节炎需要每针75-150毫克的剂量,因此目前仍需要活性更高的白细胞介素-1受体拮抗剂。
发明内容
本发明的申请人在已有的白细胞介素-1受体拮抗剂:IL-1Ra野生型(其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ.I.D.NO1、SEQ.I.D.NO2所示)X线衍射晶体结构的基础上,对其活性中心附近的氨基酸进行了随机突变,获得了与白介素-1受体亲和力更高、生物活性更佳的突变体。
本发明公开了五种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体,分别为SEQ.I.D.NO.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸单点突变,其中第9位赖氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸和SEQ.I.D.NO.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸三点突变,其中第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸。
本发明还公开了上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体的制备方法,包括首先IL-1Ra野生型基因的获得然后获得各种突变体基因、IL-1Ra(突变体)表达载体构建、目的基因的表达和目的蛋白的纯化四个步骤,其中表达质粒为pET-22b(+)质粒,转化宿主菌为BL21(DE3)。
得到的目的蛋白通过活性实验检测,结果表明野生型白细胞介素-1受体拮抗剂:IL-1Ra野生型中和拮抗IL-1的生物活性为国外已上市的Kineret(N端甲硫氨酸形式的白细胞介素-1受体拮抗剂)的2倍,各突变体的生物活性均优于野生型,其中三点突变的生物活性最好,为野生型的5倍。
本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体可以用来制备治疗炎症性疾病药物中的用途,其中炎症性疾病包括关节炎、肠炎、哮喘、肺纤维化、肾小球肾炎、移植物抗宿主反应、急性肺损伤、严重角膜烧伤、类风湿性关节炎。本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体优选用于类风湿关节炎的治疗。
附图说明
图1:人IL-1Ra基因RT-PCR扩增结果1.RT-PCR扩增产物;2.DNA Marker,自上而下为2、1、0.75、0.5、0.25、0.1kb;
图2:pET-22b(+)物理结构图:其中T7为T7启动子,lacI为lacI编码区,ori为复制起始位点,Ap为氨苄青霉素抗性基因,fl origin为fl复制起始位点;
图3:pET-22b(+)/IL-1ra物理结构图,相应部位同图2;
图4:含有人IL-1Ra cDNA的T载体双酶切图谱,其中1、2、3为质粒双酶切产物,4为DNA Marker,自上而下为21、5.1、4.9、1.9、1.38、1.37、0.95、0.56kb;
图5:rhIL-1Ra诱导表达SDS-PAGE电泳分析,M:分子量标准(自上而下为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD);1:诱导前菌体全蛋白;2~6:诱导1,2,3,4,5小时菌体全蛋白;
图6:rhIL-1Ra诱导表达全菌及裂解物SDS-PAGE电泳分析,M:分子量标准(自上而下为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD);1-2:菌体全蛋白;3-4:菌体裂解后上清;5,6:菌体裂解后沉淀;
图7:rhIL-1Ra免疫印迹分析M:分子量标准(自上而下为43、29、18、14.4kD);1:实施例3产品;2:Kineret;
图8:生物活性比较结果,其中■为Kineret,Wild type为野生型,Mutant1为第9位赖氨酸突变为亮氨酸,Mutant 2为第9位赖氨酸突变为异亮氨酸,Mutant3为第26位精氨酸突变为赖氨酸,Mutant 4为第40位缬氨酸突变为亮氨酸,Mutant5为第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸。
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步说明,不应理解为对本发明的限制。
实施例1野生型IL-1Ra基因及各型突变体基因的获得
取健康志愿者外周血15ml,密度梯度离心去除红细胞,收集淋巴细胞体外培养并加PHA刺激。培养结束收集淋巴细胞,用Trizol试剂抽提总RNA。
根据Genebank公布的IL-1Ra基因序列设计PCR引物:
引物1(SEQI.D.NO 3):
5’TTGCCATATGCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGCGTCCGTCTGGGAGA
引物2(SEQ I.D.NO 4):
5’ATTGAAGCTTCTACTCGTCCTCCTGGAA
设计序列时,在起始密码子ATG之前,加入了Nde I的酶切位点;在起始密码子之后,加入了His标签蛋白及EK酶切位点;而在最后一个氨基酸Glu之后,立即有TAG作为终止密码,其后是Hind III的酶切位点。引物序列与IL-1Ra胞内可溶性蛋白152个氨基酸基因序列的两端互补。引物设计时将起始密码ATG之后的第36、39碱基A、C分别改为了大肠杆菌偏爱密码T、G,由于兼并密码子编码的氨基酸不变,因此对表达产物的氨基酸序列没有影响。
在0.5ml微量反应管中,24μl反应液中加入3’端引物200pmol/L,总RNA15μg,70℃加热5分钟后加入第一链缓冲液(TAKARA公司)、RNsin(Progema公司)、AMV逆转录酶(TAKARA公司)、dNTPs(TAKARA公司),混合反应物于42℃反应1小时。
逆转录结束后于20μl反应液中加入5’端引物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶(TAKARA公司),覆盖石蜡油。扩增条件为:94℃变性1分钟,65℃退火1分钟,72℃延伸1.5分钟,共30个循环,最后于75℃延伸5分钟。电泳检测扩增片段大小约为480bp,见图1。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中,转化TG1菌株(Novagen公司),测序验证无误,其氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ.I.D.NO1、SEQ.I.D.NO2所示。
Mutant1(K9L)基因
根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
引物3(SEQI.D.NO 5):5’CTGGGAGAAAATCCAGCTTGATGCA
引物4(SEQ I.D.NO 6):5’ATTCTGAAGGCTTGCATCAAGCTGG
引物1’(SEQ I.D.NO 13):5’TTGCCATATGCACCATCATCATCAT
以野生型基因为模板,分别以引物1’与引物4、引物3与引物2进行PCR,反应条件同前,再以反应产物为模板,引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中,转化TG1菌株(Novagen公司),测序验证无误。
Mutant2(K9I)基因
根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
引物5(SEQ I.D.NO 7):5’CTGGGAGAAAATCCAGCATCATGCA
引物6(SEQ I.D.NO 8):5’ATTCTGAAGGCTTGCATGATGCTGG
以野生型基因为模板,分别以引物1’与引物6、引物5与引物2进行PCR,反应条件同前,再以反应产物为模板,引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中,转化TG1菌株(Novagen公司),测序验证无误。
Mutant3(R26K)基因
根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
引物7(SEQ I.D.NO 9):5’AGAAGACCTTCTATCTGAAGAACAA
引物8(SEQ I.D.NO10):5’GCAACTAGTTGGTTGTTCTTCAGAT
以野生型基因为模板,分别以引物1’与引物8、引物7与引物2进行PCR,反应条件同前,再以反应产物为模板,引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中,转化TG1菌株(Novagen公司),测序验证无误。
Mutant4(V26L)基因
根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
引物9(SEQ I.D.NO 11):5’ACTTGCAAGGACCAAATCTCAATTT
引物10(SEQ I.D.NO 12):5’ATCTTTTCTTCTAAATTGAGATTTG
以野生型基因为模板,分别以引物1’与引物10、引物9与引物2进行PCR,反应条件同前,再以反应产物为模板,引物1’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中,转化TG1菌株(Novagen公司),测序验证无误。
Mutant5(R26K K9IV40L)基因
以Mutant3基因为模板,分别以引物1’与引物8、引物7与引物2进行PCR,反应条件同前,再以反应产物为模板,引物1’与引物2进行overlap PCR。获得中间MutantA。
以中间MutantA基因为模板,分别以引物1’与引物10、引物9与引物2进行PCR,反应条件同前,再以反应产物为模板,引物1’与引物2进行overlapPCR。将扩增基因装入T Vector(Promega公司)中,转化TG1菌株(Novagen公司),测序验证无误,获得中间Mutant5。
实施例2IL-1Ra表达载体构建(以野生型基因为例,其余各型突变体构建方法与野生型相同)
表达质粒为pET-22b(+)质粒,结构图见附件。插入目的基因后原质粒的peIB引导序列被取代,示意图见图2及图3。
挑取含有测序质粒的重组TG1菌单克隆于LB培养液,过夜培养,小量质粒抽提试剂盒提取质粒,用Nde I和HindIII双酶切含有上述目的基因的中间载体,电泳回收480bp左右的小片段,结果见图4。将其插入用相同的两种酶酶切过的pET-22b(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)感受态细胞,载体自连作为对照。
实施例3目的基因的表达(以野生型IL-1Ra为例,其余各型突变体表达方法与野生型相同)
质粒酶切图谱鉴定为正确后,用该质粒转化感受态BL21/DE3大肠杆菌,挑选10个克隆,分别接种在小试管中的LB培养基中,37℃振荡培养,待细菌生长到OD600nm=0.6时,留少量细菌悬液于-20℃后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG(TAKARA公司),继续振荡培养,每隔1小时收获细菌直至5小时。
用15%SDS-PAGE观察不同克隆的细菌在加入IPTG之前以及之后的不同时间点的蛋白表达情况,结果显示全部克隆均在诱导后增加了分子量20kDa左右的蛋白条带。该条带分子量与文献报道的rhuIL-1Ra分子量一致,见图5。诱导表达4小时,目的蛋白的表达量达到最高,继续诱导表达量不再提高。
取经IPTG诱导表达的菌体冻融破碎,离心收集上清和沉淀,用15%SDS-PAGE电泳分析,结果目标蛋白主要在细胞破碎后的上清液中,表明IL-1Ra以可溶形式表达,见图6。重组蛋白经小量纯化后,用免疫印迹的方法检测(步骤:15%SDS-PAGE,半干法电转移至硝酸纤维素薄膜(200mA,30min),用3%BSA将膜封闭后加抗人IL-1Ra单抗(R&D Systems),室温孵育1h后洗膜3次,再加入过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗结合45min后,洗膜、显色),结果提示IPTG诱导表达的蛋白性质与进口对照品rhIL-1Ra(Kineret)一致,见图7。
实施例4目的蛋白的纯化(以野生型IL-1Ra为例,其余各型突变体纯化方法与野生型相同)
发酵终止后,取出菌液,低速离心(5,000rpm,20分钟,4℃),收集菌体,用生理盐水洗涤一次,所有上清液待灭菌后弃去。将湿菌体称量,于-20℃保存。取一定量的菌体,悬浮于适量的0.01mol/L PBS(pH 7.0)缓冲液中(菌体与悬浮液的体积比为1;10),冰浴下使用高压均质机进行碎菌,共3个循环;取样进行染色涂片,显微镜下检查,基本无完整细胞,离心20,000rpm,20分钟,4℃,收集上清。上清经连接了Ni2+的金属螯合柱纯化,获得以粗制IL-1Ra为主(纯度大于70%)的蛋白溶液。
上述溶液加入一定量的重组牛肠激酶(rEK)(上海张江生物技术有限公司产品),2mmol/L CaCl2,置21℃孵育20小时,将N端的Hi s标签蛋白及EK酶切位点去除,获得IL-1Ra粗制品。
IL-1Ra粗制品经0.8μm滤膜过滤后采用强阳离子交换介质SP-SepharoseFast Flow在pH 6.2进行离子交换层析,大量的可溶性细菌杂蛋白、核酸、内毒素等被去除,目标蛋白的纯度可以达到90%,收率在80%以上。提高pH至8.5,进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,可进一步去除残存的细菌杂蛋白、细菌内毒素,使样品纯度达到98%以上,获得IL-1Ra精制品。
实验例5生物活性比较实验
材料:
测活细胞:A375.S2黑色素瘤细胞系ATCC CRL-1872。
培养液:为含10%新生小牛血清(NBS),RPMI-1640/D’MEM(1∶1)培养液。
胰蛋白酶:0.25%胰蛋白酶溶解于细胞培养用PBS中
Kineret:Amgen公司产品。
方法:
1.用10mL培养液稀释IL-1至终浓度为4ng/mL。
2.用步骤1培养液稀释样品至800ng/mL,在96孔板中连续2倍比稀释(最高浓度孔初始加入200μl,余孔各加入100μl稀释液,而后用多通道加样器自最高浓度孔吸出100μl加入下一孔,吹匀后继续向下重复,至最低浓度后吸出的100μl丢弃),设置复孔。
3.取对数生长期的A375.S2细胞,胰蛋白酶消化,计数,普通培养液调整细胞密度至8×104/ml,加入96孔培养板中,0.1ml/孔。
4.96孔培养板置于37℃8%二氧化碳培养箱中培养。
5.72h后,加入新鲜配制的20;1混合的MTS/PMS溶液(Progema)20μl/孔,在孵箱中继续孵育3小时,用酶标仪测量其A490-A630值。
结果:
本发明中野生型IL-1Ra中和拮抗IL-1的生物活性约为Kineret的2倍,其余各型突变体生物活性均优于野生型,其中以Mutant 5活性最佳,约为Kineret的10倍。见图8。
Claims (2)
1.一种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体,其特征在于SEQ.I.D.NO.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸单点突变,其中第9位赖氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸。
2.一种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体,其特征在于SEQ.I.D.NO.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸三点突变,其中第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸。
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