EP1181377A2 - Proteinkonjugate auf basis von lumazinsynthase, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung - Google Patents

Proteinkonjugate auf basis von lumazinsynthase, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung

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EP1181377A2
EP1181377A2 EP00920476A EP00920476A EP1181377A2 EP 1181377 A2 EP1181377 A2 EP 1181377A2 EP 00920476 A EP00920476 A EP 00920476A EP 00920476 A EP00920476 A EP 00920476A EP 1181377 A2 EP1181377 A2 EP 1181377A2
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EP
European Patent Office
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protein
lumazine synthase
dna
region
functional
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Withdrawn
Application number
EP00920476A
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English (en)
French (fr)
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Markus Fischer
Adelbert Bacher
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag

Definitions

  • the invention relates to protein conjugates, methods, vectors, proteins and DNA for their production and their use, as well as medicaments or vaccines containing the same.
  • the present invention serves to produce supramolecular particles which present one or more different, arbitrarily determinable structural units in large numbers on the surface of a single, approximately spherical protein molecule.
  • 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazine synthase (hereinafter referred to as lumazine synthase) catalyzes the penultimate step of vitamin B 2 biosynthesis in microorganisms and plants.
  • Lumazine synthases from certain bacteria form highly symmetrical, icosahedral complexes of 60 subunits with a molecular weight of approx. 1 MDalton (Bacher and Ladenstein, 1991; Bacher et al., 1980; Ladenstein et al, 1986 , 1988, 1994; Mörtl et al, 1996).
  • X-ray structures of the capsid envelope of the lumazine synthase from Bacillus subtilis are known (Ladenstein et al., 1988, 1994; Ritsert et al., 1995).
  • the protein from Bacillus subtilis can be denatured using urea and then renatured.
  • the efficiency of the renaturation can be increased by adding a ligand (substrate analog), for example 5-nitro-6- (D-ribitylamino) -2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione or 5-nitroso-6- (D-ribitylamino) ) -2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione.
  • the folding of the renatured protein is identical to the folding of the native lumazine synthase. In the presence of the ligand mentioned, the lumazine synthase from Bacillus subtilis is stable up to pH 10.
  • the environment of the inhibitor molecule is known due to the X-ray structure.
  • the binding site of this ligand is made up of segments neighboring monomers formed (Bacher et al. 1986; Ritsert et al .. 1995). This constellation explains the supporting influence of the ligand in the renaturation of the high molecular weight protein complex.
  • Lumazine synthases from various microorganisms can be efficiently expressed in recombinant strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • the recombinant proteins can be isolated in high yield.
  • Both the N and the C terminus lie on the surface of the icosahedral capsid molecule.
  • lumazine synthase from Bacillus subtilis this was shown for the first time by X-ray structure analysis (Ladenstein et al. 1988).
  • DNA synthesis was used to obtain a gene optimally adapted to the codon use of Escherichia coli for the expression of the thermostable lumazine synthase from the thermophilic microorganism Aquifex aeolicus.
  • the protein can be obtained recombinantly in large amounts. It is stable for at least a week at a temperature of 80 ° C.
  • Icosahedral lumazine synthases can be functionalized with structural units on their surface.
  • structural units biomolecules
  • oligo- or polypeptides with freely selectable segments are preferred.
  • the presented proteins conjugated biomolecules
  • a carrier protein in the sense of the invention is understood to mean a natural (unchanged) or a modified lumazine synthase in which the primary structure has been changed.
  • One or more amino acids can be exchanged and / or removed and / or added and / or changed. It is not necessary to maintain the original catalytic activity of the lumazine synthase. Rather, e.g. catalytically inactive, modified proteins can also be used for all applications according to the invention.
  • the number of conjugated biomolecules on the surface of the carrier protein can extend over a wide range, the surface according to the invention having up to 60 (at one terminus) or 120 (at both terms) or 180 (at both terms plus) Loop insertion) identical or differently structured in their peptide motifs.
  • Protein subunits based on the structural basis. Lumazine synthase can also be assembled into even larger, perhaps funky particles and tubular structures. These associates can contain well over 60 subunits. However, they do not have the strict, Geometric regularity of the icosahedral 60-mer Lumaz ⁇ ns ⁇ nthase molecules
  • the length of the peptide segments presented can vary over a wide range, preferably over 1 - 500 amino acids according to the invention, it being possible for the peptide motifs to be both unchanged and modified
  • Proteins according to the invention can also contain one or more ammosaur analogs or non-naturally occurring amino acids which can be introduced in the sequence by biological means (for example by means of suppressor tRNA technologies etc.) or by chemical means (for example by means of coupling reagents, etc.). Modifications can also be made (e.g. glycosylation, etc) or devatization (e.g. biotmylation, etc) are available.
  • the underlying genetic information for the specification of the peptide segments artificially incorporated into the structure of the luminescent synthase subunit can range from a few codons to several genes, depending on whether an ohgopeptide, a polypeptide or a protein consisting of several subunits is to be encoded.
  • the surface of a lumazine synthase can also be modified chemically so that its outer periphery is covalently linked to a large number of functional areas
  • heteroohgomeric lumazine synthase conjugates takes place via a dissociation step and a subsequent folding / reassociation step.
  • the chimeric proteins present after the denaturation can be mixed as desired natural icosahedral structure possible Immunological analysis methods based on the ELISA test system
  • Antibodies bind with high specificity to certain target structures (antigens). Test methods based on the detection of specific antibody-antigen complexes have been developed. To determine if an antibody has bound to its target antigen. there are different options. Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) is one of these methods. In principle, the ELISA can be used to determine any antigen. Haptens or Antikö ⁇ ers be worked out, he has found its application today mainly in clinical biochemistry. It is used, for example, to measure hematological factors and the concentrations of serum proteins such as Immunoglobulins, oncofetal proteins and hormones such as Insulin.
  • ELISA Enzyme-linked immunoabsorbent assay
  • An ELISA protocol generally consists of the following sub-steps.
  • sample which should contain a specific molecule or a certain organism, is bound to a solid support (e.g. microtitre plate made of plastic).
  • a solid support e.g. microtitre plate made of plastic.
  • a second antibody (secondary antibody) is added instead, which specifically binds to the primary antibody, but not to the antigen from 1.
  • This second antibody is often chemically coupled with an enzyme (indicator system), which catalyzes a conversion of a colorless substrate into a colored product (e.g. alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, etc.).
  • the second antibody is usually directed against the constant section of the first antibody. Unbound secondary antibodies are removed by washing.
  • an indicator system e.g. horseradish peroxidase
  • an indicator system e.g. horseradish peroxidase
  • the visualization is based on a stable link between the investigated reactant (antigen or antibody) and an indicator system.
  • the following indicators (amplifiers) are used: fluorescent dyes. Luminescent dyes, radioactivity, enzymes, etc.
  • the indicators can be covalently or non-covalently bound to the respective reactants. For example, stable, non-covalent links between the indicator and the desired reaction partner are used. the antigen-antibody binding. the biotin-avidin bond or the lectin bond.
  • the primary antibody is covalently linked to the indicator.
  • the indirect arrangement bypasses the marking of the primary antibody.
  • the primary antibody is identified by an antibody that is marked with an indicator. detected.
  • This secondary antibody which is obtained from another animal species binds to all primary antibodies of any specificity from the first species.
  • Another method of detection is a method in which three antibodies are used one after the other.
  • the primary antibody from species A is detected by an unmarked secondary antibody from species B. which is present in excess. This is followed by the addition of a tertiary antibody from species A, which is linked to an indicator.
  • the secondary antibody ( ⁇ ' errisonsantikö ⁇ er) acts as a bridge between primary and tertiary antibodies.
  • An increase in sensitivity is conveyed through the use of several antibodies connected in series.
  • the visualization of the bound primary antibody can alternatively take place through other binding systems.
  • a suitable system is the avidin-biotin complex binding (ABC system).
  • the primary or secondary antibodies must be biotinylated.
  • the indicators are also biotinylated and are bound to the tetravalent avidin with the saturation of three binding sites.
  • the fourth avidin binding site can bind to the biotinylated primary or secondary antibodies.
  • a biotinylated multimeric lumazine synthase conjugate (linker protein) between the primary antibody and the indicator: a lumazine synthase which contains up to 60 biotin molecules (eg bound to the lumazine synthase via a short spacer to avoid possible steric hindrance) on its surface, occupies a special position due to its spherical, multimeric structure.
  • the binding between antibody and linker protein or between linker protein and indicator is carried out using an avidin bridge or a streptavidin bridge. Alternatively, avidin- or streptavidin-labeled primary antibodies or indicators can also be used.
  • Indicator molecules can be bound to 59 of the 60 biotin molecules on the multimeric linker protein, whereby only one biotin molecule is necessary to mediate a bond between the primary antibody and the linker protein.
  • the resulting multiple binding of the color reaction mediating enzyme results in extreme signal amplification, the signal strength increasing in proportion to the antigen concentration.
  • heterooligomeric biotinylated lumazine synthase conjugates By the inventive reassociation of different lumazine synthase variants (for example a combination of 1-3 antigen-containing lumazine synthase monomers with up to 59 biotinylated lumazine synthase monomers). a heterooligomeric lumazine synthase conjugate is generated which contains both a reactant (eg antigen) and several biotin molecules. Indicator molecules can be bound to the biotin molecules by means of streptavidin or avidin (or else via an anti-biotin antibody). Two possible uses are discussed in the following as examples: A) A lumazine synthase conjugate.
  • a color reaction is achieved in both cases (A and B) by any streptavidin-coupled enzyme which complexes with the biotinylated lumazine synthase.
  • the signal amplification is achieved by the interposition of this multi-biotinylated linker protein (lumazine synthase conjugate) and the resulting multiple binding of the color reaction-dispersing enzyme.
  • heterooligomeric, non-biotinylated, lumazine synthase conjugates Through the inventive reassociation of different lumazine synthase variants, a heterooligomeric lumazine synthase conjugate is produced, which both a reactant (eg antigen. Which can specifically bind antibodies from a patient's serum) in a simpler manner Execution, as well as epitopes in multiple execution, which are recognized by indicator-marked antibodies, contains. Here too, signal amplification is achieved due to the possible multiple binding of antibody indicator complexes to the multimeric protein.
  • a reactant eg antigen. which can specifically bind antibodies from a patient's serum
  • a biosensor consists of at least three components: biological receptor. Transducers and associated electronics.
  • the biological receptor can be an antibody or an antigen that is coupled to the transducer in various ways. In both of them Variations allow the sensors to measure the specific formation of antigen-antibody complexes.
  • Volume transducers are particularly suitable for use as chemical sensors in liquids, for example serums. These include the quartz crystals, which are coated on a specially treated surface (depending on the test principle) with antigenic proteins or monoclonal antibodies. If an electrical alternating voltage is applied to these quartz crystals, the crystal is excited to elastic vibrations, the amplitude of which reaches a maximum when the electrical frequency matches one of the mechanical natural frequencies of the respective quartz crystal. These vibrations can be recorded with suitable measuring systems. If you put a quartz crystal coated with antigens in a solution that contains specific binding antibodies, they attach to its surface and change its mass. This causes a change in its oscillation frequency and thus indicates the binding of an antibody.
  • This interfering wave is the electromagnetic energy that arises at the interface between fiber optics and liquid.
  • the energy is absorbed when absorbent molecules appear at the interface so that the degree of absorption is proportional to the amount of absorbent material at the interface.
  • the formation of antigen-antibody complexes, the antigen or the antibody being bound to the fiber surface, can thus be detected.
  • a metal-coated glass is used as an optical device in which an internally completely reflected light beam causes an induced electromagnetic surface wave or plasmon.
  • a detectable surface plasmon resonance occurs at a certain angle of incidence of the light, which is decisive for the refractive index of the medium that is adjacent to the metal film. depends.
  • the potentiometric immune sensors include the ion-sensitive field effect transistors.
  • a receptor Antikö ⁇ er. Antigen or other receptor
  • the binding of an analyte to the receptor layer causes a change in the charge distribution and thus a switching of the field effect transistor.
  • Artificial protein molecules based on the lumazine synthase can be used as a carrier phrotein when building a biosensor e.g. for the presentation of antigenic catch phages, for the detection of antibodies against certain infections.
  • the inventive formation of mixed lumazine synthase conjugates enables the respective peptides to be incorporated into an icosahedral structure together with a binding-promoting biotin molecule.
  • up to 59 identical or different antigenic active peptides e.g. domains of viral surface proteins
  • a representative peptide library can be placed on a single sensor.
  • the binding of the multimeric lumazine synthase conjugates to the surface of a transducer can be made possible, for example, via a streptavidin / biotin coupling.
  • the surface of a sensor chip e.g. field effect transistor, surface plasmon transducer surface, etc.
  • a sensor chip e.g. field effect transistor, surface plasmon transducer surface, etc.
  • Stability problems and non-specificities are not expected when using a thermostable carrier protein and the biotin streptavidin system.
  • Small molecules can also be bound to the surface by simple chemical coupling. The coupling locations are singular. exposed reactive amino acids are available on the surface of the spherical protein.
  • a functionalized lumazine synthase is provided with 60 identical or differently modified subunits via an anchor (peptide, fatty acid, etc.) with a surface (e.g. transducer surface or any other surface that is already on one Converter is connected).
  • the detection sensitivity for foreign molecule binding on the surface of the lumazine synthase is increased by a high number of functional groups (for example epitopes for antibody recognition, antibodies for detection of foreign molecules in solution or other receptors).
  • Vaccinations lead to immunological resistance to pathogens.
  • Vaccines are mainly used for prevention, that is, they should build up protection in immunized persons, which protects them against infection and thus against the disease when they come into contact with the respective pathogen.
  • the injected or orally administered vaccine results in
  • Organism for the formation of antibodies and / or for a cellular immune response Organism for the formation of antibodies and / or for a cellular immune response.
  • the future infectious organism is killed or neutralized so that the disease does not break out.
  • Attenuated viruses are used as vaccines. Attenuated viruses are similar to disease-causing pathogens, but differ ⁇ 'on them in terms of virulence behavior: they cause only a limited or weakened infection and thereby induce the formation of neutralizing antibodies and cyto-toxic T cells.
  • the molecular basis of attenuation are mutations in the genome of wild-type viruses. Attenuated viruses usually give a very good vaccination protection, which is maintained over several years, but they carry the risk that they can mutate back to the wild type in the course of the weakened infection.
  • Another possibility for immunization in humans and animals consists in the presentation of antigenic active parts of surface viral proteins on other, non-pathogenic viruses. e.g. Plant viruses.
  • the gene fragments that code for an antigenic determinant (e.g. surface protein) of the pathogenic virus are incorporated into the genome of the non-pathogenic virus (Dalsgaard et al., 1997).
  • the foreign protein is presented together with a viral protein on the surface of the non-pathogenic virus.
  • DNA fragments of any size cannot be integrated into the virus genome. It is therefore necessary to know exactly which proteins of the virus, against whose infection vaccination protection is to be generated, are important for triggering a protective immune response.
  • Such a vaccine cannot produce the breadth of an immune response that arises when an infection with the wild-type virus or its attenuated variant occurs.
  • the immunological response is limited to a selected protein.
  • Vaccines which consist of synthetic peptides with a length of 15 to 30 amino acids, represent a vaccine form.
  • individual epitopes of viral proteins that cause the formation of neutralizing antibodies are selected and chemically synthesized.
  • a prerequisite is well-founded detailed knowledge of the protein segments that can cause a virus-neutralizing immune response.
  • high-molecular molecules including proteins and carrier-fixed peptides
  • proteins and carrier-fixed peptides are suitable. because they can be administered without the use of excipients, but still provide good immunity, especially as vaccines.
  • the redundant occurrence of antigenic determinants in large numbers, as can be observed, for example, in the case of viruses or bacteria, on the immunogenic high-molecular molecule promotes the desired high antigenicity, ie the preventive immune response.
  • the lumazine synthase is suitable, especially because of its icosahedral structure.
  • the lumazine synthase consists of at least 60 subunits, ie at least 60 identical or different antigenic determinants can be presented in one molecule.
  • the lumazine synthase has a high molecular structure and a surface structure comparable to that of some viruses, ie a high antigenicity is to be expected.
  • Such vaccines are free of viral genes and can be produced in large quantities with relatively little effort. Since large parts of the virus proteins can be presented, in this case no detailed knowledge of the protein sections that can provoke a virus-neutralizing immune response is required.
  • the genetically engineered proteins which are the subject of the present invention are based on the covalent linkage of a wild-type lumazine synthase sequence or a modified lumazine synthase with substructures of viruses, bacteria. Fungi, protozoa or toxins.
  • the linkage can take place at the N-terminus and / or at the C-terminus of the lumazine synthase.
  • the peptides to be presented can be inserted into the sequence at suitable locations in the lumazine synthase subunit such that they are presented in the form of a loop on the surface of the multi-subunit protein.
  • a given immunological determinant can thus be used in a defined high number, e.g.
  • association according to the invention of subunits with different, genetically engineered peptide or protein sequences also offers the possibility of producing Protein molecules that have several different antigenic sequences on a given
  • the nucleic acids used contain genes or parts of genes of a pathogenic organism that specify an immunogenic protein. Detailed knowledge of the immunologically important components is of great benefit for the development of this vaccine.
  • the genes used mainly code for the surface components of a pathogen or for parts of bacterial toxins. They are integrated together with regulatory elements to control their expression in a vector system and injected intramuscularly as purified DNA and expressed there. In muscle cells in particular, DNA can be detected as an episome over long periods of time, since it is obviously very slow to degrade. If the relevant genes are expressed, the organism can develop both a humoral and a cellular immune response. This form of vaccine has so far been tested in the animal system.
  • Gene constructs that specify fusion proteins consisting of protein components of pathogenic microorganisms and lumazine synthase are generally suitable as DNA vaccines.
  • the gene coding for this peptide can be introduced into a eukaryotic expression vector. After transformation of plant cells with this DNA, transgenic plants can be obtained which express the gene in question. Eating parts of this transgenic plant will also make the selected one
  • Protein component absorbed into the body and can induce an immune response there.
  • Lumazine synthase is particularly suitable as the particle-forming protein. to which parts of immunologically active proteins of the pathogen are fused.
  • a thermostable, particle-forming lumazine synthase e.g. from Aquifex aeolicus
  • Inert phrotein can even be made a boil-proof vaccine.
  • Vaccines are said to prevent the multiplication of a pathogen and thus an infection.
  • the pathogenic organism is not accessible to antibodies or, as in the case of acquired immune deficiency (AIDS), too little is known about the pathogen (HIV).
  • the target cells of HIV are helper T lymphocytes (helper cells) of the immune system, whereby the most important functions of these cells are disrupted.
  • helper cells helper T lymphocytes
  • the virus is protected from the immunological attack.
  • the infected cell can be destroyed by the production and release of HIV particles.
  • An infected cell can become a "factory" for the production of further virus particles.
  • the main consequence of an HIV infection is that the immune system can no longer offer protection against common infectious diseases.
  • the first step in an HIV infection is the interaction of a 120 kDalton glycoprotein (gpl20) from the virus envelope and the CD4 receptor on the surface of the helper cells.
  • Antibodies to CD4 block the HIV infection of helper cells in vitro. Even with an excess of free CD4 protein, the infection rate decreases in vitro
  • the development of a fusion protein from a part of the CD4 protein and from the Fc portion of an immunoglobulin represents the attempt to achieve both the protection of the helper cells and the killing of the virus.
  • the fusion protein is called CD4 immunoadhesin.
  • the molecule binds on gpl20 and blocks HIV, both of which are functions of the CD4 portion Binding cells with Fc receptors, and the long half-life in plasma, however, are due to the immunoglobulin content. After the binding of the immunoadhesin to the free virus or to HIV-infected cells, an antibody-dependent, cell-mediating cytotoxic reaction occurs, which leads to the destruction of the virus or the HIV-infected cell (from: Glick, B .. Pasternak, J. , Molecular Biotechnology, Spektrum Akademischer Verlag, 1995, p. 245).
  • the efficiency of this strategy could be improved by using a multimerized derivatized lumazine synthase.
  • a functionalized lumazine synthase can be used, which contains both CD4 protein portions. as' also about FC shares disposes. Since there is not just one functional unit per molecule, but many of these units, the efficiency should increase significantly.
  • antibodies eg specially developed "single-chain antibodies”
  • they are specifically directed against a tumor marker (eg against the teratocarcinoma antigen) and this functionalized fusion protein Use cancer therapy.
  • Another possible application is the combination of an antibody against a tumor marker with metallothionein.
  • the multimeric lumazine synthase is decorated with an anti-tumor antibody and up to 59 metallothionein molecules.
  • the metallothionein molecules are loaded with radioactive elements (with a relatively short half-life), which are suitable for radiation therapy (for example technetium 99).
  • radioactive elements with a relatively short half-life
  • the protein complex binds to the tumor via its antibody component and thereby leads the radiation source directly to the tumor tissue.
  • Similar constructs can also be used for diagnostic purposes, e.g. for the radioactive detection of a possible cancer.
  • the basis of the foreign peptides is formed by DNA sequences that code for a specific epitope (antigenic determinant).
  • the sequence of the additional peptide segments can be exactly determined by appropriate choice of the DNA sequence.
  • peptide sequences can also be incorporated which have a stochastic amino acid sequence in their entire length or in sections.
  • a diverse, randomly oriented variability of these peptides can be achieved by using synthetic oligonucleotides which have a randomly (randomly) generated sequence section, so that representative peptide libraries are created. According to the invention, these randomly generated peptides are presented on the surface of the lumazine synthase and are therefore also accessible for an antibody binding.
  • the lumazine synthase variants obtained can be used, for example, to characterize antibody binding sites.
  • isolating antigen-antibody complexes with subsequent sequencing of the bound peptide portion (-terminal Edman sequencing or Sequence determination by mass spectroscopy), the selectivity of the binding site of an antibody can be characterized.
  • the invention relates to the use of lumazine synthase molecules as carrier phrotein for foreign proteins, peptides and / or other organic chemical molecules.
  • This invention furthermore relates to a process for the selective, recombinant incorporation of the abovementioned foreign proteins or peptides both in loops or, according to the invention, preferably at the N-terminus and / or at the C-terminus of lumazine synthases.
  • the method involves an in vivo association of different lumazine synthase conjugates by way of a coexpression of the genes in question in a cell.
  • the method includes the possibility of in vitro reassociation of individually designed lumazine synthase conjugates to spherical particles by means of denaturing / renaturing monomeric subunits, which can be carried out both with and without the use of a folding-supporting ligand.
  • Lumazine synthase conjugates are provided. which have a biotinylatable peptide (Tucker and Grisshammer. 1996; Schatz. 1993; Cronan. 1990) at the C-terminus.
  • an artificial lumazine synthase molecule is provided which has an easily accessible basic amino acid (lysine) at its C-terminus.
  • a lumazine synthase molecule is provided, which via a. easily accessible cysteine molecule at the C-terminus. Both variants are suitable for the chemical coupling of organic molecules The coupling can take place, for example, by producing a
  • Acid amide bond or a disulfide bond between protein and coupling component
  • the chemical coupling according to the amide principle can also be carried out on lysine residues which occur naturally on the surface of lumazm synthase molecules
  • thermostable icosahedral lumazine synthase (from Aqmjex aeolicus) is provided, which can be used, inter alia, as a carrier for the production of particularly stable
  • the process for the preparation of lumazine synthase conjugates includes the following substeps
  • A) Obtaining a DNA which contains a gene for a lumazine synthase (for example by isolation from an organism, by PCR amplification with naturally occurring RNA or DNA as a matrix, or by DNA synthesis)
  • Expression of the fused artificial DNA in the transformed host cells as a chimeric protein can be an intended post-translational modification of the chimeric protein in vivo. e.g. Phosphorylation, glycosylation. Include biotinylation, etc.
  • Extrachromosomal (episomal) vectors e.g. plasmids
  • Integration vectors e.g. lambda vectors
  • Agrobacterium tumataciens-based vectors for plants e.g. Ti plasmid
  • Plasmid vectors are preferred according to the invention. Plasmids used can be isolated from natural sources or synthetically produced. The plasmid selected should be compatible with the host strain in question. To do this, it should have a suitable origin of replication that matches the host strain. Furthermore, the capacity of the vector should be sufficient both for the lumazine synthase variant used and for the fused foreign peptide.
  • the plasmid vector should have suitable selection mechanisms, such as a resistance gene. The selection is necessary in order to distinguish host cells with or without a plasmid. If Escherichia coli is selected as the host strain, then vectors according to the invention are those which have a promoter sequence from the bacteriophage T5 or T7. have an operator sequence, preferably the operator sequence from the Escherichia coli lactose operon (lacl), a cloning cassette with several singular interfaces for restriction endonucleases and an efficient termination sequence. Furthermore, the vector should have an origin of replication which allows a high copy number of the extrachromosomal DNA in the host cell.
  • Prokaryotic expression systems are generally well suited for the recombinant production of protein conjugates according to the invention.
  • post-translational changes may be necessary that cannot be introduced in prokaryotic organisms.
  • eukaryotic proteins cannot be glycosylated or phosphorylated in prokaryotes. Preference is therefore given to eukaryotic foreign proteins (fused to the lumazine synthase).
  • a strong promoter for example AOXl
  • a promoter specific for mammalian cells for example rat preproinsulin gene promoter
  • mammalian cells for example COS7 monkey Kidney cells
  • a promoter specific for insect cells eg baculovirus, Autographa californica
  • the vectors used should be compatible with these host strains mentioned.
  • vector systems based on the Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens are suitable.
  • physical methods are suitable (eg bombardment with microprojectiles (biolistics)).
  • Both naturally occurring proteins and synthetic proteins that do not occur in nature can be fused to the carrier protein (lumazine synthase).
  • Viruses, prokaryote (eubacteria. Archaea) and eukaryotic organisms (plants. Animals) can be considered as DNA sources.
  • the DNA to be fused can also be produced synthetically using methods customary for this.
  • the DNA can also be produced from mRNA with the aid of reverse transcriptase.
  • the recombinantly generated plasmid vectors are used to transform host cells.
  • well-characterized bacterial cells are preferred.
  • the host cells can also be eukaryotic cells.
  • Host strains used should have the enzymatic equipment necessary for the expression of the fused polypeptide. Transformation techniques are known to the person skilled in the art. Protocols for this are available from Maniatis et al. (1982). After the transformation, the transformants are analyzed.
  • the plasmids are isolated and characterized using molecular biological methods, such as restriction analysis and DNA sequencing.
  • the expression of a cloned DNA sequence in a prokaryotic or eukaryotic host cell is known from the prior art.
  • the cultivation of the transformed host cell in the method according to the invention for obtaining recombinant fusion proteins takes place under conditions which are conducive to the expression of the DNA sequence.
  • the cell disruption after expression can be carried out by all the usual methods for this.
  • the disrupted cells are separated into a soluble and an insoluble fraction using known separation methods.
  • the fusion protein is in the form of inclusion bodies in the insoluble fraction, the cell residue remaining after centrifugation is washed and then dissolved by adding a solubilizing agent.
  • the solubilization is preferably carried out in the presence of reducing agents.
  • the insoluble substances are separated using known methods.
  • the method according to the invention is characterized. that the renaturation step can be carried out in the presence of a stabilizing agent (5-nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4 (1H.3H) pyrimidinedione).
  • the fusion proteins can be purified using known chromatographic or other biochemical methods.
  • a reactive amino acid preferably a lysine and / or a cysteine residue according to the invention. coupled to a flexible peptide linker.
  • covalent coupling of molecules by chemical means is made possible or facilitated.
  • the coupling can take place in different ways. Examples are: a) Bisimide esters are readily soluble in water and can react with the ⁇ -amino group of a lysine residue under mild reaction conditions (pH 7.0 - pH 10.0). The resulting amide bond is stable.
  • Lumazine synthases activated in this way can be used for coupling with other peptides
  • R and R ' can be represented by aliphatic or aromatic radicals.
  • Carbodiimides react preferentially with the ⁇ -amino group of lysine.
  • m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester is a well-studied heterobifunctional reagent. In neutral aqueous solution, MBS first reacts in an acylation reaction with amino groups to the activated N-hydroxysuccinimide ester.
  • a second peptide can then be attached to the double bond of the ester by adding a thiol residue, d) N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) is a heterobifunctional reagent which can react under mild conditions with amino groups of the target protein .
  • SPDP N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate
  • the 2-pyridyl disulfide structure can then react with aliphatic thiols or a cysteine of another peptide via a thiol disulfide exchange reaction.
  • the coupling reaction can take place in the pH range of 5-9 and the progress of the reaction can be monitored photometrically. No reactions with other functional groups are known.
  • in vitro reassociated lumazine synthase conjugates takes place via a dissociation step and a subsequent one
  • Folding / reassociation step can be done by treatment with denaturing agents. For example, fluorine or guanidine chloride, by changing the pH, by heat treatment or other processes.
  • denaturing agents for example, fluorine or guanidine chloride, by changing the pH, by heat treatment or other processes.
  • the chimeric proteins present after the denaturation are each composed of a constant region, a lumazine synthase (or a modified lumazine synthase) and a variable region Region (any fused peptide) together.
  • the monomeric subunits can then be mixed as required. Since the recombined subunits each have a constant lumazine synthase content, renaturation of the lumazine synthase core structure is possible with formation of the natural icosahedral structure.
  • the renaturation can be carried out in the presence of a stabilizing agent (preferably 5-nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4 (1H
  • the in vivo combination of different lumazine synthase variants takes place by coexpressing the respective genes which code for the desired fusion polypeptide.
  • the genes in question can be located on the chromosomal DNA of the host strain and / or on one or more plasmid vectors.
  • FIG. 1 is a schematic representation of an ELISA protocol for the detection of a specific antigen or a specific Antikörer.
  • the antigen is bound to the microtiter species.
  • the enzyme (E) is coupled to the secondary antibody.
  • the colorless substrate is converted into a colored product by the enzyme (E).
  • FIG. 2 describes the detection of an antigen by means of a biotin-labeled primary antibody.
  • a lumazine synthase conjugate which contains up to 60 biotin molecules is covalently bound to the biotinylated primary antibody via a streptavidin or an avidin bridge (SA).
  • the color reaction is achieved by any streptavidin-coupled enzyme (E), which enters into a complex with the biotinylated lumazine synthase.
  • E streptavidin-coupled enzyme
  • a 60-fold biotinylated linker protein lumazine synthase conjugate
  • extreme signal amplification is achieved, the signal strength being proportional to the antigen concentration.
  • FIG. 3 describes the use of a lumazine synthase mixed conjugate in the diagnosis of infectious diseases.
  • a lumazine synthase molecule which contains 1 -5 short peptides of antigenic active viral or bacterial surface proteins (antigenic determinants) and up to 60 Contains biotin molecules covalently bound, serves as a detection molecule for immobilized antibodies that come from a patient's serum or other liquids.
  • B) Characteristic antibodies against certain infectious diseases are fished from the respective body fluid with the help of special immobilized epitopes (parts of surface proteins of the pathogenic organisms in question; antigenic determinants).
  • a lumazine synthase molecule which also contains 1-5 copies of the above-mentioned epitope and up to 60 biotin molecules covalently bound, serves as a detection molecule for these now immobilized antibodies.
  • a color reaction is achieved in both cases by any streptavidin-coupled enzyme (E), which enters into a complex with the biotinylated lumazine synthase.
  • E streptavidin-coupled enzyme
  • a signal amplification is achieved by the interposition of a multi-biotinylated linker protein (lumazine synthase conjugate) and the resulting multiple binding of the color-reacting enzyme.
  • Antibodies that are not bound are removed in a first washing step. There is no binding to the immobilized epitopes. the complex of lumazine synthase conjugate and antibody is not formed. Excess lumazine synthase conjugate is removed in a second washing step, so that the test batch remains colorless.
  • FIG. 4 describes a schematic representation of an experimental arrangement for the purification of antibodies with a specific antigen recognition.
  • a lumine synthase conjugate which has both a desired foreign peptide (in a multiple version) and a biotinylated portion (in a single version) is bound to immobilized streptavidin via its biotin portion.
  • the streptavidin molecules are coupled to a solid phase.
  • the mixed antibody population is placed on a column with immobilized streptavidin (or mixed with streptavidin material), the antibodies binding with the desired specificity to the foreign peptide portion on the lumazine synthase conjugate.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of the structure of a biosensor, which in principle can consist of at least three parts: 1. The biological receptor. 2. The converter unit, 3. The attached electronics. The biological receptor can be bound to the transducer or transducer in different ways.
  • FIG. 6 schematically shows a functionalized lumazine synthase with 60 identical or differently modified subunits, which are linked via an anchor (peptide, fatty acid. other functional groups) with a surface (for example ⁇ andler surface, membrane, other surfaces, etc) ⁇ is connected.
  • the sensitivity to detection of foreign molecules on the surface of the lumazine synthase will result in a large number of functional groups (for example epitopes for the detection of antibodies and antibodies for the detection of foreign molecules Solution or other receptors) increased
  • Figure 7 shows schematically a possible structure of a field effect transistor including a multimer.
  • Functionalized lumazine synthase A change in the surface charge at the gate electrode that occurs due to the binding of a foreign molecule to the surface of the lumazine synthase modulates the current flow through the field effect transistor
  • FIG. 8 shows a sequence comparison of lumazine synthases from the following organisms I Mycobactenum avium 2 Mycobactemun tuberculosis 3 Corvnebactermm ammomagenes, 4 Chlorobium tepidum 5 Aquijex aeolicus 6 Thermotoga maritima ⁇ Bacillus subtilis 8 Bacillus amyloliquefacusphosphomium pneumoe v Photobacterium phosporeum 14 S putrefaciens 15 Photobacterium leiognathi 16 Shigella flexne i 1 " Escherichia coli, 18 Haemophilus influenzae 19 Dehalospv ggum multivorans 20 Hehcobacter pylori 21 Deinococcus radwdurans 22 Svnechocystis sp, 23 P orphidophobia f.
  • the ligand 5-nitro-6- (D- ⁇ b ⁇ tylammo) -2 4- (lH, 3H) - py ⁇ midmdion binds in the contact point between two monomeric subunits (Ladenstein et al, 1988. 1994, Ritsert et al. 1995)
  • FIG. 10 shows a model of the icosahedral lumazine synthase from Bacillus subtilis. One of 12 pentameric subunits is highlighted by the use of different shades of gray. Both the N and the C part minus are on the surface and are freely accessible
  • FIG. 11 shows the expression vectors used in the exemplary embodiments. SD, ribosomal binding site; MCS. Cloning cassette with unique interfaces; to, ti,
  • Terminator sequences (cat), inactive gene for chloramphenicol acetyl transferase
  • FIG. 12 describes the 1st PCR for introducing a mutation using the example of replacing the amino acid cysteine at position 93 with serine in the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis.
  • two separate PCR In the first step of directed mutagenesis, two separate PCR
  • Fragment A contains the intended mutation and an intact recognition sequence for the restriction endonuclease
  • Fragment B represents the entire but unmutated ribH gene
  • FIG. 13 describes the 2nd PCR when introducing a mutation.
  • Mutagenesis is the introduced mutation, which is now still at the 3 'end of the
  • PCR generated gene fragment is located in the whole by overlapping extension
  • FIG. 14 describes the 3rd PCR for introducing a mutation.
  • the 3rd PCR serves the
  • FIGS. 15 to 24, 26 to 28 and 30 and 31 the sequence of the lumazine synthase used in each case is identified by bold print. The left regions are underlined. Recognition sequences for the respective restriction endonucleases are in italics and underlined. Fused sequences or amino acids that are not included in the linker sequence are underlined with dots. The amino acid sequence is given in the one-letter code.
  • FIG. 15 shows the structure of the vector pNCO-N-BS-LuSy for the fusion of foreign proteins to the N-terminus of the lumazine synthase.
  • FIG. 16 shows the structure of the vector pXCO-C-BS-LuSy for the fusion of foreign proteins at the C-terminus of the lumazine synthase.
  • Figure 17 shows the structure of the vector pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR.
  • Figure 18 shows the structure of the vector p ⁇ ' CO-N-VP2-BS-LuSy in the area of the N-terminus.
  • FIG. 19 shows the structure of the vector pXCO-C-VP2-BS-LuSy in the area of the C-terminus.
  • FIG. 20 shows the structure of the vector pNCO-C-Biotag-BS-LuSy in the region of the C-
  • FIG. 21 shows the structure of the vector pNCO-Lysl 65-BS-LuSy in the region of the C-terminus.
  • FIG. 22 shows the structure of the vector pNCO-Cysl 67-BS-LuSy in the region of the C-terminus.
  • FIG. 23 shows the structure of the vector pFLAG-MAC-BS-LuSy in the area of the N-terminus.
  • FIG. 24 shows the structure of the vector pNCO-C-His6-BS-LuSy in the region of the C-terminus.
  • FIG. 25 shows the construction of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus
  • AQUI-1 1 AQUI-1 1
  • 6-stage polymerase chain reaction AQUI-1 1
  • FIG. 26 shows the coupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide. to the C-terminus of the thermostable lumazine synthase
  • Aquifex aeolicus (Peptide is linked via a linker with 3 alanine residues to the C-terminus of the
  • FIG. 27 shows the coupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide. via a linker of 6 histidine and 3 alanine residues at the C-
  • thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus.
  • FIG. 28 shows the coupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide. via a linker consisting of 6 histidine residues and the sequence
  • FIG. 29 shows the production of a chimeric protein consisting of part of the
  • Lumazine synthase from Bacillus subtilis and part of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus. (RBS: ribosomal binding site)
  • FIG. 30 shows the 5 ' region of the vector pNCO-AA-Bglll-LuSy or of the vector pNCO-
  • FIG. 31 shows the 3 ' region of the vector pNCO-AA-LuSy- (BamHI) or the vector pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI) for the fusion of foreign genes to the 3' end of the vector pNCO-AA-LuSy- (BamHI) or the vector pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI) for the fusion of foreign genes to the 3' end of the
  • Lumazine synthase from Aquifex aeolicus A peptide with the sequence GSVDLQPSLIS is fused to the C-terminus of the carrier phrotein.
  • SEQ ID No. 1 shows the DNA sequence of the expression vector pNC0113.
  • SEQ ID No.2 shows the DNA sequence of the expression vector p602 / -CAT. (Swing vector for expression of genes in Escherichia coli and Bacillus subtilis; Henner, 1990; LeGrice.
  • SEQ ID No.3 shows the DNA sequence of the expression plasmid pNCO-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.4 shows the DNA sequence of the expression plasmid p602-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.5 shows the DNA sequence of the expression plasmid pXCO-BS-LuSy-C93S.
  • SEQ ID ⁇ o.6 shows the DNA sequence of the expression plasmid pNCO-BS-LuSy-Cl 39S.
  • SEQ ID ⁇ o.7 shows the DNA sequence of the expression plasmid pNCO-BS-LuSy-C93 / l 39S.
  • SEQ ID No.8 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-X-BS-LuSy for the fusion of foreign peptides to the N-terminus of the lumazine synthase from Bacillus subtilis.
  • SEQ ID No.9 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-BS-LuSy for the fusion of foreign peptides to the C-terminus of the lumazine synthase from Bacillus subtilis.
  • SEQ ID No.10 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy.
  • Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the
  • SEQ ID No.ll shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-EC-MBP-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.12 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR.
  • SEQ ID No.13 shows the DNA sequence of the expression vector ph ' CO-N-VP2-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.14 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-VP2-BS-LuSy.
  • SEQ ID ⁇ o.15 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-N / C-VP2-BS-LuSy.
  • Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the VP2 domain of the ' mine enteritis virus ' and the lumazine synthase from Bacillus subtilis.
  • SEQ ID No.16 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-Biotag-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.17 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-Lysl 65-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.18 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-Cysl67-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.19 shows the DNA sequence of the expression vector pFLAG-MAC-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.20 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-His6-BS-LuSy.
  • SEQ ID No.21 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-LuSy.
  • SEQ ID No.22 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-Biotag-AA-LuSy.
  • SEQ ID No.23 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-His6-C-Biotag-AA-
  • Lusy (Expression plasmid for expressing the lumazine synthase from Aquifex aeolicus with C- terminal, via a linker of 6 histidine and 3 alanine residues coupled, in vivo biotinizable peptide)
  • SEQ ID No.24 shows the DNA sequence of the Expwessionsweklo ⁇ s pNCO-His6-GLY2-SER-GLY-
  • SEQ ID No.25 shows the DNA sequence of the expression vector pXCO-BS-LuSy-Agel-AA-
  • Lumazine synthase from Bacillus subtilis and part of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus the portion of the lumazine synthase from Bacillus subtilis is printed in bold, the
  • SEQ ID No.26 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-Bglll-LuSy
  • thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus using the
  • SEQ ID No.27 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-LuSy- (BamHI)
  • thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus using the
  • SEQ ID No.28 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-Bglll-LuSy-
  • thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus below
  • the bacterial strains used are deposited with the DSM in accordance with the Budapest Treaty. The instructions are given later.
  • strains of Bacillus subtilis and Escherichia coli used in the exemplary embodiments are listed below with their genotype and literature reference.
  • oligonucleotides used were manufactured by Gibco BRL, Eggenstein and MWG-Biotech, Ebersberg as part of an order synthesis.
  • the batch was carried out in a thermal cycler (GeneAmp ⁇ PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions: 1. 5.0 min at 95 ° C
  • Steps 2-4 were repeated 20 times.
  • the emission is measured using a photomultiplier 460 nm in a bandwidth of 10 nm.
  • the equilibrium was carried out with 2 ml of TNE buffer (100 mM Tris / HCl pH 7.4. 10 mM EDTA. 1 M NaCl) containing 0.1 ⁇ g / ml dye.
  • 2 ⁇ l of a calibration standard with a known DNA concentration (plasmid DNA) were then added and this concentration was adjusted on a fluorometer. After the zero point of the device had been checked with buffer / dye solution, 2 ⁇ l of the DNA sample of unknown concentration were added and the concentration was read in ⁇ g / ⁇ l.
  • Steps 2-4 were repeated 30 times.
  • restriction enzymes were obtained from Pharmacia Biotech (Freiburg). The mixture was incubated at 37 ° C. for 180 min and purified as described under B) and used for ligation.
  • the expression vector pNCO 1 13 was digested with the restriction endonucleases EcoRI and BamHI.
  • the cell pellet was then in 1 1 ice-cold and sterile 10% glycerol solution suspended and centrifuged again followed by two further washing steps (500 ml 10% glycerol solution; 20 ml 10% glycerol solution) with subsequent centrifugation. After the last centrifugation step, the residue was poured into 2-3 ml 10% Glycerol solution was taken up and placed on ice. The electroporation cell and cuvette holder were pre-cooled on ice for 15 minutes.
  • the cells were incubated for 1 h at 37 ° C. in a shaker and then in 20 ⁇ l and 200 ⁇ l portions on LB-Amp plates (21 g / 1 agar: 10 g / 1 casein hydrolyzate: 5 g / l yeast extract; 5 g / 1 NaCl; 150 mg / 1 ampicillin) and incubated overnight at 37 ° C. and the expression strain XLl-pNCO-BS-LuSy was obtained.
  • the sequencing of the plasmid DNA was carried out according to the chain termination method of Sanger et al. (1971) with labeled terminators and Taq DNA polymerase.
  • the sequencing mixture contained 1 ⁇ g of plasmid DNA from I).
  • 10 pmol sequencing oligonucleotide Seq-1 (5 ' gtg agc gga taa caa ttt cac aca g 3 ' )
  • 10 ⁇ l terminator Premix TM (dNTP 's , ddNTP 's , labeled ddNTP 's and Taq DNA polymerase) from ABI (Weiterstadt) and was with bidest.
  • the polymerase reaction was carried out 25 times in succession. After the polymerase reaction, 80 ul bidist. Water was added to the batch and twice with 100 ⁇ l phenol / chlorofoi amyl alcohol mixture (25:24: 1) from ABI (Weiterstadt), the heavier, reddish colored, chloroform-containing phase being discarded. The DNA was precipitated with 300 ⁇ l of absolute ethanol in the presence of 10 ⁇ l of a 3 M sodium acetate solution. The DNA was then pelleted by centrifugation (Eppendorf-Rotor. 14000 Umin '1 , RT, 30 min), the residue was washed with ice-cold 70% ethanol solution and dried in a vacuum centrifuge.
  • the dry DNA pellet was in a mixture of 1 ul 50 mM EDTA. pH 8.0 and 5 ⁇ l of formamide were taken in and heated to 95 ° C. for 2 min to denature the DNA and then immediately cooled on ice. 1.5 ul of these samples were then applied to a 4.75% polyacryiamide sequencing gel.
  • 13.3 ml of UltraPureSequagel 'sequencing system concentrate from National Diagnostics (Atlanta, Georgia, USA) were mixed with 49.7 ml of UltraPureSequagel TM sequencing system diluent and deionized with a spatula tip from Amberlite MB-1.
  • LB-AMP medium (10 g / 1 casein hydrolyzate; 5 g / 1 yeast extract; 5 g / 1 NaCl; 150 mg / 1 ampicillin). Cultivation was carried out in a volume of 25 ml in 100 ml Erlenmeyer flasks. First, an overnight culture (approx. 15 ml) of cells from H). which came from a single colony. The main culture was inoculated 1:50 (v / v) with the overnight culture. The growth of liquid cultures was monitored by measuring the optical density at 600 nm (OD 6 oo) against ungrowth medium as a zero value.
  • the expression strains were oo grown to an OD of 0.7 6 and then the transcription of the Lumazinsynthasegens with IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside) at a concentration of 2 mM. After fermentation (after induction a further 5 h) the cells were harvested by centrifugation (5000 rpm "1 4 ° C 15 min.), Washed with saline (20% of the volume of the main culture; Saline: 0.9% NaCl Ls ⁇ .) And stored at -20 ° C until further use. L) The cells from K) were disrupted using an ultrasound-producing apparatus (Branson-Sonifier B-12A. Branson SONIC Power Company. Dunbury, Connecticut).
  • the washed cell pellet was suspended in 800 ⁇ l digestion buffer (50 mM K-phosphate. PH 7.0; 10 mM EDTA; 10 mM Na 2 SO 3 ; 0.3 mM PMSF; 0.02% sodium azide) and cooled on ice for 10 min .
  • the cell suspension was then treated for 8 seconds with the needle probe of the ultrasound device at step 4.5.
  • the suspension was then cooled on ice for 5 minutes and subjected to an ultrasound treatment again.
  • the cell suspension was then centrifuged (Eppendorff centrifuge; 15000 Umin " 1 4 ° C, 15 min) and the supernatant (crude extract) used for further processing.
  • the crude extracts from L) were 1: 2; Diluted 1: 5 or 1:10 with protein application buffer (20% glycerol 4% 2-mercaptoethanol: 4% (w / v) SDS; 0.05% bromophenol blue) and boiled on a boiling water bath for 15 min. After cooling the remaining insolubles of the samples were in an Eppendorf centrifuge pelleted (15000 rpm '1. 5 min, 4 ° C) and 8 ul of the clear supernatant to the stacking gel applied. As a molecular weight standard was used Dalton Mark VII-L from Sigma (Deisenhofen ) with protein bands at 66, 44, 36, 29, 24, 20 and 14 kDa (hereinafter referred to as brand ⁇ roteins).
  • the electrophoresis was carried out at a constant 20 mV per SDS gel.
  • the protein bands were subsequently stained using Coomassie Staining solution (40% methanol; 10% acetic acid; 0.2% (w / v) Coomassie Blue R 250)
  • a Coomassie decolorizing solution was used to decolorize the acrylamide gel not containing the protein matrix (40% methanol; 10% acetic acid (tech. ); 50% water)
  • a protein band with a molecular weight of approximately 16 kDa was observed, which was found in a comparison strain without pNCO-BS-LuSy expression plate smid was not to be seen.
  • the observed band corresponded to a share of approx. 10% based on all soluble proteins (estimated).
  • the evaluation was carried out by HPLC on the reverse phase Nucleosil 10C ⁇ 8 (4 x 250 mm)
  • concentration of the 6.7-dimethyl-8-ribityllumazine formed was determined by fluorescence detection (excitation: 407 nm; emission: 487 nm).
  • the elution buffer contained 7% methanol and 30 mM
  • Formic acid the standard used was chemically synthesized 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine, and one unit (1 U) of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase catalyzed the formation of 1 nmol of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine at 37 ° C.
  • the volume extract of the strain XLl-pNCO-BS-LuSy could be measured to have a volume activity of approximately 15600 U / ml, and after determining the total protein concentration according to O) (13 mg / ml) a specific activity of approximately 1200 U / mg could be measured be calculated.
  • the protein in the crude extract was determined using a variant of the Bradford method (Read and Northcote, 1981; Compton and Jones, 1985).
  • the dye reagent was made up by adding 0.1 g Serva Blue G, 100 ml 16 M phosphoric acid and 47 ml
  • the membrane was then swirled overnight with 10 ⁇ l of anti-sRFS (rabbit raw serum with polyclonal antibodies against lumazine synthase; 1:10 diluted in 1 mg / 1 BSA) in a total volume of 5 ml of antibody wash buffer-C (with 1% milk powder) . After the incubation, the membrane was washed 3 times with 5 ml of Antibody Wash Buffer A each. The rinsed membrane was then incubated for 1 hour with 20 ⁇ l anti-rabbit IgG-HRP conjugate (in 50% glycerol) in Antibody Wash Buffer C.
  • anti-sRFS rabbit raw serum with polyclonal antibodies against lumazine synthase; 1:10 diluted in 1 mg / 1 BSA
  • antibody wash buffer-C with 1% milk powder
  • bands containing lumazine synthase were detected by adding 3,3 '- diaminobenzidine (6 mg in 10 ml antibody wash buffer A) and 10 ⁇ l hydrogen peroxide (30%). After development of the membrane, the lumazine synthase could be detected with a molecular weight of approx. 16.2 kDa.
  • the digested cell suspension was then centrifuged (Sorvall SS34 rotor; 15000 Umin "1 ; 4 ° C) and the clear supernatant on an anion exchange column (DEAE-Cellulose DE52; 2 x 15 cm. Whatman Ltd., Maidstone. GB) applied.
  • the column was first with 100 ml of buffer A (50 mM K -Phosphate. 10 mM EDTA. 10 mM sodium sulfite.
  • Active fractions were pooled and dialyzed against buffer A in a ratio of 1: 1000 (18 h. 4 ° C.) then concentrated using an ultracentrifuge (Beckman LE 70 with fixed angle rotor 70Ti; 32000 Umin "1 , 18 h, 4 ° C).
  • the concentrated protein solution which was approximately 75% enriched, was applied to a gel filtration column equilibrated with buffer A (Sepharose-6B, 2 x 180 cm, Pharmacia Biotech, Freiburg) and eluted with buffer A (flow rate: 0.5 ml / min). The lumazine synthase eluted shortly after the exclusion limit.
  • the fractions were then tested for lumazine synthase activity according to N) and then concentrated using an ultracentrifuge (Beckman LE 70 with fixed-angle rotor 70Ti; 32000 rpm, 1 , 18 h, 4 ° C.).
  • the purity test was carried out according to M) (SDS-PAGE) 16 kDa was observed and after determination of the enzymatic activity according to N) and the protein concentration according to O) a specific activity of 12400 U / mg could be calculated.
  • Negative contrasts according to P) showed hollow, spherical particles with an outer diameter of approx. 15 nm and an inner diameter of approx. 5 nm.
  • the enzyme sample was centrifuged at 3000 rpm "1 and 4 ° C so long, had to be adjusted, the balance between centrifugation and back diffusion
  • the data were analyzed with the software XLA-Data-Analysis. (Subprogram Origin single: Beckman Instruments).
  • the partial specific volume of the protein was approximately calculated from the partial specific volume of the amino acids and addition of a temperature correction according to Cohn and Edsall (1943)
  • a molecular mass of 925 kDa at 4 ° C. was obtained for the lumazine synthase and thus the aggregation to a 60-mer approved.
  • the cells were placed on ice for 30 minutes and then to obtain the cell mass centrifuged (Sorvall GSA rotor, 2300 rpm '1. 4 ° C. 15 min). The supernatant was discarded, the cell pellet with 300 ml ice-cold , sterile 1 mM HEPES buffer (1 mM (N-2-hydroxyethylpiperazine-N ' -ethanesulfonic acid in water, pH 7.0) and centrifuged again.
  • the sediment was washed twice in 200 ml PEB buffer (272 mM sucrose; 1 mM MgCl 2 ; 7 mM K-phosphate, pH 7.4) and the cell pellet was finally suspended in 16 ml PEB buffer and cooled on ice.
  • the electroporation cell and cell holder were pre-cooled on ice for 15 min.
  • LB-ERY-KAN medium (10 g / 1 casein hydrolyzate; 5 g / 1 yeast extract; 5 g / 1 NaCl; 15 mg / 1 erythromycin; 15 mg / ml kanamycin) were inoculated with 1 ml of the transformation mixture and used for Brewed for 4-8 h at 32 ° C in a shaking incubator.
  • portions of 100 ⁇ l, 200 ⁇ l and 400 ⁇ l of the transformation mixture were placed directly on LB-ERYKAN selective agar plates (21 g / 1 agar; 10 g / 1 casein hydrolyzate; 5 g / 1 yeast extract; 5 g / 1 NaCl; 15 mg / 1 erythromycin; 15 mg / ml kanamycin).
  • LB-ERYKAN selective agar plates 21 g / 1 agar; 10 g / 1 casein hydrolyzate; 5 g / 1 yeast extract; 5 g / 1 NaCl; 15 mg / 1 erythromycin; 15 mg / ml kanamycin.
  • the digested cell suspension was then centrifuged (Sorvall SS34 rotor; 15000 rpm " ; 4 ° C), filtered (pore size 0.22 ⁇ m) and the clear supernatant applied to a gel filtration column equilibrated with buffer A (according to Example 1R) and eluted with buffer A (flow rate: 0.5 ml / min).
  • the lumazine synthase was not retarded by the column material.
  • the fractions were then tested for lumazine synthase activity according to Example 1N) and then concentrated using an ultracentrifuge (Beckman LE 70 with fixed-angle rotor 70Ti; 32000 rpm) "1 : 18 h, 4 ° C).
  • Example 1M The purity was checked according to Example 1M) (SDS-PAGE), with only one product binding was observed at approx. 16 kDa. After determining the enzymatic activity and the protein concentration (according to Example 1 N) and O)), a specific activity of 12400 U / mg could be calculated. Negative contrasts (according to Example 1 P)) showed hollow, spherical particles with an outside diameter of about 15 nm and an inside diameter of about 5 nm. T) The quaternary structure of the purified lumazine synthase was checked according to Example 1 S) to U) and gave a comparable result.
  • the batch was carried out in a thermal cycler (Gene.Amp ' PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions: 1. 5.0 min at 95 ° C
  • Steps 2-4 were repeated 20 times.
  • thermocycler GeneAmp ® PCR System 2400; Perkin Elmer
  • Steps 2-4 were repeated 20 times.
  • PCR approach with the primer combination PNCO-Ml / RibH-3.
  • the PCR approach was carried out according to A), but the PCR steps were repeated 25 times.
  • Example 1 The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was amplified and purified analogously to Example 3 A) with the oligonucleotides PNCO-M2 and RibH-3 from the plasmid pNCO-BS-LuSy (Example 1).
  • Example 3 B Part of the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was analogous to Example 3 B) with the oligonucleotides PNCO-Ml and C139S (5 ' ggc aga aac agc tga atc tac acc ttt gtt g 3 ' ), which shows the mutation and the cleavage site Introduces PvuII (amino acid conservative) for the detection of the mutation, amplified from the plasmid pNCO-BS-LuSy (Example 1). The PCR was carried out and the fragment (394 bp) was purified analogously to Example 3 A) and B).
  • Example 3 D) The further molecular biological procedure corresponded to Example 3 D) to H).
  • the introduced mutation was diagnosed by digesting the plasmid pNCO-BS-LuSy-C139S with the restriction endonuclease PvuII (CAG * CTG) (fragments with 3539 bp and 340 bp).
  • the following examples describe the production of Escherichia coli expression vectors for the fusion of genes or synthetically produced DNA fragments at the 5 'end or at the 3 ' end of the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis.
  • the vectors contain the vector elements preferred according to the invention, such as promoter from bacteriophage T5, a lac operator sequence, an ampicillin resistance marker and an origin of replication compatible with Escherichia coli.
  • the following examples describe the fusion of an intact complete gene to the 5 'end or to the 3' end of the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis.
  • the examples illustrate the feasibility of fusing complete, biologically active proteins to the N-terminus and to the C-terminus of the icosahedral lumazine synthase from Bacillus subtilis.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the restriction enzyme was obtained from New England Biolabs (Schwalbach). The mixture was incubated at 37 ° C. for 150 min and purified as described under Example 1 B) and used for digestion with the restriction endonuclease Notl.
  • the restriction enzyme was obtained from New England Biolabs (Schwalbach). The mixture was incubated at 37 ° C. for 150 min and purified as described under Example 1 B) and used for the ligation.
  • the mixture was also incubated at 37 ° C. for 150 min and the resulting DNA fragment with a length of 3863 bp was purified as described under Example 1 B) and used for ligation.
  • Example 2 S The purification was done according to Example 2 S) on a Sepharose 6B gel filtration column, maintaining the concentration of the protein fractions at 28000 rpm "1 performed.
  • Negative staining according to Example 1 P) revealed hollow spherical particles having an outer diameter of approximately 20 nm and an inner diameter of approx. 5 nm.
  • the gene for the ... maltose-binding protein "(MBP) was PCR-derived from the plasmid pMAL-C2 (New England Biolabs. Schwalbach) using the oligonucleotides MALE-1 (5 ' gag gag aaa tta act atg aaa atc gaa gaa ggt aaa c 3 '), which is complementary at the 3' end to the 5 ' end of the MBP gene and at the 5 ' end for part of an optimized one encoded ribosomal binding site, and MALE-2 (5 ' gca ggt cga etc tag egg ccg ega att ctg 3'), which is complementary to the gene of the MBP at the 3 ' end and immediately after the last coding base triplet a recognition sequence for the endonuclease Notl introduces, amplifies.
  • the PCR was carried out analogously to Example 1A, using about 10 ng of plasmid DNA.
  • Example 2 S Purification was carried out according to Example 2 S) on a Sepharose 6B gel filtration column, maintaining the concentration of the protein fractions at 28000 rpm "1 performed.
  • Negative staining according to Example 1 P) revealed hollow spherical particles having an outer diameter of approximately 25 nm and an inner diameter of approx. 5 nm.
  • Example 10 The quaternary structure was checked according to Example 1 S). In comparison to the BS-LuSy and EC-DHFR-BS-LuSy, there was a clear difference in the speed of migration (EC-MBP-BS-LuSy migrated much more slowly than BS-LuSy and EC-DHFR-BS-LuSv, but also formed a discrete one Gang) can be observed.
  • Example 10 In comparison to the BS-LuSy and EC-DHFR-BS-LuSy, there was a clear difference in the speed of migration (EC-MBP-BS-LuSy migrated much more slowly than BS-LuSy and EC-DHFR-BS-LuSv, but also formed a discrete one Gang) can be observed.
  • Example 10 Example 10
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the restriction enzyme was obtained from Pharmacia Biotech (Freiburg). The mixture was incubated at 37 ° C. for 150 min and purified as described under Example 1 B) and used for digestion with the restriction endonuclease Notl.
  • the 17 amino acid long peptide is one of the highly conserved areas of the VP2 surface protein from various animal virus types, such as the ' Mink enteritis virus ' , the eline panleukopeniavirus ' or the' Canine Parvovirus ' .
  • the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was first isolated with the oligonucleotides N-VP2-1 (5 'ggt cag ccg gct gtt cgt aac gaa cgt atg aat atc ata caa gga aat tta gtt ggt ac 3 ' ) 3 'end complementary to the 5' end of the lumazine synthase gene and at the 3 'end encoded for part of the VP2 domain and RibH-3 (see Example 3A) from the plasmid pRF2 (see Example 1A)) amplified.
  • the PCR was carried out according to Example 1A).
  • Example 2 The PCR approach was carried out according to Example 1 B). whereby a DNA fragment with a length of 504 bp was obtained, purified and used as a DNA template for a second PCR.
  • Example 1A The PCR approach was carried out according to Example 1 B). wherein a DNA fragment with a length of 506 bp was obtained, purified and used as a DNA template for a second PCR.
  • Example 1 E) The further processing was carried out analogously to Example 1 E) to L). whereby the Escherichia coli expression strain XLl-pNCO-C-VP2-BS-LuSy was obtained.
  • Example 1 Starting from the expression plasmid pNCO-N-VP2-BS-LuSy obtained in Example 1 1, which contains the VP2 domain fused to the 5 ' end of the lumazine synthase gene, the VP2 domain became analogous to Example 12 at the 3 ' end of the lumazine synthase gene fused.
  • the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was determined using the polymerase chain reaction and the synthetic oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A) and C-Biotag-1 (5 ' cat agc ttc gaa gat gcc gcc gag tgc ggc cgc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3 '), which at its 3 ' end is complementary to the gene for lumazine synthase and immediately behind the last coding base triplet of lumazine synthase, DNA for a linker consisting of 3 alanine residues and introduces a portion of the DNA coding for the biotinylatable peptide, amplified from the plasmid pNCO-BS-LuSy (see Example 1). The PCR was carried out analogously to Example 1A).
  • Example 1 K To produce a total protein extract, the cells were cultivated analogously to Example 1 K). 1/12 of the cell mass obtained was suspended with 300 ⁇ l protein application buffer (see Example 1M)) and boiled in a boiling water bath for 15 min. After cooling the remaining insolubles of the samples were in a Eppendorfzentriglage pelleted (15000 rpm "1, 5 min, 4 ° C) and 8 ul of the clear supernatant to the stacking gel applied. The further procedure was carried out analogously to Example 1 M). It showed in connection with G) that the strain XLl-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy recombinant protein in the form of insoluble inclusion bodies in an amount of approx. 15% based on all cellular proteins (soluble and insoluble proteins, estimated by the SDS -PAGE) returns.
  • the membrane was then swiveled overnight with 20 ⁇ l streptavidin coupled to ' alkaline phosphatase' (Promega, Madison, Wisconsin, USA) in a total volume of 15 ml of antibody wash buffer C After the incubation, the membrane was washed 3 times with 5 ml of Antibody Wash Buffer A each. After washing, the biotin-bound streptavidin was detected by adding the substrates for the alkaline phosphatase.
  • the plastic surface of the sample bag not covered with avidin was incubated with 350 ⁇ l covering solution (3% milk powder in PBS) for 60 min at 37 ° C. The The covering solution was then poured off and the microtiter plate was tapped briefly. 100 ⁇ l of the renatured sample solution from L) (approx. 1 mg / ml) was then added to the first of 8 sample pockets. 50 ⁇ l of dilution solution (1% milk powder in PBS) were placed in each of sample pockets 2-8. The 8th sample bag was released. 50 ⁇ l from sample pocket 1 were diluted with the 50 ⁇ l dilution solution in sample pocket 2 (pipette up and down 10 times).
  • sample pocket 2 50 ⁇ l from sample pocket 2 were then diluted with 50 ⁇ l dilution solution from sample pocket 3, etc. Finally, 50 ⁇ l from sample pocket 7 were discarded, so that all sample pockets now contained 50 ⁇ l sample solution in different concentrations (log 2 dilution).
  • the samples were covered with adhesive film and incubated for 2 hours at 37 ° C. The sample solutions were then poured off, the microtitre plate was tapped briefly and the sample pockets were washed 3 times with 350 ⁇ l washing solution (PBS) each. 15 ⁇ l streptavidin-alkaline phosphatase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) were then diluted in 20 ml dilution solution (detection solution).
  • biotinylated lumazine synthase molecules If there are too many biotinylated lumazine synthase molecules on the surface of the microtiter plate (bound to the microtiter plate via avidin), the side biotin molecules are no longer accessible for binding to streptavidin. Only after the concentration of the biotinylated lumazine synthase molecules has been reduced are the lateral biotin molecules accessible for binding to streptavidin, ie the signal strength increases.
  • a linker (tentacle linker) was introduced between the C-terminus of lumazine synthase and the amino acid in question, so that the reactive amino acids are accessible for almost any chemical coupling with foreign molecules.
  • coding for the peptide (Gly) Ser- (Gly) 3 Ser-Gly-Lys introduces, amplified from the plasmid pNCO-BS-LuSy. Immediately after the codon for lysine (aaa) at amino acid position 165, the oligonucleotide C-Lysl65 is used to introduce a stop codon and a recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI into the DNA sequence.
  • the PCR was carried out analogously to Example 1A).
  • the oligonucleotide C-Cysl67 is used to introduce a stop codon and a recognition sequence for the BamHI restriction endonuclease into the DNA sequence.
  • a DNA fragment with a length of 549 bp was obtained.
  • the Escherichia coli strain XLl-pNCO-Cysl 67-BS-LuSy was obtained.
  • the mixture was also incubated at 37 ° C. for 180 min and the resulting DNA fragment was purified as described in Example 1B) and used for digestion with the restriction endonuclease EcoRI.
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 180 min and purified as described under B) and used for ligation.
  • Negative contrasting on the electron microscope according to Example 1 P) showed hollow, spherical particles with an outer diameter of approximately 15 nm and an inner diameter of approximately 5 nm.
  • Example 1 S The quaternary structure was checked as in Example 1 S).
  • the purified lumazine synthase fusion protein was seen as a discrete band on the native gel. There was reduced mobility compared to a wild-type lumazine synthase. due to the enlarged diameter can be observed.
  • the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was first identified using the oligonucleotides RibH-1 (see Example 1A) and RibH-His6-Cl (5 ' gtg gtg atg gtg atg ttc gaa aga acg gtt taa g 3 " ) which at its 3 ' end is complementary to the 3 ' end of the lumazine Synthase gene from Bacillus subtilis and coded at the 5 ' end for part of the affinity peptide, amplified from the plasmid pRF2 (cf. Example 1A).
  • Example 2B The PCR approach was carried out according to Example 1 B). wherein a DNA fragment with a length of 492 bp was obtained, purified and as a template for a 2nd PCR according to Example 1 C). however with the oligonucleotide combination EcoRI-RBS-2 (cf. Example 2A) and RibH-His6-C-2 (5 'tat tat gga tcc tta atg gtg gtg atg gtg atg 3 ' ). which completes the His6 domain in the 3 ' direction, introduces a stop codon into the sequence immediately behind the last coding base triplet of this domain and contains a recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI immediately behind this stop codon.
  • H The accessibility of the His6 peptides in the native protein was verified using microtitre plates and a multi-channel photometer (ELISA reader).
  • 100 ⁇ l of the crude extract solution from D) (approx. 5-8 mg / ml total protein) was added to the first of 8 sample pockets.
  • 50 ⁇ l of dilution solution (1% milk powder in PBS) were placed in each of sample bags 2-8. The 8th sample bag was released.
  • 50 ⁇ l from sample pocket 1 were diluted with the 50 ⁇ l dilution solution in sample pocket 2 (10 x up and down pipemeren).
  • 50 ⁇ l from sample pocket 2 were then diluted with 50 ⁇ l nerdilution solution from sample pocket 3, etc.
  • sample pocket 7 50 ⁇ l from sample pocket 7 were discarded, so that all sample pockets now contained 50 ⁇ l sample solution in different concentrations (log 2 dilution).
  • the samples were covered with adhesive film and incubated overnight at 37 ° C.
  • the plastic surface of the sample bag not covered with fusion protein was incubated with 350 ⁇ l covering solution (3% milk powder in PBS) for 60 min at 37 ° C.
  • the covering solution was then poured off, the microtitre plate was tapped briefly and the sample pockets were washed 3 times with 350 ⁇ l washing solution (PBS) each.
  • 10 ⁇ l Penta-His TM Antibody were diluted in 5 ml dilution solution (1st antibody).
  • each of the 1st antibodies were pipetted into the sample pockets 1-8 and incubated for 2 hours at 37.degree.
  • the first antibody was then poured off, the microtitre plate was tapped briefly and the sample pockets were washed 3 times with 350 ⁇ l washing solution (PBS) each.
  • PBS washing solution
  • the second antibody was then poured off, the microtiter plate was tapped briefly and the sample pockets were washed 3 times with 350 ⁇ l washing solution (PBS) each.
  • the microtiter plate was developed with the addition of 150 ⁇ l substrate solution (100 mg o-phenylenediamine in 25 ml substrate buffer, 50 mM citric acid, pH 5) for the peroxidase and measurement of the absorbance at 492 nm.
  • 150 ⁇ l substrate solution 100 mg o-phenylenediamine in 25 ml substrate buffer, 50 mM citric acid, pH 5
  • the highly specific Penta-His- Antibodies are recognized.
  • a concentration-dependent (log2 dilution of bound fusion protein) signal reduction was observed.
  • Example 1 S The quaternary structure was checked as in Example 1 S).
  • the purified lumazine synthase fusion protein was seen as a discrete band on the native gel. There was reduced mobility compared to a wild-type lumazine synthase. due to the enlarged diameter can be observed.
  • Example 14 The cultivation of the Escherichia coli strain XLl-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (Example 14) was carried out in accordance with Example 1K). however in a volume of 500 ml.
  • Example 18 The cultivation of the Escherichia coli strain XLl-pNCO-C-His6-BS-LuSy (Example 18) was also carried out according to Example 1K). however in a volume of 500 ml.
  • the cells from A) were disrupted using an ultrasound-generating apparatus (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company. Dunbury. Connecticut).
  • the washed cell pellet was suspended in 40 ml of separation buffer (50 mM Tris pH 9.5) and cooled on ice for 10 min.
  • the cell suspension was then treated 15 times with the needle probe of the ultrasound device at level 5.
  • the suspension was then cooled on ice for 5 minutes. The process would be repeated 4 times in total.
  • the cell suspension was then centrifuged (Sorvall SS34 rotor with Zentrif ge; 5000 rpm "1, 4 ° C, 10 min) separated, the supernatant (crude extract Al) and further processed, the cell pellet (residue Al).
  • the cells from B) were also disrupted using an ultrasound-generating apparatus (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Connecticut). Finally, the washed cell pellet was suspended in 40 ml of separation buffer (50 mM Tris pH 9.5) and cooled on ice for 10 min. The cell suspension was then treated 15 times with the needle probe of the ultrasound device at level 5. The suspension was then cooled on ice for 5 minutes. The process was repeated 4 times in total. The cell suspension was then centrifuged (Sorvall centrifuge with SS34 rotor: 15,000 rpm "1, 4 ° C, 30 min), the supernatant-B separated and further processed.
  • separation buffer 50 mM Tris pH 9.5
  • the dialysis buffer from T) was diluted with 40 ml refolding buffer B (100 mM K-phosphate buffer. PH 7.0. 1 mM DTE. 0.02% Na-Azide) and dialyzed for a further 24 h at 4 ° C (mixture Al / 10 and Mixture Bl / 10).
  • the dialysis buffer from U) was then diluted with 80 ml refolding buffer B and dialyzed for a further 24 h at 4 ° C. and the dialysates mixture Al / 20 and mixture B-1/20 were obtained.
  • the detection of the two subunits in the renatured icosahedral protein was carried out using microtitre plates and a multi-channel photometer (ELISA reader). The wells were coated with avidin as in Example 14M). 100 ⁇ l of the renatured sample solution from W) (approx. 0.5-1 mg / ml) was added to the first of 8 sample pockets. 50 ⁇ l of digestion solution (1% milk powder in PBS) were placed in each of sample bags 2 - 8. The 8th sample bag was released. 50 ⁇ l from sample pocket 1 were diluted with the 50 ⁇ l dilution solution in sample pocket 2 (10 x pipette up and down).
  • the first antibody was then poured off, the microtitre plate was tapped briefly and the sample pockets were washed 3 times with 350 ⁇ l washing solution (PBS) each.
  • 150 ⁇ l of the second antibody (10 ⁇ l anti-mouse-IgG-HRP-HRP conjugate in 5 ml dilution solution, Sigma. Kunststoff) was added with an incubation time of 2 h at 37 ° C.
  • the second antibody was then poured off, the microtiter plate was tapped briefly and the sample pockets were washed 3 times with 350 ⁇ l washing solution (PBS) each.
  • the microtiter plate was developed with the addition of 150 ⁇ l substrate solution (100 mg o-phenylenediamine in 25 ml substrate buffer, 50 mM citric acid, pH 5) for the peroxidase and measurement of the absorbance at 492 nm.
  • Supernatant mixture A-1/200 and supernatant Mix B-1/200 could be recognized by the highly specific Penta His antibodies.
  • a concentration-dependent (log2 dilution of bound fusion protein) signal reduction was observed. A stronger signal was observed with the supernatant mixture A- 1/200 than with the supernatant mixture B- 1/200.
  • a biotin molecule is sufficient for binding to the avidin-coated microtiter plate, while the signal strength correlates with the number of His6 epitopes per molecule.
  • supernatant mixture A-1/200 there are more His6 epitopes per icosahedron than in the comparative construct supernatant mixture Bl / 200. so that with supernatant mixture Al / 200, as the practical experiment confirms, a stronger signal can be expected. It follows from this result that icosahedra consisting of different subunits were obtained with the refolding measures described above.
  • thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus using 11 synthetic oligonucleotides adapted to the Escherichia coli codon use and a 6-stage polymerase chain reaction (Deckert et al., 1998)
  • the first part of the gene for the lumazine synthase from Aquifex aeolicus was with the oligonucleotides AQUI-1 (5 ' gct gcg ggt gaa ctg gcg cgt aaa gag gac att gat gct gtt atc gca att ggc gtt etc atc 3 ' : strand primer) and AQUI-2 (5 ' eta atg aaa ggt teg ega ggc ctt tg aaa ctt cag agg ega tat aat ega aat gtg gcg ttg 3 ' ; counter strand primer) using the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis as a template (vector pNCO-BS- LuSy, see Example 1 G)) amplified.
  • AQUI-1 '
  • AQUI-1 contains the recognition sequence for the restriction endonuclease Mfel (C * AATTG) and AQUI-2 for StuI (AGG * CCT).
  • the batch was carried out in a thermal cycler (GeneAmp '' 'PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions: 1. 5.0 min at 95 ° C
  • Steps 2-4 were repeated 20 times.
  • AQUI-3 contains the recognition sequence for the restriction endonuclease Agel (A * CCGGT) and AQUI-4 for SnaBI (TAC * GTA) and PvuII (CAG * CTG). The polymerase chain reaction was carried out as described under A).
  • AQUI-5 contains the recognition sequence for the restriction endonuclease Eagl (C * GGCCG) and AQUI-6 for BssHII (G * CGCGC) and PvuII (CAG * CTG). The polymerase chain reaction was carried out as described under A).
  • AQUI-7 contains the recognition sequence for the restriction endonuclease Sall (G * TCGAC) and AQUI-8 for Eco47III (AGC * GCT). The polymerase chain reaction was carried out as described under A).
  • Oligonucleotides AQUI-9 (5 ' atg caa atc tac aa ggt aa eta act gct gaa ggc ctt cgt ttc ggt atc gta gca tca cgt ttt aat c 3 ' : strand primer) and AQUI-10 (5 ' tat tat gga tcc tta teg gag aga ctt gaa taa gtt tgc cat ttc aat gg 3 ' ; counter strand primer).
  • oligonucleotides were adapted to the optimal codon usage (for highly expressed genes) of Escherichia coli.
  • AQUI-9 completes the gene for the lumazine synthase from Aquifex aeolicus and contains the recognition sequence for the restriction endonuclease StuI (AGG * CCT).
  • the oligonucleotide AQUI-10 which is complementary to the gene of lumazine synthase from Aquifex aeolicus at the 3 ' end. introduces a recognition sequence for the endonuclease BamHI (G * GATCC) immediately behind the stop codon. The polymerase chain reaction was carried out as described under A).
  • oligonucleotide AQUI-1 1 is complementary at the 3 ' end to the 5 ' end of the synthetic gene for the lumazine synthase from Aquifex aeolicus. At the 5 ' end, it introduces a ribosomal binding site and a recognition sequence for the restriction endonuclease EcoRI before the start codon.
  • the polymerase chain reaction was carried out as described under A).
  • Steps H) -M) were then carried out in accordance with Example 1.
  • a protein band with a molecular weight of 16.7 kDa was observed, which could not be seen in a comparison strain without the plasmid in question.
  • the observed band corresponded to a share of approximately 20% based on all soluble proteins.
  • Example 1 P The negative contrast was carried out according to Example 1 P) and showed hollow, spherical particles with an outer diameter of approximately 15 nm and an inner diameter of approximately 5 nm.
  • Q The protein was purified in two steps: the cultivation of the Escherichia coli strain XL 1 -pNCO-AA-LuSy was carried out according to Example 1 K), but in a volume of 1 1. The digestion was carried out according to Example 1 R). The clear supernatant was then incubated in a water bath at 90 ° C. for 20 min. The suspension was then centrifuged (Sorvall SS34 rotor: 15000 rpm " ; 4 ° C; 30 min). With this step, the target protein could be enriched by a factor of 4 (estimated by SDS-PAGE). The further purification was carried out in accordance with Example 2 S) using the supernatant after centrifugation and a gel filtration column.
  • the oligonucleotide AQUI-C-Notl is complementary to the gene for the lumazine synthase at its 3 ' end and introduces a recognition sequence for the restriction endonuclease Notl (GC * GGCCGC) immediately behind the last coding base triplet of the lumazine synthase. This recognition sequence is translated into three alanine molecules.
  • the PCR was carried out analogously to Example 1A).
  • Example 14 5 ⁇ g of the expression plasmid pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (Example 14) in a volume of 30 ⁇ l were treated analogously to Example 8 G) and H). The 3437 bp DNA fragment was isolated and purified. F) The further processing was carried out analogously to Example 1 E) to L). whereby the Escherichia coli expression strain XL ⁇ -pNCO-C-Biotag-AA-LuSy was obtained.
  • the oligonucleotide AQUI-C-HIS ö - ⁇ otl is complementary to the gene for the lumazine synthase at its 3 'end and carries a sequence immediately behind the last coding base triplet of the lumazine synthase, coding for 6 histidine molecules and a recognition sequence for the restriction endonuclease ⁇ otl (GC * GGCCGC). This recognition sequence is translated into three alanine molecules.
  • the PCR was carried out analogously to Example 1A).
  • the supernatant was decanted and mixed with 6 ml Ni-NTA agarose (Quiagen, Hilden) and incubated overnight with swirling (20th The suspension was then subjected to centrifugation (800 g, 20 ° C., 10 min), the supernatant was decanted and the residue was taken up in 10 ml of NTA buffer A and incubated for 15 min at 20 ° C. After centrifugation (see above) and removal of the supernatant, the residue was incubated in 10 ml of NTA buffer B (8 M urea, 100 mM Na phosphate buffer, 10 mM Tris pH 6.3) at 20 ° C.
  • the oligonucleotide AQUI-C-HIS 6 -GLY 2 -SER-GLY-NotI is complementary to the gene for the lumazine synthase at its 3 ' end, has a sequence immediately behind the last coding base triplet of the lumazine synthase, coding for the peptide HHHHHHGGSG, and a recognition sequence for the restriction endonuclease Notl (GC * GGCCGC). This recognition sequence is translated into three alanine molecules.
  • the PCR was carried out analogously to Example 1A).
  • thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus
  • the oligonucleotide BS-LuSy-Agel is complementary to the gene for the lumazine synthase and introduces a recognition sequence for the restriction endonuclease Agel (A * CCGGT) into the DNA sequence.
  • the PCR was carried out analogously to Example 1A).
  • B) The PCR approach was carried out according to Example 1 B). whereby a DNA fragment with a length of 225 bp was obtained, purified.
  • the purified DNA fragment from B) was digested with the restriction endonuclease Agel.
  • the mixture was incubated at 25 ° C. for 180 min and purified as described under B) and used for digestion with the restriction endonuclease EcoRI.
  • Example 1 E) The further processing was carried out analogously to Example 1 E) to L), the Escherichia coli expression strain XL1-pNCO-BS-LuSy-Agel-AA-LuSy being obtained.
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Abstract

Die Erfindung betrifft Proteinkonjugate, Verfahren, Vektoren, Proteine und DNA zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung, sowie Arzneimittel oder Impfstoffe mit einem Gehalt derselben. Sie dient zur Herstellung supramolekularer Partikel, welche eine oder mehrere unterschiedliche, willkürlich bestimmbare Struktureinheiten in grosser Anzahl auf der Oberfläche eines einzelnen, etwa kugelförmigen Proteinmoleküls präsentieren. Ikosaedrische Lumazinsynthasen werden als Trägerproteine für Peptide bzw. Proteine eingesetzt. Ein DNA-Fragment, welches für ein Peptidmolekül kodiert, wird unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren mit einen DNA-Fragment, welches für eine ikosaedrische Lumazinsynthase kodiert, fusioniert. Das DNA-Fragment wird in einen Klonierungsvektor inseriert und in einen geeigneten Wirtsstamm transformiert. Auf dem Wege der Genexpression wird ein Polypeptid produziert. Bei der Verwendung von bestimmten Peptidstrukturen als Fusionspartner erfolgt im Wirtsstamm eine posttranslationale Veränderung derselben. Das chimäre Peptid wird gereinigt und bei Bedarf chemisch verändert. Desweiteren können durch Vermischung ikosaedrische Moleküle hergestellt werden, die bis zu 120 unterschiedliche Peptidmotive auf deren Oberfläche enthalten. Die entstandenen Verbindungen eignen sich als Hilfsmittel zur Durchführung von Analysenverfahren (ELISA, Biosensoren) oder zur Herstellung von Impfstoffen.

Description

Beschreibung
Proteinkonjugate, Verfahren, Vektoren, Proteine und DNA zu deren Herstellung, deren Verwendung, sowie Arzneimittel und Impfstoffe mit einem Gehalt derselben.
Die Erfindung betrifft Proteinkonjugate, Verfahren, Vektoren, Proteine und DNA zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung, sowie Arzneimittel oder Impfstoffe mit einem Gehalt derselben. Die vorliegende Erfindung dient zur Herstellung supramolekularer Partikel, welche eine oder mehrere unterschiedliche, willkürlich bestimmbare Struktureinheiten in großer Anzahl auf der Oberfläche eines einzelnen, etwa kugelförmigen Proteinmoleküls präsentieren.
Eigenschaften der Lumazinsynthase und auf Lumazinsynthase basierender artefizieller
Proteinkonjugate
6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase (im Folgenden als Lumazinsynthase bezeichnet) katalysiert den vorletzten Schritt der Vitamin-B2-Biosynthese in Mikroorganismen und Pflanzen.
Lumazinsynthasen aus bestimmten Bakterien (z.B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aquifex aeolicus) bilden hochsymmetrische, ikosaedrische Komplexe aus 60 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von ca. 1 MDalton (Bacher und Ladenstein, 1991; Bacher et al., 1980; Ladenstein et al, 1986, 1988, 1994; Mörtl et al, 1996). Röntgenstrukturen der Kapsidhülle der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis sind bekannt (Ladenstein et al., 1988, 1994; Ritsert et al., 1995). Das Protein aus Bacillus subtilis kann unter Verwendung von Harnstoff denaturiert und anschließend renaturiert werden. Die Effizienz der Renaturierung läßt sich durch die Zugabe eines Liganden (Substratanalogon), beispielsweise 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)-2,4- (lH,3H)-pyrimidindion oder 5-Nitroso-6-(D-ribitylamino)-2,4-(lH,3H)-pyrimidindion, erhöhen. Die Faltung des renaturierten Proteins ist identisch mit der Faltung der nativen Lumazinsynthase. In Gegenwart des genannten Liganden ist die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis bis pH 10 stabil. Die Umgebung des Inhibitormoleküls ist aufgrund der Röntgenstruktur bekannt. Die Bindungsstelle dieses Liganden wird aus Segmenten benachbarter Monomeren gebildet (Bacher et al. 1986; Ritsert et al.. 1995). Diese Konstellation erklärt den unterstützenden Einfluß des Liganden bei der Renaturierung des hochmolekularen Proteinkomplexes.
Lumazinsynthasen aus verschiedenen Mikroorganismen können in rekombinanten Stämmen von Escherichia coli und Bacillus subtilis effizient exprimiert werden. Die rekombinanten Proteine können in hoher Ausbeute isoliert werden.
Sowohl der N- als auch der C-Terminus liegen an der Oberfläche des ikosaedrischen Kapsidmoleküls. Für Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde dies erstmals durch Röntgenstrukturanalyse gezeigt (Ladenstein et al.. 1988). Durch DNA-Synthese konnte ein optimal an die Kodonverwendung von Escherichia coli angepasstes Gen zur Expression der thermostabilen Lumazinsynthase aus dem thermophilen Mikroorganismus Aquifex aeolicus erhalten werden. Das Protein kann in hohen Mengen rekombinant erhalten werden. Es ist bei einer Temperatur von 80 °C mindestens eine Woche stabil. Daß bei Aquifex aeolicus dieselben strukturellen Verhältnisse wie bei der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis vorliegen, folgt aus der Tatsache, daß Fusionsproteine mit Verlängerung des C-terminalen und/oder N-terminalen Endes zu ikosaedrischen Kapsiden assoziieren können, bzw. daß auch chimäre Proteine, bestehend aus Teilen der Lumazinsynthasen aus Aquifex aeolicus und Bacillus subtilis hergestellt werden können. Es ist folglich von einer sehr ähnlichen Quartärstruktur auszugehen.
Ikosaedrische Lumazinsynthasen können an ihrer Oberfläche mit Struktureinheiten funktionalisiert werden. Als Struktureinheiten (Biomoleküle) kommen vorzugsweise Oligo- oder Polypeptide mit frei wählbaren Segmenten in Betracht. Die präsentierten Proteine (konjugierte Biomoleküle) sind mit dem Trägerprotein kovalent verbunden (Lumazinsynthase-Konjugat). Unter einem Trägerprotein im Sinne der Erfindung versteht man eine natürliche (unveränderte) oder eine modifizierte Lumazinsynthase, bei der die Primärstruktur verändert wurde. Es können dabei eine oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht und/oder entfernt und/oder zugefügt und/oder verändert vorliegen. Der Erhalt der ursprünglichen katalytischen Aktivität der Lumazinsynthase ist hierbei nicht erforderlich. Vielmehr können z.B. auch katalytisch inaktive, modifizierte Proteine für alle erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden.
Die Anzahl der konjugierten Biomoleküle auf der Oberfläche des Trägerproteins kann sich über einen weiten Bereich erstrecken, wobei erfindungsgemäß die Oberfläche mit bis zu 60 (an einem Terminus) bzw. 120 (an beiden Termini) bzw. 180 (an beiden Termini plus Schleifenmsertion) identischen oder in ihrer Struktur verschiedenen Peptidmotiven dekoriert sein kann Proteinuntereinheiten auf der strukturellen Grundlage \on Lumazinsynthase können außerdem auch zu noch gioßeren etwa spaπschen Partikeln und zu tubularen Strukturen assembhert werden Diese Λssoziate können weit über 60 Untereinheiten enthalten Sie besitzen allerdings nicht die strenge, geometrische Regelmäßigkeit der ikosaedrischen 60-meren Lumazιns\nthase-Molekule
Die Lange der präsentierten Peptidsegmente kann über einen weiten Bereich variieren, erfin- dungsgemaß vorzugsweise über 1 - 500 Aminosäuren, wobei die Peptidmotive sowohl unverändert als auch modifiziert vorliegen können
Erfindungs gemäße Proteine können auch eine oder mehrere Ammosaureanaloga oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten die auf biologischem Wege (z B mittels Suppressor-tRNA-Techmken etc ) oder auf chemischen Wege (z B über Kopplungsreagenzien, etc ) m die Sequenz eingeführt werden Ebenso können Modifikationen (z B Glykosylierung, etc ) oder Deπvatisierung (z B Biotmylierung, etc ) vorliegen Die zugrunde liegende genetische Information für die Spezifikation der artefiziell in die Struktur der Lumazmsynthaseuntereinheit eingebrachten Peptidabschnitte kann sich dabei von wenigen Codons bis zu mehreren Genen erstrecken, abhangig davon, ob ein Ohgopeptid, ein Polypeptid oder ein aus mehreren Untereinheiten bestehendes Protein kodiert werden soll Die Obeiflache einer Lumazinsynthase kann auch auf chemischem Wege modifiziert werden, so daß deren Außenperipherie mit einer Vielzahl an Funktionsbereichen kovalent verknüpft
Die Herstellung \ on heteroohgomeren Lumazinsvnthase-Konjugaten erfolgt über einen Dissoziationsschritt und einen nachfolgenden Faltungs/Reassoziationsschπtt Die nach der Denaturierung monomer vorliegenden chimaren Proteine können beliebig gemischt werden Da die rekombinierten Untereinheiten jeweils einen konstanten Lumazmsynthaseanteü besitzen, ist eine Renaturierung der Lumazinsv nthase Kernstruktur untei Ausbildung der natürlichen ikosaedrischen Struktur möglich Immunologische Analysenverfahren auf der Basis des ELISA-Testsystems
Antikörper binden mit hoher Spezifität an bestimmte Zielstrukturen (Antigene). Es wurden Testverfahren entwickelt, die auf dem Nachweis spezifischer Antiköφer-Antigen-Komplexe basieren. Um festzustellen, ob ein Antikörper an sein Zielantigen gebunden hat. gibt es verschiedene Möglichkeiten. Der enzymgekoppelte Immunnachweis (enzyme-linked immuno- absorbent assay, ELISA) ist eines dieser Verfahren. Der ELISA kann im Prinzip zur Bestimmung jedes Antigens. Haptens oder Antiköφers ausgearbeitet werden, seine Anwendung hat er heute vor allem in der klinischen Biochemie gefunden. Man mißt damit beispielsweise hämatologische Faktoren sowie die Konzentrationen von Serumproteinen wie z.B. Immunglobuline, onkofötale Proteine und Hormone wie z.B. Insulin. Bei der Diagnostik infektiöser Erkrankungen werden bakterielle Toxine, Mikroorganismen wie Candida albicans, Rotaviren, Herpesviren, HIV oder Hepαtttw-R-Oberflächenantigen auf diese Weise nachgewiesen. Desweiteren werden immunchemische Analyseverfahren zur Antikörperbestimmung, zwecks Diagnose abgelaufener oder ablaufender Infektionskrankheiten (z.B. mit HIV, Hepatitis), angewendet. Ein ELISA-Protokoll besteht im allgemeinen aus folgenden Teilschritten.
1. Die Probe, die ein spezifisches Molekül oder einen bestimmten Organismus enthalten soll, wird an einen festen Träger gebunden (z.B. Mikrotiteφlatte aus Kunststoff).
2. Der Nachweis eines Antigens (Protein. Peptid. Hapten-Konjugat. etc.) erfolgt durch die spezifische Bindung eines spezifischen Antiköφers (primärer Antiköφer), der gegen das betreffende Antigen aus 1. gerichtet ist. Hierbei kann der primäre Antiköφer selbst markiert sein (z.B. radioaktiv) und daher unmittelbar lokalisiert werden (z.B. Autoradiographie). Alternativ kann entsprechend dem folgenden Absatz weitergearbeitet werden.
3. Häufig erfolgt stattdessen die Zugabe eines zweiten Antiköφers (sekundärer Antiköφer), der spezifisch an den primären Antiköφer, aber nicht an das Antigen aus 1., bindet. Dieser zweite Antiköφer ist häufig chemisch mit einem Enzym gekoppelt (Indikatorsystem), welches eine Umwandlung eines farblosen Substrates in ein farbiges Produkt katalysiert (z.B. Alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, etc.). Der zweite Antiköφer ist meistens gegen den konstanten Abschnitt des ersten Antiköφers gerichtet. Nicht gebundene sekundäre Antiköφer werden durch Waschen entfernt.
4. Zugabe eines farblosen Substrats und dessen Umwandlung in ein farbiges Produkt. Erfolgt keine Bindung des primären Antiköφers an die in der Probe vorhandenen Antigene. so wird der primäre Antiköφer im ersten Waschschritt entfernt. Folglich kann der enzymmarkierte sekundäre Antiköφer ebenfalls nicht binden, d.h. der Testansatz bleibt farblos. Ist die betreffende antigene Struktur vorhanden, so kann der primäre Antiköφer binden und an diesen der sekundäre Antiköφer. Das an den zweiten Antiköφer gekoppelte Enzym katalysiert die Farbreaktion, deren Produkt sich leicht nachweisen läßt (z.B. photometrisch, etc.). Die gemessene Menge der Enzymaktivität ist dem Gehalt an spezifischem Antigen bzw. Antiköφer proportional (aus: Glick. B.. Pasternak. J., Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, 1995, S. 201 ff).
Bei der Durchführung von Bindungstests bedarf es eines Indikatorsystems (z.B. Meerrettich- Peroxidase), welches eine Sichtbarmachung der abgelaufenen Immunreaktion erlaubt. Die Visualisierung beruht auf einer stabilen Verkn pfung zwischen dem untersuchten Reaktanten (Antigen oder Antiköφer) und einem Indikatorsystem. Als Indikatoren (Amplifikatoren) werden eingesetzt: Fluoreszenzfarbstoffe. Lumineszenzfarbstoffe, Radioaktivität, Enzyme, etc.. Die Indikatoren können kovalent oder nicht-kovalent an die jeweiligen Reaktanten gebunden vorliegen. Als stabile nicht-kovalente Verknüpfungen zwischen Indikator und gesuchtem Reaktionspartner dienen z.B. die Antigen-Antiköφer-Bindung. die Biotin-Avidin- Bindung oder die Lektin-Bindung.
Bei der direkten Methode ist der Primärantiköφer mit dem Indikator kovalent verbunden. Die indirekte Anordnung umgeht die Markierung des Primärantiköφers. Der Primärantiköφer wird durch einen Antiköφer, der mit einem Indikator markiert ist. detektiert. Dieser Sekundärantiköφer. der aus einer anderen Tierspezies gewonnen wird, bindet an alle Primärantiköφer jeder beliebigen Spezifität aus der ersten Spezies.
Eine weitere Möglichkeit der Detektion stellt eine Methode dar, bei der drei Antiköφer nacheinander zum Einsatz kommen. Der Primärantiköφer aus Spezies A wird von einem nicht-markierten Sekundärantiköφer aus Spezies B. der im Überschuß vorliegt detektiert. Anschließend folgt die Zugabe eines Tertiärantiköφers aus Spezies A, der mit einem Indikator verknüpft ist. Der Sekundärantiköφer (λ'erbindungsantiköφer) wirkt als Brücke zwischen Primär- und Tertiärantiköφer. Durch die Verwendung mehrerer hintereinan- dergeschalteter Antiköφer wird eine Steigerung der Empfindlichkeit vermittelt. Die Sichtbarmachung des gebundenen Primärantiköφers kann alternativ durch andere Bindungssysteme erfolgen. Ein geeignetes System stellt die Avidin-Biotin-Complex-Bindung dar (ABC-System). Hierbei muß der Primär- oder der Sekundärantiköφer biotinyliert vorliegen. Die Indikatoren liegen ebenfalls biotinyliert vor und werden an das tetravalente Avidin unter Absättigung dreier Bindunεsstellen gebunden. Die vierte Avidinbindunεsstelle kann an den biotinylierten Primär- oder Sekundärantiköφer binden. Sind die verwendeten Indikatoren mehrfach biotinyliert. ergeben sich sehr große Avidin-Enzym-Komplexe. die die Empfindlichkeit des Testsystems erhöhen (Anstelle von Avidin kann auch Streptavidin verwendet werden), (aus Bioanalytik, F. Lottspeich. H. Zorbas. Spektrum Akademischer Verlag, 1998, S. 91 ff) Bei diesem Verfahren besteht das Problem einer weiteren Steigerung der Empfindlichkeit.
Signalamplifikation durch den Einsatz einer derivatisierten. multimeren Lumazinsynthase in Lösung oder auf einer beliebigen Oberfläche:
1. Durch Zwischenschaltung eines biotinylierten multimeren Lumazinsynthase -Konjugats (Linkerprotein) zwischen Primärantikörper und Indikator: Eine Lumazinsynthase, die bis zu 60 Biotinmoleküle (z.B. über einen kurzen Abstandshalter an die Lumazinsynthase gebunden, um eine mögliche sterische Hinderung zu vermeiden) auf ihrer Oberfläche enthält, nimmt dabei aufgrund ihrer sphärischen, multimeren Struktur eine besondere Stellung ein. Die Bindung zwischen Antiköφer und Linkeφrotein bzw. zwischen Linkeφrotein und Indikator erfolgt dabei unter Verwendung einer Avidinbrücke oder einer Streptavidinbrücke. Alternativ dazu, können auch Avidin- oder Streptavidin-markierte Primärantiköφer bzw. Indikatoren zum Einsatz kommen. An 59 der 60 Biotinmoleküle auf dem multimeren Linkeφrotein können Indikatormoleküle gebunden werden, wobei lediglich ein Biotinmolekül zur Vermittlung einer Bindung zwischen Primärantiköφer und Linkeφrotein notwendig ist. Durch die resultierende mehrfache Bindung von farbreaktionvermittelndem Enzym, wird eine extreme Signalverstärkung erreicht, wobei die Signalstärke proportional zur Antigenkonzentration ansteigt.
2. Durch Einsatz von heterooligomeren biotinylierten Lumazinsynthase-Konjugaten: Durch die erfindungsgemäße Reassoziation von unterschiedlichen Lumazinsynthase-Varianten (beispielsweise eine Kombination von 1-3 Antigen-enthaltenen Lumazinsynthasemonomeren mit bis zu 59 biotinylierten Lumazinsynthasemonomeren). wird ein heterooligomeres Lumazinsynthase-Konjugat erzeugt, welches sowohl einen Reaktanden (z.B. Antigen) als auch mehrere Biotin-Moleküle enthält. An die Biotin-Moleküle können Streptavidin- oder Avidin-vermittelt (oder auch über einen Anti-Biotin-Antiköφer) Indikatormoleküle gebunden werden. Exemplarisch sollen im folgenden zwei Einsatzmöglichkeiten besprochen werden: A) Ein Lumazinsynthase-Konjugat. welches 1-5 kurze Peptide von antigen wirksamen viralen oder bakteriellen Oberflächenproteinen ( antigene Determinanten) und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für immobilisierte Antiköφer, die aus einem Patientenserum oder anderen Flüssigkeiten stammen. B) Charakteristische Antiköφer gegen bestimmte Infektionskrankheiten werden mit Hilfe spezieller immobilisierter Epitope (Teile von Oberflächenproteinen der betreffenden pathogenen Organismen: antigene Determinanten) aus der jeweiligen Köφerflüssigkeit gefischt. Ein Lumazinsynthase-Konjugat, welches ebenfalls 1-5 Kopien des oben bezeichneten Epitops und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für die. an das immobilisierte Epitop gebundenen. Antiköφer. Eine Farbreaktion wird in beiden Fällen (A und B) durch ein beliebiges streptavidingekoppeltes Enzym, welches einen Komplex mit der biotinylierten Lumazinsynthase eingeht, erreicht. Durch die Zwischenschaltung dieses mehrfach biotinylierten Linkeφroteins (Lumazinsynthase-Konjugat) und der dadurch bedingten mehrfachen Bindung von farbreaktionverrnittelndem Enzym, wird eine Signalverstärkung erreicht.
3. Durch Einsatz von heterooligomeren, nicht biotinylierten, Lumazinsynthase-Konjugaten: Durch die erfindungsgemäße Reassoziation von unterschiedlichen Lumazinsynthase- Varianten wird ein heterooligomeres Lumazinsynthase-Konjugat erzeugt, welches sowohl einen Reaktanden (z.B. Antigen. welches spezifisch Antiköφer aus einem Patientenserum binden kann) in einfacher Ausführung, als auch Epitope in mehrfacher Ausführung, welche von Indikator-markierten Antiköφern erkannt werden, enthält. Auch hierbei wird, durch die mögliche mehrfache Bindung von Antiköφer-Indikator-Komplexen an das multimere Protein, eine Signalverstärkung erreicht.
Biosensoren
Klassische biochemische Analysenverfahren, wie z.B. der Immunassav, basieren auf chemischen Reaktionssystemen in flüssigem Zustand. Eine mögliche Alternative bietet die Anwendung von Festphasenmeßapparaturen oder Biosensoren. In den letzten Jahren findet die Verwendung von Biosensoren als schnelle und empfindliche Testsysteme zum Nachweis verschiedenster Stoff- und Molekülklassen immer mehr Anwendung. Ein Biosensor besteht aus mindestens drei Bestandteilen: biologischer Rezeptor. Wandler und angegliederte Elektronik. In einem Immunsensor kann der biologische Rezeptor ein Antiköφer oder ein Antigen sein, der auf verschiedene Arten an den Wandler gekoppelt ist. In beiden genannten Variationen ermöglichen die Sensoren die Messung sich spezifisch ausbildender Antigen- Antiköφer-Komplexe.
Für den Einsatz als chemische Sensoren in Flüssigkeiten, beispielsweise Seren, sind vor allem Volumenschwinger geeignet. Zu ihnen gehören die Schwingquarze, die auf einer speziell behandelten Oberfläche (je nach Testprinzip) mit antigenen Proteinen oder monoklonalen Anti- köφern beschichtet werden. Legt man an diese Quarze eine elektrische Wechselspannung an, so wird der Kristall zu elastischen Schwingungen angeregt, deren Amplitude ein Maximum erreicht, wenn die elektrische Frequenz mit einer der mechanischen Eigenfrequenzen des jeweiligen Quarzes übereinstimmt. Diese Schwingungen lassen sich mit geeigneten Meßsystemen erfassen. Gibt man einen mit Antigenen beschichteten Quarzkristall in eine Lösung, die spezifisch bindende Antiköφer enthält, so lagern sich diese an seine Oberfläche an und verändern seine Masse. Dadurch wird eine Veränderung seiner Schwingfrequenz erreicht und zeigt so die Bindung eines Antiköφers an. Neben diesen piezoelektrischen Immunsensoren versucht man, Meßtechniken zu entwickeln, deren Funktionsweise derjenigen von potentiometrischen Elektroden gleicht, die also Ähnlichkeit zu pH-Meßgeräten haben. In diesem Fall zielt man darauf ab, die Veränderung des Potentials zu bestimmen, die bei der Ausbildung der Antigen-Antiköφer-Komplexe auf einer dünnen equilibrierten Silicagelschicht an der Oberfläche der pH-Glasmembran entsteht. Eine weitere Möglichkeit der immunsensorischen Messung besteht in der Immobilisierung von Proteinen (Antiköφer oder Antigene) auf der Oberfläche einer optischen Faser. Die bei diesem Verfahren am häufigsten genutzten optischen Phänomäne sind interferierende Wellen und Oberflächenplasmone. Eine interferierende Welle wird gebildet, wenn Licht, das an einer optischen Faser entlang strahlt, intern reflektiert wird. Diese interferierende Welle ist die elektromagnetische Energie, die an der Schnittstelle von Faseroptik und Flüssigkeit entsteht. Die Energie wird absorbiert, wenn absorbierende Moleküle an der Schnittstelle auftreten, so daß der Grad der Absoφtion proportional zu der Menge des absorbierenden Materials der Schnittstelle ist. Die Ausbildung von Antigen-Antiköφer-Komplexen, wobei das Antigen oder der Antiköφer an die Faseroberfläche gebunden vorliegt, kann so nachgewiesen werden. Bei der 'Surface plasmon resonance wird ein metallbeschichtetes Glas als optische Einrichtung benutzt, bei der ein intern vollständig reflektierter Lichtstrahl eine induzierte elektromagnetische Oberflächenwelle oder Plasmon hervorruft. Eine nachweisbare Oberflächenplasmonresonanz tritt bei einem bestimmten Einfallswinkel des Lichts auf, der entscheidend vom Refraktionsindex des Mediums, welches an den Metallfilm angrenzt. abhängt. Somit können Veränderungen in dieser Schicht, wie sie z.B. nach der Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen zu erwarten sind, gemessen werden. Zu den potentiometrischen Immunsensoren sind die ionensensitiven Feldeffekttransistoren zu zählen. Eine Rezeptor (Antiköφer. Antigen oder sonstiger Rezeptor) wird dabei auf dem Halbleitertor des Transistors verankert. Die Bindung eines Analyten an die Rezeptorschicht ruft eine Veränderung in der Ladungsverteilung und damit eine Schaltung des Feldeffekttransistors hervor. (Aus Modrow S., Falke D., Molekulare Virologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin. Oxford. S. 108; Liddell E., Weeks I., Antiköφer- Techniken, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin. Oxford, S. 154 ff). Auch bei diesen Sensorverfahren besteht der Wunsch nach Steigerung der Empfindlichkeit.
Signalamplifikation durch den Einsatz derivatisierter. multimerer Lumazinsynthasemoleküle auf einer signalvermittelnden Oberfläche:
Artefizielle Proteinmoleküle auf der Grundlage der Lumazinsynthase können beim Aufbau eines Biosensors als Trägeφrotein z.B. zur Präsentation von antigen wirksamen Fängeφeptiden, zum Nachweis von Antiköφern gegen bestimmte Infektionen dienen. Durch die erfindungsgemäße Ausbildung von gemischten Lumazinsynthase-Konjugaten können die jeweiligen Peptide zusammen mit einem bindungsvermittelnden Biotinmolekül in eine ikosaedrische Struktur eingebaut werden. Auf diese Weise können bis zu 59 identische oder verschiedene antigen wirksame Peptide (z.B. Domänen von viralen Oberflächenproteinen) in Verbindung mit einem Biotinmolekül. auf einem ikosaedrischen Molekül präsentiert werden. Durch Verwendung mehrerer verschiedener multimerer Lumazinsynthase-Konjugate läßt sich eine repräsentative Peptidbibliothek auf einem einzigen Sensor plazieren. Die Bindung der multimeren Lumazinsynthase-Konjugate an die Oberfläche eines Wandlers läßt sich beispielsweise über eine Streptavidin/Biotin-Kopplung ermöglichen.
Die Empfindlichkeit eines derartigen Testsystems wird durch das Anbieten mehrerer antigener Determinanten erheblich gesteigert, da dadurch nicht nur ein, sondern mehrere gegen einen bestimmten Erreger gebildeter Antiköφer erfasst werden. Desweiteren ist kein fundiertes Detailwissen über Proteinabschnitte erforderlich, die zur Bindung von Antiköφern beitragen, da mit begrenztem Aufwand mehrere Proteine des betreffenden Erregers auf dem Sensor präsentiert werden können. Da die Streptavidin/Biotin-Kopplung für alle Epitoppräsentationen verwendet werden kann, benötigt man zum Aufbau eines Biosensors immer die gleichen, nämlich Avidin oder Streptavidin beschichtete Oberflächen, d.h. die instrumentelle Ausstattung muß nicht verändert werden. Die jeweiligen individuellen, epitoppräsentierenden oder biotinylierten Lumazinsynthase-Untereinheiten können leicht auf rekombinantem Wege hergestellt werden. Dies hat wesentliche Vorteile bei der Entwicklung bzw. der Evaluierung derartiger Nachweisverfahren.
Durch die Anwesenheit von bis zu 59 Fängeφeptiden in einem Molekül kann die Oberfläche eines Sensor-Chips (z.B. Feldeffekttransistor, Oberflächenplasmon- Wandleroberfläche, etc.) extrem vergrößert werden und dadurch eine enorme Empfindlichkeitssteigerung erreicht werden. Stabilitätsprobleme und Unspezifitäten sind bei der Verwendung eines thermostabilen Trägeφroteins und des Biotin Streptavidin-Systems nicht zu erwarten. Ebenso können auch kleine Moleküle durch einfache chemische Kopplung an die Oberfläche gebunden werden. Als Kopplungsorte stehen hierfür singuläre. exponierte reaktive Aminosäuren auf der Oberfläche des sphärischen Proteins zur Verfügung. Prinzipieller Aufbau eines Schichtsystems auf der Basis einer multimeren Lumazinsynthase: Eine funktionalisierte Lumazinsynthase ist mit 60 gleichen bzw. unterschiedlich modifizierten Untereinheiten über einen Anker (Peptid. Fettsäure, etc.) mit einer Oberfläche (beispielsweise Wandleroberfläche oder sonstige beliebige Oberfläche, die sich schon auf einem Wandler befindet) verbunden. Die Detektionempfindlichkeit für Fremdmolekülbindung auf der Oberfläche der Lumazinsynthase wird dabei durch eine hohe Anzahl funktioneller Gruppen (beispielsweise Epitope zur Antiköφererkennung, Antiköφer zur Detektion von Fremdmolekülen in Lösung oder sonstiger Rezeptoren) erhöht.
Herstellung von Impfstoffen (in vitro)
Impfungen führen zu einer immunologischen Resistenz gegen Krankheitserreger. Impfstoffe dienen überwiegend zur Prävention, das heißt, sie sollen bei den immunisierten Personen einen Schutz aufbauen, der sie bei Kontakt mit dem jeweiligen Erreger vor der Infektion und somit vor der Erkrankung schützt. Der injizierte oder oral verabreichte Impfstoff führt im
Organismus zur Bildung von Antiköφern und/oder zu einer zellulären Immunantwort.
Infolgedessen wird bei einer künftigen Exposition der infektiöse Organismus abgetötet oder neutralisiert, so daß die Krankheit nicht ausbricht.
Infektionen mit Bakterien. Viren. Pilzen und Protozoen sind weltweit ein Hauptfaktor der
Morbidität und Mortalität. Durch die zunehmende Resistenzentwicklung gegen so gut wie alle verfügbaren Antibiotika ist auch in Industrieländern eine Verschärfung der Morbiditätssituation zu erwarten. Die Entwicklung neuartiger Impfstoffe ist auch deshalb von größter medizinischer Bedeutung.
Als Impfstoffe kommen unter anderem attenuierte Viren zur Anwendung. Attenuierte Viren ähneln den krankheitscrzeugenden Erregern, sie unterscheiden sich λ'on ihnen jedoch im Hinblick auf das Virulenzverhalten: sie verursachen nur eine begrenzte bzw. abgeschwächte Infektion und induzieren dadurch die Bildung von neutralisierenden .Antikörpern und cyto- toxischen T-Zellen. Die molekulare Basis der Attenuierung sind Mutationen im Genom von Wildtypviren. Attenuierte Viren verleihen meist einen sehr guten Impfschutz, der über mehrere Jahre erhalten bleibt, sie bergen jedoch das Risiko, daß sie im Verlauf der abgeschwächten Infektion zur Wildtypform zurückmutieren können.
Eine weitere Möglichkeit zur Immunisierung bei Mensch und Tier besteht in der Präsentation von antigen wirksamen Teilen von viralen Oberflächenproteinen auf anderen, nicht pathogen wirkenden Viren. z.B. Pflanzenviren. Die Genfragmente, die für eine antigene Determinante (z.B. Oberflächenprotein) des pathogen wirkende Virus kodieren werden in das Genom des nicht pathogen wirkenden Virus eingebaut (Dalsgaard et al., 1997). Das Fremdprotein wird zusammen mit einem viralen Protein auf der Oberfläche des nicht-pathogen wirkenden Virus präsentiert. Es können jedoch nicht beliebig große DNA-Fragmente in das Virusgenom integriert werden. Daher muß man genau wissen, welche Proteine des Virus, gegen dessen Infektion ein Impfschutz erzeugt werden soll, für die Auslösung einer schützenden Immunantwort wichtig sind. Ein derartiger Impfstoff kann nicht die Breite einer Immunantwort erzeugen, die beim Ablauf einer Infektion mit dem Wildtypvirus oder seiner attenuierten Variante entsteht. Bei dieser .Art von rekombinanten Impfviren beschränkt sich die immunologische Reaktion auf ein ausgewähltes Protein.
Impfstoffe, die aus synthetischen Peptiden mit einer Länge von 15 bis 30 Aminosäuren bestehen, stellen eine Vakzineform dar. die sich heute in der Eφrobung befindet. Hier werden einzelne Epitope viraler Proteine, welche die Bildung von neutralisierenden Antiköφern bewirken, ausgewählt und chemisch synthetisiert. Voraussetzung ist auch in diesem Fall ein fundiertes Detailwissen über die Proteinabschnitte, die eine virusneutralisierende Immunantwort hervorrufen können. Aufgrund der hohen genetischen Variabilität der meisten Viren und der unterschiedlichen Fähigkeit einzelner Individuen, bestimmte Proteinregionen immunologisch zu erkennen, müßten in einem auf synthetischen Peptiden basierenden Impfstoff mehrere verschiedene Epitope miteinander kombiniert werden. Da es abgesehen von Aluminiumhydroxid kein geeignetes beim Menschen einsetzbares Adjuvans. das die Immunantwort in ausreichender Weise verstärken kann. gibt, ist bislang noch kein Impfstoff verfügbar, der auf synthetischen Peptiden beruht. (Aus Modrow S.. Falke D., Molekulare Virologie, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. Berlin. Oxford, S. 87 ff) Im Gegensatz zu kurzen Peptiden eignen sich hochmolekulare Moleküle, u.a. Proteine und trägerfixierte Peptide. da sie ohne die Verwendung von Hilfsstoffen verabreicht werden können, aber dennoch eine gute Immunität liefern, vorzüglich als Impfstoffe. Das redundante Vorkommen antigener Determinanten in hoher Anzahl, wie sie z.B. bei Viren oder Bakterien zu beobachten sind, auf dem immunogenen hochmolekularen Molekül begünstigt dabei die erwünschte hohe Antigenität d.h. die präventive Immunantwort. Als Trägeφrotein eignet sich hierfür, insbesondere wegen ihrer ikosaedrischen Struktur, die Lumazinsynthase. Die Lumazinsynthase besteht aus mindestens 60 Untereinheiten, d.h. mindestens 60 gleichartige oder verschiedene antigene Determinanten lassen sich in einem Molekül präsentieren. Die Lumazinsynthase ist hochmolekular aufgebaut und hat eine mit einigen Viren vergleichbare Oberflächenstruktur, d.h. eine hohe Antigenität ist zu erwarten. Derartige Impfstoffe sind frei von viralen Genen und sie lassen sich mit relativ geringem Aufwand in hohen Mengen herstellen. Da große Teile der Virusproteine präsentiert werden können, ist in diesem Fall kein fundiertes Detailwissen über die Proteinabschnitte, die eine virusneutralisierende Immunantwort hervorrufen können, erforderlich.
Die gentechnisch hergestellten Proteine, welche Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, beruhen auf der kovalenten Verknüpfung einer Wildtyp-Lumazinsynthasesequenz oder einer modifizierten Lumazinsynthase mit Teilstrukturen von Viren, Bakterien. Pilzen, Protozoen oder Toxinen. Die Verknüpfung kann dabei am N-Terminus und/oder am C-Terminus der Lumazinsynthase erfolgen. Außerdem können die zu präsentierenden Peptide an geeigneten Stellen der Lumazinsynthaseuntereinheit so in die Sequenz eingefügt werden, daß sie in Form einer Schleife auf der Oberfläche des Multi-Untereinheiten-Proteins präsentiert werden. Damit kann eine gegebene immunologische Determinante in einer definierten hohen Anzahl, z.B. erfindungsgemäß bevorzugt 60-fach oder 120-fach. auf einem ikosaedrischen Molekül aus 60 Untereinheiten mit der Triangulationszahl T = 1, präsentiert werden. Außerdem können auch höhermolekulare Assoziate hergestellt werden, welche mehr als 100 Untereinlieiten enthalten (Triangulationszahl T = 2 oder höher) und damit eine noch größere Anzahl Epitope präsentieren können.
Die erfindungsgemäße Assoziation von Untereinheiten mit unterschiedlichen, gentechnisch aufgepfropften Peptid- oder Proteinsequenzen bietet auch die Möglichkeit zur Herstellung von Proteinmolekülen, welche mehrere unterschiedliche antigene Sequenzen auf einem gegebenen
Molekül präsentieren können.
DNA-Impfstoff
Seit dem Beginn der 90er Jahre wird auch die Möglichkeit zum Einsatz von DNA als Impfstoff untersucht. Die verwendeten Nukleinsäuren enthalten Gene oder Teile von Genen eines pathogenen Organismus, die ein immunogenes Protein spezifizieren. Für die Entwicklung dieser Vakzine ist detailiertes Wissen über die immunologisch wichtigen Komponenten von großem Nutzen. Die verwendeten Gene kodieren überwiegend für die Oberflächenkomponenten eines Erregers oder auch für Teile von bakteriellen Toxinen. Sie werden zusammen mit regulatorischen Elementen zur Kontrolle ihrer Expression in ein Vektorsystem integriert und als gereinigte DNA intramuskulär injiziert und dort exprimiert. Insbesondere in Muskelzellen ist die DNA über lange Zeiträume als Episom nachweisbar, da sie offensichtlich nur sehr langsam abgebaut wird. Wenn die entsprechenden Gene exprimiert werden, kann der Organismus sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunantwort entwickeln. Diese Form der Impfstoffe wurde bisher im Tiersystem eφrobt. Genkonstrukte, welche Fusionsproteine bestehend aus Proteinkomponenten pathogener Mikoorganismen und aus Lumazinsynthase spezifizieren, sind grundsätzlich als DNA- Impfstoff geeignet. Ein DNA-Vakzin. bestehend aus einem Gen kodierend für eine Lumazinsynthase (partikelbildende Komponente) und einem ausgewählten Gen des Erregers kann intrazellulär exprimiert werden und kann so eine relativ lang anhaltende Produktion des Immunsystem stimulierenden Antigens gewährleisten. Nach den bisherigen Erfahrungen mit Lumazinsynthase aus verschiedenen Organismen sollte der Zusammenbau des Ikosaeders in vivo ohne Hilfsmoleküle (vgl. Chaperonine) möglich sein.
Orale Impfstoffe auf pflanzlicher Basis
Ist bekannt, gegen welche immunologisch wichtige Proteinkomponente des Erregers eine schützende Immunantwort induziert wird, kann das für dieses Peptid kodierende Gen in einen eukaryoten Expressionsvektor eingebracht werden. Nach Transformation von Pflanzenzellen mit dieser DNA können transgene Pflanzen erhalten werden, welche das betreffende Gen exprimieren. Durch Verzehr von Teilen dieser transgenen Pflanze wird auch die ausgewählte
Proteinkomponente in den Köφer aufgenommen und kann dort eine Immunantwort induzieren.
Als partikelbildendes Protein eignet sich insbesondere die Lumazinsynthase. an die Teile von immunologisch wirksamen Proteinen des Erreεers fusioniert sind. Durch Verwendung einer thermostabilen, partikelbildenden Lumazinsynthase (z.B. aus Aquifex aeolicus) als
Trägeφrotein kann sogar ein kochfester Impfstoff erzeugt werden.
Multifunktional derivatisierte Immuntherapeutika auf der Basis der multimeren L umazinsynthase
Impfstoffe sollen die Vermehrung eines Krankheitserregers und damit eine Infektion verhindeπi. In einigen Fällen ist es schwierig, einen zuverlässigen Impfstoff zu entwickeln, da der pathogene Organismus für Antiköφer nicht zugänglich ist, oder wie im Fall der erworbenen Immunschwäche (AIDS) zu wenig über den Erreger (HIV) bekannt ist. Die Zielzellen von HIV sind Helfer-T-Lymphozyten (Helferzellen) des Immunsystems, wobei die wichtigsten Funktionen dieser Zellen gestört werden. Wenn HIV in eine Helferzelle eindringt, ist das Virus vor dem immunologischen Angriff geschützt. Im weiteren Verlauf der Krankheit kann die infizierte Zelle durch die Produktion und die Freisetzung von HIV-Partikeln zerstört werden. Eine infizierte Zelle kann dabei zu einer „Fabrik" für die Produktion weiterer Viruspartikel werden. Die Konsequenz einer HIV-Infektion ist vor allem, daß das Immunsystem keinen Schutz mehr vor gewöhnlichen Infektionskrankheiten bieten kann. Der erste Schritt bei einer HIV-Infektion ist die Wechselwirkung eines 120 kDalton-Glykoproteins (gpl20) aus der Virushülle und dem CD4-Rezeptor an der Oberfläche der Helferzellen. Antiköφer gegen CD4 blockieren in vitro die HIV-Infektion von Helferzellen. Auch bei einem Überschuß an freiem CD4-Protein geht die Infektionsrate in vitro zurück. Die Entwicklung eines Fusionsproteins aus einem Teil des CD4-Proteins und aus dem Fc-Anteil eines Immunglobulins stellt den Versuch dar. sowohl den Schutz der Helferzellen als auch die Abtötung des Virus zu erreichen. Das Fusionsprotein wird CD4-Immunadhäsin genannt. Das Molekül bindet an gpl20 und blockiert das HIV; beides sind Funktionen des CD4-Anteils. Die Fähigkeit des Fusionsproteins, an Zellen mit Fc-Rezeptoren zu binden, und die lange Halbwertszeit im Plasma sind hingegen auf den Immunglobulinanteil zurückzuführen. Nach der Bindung des Immunadhäsins an das freie Virus oder an HlV-infizierte Zellen kommt es zu einer antiköφerabhängigen, zellvermittelnden cytotoxischen Reaktion, die zur Zerstörung des Virus oder der HlV-infizierten Zelle führt, (aus: Glick, B.. Pasternak, J., Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, 1995, S. 245).
Durch die Verwendung einer multimeren derivatisierten Lumazinsynthase könnte sich die Effizienz dieser Strategie verbessern lassen. Es kann eine funktionalisierte Lumazinsynthase zur Verwendung kommen, die sowohl über CD4-Protein-Anteile. als' auch über Fc-Anteile verfügt. Da pro Molekül nicht nur eine funktioneile Einheit, sondern viele dieser Einheiten, vorhanden sind, sollte sich die Effizienz erheblich steigern lassen.
Anstelle des CD4-Anteils könnte man in das multimere Protein auch Antiköφer (z.B. speziell entwickelte ,.Single-chain- Antiköφer"). die beispielsweise spezifisch gegen einen Tumormarker (z.B. gegen das Teratocarcinom-Antigen) gerichtet sind, einführen und dieses funktionalisierte Fusionsprotein zur Krebstherapie einsetzen.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Kombination eines Antiköφers gegen einen Tumormarker mit Metallothionein. Die multimere Lumazinsynthase ist dabei mit einem AntiTumor- Antiköφer und bis zu 59 Metallothionein-Molekülen dekoriert. Die Metallothioneinmoleküle wiederum werden mit radioaktiven Elementen (mit relativ kurzer Halbwertszeit), welche für eine Strahlentherapie geeignet sind (beispielweise Technetium 99) beladen. Im Laufe der Therapie bindet der Proteinkomplex über seinen Antiköφer-Anteil an den Tumor und führt dabei die Strahlenquelle direkt an das Tumorgewebe heran. Ähnliche Konstrukte können auch für diagnostische Zwecke, z.B. zur radioaktiven Detektion einer möglichen Krebserkrankung, eingesetzt werden.
Verwendung von Lumazinsynthase-Konjugaten bei der Charakterisierung und Reinigung von Antikörpern
Die Grundlage der Fremdpeptide bilden DNA-Sequenzen, die für ein bestimmtes Epitop (antigene Determinante) kodieren. Die Sequenz der zusätzlichen Peptidsegmente kann durch entsprechende Wahl der DNA-Sequenz exakt bestimmt werden. Es können aber auch Peptidsequenzen eingebaut werden, die in ihrer gesamten Länge oder in Teilabschnitten eine stochastische Aminosäuresequenz besitzen. Eine vielfältige, zufallsorientierte Variabilität dieser Peptide kann durch den Einsatz von synthetischen Oligonukleotiden, die über einen zufällig (randomisiert) generierten Sequenzabschnitt verfügen, erreicht werden, so daß repräsentative Peptidbibliotheken entstehen. Diese zufällige generierten Peptide werden erfindungsgemäß auf der Oberfläche der Lumazinsynthase präsentiert und sind somit auch für eine Antiköφerbindung zugänglich.
Die erhaltenen Lumazinsynthase-Varianten (mit einer zufallsorientierten Variabilität des Fremdpeptids) können z.B. zur Charakterisierung von Antiköφer-Bindungsstellen verwendet werden. Durch die Isolierung von Antigen-Antiköφer-Komplexen mit anschließender Sequenzierung des gebundenen Peptidanteils ( -terminale Edman-Sequenzierung oder Sequenzbestimmung mittels Massenspektroskopie), kann die Selektivität der Bindungsstelle eines Antiköφers charakterisiert werden.
Desweiteren kann gezielt nach Antikoφern, die über eine bestimmte Antigenerkennung (Antigensequenz in diesem Fall bekannt) verfügen, gesucht werden. Durch den Einsatz von Misch-Konjugaten. d.h. Lumzinsynthase-Konjugaten. die sowohl über ein gewünschtes Fremdpeptid (in mehrfacher Ausführung), als auch über einen biotinylierten Anteil (in einfacher Ausführung) verfügen, können selektiv Antikörper aus einer Mischpopulation gereinigt werden. Die Verwendung von Streptavidin oder Avidin gekoppelt an eine feste Phase bietet sich hierfür an. Die Reinigung kann erfindungsgemäß aber auch auf der Basis von anderen Affmitätsmaterialien erfolgen. Die Elution der Antikörper erfolgt durch bekannte Standardmethoden.
Lösung der beschriebenen technischen Probleme
Die Lösung der oben beschriebenen technischen Probleme wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Lumazinsynthase-Molekülen als Trägeφrotein für Fremdproteine, Peptide und/oder sonstige organisch-chemische Moleküle. Ferner ist Gegenstand dieser Erfindung ein Verfahren zum selektiven, rekombinanten Einbau der obengenannten Fremdproteine, bzw. Peptide sowohl in Schleifen (loops) oder erfindungsgemäß vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus von Lumazinsynthasen. Das Verfahren beinhaltet eine in vivo Assoziation von unterschiedlichen Lumazinsynthase-Konjugaten auf dem Wege einer Koexpression der betreffenden Gene in einer Zelle. Ferner beinhaltet das Verfahren die Möglichkeit der in vitro Reassoziation von individuell gestalteten Lumazinsynthase-Konjugaten zu sphärischen Partikeln auf dem Wege der Denaturierung/Renaturierung von monomeren Untereinheiten, die sowohl mit als auch ohne die Verwendung eines faltungsunterstützenden Liganden durchgeführt werden kann. Bereitgestellt werden Lumazinsynthase-Konjugate. die über ein biotinylierfähiges Peptid (Tucker und Grisshammer. 1996; Schatz. 1993; Cronan. 1990) am C-Terminus verfügen. Desweiteren wird ein artefizielles Lumazinsynthase-Molekül bereitgestellt, welches an seinem C-Terminus über eine gut zugängliche basische Aminosäure (Lysin) verfügt. Ferner wird ein Lumazinsynthase-Molekül bereitgestellt, welches über ein. gut zugängliches Cysteinmolekül am C-Terminus verfügt. Beide Varianten eignen sich zur chemischen Kopplung von organischen Molekülen Die Kopplung kann z B erfolgen durch Herstellung einer
Saureamidbmdung oder einer Disulfidbindung zwischen Protein und Kopplungskomponente.
Die chemische Kopplung nach dem Amidprmzip kann auch erfolgen an Lysinreste, die natürlicherweise auf der Oberflache von Lumazmsynthasemolekulen vorkommen
Desweiteren wird eine thermostabile ikosaedrische Lumazinsynthase (aus Aqmjex aeolicus) bereitgestellt, die sich unter anderem als Trageφrotem zur Herstellung von besonders stabilen
Lumazinsynthase-Konjugaten eignet
Das Verfahren zur Herstellung von Lumazinsynthase-Konjugaten beinhaltet folgende Teilschritte
I Praparation des Fusions-Vektors
A) Gewinnung einer DNA, die em Gen für eine Lumazinsynthase enthalt (z B. durch Isolierung aus einem Organismus, durch PCR-Amp fikation mit natürlich vorkommender RNA oder DNA als Matrix, oder durch DNA-Synthese)
B) Einführung von geeigneten Restriktionsschnittstellen zur spateren Insertion von Fremd- DNA in das Lumazmsynthasegen, Anpassung der Lumazinsynthasesequenz an besondere Anforderungen mit Hilfe bekannter molekularbiologischer oder biochemischer Mutagene- semethoden: Insertion der DNA in einen Klonierungsvektor unter Verwendung bekannter molekularbiologischer Methoden. (Alternativ hierzu kann der für das Fremdpeptid kodierende DNA-Abschnitt direkt unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und synthetischer Oligonukleotide mit dem Lumazinsv nthasegen fusioniert werden, wobei II. D gewährleistet sein muß)
C) Transformation von Wirtszellen mit dem entstandenen Plasmid
D) Selektion der Transformanden mit Hilfe von Antibiotika oder anderen Selektionsverfahren
E) Analyse der Transformanden mit Hilfe molekularbiologischer und biochemischer Verfahren, wie z B Restπktionskartierung, Sequenzierung, Messung einer enzymatischen Aktivität, etc.
II. Insertion einer für em Fremdpeptid kodierenden DNA
A) Klomerung der Fremd-DNA mit Hilfe molekularbiologischer Methoden oder synthetische Herstellung einer DNA unter Verwendung chemischer Verfahren
B) Analyse der DNA unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren C) Präparation der für das fusionierende Fremdpeptid kodierenden DNA
D) Insertion der präparierten DNA an das 5 '- und/oder an das 3 '-Ende und/oder in eine Schleifenregion des Lumazinsynthasegens im unter I. präparierten Vektor, so daß eine Fusion des Fremdgens mit dem Lumazinsynthasegen stattfindet. Die Klonierung hat so zu erfolgen, daß alle verwendeten Leserahmen im korrekten Leseraster eingebaut sind, damit die fusionierten Gen-Fragmente gemeinsam als Fusionsprotein translatiert werden.
E) Transformation von Wirtszellen mit dem entstandenen Plasmid
F) Selektion der Transformanden mit Hilfe von .Antibiotika oder anderen Selektionsverfahren
G) Analyse der Transformanden mit Hilfe molekularbiologischer und biochemischer Verfahren, wie z.B. Restriktionskartierung. Sequenzierung. Messung der enzymatischen Aktivität, etc.
III. Expression und Reinigung der hybriden Polypeptide
A) Fermentation des Wirtsstammes mit der fusionierten artefiziellen DNA unter Verwendung bekannter mikrobiologischer Methoden.
B) Expression der fusionierten artefiziellen DNA in den transformierten Wirtszellen als chimäres Protein. Die Expression der artefiziellen DNA kann eine beabsichtigte post- translationale Veränderung des chimären Proteins in vivo. z.B. Phosphorylierung, Glycosylierung. Biotinylierung, etc. einschließen.
C) Präparation eines Zellextraktes mit dem fusionierten Polypeptid
D) Reinigung des Fusionsproteins mittels chromatographischer oder sonstiger Methoden
E) Falls erforderlich: Solubilisierung und in vitro Faltung (Renaturierung)
F) Falls erforderlich: Chemische Modifizierung der Oberfläche von Lumazinsynthase-Varian- ten
G) Falls erforderlich: In vitro Assoziation unter Kombination unterschiedlicher Lumazinsynthas e - V arianten
Weitere Erläuterung des Verfahrens.
Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung können eine Vielzahl verschiedener Vektoren zur Anwendung kommen. Extrachromosomale (episomale) Vektoren (z.B. Plasmide). Integrationsvektoren (z.B. Lambda-Vektoren). Agrobakterium tumataciens-basierte Vektoren für Pflanzen (z.B. Ti-Plasmid). Erfindungsgemäß bevorzugt sind Plasmidvektoren. Verwendete Plasmide können aus natürlichen Quellen isoliert oder synthetisch hergestellt worden sein. Das ausgewählte Plasmid sollte mit dem betreffenden Wirtsstamm kompatibel sein. Dazu sollte es u.a. über einen geeigneten, zum Wirtsstamm passenden Replikationsursprung verfügen. Ferner sollte die Kapazität des Vektors sowohl für die verwendete Lumazinsynthase-Variante als auch für das fusionierte Fremdpeptid ausreichend sein. Desweiteren sind auf dem Plasmidvektor singuläre Schnittstellen zur Klonierung von DNA-Fragmenten erforderlich. Der Plasmidvektor sollte über geeignete Selektionsmechanismen, wie z.B. über ein Resistenzgen verfügen. Die Selektion ist notwendig, um Wirtszellen mit oder ohne Plasmid unterscheiden zu können. Falls Escherichia coli als Wirtstamm ausgewählt wird, so sind erfindungsgemäß Vektoren, die über eine Promotorsequenz aus dem Bakteriophagen T5 oder T7. über eine Operatorsequenz, bevorzugt die Operatorsequenz aus dem Escherichia coli Lactose-Operon (lacl), über eine Klonierungskassette mit mehreren singulären Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen und eine effiziente Terminationssequenz verfügen, bevorzugt. Ferner sollte der Vektor über einen Replikationsursprung verfügen, der eine hohe Kopienzahl der extrachromosomalen DNA in der Wirtszelle erlaubt.
Prokaryotische Expressionssysteme sind im allgemeinen gut geeignet zur rekombinanten Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinkonjugaten. In einigen Fällen können jedoch posttranslationale Veränderungen notwendig sein, die in prokaryonten Organismen nicht eingeführt werden können. Eukaryote Proteine können beispielsweise in Prokaryoten nicht glykosyliert oder phosphoryliert werden. Vorzugsweise werden daher eukaryote Fremdproteine (fusioniert an die Lumazinsynthase). welche eine derartige posttranslationale Modifikation benötigen, unter der Kontrolle eines starken Promotors (z.B. AOXl) in niedrigen Eukaryoten (z.B. Pichia pastoris) oder unter der Kontrolle eines für Säugerzellen spezifischen Promotors (z.B. Ratten-Preproinsulin-Genpromotor) in Säugetierzellen (z.B. COS7-Affen-Nieren-Zellen) oder eines für Insektenzellen (z.B. Baculovirus, Autographa californica) spezifischen Promotors (z.B. Polyhedrinpromotor) exprimiert. Die verwendeten Vektoren sollten zu diesen genannten Wirtsstämmen kompatibel sein.
Zur Herstellung von oralen Impfstoffen auf pflanzlicher Basis bieten sich z.B. Vektorsysteme auf der Basis des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens an. Als Alternative zur Genübertragung bei Pflanzen (z.B. bei monokotylen Pflanzen, wie Reis. Weizen. Mais, etc.) eignen sich physikalische Methoden (z.B. Beschüß mit Mikroprojektilen (Biolistik)). Es können sowohl natürlich vorkommende Proteine als auch synthetische Proteine, die in der Natur nicht vorkommen, an das Trägeφrotein (Lumazinsynthase) fusioniert werden. Als DNA-Quellen kommen z.B. Viren, prokaryote (Eubakterien. Archaea) und eukaryote Organismen (Pflanzen. Tiere) in Frage. Die zu fusionierende DNA kann auch synthetisch, unter Verwendung hierfür üblicher Methoden, hergestellt werden. Ferner kann die DNA auch mit Hilfe von Reverser Transkriptase aus mRNA hergestellt werden.
Die rekombinant erzeugten Plasmid-Vektoren werden zur Transformation von Wirtszellen verwendet. Erfindungsgemäß bevorzugt sind gut charakterisierte Bakterienzellen. Die Wirtszellen können auch eukaryote Zellen sein. Verwendete Wirtsstämme sollten über die zur Expression des fusionierten Polypeptides notwendige enzymatische Ausstattung verfügen. Transformationstechniken sind dem Fachmann bekannt. Protokolle hierfür sind bei Maniatis et al. (1982) beschrieben. Nach der Transformation erfolgt eine Analyse der Transformanden. Die Plasmide werden isoliert und mit Hilfe molekularbiologischer Methoden, wie Restriktionsanalyse, DNA-Sequenzierung, charakterisiert.
Die Expression einer klonierten DNA-Sequenz in einer prokaryoten oder eukaryoten Wirtszelle ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die Kultivierung der transformierten Wirtszelle bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung von rekombinanten Fusionsproteinen findet unter solchen Bedingungen statt, die für die Expression der DNA-Sequenz förderlich sind. Der Zellaufschluß nach der Expression kann durch alle hierfür üblichen Methoden ausgeführt werden. Die aufgeschlossenen Zellen werden unter Verwendung bekannter Trennverfahren in eine lösliche und eine unlösliche Fraktion getrennt.
Sollte sich das Fusionsprotein in Form von Einschlußköφern in der unlöslichen Fraktion befinden, so wird der nach einer Zentrifugation verbliebene Zellrückstand gewaschen und anschließend durch Zugabe eines Solubilisierungsmittels, gelöst. Die Solubilisierung erfolgt bevorzugt in Gegenwart von reduzierenden Agenzien. Die unlöslichen Stoffe werden mittels bekannter Methoden abgetrennt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet. daß der Renaturierungsschritt in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels (5-Nitro-6-(D- ribitylamino)2,4(lH.3H)-pyrimidindion) durchgeführt werden kann. Die Reinigung der Fusionsproteine kann mit Hilfe bekannter chromatographischer oder anderer biochemischer Methoden erfolεen.
Durch die molekularbiologische Einführung einer reaktiven Aminosäure, erfindungsgemäß bevorzugt eines Lysin- und/oder eines Cysteinrestes. gekoppelt an einen flexiblen Peptidlinker. wird eine kovalente Ankopplung von Molekülen auf chemischen Wege ermöglicht bzw. erleichtert. Die Kopplung kann erfmdungsgemäß auf verschiedene Arten erfolgen. Als Beispiele sollen hier genannt werden: a) Bisimid-Ester sind in Wasser gut löslich und können unter milden Reaktionsbedingungen (pH 7.0 - pH 10,0) mit der ε- Aminogruppe eines Lysinrestes reagieren. Die resultierende Amidbindung ist stabil. Auf diese Weise aktivierte Lumazinsynthasen können zur Kopplung mit anderen Peptiden verwendet werden, b) Carbodiimide gehören zu einer Verbindungsgruppe, die mit der allgemeinen Formel R-N=C=N-R' zu beschreiben sind. R und R' können durch aliphatische oder aromatische Reste repräsentiert werden. Carbodiimide reagieren bevorzugt mit der ε- Aminogruppe von Lysin. c) m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) ist ein gut untersuchtes heterobifunktionelles Reagenz. In neutraler wässriger Lösung reagiert MBS zunächst in einer Acylierungsreaktion mit Aminogruppen zum aktivierten N- hydroxysuccinimidester. Ein zweites Peptid kann dann mittels Addition eines Thiolrestes an die Doppelbindung des Esters gebunden werden, d) N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- propionat (SPDP) ist ein heterobifunktionelles Reagenz, welches unter milden Bedingungen mit Aminogruppen des Zielproteins reagieren kann. Die 2-Pyridyldisulfid-Struktur kann dann mit aliphatischen Thiolen oder einem Cystein eines weiteren Peptids über eine Thiol- Disulfidaustauschreaktion reagieren. Die Kopplungsreaktion kann im pH-Bereich von 5-9 erfolgen und der Reaktionsfortschritt kann photometrisch verfolgt werden. Es sind keine Reaktionen mit anderen funktionellen Gruppen bekannt.
Die erfindungsgemäße Herstellung von in vitro reassoziierten Lumazinsynthase-Konjugaten erfolgt über einen Dissoziationsschritt und einen nachfolgenden
Faltungs/Reassoziationsschritt. Die Dissoziation kann erfolgen durch Behandlung mit denaturierenden Agentien. z.B. Flarnstoff oder Guanidinchlorid, durch Änderung des pH- Werts, durch Wärmebehandlung oder andere Verfahren. Die nach der Denaturierung monomer vorliegenden chimären Proteine setzen sich jeweils aus einer konstanten Region, einer Lumazinsynthase (bzw. einer modifizierten Lumazinsynthase) und einer variablen Region (ein beliebiges fusioniertes Peptid) zusammen. Die monomeren Untereinheiten können anschließend beliebig gemischt werden. Da die rekombinierten Untereinheiten jeweils einen konstanten Lumazinsynthaseanteil besitzen, ist eine Renaturierung der Lumazinsynthase Kernstruktur unter Ausbildung der natürlichen ikosaedrischen Struktur möglich. Die Renaturierung kann dabei in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels (bevorzugt 5-Nitro-6-(D- ribitylamino)2,4(lH.3H)-pyrimidindion) erfolgen.
Die in vivo Kombination von verschiedenen Lumazinsynthase-Varianten erfolgt auf dem Wege der Coexpression der jeweiligen Gene, die für das gewünschte Fusionspolypeptid kodieren. Die betreffenden Gene können sich hierbei auf der chromosomalen DNA des Wirtsstammes und/Oder auf einem oder mehreren Plasmidvektoren befinden. Durch eine Abstimmung der Expression der in vivo zu assoziierenden Lumazinsynthase-Varianten läßt sich ein bestimmtes Mischungsverhältnis, d.h. bestimmte Kombinations-Varianten einstellen.
In den Zeichnungen bedeuten:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines ELISA-Protokolls zum Nachweis eines bestimmten Antigens oder eines bestimmten Antiköφers. Das Antigen ist an die Mikrotiteφlarte gebunden. Das Enzym (E) ist an den sekundären Antiköφer gekoppelt. Das farblose Substrat wird durch das Enzym (E) zu einem farbigen Produkt umgesetzt. Figur 2 beschreibt die Detektion eines Antigens mittels eines biotinmarkierten primären Antiköφers. Ein Lumazinsynthase-Konjugat (verstärkendes Linkermolekül), welches bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält ist über eine Streptavidin- oder eine Avidinbrücke (SA) an den biotinylierten primären Antiköφer gebunden. Die Farbreaktion wird durch ein beliebiges streptavidingekoppeltes Enzym (E), welches einen Komplex mit der biotinylierten Lumazinsynthase eingeht, erreicht. Durch die Zwischenschaltung eines 60-fach biotinylierten Linkeφroteins (Lumazinsynthase-Konjugat) und der dadurch bedingten mehrfachen Bindung von farbreaktionvermittelndem Enzym, wird eine extreme Signalverstärkung erreicht, wobei die Signalstärke proportional zur Antigenkonzentration ist. Figur 3 beschreibt den Einsatz eines Lumazinsynthase-Mischkonjugates bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten.
A) Ein Lumazinsynthasemolekül. welches 1 -5 kurze Peptide von antigen wirksamen viralen oder bakteriellen Oberflächenproteinen (antigene Determinanten) und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für immobilisierte Antiköφer, die aus einem Patientenserum oder anderen Flüssigkeiten stammen. B) Charakteristische Antiköφer gegen bestimmte Infektionskrankheiten werden mit Hilfe spezieller immobilisierter Epitope (Teile von Oberflächenproteinen der betreffenden pathogenen Organismen; antigene Determinanten) aus der jeweiligen Köφerflüssigkeit gefischt. Ein Lu- mazinsynthasemolekül. welches ebenfalls 1-5 Kopien des oben bezeichneten Epitops und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für diese nun immobilisierten Antiköφer.
Eine Farbreaktion wird in beiden Fällen durch ein beliebiges streptavidingekoppeltes Enzym (E), welches einen Komplex mit der biotinylierten Lumazinsynthase eingeht, erreicht. Durch die Zwischenschaltung eines mehrfach biotinylierten Linkeφroteins (Lumazinsynthase- Konjugat) und der dadurch bedingten mehrfachen Bindung von farbreaktionvermirtelndem Enzym, wird eine Signalverstärkung erreicht.
Nicht gebundene Antiköφer werden in einem ersten Waschschritt entfernt. Erfolgt keine Bindung an die immobilisierten Epitope. so wird der Komplex aus Lumazinsynthase-Konjugat und Antiköφer nicht gebildet. Überschüssiges Lumazinsynthase-Konjugat wird in einem zweiten Waschschritt entfernt, so daß der Testansatz farblos bleibt.
Figur 4 beschreibt eine schematische Darstellung einer Versuchsanordnung zur Reinigung von Antiköφern mit einer spezifischen Antigenerkennung. Ein Lumzinsynthase-Konjugat, das sowohl über ein gewünschtes Fremdpeptid (in mehrfacher Ausführung), als auch über einen biotinylierten Anteil (in einfacher Ausführung) verfügt, wird an über seinen Biotinanteil an immobilisiertes Streptavidin gebunden. Die Streptavidinmoleküle sind an eine feste Phase gekoppelt. Die Antiköφermischpopulation wird auf eine Säule mit immobilisiertem Streptavidin gegeben (oder mit Streptavidinmaterial gemischt), wobei die Antiköφer mit der gewünschten Spezifität an den Fremdpeptidanteil auf dem Lumazinsynthase-Konjugat binden. Der Waschprozeß des Streptavidin-Lumazinsynthase-Konjugat-Antiköφer-Komplex und die anschließende Elution der spezifischen Antiköφer erfolgt durch bekannte Standardmethoden. Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus eines Biosensors, der prinzipeil aus mindestens drei Teilen bestehen kann: 1. Der biologische Rezeptor. 2. Die Wandler-Einheit, 3. Die angegliederte Elektronik. Der biologische Rezeptor kann auf unterschiedliche Weise an den Wandler bzw. Transduktor gebunden vorliegen.
Figur 6 zeigt schematisch eine funktionalisierte Lumazinsynthase mit 60 gleichen bzw. unterschiedlich modifizierten Untereinheiten, die über einen Anker (Peptid, Fettsäure. sonstige funktionelle Gruppen) mit einer Oberflache (beispielsweise \\ andleroberflache. Membran, sonstige Oberflachen, etc ) \ erbunden ist Die Detektionsempfmdhchkeit für Fremdmolekulbmdung auf der Oberfläche dei Lumazinsynthase wird duich eine hohe Anzahl funktioneller Gruppen (beispielsweise Epitope zur Antikoφererkennung Antikoφer zur Detektion von Fremdmolekulen m Losung oder sonstige Rezeptoren) erhöht Figur 7 zeigt schematisch einen möglichen Aufbau eines Feldeffekttransistois unter Einbeziehung einer multimeren. funktionalisierten Lumazinsynthase Eine Veränderung der Oberflachenladung an der Torelektrode die durch die Bindung eines Fremdmolekuls an die Oberflache der Lumazinsynthase eintritt moduliert dabei den Stromfluß durch den Feldeffekttransistor
Figur 8 zeigt einen Sequenzvergleich von Lumazinsynthasen aus folgenden Organismen I Mycobactenum avium 2 Mycobactemun tuberculosis 3 Corvnebactermm ammomagenes, 4 Chlorobium tepidum 5 Aquijex aeolicus 6 Thermotoga maritima ~ Bacillus subtilis 8 Bacillus amyloliquefaciens 9 4 pleuropneumomae 10 Streptococcus pneumomae, II Staphylococcus aureus, 12 Vibπo cholerae 13 Photobacterium phosporeum 14 S putrefaciens 15 Photobacterium leiognathi 16 Shigella flexne i 1 " Escherichia coli, 18 Haemophilus influenzae 19 Dehalospv ülum multivorans 20 Hehcobacter pylori 21 Deinococcus radwdurans 22 Svnechocystis sp , 23 P orphyi omonas gingivahs, 24 Arabidopsis thahana 25 Methanococcus jannaschu, 26 Archaeoglobus fulgidus, 27 Methanobacterium thermoautotrophicum 28 Chlamydia trachomatis 29 Saccharomyces cerevisiae, 30 Brucella abortus Die Proteinsequenzen wurden durch Übersetzung der zugrundeliegenden DNA-Sequenzen erhalten Die gezeigte Sequenzmenge wurde erhalten durch Datenbanksuche unter Verwendung der Suchalgoπthmen nach Altschul et al (1997) und der Sequenz der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis als Suchmatrize Figur 9 zeigt die Aufsicht auf eine pentamere Untereinheit der ikosaedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis Der Ligand 5-Nιtro-6-(D-πbιtylammo)-2 4-(lH,3H)- pyπmidmdion bindet in der Kontaktstelle zwischen zwei monomeren Untereinheiten (Ladenstein et al , 1988. 1994, Ritsert et al . 1995)
Figur 10 zeigt ein Modell dei ikosaedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis Eine von 12 pentameren Untereinheiten ist durch die Verwendung unterschiedlicher Grautone hervorgehoben Sowohl der N- als auch der C-Tei minus liegen an der Oberflache und sind frei zugänglich Figur 11 zeigt die in den Ausführungsbeispielen verwendeten Expressionsvektoren. SD, ribosomale Bindungsstelle; MCS. Klonierungskassette mit singulären Schnittstellen; to, ti,
Terminatorsequenzen; (cat), nicht aktives Gen für die Chloramphenicolacetyltransferase
(verschobener Leserahmen); (Δcat). inaktives Gen für die Chloramphenicolacetyltransferase
(Deletion); Restriktionsschnittstellen sind durch Buchstaben gekennzeichnet: B, BamHI; E.
EcoRI; H, Hindlll: N, Ncol; P, PstI: S. Sall. Translationsstart im Vektor pNC01 13 bei
Position 1 13 und an Position 233 bei p602/-CAT.
Figur 12 beschreibt die 1. PCR zur Einführung einer Mutation am Beispiel des Austausches der Aminosäure Cystein an Position 93 gegen Serin im Gen der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Im ersten Schritt der gerichteten Mutagenese werden zuerst zwei getrennte PCR-
Ansätze, mit den Oligonukleotidepaarungen PNCO-M1/C93S und PNCO-M2/RibH-3 und dem Expressionsplasmid pNCO-BS-LuSy als Matrize, durchgeführt. Fragment A enthält die beabsichtigte Mutation und eine intakte Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease
EcoRI. Fragment B repräsentiert das gesamte, aber unmutiert vorliegende ribH-Gen
(Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis). In diesem Fragment ist die 5'-
Klonierungsschnittstelle deletiert. (R: ribosomale Bindungsstelle)
Figur 13 beschreibt die 2. PCR bei der Einführung einer Mutation. Im zweiten Schritt der
Mutagenese wird die eingeführte Mutation, die sich jetzt noch am Ende 3 '-Ende des durch
PCR generierten Gen-Fragmentes befindet, durch überlappende Verlängerung, in das gesamte
Gen eingeführt.
Figur 14 beschreibt die 3. PCR zur Einführung einer Mutation. Die 3. PCR dient der
Vermehrung des verlängerten Codonstranges von Fragment A.
In den Figuren 15 bis 24, 26 bis 28 und 30 und 31 ist die Sequenz der jeweils verwendeten Lumazinsynthase durch Fettdruck gekennzeichnet. Die Linkerregionen sind unterstrichen. Erkennungssequenzen für die jeweiligen Restriktionsendonukleasen sind kursiv und unterstrichen. Fusionierte Sequenzen, bzw. Aminosäuren, die nicht zur Linkersequenz gezählt werden, sind punktiert unterstrichen. Die Aminosäurensequenz ist im Einbuchstaben-Code angegeben.
Figur 15 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-N-BS-LuSy zur Fusion von Fremdproteinen an den N-Terminus der Lumazinsynthase. Figur 16 zeigt die Struktur des Vektors pXCO-C-BS-LuSy zur Fusion von Fremdproteinen an den C-Terminus der Lumazinsynthase.
Figur 17 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR.
Figur 18 zeigt die Struktur des Vektors p\'CO-N-VP2-BS-LuSy im Bereich des N-Terminus.
Figur 19 zeigt die Struktur des Vektors pXCO-C-VP2-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus.
Figur 20 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-C-Biotag-BS-LuSy im Bereich des C-
Terminus.
Figur 21 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-Lysl 65-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus.
Figur 22 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-Cysl 67-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus.
Figur 23 zeigt die Struktur des Vektors pFLAG-MAC-BS-LuSy im Bereich des N-Terminus.
Figur 24 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-C-His6-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus.
Figur 25 zeigt die Konstruktion der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus
(Deckert et al.. 1998) unter Verwendung von 1 1 synthetischer Oligonukleotide (AQUI-1 bis
AQUI-1 1) und einer 6-stufigen Polymerase-Kettenreaktion.
Figur 26 zeigt die Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids. an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus
Aquifex aeolicus. (Peptid ist über einen Linker mit 3 Alaninresten an den C-Terminus des
Trägeφroteins gebunden)
Figur 27 zeigt die Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids. über einen Linker aus 6 Histidin- und 3 Alaninresten an den C-
Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus.
Figur 28 zeigt die Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids. über einen Linker bestehend aus 6 Histidinresten und der Sequenz
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ala an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus
Aquifex aeolicus.
Figur 29 zeigt die Herstellung eines chimären Proteins bestehend aus einem Teil der
Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis und einem Teil der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. (RBS: ribosomale Bindungsstelle)
Figur 30 zeigt den 5 '-Bereich des Vektors pNCO-AA-Bglll-LuSy bzw. des Vektors pNCO-
AA-BglII-LuSy-(BamHI) zur Fusion von Fremdgenen an das 5 '-Ende der Lumazinsynthase aus
Aquifex aeolicus. Die neu in die Sequenz eingeführte Erkennungssequenz für die singuläre
Restriktionsendonuklease Bεlll ist eingezeichnet. Figur 31 zeigt den 3 '-Bereich des Vektors pNCO-AA-LuSy-(BamHI) bzw. des Vektors pNCO-AA-BglII-LuSy-(BamHI) zur Fusion von Fremdgenen an das 3 '-Ende der
Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. An den C-Terminus des Trägeφroteins ist ein Peptid mit der Sequenz GSVDLQPSLIS fusioniert.
Die angeführten DNA-Sequenzprotokolle erläutern den Aufbau, der in den Beispielen angeführten Plasmide. In den Sequenzprotokollen sind die Erkennungssequenzen der jeweiligen verwendeten Restriktionsendonukleasen kursiv und unterstrichen: die exprimierten Fusionsproteine sind jeweils fettgedruckt und Linkersequenzen sind punktiert unterstrichen; auf Ausnahmen in der Zeichenformatierung wird hingewiesen.
SEQ ID No.l zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNC0113. (Vektor zur
Expression von Genen in Escherichia coli: Stüber et al.. 1990)
SEQ ID No.2 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors p602/-CAT. (Schaukelvektor zur Expression von Genen in Escherichia coli und Bacillus subtilis; Henner, 1990; LeGrice.
1990)
SEQ ID No.3 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pNCO-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid mit der unveränderten Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis zur
Expression in Escherichia coli)
SEQ ID No.4 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides p602-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid mit der unveränderten Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis zur
Expression in Escherichia coli und Bacillus subtilis)
SEQ ID No.5 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pXCO-BS-LuSy-C93S.
(Expressionsplasmid mit einer veränderten Lumazinsynthase-Nariante, wobei die Aminosäure
Cystein an Position 93 durch die Aminosäure Serin ausgetauscht wurde)
SEQ ID Νo.6 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pNCO-BS-LuSy-Cl 39S.
(Expressionsplasmid mit einer veränderten Lumazinsynthase-Nariante. wobei die Aminosäure
Cystein an Position 139 durch die Aminosäure Serin ausgetauscht wurde)
SEQ ID Νo.7 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pNCO-BS-LuSy-C93/l 39S.
(Expressionsplasmid mit einer veränderten Lumazinsynthase-Nariante. wobei die Aminosäure
Cystein an den Positionen 93 und 139 durch die Aminosäure Serin ausgetauscht wurde) SEQ ID No.8 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-X-BS-LuSy zur Fusion von Fremdpeptiden an den N-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis.
SEQ ID No.9 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-BS-LuSy zur Fusion von Fremdpeptiden an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis.
SEQ ID No.10 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der
Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei die Dihydrofolatreduktase an den N-Terminus der Lumazinsynthase fusioniert vorliegt)
SEQ ID No.ll zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-EC-MBP-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus dem maltosebindenden Protein aus Escherichia coli und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei das maltosebindene Protein an den N-Terminus der Lumazinsynthase fusioniert vorliegt)
SEQ ID No.12 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR.
Die Linkersequenz zwischen der Lumazinsynthase und der Dihydrofolatreduktase ist punktiert unterstrichen. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der
Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei die Dihydrofolatreduktase an den C-Terminus der Lumazinsynthase f sioniert vorliegt)
SEQ ID No.13 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors ph'CO-N-VP2-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der VP2-Domäne des 'Mine enteritis Virus' und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich die VP2-
Domäne am N-Terminus befindet; das ehemalige Startcodon der Lumazinsynthase ist unterstrichen)
SEQ ID No.14 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-VP2-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der NP2-Domäne des 'Mine enteritis Virus' und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. wobei sich die VP2-
Domäne am C-Terminus befindet)
SEQ ID Νo.15 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-N/C-VP2-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der VP2 -Domäne des 'Mine enteritis Virus' und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. wobei sich die VP2-
Domäne sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus befindet; das ehemalige Startcodon der Lumazinsynthase ist unterstrichen) SEQ ID No.16 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-Biotag-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 13
Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptid und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich das fusionierte Peptid am C-Terminus befindet)
SEQ ID No.17 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-Lysl 65-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression einer veränderten Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. bei der der C-Terminus verlängert wurde und mit einem Lysinrest endet; das Codon für Lysin
(AAA) ist unterstrichen)
SEQ ID No.18 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-Cysl67-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression einer veränderten Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. bei der der C-Terminus verlängert wurde und mit einem Cysteinrest endet; das Codon für
Cystein (TGC) ist unterstrichen)
SEQ ID No.19 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pFLAG-MAC-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 12
Aminosäuren langen Epitop, welches von einem monoklonalen Antiköφer erkannt wird, und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. wobei sich das fusionierte Peptid am N-Terminus befindet; das ehemalige Startcodon der Lumazinsynthase ist unterstrichen)
SEQ ID No.20 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-His6-BS-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 6
Aminosäuren langen Peptid (6 x Histidin) und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich das fusionierte Peptid am C-Terminus befindet; das Peptid ist unterstrichen)
SEQ ID No.21 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression der unveränderten, thermostabilen Lumazinsynthase aus
Aquifex aeolicus; die DNA-Sequenz wurde an die Codon-Nerwendung von Escherichia coli angepasst; die DNA wurde vollsynthetisch hergestellt)
SEQ ID No.22 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-Biotag-AA-LuSy.
(Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 13
Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptid und der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus, wobei sich das fusionierte Peptid am C-Terminus befindet; das Peptid ist über einen
Linker mit 3 Alaninresten mit dem C-Terminus des Trägeφroteins verbunden)
SEQ ID No.23 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-His6-C-Biotag-AA-
Lusy. (Expressionsplasmid zur Expression der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus mit C- terminal, über einen Linker aus 6 Histidin- und 3 Alaninresten gekoppeltem, in vivo biotinyiierfähigem Peptid)
SEQ ID No.24 zeigt die DNA-Sequenz des Expvessionswekloτs pNCO-His6-GLY2-SER-GLY-
C-Biotag-AA-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus mit C-terminal. über einen Linker bestehend aus der Aminosäurenfolge
HHHHHHGGSGAAA gekoppeltem, in vivo biotinyiierfähigem Peptid)
SEQ ID No.25 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pXCO-BS-LuSy-Agel-AA-
Lusy. (Expressionsplasmid zur Expression eines chimären Proteins bestehend aus einem Teil
Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis und einem Teil der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus: der Anteil der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis ist fettgedruckt, der
Anteil der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus ist doppelt unterstrichen)
SEQ ID No.26 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-Bglll-LuSy,
(Vektor zur Fusion von Fremdpeptiden an den N-Terminus bzw. an das 5 '-Ende der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter Verwendung der
Restriktionsendonuklease Bglll).
SEQ ID No.27 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-LuSy-(BamHI)
(Vektor zur Fusion von Fremdpeptiden an den C-Terminus bzw. an das 3 '-Ende der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter Verwendung der
Restriktionsendonuklease BamHI)
SEQ ID No.28 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-Bglll-LuSy-
(BamHI). (Vektor zur Fusion von Fremdpeptiden an den N- und an den C-Terminus bzw. an das 5 '- und an das 3 '-Ende der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter
Verwendung der Restriktionsendonukleasen Bglll und BamHI)
Die verwendeten Bakterienstämme werden bei der DSM gemäß Budapester Vertrag hinterleεt. Die Hinteiieεungsnummern werden nachgereicht.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
Die in den Ausführungsbeispielen verwendeten Stämme von Bacillus subtilis und Escherichia coli sind im folgenden mit Genotyp und Literaturstelle aufgeführt.
Stamm Genotyp Literatur Bacillus subtilis Klonierstamm
BR151 [pBLl] tφ. met. lys Lovell. 1981
Escherichia coli Klonierstämme
XLl-Blue recAl . endAl . gyrA96. thi-1. hsdR17. Bullock et al., supE44. relAl. lac[F'. proAB. 1987 lacr'ZΔM15, Tnl0(tetr)]
RR28 F", thi. pro, lac, gal, ara. mtl. xyl. Hennecke et al., supE44. endA. hsd(r", m"). pheS. recA 1982
Die verwendeten Oligonukleotide wurden von den Firmen Gibco BRL, Eggenstein und MWG-Biotech, Ebersberg im Rahmen einer Auftrags synthese hergestellt.
Beispiel 1
Heterologe Expression des Gens der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis in
Escherichia coli XL1
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden RibH-1 (5 ' gag gag aaa tta acc atg aat atc ata caa gga aat tta g 3 '). welches am 3 '-Ende zum 5 '-Ende des Lumazinsynthasegens komplementär ist und am 5 '-Ende für einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle kodiert, und RibH-2 (5 ' tat tat gga tcc cca tgg tta ttc gaa aga acg gtt taa gtt tg 3 '), welches am 3 '-Ende zum Gen der Lumazinsynthase komplementär ist und hinter dem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Endonuklease BamHI (G*GATCC) einführt, aus dem Plasmid pRF2 (Perkins et al., 1991), welches das gesamte RIB-Operon aus Bacillus subtilis enthält, amplifiziert (Mullis et al., 1986).
10 μl PCR-Puffer 75 mM Tπs/HCl. pH 9 0. 20 mM (NH4)2SOj, 0 01 % (w/v) Tvveen 20)
6 μl Mg2~ [1.5 mM] 8 μl dNTP's öe 200 μM] 1 μl RibH-1 [0,5 μM] 1 μl RibH-2 [0.5 μM) 1 μl pRF2 [10 ng]
1 μl Goldstar-Taq-Polymerase [0.5 U] (Eurogentec. Seraing, Belgien) 72 μl H Obιdest
Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp^PCR System 2400; Perkin Eimer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 5,0 min 95 °C
2. 0,5 min 94 °C
3. 0,5 min 50 °C
4. 0,8 min 72 °C
5. 7,0 min 72 °C
6. abkühlen auf4 °C
Die Schritte 2. - 4. wurden 20 x wiederholt.
B) Der PCR-Ansatz wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, die DNA durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht und und das Fragment mit einer Länge von 498 bp mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wurde gewogen und mit der 5-fachen Menge an 6 M NaJ-Lösung versetzt. Nach Aufschmelzen des Gelstückes wurde zu dieser Lösung Glasmilch (Geneclean II-Kit, BiolOl San Diego. CA) zugegeben (2 μl Glasmilch pro 1 μg DNA). Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde die Suspension zentrif giert (Eppendorfzentrifüge. 8000 Umin"1, 2 min, 4 °C). der Überstand verworfen und die Glasmilch mit 500 μl NEW-Waschlösung (Zusammensetzung vom Hersteller nicht angegeben) suspendiert, zentrifügiert (s.o.) und der Überstand anschließend vollständig entfernt. Die Elution der DNA erfolgte mit 30 μl bidestilliertem Wasser (45 °C. 15 min). Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte fluorometrisch unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes Bisbenzimid H 33258 (Höchst, Frankfurt). In Gegenwart von DNA liegt das Absoφtionsmaximum dieses Farbstoffes bei 365 nra. das Emissionsmaximum bei 458 nm. Das verwendete Fluorometer arbeitet mit einer Quecksilberlampe und benutzt zur Anregung eine Wellenlänge von 365 nm in einer Bandbreite von 100 nm. Die Messung der Emission erfolgt mittels eines Photomultipliers bei 460 nm in einer Bandbreite von 10 nm. Die Nulleichung erfolgte mit 2 ml TNE-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 7.4. 10 mM EDTA. 1 M NaCl), der 0,1 μg/ml Farbstoff enthielt. Anschließend wurden 2 μl eines Eichstandards mit bekannter DNA Konzentration (Plasmid-DNA) zugeben und diese Konzentration am Fluorometer eingestellt. Nachdem der Nullpunkt des Gerätes mit Puffer/Farbstoff-Lösung übeφrüft worden war, wurden 2 μl der DNA-Probe unbekannter Konzentration zugegeben und die Konzentration in μg/μl abgelesen. 10 ng der isolierten DNA aus B) dienten anschließend als Matrize für eine 2. Polymerase- kettenreaktion mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-1 (5' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta acc atg 3 '). welches die ribosomale Bindungsstelle vervollständigt und unmittelbar vor der ribosomalen Bindungsstelle eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI (G*AATTC) in das DNA-Fragment einführt, und RibH-2: lO μl PCR-Puffer
6 μl Mg2_ [1.5 mM]
8 μl dNTP's [je 200 μM]
1 μl EcoRI-RBS [0.5 μM]
1 μl RibH-2 [0.5 μM)
1 μl DNA aus der l .PCR [10 ng]
1 μl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] (Eurogentec. Seraing, Belgien) 72 μl H2Obldest Der Ansatz wurde im Thermocycler ( GeneAmp8' PCR System 2400; Perkin Eimer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 5,0 min 95 °C
2. 0,5 min 94 °C
3. 0.5 min 50 °C
4. 0,8 min 72 °C
5. 7,0 min 72 °C
6. abkühlen auf 4 °C
Die Schritte 2. - 4. wurden 30 x wiederholt.
D) Der PCR-Ansatz wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das Fragment mit einer Länge von 516 bp wie unter B) beschrieben gereinigt.
E) Das isolierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI verdaut.
30,0 μl Fragment aus D) 2,5 μl EcoRI [62,5 U] 3,0 μl BamHI [60 U]
24,0 μl OPAU ( 10 x; 500 mM Kaliumacetat: 100 mM Magnesiumacetat: 100 mM ;Tris-Aceta_, pH 7,5)
Die Restriktionsenzyme wurden von der Firma Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen. Der Ansatz wurde 180 min bei 37 °C inkubiert und wie unter B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.
F) Der Expressionsvektor pNCO 1 13 wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI verdaut.
25,0 μl pNCO113 [5 μg]
2,5 μl EcoRI [62,5 U]
3,0 μl BamHI [60 U] 24,0 μl OPAU (10 x) 65.5 μl H2Obidest
Der Ansatz wurde ebenfalls 180 min bei 37 °C inkubiert und das entstanden DNA- Fragment mit einer Länge von 3387 bp wie unter B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt. G) Ligation der DNA-Fragmente aus E) und F) in einem molaren Verhältnis von 3 : 1.
(Sgamarella. 1979)
1 μl Expressionsvektor aus F) [50 fmol]
2 μl DNA-Fragment aus E) [150 fmol]
4 μl H?Obldest mischen, 10 min auf 55 °C erwärmen und dann 5 min auf Eis stellen
2 μl T -Puffer (5 \. 250 mM Tπs'HCl. pH 7 6. 50 mM MgCk 5 mM ATP. 5 mM DTT. 25 % (w/v) Poly- ethylenglycol-8000.
1 μl T4-Ligase [1 U] (Gibco BRL. Eggenstein)
Der Ansatz wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert und das Plasmid pNCO-BS-LuSy erhalten. H) Herstellung elektrokompetenter Escherichia coli XLl-Zellen (Dower et al, 1988): 1 Liter LB-Medium wurde 1 : 100 mit einer bei 28 °C gewachsenen Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5 bis 0,7 (frühe bis mittlere logarithmische Phase) bebrühtet. Die Bakterienkultur wurde zum Anhalten des Zellwachstums 15 min auf Eis gestellt und danach zur Gewinnung der Zellmasse zentrifügiert (Sorvall-GS-3-Rotor. 2300 U/min" 1, 4 °C, 15 min). Das Zellpellet wurde dann in 1 1 eiskalter und steriler 10 %iger Glycerinlösung suspendiert und abermals zentrifügiert. Es folgten zwei weitere Waschschritte (500 ml 10 %ige Glycerinlösung; 20 ml 10 %ige Glycerinlösung) mit anschließender Zentrifugation. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde der Rückstand in 2-3 ml 10 %iger Glycerinlösung aufgenommen und auf Eis gestellt. Elektroporationszelle und Küvettenhalter wurden 15 min auf Eis vorgekühlt. In einem vorgekühlten 0,5 ml Eppendorf-Gefäß wurden 40 μl der vorbereiteten Zellsuspension mit 1-2 μl des Ligationsansatzes aus G) vermischt und anschließend in die vorgekühlte Elektroporationszelle (0,1 cm) pipettiert. Die Elektroporation wurde bei 25 μF. 1.8 kV, 200 Ω (BioRad. München) durchgeführt, wobei die Zeitkonstante der Elektroporation bei 4-5 msec lag. Unmittelbar nach dem Elektroporationsvorgang wurde die Zellsuspension mit 1 ml SOC-Medium (2 % Pepton; 0.5 % Hefe-Extrakt: 10 mM NaCl; 2.5 mM KC1; 10 mM MgCl2; 10 mM MgS04; 20 mM Glucose) versetzt und in ein steriles 10 ml Gefäß überführt. Zur phänotypischen Expression wurden die Zellen 1 h bei 37 °C im Schüttler bebrühtet und anschließend in 20 μl und 200 μl Portionen auf LB-Amp-Platten (21 g/1 Agar: 10 g/1 Caseinhydrolysat: 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl; 150 mg/1 Ampicillin) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert und der Expressionsstamm XLl -pNCO-BS-LuSy erhalten.
I) Die Isolierung der Expressionsplasmide (pNCO-BS-LuSy) aus den unter H) erhaltenen Expressionsstämmen (XL1 -pNCO-BS-LuSy) wurde nach Birnboim und Doly (1979) durchgeführt. Zellen aus einer 100 ml Übernacht-Kultur (10 g/1 Caseinhydrolysat; 5 g/1 Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl; 150 mg/1 Ampicillin) wurden in 4 ml Puffer S l (50 mM Tris/HCl. 10 mM EDTA, 100 μg Rnase A/ml. pH 8.0) suspendiert und anschließend mit 4 ml Puffer S2 (200 mM NaOH. 1 % SDS) versetzt. Nach vorsichtigem Umschwenken des Probengefäßes und einer 5 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Mischung mit 4 ml Puffer S3 (2,6 M KAc, pH 5,2) versetzt, gemischt und 20 min auf Eis gestellt. Nach Zentrifugati on (SS34-Rotor, 17000 Umin" 1, 4 °C, 30 min) wurde der Überstand unter Nerwendung von Νucleobond®AX100 Säulen (Macherey und Nagel. Düren) gereinigt. Das Säulenmaterial wurde mit 2 ml Puffer N2 (0.9 M KC1; 100 mM Tris-Phosphat, pH 6,3; 15 % (v/v) Ethanol) äquilibriert und anschließend der Überstand aufgetragen. Nach Auswaschung von Verunreinigungen mit 8 ml Puffer N3 (1 ,3 M KC1, pH 6.3) wurde die DNA mit 2 ml Puffer N5 (1,3 M KCL pH 8.0) eluiert. Aus dem Eluat wurde die DNA mit 0,7-fachen Volumen Isopropanol gefällt. 2x mit eiskaltem 70 %igem Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge getrocknet und in 200 μl bidestilliertem Wasser aufgenommen.
J) Die Sequenzierung der Plasmid-DNA (pNCO-BS-LuSy) wurde nach der Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1971) mit markierten Terminatoren und Taq-DNA-Polymerase durchgeführt. Der Sequenzieransatz enthielt 1 μg Plasmid-DNA aus I). 10 pmol Sequenzie- roligonukleotid Seq-1 (5' gtg agc gga taa caa ttt cac aca g 3 '), 10 μl Terminator Premix™ (dNTP's, ddNTP's, markierte ddNTP's und Taq-DNA-Polymerase) von ABI (Weiterstadt) und wurde mit bidest. Wasser auf ein Endvolumen von 21 μl aufgefüllt (lichtgeschützt durchgeführt, da markierte ddNTP's lichtempfindlich sind). Die Reaktion wurde in einer GeneAmpPCR System 2400 Maschine von Perkin Eimer (Norwalk. Connecticut, USA) mit folgendem Programm durchgeführt:
15 s/96 °C (Denaturierung der DNA) 15 s/50 °C (Annealing des Primers) 4 min/72 °C (Vermehrung der DNA)
Die Polymerasereaktion wurde 25 mal hintereinander durchgeführt. Nach der Polymerase-Reaktion wurden 80 μl bidest. Wasser zum .Ansatz gegeben und zweimal mit je 100 μl Phenol/Chlorofoi Amylalkohol-Mischung (25:24: 1) von ABI (Weiterstadt) ausgeschüttelt, wobei die schwerere, rötlich gefärbte, Chloroform enthaltende Phase verworfen wurde. Das Ausfällen der DNA erfolgte mit 300 μl absolutem Ethanol in Anwesenheit von 10 μl einer 3 M Natriumacetat-Lösung. Die DNA wurde anschließend durch Zentrifugation (Eppendorf-Rotor. 14000 Umin'1, RT, 30 min) pelletiert, der Rückstand mit eiskalter 70 %iger Ethanol-Lösung gewaschen und in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Das trockene DNA-Pellet wurde in einer Mischung aus 1 μl 50 mM EDTA. pH 8,0 und 5 μl Formamid aufgenommen und zur Denaturierung der DNA 2 min auf 95 °C erhitzt und danach sofort auf Eis gekühlt. 1.5 μl dieser Proben wurden dann auf ein 4,75 %iges Polyacryiamid-Sequenziergel aufgetragen. Zur Erstellung des Sequenziergels wurden 13,3 ml UltraPureSequagel ' Sequencing-System-Konzentrat von National Diagnostics (Atlanta, Georgia, USA) mit 49,7 ml UltraPureSequagel™Sequencing- System-Diluent vermischt und mit einer Spatelspitze von Amberlite MB-1 entionisiert. Die Suspension wurde anschließend filtriert (0,2 μm Filter) und 7 ml UltraPureSequagel™Sequencing-System-Puffer zugegeben. Nachdem 10 min unter Wasserstrahl-Vakuum entgast worden war. wurden 210 μl einer 10 %igen Ammoniumperoxodisulfat-Lösung und 25 μl TEMED zugegeben und in einen vorbereiteten Gelträger gegossen. Die Auftrennung der markierten DNA-Fragmente erfolgte in TBE-Puffer (1 M Tris-Base. pH 8,3; 0,85 M Borsäure; 10 mM EDTA) in einem Zeitraum von 7 h auf einem Prism™377-DNA-Sequencer von Perkin-Elmer-ABI (Weiterstadt). K) Expressionsplasmide. die ein korrekt eingebautes Gen für die Lumazinsynthase enthielten wurden anschließend in LB-AMP-Medium (10 g/1 Caseinhydrolysat; 5 g/1 Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl; 150 mg/1 Ampicillin) kultiviert. Anzuchten wurden in einem Volumen von 25 ml in 100 ml Erlenmeyerkolben durchgeführt. Es w irde zunächst eine Übernachtkultur (ca. 15 ml) Zellen aus H). welche aus einer Einzelkolonie stammten, angeimpft. Die Hauptkultur wurde 1 :50 (v/v) mit der Übernachtkultur angeimpft. Das Wachstum von Flüssigkulturen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD6oo) gegen unbewachsenes Medium als Nullwert verfolgt. Die Expressionsstämme wurden bis zu einer OD6oo von 0,7 angezogen und dann die Transkription des Lumazinsynthasegens mit IPTG (Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid) in einer Konzentration von 2 mM induziert. Nach erfolgter Fermentation (nach Induktion weitere 5 h) wurden die Zellen mittels Zentrifugation (5000 Umin"1 4 °C. 15 min) geerntet, mit Saline gewaschen (20 % des Volumens der Hauptkultur; Saline: 0.9 % NaCl-Lsε.) und bei -20 °C bis zu einer weiteren Verwendung gelagert. L) Der Aufschluß der Zellen aus K) erfolgte unter Verwendung einer Ultraschall-erzeugenden Apparatur (Branson-Sonifier B-12A. Branson SONIC Power Company. Dunbury, Connecticut). Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 800 μl Aufschlußpuffer (50 mM K-Phosphat. pH 7.0; 10 mM EDTA; 10 mM Na2SO3; 0.3 mM PMSF; 0,02 % Na- triumazid) suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 8 sec mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes bei Stufe 4,5 behandelt. Anschließend wurde die Suspension 5 min auf Eis gekühlt und nochmals einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Die Zellsuspension wurde anschließend zentrifügiert (Eppendorff-Zentrifüge; 15000 Umin" 1 4 °C, 15 min) und der Überstand (Rohextrakt) zur weiteren Verarbeitung eingesetzt.
M) Zur Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges (Lumazinsynthase), wurde eine denaturierende Polyacrylamidelektrophorese nach Laemmli (1970) durchgeführt. Routinemäßig wurden Gele mit 4 % Acryiamid im Sammelgel und 16 % Acryiamid im Trenngel angefertigt (Acrylamidstammlösung: 38,8 % (w/v) Acryiamid; 1,2 % (w/v) N,N'-Methylenbisacrylamid). Die Rohextrakte aus L) wurden 1 :2; 1 :5 oder 1 :10 mit Protein-Auftragspuffer (20 % Glycerin 4 % 2-Mercaptoethanol: 4 % (w/v) SDS; 0,05 % Bromphenolblau) verdünnt und 15 min auf siedendem Wasserbad gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die verbliebenen unlöslichen Bestandteile der Proben in einer Eppendorfzentrifuge pelletiert (15000 Umin"1. 5 min, 4 °C) und 8 μl des klaren Überstandes auf das Sammelgel aufgetragen. Als Molekulargewichtsstandard diente Dalton Mark VII-L von Sigma (Deisenhofen) mit Proteinbanden bei 66, 44, 36, 29, 24, 20 und 14 kDa (Im Folgenden als Markeφroteine bezeichnet). Die Elektrophorese wurde bei konstant 20 mV je SDS-Gel durchgeführt. Die Anfärbung der Proteinbanden erfolgte anschließend unter Verwendung von Coomassie-Färbelösung (40 % Methanol; 10 % Essigsäure; 0,2 % (w/v) Coomassie Blue R 250). Zur Entfärbung des nicht mit Proteinmatrix versetzten Acrylamidgels wurde eine Coomassie-Entfärbelösung verwendet (40 % Methanol; 10 % Essigsäure (tech.); 50 % Wasser). Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 16 kDa beobachtet werden. die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
N) Die Übeφrüfung der Funktionalität der 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase erfolgte unter Verwendung der natürlichen Substrate (5-Amino-6-ribitylamino-2,4(l H,3H)-pyrimidin- dion und L-3.4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat: Bacher et al.. 1997). Der Ansatz enthielt 100 mM K-Phosphat-Puffer pH 7.0. 4 mM EDTA, 0,6 mM 5-Amino-6-ribitylamino- 2,4(1 H,3H)-pyrimidindion (PYR; hergestellt durch katalytische Hydrierung von 5-Nitro-6- ribitylamino-2,4(l H.3H)-pyrimidindion). 2 mM DTT, 1 mM L-3.4-Dihydroxy-2-butanon- 4-phosphat (DHP) und Rohextrakt aus L). Die Mischung wurde zuerst ohne PYR 3 min vorinkubiert und die Enzymreaktion dann durch Zugabe von PYR gestartet. Der Testansatz wurde bei 37 °C inkubiert. Von der Mischung wurden nach unterschiedlichen Zeitintervailen (2, 5 und 10 min) Portionen entnommen, die Reaktion durch Zugabe von TCA (15 % in Wasser) abgestoppt und zentrifügiert (15000 Umin"1, 5 min, RT). Die Auswertung erfolgte mittels HPLC an der reversen Phase Nucleosil 10Cι8 (4 x 250 mm). Die Konzentration des gebildeten 6.7-Dimethyl-8-ribityllumazins wurde durch Fluoreszenzdetektion (Anregung: 407 nm; Emission: 487 nm) bestimmt. Der Elutionspuffer enthielt 7 % Methanol und 30 mM Ameisensäure. Als Standard diente chemisch synthetisiertes 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin. Eine Einheit (1 U) 6.7-Dimethyl- 8-ribityllumazinsynthase katalysiert bei 37 °C die Bildung von 1 nmol 6,7-Dimethyl-8- ribityllumazin je Stunde. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-BS-LuSy konnte eine Volumenaktivität von ca. 15600 U/ml gemessen werden. Nach Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration nach O) (13 mg/ml) konnte eine spezifische Aktivität von ca. 1200 U/mg berechnet werden.
O) Die Bestimmung des Proteins im Rohextrakt erfolgte nach einer Variante der Methode von Bradford (Read und Northcote, 1981 ; Compton und Jones, 1985). Das Farbstoffreagenz wurde durch Auffüllen von 0,1 g Serva Blue G, 100 ml 16 M Phosphorsäure und 47 ml
P) Ethanol in Wasser gewonnen, filtriert und im Dunkeln bei 4 °C aufbewahrt. Die Rohextrakte wurden mit einem Puffer, der 2,0 g Na2HP04, 0,6 g KH2P04, 7,0 g NaCl und 0,2 g Natriumazid pro Liter Wasser enthielt. 50-fach verdünnt. Zu 50 μl dieser Lösung wurden 950 μl Reagenz gegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion bei 595 nm gegen eine Leeφrobe aus 50 μl Puffer auf 950 μl Reagenz bestimmt. Für jede Probe erfolgte eine Dreifachbestimmung. Die Ergebnisse wurden mittels einer mit BSA (Rinderserumalbumin) als Standard erhaltenen Eichgeraden in Proteinkonzentrationen umgerechnet.
Q) Für die Negativkontrastierung wurden Trägernetzchen verwendet, die mit Formvar/Kohle beschichtet waren. Diese wurden jeweils vor der Verwendung neu beglimmt (vgl. Standardprotokolle zur Durchführung von Negativkontrastierung am Elektronenmikroskop). Etwa 10 μl Proteinlösung (~ 1 mg/ml) wurden auf das Netzchen gegeben. Der Teil, der nach 1 min noch nicht an das Trägermaterial adsorbiert war, wurde entfernt. Anschließend wurde die protein altige Schicht mehrmals abwechselnd mit Uranylacetatlösung (2 % in Wasser) und bidest. Wasser benetzt. Der letzte Tropfen Uranylacetat wurde ca. 30 sec auf dem Präparat belassen. Abschließend wurde das Trägernetzchen mit Filteφapier getrocknet und in die Trägerapparatur des Elektronenmikroskops eingesetzt (Transmissions-Elektronenmikroskop JEM-100CX. Jeol. Japan). Negativkontrastierungen zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.
R) Die Western-Blot Analyse wurde nach der Methode von Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Ausgehend von einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel (16 %) erfolgte die Übertragung der denaturierten Proteine über einen Zeitraum von 2 Stunden bei einer konstanten Stromstärke von 40 mA. Nach erfolgter Transformation der Proteine auf die Membrane, wurde diese kurz in Antiköφer- Waschpuffer- A (20 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3 mM KC1; 0.05 % Tween 20) gewaschen und anschließend in Antiköφer- Waschpuffer-B (mit 3 % Milchpulver) 1 Stunde inkubiert. Danach wurde die Membran übernacht mit 10 μl Anti-sRFS (Kaninchen Rohserum mit polyklonalen Antiköφern gegen die Lumazinsynthase; 1 :10 verdünnt in 1 mg/1 BSA) in einem Gesamtvolumen von 5 ml Antikörper- Waschpuffer-C (mit 1 % Milchpulver) geschwenkt. Nach der Inkubation wurde die Membran 3 x mit je 5 ml Antiköφer- Waschpuffer-A gewaschen. Die gespülte Membran wurde anschließend 1 Stunde mit 20 μl Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat (in 50 % Glycerin) in Antiköφer- Waschpuffer-C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen erfolgte die Detektion von Lumazinsynthase enthaltenden Banden via Zugabe von 3,3 '- Diaminobenzidin (6 mg in 10 ml Antiköφer- Waschpuffer-A) und 10 μl Wasserstoffperoxid (30 %ig). Nach Entwicklung der Membran konnte die Lumazinsynthase bei einem Molekulargewicht von ca. 16,2 kDa detektiert werden.
S) Die Reinigung der Lumazinsynthase aus dem Stamm XLl-pNCO-BS-LuSy erfolgte in zwei Schritten: Der Kultivierung der Escherichia coli Zellen erfolgte nach K), jedoch in einem Volumen von 1 1. Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 32 ml Aufschlußpuffer suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 15 mal mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury. Connecticut) bei Stufe 5 behandelt. Anschließend wurde die Suspension 5 min auf Eis gekühlt. Der Vorgang wurde insgesamt 4 mal wiederholt. Die aufgeschlossenen Zellsuspension wurde anschließend zentrifügiert (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin" 1 ; 4°C) und der klare Überstand auf eine Anionenaustauschersäule (DEAE-Cellulose DE52; 2 x 15 cm. Whatman Ltd., Maidstone. GB) aufgetragen. Die Säule wurde zunächst mit 100 ml Puffer A (50 mM K-Phosphat. 10 mM EDTA. 10 mM Natriumsulfit. 0.02 % Natriumazid, pH 7,0) gespült und die Lumazinsynthase anschließend unter Durchführung eines Elutionsgradienten (101 ml bis 200 ml 15 % Puffer B; 201 ml bis 500 ml 18 % Puffer B; 501 ml bis 650 ml 100 % Puffer B) unter Einbeziehung von Puffer B (IM K-Phosphat, 10 mM EDTA, 10 mM Natriumsulfit. 0.02 % Natriumazid. pH 7,0) eluiert (Flußrate: 1 ml/min). Die Lumazinsynthase konnte bei ca. 250 mM K-Phosphat eluiert werden. Die Fraktionen wurden anschließend nach N) auf Lumazinsynthaseaktivität getestet. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und gegen Puffer A in einem Verhältnis 1 : 1000 dialysiert (18 h. 4 °C). Das Dialysat wurde anschließend unter Verwendung einer Ultrazentrifuge konzentriert (Beckman LE 70 mit Festwinkelrotor 70Ti; 32000 Umin"1, 18 h, 4 °C). Die zu ca. 75 % angereicherte konzentrierte Proteinlösung wurde auf eine mit Puffer A equilibrierte Gelfiltrationssäule (Sepharose-6B, 2 x 180 cm, Pharmacia Biotech, Freiburg) aufgetragen und mit Puffer A eluiert (Flußrate: 0,5 ml/min). Die Lumazinsynthase eluierte kurz nach der Ausschlußgrenze. Die Fraktionen wurden anschließend nach N) auf Lumazinsynthaseaktivität getestet und anschließend unter Verwendung einer Ultrazentrifüge konzentriert (Beckman LE 70 mit Festwinkelrotor 70Ti; 32000 Umin"1, 18 h, 4 °C). Die Reinheitsübeφrüf ng erfolgte nach M) (SDS-PAGE), wobei nur noch eine Proteinbande bei ca. 16 kDa zu beobachten war. Nach Bestimmung der enzymatischen Aktivität nach N) und der Proteinkonzentration nach O) konnte eine spezifische Aktivität von 12400 U/mg berechnet werden. Negativkontrastierungen nach P) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm. Zur Übeφrüfüng der Quartärstruktur des gereinigten Proteins wurde eine native Elektrophorese unter Verwendung von 3,5 %igen Polyacrylamidflachgelen durchgeführt. 5,7 ml Acrylamidstammlösung (38,8 % (w/v) Acryiamid; 1,2 % (w/v) N,N '-Methyl enbisacryl- amid), 46 ml Gelpuffer (0,2 M Na-Phosphat. pH 7,2), 13 ml H2Ob,dest, 300 μl Ammoium- peroxodisulfatlösung (10 % (w/v) in Wasser). 65 μl TEMED (N.N,N'.N'-Tetramethyl- ethylendiamin) und 5 mg Bromphenolblau wurden gemischt und in einen Gelgießstand (Pharmacia Biotech. Freiburg) unter Verwendung einer Trägerfolie (GelBond" PAG Film. FMC Bioproducts. Rockland, ME. USA) gegossen und über Nacht bei Raumtemperatur polymerisiert. Auf das Gel wxirden 20 μl Proteinlösung in einer Konzentration von 0,2-1 mg/ml gegeben. Als Elektrodenpuffer wurde der Gelpuffer verwendet. Das Gel wurde bei konstant 100 mA unter Temperaturkontrolle (10 °C) entwickelt. Die Anfärbung bzw. Entfärbung erfolgte wie unter M) beschrieben. Die gereinigte Lumazinsynthase war als diskrete Bande auf dem nativen Gel zu sehen und zeigte dasselbe Laufverhalten wie eine aus Wildtyp Bacillus subtilis gereinigte Probe.
U) Zur Übeφrüfung der Quartärstruktur bzw. der Beurteilung der strukturellen Homogenität der gereinigten Lumazinsynthase wurde eine Sedimentationsanalyse an der analytischen Ultrazentrifuge (Optima XLA mit Rotor AN60 Ti, Beckman Instruments, München), durchgeführt (Laue et al., 1992). Zur Bestimmung der Sedimentationsgeschwindigkeit wurde die Lumazinsynthase bei 45000 Umin"1 zentrifügiert. Alle 5 min wurde die radiale Absoφtionsänderung bei 280 nm gemessen und damit der Sedimentationsverlauf des Proteins verfolgt. Rekombinante Lumazinsynthase sedimentierte als homogene, symmetrische Grenzschicht, d.h. bei der Probe handelte es sich um eine einzige Molekülspezies. Aus dem zeitlichen Sedimentationsfortschritt während der einzelnen Messungen wurde eine mittlere Sedimentationskonstante S2o,w von 26.3 S bestimmt.
V) Die genaue Bestimmung des nativen Molekulargewichts der Lumazinsynthase und die entgültige Bestätigung des Aggregationsgrades erfolgte mit der analytischen Ultrazentrifuge nach der Sedimentationsgleichgewichtsmethode. Die radiusabhängige Konzentrationsmessung erfolgte über die Messung der Absoφtion bei 280 nm. Die Proben waren konzentriertes Protein (nach Sepharose-6B), das auf SDS-Polyacrylamidgelen nur noch eine einzige Bande (16,2 kDa) zeigte. Die Absoφtion der verwendeten Proben betrug etwa 0,3 bei 280 nm. 150 μl Probe wurden in den Probensektor einer Meßzelle gegeben und mit 15 μl Öl (Fluorochemical FC 43, Beckman) unterschichtet. Der Referenzsektor wurde mit 200 μl Puffer A (siehe R)) befüllt. Die Enzymprobe wurde bei 3000 Umin"1 und 4 °C solange zentrifügiert, bis sich das Gleichgewicht zwischen Zentrifugation und Rückdiffusion eingestellt hatte. Die Auswertung der Daten erfolgte mit der Software XLA-Data-Analysis (Teilprogramm Origin-single: Beckman Instruments). Das partielle spezifische Volumen des Proteins wurde näherungsweise nach Cohn und Edsall (1943) aus den partiellen spezifischen Volumina der Aminosäuren und Addition einer Temperaturkorrektur errechnet. Für die Lumazinsynthase wurde eine Molekülmasse von 925 kDa bei 4 °C erhalten und damit die Aggregation zu einem 60-mer bestätigt. Beispiel 2
Homologe Expression der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis im Bacillus subtilis
Stamm BR151-pBLl
Im Vergleich zur heterologen Expression in Escherichia coli kann bei der homologen Expression in Bacillus subtilis eine höhere Ausbeute an Lumazinsynthase erzielt werden.
A) Analog Beispiel 1 A) - E), wobei anstelle des Oligonukleotids EcoRI-RBS-1 Oligonukleotid EcoRI-RBS-2 (5' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg 3 ') verwendet wurde.
B) Der Expressionsvektor p602/-CAT wurde analog Beispiel 1 F) verdaut. Das entstandene DNA-Fragment mit einer Länge von 5269 bp wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.
C) Die Ligation erfolgte analog Beispiel 1 G), wobei das Expressionsplasmid p602-BS-LuSy erhalten wurde.
D) Die Transformation von Escherichia coli XLl-Zellen erfolgte analog Beispiel 1 H), jedoch wurden anstelle LB-AMP-Platten, LB-KAN-Selektivagaφlatten (21 g/1 Agar; 10 g/1 Ca- seinhydrolysat; 5 g/1 Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl; 15 mg/1 Kanamycin) verwendet, da der Vektor p602/-CAT über eine Kanamycin-Resistenz anstelle der Ampicillin-Resistenz verfügt.
E) Die Isolierung der Expressionsplasmide erfolgte analog Beispiel 1 I), jedoch wurden die Zellen auf LB-KAN-Flüssigmedium (10 g/1 Caseinhydrolysat; 5 g/1 Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl; 15 mg/1 Kanamycin) angezogen.
F) Die Sequenzierung erfolgte analog Beispiel 1 J) jedoch mit Sequenzieroligonukleotid Seq- 2 (5' gta taa tag att caa att gtg agc gg 3 ').
G) Die Kultivierung der Expressionsstämme erfolgte analog Beispiel 1 K), jedoch unter Verwendung von LB-KAN-Flüssigmedium.
H) Der Aufschluß der Zellen wurde analog Beispiel 1 L) durchgeführt.
I) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese des Escherichia coli Stammes XLl-p602-BS- LuSy (durchgeführt gemäß Beispiel 1 M)) zeigte eine diskrete Proteinbande bei ca. 16 kDa, die einer Expressionsrate von ca. 30 % bezogen auf die gesamte lösliche Proteinfraktion entsprach.
J) Die Übeφrüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1 N) und der Gesamtproteinkonzentration gemäß Beispiel 1 O) ergab eine spezifische Aktivität von ca. 3700 U/mg. K) Die Herstellung elektrokompetenter Bacillus subtilis Zellen erfolgte nach einer modifizierten Vorschrift von Brigidi et al. (1989). 500 ml LB-ERY-Flüssigmedium (10 g/1 Casein- hydrolysat; 5 g/1 Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl: 15 mg/1 Erythromycin) wurden 1 : 100 mit einer Bacillus subtilis Zellen (BR151 [pBLl ]) enthaltenden Übernacht-Kultur angeimpft und bei 32 °C bis zu einer optischen Dichte (578 nm) von 0.6 bebrühtet. Zum Abstoppen des Zellwachstums wurden die Zellen 30 min auf Eis gestellt und anschließend zur Gewinnung der Zellmasse zentrifügiert (Sorvall-GSA-Rotor, 2300 Umin"1. 4 °C. 15 min). Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet mit 300 ml eiskaltem, sterilem 1 mM HEPES-Puffer (1 mM (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure in Wasser, pH 7,0) gewaschen und erneut zentrifügiert. Das Sediment wurde zweimal in je 200 ml PEB-Puffer (272 mM Saccharose; 1 mM MgCl2; 7 mM K-Phosphat. pH 7,4) gewaschen und zentrifügiert. Das Zellpellet wurde abschließend in 16 ml PEB-Puffer suspendiert und auf Eis gekühlt. Elektroporationszelle und Zellenhalter wurden 15 min auf Eis vorgekühlt. 800 μl Zellsuspension wurde in einem vorgekühlten Eppendorf-Gefäß mit 500-1500 ng Plasmid- DNA (p602-BS-LuSy aus E)) vermischt und 10 min auf Eis inkubiert. Nach Überführung der inkubierten Suspension in die Elektroporationszelle (4 mm) wurde die Elektroporation bei 25 μF und 2.5 kV in einer Elektroporationsapparatur (Gene Pulse, BioRad, München) durchgeführt. Anschließend wurde die Zellsuspension für weitere 10 min auf Eis inkubiert. Zur Expression des Phänotyps (Kanamycin-Resistenz) wurden die transformierten Zellen in 6 ml LB-ERY-Medium (s.o.) pipettiert und 2 h bei 32 °C bebrühtet. Anschließend wurden 25 ml LB-ERY-KAN-Medium (10 g/1 Caseinhydrolysat; 5 g/1 Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl; 15 mg/1 Erythromycin; 15 mg/ml Kanamycin) mit 1 ml des Transformationsansatzes beimpft und für 4-8 h bei 32 °C im Schüttelinkubator bebrühtet. Parallel dazu wurden Portionen von 100 μl, 200 μl und 400 μl des Transformationsansatzes direkt auf LB-ERY- KAN-Selektivagaφlatten (21 g/1 Agar; 10 g/1 Caseinhydrolysat; 5 g/1 Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl; 15 mg/1 Erythromycin; 15 mg/ml Kanamycin) ausplattiert. Portionen der Flüssigkultur wurden nach 2. 4, 6 und 8 h auf LB-ERY-KAN-Platten ausplattiert.
L) Die erhaltenen Bacillus subtilis Stämme BR151-pBLl-p602-BS-LuSy wurden unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion auf Anwesenheit des Expressionsplasmides getestet. Zur Analytik der Transformanden wurden jeweils PCR- Ansätze (vgl. Beispiel 1 A) jedoch ohne Matrizen-DNA und entsprechend mehr Wasser) vorgelegt und darin unter Verwendung von sterilen Zahnstochern frisches Zellmaterial (von den erhaltenen Kolonien) suspendiert. Nach erfolgter Suspendierung wurde eine Kopie der jeweiligen Transformande auf einer LB-ERY-KAN-Selektivagaφlatte angelegt. Bei allen getesteten Kolonien wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von 498 bp erhalten.
M) Die Kultivierung der Zellen erfolgte auf LB-ERY-KAN-Flüssigmedium (10 g/1 Caseinhydrolysat: 5 g7l Hefeextrakt; 5 g/1 NaCl: 15 mg/1 Erythromycin: 15 mg/ml Kanamycin) gemäß Beispiel 1 K). jedoch wurde die Fermentation bei 32 °C durchgeführt und die Wachstumsphase nach Induktion mit IPTG betrug 18 h.
N) Der Aufschluß der Zellen erfolgte analog Beispiel 1 L).
O) Die Übeφrüf ng der Expressionsrate anhand einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese erfolgte analog Beispiel 1 M) und ergab eine Expressionsrate von ca. 40 -50 % bezogen auf die gesamte lösliche Proteinfraktion.
P) Die Übeφrüfüng der Funktionalität bzw. der Proteinkonzentration wurde gemäß Beispiel 1 N) und O) durchgeführt. Im Rohextrakt des Expressionsstammes BR151-pBLl-p602-BS- LuSy konnte eine spezifische Aktivität von 4000 U/mg gemessen werden.
Q) Die Durchführung der Negativkontrastierung erfolgte nach Beispiel 1 P), wobei hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm zu beobachten waren.
R) Die Western-Blot- Analyse wurde nach Beispiel 1 Q) durchgeführt und ergab ein vergleichbares Ergebnis.
S) Da die Expressionsrate im verwendeten Bacillus subtilis Stamm BR151-pBLl-p602-BS- LuSy deutlich höher lag als im Escherichia coli Stamm XLl-pNCO-BS-LuSy konnte die Reinigung mit einer einzigen Säule (Sepharose-6B, 2 x 180 cm, Pharmacia Biotech, Freiburg) durchgeführt werden. Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach M), jedoch in einem Volumen von 11. Der Aufschluß erfolgte nach Beispiel 1 R) in 32 ml Aufschlußpuffer, jedoch wurden dem Aufschlußpuffer 30 mg Lysozym zugesetzt. Es erfolgte zunächst eine Inkubation der Zellsuspension (37 °C. 60 min) an die sich der Ultraschall- Aufschluß gemäß Beispiel 1 R) anschloß. Die aufgeschlossenen Zellsuspension wurde anschließend zentrifügiert (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin"1; 4°C), filtriert (Porenweite 0,22 μm) und der klare Überstand auf eine mit Puffer A (gemäß Beispiel 1 R)) equilibrierte Gelfiltrationssäule aufgetragen und mit Puffer A eluiert (Flußrate: 0.5 ml/min). Die Lumazinsynthase wurde vom Säulenmaterial nicht retardiert. Die Fraktionen wurden anschließend nach Beispiel 1 N) auf Lumazinsynthaseaktivität getestet und anschließend unter Verwendung einer Ultrazentrifuge konzentriert (Beckman LE 70 mit Festwinkelrotor 70Ti; 32000 Umin"1. 18 h, 4 °C). Die Reinheitsübeφriifung erfolgte nach Beispiel 1 M) (SDS-PAGE), wobei nur eine Pro- teinbande bei ca. 16 kDa zu beobachten war. Nach Bestimmung der enzymatischen Aktivität und der Proteinkonzentration (gemäß Beispiel 1 N) und O)) konnte eine spezifische Aktivität von 12400 U/mg berechnet werden. Negativkontrastierungen (gemäß Beispiel 1 P)) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm. T) Die Übeφrüfung der Quartärstruktur der gereinigten Lumazinsynthase erfolgte gemäß Beispiel 1 S) bis U) und ergab ein vergleichbares Ergebnis.
Beispiel 3
Ersatz der Aminosäure Cystein an der Positionen 93 durch die Aminosäure Serin in der
Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden PNCO-M2 (5' aga tat ttt cat taa aga gga gaa 3 '), welches am 3 '-Ende an einen Teil der ri- bosomalen Bindungsstelle bindet und am 5 '-Ende einen nicht bindenden Sequenzabschnitt zur Deletion der vektoriellen EcoRI-Schnittstelle enthält und RibH-3 (5 ' tat tat gga tcc tta ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3 ') aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert. lO μl PCR-Puffer 6 μl Mg2~ [l,5 mM] 8 μl dNTP's [je 200 μM] 1 μl PNCO-M2 [0,5 μM] 1 μl RibH-3 [0,5 μM) 1 μl pNCO-BS-LuSy [10 ng]
1 μl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgien) 72 μl H2Obidest
Der Ansatz wurde im Thermocycler (Gene.Amp' PCR System 2400; Perkin Eimer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 5,0 min 95 °C
2. 0,5 min 94 °C
3. 0.5 min 50 °C
4. 0,5 min 72 °C
5. 7,0 min 72 °C
6. abkühlen auf 4 °C
Die Schritte 2. - 4. wurden 20 x wiederholt. B) Der PCR-Ansatz wαirde gemäß Beispiel 1 B) gereinigt, wobei ein Fragment mit 505 bp erhalten wurde.
C) Ein Teil des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden PNCO-Ml (5 ' gtg agc gga taa caa ttt cac aca g 3 '), welches im Bereich der EcoRI-Schnittstelle im Expressionsvektor bindet und diese Erkennungssequenz unberührt läßt und C93S (5 ' gca gct tca ttc gaa aca taa tcg taa tg 3 '). welches die Mutation und die Schnittstelle BstBI (aminosäurenkonservativ) zur Detektion der Mutation einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert. Die Durchführung der PCR und die Reinigung des Fragmentes (256 bp) erfolgte analog A) und B).
D) Verlängerung des DNA-Fragmentes (256 bp) aus C) durch Kombination mit DNA-Fragment (505 bp, repräsentiert die gesamte Genlänge) aus B) und Durchführung einer PCR. Bei diesem PCR-Ansatz dienen die eingesetzten PCR-Fragmente aus B) und C) selbst als Primer für die Polymerasereaktion. Um eine effiziente Verlängerung zu erreichen wurden beide Fragmente in äquimolaren Mengen (je 500 fmol) eingesetzt.
10 μl Puffer
6 μl Mg2~ [l ,5 mM]
8 μl dNTP's [je 200 μM]
1 μl DNA-Fragment aus B) (500 fmol)
1 μl DNA-Fragment aus C) (500 fmol)
1 μl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] 73 μl H2O ιdest
Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp® PCR System 2400; Perkin Eimer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 5,0 min 95 °C
2. 0,5 min 94 °C
3. 0,5 min 65 °C
4. 0,5 min 72 °C
5. 7,0 min 72 °C
6. abkühlen auf 4 °C
Die Schritte 2. - 4. wurden 20 x wiederholt. E) Eine ungereinigte Portion des PCR-Ansatzes aus D) diente als DNA-Matrize für einen
PCR-Ansatz mit der Primerkombination PNCO-Ml/RibH-3. Der PCR-Ansatz wurde gemäß A) durchgeführt, wobei jedoch die PCR-Schritte 25 x wiederholt wurden.
F) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B) gereinigt, wobei ein Fragment mit 528 bp erhalten wurde.
G) Die Weiterverarbeitung erfolgte gemäß Beispiel 1 E) bis I). Die eingeführte Mutation wurde durch Verdau des Plasmids pNCO-BS-LuSy-C93S mit der Restriktionsendonuklease BstBI (TT*CGAA) diagnostiziert (Fragmente mit 3698 bp und 181 bp).
H) Die Sequenzierung erfolgte gemäß Beispiel 1 J).
I) Proteinchemische Arbeiten wurden gemäß Beispiel 1 K) bis S) durchgeführt, wobei kein signifikanter Unterschied zur Wildtyp-Lumazinsynthase erkennbar wurde.
Beispiel 4
Ersatz der Aminosäure Cystein an der Positionen 139 durch die Aminosäure Serin in der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde analog Beispiel 3 A) mit den Oligonukleotiden PNCO-M2 und RibH-3 aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert und gereinigt.
B) Ein Teil des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde analog Beispiel 3 B) mit den Oligonukleotiden PNCO-Ml und C139S (5 ' ggc aga aac agc tga atc tac acc ttt gtt g 3 '), welches die Mutation und die Schnittstelle PvuII (aminosäurenkonservativ) zur Detektion der Mutation einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert. Die Durchführung der PCR und die Reinigung des Fragmentes (394 bp) erfolgte analog Beispiel 3 A) und B).
C) Das weitere molekularbiologische Vorgehen entsprach Beispiel 3 D) bis H). Die eingeführte Mutation wurde durch Verdau des Plasmids pNCO-BS-LuSy-C139S mit der Restriktionsendonuklease PvuII (CAG*CTG) diagnostiziert (Fragmente mit 3539 bp und 340 bp).
D) Das weitere biochemische Vorgehen entsprach Beispiel 1 K) bis S) wobei kein signifikanter Unterschied zur Wildtyp-Lumazinsynthase erkennbar wurde.
Beispiel 5 Ersatz der Aminosäure Cystein an den Positionen 93 und 139 durch die Aminosäure Serin in der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Der Herstellung der Doppelmutante pNCO-BS-LuSy-C93/139S erfolgte analog zu Beispiel 4, jedoch wurde als DNA-Matrize das Plasmid pNCO-BS-LuSy-C93S verwendet.
B) Nach erfolgter biochemischer Charakterisierung (gemäß Beispiel 1 K) bis S)) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym festgestellt werden.
Konstruktion von Expressionsvektoren zur N-terminalen und C-terminalen Fusion von Fremdproteinen an die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung von Escherichia coli Expressionsvektoren zur Fusion von Genen oder synthetisch hergestellter DNA-Fragmenten an das 5 '-Ende bzw. an das 3 '-Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Die Vektoren enthalten die erfindungsgemäß bevorzugten Vektorelemente, wie Promotor aus dem Bakteriophagen T5, eine lac-Operatorsequenz, einen Ampicillinresistenzmarker und einen zu Escherichia coli kompatiblen Replikationsursprung.
Beispiel 6
Vektor zur Fusion von Fremd-DNA an das 5 -Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden Nl (5' act atg gcg gcg gcg cgt agc tgc gcg gcc gcx atg aat atc ata caa gga aat tta g 3 '), welches eine Notl-Schnittstelle unmittelbar vor dem Startcodon erzeugt und RibH-4 (3 ' tat tat gga tcc aaa tta ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3 ') aus dem Plasmid pRF2 (siehe Beispiel 1) amplifiziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1 A) durchgeführt.
B) Die Reinigung erfolgte analog Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit 513 bp erhalten wurde.
C) 10 ng der isolierten DNA aus B) dienten anschließend als Matrize für eine 2. PCR mit den Oligonukleotiden N2 (5 ' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg gcg gcg gcg cgt agc tgc 3 '), welches in 5 '-Richtung eine ribosomale Bindungsstelle und eine Erkennungssequenz für die Endonuklease EcoRI einführt, und RibH-4.
D) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1 B), E) bis J). Es wird das Plasmid pNCO-N-BS-LuSy erhalten. Beispiel 7
Vektor zur Fusion von Fremd-DNA an das 3 -Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (vgl. Beispiel 2 Λ)) und C2 (5 ' ttt tcg gga tcc ttt taa act gtt tgc ggc cgc taa ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3 '). welches eine Notl-Schnittstelle hinter dem letzten kodierenden Basentriplett des Gens für die Lumazinsynthase und in 3 '-Richtung eine BamHI- Schnittstelle im Abstand von 13 Nukleotiden einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (vgl. Beispiel 1) amplifiziert. Das ehemalige Stopcodon des Lumazinsynthase-Gens wird durch das für die Aminosäure Leucin kodierende Basentriplett TTA ersetzt.
B) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1 B), E) bis J). Es wird das Plasmid pNCO-C-BS-LuSy erhalten.
Fusion von vollständigen Proteinen an den N-Terminus bzw. an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
Die folgenden Beispiele beschreiben die Fusion eines intakten vollständigen Gens an das 5'- Ende bzw. an das 3 '-Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Die Beispiele illustrieren die Durchführbarkeit der Fusion von vollständigen, biologisch aktiven Proteinen an den N-Terminus als auch an den C-Terminus der ikosaedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis.
Beispiel 8
Fusion der Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli an den N-Terminus der
Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Dihydrofolatreduktase (DHFR) wurde mittels PCR aus isolierter chromo- somaler-DNA (Escherichia coli RR28) unter Nerwendung der Oligonukleotide EC-DHFR- I (5' gag gag aaa tta act atg atc agt ctg an gcg g 3 '). welches am 3 '-Ende zum 5 '-Ende des DHFR-Gens komplementär ist und am 5 '-Ende für einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle kodiert, und EC-DHFR-2 (5 ' cta gcc gta aat tct ata gcg gcc gc& cgc cgc tcc aga atc 3 '). welches am 3 '-Ende zum Gen der DHFR komplementär ist und unmittelbar hinter dem letzten codierenden Basentriplett eine Erkennungssequenz für die Endonuklease Νotl einführt, amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A). wobei ca. 50 ng chromosomale DNA eingesetzt wurde. B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 513 bp erhalten wurde.
C) Die Durchführung einer zweiten PCR erfolgte analog Beispiel 1 C). wobei jedoch die Oli- gonukleotid-Kombmation BS-Mfel (5 ' ata ata caa ttg att aaa gag gag aaa tta act atg 3 '), welches die ribosomale Bindungsstelle vervollständigt und unmittelbar vor der ribosomalen Bindungsstelle eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Mfel in das DNA-Fragment einführt, und EC-DHFR-2 verwendet wurde.
D) Der PCR-Ansatz wurde wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt, wobei ein Fragment mit einer Länge von 531 bp erhalten wurde.
E) Das isolierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen Mfel verdaut.
30,0 μl Fragment aus der 2. PCR 5,0 μl Mfel [50 U]
10,0 μl Puffer 4 ( 10 \, 50 mM K-Acetat. 20 mM Tπs-Acetat. 10 mM Mg-Acetat. 1 mM Dithiothreitol, pH 7,9)
55,0 μl H2Obldest
Das Restriktionsenzym wurde von der Firma New England Biolabs (Schwalbach) bezogen. Der Ansatz wurde 150 min bei 37 °C inkubiert und wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt und zum Verdau mit der Restriktionsendonuklease Notl eingesetzt.
F) Das gereinigte DNA-Fragment aus E) wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl verdaut.
30,0 μl Fragment aus E) 5,0 μl Notl [50 U]
10,0 μl Puffer 3 ( 10 x. 100 mM NaCl. 50 M Tπs-HCI. 10 mM MgCU, 1 mM Dithiothreitol. pH 7,9)
Das Restriktionsenzym wurde von der Firma New England Biolabs (Schwalbach) bezogen. Der Ansatz wurde 150 min bei 37 °C inkubiert und wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.
G) 5 μg des Expressionsvektors pNCO-N-BS-LuSy in einem Volumen von 30 μl wurden zunächst mit der Restriktionsendonuklease Notl analog F) verdaut und gemäß Beispiel 1 B) gereinigt.
H) Das Vektorfragment aus G) wurde anschließend mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut. 30,0 μl Vektor-Fragment aus G 2,5 μl EcoRI [62,5 U]
20.0 μl OPAU ( 10 \. 500 mM K-Acetat. 100 mM Mg-Acetat. 100 mM Tπs-Acetat pH 7,5)
47,5 μl H2Ob,Ces
Der Ansatz wurde ebenfalls 150 min bei 37 °C inkubiert und das entstanden DNA- Fragment mit einer Länge von 3863 bp wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.
I) Das weitere Vorgehen erfolgte gemäß Beispiel 1 G) bis L).
J) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde gemäß Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 34,5 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 40-50 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
K) Die Übeφrüfung der Funktionalität der 6.7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase erfolgte gemäß Beispiel 1 N) in Verbindung mit O). Im Rohextrakt konnte kein signifikanter Unterschied zu einer nicht-derivatisierten Wildtyp-Lumazinsynthase beobachtet werden.
L) Die Reinigung erfolgte gemäß Beispiel 2 S) an einer Sepharose-6B-Gelfiltrationssäule, wobei die Konzentrierung der Proteinfraktionen bei 28000 Umin"1 durchgeführt wurde. Negativkontrastierung gemäß Beispiel 1 P) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 20 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.
M) Die Übeφrüfung der Quartärstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1 S). Im Vergleich zur Wildtyp-Lumazinsynthase konnte ein deutlicher Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit (EC-DHFR-BS-LuSy wanderte deutlich langsamer, bildete aber auch eine diskrete Bande) beobachtet werden.
Beispiel 9
Fusion des 'Maltose-bindenden-Proteins' aus Escherichia coli an den N-Terminus der
Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für das ...Maltose-bindene-Protein" (MBP) wurde mittels PCR aus dem Plasmid pMAL-C2 (New England Biolabs. Schwalbach) unter Verwendung der Oligonukleotide MALE-1 (5' gag gag aaa tta act atg aaa atc gaa gaa ggt aaa c 3 '). welches am 3 '-Ende zum 5 '-Ende des MBP-Gens komplementär ist und am 5 '-Ende für einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle kodiert, und MALE-2 (5 ' gca ggt cga etc tag egg ccg ega att ctg 3 '), welches am 3 '-Ende zum Gen des MBP komplementär ist und unmittelbar hinter dem letzten codierenden Basentriplett eine Erkennungssequenz für die Endonuklease Notl einführt, amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A), wobei ca. 10 ng Plasmid-DNA eingesetzt wαirde.
B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1 B). wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 1210 bp erhalten wurde.
C) Die Durchführung einer zweiten PCR erfolgte analog Beispiel 1 C). wobei jedoch die Oli- gonukleotid-Kombination BS-Mfel (5 ' ata ata caa ttg att aaa gag gag aaa tta act atg 3 '), welches die ribosomale Bindungsstelle vervollständigt und unmittelbar vor der ribosomalen Bindungsstelle eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Mfel in das DNA-Fragment einführt, und MALE -2 verwendet wurde.
D) Der PCR-Ansatz wurde wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt, wobei ein Fragment mit einer Länge von 1227 bp erhalten wurde.
E) Das weitere Vorgehen erfolgte gemäß Beispiel 8 E) bis I).
F) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde gemäß Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-EC-MBP-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 59,5 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-EC-MBP-BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 50 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
G) Die Übeφrüfung der Funktionalität der 6.7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase erfolgte gemäß Beispiel 1 N) in Verbindung mit O). Im Rohextrakt konnte kein signifikanter Unterschied zu einer nicht-derivatisierten Wildtyp-Lumazinsynthase beobachtet werden.
H) Die Reinigung erfolgte gemäß Beispiel 2 S) an einer Sepharose-6B-Gelfiltrationssäule, wobei die Konzentrierung der Proteinfraktionen bei 28000 Umin"1 durchgeführt wurde. Negativkontrastierung gemäß Beispiel 1 P) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 25 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.
I) Die Übeφrüfung der Quartärstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1 S). Im Vergleich zur BS- LuSy und EC-DHFR-BS-LuSy konnte ein deutlicher Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit (EC-MBP-BS-LuSy wanderte deutlich langsamer als BS-LuSy und EC- DHFR-BS-LuSv, bildete aber auch eine diskrete Bande) beobachtet werden. Beispiel 10
Fusion der Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli an den C-Terminus der
Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Dihydrofolatreduktase ( DHFR) wurde mittels PCR aus isolierter chromo- somaler-DNA (Escherichia coli RR28) unter Nerwendung der Oligonukleotide Oligonukleotide EC-FolA-1 (5 ' ata gtg gcg aca atg egg ccg ctg gtg gag gcg gaa tga tea gtc tga ttg egg cg 3'), welches am 3 '-Ende zum 5 '-Ende des DHFR-Gens komplementär ist und am 5 '-Ende unmittelbar vor dem Startcodon des DHFR-Gens eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Νotl einführt und EC-FolA-2 (5 ' ttc tat gga tcc tta ccg ccg etc cag aat c 3 '), welches am 3 '-Ende zum Gen der DHFR komplementär ist und unmittelbar hinter dem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Endonuklease BamHI einführt, amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A). wobei ca. 50 ng chromosomale DNA eingesetzt wurde.
B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 524 bp erhalten wurde.
C) Das isolierte DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonukleasen BamHI verdaut.
30,0 μl Fragment aus der 2. PCR
3,0 μl BamHI [60 U] 20,0 μl OPAU (lOx)
Das Restriktionsenzym wurde von der Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen. Der Ansatz wurde 150 min bei 37 °C inkubiert und wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt und zum Verdau mit der Restriktionsendonuklease Notl eingesetzt.
D) Das gereinigte DNA-Fragment aus C) wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl gemäß Beispiel 8 F) verdaut und wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.
E) 5 μg des Expressionsvektors pNCO-C-BS-LuSy in einem Volumen von 30 μl wurden zunächst gemäß C) und D) verdaut, wobei ein Fragment mit einer Länge von 3880 bp entstanden ist, gemäß Beispiel 1 B) gereinigt, und zur Ligation eingesetzt.
I) Das weitere Vorgehen erfolgte gemäß Beispiel 1 G) bis L).
J) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde gemäß Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 34.8 kDa beobachtet werden, die in einem Ver- gleichsstamm ohne pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 25 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
K) Die Übeφrüfung der Funktionalität der 6.7-Dimethyl-8-ribityllumazιnsynthase erfolgte gemäß Beispiel 1 N) in Verbindung mit O). Im Rohextrakt konnte kein signifikanter Unterschied zu einer nicht-derivatisierten Wildtyp-Lumazinsynthase beobachtet werden.
L) Die Übeφrüfüng der Quartärstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1 S). Im Vergleich zur Wildtyp-Lumazinsynthase konnte ein deutlicher Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit (EC-DHFR-BS-LuSy wanderte deutlich langsamer, bildete aber auch eine diskrete Bande) beobachtet werden.
Kopplung eines 17 Aminosäuren langen Epitops des VP2 Oberflächenproteins eines Säugetiervirus an den N-Terminus, an den C-Terminus und an beide Termini der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
Die folgenden Beispiele beschreiben die Fusion von kurzen Peptiden an beide Termini der ikosaedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis unter Erhalt der sphärischen Struktur. Durch die gleichzeitige Belegung beider Termini wird eine 120-fache Belegung der Oberfläche des Ikosaeders ermöglicht.
Das 17 Aminosäuren lange Peptid zählt zu den hochkonservierten Bereichen des VP2 Oberflächenproteins von verschiedenen tierischen Virusarten, wie z.B. des 'Mink enteritis Virus', des eline panleukopeniavirus' oder des 'Canine Parvovirus'.
Beispiel 1 1
Fusion der VP2-Domäne an den N-Terminus der Lumazinsynthase
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde zunächst mit den Oligonukleotiden N-VP2-1 (5 ' ggt cag ccg gct gtt cgt aac gaa cgt atg aat atc ata caa gga aat tta gtt ggt ac 3'), welches an seinem 3 '-Ende komplemetär zum 5 '-Ende des Lumazinsynthase- gens und am 3 '-Ende für einen Teil der VP2-Domäne kodiert und RibH-3 (siehe Beispiel 3 A)) aus dem Plasmid pRF2 (siehe Beispiel 1 A)) amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte gemäß Beispiel 1 A).
B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B). wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 504 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 2. PCR eingesetzt. C) Die Durchführung der 2. PCR erfolgte analog Beispiel 1 C). wobei jedoch die Oligonukleotid-Kombination N-VP2-2 (5 ' gag gag aaa tta act atg ggg gac ggt gct gtt cag ccg gac ggt ggt cag ccg gct gtt cgt aac gaa cg 3 '). welches an seinem 3 '-Ende komplementär zu dem schon eingeführten Teil der VP2-Domäne ist. die VP2-Domäne vervollständigt, ein ATG-Startcodon und einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle unmittelbar vor der VP2-Sequenz einführt, und RibH-3 verwendet wurden.
D) Der PCR-Ansatz aus C) wurde analog Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 549 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 3. PCR eingesetzt.
E) Die Durchführung der 3. PCR erfolgte analog Beispiel 1 C). jedoch mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und RibH-3.
F) Der PCR-Ansatz aus E) wurde analog Beispiel 1 B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 567 bp erhalten.
G) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis L). wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XLl-pNCO-N-VP2-BS-LuSy erhalten wurde.
H) Die Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges wurde analog Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-N- NP2-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,2 kDa beobachtet werden, die in einem Nergleichsstamm ohne pΝCO-Ν-NP2-BS-LuSy-Expres- sionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca.
I) 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
J) Nach Übeφrüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1 N) bis Q) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym beobachtet werden.
Beispiel 12
Fusion der NP2-Domäne an den C-Terminus der Lumazinsynthase
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde zunächst mit den Oligonukleotiden RibH- 1 (siehe Beispiel 1 A)) und C-NP2-1 (5' cca ccg tcc ggc tga aca gca ccg tca cct tcg aaa gaa egg ttt aag ttt gcc 3 '). welches an seinem 3 '-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase einen Teil der NP2-Domäne einführt, aus dem Plasmid pRF2 (siehe Beispiel 1 A)) amplifiziert. B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B). wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 506 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 2. PCR eingesetzt.
C) Die Durchführung der 2. PCR erfolgte analog Beispiel 1 C), wobei jedoch die Oligonukleotid-Kombination EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und C-VP2-2 (5' ata tat gga tcc taa cgt tcg tta cga aca gcc ggc tga cca ccg tcc ggc tga aca gca ccg tc 3 '), welches die VP2-Domäne in 3 '-Richtung vervollständigt, hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der VP2-Domäne ein Stopcodon in die Sequenz einführt und unmittelbar hinter diesem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI beinhaltet, verwendet wurde.
D) Der PCR-Ansatz aus C) wurde analog Beispiel 1 B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 564 bp erhalten.
E) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis L). wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XLl-pNCO-C-VP2-BS-LuSy erhalten wurde.
F) Die Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges wurde analog Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-C- VP2-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,1 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-C-VP2-BS-LuSy- Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
G) Nach Übeφrüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1 N) bis Q) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym beobachtet werden.
Beispiel 13
Fusion der VP2-Domäne an den N- und an den C-Terminus der Lumazinsynthase
A) Ausgehend von dem in Beispiel 1 1 erhaltenen Expressionsplasmid pNCO-N-VP2-BS- LuSy, welches die VP2-Domäne an das 5 '-Ende des Lumazinsynthasegen fusioniert enthält, wurde analog Beispiel 12 die VP2 Domäne an das 3 '-Ende des Lumazinsynthasegens fusioniert.
B) Die Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges wurde analog Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL l-pNCO-N/C- VP2-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 20 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-N/C-VP2-BS-LuSy-Expres- sionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. C) 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine ( geschätzt).
D) Nach Übeφrüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1 N) bis Q) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym beobachtet werden.
Beispiel 14
Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde unter Verwendung der Poly- merasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und C-Biotag-1 (5' cat agc ttc gaa gat gcc gcc gag tgc ggc cgc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3 '), welches an seinem 3 '-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase, DNA für einen Linker, bestehend aus 3 Alaninresten und einen Teil der DNA kodierend für das biotinylierfähige Peptid einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (siehe Beispiel 1) amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A).
B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 528 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 2. PCR eingesetzt.
C) Die Durchführung der 2. PCR erfolgte analog Beispiel 1 C), wobei jedoch die Oligonukleotid-Kombination EcoRI-RBS-2 und C-Biotag-2 (5 ' tat tat gga tcc tta gcg cca etc cat ctt cat agc ttc gaa gat gcc gcc gag tgc ggc 3 '), welches die biotinylierfähige Domäne in 3 '-Richtung vervollständigt, unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett dieser Domäne ein Stopcodon in die Sequenz einführt und unmittelbar hinter diesem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI beinhaltet, verwendet wurde.
D) Der PCR-Ansatz aus C) wurde analog Beispiel 1 B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 558 bp erhalten.
E) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis L). wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XLl-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy erhalten wurde.
F) Bei der Übeφrüfung der Funktionalität der Lumazinsynthase gemäß Beispiel 1 N) konnte nur eine enzymatische Aktivität, die der Aktivität des Escherichia coli Stammes XL1 entsprach, ermittelt werden.
G) Die Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe der löslichen Proteine wurde analog Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy konnte keine signifikante Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,5 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-C-Biotag-BS-LuSy-Expres- sionsplasmid nicht zu sehen war.
H) Zur Herstellung eines Gesamtproteinextraktes wurden die Zellen analog Beispiel 1 K) kultiviert. 1/12 der gewonnenen Zellmasse wαirde mit 300 μl Proteinauftragspuffer (siehe Beispiel 1 M)) suspendiert und 15 min auf siedendem Wasserbad gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die verbliebenen unlöslichen Bestandteile der Proben in einer Eppendorfzentrifüge pelletiert (15000 Umin"1, 5 min, 4 °C) und 8 μl des klaren Überstandes auf das Sammelgel aufgetragen. Das weitere Vorgehen erfolgte analog Beispiel 1 M). Es zeigte sich in Verbindung mit G), daß der Stamm XLl-pNCO-C-Biotag- BS-LuSy rekombinantes Protein in Form von unlöslichen Einschlußköφern in einer Menge von ca. 15 % bezogen auf alle zellulären Proteine (lösliche und unlösliche Proteine, abgeschätzt vom SDS-PAGE) liefert.
I) Zum Nachweis des Lumazinsynthaseanteils im artefiziellen Lumazinsynthase- Fusionsprotein wurde eine Western-Blot Analyse analog Beispiel 1 Q), wobei jedoch zusätzlich zur löslichen Proteinfraktion auch die Gesamtproteinfraktion analysiert wurde, durchgeführt. Nach Entwicklung der Membran konnte rekombinantes Lumazinsynthase- Fusionsprotein nur in der Gesamtproteinfraktion, jedoch nur zu einem vernachlässigbaren Anteil in der löslichen Proteinfraktion nachgewiesen werden.
J) Zum Nachweis der Biotinvlierung wurden sowohl die lösliche Proteinfraktion, als auch die Gesamtproteinfraktion auf eine Membran übertragen. Ausgehend von einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel (16 %) erfolgte die Übertragung der denaturierten Proteine über einen Zeitraum von 2 Stunden bei einer konstanten Stromstärke von 40 raA. Nach erfolgter Transformation der Proteine auf die Membrane, wurde diese kurz in Antiköφer- Waschpuffer-A (siehe Beispiel 1 Q)) gewaschen und anschließend in Antiköφer- Waschpuffer-B 1 Stunde inkubiert. Danach wurde die Membran übernacht mit 20 μl Streptavidin gekoppelt an 'alkalische Phosphatase' (Promega, Madison, Wisconsin, USA) in einem Gesamtvolumen von 15 ml Antiköφer- Waschpuffer-C geschwenkt. Nach der Inkubation wurde die Membran 3 x mit je 5 ml Antiköφer- Waschpuffer-A gewaschen. Nach erfolgtem Waschen erfolgte die Detektion des Biotin-gebundenen Streptavidins via Zugabe der Substrate für die Alkalische Phosphatase. 50 μl BCIP-Stammlösung (25 mg 5-Brom-4- Chlor-indol-3-yl-phosphat in 500 μl Dimethylformamid lösen und lichtgeschützt bei 4 °C aufbewahren) und 100 μl NBT-Stammlösung (50 mg Nitroblautetrazoliumchlorid in 700 μl Dimethylformamid und 300 μl Wasser lösen und lichtgeschützt bei 4 °C aufbewahren) werden in 15 ml Färbepuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl. 5 mM MgCl2, pH 9,5) verdünnt. Nach Entwicklung der Membran in dieser Lösung konnte im Gesamtproteinextrakt rekombinantes. biotinyliertes Protein bei einem Molekulargewicht von ca. 18,5 kDa in Form einer blauen Bande, detektiert werden. Gesamtprotein aus dem Escherichia coli Stamm XL1 ohne das Plasmid pNCO-C-Biotag-BS-LuSy wies keine diesbezügliche Färbung auf. Nach erfolgter Anfärbung wurde die Membran in Wasser gewaschen und 5 min in einem Stop-Puffer (20 mM Tris-HCl. 25 mM EDTA-Na2, pH 8,0) inkubiert.
K) Zur Renaturierung des unlöslichen biotinylierten Lumazinsynthase-Fusionsproteins wurden zunächst die löslichen Proteinfraktionen gemäß Beispiel 1 L) abgetrennt.
L) Der unlösliche Rückstand aus K) wurde in 100 mM K-Phosphatpuffer. pH 7,0, der 6 M Harnstoff. 6 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4-(lH.3H)-pyrimidindion und 100 mM Dithiothreitol (DTE) enthielt, während 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur solubi- lisiert. Die entstandene Proteinlösung wurde anschließend zweimal gegen das 10-fache Volumen 100 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,0, der 1 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4- (lH,3H)-pyrimidindion und 1 mM DTE enthielt, jeweils 12 Stunden bei 4 °C dialysiert. Nach Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin"1; 20 min; 4 °C) wurde das im Überstand enthaltene Protein unter Verwendung einer Ultrazentrifuge konzentriert (Beckman TFT 70-Rotor; 32000 Umin'1; 16 h; 4 °C). Die Analytik des renaturierten Proteins erfolgte gemäß den Ausführungen J). Beispiel 1 S) und Beispiel 1 P). Mit der oben beschriebenen Maßnahme konnte renaturiertes, ikosaedrisches, aus 60 Untereinheiten bestehendes Fusionsprotein erhalten werden.
M) Der Nachweis der Zugänglichkeit der Biotinmoleküle im nativen Protein erfolgte unter Verwendung von Mikrotiteφlatten und eines Mehrkanalphotometers (ELISA-reader). 100 μl einer Avidin-Stammlösung (Sigma, München) mit der Konzentration 1 mg/ml wurden zunächst in 20 ml Beschichtungspuffer (20 mM Na-Carbonat, pH 9,6) verdünnt (Standardlösung). Jeweils 100 μl der Standardlösung wurden in die Probentaschen der Mi- krotiteφlatte pipettiert. die Probentaschen anschließend mit einer Klebefolie verschlossen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Lösung wαirde anschließend abgegossen und jeder Napf 3 mal mit je 200 μl PBS (20 mM Na-Phosphat. 130 mM NaCl, pH 7,2) gewaschen. Die nicht mit Avidin bedeckte Kunststoffoberfläche der Probentasche wurde mit je 350 μl Abdecklösung (3 % Milchpulver in PBS) für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Abdecklösung wurde anschließend abgegossen und die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft. In die 1. von 8 Probentaschen wurde anschließend 100 μl der renaturierten Probenlösung aus L) (ca. 1 mg/ml) gegeben. In die Probentaschen 2 - 8 wαirden jeweils 50 μl Verdünnungslösung (1 % Milchpulver in PBS) gegeben. Die 8. Probentasche wurde freigelassen. 50 μl aus Probentasche 1 wurden mit den 50 μl Verdünnungslösung in Probentasche 2 verdünnt (10 x auf und ab pipettieren). 50 μl aus Probentasche 2 wurden anschließend mit 50 μl Verdünnungslösung aus Probentasche 3 verdünnt, etc.. Zum Schluß wurden 50 μl aus Probentasche 7 verworfen, so daß nun alle Probentaschen 50 μl Probenlösung in verschiedenen Konzentrationen (log 2 Verdünnung) enthielten. Die Proben wurden mit Klebefolie abgedeckt und 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Probenlösungen wurden anschließend abgegossen, die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden 15 μl Streptavidin- Alkalische Phosphatase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) in 20 ml Verdünnungslösung verdünnt (Detektionslösung). Jeweils 100 μl Detektionslösung wurden in die Probentaschen 1 - 8 pipettiert und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Detektionslösungen wurden anschließend abgegossen, die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Die Entwicklung der Mikrotiteφlatte erfolgte unter Zugabe von 150 μl Substratlösung (10 mg p-Nitrophenylphosphat in 10 ml Färbepuffer (siehe J)) für die Alkalische Phosphatase und Messung der Extinktion bei 405 nm. Da es sich bei der Lumazinsynthase um ein sphärisches Molekül handelt, liegen die Biotinmoleküle statistisch auf der Oberfläche verteilt vor. Befinden sich zuviele biotinylierte Lumazinsynthasemoleküle auf der Oberfläche der Mikrotiteφlatte (über Avidin an die Mikrotiteφlatte gebunden), so sind die seitlichen Biotinmoleküle für eine Bindung an Streptavidin nicht mehr zugänglich. Erst nach Verringerung der Konzentration der biotinylierten Lumazinsynthasemoleküle werden die seitlichen Biotinmoleküle für eine Bindung an Streptavidin zugänglich, d.h. die Signalstärke steigt an.
Markierung des C-terminalen Endes der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis mit einer reaktiven Aminosäure
Die folgenden Beispiele beschreiben die Einführung von reaktiven Aminosäuren (Lysin und Cystein) am C-Terminus der Lumazinsynthase. Auf der Oberfläche der Lumazinsynthase sind zwar basische Aminosäuren, die sich eventuell für eine kovalente Kopplung von chemischen Molekülen eignen vorhanden, ihre Zugänglichkeit ist jedoch durch benachbarte Aminosäurenreste eingeschränkt. Auf der Oberfläche der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis befinden sich keine freien Cysteinreste die sich, aufgrund ihrer Thiolgruppe für eine kovalente Kopplung von chemischen Molekülen eignen könnten.
Zur Verbesserung der Zugänglichkeit, bzw. zur Minimierung der sterischen Hinderung wurde ein Linker (Tentakel-Linker) zwischen dem C-Terminus der Lumazinsynthase und der betreffenden Aminosäure eingeführt, so daß die reaktiven Aminosäuren für nahezu jede chemische Kopplung mit Fremdmolekülen zugänglich werden.
Beispiel 15
Verlängerung des C-Terminus und Einführung einer terminalen basischen Aminosäure
(Lysin) als Grundlage zur chemischen Kopplung von Zielmolekülen
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wαirde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und C-Lvsl 65 (5 ' tat tat gga tcc tta ttt acc aga gcc acc acc aga acc acc gcc acc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3 '). welches an seinem 3 '-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase em Gen. kodierend für das Peptid (Gly) Ser- (Gly)3Ser-Gly-Lys. einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy amplifiziert. Unmittelbar hinter dem Codon für Lysin (aaa) an der Aminosäurenposition 165 wird mit dem Oligonukleotid C-Lysl65 ein Stopcodon und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI in die DNA-Sequenz eingeführt. Die PCR wurde analog Beispiel 1 A) durchgeführt.
B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 543 bp erhalten wurde.
C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1 B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO-Lysl65-BS-LuSy erhalten.
D) Die Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges erfolgte analog Beispiel 1 M). Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-Lysl65-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-Lysl65-BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
E) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 1 N) bis Q) durchgeführt, wobei keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (BS-LuSy) zu beobachten waren.
Beispiel 16
Verlängerung und Einführung eines terminalen Cvsteinrestes an den C-Terminus der
Lumazinsynthase als Grundlage zur chemischen Kopplung von Zielmolekülen
A) Die Konstruktion erfolgte analog Beispiel 15 A) bis C). jedoch wurde anstelle des Oligo- nukleotids C-Lysl 65 das Oligonukleotid C-Cvsl 67 (5 ' tat tat gga tcc tta gca gcc acc acc aga gcc acc acc aga acc acc gcc acc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3 '), welches an seinem 3 '-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase ein Gen, kodierend für das Peptid (Gly) Ser-(Gly)3Ser-(Gly)3-Cys. einfuhrt, verwendet. Unmittelbar hinter dem Codon für Cystein 167 (tgc) wird mit dem Oligonukleotid C-Cysl67 ein Stopcodon und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI in die DNA-Sequenz, eingeführt. Es wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von 549 bp erhalten. Es wurde der Escherichia coli Stamm XLl-pNCO-Cysl 67-BS-LuSy erhalten.
B) Bei der Übeφrüfung der Molekülmasse des monomeren Proteinstranges (Cysl67-BS- LuSy) analog Beispiel 15 D) konnte eine Bande bei ca. 17,1 kDa beobachtet werden. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 5 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
C) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 1 N) bis Q) durchgeführt, wobei keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (BS-LuSy) zu beobachten waren.
Beispiel 17
Kopplung eines 12 Aminosäuren langen Peptids mit der Erkennungssequenz für einen monoklonalen Antikörper (Anti-FLAG-M2/IgGl/Maus) an den N-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden FLAG-BS-LuSv- 1 (5 ' ata ata ata aag ctt atg aat atc ata caa gga aat tta g 3 '), welches an seinem 3 '-Ende komplemetär zum 5 '-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis und am 5 '-Ende eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Hindlll einführt und Flag-BS-LuSy-2 (5' tat tat gaa ttc tta ttc gaa aga acg gtt taa g 3 '), welches an seinem 3 '-Ende komplemetär zum 3 '-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis und am 5 '-Ende eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI einführt, aus dem Plasmid pRF2 ('vgl. Beispiel 1 A)) amplifiziert.
B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 492 bp erhalten wurde, gereinigt.
C) Das isolierte DNA-Fragment und der Nektor pFLAG-MAC (Eastman Kodak Company, New Haven) wurden zunächst mit der Restriktionsendonuklease Hindlll verdaut.
30,0 μl pFLAG-MAC [5 μg] bzw. 30 μl isoliertes DNA-Fragment 3,0 μl Hindlll [60 U] 10,0 μl OPAU (10 x)
57,0 μl H2Obidest
Der Ansatz wαirde ebenfalls 180 min bei 37 °C inkubiert und das entstanden DNA- Fragment wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt und zum Verdau mit der Restriktionsendonuklease EcoRI eingesetzt.
D) Das isolierte DNA-Fragment und der Vektor pFLAG-MAC aus C) wurden anschließend mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut.
30,0 μl DNA-Fragmente aus C)
3,0 μl EcoRI [60 U] 24,0 μl OPAU (10 x)
Der Ansatz wαirde 180 min bei 37 °C inkubiert und wie unter B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.
E) Die weitere Vorgehensweise erfolgte gemäß Beispiel 1 G) bis L). F) Nach Durchführung einer denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß Beispiel 1 M) konnte im Rohextrakt eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,7 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pFLAG-MAC-BS-LuSy- Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
G) Die Übeφrüfüng der Funktionalität erfolgte analog Beispiel 1 N) bis P). wobei kein signifikanter Unterschied zum Wildtypenzym beobachtet werden konnte.
H) Zur immunologischen Übeφrüfung der Funktionalität des FLAG-Peptides wurde eine Western-Blot- Analyse gemäß Beispiel 1 Q), jedoch unter Verwendung des monoklonalen Antiköφers ,Anti-FLAG®M2' (Eastman Kodak Company, New Haven) als 1. Antiköφer (10 μl Anti-FLAG®M2 in 5 ml TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) und Anti-Maus- IgG-HRP-Konjugat als 2. Antiköφer (10 μl Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat in 5 ml TBS; vgl. Beispiel 18 H)). Nach Entwicklung der Membran konnte das Fusionsprotein bei ca. 17,7 kDa detektiert werden.
I) Die Reinigung erfolgte analog Beispiel 2 S). es wurde jedoch kein Lysozym zum Aufschlußpuffer zugesetzt.
J) Negativ-Kontrastierung am Elektronenmikroskop gemäß Beispiel 1 P) zeigten hohle , sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.
K) Die Übeφrüfüng der Quartärstruktur wurde analog Beispiel 1 S) durchgeführt. Das gereinigte Lumazinsynthase-Fusionsprotein war als diskrete Bande auf dem nativen Gel zu sehen. Es konnte eine verringerte Mobilität im Vergleich zu einer Wildtyp- Lumazinsynthase. die auf den vergrößerten Durchmesser zurückzuführen ist, beobachtet werden.
Beispiel 18
Kopplung eines 6 Aminosäuren langen Peptids (6 x Histidin) zur Bindung an Ni-Chelat- Affinitätsmatrix, zur Bindung eines monoklonalen Antikörpers (Penta-His) bzw. zur Bindung von Ni-NTA-HRP-Konjugat an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde zunächst mit den Oligonukleotiden RibH-1 (vgl. Beispiel 1 A)) und RibH-His6-C-l (5 ' gtg gtg atg gtg atg ttc gaa aga acg gtt taa g 3 "). welches an seinem 3 '-Ende komplemetär zum 3 '-Ende des Lumazin- synthasegens aus Bacillus subtilis und am 5 '-Ende für einen Teil des Affinitätspeptids kodiert, aus dem Plasmid pRF2 (vgl. Beispiel 1 A)) amplifiziert.
B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B ). wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 492 bp erhalten wurde, gereinigt und als Matrize für eine 2. PCR gemäß Beispiel 1 C). jedoch mit der Oligonukleotidkombination EcoRI-RBS-2 (vgl. Beispiel 2 A)) und RibH- His6-C-2 (5' tat tat gga tcc tta atg gtg gtg atg gtg atg 3 '). welches die His6-Domäne in 3 '- Richtung vervollständigt, unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett dieser Domäne ein Stopcodon in die Sequenz einführt und unmittelbar hinter diesem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI beinhaltet, verwendet wurde.
C) Der PCR-Ansatz aus B) wurde analog Beispiel 1 B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 528 bp erhalten.
D) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XLl-pNCO-C-His6-BS-LuSy erhalten wurde.
E) Nach Durchführung einer denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß Beispiel 1 M) konnte im Rohextrakt eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,1 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-C-His6-BS-LuSy-Ex- pressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 30 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
F) Die Übeφrüfüng der Funktionalität erfolgte analog Beispiel 1 N) bis P), wobei kein signifikanter Unterschied zum Wildtypenzym beobachtet werden konnte.
G) Zur immunologischen Übeφrüfung der Funktionalität des His6-Peptides wurde eine Wes- tern-Blot-Analyse gemäß Beispiel 1 Q), jedoch unter Verwendung des monoklonalen Antiköφers enta-His™ Antibody' (Quiagen. Hilden) als 1. Antiköφer (10 μl Penta-His' Antibody in 5 ml TBS (siehe Beispiel 17 H)) und Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat als 2. Antiköφer (10 μl Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat in 5 ml TBS). Nach Entwicklung der Membran konnte das Fusionsprotein bei ca. 17.1 kDa detektiert werden.
H) Der Nachweis der Zugänglichkeit der His6-Peptide im nativen Protein erfolgte unter Verwendung von Mikrotiteφlatten und eines Mehrkanalphotometers (ELISA-reader). In die 1. von 8 Probentaschen wurde je 100 μl der Rohextraktlösung aus D) (ca. 5-8 mg/ml Gesamtprotein) gegeben. In die Probentaschen 2 - 8 wurden jeweils 50 μl Verdünnungslösung (1 % Milchpulver in PBS) gegeben. Die 8. Probentasche wurde freigelassen. 50 μl aus Probentasche 1 wurden mit den 50 μl Verdünnungslösung in Probentasche 2 verdünnt (10 x auf und ab pipemeren). 50 μl aus Probentasche 2 wurden anschließend mit 50 μl Nerdünnungslösung aus Probentasche 3 verdünnt, etc.. Zum Schluß wurden 50 μl aus Probentasche 7 verworfen, so daß nun alle Probentaschen 50 μl Probenlösung in verschiedenen Konzentrationen (log 2 Verdünnung) enthielten. Die Proben wurden mit Klebefolie abgedeckt und Übernacht bei 37 °C inkubiert. Die nicht mit Fusionsprotein bedeckte Kunststoffoberfläche der Probentasche wurde mit je 350 μl Abdecklösung (3 % Milchpulver in PBS) für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Abdecklösung wurde anschließend abgegossen, die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden 10 μl Penta-His™ Antibody (Quiagen. Hilden) in 5 ml Verdünnungslösung verdünnt (1. Antiköφer). Jeweils 50 μl 1. Antiköφer wurden in die Probentaschen 1 - 8 pipettiert und 2 Stunde bei 37 °C inkubiert. Der 1. Antiköφer wurde anschließend abgegossen, die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 150 μl des 2. Antiköφers (10 μl Anti-Maus-IgG- HRP-Konjugat in 5 ml Verdünnungslösung, Sigma. München) mit einer Inkubationszeit von 2 h bei 37 °C. Der 2. Antiköφer wurde anschließend abgegossen, die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Die Entwicklung der Mikrotiteφlatte erfolgte unter Zugabe von 150 μl Substratlösung (100 mg o-Phenylendiamin in 25 ml Substratpuffer, 50 mM Citronensäure, pH 5) für die Peroxidase und Messung der Extinktion bei 492 nm. Das Fusionsprotein konnte von den hochspezifischen Penta-His-Antiköφern erkannt werden. Es konnte eine konzentrationsabhängige (log2 Verdünnung von gebundenem Fusionsprotein) Signalverringerung beobachtet werden.
I) Νegativ-Kontrastierung am Elektronenmikroskop gemäß Beispiel 1 P) zeigten hohle , sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.
J) Die Übeφrüfüng der Quartärstruktur wurde analog Beispiel 1 S) durchgeführt. Das gereinigte Lumazinsynthase-Fusionsprotein war als diskrete Bande auf dem nativen Gel zu sehen. Es konnte eine verringerte Mobilität im Vergleich zu einer Wildtyp- Lumazinsynthase. die auf den vergrößerten Durchmesser zurückzuführen ist, beobachtet werden.
Beispiel 19 Herstellung von Mischungen aus C-Biotag-BS-LuSy und C-His6-BS-LuSy auf dem Wege der gesteuerten in vitro Rückfaltung der unlöslichen Proteine
A) Die Kultivierung des Escherichia coli Stammes XLl-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (Beispiel 14) erfolgte gemäß Beispiel 1 K). jedoch in einem Volumen von 500 ml.
B) Die Kultivierung des Escherichia coli Stammes XLl-pNCO-C-His6-BS-LuSy (Beispiel 18) erfolgte ebenfalls gemäß Beispiel 1 K). jedoch in einem Volumen von 500 ml.
C) Der Aufschluß der Zellen aus A) erfolgte unter Verwendung einer Ultraschall-erzeugenden Apparatur (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company. Dunbury. Connecticut). Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 40 ml Abtrennpuffer (50 mM Tris pH 9,5) suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 15 mal mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes bei Stufe 5 behandelt. Anschließend wurde die Suspension 5 min auf Eis gekühlt. Der Vorgang wαirde insgesamt 4 mal wiederholt. Die Zellsuspension wurde anschließend zentrifügiert (Sorvall-Zentrif ge mit SS34-Rotor; 5000 Umin"1, 4 °C, 10 min), der Überstand (Rohextrakt A-l) abgetrennt und das Zellpellet (Rückstand A-l) weiterverarbeitet.
D) Der Aufschlußvorgang wurde ein zweites Mal durchgeführt, wobei der Rückstand A-l aus C) wiederum in 40 ml Abtrennpuffer suspendiert wurde. Die weitere Durchführung erfolgte analog C). Es wurde Rohextrakt A-2 und unlöslicher Rückstand A-2 erhalten.
E) Der Aufschluß der Zellen aus B) erfolgte ebenfalls unter Verwendung einer Ultraschall-erzeugenden Apparatur (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Connecticut). Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 40 ml Abtrennpuffer (50 mM Tris pH 9.5) suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 15 mal mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes bei Stufe 5 behandelt. Anschließend wurde die Suspension 5 min auf Eis gekühlt. Der Vorgang wurde insgesamt 4 mal wiederholt. Die Zellsuspension wurde anschließend zentrifügiert (Sorvall-Zentrifüge mit SS34-Rotor: 15000 Umin" 1, 4 °C, 30 min), der Überstand-B abgetrennt und weiterverarbeitet.
F) Der unlösliche Rückstand A-2 (C-Biotag-BS-LuSy) aus D) wurde in 40 ml Solubilisierungspuffer (50 mM Tris, pH 9,5. 6 M Guanidiniumthiocyanat (G-SCN), 100 mM Dithiothreitol (DTE)), während 24 h unter Rühren bei Raumtemperatur solubilisiert.
G) Zum löslichen Überstand-B (40 ml) wurden 6 M G-SCN und 100 mM DTE gegeben und 24 h unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. H) Die Solubilisierungslösung aus F) wurde einer Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin"1; 20 min; 25 °C) unterworfen und Rückstand-A-3 und Überstand-A-3 erhalten.
I) Anschließend wurden Portionen von Überstand-A-3 und Rückstand-A-3 unter Verwendung einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
J) Die Übeφrüfüng der Überstände wαirde analog Beispiel 1 M) durchgeführt.
K) Zur Übeφrüfüng von Rückstand-A-3 wurde eine Spatelspitze des Rückstandes mit 200 μl Proteinauftragspuffer (siehe Beispiel 1 M)) suspendiert und 15 min auf siedendem Wasserbad gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die verbliebenen unlöslichen Bestandteile der Probe in einer Eppendorfzentrifüge pelletiert (15000 Umin"1, 5 min, 4 °C) und 6 μl des klaren Überstandes auf das Sammelgel aufgetragen. Das weitere Vorgehen erfolgte analog Beispiel 1 M).
L) Aus J) und K) zeigte sich, daß sich das unlösliche Protein C-Biotag-BS-LuSy zu ca. 80 % unter den angegebenen Bedingungen solubilisieren läßt.
M) Der erhaltene Rückstand-A-3 aus H) wurde nochmals den Schritten F) und H) bis K) unterworfen. Die Solubilisierungsrate konnte nicht verbessert werden.
N) Die Fusionsproteinmengen der beiden Überstände A-3 und B waren vergleichbar.
O) 2 ml Überstand-C-Bio-BS-LuSy (Überstand- A-3) und 2 ml Überstand-C-His6-BS-LuSy (Überstand-B) wurden gemischt (Mischung A).
P) 3,5 ml Überstand-C-Bio-BS-LuSy und 0,5 ml Überstand-C-His6-BS-LuSy wurden gemischt (Mischung B).
Q) Mischung A und Mischung B wurden 48 h bei Raumtemperatur gerührt.
R) Mischung A und Mischung B aus Q) wurden anschließend gegen 400 ml Abtrennpuffer, der 8 M Harnstoff und 1 mM DTE enthielt während 18 h bei Raumtemperatur dialysiert.
S) Zu beiden Mischungen wurde anschließend 6,6 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4- (lH,3H)-pyrimidindion gegeben und 8 h bei Raumtemperatur gerührt und Mischung A-Nitro bzw. Mischung B-Nitro erhalten.
T) Mischung A-Nitro und Mischung B-Nitro wurden in einen Dialyseschlauch überführt und gegen 32 ml (5-faches Volumen) Rückfaltungspuffer A (100 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,0, 1 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2.4-(lH,3H)-pyrimidindιon, 1 mM DTE, 0,02 % Na- Azid) 12 Stunden bei 4 °C dialysiert und Mischung A-l/5 und Mischung B-l/5 erhalten.
U) Anschließend wurde der Dialysepuffer aus T) mit 40 ml Rückfaltungspuffer B (100 mM K-Phosphatpuffer. pH 7.0. 1 mM DTE. 0.02 % Na-Azid) verdünnt und weitere 24 h bei 4 °C dialysiert (Mischung A-l/10 und Mischung B-l/10). V) Anschließend wurde der Dialysepuffer aus U) mit 80 ml Rückfaltungspuffer B verdünnt und weitere 24 h bei 4 °C dialysiert und die Dialysate Mischung A-l/20 und Mischung B- 1/20 erhalten.
W) Mischung A-l/20 und Mischung B- l/20 wurden anschließend gegen 72 ml (10-faches Volumen) Rückfaltungspuffer C (100 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,0. 1 mM DTE, 0,25 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2.4-(lH.3H)-pyπmidindion, 0,02 % Na-Azid) 24 h bei 4 °C dialysiert und Mischung A- 1/200 und Mischung B- 1/200 erhalten.
X) Nach Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor: 15000 Umin"1; 20 min: 4 °C) wurden Portionen von Überstand-Mischung A- 1/200 bzw. Mischung B- 1/200 und Rückstand-Mischung A- 1/200 bzw. Mischung B-l/200 unter Verwendung einer SDS-Polyacrylamidgelelektropho- rese analysiert.
Y) Die Übeφrüfüng der Überstände wurde analog Beispiel 1 M) durchgeführt.
Z) Die Übeφrüfung der Rückstände erfolgte analog K).
AA) Aus Y) und Z) zeigte sich, daß sich ca. 50-80 % gemischtes Lumazinsynthase-Konjugat unter den angegebenen Bedingungen erzeugen läßt. Die Fusionsproteinmengen der eingesetzten Proteinmengen entsprachen sich im rückgefalteten Zustand (abgeschätzt vom SDS- PAGE), so daß kein Unterschied im Rückfaltungsverhalten der beiden Fusionsproteine festgestellt werden konnte.
BB) Die Übeφrüfung der Quartärstruktur erfolgte analog Beispiel 1 S), wobei jedoch 40 μl Proteinlösung (Überstand-Mischung A- 1/200. Überstand-Mischung B- 1/200) eingesetzt wurde. Die renaturierten Fusionsprotein-Mischungen waren als diskrete Banden auf dem nativen Polyacrylamidgl zu sehen. Die Mobilität war vergleichbar mit den Mobilitäten der renaturierten Proteine C-Bio-BS-LuSy und C-His6-BS-LuSy, was höchstwahrscheinlich auf den ähnlichen hydrodynamischen Durchmesser der Proteine zurückzuführen ist. Mit der oben beschriebenen Maßnahme konnte demnach renaturiertes, ikosaedrisches, aus 60 Untereinheiten bestehendes Fusionsprotein erhalten werden.
CC) Der Nachweis der beiden Untereinheiten im renaturierten ikosaedrischen Protein erfolgte unter Verwendung von Mikrotiteφlatten und eines Mehrkanalphotometers (ELISA-reader). Die Beschichtung der Näpfe mit Avidin erfolgte analog Beispiel 14 M). In die 1. von 8 Probentaschen wurde je 100 μl der renaturierten Probenlösung aus W) (ca. 0,5-1 mg/ml) gegeben. In die Probentaschen 2 - 8 wurden jeweils 50 μl Verdürmungslösung (1 % Milchpulver in PBS) gegeben. Die 8. Probentasche wurde freigelassen. 50 μl aus Probentasche 1 wurden mit den 50 μl Verdünnungslösung in Probentasche 2 verdünnt (10 x auf und ab pipettieren). 50 μl aus Probentasche 2 wurden anschließend mit 50 μl Verdünnungslösung aus Probentasche 3 verdünnt, etc.. Zum Schluß wαirden 50 μl aus Probentasche 7 verworfen, so daß nun alle Probentaschen 50 μl Probenlösung in verschiedenen Konzentrationen (log 2 Verdünnung) enthielten. Die Proben wurden mit Klebefolie abgedeckt und Übernacht bei 37 °C inkubiert und danach wurde 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden 10 μl Penta-His Antibody (Quiagen. Hilden) in 5 ml Verdünnungslösung verdünnt (1. Antiköφer). Jeweils 50 μl 1. Antiköφer wurden in die Probentaschen 1 - 8 pipettiert und 2 Stunde bei 37 °C inkubiert. Der 1. Antiköφer wurde anschließend abgegossen, die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 150 μl des 2. Antiköφers (10 μl Anti-Maus-IgG- HRP-HRP-Konjugat in 5 ml Verdünnungslösung, Sigma. München) mit einer Inkubationszeit von 2 h bei 37 °C. Der 2. Antiköφer wurde anschließend abgegossen, die Mikrotiteφlatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 x mit jeweils 350 μl Waschlösung (PBS) gewaschen. Die Entwicklung der Mikrotiteφlatte erfolgte unter Zugabe von 150 μl Substratlösung (100 mg o-Phenylendiamin in 25 ml Substratpuffer, 50 mM Citronensäure, pH 5) für die Peroxidase und Messung der Extinktion bei 492 nm. Überstand-Mischung A- 1/200 und Überstand-Mischung B- 1/200 konnten von den hochspezifischen Penta-His-Antiköφern erkannt werden. Es konnte eine konzentrationsabhängige (log2 Verdünnung von gebundenem Fusionsprotein) Signal Verringerung beobachtet werden. Bei Überstand-Mischung A- 1/200 konnte ein stärkeres Signal als bei Überstand-Mischung B- 1/200 beobachtet werden. Zur Bindung an die Avidin-beschichtete Mikrotiteφlatte genügt theoretisch ein Biotinmolekül, während die Signalstärke mit der Anzahl von His6-Epitopen pro Molekül korelliert. In Überstand-Mischung A- 1/200 sind pro Ikosaeder mehr His6-Epitope enthalten als im Vergleichskonstrukt Überstand- Mischung B-l/200. so daß bei Überstand-Mischung A-l/200, wie der praktische Versuch bestätigt, ein stärkeres Signal zu erwarten ist. Aus diesem Ergebnis folgt, daß mit den oben beschriebenen Rückfaltungsmaßnahmen Ikosaeder erhalten wurden, die aus verschiedenen Untereinheiten bestehen.
Beispiel 20 Herstellung der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter Verwendung von 11, an die Escherichia coli Codonsverwendung angepasster synthetischer Oligonukleotide und einer 6-stufigen Polymerase-Kettenreaktion (Deckert et al., 1998)
A) Das erste Teilstück des Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde mit den Oligonukleotiden AQUI-1 (5 'gct gcg ggt gaa ctg gcg cgt aaa gag gac att gat gct gtt atc gca att ggc gtt etc atc 3 ': Strangprimer) und AQUI-2 (5 'eta atg aaa ggt teg ega ggc ctt ttg aaa ctt cag agg ega tat aat ega aat gtg gcg ttg 3 '; Gegenstrangprimer) unter Verwendung des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis als Matrize (Vektor pNCO-BS-LuSy, vgl. Beispiel 1 G)) amplifiziert. Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codon- verwendung (für stark exprimierte Gene; Grosjean und Fiers, 1982; Ikemura, 1981 ; Wada et al. 1992) von Escherichia coli angepasst. AQUI-1 enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Mfel (C*AATTG) und AQUI-2 für StuI (AGG*CCT).
10 μl PCR-Puffer (75 mM Tris/HCl, pH 9.0: 20 mM (NH4)2S04; 0.01 % (w/v) T een 20)
6 μl Mg2" [l ,5 mM] 8 μl dNTP's [je 200 μM] 1 μl AQUI-1 [0,5 μM] 1 μl AQUI-2 [0,5 μM)
1 μl pNCO-BS-LuSy (vgl. Beispiel 1) [10 ng]
1 μl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgien) 72 μl H2Obidest
Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp '"' PCR System 2400; Perkin Eimer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 5,0 min 95 °C
2. 0,5 min 94 °C
3. 0,5 min 50 °C
4. 0.5 min 72 °C
5. 5,0 min 72 °C
6. abkühlen auf 4 °C
Die Schritte 2. - 4. wurden 20 x wiederholt.
B) Der PCR-Ansatz wurde mittels Agarosegelelektrophorese (3 % Agarose) aufgetrennt, die DNA durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht und das Fragment mit einer Länge von 132 bp mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten. Die weitere Aufreinigung erfolgte gemäß Beispiel 1 B). C) 10 ng der isolierten DNA aus B) dienten anschließend als Matrize für eine 2. PCR mit den Oligonukleotiden AQÜI-3 (5 ' act ctg gtt cgt gtt cca ggc tca tgg gaa ata ccg gtt gct gcg ggt gaa ctg gcg cgt aaa g 3'; Strangprimer) und AQUT-4 (5' cca agg tgt cag ctg taa taa cac ega agg tga tag gtt tac gta gtt eta atg aaa ggt teg ega ggc c 3 '; Gegenstrangprimer). Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codonverwendung für stark exprimierte Gene (Grosjean und Fiers, 1982; Ikemura. 1981 ; Wada et al. 1992) von Escherichia coli angepasst. AQUI-3 enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Agel (A*CCGGT) und AQUI-4 für SnaBI (TAC*GTA) und PvuII (CAG*CTG). Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.
D) Das Produkt aus C) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 219 bp erhalten.
E) 10 ng der isolierten DNA aus D) dienten anschließend als Matrize für eine 3. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-5 (5 ' gga ggg tgc aat tga ttg cat agt ccg tca tgg egg ccg tga aga aga cat tac tet ggt teg tgt tcc agg c 3 '; Strangprimer) und AQUI-6 (5 ' gtt gcc gtg ttt tgt gcc ggc gcg etc gat agc ctg ttc caa ggt gtc agc tgt aat aac 3 '; Gegenstrangprimer). Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codonverwendung (für stark exprimierte Gene) von Escherichia coli angepasst. AQUI-5 enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Eagl (C*GGCCG) und AQUI-6 für BssHII (G*CGCGC) und PvuII (CAG*CTG). Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.
F) Das Produkt aus E) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 309 bp erhalten.
G) 10 ng der isolierten DNA aus F) dienten anschließend als Matrize für eine 4. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-7 (5 ' egg tat cgt agc atc acg ttt taa tca tgc tet tgt ega ccg tet ggt gga ggg tgc aat tga ttg cat ag 3 '; Strangprimer) und AQUI-8 (5' gaa taa gtt tgc cat ttc aat ggc aga aag cgc tgc ttc cca acc ttt gtt gcc gtg ttt tgt gcc ggc 3 '; Gegenstrangprimer). Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codonverwendung (für stark exprimierte Gene) von Escherichia coli angepasst. AQUI-7 enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Sall (G*TCGAC) und AQUI-8 für Eco47III (AGC*GCT). Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.
H) Das Produkt aus G) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 405 bp erhalten. I) 10 ng der isolierten DNA aus H) dienten anschließend als Matrize für eine 5. PCR mit den
Oligonukleotiden AQUI-9 (5 ' atg caa atc tac aa ggt aaa eta act gct gaa ggc ctt cgt ttc ggt atc gta gca tca cgt ttt aat c 3 ': Strangprimer) und AQUI-10 (5 ' tat tat gga tcc tta teg gag aga ctt gaa taa gtt tgc cat ttc aat gg 3 '; Gegenstrangprimer). Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codonverwendung (für stark exprimierte Gene) von Escherichia coli angepasst. AQUI-9 vervollständigt das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus und enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease StuI (AGG*CCT). Das Oligonukleotid AQUI-10. welches am 3 '-Ende zum Gen der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus komplementär ist. führt unmittelbar hinter dem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Endonuklease BamHI (G*GATCC) ein. Die Polymerase- Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.
J) Das Produkt aus I) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 476 bp erhalten.
K) 10 ng der isolierten DNA aus J) dienten anschließend als Matrize für eine 6. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-1 1 (5 ' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg caa atc tac gaa ggt aaa eta ac 3 '; Strangprimer) und AQUI-10 (Gegenstrangprimer). Das Oligonukleotid AQUI-1 1 ist am 3 '-Ende zum 5 '-Ende des synthetischen Gens für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus komplementär. Am 5 '-Ende führt es eine ribosomale Bindungsstelle und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI vor dem Startcodon ein. Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.
L) Das Produkt aus K) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 510 bp erhalten.
M) Die weitere Verarbeitung des DNA-Fragmentes aus L) erfolgte wie unter Beispiel 1 E)-G) wobei das Plasmid pNCO-AA-LuSy erhalten wαirde.
N) Anschließend wurden die Schritte H)-M) gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-AA-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 16.7 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne das betreffende Plasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca 20 % bezogen auf alle löslichen Proteine.
O) Die Übeφrüfung der Funktionalität erfolgte gemäß Beispiel 1 N). Das Protein zeigte eine optimale Aktivität im Bereich von 80 - 90 °C.
P) Die Negativkontrastierung erfolgte gemäß Beispiel 1 P) und zeigte hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm. Q) Die Reinigung des Proteins erfolgte in zwei Schritten: Die Kultivierung des Escherichia coli Stammes XL l -pNCO-AA-LuSy erfolgte gemäß Beispiel 1 K), jedoch in einem Volumen von 1 1. Der Aufschluß erfolgte gemäß Beispiel 1 R). Der klare Überstand wurde anschließend im Wasserbad 20 min bei 90 °C inkubiert. Die Suspension wurde anschließend zentrifügiert (Sorvall SS34-Rotor: 15000 Umin" 1; 4 °C; 30 min). Mit diesem Schritt konnte eine Anreicherung des Zielproteins um Faktor 4 erreicht werden (abgeschätzt von SDS- PAGE). Die weitere Reinigung erfolgte gemäß Beispiel 2 S) unter Verwendung des Überstandes nach der Zentrifugation und einer Gelfiltrationssäule.
R) Die Übeφrüfüng der Quartärstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1 S) und ergab ein mit der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis vergleichbares Ergebnis.
Beispiel 21
Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus
A) Das Gen für die synthetische Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und AQUI-C-Notl (5 ' tat tat tat agc ggc cgc teg gag aga ctt gaa taa g 3 ') aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy (siehe Beispiel 20) amplifiziert. Das Oligonukleotid AQUI-C-Notl ist an seinem 3 '-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase und führt unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Notl (GC*GGCCGC) ein. Diese Erkennungssequenz wird in drei Alaninmoleküle translatiert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A).
B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 513 bp erhalten wurde, gereinigt.
C) Das gereinigte DNA-Fragment aus B) wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl analog Beispiel 8 F) verdaut und anschließend gemäß Beispiel 1 B) gereinigt.
D) Das gereinigte DNA-Fragment aus C) wurde analog Beispiel 8 H) mit der Restriktionsendonuklease EcoRI behandelt und ein Fragment mit der Länge von 498 bp erhalten.
E) 5 μg des Expressionsplasmids pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (Beispiel 14) in einem Volumen von 30 μl wurden analog Beispiel 8 G) und H) behandelt. Das DNA-Fragment mit einer Länge von 3437 bp wurde isoliert und gereinigt. F) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis L). wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL\-pNCO-C-Biotag-AA-LuSy erhalten wurde.
G) Bei der Übeφrüfüng der Funktionalität der Lumazinsynthase gemäß Beispiel 1 N) konnte nur eine enzymatische Aktivität, die der Aktivität des Escherichia coli Stammes XL1 entsprach, ermittelt werden.
H) Die Übeφrüfüng der Expressionsrate bzw. der Größe der löslichen Proteine wurde analog Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-C-Biotag-AA-LuSy konnte keine signifikante Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,5 kDa beobachtet werden, die in einem Nergleichsstamm ohne pΝCO-C-Biotag-AA-LuSy-Expres- sionsplasmid nicht zu sehen war.
I) Die weitere Nerarbeitung erfolgte analog Beispiel 14 H) bis M). Es konnte ein vergleichbares Ergebnis erzielt werden.
Beispiel 22
Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, über einen Linker bestehend aus der Aminosäurenfolge H-H-H-H-H-H-A-A-A an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus
A) Das Gen für die synthetische Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde analog Beispiel 21 unter Nerwendung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und AQUI-C-HISή-Νotl (5' tat tat tat agc ggc cgc atg gtg gtg atg gtg atg teg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3 ') aus dem Plasmid pΝCO-AA-LuSy (siehe Beispiel 20) amplifiziert. Das Oligonukleotid AQUI-C-HISö-Νotl ist an seinem 3 '- Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase und führt unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase eine Sequenz, kodierend für 6 Histidinmoleküle und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Νotl (GC*GGCCGC) ein. Diese Erkennungssequenz wird in drei Alaninmoleküle translatiert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A).
B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B). wobei ein DΝA-Fragment mit einer Länge von 531 bp erhalten wurde, gereinigt.
C) Das gereinigte DΝA-Fragment aus B) wurde mit der Restriktionsendonuklease Νotl analog Beispiel 8 F) verdaut und anschließend gemäß Beispiel 1 B) gereinigt.
D) Das gereinigte DΝA-Fragment aus C) wurde analog Beispiel 8 H) mit der Restriktionsendonuklease EcoRI behandelt und ein Fragment mit der Länge von 516 bp erhalten. E) Der Expressionsvektor wαirde gemäß Beispiel 21 E) vorbereitet.
F) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis J), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XLl-pNCO-HIS6-C-Biotag-AA-LuSy erhalten wurde.
G) Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Beispiel 1 R). Nach der Zentrifugation wurde der klare Überstand verworfen und mit dem verbliebenen Rückstand weitergearbeitet.
H) Der unlösliche Rückstand aus G) wurde in 50 ml NTA-Puffer A (50 mM Na-Phosphat- Puffer pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,02 % Na-Azid. 6 M Guanidiniumhydrochlorid) während 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor, 15000 Umin" 1, 20 °C. 20 min). Der Überstand wurde dekantiert und mit 6 ml Ni-NTA-Agarose (Quiagen, Hilden) versetzt und über Nacht unter umschwenken inkubiert (20 °C). Anschließend wurde die Suspension einer Zentrifugation unterworfen (800 g, 20 °C, 10 min). Der Überstand wurde dekantiert. Der Rückstand wurde in 10 ml NTA-Puffer-A aufgenommen und 15 min unter umschwenken bei 20 °C inkubiert. Nach Zentrifugation (s.o.) und Abnahme des Überstandes wurde der Rückstand in 10 ml NTA- Puffer-B (8 M Harnstoff, 100 mM Na-Phosphat-Puffer, 10 mM Tris pH 6.3) für 15 min bei 20 °C inkubiert und weiterverarbeitet (s.o.). Der Vorgang wurde ein zweites Mal wiederholt. Anschließend wurde der Rückstand zweimal mit je 10 ml NTA-Puffer-C (8 M Harnstoff, 100 mM Na-Phosphat-Puffer. 10 mM Tris pH 5,9) behandelt. Zum Schluß wurde der Rückstand zweimal mit je 10 ml NTA-Puffer-D (8 M Harnstoff, 100 mM Na- Phosphat-Puffer, 10 mM Tris pH 4.5) gewaschen. Die Verunreinigungen konnten mit NTA-Puffer-B entfernt werden, das Zielprotein wαirde mit NTA-Puffer-C bzw. D eluiert. Auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (nach Neutralisation) gemäß Beispiel 1 M) konnte nur noch eine singuläre Bande bei 19,3 kDa beobachtet werden.
Beispiel 23
Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, über einen Linker bestehend aus den Aminosäuren H-H-H-H-H-H-G-G-S-G-A-A-A an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus
A) Das Gen für die synthetische Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde analog Beispiel 21 unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und AOUI-C-HISg-GLY2-SER-GLY-NotI (5' tat tat tat agc ggc cgc gcc aga acc gcc atg gtg gtg atg gtg atg teg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3 ') aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy (siehe Beispiel 20) amplifiziert. Das Oligonukleotid AQUI- C-HIS6-GLY2-SER-GLY-NotI ist an seinem 3 '-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase, führt unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase eine Sequenz, kodierend für für das Peptid H-H-H-H-H-H-G-G-S-G, und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Notl (GC*GGCCGC) ein. Diese Erkennungssequenz wird in drei Alaninmoleküle translatiert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A).
B) Der PCR-Ansatz wαirde gemäß Beispiel 1 B). wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 543 bp erhalten wurde, gereinigt.
C) Das gereinigte DNA-Fragment aus B) wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl analog Beispiel 8 F) verdaut und anschließend gemäß Beispiel 1 B) gereinigt.
D) Das gereinigte DNA-Fragment aus C) wurde analog Beispiel 8 H) mit der Restriktionsendonuklease EcoRI behandelt und ein Fragment mit der Länge von 528 bp erhalten.
E) Der Expressionsvektor wurde gemäß Beispiel 21 E) vorbereitet.
F) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XLl-pNCO-HIS6-GLY2-SER-GLY-C-Biotag-AA-LuSy erhalten wurde.
G) Die weitere Verarbeitung erfolgte gemäß Beispiel 22 G) bis H) wobei ein vergleichbares Ergebnis erzielt wurde.
Beispiel 24
Herstellung eines Chimären Proteins bestehend aus einem Teil der Lumazinsynthase aus
Bacillus subtilis und einem Teil der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus
A) Ein Teil des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtils wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und BS-LuSv-Agel (5' tat tat tat aac egg tat ttc aaa tgc gcc 3 ') aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (siehe Beispiel 1) amplifiziert. Das Oligonukleotid BS-LuSy- Agel ist an seinem 3 '-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase und führt eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Agel (A*CCGGT) in die DNA- Sequenz ein. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1 A). B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1 B). wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 225 bp erhalten wurde, gereinigt. Das gereinigte DNA-Fragment aus B) wurde mit der Restriktionsendonuklease Agel verdaut.
30,0 μl DNA-Fragmente aus C) 4,0 μl Agel [8 U]
10,0 μl Puffer 1 ( 10 X) [ 10 mM Bis-Tπs-Propane-HCl. 10 mM MgCl2, 1 mM DTT. pH 7,0]
56,0 μl H2Obιdest
Der Ansatz wurde 180 min bei 25 °C inkubiert und wie unter B) beschrieben gereinigt und zum Verdau mit der Restriktionsendonuklease EcoRI eingesetzt.
C) Verdau des gereinigten Fragmentes aus B) mit der Restriktionsendonuklease EcoRI.
30,0 μl DNA-Fragment aus B) 3,0 μl EcoRI [60 U]
20,0 μl OPAU (10 x) Der Ansatz wurde 180 min bei 37 °C inkubiert und das entstanden DNA-Fragment wie unter Beispiel 1 B) beschrieben gereinigt.
D) Das Plasmid PNCO-AA-LuSy (30 μl, 5 μg] wurde analog B) und C) behandelt und anschließend gemäß Beispiel 1 B) gereinigt, wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 3676 bp erhalten wurde.
E) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1 E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1 -pNCO-BS-LuSy-Agel-AA-LuSy erhalten wurde.
F) Bei der Übeφrüfüng der Funktionalität der Lumazinsynthase gemäß Beispiel 1 N) konnte eine enzymatische Aktivität ermittelt werden.
G) Die Übeφrüfüng der Expressionsrate bzw. der Größe der löslichen Proteine wurde analog Beispiel 1 M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1- pNCO-BS-LuSy-Agel-AA- LuSy konnte eine signifikante Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 16,4 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-BS-LuSy-Agel-AA-LuSy Expressionsplasmid nicht zu sehen war.
Beispiel 25
Herstellung eines Vektors zur rekombinanten N-terminalen Fusion von Fremdpeptiden an die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus (Fremdpeptide können auch ohne Linker direkt an das Trägerprotein fusioniert werden; hierfür wird die singuläre Restriktionsschnittstelle Bglll verwendet, die sich in der Sequenz des Trägerproteins befindet)
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde mit den Oligonukleotiden AQUI-1 1 -Bglll (5 ' ata ata gaa ttc att aaa ag gag aaa tta act atg cag atc tac gaa gg 3 '), welches am 3 '-Ende teilweise komplementär zum 5 '-Ende der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus ist, wobei durch eine stille Mutation eine singuläre Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Bglll (A*GATCT) eingeführt wird und am 5 '-Ende eine ribosomale Bindungsstelle und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI einführt, und AQUI-10 (siehe Beispiel 20 I)) aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy amplifiziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1 A) durchgeführt.
B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 510 bp erhalten wurde.
C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1 B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO-AA-Bglll-LuSy erhalten.
D) Die Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges erfolgte analog Beispiel 1 M). Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-AA-Bglll-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 16,7 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-AA-Bglll-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 20 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
E) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 20 O) bis R) durchgeführt, wobei keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (AA-LuSy) zu beobachten waren.
Beispiel 26
Herstellung eines Vektors zur C-terminalen Fusion von Fremdpeptiden an die
Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und AQUI-lOJBamHI) (5 ' tat tat gga tcc teg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3 '), welches am 3 '-Ende komplementär zum 3 '-Ende der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett eine singuläre Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI (G*GATCC) einführt (das, in der ursprünglichen Sequenz enthaltene Stopcodon wird aufgelöst: als neues Stopcodon dient ein. in der Vektorsequenz vorhandenes Stopcodon), aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy amplifiziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1 A) durchgeführt.
B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 507 bp erhalten wurde.
C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1 B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO-AA-LuSy-(BamHI) erhalten.
D) Die Übeφrüfüng der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges erfolgte analog Beispiel 1 M). Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-AA-LuSy-(BamHI) konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,8 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-AA-LuSy-(BamHI)- Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 20 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).
E) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 20 O) bis R) durchgeführt, wobei keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (AA-LuSy) zu beobachten waren.
Beispiel 27
Herstellung eines Vektors zur gleichzeitigen N- und C-terminalen Fusion von
Fremdpeptiden an die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus
A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und AQUI-lO-(BamHI) (siehe Beispiel 26), aus dem Plasmid pNCO-AA-Bglll-LuSy amplifiziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1 A) durchgeführt.
B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1 B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 507 bp erhalten wurde.
C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1 B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO-AA-BglII-LuSy-(BamE[I) erhalten.
D) Die Übeφrüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges erfolgte analog Beispiel 1 M). Im Rohextrakt des Stammes XLl-pNCO-AA-Bglll-LuSy- (BamHI) konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,8 kDa beobachtet werden, die in einem Nergleichsstamm ohne pΝCO-AA-BglII-LuSy-(BamHI)- Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 20 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt). E) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 20 0) bis R) durchgeführt, wobei keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (AA-LuSy) zu beobachten waren. Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Protein-Konjugat, bestehend aus mindestens einem Funktionsbereich an einer beliebigen Position der Sequenz eines Trägerproteinbereichs zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ, so daß deren Außenperipherie mit einer Vielzahl dieser Funktionsbereiche kovalent verknüpft ist.
2. Rekombinant herstellbares Protein-Konjugat, bestehend aus mindestens einem Funktionsproteinbereich am N-Terminus und/oder C-Terminus und/oder inseriert in eine Sch leifen reg ion der Seq uenz eines Trägerproteinbereichs zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ, so daß deren Außenperipherie mit einer Vielzahl der Funktionsproteinbereiche kovalent verknüpft ist.
3. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich eine Aminosäuresequenz - ausgewählt aus einer Sequenzmenge - aufweist, die sich dadurch ergibt, daß man für jede Aminosäureposition in der Sequenz einer vorbestimmten nativen Lumazinsynthase eine Am inosäure oder eine Deletion aus der entsprechenden Position ei nes Alig nments der vorbestim mten Lumazinsynthase-Sequenz mit mindestens einer nativen Lumazinsynthase- Sequenz eines anderen Organismus auswählt.
4. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich die Sequenz einer nativen Lumazinsynthase aufweist.
5. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich d ie Sequenz einer thermostabi len nativen Lumazinsynthase aufweist.
6. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß die thermostabile native Lumazinsynthase d ie Proteinseq uenz der Lumazinsynthase aus einem hyperthermophilen Mikroorganismus, insbesonders aus Aquifex aeolicus aufweist.
7. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich aus einer Mischsequenz bestehend aus den Aminosäurenpositionen 1 - 60 der nativen Lumazinsynthase aus einem mesophilen Organismus, bezogen auf Bacillus subtilis, und den Aminosäurenpositionen 61 - 154 der nativen Lumazinsynthase aus einem hyperthermophilen Mikroorganismus, bezogen auf Aquifex aeolicus, aufgebaut ist.
8. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich aus einer beliebigen Sequenz besteht, wobei die Hauptkette dieser Sequenz in α-Helix und ß-Faltblatt-Motiven faltet, wobei 4 ß-Segmente ein paralleles, zentrales 4-strängiges ß-Faltblatt bilden und wobei das zentrale 4-strängige ß-Faltblatt auf beiden Seiten von jeweils 2 α- Helices flankiert wird, so daß sich 5 Einheiten dieser α-ßMotive zu einer pentameren Struktur zusammenlagern, wobei der N-Terminus einer jeden Einheit in der benachbarten Einheit das fünfte ß-Segment zum zentralen 4- strängigen ß-Faltblatt bilden kann , wobei 12 dieser pentameren Unterstrukturen sich zusammenlagen und die ikosaedrische Struktur einer Lumazinsynthase bilden und die N- und C-Termini der beliebigen Sequenz mit den oben beschriebenen Strukturmerkmalen sich an der Oberfläche des gebildeten Ikosaeders befinden, und wobei die beliebige Sequenz vorzugsweise aus dem Vergleich einer Sequenzmenge verschiedener, d.h. aus verschiedenen Organismen stammenden Lumazinsynthasesequenzen, insbesondere unter Verwendung von Suchalgorithmen nach Altschul et al. (1997), gewonnen werden.
9. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich eine Sequenz einer nativen Lumazinsynthase aufweist, bei der mindestens eine Cysteineinheit durch eine andere Aminosäure ausgetauscht oder deletiert ist oder chemisch modifiziert ist.
10. Protein-Konjugat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cysteineinheit an einer der Position 93 und/oder der Position 139 der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis entsprechenden Position deletiert ist oder gegen eine andere Aminosäure, vorzugsweise Serin, ausgetauscht ist.
11. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch g e ke n n ze i c h n e t , d a ß d e r T rä g e rp rote i n b e re i c h u n d d e r Funktionsproteinbereich über ein Linkerpeptid miteinander verknüpft sind.
12. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Funktionsproteinbereich die Sequenz einer Dihydrofolatreduktase, eines Maltose-bindenden Proteins, eines in vivo biotinylierbaren Peptids, eines Antigen-wirksamen Peptids, insbesondere aus einem Oberflächenprotein eines Virus, eines durch einen monoklonalen Antikörper erkennbaren Peptids, eines zufällig generierten Peptids, oder eine chemisch derivatisierbare Aminosäure, beispielsweise Cystein oder Lysin ist.
13. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich chemisch modifiziert ist.
14. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Funktionsproteinbereich chemisch modifiziert, vorzugsweise biotinyliert ist.
15. Heterooligomeres Protein-Konjugat bestehend aus Mischungen von mindestens zwei unterschiedlichen Protein-Konjugaten nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder von mindestens einem Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und mindestens einem Trägerproteinbereich ohne Funktionsproteinbereich mit einer Sequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die einzelnen Proteine gegebenfalls durch chemische Behandlung miteinander kovalent verknüpft sind.
16. Verfahren zur Herstellung eines Protein-Konjugats nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch die folgenden Schritte, a) Isolierung einer Lumazinsynthase aus einem Wild-Typ oder einem rekombinanten Organismus (Trägerprotein); b) Chemische Kopplung von Funktionsmolekülen an das Trägerprotein; c) Reinigung des Protein-Konjugats.
17. Verfahren zur Herstellung eines Protein-Konjugats oder eines heterooligomeren Proteins nach einem der Ansprüche 2 bis 14, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte, a) Herstellung einer ersten DNA, die für den Trägerproteinbereich kodiert; b) das Fusionieren von mindestens einer zweiten DNA, die für den Funktionsbereich und gegebenenfalls für das Linkerprotein kodiert mit dem 5'- Ende und/oder dem 3'-Ende der ersten DNA und/oder Inserieren der zweiten DNA in einem für eine Schleifenregion des Trägerproteinbereichs kodierenden Region der ersten DNA unter Bildung einer artefiziellen DNA.; c) Umwandlung der artefiziellen DNA der Stufe b) in ein Expressionsplasmid; d) Transformation von Wirtszellen mit einem oder mehreren der in Stufe c) erhaltenen Expressionspiasmiden; e) Expression der artefiziellen DNA in den transformierten Wirtszellen unter Bildung eines Proteinkonjugats, gegebenenfalls unter der Einführung einer vorbestimmten posttransiationaien Modifikation des Protein-Konjugats in vivo, vorzugsweise durch Phosphorylierung, Glycosylierung oder Biotinylierung; f) Reinigung des Protein-Konjugats; g) gegebenenfalls Modifizierung des Protein-Konjugats durch chemische Kopplung von Aminosäurenresten auf der Proteinoberfiäche einer aus dem Protein-Konjugat gebildeten Kapsid-Raumstruktur mit frei bestimmbaren Kopplungspartnern.
18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man ein heterooiigomeres Protein herstellt durch a) Mischen verschiedener, gemäß Anspruch 16, Stufe c) und/oder Anspruch 17, Stufe f) gewonnener Protein-Konjugate; b) Denaturierung der erhaltenen Mischung und c) Renaturierung der Mischung; oder durch a2) Denaturierung verschiedener, gemäß Anspruch 16, Stufe c) und/oder Anspruch 17, Stufe i) gewonnener Protein-Konjugate, b2) Mischung der denaturierten Protein-Konjugate , c2) Renaturierung der Mischung.
19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein- Konjugate einsetzt, die unter Verwendung eines faltungsunterstützenden Liganden hergestellt wurden.
20. Vektoren zur Herstellung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 2 bis 14.
21. DNA, die für ein Protein gemäß Anspruch 20 kodiert.
22. Protein, bestehend aus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, gekennzeichnet dadurch, daß die Aminosäure Cystein an Position 93 gegen die Aminosäure Serin ausgetauscht ist.
23. Protein, bestehend aus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtiiis, gekennzeichnet dadurch, daß die Aminosäure Cystein an Position 139 gegen die Aminosäure Serin ausgetauscht ist.
24. Protein, bestehend aus der Lumazinsynthase aus Baciilus subtilis, gekennzeichnet dadurch, daß die Aminosäure Cystein an den Positionen 93 und 139 gegen die Aminosäure Serin ausgetauscht ist.
25. An die Kodon-Verwendung von Escherichia coli angepasste DNA zur Herstellung der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus in einem rekombinanten Escheπchia coli - Stamm.
26. Protein, bestehend aus der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus, zur Verwendung als Trägerprotein gemäß Anspruch 1.
27. Chimäres Protein , bestehend aus den Aminosäuren 1 -60 der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis und den Aminosäuren 61-154 der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus, zur Verwendung als Trägerprotein gemäß Anspruch 1.
28. Vektor zur Herstellung von Protein-Konjugaten nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 5'-Ende des Trägerproteingens vom Lumazinsynthase-Typs befindet, wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich, einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ und optional ein Linkerpeptid enthält, und wobei der Funktionsproteinbereich und das Linkerpeptid sich am N-Terminus des Trägerproteinbereichs befinden, und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) ein DNA-Fragment, kodierend für einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ ; b ) e i n D NA- F rag m e n t , k od i e re n d f ü r e i n e n b e l ie b i g e n Funktionsproteinbereich; c) optional: ein DNA-Fragment kodierend für ein Linkerpeptid.
29. Ein Vektor nach Anspruch 28, gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, kod ierend für den Trägerproteinbereich, das Gen für die Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli, kodierend für den Funktionsproteinbereich und als Linkerpeptid ein DNA- Fragment kodierend für ein Tripeptid bestehend aus der Aminosäure Alanin enthält.
30. Ein Vektor nach Anspruch 28, gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, kodierend für den Trägerproteinbereich, das Gen für das 'Maltose bindende Protein' aus Escherichia coli, kodierend für den Funktionsproteinbereich und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment, kodierend für die Aminosäurensequenz SNNNNNNNNNNLGIEGRISEFAAA enthält.
31. Vektor zur Herstellung von Protein-Konjugaten nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 3'-Ende des Trägerproteingens vom Lumazinsynthase-Typs befindet, und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich, einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ, und optional ein Linkerpeptid enthält, und wobei der Funktionsproteinbereich und das Linkerpeptid sich am C-Terminus des Trägerproteinbereichs befindet, und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) ein DNA-Fragment, kodierend für einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ (jeweils ohne Stop-Codon); b) ein DNA-Fragment, kodierend für einen beliebigen Funktionsproteinbereich; c) optional: ein DNA-Fragment kodierend für ein Linkerpeptid.
32. Vektor nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, kodierend für den Trägerproteinbereich, das Gen für die Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli, kodierend für den Funktionsproteinbereich und als Linkerpeptid ein DNA- Fragment kodierend für die Aminosäuresequenz LAAAGGGG enthält.
33. Vektor nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus (gemäß Anspruch 25) kodierend für den Trägerproteinbereich und ein Genfragment, kodierend für den Funktionsproteinbereich mit der Aminosäuresequenz GSVDLQPSLIS enthält. Der Vektor verfügt über eine singuläre Erkennungssequenz am 5'-Ende der Gensequenz des Trägerproteins für die Restriktionsendonuklease Bglll, wobei diese Schnittstelle für eine Fusion von Fremdgenen an das 5'-Ende der Lumazinsynthase genutzt werden kann.
34. Vektor zur Herstellung von Protein-Konjugaten nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteii am 3 '-Ende des Trägerproteingens vom Lumazinsynthase-Typs befindet, wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich, einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ, und optional ein Linkerpeptid enthält, und wobei der Funktionsproteinbereich und das Linkerpeptid sich am C-Terminus des Trägerproteinbereichs befindet, und wobei der Funktionsproteinbereich in vivo biotinyliert wird und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) ein DNA-Fragment, kodierend für einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ (jeweils ohne Stop-Codon); b) ein DNA-Fragment kodierend für ein biotinylierbares Peptid mit der Sequenz LGGIFEAMKMEWR, wobei die Aminosäure Lysin in vivo biotinyliert wird; c) optional: ein DNA-Fragment, kodierend für ein Linkerpeptid.
35. Ein Vektor nach Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase a us Bacillus subtilis, kod ierend für den Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment, kodierend für ein Tripeptid bestehend aus der Aminosäure Alanin enthält.
36. Ein Vektor nach Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß er das an die Kodon-Verwendung von Escherichia coli angepasste Gen, kodierend für die Lumazinsynthase a us Aquifex aeolicus nach Anspruch 25 als Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment, kodierend für ein Tripeptid bestehend aus der Aminosäure Alanin enthält.
37. Ein Vektor nach Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß er das an die Kodon-Verwendung von Escherichia coli angepasste Gen, kodierend für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus nach Ansp ruch 25 als Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment, kodierend für Peptid, bestehend aus der Aminosäurensequenz HHHAAA enthält.
38. Ein Vektor nach Anspruch 34 gekennzeichnet dadurch, daß er das an die Kodon-Verwendung von Escheπchia coli angepasste Gen, kodierend für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus nach Anspruch 25 als Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment, kodierend für Peptid, bestehend aus der Aminosäurensequenz HHHHHHGGSGAAA enthält.
39. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions- DNA-Anteil für ein antigen wi rksames Peptid a u s d em VP2- Oberflächenprotein des 'Mink enteritis Virus' kodiert und das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinanteil und einen Trägerproteinanteil enthält und wobei der Funktionsproteinanteil sich am N-Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis; b) Peptidkodierende DNA am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz MGDGAVQPDGGQPAVRNER
40. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions- D NA-Antei l fü r ei n antigen wirksames Peptid a us dem VP2- Oberflächenprotein des 'Mink enteritis Virus1 kodiert und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinanteil und einen Trägerproteinanteil enthält, wobei der Funktionsproteinanteil sich am C-Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis (ohne Stop-Codon), b) Peptidkodierende DNA am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz GDGAVQPDGGQPAVRNER.
41. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 5'-Ende und am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet und der Funktions-DNA-Anteii für ein antigen wirksames Peptid aus dem VP2- Oberflächenprotein des 'Mink enteritis Virus' kodiert und das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinanteil und einen Trägerproteinanteil enthält, und wobei der Funktionsproteinanteil sich sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis (ohne Stop-Codon). b) Zwei peptidkodierende Sequenzen am 5'- und am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Peptid am N-Terminus besitzt die Sequenz MGDGAVQPDGGQPAVRNER, das Peptid am C-Terminus die Sequenz GDGAVQPDGGQPAVRNER.
42. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet und der Funktions- DNA-Anteil für ein Oktapeptid (FLAG-Peptid) kodiert, welches durch einen monoklonalen Antikörper (vorzugsweise Anti-FLAG-M2; IBI E.coli FLAG® Expression System, Integra Biosciences, Fernwald) erkannt wird, wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält und wobei sich der Funktionsproteinbereich am N-Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis; b) Peptidkodierende DNA am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz MDYKDDDDK; c) DNA, kodierend für ein Linkerpeptid mit der Sequenz VKL.
43. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions- DNA-Anteil für ein Hexapeptid (His-6Peptid) kodiert, welches durch einen monoklonalen Antikörper (vorzugsweise Penta-His™ Antibody; Quiagen, Hilden) erkannt wird, und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält, und wobei der Funktionsproteinbereich sich am C-Terminus der Lumazinsynthase befindet, und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis ohne Stopkodon. b) Peptidkodierende DNA am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz HHHHHH.
44. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions- DNA-Bereich für eine artefizielle Peptidsequenz kodiert, die mit der Aminosäure Lysin endet, wobei die Aminosäure Lysin zur chemischen Kopplung von Funktionsmolekülen an den Trägerproteinbereich verwendet werden (vgl. Anspruch 16 b) kann, und wobei der Funktionsproteinbereich als Linker (Tentakel-Linker) dient, und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält, wobei der Funktionsproteinbereich sich am C- Terminus des Trägerproteinbereichs befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis. b) Kodon für Lysin (aaa) am 3'-Ende der artefiziellen DNA. c) DNA kodierend für ein Linkerpeptid mit der Sequenz GGGGSGGGSG.
45. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions- DNA-Bereich für eine artefizielle Peptidsequenz kodiert, die mit der Aminosäure Cystein endet, wobei die Aminosäure Cystein zur chemischen Kopplung von Funktionsmolekülen an den Trägerproteinbereich verwendet werden (vgl. Anspruch 16 b) kann, wobei der Funktionsproteinbereich als Linker (Tentakel-Linker) dient, und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält und wobei der Funktionsproteinbereich sich am C-Terminus des Trägetproteinbereichs befindet, und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält: a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis (ohne Stop-Codon). b) Kodon für Cystein (tgc) am 3'-Ende der artefiziellen DNA. c) DNA kodierend für ein Linkerpeptid mit der Sequenz GGGGSGGGSGGG.
46. Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Anwendung als Arzneistoff oder Impfstoff.
47. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels oder eines Impfstoffs.
48. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung von diagnostisch oder therapeutisch verwendbaren Antikörpern.
49. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur selektiven Detektion von Antikörpern oder zur Reinigung von Antiköpergemischen oder zur Charakterisierung von Antikörpern.
50. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung von Proteinbibliotheken.
51. Arzneimittel, enthaltend eine pharmakologisch wirksame Menge eines Protein-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
52. Impfstoff, enthaltend eine immunologisch wirksame Menge eines Protein- Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
53. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Biosensor.
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