CN116949005A - 应用岩藻糖基转移酶生产2’-岩藻糖基乳糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了应用岩藻糖基转移酶生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，属于微生物发酵工程领域。本发明提供了从云南热泉环境所获取的微生物基因资源库中筛选的α‑1,2的岩藻糖基转移酶及其编码基因，利用基因重组技术，将α‑1,2岩藻糖基转移酶的编码基因在大肠杆菌BW25113中异源表达，所获得的基因工程菌可用于2’‑岩藻糖基乳糖的发酵生产。本发明所筛选的α‑1,2岩藻糖基转移酶具有良好的热稳定性，在2’‑岩藻糖基乳糖的发酵生产等应用中具有很大的潜力。

Description

应用岩藻糖基转移酶生产2’-岩藻糖基乳糖的方法
技术领域
本发明涉及应用岩藻糖基转移酶生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，属于微生物发酵工程领域。
背景技术
母乳是新生婴儿重要的营养来源，它含有多种有益成分。母乳低聚糖(HMO)是母乳中独特的哺乳动物低聚糖，也是含量第三丰富的成分(5-15g/L)，仅次于乳糖(70g/L)和脂质(40g/L)，对婴幼儿的健康成长和发育有重要的作用。越来越多的证据表明，母乳低聚糖(HMO)可能是母乳能有良好功效的关键因子，可介导细胞之间的通讯过程，如细胞识别、肿瘤发现和病原体粘附。此外，HMO衍生的相关物质，特别是大脑中大量存在的岩藻糖基和半乳糖基部分，对大脑发育和认知具有重要意义。
鉴于HMO提供的不可替代的生理功能，婴儿配方奶粉和益生元市场对其的需求越来越大。迄今为止，已经鉴定出200多种不同的HMO，其中大约一半以上的HMO是岩藻糖基化的，主要包括2'-岩藻糖乳糖(2'-FL)、3'-岩藻糖乳糖(3'-FL)、乳糖-N-岩藻五糖(LNFP)和乳糖-N-二岩藻六糖(LNDFH)。2'-FL是一种由乳糖和岩藻糖通过一个α-(1,2)-键形成的三糖，是最丰富(占HMO总量的30％以上)、功能最重要的HMO之一。
目前，通过微生物发酵工程合成2'-FL已被证明优于酶法和化学合成法等，其具备生长周期短，操作简便，可大规模发酵等优势。2'-FL的微生物生产受多方面因素影响，异源表达具有高催化活性的α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FucTs)是关键的限速步骤。对于不同来源α-1,2-岩藻糖基转移酶的筛选在国内外屡见不鲜，常见如来自Helicobacterpylori的fucT2、大肠杆菌O126(WbgL)，它们具有用于供体-底物结合的高度保守基序I(HxRRxD)的排列氨基酸序列，这可能是相关底物催化活性的关键位点。但现有的文献专利对于α-1,2-岩藻糖基转移酶的热稳定性研究较少，一般认为，热稳定性高的酶会提高生产效率。因此，为了实现2'-FL工业化大规模生产，筛选活性高、热稳定性好的关键酶至关重要。
发明内容
[技术问题]
缺少2’-岩藻糖基乳糖产量高、热稳定性好的岩藻糖基转移酶。
[技术方案]
本发明披露了一种新型α-1,2-岩藻糖基转移酶，所述新型α-1,2-岩藻糖基转移酶是指从云南热泉环境所获取的微生物基因资源库中筛选得到的。构建α-1,2-岩藻糖基转移酶的表达质粒并转入敲除wcaJ、lacZ基因的宿主菌，培养所得重组菌使之以甘油和乳糖为底物获得了高产量的2’-岩藻糖基乳糖。
本发明的第一个目的是提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的新型α-1,2-岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.69)，命名为CP8899，来源为云南热泉环境所获取的微生物基因资源库。该新型α-1,2-岩藻糖基转移酶具有良好的热稳定性。
在本发明的一种实施方式中，编码新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述新型α-1,2-岩藻糖基转移酶来源于Mycobacterium sp.。
本发明的第二个目的是提供一种能够表达所述新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因工程菌，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ基因和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的底盘菌株包括但不限于大肠杆菌BW25113。
在本发明的一种实施方式中，所述敲除是使用CRISPR-Cas9方法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶基因lacZ的NCBI序列号为NP_4184878.1；所述UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ的NCBI序列号为NP_416551.1。
在本发明的一种实施方式中，以pBAD为表达载体，表达新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法是应用所述基因工程菌进行发酵生产。
将所述基因工程菌接种到无机盐培养基中，以甘油作为初始碳源，进行发酵生产。
在本发明的一种实施方式中，所述初始碳源的终浓度为10.0-30.0g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述无机盐培养基包括：甘油10.0-30.0g/L、KH2PO413.0g/L、(NH4)2PO44.0g/L、柠檬酸1.7g/L、MgSO4·7H2O 1.4g/L、CaCl2 0.1g/L、微量元素10mL/L[母液：10g/L Fe(III)citrate、2.25g/L ZnSO4·7H2O、1.0g/L CuSO4·5H2O、0.35g/L MnSO4·H2O、0.23g/L Na2B4O7·10H2O、0.11g/L(NH4)6Mo7O24、2.0g/L CaCl2·2H2O]，pH调节到7.0-7.2。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养条件为37℃，220rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵为分批补料方式。
在本发明的一种实施方式中，所述分批补料是指待所述初始碳源甘油消耗完全后，补充50％甘油和终浓度为5g/L的乳糖。
本发明的第四个目的是提供了新型α-1,2-岩藻糖基转移酶与表达新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因工程菌在生产2'-FL发酵生产中的应用。
[有益效果]
本发明提供了一种新型α-1,2-岩藻糖基转移酶CP8899，相比于现有α-1,2-岩藻糖基转移酶，具有良好的热稳定性。热稳定测试中，CP8899在42℃反应时，相对活性仅降低到83.2％。
本发明还提供了表达所述新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因工程菌，是以敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ基因和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ的大肠杆菌BW25113为表达宿主，以pBAD为表达载体表达了新型α-1,2-岩藻糖基转移酶。
本发明还提供了应用所述基因工程菌生产2’-FL的方法，以甘油为碳源培养所述基因工程菌72h时，2'-FL的产量可达11.2g/L，高于4.8g/L(幽门螺杆菌HPfucT2重组菌株)及5.1g/L(大肠杆菌O126 WbgL重组菌株)。将所述基因工程菌经5L发酵罐发酵，发酵85h后，2’-FL产量达到65.2g/L。
附图说明
图1为CP8899岩藻糖基转移酶的系统发育树分析；
图2为3个岩藻糖基转移酶的SDS-PAGE分析，包括上清液和不溶物部分；1：大肠杆菌pBAD-HPfucT2，上清液部分；2：大肠杆菌BW25113 pBAD-HPfucT2，不溶部分；3：大肠杆菌BW25113 pBAD-WbgL，上清液部分；4：大肠杆菌BW25113 pBAD-WbgL，不溶部分；5：大肠杆菌BW25113 pBAD-CP8899，上清液部分；6：大肠杆菌BW25113 pBAD-CP8899，不溶部分；
图3为不同来源的岩藻糖基转移酶产2'-FL量比较；
图4为CP8899、HpFucT2和WbgL3个岩藻糖基转移酶的热稳定性比较；
图5为CP8899酶在5L发酵罐上产2’-FL能力，其中包括OD600、乳糖、甘油和2’-FL随发酵时间的变化趋势。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明。
1.以下实施例中，如没有明确说明，质粒均采用大肠杆菌扩增。
2.以下实施例中，如没有明确说明，所使用的试剂和材料均为上海阿拉丁生化科技股份有限公司购入，基因合成和基因测序均是通过北京擎科生物科技股份有限公司获得。
3.本发明提供的岩藻糖基转移酶来源于云南热泉取样得到的微生物库，通过相关酶家族的绝对保守区域筛选得到。
4.以下实施例中，如没有明确说明，均采用摇瓶培养方式。其中，用于大肠杆菌活化的培养基为LB培养基，用于发酵的培养基为无机盐发酵培养基。
(1)LB培养基配方(g/L)：蛋白胨10.0，氯化钠10.0，酵母粉5.0
(2)无机盐发酵培养基配方：甘油10.0-30.0g/L、KH2PO4 13.0g/L、(NH4)2PO44.0g/L、柠檬酸1.7g/L、MgSO4·7H2O 1.4g/L、CaCl2 0.1g/L、微量元素10mL/L[母液：10g/L Fe(III)citrate、2.25g/L ZnSO4·7H2O、1.0g/L CuSO4·5H2O、0.35g/L MnSO4·H2O、0.23g/LNa2B4O7·10H2O、0.11g/L(NH4)6Mo7O24、2.0g/L CaCl2·2H2O]，pH调节到7.0-7.2，pH调节到7.0-7.2。
5.以下实施例中，HPLC联用ELSD检测条件：其中色谱柱型号为ZORBAXCarbohydrate(4.6×250mm 5-Micron)，洗脱液为乙腈/水(75：25)，上样量5μL，在35℃下以1.4ml/min流速洗脱15min。
实施例1
(1)酶的筛选和同源性比较
在云南热泉中所获取的微生物基因资源库中，根据岩藻糖基转移酶供体-底物结合的高度保守基序I(HxRRxD)的氨基酸序列进行筛选。HxRRxD的H(组氨酸)、R(精氨酸)和D(天冬氨酸)为相应氨基酸缩写，x为任意氨基酸。获得多条潜在的岩藻糖基转移酶序列，利用已有的生物信息学工具(如Alpha Fold等)对其进行活性预测，最终预测得到CP8899序列。将CP8899岩藻糖基转移酶的蛋白序列利用NCBI的BLAST功能进行序列同源性比对，挑选序列相似度高的10条序列下载，利用软件MEGA11建立系统发育树(图1)。对系统发育树分析，其中CP8899岩藻糖基转移酶与序列WP 267734534.1:2-244alpha-12-fucosyltransferase Mycobacterium sp.Aquia 213进化关系最近，故认为本实验筛选到的岩藻糖基转移酶来源于Mycobacterium sp.。
(2)3种岩藻糖基转移酶的表达质粒的构建
为了验证CP8899的催化功能，以目前文献中报道最多的两种岩藻糖基转移酶作为对照，分别是幽门螺旋杆菌来源的HpFut2(NCBI登录号：ARB16053.1)和大肠杆菌O126来源的WbgL(NCBI登录号：WP_000022655.1)。本发明所使用的岩藻糖基转移酶的DNA序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并通过同源重组的方法连接到pBAD载体。其中，CP8899基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)通过5-引物CP8899-F及3-引物CP8899-R扩增，HpFucT2基因通过5-引物HpFucT2-F及3-引物HpFucT2-R扩增，WbgL基因通过5-引物WbgL-F及3-引物WbgL-R扩增，利用5-引物pBAD-F及3-引物pBAD-R从pBAD扩增载体骨架(表1)。使用大肠杆菌TOP10或DH5α(商用)进行质粒构建宿主，分别构建质粒pBAD-HpFucT2、pBAD-WbgL、pBAD-CP8899。
表1质粒构建引物序列表
(3)利用CRISPR/Cas9技术敲除底盘菌株BW25113的相关基因
利用CRISPR/Cas9技术敲除BW25113的lacZ和wcaJ。具体操作步骤及引物序列如下：
①构建lacZ敲除的DonorDNA
以大肠杆菌BW25113(或其基因组)为模板，分别利用引物lacZ-UF/lacZ-UR和lacZ-DF/lacZ-DR扩增上下游同源臂，纯化回收后利用引物lacZ-UF/lacZ-DR进行重叠延伸PCR(overlap PCR)，根据测序结果判断是否获得条带大小及碱基正确的条带，回收获得lacZ敲除的Donor DNA。
②构建pTargetF-lacZ质粒
以pTargetF质粒为模板，利用引物pTF-lacZ-F/pTF-lacZ-R进行反向PCR，纯化回收后化转感受态细胞大肠杆菌TOP10或DH5α(商用)，37℃培养16h(或过夜培养)，挑取单菌落进行测序，测序正确的质粒即为pTargetF-lacZ质粒。
③构建带pCas9质粒的底盘细胞
将pCas9质粒通过电转化或化学转化法导入BW25113感受态细胞中，涂抹卡那霉素抗性平板，30℃培养，得到BW25113::pCas9电转感受态细胞。
④BW25113基因组敲除lacZ
加入200ng pTargetF-lacZ质粒及800ng DonorDNA，共转化BW25113::pCas9电转感受态细胞，30℃，200rpm复苏45-60min后，重悬，涂抹含有两种抗性的平板，30℃过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR，选择阳性结果送测，确定已敲除目的基因的菌株。
⑤工具质粒的丢失
将上述获得的正确的敲除子接种于卡那霉素LB培养基，加入0.5mM IPTG诱导，30℃过夜培养。稀释后涂抹卡那霉素抗性平板，挑取单菌落进行影印筛选(分别涂抹卡那霉素平板和卡那霉素、壮观霉素双抗性平板，30℃培养)，挑选在卡那霉素平板上生长且不在双抗平板上生长的菌株，该菌株即为已经丢失掉pTargetF-lacZ的菌株，可用于后续连续基因编辑，保存在甘油中，命名为BW25113ΔlacZ::pCas。
⑥丢失pCas质粒
将保存于甘油中的BW25113ΔlacZ::pCas菌株接种在无抗LB培养基，42℃过夜培养。稀释后涂抹于无抗平板(37℃培养)，挑取单菌落进行影印筛选(分别涂无抗平板和卡那平板，37℃培养)，挑选在无抗性平板上生长且不在卡那霉素平板上生长的菌株，该菌株即为已经丢失掉pCas9的菌株，此时已获得成功敲除目的基因且无抗性的底盘菌株，命名为BW25113ΔlacZ。
⑦为了获得符合预期的能同时利用甘油和葡萄糖的高产2′-岩藻糖基乳糖工程菌株，需要在BW25113ΔlacZ的基础上继续敲除wcaJ基因，获得产2′-岩藻糖基乳糖工程菌株BW25113ΔlacZΔwcaJ，敲除wcaJ基因具体步骤参考上述步骤①-⑥，涉及到的引物序列见表3。
表2敲除lacZ基因所用引物及核苷酸序列
表3.敲除wcaJ基因所用引物及核苷酸序列
(4)岩藻糖基转移酶相关菌株的培养及表达
将步骤(2)构建的3种表达质粒利用电刺激的方法转入步骤(3)所述菌株BW25113ΔlacZΔwcaJ中，得到分别带有pBAD-HpFucT2、pBAD-WbgL、pBAD-CP889质粒的大肠杆菌BW25113实验菌株。
在含20mL无机盐培养基的100mL规格锥形瓶中加入100μg/mL的氨苄霉素，使用甘油(10g/L)作为碳源生长，分别加入1％ LB培养基活化后的上述3种实验菌株，在37℃，220rpm条件下培养至OD600nm＝0.6-0.8，添加终浓度为0.2％的L-阿拉伯糖和5g/L的乳糖，之后在30℃，200rpm条件下继续培养，每24h取样一次。
SDS-PAGE的分析蛋白表达情况
测定24h、48h和72h的2’-FL产量并通过SDS-PAGE对表达结果进行检测。其中，使用碧云天SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配置12％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析。10OD样品超声破碎(20％功率)，1 200rpm离心5min取上清，沉淀用50mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液重悬，将蛋白样(10μL)上样于点样槽中。预览蛋白Blue Protein Marker(/>BEIJING，CHINA)用于检测分子质量，考马斯亮蓝用于蛋白凝胶的染色。SDS-PAGE分析结果(图2)表明，岩藻糖基转移酶CP8899相较于其他两种酶的可溶表达量更多，几乎没有蛋白在包涵体中。
利用HPLC检测不同来源的岩藻糖基转移酶所生产2’-FL的量
2’-FL通过HPLC联用ELSD检测，从实验结果(图3)可以看出，发酵72h后，与表达源自幽门螺杆菌(HPfucT2)及大肠杆菌O126(WbgL)的岩藻糖基转移酶的重组菌株相比，本实验筛选得到CP8899岩藻糖基转移酶的重组菌株的2’-FL产量更高，72h后3种菌株的产量分别为4.8、5.1和11.2g/L。
实施例2酶的纯化及热稳定性测试
本实施例对3个岩藻糖基转移酶进行纯化并通过设定不同的反应温度以测定其热稳定性，HPLC联用ELSD方法检测2’-FL的产出，进而将产出浓度用于随后的酶相对活性的计算。
实施例1得到的分别带有pBAD-HpFucT2、pBAD-WbgL、pBAD-CP8899质粒的3种重组大肠杆菌在200mL LB培养基中培养(37℃，220rpm)，待菌液OD600达到0.6-0.8时，经终浓度为0.2％ L-阿拉伯糖进行诱导8h(30℃，220rpm)，之后将培养液离心(5000rpm，30min)去除上清液，得到重组大肠杆菌细胞沉淀。经50mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液重悬沉淀，得到重组大肠杆菌细胞悬液，最终通过超声破碎(20％功率，5min)，离心(12000rpm，30min)，获得粗酶上清液。通过使用先前由100mL 50mM pH 7.4的Tris-HCl(缓冲液1)平衡的Ni2+-NTASepharose(Hilden,Germany)将粗酶上清液(15mL)上样到IMAC柱(0.8cm2×10cm，1.5mL/min)中。经包含0.3M NaCl和20mM咪唑的缓冲液2的洗涤步骤后，利用缓冲液3(50mMTris-HCl pH 7.4，0.3M NaCl以及300mM咪唑)洗脱蛋白质，收集用缓冲液3洗脱的包含活性可溶的3个酶的洗脱液。
酶反应混合物包括：20mM乳糖、10mM L-GDP-岩藻糖、50mM pH 7.4Tris-HCl和50mMATP，其总体积为5mL。通过添加2mL同蛋白浓度的酶溶液开始反应，然后培养温度取30，35，37，40和42℃5个水平，反应时间为24h。
实验结果表明(图4)，幽门螺杆菌(HPfucT2)与大肠杆菌O126(WbgL)岩藻糖基转移酶的热稳定性相近，且随温度升高(30℃到42℃)，相对活性迅速下降至30％左右。而与上述两种岩藻糖基转移酶相比，本实验筛选得到CP8899岩藻糖基转移酶的热稳定性更高，随着温度的升高，酶的相对活性受到影响较小，在42℃反应时，相对活性仅降低到83.2％。
实施例5 5L发酵罐的转化验证
本实施例对CP8899酶在5L发酵罐上产2’-FL的能力进行检测，发酵培养基配方已在上文列出，采用分批补料方式。发酵菌株为上述实施例1得到的带有pBAD-CP8899质粒的大肠杆菌BW25113实验菌株，甘油和乳糖采用分批补料方式补料。发酵条件：无机盐发酵培养基，发酵培养基的初始体积为1.8L，实验菌株接种量为10％，发酵过程保持37℃，初始碳源甘油(50％，m/v)浓度为20g/L，发酵全程使用氨水控制pH，使其维持在7.0。待初始碳源消耗完全后，开始流加甘油(50％，m/v)，当OD600nm达到30左右时，加入终浓度为0.2％L-阿拉伯糖进行诱导，同时流加200g/L的乳糖，使其浓度维持在5g/L左右，直至发酵结束。发酵过程通过级联控制，通过调节转速、通气量，使溶氧维持在25％。发酵全程定时取样并测定菌体OD600nm，取1mL发酵液12000rpm离心5min，取上清液并用0.22μm膜处理，发酵过程中利用HPLC检测2′-岩藻糖基乳糖的生成量(图5)。发酵85h后，2’-FL产量达到了65.2g/L。

Claims (10)

1.一种岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述岩藻糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种能够表达权利要求1所述岩藻糖基转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的底盘菌株包括但不限于大肠杆菌BW25113。
5.根据权利要求3或4所述的基因工程菌，其特征在于，以pBAD为表达载体，表达新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因。
6.一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求3-5任一项所述基因工程菌接种到无机盐培养基中，以甘油作为初始碳源，进行发酵生产2′-岩藻糖基乳糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基包括甘油10.0-30.0g/L、KH2PO4 13.0g/L、(NH4)2PO44.0g/L、柠檬酸1.7g/L、MgSO4·7H2O 1.4g/L、CaCl2 0.1g/L、微量元素母液10mL/L，pH调节到7.0-7.2；
所述微量元素母液：10g/L Fe(III)citrate、2.25g/L ZnSO4·7H2O、1.0g/L CuSO4·5H2O、0.35g/L MnSO4·H2O、0.23g/L Na2B4O7·10H2O、0.11g/L(NH4)6Mo7O24、2.0g/L CaCl2·2H2O。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵过程中还进行分批补料，所述分批补料是指待所述初始碳源消耗完全后，补充50％甘油和终浓度为5g/L的乳糖。
9.权利要求1所述岩藻糖基转移酶，或权利要求2所述基因，或权利要求3-5任一项所述基因工程菌，或权利要求6-8任一项所述方法在生产2’-岩藻糖基乳糖与含2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述产品包括婴儿配方奶粉。
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