UA72186C2 - Receptors functions modulators pertaining to family of receptors tnf/ngf - Google Patents

Description

У загальних рисах, цей винахід стосується царини рецепторів, які належать до надсімейства рецепторів

ТМЕ/ЧСРЕ, і регулювання Їх біологічних функцій. Надсімейство рецепторів ТМЕ/ЧСЕ включає такі рецептори, як рецептори фактору некрозу пухлини р5і5 і р75 (ТМЕ-К, далі називаються ро5-К і р/5-кК) і рецептор ЕА5Б- ліганду (який називається також ГАБ/АРОЇ або ЕГАБ5-Е, і далі називається ГА5-К), та інші. Зокрема, цей винахід стосується нових білків, які зв'язуються з іншими білками, що самі по собі прямо або опосередковано зв'язуються з членами сімейства рецепторів ТМЕ/МОРЕ та іншими внутрішньоклітинними модуляторними білками, а більш конкретно, цей винахід стосується одного з таких білків, позначених у даному описі КАР (РІР-асоційований білок-2), що зв'язується з ВІР ("білок, який взаємодіє з рецептором") який, в свою чергу, зв'язується сам з собою і з МОКТ-1, ЕА5Б-НВ, р55-Е, ТКАОО і Тгаїг2.

Згідно з цим, цей винахід, у загальних рисах, стосується нових білків, що здатні модулювати або опосередковувати функцію КІР, і, таким чином, здатні прямо або опосередковано модулювати або опосередковувати функцію інших білків, які безпосередньо або опосередковано зв'язуються з ВІР. Зокрема, даний винахід стосується КАР, його одержання і використання, а також будь-яких ізоформ, фрагментів і похідних КАР, їх одержання і використання.

Фактор некрозу пухлини (ТМР-о) і лімфотоксин (ТМЕ-р) (далі, позначка ТМЕ стосується як ТМЕ-с, так і

ТМЕ-В) являють собою поліфункціональні про-запальні цитокіни, які утворюються, головним чином, мононуклеарними фагоцитами, що справляють множинну дію на клітини (УМаїаси, 0. (1986), у: Іпїегегоп 7 (Юп Стгоззег, єд.), рр.83-122, Асадетіс Ргевз5, І опдоп; і Вешіег 85. Сегаті (1987)). Ефекти як ТМЕ-с, так і ТМЕ-

В ініціюються їх зв'язуванням з рецепторами клітинної поверхні. Деякі з цих ефектів є, певно, сприятливими для організму: вони можуть руйнувати, наприклад, пухлинні клітини або інфіковані вірусом клітини, і посилювати антибактеріальну активність гранулоцитів. Таким чином, ТМЕ забезпечує захист організму від пухлин та інфекційних агентів, і сприяє його відновленню від пошкодження. Тому ТМЕ може використовуватись в якості протипухлинного агента, що зв'язується зі своїми рецепторами на поверхні пухлинних клітин, і, завдяки цьому, ініціює процеси, які ведуть до загибелі пухлинних клітин. ТМЕ може також використовуватись в якості протиінфекційного агента.

Однак, як ТМЕ-о, так і ТМЕ-р справляють також несприятливу дію. Є дані, що надпродукування ТМЕ-о. може відігравати головну роль в патогенезі деяких захворювань. Так, наприклад, відомо, що дія ТМЕ-с, головним чином, на судинну мережу, є основною причиною виникнення симптомів септичного шоку (Тгасеу еї а!І., 1986). При деяких захворюваннях, ТМЕ може викликати надмірну втрату ваги (кахексію), пригнічуючи активність адипоцитів і стимулюючи анорексію, через що ТМЕ-о; раніше називали кахетином. Цей факт був також описаний як медіатор пошкодження тканини при ревматичних хворобах (Вешіег « Сегаті, 1987) і як головний медіатор пошкодження тканин, що спостерігається при реакціях ""-трансплантат проти хазяїна" (Рідиеї еї аїІ., 1987). Крім того, відомо, що ТМЕ бере участь в процесах запалення і в багатьох інших захворюваннях.

Вище зазначені біологічні ефекти ТМЕ ініціюють і/або опосередковують два різних рецептора ТМЕ-Е, які незалежно експресуються, ро55 і р75, що специфічно зв'язуються як з ТМЕ-с, так і з ТМЕ-р. Ці два рецептори мають структурно відмінні внутрішньоклітинні домени, що дає основу припустити, що вони по-різному передають сигнал (див., Ноптапп еї аї., 1989; ЕпдеІтапп еї а!., 1990; ВгосКНнаизх еї аї!., 1990; І еоїзеНег еї аї., 1990; 5спаї! еї а!., 1990; Морпаг еї а!., 1990; Зтій еї а!., 1990; 5 Неїег еї а!., 1990). Однак, ще потрібно буде з'ясувати клітинні механізми, наприклад, різні білки і можливо інші фактори, що беруть участь у внутрішньоклітинній передачі сигналу ТМЕ-рецепторами р55 і р/5. Внутрішньоклітинна передача сигналу, відбувається, очевидно, після зв'язування ліганду, тобто, ТМЕ (о або р), з рецептором, відповідальним за ініціацію каскаду реакцій, які, врешті-решт, приводять до відповіді клітини на ТМЕ, що спостерігається.

Що стосується зазначеного вище цитоцидного ефекту ТМЕ, то в більшості клітин, що досліджувалися до цього часу, цей ефект стимулюється, головним чином, рецептором р5о55 ТМеЕ-К. Антитіла проти позаклітинного домену (домену, що зв'язується з лігандом) ро5 ТМЕ-К, самі можуть стимулювати цитоцидний ефект (див., ЕР 412486), який корелює з ефективністю перехресного зшивання рецептора з антитілами, що, очевидно, є першою стадією генерування процесу внутрішньоклітинної передачі сигналу.

Крім того, дослідження мутацій (Вгакерив5сп еї аї., 1992; Тападійа еї аї.,, 1993) показали, що біологічна функція р55 ТМЕ-Е залежить від цілісності внутрішньоклітинного домену, і згідно з цим було висловлене припущення, що ініціація передачі внутрішньоклітинного сигналу, яка веде до цитоцидного ефекту ТМЕ, відбувається внаслідок асоціації двох або більше внутрішньоклітинних доменів ро5 ТМЕ-Е. Більше того,

ТМЕ (о або р) присутній у формі гомотримера, і було висловлене припущення, що в цій формі він індукує внутрішньоклітинну передачу сигналу за допомогою ро55 ТМЕ-К завдяки його здатності зв'язуватися і перехресно зшиватися з молекулами рецептора, тобто, викликати агрегацію рецепторів.

Іншим членом суперсімейства рецепторів ТМЕ/МОЕ є рецептор РАЗ (ГА5Б-К), що також був названий

ЕА5-антигеном, білком клітинної поверхні, що експресується в різних тканинах і має гомологію з рядом рецепторів клітинної поверхні, включаючи ТМЕ-К і МОБ-Н. ЕАБ-К опосередковує загибель клітин у формі апоптозу (поп еї аї., 1991), і, очевидно, служить в якості негативного селектора автореактивних Т-клітин, тобто, в процесі визрівання Т-клітин, ЕАБ-К опосередковує апоптотичну загибель Т-клітин, які розпізнають свої власні антигени. Було також виявлено, що мутації в гені РАБ-А (Ірг) викликають лімфопроліферативні розлади у мишей, що нагадують автоїмунне захворювання людини, системний червоний вовчак (СЧВ) (У/агапаре-Рикипада еї а!ї., 1992). Очевидно, що ліганд для РА5-К являє собою асоційовану з клітинною поверхнею молекулу, присутню, серед інших, на Т-клітинах-кілерах (або цитотоксичних Т-лімфоцитах -

ЦТЛ), а тому, при контактуванні ЦТЛ з клітинами, що несуть ГА5-К, вони здатні індукувати апоптотичну загибель ЕА5-В-несучих клітин. Крім того, були одержані моноклональні антитіла, що є специфічними для

ЕАБ5Б-Е, і ці моноклональні антитіла здатні індукувати апоптотичну загибель клітин, що несуть ЕГАЗ-В, включаючи мишачі клітини, трансформовані КДНК, що кодує людський РАБ-А (ІН еї аї., 1991).

Заявниками був розроблений ряд методів (див., наприклад, Європейські заявки МоМо ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 і ЕР 412486) регулювання несприятливих ефектів ТМЕ, що передбачають інгібування зв'язування ТМЕ з їх рецепторами з використанням антитіл проти ТМЕ або з використанням розчинних ТМЕ- рецепторів (в основному, розчинних позаклітинних доменів цих рецепторів) для конкурування з ТМЕ за зв'язування зі зв'язаними з клітинною поверхнею ТМЕ-К. Крім того, виходячи з того факту, що зв'язування

ТМЕ зі своїм рецептором є необхідним для ТМЕ-індукування клітинних ефектів, заявниками були розроблені способи (див., наприклад, ЕР 568925) модуляції ТМЕ-ефекту шляхом модуляції активності ТМЕ-В.

Коротко, ЕР 568925 стосується способу модуляції передачі сигналу і/або розщеплення ТМЕ-К, завдяки чому пептиди або інші молекули можуть взаємодіяти або з самим рецептором, або з ефекторними білками, які взаємодіють з рецептором, що веде до модуляції нормальної функції ТМЕ-К. В ЕР 568925 описані конструювання і характеризація різних мутантних ро5 ТМЕ-К, що мають мутації в позаклітинних, трансмембранних і внутрішньоклітинних доменах роб ТМЕ-К. Таким чином, області, присутні в вищезазначених доменах роб ТМЕ-Е, були ідентифіковані як області що мають важливе значення для функціонування рецептора, тобто, для зв'язування ліганду (ТЕ) і подальшої передачі активуючого сигналу і каскаду реакцій внутрішньоклітинного розповсюдження сигналу, які, врешті-решт, призводять до впливу

ТМЕ на клітини, що спостерігається. Крім того, був також описаний ряд способів виділення і ідентифікації білків, пептидів або інших факторів, здатних зв'язуватися з різними ділянками в зазначених вище доменах

ТМЕ-Е, де названі білки, пептиди та інші фактори можуть брати участь в регулюванні або модуляції активності ТМЕ-В. В ЕР 568925 описаний також ряд способів виділення і клонування послідовностей ДНК, які кодують такі білки і пептиди; способів конструювання експресувальних векторів для продукування цих білків і пептидів; та способів одержання антитіл або їх фрагментів, які взаємодіють з ТМЕ-К або з вищезазначеними білками і пептидами, що зв'язуються з різними областями ТМЕ-К. Однак, в ЕР 568925 не вказані конкретні білки і пептиди, що зв'язуються з внутрішньоклітинними доменами ТМЕ-К (наприклад, ро5

ТМЕ-К), а також не описаний спосіб з використанням подвійних дріжджових гібридів для виділення та ідентифікації таких білків або пептидів, що зв'язуються з внутрішньоклітинними доменами ТМЕ-В. У аналогічний спосіб, в ЕР 568925 не описані білки або пептиди, здатні зв'язуватися з внутрішньоклітинним доменом ГА5Б-В.

Хоча відомо, що рецептори фактору некрозу пухлини (ТМ) і структурно споріднений рецептор ЕГА5-В запускають в клітинах після їх стимуляції лейкоцит-продукованими лігандами, деструктивну активність, що призводить до їх власної загибелі, механізми даного запуску доки ще мало зрозумілі. Дослідження мутацій показали, що в передачі сигналу цитотоксичності рецептором РАБ-К і рецептором р55 ТМЕ-К (ро5-Н) беруть участь різні області внутрішньоклітинних доменів цих рецепторів (Вгакеризсп еї а!., 1992; Тападіїа еї а!., 1993; йоп 8 Мадаїа, 1993). Дані області ("домени загибелі") мають подібні послідовності. "Домени загибелі" як рецептора ЕГАБ-Е, так і рецептора р55-К мають тенденцію до самоасоціації. їх самоасоціація, очевидно, стимулює агрегацію цих рецепторів, яка необхідна для ініціації передачі сигналу (див. 5опо еї аї., 1994; Умаїасип еї аї., 1994; Воїдіп еї аїЇ.,, 1995), і, при високих рівнях експресії рецептора, вона може призводити до стимуляції ліганд-незалежної передачі сигналу (Воїаїіп еї аї., 1995).

Подібно до інших рецептор-індукованих ефектів, індукування загибелі клітин рецепторами ТМЕ і ЕА5Б-А здійснюється шляхом серії білок-білюових взаємодій, що відбуваються в результаті зв'язування ліганду з рецептором, і, врешті-решт, активації ферментних ефекторних функцій, які в конкретних дослідженнях пролили світло на неферментативні білок-білкові взаємодії, що ініціюють передачу сигналу загибелі клітин: зв'язування молекул тримірного ТМЕ або РАБ-Н-ліганду з рецепторами, що веде до взаємодії їх внутрішньоклітинних доменів (Вгакеризсі еї аї!., 1992; Тападіїа еї а!., 1993; МКоп 8. Мадаїа, 1993), посиленому завдяки здатності мотивів "доменів загибелі" до самоасоціації (Воїадіп еї аї., 1995а), і індукованому завдяки зв'язуванню двох цитоплазматичних білків (які можуть також зв'язуватися один з одним) з внутрішньоклітинними доменами рецепторів МСЖТ-1 (або ГАОО) з ЕА5-А (Воїаіп еї аї., 19950, Спіппаїуап єї а!., 1995; Кізспкеї еї а!ї., 1995) і ТЕАБО з р55-К (Нзи еї аї., 1995; Нзи еї а!ї., 1996). Три білки, які зв'язуються з внутрішньоклітинним доменом ЕА5Б-К і р55-К в області "домену загибелі", що бере участь в індукуванні загибелі клітин завдяки рецепторам шляхом гетероасоціації гомологічних областей, і які також здатні незалежно стимулювати загибель клітин, були ідентифіковані методом скринінгу з використанням дріжджового подвійного гібриду. Однім з них є білок, МОЕТ-1 (Воїаіп еї а!., 19955), також відомий як ГАЮО (Спіппаїуап еї аї., 1995), який специфічно зв'язується з ГЕАБ-Е. Другий білок, ТЕКА0О (див. також Нзи еї аї., 1995, 1996), зв'язується з р55-КЕ, а третій білок, ВІР (див. також 5іапдег еї а!., 1995), зв'язується як з ГА5-В, так і з р55-К. Окрім їх зв'язування з ГА5-В і р55-К, ці білки також здатні зв'язуватися один з одним, що призводить до функціональних "завад" між БАБ-К і рб55-К. Це зв'язування відбувається за допомогою консервативного мотиву послідовності, "модуля домену загибелі", спільного для рецепторів і асоційованих з ними білків. Крім того, хоча в тесті з використанням дріжджового подвійного гібриду було показано, що

МОВТ-1 спонтанно зв'язується з ЕА5Б-К в клітинах ссавців, однак, це зв'язування має місце лише після стимуляції рецептора, що дає підстави припустити, що МОКТТ-1 бере участь в ініціюванні подій передачі сигналу ГАБ-Н. МОНВТ-1 не містить жодного мотиву послідовності, характерного для ферментативної активності, а тому, здатність МОКТ-1 стимулювати загибель клітин, очевидно, не є його власною притаманною йому активністю, а скоріше, вона є наслідком активації деякого іншого білка(ів), що зв'язується з МОКТ-1 і є наступною ланкою каскаду реакцій передачі сигналу. Було показано, що клітинна експресія мутантів МОРТ-1, в яких відсутня М-кінцева частина молекули, блокує індукування цитотоксичності білками РАБ/АРО1 (РГА5Б-К) або р55-8 (Нзи евї аї., 1996; Спіппаїуап еї а!., 1996), що вказує на те, що ця М-кінцева область передає сигнал цитоцидної дії обох рецепторів шляхом білок-білкових взаємодій.

Таким чином, очевидно, що мотиви "домену загибелі" рецепторів р55-К і БАБ-КЕ, а також три асоційовані з ними білки МОЕТ-1, КІР і ТКАБО є ділянками білок-білкових взаємодій. Ці три білюи МОКТ-1,

КІР ї ТКА0ВО взаємодіють з внутрішньоклітинними доменами ро5-К і ГАБ-К шляхом зв'язування їх "доменів загибелі" з рецепторами; що стосується КІР і ТЕАОО, їх "домени загибелі" також здатні до самоасоціації, хоча МОКТ-1 відрізняється від них в цьому відношенні, і його домен загибелі не здатний до самоасоціації.

Крім того, МОКТ-1 і ТКАБО по-різному зв'язуються з БАБ-К і ро55-К, а також зв'язуються один з одним.

Більше того, як МОКТ-1, так і ТКАСО ефективно зв'язуються з КІР. Згідно з цим, очевидно, що взаємодія між трьома білеами МОКТ-1, КІР і ТЕАБО є важливою частиною всієї модуляції внутрішньоклітинної передачі сигналу, опосередкованої цими білками. Перешкода взаємодії між цими трьома внутрішньоклітинними білками буде призводити до модуляції ефектів, що викликаються цією взаємодією.

Так, наприклад, інгібування зв'язування ТКАЮО з МОКТ-1 може модулювати взаємодію ЕА5-Е з р55 ТМЕ-В.

В аналогічний спосіб, інгібування КІР, окрім вищезазначеного інгібування зв'язування ТКА0О з МОРКТ-1, може крім того, модулювати взаємодію ГАЗ-К з ро55 ТМЕ-В.

Моноклональні антитіла, що продуковані проти "домену загибелі" р55-К, а зокрема, проти зв'язувального центру ділянок ТКАОО і КІР, можуть також використовуватись для інгібування або запобігання зв'язуванню цих білків, і таким чином, для модуляції взаємодії між РА5-К і р55-В.

Більше того, нещодавно було також виявлене, що окрім вищезазначеної цитотоксичної активності і її модуляції, опосередкованої різними рецепторами і зв'язними з ними білками, включаючи ЕРА5-А, р55-В,

МОНВТ-1, ТКАОО, КІР, МАСН, Мена і С1, ряд цих рецепторів і зв'язних з ними білків також беруть участь в модуляції активності ядерного фактору транскрипції МЕ-КВ, який є ключовим медіатором виживання клітин або їх життєздатності, і який є відповідальним за регулювання експресії багатьох генів імунної і запальної відповіді. Так, наприклад, було встановлено, що ТМЕ-о може фактично стимулювати активацію МЕ-КВ, а тому ТМЕ-о здатний індукувати два види сигналу в клітинах, один сигнал, який спричинює загибель клітини, і інший сигнал, що захищає клітини від загибелі шляхом індукування експресії гена за допомогою МЕ-КВ (див. Вед « Вайітоге, 1996; М/апд еї а!., 1996; Мап Апіжмегр еї а!., 1996). Аналогічний подвійний ефект був також описаний для ГА5-К (див. посилання на цей ефект, що наводиться в вищезазначеній роботі Мап

Апімегр еї а!., 1996). З цього випливає, що існує слабка рівновага між загибеллю і виживанням клітин після стимуляції різних типів клітин з ТМЕ-о і/або РА5-В-лігандом, причому, кінцевий результат цієї стимуляції залежить від того, який внутрішньоклітинний каскад реакцій стимулюється більшою мірою: той, що призводить до загибелі клітини (як правило по типу апоптозу), або той, що веде до виживання клітини шляхом активації МЕ-КВ.

Крім того, нещодавно авторами даного винаходу був виявлений можливий механізм, за допомогою якого члени сімейства рецепторів ТМЕ/МОЕ активують МЕ-КВ (див., Маїїпіп еї аї!., 1997, і різні відповідні посилання, наведені в цій роботі; і спільну одночасно розглядувану заявку на патент Ізраїлю МоМо І. 117800 та Ії 119133). Отже, звідси випливає, що кілька членів сімейства рецепторів ТМЕ/МОЕ здатні активувати МЕ-

КВ за допомогою спільного білка-адаптора, Тгаї2. Щойно виявлена протеїн-кіназа, яку назвали МІК (див. вище, Маїїпіп еї аї., 1997, І 117800 і І 119133), здатна зв'язуватися з Тгаг2 і стимулювати активність МЕ-КВ.

Дійсно, було показано (див. вищезазначену роботу Маїїпіп еї аїЇ., і заявки І), що експресія в клітинах мутантів, дефіцитних по кіназі МІК, призводить до того, що ці клітини стають неспроможними до стимуляції

МЕ-КВ у нормальний ендогенний спосіб, і також до того, що в цих клітинах блокується індукування МЕ-КВ- активності фактором ТМЕ за допомогою будь-якого ЕА5-Е, і блокується індукування МЕ-КВ білками ТЕАОО,

ВІР Її МОЕТ-1 (що є білками-адаптерами, які зв'язуються з цими рецепторами р55-Е і/або ГА5-К). Всі ці рецептори р55-Н, р75-В, ЕАБ-К та їх білки-адаптори МОКТ-1, ТКАБО, і КІР прямо або опосередковано зв'язуються з Тгаїг, які, завдяки своїй здатності зв'язуватися з МІК, очевидно, модулюють індукування МЕ- кВ.

Очевидно, що з вищезазначених білків-модуляторів, які беруть участь у тендітній рівновазі між загибеллю і виживанням клітин після стимуляції ГА5-Е і/або р55-Е, білок ВІР відіграє важливу роль. Білок

ВІР (див. Зіапдег еї аї., 1995, а також Маїтпіп еї а!., 1997) має в своїй С-кінцевій області "домен загибелі", здатний індукувати цитотоксичність клітини незалежним чином, а також шляхом асоціації з доменами загибелі МОКТ-1, р55-В, ЕА5Б-Е і ТЕАОО. В своїй М-кінцевій області, ВІР також має протеїн-кіназний домен і проміжний домен, який, очевидно, здатний перехресно взаємодіяти (зв'язуватися) з Тгаї2, і, таким чином, брати участь в індукуванні МЕ-КВ. Згідно з цим, деталі, що стосуються характеристик і послідовностей КІР (ДНК ії амінокислотної послідовності), подані в вищезазначених публікаціях (зокрема, біапдег еї аї!., 1995), що в всій своїй повноті вводяться у цей опис шляхом посилання.

Метою даного винаходу є одержання нового білка КАР, включаючи всі його ізоформи, аналоги, фрагменти або похідні, здатні зв'язуватися з білком РІР (який називається далі "ВІР"). Оскільки ВІР здатний прямо або опосередковано взаємодіяти з внутрішньоклітинними медіаторами запалення, клітинної цитотоксичності/клітинної загибелі, такими як, р55-К і ЕА5-РЕ, і з асоційованими із ними білками-адаптерами або білками-модуляторами, такими як, наприклад, МОКТ-1, ТЕАОО, МАСН, Мсп4, 1 та інші, з цього випливає, що нові білки цього винаходу, завдяки своїй здатності зв'язуватися з КІР, здатні впливати на процес внутрішньоклітинної передачі сигналу, ініційований зв'язуванням РАз-ліганду зі своїм рецептором, і зв'язуванням ТМЕ зі своїм рецептором (р55-К), і що ці нові білки даного винаходу, як такі, є модуляторами роБ-В-ї ЕА5-А-опосередкованого впливу на клітини. Оскільки КІР також здатний взаємодіяти з Тгаг,і, завдяки цьому, здатний прямо або опосередковано взаємодіяти з МІК, і, крім того, КІР сам по собі діє як модулятор процесів запалення і виживання клітин, включаючи індукування МЕ-КВ, отже, нові білки цього винаходу є модуляторами КіІР-асоційованого запалення і активності виживання клітин. В аналогічний спосіб, за допомогою РА5Б-В, р55-Е та їх білків-модуляторів МОКТ-1 і ТКАОО, здатних індукувати МЕ-КВ і виживання клітин або прямо, або опосередковано шляхом зв'язування з КІР або шляхом зв'язування з

Тгаї2, з якими зв'язується РІР, білки даного винаходу можуть бути також медіаторами процесів виживання клітин, діючи із застосуванням спільних або схожих механізмів внутрішньоклітинної передачі сигналу, де різні вищезазначені білки індукують виживання клітин. В аналогічний спосіб, оскільки р75-К зв'язується з

Ттаг2, з яким зв'язується КІР, нові білки цього винаходу можуть бути також модуляторами РІР- асоційованого опосередковування р/75-Р-опосередкованої активності.

Іншою метою даного винаходу є одержання антагоністів (наприклад, антитіл, пептидів, органічних сполук, або навіть деяких ізоформ) відносно до вищезазначених нових білків ВАР, їх ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних, що можуть використовуватись для інгібування процесу передачі сигналу, або, більш конкретно, процесів запалення, цитотоксичності, або виживання клітин, якщо це необхідно.

Іншою метою даного винаходу є використання зазначених вище нових білків КАР, їх ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних для виділення і характеризації додаткових білків або факторів, що можуть брати участь в регулюванні рецепторної активності, наприклад, інших білків, що можуть зв'язуватися з білками

ЕАР і впливати на їх активність, і/або для виділення і ідентифікації інших рецепторів, які беруть участь в попередніх або подальших реакціях даного процесу(ів) передачі сигналу, і з якими зв'язуються ці нові білки,

їх аналоги, фрагменти і похідні, а тому, в функції яких, ці білки також беруть участь.

Ще однією метою цього винаходу є одержання інгібіторів, що можуть вводитись в клітини для зв'язування або взаємодії з КАР і з можливими ізоформами ЕАР, де зазначені інгібітори можуть інгібувати

ВІР-асоційовану активність в клітинних цитотоксичних процесах, а тому, якщо це необхідно, підвищувати здатність клітин до виживання, або вони можуть інгібувати КІР-асоційовану активність в процесах виживання клітин, а тому, якщо це необхідно, посилювати клітинну цитотоксичність.

Крім того, метою даного винаходу є використання зазначених вище білків ВАР, їх ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних в якості антигенів для одержання поліклональних і/або моноклональних антитіл проти цих білків. Ці антитіла, в свою чергу, можуть використовуватись, наприклад, для виділення нових білків з різних джерел, таких як, клітинні екстракти або трансформовані клітинні лінії.

Більше того, ці антитіла можуть використовуватись для діагностичних цілей, наприклад, для ідентифікації розладів, пов'язаних з невірним функціонуванням клітинні ефектів, опосередкованих р5о55-В,

ЕА5-Е або інших споріднених рецепторів.

Іншою метою цього винаходу є одержання фармацевтичних композицій, що містять зазначені вище нові білки ВАР, їх ізоформи, або їх аналоги, фрагменти чи похідні, а також фармацевтичних композицій, які містять вищезазначені антитіла або інші антагоністи.

Згідно з цим винаходом було виділено новий білок КАР. КАР здатний зв'язуватися або взаємодіяти з

ВІР, і отже, є модулятором або медіатором внутрішньоклітинної активності КІР. КІР бере участь в модуляції або опосередкуванні каскадів реакцій внутрішньоклітинної передачі сигналу, наприклад, процесів, асоційованих з клітинної цитотоксичністю або з загибеллю клітин, в яких КІР має власну цитотоксичну активність, а також цитотоксичну активність в комбінації, прямо або опосередковано, з рядом інших асоційованих з клітинною загибеллю білків, таких як, наприклад, МОКТ-1, ТЕАОО, МАСН, Меп, СІ, р55-К і

ЕАБ5Б--К, з якими КІР може асоціюватись або зв'язуватися прямо чи опосередковано через мотив/модуль "домену загибелі", присутній в РІР і в усіх вищезазначених білках; інших каскадів реакцій, якими є процеси запалення, виживання або життєздатність клітин, де КІР може відігравати активуючу роль, прямо або опосередковано, завдяки присутності кіназного мотиву або домену, наявного в РІР, і здатності ВІР зв'язуватися з Тгаї2, який може зв'язуватися з МІК, котрий, в свою чергу, безпосередньо бере участь в активації МЕ-КВ, що відіграє центральну роль в запаленні і виживанні клітин. Крім того, ро5 і ТКАВО здатні взаємодіяти з Тгаї2, а також беруть участь в активації МЕ-КВ, і, завдяки цьому, в механізмі виживання клітин, а тому РІР, завдяки своїй здатності зв'язуватися або взаємодіяти з р55, ЕА5Б-Е і ТЕАбО (а також з

Тгаї2), може також брати участь, за допомогою цих білків, в модуляції запалення і активації виживання клітин. Згідно з цим, КІР є модулятором або медіатором цих процесів, і отже, ВАР цього винаходу, завдяки зв'язуванню з РІР, є модулятором або медіатором зазначених внутрішньоклітинних каскадів реакцій.

ВАР було виділено та клоновано з використанням дріжджової двогібридної системи, а також було секвеновано і охарактеризовано, і як буде докладно описане нижче, КАР являє собою високоспецифічний

ВІР-зв'язувальний білок, і отже він є специфічним КІР-модулятором/медіатором. КАР не зв'язується з

ТВАБО, МОВТ-1, р55-8А, р75-К і МАСН. Окрім того, очевидно, що КАР не містить характерного модуля або мотиву "домену загибелі", що підтверджує виявлений факт, що КАР сам по собі не індукує клітинну цитотоксичність.

Вживане в даному описі поняття КІР-активність означає його активність в модуляції/опосередкуванні процесів запалення і загибеліу' виживання клітин, і його активність в модуляції/опосередкуванні процесу виживання клітин. Ці активності описані вище і нижче в даному описі, а також в зазначених вище публікаціях і патентних заявках, які у всій своїй повноті вводяться у цей опис шляхом посилання.

Аналогічно вживане в даному описі поняття КАР-активність означає його активність в модуляції/опосередкуванні КІР-активності завдяки своєму специфічному зв'язуванню з КІР, причому, ця

ВАР-опосередкована модуляція активності КІР включає модуляцію/опосередкування процесів запалення і загибелі/виживання клітин, в яких КІР бере участь прямо чи опосередковано, а тому, КАР, як такий, може розглядатися як непрямий модулятор/медіатор всіх зазначених вище білків, і можливо, ряду інших білків, що беруть участь в запаленні, загибелі і виживанні клітин, і з якими зв'язується КІР, або з якими ВІР взаємодіє у прямий чи непрямий спосіб.

Таким чином, відповідно до цього винаходу, був одержаний новий білок, позначений КАР. Як вказувалося вище, КАР було виділено й клоновано методом двогібридного скринінгу, та охарактеризовано як молекулу, що зв'язується з КІР. Секвенування КАР, що проводили шляхом порівняння послідовності

ЕАР з різними послідовностями, наявними в базі даних, наприклад, в Сеперапк "древі" і в базах даних людського геному рівня 1 (Нитап сСепоте БОаїаразе), виявило, що він є новим білком, і будь-якої гомології між послідовністю КАР і відомими послідовностями виявлено не було. Фактично були виявлені дві послідовності ДНК, які відрізняються лише своїми 5'-секодуючими областями, які, певно, походили від того ж самого гену внаслідок альтернативного сплайсингу.

Ще залишається з'ясувати, яким чином КАР зв'язується з РІР, а зокрема, необхідно визначити області гомології або зв'язування КАР с РІР, які забезпечують їх зв'язування одного з одним. Очевидно, що КАР не містить ані модуля "домену загибелі", ані будь-якої іншої відомої області ферментативної чи іншої активності, наприклад, кіназного або протеазного домену.

Виходячи з зазначеного вище випливає, що, як вказано вище і як буде вказано нижче, КАР є, по видимому, специфічним ВІР-зв'язувальним білком, а тому модулятором/медіатором внутрішньоклітинної активності КІР.

Таким чином, цілююом очевидно, що КАР відіграє певну роль в модуляції/опосередкуванні активності, спрямованої на запалення, виживання і/або загибель клітин, в якій КІР бере участь прямо або опосередковано, а особливо, активності, спрямованої на цитотоксичність та запалення, що викликається або індукується різними стимуляторами, включаючи сигнали, що передаються рецепторами сімейства

ТМЕ/ЧОБЕ і можливо іншими рецепторами. (Для схеми участі КІР в цих внутрішньоклітинних подіях, а отже і участі ВАР, див. Фіг.1 в роботі Маїнпіп еї а!., 1997).

КАР може також служити в якості інгібітору клітинної цитотоксичності та запалення завдяки його присутності як частини комплексу з іншими білками, наприклад, з ВІР і білками, зв'язаними з РІР, і, як такий,

він може впливати на цитотоксичні або запальні ефекти цих інших білків (наприклад, ро5-Н, ЕА5Б-К, МАСН,

Меп, 1 і МОКТ-1), що, врешті-решт, веде до інгібування їх цитотоксичної активності або їх активності при запаленні.

КАР може також служити в якості підсилювача або стимулятора клітинної цитотоксичності та запалення, і даний ефект досягається шляхом стимуляції активності інших білків, наприклад, КІР та інших білків, зв'язаних з ВІР, які, як зазначено вище, забезпечують КІР-опосередкований рекрутинг цих білків, причому, зазначений рекрутинг служить для стимуляції цитотоксичної активності різних білків або для стимуляції їх запальних ефектів.

В аналогічний спосіб, КАР може також служити в якості інгібітору або стимулятора каскаду реакцій, спрямованих на виживання клітин, завдяки, як зазначено вище, участі КІР у цьому каскаді реакцій.

Згідно з цим, даний винахід стосується послідовності ДНК, що кодує РКІР-асоційований білок (КАР), його лізоформи, аналоги або фрагменти, здатні зв'язуватися з КІР і модулювати чи опосередковувати внутрішньоклітинну активність КІР; причому, зазначена внутрішньоклітинна активність спрямована на модуляцію/опосередкування запалення і/або загибель клітин і/або виживання клітин.

Зокрема, цей винахід стосується послідовності ДНК, вибраної з групи, яка складається з: (а) послідовності КДНК, яка походить від кодуючої області нативного білка КАР; (Б) послідовностей ДНК, які здатні гібридизуватись з послідовністю (а) в помірно жорстких умовах, і які кодують біологічно активний білок КАР; і (с) послідовностей ДНК, які є виродженими внаслідок виродженості генетичного коду для послідовностей ДНК, визначених в (а) і (Б), і які кодують біологічно активний білок КАР.

Іншим конкретним варіантом вищезазначеної послідовності ДНК даного винаходу є послідовність ДНК, що містить, принаймні, частину послідовності, яка кодує, принаймні, одну ізоформу білка КАР. Іншим варіантом вищезазначеної послідовності ДНК є послідовність, яка кодує білок ВАР, показаний на Фіг.1. Ще одним варіантом послідовності ДНК є послідовність ДНК, показана на фіг.2.

Цей винахід стосується білків КАР і його аналогів, фрагментів чи похідних, що кодуються будь-якою з вищезазначених послідовностей цього винаходу; причому, зазначені білки, аналоги, фрагменти і похідні здатні зв'язуватись з ВІР і модулювати/опосередковувати його біологічну активність у внутрішньоклітинних каскадах реакцій, спрямованих на загибель і/або виживання клітин.

Конкретним варіантом цього винаходу є білок КАР, його аналоги, фрагменти і похідні. Послідовність білка КАР, виведена з послідовностей ДНК Фітг.1 і 2, показана на Фіг.3. Іншим варіантом цього винаходу є будь-яка ізоформа білка КАР, його аналоги, фрагменти і похідні.

Даний винахід також стосується векторів, що кодують вищезазначений білок КАР, і його аналоги, фрагменти чи похідні цього винаходу, які містять вищезазначену послідовність ДНК даного винаходу; причому, ці вектори здатні експресуватись в підхожих еукаріотичних або прокаріотичних клітинах-хазяїнах; трансформованих еукаріотичних або прокаріотичних клітин-хазяїв, що містять зазначені вектори; і способу продукування білка КАР, або його аналогів, фрагментів чи похідних даного винаходу шляхом культивування зазначених трансформованих клітин-хазяїв в умовах, підхожих для експресії зазначеного білка, його аналогів, фрагментів або похідних, забезпечення посттрансляційних модифікацій зазначеного білка, необхідних для одержання зазначеного білка, і виділення зазначеного білка, його аналогів, фрагментів чи похідних з культурального середовища зазначених трансформованих клітин або з клітинних екстрактів зазначених трансформованих клітин. Подані вище визначення передбачають включення всіх ізоформ білка КАР.

В іншому своєму аспекті, цей винахід також стосується антитіл або їх активних похідних чи фрагментів, які мають специфічність до білка КАР і його аналогів, фрагментів та похідних даного винаходу.

В ще одному своєму аспекті, цей винахід стосується різних способів використання вищезазначених послідовностей ДНК або білків, що кодуються цими послідовностями згідно з цим винаходом, причому, зазначеними способами використання є, серед інших: (ї Спосіб модуляції внутрішньоклітинних каскадів реакцій запалення, загибелі клітин і/або виживання клітин, модульованих або опосередкованих білком КАР, що передбачає обробку зазначених клітин одним чи кількома білками ЕАР, їх ізоформами, аналогами, фрагментами або похідними, здатними зв'язуватися з

ВІР, де зазначена обробка зазначених клітин передбачає введення в зазначені клітини зазначених одного чи більше білків, їх ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних у формі, підхожій для їх внутрішньоклітинного введення; або введення в зазначені клітини послідовності ДНК, що кодує зазначені один чи більше білків, їх ізоформ, аналогів, фрагментів, або похідних у формі підхожого вектора, який несе зазначену послідовність; причому, зазначений вектор є придатним для ефективного введення зазначеної послідовності в зазначені клітини так, щоб ця послідовність експресувалась в зазначених клітинах. (її Спосіб модуляції каскадів реакцій запалення, загибелі клітин і/або виживання клітин, опосередкованих лігандами сімейства ТМЕ шляхом їх впливу на клітини через дію білка КІР, як описано вище в (ї), де зазначена обробка клітин передбачає введення в зазначені клітини зазначеного білка КАР або його ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних у формі, підхожій для внутрішньоклітинного введення; або введення в зазначені клітини послідовності ДНК, що кодує зазначений білок 51 або його ізоформи, аналоги, фрагменти чи похідні у формі підхожого вектора, що несе зазначену послідовність; причому, зазначений вектор є придатним для ефективного введення зазначеної послідовності в зазначені клітини так, щоб ця послідовність могла експресуватись у зазначених клітинах. (ії) Спосіб, аналогічний до описаного вище в (ії), де зазначену обробку зазначених клітин проводять шляхом трансфекції зазначених клітин рекомбінантним вектором на основі вірусів тварин, і де зазначений спосіб передбачає проведення стадій: а) конструювання рекомбінантного вектору на основі вірусу тварин, що несе послідовність, яка кодує вірусний поверхневий білок (ліганд), що здатний зв'язуватися зі специфічним рецептором клітинної поверхні на поверхні ЕА5-В- або р55-В-Несучої клітини, і другу послідовність, яка кодує білок, вибраний з білка КАР, та його ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних, який при його експресії в зазначених клітинах, здатний модулювати/опосередковувати процеси внутрішньоклітинного запалення, загибелі клітин і/або виживання клітин; і

(р) інфікування зазначених клітин зазначеним вектором (а). (м) Спосіб модуляції каскадів реакцій запалення, загибелі клітин і/або виживання клітин, опосередкованих впливом лігандів сімейства ТМЕ на клітини через дію білка ВІР, де зазначений спосіб передбачає обробку зазначених клітин антитілами або їх активними фрагментами або похідними згідно з цим винаходом, де зазначена обробка передбачає введення в зазначені клітини підхожої композиції, що містить зазначені антитіла, їх активні фрагменти або похідні, і де, в тому випадку, якщо позаклітинну поверхню обробляють, принаймні, частиною білка КАР, зазначену композицію виготовляють для позаклітинного застосування, а у випадку, якщо зазначені білки КАР є повністю внутрішньоклітинними, зазначену композицію виготовляють для внутрішньоклітинного застосування. (М) Спосіб модуляції каскадів реакцій запалення, загибелі клітин і/або виживання клітин, опосередкованих впливом лігандів сімейства ТМЕ на клітини через дію білка ВІР, де зазначений спосіб передбачає обробку зазначених клітин олігонуклеотидною послідовністю, яка кодує антисмислову послідовність, принаймні, частини послідовності білка КАР цього винаходу, де зазначена олігонуклеотидна послідовність здатна блокувати експресію білка КАР. (м) Спосіб, описаний у п. (ії) для обробки пухлинних або ВІЛ-інфікованих клітин чи інших патологічних клітин, який передбачає: а) конструювання рекомбінантного вектора на основі вірусу тварини, що несе послідовність, яка кодує вірусний поверхневий білок, здатний зв'язуватися зі специфічним рецептором поверхні пухлинної клітини або рецептором поверхні ВІЛ-інфікованої клітини, або рецептором, що знаходиться на поверхні іншої патологічної клітини; і послідовність, яка кодує білок, вибраний з білка КАР, його аналогів, фрагментів і похідних даного винаходу, який, при його експресії в зазначених пухлинних клітинах, ВІЛ-інфікованих клітинах або інших патологічних клітинах, здатний знищувати зазначені клітини шляхом впливу на них білка

ВІР; (Б) інфікування зазначених пухлинних клітин, або ВІЛ-інфікованих клітин, чи інших патологічних клітин зазначеним вектором. (мі) Спосіб модуляції каскадів реакцій загибелі клітин і/або виживання клітин, опосередкованих впливом лігандів сімейства ТМЕ шляхом дії на клітини білка КІР, де зазначений спосіб передбачає процедуру обробки рибозимом, у якій вектор, що кодує послідовність рибозиму, здатного взаємодіяти з клітинною послідовністю мРНК, що кодує білок КАР цього винаходу, вводять в зазначені клітини в такій формі, що забезпечує експресію зазначеної рибозимної послідовності в зазначених клітинах, і де у випадку, якщо зазначена рибозимна послідовність експресується в зазначених клітинах, вона взаємодіє з зазначеною клітинною послідовністю мРНК та розщепляє цю послідовність МРНК, що приводить до інгібування експресії зазначеного білка КАР в зазначених клітинах. (мії) Спосіб, вибраний з вищезазначених способів цього винаходу, де зазначена послідовність, яка кодує білок КАР, містить, принаймні, одну з ізоформ ЕАР, або один з його аналогів, фрагментів і похідних даного винаходу, що здатні зв'язуватися з КІР. (їх) Спосіб виділення і ідентифікації білків цього винаходу, здатних зв'язуватися з білком ВІР, який передбачає проведення процедури з використанням дріжджового подвійного гібриду, де послідовність, яка кодує зазначений білок ВІР, або присутня в одному гібридному векторі, і послідовність з бібліотеки кДНК чи бібліотеки геномних ДНК, наявна в другому гібридному векторі, і де ці вектори потім використовують для трансформації дріжджових клітин-хазяїв, після чого позитивні трансформовані клітини виділяють, і зазначений другий гібридний вектор екстрагують з одержанням послідовності, яка кодує білок, що зв'язується з зазначеним білком ВІР. (хХ) Спосіб, описаний вище в пп. (і)-(їх), де зазначеним білком КАР є будь-яка з ізоформ КАР, або будь- який з його аналогів, фрагментів і похідних. (хі) Спосіб, описаний вище в пп. (і)-(х), де білок КАР або будь-яка з його ізоформ, чи будь-який з його аналогів, фрагментів і похідних бере участь в модуляції клітинного ефекту, опосередкованого або модульованого будь-яким іншим медіатором чи індуктором, з яким зазначений білок КАР або його ізоформа, аналог, фрагмент чи похідне може зв'язуватися прямо або опосередковано.

Даний винахід також стосується фармацевтичної композиції для модуляції процесів запалення, і загибелі і/або виживання клітин, опосередкованих впливом сімейства ТМЕ на клітини шляхом дії на вищезазначені клітини білка КІР або іншого медіатора чи індуктора, де зазначена композиція включає в якості активного інгредієнта будь-який з таких компонентів: (Ї) білок ЕАР цього винаходу або його біологічно активні фрагменти, аналоги, похідні, або їх суміші; (ії) рекомбінантний вектор на основі вірусу тварини, що кодує білок, здатний зв'язуватися з рецептором клітинної поверхні, і кодує білок КАР або його біологічно активні фрагменти чи аналоги цього винаходу; (ії) олігонуклеотидна послідовність, яка кодує антисмислову послідовність білка КАР цього винаходу, де зазначений олігонуклеотид може бути другою послідовністю рекомбінантного вектору на основі вірусу тварини, визначеного вище в п. (ії).

Даний винахід також стосується:

І. способу модуляції процесів запалення і внутрішньоклітинних процесів загибелі і/або виживання клітин, модульованих/опосередкованих білком КІР або дією будь-якого іншого медіатора чи індуктора, або будь-якого іншого індуктора чи інгібітору МЕ-КВ на клітини, де зазначений спосіб передбачає обробку цих клітин згідно з способом даного винаходу, описаним вище в пп. (І)-(х), білююм КАР, його ізоформами, аналогами, фрагментами чи похідними, або послідовностями, які кодують білки КАР, або його ізоформи, аналоги або фрагменти, де зазначена обробка веде до підсилення або до інгібування зазначеного КІР- опосередкованого ефекту, і, завдяки цьому, також ефекту, опосередкованого ЕА5Б-В- або р55-Е, або іншим медіатором чи індуктором, або індуктором чи інгібітором МЕ-КВ.

ІЇ. способу, зазначеного вище, де зазначений білок КАР, його аналог, фрагмент чи похідна є частиною білка КАР, що бере участь в специфічному зв'язуванні з ВІР, або з іншим медіатором чи індуктором, або з іншим індуктором чи інгібітором МЕ-КВ, або послідовність зазначеного білка КАР кодує частину білка ВАР, який бере участь в специфічному зв'язуванні з РІР, або з іншим медіатором чи індуктором, або з іншим індуктором чи інгібітором МЕ-КВ.

ПШ. способу, описаного вище, де зазначений білок КАР є однією з ізоформ КАР, здатною посилювати

ВІР-асоційований ефект.

ІМ. способу, описаного вище, де зазначений білок КАР є однією з ізоформ ЕАР, здатною інгібувати ВІР- асоційовану дію на клітини, або дію на клітини, опосередковану іншим медіатором або індуктором, і, завдяки цьому, також інгібувати РА5Б-В- або р55-р-асоційовану дію на клітини, або дію на клітини іншого цитотоксичного медіатора чи індуктора.

М. способу, описаного вище, де зазначений білок КАР, його ізоформа, аналог, фрагмент чи похідна здатні посилювати або інгібувати КІР-асоційовану дію на процес запалення і виживання клітини шляхом прямого або опосередкованого інгібування МЕ-КВ, або шляхом прямої або опосередкованої активації УМК або кінази р38.

Виділення білків КАР, їх ідентифікація і характеризація можуть бути здійснені будь-якими стандартними методами скринінгу, що використовуються для виділення та ідентифікації білків, наприклад, методом з використанням дріжджового подвійного гібриду, методами афінної хроматографії, і будь-якими іншими добре відомими стандартними методами, які зазвичай використовуються з цією метою.

Інші аспекти і варіанти даного винаходу будуть також зрозумілі з поданого нижче докладного опису винаходу.

При цьому, слід зазначити, що вжиті в описі терміни "модуляція/опосередкування дії ВІР, або ГА5-В- ліганду, або ТМЕ на клітини" і будь-які інші з таких "модуляцій/опосередкувань", зазначених у цій заявці, також включають іп мйго та іп мімо-обробку, і, окрім цього, також включають інгібування або підсилення/збільшення.

На Фіг.1 показана нуклеотидна послідовність, яка кодує КАР; і

На Ффіг.2 показана виведена амінокислотна послідовність КАР.

В одному з своїх аспектів, цей винахід стосується нових білків КАР, що здатні зв'язуватися з білком КІР, і, завдяки цьому, опосередковувати або модулювати внутрішньоклітинну активність КІР, особливо в тих випадках, де КІР бере участь в модуляції або опосередкуванні каскадів реакцій запалення, загибелі клітин/виживання клітин, докладно описаних вище. Таким чином, КАР може інгібувати активність КІР в каскадах реакцій запалення, загибелі клітин/виживання клітин; КАР може посилювати активність КІР в процесах запалення або загибелі/виживання клітин; або він може посилювати активність КІР в одному з зазначених процесів, та інгібувати активність КІР в іншому.

Більш конкретно, даний винахід стосується нового білка КАР. КАР було секвеновано та охарактеризовано, і було виявлено, що КАР являє собою РКІР-зв'язувальний білок, який має високу специфічність відносно до КІР, але не зв'язується з рядом білків, про які відомо, що вони беруть участь у внутрішньоклітинній передачі сигналу, яка призводить до запалення, загибелі клітин або виживання клітин.

ЕАР, очевидно, також не містить жодного домену, спільного з білками, які виявляють активність в будь- якому з цих каскадів реакцій, тобто, КАР не містить мотиву або модулю "домену загибелі", і він не містить кіназного мотиву або домену, а також він не містить протеазного домену або мотиву. Визначена послідовність КАР також являє собою унікальну послідовність, як було встановлено виходячи з порівняння з послідовностями в ряді баз даних, включаючи Сеперапк, бази даних людського геному рівня 1 (Нитап бепоте Оаїаразе) і "ареві". Як було докладно описано вище (також з посиланнями на всі зазначені публікації і патентні заявки), КІР бере участь у внутрішньоклітинних каскадах реакцій запалення, і загибелілвиживання клітин. Тому, регулювання або контроль активності КІР може забезпечувати регулювання будь-якого або всіх з цих процесів при ініціації цих процесів, наприклад, шляхом зв'язування

ТМЕ- або Раз-ліганду з їх рецепторами (зокрема, рецепторами для ТМЕ, р55-К). КІР може відігравати ключову роль у визначенні, який з зазначених процесів активований більшою мірою, і таке визначення може здійснюватись завдяки здатності КІР зв'язуватися з рядом цитотоксичних білків, що містять домени загибелі, а також з рядом білків, що мають кіназну активність. Згідно з цим, білки, такі як, білок КАР цього винаходу, що може специфічно зв'язуватися з КІР, може відігравати важливу роль в модуляції КІР- активності, і завдяки цьому в модуляції міри індукування одного з процесів відносно до інших процесів.

Таким чином, білок КАР цього винаходу є важливим модулятором або медіатором внутрішньоклітинного сигналу.

Внаслідок унікальної здатності рецепторів ЕА5Б-К і ТМЕ викликати загибель клітин, а також здатності рецепторів ТМЕ стимулювати різні інші активності, спрямовані на руйнування тканин, аберація функції цих рецепторів може особливо згубно впливати на організм. Дійсно, було показано, що як надлишок, так і дефіцит функції цих рецепторів сприяє розвитку патологічних симптомів різних захворювань. Ідентифікація молекул, які беруть участь в активності цих рецепторів в передачі сигналів, і виявлення механізмів модуляції функції цих молекул, можливо, є ключем для розробки нових терапевтичних методів лікування цих захворювань. В зв'язку з передбачуваною важливою роллю КІР в ЕА5Б-В- і р55-В-токсичності, а отже і передбачуваною важливою регуляторною роллю КАР в КІР-опосередкованій модуляції БГАБ-А і ТМЕ, очевидно, що особливо важливо розробити потрібні лікарські засоби, які можуть блокувати цитотоксичну функцію КІР, можливо, шляхом блокування зв'язування КАР з РІР або у якийсь інший спосіб інгібувати взаємодію між КАР і КІР в таких умовах, при яких КАР сприяє підсиленню КіІР-опосередкованої цитотоксичності (як показано вище, КІР є цитотоксичним сам по собі і в комбінації з іншими білками, які містять області "домену загибелі").

В аналогічний спосіб, також відомо (див. вище), що БАБ-Е і р55-К беруть участь в активації МЕ-КВ, і, таким чином, у виживанні клітин. Згідно з цим, якщо треба знищити клітини, наприклад, ракові клітини, ВІЛ- інфіковані клітини тощо, необхідно посилити цитотоксичну дію ЕА5-Е і р55-Е (і асоційованих із ними білків, таких як, наприклад, МОЕТ-1, МАСН, Мсп4, С1, ТЕАОО), і в той самий час інгібувати їх здатність індукувати

МЕ-КВ. Отже, якщо взаємодія або зв'язування КАР з ВІР веде до збільшення можливої ролі КІР в підсиленні індукування МЕ-КВ (можливо за допомогою Тгаї2, а можливо за допомогою кіназного домену і/або проміжного домену КІР), необхідно блокувати цю взаємодію між КАР і КІР з метою інгібування або, принаймні, запобігання підсиленню активації МЕ-КВ, і, завдяки цьому, зрушення рівноваги ТМЕ- або ЕГА5Б- ліганд-індукованих ефектів в бік клітинної цитотоксичності, що, врешті-решт, призводить до збільшення загибелі клітин.

В аналогічний спосіб, в протилежній ситуації (тій, що вказана вище), при якій зв'язування КАР з ВІР фактично призводить до інгібування запальної або цитоксичної дії БА5-К і р55-К, і при якій бажано блокувати ці цитотоксичні ефекти, наприклад, при запаленні, різних автоїмунних захворюваннях, тощо, де необхідно стимулювати виживання клітин, дуже важливо розробити такі лікарські засоби, що будуть посилювати взаємодію між КАР і КІР з підсиленням загального інгібування загибелі клітин і зрушення рівноваги в бік виживання клітин. Виходячи з вищезазначеного, очевидно, що у випадку, коли взаємодія

ЕАР з КІР викликає інгібування функції КІР в підвищенні активації МЕ-КВ, і, якщо виживання клітин є бажаним, необхідно блокувати цю взаємодію між КАР і РІР, і, таким чином, посилити активність КІР в підвищенні активації МЕ-КВ.

Виходячи з вищезазначеного, очевидно, що РІР відіграє ключову роль в рівновазі між індукуванням або опосередкуванням каскадів реакцій запалення, загибелі клітин або виживання клітин, а тому КАР також відіграє таку ж важливу роль як і модулятор КІР. Вплив на взаємодію/зв'язування між КАР і КІР з застосуванням різних лікарських засобів або курсів лікування, як вказано вище і нижче, очевидно, дасть змогу досягнути зрушення в каскаді реакцій внутрішньоклітинної передачі сигналу в напрямку від загибелі клітин в бік виживання клітин, або навпаки, якщо це необхідно.

Цей винахід також стосується послідовності ДНК, яка кодує білок РАР, і білків КАР, які кодуються цими послідовностями ДНК.

Крім того, даний винахід стосується послідовностей ДНК, які кодують біологічно активні аналоги, фрагменти і похідні білка КАР, і аналогів, фрагментів та похідних, що кодуються цими послідовностями.

Одержання таких аналогів, фрагментів і похідних забезпечується стандартними методами (див. наприклад,

Батиьгоок еї аї., 1989), де в послідовностях ДНК, які кодують білок ВАР, один або кілька кодонів можуть бути делеговані, додані чи замінені іншими кодонами, з одержанням аналогів, що мають, принаймні, одну заміну амінокислотного залишку порівняно з нативним білком.

З вищезазначених послідовностей ДНК цього винаходу, які кодують білок КАР, його ізоформу, аналог, фрагмент чи похідну, також включених як варіант цього винаходу, послідовності ДНК здатні гібридизуватись з послідовністю КДНК, яка походить від кодуючої області нативного білка КАР, де таку гібридизацію здійснюють в помірно жорстких умовах, і де послідовності ДНК, які гібридизуються, кодують біологічно активний білок ВАР. Отже, цими гібридизованими послідовностями ДНК є послідовності ДНК, що мають відносно високу гомологію з послідовністю КДНК нативного КАР, і, як такі, являють собою КАР-подібні послідовності, які можуть бути, наприклад, природними послідовностями, що кодують різні ізоформи ЕАР, або природними послідовностями, які кодують білки, що належать до групи КАР-подібних послідовностей, що кодують білок, який має КАР-активність. Крім того, цими послідовностями можуть бути також, наприклад, синтезовані послідовності, які не трапляються в природі, які є аналогічними послідовності КДНК нативного КАР, але, при цьому, включають ряд потрібних модифікацій. Отже, такими синтетичними послідовностями є всі можливі послідовності, які кодують аналоги, фрагменти і похідні КАР, кожен з яких має активність КАР.

Для одержання різних вищезазначених природних КАР-подібних послідовностей, можуть використовуватись стандартні методи скринінгу та виділення природних зразків ДНК або РНК з різних тканин з використанням природної КДНК КАР або її частини в якості зонда (див. наприклад, стандартні методи, описані в посібнику Затьгоок еї а!., 1989).

Аналогічно, для одержання вищезазначених різних синтетичних КАР-подібних послідовностей, що кодують аналоги, фрагменти або похідні ВАР, може використовуватись ряд стандартних методів, докладно описаних нижче для одержання зазначених аналогів, фрагментів і похідних.

Поліпептид або білок, "який істотно відповідає" білку КАР, означає не тільки білок КАР, але також і поліпептиди чи білки, що є аналогами КАР.

Аналогами, які, в основному, відповідають білку КАР, є такі поліпептиди, в яких одна чи кілька амінокислот амінокислотної послідовності білка КАР були замінені іншою амінокислотою, делеговані і/або інсертовані, за умови, що одержаний в результаті цього білок має, в основному, ту ж саму або більш високу активність, ніж білок КАР, якому він відповідає.

Для одержання білка, який, в основному, відповідає білку КАР, заміни в послідовності білків КАР, таких як, ізоформи, є, в основному, відносно незначними. Хоча число замін може бути більше десяти, однак, більш прийнятним є те, щоб таких замін було не більше десяти, ще більш прийнятно, не більше п'яти, а найбільш прийнятно, не більше трьох. Хоча для виявлення можливих біологічно активних білків, які, в основному, відповідають білкам КАР, можуть використовуватись будь-які методи, однак, одним з таких методів є використання стандартної техніки мутагенезу білок-кодуючої ДНК, яка веде до невеликих модифікацій. Білки, експресовані такими клонами, можуть бути потім скриновані на їх здатність зв'язуватися з КІР і модулювати активність КІР при модуляції/опосередкуванні вищезазначених внутрішньоклітинних каскадів реакцій. "Консервативними" замінами є такі заміни, які, як очікується, не повинні змінювати активність білка, і які зазвичай спочатку повинні бути оцінені, як заміни, що, як передбачається, не змінюють розмір, заряд або конфігурацію білка, і, таким чином, як передбачається, не змінюють його біологічних властивостей.

Консервативні заміни білків КАР включають аналог, де, принаймні, один амінокислотний залишок в поліпептиді був консервативно замінений іншою амінокислотою. Такі заміни, більш прийнятно, здійснюють згідно з поданим нижче в Таблиці ІА списком, де заміни можуть визначатись шляхом рутинного експериментування з одержанням модифікованих структурних і функціональних властивостей синтезованої поліпептидної молекули при збереженні біологічної активності, притаманної білку ВАР.

Таблиця ІА

777ле 7/7 | їешМа!//

Альтернативно, іншою групою замін в білку КАР є такі заміни, де, принаймні, один амінокислотний залишок в поліпептиді було вилучено, і замість нього вставлено інший залишок згідно з Таблицею ІВ. Типи замін, що можуть бути зроблені в поліпептиді, можуть бути вибрані виходячи з аналізу частоти стрівальності амінокислотних замін між гомологічними білками інших виді, таких, що подані в Таблиці 1-2 в роботі Зспиці еї аї!., О.Е., Ргіпсіріе5 ої Ргоївіп Зігисішге Зргіпдег-Мегіад, Мем/ Могк, МУ, 1978, і Рід5. 3-9 ої

Стгеідпіоп, Т.Е., Ргоїєїпе: Біписішге апа Моїесшаг Ргорепієв, М.Н. Егеетап 4 Со., Зап Егапсізсо, СА, 1983.

Виходячи з цього аналізу, альтернативні консервативні заміни визначають в цьому описі як заміни всередині однієї з таких п'яти груп:

Таблиця ІВ "| залишки: Аа, зег, ТПг (Рго, су) "| аміди: Азр, Азп, Сім, СіІп "ТА, Гуз "Ге, Пе, Ма! (Сув)

Три амінокислотні залишки, зазначені вище в дужках, відіграють особливу роль в укладці білка. Су являє собою залишок, що не має будь-якого бокового ланцюга, і внаслідок цього він надає ланцюгу гнучкості. У цьому випадку, однак, є тенденція до стимуляції утворення вторинної структури, що відрізняється від с-спіралі. Залишок Рго, через його незвичайну геометрію, сильно ускладнює ланцюг, і, в основному, стимулює утворення р-виток-подібних структур, хоча, в деяких випадках, Сух може виявитися здатним брати участь в утворенні дисульфідного зв'язку, що має важливе значення для укладки білка. Слід зазначити, що 5спціз та ін., див. вище, мали 6 об'єднати названі вище Групи 1 і 2. Слід також зазначити, що

Туг, через його можливий водневий зв'язок, має значну спорідненість з зег і ТПг, тощо.

Згідно з цим винаходом, консервативні амінокислотні заміни, наведені вище, відомі фахівцям, і, як припускається, після здійснення цих амінокислотних замін повинні зберігатися біологічні і структурні властивості поліпептиду. Більшість делецій і замін, здійснюваних згідно з цим винаходом, не вносять істотних змін в характеристики білка або поліпептидної молекули. Термін "характеристики" визначений неінклюзивним чином і означає як зміну у вторинній структурі, наприклад, в о-спіралі або в р-складці, так і зміну в біологічній активності, наприклад, у зв'язуванні з КІР і/або опосередкуванні впливу КІР на загибель клітини.

Прикладами продукування амінокислотних замін в білках, які можуть використовуватись для одержання аналогів білків КАР для використання в цьому винаході, є стадії будь-яких відомих методів, таких як ті, що описані в патентах США КЕ 33653, 4959314, 4588585 і 4737462 (Магк еї а1.); 5116943 (Коїнз еї. аІ.), 4965195 (Матеп еї аі.), 4879111 (Спопо еї а!.), і 5017691 (І ее еї аї.); і білки з замінами лізину, описані в патенті США

Мо 4904584 (ЗПпаму еї а!1.).

Окрім консервативних замін, що обговорюються вище, які не повинні значно вплинути на активність білка КАР, в обсяг цього винаходу входять або консервативні заміни, або менш консервативні заміни і більш довільні заміни, які приводять до збільшення біологічної активності аналогів білків КАР.

Якщо необхідне точне підтвердження впливу даної заміни або делеції, для будь-якого фахівця очевидно, що вплив даної заміни (замін), делеції (делеції), тощо може оцінюватись шляхом рутинного аналізу на зв'язування і загибель клітин. Скринінг з використанням такого стандартного тесту не передбачає надмірного експериментування.

Підхожими аналогами КАР є такі аналоги, що зберігають, принаймні, здатність до зв'язування з РІР, і, завдяки цьому, як вказувалося вище, опосередковують активність КІР в каскаді внутрішньоклітинних реакцій, описаних вище. Таким чином, можуть продукуватись аналоги, що мають так звану домінантно- негативну дію, а саме, аналоги, які є дефектним або по зв'язуванню з КІР, або по подальшій передачі сигналу, або по якійсь іншій активності, що продукується після такого зв'язування. Ці аналоги можуть використовуватись, наприклад, для інгібування дії КІР або для інгібування МЕ-КВ-індукувальної дії КІР (прямої або непрямої) залежно від того, яка з цих активностей є головною активністю, що модульована взаємодією КАР з КІР (див. вище), і це інгібування забезпечується такими аналогами, які конкурують з природним КАР за зв'язування з КІР.

На генетичному рівні, ці аналоги зазвичайно продукують шляхом сайт-спрямованого мутагенезу нуклеотидів в ДНК, яка кодує білок КАР, внаслідок чого одержують ДНК, що кодує цей аналог, з подальшим синтезом цієї ДНК і експресією поліпептиду в рекомбінантній клітинній культурі. Цей аналог, як правило, має ту ж саму або підвищену, що являє особливий інтерес, біологічну активність порівняно з природним білком. А!Єзирбеї еї а!., Сигепі Ргоїосої5 іп Моіесшаг Віоіоду, сгеепе Рибіісайоп5 апа Умієу Іпіеїзсівеєпсе, Мем

МоїКк, М.У., 1987-1995; Затрбгоок еї аї., (1989), МоіІесшаг Сіопіпд: А Іабогаїгу тапиаї!, Соїй бріпд Натбог

І арогаюгу, Соїа бргіпд Натог, МУ, 1989.

Одержання білка БАР, як вказано вище, або альтернативної нуклеотидної послідовності, яка кодує той самий поліпептид, який, проте, відрізняється від природної послідовності внаслідок замін, допустимих завдяки відомій виродженості генетичного коду, може здійснюватись шляхом сайт-специфічного мутагенезу

ДНК, яка кодує раніше одержаний аналог або нативний варіант білка КАР. Сайт-специфічний мутагенез дає змогу продукувати аналоги шляхом використання специфічних олігонуклеотидних послідовностей, що кодують послідовність ДНК з потрібною мутацією, а також достатнє число суміжних нуклеотидів з одержанням праймерної послідовності достатнього розміру і варіабельності для утворення стабільного дуплекса на обох сторонах від делеційного стику. В основному, більш прийнятним є праймер завдовжки від близько 20 до 25 нуклеотидів приблизно з 5-10 додатковими нуклеотидами на кожному боці послідовності, що модифікується. В загальних рисах, техніка сайт-специфічного мутагенезу добре відома фахівцям, і описана в публікаціях, таких як, публікація Адеїтап еї аї., ОМА 2:183 (1983), опис якої вводиться в цю заявку шляхом посилання.

Слід зазначити, що в методі сайт-специфічного мутагенезу зазвичай використовують фаговий вектор, що існує як в одноланцюжковій формі, так і в дволанцюжковій формі. Типовими векторами, які використовуються в сайт-спрямованому мутагенезі, є такі вектори, як фаг М13, описаний, наприклад, в публікації Меззіпуд еї аїІ., Тпіга Сіемеїапа Бутрозішт оп Масгогпоїесшев апа Весотбріпапі ОМА, Еайюог А.

Уманоп, ЕїІземіег, Атв5іегдат (1981), опис якої вводиться в цю заявку в якості посилання. Ці фаги є комерційно доступними, і широко використовуються фахівцями. Альтернативно, для одержання одноланцюжкової ДНК можуть використовуватись плазмідні вектори, що містять сайт ініціації реплікації одноланцюжкового фагу (Меїга еї аїІ., Ме. Еп7утої. 153:3, 1987).

В загальних рисах, зазначений вище сайт-спрямований мутагенез здійснюють спочатку шляхом одержання одноланцюжкового вектору, що включає в свою послідовність послідовність ДНК, яка кодує відповідний поліпептид. Олігонуклеотидний праймер, що несе потрібну мутовану послідовність, одержують синтетично шляхом автоматизованого ДНК/олігонуклеотидного синтезу. Потім цей праймер гібридизують з одно-ланцюжковим вектором, що містить послідовність потрібного білка, і піддають обробці полімеризуючими ДНК ферментами, такими як, фрагмент Кленова полімерази | Е.соїї, для завершения синтезу ланцюга, що несе мутацію. Таким чином, мутована послідовність і другий ланцюг несуть потрібну мутацію. Потім цей гетеродуплексний вектор використовують для трансформації відповідних клітин, таких як, клітини штаму УМ101 Е. сої, і відбирають клони, що містять рекомбінантні вектори, що несуть структуру мутованої послідовності.

Після відбору такого клону, послідовність мутованого білю»а КАР може бути вилучено і введено у відповідний вектор, як правило, у вектор переносу або експресувальний вектор такого типу, що може використовуватись для трансфекції відповідного хазяїна.

Згідно з цим, ген або нуклеїнова кислота, яка кодує білок ВАР, можуть бути також детектовані, одержані і/або модифіковані іп міїго, іп 5їш, і/або іп мімо відомими методами ампліфікації ДНК або РНК, такими як, ПЛР і хімічний олігонуклеотидний синтез. ПЛР дозволяє ампліфікувати (збільшувати число копій) специфічні послідовності ДНК шляхом повторних полімеразних ДНК реакцій. Ця реакція може використовуватись замість клонування, і все, що вимагається для її здійснення - це знання послідовності нуклеїнової кислоти.

Для здійснення ПЛР конструюють праймери, комплементарні потрібній послідовності. Потім, ці праймери генерують шляхом автоматизованого синтезу ДНК. Оскільки можуть бути сконструйовані праймери для гібридизації з будь-якою частиною гену, можна створити такі умови, щоб було допустимим "помилкове" спарювання комплементарних основ. Ампліфікація ділянок з таким помилковим спарюванням може приводити до синтезу мутагенізованого продукту, що сприяє продукуванню пептиду з новими властивостями (тобто, сайт-спрямований мутагенез). Див., також А!йзибеї, гл.16 (див. вище). Може також здійснюватись синтез шляхом зв'язування комплементарної ДНК (КДНК) з використанням зворотної транскриптази в ПЛР, при цьому, РНК може використовуватись в якості вихідного матеріалу для синтезу позаклітинного домену пролактинового рецептора без клонування.

Крім того, можуть бути сконструйовані ПЛР-праймери для введення нових сайтів рестрикції або інших елементів, таких як, кодони термінації, на кінцях генного сегменту, що ампліфікується. Це введення сайтів рестрикції в 5- і 3"-кінці ампліфікованої генної послідовності дозволяє продукувати генні сегменти, що кодують білок АР або його фрагмент, і які зазвичай продукують для лігування з іншими послідовностями і/або з клонуючими сайтами у векторах.

ПЛР та інші методи ампліфікації РНК і/або ДНК добре відомі фахівцям, і можуть використовуватись ними згідно з цим винаходом без зайвого експериментування, лише виходячи з опису і інструкцій, наведених в цій заявці. Відомими методами амліфікації ДНК або РНК є, але не обмежуються ними, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і аналогічні способи ампліфікації (див. наприклад, патенти США МоМо 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 (Миїїїв5 еї а/.); 4795699 і 4921794 (Тарог еї аІ.); 5142033 (Іппів); 5122464 (У/ізоп єї а1.); 5091310 (Іппіє); 5066584 (СупПепвієп еї а)ї.); 4889818 (Сеїапа еї аї.); 4994370 (5іїмег єї а).); 4766067 (Візулаз); 4656134 (Кіпдо!а); і Іппі5 еї аї!., ед5., РОК Ргоїосої5; А Сціде то МеїШ/оай апа Арріїсайоп»5), і

РНК-опосередкована ампліфікація, де для цільової послідовності використовується антисмислова РНК в якості матриці для синтезу дволанцюжкової ДНК (патент США Ме5130238, Маїек еї аї., з торговим знаком

МАЗВА); та імуно-ПЛР, де ампліфікація ДНК використовується разом з міченням антитілом (Ки?іска еї аї.,

зсіепсе 260:487 (1993); запо еї аї., Зсіепсе 258:120 (1992); Запо еї а!ї., Віотесппідцез 9:1378 (1991); зміст цих патентів у всій своїй повноті вводиться в цей опис шляхом посилання.

В аналогічний спосіб, біологічно активні фрагменти білків КАР (наприклад, фрагменти будь-якого з КАР або його ізоформ) можуть бути одержані як описано вище для аналогів білків КАР. Підхожими фрагментами білків КАР є такі фрагменти, які зберігають властивості БАР, і які можуть прямо або непрямо модулювати чи опосередковувати біологічну активність КІР або інших білків, асоційованих з РІР. Згідно з цим, можуть бути одержані фрагменти білка КАР, які мають домінантно-негативну або домінантно- позитивну дію, як описано вище в зв'язку з аналогами КАР. При цьому, слід зазначити, що ці фрагменти представляють спеціальний клас аналогів цього винаходу, а саме, вони визначають частини білків КАР, що походять від повнорозмірної послідовності білка КАР (наприклад, від послідовності будь-якого з ВАР або його ізоформ), де кожна така частина або фрагмент має будь-яку з вищезазначених бажаних активностей.

Таким фрагментом може бути, наприклад, пептид.

В аналогічний спосіб, похідні можуть бути одержані шляхом стандартних модифікацій бокових груп одного чи кількох амінокислотних залишків білка КАР, його аналогів або фрагментів, або шляхом кон'югування білка КАР, його аналогів або фрагментів з іншою молекулою, наприклад, з антитілом, ферментом, рецептором, тощо, як добре відомо фахівцям. Згідно з цим, термін "похідні", що вживається у цьому описі, охоплює ті похідні, які можуть бути одержані з функціональних груп, присутніх у вигляді бокових ланцюгів на залишках, або з М- або С-кінцевих груп, у спосіб, відомий фахівцям, і які входять до обсягу цього винаходу. Цими похідними можуть бути хімічні молекули, такі як, вуглецеві або фосфатні залишки, за умови, що така фракція має ту ж саму чи підвищену біологічну активність порівняно з білками

ВАР.

Так, наприклад, такими похідними можуть бути аліфатичні складноефірні групи, аміди карбоксильних груп, утворені шляхом реакції з аміаком або з первинними чи вторинними амінами, М-ацильні похідні або вільні аміногрупи амінокислотних залишків, утворені ацильними групами (наприклад, алканоїльними або карбоциклічними ароїльними групами), або О-ацильні похідні вільної гідроксильної групи (наприклад, групи серильних або треонільних залишків), утворені ацильними групами.

Термін "похідні" включає тільки ті похідні, які не містять амінокислотних замін двадцяті природних амінокислот.

ЕАР являє собою білок або поліпептид, тобто, послідовність амінокислотних залишків. В поняття такого поліпептиду також входить поліпептид, який складається з більш великої послідовності, що включає повну послідовність білка КАР, визначену в цьому описі, за умови, що ці додання не справляють впливу на основні і нові характеристики білків цього винаходу, тобто, за умови, що вони або зберігають, або підвищують біологічну активність білка КАР, або вони можуть відщеплюватись з утворенням білка або поліпептиду, що має біологічну активність, притаманну активності білка КАР. Так, наприклад, до обсягу цього винаходу можуть входити гібридні білки КАР, утворені з іншими амінокислотами або пептидами.

Новий білок КАР, його аналоги, фрагменти і похідні мають ряд можливих застосувань, наприклад: (Ї) Білок КАР, його аналоги, фрагменти і похідні можуть використовуватись для модуляції функції КІР в каскаді реакцій запалення, загибелі клітин або виживання клітин, які описано вище. Так, наприклад, якщо

ЕАР може модулювати вплив КІР на активацію МЕ-КВ, УМК (кіназу дипе) або кіназу ра, і така дія КАР веде до підсилення КАР-ВІР-ефекту і в цьому випадку, його бажано використовувати проти пухлин, в проти- або про-запальних реакціях, проти ВІЛ, тощо. В цьому випадку, білок КАР, його аналоги, фрагменти і похідні, що модулюють запалення, посилюють цитотоксичну дію, або блокують ефект виживання клітин, можуть вводитись в клітини у стандартні способи, відомі по суті. Так, наприклад, якщо білок ВАР є повністю внутрішньоклітинним (як припускається) і повинен вводитись лише в клітини, де бажаною є дія ГА5-В- ліганду або ТМЕ, або іншого цитотоксичного білка, що опосередковується РІР, необхідно використовувати систему для специфічного введення цього білка в клітини. Одним з шляхів здійснення цієї мети є створення рекомбінантного вірусу тварини, наприклад, вірусу, що походить від вірусу коров'ячої віспи, в ДНК якого вводять такі два гени: ген, який кодує ліганд, що зв'язується з білками клітинної поверхні, специфічно експресованими клітинами, наприклад, такими як, білок др 120 вірусу ВІЛ, який специфічно зв'язується з деякими клітинами (СО4-лімфоцитами і спорідненими клітинами лейкозу), або будь-який інший ліганд, який специфічно зв'язується з клітинами, що несуть ЕА5Б-К або р55-К, так, щоб цей рекомбінантний вірусний вектор був здатний зв'язуватися з зазначеними ЕГА5-В- або р55-Н-несучими клітинами; і ген, який кодує білок КАР. Таким чином, експресія зв'язного з клітинною поверхнею білка на поверхні вірусу буде спрямована на вірус, специфічний до пухлинної клітини або іншої ГА5-В- або р55-В-несучої клітини, після чого послідовність, яка кодує білок КАР, буде введена в клітини за допомогою цього вірусу, і потім експресована в цих клітинах, що приведе до підсилення КІР-опосередкованої дії РА5-В-ліганду або ТМЕ чи незалежної дії КІР. Конструювання такого рекомбінантного вірусу тварини здійснюють стандартними методами (див., наприклад, Затьгоок та ін., 1989). ІНШИМ можливим способом є введення послідовностей білка КАР (наприклад, будь-якого з КАР або його ізоформ) у формі олігонуклеотидів, що можуть бути абсорбовані клітинами та експресовані в них. (ї) Вони можуть використовуватись для інгібування дії ЕА5-В-ліганду, або ТМЕ, чи спорідненого білка, опосередкованої КІР або незалежної дії КІР, наприклад, в таких випадках, як пошкодження тканини при септичному шоку, реакції "трансплантат проти хазяїна", або гострий гепатит, при яких бажано блокувати внутрішньоклітинну передачу сигналу ГА5-В-лігандом або ТМЕ-індукованим рецептором ГА5-Е або р55-В8, або незалежної дії КІР, або передачу сигналу, опосередковану іншим білком; і, в той самий час, вони можуть використовуватись для підсилення каскаду реакцій виживання клітин. У цьому випадку, можна, наприклад, ввести в клітини, стандартними методами, олігонуклеотиди, що мають антисмислову кодуючу послідовність для білка КАР, яка повинна ефективно блокувати трансляцію мРНК, що кодує білок ЕАР, і, таким чином, блокувати його експресію і призводити до інгібування дії ГЕА5-В-ліганду, або ТМЕ, чи КІР, або іншого білка. Такі олігонуклеотиди можуть вводитись в клітини методом з використанням вищезазначеного рекомбінантного вірусу, другої послідовності, яка присутня в цьому вірусі, і яка є олігонуклеотидною послідовністю.

Аналогічно зазначеному вище, залежно від природи взаємодії КАР-КІР, з використанням вищезазначених способів (Її) і (і) можуть бути також посилені або інгібовані клітинні запальні реакції і реакції виживання клітин, якщо це необхідно.

Іншим можливим способом є використання антитіл, специфічних для білка КАР, з метою інгібування його активності у внутрішньоклітинній передачі сигналу.

Ще одним способом інгібування КІР-опосередкованого дії або незалежної дії КІР є нещодавно розроблений спосіб з використанням рибозиму. Рибозими являють собою каталітичні РНК-молекули, які специфічно розщепляють РНК. Рибозими можуть бути сконструйовані для розщеплення вибраних цільових

РНК, наприклад, мРНК, що кодують білок КАР цього винаходу. Такі рибозими повинні мати послідовність, специфічну для мРНК білка КАР, і повинні бути здатними до взаємодії з нею (комплементарному зв'язуванню) з подальшим розщепленням мРНК, що веде до зниження (або до повної втрати) експресії білка КАР. Причому, рівень зниження експресії залежить від рівня експресії рибозиму в клітині-мішені. Для введення рибозимів в вибрані клітини (наприклад, в клітини, що несуть ГАБ-К або р55-к) , може використовуватись будь-який підхожий вектор, наприклад, плазмідні вектори, вектори на основі вірусів тварин (ретровірусів), які зазвичай використовуються для цих цілей (див., також вище п. (ії), де цей вірус має в якості другої послідовності КДНК, яка кодує вибрану рибозимну послідовність). (Огляд методів, що стосуються рибозимів, див. Спеп еї аї!., 1992; 2пао 45 Ріск, 1993; Зпоге еї а!., 1993; дозерп «5 Вигке, 1993;

Зпітауата еї а!., 1993; Сапіог єї а!., 1993; Вагіпада, 1993; Стізеї| еї а!., 1993 і Коі2гиті еї аї!., 1993). Цей метод є застосовним у тому випадку, якщо взаємодія КАР-КІР посилює цитотоксичність клітин тоді, коли це необхідно для блокування цієї цитотоксичності, або в тому випадку, якщо взаємодія КАР-ВІР. інгібує активацію МЕ-КВ також тоді, коли це необхідно для блокування цього інгібування з метою підвищення зазначеної активації МЕ-КВ, тобто, в обох випадках, коли необхідне стимулювання виживання клітин, як описано вище в пункті (Ії). (ії) Білок КАР, а також його аналоги, фрагменти або похідні можуть також використовуватись для виділення, ідентифікації та клонування інших білків того ж класу, тобто, білків, що зв'язуються з РІР або з функціонально спорідненими рецепторами чи білками, які беруть участь в процесах внутрішньоклітинної передачі сигналу. З цією метою може використовуватись зазначена вище дріжджова двогібридна система, або може використовуватись нещодавно розроблена система з використанням несуворої Саузерн- гібридизації з подальшим ПЛР-клонуванням (М/їК5 еї аї., 1989). В цій публікації, УМіІк5 та ін. описують ідентифікацію і клонування двох передбачуваних протеїн-тирозинкіназ шляхом несуворої Саузерн- гібридизації з подальшим клонуванням за допомогою ПЛР на основі відомої послідовності кіназного мотиву, виявленої кіназної послідовності. Цей метод може здійснюватись відповідно до цього винаходу з використанням послідовності білка КАР для ідентифікації і клонування послідовностей споріднених ВІР- зв'язувальних білків. (м) Ще одним варіантом застосування білка КАР цього винаходу або його аналогів, фрагментів і похідних є їх використання в методах афінної хроматографії для виділення і ідентифікації інших білків або факторів, з якими вони здатні зв'язуватися, наприклад, інших білків або факторів, що беруть участь в процесах внутрішньоклітинної передачі сигналу. В цьому варіанті застосування, білок КАР цього винаходу, його аналоги, фрагменти або похідні, можуть бути окремо зв'язані з матрицями, що використовуються в афінній хроматографії, а потім піддані контакту з клітинними екстрактами або виділеними білками чи факторами, які, як припускають, беруть участь в процесі внутрішньоклітинної передачі сигналу. Після проведення афінної хроматографії, інші білки або фактори, що зв'язуються з білюом КАР цього винаходу, або з його аналогами, фрагментами чи похідними, можуть бути елюйовані, виділені і охарактеризовані. (М) Як зазначено вище, білок КАР даного винаходу, або його аналоги, фрагменти чи похідні можуть також використовуватись в якості імуногенів (антигенів) для продукування антитіл, специфічних для цих білків. Ці антитіла можуть також використовуватись для очистки білка КАР (наприклад, КАР або будь-якої з його ізоформ) або з клітинних екстрактів, або з трансформованих клітинних ліній, які продукують білок ВАР, або його аналоги, чи фрагменти. Крім того, ці антитіла можуть використовуватись з метою діагностики для ідентифікації розладів, пов'язаних з аномальним функціонуванням системи КІР-опосередкованого БА5Б-В- ліганду чи ТМЕ, або з незалежною КІР-активністю, наприклад, з клітинними ефектами, індукованими надактивним або недостатньо активним ЕАБ5-Н-лігандом чи ТМЕ і опосередкованими КІР, або зі специфічним впливом на клітини самого КІР. Таким чином, якщо такі ефекти пов'язані з недостатньо функціонуючою системою внутрішньоклітинної передачі сигналу, що включає білок РІР, або різні зазначені вище РКІР-зв'язувальні білки або сам білок КАР, такі антитіла мають служити в якості важливого діагностичного інструменту.

Слід також зазначити, що виділення, ідентифікація і характеризація білка КАР цього винаходу можуть бути здійснені будь-якими добре відомими стандартними методами скринінгу. Так, наприклад, один з цих методів скринінгу, тобто, метод з використанням дріжджового подвійного гібриду, описаний нижче, використовувався для ідентифікації білка КАР (див. біапдег еї а!., 1995), а потім інших різних білків ВАР цього винаходу (окрім різних інших нових вищезазначених і нижченазваних білків, описаних в спільних водночас розглядуваних заявках). В аналогічний спосіб, як вказується вище і нижче, для виділення, ідентифікації і характеризації білка КАР даного винаходу, або для виділення, ідентифікації і характеризації додаткових білків, факторів, рецепторів тощо, здатних зв'язуватися з білюом КАР цього винаходу, можуть використовуватись інші способи, такі як, афінна хроматографія, метод гібридизації ДНК, і т. і., які добре відомі фахівцям.

Як вказувалося вище, білок КАР може використовуватись для генерування антитіл, специфічних до білків КАР, наприклад, до КАР і його ізоформ. Ці антитіла або їх фрагменти можуть використовуватись у спосіб, докладно описаний нижче, де буде очевидно, що в цих застосуваннях, антитілами або їх фрагментами є антитіла, специфічні для білків КАР.

Згідно з даним винаходом, виходячи з того факту, що КАР специфічно зв'язується з КІР, і, як такий, є медіатором/модулятором КІР, а тому, може опосередковувати/модулювати КіІР-активність в каскадах реакцій запалення, загибелі або виживання клітин, таким чином, що КІР функціонує незалежно або в поєднанні з іншими білками (наприклад, з РАБ-В, р55-В, МОВАТ-1, МАСН, Мсп4, 01 і ТЕАБО в каскадах реакцій загибелі клітин, або з Тгаг2 в каскадах реакцій виживання клітин), важливе значення має одержання лікарських засобів, що можуть посилювати або інгібувати взаємодію КАР-РІР, якщо це необхідно, і залежно від того, які з цих каскадів реакцій посилюються/інгібуються взаємодією КАР-ВІР. Є багато захворювань, при яких використання таких лікарських засобів може справити значний благотворний вплив. Такими захворюваннями, серед інших, є гострий гепатит, при якому гостре ураження печінки є, очевидно, наслідком опосередкованої ЕА5-В-лігандом загибелі клітин печінки, автоіїмунно-індукованої загибелі клітин, такої як, загибель р-клітин островків Лангерганса підшлункової залози, що призводить до діабету; загибель клітин при відторгненні трансплантата (наприклад, нирки, серця і печінки), загибель олігодендроцитів в головному мозку при розсіяному склерозі, та ВІЛ-інгібоване "самогубство" Т-клітин, що викликає проліферацію вірусу

ВІЛ, і таким чином викликає СНІД.

Можливо, що КАР або один чи кілька його можливих ізоформ можуть служити "природними" інгібіторами КІР в одному або кількох вищезазначених каскадів реакцій, а тому вони можуть використовуватись в якості вищезазначених специфічних інгібіторів КІР. В аналогічний спосіб, інші речовини, такі як пептиди, органічні сполуки, антитіла, тощо, можуть також скринуватись з одержанням специфічних лікарських засобів, що здатні інгібувати взаємодію КАР-ВІР.

Необмежувальний приклад способу конструювання і скринінгу пептидних інгібіторів взаємодії КАР-ВІР грунтується на попередньому вивченні пептидних інгібіторів ІСЕ або ІСЕ-подібних протеаз, субстратної специфічності ІСЕ, і стратегій аналізу епітопів з використанням пептидного синтезу. Було виявлено, що найменшою вимогою для забезпечення розщеплення пептиду за допомогою ІСЕ є включення чотирьох амінокислот ліворуч від сайта розщеплення зі значною перевагою для аспарагінової кислоти в положенні Рі і метиламіну, який достатньо включити праворуч від положення Р' (5ієаїйй еї аї., 1990; Номжмага еї аї., 1991;

Тпогпре!гу еї аї., 1992). Крім того, виявлено, що флуорогенний субстратний пептид (тетрапептид), ацетил-

Авр-аІи-МаІ-Азр-а-(4-метилкумарил-7-амід), який скорочено позначається Ас-ЮПЕМО-АМС, що відповідає послідовності полі--"АОР-рибоза)-полімерази (РАЕР), розщеплявся в клітинах відразу після стимуляції ЕА5-

КЕ, а також інших процесів апоптозу (Кашїтапп, 1989; Кашптапп еї аї.,, 1993; І агерпік еї аї., 1994), і ефективно розщеплявся СРРЗ2 (членом сімейства СЕОЗ/ЛСЕ-протеази) і МАСН-протеазами (і також можливо аналогічно розщеплявся під дією (1-протеаз - див. наприклад, спільну водночас розглядувану заявку І 120367).

Оскільки, очевидно, Азр в положенні Рі субстрату є важливим елементом, тетрапептиди, що мають Агр в якості четвертого амінокислотного залишку і різні комбінації амінокислот в положеннях перших трьох залишків, можуть бути проаналізовані на їх зв'язування з активним центром протеаз, з використанням, наприклад, методу, розробленого Сіузеп (Сеузеп, 1985; Сеузеп еї а!., 1987), де велике число пептидів на твердих носіях оцінювали на їх специфічне зв'язування з антитілами. Зв'язування МАСН-протеаз зі специфічними пептидами може бути детектоване рядом методів детекції, добре відомих фахівцям, таких як, радіоактивне мічення с1-протеаз, тощо. Було показано, що цей метод Сеузеп дає змогу тестувати за кожний робочий день, принаймні, 4000 пептидів.

В аналогічний спосіб може бути виявлена точна область зв'язування або область гомології, яка визначає взаємодію між КАР і КІР, а потім можуть бути скриновані пептиди, що можуть служити для блокування цієї взаємодії, наприклад, синтезовані пептиди, які мають послідовність, аналогічну послідовності області зв'язування або комплементарну їй послідовність, що може конкурувати природним

ЕАР за зв'язування з КІР.

Лікарські або пептидні інгібітори, які здатні інгібувати КАР-активність в запаленні або клітинній загибелі шляхом інгібування взаємодії КАР з РІР, можуть бути кон'юговані або об'єднані в комплекс з молекулами, що полегшують доступ в клітини.

В патенті США Ме5149782 описане кон'югування молекули, транспортованої через клітинну мембрану за допомогою агента змішування з мембраною, такого як, фузогенні поліпептиди, поліпептиди, які утворюють іонні канали, інші мембранні поліпептиди, і жирні кислоти з довгим ланцюгом, наприклад, миристинова кислота, пальмітинова кислота. Ці мембранозв'язувальні агенти вводять молекулярні кон'югати в ліпідний бішар клітинних мембран і полегшують їх доступ в цитоплазму.

В патенті США Ме5108921 (Гом/ еї а) даний огляд підхожих методів трансмембранної доставки молекул, якими є, але не обмежуються ними, білки і нуклеїнові кислоти, завдяки механізму рецептор- опосередкованої ендоцитотичної активності. Цими системами рецепторів є такі системи, що розпізнають галактозу, манозу, манозо-б6-фосфат, трансферин, асіалоглікопротеїн, транскобаламін (вітамін Ві2). с-2- макроглобулін, інсулін, та інші пептидні фактори зростання, такі як, епідермальний фактор зростання (ЕСБЕ).

Г ому та ін. вказують, що рецептори вітамінів, такі як, рецептори біотину і фолату, можуть більш прийнятно використовуватись для підсилення транспорту через клітинну мембрану завдяки локалізації і множинності рецепторів біотину та фолату на поверхні мембрани більшості клітин, і асоційованих із ними процесів рецептор-опосередкованого трансмембранного транспорту. Таким чином, комплекс, утворений між сполукою, що доставляється в цитоплазму, і лігандом, таким як, як біотин або фолат, контактує з клітинною мембраною, що несе рецептори біотину або фолату, та ініціює механізм рецептор-опосередкованого трансмембранного транспорту, що дозволяє потрібній сполуці проникнути в клітину.

Крім того, фахівцям відомо, що приєднання потрібної пептидної послідовності до лідерної/сигнальної пептидної послідовності для створення "химерного" пептиду буде забезпечувати транспорт цього "химерного" пептиду через клітинну мембрану в цитоплазму.

Як відомо фахівцям в області пептидів, термін "пептидні інгібітори взаємодії КАР-ВІР цього винаходу" включає в себе псевдопептидні лікарські засоби або інгібітори, що можуть також легко скринуватись на зв'язування з ЕАР/КІР-протеазою для одержання, ймовірно, більш стабільних інгібіторів.

Слід також зазначити, що ті ж самі методи для полегшення або підсилення транспорту пептидних інгібіторів через клітинні мембрани, які обговорюються вище, можуть також застосовуватись і до самого

ЕАР або його ізоформ, а також до інших пептидів та білків, що мають аналогічну внутрішньоклітинну дію.

Що стосується антитіл, зазначених вище, термін "антитіло" означає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (МАТ), химерні антитіла, антиідіотипові (анти-І4) антитіла проти антитіл, що можуть бути помічені в розчинній або зв'язаній формі, а також їх фрагменти, що продукуються відомими методами,

такими як, але не обмежуючись ними, ферментативне розщеплення, пептидний синтез або рекомбінантна техніка.

Поліклональні антитіла є гетерогенними популяціями молекул антитіл, одержаних з сироватки тварин, яких імунізували антигеном. Моноклональне антитіло містить, в основному, гомогенну популяцію антитіл, специфічних до антигену, при цьому, зазначена популяція містить, в основному, схожі сайти зв'язування епітопу. МАТ можуть бути одержані методами, відомими фахівцям. Див., наприклад, Копіег 85 Міїєтеїп,

Майшге, 256: 495-497 (1975); патент США Ме4376110; А!,Єзибеї еї аї., ей5., Нагпом/ 5 Гапе, АМТІВООІЕ5: А

ГАВОВАТОНУ МАМИАЇ., Соіа-Зргіпд Нагрог ІГарогаїогу, (1988); і Соїїдап еї аї!., ед5., Сишгтепі Ргоїосої!5 іп

Ітітипоіоду, Стеепе Рибіїзспіпуд Авзос. апа УМіеу Іпієгзсіепсе, М.М. (1992-1996), зміст яких в всій своїй повноті вводиться в цей опис шляхом посилання. Такими антитілами може бути будь-який клас імуноглобулінів, включаючи Ідс, ІМ, ІЧЗЕ, ДА, СІСО та будь-який їх підклас. Гибридома, що продукує МАТ цього винаходу, може бути культивована іп міг, іп віш, або іп мімо. Продукування високих титрів цього МАТ

Їп мімо або іп віш робить цей метод продукування більш прийнятним.

Химерні антитіла являють собою молекули, різні частини яких походять від різних видів тварин, такі як, молекули, що мають варіабельну область, яка походить від мишачого МАТ, і константну область, що походить від імуноглобуліну людини. Химерні антитіла використовуються, головним чином, для зниження імунногенності при їх застосуванні і для збільшення виходу при продукуванні; так, наприклад, в тому випадку, коли мишачі МАТ мають більш високі виходи з гібридом, але більш високу імуногенність для людини, використовуються такі антитіла, як людські/умишачі химерні МАТ. Химерні антитіла і методи їх продукування відомі фахівцям (Сарбійу еї аї!., Ргос. Маї). Асай. зсі., ОБА, 81: 3273-3277 (1984), Моїтізоп еї аї.,

Ргос. Май). Асад. 5сі., ОБА, 81: 6851-6855 (1984); Вошііаппе еї аї., Майте, 312: 643-646 (1984); Сарійну еї аї.,

Європейська патентна заявка 125023 (опублікована 14 листопада 1984); Мецибрегдег еї аї., Майиге, 314: 268- 270 (1985); Тапідиспі еї аІ., Європейська патентна заявка 171496 (опублікована 19 лютого 1985); Могтізоп еї аІ., Європейська патентна заявка 173494 (опублікована 5 березня 1986); Меибрегдег еї аІ., заявка РСТ УМО 8601533 (опублікована 13 березня 1986); Кидо еї аІ., Європейська патентна заявка 184187 (опублікована 11 червня 1986); ЗзЗападап еї аї., У. Іттипої., 137: 1066-1074 (1986); Коріпзоп еї аіІ.. Міжнародна патентна заявка Мо М/О 8702671 (опублікована 7 травня, 1987); іч еї а!., Ргос. Маї). Асай. 5сі., ОБА, 84: 3439-3443 (1987); Бип єї аі!., Ргос. Маї). Асад. 5сі., ОБА, 84: 214-218 (1987); Вецег вї аі., Зсіеєпсе 240: 1041-1043 (1988); і

Нагіому 5 Гапе, АМТІВООІЕ5: А ГАВОКАТОКУ МАМОАГ, див. вище. Ці роботи вводяться в цей опис в якості посилання.

Антиідіотипове антитіло (анти-І4) являє собою антитіло, що пізнає унікальні детермінанти, в основному, асоційовані з антигензв'язувальним центром антитіла. Ід-антитіло може бути одержане шляхом імунізації тварин того ж самого виду і генетичного типу (наприклад, мишачого штаму) як джерела МАТ, проти якого одержане анти-і4. Імунізована тварина буде розпізнавати і давати відповідну реакцію на ідіотипові детермінанти імунізуючого антитіла шляхом продукування антитіла проти зазначених ідіотипових детермінант (антитіло проти І4). Див. наприклад, патент США Ме4699880, який у всій своїй повноті вводишься в цей опис в якості посилання.

Анти-Ій антитіло може також використовуватись в якості "імуногену" для індукування імунної відповіді ще у іншої тварини, з одержанням так званого анти-анти-Ііа антитіла. Це анти-анти-Іій антитіло, за своїми епітопами, може бути ідентичним початковому МАТ, що індукує анти-Ій антитіло. Таким чином, з використанням антитіл проти ідіотипових детермінант МАТ можна ідентифікувати інші клони, які експресують антитіла з ідентичною специфічністю.

Згідно з цим, МАТ, генеровані проти білків КАР, їх аналогів, фрагментів або похідних цього винаходу, можуть використовуватись для індукування анти-ій антитіл у підхожих тварин, таких як миші ВАЇ В/с.

Клітини селезінки від таких імунізованих мишей використовують для продукування анти-їа гібридом, що секретують анти-ій МАТ. Крім того, анти-Ій МАТ можуть бути зв'язані з носієм, таким як, гемоціанін лімфи слимака (КІН), і використані для імунізації інших мишей ВА В/с. Сироватка від зазначених мишей міститиме анти-анти-Ій антитіла, які мають зв'язувальні властивості вихідного МАТ, специфічного для епітопу вищезазначеного білка КАР, або їх аналогів, фрагментів і похідних.

Таким чином, анти-ій МАТ мають свої власні ідіотипові епітопи, або "ідіотопи", структурно схожі з епітопом, що оцінюються, таким як білок-а СОКВ.

Термін "антитіло", крім того, стосується обох інтактних молекул, а також їх фрагментів, таких як, наприклад, Бар і (Гар)», що здатні зв'язуватися з антигеном. Рар і (Гар)»-фрагменти не містять Ес- фрагменту інтактного антитіла, швидко виводяться з кровотоку, і можуть мати більш тканиноспецифічне зв'язування, ніж інтактне антитіло (мапі еї аї., У. Мисі. Мед. 24: 316-325 (1983)).

Звідси ясно, що Раб і (РГаб)» та інші фрагменти антитіл, що використовуються в цьому винаході, можуть використовуватись для детекції і кількісної оцінки білка КАР згідно з методами, описаними в даній заявці для молекул інтактного антитіла. Такими фрагментами як правило є фрагменти, продуковані шляхом протеолітичного розщеплення, з використанням ферментів, таких як папаїн (для продукування Рабр- фрагментів) або пепсин (для продукування (Гар)2-фрагментів).

Вважається, що антитіло "здатно зв'язуватися" з молекулою у тому випадку, якщо воно здатне специфічні реагувати з цією молекулою з подальшим зв'язуванням цієї молекули з антитілом. Термін "епітоп" означає частину будь-якої молекули, здатну зв'язуватися з антитілом, яка також може розпізнаватись зазначеним антитілом. Епітопи "антигенних детермінант" зазвичай складаються з хімічних активних поверхневих груп молекул, таких як, бокові ланцюги амінокислот і цукрів, та мають специфічну тривимірну структуру, а також конкретний заряд.

Термін "антиген" означає молекулу або частину молекули, що здатна зв'язуватися з антитілом, і яка, крім того, здатна індукувати продукування у цієї тварини антитіла, здатного зв'язуватися з епітопом даного антигену. Антиген може мати один чи більше епітопів. Специфічна реакція, про яку говорилось вище, означає, що антиген буде реагувати з високою мірою селективності з відповідним йому антитілом, а не з безліччю інших антитіл, що можуть продукуватись іншими антигенами.

Антитіла, включаючи фрагменти антитіл, що використовуються в цьому винаході, можуть застосовуватись для кількісного або якісного виявлення білка КАР в зразку або для виявлення присутності клітин, які експресують білок КАР цього винаходу. Це може здійсненюватись імунофлуоресцентними методами із застосуванням флуоресцентно міченого антитіла (див. нижче) в поєднанні з детекцією, що проводиться методами оптичної мікроскопії, проточної цитометрії або флюрометрії.

Антитіла (або їх фрагменти), що використовуються в цьому винаході, можуть використовуватись в гістологічному аналіз) що його проводять методами імунофлуоресцентної або імуно-електронної мікроскопії для іп 5йш-детекції білюа КАР цього винаходу. Детекція іп 5іш може здійснюватись шляхом взяття гістологічного зразка у пацієнта, і одержання міченого антитіла цього винаходу проти такого зразка.

Антитіло (або фрагмент) більш прийнятно одержують шляхом внесення міченого антитіла (або фрагменту) в біологічний зразок або шляхом нанесення цього антитіла на біологічний зразок. У такий спосіб можна визначити не лише присутність білка КАР, але також і його розподіл на досліджуваній тканині. З використанням даного винаходу, для кожного фахівця очевидно, що для досягнення такої іп зйи-детекції може бути модифікований весь широкий спектр гістологічних методів (таких як, методи забарвлення).

Такі аналізи для білка КАР цього винаходу зазвичай передбачають інкубування біологічного зразка, такого як, біологічна рідина, екстракт з тканини, свіжозібрані клітини, такі як, лімфоцити чи лейкоцити, або клітини, що були інкубовані в культурі тканини в присутності детектованого міченого антитіла, здатного ідентифікувати білок КАР; і детекцію антитіла будь-яким з ряду методів, добре відомих фахівцям.

Біологічний зразок може наноситись на твердофазну підкладку або носій, такий як, нітроцелюлоза, або іншу тверду підкладку чи носій, що здатний імобілізувати клітини, клітинні частинки або розчинні білки.

Потім, підкладка або носій можуть бути промиті підхожими буферами з подальшою обробкою детектованим міченим антитілом згідно з цим винаходом, як вказано вище. Ця твердофазна підкладка або носій потім можуть другий раз промиватись буфером для вилучення незв'язаного антитіла. Потім, кількість зв'язаної мітки на зазначеній твердій підкладці або носії можуть бути детектовані стандартними методами.

Термін "твердофазна підкладка", "твердофазний носій", "тверда підкладка", "твердий носій", "підкладка" або "носій" означає будь-яку підкладку або носій, здатні зв'язуватись з антигеном або антитілами. Широко відомими підкладками або носіями є скло, полістирол, поліпропілен, поліетилен, декстран, амілази на найлоні, природні і модифіковані целюлози, поліакриламіди, габрос і магнетит. Для цілей даного винаходу, носій, за своєю природою, може бути або деякою мірою розчинним, або нерозчинним. Підкладка може мати фактично будь-яку можливу структурну конфігурацію, за умови, що об'єднана молекула здатна зв'язуватися з антигеном або антитілом. Таким чином, конфігурація підкладки або носія може бути сферичною, у вигляді гранули, циліндричною, у вигляді внутрішньої поверхні тест-пробірки, або зовнішньої поверхні стрижня.

Альтернативно, ця поверхня може бути плоскою, такою як, аркуш, паперова тест-смужка, тощо. Більш прийнятними підкладками або носіями є полістиролові гранули. Фахівцям в цій галузі можуть бути відомі інші підхожі носії для зв'язування антитіла чи антигену, або вони можуть самі виявити потрібні носії шляхом рутинного експериментування.

Активність зв'язування даної кількості антитіла цього винаходу, зазначеного вище, може визначатись добре відомими методами. Кожний фахівець може самостійно визначити робочі й оптимальні умови аналізу для кожного тесту шляхом рутинного експериментування.

Окрім цих аналізів можуть бути проведені інші стадії, такі як, промивання, перемішування, струшування, фільтрування, тощо, як тимчасові або необхідні стадії для даного і конкретного випадку.

Одним з способів, в який антитіло цього винаходу можна детектовано помітити, є зв'язування цього антитіла з ферментом і використання його в імуноферментному аналізі (ІФА). Цей фермент, при його подальшій обробці відповідним субстратом, буде, в свою чергу, реагувати з субстратом так, що в результаті цього буде продукуватись хімічна молекула, яку можна детектувати, наприклад, спектрофотометричним методом, флюрометричним методом, або шляхом візуалізації. Ферментами, які можуть використовуватись для детектованого мічення антитіла, є, але не обмежуються ними, малатдегідрогеназа, стафілококова нуклеаза, дельта-5-стероїдизомераза, дріжджова алкогольдегідрогеназа, альфа- гліцерофосфатдегідрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза хріну, лужна фосфатаза, аспарагіназа, глюкозооксидаза, бета-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6- фосфатдегідрогеназа, глюкоамілаза і ацетилхолінестераза. Ця детекція може здійснюватись колориметричними методами, в яких використовується хромогенний субстрат для ферменту. Детекція може також здійснюватись шляхом візуального порівняння міри ферментативної реакції субстрату порівняно з аналогічно одержаними стандартами.

Детекція може здійснюватись з використанням будь-яких інших імуноаналізів. Наприклад, шляхом радіоактивного мічення антитіл або фрагментів антитіл, можна детектувати К-РТразу з використанням радіоїмуноаналізу (РІА). Повний опис РІА можна знайти в роботі І арогаїгу Тесппідце5 апа Віоспетівігу іп

Моїесшіаг Віооду, ру УмМогк, Т. 5. еї аїі.. Мой Ноїїапа Рибріїзпіпд Сотрапу, ММ (1978) з конкретним посиланням на главу, що називається "Ап Іпігодисіп о Кадіоїттипе А5зау апа Кеїаїеа Тесппідоевз" ру

Спага, Т., що вводиться в цей опис шляхом посилання. Радіоактивний ізотоп може детектуватись методами з використанням д-лічильника або сцинтиляційного лічильника, або за допомогою авторадіографії.

Антитіло даного винаходу може також помічатись флуоресцентною сполукою. При експонуванні флуоресцентно міченого антитіла світлом з відповідною довжиною хвилі, його присутність може потім виявлятись завдяки флуоресценції. З великого ряду сполук, які зазвичай використовуються для флуоресцентного мічення, можна назвати флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, фікоеритрин, пікоціанін, алофікоціанін, о-фтальдегід і рлуоресцамін.

Зазначене антитіло може бути також детектовано помічене з використанням флуоресцентних металів, таких як, 72Е, або інших металів ряду лантаноїдів. Ці метали можуть бути зв'язані з антитілом з використанням груп, що утворюють хелатні комплекси Кк металами, таких як, діетилетилентриамінпентаоцтова кислота (ЕТРА).

Це антитіло може бути також детектовано позначене шляхом його зв'язування з хемілюмінісцентною сполукою. Присутність антитіла, позначеного хемілюмінесцентною міткою, потім визначають шляхом виявлення присутності люмінесценції, яка продукується в процесі хімічної реакції. Прикладами особливо підхожих хемілюмінесцентних сполук-міток є люмінол, ізолюмінол, терароматичний складний ефір акридинію, імідазол, сіль акридинію та складний ефір щавлевої кислоти.

В аналогічний спосіб, для мічення антитіла цього винаходу може використовуватись біолюмінесцентна сполука. Біолюмінсценція являє собою тип люмінесценції, що виявляється в біологічних системах, в яких каталітичний білок сприяє збільшенню ефективності хемілюмінесцентної реакції. Присутність біолюмінесцентного білка визначають шляхом виявлення присутності люмінесценції. Важливими біолюмінесцентними сполуками, що можуть використовуватись для мічення, є люциферин, люцифераза й екворин.

Молекула антитіла цього винаходу може бути адаптована для використання в імунометричному аналізі, а також в "двошаровому" чи "сендвіч"-аналізі. В типовому імунометричному аналізі, певна кількість неміченого антитіла (або фрагменту антитіла) зв'язується з твердою підкладкою або з твердим носієм, після чого додають певну кількість детектовано міченого розчинного антитіла для виявлення і/або кількісної оцінки третинного комплексу, що утворюється між антитілом, зв'язаним з твердою фазою, антигеном та міченим антитілом.

Звичайно і більш прийнятно, імунометричний аналіз являє собою "прямий" аналіз, в якому антитіло, зв'язане з твердою фазою, спочатку піддають контакту з тестованим зразком для екстракції антигену з зразка шляхом утворення подвійного комплексу "антитіло-антиген". Після відповідного періоду інкубації, тверду підкладку або твердий носій промивають для вилучення залишку рідкого зразка, включаючи антиген, який не прореагував, якщо він наявний, а потім піддають контакту з розчином, що містить невідому кількість міченого антитіла (що функціонує як "молекула-репортер"). Після другого періоду інкубування, мічене антитіло зв'язується з комплексом, утвореним антигеном, зв'язаним з твердою підкладкою або твердим носієм, за допомогою неміченого антитіла, а потім тверду підкладку або твердий носій промивають другий раз для вилучення міченого антитіла, що не прореагувало.

Інший тип "сендвіч"-аналізу, що також може використовуватись з антигенами цього винаходу, являє собою так званий "одночасний" або "зворотний" аналіз. Одночасний аналіз передбачає одну стадію інкубування, оскільки антитіло, зв'язане з твердою підкладкою або твердим носієм мічене антитіло додають до тестованого зразка одночасно. По закінченні інкубування, тверду підкладку або твердий носій промивають для вилучення залишку рідкого зразка і міченого антитіла, яке не утворило комплекс. Потім, присутність міченого антитіла, асоційованого з твердою підкладкою або твердим носієм, визначають у такий самий спосіб, як це роблять в стандартному "прямому" сендвіч-аналізі.

У "зворотному аналізі", використовується постадійне додання спочатку розчину міченого антитіла в рідкий зразок, а потім поміченого антитіла, зв'язаного з твердою підкладкою або твердим носієм після відповідного періоду інкубування. Після другого інкубування, тверду фазу промивають у стандартний спосіб для вилучення залишку тестованого зразка і розчину міченого антитіла, що не прореагувало. Потім, присутність міченого антитіла, асоційованого з твердою підкладкою або твердим носієм, визначають так само, як це роблять в "одночасному" і "прямому" аналізах.

Білок КАР цього винаходу можна одержати у стандартний спосіб рекомбінантних ДНК (див., наприклад,

Батиьгоок еї аї!., 1989, і Апзабеї еї а!ї., 1987-1995, див. вище), в якому підхожі еукаріотичні або прокаріотичні клітини, добре відомі фахівцям, трансформують відповідними еукаріотичними або прокаріотичними векторами, що містять послідовності, які кодують білки. Згідно з цим, даний винахід також стосується зазначених експресувальних векторів і трансформованих хазяїв, що використовуються для продукування білків цього винаходу. Як зазначалось вище, цими білками також є їх біологічно активні аналоги, фрагменти і похідні, а тому, векторами, що кодують ці білки, також є вектори, які кодують аналоги і фрагменти цих білків, а трансформованими хазяїнами є хазяї, що продукують такі аналоги і фрагменти. Похідними цих білків, продукованих трансформованими хазяїнами, є похідні, одержані шляхом стандартної модифікації білків, або їх аналогів, чи фрагментів.

Цей винахід також стосується фармацевтичних композицій, які включають рекомбінантні вектори на основі вірусів тварин, які кодують білюи КАР, причому цей вектор також кодує білок вірусної поверхні, здатний зв'язуватися зі специфічними білками поверхні клітин-мішеней (наприклад, ракових клітин), що забезпечує пряму інсерцію послідовностей білка КАР в клітини. Крім того, фармацевтичні композиції цього винаходу в якості активного інгредієнта включають: (а) олігонуклеотидну послідовність, яка кодує анти- смислову послідовність білка КАР, або (Б) лікарські засоби, що блокують КАР-ВІР-взаємодію.

Фармацевтичні композиції даного винаходу включають достатню кількість активного інгредієнта, необхідного для досягнення поставленої мети. Крім того, фармацевтичні композиції можуть містити підхожі фармацевтично прийнятні носії, що містять наповнювачі або домішки, які полегшують введення активних сполук в препарати, що можуть використовуватись фармацевтично, і які можуть стабілізувати такі препарати для введення індивідууму, який потребує цього, як добре відомо кожному фахівцю.

Білок ВАР і його ізоформи або ізотипи, як припускають, експресуються в різних тканинах на помітно різних рівнях, і, очевидно також, що поряд з ними, в аналогічний спосіб, експресируются різні види ізотипів інших білків, які беруть участь в каскадах реакцій внутрішньоклітинної передачі сигналу, як це було показано в спільних і водночас розглядуваних патентних заявках, що цитувалися вище. Ці відмінності можна, ймовірно, віднести за рахунок тканиноспецифічного характеру відповіді на дію Раз/АРО!-ліганду і

ТМЕ. Як і у випадку інших СЕОЗ/СЕ-гомологів (У/апд еї аї!., 1994; АІпеттгі еї а!І., 1995), авторами даного винаходу було раніше показано (в зазначених вище заявках), що ізоформи МАСН, які містять неповні

СЕОЗ/ЛСЕ-області (наприклад, МАСНеЗ3), мають інгібувальну дію на активність ко-експресованих молекул

МАСНоїЇ або МАСНог; при цьому, було також виявлено, що індукування загибелі клітин блокується

Раз/АРОТЇ ії р5Б5-К. Експресія таких інгібувальних ізоформ в клітинах може являти собою механізм самозахисту клітин від Раз/АРО1- і ТМЕ-опосередкованої цитотоксичності. Підозрюється, що аналогічну інгібувальну дію мають, принаймні, деякі С1-ізоформи (01 являє собою недавно виділений новий білок, що зв'язується з Мсп4 і можливо з МАСН, а також білок, що зв'язується з МОКТ-1, який має МОКТ-модулі і протеазний домен - див. спільну і водночас розглядувану заявку І 120367). Широка гетерогенність ізоформ

МАСН, і таким чином, передбачувана аналогічна гетерогенність ізоформ (1, які значною мірою переважають над будь-якими іншими протеазами сімейства СЕОЗ/ЛСЕ, що спостерігаються, повинна забезпечувати особливо точне регулювання функцій активних ізоформ МАСН, і аналогічно активних ізоформ С1. Отже, як вказується вище, білки КАР або їх можливі ізоформи можуть мати різну дію в різних тканинах з точки зору їх взаємодії з КІР і, таким чином, різний вплив на рівновагу між активацією каскадів реакцій загибелі клітин і виживання клітин, як описано вище.

Ймовірно також, що деякі можливі ізоформи ВАР мають інші функції. Наприклад, ВАР або деякі ізоформи КАР можуть також діяти як "заякорювальні" сайти для молекул, які беруть участь в інших не- цитотоксичних ефектах Раз/АРО1- і ТМЕ-рецепторів шляхом взаємодії з КІР або навіть незалежно від ВІР.

Внаслідок унікальної здатності Раз/АРО1- і ТМЕ-рецепторів викликати запалення, загибель клітин, а також внаслідок здатності ТМЕ-рецепторів стимулювати інші активності, які сприяють руйнуванню тканини, відхилення в функції цих рецепторів мають справляти особливо несприятливий вплив на організм. Дійсно, було показано, що як надлишкова, так і недостатня функція цих рецепторів призводять до патологічних проявів різних захворювань (Маззаїййї, 1992; Мадата 4 сСоїів5іеіп, 1995). Ідентифікація молекул, які забезпечують активність рецепторів в передачі сигналу, і пошук шляхів модуляції активності цих молекул повинні привести до прямого одержання нових терапевтичних методів. Інші аспекти цього винаходу будуть очевидні з наведених нижче прикладів.

Цей винахід більш докладно описаний в наведених нижче необмежувальних прикладах, які супроводжуються малюнками.

При цьому, слід зазначити, що такі процедури, як: (ї) двогібридний скринінг та двогібридний тест на експресію р-галоктозидази; (ії) індукована експресія, метаболічне мічення, та імунопреципітація білків; (ії) іп міго-зв'язування; (ім) аналіз на цитотоксичність; і (м) Нозерн-аналіз та аналіз послідовності (див., також

Воїдіп еї а!., 1995р5) 2, З (див. також Воїдіп еї аї!., 1996) і 4, див. нижче, стосовні до МОКТ-1 і МОВТ-1- зв'язувального білка (наприклад, МАСН), а також до щойно виділеного білка 1 (див. ІЇ 120367), можуть бути рівною мірою застосовані (з деякими модифікаціями) для відповідного виділення, клонування і характеризації КАР цього винаходу та його можливих ізоформ. Таким чином, ці процедури розглядаються як повний опис тих самих процедур, що використовуються для виділення, клонування і характеризації КАР цього винаходу, і докладно описаних наприклад, в тій самій або еквівалентній формі в спільних і водночас розглядуваних заявках на патент Ізраїлю МеМо 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 і 120367, а також у відповідній заявці РСТ МеРСТ/О596/10521. Крім того, що стосується білка МІК і його ролі в активації МЕ-КВ, а отже і у виживанні клітин, та ролі, яку відіграє Тгаї2 в цьому каскаді реакцій виживання клітин, наприклад, у взаємодії між Тгаї2 і РІР та інших білків, вони були докладно описані авторами цього винаходу в спільних і водночас розглядуваних заявках І. МоМео 117800, 119133 і Маїїпіп еї а!., 1997.

Приклад:

Клонування та виділення білка КАР, який зв'язується з білком КІР (її Секвенування шляхом двогібридного скринінгу та попередній аналіз

Методом двогібридного скринінгу (див., наприклад, Рієеїд5 8 5опо, 1989, МУ/О/96/1 8641) з використанням

ВІР, у якого був відсутній домен загибелі, в якості затравки в В-клітинній бібліотеці, було виділено та секвеновано клон завдовжки близько 1,9т.п.о.

Були сконструйовані і одержані праймери від 5'-кінця цієї послідовності З використанням ПЛР скринували кілька бібліотек КДНК. З бібліотеки кДНК товстої кишки і бібліотеки КДНК серця був одержаний клон завдовжки близько 0,3т.п.о., і цей клон лігували з клоном завдовжки близько 1,9т.п.о., одержаним з В- клітинної бібліотеки.

Секвенували новий клон завдовжки близько 2,2т.п.о. (див., Фіг1) і визначили його виведену амінокислотну послідовність (Фіг.2).

Аналіз цієї послідовності показав, що білок КАР, очевидно, не має ані "домену загибелі", ані модуля

МОКТ, ані протеазного домену, аналогічно сімейству ІСЕ, ані кіназного домену, ані доменів ТКАЕ (див. вищезазначені спільні і водночас розглядувані патентні заявки та різні посилання, і зокрема, Маїпіп еї аї., 1997, що стосуються всіх різних доменів, які беруть участь в каскадах реакцій внутрішньоклітинної передачі сигналу). Дослідження зв'язування виявили, що КАР зв'язується, головним чином, лише з КІР, і не здатний зв'язуватися з ТКАВО, МОКТ-1, рб55-Н, р75-К і МАСН.

Тому, очевидно, що КАР являє собою специфічний КІР-зв'язувальний білок, який високою мірою специфічно взаємодіє/зв'язується з КІР, можливо за допомогою зв'язувальної області домену, яка не наявна в інших білках, що беруть участь в внутрішньоклітинній передачі сигналу, і виділених до цього часу.

Виходячи з цього очевидно, що КАР є модулятором/медіатором внутрішньоклітинної активності КІР, яка відіграє важливу роль в РІР-модуляції!/опосередкуванні каскадів реакцій запалення /і загибелі клітин/виживання клітин.

Отже, клон більа КАР одержували методом двогібридного скринінгу двогібридної бібліотеки кКДНК лімфоцитів периферійної крові людини з використанням в якості затравки фрагменту білка РІР, у якого був відсутній "домен загибелі". Послідовність КІР взяли з попередніх публікацій (наприклад, 5іапдег еї аї., 1995), і, крім того, вона є в банку даних СепВапк під номером доступу Ме025994, і являє собою послідовність КІР людини (є також мишача послідовність КІР під номером доступу МеО25995). З використанням даних про цю послідовність були сконструйовані відповідні ПЛР-праймери за допомогою програмного забезпечення О/ Іс04тм, і був одержаний фрагмент ДНК, що відповідає кодуючій частині КІР, але без його С-кінцевої ділянки "домену загибелі", шляхом ПЛР з використанням в якості матриці кКДНК, що походить від бібліотеки повної РНК фібробластів людини (стандартними методами). Ця кодуюча частина

ВІР, в якій була відсутня область "домену загибелі" РІР, була потім клонована у вектор ровт-9 (Сіопіесі) і використана в якості затравки, як вказувалося вище, в процедурі двогібридного скринінгу. Шляхом цього двогібридного скринінгу був одержаний ряд клонів, всі з яких кодували білки, які є КЕІР-зв'язувальними білками, що взаємодіють з РІР в тій області КІР, що знаходиться за межами "домену загибелі" (С-кінцева область ВІР), не присутнього в КІР-затравці". Згідно з подальшими процедурами, описаними вище, був одержаний клон кКДНК, послідовність якого показана на Ффіг.1.

Аналіз вищезазначених послідовностей клону КАР і послідовностей в базах даних людського геному рівня 1 "арезі" (Нитап Сепоте Оаїаразе) і базах даних сСеперапк показали, що послідовність ВАР є унікальною (новою) послідовністю, оскільки відомі послідовності не виявляли будь-якої помітної гомології з цією послідовністю КАР.

Для того, щоб визначити, чи може КАР зв'язуватися з будь-яким іншим з відомих білків, які беруть участь в внутрішньоклітинній передачі сигналу, були проведені аналітичні тести на зв'язування. В цих тестах, білои ТКАРО, МОЕТ-1, р55-8, р75-Е, МАСН були проаналізовані на їх здатність зв'язуватися з КАР.

Однак, було виявлено, що КАР не здатний зв'язуватися з жодним з цих білків. КАР також не зв'язується з жодним з нерелевантних контрольних білків, наприклад, ламіном, цикліном 0.

Отже, всі вищезазначені результати показали, що новий білок БАР може високою мірою специфічно взаємодіяти з РІР, і цей білок, як такий, являє собою специфічний модулятор/медіатор КІР. Конкретна ділянка взаємодії між КАР і КІР ще необхідно визначити, але припускається, що ця ділянка є специфічною для РІР та КАР, і відомо, що вона не є спільною з ділянками інших білків, які взаємодіють з КІР, наприклад,

МОНВТ-1, ТВАООБ, ЕАБ-К і можливо також і Тгаї2 (див. Маїїпіп еї аї., 1977). З цього також випливає (виходячи з аналізу послідовності і порівняння з послідовностями в різних базах даних, зазначених вище), що КАР не має ані "домену загибелі", ані модуля МОКТ, ані протеазного домену (наприклад, мотиву ІСЕ/СЕОЗ), ані кіназного домену/мотиву, і ані домену ТЕАБ. Згідно з цим, попередній аналіз на біологічну активність також виявив, що КАР очевидно має такі властивості: (Ї) ЕАР сам по собі не є токсичним для клітин у випадку його надекспресії; (ї) ВАР не захищає клітини від ТМЕ-знищення, і таким чином, очевидно, що він не є інгібітором ТМЕ- індукованої клітинної цитотоксичності; (ії) КАР сам по собі не індукує МЕ-КВ; (м) ЕАР блокує активацію МЕ-КВ під дією ТКЕАОО, ВІР і ТМЕ-Е р55; (М) як було виявлено, КАР також блокує індукування УМК (кінази Уип), що викликається ВІР.

Отже, згідно з вищезазначеним, очевидно, що КАР є високою мірою специфічним КІР-зв'язувальним білком, а тому, він є модулятором/медіатором РІР, і ймовірно, бере участь в КІР-опосередкованих процесах внутрішньоклітинної передачі сигналу.

Зважаючи на описане вище, очевидно, що КАР бере участь в модуляції/опосередкуванні внутрішньоклітинних активностей КІР, де цими активностями є його участь в каскаді реакцій запалення і загибелі клітин (незалежно, за участю його "домену загибелі" або шляхом взаємодії з іншими білками, такими як, МОКТ-1, ТААОО, р55-Н, ЕА5-Е, і асоційованими з ними протеазами, такими як, МАСН, Мена, с1 тощо) і участі КІР в каскаді реакцій виживання клітин (активація МЕ-КВ, можливо шляхом взаємодії з Тгаїг2).

Можливі механізми, згідно з якими КАР може модулювати/опосередковувати активність КІР, докладно описані вище; так, наприклад, КАР-ВІР-взаємодія може призводити до підсилення або реакцій загибелі клітин, або реакцій виживання клітин, або вона може призводити до інгібування або реакцій загибелі клітин, або реакцій виживання клітин, і це підсилення або інгібування, можливо, залежить від відносної активності учасників цих двох протилежних внутрішньоклітинних процесів. КАР може також діяти як заякорювальний білок, який сприяє агрегації ряду молекул КІР та інших КІР- або КАР-зв'язувальних білків, агрегати яких можуть потім функціонувати у напрямку загибелі клітин або виживання клітин (або навіть того і іншого) залежно від відносних активностей/кількостей інших учасників цих каскадів реакцій, які відбуваються в клітині.

У зв'язку наведеним вище повним описом цього винаходу, слід зазначити, що кожному фахівцю очевидно, що він може здійснюватись з використанням широкого ряду еквівалентних параметрів, концентрацій і умов, які не виходять за рамки суті і обсягу винаходу, і без зайвого експериментування.

Хоча даний винахід описано на конкретних варіантах його втілення, проте, в нього можуть бути внесені додаткові модифікації. Застосування цього винаходу включають будь-які його варіанти, способи або адаптації, які відповідають, в загальних рисах, ідеї винаходу, та включають такі відхилення від цього опису у тому вигляді, як вони випливають з відомої або звичайної практики, до якої має відношення цей винахід, і як вони можуть бути застосовані до основних відмітних ознак, описаних вище і сформульованих в поданій нижче формулі винаходу.

Всі роботи, що цитувалися в цьому описі, включаючи журнальні статті і реферати, опубліковані або відповідні патентні заявки США, або іноземні патентні заявки, видані патенти США або іноземні патенти, чи будь-які інші роботи, у всій своїй повноті вводяться в цей опис шляхом посилання, включаючи всі дані, таблиці, малюнки і текст, подані в роботах, що цитуються. Крім того, повний зміст робіт, що цитуються в цій заявці, також у всій своїй повноті вводиться в цей опис шляхом посилання.

Посилання на стадії відомих методів, стадії стандартних методів, на відомі методи або стандартні методи ніяким чином не повинні означати, що будь-який аспект, опис або варіант здійснення цього винаходу розкривається, описується або передбачається в цих роботах.

Наведений вище опис конкретних варіантів втілення винаходу настільки повно розкриває загальну ідею цього винаходу, що інші фахівці, використовуючи дані, відомі в цій галузі (включаючи зміст літератури, що цитувалася), можуть легко модифікувати і/або адаптувати ці конкретні варіанти винаходу для різних цілей без зайвого експериментування, не виходячи, однак, за рамки загальної концепції даного винаходу. Тому, такі адаптації та модифікації, виходячи з їх описів і пояснень, наведених в цій заявці, також входять в суть і обсяг даного винаходу як еквіваленти описаних варіантів здійснення винаходу. Слід зазначити, що фразеологія і термінологія наводиться в цій заявці лише з описовою метою і повинна розглядатися фахівцями не як обмеження, а лише як опис і пояснення в комбінації зі знаннями, якими володіє кожен фахівець.

Список послідовностей (1) Загальна інформація: (Ї) Заявник: (А) Назва: Хеда Кезеагсі апа ОемеІюортепі Со. (ла (В) Вулиця: Ууеі2тапп Іпзійше ої зсіепсе, Р.О.В. 95 (С) Місто: Кепомої (Е) Країна: Ізраїль (Р) Поштовий індекс: 76100 (С) Телефон: 972-8-93344093

(Н) Телефакс: 972-8-9470739 (А) Ім'я Умаїїаси, Оамід (В) Вулиця: 24 Вогоспом 5ігееї (С) Місто: Кепомої (Е) Країна: Ізраїль (Р) Поштовий індекс: 76406 (А) Ім'я КОМАГЕМКО, Апагеї (В) Вулиця: Вей Сіоге, МУеі2тапп Іпбзійше ої Зсіепсе (С) Місто: Кемопої (Е) Країна: Ізраїль (Р) Поштовий індекс: 76100 (ї) Назва винаходу: Модулятори функції рецепторів сімейства рецепторів ТМО/МОБЕ та інших білків (ії) Число послідовностей: 2 (м) Форма комп'ютерного зчитування: (А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: ІВМ РО-сумісний (С) Операційна система: РС-0О5/М5-005 (р) Програмне забезпечення: Раїепіїп КеІвазе 41.0, Мегвіоп 1.30 (у) Дані стосовні цієї заявки:

Номер заявки: І РСТ/ЛІ 98/00125 (мі) Дані щодо пріоритетної заявки: (А) Номер заявки: І. 120485 (В) Дата подання: 19 березня 1997р. (2) Дані послідовності 5ЕО ІЮ Мо:1: () Характеристики послідовності: (А) Довжина: 2154 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ланцюгів: один (0) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: кКДНК (їх) Опис послідовності ЗЕО ІЮО Мо:1:

ССАВАВОСТІ СТСОВОбОСС АТТВОСААТО ОСОДААСОМЮ СпесЦпОбСС АКТВІШНОВЕ а шОПТЕСТуУТТ ЩОЦІ ССТІДОСТВИ СОСТОАОС СпоТАООВО дао. І89 тостеВсуау УМИМюОбеб вшстестова соовораоє отососстсо соосттонов 180 птупвасора стросотлов стосу ФАТОАСаСТИ БОТИ ТІСТаКАВСО 253

ОВОсТОИСЯ СТИОВОХМХ СОХКАК БОКУ ПУСОВОСТЄ ХОБЛОЛСЛУ З

ІДД СОУ МИКАЕ СТО ССТОСРТИТА МУЛОССЯУТІ ТАСЛКТТАЦА З

ТІЛЬАСТАСР РЗФАТОСОСТ САСТБОВОСАТ ЗБВАСЬЛВССТ ТООСТТІАТА. ЗОЗ 326

ТОСТИ ТОМТАЄУРТУ ОАТУСТЕСАА ЯКТОРИКТУС САЯОСССУВА ТАТАССТТСА чо

ТЕСАСКСКТТ СРЗВОУСМУТО ТІСВСТОСАЄЮ ЛАТААТСАВИ ДАСТЗАССА ПЕОСТОСЛАХ му

САСАСТАНСА МОВО АТОА АСВДОСААОТ СВІТОВЕ ВАООДСАСЗЄ ДООССМИСТ як спТИТІТОА АТОВООДСВ ТВТОТТАООЗ СПТАСТІЯДА БТТТТОДАВИ ТСАСТИБАТТ. Км

СЛАБАТАМУЙ СОЖВТВТОСЄ ВБРООСАСА БОРТТСТАТЕ сстолемкох СКСТИЦИ ч25

ДОТОААХОВО ТОСААЦОА ЛАТОСУКОВІ ТОАТУАЮДОВ БОТТОТАУСВ СОСКИ 780

ЕБІТСТОВТС ССВАТШАМ СУТОАТАОО ТТаБІЛСАТИ ТТСТОВТТУ БОАООДОХІ ів

ТАСКТАСОТО ВЛОЗСАССОК АОСАКАССА СТЯТОСЬТВС СОПЛОДЛАЙТО СААЖЕТСА зе сосототТКА достоснота СЕТЕСАТОСТ СТОТІООВОО БОЛОТО ЗАСТ САСС З

ТВТОТВССТТ ТОЗЧАВАЙСТ ЗАРТОТТЗТА ААТОИТАСАЄС ТЯЛАДАТСВА САДТОАСАТИУ їобго

МІАЛСТСТОА ААРИКТІОЮА ОСТ УКССА БРАТОТТІТА УІТСАЛАЄА ОКАХСТКОЗа 15385

ПААДТАТЯО СПРАСАТЖТА САВАПЯТСТІ СЛОРДВСТОТ СТОБОСЄТСТТ ТАВАВАССВО іх

СТОР УТАТІ СТОТЕТУМ ТТІТАСССОВ СААСОВСТОА АССТЯКСАТА ТБІАТУМОа мм

ЛТТОЗТСПТСО ТІОГАТІТОСА АСІОДААСС СОСАТОТТОВ БРСТТЄТОСА ТОТТОрТо їх

ОТОТТЗТОТЕ ТУРОТИСВТВ ТОРІ ФТОТІТАСТО СТТСАМАТОА СЕСАСТЕСТО все

ТаЗАОВТРТХ ТАТАТСТОСЯ еоКтТосК ОМОДАТАСТО ТСЛОВОТТСА ДОАСАСМВАТ 1і389

ТОПЛЯЛИЛАС ТаТАСВШОАА ОБКОСЛИЛУМ СЛЮМІЛЕДЛАЄ КАТПОССОВЛА МІССВТТТ, 12558

СТОоАЛОСТОС ТУМАТКВТС ЯАСТОВИВОС ЛІТОМ ТСТ АТСССАВІОЄ СТРОСАСССТ ї309 пОбссСАтТІтТе СТАбСТОССЯ ФСТТОСТОСА БЗАДУЛАТОВ ПООСТЗАМЛТА ТОАКСАЛАЖА 1550

Ол МІУХ СОЛО ДБВОССКАТО ТО ТОВ УТ УМОВ ОСОБАМИ іще

СОСеБОЦЯЦИ ТТОЦУТУМ ЗОМ ТІК ТОПУХ ІОНИ УВИУ УА зве

МАДХОДСАТОВ ФООУВЦИХ МАТКА ДУМУ КЯМЕ ТУЗАЖТТМЇ МАУ ІННУ

ОБТОШАуСКА СТОЛОВУ СО ОСТУТУВІ ДТВУХУТІОА ЗУМИВАТТХ БАБУ це

ОсТЄСАТУТО ТТУЄІТИТТ; ТАДАКИТАСВО АТОМА КТКОЮТОС МОДТЄРОски ре

СТАТТІ ТДВТТИТуЯТ ЗУХОВОХЕ СОВОЖОСОАЄ МАВОСТТХТУВ ВОМОАТАККТ їх

ТТАТАСМУІ МІЗИСТОВІА ТАСТОВАМ датестству САСАММІУТЕ СОДУ ТО їз

ФУТ МУМКТО СІАДТІВКЮ ЗОСММТЯУЄ УСТОСТУТАИХ БІХАОАСУТУ ПЛТХУХТОАТ З

ПОХаТУТА ССЕСКУТЛОХ АВМ ТА АУТТААНАВИ КАКЛЖАМА КРАЗАВЛАА 125

ДАЗАМАМАМА ТІСТО КОПІЯ УУУУСТАОВ БУМ ШАТИ УК хе (2) Дані послідовності 5ЕО ІЮ Мо:2 () Характеристики послідовності: (А) Довжина: 591 амінокислота

(В) Тип: амінокислотна (С) Кількість ланцюгів: один (0) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮО Мо:2 го уз Аза ше Буд лту Без їеу Еко ЗХ Аз Бук ге олія біж Лкд 1 і з їх бій іржа Тхродоу КУ Ме спо БІ Жко РБо йсу бом беу Ту рто вх 25 2 У із Беи Хаї Укі Аіх Зех кі Б1у бок бох Бгто Ко Щу А) бХу Ах 35 З ЧЕ кіз Вуо ру Ату дуЗ Ахо БУЄ Ббуо дху Беу РОЗ Ако Узі бій дтя буо хо ху ва ву лі дів Суг Ягу Акт Віз бім Дів дів тіж віз ліз Зеу З: МІХ «5 "й 75 83 длро зом Лів Мія піу сім А) Аку ХУ Ху Ві5 біу бкроліу буо Аха та т чЕ

Тхз Зіу іо віх біу Бго Афв бує Ауо З1у оз Тер обех бхо то ДУ 125 хе Ко

Пежо йхи Трт дхо Бре ТВу 436 Тв їсм Ази Тус мус бр бу бо ДЕ

КЖ їж АЕ5 б3у Ахр іч бі Піх їво Ахо Бі Туг біу 538 Чо3 бе б)у Ве бво хо їз 34

ХА муай їжа її Муз дій ВЗе ляр 115 хо Аз ба доп 5ів РТо бох 145 Ух 155 165

Вох Тлгодов бак ЗМО КАБ бах су Мп олій Во» йха біо Що без 513 155 Ута ие

ТЕ вх Зех ДП осі Тк Зк Ме БІіх дор бій бій гуо Язх хр Зах 38 ії ї55

Би бі» бЬу іп дія дія бій зв ЗЛУ Маф тки доп дор Ар боу БЕ 185 ЖК 253 цез Зіу ро Зек бі: Ази бе сія Лів 035 Зех 236 БМ Авр воп Вів

Та тій 150 нів мес діа ЗМ П3у Умк бзу Ре тує 2бо Зно сію бо Мет ї6у Суз 225 2 3 іо

Бек бій Бех Ужі Зіч б3у бін уаї Рго біз Вер обец біц бх йбо Ту 245 250 235

Сів Бек віх Абр суб Зні хо ліз дя Аєрд біз беу 238 Ув3 за ів 26895 255 ато

Міо тем бсу МЕЖ їмо Б30 Жегобіу Тух І18 бо Зі ЗІу Тр бім Аїа 275 288 535 жук дів фо Бет Мет Рко ім буз Тхр уз їсц обох б1у умі Тух Цув 29 255 з зви бій Тух Меї Яіо Ехо БЕ. Суз 015 С1У Бех Зех ДІіз Трт Ту Тбк 5 зм 335 353

Суя Уаї Бко їй біу й5п оре» дію Уа) Узі) два Ліо ТКЕ Цез Був Це 3х5 330 325

Ба деп бін їі» ах ет Ме) уз йгу бец бій ох іх буФ біз Кер 345 3:15 355 пе Ті бух Був бімх шуб іже О1у біо Лхе Ухі Ліз пев бів Тух Був заз зо За5

Вар обси біб пуб бед бех бгу Пе РВЕ Му АБр обі? фцо Ухі Тух Бо

Зо 35 332

Без іно Аїх Ре ТМ вхо пів Віз Бео Авп без ту дер Уаї Рбе Бу зак 230 395 А їмо У»і Узі Го го рей 61; ем вуз Мем Ах Кі ре АУд дао 05 305 «м 315

Азер хі Агу Зсу Узі ШЕЧ Бех рео Зех ліз Маф Су Аки Азроїем ЕВе 420 425 430 лах для пвх йо дев Бко їеу їом Ттр Аку БМе іо Тукт ем Агу дор 435 зв 455 ре луФ дар Дап Тс Ук) дк Маі 0іх Яр ТУ Дер Тхр шує спів реа 235 355 зб бук вхз Мує АхУ Віз їі бій ДкО Му біз Зв руо бух ЗАЛУ хо ре 255 та 5 чо

Уа) Мас йон їех бго Зек вх ТП ВАВ ЇВ Ті Ро РБе Хух Кто Ак» 255 490 485 тка Цви Біх Ро хз Бо рМе Бро Бех Зех Аг бе; Рко Рго Піу їі 506 55 ща

Тіз 51у біт січ тТух АороЗІіМ Агу Кго Тис фо Руб Тухг Уаі 5Му дер ів 520 Зх

Тез Тіе Зах бех ву Фо Бхо Б3іу Руб бі» 035 Ткк о руо бек бів РЕ 5530 535 ща

Тко Рез йей Ака Рхо Згу РБе Аврорго Уві біу ро їй вуо б3у Бо ах 50 55 ві

АепоРга І1Є Ітбі хо 01у ДуФ ПІУ СІМ бго Лев Авр Ага Блє Рго ров 555 37 55

Бху Рі? Ве Аха 51Уу вдо ртго Тне АЗрР б1у дк без йох Яке Ммеє 585 585 вк ов 1.2: Ше. о 1 59 1 і сиМААнИсСтТт ФТОСАСОТСІ АТТКОСАМТІ ОСПСАХАМОСЯЇ ПАЦОФОКИ СТІ г У

ХМ ТТТ ШСОСОТЕТОМ ПОТОацетАЄ ОСПоТІАОУХ Порти ос паст псоо 1

КТ ОТОсТІдисСстТ ТУЮ АО АСТСТОПО ОСпИКУМАМ ПІЦИ слдостю у) ав шТпадДосст стТобОСПоЯс СІОПФНОСВТ о сятпдетото ПоЗОМиОИЄ ФУсСТТАЛОсоЯ З; 311 оасстооспо сТоСАСИТВ СОбАЄСОСХА ОсПобИСТО5Ь БІОТИ ФОДАЧАМСАТОМИ)

Зо» ФипеФфосСст ССОСТойОСтТ СТОПТССССТ СИТОУГООТА АТОМ ЗУСАМТТАТА 35

ОМ ТТСААСТАТА АССХТСПОСТ САСТЕСАСАТ САЛСАСАТСТ ТОДСТЯСАТЬ ФИЛОАТУИТТ 252

ЗІВОЗІТО АТ ТОАТАТЯТРТ ЖАТУШТТСАЛ ЗАТОАСАТТИ ЗМЗІОЛЕТАА ТАТаОстТІА а5О

ЖО1 ТІСАСАСАТІ ФАФКОСАТІХ УТГАФТЕСКО ОМАТААТЯМ АХСТВЯАЄ САССТФТАВЕ ОВО

ЗІ САСАСТАОІУ ТОСКОЗАТИХ АСКАШСАМТ ОСАТРТАТУЄ АМЛАСАЦЕУ МОССИАСТОЖ ЛО

АЗОТ ТТОЗМ АТОКООАСА АТ ТТАО2О СІТАСМААМ АУТТТІМАФСС ТІДОТИААЛУ ВО «ФК СУКТАТААТІ ППСАТАТУ АбКОЦЖАТА ОПОТТТСТАТ ФПТАТМАСС СКЛЕЄТСТуВ 13у 721 ВЕТІААТИІ УСЙААЗОІ АШТОПАПАВ ОТАТТАБАЛМ СПТУ МА ММАУТЯМ ІВ)

ТКІОТУСКТОСАТО СЄАЛТЦАТО ФТІФАТУТВ ОТТСАТАТАТ ТТІТОАТИТТ ФІВОТсАСУТ ЗУ 241 ТМСАТАССТО ХООСАСООА АПЛІААМУВІА ОПТБТОЛАТЕО ШЕОУХАМІТЯ САВИТТАЦІ ВУХ

Зі попЛугоТАТА АОСТОПАДТЬ СХТОСАТИСТ сІСТОлОХОя ЧПАОІСТОй УАСЖСТІАСХ Й

ЗБ ТОМУ РИСЛТЕ ТООЛКМТІСТ САТІЛТТатА ОДЛУТАТІШ ТАДЛАМТІМА САЛТОТАТІ ЩІ

І15І1 АПВАНТВТНА АМАСАТУТА ОПІЕЄТАССА ОСААТЛТУТТТА ТОТПОМАХМИА ПААМОФьиОВ МІК

ДО2і САВААТОТАФ ССАМАТАТА САВАСУТІУТ ОСАПОАЛСТСТ СТСПУуСТОТІ ТОАМЖАХОЛЯ 115

ММ стооТотТУуМ СТсТтТУЦОП ТТТУАССІВА ОТААССАСТОХ КССТМІЛИМ ТММ ТІОМ 2129 1 ТтОПтТооТОс ТСССАТМАА ОС АСТІАААФТА Ше ТСТ МИТУСТУТ» ТОТТОУТМИМ Кг 1222 сто тТотт ТОТОТУудот Тс утТеКс УМОВУ ПТХІААХТІА ФСЕМІТИСТУ 3129 1311. ТОАСИТТТ ТАТАТЕИЄ ЗОМ Х ОЗАПАДТАЄТО ТСАСАПТТІМ АЗАТАСАТМВ 1135

ЗІВІ ТОБАЛАСИЛІ ТОТКІМІЗАХ ПРСЄСАЄМТА ПАЛАСААМАФ АМТФСТЕЧАА здопІоптт? Ма 1411 ТОАТОСУСІ ТОССАТІЗТЄ АДЛОТОАТАТЄ ОХОТОСАТКІТ АТСФСАЛТОС СтІВІММОТ 1205 15855 АОС СТЛОТТООСО СоТУССТОТА ВОМУ ТАТИ МИКРМІВАТА ТИЗОПРААВА ТЕ звЕ) СОМАсТАСТТУ КСТАТОТТИО АОМОССАММО АТИМАСТІЙ ТТ Тома цАФТ і

УЄЖЕ СССАСИСАЛТ УРОСТЕІМІТ ПпРЗАСІАСОС ТРТЛАУТИТАЄ ТТПОПИТАЄХ ТПИМІСАЄСТ їйВ5Е з2ВІі ААШОСУ ТТ ТТИСАШОФІо АОБІЦОССОС АХАТІМУ АТ ІТОФСТТТАЄ АСЕТАСПАИт АТЯЄ

ЕТ1 соми МА СТСАТИОСТО ОТОТОМУТС КТОТСАТТЯА ТУТОТАЖТМЄ? САТТТСТОСА 3870 1591 ВТУСАТІТИ ТУРУЄТУТИ ТКАХСТАЄМ: ОАТИТВАТТО ФОТЦЄЮТЦЄ УОМТОТОВАХ 1855 182 ЙИТАУСКОЇ ТОДТТСТИУ СРІЦАСАЧИУТ ОССАФЧОПОМІ ААМІТТІТА АОМОМТАТАТ 1 1225 ЗТУРАЦІССТ МІОДЯТХОТА ТІАСОСАМАЄ ОУТТОТТІТОТ ПАІАЖМТТО оусТтоЗалА УВІ 353: ТАДСТОСТ ПШСААТЮТИ УООТОТТЦУТ ТОД УСТАЗ АТТОХМАСУРВ? отТРуЄСтТоМт Зо їОчІ БОУТИМОЄТА СОМБДТТМАД АЙМАМИТИТА МАТУЗААМАЙ АМАХМАВМАХ ВААМАЛААМА ІСТ.

ТІ) КУМАМАВАХХ ТТ ДССПІ ПОСТОМ ОТОСАТСТУМ СбОІОТОАТІ ТМ У мі ! 1 І 25 Н 15 ! 3 ; т- Н бо кт х 1 їх і що Н 7 ї КК Н 33 : «ї

І ЕЖАЗАКРЕРЕ МКФАСВРОК ФГРЗРЕКЬЯУ ОРБАТСУАЕРЕ ЗВТРЕМІМА» ЗЕАЖТЕКАТАИ 25

ТА ФТІАЖКААСКИ БЕЛАСОАБЕА пЬДЛОСАМЯС АУРА РІЕН СТАБАОТИ В ам УВЕТТ 51

ОМ МУКУ ЕКІщО ВЖТСАБЖОХУ дОПУЛІВІМО ОСІ АВХАВІ ТОБЖИЕІУ? МУЕЛЬДТУВИ 027

ПИВО ШОВ РЕГОБОААСІ ЯСНО ВМИЙ ОБІОНТЯХЕВІ СТХММУЄЄТ БРУРЗЕВНМЄ 15

ТИ ЗАЖСЕЕУСЕК ЗОСТЬКЦІАО СОБАВОУМІХ СТИ ІМОВІО УХКТОУУАМАА ПЕМРУЕКОЗКЦЮ УТ

БІ СУУКОдІМНУ БОІЖОБЛАТОХ СТІЛ УХ МАТЬКТНМИІ ШІЛУКАТМЕ ФЕЕІСКІКуй Б

І:51 ШХУАМЕТКВО ЗМОПКОККЦЄ ПОЖУЦСАКТХ ЗАКІНЧУЄ ЗТУСВОВІКЬ ЗІБЩМІЛУДЕ 2 451 ФБЕІІУУЦКАКВ ЦПЕТАБКРЕМО МАБОТУДИОВ ОБМТУДУЙТТО МКХБТККАКІ СКХЕОТАБАК ВО 131 МОР УЕТНТ ІРЕХІБЖЬИЕ ВЕРБІБЩЬЯХ ОЗТЛОУДНОМ УЮ ФТЕЕТУЄФРІ СВСІОФІШК 24 ЗЗР МаР» БЖИЖУЗЕЦЖТЕ МУРІВ ОМОБРЕРКТМХ ФАРБУЄ В ЖІ її В 1 ж ро-5е рок ха ох - Яи мо і ик

Claims (21)

1. Послідовність ДНК, яка кодує поліпептид, що має активність КІР-асоційованого білка (КАР), причому зазначена послідовність ДНК здатна гібридизуватись з послідовністю ДНК, наведеною на фігурі 1, в помірно жорстких умовах.

2. Послідовність ДНК за п. 1, де активність КАР характеризується тим, що (1) КАР сам по собі не токсичний щодо клітин при надекспресії; (11) КАР не захищає клітини від знищення ТМЕ і, таким чином, не є інгібітором ТМЕ- індукованої цитотоксичності; (11) КАР сам по собі не індукує МЕ-кВ; (іу) КАР блокує активацію МЕ-кВ ТКА, КІР і ТМЕ-К; 1/або (у) КАР блокує індукцію кінази /ип (ЛАК), викликану КІР.

3. Спосіб одержання послідовності ДНК за п. І або 2 шляхом застосування дріжджової двогібридної методики, причому зазначена методика включає такі стадії: (а) одержання одного гібридного вектора, що несе послідовність, яка кодує КІР, що не містить домену загибелі, 1 другого гібридного вектора, що несе послідовність з бібліотеки КкКДНК або геномних ДНК; (б) трансформування дріжджових клітин-хазяїв векторами зі стадії (а); (в) виділення позитивно трансформованих клітин; 1 (г) виділення з позитивно трансформованих клітин зі стадії (в) зазначеного другого гібридного вектора для одержання вказаної послідовності ДНК, що кодує поліпептид, який зв'язується з зазначеним КІР.

4. Вектор, що включає послідовність ДНК за п. 1 або 2.

5. Вектор за п. 4, здатний експресуватись в еукаріотичній або прокаріотичній клітині -хазяїні.

6. Вектор за п. 4 або 5, який являє собою рекомбінантний вектор на основі вірусу тварини, що несе послідовність ДНК, яка кодує білок вірусної поверхні (ліганд), який здатний зв'язуватись зі специфічним рецептором клітинної поверхні на поверхні клітини, що підлягає трансфекції зазначеним вектором, і другу послідовність ДНК, що включає послідовність ДНК за п. 1 або 2.

7. Вектор за п. 6, де рецептор клітинної поверхні специфічний щодо пухлинних клітин, ВІЛ- інфікованих клітин або інших патологічних клітин.

8. Трансформована еукаріотична або прокаріотична клітина-хазяїн, яка містить вектор за пп.

4-7.

9. Спосіб одержання поліпептиду, що має активність КІР-асоційованого білка (КАР), який включає вирощування трансформованих клітин-хазяїв за п. 8 в умовах, придатних для експресії зазначеного поліпептиду, що здійснюють посттрансляційні модифікації, необхідні для одержання зазначеного поліпептиду 1 виділення вказаного експресованого поліпептиду.

10. Поліпептид, що не містить домену загибелі, модуля МОКТ, протеазного домену, кіназного домену/мотиву і домену ТКАЕ, який має амінокислотну послідовність, що кодується послідовністю ДНК за п. 1 або 2, або який одержується відповідно до способу за пунктом 9.

11. Поліпептид за п. 10, де зазначена послідовність являє собою пептид.

12. Спосіб модуляції або опосередкування іп уйто модульованих/опосередкованих КІР внутрішньоклітинних ефектів на каскади реакцій запалення, клітинної загибелі або виживання клітин, в яких КІР бере участь прямо або опосередковано через інші модулятори/медіатори цих каскадів реакції, який включає обробку зазначених клітин одним або кількома поліпептидами за п. 10 або 11, здатними зв'язуватися з КІР і модулювати чи опосередковувати зазначену внутрішньоклітинну активність КІР, причому зазначена обробка зазначених клітин передбачає введення в зазначені клітини вказаного одного чи кількох поліпептидів у формі, придатній для їх внутрішньоклітинного введення; або введення в зазначені клітини послідовності ДНК за п. І або 2, яка кодує зазначені один чи кілька поліпептидів, у формі підхожого вектора, що несе зазначену послідовність, причому вказаний вектор здатний вводити зазначену послідовність у зазначені клітини таким чином, що вказана послідовність експресується у зазначених клітинах.

13. Спосіб за п. 12, де зазначена обробка вказаних клітин здійснюється шляхом трансфекції вказаних клітин вектором за п. 6.

14. Спосіб модуляції іп уйго КІР-модульованого/опосередкованого впливу на клітини, який включає обробку зазначених клітин олігонуклеотидною послідовністю, яка кодує антисмислову послідовність принаймні частини послідовності ДНК за п. 1 або 2, причому зазначена олігонуклеотидна послідовність здатна блокувати експресію білка КАР.

15. Спосіб за п. 14, де зазначену олігонуклеотидну послідовність вводять у зазначені клітини за допомогою вектора за п. 6 1 де зазначена друга послідовність зазначеного вірусу кодує вказану олігонуклеотидну послідовність.

16. Спосіб модуляції іп уйто дії КІР на клітини, який включає застосування рибозимної методики, де вектор, що кодує рибозимну послідовність, здатну взаємодіяти з клітинною послідовністю МРНК, яка кодує поліпептид за п. 10 або 11, вводять у зазначені клітини у такій формі, яка забезпечує експресію зазначеної рибозимної послідовності в зазначених клітинах, і де у випадку, якщо зазначена рибозимна послідовність експресується в зазначених клітинах, вона взаємодіє з зазначеною клітинною послідовністю мРНК і1 розщеплює зазначену послідовність мРНК, що призводить до інгібування експресії зазначеного поліпептиду в зазначених клітинах.

17. Спосіб виділення і ідентифікації поліпептидів за пп. 10 або 11, здатних безпосередньо зв'язуватися з КІР, який включає застосування дріжджової двогібридної методики, де послідовність, яка кодує КІР, що не містить домену загибелі, міститься в одному гібридному векторі, а послідовність з бібліотеки кКДНК або геномних ДНК міститься в другому гібридному векторі, причому дані вектори потім використовують для трансформації дріжджових клітин-хазяїв і позитивно трансформовані клітини виділяють з подальшим виділенням зазначеного другого гібридного вектора з одержанням послідовності, яка кодує білок, що зв'язується з зазначеним КІР.

18. Спосіб модуляції Шо УШшО процесів, які прямо або непрямо опосередковуються/модулюються КІР, 1 які включають інгібування МЕ-кВ 1 ЛУК, де зазначений спосіб передбачає обробку зазначених клітин одним чи кількома поліпептидами за пп. 10 або 11, здатними зв'язуватися з КІР де зазначена обробка клітин передбачає введення в зазначені клітини зазначеного одного чи кількох поліпептидів у формі, придатній для їх внутрішньоклітинного введення, або введення в зазначені клітини послідовності ДНК за п. 1 або 2, яка кодує зазначені один чи кілька поліпептидів, у формі підхожого вектора, що несе зазначену послідовність, причому зазначений вектор здатний вводити зазначену послідовність в зазначені клітини таким чином, що зазначена послідовність експресується у зазначених клітинах.

19. Фармацевтична композиція, яка містить послідовність ДНК за п. 1 або 2, вектор за п. 6 або 7, поліпептид за п. 10 або 11, олігонуклеотид, що кодує антисмислову послідовність принаймні до частини зазначеної послідовності ДНК, або вектор, що кодує рибозим, здатний взаємодіяти з МРНК, що кодує зазначений поліпептид, і необов'язково фармацевтично прийнятний носій.

20. Застосування вектора за п. 7 для приготування фармацевтичної композиції, призначеної для лікування пухлин, СНІДу та інших захворювань, при яких експресуються специфічні рецептори клітинної поверхні.

21. Застосування послідовності ДНК за п. 1 або 2, вектора за п. 6 або 7, поліпептиду за п. 10 або 11, олігонуклеотиду, який кодує антисмислову послідовність принаймні до частини зазначеної послідовності ДНК, або вектора, що кодує рибозим, здатний взаємодіяти з МРНК, яка кодує зазначений поліпептид, для приготування фармацевтичної композиції, призначеної для модуляції дії КІР на клітини або для лікування пухлин, запальних захворювань, СНІДУ, септичного шоку, відторгнення трансплантата, гострого гепатиту, аутоімунних захворювань або цукрового діабету.