KR20000075718A

KR20000075718A - Ｔｎｆ/ｎｇｆ 수용체 페밀리의 수용체의 기능을 조절하는 물질

Info

Publication number: KR20000075718A
Application number: KR1019997007787A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 왈치; 안드레이 코발렌코
Original assignee: 폴리나 벤-아미, 야코브 코헨; 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 1997-03-19
Filing date: 1998-03-19
Publication date: 2000-12-26
Also published as: CN1250479A; JP2001519656A; US20030039646A1; US7189535B2; IL131929A0; CA2281738A1; AU6634798A; US20020058024A1; NO994524L; EP0972033A1; UA72186C2; HK1025127A1; IL131929A; EA199900842A1; BR9808915A; US7083788B2; WO1998041624A1; CN1189564C; AU747005B2; EA006874B1

Abstract

RIP의 기능을 조절하는 단백질에 대해 설명한다. 또한, 이들 단백질을 생산하는 것과 이들의 용도에 대해서도 설명한다.

Description

ＴＮＦ/ＮＧＦ 수용체 페밀리의 수용체의 기능을 조절하는 물질{MODULATORS OF THE FUNCTION OF RECEPTORS OF THE TNF/NGF RECEPTOR FAMILY}

종양 괴사 인자(TNF-α)와 임파톡신(TNF-β)(이하 TNF는 TNF-α와 TNF-β를 모두 말하는 것이다)는 단핵 식세포에 의해 주로 만들어지는 다기능 전(pro)-염증성 사이토킨으로 세포에 많은 영향을 준다(Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; and Beutler and Cerami (1987)). TNF-α와 TNF-β는 특정 세포 표면 수용체에 결합함으로써 이들의 영향이 나타난다. 일부 효과는 유기체에 유익한 것으로, 예를 들면, 이들은 종양 세포 또는 바이러스에 감염된 세포를 파괴하고, 입상세포의 항균 활성을 증가시킨다. 이와 같은 방식으로, TNF는 종양 및 감염성 물질에 대해 유기체의 방어기작에 관여하고, 이러한 손상으로부터 회복할 수 있도록 한다. 따라서, TNF는 항-종양 물질로 이용되어, 종양 세포 표면에 있는 이들 수용체에 결합함으로써, 종양 세포를 죽음에 이르게 한다. TNF는 또한 항-감염성 물질로 이용될 수도 있다.

그러나, TNF-α 및 TNF-β는 유해한 효과를 가지기도 한다. 몇 가지 질병에서는 TNF-α의 과도한 생산으로 인하여 주요 병인 역할을 한다는 증거가 있다. 예를 들면, 맥관구조에서 주로 TNF-α의 효과는 폐혈증 쇼크 증상의 주요 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Tracey et al., 1986). 일부 질병에서, TNF는 지방세포의 활성을 억제하여, 식욕감퇴를 일으켜 괴도하게 체중이 감소되는 원인(악액질)이 되어, TNF-α를 카테친(cachetin)이라고도 한다. 또한, 류마티스 질환에서는 조직 파괴를 조적하는 중개물질로 설명되고(Beutler and Cerami, 1987), 이식편-숙주 반응에서 관찰되는 손상의 주요 중개물질이라고도 한다(Piquet et al., 1987). 또한, TNF는 염증 과정 및 많은 다른 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다.

두 개 별개의 독립적으로 발현되는 수용체인 p55 및 p75 TNF-Rs(각각 특이적으로 TNF-α 및 TNF-β에 결합됨)는 상기에서 설명하는 TNF의 생물학적 효과를 개시하고 조절한다. 이와 같은 두 개 수용체는 구조적으로 다른 세포내 도메인을 가지고 있기 때문에 이들은 다른 시그날을 만든다고 한다(Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; and Heller et al., 1990)). 그러나, 예를 들면, p55 및 p75 TNF-Rs의 세포내 시그날 발생에 관계하는 다양한 단백질 및 다른 가능한 인다의 세포내 메카니즘에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. TNF(α또는 β)와 같은 리간드가 수용체에 결합한 후에 발생하는 세포내 시그날은 일련 반응이 시작되도록 하여 결국 TNF에 대해 세포의 관찰된 반응이 나타나게 하는 것이다.

현재까지 연구된 대부분 세포에서 상기에서 설명하는 TNF의 세포파괴 효과에 있어서, 이와 같은 효과는 주로 p55 TNF-R에 의해 촉진되었다. p55 TNF-R의 세포외 도메인(리간드 결합 도메인)에 대한 항체 자체가 세포파괴 효과를 촉진하는데(EP 412486참고), 이는 항체에 의해 수용체 교차 연결의 효과와 관련이 있는 것으로 세포내 시그날 발생 과정의 발달의 처음 단계로 보인다. 또한, 돌연변이 연구에 따르면(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993), p55 TNF-R의 생물학적 기능은 세포내 도메인의 보전성에 따라 달라지고, 따라서, TNF의 세포파괴 효과를 유도하는 세포내 시그날는 p55 TNF-R의 두 개 이상 세포내 도메인이 연합된 결과로 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, TNF(α및 β)은 동종삼량체로 발생되기 때문에, 수용체 분자에 결합하여, 교차 연결되는 방법(가령, 수용체 응집을 일으키는)으로 p55 TNF-R를 통하여 세포내 시그날을 유도하는 것으로 알려져 있다.

TNF/NGF 슈퍼패밀리 수용체의 또 다른 요소는 FAS 수용체(FAS-R)로 이는 FAS 항원으로 불리기도 하였는데, 이는 다양한 조직에서 발현되는 세포 표면 단백질로써, TNF-R 및 NGF-R를 포함하는 다수의 세포-표면 수용체와 상동성을 공유한다. FAS-R는 아포프토시스 형태로 세포 죽음을 중개하고(Itoh et al., 1991), T 세포가 성숙되는 동안에 자가활성을 가지는 T 세포의 네가티브 선택물질로써 작용하는 것으로 보인다. FAS-R는 자체-항원을 인지하는 T 세포의 아포프토시스성 죽음을 중개한다. FAS-R 유전자(lpr)에서 돌연변이는 쥐에서 임파증식 질환을 일으키는 것으로 알려져 있는데, 이 질환은 사람의 자가면역 질환 전신 홍반성 낭창(SLE)(Watanabe-Fukunaga et al., 1992)과 유사하다. FAS-R에 대한 리간드는 킬러 T 세포(또는 세포독성 T 임파세포-CTLs)에 의해 운반되는 세포-표면 연합된 분자인 것으로 보이고, CTLs이 FAS-R를 가지는 세포와 접촉하였을 때, FAS-R를 가지는 세포의 아포프토시스성 세포 죽음을 유도할 수 있다. 또한, FAS-R에 특이적인 단클론 항체를 준비하고, 이와 같은 단클론 항체는 사람 FAS-R를 인코드하는 cDNA에 의해 형질변환된 생쥐 세포를 포함하는 FAS-R를 가지는 세포에서 아포프토시스성 세포 죽음을 유도할 수 있다(Itoh et al., 1991).

출원인은 다수의 출원(EP 186833, EP 308378, EP 398327, EP 412486)에서 TNF 수용체에 이것이 결하보디는 것을 저해하여 TNF의 유해한 효과를 조절하는 것에 대해 연구를 하였는데, 이때 세포 표면에 결합된 TNF-Rs에 TNF가 결합되는 것과 경쟁을 시키기 위해 가용성 TNF 수용체(수용체의 가용성 세포외 도메인이 필수적)를 이용하거나 항-TNF 항체를 이용하였다. 또한, TNF의해 효과를 유도하기 위해서는 TNF 수용체에 TNF가 결합해야 한다는 기본 조건하에, 출원인은 TNF-Rs의 활성을 조절함으로써 TNF 효과를 조절하도록 하였다(EPO 568925).

간단하게 설명하면, EPO 568925는 TNF-Rs에서 시그날 변환을 조절 또는 절단하는 방법에 관한 것으로, 펩티드 또는 다른 분자는 수용체 자체 또는 단백질과 상호작용할 수 있는 다른 효과물질과 상호작용하여, TNF-Rs의 정상 기능을 조절한다. EPO 568925에서는 p55 TNF-R의 세포외 도메인, 막통과 도메인, 세포내 도메인에 돌연변이을 가지는 다양한 p55 TNF-Rs 돌연변이를 작제하고, 이의 특징을 조사하였다. 이와 같은 방식으로, 수용체의 기능가령, 리간드(TNF)의 결합, 이어서 시그날 변환 및 세포내 시그날 생성시켜, 종국에는 세포에서 TNF에 의해 유도되는 효과가 발생하는데 있어서 필수적인 p55 TNF-R의 상기 도메인에 있는 부분이 있다는 것을 확인하였다. 또한, TNF-R의 상기 다양한 도메인에 결합할 수 있는 단백질, 펩티드 또는 다른 인자를 분리 및 확인하는 여러 가지 방법에 대해 설명하는데, 단백질, 펩티드 및 다른 인자는 TNF-R의 활성을 조절 또는 변조하는데 관계한다. 이와 같은 단백질 및 펩티드를 인코드하는 DNA 서열의 분리 및 클로닝하는 방법; 이들 단백질 및 펩티드를 생산하기 위한 발현 벡터의 작제 방법; TNF-R의 다양한 부분에 겨랍하는 상기 단백질 및 펩티드 또는 TNF-R와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편을 준비하는 방법등이 EPO 568925에 설명되어 있다. 그러나, EPO 568925에서는 TNF-Rs의 세포내 도메인(가령 p55 TNF-R)에 결합할 수 있는 실제 단백질 및 펩티드를 특정화시키지 못하였고, TNF-Rs의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 이와 같은 단백질 및 펩티드를 분리 및 확인하기 위해 이스트 두 개 하이브리드 방법에 대해서도 설명하지 않았다. 유사하게, EPO 568925에서는 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 대해서 설명하지 못하였다.

종양 괴사 인자(TNF) 수용체 및 세포에서 구조적으로 관련된 수용체 FAS-R가 백혈구 세포에 의해 생산되는 리간드에 의해 파괴 활성을 촉진시켜, 소멸되도록 하는 것은 공지되어 있지만, 이와 같은 자극 메카니즘에 대해서는 아는 것이 별로 없다. 돌연변이 연구에 따르면, 세포 독성을 위한 FAS-R 및 p55 TNF 수용체(p55-R) 시그날 발생은 세포내 도메인내에 별개 부분이 관여한다는 것을 알았다(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). 이들 부분("죽음 도메인" 또는 'DED'이라고 불리는 "죽음 효과 물질 도메인")은 유사한 서명을 가진다. FAS-R 및 p55-R의 "죽음 도메인"은 자체-연합하는 경향이 있다. 이와 같은 자체-연합이 실제 수용체 응집을 촉진시키고, 이와 같은 응집은 시그날 발생을 개시하는데 필수적이며(see Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), 상당 수준의 수용체가 발현되는 경우에 리간드와는 무관한 시그날 발생이 일어난다(Boldin et al., 1995).

다른 수용체에 의해 유도되는 효과와 같이, TNF 수용체 및 FAS-R에 의해 유도되는 세포 족음 유도는 리간드-수용체 결합으로 시작되는 일련의 단백질-단백질 상호작용을 통하여, 결국 효소 효과물질의 기능이 활성화됨으로써 발생되는 것으로, 수용체에 삼량체 TNF 또는 FAS-R 리간드 분자가 결합하여 세포를 죽게하는 시그날이 개시되는 비-효소 단백질-단백질 상호작용을 설명하였는데, 자체 연합하는 죽음-도메인 모티프(또는 즉음 효과물질 도메인, DED)의 성질(Boldin et al., 1995a)에 의해 증가되고, 수용체의 세포내 도메인에 대해 두 개 세포질 단백질 즉, MORT-1(또는 FADD)가 FAS-R에 결합(Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) 및 TRADD가 p55-R에 결합(Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996)되는 것을 유도하여 이들 세포내 도메인의 상호작용이 나타나게 된다는 것이다(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). 이스트 두 개 하브리드 스크리닝 과정을 통하여, 연합된 상동 부분을 통하여 수용체에 의해 세포 죽음이 유도되는데에는 "죽음-도메인" 부분에서 FAS-R 및 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 세 가지 단백질이 관련된다는 것과 독립적으로 세포 죽음을 촉진할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 단백질 중에 하나는 MORT-1 (Boldin et al. 1995b)로써, FAS-R에 특이적으로 결합하는 FADD(Chinnaiyan et al., 1995)으로도 알려진 것이다. 두 번째 것은 p55-R에 결합하는 TRADD(see also Hsu et al., 1995, 1996)이고, 세 번째 것은 FAS-R 및 p55-R에 결합하는 RIP(see also Stanger et al., 1995)이다. FAS-R 및 p55-R에 결합하는 것이외에도, 이들 단백질은 서로 결합하여, FAS-R 및 p55-R 사이에 기능적으로 "교차"할 수 있는 능력을 가진다. 이와 같은 결합은 수용체 및 연합 단백질에 공통인 "죽음 도메인 모듈"("죽음 효과물질 도메인"의 약어인'DED'라고 부름)인 보존된 서열 모티프를 통하여 발생된다. 또한, 이스트 두 개 하이브리드 테스트에서, MORT-1는 포유류 세포에서 자발적으로 FAS-R에 결합하나, 이와 같은 결합은 수용체의 자극이 있어야만 발생되기 때문에, MORT-1가 FAS-R 시그날 발생의 초기 단계에 관여하고, MORT-1에는 효소 활성 특징이 있는 임의 서열 모티프를 가지고 있지 않으며, 따라서, 세포 죽음을 촉진시키는 이들의 능력은 MORT-1 자체의 고유 활성이 관여되는 것이 아니라, MORT-1에 결합하여 시그날발생 일련 반응의 하류에서 작용하는 일부 다른 단백질의 활성에 의한 것이 아닌가 하는 제안을 하였다. 분자의 N-말단이 없는 MORT-1 돌연변이를 세포내에 발현시키면, FAS/APO1(FAS-R) 또는 p55-R에 의한 세포 독성 유도가 차단되는 것을 볼 수 있기 때문에(Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), N-말단이 단백질-단백질 상호작용을 통하여 수용체의 세포파괴 효과에 대한 시그날을 전달하는 것임을 알 수 있다.

따라서, 수용체 p55-R 및 FAS-R의 "죽음 모티프" 뿐만 아니라 이것이 연합된 MORT-1, RIP, TRADD 단백질도 단백질-단백질 상호작용 부위가 되는 것으로 보인다. 세 개 단백질 MORT-1, RIP, TRADD는 수용체에 이들 죽음 도메인이 결합함으로써 p55-R 및 FAS-R 세포내 도메인과 상호작용하고, RIP 및 TRADD의 경우에, 이들 죽음 도메인은 자체 연합되지만, MORT-1는 이들 죽음 도메인이 자체 연합되지 않고 다른 특징을 가진다. 또한, MORT-1 및 TRADD는 FAS-R 및 p55-R에 상이하게 결합하고, 또한, 서로 결합된다. 또한, MORT-1 및 TRADD는 RIP에 효과적으로 결합한다. 따라서, 세 가지 단백질 MORT-1, RIP, TRADD사이에 상호작용은 이들 단백질에 의해 중개되는 세포내 시그날 발생의 전반적인 조절에 상당히 중요한 부분이 된다. 이와 같은 세 가지 세포내 단백질사이에 상호작용을 간섭하면, 이들 상호작용에 의한 효과를 조절하게 되는 것이다. 예를 들면, MORT-1에 결합하는 TRADD를 저해하면, FAS-R-p55 TNF-R 상호작용을 조절하게 된다. 유사하게, MORT-1에 TRADD의 결합을 저해하는 것에 추가하여, RIP를 저해하면, FAS-R-p55 TNF-R 상호작용을 조절하게 된다.

p55-R의 "죽음 도메인"에 대한 단클론 항체, 특히 TRADD 및 RIP의 결합 부위에 대한 단클론 항체를 이용하여, 이들 단백질의 결합을 방해 또는 저해하고, 따라서, FAS-R 및 p55-R사이에 상호작용을 조절하게 된다.

또한, 다양한 수용체 및 FAS-R, p55-R, MORT-1, TRADD, RIP, MACH, Mch4, G1을 포함하는 이들의 결합 단백질에 의해 중개되는 세포독성 활성 및 이의 조절이외에도, 다수의 이들 수용체 및 이들의 결합 단백질이 핵 전사 인자 NF-κB의 활성 조절에 관여하는 것으로 보이는데, 이 인자는 세포 생존에 중요한 중간물질로써, 많은 면역 및 염증 반응 유전자의 발현을 조절하는 담당을 한다. 예를 들면, TNF-α는 실제 NF-κB의 활성을 자극하여, TNF-α는 세포에 두 종류의 시그날을 유도할 수 있는데, 하나는 세포 죽음을 유도하는 것이고, 다른 하나는 NF-κB를 통하여 유전자 발현을 유도함으로써 죽음 유도에 대해 세포를 보호하는 것이다(see Beg and Baltimore, 1996; Wang et al., 1996; Van Antwerp et al., 1996). FAS-R에서도 이중 효과에 대한 보고가 있었다(이 효과에 대해서는 Van Antwerp et al., 1996 참고). 따라서, TNF-α 및 FAS-R 리간드에 의해 다양한 세포를 자극하는 경우에, 세포 죽음 및 세포 생존간에 미묘한 균형이 존재한다는 것을 알 수 있고, 자극을 받은 세포내 경로의 결과가 다소 클 경우에, 세포는 죽게되거나(통상 아포프토시스에 의해), 또는 NF-κB의 활성화를 통하여 세포는 생존하게 된다.

또한, 본 발명자는 TNF/NGF 수용체 구성요소가 NF-κB를 활성화시켜 가능한 과정을 밝혔다(see Malinin et al., 1997, 다양한 참고문헌, 공동 계류중인 출원 이스라엘 특허 출원 IL 117800; IL 119133). 간략하게 설명하면, TNF/NGF 수용체 페밀리의 일부 구성요소는 통상적인 어뎁터 단백질인 Traf2를 통하여, NF-κB를 활성화시킬 수 있다. 새로 밝혀진 NIK라고 불리는 단백질 카이나제(see above Malinin et al., 1997 and IL 117800 and IL 119133)는 Traf2에 결합할 수 있고, NF-κB 활성을 자극할 수 있다. 사실, 카이나제-결손된 NIK 돌연변이에서 발현되면 세포는 정상적인 내생 방식으로 NFκB을 자극할 수 없게 되고, 세포에서 FAS-R를 통하여 TNF에 의해 NF-κB 활성화가 차단되고, TRADD, RIP, MORT-1(p55-R and/or FAS-R)에 의한 NF-κB 유도도 차단된다. p55-R, p75-R, FAS-R 모든 수용체 및 이들 어뎁터 단백질 MORT-1, TRADD, RIP는 Traf2에 직간접적으로 결합하고, NIK에 결합하여, NF-κB의 유도를 조절한다.

FAS-R 및 p55-R 자극후에, 세포 생존 및 세포 죽음간에 미묘한 균형을 유지하는데 관련된 상기 어뎁터 단백질중에, 단백질 RIP이 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. RIP(see Stanger et al., 1995 and also Malinin et al., 1997)는 C-말단에 "죽은 도메인"을 가지고 있어, 독립적인 방식으로 세포 독성을 유도하고, 그리고, MORT-1, p55-R, FAS-R, TRADD의 죽음 도메인과 연합하여 세포 독성을 유도한다. RIP는 또한 N-말단에 단백질 카이나제 도메인을 가지고, Traf2와 상호작용하는 것(결합)으로 보이는 중간 도메인을 가지고 있어, NF-κB 유도에 관여하는 것으로 보인다. 따라서, RIP의 특징 및 서열(DNA 및 아미노산)이 상기 문헌(in particular, Stanger et al., 1995)에 공지되어 있다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 RIP 단백질에 결합할 수 있는 신규한 단백질 RAP(모든 동소체, 유사체, 유도체, 이의 단편을 포함)에 관한 것이다. RIP는 p55-R 및 FAS-R와 같은 세포내 염증 중개물질, 세포 독성 및 세포 죽음에 관계하는 중개물질과 MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1 및 다른 단백질과 같은 이들과 연합하는 어뎁처 또는 조절물질과 직간접적으로 상호작용할 수 있기 때문에, RIP에 결합함으로써, 본 발명의 신규한 단백질은 FAS 리간드가 이의 수용체에 결합하여 개시되는, 그리고 TNF가 이의 수용체(p55-R)에 결합하여 개시되는 세포내 시그날 발생과정에 영향을 주고, 이와 같은 본 발명의 신규한 단백질은 세포에서 p55-R 또는 FAS-R 중개된 효과의 조절물질이 된다. RIP는 Traf2와 상호작용할 수 있기 때문에, NIK와 직간접적으로 상호작용할 수 있고, 이와 같은 RIP는 NF-κB 유도가 관련되는 염증 및 세포 생존의 조절물질이 되어, 본 발명의 신규한 단백질은 RIP-관련된 염증 및 세포 생존 활성의 조절물질이 된다. 유사하게, FAS-R, p55-R, 이들의 조절 단백질 MORT-1, TRADD는 RIP에 결합하여 직간접적으로 NF-κB 유도, 세포 생존을 유도할 수 있고, Traf2에 결합하여 유도할 수도 있는데, RIP는 본 발명의 단백질에 결합하여 공통적인 또는 관련된 세포내 시그날 발생 과정을 통하여 세포 생존 과정을 조절하는데, 이때 다양한 상기에서 언급한 단백질이 세포 생존을 유도하도록 작용한다. 유사하게, p75-R은 RIP가 결합하는 Traf2에 결합하기 때문에, 본 발명의 신규한 단백질은 p75-R 중개된 활성의 RIP-관련된 조절에 조절물질이 된다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 RAP 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 유도체에 대한 길항물질(가령, 항체, 펩티드, 유기 화합물 또는 일부 경우에 동소체)을 제공하여 시그날 발생 과정 좀더 구체적으로는 원하는 경우에 세포-독성을 저해하는데 이용한다.

본 발명의 또 다른 목적은 수용체 활성을 조절하는데 관련된 추가 단백질 또는 인자를 분리하고 특징화하는데 있어서, 신규한 RAP 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체를 이용하는데, 가령, RAP 단백질에 결합하여, 이들의 활성에 영향을 주고, 신규한 RAP 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체가 결합하는 시그날 발생 과정의 상류 또는 하류에 있는 다른 수용체를 분리 및 확인하는데 이용한다.

본 발명의 또 다른 목적은 RAP 및 가능한 RAP 동소체에 결합하거나 상호작용하기 위해 세포내로 도입되는 저해물질을 제공하는데, 저해물질은 세포 독성 과정에서 RIP-연합된 활성을 저해하여, 원하는 경우에는 세포 생존을 강화시키고, 또는 세포 생존 과정에서 RIP-연합된 활성을 저해하고, 원하는 경우에는 세포 독성을 강화시킨다.

또한, 본 발명의 목적은 다클론성 또는 단클론성 항체를 만드는데 항원으로 신규한 RAP 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체를 이용하는 것에 관계한다. 이와 같이 만들어진 항체는 세포 추출물 또는 형질변환된 세포주와 같은 다른 소스로부터 새로운 단백질을 정제하는데 이용된다.

또한, 이와 같은 항체를 진단 목적으로 이용하는데, 가령, p55-R, FAS-R 또는 다른 관련 수용체에 의해 중개되는 비정상적인 세포 기능과 연관된 질환을 확인하는데 이용된다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 구성된 제약학적 조성물 뿐만 아니라 상기 항체 또는 다른 길항물질로 구성된 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 신규한 단백질 RAP을 분리하였다. RAP는 RIP에 결합하거나 상호작용할 수 있어, RIP 세포내 활성의 조절물질이 된다. RIP는 세포내 시그날 발생 과정 조절에 관여하는데, 예를 들면, 세포독성 또는 세포 죽음과 연관된 과정으로 RIP는 자체적으로 세포독성 활성을 가지거나 또는 MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1, p55-R, FAS-R와 같은 다른 세포 죽음과 관련된 단백질과 직간접적으로 연합하여 세포 독성 활성을 가지는데, RIP는 RIP에 있는 "죽음 도메인" 모티프 또는 모듈을 통하여 직간접적 방식으로 연합하거나 결합하는데, 전술한 단백질과 함께 또 다른 경로 염증, 세포 생존 과정이 되는데, RIP는 RIP에 존재하는 카이나제 모티프 또는 도메인 존재하에 직간접적으로 활성화 역할을 하는데, RIP은 Traf2에 결합할 수 있고, 이는 다시 NIK에 결합하여, 직접적으로 염증 및 세포 생존에 중요한 역할을 하는 NF-κB의 활성화에 관여한다. 또한, p55-R 및 TRADD는 Traf2와 상호작용할 수 있고, NF-κB 활성화에 관여하여, 세포 생존 과정에서, p55-R, FAS-R, TRADD(뿐만 아니라 Traf2)와 결합하거나 상호작용하여 RIP는 이들 단백질에 의해 염증, 세포 생존 활성화 조절에 관여한다. 따라서, RIP는 이와 같은 경로에 조절물질이 되고, 본 발명의 신규한 RAP는 RIP에 결합하여 이와 같은 세포내 경로의 조절물질이 된다.

RAP를 분리하여, 이스트 이중-하이브리드 시스템을 이용하여, 클론하고, 서열화하고, 특징을 조사하였는데, RAP는 매우 특이적인 RIP-결합 단백질로써, 특이적인 RIP 조절물질이다. RAP는 TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH에 결합하지 않는다. 또한, RAP는 특징적인 죽음 도메인 모듈 또는 모티프를 가지고 있지 않으며, 이는 RAP가 자체에서 세포 죽음을 유도하지 않는다는 것과 일치한다.

여기에서 이용된 것과 같이, RIP 활성은 염증 및 세포 죽음/생존 과정을 조절하는데 모두 활성을 가지고, 세포 생존 과정에도 활성을 가진다. 이와 같은 활성에는 상기 그리고 하기에서 설명하였고, 모든 언급한 문헌 및 특허 출원에도 나타내었고, 여기에서는 참고문헌으로 첨부한다. 유사하게, 여기에서 사용된 바와 같이, RAP 활성은 RIP에 특이적으로 결합하여 RIP 활성을 조절한다는 것을 포함하는데, RAP에 의한 RIP 조절에는 염증, 세포 죽음, 세포 생존 과정의 조절을 포함하는데, 이때, RIP는 직간접적으로 관여하고, RAP는 상기 언급한 모든 단백질 및 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존에 관련된 것으로 보이는 다수의 다른 물질의 간접적인 조절물질로 간주되는데, 이는 RIP가 결합하거나 또는 RIP가 직간접적으로 방식으로 상호작용하여 이루어진다.

따라서, 본 발명에 따라, RAP로 지칭한 신규한 단백질을 제공한다. 언급한 바와 같이, 이와 같은 RAP 단백질은 이중 하이브리드 스크리닝 검사를 이용하여 분리 및 클로닝하였고, 이는 RIP4에 결합하는 분자라는 것을 알았다. RAP 서열에 EK르면, RAP 서열과 Genebank "dbest" and Human Genome Database level 1 databases와 같은 다양한 서열간에 서열을 비교하여 신규한 단백질이라는 것으로 나타났는데, 이는 RAP 서열과 임의 공지된 서열간에 유사성이 없는 것으로 나타났다. 5'-넌 코딩 부분만이 상이한 실제 두 가지 DNA 서열을 발견하였는데, 이는 동일한 유전자를 또 다른 방식으로 접합하여 발생된 것일 것이다.

RAP가 어떻게 RIP에 결합되는지를 밝혀야 하고, 이들이 서로 결합할 수 있도록 RAP와 RIP간에 상동부분 또는 결합 부분을 결정할 필요가 있다. RAP는 실제 죽은 도메인 모듈 또는 효소 또는 다른 활성을 인지하는 부분, 예를 들면, 카이나제 또는 프로테아제 도메인을 가지고 있지 않다.

전술한 관점에서 볼 때, RAP은 특이적인 RIP-결합 단백질이고, RIP 세포내 활성의 조절물질이 된다.

따라서, RAP는 염증, 세포 생존, 세포 죽음 활성을 조절하는데 역할을 하는데, 이때 RIP는 TNF/NGF 수용체 페밀리의 수용체 및 다른 가능한 수용체를 통하여 전달되는 것을 포함한 다양한 자극에 의해 유도된 또는 원인이 되는 세포 독성과 직간접적으로 관련이 있는 것으로 보인다(이와 같은 세포내 과정에 RIP과 관련되었고, 이는 Malinin et al., 1997의 도 1을 참고).

RAP는 다른 복합 단백질 예를 들면, RIP 및 RIP에 결합되는 단백질의 일부분으로 존재하여 세포 독성 및 염증의 저해물질로도 작용하고, 이들 다른 단백질(가령, p55-R, FAS-R, MACH, Mch4, MORT-1)의 세포 독성 및 염증 효과에 영향을 주고, 결국에는 세포독성 활성의 방해 또는 염증반응에서 이들의 활성을 방해하게 된다.

RAP은 또한 세포 독성 및 염증의 강화 또는 보강 물질로 작용하는데, 다른 단백질 가령, 상기에서 언급한 바와 같은 RIP 및 RIP에 결합하는 다른 단백질의 활성을 증가시키는데, 보충과정은 다양한 단백질의 세포 독성 활성증 증가시키거나 또는 이들의 염증 효과를 증가시키는 것이 된다.

유사하게, RAP은 RAP이 관련된 경로를 가지는 다른 세포내 중개물질 또는 조절물질의 증강물질 또는 저해물질로 작용한다.

따라서, 본 발명은 본 발명은 RIP에 결합할 수 있고, RIP의 세포내 활성을 조절할 수 있는 RIP-연합된 단백질(RAP) 동소체, 이의 유사체, 이의 단편을 인코드하는 DNA 서열을 제공하는데, 이때 세포내 활성은 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존을 조절하는 것이다.

특히, 본 발명은 다음과 같이 구성된 DNA 서열을 제공한다;

(a) 고유 RAP 단백질의 코딩 부분에서 유도된 cDNA 서열;

(b) 생물학적으로 활성이 있는 RAP 단백질을 인코드하고, 중간정도의 스트린젼트 조건하에서 (a)서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열; 그리고

(c) 생물학적으로 활성이 있는 RAP 단백질을 인코드한고, (a) 및 (b)에서 정의된 것과 같은 DNA 서열에 대한 유전자 코드로 축중할 수 있는 DNA 서열.

본 발명의 상기 DNA 서열의 또 다른 구체예는 RAP의 적어도 한 개의 동소체를 인코드하는 서열의 일부분으로 구성된 DNA서열이다. 상기 DNA 서열의 또 다른 구체예는 도 1에서 나타낸 것과 같은 RAP 단백질을 인코드하는 서열이다. 또다른 구체예는 도 2에서 나타낸 것과 같다.

본 발명은 본 발명의 서열에 의해 인코드된 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 제공하는데, 이와 같은 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 RIP에 결합할 수 있고, 세포 죽음/세포 생존 과정에서 이의 생물학적 활성을 조절한다.

본 발명의 특정 구체예는 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체이다. 도 1, 2에서 유추된 RAP 단백질 서열은 도 3에 나타내었다. 또 다른 구체예는 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체의 동소체이다.

또한 본 발명은 상기 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 벡터를 제공하는데, 벡터에는 본 발명의 DNA 서열을 포함하며, 이들 벡터는 진핵 또는 원핵 숙주 세포에서 발현할 수 있으며; 이와 같은 벡터를 포함하는 형질변환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포; 본 발명의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이때 생산하는 방법은 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 발현시키기 위한 적절한 조건하에서 형질변환된 숙주 세포를 생장시키고, 이와 같은 단백질을 얻는데 필수적인 해독후 변형을 제공하고; 형질변환된 세포의 배양 배지 또는 형질변환된 세포 추출물로부터 발현된 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 추출하는 단계로 구성된다.

또 다른 측면에서는 본 발명은 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에 특이적인 항체 또는 이의 활성 유도체 및 단편을 제공한다.

발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명의 DNA 서열 또는 단백질의 다양한 용도를 제공하는데, 일반적으로는 다음에 이용된다;

(i) 세포내 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정을 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 세포를 본 발명의 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 처리하고, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내에 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하는데 적합한 형태로 하여, 이들을 도입하거나 또는 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 가지는 벡터를 이용하여 이들을 인코드하는 서열을 세포로 도입하는데, 이들 벡터는 서열이 세포내에서 발현될 수 있도록 세포로 서열을 삽입할 수 있어야 한다; 그리고

(ii) 상기 (i)에 따른 세포에서 RIP 단백질의 작용에 의해, TNF 페밀리의 리간드가 중개되는 염증, 세포 죽음, 세포 생존 과정을 조절하는 것인데, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내로 도입하는데 적합한 형으로 한 가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하거나 또는 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 가지는 적합한 벡터를 이용하여 세포내로 이들을 인코드하는 뉴클레오티드를 도입하고, 이때 벡터는 서열이 세포내에서 발현될 수 있도록 세포에 서열을 삽입할 수 있는 능력을 가진다;

(iii) 상기(ii) 방법으로, 이때 세포를 처리하는 방법은 재조합 동물 바이러스 벡터로 세포에 트랜스펙트시키는데, 이 단계는 다음과 같다;

(a) 재조합 동물 바이러스 벡터를 작제하는데, 벡터는 FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포의 표면에서 특이적인 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 바이러스성 표면 단백질(리간드)를 인코드하는 서열과 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에서 선택된 단백질을 인코드하는 제 2 서열을 가지는데, 이때 제 2 서열은 세포에서 발현되었을 때, FAS-R 또는 p55-R의 활성을 조절 또는 중개할 수 있는 능력을 가지고;

(b) (a)벡터를 세포에 감염시킨다.

(iv) RIP 단백질 작용에 의해 세포에서 TNF 페밀리의 리간드에 의해 중개된 염증, 세포 죽음, 세포 생존 과정을 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 본 발명에 따른 항체, 이의 활성 단편 또는 이의 유도체로 세포를 처리하는데, 처리하는 방법은 세포에 항체, 이의 단편 및 이의 활성 유도체를 포함하는 적절한 조성물을 제공하고, RAP단백질의 일부분이 세포외 표면에 노출될 경우에, 조성물은 세포외로 적용할 수 있도록 제조하고, RAP 단백질이 전적으로 세포내에 있는 경우에는 조성물은 세포내 제공용으로 제조한다.

(v) RIP 단백질 작용에 의해 세포에서 TNF 페밀리의 리간드에 의해 중개된 염증, 세포 죽음, 세포 생존 과정을 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 본 발명의 RAP 단백질 서열의 적어도 일부분의 안티센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열로 세포를 처리하고, 이때 올리고뉴클레오티드 서열은 RAP 단백질의 발현을 차단할 수 있다.

(vi) 종양 세포 또는 HIV-감염된 세포 또는 다른 질병에 걸린 세포를 치료하기 위한 (ii)에서와 같은 방법에 이용되는데, 이때 그 방법은 다음과 같다;

(a) 재조합 동물 바이러스 벡터를 작제하는데, 벡터는 특이적인 종양 세포 표면 수용체 또는 HIV-감염된 세포 표면 수용체 또는 다른 질환이 있는 세포가 가지는 수용체에 결합하는 바이러스성 표면 단백질을 인코드하는 서열과 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에서 선택된 단백질을 인코드하는 제 2 서열을 가지는데, 이때 제 2 서열은 종양, HIV-감염된 세포 또는 다른 질병이 있는 세포에서 발현되었을 때, 세포를 죽일 수 있는 능력을 가지고;

(b) (a)벡터를 세포에 감염시킨다.

(vii) RIP 단백질 작용에 의해 세포에서 TNF 페밀리의 리간드에 의해 중개된 염증, 세포 죽음, 세포 생존 과정을 조절하는 방법에 이용되는데, 이는 리보자임 과정을 이용하는 것으로써, 본 발명에 따른 RAP 단백질을 인코드하는 세포 mRNA 서열과 상호작용할 수 있는 리보자임 서열을 인코드하는 벡터를 세포에 도입시켜, 세포에서 리보자임 서열이 발현될 수 있도록 하고, 리보자임 서열이 세포에서 발현되었을 경우에, 세포 mRNA 서열과 상호작용하여, mRNA 서열을 절단하게 하여, 세포에서 RAP 단백질의 발현을 저해하게 한다.

(viii) 본 발명에 따른 방법에서 선택된 방법에 이용되는데, 이때 RAP 단백질을 인코드하는 서열은 RIP에 결합할 수 있는 RAP 동소체, 유사체, 단편, 및 이의 유도체로 구성된다.

(xi) RIP 단백질에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 단백질을 분리하고, 확인하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 이스트 두 개 하이브리드 과정을 이용하는데, 한 개 하이브리드 벡터에는 RIP 단백질을 인코드하는 서열이 있고, 두 번째 하이브리드 벡터에는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리의 서열을 가지고 있어, 이 벡터를 이용하여 이스트 숙주 세포를 형질변환시키고, 양성으로 형질변환된 세포를 분리하고, 제 2 하이브리드 벡터를 추출하여, RIP 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 인코드하는 서열을 얻는다.

(x) (i)-(ⅸ)중 임의 방법에 이용되는데, 이때 RAP 단백질은 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체중 하나가 된다.

(xi) (i)-(ⅸ)중 임의 방법에 이용되는데, RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체가 직간접적으로 결합할 수 있는 임의 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질에 의해 조절 또는 중개되는 세포 효과를 조절하는데 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체이 관련된다.

본 발명은 또한, 상기에서 언급한 바와 같이, RIP 단백질의 작용을 통하여, TNF 페밀리 효과에 의해 또는 임의 다른 중개물질 또는 유도물질의 효과에 의해 중개되는 염증, 세포 죽음, 세포 생존과정을 조절하는 제약학적 조성물을 제공하거나 또는 상기에서 언급한 것과 같이 세포에서 임의 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질의 효과를 조절하는 제약학적 조성물을 제공하는데, 이때 제약학적 조성물은 다음중 하나를 활성 성분으로 포함한다;

(i) 본 발명에 따른 RAP 단백질, 생물학적으로 활성을 가지는 단편, 유사체, 유도체;

(ii) 본 발명에 따른 RAP 단백질, 생물학적으로 활성을 가지는 단편, 유사체, 유도체를 인코드하고, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 인코드하는 재조합 동물 바이러스성 벡터;

(iii) 본 발명에 따른 RAP 단백질 서열의 안티-센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열, 이때 올리고뉴클레오티드는 상기(ii)의 재조합 동물 바이러스 벡터의 제 2 서열이 된다.

본 발명은 다음을 제공한다;

I. RIP 단백질, 임의 다른 중개물질 또는 유도물질 또는 임의 다른 NF-κB 유도물질 또는 저해물질에 의해 중개되는 염증, 세포내 세포 죽음 또는 세포 생존을 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 (i)-(x)중 임의 방법에 따라, 세포를 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체 또는 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열로 처리하여, RIP-중개된 효과의 증강 또는 저해하여, FAS-R 또는 p55-R-중개된 효과 또는 다른 NF-κB 유도물질 또는 저해물질 또는 다른 중개물질 또는 유도물질의 효과를 강화 또는 저해한다.

Ⅱ. 상기 방법에서, RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 RIP 또는 다른 중개물질 또는 유도물질 또는 다른 NF-κB 유도물질 또는 저해물질에 특이적으로 결합하는 RAP 단백질의 일부분으로, RAP 단백질 서열은 RIP 또는 다른 중개물질 또는 유도물질 또는 다른 NF-κB 유도물질 또는 저해물질에 특이적으로 결합하는 단백질의 일부분을 인코드한다.

Ⅲ. 상기 방법에서, RAP 단백질은 RAP 동소체로, 이때 동소체는 RIP-연합된 효과를 강화시킬 수 있다.

Ⅳ. 상기 방법에서, RAP 단백질은 RAP 동소체로, 이때 동소체는 RIP-연합된 효과를 저해시킬 수 있어, 세포에서 FAS-R- 또는 p55-R-연합된 효과를 저해시키거나 또는 세포에서 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질 효과를 저해시킨다.

V. 상기 방법에서, 상이 RAP 단백질, 동소체, 유사체, 단편 또는 이의 유도체는 NF-κB의 직간접적 저해 또는 JNK 또는 p38 카이나제의 직간접적인 저해에 의해 세포 생존 및 염증 과정에서 RIP-연합된 효과를 저해 또는 강화할 수 있다.

단백질을 분리 및 확인하는데 이용되는 표준 스크리닝 기술을 이용하여 RAP 단백질의 분리, 확인 및 특징화를 실행하는데, 예를 들면, 이스트 두 개 하이브리드 방법, 친화력 크로마토그래피 방법 및 이와 같은 목적에 이용되는 임의 공지된 다른 표준 과정을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 구체예는 다음의 발명의 상세한 설명에 기술한다.

여기에서 사용된 용어중, "세포에서 RIP-리간드, FAS-리간드 또는 TNF 효과 조절" 및 "세포에서 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 효과의 조절"은 in vitro 및 in vivo 처리를 모두 포함하고, 조절에는 저해, 강화 및 증강 작용이 포함된다.

본 발명은 TNF/NGF 슈퍼페밀리 수용체에 속하는 수용체 분야에 관한 것으로, 이들의 생물학적 기능을 조절하는 것에 관계한다. TNF/NGF 슈퍼페밀리 수용체에는 p55 및 p75 종양 괴사 인자 수용체(TNF-Rs는 p55-R 및 p75-R로 통칭함), FAS 리간드 수용체(FAS/APO1 또는 FAS-R로 불리기도 하지만, 이하에서는 FAS-R로 칭함)등의 수용체를 포함한다. 특히 본 발명은 TNF/NGF 수용체 페밀리 및 다른 세포내 조절 단백질의 구성원에 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질에 결합하는 신규한 단백질에 관계하는 것으로, 좀더 구체적으로는, RIP("수용체 상호작용 단백질")에 결합하는 RIP로 지정한 단백질(RIP-연합된 단백질 2)에 관계하고, RIP는 또한, MORT-1. FAS-R, p55-R, TRADD, Traf2에 결합하거나 자체에 결합한다.

따라서, 본 발명은 일반적으로 RIP의 기능을 직접 간접적으로 조절 또는 중개할 수 있는 또는 RIP에 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질에 관계한다. 특히, 본 발명은 RAP, 이를 만드는 방법 및 이의 용도뿐만 아니라, 다양한 RAP의 새로운 동소체 및 이를 만드는 방법, 이의 용도에 관계한다.

도 1은 RAP의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 2는 RAP의 유추된 아미노산 서열을 나타낸다.

본 발명은 RIP 단백질에 결합할 수 있는 신규한 RAP 단백질에 관련된 것으로, RIP의 세포내 활성을 조절하는데, 특히, RIP가 상기에서 언급한 바와 같이, 염증, 세포 죽음, 세포 생존 과정에 관련된다. 따라서, RAP는 세포 죽음/염증 생존 과정에서 RIP 활성을 조절하고, RAP는 염증, 세포 죽음 생존 과정에서 RIP 활성을 강화하거나 또는 다른 과정은 방해하면서 이들 과정중 하나에서 RIP 활성을 강화시킨다.

좀더 구체적으로는 신규한 RAP 단백질을 제공하는데, RAP는 서열화되고, 특징을 조사하였는데, RAP는 RIP에 특이성이 큰 RIP-결합 단백질인 것으로 나타났으나, 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존을 유도하는 세포내 시그날 발생과정에 관련된 것으로 공지된 다수의 단백질에 대해서는 결합을 하지 않는 것으로 나타났다. RAP는 또한, 이들과정에 활성이 있는 단백질에 공통인 도메인을 가지지 않는데, 예를 들면, RAP는 "죽음 도메인" 모듈을 가지지 않으며, 카이나제 모티프 또는 도메인을 가지지 않으며, 프로테아제 도메인도 가지지 않는다. RAP 서열은 Genebank, Huna, Genome level 1, 'dbes' 데이터 베이스를 포함한 다수의 데이터베이스에 있는 서열과 비교하였을 때 독특한 것이다. 상기에서 언급한 것과 같이, RIP는 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존에 세포내적으로 관련되어 있다. 여기에서, RIP의 활성을 조절 또는 제어하면, TNF 또는 FAS-R가 이들의 수용체(TNF의 경우에는 p55-R) 와 같은 과정을 조절하게 된다. RIP는 이 과정이 많이 활성화되는 지를 결정하는 중요한 역할을 하는 것으로 죽음 도메인을 가지는 다수의 세포독성 단백질 및 카이나제 활성을 가지는 다수의 프로테아제에 결합하여 이를 조절한다. 따라서, RIP에 특이적으로 결합하는 RAP 단백질은 RIP 활성을 조절하는데 중요한 역할을 하고, 다른 것과 비교하여 한 과정을 유도하게 된다. 따라서, 본 발명의 RAP 단백질은 중요한 세포내 시그날 조절물질이 된다.

세포를 죽게하는 FAS-R 및 TNF 수용체의 독특한 능력 뿐만 아니라 다양한 다른 조직-손상 활성을 촉진시키는 TNF의 능력 때문에, 이들 수용체의 기능이 변형되는 것은 특히 유기체에 유해하게 된다. 또한, 이들 수용체의 과도한 또는 부족한 기능은 다양한 질병의 병인이 나타나게 하는 원인이 되는 것으로 보인다. 이들 수용체의 시그날 발생 활성에 참여하는 분자를 확인하고, 이들 분자의 기능을 조절하는 방법을 찾는 것은 이들 질병에 대한 새로운 치료요법적 접근방법을 제공하는 것이다. FAS-R 및 p55-R 독성에서 주요한 역할은, RIP 조절을 통하여, FAS-R 및 TNF에서 RAP의 중용한 역할에 대해서 추정할 때, RAP가 RIP-중개된 세포독성을 강화시키는 작용을 할 수 있는 조건하에 RAP와 RIP간에 상호작용을 저해 또는 RAP가 RIP에 결합하는 것을 차단함으로써 RIP의 세포 독성 기능을 차단하는 약물을 고안하는 것이 중요하다(상기에서 언급한 바와 같이, RIP는 자체에서 세포독성이 있고, 죽음 도메인 부분을 가지는 다른 단백질과 공유하여 세포독성을 가진다).

유사하게, FAS-R 및 p55-R는 NF-κB의 활성화에 관련되어 있고, 따라서 세포 생존에도 관련되어 있다. 따라서, 암세포, HIV-감염된 세포와 같은 세포를 죽이고자 할 경우에, FAS-R 및 p55-R(및 다른 연합된 단백질 가령, MORT-1, MACH, Mch4, G1, TRADD)의 세포독성 효과를 강화시키는 것이 바람직한데, 동시에 NF-κB를 유도하는 능력을 저해시킨다. RAP 상호작용 또는 RIP에 결합하여, NF-κB 유도를 강화시키는 RIP의 능력을 증강시키게 되어(이는 Traf2 및 RIP의 중간 도메인 또는 카이나제 도메인을 경우하여), RAP 및 RIP의 상호작용을 차단하여, NF-κB의 활성화 또는 증강을 방해하고, TNF- 또는 FAS-리간드 유도된 효과의 균형을 세포 독성 방향으로 이동시켜, 결국에는 세포 죽음을 증가시킨다.

유사하게, 상기와 반대 상황에서, RIP에 RAP가 결합하여, FAS-R EH는 p55-R 염증 또는 세포독성 효과를 저해하게 되어, 세포 생존이 증가하게 되는 염증, 다양한 자가면역 질환등과 같은 세포 독성 효과를 차단하는 것이 바람직하고, RAP 및 RIP사이에 상호작용을 강화시켜, 세포 죽음의 전반적인 저해를 강화시켜, 세포 생존쪽으로 균현을 이동시키는 것이 바람직하다. RIP와 RAP의 상호작용이 NF-κB 활성화를 증강시키는데 RIP의 기능을 저해하게 되고, 세포 생존을 원하는 경우에, RAP 및 RIP의 상호작용을 차단하여, NF-κB 활성화를 증강시키는데 있어서, RIP의 활성을 강화시킨다.

전술한 관점에서 볼 때, RIP는 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존과정의 유도를 균형을 이루는데 중요한 역할을 하고, RAP는 RIP의 조절물질로도 중요한 역할을 한다. 다양한 약물 또는 치료를 이용하여 RAP-RIP 상호작용 또는 균형에 영향을 주면, 세포 죽음으로부터 세포 생존으로 또는 그 역으로 세포내 시그날 발생 과정을 이동시킬 수 있다.

본 발명은 RAP 단백질을 인코드하는 DNA 서열 및 DNA 서열에 인코드된 RAP 단백질에 관계한다.

또한, 본 발명은 RAP 단백질의 생물학적으로 활성이 있는 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 DNA 서열 및 이 서열에 의해 인코드된 RAP 단백질의 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에 관계한다. 이와 같은 유사체, 단편 및 이의 유도체는 표준 방법(Sambrook, et al., 1989)으로 준비할 수 있는데, RAP 단백질을 인코드하는 DNA 서열에 한 개 이상의 코돈을 결손, 또는 다른 것을 추가 또는 대체하여 고유 단백질에 대해 적어도 한 가지 이상의 단백질 잔기가 변화된 유사체를 만드는 것이다.

RAP 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 유도체를 인코드하는 본 발명의 상기 DNA 서열에서, 본 발명의 구체예에는, 고유 RAP 단백질의 코딩 부분에서 유도된 cDNA 서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열이 포함되는데, 이때 하이브리드 반응은 약간 스트린젼트한 조건하에서 실시하고, 하이브리드 가능한 DNA 서열은 생물학적으로 활성을 가진 RAP 단백질을 인코드한다. 이와 같은 하이브리드 가능한 DNA 서열에는 고유 RAP cDNA 서열에 상대적으로 상동성이 높은 DNA 서열이 포함되고, 이는 RAP-유사 서열로, 다양한 RAP 동소체 또는 RAP 활성을 가지는 단백질을 인코드하는 RAP-유사 서열에 속하는 단백질을 인코드하는 자연 발생적인 서열이 된다. 이와 같은 서열에는 고유 RAP cDNA 서열과 유사하나, 원하는 변형을 초함한다. 합성 서열에는 모든 가능한 RAP의 유사체, 단편 및 유도체를 인코드하는 서열이 되는데, 모두다 RAP 활성을 가진다.

다양한 RAP-유사 서열을 얻기 위해서는, 다양한 조직으로부터 자연에서 유도되는 DNA 또는 RNA 샘플을 스크리닝 및 분리하는 표준 과정을 이용하는데, 프로브로는 자연 RAP cDNA 또는 이의 일부분을 이용한다(Sambrook et al., 1989).

유사하게, RAP의 유사체, 단편 또는 유도체를 인코드하는 RAP-유사 서열을 준비하기 위해서는, 다수의 표준 방법을 이용하는데, 이는 하기에서 이와 같은 유사체, 단편 및 유도체에 대한 설명을 참고한다.

RAP 단백질에 "실제 상응하는" 단백질 또는 폴리펩티드에는 RAP 단백질 또는 RAP 유사체인 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.

RAP 단백질에 상응하는 유사체는 RAP 단백질의 아미노산중 한 가지 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 결손되거나 삽입되어 생성된 단백질이 RAP 단백질에 상응하는 생물학적 활성이 동일한 또는 더 큰 단백질이 되어야 한다.

RAP-결합 단백질에 실제 상응하도록 하기 위해서는 동소체와 같은 RAP 단백질의 서열에 만들어지는 변화는 아주 적은 것이다. 변화의 수는 10미만이고 적절하게는 5이하의 변화, 가장 적절한 수는 3이하가 된다. 임의 기술을 이용하여 실제 RAP 단백질에 상응하는 생물학적으로 활성을 가지는 단백질을 만들 수 있는데, 한 가지 기술은 단백질을 인코드하는 DNA에 통상적인 돌연변이 기술을 이용하는 것으로 약간의 변화가 있다. 이와 같은 클론에 의해 발현되는 단백질들은 상기에서 언급하는 세포내 과정의 조절에서 RIP의 활성을 조절하거나 RIP에 결합하는 능력으로 스크리닝된다.

"보존성" 변화는 단백질의 활성에 변화를 주지 않고, 단백질의 크기, 전하, 모양을 변화시키지는 않는 것으로 우선 스크리닝하여 생물학적 활성에 변화를 주지 않는 것이 된다.

RAP 단백질의 보존성 치환체는 폴리펩티드에 있는 적어도 한 개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열로 보존성을 유지하면서 치환된 유사체이다. 이와 같은 치환은 적절하게는 표 1a에서 제시하는 것에 따라 이루어지는데, 치환체는 RAP 단백질의 생물학적 활성 특징을 유지하면서 합성된 폴리펩티드 분자의 변형된 구조적 그리고 기능적 성질을 제공하는 일상적인 실험에 의해 결정한다.

원래 아미노산	예시적인 치환제
Ala	Gly; Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala; Pro
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Tyr; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

또는 RAP 단백질의 치환체의 또 다른 그룹은 다음의 표 1b에 있는 것과 같이 폴리펩티드에 있는 적어도 하나의 아미노산을 제거하고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이 된다. 폴리펩티드에서 이루어진 이와 같은 치환은 Schulz et al., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 and Figs. 3-9 of Creighton, T.E. Protein; Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, CA 1983의 표 1-2에 제시한 것과 같은 상이한 종간의 단백질 유사성에서 아미노산 변화 빈도를 분석한 결과를 기초로 한 것이다. 이와 같은 분석을 기초로 하여 또 다른 보존성 치환체는 다음의 다섯 가지 그룹중 하나에서 교환이 이루어진 것이다.

1. 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기; Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly)

2. 극성 음전하를 띈 잔기와 이의 아미드; Asp, Asn, Glu, Gln

3. 극성 양전하를 띈 잔기; His, Arg, Lys

4. 큰 지방족 비극성 잔기; Met, Leu, Ile, Val(Cys)

5. 큰 방향족 잔기; Phe, Tyr, Trp

괄호안에 있는 세 가지 아미노산은 단백질 구조에 중요한 역할을 한다. Gly는 어떠한 측쇄도 가지지 않는 유일한 것이고 따라서 사슬에 유연성을 부여한다. 그러나 이는 α사슬이외의 제2차 구조 형성을 촉진시키는 경향이 있다. Pro는 이의 구조적인 특징으로 인하여, 사슬을 단단하게 억압하고 일반적으로 β-회전과 같은 구조를 만드는 경향이 있고, 일부 경우에는 Cys는 단백질의 폴딩에 중요한 역할을 하는 이황화결합에 참가할 수 있다. Tyr은 이의 수소결합 가능성 때문에 Ser, Thr와 상당히 유사한 특징을 가진다.

본 발명에 따른 전술한 것과 같은 보존성 아미노산 치환은 본 기술분야에 공지된 것이고, 아미노산 치환 후에 폴리펩티드의 생물학적 그리고 구조상의 성질을 유지할 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 대부분의 결손 및 치환은 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 특징에 파격적인 변화를 주지는 않는다. " 특징"은 α-사슬, β-쉬트 등의 2차 구조에서의 변화 및 세포에서 RIP에 결합 또는 세포 죽음에서 RIP의 효과 등의 생물학적 활성에 변화 등을 포함한 포괄적인 것을 의미한다.

본 발명에 이용할 수 있는 RAP 단백질의 유사체를 만들기 위해 이용될 수 있는 단백질에 아미노산 치환제를 만드는 예는 임의 공지의 방법을 포함하는데 이는 미국 특허 RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585; 4,737,462(Mart et al.,); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,) 및 리신 치환된 단백질은 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에 상술하고 있다.

전술한 RAP 단백질의 활성에 큰 변화를 주지 않는 보존성 치환이외에, RAP 단백질의 활성이 상당히 증가되도록 하는 보존성이 약한 치환 및 다소 무작위 치환도 본원 발명의 범위에 속한다.

치환 또는 결손의 정확한 효과를 확인하였을 경우에, 당업자는 치환, 결손 등의 효과를 일상적인 결합 및 세포 죽음 검사를 통하여 평가할 수 있음을 인지할 것이다. 이와 같은 표준 테스트를 이용하는 스크리닝은 과도한 실험을 요하지는 않는다.

수용가능한 RAP 유사체에는 RIP에 결합하는 능력을 보유하고 있어, 상기에서 언급한 바와 같은 세포내 과정에서 RIP의 활성을 중개하는 것이 된다. 이와 같은 방식에서, 유사체는 소위 우성-음성 효과를 가지는데, 즉, RIP에 결합하는 또는 이와 같은 결합 후에 연속되는 시그날 발생 또는 다른 활성이 결손된 유사체가 생성될 수도 있다. 이와 같은 유사체를 이용하여. RIP의 효과를 저해하거나 또는 NF-κB 유도성 RIP 효과(직간접적으로)를 저해하는데, 이와 같은 활성은 RAP 및 RIP의 상호작용에 의해 주로 조절되는데, RIP에 결합하는데 있어서 자연 RAP와 경쟁하게 한다.

유전자 수준에서, 이와 같은 유사체는 RAP 단백질을 인코드하는 DNA 서열의 뉴클레오티드에 부위-직접적인 돌연변이를 이용하여 유사체를 인코드하는 DNA 서열을 만들고, DNA을 합성하고 재조합 세포 배양물에서 폴리펩티드를 발현시켜 만들 수 있다. 일반적으로 유사체는 천연 발생 단백질과 동일한 또는 생물학적 활성이 양적으로 증가된다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologu, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989).

RAP 단백질 고유 또는 초기 준비된 유사체를 인코드하는 DNA의 부위-돌연변이를 이용하여, 동일한 폴리펩티드를 인코드하는 또는 천연 서열과는 다른(공지의 유전자 코드의 축중으로 인한 변화 때문에) 서열을 가지는 RAP 단백질을 준비할 수 있다. 부위-특이적인 돌연변이는 원하는 돌연변이를 가지는 DNA 서열을 인코드하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열과 인접한 상당수의 뉴클레오티드을 이용하여 유사체를 만들 수 있는데 유사체는 반대로 된 결손 양측에 안정한 이중 나선을 만들기 위해 충분한 크기의 프라이머 서열을 제공한다. 일반적으로 길이가 20 내지 25개 뉴클레오티드로 된 프라이머가 적절한데 서열의 각 측면에는 약 5 내지 10개의 상보 뉴클레오티드가 바뀔 수 있다. 일반적으로, 부위-특이적인 돌연변이 기술은 당업자에게 공지된 기술이고, 이는 Adelman et al., DNA 2;183(1983)에 예시하고 있다.

인지하는 바와 같이, 부위 특이적인 돌연변이 기술은 일반적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 형으로 존재하는 파아지 벡터를 이용한다. 부위-특이적인 돌연변이에 유용한 전형적인 벡터는 Messing et al., Third Cleveland Symposim on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor, A. Walton, Elsevier, Amsterdam(1981)에 상술하고 있는 M13 파아지이다. 이들 파아지는 시판되는 것을 이용할 수 있고 일반적으로 당업자에게 공지된 것이다. 또는 복제원점을 포함하는 한가닥 파아지를 포함하는 벡터를 이용하여 단일-가닥 DNA를 얻을 수 있다(Veira et al., Meth. Enzymol. 153;3, 1987).

일반적으로, 본 발명에 따르는 부위-직접적인 돌연변이는 관련 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 한 가닥 벡터를 얻어야 한다. 원하는 돌연변이된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 자동화된 DNA/올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 준비한다. 이와 같은 프라이머를 단일가닥 단백질 서열을 포함하는 벡터에 어닐링하고 대장균 폴리메라제 I Klenow 단편과 같은 DNA 중합효소로 처리하여 돌연변이을 포함하는 가닥을 완전히 합성한다. 따라서, 돌연변이된 서열과 제2가닥은 원하는 돌연변이를 가진다. 이와 같은 이형이중 벡터를 이용하여 대장균(E. coli) JM101와 같은 적절한 세포에 형질 도입시키고 돌연변이된 서열을 가지는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.

이와 같은 클론을 선택한 후에, 돌연변이된 RAP 단백질 서열을 제거하여 적절한 벡터에 옮기고, 이때 벡터는 일반적으로 적절한 숙주에 트랜스펙션을 위해 이용되는 형태의 발현 벡터가 된다.

따라서, RAP 단백질을 인코드하는 유전자 또는 핵산은 PCR 및 화학적 올리고뉴클레오티드 합성과 같은 공지의 DNA 또는 RNA 증폭 기술을 이용하여 in vitro, in vivo에서 감지, 수득 및 변형된 것이다. PCR을 이용하면 반복된 DNA 폴리메라제 반응에 의해 특정 DNA를 증폭(수를 증가)시킬 수 있다. 이와 같은 반응은 클로닝을 대신할 수 있는데; 이때 모든 핵산 서열을 알아야 한다. PCR을 실행하기 위해, 원하는 서열에 상보적인 프라이머를 만든다. 일반적으로 자동화된 DNA 합성에 의해 프라이머를 만들 수 있다. 프라이머는 유전자의 임의 부분에 하이브리드할 수 있도록 만들어진 것이기 때문에, 상보적인 염기 쌍에 짝이 잘못진 것(mismatch)을 견딜 수 있도록 환경을 만든다. 이와 같은 잘못이룬 쌍을 증폭시키면 돌연변이된 생성물을 만들게 되고 새로운 성질을 가지는 펩티드가 형성된다(가령, 부위 특이적인 돌연변이)(Ausubel., Ch.16). 또한, PCR에서 역전사효소를 이용하여 커플링 상보적인 DNA(cDNA) 합성하여, 클로닝없이 프로락틴 수용체의 세포외 도메인 합성을 위한 출발물질로 RNA를 이용한다.

또한, PCR 프라이머는 증폭된 유전자 부분의 양단에 종료 코돈이 있는 것과 같은 특징 및 새로운 제한효소 절단 부위를 가지는 등과 같이 만든다. 증폭된 유전자 서열의 5'와 3'단부에 제한효소 절단부위가 위치하면, RAP 단백질 또는 이의 단편을 인코드하는 유전자 단편이 벡터에 다른 서열 및 클로닝 부위를 결찰하도록 만들 수 있다.

PCR 또는 RNA 및 DNA를 증폭시키는 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 야기에서 제시하는 기술에 따라 과도한 실험없이도 본 발명에 따라 이용될 수 있다. DNA 또는 RNA를 증폭시키는 공지된 방법은 폴리메라제 사슬 연쇄반응(PCR)과 관련된 증폭 과정(참고; 미국 특허, 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188(Mullis et al.,); 4,921,794(Tobor et al.,); 5,142,033(Innis et al.,); 5,122,464(Wilson et al.,); 5,091,310(Innis); 5,066,584(Gyllensten et al.,); 4,889,818(Gelfand et al,); 4,994,370(Silver et al.,); 4,766,067(Biswas); 4,656,134(Ringold); Innis et al., eds, PCR Protocols; A Guide to Method and Applications) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위해 주형으로 표적 서열에 안티센스 RNS를 이용하여 RNA 중개된 증폭(미국 특허 5,130,238(Malek et al., NASBA) 및 항체 라벨링이 된 DNA 증폭을 이용하여 복합된 면역-PCR(Ruzick et al., Science 260;487(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotechniques 9;1378(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotchnique 9;1378(1991)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.

유사한 방식으로 RAP 단백질의 생물학적으로 활성 단편(가령, RAP의 동소체)을 RAP 단백질의 유사체에대해 전술한 것과 같이 만들 수 있다. RAP 단백질의 적절한 단편은 RAP 단백질 능력을 보유하고, RIP의 생물학적 활성을 조절할 수 있고 또는 RIP와 직간접적으로 연합되는 다른 단백질의 생물학적 활성을 중재할 수 있는 것을 말한다. 따라서, RAP 단백질 단편은 유사체에 대해 전술한 것과 같이 도미넌트-네가키브 또는 도미넌트-포지티브 효과를 가지도록 만든다. 이와 같은 단편은 본 발명의 유사체의 특정 부류를 나타내는데 즉, 이들은 완전한 RAP 단백질에서 유도된 RAP 단백질의 일부이고(가령, RAP 또는 이의 동소체중 하나), 이와 같은 일부분 또는 단편은 원하는 활성의 일부를 가진다. 이와 같은 단편은 펩티드가 될 수 있다.

유사하게, 당업자에게 공지된 것과 같이, RAP 단백질, 이의 유사체, 단편의 하나이상의 아미노산 잔기의 측쇄에 표준 변화 또는 다른 분자 가령, 항체, 효소, 수용체 등에 RAP 단백질, 유사체 또는 단편을 결합시켜 유도체를 만들 수 있다. 따라서, 여기에서 언급하는 "유도체"는 당업자에게 공지된 방법으로 잔기의 측쇄 또는 N- 또는 C-단부 그룹에 있는 기능기로부터 만든 유도체를 포함하고 이 또한 본 발명의 범위에 속한다. 유도체는 이와 같은 단편이 RAP 단백질으로 동일한 또는 더 큰 생물학적 활성을 가진다면 탄수화물 또는 인산 잔기와 같은 화학적 부분을 가질 수 있다.

가령, 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 2차 아민과 반응한 카르복실기의 아미드, 아실 부분을 형성한 아미노산의 자유 아미노시 또는 N-아실 유도체(가령, 알카노일 또는 카르복실 아로일 기) 또는 아실 부분을 형성하는 자유 히드록실 기의 O-아실 유도체(가령, 세릴 또는 트레오닐 잔기)를 포함한다.

"유도체"는 한 아미노산이 20개의 자연 발생 아미노산중 하나로 변화되지 않은 유도체만을 포함하는 것이다.

RAP 단백질은 단백질 또는 폴리펩티드 즉, 아미노산 서열이다. 정의에 따르면, RAP 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하는 큰 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드는 본 발명의 기초적인 그리고 신규한 특징에 영향을 주지 않는 한 이와 같은 폴리펩티드도 본 발명의 범위에 속하는데 가령, 이들은 RAP 단백질의 생물학적 활성을 보유하거나 증가된 활성을 가지고 또는 RAP 단백질의 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 남기기 위해 절단될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 다른 아미노산 또는 펩티드와 RAP 단백질로된 융합 단백질을 포함한다.

신규한 RAP, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체는 다음과 같은 용도를 가질 수 있다;

(i) RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 상기에서 언급한 바와 같은 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정의 기능을 조절하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, RAP가 NF-κB, JNK(June kinase) 또는 p38 카아니제의 활성화에 RIP 효과를 조절할 수 있다면, 이와 같은 RAP 효과는 항-종양, 항-염증, 항-HIV 치료시에 이와 같은 RAP-RIP 효과를 강화시킨다. 이와 같은 경우에, 염증을 조절하고, 세포독성 효과를 강화시키는 또는 세포 생존 효과를 차단시키는 RAP 단백질, 이의 유사체, 단편, 유도체를 공지된 방법을 이용하여 세포내로 유도한다. 가령, 단백질이 세포내 단백질인 경우에 이들은 RIP에 의해 중개되는 FAS-R 리간드 또는 TNF- 또는 다른 단백질 효과를 원하는 세포안으로만 유도해야 하고, 세포에는 이들 단백질을 특정하게 유도할 수 있는 시스템이 필수적이다. 이와 같은 것을 실시하는 한 가지 방법은 벡시니아(Vaccinia)에서 유도된 것과 같은 재조합 동물 바이러스를 만들고, 다음의 두 가지 유전자를 도입하는데; 세포에 의해 특이적으로 발현될 세포 표면에 결합될 수 있는 리간드를 인코드하는 유전자 가령, 일부 세포(CD4 임파세포와 관련된 백혈구종)에 특이적으로 결합할 수 있는 AIDs(HIV) 바이러스 gp120 또는 재조합 바이러스 벡터가 FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포에 결합할 수 있도록 하기 위해, FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포에 특이적으로 결합하는 임의 다른 리간드를 인코드하는 유전자와 RAP 단백질을 인코드하는 유전자를 도입한다. 따라서, 바이러스를 통하여 RAP 단백질을 인코드하는 서열을 세포내로 유입시키면, 바이러스 표면에 세포-표면 결합 단백질의 발현하여 바이러스가 특이적으로 종양세포 또는 다른 FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포를 표적으로 하고, 일단 세포내에서 발현되면, FAS-R 리간드 또는 TNF-효과 또는 독립적으로 RIP를 강화시킨다. 이와 같은 재조합 동물 바이러스의 작제는 표준과정에 따른다(가령 Sambrook et al., 1989). 또 다른 가능성은 세포에 의해 흡수되고 그 안에서 발현되는 올리고뉴클레오티드형의 RAP 단백질(RAP 또는 이의 동소체중 하나)이 인코드된 서열을 도입시키는 것이다.

(ii) RIP 또는 독립적인 RIP 효과에 의해 중개되는 FAS-R 리간드 또는 TNF- 또는 다른 관련 단백질을 저해시키는데 이용되는데, 폐혈증 쇼크, 이식편대 숙주 반응 또는 급성 간염과 같은 조직 손상의 경우에, FAS-R 리간드 또는 TNF 유도된 FAS-R EH는 p55-R 세포내 시그날 또는 독립적인 RIP 효과 또는 다른 시그날 발생과 관련된 다른 단백질을 차단하고, 동시에 세포 생존 과정을 증가시킨다. 이와 같은 상황에서는 표준 공정에 따라 RAP 단백질을 인코드하는 mRNA의 해독을 효과적으로 방해하는 본 발명의 RAP 단백질에 대한 안티-센스 코딩 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 세포내로 유도할 수 있고 따라서 이들의 발현을 차단하여, FAS-R 리간드 또는 TNF- 또는 다른 단백질 효과를 저해한다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 상기 재조합 바이러스 방식을 이용하여 세포내로 유입시킬 수 있고 바이러스에 의해 운반되는 제 2 서열이 올리고뉴클레오티드 서열이다.

유사하게, 상기에서 언급한 것과 같이, RAP-RIP 상호작용에 따라, 상기 (i) 및 (ii)과정에 의해, 원하는 경우에 세포 염증 및 생존 과정을 강화 또는 저해한다.

또 다른 가능성은 세포내 시그날 활성을 방해하기 위해 RAP 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것이다.

RIP-중개된 효과 또는 RIP 독립적인 효과를 저해하는 또 다른 방법은 최근에 개발된 라이소자임 방식이다. 라이소자임은 특이적으로 RNA를 절단하는 촉매 RNA 분자이다. 라이소자임은 선택된 표적 RNA를 절단하도록 만들 수 있는데 가령, 본 발명의 RAP 단백질을 인코드하는 mRNA를 절단하도록 만들 수 있다. 이와 같은 라이소자임은 RAP 단백질의 mRNA에 특이적인 서열을 가지고, mRNA의 절단 후에 이와 상호작용하여(상보적인 결합), RAP 단백질 발현을 감소 또는 완전히 못하도록 할 수 있는데, 발현 감소 정도는 표적 세포에 있는 라이소자임 발현정도에따라 달라진다. 선택된 세포(가령, FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포)내로 라이소자임을 유도시키기 위해, 플라스미드, 동물 바이러스(레트로바이러스) 벡터등과 같은 적절한 벡터를 이용하는데 이들은 i) 바이러스가 라이소자임을 인코드하는 cDNA와 같은 제 2 서열을 가지도록 하는 목적에 이용된다(Methods etc., concerning ribozymes see Chen et al., 1992;Zhao and Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph and Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 and Koizumi et al., 1993). 이와 같은 방식은 세포독성을 차단해야 하는 상황에서 RAP-RIP 상호작용이 세포 독성을 강화시키는 경우에 적합하고 또는 NF-κB 활성 증가시키기 위해 저해 활성을 차단하는 것이 바람직한 동일한 상황에서 RAP-RIP 상호적용이 세포 독성을 강화시킬 경우에 적합한데, 두 가지 모두 (ii)에서와 같이 세포 생존을 증가시킨다.

(iii) RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 동일한 종류의 다른 단백질을 분리하고 확인하고 클론하는데 이용되는데, 가령, 세포내 시그날 발생과정에 관여하는 RIP에 결합하는 또는 기능적으로 관련된 수용체에 결합하는 단백질을 분리, 확인, 클론하는데 이용된다. 이와 같은 경우에, 상기에서 언급한 것과 같은 이스트 두 개-하이브리드 시스템을 이용하거나 최근에 개발된 PCR 클로닝 후에 엄격하지 않은(non-stringent) 서던 하이브리드반응을 이용하는 시스템을 이용할 수 있다(Wilks et al., 1989). Wilks et al., 에서는 비-스트린젼트 서든 하이브리드반응후에, 카이나제 모티프의 공지된 서열에 기초하여 PCR에 의해 클로닝하여, 두 개 가상 단백질-티로신 카이나제를 확인하고, 클로닝하는 것에 대해 설명한다. 이와 같은 방법을 이용하여, RAP 단백질 서열을 이용하여, 관련된 RIP 결합 단백질을 확인하고 클론한다.

iv) 본 발명의 RAP 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 이용하는 또 다른 방법은 세포내 시그날 과정에 관계하는 다른 단백질 또는 인자에 결합할 수 있는 능력을 가지는 다른 단백질 또는 인자를 분리 및 확인하기 위한 친화성 크로마토그래피 방법에 사용하는 것이다. 이와 같은 용도에서, 본 발명의 RAP 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체는 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 개별적으로 부착시키고 그 다음 세포 추출물 또는 세포내 시그날 공정에 관계하는 것으로 보이는 분리된 단백질 또는 인자와 접촉시킨다. 친화력 크로카토그래피후에 RAP 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체에 결합된 다른 단백질 또는 인자를 용출시키고, 분리하여 특징을 조사한다.

(v) 전술한 것과 같이, 본 발명의 RAP 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 이뮤노겐(항원)으로 이용하여 이에 대한 특이적인 항체를 만들 수 있다. 이와 같은 항체를 이용하여 세포 추출물 또는 이와 같은 RAP 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 생산하는 형질변환된 세포로부터 본 발명의 RAP 단백질(RAP 또는 이의 동소체)을 정제할 수 있다. 또한, 이들 항체를 이용하여 RIP 또는 RIP의 자체 특이적인 세포 효과에 의해 중재되는 과도한 또는 과소한 FAS-R 리간드 또는 TNF-유도된 세포 효과를 가지는 RIP-중개된 FAS-R 리간드 또는 TNF-시스템 또는 독립 RIP 활성의 이상이 있는 것과 연관된 질병을 확인하기 위한 진단을 할 수 있다. 따라서, RIP 단백질, 다양한 단백질, RIP 결합 단백질 또는 RAP 단백질 자체가 관련된 기능이상의 세포내 시그날 시스템과 질병이 연관이 있는 경우에 이와 같은 항체들은 중요한 진단 도구가 될 수 있다.

공지의 표준 스크리닝 과정을 이용하여 본 발명의 RAP 단백질을 분리, 확인 및 특징화할 수 있다. 예를 들면, 하기에서 제시하는 바와 같이, 스크리닝 과정중 하나는 이스트 두 개-하이브리드 과정을 이용하여, RIP 단백질을 확인하고, 이어서 본 발명의 RAP 단백질 및 다양한 RIP-결합 단백질을 확인할 수 있다. 상기에서 그리고 하기에서 언급하는 것과 같이, 당분야에 공지된 친화력 크로마토그래피, DNA 하이브리드 과정등을 이용하여, 본 발명의 RAP 단백질을 분리, 확인 및 특징화하거나, 본 발명의 RAP 단백질에 결합할 수 있는 추가 단백질, 인자. 수용체등을 분리, 확인, 특징화할 수 있다.

여기에서 제시된 바와 같이, RAP 단백질을 이용하여 RAP에 특이적인 항체 가령, RAP 및 이의 동소체에 특이적인 항체를 만든다. 이와 같은 항체 또는 이의 단편은 하기에서 상세히 설명하고, 이들은 RAP 단백질에 특이적이라는 것을 인지할 것이다.

RAP가 RIP에 특이적으로 결합하고, 이는 RIP의 조절물질이고, 따라서 RIP가 독립적으로 또는 다른 단백질(가령 FAS-R, p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, G1, TRADD) 과 연합하여 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정에서 RIP의 활성을 조절한다는 본 발명에 따른 발견에 기초하여, 원하는 바에 따라 RAP-RIP 상호작용을 강화 또는 저해하는 약물을 고안하고, 이와 같은 경로는 RAP-RIP 상호작용에 의해 강화/저해된다. 이와 같은 약물이 도움을 줄 수 있는 질병은 수없이 많다. 이들 가운데에는, 간에 급성 손상은 간 세포의 FAS-R 리간드-중개된 죽음이라는 것을 반영하는 급성 간염; 췌장의 β랑게르한스샘 세포의 죽음과 같은 자가면역-유도된 세포 죽음으로 인하여, 진성 당뇨병이 되고; 이식편 거부로 인한 세포 죽음(신장, 심장, 간); 다발성 경색에서 핍지신경교의 죽음; AIDS-저해된 T 세포 자살로 인하여 AIDS 바이러스를 증식하게 하고, AIDS 질병이 된다.

여기에서 언급한 것과 같이, RAP 또는 이의 가능한 동소체(가령, RAPβ동소체)는 RAP 프로테아제 또는 RAP 프로테아제 동소체의 "자연" 저해물질로 작용하고, 이들을 상기 특정 RAP 프로테아제 저해물질로 이용할 수 있다. 유사하게, 펩티드, 유기 화합물, 항체등과 같은 다른 물질을 스크린하여, RAP 프로테아제를 저해할 수 있는 특정 약물을 수득한다.

RAP 프로테아제의 펩티드 방해물질을 어떻게 만들고 스크리닝하는지의 예는 ICE 또는 ICE-유사 프로테아제의 펩티드 방해물질에 대한 기존 연구, 펩티드 합성을 이용하여 에피토프 분석을 위한 전략과 ICE 기질 특이성에 대한 연구를 기초로 한다. ICE에 의한 펩티드의 효과적인 절단에 필요한 최소 조건은 P₁위치에 아스파르트산을 선호하는 절단 위치의 우측에 네 가지 아미노산과 P₁위치에 우측에 메틸아민이 절단위치에 관계한다는 것을 알았다(Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). 또한, 프로로로젠 지질 펩티드(테트라펩티드) 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-메틸-코마릴-7-아미드)[약어 Ac-DEVD-AMC]는 FAS-R 자극후에 그리고 다른 아포토틱 과정후에(Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994) 세포에서 절단되는 것으로 밝혀진 폴리(A에-리보즈) 폴리메라제(PARP)에 있는 서열에 상응하고 CPP32(CED/ICE 프로테아제 족의 한 구성원)와 MACH 프로테아제(및 RAP 프로테아제에 의해 가능한 것)에 의해 효과적으로 절단된다.

기질의 P₁위치에 Asp가 중요한 것으로 보이기 때문에, 4번째 아미노산이 Asp를 가지는 테트라펩티드와 처음 세 개 잔기 위치에 다양한 아미노산 복합물을 Gelyson(Geysen, 1985; Geysen et al., 1987)이 개발한 방법을 이용하여 프로테아제의 활성 부위에 결합하는 지를 스크리닝하는데 이 방법은 여러 가지 많은 펩티드를 고형 서포트에 붙이고 항체와 특이적인 상호작용을 하는 지를 스크리닝하였다. 특정 펩티드에 MACH 프로테아제가 결합하는 것은 방사능라벨링과 같은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여 감지할 수 있다. Geysen의 방법은 각 하루 작업일동안 적어도 4000펩티드를 테스트할 수 있다.

유사하게, RAP 및 RIP의 상호작용을 결정하는 상동 부분 또는 정확한 결합 부분을 밝히고, 이와 샅은 상호작용을 차단할 수 있는 펩티드를 스크린하는데, 예를 들면, 합성된 펩티드는 RIP에 결합하는데 있어서 천연 RIP와 경쟁할 수 있는 결합 부분 또는 이에 상보적인 부분에 유사한 서열을 가진다.

RAP-RIP 상호작용을 저해하여 RAP의 세포 죽음 활성 또는 염증을 저해하는 능력을 가지는 약물 또는 펩티드 방해물질은 세포로 들어갈 수 있는 분자와 결합하거나 복합시킬 수 있다.

미국 특허 5,149,782에서는 세포막을 통하여 이동될 분자에 퓨소제닉(fusogenic) 폴리펩티드, 이온-채널 형성 폴리펩티드, 다른 막 폴리펩티드, 미리스틱산, 팔미드산과 같은 긴 사슬 지방산등과 같은 막 혼합물질과 결합시킬 수 있다. 이와 같은 막 혼합 물질은 세포 막의 지질 이중층에 분자 결합물질을 삽입하여 세포질로 이들을 들어가게 할 수 있다고 상술하고 있다.

Low et al.,의 미국 특허 5,108,921에서는 수용체 중개된 엔도사이토시스 활성 메카니즘에 의해 단백질 및 핵산을 포함하나 이에 국한시키지 않는 분자를 막을 통하여 수송하는 방법에 대해 언급하고 있다. 이와 같은 수용체 시스템에는 이들을 인지하는 갈락토즈, 만노즈, 만노즈-6-포스페이트, 트랜스페린, 아시알글리토프로테인, 트란스코발민(비타민 B₁₂), α-2 마크로글로불린, 인슐린 및 상피 성장 인자(EGF)와 같은 다른 펩티드 성장 인자 등을 포함한다. Low et al.,은 바이오틴 및 폴레이트(folate)와 같은 영양소 수용체를 이용하면 대부분의 세포 표면에 바이오틴 및 폴레이트가 다수 위치하고 막 수용체 중개된 연합적인 막 통과 과정으로 인하여 막을 통한 수송을 강화시킬 수 있다. 따라서, 세포질로 수송할 화합물과 바이오틴 또는 폴레이트와 같은 리간드간사이에 형성된 복합체는 바이오틴 또는 폴레이트를 포함하는 세포 막과 접촉하게 되어 수용체 중개된 막-통과 수송을 개시하고 세포안으로 원하는 화합물이 들어가게 된다.

또한, 본 기술에 공지된 바와 같이, 원하는 펩티드 서열에 리더/시그날 펩티드 서열을 융합시켜 "키메라 펩티드"를 만들면 이와 같은 키메라 펩티드는 세포막을 통하여 세포질로 수송될 수 있다.

펩티드 분야에 숙지의 지식을 가진 자는 본 발명에 따른 RAP-RIP 상호작용의 펩티드 방해물질이란 좀더 안정적인 방해물질을 만들기 위해 RAP/RIP 프로테아제에 결합하는 지를 신속하에 스크리닝할 수 있는 펩티드를 모방한 약물 또는 방해물질을 포함한다는 것을 인지할 것이다.

전술한 것과 같이 세포막을 통하여 펩티드 방해물질의 수송을 실행하거나 강화한다는 의미는 RAP 또는 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 이와 같은 효과를 세포내에서 발휘할 수 있는 다른 펩티드 및 단백질에 적용한다는 것을 의미한다.

명세서를 통하여 언급된 "항체"에 대해서는 다클론성 항체, 단클론성 항체(mAbs), 키메라 항체, 가용성 또는 결합형의 라벨이 된 항체에 대한 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 효소에의한 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기술등과 같이 임의 공지된 기술에 의해 만들 수 있는 항체 단편을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

다클론성 항체는 항원으로 면역 처리한 동물의 혈장으로부터 유도한 이형 집단 항체 분자를 말한다. 단클론성 항체는 항원에 특이적인 실제 동종의 항체 집단을 의미하는데 이들 집단에는 실제 유사한 에피토프 결합 부위를 가진다. MAbs는 Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975); 미국 특허 4,376,110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES; A LABORATORY MANAUAL, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); and Colligan et al., eds, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y.,(1992-199)에 상술한 기술을 이용하여 만들 수 있다. 이와 같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, GILD 및 이의 하류를 포함하는 임의 이뮤노글로블린이 된다. 본 발명의 mAb를 만드는 하이브리도마는 in vitro, in vivo, in situ에서 배양할 수 있다. in vivo 또는 in situ의 고역가의 단클론항체 생산이 적절한 방법이다.

키메라 항체는 상이한 부분을 가지는 분자로 뮤린(murin) mAb와 사람 이뮤노글로블린 항상부분에서 유도한 다양한 부분을 가지는 다른 동물종에서 유도할 수 있는 것이다. 주로 키메라 항체는 면역원성을 감소시키는데 이용되고 생산성을 증가시키는데 이용되는데 가령 뮤린 mAb는 하이브리도마에서 높은 역가를 가지나 사람에서는 높은 면역원성을 가지기 때문에 사람/뮤린 키메라 mAb를 이용한다. 키메라 항체와 이를 생산하는 방법에 대해서는 본 분야에 공지되어 있다(Cabily et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81;3273-3277(1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646(1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270(1985); Taniguchi et al., European Patent Application 171496(published Feb 19, 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494(published Mar 13, 1996); Kudo et al., European Patent Application 184187(published June 11, 1986); Sahagan et al., J. Immunol 137;1066-1074(1986); Robinson et al., International Patent Application No. Wo 8702671(published May 7, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 3439-3443(1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84-214-218(1987); Better et al., Science 240;1041-1043(1988) and Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, supra.

항-이디오타입(항-Id) 항체는 항체의 항원 결합 부위와 일반적으로 연합하는 독특한 결정 부위를 인지하는 항체이다. Id 항체는 항-Id를 만든 mAb원으로써 동일 종 그리고 동일한 유전자형의 동물(가령, 쥐 strain)에 면역처리하여 준비할 수 있다. 면역처리된 동물은 이와 같은 이들 이디오타입 항원결정기에 대한 항체를 준비함으로써 면역처리된 항체의 이디오타입 결정부위를 인지하고 반응한다(참고 미국 특허 4,699,880).

항-id 항체는 다른 동물에서 소위 항-항-id 항체를 만드는 면역 반응을 유도하는 "이뮤노겐"으로 이용될 수 있다. 항-항-id는 항-ID를 유도한 원래 mAb의 에피토프와 동일하다. 따라서, mAb의 이디오타입 결정부위에 대한 항체를 이용함으로써 동일한 특이성을 가지는 항체를 발현시키는 다른 클론을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 RAP 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체에 대항하여 발생된 mAb을 이용하여 BALB/c 쥐과 같은 적절한 동물에서 항-Id 항체를 유도할 수 있다. 이와 같은 면역처리된 쥐의 췌장 세포를 이용하여 항-Id mAb를 분비하는 항-Id 하이브리드를 생산한다. 또한, 항-Id mAb를 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 결합시켜 추가 BALB/c 쥐를 면역처리한다. 이들 쥐의 혈청에는 상기 RAP 단백질 또는 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체의 에피토프에 특이적인 고유 mAb의 결합 성질을 가지는 항-항-Id 항체를 포함할 수 있다.

항-Id mAbs에는 이들 고유의 이디오타입 에피토프 또는 GRB 단백질-a와 같은 평가할 에피토프와 구조적으로 유사한 "이디오토프(idiotopes)"를 가진다.

"항체"는 고유 항체뿐만 아니라 항원에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')₂와 같은 단편을 포함한다. Fab와 F(ab')₂단편은 고유 항체의 Fc 단편이 부족하고 순환계로 부터 더 빨리 제거되고 고유 항체보다는 다소 특이성이 적은 조직 결합을 가진다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24;316-325(1983)).

Fab와 F(ab')₂및 본 발명의 항체의 다른 단편을 이용하면 고유 항체 분자에 대해 본 발명에서 상술하고 있는 RAP 단백질의 감지와 정량을 할 수 있다. 이와 같은 단편은 일반적으로 파파인(Fab 단편을 만듬) 또는 펩신(F(ab')₂단편을 만듬)과 같은 효소를 이용하여 단백질 분해에 의해 만들 수 있다.

항체는 분자에 특이적으로 반응한다면 특이적으로 분자에 결합할 수 있는 능력이 있는 항체에 분자가 결합한다. "에티토프"는 항체에 의해 인지되어 항체가 분자의 임의 부분에 결합할 수 있는 부분을 말한다. 에피토프 또는 "항원 결정부위"는 일반적으로 아미노산 또는 당의 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성이 있는 표면 그룹으로 구성되고 3차 구조적인 특징 및 특이적인 전하 특징을 가진다.

"항원"은 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 만들기 위해 동물에 추가 유도할 수 있는 항체에 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가진다. 상기에서 언급한 특이적인 반응은 매우 특이적인 방식으로 항원에 상응하는 항체에 반응을 하고 다른 항원에 의해 야기되는 다른 항체에는 반응하지 않는다는 것을 말한다.

본 발명에 유용한 항체의 일부분을 포함하는 항체를 이용하여 샘플에서 RAP 단백질을 정량 또는 정성적으로 감지하거나 본 발명의 RAP 단백질을 발현시키는 세포의 존재를 확인할 수 있다. 이는 광 현미경, 흐름 세포 계산기 또는 형광측정 감지기가 결합된 형광 라벨된 항체(하기 참조)를 이용한 면역형광 기술을 이용한다.

본 발명의 항체(또는 이의 단편)를 조직학적으로 이용하여 면역형광 또는 면역전자 현미경에서 본 발명의 RAP 단백질의 in situ 감지한다. In situ 감지는 환자에서 조직학적 견본을 떼내고, 본 발명의 라벨된 항체를 견본에 제공하여 이루어진다. 항체(또는 이의 단편)은 생물학적 샘플에 라벨된 항체(또는 이의 단편)을 제공하거나 겹치게 하여 적절하게 제공할 수 있다. 이와 같은 과정을 이용하여 RAP 단백질의 존재를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 검사한 조직에서 이의 분포를 알 수 있다. 본 발명을 이용하면, 당업자는 이와 같은 in situ 감지를 위해 광범위한 다양한 조직학적 방법(가령 착색 과정)을 변형시킬 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 RAP 단백질의 생물학적 검사는 일반적으로 RAP 단백질을 확인할 수 있는 감지 가능한 라벨된 항체 존재하에 생물학적 유체, 조직 추출물, 임파세포 또는 백혈구세포와 같은 새로 수득한 조직 또는 조직 배양물에서 배양된 세포를 배양하고, 공지의 여러 가지 방법을 이용하여 항체를 감지하는 것으로 구성된다.

생물학적 샘플은 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 니트로셀룰로오즈 또는 다른 서포트 또는 담체와 같은 고형상 서포트 또는 담체로 처리한다. 서포트 또는 담체는 전술한 것과 같이 본 발명에 따른 감지 가능한 라벨링된 항체로 처리한 후에 적절한 완충액으로 세척한다. 고형상 서포트 또는 담체를 다시 세척하여 결합 안된 항체를 제거한다. 고형상 서포트 또는 담체에 결합된 라벨의 양을 통상적인 방법을 이용하여 감지한다.

"고형성 서포트", "고형상 담체", "고형 서포트", "고형 담체", "서포트" 또는 "담체"는 항원 또는 항체가 결합할 수 있는 임의 서포트 또는 담체를 의미한다. 공지의 서포트 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나이론 아밀라제, 천연 또는 변형된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철광을 포함한다. 천연 담체는 본 발명의 목적을 위해 어느 정도의 가용성 또는 불용성일 수 있다. 서포트 물질은 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한 임의 가능한 구조적인 모양을 가질 수 있다. 따라서, 서포트 또는 담체 모양은 비드와 같은 원형, 시험관의 내부 또는 막대의 외부와 같은 실린더형이 될 수 있다. 또는 표면은 쉬트, 테스트 스트립등과 같은 편평한 것일 수 있다. 적절한 서포트 또는 담체는 폴리스테렌 비드를 포함한다. 당업자는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 다른 적절한 담체를 이용할 수 있고 임의 실험을 통하여 결정할 수 있다.

상기에서 언급한 것과 같이 본 발명의 주어진 항체에 대한 결합 활성은 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 당업자는 일상적인 실험을 이용하여 각 측정에 적합한 실험 조건을 결정할 수 있다.

세척, 교반, 혼합, 여과등과 같은 다른 과정은 특정 상황에따라 또는 통성적인 과정에 따라 추가할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 효소를 연결하여 감지가능한 라벨링을 하는 한 가지 방법으로 효소 면역검사(EIA)에 이용할 수 있다. 다시 이와 같은 효소는 적절한 기질에 노출되었을 때, 분광광도계, 형광 측정 또는 다른 시각적 수단등으로 감지할 수 있는 화학적 부분을 만드는 방식으로 기질과 반응한다. 항체에 감지가능한 라벨링을 하는데 이용되는 효소로는 말레이트 디하이드로게나제, 스타필로코커스 핵산분해효소, 델타-5-스테로이드 이소메라제, 이스트 알코올 디하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 디하이드로게나제, 트리오즈 포스페이트 이소메라제, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, 아스파라기나제, 포도당 산화효소, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레이즈, 카탈라제, 포도당-6-??스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라제, 아세틸콜린-에스테라제 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 효소에 대한 발색 기질을 이용하는 발색 방법으로 감지할 수 있다. 유사하게 준비된 표준과 비교하여 기질의 효소반응의 정도를 시각적으로 비교함으로써 감지할 수 있다.

다양한 다른 면역검사를 이용하여 감지할 수 있다. 가령, 항체 또는 항체 단편에 방사능활성 라벨링을 함으로써, 방사능 면역검사(RIA)를 통한 R-PTPase를 감지할 수 있다. RIA에 대해서는 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY(1978) with particular reference to the chapter entitled "An Imtroduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard. T.에 상세하게 기술하고 있다. 방사능활성 에피토프는 카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 자가방사 등에 의해 감지될 수 있다.

형광 화합물로 본 발명에 따른 항체를 라벨할 수 있다. 형광 라벨된 항체를 적절한 파장의 빛에 노출시키면, 형광이 존재하기 때문에 존재를 확인할 수 있다. 흔히 이용되는 형광 라벨링 화합물중에는 형광 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리틴, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플로로카민 등을 포함한다.

항체는¹⁵²E 또는 다른 란탄이드과 같은 형광을 발생하는 금속을 이용하여 라벨링을 할 수 있다. 이와 같은 금속은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(ETPA)과 같은 금속 킬레이트 기를 이용하여 항체에 결합할 수 있다.

항체는 화학적 발광 화합물에 결합시켜 감지 가능한 라벨링을 할 수 있다. 화학적 발광 화합물이 결합된 항체는 화학 반응 과정동안에 발생하는 발광을 존재를 감지함으로써 결정할 수 있다. 특히 유용한 화학적 발광 라벨링 화합물의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 트레오마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리딘염 및 옥살레이트 에스테르이다.

유사하게, 생물학적 발광 화합물을 이용하여 본 발명의 항체를 라벨링시킬 수 있다. 생물학적 발광은 촉매 단백질이 화학적 발광 반응의 효과를 증가시키는 생물계에서 볼 수 있는 일종의 화학적 발광이다. 생물학적 발광의 존재는 발광의 존재를 감지하여 결정할 수 있다. 라벨링을 목적으로 하는 중요한 생물학적 발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿠오린이 있다.

본 발명의 항체 분자는 "two-site" 또는"sandwich" 검사로 공지된 면역측정 검사에 이용할 수 있다. 일반적인 면역측정 검사에서 라벨안된 항체(또는 항체의 단편)의 양은 고형 서포트 또는 담체에 결합된 것이고 감지 가능한 라벨된 가용성 항체를 첨가하면 고형상 항체, 항원 및 라벨된 항체간에 형성된 세 가지 복합체의 감지 및 정량할 수 있다.

일반적인 그리고 적절한 면역측정 검사에는 "forward" 검사를 포함하는데 이는 고형상에 결합된 항체를 우선 고형상과 항원 복합체를 형성할 수 있도록 샘플에서 항원을 추출하기 위해 샘플과 접촉시킨다. 적절한 배양 기간 후에, 고형상 서포트 또는 담체를 세척하여 반응 안한 항원을 포함하는 유체 샘플 잔류물을 제거하고 양을 모르는 라벨된 항체를 포함하는 용액과 접촉시킨다(이는 "reporter" 분자로 작용을 함). 고형 서포트 또는 담체에 결합된 항원 복합체에 라벨된 항체를 결합시키기 위한 제2배양 기간 후에, 고형 서포트 또는 담체는 2번째로 세척하여 반응 안된 라벨링 항체를 제거한다.

또 다른 형태의 "sandwich" 검사는 본 발명의 항원을 유용하게 이용하는 것으로 소위 "simultaneous" 또는 "reverse" 검사를 이용한다. 동시검사는 고형상 서포트에 결합된 항체와 라벨된 항체를 동시에 테스트할 샘플에 첨가하는 1단계 배양 단계로 구성된다. 배양이 완료된 후에, 고형상 서포트 또는 담체를 세척하여 유체 샘플 잔류물과 결합 안된 라벨된 항체를 제거한다. 고형상 서포트 또는 담체와 연합된 라벨된 항체는 "forward" 샌드위치 검사와 같이 결정된다.

"reverse" 검사에서, 유체 샘플에 라벨된 항체 용액을 우선 첨가하고 적절한 배양 시간 후에 고형 서포트 또는 담체에 라벨 안된 항체를 첨가한다. 제2배양 후에, 고형상은 통상의 방식으로 세척하여 테스트할 샘플에 잔류물과 반응 안된 라벨링된 항체 용액을 제거한다. 고형 서포트 또는 담체와 연합된 라벨된 항체는 "simultaneous" 또는 "forward" 검사와 같이 결정할 수 있다.

본 발명의 RAP 단백질은 임의 표준 재조합 DNA 과정(Sambrook et al., 1989, and Ansabel et al., 1987-1995, supra)을 이용하여 생산할 수 있는데, 즉 본 발명의 단백질을 인코드하는 진핵 또는 원핵 벡터를 당분야에 공지된 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 형질도입시킨다. 따라서, 본 발명은 이와 같이 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 이용되는 발현 벡터 및 형질변환된 숙주에 관계한다. 전술한 것과 같이, 이와 같은 단백질에는 이들의 생물학적 활성 유사체, 단편, 유도체등이 포함되고, 이들을 인코드하는 벡터에는 이와 같은 유도체 및 단편을 인코드하는 것도 포함되고, 형질변환된 숙주에는 이와 같은 유도체 및 단편을 생산하는 것도 포함된다. 형질변환된 숙주에 의해 생산되는 이와 같은 단백질의 유도체는 단백질 또는 이의 유사체 및 단편을 표준 방법에 따라 변형된 유도체가 된다.

본 발명은 또한 RAP 단백질을 인코드하는 재조합 동물 바이러스로 구성된 제약학적 조성물에 관계하는데, 벡터에는 세포에 RAP 서열을 삽입하기 위한 특정 표적 세포(암 세포) 표면 단백질에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질을 인코드한다. 또한 본 발명의 제약학적 조성물에는 활성성분으로써 RAP 단백질 서열의 안티-센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드(a)과 RAP-RIP 상호작용을 차단하는 약물(b)로 구성된다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물에는 원하는 목적을 실행하기 위해 충분한 양의 활성성분을 포함한다. 또한, 제약학적 조성물은 제약학적으로 이용할 수 있는 조제물에 활성화합물을 프로세싱할 수 있는 그리고 환자에게 투약할 조제물을 안정화시킬 수 있는 부형제 및 보조제로 구성된 제약학적 조성물 수용 가능한 담체로 구성되는데 이는 당업자에게 공지되어 있다.

RAP 단백질 및 이의 동소체 또는 이소타입은 공동 출원에서 언급하고 있는 것과 같이, 세포내 시그날발생 경로에 관여하는 다양한 다른 단백질의 발현에는 유사한 방식으로 상이한 패턴의 이소타입과 함께 여러 조직에서 상당히 다른 수준으로 발현되는 것으로 보인다. 이와 같은 차이는 Fas/APO1-리간드와 TNF에 반응하는 조직-특이적 반응을 일으키게 한다. 다른 CED3/ICE 동사체의 경우와 같이(Wanh etal.,; Alnemri et al., 1995), 본 발명은 불완전한 CED3/ICE부분(가령, MACHα3)을 포함하는 MACH 동소체는 공동 발현된 MACHα1-MACHα2 분자의 활성에 방해효과를 가지는 것으로 밝혀졌고; 이는 Fas/APO1과 p55-R에 의한 세포 죽음을 유도하는 것을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 세포에서 이와 같은 저해성 동소체의 발현은 Fas/APO1 및 TNF-중개된 세포독성에 대해 세포의 자가-방어 기작에 관여한다. 적어도 일부 G1 동소체의 유사한 방해 효과를 예측할 수 있다(G1은 최근에 분리된 신규한 Mch4- 및 가능한 MACH- 결합 단백질 및 MORT MODULES를 가지는 MORT-1 결합 단백질, 프로테아제 도메인이다-공동 출원 IL-120367참고). CED3/ICE 족의 다른 프로테아제에서 관찰되는 것보다 상당히 초과한 MACH 동소체의 광범위한 이형성(heterogeneity)으로 인하여 활성 MACH 동소체의 기능을 활성 G1 동소체를 분석하여 매우 정교하게 조절할 수 있도록 한다. 여기에서, 상기에서 언급한 것과 같이, RAP 단백질 또는 다른 가능한 동소체는 RIP와 상호작용에 대한 상이한 조직에서 다양한 효과를 가지고, 상기에서 설명한 것과 같이 세포 죽음 또는 세포 생존 과정의 활성 사이에 균형에 의해 이들이 영향을 받는다.

가능한 RAP 단백질중의 일부는 다른 기능을 할 수 있다. 예를 들면, RAP 및 일부 RAP 동소체는 RIP와 상호작용 또는 RIP 독립적으로 Fas/APO1 및 TNF 수용체의 다른 비-세포독성 효과에 관여하는 분자에 대한 도킹 부위가 된다.

염증, 세포 죽음의 원인이 되는 Fas/APO1 및 TNF 수용체 능력 및 다른 조직-손상 활성을 자극하는 TNF 수용체의 능력으로 인하여 이들 수용체의 기능의 변형은 유기체에 상당히 유해하다. 또한, 이들 수용체의 과도한 또는 결핍된 기능은 다양한 질병의 병인에 기여한다(Vassalli, 1992, Nagata and Golstein, 1995). 수용체의 시그날 발생에 참여하는 분자의 확인 및 이들 분자의 활성을 조절하는 방법을 발견하는 것이 새로운 치료요법을 발견하는 것이다.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명을 하는데 이에 국한시키지는 않는다.

i) 두 가지 하이브리드 스크린과 두 가지 하이브리드 β-갈락토시다제 발현 테스트; (ii) 단백질의 유도된 발현, 대사적 라벨링 면역침전; (iii) in vitro 결합; (iv) 세포독성의 평가; (v) 노던 분석 및 서열 분석; 참고 실시예 1(Boldin et al., 1995b) 및 실시예 2, 3(Boldin et al., 1996)에서는 RIP 및 RIP 결합 단백질에 대한 것으로 본 발명의 RAP 및 이의 동소체의 이에 상응하는 분리, 클로닝, 특징화에 동일하게 적용할 수 있다. 이와 같은 과정은 하기 실시예 1에서 설명하는 것과 같이 본 발명에 따른 RAP의 분리, 클로닝, 특징화와 동일하다(하기 참고 실시예 1-3은 공동 출원중인 이스라엘 출원 114615, 114986, 115319, 116588, 117932, 120367 및 PCT/US96/10521에 상세하게 설명을 하고 있다. 또한, NF-κB 활성화에 NIK 단백질 및 이의 역할과 세포 생존 과정에서 Traf2에 의한 세포 생존 및 역할 예를 들면, Traf2 및 다른 단백질사이에 상호작용은 본 발명자의 공동 이스라엘 출원 IL 117800, IL119133 및 Malinin et al., 1997에서 설명하고 있다.

실시예 1: RIP 단백질에 결합하는 RAP을 클로닝 및 분리

(i) 이중-하이브리드 스크린 및 예비분석

B-세포 라이브러리에서 미끼로 죽음 도메인이 없는 RIP로 이중 하이브리드 스크린을 이용하여(Fields and Song, 1989), 약 1.9kb 크기의 클론을 분리하고, 서열화한다.

이 서열의 5' 말단에서 프라이머를 고안하여 준비하였다. PCR을 이용하여, 몇 가지 cDNA 라이브러리를 스크린하였다. 결장 cDNA 라이버르리와 심장 cDNA 라이브러리로부터, 약 0.3kb 클론을 수득하고, 이를 B-세포 라이브러리에서 수득한 약 1.9kb 클론에 결찰한다.

약 2.2kb의 새로운 클론을 서열화하고(도 1참고), 이의 유추된 아미노산 서열을 결정한다(도 2).

서열을 분석하여, RAP 단백질은 "죽음 도메인"을 가지고 있지 않으며, MORT MODULE로 가지고 있지 않고, ICE 페밀리의 것과 같은 프로테아제 도메인을 가지고 있지 않으며, 카이나제 도메인을 가지고 있거나 TRAF 도메인도 가지고 있지 않는 것을 알 수 있다(공동 출원 및 다양한 문헌 참고 특히, Malinin et al., 1997). 결합 연구에 따르면, RAP는 RIP에만 결합하고, TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH에는 결합할 수 없다.

따라서, RAP는 현재까지 다른 세포내 시그날 발생 단백질에는 존재하지 않는 결합 도메인을 통한 매우 특이적인 방식으로 RIP와 상호작용/결합하는 특이적인 RIP-결합 단백질이라는 것이 밝혀졌다. RAP는 염증, 세포 죽음/세포 생존 과정을 RIP가 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 RIP 세포내 활성의 특이적인 중개물질이다.

간략하게 설명하면, "미끼"로 RIP의 "죽음 도메인"이 없는 RIP 단백질 단편을 이용하여, 사람 말초 혈액 임파세포 이중-하이브리드 cDNA 라이브러리를 이중 스크리닝한 후에 RAP 단백질 클론을 얻는다. RIP 서열은 공고된 것으로부터(Stanger et al., 1995) 얻을 수 있고, 사람 서열은 U25994의 번호를 가지는 GENEBANK에서 얻는다(생쥐의 RIP 서열은 U25995이다). 이와 같은 서열 정보를 이용하여, PCR-프라이머는 OLIGO4^TM소프트웨어로 고안하고, C-말단의 "죽음 도메인"이 없는 RIP의 코딩 부분에 상응하는 DNA 단편은 총 RNA 사람 섬유아세포 라이브러리(표준 과정을 이용)의 주형 cDNA로부터 얻는다. 그 다음 RIP의 죽음 도메인이 없는 RIP의 코딩 부분은 pGBT 벡터(Clontech)로 클론시키고, 이를 상기에서 언급한 것과 같이, 이중-하이브리드 스크리닝 과정에 "미끼"로 이용한다. 이와 같은 이중-하이브리드 스크린에서 클론의 수는 "죽음 도메인" 밖의 RIP 부분(RIP의 C-말단)에서 RIP와 상호작용하는 RIP-결합 단백질인 단백질의 모든 코딩 부분으로써, RIP의 "미끼"에 있지는 않는다. 상기와 같이 처리한 후에, cDNA 클론의 서열은 도 1에서 나타내었다.

상기 RAP 클론의 서열 및 "dbest" 데이터베이스의 서열을 분석하면, Human Genome Database level 1 및 GeneBank database에서는 RAP 서열이 공지되지 않은 새로운 것이고, 이에 상응하는 상동성을 가지는 서열도 없었다.

RAP가 다른 공지의 세포내 시그날 발생 단백질에 결합하는 지를 결정하기 위해 결합 검사를 실시하였다. 이 테스트에서, TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH는 RAP에 결합하는 능력이 있는 지에 대해 테스트하였다. 그러나, RAP는 이들 단백질에 결합할 수 없는 것으로 나타났다. RAP는 무관한 기준 단백질, 라미닌, 사이클린 D에도 결합할 수 없다.

상기 결과에 따르면, 신규한 RAP 단백질은 매우 특이적인 방식으로 RIP와 상호작용하고, 이는 RIP의 특이적인 조절물질이라는 것이다. RAP와 RIP의 정확한 결합 부위를 밝혀야 하지만, 이 부위는 RIP 및 RAP에 특이적인 것으로, RIP와 상호작용하는 것으로 알려진 다른 단백질 가령, MORT-1, TRADD, FAS-R, Traf2(Malinin et al., 1997)과는 공유되지 않는 것이다. 상기에서 언급한 것과 같은 다양한 데이터베이스의 서열과 비교 분석하면, RAP는 "죽음 도메인", MORT MODULE, 프로테아제 도메인(ICE/CED3 모티프), 카아나제 도메인/모티프 또는 TRAF 도메인을 가지지 않는 것으로 나타났다. 이와 같이, 예비 생물학적 활성 분석에 따르면, RAP는 다음과 같은 성질을 가진다;

(i) RAP는 과다 발현되었을 경우에 세포에 독성을 가지지 않고;

(ii) RAP는 TNF 치사로부터 세포를 보호할 수 없고, TNF-유도된 세포 독성의 저해물질이 아니고;

(iii) RAP는 NF-κB을 유도하지 못하고;

(iv) RAP는 TRADD, RIP, p55 TNF-R에 의해 활성화되는 NF-κB를 차단하지 못하고;

(v) RAP는 RAP에 의한 JNK(Jun kinase) 유도를 차단한다.

전술한 것으로부터 RAP는 매우 특이적인 RIP 단백질이고 따라서 RIP의 조절물질/중개물질이고, 이는 RIP-중개된 세포내 시그날 발생 과정에 관여하는 것으로 보인다.

상기 관점에서, RAP는 RIP 활성의 조절/중개에 관련되고, 이는 염증, 세포 죽음 과정에 관여하고("죽은 도메인"을 통하여 또는 MORT-1, TRADD, p55-R, FAS-R과 같은 다른 단백질과 상호작용을 통하여), MACH, Mch4, G1과 같은 연합된 프로테아제에 관여하고, 세포 생존 과정에 RIP관련(NF-κB 활성, 이는 Traf2와 상호작용을 통하여)된다. RAP가 RIP의 활성을 조절하는 과정은 상기에서 상세하게 설명하였고, 예를 들면, RAP-RIP 상호작용으로 세포 죽음 또는 세포 생존 과정을 강화시키고, 또는 세포 죽음 또는 세포 생존 과정을 저해하고, 이와 같은 강화 및 저해는 두 가지 상반되는 세포 과정에서 다른 성분의 상대적인 활성에 따라 달라지는 것이다. RAP는 RAP 분자를 응집시키는 펩티드 및 다른 RIP- 또는 RAP-결합 단백질에 도킹 부위로 작용하고, 이와 같은 응집으로 세포 죽음 또는 생존을 유도하는데, 이는 세포에서 이들 과정에 관련된 다른 성분의 상대적인 활성/양에 따라 달라진다.

본 발명은 특정 구체예로 설명하였으나, 추가 변형이 가능하다는 것을 인지할 것이다. 본 출원은 본 발명의 원리등을 포함한 다용한 용도, 적용 범위를 수용하고, 이들은 청구범위에서 제시한 기본적인 특징을 가진다.

여기에서 이용한 문헌(모든 문헌, 요약서, 공고된 미국 또는 다른 외국 출원, 또는 임의 다른 문헌)을 참고문헌으로 하여 제시한다. 또한, 전체 내용도 첨부한다.

공지의 방법, 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본 발명의 구체예에서 기재하는데 있어서 임의 동의를 받지 않았다.

특정 구체예의 설명은 본 발명의 일반적인 특징을 충분히 제시하는 것으로, 당분야에 숙지된 지식을 가진 자는 실험없이 다양하데 변형 및 조절할 수 있을 것이다. 따라서, 이와 같은 변형 및 수정도 여기에서 제시하는 범위에 등가이다. 여기에서 이용한 기술적인 용어는 설명을 하기 위함이고, 이에 한정하고자 함은 아니고, 본 발명의 용어는 당업자가 이해하고, 실시할 수 있도록 설명하였다.

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SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT:

(A) NAME: Yeda Research and Development Co. Ltd.

(B) STREET: Weizmann Institute of Science, P.O.B. 95

(C) CITY: Rehovot

(E) COUNTRY: Israel

(F) POSTAL CODE (ZIP): 76100

(G) TELEPHONE: 972-8-9344093

(H) TELEFAX: 972-8-9470739

(A) NAME: WALLACH, David

(B) STREET: 24 Borochov Street

(C) CITY: Rehovot

(E) COUNTRY: Israel

(F) POSTAL CODE (ZIP): 76406

(A) NAME: KOVALENKO, Andrei

(B) STREET: Beit Clore, Weizmann Institute of Science

(C) CITY: Rehovot

(E) COUNTRY: Israel

(F) POSTAL CODE (ZIP): 76100

(ii) TITLE OF INVENTION: Modulators of the Function of Receptors of

the TNG/NGF Receptor Family and Other Proteins

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2

(iv) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(v) CURRENT APPLICATION DATA:

APPLICATION NUMBER: IL PCT/IL98/00125

(vi) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: IL 120485

(B) FILING DATE: 19-MAR-1997

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 2154 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

CCAAAAGCTT CTCGACGGCC ATTACCAATC GCGAAACCGG CAGGGCGGCC ACTGTGGCGG 60

GGCTTCTTTT CCCCGTTTCG CCTCAGCTAC CCCTCAGCTC CGGTAGTCGC CAGTCCGGGG 120

TCGTCGCCGT TTGGGGCGGG AGCTGCTCGG CCCCGCCGCC GTCCCCGTCG CCGCTTCCGG 180

GTCCAGGCCC CTCGGGCCGC CTGCCGCCGT CATGAGGCTG CGGGTGCGGC TTCTGAAGCG 240

GACCTGGCCG CTGGAGGTGC CCGAGGCGGA GCCGGCTGGG GTCCGGCTCC TGGAGAACAT 300

GGCCCGGCCT CCCGTGGGCT CTGGTCCCCT CCTCGTTCTA ATACCCGATT TACAATTACA 360

TTGAACTACA AGGATCCCCT CACTGGAGAT GAAGAGACCT TGGCTTCATA TGGGATTGTT 420

TCTGGGGACT TGATATGTTT GATTCTTCAA GATGACATTC CAGCGCCTAA TATACCTTCA 480

TCCACAGATT CAGAGCATTC TTCACTCCAG AATAATGAGC AACTGGCCAC CAGCTCCAAT 540

CAGACTAGCA TGCAGGATGA ACAACCAAGT GATTCATTCC AAGGACAGGC AGCCCAGTCT 600

GGTGTTTGGA ATGACGACAG TATGTTAGGG CCTAGTCAAA ATTTTGAAGC TGAGTCAATT 660

CAAGATAATG CGCATATGGC AGAGGGCACA GGTTTCTATC CCTCAGAACC CATGCTCTGT 720

AGTGAATCGG TGGAAGGGCA AGTGCCACAT TCATTAGAGA CCTTGTATCA ATCAGCTGAC 780

TGTTCTGATG CCAATGATGC CTTGATAGTG TTGATACATC TTCTCATGTT GGAGTCAGGT 840

TACATACCTC AGGGCACCGA AGCCAAAGCA CTGTCCATGC CGGAGAAGTG GAAGTTGAGC 900

GGGGTGTATA AGCTGCAGTA CATGCATCCT CTCTGCGAGG GCAGCTCCGC TACTCTCACC 960

TGTGTGCCTT TGGGAAACCT GATTGTTGTA AATGCTACAC TAAAAATCAA CAATGAGATT 1020

AGAAGTGTGA AAAGATTGCA GCTGCTACCA GAATCTTTTA TTTGCAAAGA GAAACTAGGG 1080

GAAAATGTAG CCAACATATA CAAAGATCTT CAGAAACTCT CTCGCCTCTT TAAAGACCAG 1140

CTGGTGTATC CTCTTTTGGC TTTTACCCGA CAAGCACTGA ACCTACCAGA TGTATTTGGG 1200

TTGGTCGTCC TCCCATTGGA ACTGAAACTA CGGATCTTCC GACTTCTGGA TGTTCGTTCC 1260

GTCTTGTCTT TGTCTGCGGT TTGTCGTGAC CTCTTTACTG CTTCAAATGA CCCACTCCTG 1320

TGGAGGTTTT TATATCTGCG TGATTTTCGA GACAATACTG TCAGAGTTCA AGACACAGAT 1380

TGGAAAGAAC TGTACAGGAA GAGGCACATA CAAAGAAAAG AATCCCCGAA AGGGCGGTTT 1440

GTGATGCTCC TGCCATCGTC AACTCACACC ATTCCATTCT ATCCCAACCC CTTGCACCCT 1500

AGGCCATTTC CTAGCTCCCG CCTTCCTCCA GGAATTATCG GGGGTGAATA TGACCAAAGA 1560

CCAACACTTC CCTATGTTGG AGACCCAATC AGTTCACTCA TTCCTGGTCC TGGGGAGACG 1620

CCCAGCCAGT TTCCTCCACT GAGACCACGC TTTGATCCAG TTGGCCCACT TCCAGGACCT 1680

AACCCCATCT TGCCAGGGCG AGGCGGCCCC AATGACAGAT TTCCCTTTAG ACCCAGCAGG 1740

GGTCGGCCAA CTGATGGCCG GCTGTCATTC ATGTGATTGA TTTGTAATTT CATTTCTGGA 1800

GCTCCATTTG TTTTTGTTTC TAAACTACAG ATGTCAACTC CTTGGGGTGC TGATCTCGAG 1860

TGTTATTTTC TGATTGTGGT GTTGAGAGTT GCACTCCCAG AAACCTTTTA AGAGATACAT 1920

TTATAGCCCT AGGGGTGGTA TGACCCAAAG GTTCCTCTGT GACAAGGTTG GCCTTGGGAA 1980

TAGTTGGCTG CCAATCTCCC TGCTCTTGGT TCTCCTCTAG ATTGAAGTTT GTTTTCTGAT 2040

GCTGTTCTTA CCAGATTAAA AAAAAGTGTA AATTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2100

AAAAAAAAAA TTCCTGCGGC CGCTCGAGCA TGCATCTAGA GGCCGTGATC TAAT 2154

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 591 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Pro Lys Ala Ser Arg Arg Pro Leu Pro Ile Ala Lys Pro Ala Gly Arg

1 5 10 15

Pro Leu Trp Arg Gly Phe Phe Ser Pro Phe Arg Leu Ser Tyr Pro Ser

20 25 30

Ala Pro Val Val Ala Ser Pro Gly Ser Ser Pro Phe Gly Ala Gly Ala

35 40 45

Ala Arg Pro Arg Arg Arg Pro Arg Arg Arg Phe Arg Val Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Ala Ala Cys Arg Arg His Glu Ala Ala Gly Ala Ala Ser Glu Ala

65 70 75 80

Asp Leu Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly Gly Ala Gly Trp Gly Pro Ala

85 90 95

Pro Gly Glu His Gly Pro Ala Ser Arg Gly Leu Trp Ser Pro Pro Arg

100 105 110

Ser Asn Thr Arg Phe Thr Ile Thr Leu Asn Tyr Lys Asp Pro Leu Thr

115 120 125

Gly Asp Glu Glu Thr Leu Ala Ser Tyr Gly Ile Val Ser Gly Asp Leu

130 135 140

Ile Cys Leu Ile Leu Gln Asp Asp Ile Pro Ala Pro Asn Ile Pro Ser

145 150 155 160

Ser Thr Asp Ser Glu His Ser Ser Leu Gln Asn Asn Glu Gln Leu Ala

165 170 175

Thr Ser Ser Asn Gln Thr Ser Met Gln Asp Glu Gln Pro Ser Asp Ser

180 185 190

Phe Gln Gly Gln Ala Ala Gln Ser Gly Val Trp Asn Asp Asp Ser Met

195 200 205

Leu Gly Pro Ser Gln Asn Phe Glu Ala Glu Ser Ile Gln Asp Asn Ala

210 215 220

His Met Ala Glu Gly Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Glu Pro Met Leu Cys

225 230 235 240

Ser Glu Ser Val Glu Gly Gln Val Pro His Ser Leu Glu Thr Leu Tyr

245 250 255

Gln Ser Ala Asp Cys Ser Asp Ala Asn Asp Ala Leu Ile Val Leu Ile

260 265 270

His Leu Leu Met Leu Glu Ser Gly Tyr Ile Pro Gln Gly Thr Glu Ala

275 280 285

Lys Ala Leu Ser Met Pro Glu Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val Tyr Lys

290 295 300

Leu Gln Tyr Met His Pro Leu Cys Glu Gly Ser Ser Ala Thr Leu Thr

305 310 315 320

Cys Val Pro Leu Gly Asn Leu Ile Val Val Asn Ala Thr Leu Lys Ile

325 330 335

Asn Asn Glu Ile Arg Ser Val Lys Arg Leu Gln Leu Leu Pro Glu Ser

340 345 350

Phe Ile Cys Lys Glu Lys Leu Gly Glu Asn Val Ala Asn Ile Tyr Lys

355 360 365

Asp Leu Gln Lys Leu Ser Arg Leu Phe Lys Asp Gln Leu Val Tyr Pro

370 375 380

Leu Leu Ala Phe Thr Arg Gln Ala Leu Asn Leu Pro Asp Val Phe Gly

385 390 395 400

Leu Val Val Leu Pro Leu Glu Leu Lys Leu Arg Ile Phe Arg Leu Leu

405 410 415

Asp Val Arg Ser Val Leu Ser Leu Ser Ala Val Cys Arg Asp Leu Phe

420 425 430

Thr Ala Ser Asn Asp Pro Leu Leu Trp Arg Phe Leu Tyr Leu Arg Asp

435 440 445

Phe Arg Asp Asn Thr Val Arg Val Gln Asp Thr Asp Trp Lys Glu Leu

450 455 460

Tyr Arg Lys Arg His Ile Gln Arg Lys Glu Ser Pro Lys Gly Arg Phe

465 470 475 480

Val Met Leu Leu Pro Ser Ser Thr His Thr Ile Pro Phe Tyr Pro Asn

485 490 495

Pro Leu His Pro Arg Pro Phe Pro Ser Ser Arg Leu Pro Pro Gly Ile

500 505 510

Ile Gly Gly Glu Tyr Asp Gln Arg Pro Thr Leu Pro Tyr Val Gly Asp

515 520 525

Pro Ile Ser Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Glu Thr Pro Ser Gln Phe

530 535 540

Pro Pro Leu Arg Pro Arg Phe Asp Pro Val Gly Pro Leu Pro Gly Pro

545 550 555 560

Asn Pro Ile Leu Pro Gly Arg Gly Gly Pro Asn Asp Arg Phe Pro Phe

565 570 575

Arg Pro Ser Arg Gly Arg Pro Thr Asp Gly Arg Leu Ser Phe Met

580 585 590

Claims

RIP-연합된 단백질(RAP), 이의 동소체, 단편 또는 이의 유사체를 인코드하는 DNA 서열에 있어서, RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 RIP에 결합할 수 있거나 RIP의 세포내 활성을 중개 또는 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1 항에 있어서,

(a) 고유 RAP 단백질의 동소체 코딩 부분에서 유도된 cDNA;

(b) 스트린젼트 조건하에 (a)서열에 하이브리드될 수 있고, RAP 단백질의 생물학적으로 활성이 있는 동소체에 인코드할 수 있는 DNA 서열;

(c) (a) 및 (b)에서 정의한 DNA 서열에 대한 유전자 코드에 축중하고, RAP 단백질의 생물학적으로 활성이 있는 동소체를 인코드하는 DNA 서열에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1 항에 있어서, 도 1에서 설명된 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 도 1에 나타낸 서열로 구성되고, RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 단편을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1-4항중 어느 한항에 따른 DNA 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
제 5 항에 있어서, 진핵 세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 5 항에 있어서, 원핵 세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 5 항 내지 7항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질변형된 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
제1-4항에 따른 DNA 서열에 의해 인코드된 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에 있어서, RIP가 직접관여하거나 또는 다른 세포내 조절물질 과 연합하여 간접적으로 관련되는 염증, 세포 생존 또는 세포 죽음 과정에서 RIP에 결합하거나 RIP의 세포내 활성을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체.
제 9 항에 있어서, RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 도 1에서 나타낸 아미노산 서열의 일부를 가지는 것을 특징으로 하는 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체.
제 9 또는 10 항에 따른 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 생산하는 방법에 있어서, RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 발현시키는데 적합한 조건하에 제 10 항에 따른 형질변환된 숙주 세포를 생장시키고, 이와 같은 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 수득하는데 필수적인 전사후 변형을 시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제9-10항에 따른 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에 특이적인 것을 특징으로 하는 항체, 이의 활성 단편, 이의 유도체.
RIP가 직접관여하거나 또는 다른 세포내 조절물질 과 연합하여 간접적으로 관련되는 염증, 세포 생존 또는 세포 죽음 과정에서 RIP 조절된/중개된 세포내 효과를 조절 또는 중개하는 방법에 있어서, 세포에 제 9-10항중 어느 한항에 따른 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 처리하고, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내로 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하거나 또는 적절한 벡터를 이용하여 한 가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 벡터에 도입시켜, 벡터를 세포내로 도입시키고, 이때 벡터는 이들 서열을 세포내로 삽입시킬 수 있고, 세포에서 발현시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 세포를 처리하는 방법은 세포내로 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하거나 또는 적절한 벡터를 이용하여 한 가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 벡터에 도입시켜, 벡터를 세포내로 도입시키고, 이때 벡터는 이들 서열을 세포내로 삽입시킬 수 있고, 세포에서 발현시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항 또는 14항에 있어서, 세포는 다음과 같은 단계로 구성된 재조합 동물 바이러스 벡터로 세포에 트랜스펙션시키는데;

(a) FAS-R- 또는 p55-R-를 가지는 세포의 표면에 특이적인 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 바이러스성 표면 단백질(리간드)를 인코드하는 서열과 제 9-10항에 따른 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 제 2 서열을 가지는 재조합 동물 바이러스 벡터를 작제하고, 세포에서 발현되었을 때, RIP의 활성을 조절할 수 있고; 그리고

(b) (a)벡터를 세포에 감염시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
세포에서 RIP 조절된/중개된 효과를 조절하는 방법에 있어서, 제 12항에 따른 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 유도체로 처리하는데, 이때 세포를 처리하는 방법은 항체, 활성 단편 또는 이의 유도체를 포함하는 적절한 조성물을 세포에 제공하는데, 이때, RAP 단백질 또는 이의 일부는 세포의 세포외표면에 노출되는 경우에는, 조성물은 세포외에서 사용하도록 제조되고, RAP 단백질이 세포내의 것인 경우에는 조성물은 세포내에 사용하도록 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
세포에서 RIP 조절/중개된 효과를 조절하는 방법에 있어서, 세포는 제1-4항중 어느 한항에 따르는 RAP 단백질을 인코드하는 DNA 서열의 일부에 대한 안티센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열로 처리하고, 이때 올리고뉴클레오티드 서열은 RAP 단백질 발현을 차단할 수 있는 능력이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열은 제 15항에 따른 바이러스를 통하여 세포로 도입되고, 이때 바이러스의 제 2 서열은 올리고뉴클레오티드 서열을 인코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
종양 세포 또는 HIV-감염된 세포 또는 다른 질병을 가진 세포를 처리하는 방법에 있어서,

(a) 특정 종양 세포 수용체 또는 HIV-감염된 세포 표면 수용체 또는 다른 질병을 가진 세포가 가지는 수용체에 결합할 수 있는 바이러스성 표면 단백질을 인코드하는 서열 및 제9-10항에 따르는 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에서 선택된 단백질을 인코드하는 서열을 가지는 재조합 동물 바이러스 벡터를 작제하고; 종양 세포, HIV-감염된 또는 다른 질병을 가진 세포에서 발현되었을 경우에, HIV-감염된 또는 다른 질병을 가지는 세포는 RIP 조절/중개된 직간접적으로 세포의 죽음을 강화시키는 능력을 가지고; 그리고

(b) 종양 또는 HIV-감염된 세포 또는 다른 질병을 가진 세포에 (a) 벡터를 감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
세포에서 RIP 효과를 조절하는 방법에 있어서, 리보자임 과정을 이용하는데, 이때 제9-10항에 따른 RAP 단백질을 인코드하는 세포 mRNA 서열과 상호작용할 수 있는 리보자임 서열을 인코드하는 벡터를 세포내로 도입시키는데, 세포에서 리보자임 서열이 발현될 수 있도록 하고, 세포에서 리보자임 서열이 발현된 경우에, 세포 mRNA 서열과 상호작용하여, mRNA 서열을 절단하고, 세포에서 RAP 단백질의 발현을 방해하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9-10항에 따른 RIP에 직접적으로 결합할 수 있는 단백질을 분리 및 확인하는 방법에 있어서, 이스트 이중-하이브리드 과정을 이용하는데, RIP을 인코드하는 서열이 한 개 하이브리드 벡터가 가지고, 제 2 하이브리드 벡터는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 가지고, 이때 벡터를 이용하여 이스트 숙주 세포를 형질변환시키고, 양성으로 형질변환된 세포를 분리하고, RIP에 결합하는 단백질을 인코드하는 서열을 얻기 위해 제 2 하이브리드 벡터를 추출하는 과정으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제13-21항중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체중 적어도 한 가지인 것을 특징으로 하는 방법.
세포에서 RIP 효과를 조절하는 제약학적 조성물에 있어서, 활성물질로써 제 9-10항에 따르는 RAP 단백질의 적어도 한 가지 동소체, 이의 생물학적으로 활성이 있는 단편, 유사체, 유도체, 또는 이의 혼합물로 구성되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
세포에서 RIP 효과를 조절하는 제약학적 조성물에 있어서, 활성물질로써, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 인코드하고, 제9-10항에 따르는 RAP 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성이 있는 단편, 유사체 또는 유도체를 인코드하는 재조합 동물 바이러스 벡터로 구성되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
세포에서 RIP 효과를 조절하는 제약학적 조성물에 있어서, 활성물질로써, 제1-4항에 따른 RAP 단백질 mRNA 서열의 안티-센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
RIP에 의해 직간접적으로 조절되는 과정을 중개하는 방법에 있어서, 제9-10항에 따른 RIP에 결합할 수 있는 한 가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 처리하는데, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내로 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하거나 또는 적절한 벡터를 이용하여 한 가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 벡터에 도입시켜, 벡터를 세포내로 도입시키고, 이때 벡터는 이들 서열을 세포내로 삽입시킬 수 있고, 세포에서 발현시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
NF-κB 및 JNK의 저해를 유도하는 과정을 포함하는 RIP에 의해 직간접적으로 조절되는 과정을 중개하는 방법에 있어서, 제9-10항에 따른 RIP에 결합할 수 있는 한 가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 처리하는데, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내로 한가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하거나 또는 적절한 벡터를 이용하여 한 가지 이상의 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 벡터에 도입시켜, 벡터를 세포내로 도입시키고, 이때 벡터는 이들 서열을 세포내로 삽입시킬 수 있고, 세포에서 발현시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 단편은 펩티드인 것을 특징으로 하는 RAP 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체.