EA003269B1 - Cash (гомолог каспазы) с "гибель-эффекторным" доменом, модуляторы функций fas-рецепторов - Google Patents

Abstract

Раскрыты белки, способные модулировать или опосредовать функции MORT-1. Также раскрыты последовательности ДНК, кодирующие эти белки, и получение таких рекомбинантных белков, а также пути их использования.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом касается области науки, изучающей рецепторы, относящиеся к суперсемейству ΤΝΡ/ΝΟΡ-рецепторов, и контроль за их биологическими функциями. Суперсемейство ΤΝΡ/ΝΟΡ-рецепторов включает такие рецепторы как рецептор факторов некроза опухолей р55 и р75 (т.н. ΤΝΡ-К, также обозначаемые, соответственно, как СО 120а и СО120Ь: в данном тексте они будут обозначаться как р55-К и р75-К) и рецепторы ΡΆ8лигандов (также обозначаемые как ΡΆ8/ΆΡ01 или ΡΆ8-Κ, или СО95, а в данном тексте они будут обозначаться как ЕА8-К) и другие. Конкретнее, настоящее изобретение касается новых белков, которые связываются с другими белками, которые сами связываются с белком ΜΟΚΤ1 (или ΡΆΟΏ), они также называются ΜΟΚΤ-1связывающимися белками, или касается белков, которые напрямую связываются с белком ΜΟΚΤ-1, а конкретнее изобретение касается одного такого белка, обозначенного здесь как С1 (также обозначается как СЛ8Н для гомолога каспазы, но далее будет называться как С1), который связывается с ΜΟΚΤ1связывающимся белком Μο1ι4 (также обозначаемым/называемым как СЛ8Р-10) и, повидимому, связывается с другим ΜΟΚΤ1связывающимся, называемым МАСН (также обозначаемым/называемым как СА8Р-8), и, вероятно, сам связывается с ΜΟΚΤ-1 напрямую.

Соответственно настоящее изобретение, в принципе, касается новых белков, которые способны модулировать или опосредовать функции ΜΟΚΤ-1 напрямую или косвенно или других белков, связывающихся с ΜΟΚΤ-1 напрямую или ненапрямую. В частности, настоящее изобретение касается белка 01, его получения и его использования, а также некоторых новых изоформ 01, их получения и использования.

Предпосылки для изобретения в соответствующей области техники

Фактор некроза опухолей (ΤΝΡ-α) и лимфотоксин (ΤΝΡ-β) (далее аббревиатура ΤΝΡ будет относится и к ΤΝΡ-α и к ΤΝΡ-β) являются многофункциональными провоспалительными цитокинами, образуемыми в основном моноядерными фагоцитирующими клетками, обладающими разнообразными эффектами на клетки (\Уа11ас11. 1986, Ιη 1п!ег£егоп 7, еб. Ьу I. Огс55сг. Асаб. Рге88, Ьопбоп, рр. 83-122; и Веибег & Сегаш1, 1987). И ΤΝΡ-α, и ΤΝΡ-β проявляют свою активность путем связывания со специфическими поверхностно-клеточными рецепторами. Некоторые из их проявлений являются, вероятно, для организма позитивными: например, они могут разрушать опухолевые клетки или клетки, зараженные вирусами, и обусловливать противобактериальную активность гранулоцитов. В этом случае ΤΝΡ являются факторами защиты организма против опухолей и инфекционных агентов и участвуют в заживлении ран. Таким образом, ΤΝΡ могут быть использованы в качестве противоопухолевого средства, при применении которого оно связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и таким образом инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. Также ΤΝΡ могут быть использованы в качестве противоинфекционных агентов.

Однако и ΤΝΡ-α, и ΤΝΡ-β также обладают отрицательными проявлениями. Существуют доказательства того, что избыточная выработка ΤΝΡ-α может играть основную патогенетическую роль в развитии некоторых заболеваний. Например, действие ΤΝΡ-α, в первую очередь, на сосудистую систему известно как главная причина развития симптомов септического шока ^гасеу е! а1., 1986). При некоторых заболеваниях ΤΝΡ может обусловливать существенную потерю веса (кахексию) путем подавления активности адипоцитов, приводя к анорексии, что привело к обозначению ΤΝΡ-α как кахетина. Также было описано, что ΤΝΡ-α является медиатором повреждений тканей при ревматических заболеваниях (Веибег & Сегаш1, 1987) и основным медиатором повреждений, наблюдающихся при синдроме трансплантат против хозяина (Рк.|ие1 е! а1., 1987). Кроме того, ΤΝΡ известен как участник воспалительного процесса и многих других заболеваний.

Два отчетливо различающихся и независимо экспрессируемых рецептора - р55 и р75 ΤΝΡ-К - которые специфически связывают и ΤΝΡ-α, и ΤΝΡ-β, инициируют и (или) опосредуют описанные выше биологические проявления ΤΝΡ. Эти два рецептора включают разные по структуре внутриклеточные домены, что указывает на различие их сигнальной активности (см. Нойтапп е! а1., 1989; Епде1тапп е! а1., 1990; Вгоскйаик е! а1., 1990; Ьеойсйег е! а1., 1990; 8сйа11 е! а1., 1990; Ыорйаг е! а1., 1990; 8тйй е! а1., 1990; и Небег е! а1., 1990). Однако пока точно не установлены клеточные механизмы, по которым действуют, например, различные белки и, повидимому, другие факторы, вовлечённые во внутриклеточную передачу сигналов, на рецепторы р55 и р75 ΤΝΡ-К. При этом существует внутриклеточный сигнальный путь, который активен обычно после связывания рецепторов своего лиганда, т.е. ΤΝΡ (α или β), и который ассоциирован с запуском каскада реакций, в конечном счете, приводящих к наблюдаемому ответу клеток на ΤΝΡ.

С точки зрения обозначенного выше цитотоксического действия ΤΝΡ в большинстве изученных к настоящему времени типов клеток данное проявление опосредуется в основном рецептором р55 ΤΝΡ-К. Антитела к внеклеточным доменам (т. е. доменам связывания лиганда) рецептора р55 ΤΝΡ-К сами могут опосредовать цитотоксическое действие (см. ЕР 412486), что коррелирует с эффективностью перекрестного сшивания рецептора с антителами, что рассматривается как первый этап в запуске внутриклеточного сигнального механизма. Далее, мутационный анализ (ВгакеЬиксй с1 а1., 1992; Тайадйа с1 а1., 1993) показал, что биологические функции р55 ΤΝΕ-К зависят от сборки его внутриклеточного домена: соответственно, было подтверждено, что запуск внутриклеточного сигнального механизма, приводящего к цитотоксическому действию ΤΝΕ, является следствием связывания двух или большего числа внутриклеточных доменов р55 ΤΝΕ-К. Более того, ΤΝΕ (α и β) является гомотримером, а раз так, то было подтверждено, что индукция внутриклеточного сигнального механизма через р55 ΤΝΕ-К происходит благодаря его способности связываться и образовывать поперечные сшивки с молекулами рецепторов, т.е. образовывать агрегации рецепторов.

Другим членом суперсемейства ΤΝΕ/Ν6Εрецепторов является ΕΆδ-рецептор (РА8-К), который также называют ΕΆδ-антигеном: это поверхностно-клеточный белок, экспрессируемый в различных тканях и проявляющий сходство с рядом других поверхностно-клеточных рецепторов, включая ΤΝΕ-К и ΝΟΕ-К. Рецептор РА8-К опосредует гибель клеток по типу апоптоза (Пой е1 а1., 1991) и, по-видимому, работает как негативный селектор автореактивных Тлимфоцитов, т.е. в ходе созревания Тлимфоцитов РА8-К опосредует апоптотическую гибель Т-клеток, распознающих собственные антигены. Также 1рг было установлено, что мутации в гене РА8-К (мутации 1рг) обусловливают лимфопролиферативное расстройство у мышей, которое напоминает системную красную волчанку, являющуюся аутоиммунным заболеванием человека (^аРаплЬе-Рикипада е1 а1., 1992). Лигандом для рецептора РА8-К предположительно является ассоциируемая с клеточной поверхностью молекула, которую несут, помимо других типов клеток. Т-киллеры (или цитотоксические Т-лимфоциты - СТЬ), соответственно, когда такие ΟΤΕ контактируют с клетками, несущими РА8-К, они способны индуцировать апоптотическую гибель клеток, несущих РЛ8-К. Кроме того, было сформировано моноклональное антитело, являющееся специфичным в отношении РА8-К, это моноклональное антитело способно индуцировать гибель несущих РА8-К клеток по типу апоптоза, включая мышиные клетки, трансформированные внесением кДНК, кодирующей РА8-К человека (Ной е1 а1., 1991).

При том, что цитотоксическое действие лимфоцитов опосредуется взаимодействием вырабатываемого лимфоцитами лиганда с широко распространенным поверхностно-клеточным рецептором РА8-К (СЭ95), который обладает способностью запускать механизм гибели клеток, также было установлено, что различные другие нормальные клетки, помимо Тлимфоцитов, экспрессируют РА8-К на своей поверхности и могут быть убиты опосредованно действием этого рецептора. Предполагается, что неконтролируемая индукция такой гибели является фактором тканевых повреждений при определенных заболеваниях, например, разрушения клеток печени при остром гепатите. Соответственно, обнаружение путей сдерживания цитотоксической активности РА8-К может иметь терапевтическое значение.

С другой стороны, поскольку было также обнаружено, что некоторые клетки злокачественных опухолей и клетки, зараженные ВИЧ, несут РА8-К на своей поверхности, то антитела к РА8-К или лиганду РА8-К могут быть использованы для контроля опосредуемого РА8-К цитотоксического действия на такие клетки и тем самым служить способом борьбы с клетками злокачественных опухолей или клетками, зараженными ВИЧ (см. Ной е1 а1., 1991). Нахождение каких-либо ещё путей усиления цитотоксической активности РА8-К также может иметь терапевтическое значение.

Очевидно, имеет место насущная необходимость разработки способа модулирования клеточных ответов на ΤΝΕ (α или β) и лиганд РА8-К. Например, при описанных выше патологиях, когда наблюдается сверхэкспрессия ΤΝΕ или лиганда РА8-К, желательным становится подавление цитотоксического действия, индуцируемого ΤΝΕ или лигандом РА8-К, в то время как при других ситуациях, например, при заживлении повреждений, желательным оказывается усиление действия ΤΝΕ, или в случае с РА8-К в отношении опухолевых или ВИЧзараженных клеток желательным является усиление эффекта, вызываемого РА8-К.

Заявителями был предложен ряд соответствующих подходов (см., например, заявки на европейские патенты №№ ЕР-186833, ЕР308378, ЕР-398327 и ЕР-412486), направленных на контроль отрицательного действия ΤΝΕ путем подавления связывания ΤΝΕ на их рецепторах с использованием антител к ΤΝΕ или с использованием растворимых рецепторов ΤΝΕ (т. е. достаточных для растворения внеклеточных доменов таких рецепторов) с целью создания конкуренции за связывание ΤΝΕ на рецепторах ΤΝΕ-К, расположенных на клеточных поверхностях. Кроме того, на основании того, что связывание ΤΝΕ с их рецепторами является необходимым для проявления соответствующих индуцируемых эффектов ΤΝΕ, заявители предлагали подходы (см., например, ЕРО-568925), направленные на модулирование действия ΤΝΕ путем изменения активности рецепторов ΤΝΕ-К.

Вкратце, заявка ЕРО-568925 касается способа модулирования передачи сигнала и (или) расщепления ΤΝΕ-К таким образом, чтобы пептиды или иные молекулы могли взаимодейство5 вать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с этим рецептором, в результате чего обеспечивается модуляция нормальной функции ΤΝΕ-Κ. В заявке ЕРО-568925 описана конструкция и дана характеристика различных мутантных форм р55 ΤΝΕ-Κ, имеющих мутации в составе внеклеточного, трансмембранного и внутриклеточного доменов р55 ΤΝΕ-Κ. В этом случае были идентифицированы участки этих доменов в составе р55 ΤΝΕ-Κ, являющиеся ключевыми с точки зрения обеспечения функций рецептора, т.е. связывания своего лиганда (ΤΝΕ) и последующей передачи сигнала и запуска внутриклеточного сигнального механизма, которые, в конечном счете, и приводят к наблюдаемым проявлениям действия ΤΝΕ на клетки. Кроме того, также описан ряд подходов к выделению и идентификации белков, пептидов или иных факторов, которые способны связываться с различными участками вышеуказанных доменов ΤΝΕ-Κ, белки, пептиды и иные факторы которых могут быть вовлечены в регуляцию или модулирование активности рецептора ΤΝΕ-Κ. Также в заявке ЕРО-568925 представлен ряд подходов к выделению и клонированию последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды, для конструирования экспрессирующих векторов, предназначенных для выработки таких белков и пептидов, и к получению антител или их фрагментов, взаимодействующих с ΤΝΕ-Κ. или с вышеозначенными белками и пептидами, которые связываются с различными сегментами ΤΝΕ-Κ. Однако заявка ЕРО-568925 не уточняет параметры белков и пептидов, действующих в отношении связывания с внутриклеточным доменом рецепторов ΤΝΕ-Κ (например, р55 ΤΝΕΚ), и не описывает дигибридный дрожжевой подход для выделения и идентификации таких белков или пептидов, которые связываются с внутриклеточными доменами рецепторов ΤΝΕΚ. Также в заявке ЕРО-568925 нет описания белков или пептидов, способных связываться с внутриклеточным доменом рецептора ΕΑ8-Κ.

Таким образом, если желательным является подавление действия ΤΝΕ или лиганда ΕΑ8Κ, то должно быть желательным уменьшить количество или уровень активности ΤΝΕ-Κ или ΕΑ8-Κ на поверхности клеток, в то время как увеличение количества или уровня активности ΤΝΕ-Κ или ΕΑ8-Κ должно быть желательным тогда, когда подразумевается усиление действия ΤΝΕ или лиганда ΕΑ8-Κ. В связи с этим были секвенированы и проанализированы промоторы генов, кодирующих и р55 ΤΝΕ-Κ, и р75 ΤΝΕ-Κ, и были выявлены некоторые ключевые мотивы последовательностей, для которых была установлена специфичность по отношению к различным транскрипционным факторам: это значит, что экспрессия этих рецепторов ΤΝΕ-Κ может контролироваться на уровне соответствующих промоторов, т.е. подавление транскрипции с промотора приводит к уменьшению количества этих рецепторов, а усиление транскрипции с этих промоторов - к увеличению количества этих рецепторов (ЕР-606869 и XVО 95/31206). Также еще не имеется сообщений об исследовании регуляции ΕΑ8-Κ на уровне промотора гена, кодирующего этот рецептор.

Хотя и известно, что рецепторы факторов некроза опухолей (ΤΝΕ) и структурно сходный рецептор ΕΑ8-Κ в ответ на стимуляцию вырабатываемыми лейкоцитами лигандами опосредуют деструктивную активность в пределах клеток, приводящую к их собственной гибели, механизмы такого опосредованного влияния пока окончательно не ясны. Анализ мутаций указывает на то, что ΕΑ8-Κ и рецептор р55 ΤΝΕ (р55Κ) вовлекают разные участки своих внутриклеточных доменов в сигнальные механизмы цитотоксичности (ВтакеЬиксй с1 а1., 1992; ΤαΠαβΙία с1 а1., 1993; Ной & Ыада!а, 1993). Эти сегменты (т.н. гибель-домены, или гибель-эффекторные домены, или ΌΕΌ) характеризуются сходством аминокислотных последовательностей. Гибель-домены в составе ΕΑ8-Κ и ρ55-Κ проявляют тенденцию к самосвязыванию. Такое их самосвязывание предположительно способствует образованию агрегаций рецепторов, необходимых для инициации сигнальных механизмов (см 8опд е! а1., 1994; ναίΗΛ е! а1., 1994; Βοϊάίη е! а1., 1995), а высокий уровень интенсивности экспрессии рецепторов может приводить к опосредованию независимых от лигандов сигнальных механизмов (Βοϊάίη е! а1., 1995).

Некоторые проявления цитотоксичности у лимфоцитов опосредуются взаимодействием вырабатываемого лимфоцитом лиганда с рецептором ΕΑ8-Κ (СЭ95) - широко распространенным поверхностно-клеточным рецептором, который обладает способностью опосредовать гибель клеток (также см. Νада 1а & 6о18!еш, 1995), и эта гибель клеток моноядерными фагоцитами вовлекает комплекс лиганд-рецептор в составе ΤΝΕ и его рецептора ρ55-Κ (СЭ120), что структурно сходно с комплексом рецептора ΕΑ8-Κ и его лиганда (также см. УапбепаЬее1е е! а1., 1995). Как и в случае с другими проявлениями, индуцируемыми с участием рецепторов, индукция гибели клеток с участием рецепторов ΤΝΕ и ΕΑ8-Κ происходит путем серии межбелковых взаимодействий, начинающихся со связывания белка лиганда и рецептора с возможной активацией ферментных эффекторных функций, которые в анализируемом случае определяют неферментные межбелковые взаимодействия, инициирующие сигнал о гибели клеток: связывание тримерных ΤΝΕ или молекул лигандов рецептора ΕΑ8-Κ с их рецепторами, происходящее в результате взаимодействие их внутриклеточных доменов (ВгакеЬиксй е! а1., 1992; Еат1ад11а е! а1., 1993; 1!ой & Ыада1а, 1993), определяемое свойством гибель-доменов (или гибель-эффекторных доменов, ΌΕΌ) самосвязы003269 ваться (Βοϊάίη е! а1., 1995а), и индукция связывания двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - белка ΜΘΒΤ-1 (или ΕΆΌΌ) с ЕА8-В (Βοϊάίη е! а1., 1995Ь; Сй1ппа1уап е! а1., 1995; К1ксйке1 е! а1., 1995) и белка ΤΚΑΌΌ с р55-В (Нки е! а1., 1995; Нки е! а1., 1996). Три белка, которые связываются с внутриклеточным доменом ЕА8-В и р55-В по их гибель-домену, вовлечённые в индукцию клеточной гибели рецепторами через образование гетеросвязанных гомологичных сегментов и также способные независимо опосредовать клеточную гибель независимо друг от друга, были идентифицированы с применением процедуры дигибридного дрожжевого скрининга. Один из этих белков - ΜΘΚΤ-1 (Βο1άίη е! а1., 1995Ь), также известный как ΕΆΌΌ (СЫппа1уап е! а1., 1995) специфически связывается с ЕА8-В. Другой такой белок - ΤΒΆΌΌ (также см. Нки е! а1., 1995, 1996) - связывается с р55-В, а третий такой белок - К1Р (также см. 81апдег е! а1., 1995) - связывается и с РА8-Р. и с р55-В. Помимо того, что они связываются с ЕА8-В и р55-В, эти белки также способны связываться друг с другом, что может обусловливать функциональный механизм перекрестного обмена информацией между рецепторами ЕА8-В и р55-В. Такие связывания происходят с участием консервативного сегмента последовательности, т.н. модуля гибель-домена (также обозначаемого как ΌΕΌ по Эеа!й Ейес!ог Оотат - гибельэффекторный домен), обычного для рецепторов и связывающихся с ними белков. Более того, хотя в дигибридном дрожжевом тесте белок ΜΟΒΤ-1 проявлял спонтанную связываемость на ЕА8-В, в клетках млекопитающих такое связывание имело место только после стимуляции рецептора: это подтверждает, что ΜΟΚ.Τ-1 участвует в процессе инициации сигнального механизма ЕА8-В. Белок ΜΟΡΤ-1 не содержит какого-либо мотива в своей аминокислотной последовательности, характерного для проявления каталитической активности: т. е. его способность опосредовать гибель клеток предположительно не основана на активности самого ΜΟΡΤ-1. а, скорее всего, обусловливается активацией некоторых других белков (белка), которые связывают ΜΟΒΤ-1 и действуют далее вниз по сигнальному каскаду. Экспрессия в клетках мутантных вариантов ΜΟΒΤ-1, утративших Ν-концевую часть молекулы, как было показано, блокирует цитотоксичность, индуцируемую ЕА8/АР01 (ГА8-К) или р55-В (Нки е! а1., 1996; СЫппа1уап е! а1., 1996): это указывает на то, что этот Νконцевой сегмент передаёт сигнал о гибели клеток от обоих рецепторов через межбелковые взаимодействия.

Недавние исследования выявили группы цитоплазматических тиоловых протеаз, которые проявляют структурное сходство с протеазой СЕЭ3 свободноживущей нематоды СаепогйаЬ άίίίδ е1едапк и с конвертазой 1СЕ интерлейкина1β человека в связи с различными физиологическими параметрами процессов гибели клеток (см. обзоры Китаг, 1995 и Непкай, 1996). Также имеется ряд указаний на то, что протеазы (протеаза) этого семейства могут участвовать в проявлении цитотоксичности клеток, индуцируемой с участием рецепторов ЕА8-В и ΤΝΡ-Κ Для специфических пептидных ингибиторов протеаз и двух белков-блокираторов их функций, кодируемых вирусами - белка вируса коровьей оспы сгтА и бакуловирусного белка р35 - было показано обеспечение защиты клеток от проявления цитотоксичности (Епап е! а1., 1995; Бок е! а1., 1995; Τе\νа^^ е! а1., 1995; Хие е! а1., 1995; Ве1б1ег е! а1., 1995). Быстрое расщепление некоторых специфических клеточных белков предположительно действием протеаз семейства СЕЭ3/1СЕ может быть продемонстрировано в клетках вскоре после стимуляции рецепторов РА8-В или ΤΝΡ-Κ

Необходимо заметить, что эти протеазы семейства СЕЭ3/1СЕ. также называемые каспазами, вырабатываются в виде неактивных предшественников и активируются путем протеолитического расщепления в ходе индукции гибели клеток. Эти каспазы являются консервативными цистеиновыми протеазами, которые расщепляют специфические клеточные белки ниже от остатков аспарагиновой кислоты и, соответственно, играют ключевую роль во всех известных к настоящему времени процессах запрограммированной гибели клеток. Помимо их гомологичных С-концевых участков, из состава которых образуются зрелые формы протеаз, белки-предшественники включают уникальные Ν-концевые сегменты. Взаимодействия этих продоменов со специфическими регуляторными молекулами обеспечивает дифференцированную активацию различных каспаз с участием различных сигналов индукции гибели клеток (Во1бш е! а1., 1996; Μυζίο е! а1., 1996; Энап & Όίχί!, 1997, Уап Спектде е! а1., 1996; Айтаб е! а1., 1997).

Недавно была выделена, клонирована и охарактеризована одна такая протеаза и её различные изоформы (включая ингибиторные формы), обозначенная МАСН (также обозначается СА8Р-8), которая является ΜΟΡΤ1связывающимся белком и которая служит модулятором ΜΟΡΤ-1 и, соответственно, РА8-В и р55-В, и которая также может быть действовать независимо от ΜΟΒΤ-1; также было описано возможное использование данной протеазы, в частности, в приведённых в подробном списке цитируемых материалов совместных, одновременно ожидающих решения заявок на израильский патент №№ 114615, 114986, 115319, 116588 и 117932, а также в соответствующем РСТ - № РСТ/υδ 96/10521, равно как и в недавней публикации заявителей (Во1бш е! а1., 1996). Другая такая протеаза, включая её изоформы (включая ингибиторные формы), обозначенная Ме114 (также обозначаемая СА8Р-10), также недавно была выделена и охарактеризована заявителями настоящего изобретения (неопубликованные материалы) и другими исследователями (Ретаийе8-А1иетп е! а1., 1996; 8пшуа5и1а е! а1., 1996). Этот белок Мс114 также является МОКТ1связывающимся белком, который служит для модуляции активности МОКТ-1 и, соответственно, по-видимому, как модулятор РА8-К и р55-К, и который также может действовать независимо от МОКТ-1. Таким образом, подробности, касающиеся всех аспектов свойств, характеристик и путей использования Мсй4 представлены в вышеназванных публикациях, которые полностью включены в список цитирования настоящего изобретения.

Также нужно отметить, что каспазы МАСН (СА8Р-8) и Мсй4 (СА8Р-10), которые включают сходные продомены (см. Βοϊάίη е! а1., 1996; Ми/ίο е! а1., 1996; Ретаийе8-А1иетп е! а1., 1996; УтсеШ & Όίχίΐ, 1997), взаимодейству ют с помощью своих продоменов с МОКТ-1: это взаимодействие опосредуется мотивом гибель-домена или гибель-эффекторными доменами (ΌΕΌ), находящимися в Ν-концевой части МОКТ-1 и имеющимися в дуплицированном виде в составе МАСН (СА8Р-8) и Мсй4 (СА8Р10) (см. Βο1άίη е! а1., 1995Ь; СЫииа1уаи е! а1., 1995).

Также заслуживает упоминания то, что, с точки зрения сказанного выше, различные белки, ферменты и рецепторы, вовлечённые во внутриклеточные сигнальные процессы, приводящие к гибели клеток, получали неодинаковые наименования. Для преодоления возможных неточностей предлагается нижеследующий список разных наименований, включая новые наименования, принимаемые в связи с новыми стандартами, для каждого из данных белков или их составляющих, а также даны наименования, принятые к использованию в настоящем тексте с учетом соответствующего удобства.

Обычное наименование или наименование, под которым описан впервые	Другие наименования	Новое стандартное наименование	Наименование, используемое здесь
Рецептор р55Т№	Р55-К	СЭ120а	р55-К
Рецептор р75Т№	Р75-К	СЭ120Ь	р75-К
Рецептор РА8	РА8-К,РА8/АРО1	СЭ95	РА8-К
МОКТ-1	РАОП	-	МОКТ-1
МАСН	РЬ1СЕ1, Мсй5	СА8Р-8	МАСН
Мсй4	РБ1СЕ2	СА8Р-10	Мсй4
01	-	СА8Н	01
гибель-домен	гибель-доменный мотив, МОКТ-мотив, гибельэффекторный мотив (ΌΕΌ), МОКТ-модули	-	гибель-домен, гибель-доменный мотив, МОКТ-модули
протеазы	каспазы		протеазы
СЕЭ3/1СЕ		СА8Р	СЕЭ3/1СЕ

Резюме изобретения

Объектом настоящего изобретения является представление новых белков, включая все их изоформы, аналоги, фрагменты или производные, которые способны связываться с МОКТ1связывающимися белками, такими как, например, вышеназванные белки Мсй4 и МАСН и их изоформы, или способны связываться с самим МОКТ-1. С учётом того, что сам белок МОКТ-1 связывается с внутриклеточным доменом рецептора РА8-К, новые белки по настоящему изобретению благодаря связыванию с МОКТ1связывающимися белками и, соответственно, косвенно с МОКТ-1, или благодаря прямому связыванию с белком МОКТ-1, способны тем самым подавлять внутриклеточные сигнальные механизмы, инициированные связыванием РА8лиганда на его рецепторе: т.е. таким образом новые белки по настоящему изобретению являются модуляторами опосредованного РА8-К влияния на клетки. Белок МОКТ-1 также вовлечён в модулирование влияния Т№ на клетки через его участие в модуляции р55-К: соответственно, новые белки по настоящему изобретению также рассматриваются как модуляторы влияния ΈΝΕ на клетки, осуществляемого через рецептор р55-К. Также, по аналогии с охарактеризованным выше модулированием влияния на клетки, опосредуемого рецепторами РА8-К и р55-К, белки по настоящему изобретению также могут быть медиаторами или модуляторами других цитотоксических медиаторов или индукторов путем действия на общие или сопряжённые внутриклеточные сигнальные механизмы, в которых участвую Т белки по настоящему изобретению - например, 01 и его изоформы. Эти новые белки по настоящему изобретению обозначены белками 01 и, как отмечалось выше, включают собственно белок 01 (рассмотренный ниже), все его изоформы, аналоги, фрагменты и производные.

Другим объектом изобретения является представление антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений или даже некоторых изоформ вышеуказанных новых белков С1, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных, которые могут быть использованы для подавления сигнального механизма или, более конкретно, проявление цитотоксичности, если это является желательным.

Дальнейшим объектом настоящего изобретения является использование вышеназванных новых белков 01, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных с целью выделения и охарактеризования дополнительных белков или факторов, которые могут быть вовлечены в регуляцию активности рецепторов, например, других протеаз, которые расщепляют новые белки с превращением их в биологически активные, и(или) с целью выделения и идентификации других рецепторов, расположенных до начала сигнальных процессов, связывающих эти новые белки, их аналоги, фрагменты и производные (например, другие ЕА8-Н или родственные рецепторы), в функционирование которых, соответственно, они также вовлекаются.

Ещё одним объектом настоящего изобретения является представление ингибиторов, которые могут быть внесены в клетки с целью связывания или взаимодействия с белком 01 и возможными изоформами 01, обладающими протеазной активностью (белок 01 включает участок, гомологичный протеолитическим сегментам МеЕ4 и МАСН), и ингибирования их внутриклеточной активности, которая, по крайней мере, для некоторых изоформ 01, является протеолитической активностью.

Кроме того, объектом настоящего изобретения является использование вышеназванных новых белков 01, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для приготовления поликлональных и(или) моноклональных антител к ним. Со своей стороны эти антитела могут быть использованы, например, для очистки новых белков из различных источников, таких как клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии.

Далее, эти антитела могут быть использованы для целей диагностики, например, для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием клеточных процессов, опосредованных ЕА8-Н или другими родственными рецепторами.

Другим объектом настоящего изобретения является представление фармацевтических композиций, включающих вышеназванные белки 01, их изоформы или аналоги, фрагменты или производные, равно как и фармацевтические композиции, включающие вышеназванные антитела или другие антагонисты.

В соответствии с настоящим изобретением выделен новый белок 01, который способен связываться или взаимодействовать с Ме114. который сам связывается с МОНТ-1, который, в свою очередь, связывается со внутриклеточным доменом ЕА8-Н. Также 01 может взаимодействовать с другим МОНТ 1-связывающимся белком, называемым МАСН, и также может быть способен связываться или взаимодействовать напрямую с МОНТ-1. Белок 01, по-видимому, функционирует как модуляторный фактор механизма гибели клеток, инициируемого связыванием ЕА8-лиганда на рецепторе ЕА8-Н на поверхности клеток, что, по-видимому, обеспечивается наличием у него протеолитического сегмента, сходного с протеолитическими сегментами Ме114 и МАСН, соответственно белок 01 также может быть активной внутриклеточной протеазой. Далее, в зависимости от процессов транскрипции и трансляции в ходе экспрессии 01, особенно по его протеолитическому сегменту, некоторые изоформы 01 могут быть экспрессированы с исключением активного протеолитического сегмента и таким образом могут служить в качестве антагонистов протеолитической активности, опосредуемой, например, участием Ме114 и МАСН. Протеазы семейства 0ΕΌ3/Ι0Ε могут быть вовлечены в процессы апоптоза, опосредуемые ЕА8-Н. Белок МОНТ-1 (или ΕΛΩΩ) связывается с внутриклеточным доменом ЕА8-Н в ходе активации этого рецептора, а новый белок 01 по настоящему изобретению связывается с МОНТ1-связывающимися белками, такими как МеЕ4 и, вероятно, также МАСН, или напрямую с белком МОНТ-1. Белок 01, клонированный и охарактеризованный в соответствии с настоящим изобретением, может существовать в виде множественных изоформ, некоторые из которых включают сегмент гомологии с 0ΕΌ3/Ι0Ε, обладающий протеолитической активностью (протеолитический домен), сходный с таковым у МеЕ4 и у некоторых изоформ МАСН, и которые могут обусловливать гибель клеток в случае экспрессии в них. Таким образом, активация этого нового гомолога 0ΕΌ3/Ι0Ε (т.е. различных изоформ 01, включающих протеолитический домен) с участием ЕА8-Н (путём прямого или непрямого взаимодействия с МОНТ-1), по-видимому, формирует эффекторный компонент опосредуемого ЕА8-Н механизма гибели клеток.

Более того, белок 01 также функционирует в качестве эффекторного компонента механизма гибели клеток, инициируемого связыванием Т№ на рецепторе р55-Н на поверхности клеток: в этом случае путём непрямого связывания МОНТ-1 с белком ТНАПО - белком, который сам связывается с внутриклеточным доменом р55-Н (Изи е! а1., 1995), после этого или одновременно с этим происходит связывание белка 01 с МОНТ1-связывающимися белками, такими как, например, МеЕ4 или МАСН, или связывание с МОВТ-1 напрямую с превращением 01 в активную протеазу, вовлеченную в опосредование клеточной гибели.

Также нужно отметить, что, хотя 01 проявляет, по крайней мере, некоторые параметры последовательности, ключевые для функционирования протеаз СЕЭ3/1СЕ, он, однако, обладает и рядом отличительных характеристик последовательности, которые могут обеспечить ему уникальный и, по-видимому, ткане/клеточноспецифичный характер активности.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, представляется новый белок, обозначенный 01. Этот белок 01 был выделен и клонирован с применением дигибридного скрининга и был охарактеризован как молекула, которая связывается с Ме114. Как отмечалось выше, Ме114 является МОВТ1связывающимся белком, который способен запускать клеточную гибель, хотя, однако, также надо отметить, что некоторые изоформы Ме114 обладают противоположной активностью, а именно они ингибируют уничтожение клеток. Кроме того, секвенирование 01 показало, что этот белок включает в составе своей Ν-концевой части два так называемых МОВТ-МОДУЛЯ (ММ), которые также обнаруживаются в составе МОВТ1-связывающихся белков Ме114 и МАСН. Эти МОВТ-модули в составе 01 предположительно придают ему способность связываться с Ме114. а также могут быть фактором прямого связывания с МОВТ-1 и связывания с МАСН или со специфическими изоформами МАСН (специфическими вариантами сплайсинга МАСН). В аминокислотной последовательности 01 вслед за Ν-концевым сегментом, включающим МОВТ-модули, также находится длинный сегмент, проявляющий сходство с протеолитическим сегментом МАСН и Ме114. Более того, исходя из данных начального анализа вероятной локализации последовательности гена 01 на хромосомах человека, стало ясно, что ген 01 находится на хромосоме № 2 в тесной близости от локализаций генов Ме114 и МАСН, что также указывает на наличие связи между белками 01, Мей4 и МАСН.

Более подробно, по крайней мере, три возможные изоформы белка 01 были получены в соответствии с настоящим изобретением (см. ниже пример 1). Две из этих изоформ были выделены и клонированы: считается, что они представляют два варианта альтернативного сплайсинга нового белка, обозначенного 01 (или СА8Н). Эти две изоформы были названы 01α (или СА8На) для более длинной изоформы и 01 β (или СА8НЗ) для более короткой изоформы (поскольку существует более одной короткой изоформы, то данная короткая изоформа 01 β обозначается как 01 β1, а другая короткая изоформа - как 01β2: см. ниже пример 1). Каждая из этих изоформ 01 - а и β - включает два

Ν-концевых гибель-домена/МОВТ-модуля и может связываться друг с другом опосредованно через эти гибель-доменные мотивы, а также может связываться с МОВТ-1, Ме114 и МАСН опосредованно через эти же гибельдоменные мотивы. Более длинная изоформа 01а имеет уникальный С-концевой сегмент (в сравнении с короткой изоформой 01β), при том, что этот уникальный С-концевой сегмент характеризуется гомологией последовательности с таковой в сегменте протеазной активности каспаз. С точки зрения биологической активности, более короткая изоформа 01β подавляет гибель клеток и цитотоксичность, опосредуемую рецепторами р55-В и БА8-В, в то время как, напротив, более длинная изоформа 01а обладает цитотоксическим действием в отношении, по крайней мере, некоторых типов клеток (например, клеток линии 293) при том, что эта цитотоксичность вовлекает их протеазогомологичный сегмент. Однако надо отметить, что длинная изоформа 01а также может ингибировать цитотоксичность, опосредуемую рецепторами р55-В и БА8-В в других типах клеток (например, клеток Неба). Эти данные определяют, что белок 01 (а именно его различные изоформы) действуют как ослабителиингибиторы и(или) индукторы-усилители сигнальных механизмов клеточной гибели, опосредуемых рецепторами р55-В и БА8-В.

Также следует отметить, что ради простоты обозначения разных изоформ 01, например 01а и 01 β, часто в настоящем тексте будет применяться простое обозначение 01, но при этом должно быть понятно, что в этих случаях понятие 01 обозначает все изоформы 01, т.е. оно обозначает и индукторы-усилители цитотоксичности, и ингибиторы-ослабители клеточной цитотоксичности. Когда же подразумеваются специфичные изоформы 01, то они будут и именоваться соответствующим образом, например, 01а или 01β. С учетом сказанного, когда используется собирательное обозначение 01, относящееся к разным изоформам, то оно часто обозначается в данном тексте как модулятор: это означает, что он может проявлять и ингибиторное, и усиливающее действие в отношении обсуждаемой биологической функции.

С точки зрения сказанного выше становится ясно, как это было описано выше и будет рассмотрено ниже, что 01 является модулятором активности МОВТ-1 и, соответственно, модулятором клеточных эффектов, опосредуемых рецепторами БА8-В и р55-В, а также, повидимому, другими рецепторами из семейства рецепторов Т№Ж0Б и других, которые могут участвовать в сходных компонентах и механизмах внутриклеточной передачи сигналов.

Таким образом, поскольку 01 имеет протеазоподобный сегмент (по крайней мере, в составе длинной изоформы), он может напрямую отвечать за цитотоксичность и воспалительные процессы, вызываемыми или индуцируемыми различными стимуляторами, включая те, которые попадают через рецепторы из состава семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ и, вероятно, также других семейств рецепторов.

Также 61 может служить в качестве ингибитора цитотоксичности и воспалительных процессов за счёт того, что он входит в состав комплекса других белков и, соответственно, может влиять на цитотоксическую и воспалительную активность этих других белков (например, белков, Ме114 и МАСН или даже ΜΟΚΤ-1), что, в конечном счёте, приводит к подавлению их цитотоксической активности или их активности при воспалении.

Также еще 61 может служить в качестве усилителя или обусловливателя клеточной цитотоксичности и воспалительных процессов, других белков (например, белков, Ме114 и МАСН или даже ΜΟΚΤ-1), за счет связывания с ними с последующим связыванием с ΜΘΚ.Τ-1, или действуя независимо от ΜΟΚΤ-1, но в каждом случае обеспечивая цитотоксическую активность различных белков или их действие по индукции воспалительных процессов.

Также аналогичным путем белок 61 может служить в качестве ингибитора или обусловливателя других внутриклеточных медиаторов или модуляторов, вовлечённых в механизмы, в которых активно участвует сам 61.

Белок ΜΟΚΤ-1 (аббревиатура Ι^άίηΙοΓ о£ Кесер1от ΤοχίοίΙν -медиатор токсичности рецепторов - Βοϊάίη е! а1., 1995Б) способен связываться с внутриклеточным доменом ΡΑ8-Κ. Этот ΡΑδ-связывающийся белок предположительно действует в качестве медиатора или модулятора действия лиганда рецептора ΡΑ8-Κ на клетки путем опосредования или модулирования внутриклеточных сигнальных механизмов, которые обычно запускаются после связывания лиганда ΡΑ8-Κ на поверхности клеток. Дополнительно к специфичности по ΡΑδ-связыванию, для ΜΟΚΤ-1 было показано наличие других параметров (см. ссылочный пример 1), например, в его составе имеется сегмент, гомологичный сегментам гибель-доменов (ΌΌ) в составе ρ55-ΤΝΡ-Κ и ΡΑ8-Κ (ρ55-ΌΌ и ΡΑ8-ΌΌ) соответственно, он также способен к самосвязыванию. Также ΜΟΚΤ-1 сам по себе способен активировать клеточную цитотоксичность; такая активность, по-видимому, связана со способностью к самосвязыванию. Также было обнаружено, что коэкспрессия сегмента ΜΟΚΤ-1, который включает последовательность, гомологичную гибель-домену (ΜΟΚΤ-ΌΌ - присутствует в С-концевой части ΜΟΚΤ-1), в существенной степени нарушает процессы гибели клеток, индуцируемые ΡΑ8, чего можно ожидать, исходя из способности к связыванию с гибельдоменом в составе РЛ8-1С. Кроме того, при тех же условиях эксперимента, было обнаружено, что коэкспрессия части МОКТ-1, которая не содержит сегмента ΜΟΚΤ-ΌΌ (Ν-концевая часть ΜΟΚΤ-1, аминокислоты 1-117: головная часть ΜΟΚΤ-1), приводит в результате к отсутствию помех ΡΑδ-индуцируемой клеточной гибели, а то и к некоторому возрастанию цитотоксичности, индуцируемой ΡΑ8.

Соответственно весьма вероятно, что ΜΟΚΤ-1 также связывается с другими белками, вовлеченными во внутриклеточные сигнальные механизмы. Эти ΜΟΚΤ1-связывающиеся белки также могут, соответственно, действовать в качестве непрямых медиаторов или модуляторов влияния лигандов рецептора ΡΑ8-Κ на клетки путем опосредования или модулирования активности ΜΟΚΤ-1; или же эти ΜΟΚΤ1связывающиеся белки могут действовать напрямую как медиаторы или модуляторы связанного с ΜΟΚΤ-1 внутриклеточного сигнального механизма путем опосредования или модулирования активности ΜΟΚΤ-1, который, что явствует из описанного выше, обладает независимой способностью активировать клеточную цитотоксичность. Эти ΜΟΚΤ1-связывающиеся белки также могут быть использованы в любой из стандартных процедур скрининга с целью выделения, идентификации и охарактеризования дополнительных белков, пептидов, факторов, антител и т.п., которые могут быть вовлечены в сигнальные механизмы, связанные с ΜΟΚΤ-1 или связанные с ΡΑ8-Κ, или могут являться элементами других внутриклеточных сигнальных процессов. Были выделены такие ΜΟΚΤ1связывающиеся белки, и они описаны в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения израильских заявках №№ 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 и в соответствующем им РСТ № РСТ/ϋδ 96/10521 (в части, касающейся МАСН и его изоформ) и в статьях е! а1. (1996) и δτίηίуа§и1а е! а1. (1996) (в части, касающейся Μсй4 и других Мсй-белков). Один из таких ΜΟΚΤ1связывающихся белков - ранее упоминавшийся белок МАСН - был исходно клонирован, секвенирован и частично охарактеризован как имеющий следующие параметры: кДНК МАСН кодирует открытую рамку ΟΚΡ-Β; МАСН связывается с ΜΟΚΤ-1 по очень жёсткому и высокоспецифичному типу; МАСН-связывающий сайт в составе ΜΟΚΤ-1 положен выше гибельдоменного мотива ΜΟΚΤ-1; участок ΟΚΡ-Β для МАСН является его участком взаимодействия с ΜΟΚΤ-1; и МАСН характеризуется способностью к самосвязыванию и сам по себе может индуцировать клеточную цитотоксичность. Кроме того, позднее проведенные исследования, также отраженные в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявках, а также в публикации Βοϊάίη е! а1. (1996), показали, что действительно МАСН существует в виде серии изоформ. Более того, упоминавшаяся выше ΟΚΤ-Β МАСН на самом деле является одной из изоформ МАСН, обозначенной как ΜΛί,ΉβΙ. В вышеназванных публикациях, касающихся белка Мсй4, было показано, что этот белок также связывается с МОКТ-1 (или ΡΑΌΌ) и напрямую вовлечён в клеточную цитотоксичность с участием МОКТ1 или независимую от него, что связывается с его протеолитической активностью.

Соответственно, настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, кодирующую белок 61, его аналоги или фрагменты, способные связываться или взаимодействовать напрямую или опосредованно с МОКТ-1 и (или) с МОКТ1-связывающимися белками, такими как, например, Мс114 или МАСН, притом, что упомянутый белок 61, его аналоги или фрагменты способны опосредовать внутриклеточный эффект, опосредованный ΡΑ8-Β или р55ΤΝΡ-К, или что упомянутый белок 61, его аналоги или фрагменты способны также модулировать или опосредовать внутриклеточные эффекты активности других белков, с которыми они могут связываться напрямую или ненапрямую.

В частности, настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, выбираемую из группы, включающей

a) последовательность кДНК, производную от сегмента, кодирующего нативный белок 61;

b) последовательности ДНК, способные гибридизовать с последовательностью (а) в условиях средней степени жесткости и которые кодируют биологически активный белок 61; и

c) последовательности ДНК, которые являются вырожденными в результате изменения генетического кода в последовательностях ДНК, определенных в пп. (а) и (Ь) и кодирующих биологически активный белок 61.

Другим специальным вариантом вышеназванной последовательности ДНК по настоящему изобретению является последовательность ДНК, включающая, по крайней мере, часть последовательности, кодирующей, по крайней мере, одну из изоформ белка 61. Другой вариант вышеназванной последовательности ДНКэто последовательность, кодирующая белок 61, приведённый на фиг. 1 (изоформа 61α). Другой подобный вариант - это вторая изоформа белка 61, приведенная на фиг. 2 (изоформа 61β).

Настоящее изобретение представляет белки 61, их аналоги, фрагменты или производные, кодируемые любыми из обозначенных выше последовательностей ДНК по настоящему изобретению, притом, что упомянутые белки, их аналоги, фрагменты или производные способны связываться или взаимодействовать прямо или косвенно с МОКТ-1 и(или) с любыми МОКТ1связывающимися белками, такими как, например, Мс114 или МАСН, и опосредовать внутриклеточный эффект, опосредованный ΡΑ8-Β или ρ55-ΤΝΡ-Κ, или активностью любых других медиаторов или индукторов цитотоксичности, с которыми упомянутые белки 61, их аналоги, фрагменты или производные способны прямо или непрямо связываться.

Специальный вариант настоящего изобретения связан с белками 61, их аналогами, фрагментами и производными. Другой вариант представляет любую изоформу белка 61, их аналоги, фрагменты и производные.

Также настоящим изобретением представляются векторы, кодирующие вышеназванный белок 61 и его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению, которые включают вышеназванные последовательности ДНК по настоящему изобретению, так, что эти векторы способны экспрессироваться в подходящих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах; трансформированные эукариотические или прокариотические клеткихозяева, несущие такие векторы; и способ получения белка 61 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению путем выращивания таких трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии упомянутого белка, его аналогов, фрагментов или производных и эффективных с точки зрения посттрансляционных модификаций упомянутого белка в случае, если необходимо получать упомянутый белок и экстрагировать упомянутый экспрессированный белок, его аналоги, фрагменты или производные из культуральной среды с упомянутыми трансформированными клетками или из клеточных экстрактов, полученных из упомянутых трансформированных клеток. Все приведенные определения подразумевают включение всех изоформ белка 61.

В другом варианте настоящее изобретение также представляет антитела или их активные производные или фрагменты, специфичные в отношении белка 61, его аналогов, фрагментов и производных по настоящему изобретению.

Еще в одном варианте настоящее изобретение представляет различные пути использования вышеназванных последовательностей ДНК или кодируемых ими белков в соответствии с настоящим изобретением, притом, что, помимо прочего, такое использование подразумевает следующее.

(А) Способ модулирования гибели клеток или воспалительных процессов, включающий обработку упомянутых клеток одним или большим числом белков 61, их аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению, как описывалось выше, притом, что упомянутая обработка упомянутых клеток включает внесение в упомянутые клетки одного или большего числа белков, их аналогов, фрагментов или производных в форме, подходящей для их внутриклеточного введения, или внесение в упомянутые клетки нуклеотидной последовательности, кодирующей один или большее число упомянутых белков, их аналогов, фрагментов или производных в форме пригодного вектора, несущего упомянутую последовательность так, чтобы упомянутый вектор был способен обеспечивать включение упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким образом, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках; и (В) способ модулирования гибели клеток или воспалительных процессов, включающий обработку упомянутых клеток одним или большим числом ингибиторов одного или большего числа белков/ферментов, опосредующих гибель упомянутых клеток или воспалительные процессы, при том, что упомянутые ингибиторы выбирают из группы, включающей: (1) один или большее число белков 61, их аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению, способные ингибировать гибель упомянутых клеток или воспалительные процессы; и (2) ингибиторы одного или большего числа белков 61 по настоящему изобретению, при том, что упомянутые один или большее число белков 61 упрочивают/усиливают или опосредуют гибель упомянутых клеток или воспалительные процессы.

Более конкретно, вышеназванные способы по настоящему изобретению включают следующие специальные варианты:

1) способ модулирования влияния лиганда ЕА8-К или ΤΝΡ на клетки, несущие рецепторы ЕА8-К или р55-К, включающий обработку упомянутых клеток одним или большим числом белков 61, их аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению, способных связываться с ΜΟΒΤ1-связывающимися белками, такими как Ме114 или МАСН, притом, что, в свою очередь, связанный с ними МОКТ-1 напрямую связывается со внутриклеточным доменом ЕА8-К, или способных связываться напрямую или опосредованно с ΜΟΚ.Τ-1 или с МОКП-связывающимися белками так, как описано выше, при том, что в этом случае МОК.Т-1 связывается с ΤΚΑΌΌ, который, в свою очередь, связывается с внутриклеточным доменом р55-К, что тем самым обеспечивает способность модулировать/опосредовать активность упомянутых рецепторов ЕА8-К или р55-К, при том, что упомянутая обработка упомянутых клеток включает внесение в упомянутые клетки одного или большего числа белков, их аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для их внутриклеточного введения, или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК, кодирующей упомянутые один или большее число белков, их аналогов, фрагментов или производных в форме подходящего вектора, несущего упомянутую последовательность, так, что упомянутый вектор способен обеспечивать попадание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким образом, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках;

2) способ модулирования влияния лиганда ЕА8-К или ΤΝΡ на клетки в соответствии с п.

(1), описанным выше, при том, что упомянутая обработка клеток включает внесение в упомянутые клетки упомянутого белка 61 или его аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для внутриклеточного введения или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК, кодирующей упомянутый белок 61 или его аналоги, фрагменты или производные в виде подходящего вектора, несущего упомянутую последовательность, так, чтобы упомянутый вектор обеспечивал попадание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким образом, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках;

3) способ в соответствии с п. (2), описанным выше, притом, что упомянутая обработка упомянутых клеток производится путем трансфекции упомянутых клеток рекомбинантным вирусным вектором, включающий следующие этапы:

(a) конструирование рекомбинантного вектора вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), который способен связываться со специфичным поверхностноклеточным рецептором на поверхности клеток, несущих рецепторы ЕА8-К или р55-К, и вторую последовательность, кодирующую белок, выбираемый из белка 61, его аналогов, фрагментов и производных, так, что при экспрессии в упомянутых клетках обеспечивается способность к модуляции-опосредованию активности упомянутых ЕА8-К или р55-К; и (b) инфицирование упомянутых клеток упомянутым в п. (а) вектором;

4) способ модулирования влияния лиганда ЕА8-К или ΤΝΡ на клетки, несущие рецепторы ЕА8-К или р55-К, включающий обработку упомянутых клеток антителами или их активными фрагментами, или их производными в соответствии с настоящим изобретением так, что упомянутая обработка осуществляется путем внесения подходящей композиции, включающей упомянутые антитела, их активные фрагменты или их производные в упомянутые клетки, притом, что, когда, по крайней мере, часть белка 61 появляется на поверхности клетки, упомянутая композиция формируется для внеклеточного применения, а когда упомянутые белки 61 полностью внутриклеточны, то упомянутая композиция формируется для внутриклеточного внесения;

5) способ модулирования влияния лиганда ЕА8-К или ΤΝΡ на клетки, несущие ЕА8-К или р55-К, включающий обработку упомянутых клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по отношению, по крайней мере, к части последовательности белка 61 по настоящему изобретению, притом, что упомянутая олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка 61;

6) способ по п. (2), описанному выше, для обработки опухолевых клеток, или клеток, инфицированных ВИЧ, или других больных клеток, включающий (a) конструирование рекомбинантного вектора вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный антиген, способный связываться со специфичным рецептором поверхности опухолевых клеток или с рецептором поверхности клеток, заражённых вирусом ВИЧ, или с рецептором других больных клеток, а также последовательность, кодирующую белок, выбираемый из белка 61, его аналогов, фрагментов и производных по настоящему изобретению, таким образом, что в случае экспрессии упомянутые опухолевые, ВИЧ-зараженные или другие больные клетки становятся способными уничтожать упомянутые клетки; и (b) инфицирование упомянутых опухолевых или зараженных вирусом ВИЧ клеток, или других больных клеток упомянутым в п. (а) вектором;

7) способ модулирования влияния лиганда ΡΑ8-Κ или ΤΝΡ на клетки, включающий применение рибозимной процедуры, в которой вектор, кодирующий рибозимную последовательность, способную взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, кодирующей белок 61 по настоящему изобретению, вносят в упомянутые клетки в такой форме, которая позволяет экспрессировать упомянутую рибозимную последовательность в упомянутых клетках, и при том, что упомянутая рибозимная последовательность экспрессируется в упомянутых клетках так, что взаимодействует с упомянутой клеточной последовательностью мРНК и расщепляет упомянутую последовательность мРНК, в результате чего происходит ингибирование экспрессии упомянутого белка 61 в упомянутых клетках;

8) способ, выбираемый из методов по настоящему изобретению, при том, что последовательность, кодирующая упомянутый белок 61, включает, по крайней мере, одну из изоформ 61, аналоги, фрагменты и производные любой из представленных изобретением форм, которые способны связываться напрямую или ненапрямую с ΜΟΚΤ-1 или с ΜΟΚΤΙ-связывающимися белками, такими как, например, Мсй4 или МАСН, при том, что связанный с ними ΜΟΚΤ1, в свою очередь, специфически связывается с РА8-1С, или которые способны связываться напрямую или ненапрямую с ΜΟΚΤ-1 или вышеназванными ΜΘΚΤΙ-связывающимися белками, при том, что связанный с ними ΜΟΚΤ-1, в свою очередь, связывается с ΤΚΑΌΌ или, в свою очередь, связывается с р55-1С;

9) способ выделения и идентификации белков по настоящему изобретению, способных связываться напрямую или ненапрямую с белком ΜΟΚΤ-1 или с ΜΟΚΤ1-связывающимися белкам и, включающий применение дигибридного дрожжевого теста, в котором последовательность, кодирующая упомянутые белок ΜΟΚΤ-1 или ΜΟΚΤ1-связывающиеся белки, входит в состав одного гибридного вектора, а последовательность из библиотек кДНК или геномной ДНК входит в состав второго гибридного вектора, притом, что векторы затем используют для трансформации дрожжевых клеток-хозяев и выделяются позитивные трансформированные клетки с последующим экстрагированием упомянутого второго гибридного вектора с целью получения последовательности, кодирующей белок, который связывается с упомянутыми белком ΜΟΚΤ-1 или с ΜΟΚΤ1связывающимися белками;

10) способ в соответствии с любым из пп.(1)-(9), описанными выше, при том, что упомянутый белок 61 является одной из изоформ 61, аналогом, фрагментом или производным любой из них;

11) способ в соответствии с любым из пп.(1)-(10), описанными выше, при том, что белок 61 или любые из его изоформ, аналогов, фрагментов или производных вовлечены в модулирование клеточного эффекта, опосредуемого или модулируемого любым другим цитотоксическим медиатором или индуктором, с которым упомянутые белок 61, его изоформа, аналог, фрагмент или производное способны связываться напрямую или ненапрямую;

12) способ скрининга других соединений, таких как, например, пептиды, органические соединения, антитела и т.п. с целью получения специфических лекарственных препаратов, которые были бы способны подавлять активность 61, например, подавлять протеазную активность изоформы 61α, подавляя таким образом клеточную цитотоксичность или усиливая цитотоксичность за счет подавления активности 61β.

Варианты вышеназванного способа скрининга по п.(12) включают (1) способ скрининга лиганда, способного связываться с белком 61 по настоящему изобретению так, как это было описано выше, включающий контактирование матрикса в аффинной хроматографии, к которому присоединён упомянутый белок, с клеточным экстрактом так, что в результате лиганд связывается с упомянутым матриксом с последующей элюцией, выделением и анализом упомянутого лиганда;

(2) способ скрининга последовательности ДНК, кодирующей лиганд, способный связываться с белком 61 по настоящему изобретению, включающий применение дигибридного дрожжевого теста, в котором последовательность, кодирующая упомянутый белок, входит в состав одного гибридного вектора, а последова23 тельности из библиотек кДНК или геномной ДНК входят в состав второго гибридного вектора, с трансформацией дрожжевых клеток-хозяев упомянутыми векторами с последующим выделением позитивных трансформированных клеток и экстрагированием упомянутого второго гибридного вектора с целью получения последовательности, кодирующей упомянутый лиганд;

(3) способ идентификации и выработки ли- ганда, способного модулировать клеточную активность модулированную/опосредованную белком МОЕТ-1 или МОЕТ 1-связывающимся белком, включающий:

(a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим, по крайней мере, часть белка МОЕТ-1 или МОЕТ1связывающихся белков, выбираемых из белков МАСН, белков Мсй4 и других МОЕТ1связывающихся белков;

(b) идентификация и охарактеризование лиганда, помимо МОЕТ-1 или упомянутых МОКТ1-связывающихся белков или частей рецептора, входящего в семейство рецепторов ТЫЕ/Ы6Е, найденного с помощью упомянутого этапа скрининга по способности к упомянутому связыванию; и (c) получение упомянутого лиганда, по существу, в изолированном и очищенном виде;

(4) способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать проявляющуюся в модуляции или опосредовании клеточную активность белка 61 по настоящему изобретению, включающий:

(a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим, по крайней мере, часть последовательности 61α, представленной на фиг. 1, или, по крайней мере, часть последовательности 61β, представленной на фиг. 2;

(b) идентификация и охарактеризование лиганда, помимо МОЕТ-1 или МОЕТ1связывающихся белков или частей рецептора, входящего в семейство рецепторов ТЫЕ/Ы6Е, найденного с помощью упомянутого этапа скрининга по способности к упомянутому связыванию; и (c) получение упомянутого лиганда в достаточно изолированном и очищенном виде;

(5) способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную белком 61, включающий (a) скрининг лиганда, способного связываться, по крайней мере, с частью последовательности 61α, представленной на фиг. 1, или с последовательностью 61β, представленной на фиг. 2;

(b) идентификация и охарактеризование лиганда, помимо МОЕТ-1 или МОЕТ1связывающихся белков или частей рецептора, входящего в семейство рецепторов ΨΝΕ/Ν6Ε. найденного с помощью упомянутого этапа скрининга по способности к упомянутому связыванию; и (с) получение упомянутого лиганда, по существу, в изолированном и очищенном виде;

(6) способ идентификации и получения молекулы, способной напрямую или опосредованно модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную 61, включающий (a) скрининг молекулы, способной модулировать проявляющуюся в модуляции/опосредовании активность 61;

(b) идентификацию и охарактеризование упомянутой молекулы; и (c) получение упомянутой молекулы, по существу, в изолированном и очищенном виде;

(7) способ идентификации и получения молекулы, способной напрямую или ненапрямую модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную белком 61 по настоящему изобретению, включающий (a) скрининг молекулы, способной модулировать проявляющуюся в модуляции/ опосредовании активность упомянутого белка 61;

(b) идентификацию и охарактеризование упомянутой молекулы; и (c) получение упомянутой молекулы, по существу, в изолированном и очищенном виде.

Настоящее изобретение также представляет фармацевтическую композицию, предназначенную для модулирования влияния лиганда ЕА8-К. или ТЫЕ на клетки или влияния любых других цитотоксических медиаторов или индукторов на клетки так, как это было описано выше, включающие в качестве активного ингредиента один из следующих компонентов:

(ί) белок 61 в соответствии с настоящим изобретением и его биологически активные фрагменты, аналоги, производные смесей;

(ίί) рекомбинантный вектор вируса животного, кодирующий белок, способный связываться на поверхностно-клеточном рецепторе и кодирующий белок 61 или его биологически активные фрагменты или аналоги в соответствии с настоящим изобретением;

(ш) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последова тельность по отношению к последовательности белка 61 по настоящему изобретению, при том, что упомянутый олигонуклеотид может быть второй последовательностью в составе вирусного вектора в соответствии с п. (и), описанным выше. Также настоящее изобретение представ ляет

I. Способ индуцированного связывающимся модулирования МОЕТ-1влияния или МОЕТ1белково-индуцированного влияния, или влияния любого другого цитотоксического медиатора или индуктора на клетки, включающий обработку упомянутых клеток в соответствии со способом по любому из пп.(1)(10), описанных выше с использованием белков 61, их аналогов, фрагментов или производных или с использованием последовательностей, кодирующих белки 61, их аналоги или фрагменты, при том, что упомянутая обработка приводит в результате к усилению или подавлению помянутого влияния, вызванного МОКТ-1, и таким образом влияния, опосредуемого рецепторами БА8-К и р55-К, или упомянутых иных цитотоксических медиаторов или индукторов.

II. Способ в соответствии с описанным выше, при том, что упомянутые белок 61, его аналог, фрагмент или производное являются той частью белка 61, которая специфически участвует в связывании с МОКТ-1 или с МОКТ1связывающимися белками, или с упомянутыми иными цитотоксическими медиатором или индуктором, или при том, что упомянутая последовательность белка 61 кодирует ту часть белка 61, которая специфически участвует в связывании с МОКТ-1 или с МОКТ1-связывающимися белками, или с иными цитотоксическими медиатором или индуктором.

III. Способ в соответствии с описанным выше, при том, что упомянутый белок 61 является любой из изоформ 61, а упомянутые изоформы способны усиливать связанное с МОКТ1 влияние или связанный с другими цитотоксическими медиатором или индуктором влияние, тем самым также усиливая влияние на клетки, связанные с рецепторами БА8-К или р55-К, или влияние на клетки другого цитотоксического медиатора или индуктора.

IV. Способ в соответствии с описанным выше, при том, что белок 61 является любой из изоформ 61, а упомянутые изоформы способны подавлять влияние, связанное с МОКТ-1 или связанное с иным цитотоксическим медиатором или индуктором влияние на клетки, тем самым также подавив влияние на клетки, связанное с рецепторами БА8-К или р55-К, или влияние на клетки другого цитотоксического медиатора или индуктора.

Как видно из всего сказанного выше, а также и из подробного описания ниже, 61 также может быть использован вне связи с белком МОКТ-1 с целью обработки (лечения) клеток или тканей. Выделение белков 61, их идентификация и характеристика могут быть осуществлены с помощью любой из стандартных поисковых технологий, использующихся для выделения и идентификации белков, например, с помощью дигибридного дрожжевого теста, методов аффинной хроматографии и любых других хорошо известных стандартных процедур, применяемых для подобных целей.

Более того, некоторые изоформы белка 61 могут включать только протеазоподобный сегмент (проявляющий гомологию с описанными выше протеазными сегментами в составе других известных протеаз), но при отсутствии реальной протеазной активности, в результате чего такие изоформы могут служить, в первую очередь, в качестве ингибиторов так, как это было описано выше.

Далее, поскольку 61 или любая из его изоформ могут быть вовлечены в модуляцию внутриклеточных механизмов, не связанных с МОКТ-1, то 61 или любая из его изоформ могут быть использованы для модулирования сигналов в любых прочих внутриклеточных путях и механизмах.

Другие аспекты и варианты настоящего изобретения также представляются, исходя из нижеследующего подробного описания настоящего изобретения.

Надо заметить, что, по мере использования, следующие термины - модулирование влияния БА 8-лиганда или ТИБ на клетки и модулирование влияния МОКТ-1 или МОКТ1связывающегося белка на клетки - понимаются как относящиеся к воздействию как ίη νίίτο, так и ίη νίνο, а, кроме того, также предполагают и подавление (ингибирование), и усиление/ обусловливание.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А является схематическим изображением первичной нуклеотидной последовательности, кодирующей одну из изоформ белка 61, подробно описанной в примере 1;

фиг. 1В - схематическим изображением расшифрованной аминокислотной последовательности изоформы, представленной на фиг. 1 А;

фиг. 2 - схематическим изображением первичной нуклеотидной последовательности и расшифрованной аминокислотной последовательности второй изоформы белка 61, подробно описанной в примере 1;

фиг. 3 - схемой сравнения аминокислотных последовательностей сплайсинговых вариантов белка 61 (или СА8Н) человека (НС А 8 На, 1ιί.Ά8Ηβ) и мыши (СА8На), а также консервативных мотивов, найденных в составе этих белков. На фиг. 3 осуществлено параллельное сопоставление аминокислотных последовательностей 61а мыши (тСА8На), 61а человека (НСА8На) и 61 β (НСА81ф). СА8Р-8 (МАСН/ БЫСЕ1/Мей5), СА8Р-10 (\1с114/1^;МСЕ2). СА8Р3 (СРР32/апопаин/Уата) и СА8Р-1 (ГОЕ). СА8Р1 и СА8Р-3 показаны без их продоменных сегментов. В каждой последовательности аминокислотные остатки пронумерованы справа. Прерывистые линии указывают на разрывы последовательностей, сделанные с целью оптимизации сопоставления. Затенены модули гибельдоменов (ΌΕΌ). Обведены аминокислоты, оказывающиеся идентичными более чем в трёх белках. В пределах участков протеазной гомологии аминокислоты, сопоставленные с остатками в составе СА8Р-1 так, что их участие в обеспечении каталитической активности было подтверждено с применением кристаллографической рентгенографии, обозначены следующим образом: остатки, предположительно участвующие в катализе и соответствующие гистидину-237 и цистеину-285 в составе СА8Р-1, интенсивно затемнены и помечены закрашенными кружками под столбцом сопоставления. Остатки, образующие карман связывания для карбоксилатной боковой цепи Р1-Акр и соответствующие аргинину-179, глутамину-238, аргинину341 и серину-347 в составе СА8Р-1, затемнены в меньшей степени и помечены незакрашенными кружками. Известные и выявленные в экспериментах сайты расщепления по Акр-Х и сайты потенциального расщепления, найденные в одинаковых положениях в 61 (СА8Н), затенены. Горизонтальные стрелки указывают на Ν- и С-терминальные концы малой и большой субъединиц СА8Р-1. С-концы белков помечены звёздочками;

фиг. 4 (А и В) воспроизводят авторадиограммы, полученные в ходе идентификации транскриптов 61 с помощью метода Нозернблоттинга в различных тканях человека (сердце, головной мозг, плацента, лёгкие, печень, скелетные мышцы, почки, поджелудочная железа, селезёнка, тимус, простата, семенники, яичники, тонкий кишечник, толстый кишечник и лимфоциты периферической крови РВЬ). Тестирование с применением метода Нозерн-блоттинга было проведено следующим образом: помеченный изотопно зонд мРНК, соответствующий гибель-домену (ИБИ) в составе 61 (в соответствии с нуклеотидами 482-1070 в составе 61β [см. фиг. 2], т.е. сегменту, общему для обоих клонированных сплайсинговых вариантов 61 [СА8Н]), был получен с использованием РНКполимеразы Т7 (Рготеда) и применен для анализа множественных тканевых точек человека (С.’1оп1ее11). включающих поли(А)⁺-РНК (2 мкг на одну линию), происходящих из различных тканей человека;

фиг. 5 является схематическим представлением результатов анализа взаимодействия 61α (СА8На) и 61β (СА8Нв) с другими белками, включающими гибель-домены (ИБИ) в трансфицированных клетках дрожжей, например, МОВТ-1/ГАИИ, МАСНа1 (СА8Р-8а1), МАСНв1 (СА8Р-8в1), МАСЩ4 (СА8Р-8в4), Мсй4 (СА8Р-10), 61а (СА8На), 61β (СА8Нв), р55-В (р55-1С), ТВАИИ, В1Р и ламин (как негативный контроль). Параметры связывания 61 β (СА8Нв), равно как и 61а (СА8На), были оценены в репортерном штамме дрожжей 8ΕΥ526 (С1оп1ес11) с использованием ДНК-связывающего домена в составе вектора р6ВТ9-6АБ4 и активаторных доменов в составе векторов р6АИ1318 и р6АИ6Н-6АБ4. Количественный анализ связывания в клетках дрожжей в тесте по экспрессии β-галактозидазы был проведен так, как это описано в ссылочных примерах 1-3. Полученные результаты выражены во времени, необходимом для получения отчетливого окрашивания. Во всех тестированных случаях идентичные результаты были получены тогда, когда тестируемые нуклеотидные вставки были помещены в обеих комбинациях в пределах ДНКсвязывающего домена и конструкций активаторного домена плазмид. Ни одна из тестированных вставок не взаимодействовала с рядом контрольных белков, включая внутриклеточные домены р55-В (СИ120а),р75-В (СИ120Ь), СИ40, ламин, и пустые 6АБ4 векторы;

фиг. 6 (А-И) представляет результаты оценки влияния мутантных вариантов 61а (СА8На), 61β (СА8Щ) и 61а (СА8На) на жизнеспособность клеток и индукцию клеточной гибели. Количественный анализ гибели клеток, индуцируемой а клетках НеБа-Гак (данные схематически показаны в виде диаграммы на фиг. 6А) и в клетках 293-Т (данные схематически показаны в виде диаграммы на фиг. 6В и 6С) путем трансфекции этих клеток определенными конструкциями, был проведен так, как это описано в примере 1. Клетки (5х10⁵ клеток 293Т или 3х10⁵ клеток НеБа в расчете на 6сантиметровые чашки) были перемежающимся способом трансфицированы с использованием кДНК определенных белков вместе с плазмидой рСМV-β6а1 с помощью метода осаждения в растворе фосфата кальция. Каждую чашку трансфицировали 5 мкг конструкции р(кДНК); если же трансфекция осуществлялась двумя дифференцированными конструкциями, то по 2,5 мкг каждой, из них плюс 1,5 мкг вектора, экспрессирующего β-галактозидазу. Клетки промывали в течение 6-10 ч после трансфекции и затем инкубировали еще 14 ч без дополнительной обработки. Моноклокальное антитело к СИ95 (анти-ЕА8-В) (СН11 [Опсог, 6аййегкЬигд, МИ], 0,5 мкг/мл) и рекомбинантный ТИГа человека (100 нг/мл) были добавлены к клеткам одновременно вместе с циклогексимидом (10 мкг/мл) с последующей инкубацией в течение еще 4 ч. Затем клетки окрашивали с использованием 5-бром-4-хлор-3-индоксил-β-^-галактопиранозида (Х-6а1) и тестировали их с помощью фазоконтрастного микроскопа. Во всех проиллюстрированных экспериментах гибель клеток оценивали спустя 24 ч после трансфекции клеток НеБа-Гак и спустя 20 ч после трансфекции клеток 293-Т. Приведенные данные (среднее ± 8.И.; п усреднено, по крайней мере, по трем экспериментам) являются процентом окрашенных в синий цвет клеток, подсчитываемых с учетом демонстрации ими блеббинга (пузырчатости) мембран.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение в одном из своих аспектов касается новых белков 61, которые способны связываться или взаимодействовать напрямую или ненапрямую с ΜΘΚΤ-1 или с ΜΟΚΤΙ-связывающимися белками, такими как, например, Ме114 или МАСН, тем самым связываясь со внутриклеточным доменом рецептора ΡΑδ-В, с которым связывается ΜΟΚΤ-1, или связываясь с внутриклеточным доменом рецептора ρ55ΤΝΡ-Ρ. с которым связывается белок ΤΚΆΌΌ, с которым, в свою очередь, связывается белок ΜΟΚΤ-1. Соответственно белки 61 по настоящему изобретению рассматриваются в качестве медиаторов или модуляторов ΡΑδ-В, играя тем самым роль, например, в сигнальных механизмах, которые инициируются связыванием лиганда ΡΆ8 с рецептором ΡΑδ-В, а также играя роль в сигнальных механизмах, которые инициируются связыванием ΤΝΡ на рецепторе р55-В. В группу белков 61 по настоящему изобретению включён новый белок 61 и его изоформы.

Более конкретно, в соответствии с настоящим изобретением представлен новый белок 61 (также называемый СЛ8Н), который, очевидно, является гомологом протеазы СЕЭ3 нематоды. Этот новый белок 61, хотя и является близкородственным, при этом проявляет определённые отличия по структуре и субстратной специфичности, соответственно он может выполнять в какой-то степени отличающиеся функции в клетках млекопитающих. Действительно, известны два разных типа активности протеаз. Основной функцией 1СЕ (также называемой СЛ8Р-1) представляется процессирование предшественника 1Ш-1Ц, в то время как для 6ΕΌ3 было отчетливо показано функционирование в качестве эффектора запрограммированной клеточной гибели. Эта последняя функция также, как полагается, является функцией, по крайней мере, некоторых гомологичных белков млекопитающих, например, некоторых изоформ белков МАСН (также называемых СЛ8Р-8), описанных в вышеназванных совместных, находящихся на стадии рассмотрения патентных заявках, а также упоминавшихся выше родственных белков Μο1ι4 (также называемых СЛ8Р10), с которыми белок 61 по настоящему изобретению связывается. Аминокислотная последовательность ΜΑ6Ηα 1 показывает тесное родство с СРР32 (также называемым СА8Р-3), являющимся наиболее близким из известных гомологом млекопитающих 6ΕΌ3. Субстратная специфичность МАСН также сходна с таковой у СРР32, за исключением того, что ΜΑ^αΙ, повидимому, характеризуется более ограниченной субстратной специфичностью в сравнении с СРР32. Протеаза СРР32 предпочтительно расщепляет являющиеся субстратом пептиды по соответствующему сайту в составе поли-(АДФрибозо)полимеразы (РАВР), а также еще проявляет протеолитическую активность в отношении пептидов, соответствующих сайту расщепления протеазой 1СЕ в составе предшественника интерлейкина-1в. Однако, как представляется, ΜΑ6Ηα1 способна расщеплять исключительно РАВР-соответствующую последовательность. Такое соотношение ΜΑί.Ήα1 с СРР32 и СЕЭ3 и отсутствие его сходства с 1СЕ соответствует тому предположению, что ΜΑ6Ηα1 сходным образом с 6ΕΌ3 является регулятором клеточной гибели. ΜΑ6Ηα1 в то же время проявляет ряд параметров последовательности, отличающих его от СЕЭ3 и от СРР32, равно как и от других членов семейства СЕЭ3/1СЕ. С-концевая часть ΜΑ6Ηα1, расположенная выше его участка, гомологичного СЕЭ3/1СЕ. показывает отсутствие какого-либо сходства со всеми аналогично расположенными сегментами любого из соответствующих гомологов. Кроме того, имеется и ряд уникальных характеристик последовательности и в пределах сегмента гомологии с протеазами семейства СЕЭ3/1СЕ. Наличие таких различий подтверждает, что ΜΑ6Ηα1 принадлежит к обособленной эволюционной ветви данного семейства и что его участие в контроле клеточной гибели в определённой степени отличается от такового, описанного ранее для гомологов из семейства СЕЭ3/1СЕ. Также белок 61 по настоящему изобретению и его вероятные изоформы показывают некоторые отчетливые отличия в пределах сегмента гомологии с протеазами СЕЭ3/1СЕ в составе последовательности 61, а раз так, то такие различия могут представлять уникальные характеристики, отражающие специфичность активности 61 в клетках млекопитающих.

Одно важное отличие может относиться к механизму, по которому осуществляется регуляция протеазы. Будучи вовлеченной и в онтогенетически регулируемые процессы клеточной гибели, и в индуцируемый рецепторами иммунный цитолиз, расщепление белков протеазами семейства СЕЭ3/1СЕ должно бы быть подверженным регуляции как сигналами, которые формируются внутри клетки, так и сигналами, приходящими с рецепторов, находящихся на внешней поверхности клетки. В онтогенетических процессах клеточной гибели активация таких протеаз предположительно включает механизмы, которые влияют на экспрессию генов, в результате чего происходит усиление синтеза этих протеаз, равно как и снижение интенсивности синтеза некоторых белков, таких как ВСЬ-2, который является антагонистом апоптотической индукции. Однако это точно не соответствует случаю, когда цитотоксичность опосредуется рецепторами ΡΑδ-В или ΤΝΡ-В. Клетки могут быть уничтожены с участием лиганда ΤΝΡ-В или ΡΑδ-В даже тогда, когда активность белкового синтеза внутри них полностью заблокирована (в действительности они могут быть уничтожены в этом случае с большей эффективностью) и остаются стимулозависимыми и в таких условиях. Активация протеаз семейства

ί.ΈΌ3/Κ.Έ рецепторами ΤΝΕ и ΕΑ8-Κ также может происходить по механизму, который является независимым от белкового синтеза. Уникальные параметры последовательности ΜΑ0Ηα1 могут позволить ему участвовать в работе такого механизма. Сходным образом уникальные характеристики последовательности белка 61 по настоящему изобретению также согласуются с его вероятной способностью участвовать в работе такого механизма.

Таким образом, новый белок 61 может быть еще одним членом недавно обнаруженной группы протеаз, которая включает выше упоминавшуюся протеазу МАСН (и ее изоформы) и ΜΟΥ для которых была установлена связываемость, либо напрямую, либо через белокадаптор, со внутриклеточным доменом поверхностно-клеточного рецептора. По взаимодействию механизмов действия связанных с рецепторами белков, которые обладают иными каталитическими свойствами, представляется вероятным, что связывание 61 с ΜΠ14 или 61 с МАСН (или изоформой ΜΑί.Ήα1) и, в свою очередь, связывание ΜΟ14 или МАСН с ΜΟΚΤ-1, или же прямое связывание 61 с ΜΟΚΤ-1 позволяет стимулировать протеазную активность 61 и (или) ΜΕΙι и (или) МАСН в ходе связывания ΕΑδ-лиганда на рецепторе ΕΑ8-Κ. Также это может позволять активировать протеазу рецептором ρ55-Κ за счет связывания ΜΟΚΤ-1 с ΤΚΑΌΌ, который, в свою очередь, связывается с ρ55-Κ.

Для других членов семейства протеаз СЕЭ3/1СЕ было обнаружено проявление полной своей активности только после протеолитического процессинга, который происходит либо путем саморасщепления, либо под влиянием протеаз этого же семейства (обзор Китах, 1995; НепкаП. 1996). Например, как это было подробно описано в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения патентных заявках в связи с МАСН, цитотоксическое действие вследствие коэкспрессии двух основных потенциально саморасщепляющихся продуктов ΜΑ0Ηα1, в противоположность отсутствию цитотоксичности в клетках в случае экспрессии полноразмерного участка гомологии СЕО3/1СЕ, согласуется с вероятностью того, что ΜΑί.Ήα1 также проявляет свою полную активность только после процессинга. Ферментная активность, наблюдаемая в лизатах бактерий, которые экспрессируют полноразмерный сегмент, по-видимому, отражает наличие автопроцессинга данного белка, происходящего в таких условиях, или процессинга, осуществляемого некоторыми бактериальными протеазами. Пока неясно, по какому механизму такой процессинг протекает в клетках млекопитающих и как он может осуществляться при опосредовании рецепторами ΕΑ8-Κ и ρ55-Κ, а также пока ещё точно не определено, каким является относи тельный вклад протеазной активности МАСНа1 в цитотоксичность, индуцируемую ΕΑ8-Κ и ΤΝΕ. Оценка такого вклада затруднена тем, что имеет место также экспрессия ΜΑΟΗβ1, в составе которой отсутствует сегмент гомологии с СЕО3/1СЕ, приводящая к выраженной цитотоксичности. По-видимому, такое проявление цитотоксичности отражает способность ΜΑΟΗβ1 связываться с ΜΑΟΗαΤ Из-за такой способности трансфицируемые молекулы МАСН могут в результате агрегируемости приводить к конформационным изменениям молекул ΜΑΟΗα1, что является угрожающим для трансфицированной клетки. Такой механизм может также обусловливать цитотоксичность, наблюдаемую тогда, когда в клетках сверхэкспрессированы молекулы, которые действуют до МАСН (белки ΜΟΚΤ1, ΤΚΑΌΌ или гибель-домены в составе либо ρ55-Κ, либо ΕΑ8-Κ). В то же время, однако, нельзя исключить того, что цитотоксичность, наблюдаемая при индукции экспрессии МАСН или молекул, которые действуют до ее проявления, также отражает, помимо протеолитической активности гомологичного ί.ΈΌ3/Κ.Έ сегмента в составе МАСН, активацию некоторых других механизмов, которые предположительно участвуют в цитотоксическом проявлении ΕΑ8-Κ и ρ55-Κ (например, активацию нейтральной или кислой сфингомиелиназ). Также нельзя исключать и того, что протеолитическая активность сегмента гомологии ί.ΈΌ3/Κ.Έ служит другим функциям, помимо индукции цитотоксичности. Для более четкого понимания функции ΜΑΟΗα1 необходимо было бы идентифицировать эндогенные белковые субстраты, которые расщепляются вследствие активации МАСНа1. Обнаружение путей нарушения активности МАСНа1, например, путем экспрессирования молекул-ингибиторов, также может внести вклад в понимание функций этого белка и тем самым послужить выяснению путей регуляции его активности, если это является желательным.

Соответственно белок 61 по настоящему изобретению и его вероятные изоформы могут быть активными в аналогичном ключе по сравнению с вышеупомянутыми белками МАСН при наличии или отсутствии прямого взаимодействия с другими белками, а именно 61 может действовать напрямую путём связывания с ΜΟΚΤ-1 или действовать косвенно через связывание с Мс14 и (или) МАСН и, в свою очередь, путем связывания ΜΟ14 и (или) МАСН с ΜΟΚΤ-1 или в соответствии с иным, пока точно не установленным механизмом, специфичным для белка 61. Сходным образом регуляция активности 61 может быть аналогичной таковой, ранее охарактеризованной для белков МАСН.

Такое может существовать внутри клеток, которые экспрессируют естественные ингибиторы 61 в отношении протеазной активности, проявляемой этим белком. Существование изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, характерных для других членов семейства СЕИ3/1СЕ, было определено как фактор физиологического ограничения функций этих протеаз. Для некоторых из изоформ таких других протеаз было сообщено об их активности в качестве естественных ингибиторов полноразмерных изоформ, что, вероятно, обусловливается формированием неактивных гетеродимеров между ними. Это может быть справедливым также и для 61 и его некоторых вероятных изоформ, например, таких изоформ, в которых потенциальный Ν-концевой сайт расщепления отсутствует. Экспрессия таких ингибиторных изоформ может определять работу механизма клеточной самозащиты против цитотоксичности, обусловливаемой ΡΑδ-К и ΤΝΡ.

может обладать еще и другими функциями: например, 61 или любая из его изоформ могут иметь усиливающее или упрочивающее влияние на другие белки, обладающие ферментной активностью, например, на протеолитическую активность различных изоформ Мс114 и МАСН; такая усиливающая или упрочивающая активность осуществляется по механизму, в котором 61 выступает в качестве индуктора связывания других белков с МОКТ-1 (например, белков Мс114 и МАСН). Кроме того, 61 или любая из его изоформ также могут играть роль, не связанную с цитотоксичностью, но могут выступать в качестве пристанища для молекул (т.н. депо-сайта), которые вовлечены в действие ΡΑδ-К и ΊΝΈ, не связанное с проявлением цитотоксичности.

Некоторые из специфичных изоформ 61 по настоящему изобретению проиллюстрированы ниже в примере 1. Одна из них 61α (ί.Ά8Ηα). выделенная у человека и мыши (соответственно, 1ι61α/1ιί.Άί>Ηα и т61а/ тСΑ8Ηα), очевидно, представляет собой 1 мг варианта сплайсинга, включающего протеазный гомологичный сегмент и, по крайней мере, в некоторых типах клеток (например, в клетках 293Т) обладает цитотоксической активностью. Другая изоформа, обозначенная 61 β (СЛ8На), выделенная у человека, по-видимому, является коротким вариантом сплайсинга без протеазного гомологичного сегмента, эта изоформа, действующая как ингибитор сигнальных механизмов клеточной гибели.

Из-за уникальной способности рецепторов ΡΑδ-К и Т№-К обусловливать клеточную гибель, равно как и способности рецепторов Т№ опосредовать различные другие типы активности, связанные с повреждением тканей, нарушение функций этих рецепторов может иметь негативные последствия для организма. Действительно, для обоих типов функций этих рецепторов - избыточной и недостаточной - было продемонстрировано участие в патологических проявлениях различных заболеваний. Идентификация молекул, которые участвуют в сигнальной активности этих рецепторов, и обнаружение путей модулирования функций этих молекул представляет собой возможный ключевой прием, необходимый для новых лечебных методологий в отношении таких заболеваний. С точки зрения предполагаемой важной роли 61 в токсичности, обусловливаемой участием ΡΑδ-К и ΊΝΓ, считается, в частности, важным создать лекарства, которые бы могли блокировать протеолитическую функцию таких молекул, что ранее было выполнено в отношении других представителей семейства протеаз СЕИ3/1СЕ. Уникальные параметры последовательности гомологичного СЕИ3/1СЕ сегмента в составе 61 могут позволить создавать лекарства, которые бы нарушали их защищенность от цитотоксичности, обусловливаемой избыточной иммунной активностью, без нарушения физиологических процессов гибели клеток, в которые вовлечены другие члены семейства СЕИ3/1СЕ.

Как отмечалось выше, 61 или любые из его изоформ также могут быть вовлечены в модулирование других внутриклеточных сигнальных механизмов, таких как, например, действие иных цитотоксических медиаторов или индукторов или других белков, действующих вне зависимости от связывания с МОКТ-1 или с МОКТ1-независимосвязывающимися белками. Далее, 61 или, по крайней мере, его изоформы, которые включают протеазоподобный сегмент, но без реальной протеазной активности, могут быть вовлечены в первичную ингибиторную функцию: т.е. подавлять те механизмы (например, сигнальные механизмы в общих или цитотоксических механизмах), в которых 61 или его изоформы участвуют либо путем прямого связывания с участниками этих механизмов, либо путём косвенного связывания с другими белками, которые, в свою очередь, связываются с участниками этих механизмов.

Итак, настоящее изобретение также касается последовательности ДНК, кодирующей белок 61, и белков 61, кодируемых такими последовательностями ДНК.

Более того, настоящее изобретение также касается последовательностей ДНК, кодирующих биологически активные аналоги, фрагменты и производные белка 61, равно как и аналоги, фрагменты и производные, ими кодируемые. Получение таких аналогов, фрагментов и производных проводится с помощью стандартных методик (см., например, методическое руководство 8атЬгоок е1 а1., 1989), с помощью которых в последовательностях ДНК, кодирующих белок 61, один или большее число кодонов может быть делетировано, добавлено или заменено другими с последующим получением аналогов, имеющих, по крайней мере, одну замену аминокислотного остатка по сравнению с нативным белком.

Полипептид или белок, который по существу соответствует белку 01, включает не только белок 01, но также и полипептиды или белки, которые являются аналогами 01.

Аналогами, которые в существенной степени соответствуют белку 01, являются полипептиды, в составе которых одна или большее число аминокислот нативной аминокислотной последовательности 01 замещены другой аминокислотой, делетированы и(или) вставлены, в результате чего получаемый белок проявляет, по существу, такой же или больший уровень биологической активности в сравнении с белком 01, которому он соответствует.

С целью обеспечения соответствия белку 01, по существу, изменения в аминокислотной последовательности белков 01, таких как его изоформы, должны быть относительно небольшими. Хотя количество замен может быть больше десяти, предпочтительно, чтобы оно не превышало десяти замен, более предпочтительно, чтобы число замен не было более пяти, а наиболее предпочтительно - не более трёх таких замен. При том, что любые методики могут быть использованы для выявления биологически активных белков, которые в существенной степени соответствуют белкам 01, одним из таких методов является использование стандартной процедуры мутагенеза в отношении ДНК, кодирующей белок, с получением в результате малого числа модификаций. Белки, экспрессируемые такими клонами, затем могут быть подвергнуты скринингу по их способности связываться с различными МОНТ1-связывающимися белками, такими как, например, МсЕ4 и МАСН, или даже напрямую с МОНТ-1, и (или) по их ГА8-Н- и р55-Н-опосредующей активности, и(или) способности опосредовать активность любых других внутриклеточных механизмов таким образом, как это было описано выше.

Под консервативными изменениями подразумеваются те изменения, которые, как ожидается, не должны изменять активность белка и которые обычно подвергаются скринингу в первую очередь, поскольку они, как ожидается, не приводят к существенному изменению размера, заряда или конфигурации данного белка и, следовательно, как также ожидается, не приводят к изменению его биологических свойств.

Консервативные замещения в белках 01 включают такой аналог, в котором, по крайней мере, один аминокислотный остаток в составе полипептида замещён консервативным образом другой аминокислотой. Предпочтительно выполнять такие замещения в соответствии со следующим перечнем, который представлен в табл. 1А; такие замещения могут быть определены путем рутинного экспериментирования с целью получения модифицированных структурных и функциональных характеристик синтезирован ной полипептидной молекулы при поддержании биологической активности, характерной для белка 01.

Таблица 1 А

Исходный остаток	Примеры замещения
А1а	01у; 8ег
Агд	Ьуз
Азп	01п; Н1з
Азр	01и
Суз	8ег
01п	Азп
01и	Азр
01у	А1а; Рго
Н1з	Азп; 01п
11е	Ьеи; Уа1
Ьеи	11е; Уа1
Ьуз	Агд; 01п; 01и
Ме!	Ьеи; Туг; 11е
РЕе	Ме!; Ьеи; Туг
8ег	ТЕг
ТЕг	8ег
Тгр	Туг
Туг	Тгр; РЕе
Уа1	11е; Ьеи

С другой стороны, другая группа замещений в составе белка 01 представлена такими замещениями, когда, по крайней мере, один аминокислотный остаток в составе полипептида удаляется и другой остаток вносится на его место в соответствии с табл. 1В. Типы замещений, которые могут быть произведены в составе полипептида, могут основываться на анализе частоты аминокислотных замен между гомологичными белками у различных видов организмов, такие как те, которые представлены в табл. 1-2 у 8с1ш1х е! а1., 1978 (Ргшар1ез о£ Рго!ет 8!гис!иге, 8ргтдег-Уег1ад, Ыете Уогк, ΝΥ) и на рис. 3-9 у СгещЫоп Т.Е., 1983 (Рго!ешз: 8!гис!иге апб Мо1еси1аг Ргорегбез, Ргеетап & Со., 8ап Ггапазсо, СА). Основываясь на подобных анализах, альтернативные консервативные замещения определены здесь как замены в пределах одной из следующих пяти групп.

Таблица 1В

1. Маленькие алифатические, неполярные или слабополярные остатки: А1а, 8ег, ТЕг (Рго, 01у);

2. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: Азр, Азп, 01и, 01п;

3. Полярные, положительно заряженные остатки: Н1з, Агд, Ьуз;

4. Крупные алифатические неполярные остатки: Ме!, Ьеи, 11е, Уа1 (Суз); и

5. Крупные ароматические остатки: Р1 е, Туг, Тгр.

Три аминокислотных остатка, взятые в вышеприведённой таблице в скобки, характеризуются специфической ролью в пространственной архитектуре белков. Глицин является единственной аминокислотой, лишенной какой-либо боковой цепи и таким образом обеспечивает подвижность цепи. Это, однако, имеет тенденцию к образованию какой-либо иной вторичной структуры, помимо α-спиральной. Пролин благодаря своей необычной геометрии обеспечивает плотность упаковки цепи и в принципе обеспечивает тенденцию к образованию структур типа β-плоскостей, хотя в некоторых случаях остаток цистеина может принимать участие в образовании дисульфидных связей, которые важны для пространственной складчатости белка. Следует отметить, что цитированный выше 8с1ш1х е! а1. объединял вышеназванные группы 1 и 2. Надо заметить также, что тирозин, благодаря его потенциалу к образованию водородной связи, проявляет существенное родство с серином и треонином и т.п.

Консервативные аминокислотные замещения в соответствии с настоящим изобретением, например, такие, какие описаны выше, хорошо известны в данной области техники и, как ожидается, должны поддерживать биологические и структурные свойства данного полипептида после замещения аминокислот. Большинство делеций и замен в соответствии с настоящим изобретением являются такими, которые не приводят к радикальным изменениям характеристик данного белка или полипептидной молекулы. Под характеристиками понимаются как изменения во вторичной структуре, например, наличие α-спиралей или β-плоскостей, так и изменения в биологической активности, например, связывание с МОКЛ-связывающимися белками или с МОКЫ. или опосредование влияния на клетки лиганда ЕА8-К или ΤΝΕ.

Примеры проведения аминокислотных замен в составе белков, которые могут быть использованы для получения аналогов белков 61 по использованию в настоящем изобретении, включают любые известные методы, такие как представленные в патентах США КЕ-33653, 4959314, 4588585 и 4737462 у Магк е! а1.; 5116943 у Ко!к§ е! а1.; 4965195 у Nатеη е! а1.; 4879111 у Скопд е! а1.; и 5017691 у Ьее е! а1.; и лизинзамещенные белки, представленные патентом США 4904584 (8кате е! а1.).

Помимо консервативных замещений, обсуждавшихся выше, которые не должны сколько-нибудь существенно изменять активность белка 61, и консервативные замещения, и менее консервативные, и более случайные изменения, которые ведут к увеличению биологической активности аналогов белков 61, также находятся в пределах масштаба настоящего изобретения.

Когда должно быть определено точное проявление замещения или делеции, специалисту в данной области техники должно быть ясно, что такое проявление замещения(замещений), делеции(делеций) и т. п. может быть оценено с помощью стандартных тестов на связывание и гибель клеток. Проведение скрининга с использованием таких стандартных тестов не включает каких-либо неподходящих экспериментов.

Приемлемыми аналогами являются те из них, которые сохраняют, по крайней мере, способность связывания с МОКЛ-связывающимися белками, как это отмечалось выше, или с МОКЫ, или с другими белками, тем самым в соответствии с описанным выше, опосредуя активность рецепторов ЕА8-К и р55-К или других белков, отмеченных выше. Таким образом, могут быть получены аналоги, которые проявляют так называемый доминантно-негативный эффект, а именно аналоги, которые дефектны или по связыванию с МОКЛ -связывающимися белками (например, Мск4 или МАСН), или по связыванию с МОКЫ, или с другими белками, или по последующей сигнальной или протеазной активности после такого связывания. Такие аналоги могут быть использованы, например, для подавления влияния лиганда ЕА8-К или влияния других белков за счёт конкуренции с естественными МОКЛ -связывающимися белками или другими белками. Например, представляется вероятным, что изоформы МАСН, МАСНа2 и МАСНа3, являются естественными аналогами, которые служат в качестве ингибиторов активности МАСН за счет конкуренции по связыванию активных (протеазных) изоформ МАСН с МОКЫ, что представляется существенным для активации этих изоформ МАСН. Поскольку в результате активные изоформы МАСН не могут связываться с МОКЫ, то внутриклеточные сигнальные механизмы, опосредуемые рецепторами ЕА8-К и р55-К, также окажутся подавленными. Сходным образом 61 или любая из его изоформ также могут служить в качестве ингибиторов влияния ЕА8лиганда за счет конкуренции с различными МОКЛ-связывающимися белками по связыванию с МОКЫ или за счет взаимодействия с ними таким путем, который предотвращает их связывание с МОКЫ. Также могут быть получены так называемые доминантно-позитивные аналоги 61, которые будут служить для усиления влияния ЕА8-лиганда или ΤΝΕ. Они могут иметь такую же или лучшую способность к связыванию с МОКЛ -связывающимися белками или даже такие же или лучшие свойства по связыванию с МОКЫ и такие же или лучшие характеристики в отношении сигнальных механизмов по сравнению с естественными белками 61.

На генетическом уровне эти аналоги в принципе получают путем сайт-направленного мутагененза в отношении нуклеотидов в составе ДНК, кодирующей белок 61, тем самым получая ДНК, кодирующую данный аналог, с последующим синтезом этой ДНК и экспрессией рекомбинантного полипептида в клеточной культуре. Обычно аналоги проявляют такие же или улучшенные качественные показатели биологической активности в сравнении с естественно встречающимся белком: Аи8иЬе1 е! а1., 19871995, Сиггеп! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 0геепе РиЬ1. & XVНеу 1п!ег8ск, Νονν Уогк, ΝΥ; 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со 16 8рппд НагЬог ЬаЬ., Со 16 8рппд НагЬог, ΝΥ.

Приготовление белка 01 в соответствии с изложенным здесь или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей такой же полипептид, которая отличается от естественной последовательности из-за изменений, учитывающих известную вырожденность генетического кода, может быть осуществлено путем сайт-специфического мутагенеза ДНК, которая кодирует ранее приготовленный аналог или нативный вариант белка 01. Сайтспецифический мутагенез позволяет получать аналоги путем использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с желательной мутацией, а также достаточное число соседствующих нуклеотидов с получением затравочной последовательности достаточного размера и сложности, необходимых для образования стабильного дуплекса по обе стороны от пересекаемого делеционного соединения. Обычно предпочтительной является затравка, состоящая примерно из 20-25 нуклеотидов при том, что примерно 5-10 комплементирующих нуклеотидов с каждой стороны последовательности заменяются. В целом, методика сайтспецифического мутагенеза хорошо известна в данной области техники, примером чему служит публикация А6е1тап е! а1., 1983 (ΌΝΆ, 2, 183), данные которые включены в настоящий текст путем цитирования.

Нужно принять во внимание, методика сайт-специфического мутагенеза обычно использует фаговый вектор, который существует как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной формах. Обычные векторы, используемые в методе направленного мутагенеза, включают такие векторы, как фаг М13, например, так, как это описано Мессингом с соавт. (Мекыпд е! а1., 1981, 36 С1еуе1ап6 8утр. оп Масгото1еси1е§ & ВесотЬтап! ΌΝΆ, е6. А. ’№а1!оп, Е1§еу1ег, Ат§!ег6ат), данные которого включены здесь в виде цитирования. Эти фаги являются легко доступными на коммерческой основе и их использование в принципе хорошо известно специалистам в данной области техники. С другой стороны, также для получения одноцепочечной ДНК могут быть использованы плазмидные векторы, несущие одноцепочечный фаговый сайт начала репликации (Уепа е! а1., 1987, Ме111о6§ Епхуток, 153, 3).

В целом, сайт-специфический мутагенез в соответствии с описываемым здесь осуществляют сначала путем получения одноцепочечного вектора, который включает в пределах своей последовательности последовательность ДНК, кодирующую необходимый полипептид. Олигонуклеотидную затравку, несущую желательным образом мутировавшую последовательность, получают синтетическим путем с помощью автоматического ДНК-олигонуклеотидного синтеза. Эту затравку затем отжигают с одноцепочечным вектором, содержащим белоккодирующую последовательность, и подвергают воздействию ДНК-полимеризующих ферментов, таких как фрагмент Клёнова полимеразы I кишечной палочки, с целью завершения синтеза цепи, несущей данную мутацию. Таким образом, как и мутировавшая последовательность, вторая цепь несёт желательную мутацию. Такой гетеродуплексный вектор затем используют для трансформации подходящих клеток, таких как клетки 1М101 Е.сой, а клоны отбирают по включению рекомбинантных векторов, несущих мутантную последовательность.

После того как такой клон отобран, мутантный белок 01 может быть выделен и внесён в состав подходящего вектора, обычно в состав трансформационного или экспрессирующего вектора такого типа, который может быть использован для трансфекции подходящего организма-хозяина.

Соответственно, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие белок 01, также могут быть обнаружены, получены и(или) модифицированы 1п У11го, 1п 81!и и(или) 1п у|уо путем использования известных методик амплификации ДНК или РНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и химический олигонуклеотидный синтез. ПЦР позволяет амплифицировать (увеличивать в числе) специфические последовательности ДНК путем повторения реакций с участием ДНК-полимеразы. Эта реакция может быть использована вместо клонирования: все, что в этом случае требуется, - это знать состав нуклеотидной последовательности. С целью осуществления ПЦР формируют затравки, которые комплементарны представляющей интерес последовательности. Затем эти затравки генерируют с помощью автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку затравки могут быть сформированы так, чтобы они гибридизовали с частью конкретного гена, то могут быть созданы такие условия, при которых возможно проскакивание ошибок в комплементарности оснований. Амплификация таких участков, несущих ошибки, может приводить к синтезу мутантного продукта, в результате чего образуется пептид, обладающий новыми свойствами (т.е. по сути - это сайт-направленный мутагенез). См. также руководство Аи8иЬе1 е! а1., цитированное выше, глава 16. Также путем объединения синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы и метода ПЦР РНК может быть использована в качестве исходного материала для синтеза внеклеточного домена рецептора пролактина с исключением этапа клонирования.

Более того, затравки для ПЦР могут быть сконструированы так, чтобы включать новые рестрикционные сайты или другие элементы, такие как терминирующие кодоны по концам генного сегмента, предназначенного для амплифицирования. Такое помещение рестрикционных сайтов по 5'- и З'-концам амплифицируемой генной последовательности позволяет направленно получать генные сегменты, кодирующие белок 61 или его фрагменты, сформированные так, чтобы быть пригодными для лигирования на другие последовательности и(или) клонирующие сайты в составе векторов.

ПЦР и другие методы амплификации РНК и(или) ДНК хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без излишних экспериментов, основываясь на руководстве, приведенном в настоящем тексте. Известные методы амплификации ДНК или РНК включают, но этим не ограничиваются, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и сходные амплификационные процессы (см., например, патенты США 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 (МиШ§ е1 а1.), 4795699 и 4921794 (ТаЬог е1 а1.), 5142033 (Ιηηίδ), 5122464 (№1кои е1 а1.), 5091310 (Ιηηίδ), 5066584 (6у11еи8!еи е1 а1.), 4889818 (6е1ГаиБ е1 а1.), 4994370 (ЗБуег е1 а1.), 4766067 (В|5\уа5), 4656134 (Ятдо1Б) и руководство Ιηηίδ е1 а1. [еБ§.], РСЕ Рго1осо1§: А 6шБе Ю МеШоБ анБ Αтр1^йсаΐ^оη), а также амплификация по РНКпосредникам, основанная на использовании РНК, являющейся антисмысловой по отношению к последовательности-мишени и используемой в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США 5130238 - Ма1ек е1 а1.: торговая марка ΝΑ8ΒΑ) и иммунная ПЦР, которая является комбинацией ДНКамплификации с мечением антител (Ри/юка е1 а1., 1993, Заенсе, 260, 487; Заао е1 а1., 1992, 8с1еасе, 258, 120; Заао е1 а1., 1991, Вю1есйтдие8, 9, 1378), при том, что полное содержание патентов и цитируемых статей полностью включено в виде ссылок.

Аналогичным образом биологически активные фрагменты белков 61 (например, такие как любые белки 61 или его изоформы) могут быть получены так, как это было описано выше по отношению к получению аналогов белков 61. Подходящими фрагментами белков 61 являются те, которые сохраняют свойственную белку 61 способность опосредовать биологическую активность рецепторов ЕА8-К. и р55-Р или других белков так, как это было описано выше. Соответственно, могут быть получены такие фрагменты белков 61, которые обладают доминантно-негативным или доминантнопозитивным действием в соответствии с описанным выше для характеристики аналогов. Необходимо отметить, что эти фрагменты пред ставляют специальный тип аналогов по настоящему изобретению, а именно они определяют участки белков 61, являющиеся производными от полной последовательности белка 61 (например, от последовательности любого 61 или их изоформ), при том, что такая часть или фрагмент обладали какой-либо из вышеобозначавшихся желательных характеристик. Такой фрагмент может быть, например, пептидом.

Сходным образом производные могут быть получены путем стандартных модификаций боковых групп одного или большего числа аминокислотных остатков в составе белка 61, его аналогов или фрагментов или путем соединения белка 61, его аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.п., что хорошо известно в данной области техники. Соответственно, под понятием производных в данном тексте понимаются производные, которые могут быть получены из функциональных групп, которые находятся на боковых цепях аминокислотных остатков или Ν-, или С-концевых групп с помощью известных методик, и включены в настоящее изобретение. Производные могут быть химическими составляющими, такими как углеводные или фосфатные остатки, в результате чего получаемая фракция будет иметь такую же или более высокую биологическую активность по сравнению с белками 61.

Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные в результате реакций с аммонием или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные или свободные аминогруппы аминокислотных остатков, образованные ацильными составляющими (например, алканоильные группы или ароильные группы с углеродным кольцом) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, в остатках серина или треонина), образованные ацильными составляющими.

Термин производное должен включать только те производные, которые не изменяют одну аминокислоту на другую из 20 естественных природных аминокислот.

Хотя белок 61 является белком или полипептидом, он является последовательностью аминокислотных остатков. Полипептид, включающий более длинную последовательность, который содержит полную последовательность белка 61, в соответствии с принятыми здесь определениями, должен также включаться в параметры такого полипептида, т. к. добавления не влияют на основные и новые характеристики изобретения, т.е. если оно сохраняет или усиливает биологическую активность белка 61 или если удлиненный полипептид может быть впоследствии расщеплен с получением белка или полипептида, обладающего биологической активностью белка 61. Таким образом, например, настоящее изобретение также включает слитые белки, состоящие из белка 01 и других аминокислот или пептидов.

Новый белок 01, его аналоги, фрагменты и производные пригодны для использования в ряде направлений, например:

1). Белок 01, его аналоги, фрагменты и производные могут быть использованы для миметирования или усиления функций МОКТ1связывающихся белков, таких как, например, Мс114 или МАСН (включая их различные изоформы) или даже самого МОКТ-1 и, следовательно, лиганда РА8-К или Т№, или других белков в случаях, когда желательным является усиление влияния лиганда РА8-К или ЮТ, или другого белка, как, например, при применении в противоопухолевых, противовоспалительных, противо-ВИЧ и т.п. целях, при достижении которых желательной является индукция цитотоксичности с участием лиганда РА8-К или Т№, или иных белков. В этом случае белок 01, его аналоги, фрагменты или производные, которые усиливают влияние лиганда РА8-К, или Т№, или другого белка, т.е. цитотоксическое действие, могут быть внесены в клетки с помощью стандартных процедур, известных к настоящему времени. Например, тогда, когда белок 01 является полностью внутриклеточным (как это предполагается) и должен быть внесен только внутрь клеток, в которых желательно проявление влияния лиганда РА8-К, или ЮТ, или другого белка, необходимо применять специальную систему для внутриклеточного внедрения белка. Одним из путей для решения такой задачи является создание рекомбинантного животного вируса, например, производного от Уасаша, в состав ДНК которого должны быть встроены следующие два гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с поверхностноклеточными рецепторами, специфически экспрессируемыми данными клетками, например, такой лиганд как антиген др 120 СПИДа (ВИЧ), специфически связывающийся на некоторых типах клеток (на СЭ4 лимфоцитах и родственных лейкозных клетках), или же какой-либо иной лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими рецепторы РА8-К или р55-К, таким образом, чтобы такой рекомбинантный вирусный вектор был бы способен связываться такими клетками, несущими РА8-К или р55-К; и ген, кодирующий белок 01. Таким образом, экспрессия на поверхности вируса антигена, который связывается на поверхности клетки-мишени, позволит точно направлять этот вирус на опухолевую клетку или другую клетку, несущую РА8-К или р55-К с тем, чтобы после этого последовательность, кодирующая белок 01 (например, последовательность 01α) была внесена внутрь клеток с помощью этого вируса и, соответственно, экспрессирована в этих клетках, что в результате приведёт к усилению влияния лиганда РА8-К или ΨΝΕ и далее при ведет к гибели опухолевых клеток или других клеток, несущих РА8-К или р55-К, если их желательно уничтожить. Конструирование такого рекомбинантного животного вируса производится с помощью стандартных процедур (см., например, 8атЬгоок е! а1., 1989). Другим возможным путем внесения последовательности белка 01 (например, либо белка 01, либо любой из его изоформ) является внесение в форме олигонуклеотидов, которые могут быть поглощены клеткой с последующей их экспрессией внутри нее.

Еще одним путем усиления такой клеточной цитотоксичности может быть подавление активности изоформ 01 (например, 01 β), которые сами по себе являются ингибиторами клеточной цитотоксичности. Пути ингибирования таких изоформ 01 многочисленны и включают те, которые рассмотрены в нижеследующем п.2 в связи с их применением для специфического подавления ингибиторных изоформ белка 01, таких как, например, изоформа 01β.

2). Они могут быть использованы для подавления влияния на клетки лиганда РА8-К, или Т№, или другого белка, например, в таких случаях, как повреждение тканей при септическом шоке, отторжении при синдроме трансплантат против хозяина или остром гепатите, т. е. тогда, когда желательным является блокирование индуцируемых лигандом РА8-К или ΨΝΕ внутриклеточных сигналов с РА8-К или с р55-К, или сигналов, индуцируемых иными белками. В этом случае возможным является, например, внесение в клетки с помощью стандартных процедур олигонуклеотидов, имеющих антисмысловые кодирующие последовательности по отношению к последовательности, кодирующей белок 01, что обеспечивает эффективное блокирование трансляции мРНК, кодирующих белок 01, и тем самым блокирование его экспрессии, что приводит к подавлению влияния лиганда РА8-К, или Т№, или другого белка. Такие олигонуклеотиды могут быть внесены в клетки с использованием выше описанного способа конструирования рекомбинантных животных вирусов, вторая встроенная последовательность в составе которых является данной олигонуклеотидной последовательностью.

Далее, как уже отмечалось выше и ниже будет рассмотрено в качестве примера, была выделена, по крайней мере, одна изоформа белка 01, которая рассматривается в качестве естественного ингибитора клеточной цитотоксичности - это 01β1. Соответственно, такая изоформа белка 01 может быть введена в клетки напрямую или с использованием подходящего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, кодирующую эту изоформу: следовательно, в случае экспрессии в этих клетках эта изоформа 01 будет работать как ингибитор цитотоксичности.

Другая возможность предоставляется использованием антител, специфичных в отношении белка 01 по ингибированию его внутриклеточной сигнальной активности.

Еще одним путем подавления влияния лиганда БА8-К или ΤΝΡ является недавно разработанный рибозимный подход. Рибозимы это молекулы РНК, обладающие каталитической активностью, направленной на расщепление молекул РНК. Рибозимы могут быть искусственно сконструированы таким образом, чтобы избирательно расщеплять РНК-мишень, например, мРНК, кодирующую белок 01 по настоящему изобретению. Такие рибозимы должны характеризоваться последовательностью, специфичной в отношении мРНК белка 01 и должны быть способны взаимодействовать с ней (путем комплементрного связывания) с последующим расщеплением мРНК, в результате чего происходит уменьшение (или полное прекращение) экспрессии белка 01, а степень уменьшения экспрессии зависит от уровня интенсивности экспрессии рибозима в клетке-мишени. Для внесения в выбранную клетку рибозимов (например, в клетки, несущие рецепторы БА8-К или р55-К) может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмида, векторы на основе вирусов животных (ретровирусы), которые обычно используются для подобных целей (см. также п.1, описанный выше, где описаны вирусные векторы, включающие в качестве второй встраиваемой последовательности кДНК, кодирующую последовательность выбираемого рибозима). Как обзоры методов применения рибозимов см. Сйеп е! а1., 1992; 2йао & Р1ск, 1993; 8 йоге е! а1., 1993; Жерй & Вигке, 1993; 8й1тауата е! а1., 1993; Сап!ог е! а1., 1993; Ваппада, 1993; Сп5е11 е! а1., 1993 и Ко1/ит1 е! а1., 1993.

3). Белок 01, его аналоги, фрагменты или производные также могут быть использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же типа, т. е. тех, которые связываются с внутриклеточным доменом рецептора БА8-К или с функционально родственными рецепторами, или тех, которые связываются с вышеописанными Μ0КΤ1-связывающимися белками, или тех, которые связываются с белком Μ0ΚΤ-1 и тем самым связываются с функционально родственными рецепторами, такими, как БА8-К и р55-К, и, соответственно, вовлечены во внутриклеточные сигнальные процессы. В этом случае может быть использована вышеназванная система дигибридного дрожжевого скрининга, или может быть использована недавно разработанная система блотгибридизации по Саузерну с последующим ПЦРклонированием в нежестких условиях (\νί11<8 е! а1., 1989). В этой публикации были описаны идентификация и клонирование двух потенциальных протеинтирозинкиназ с применением Саузерн-блот-гибридизации в нежестких усло виях с последующим ПЦР-клонированием, основывающемся на известной последовательности основного киназного мотива. Такой подход может быть использован в соответствии с настоящим изобретением с использованием последовательности белка 01 при идентификации и клонировании тех белков, которые родственны ΜΟΚΤΊ-связывающимися белкам.

4) . Еще одним подходом к использованию белка 01 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению является использование их в аффинной хроматографии с целью выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они могут связываться, например, белка ΜΟΚΤ-1, Μ0ΚΤ1связывающихся белков или иных белков или факторов, вовлеченных во внутриклеточные сигнальные процессы. В случае такого применения белок 01, его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению могут быть по отдельности присоединены к матриксам для аффинной хроматографии и затем подвергнуты контакту с клеточными экстрактами или изолированными белками или факторами, которые предположительно участвуют во внутриклеточных сигнальных процессах. По окончании процедуры аффинной хроматографии другие белки или факторы, которые оказались связанными с белком 01 или с его аналогами, фрагментами или производными по настоящему изобретению, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы.

5) . Как отмечалось выше, белок 01 или его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению могут также быть использованы в качестве антигенов (иммуногенов) с целью выработки специфичных к ним антител. Эти антитела также могут быть использованы для целей очистки данного белка 01 (например, собственно 01 или любой из его изоформ) как из клеточных экстрактов, так и из линий трансформированных клеток, вырабатывающих белок 01 или его аналоги или фрагменты. Кроме того, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием систем лиганда БА8-К или ΤΝΡ, например, избыточного или недостаточного клеточного влияния, индуцируемого лигандом БА8-К или ΤΝΡ. Таким образом, при том, что такие заболевания связаны с нарушением функционирования системы внутриклеточных сигнальных механизмов, вовлекающей белок Μ0ΚΤ-1 или какие-либо другие, например, вышеназывавшиеся ΜΟΚΤΊ-связывающиеся белки или собственно белок 01, то такие антитела будут служить важным диагностическим средством.

Также необходимо отметить, что выделение, идентификация и охарактеризование белка по настоящему изобретению может быть осуществлено с использованием любой из из47 вестных стандартных процедур скрининга. Например, в качестве одной из таких процедур скрининга дигибридный дрожжевой тест, описанный в данном тексте, был использован для идентификации белка МОКТ-1 и в дальнейшем различных МОКТ1-связывающихся белков и белка 61 по настоящему изобретению. Также, как описано выше и будет описано далее, могут быть применены и другие подходы, такие как аффинная хроматография, методики гибридизации ДНК и т.п., которые хорошо известны в данной области техники в связи с выделением, идентификацией и охарактеризованием белка 61 по настоящему изобретению или с выделением, идентификацией и охарактеризованием других белков, факторов, рецепторов и подобного, которые способны связываться с белком 61 по настоящему изобретению.

Как уже указывалось выше, белок 61 может быть использован для выработки антител, специфичных в отношении белков 61, например, в отношении 61 и его изоформ. Эти антитела или их фрагменты могут быть использованы так, как это подробнее будет описано ниже, и должно быть понятно, что в таких случаях эти антитела или их фрагменты, те, которые специфичны в отношении белков 61.

Основываясь на данных настоящего изобретения о том, что, по крайней мере, некоторые из белков 61 или их возможные изоформы являются протеазами, сходными с протеазами семейства ί.ΈΟ3/Κ'Έ. для этих белков 61 и их изоформ представляется следующее специальное медицинское применение: было обнаружено, что уже существуют специфические ингибиторы других протеаз СЕЭ3/[СЕ, которые способны проникать в клетку и могут эффективно блокировать запрограммированную гибель клеток. Следовательно, в соответствии с настоящим изобретением является возможным сформировать такие ингибиторы, которые смогут предотвращать гибель клеток, индуцируемую лигандом РА8-К или ТИР, т.е. тот механизм, в котором принимает участие протеаза 61. Далее, с точки зрения уникальных параметров последовательностей этих новых протеаз 61, представляется возможным конструировать такие ингибиторы, которые были бы высокоспецифичными в отношения влияния ТИР и лиганда РА8-К на клетки. Данные настоящего изобретения также представляют путь изучения механизма, в котором уничтожающая клетки протеаза активируется в ответ на лиганд РА8-К и ТИР: соответственно, это позволяет разрабатывать лекарственные препараты, которые смогли бы контролировать степень такой активации. Существует достаточно много заболеваний, при лечении которых такие лекарства могли бы оказать значительную помощь. Среди таких заболеваний - острый гепатит, при котором острые поражения ткани печени, по-видимому, отражают гибель печеночных клеток, опосредован ную лигандом рецептора РА8-К; индуцируемая аутоиммунным ответом гибель клеток, такая как гибель β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, приводящая к диабету; гибель клеток в ходе отторжения пересаженной ткани (например, почек, сердца и печени); гибель олигодендроцитов головного мозга при рассеянном склерозе; и подавляемая при СПИДе самогибель Т-лимфоцитов, в результате чего обеспечивается размножение вируса СПИДа и, следовательно, развитие собственно СПИДа.

Как было отмечено выше, вполне возможно, что 61 или одна или большее число его возможных изоформ (например, изоформа 61 β) может служить в качестве естественного ингибитора протеазы 61 или изоформ протеазы 61, и это также можно использовать так, как было выше отмечено для специфических ингибиторов таких протеаз 61. Также другие соединения, такие как пептиды, органические соединения, антитела и т.п., могут быть подвергнуты скринингу с целью получения специфических лекарственных средств, способных ингибировать протеазы 61.

Не ограничивающий такого применения пример того, как пептидные ингибиторы протеаз 61 могли бы быть получены и скринированы, основывается на ранее проведённых исследованиях пептидных ингибиторов протеазы ΚΈ или ГОЕ-подобных протеаз, субстратной специфичности ΚΈ и стратегий анализа эпитопов с использованием синтеза пептидов. Минимальным условием для эффективного расщепления пептида протеазой ΚΈ, как было установлено, является наличие четырёх аминокислот влево от сайта расщепления при жестком предпочтении наличия остатка аспарагиновой кислоты в положении Р₁ и достаточности наличия метиламина справа от остатка Р₁ (81еаШ еί а1., 1990; Нотеатб еί а1., 1991; ТйогпЬепу еί а1., 1992). Более того, было установлено, что флуорогенный пептидный субстрат (являющийся тетрапептидом) ацетил-А5р-61и^а1-Акр-а-(4-метилкумарил-7амид) - сокращенно Ас-ЭЕ’^-АМС, - соответствующий последовательности АДФ-рибозополимеразы (РАКР), расщепляется в клетках через короткое время после стимуляции рецептора РА8-К, равно как и других апоптотических процессов (КаиТтапп, 1989; КаиТтапп еί а1., 1993; БахеЬшк еί а1., 1994), и эффективно расщепляется протеазой СРР32 (являющейся членом семейства протеаз СЕП3ЛСЕ) и протеазами МАСН (а также, вероятно, протеазами 61).

С учетом важности наличия остатка Акр в положении Р1 в составе субстрата, тетрапептиды, имеющие аспарагиновую кислоту в четвёртом положении и различное сочетание аминокислот в первых трёх положениях, могут быть быстро скринированы по связыванию с активным сайтом протеаз 61 с использованием, на49 пример, метода, разработанного Гейзеном (Сеукеп, 1985; Сеукеп е! а1., 1987), в котором большое число пептидов, прикреплённых на твёрдом носителе, скринируют на специфические взаимодействия с антителами. Связывание протеаз МАСН со специфическими пептидами может быть выявлено с помощью различных хорошо известных специалистам в данной области техники методов, таких как изотопное мечение протеаз С1 и т.п. Было показано, что с применением этого метода по Гейзену можно протестировать, по крайней мере, 4000 пептидов за один рабочий день.

Поскольку определенные преимущества может иметь конструирование пептидных ингибиторов, которые избирательно подавляют протеазы С1 без каких-либо помех физиологическим процессам, связанным с гибелью клеток, в которых участвуют другие члены семейства протеаз СЕЭ3/1СЕ, пул пептидов, связывающихся с протеазами С1, для анализа в таком тесте, который был описан выше, может быть синтезирован в дальнейшем в виде флуорогенного пептидного субстрата, предназначенного для тестирования избирательного расщепления протеазами С1 при отсутствии расщепления другими протеазами семейства СЕЭ3/1СЕ. Пептиды, для которых определено избирательное расщепление протеазами С1, могут затем быть модифицированы с целью усиления внутриклеточной проницаемости и ингибирующей активности в отношении С1-опосредуемой гибели клеток, как в обратимом, так и в необратимом режиме действия. Торнберри с соавт. (ЛйогпЬеггу е! а1., 1994) сообщили, что тетрапептид(ацилокси)метилкетон Ас-Туг-Уа1-Л1а-Л5рСН₂ОС (О)-[2,6-(СЕ₃)₂] Рй является сильным инактиватором протеазы 1СЕ. Сходным образом Миллиген с соавт. (М1Шдап е! а1., 1995) сообщили, что тетрапептидные ингибиторы, включающие хлорметилкетоновую или альдегидную группы, соответственно, необратимо и обратимо ингибируют протеазу 1СЕ. Кроме того, было показано ингибирование 1СЕ бензилоксикарбоксил-Акр-СН₂ОС(О)-2,6-дихлорбензолом (Όί’Β) (МакЫша е! а1., 1995). Соответственно тетрапептиды, избирательно связывающиеся с протеазами С1, могут быть модифицированы с использованием, например, альдегидной группы, хлорметилкетоновой, (ацилокси)метилкетоновой или СН₂ОС(О)-ЭСВ-групп при решении задачи создания пептидного ингибитора активности протеазы С1.

Поскольку некоторые специфические ингибиторы других протеаз семейства СЕЭ3/1СЕ характеризуются внутриклеточной проницаемостью, то внутриклеточная проницаемость пептидных ингибиторов нуждается в усилении. Например, пептиды могут быть модифицированы или превращены в свои производные химическим путем с целью усиления их проницаемости через клеточную мембрану и облегчения транспортировки таких пептидов через мембрану в цитоплазму. Мураниши с соавт. (МигашкЫ е! а1., 1991) сообщили о получении производного тиротропинового рилизинг-гормона с использованием лауриновой кислоты с образованием липофильного лауроильного производного, обладавшего хорошими характеристиками прохождения через клеточные мембраны. Закария с соавт. (2асйапа е! а1., 1991) также сообщили, что окисление метионина в сульфоксид и замещение пептидной связи его кетометиленовым изоэфиром (СОСН₂) приводит к облегчению транспорта пептида через клеточную мембрану. Имеется ряд модификаций производных, которые хорошо известны специалистам в данной области техники.

Кроме того, лекарство или пептидные ингибиторы, которые способны подавлять активность С1 в отношении гибели клеток, или их возможные изоформы могут быть соединены или включены в комплексы вкупе с молекулами, которые обеспечат более лёгкое проникновение внутрь клетки.

Патент США 5149782 представляет соединение молекулы, предназначенной для транспортировки через клеточную мембрану, с мембрано-сочетающимся агентом, таким как слитогенные полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды и жирные кислоты с длинной цепью, например, миристиновая кислота и пальмитиновая кислота. Эти сочетающиеся с мембраной агенты встраивают молекулярный конъюгат внутрь липидного бислоя плазмалеммы и облегчают его проникновение в цитоплазму.

Лоу с соавт. (Боте е! а1.) в патенте США 5108921 рассматривают приемлемые способы трансмембранной доставки молекул, таких как (не ограничиваясь этим) белки и нуклеиновые кислоты, основанные на механизме опосредованной рецепторами эндоцитозной активности. Эти рецепторные системы являются системами, распознающими галактозу, маннозу, маннозо-6фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин Βι₂), α-2-макроглобулины, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕСЕ). Лоу с соавт. указывает, что пищевые рецепторы, такие как рецепторы биотина и фолатов, могут преимущественно использоваться для интенсификации транспорта через клеточную мембрану, благодаря особенностям локализации и многочисленности биотиновых и фолатных рецепторов на поверхности большинства клеток и связанных с этими рецепторами процессами трансмембранного транспорта. Таким образом, комплекс, образованный соединением, предназначаемым для транспортировки в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, контактируют с клеточной мембраной, несущей биотиновые или фолатные рецепторы с целью инициации механизма трансмембранного транспорта, опосредованного этими рецепторами, тем самым обеспечивая вхождения желательного соединения в клетку.

Для протеазы 1СЕ известна способность к толерантности по отношению к свободному замещению по положению Р₂, и такая толерантность к свободным замещениям была использована при разработке эффективной, высокоизбирательной аффинной метки, содержащей биотин (ГйогнЬеггу е! а1., 1994). Соответственно, положение Р₂, равно как и, по-видимому, Ν-конец тетрапептидного ингибитора могут быть модифицированы или использованы для получения производных соединений, например, путем присоединения молекулы биотина, с целью усиления проницаемости этих пептидных ингибиторов через клеточную мембрану.

Кроме того, в данной области техники известно, что слияние желательной пептидной последовательности с сигнальной (лидерной) пептидной последовательностью с получением химерного полипептида может быть использовано для транспортировки такого химерного полипептида через клеточную мембрану в цитоплазму этой клетки.

Как должно быть хорошо понятно специалистам, изучающим пептиды, подразумевается, что пептидные ингибиторы протеолитической активности в соответствии с настоящим изобретением должны включать пептидомиметические лекарственные средства или ингибиторы, которые могут быть подвергнуты быстрому скринингу по связыванию с протеазой С1 с целью получения по возможности наиболее стабильных ингибиторов.

Также должно быть понятно, что такие же способы облегчения или усиления транспорта пептидных ингибиторов через клеточные мембраны, которые обсуждались выше, также применимы в отношении самого белка С1 или самих его изоформ, равно как и других белков и пептидов, которые проявляют своё влияние внутри клеток.

Что касается антител, упоминаемых на протяжении настоящего текста, термин антитело включает в себя поликлональные антитела, моноклональные антитела (тАЬк), химерные антитела, антиидиопатические (анти-1б) антитела к антителам, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, равно как и их фрагменты, полученные любым из известных методов, таких как (не ограничиваясь этим) ферментное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные технологии.

Поликлональные антитела - это гетерогенные популяции молекул антител, выделенных из сыворотки животных, иммунизованных какимлибо антигеном. Моноклональное антитело включает, по существу, гомогенную популяцию антител, специфичных в отношении антигенов, при том, что эти популяции включают, по существу, сходные эпитопы сайтов связывания. Мо ноклональные антитела могут быть получены с использованием методов, известных специалистам в данной области техники: см., например, Кой1ег & М11к!ет, 1975, \а1иге. 256, 495-497; патент США 4376110; АикиЬе1 е! а1., ебк. Наг1оте & Йапе 1988, АпйЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬ. и СоШдап е! а1., Сиггеп! РгоЮсо1к ίη 1ттипо1оду. ебк. Сгеепе РиЬ1. Аккос. & \УПеу 1п1ег8С1епсе, ΝΥ (1992-96), полное содержание которых привлечено в данном тексте в виде ссылок. Такие антитела могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов - 1дС, 1дМ, 1дЕ, 1дА, С1ЙЭ - и любому их подклассу. Гибридомы, вырабатывающие моноклональные антитела по настоящему изобретению, могут культивироваться ίη уйго, ίη кйи или ίη у1уо. Получение высоких титров моноклональных антител ίη уйго или ίη кйи делает такой подход более предпочтительным для их получения.

Химерные антитела являются молекулами, в составе которых различные части происходят от разных видов животных, например, такие как антитела, включающие вариабельные домены, выделенные из моноклональных антител мыши, и константные домены иммуноглобулинов человека. Химерные антитела, в первую очередь, используются для снижения иммуногенности при их применении и для увеличения выхода продукта, например, когда мышиные моноклональные антитела характеризуются более высоким выходом из гибридов, но более высокой иммуногенностыо в клетках человека, поэтому химерные человеко-мышиные моноклональные антитела и могут быть использованы. Химерные антитела и способы их получения хорошо известны в науке: СаЬШу е! а1., 1984, Ргос. №111. Асаб. 8с! И8А, 81, 3273-3277; Могпкоа е! а1., 1984, Ргос. Νίώ. Асаб. 8с1. И8А, 81, 68516855; Воийате е! а1., 1984, ΝιΙιιιό, 312, 643-646; СаЬ111у е! а1., заявка на европейский патент № 125023 (опубликована 14 ноября 1984 г.); №иЬегдег е! а1., 1985, ΝιΙιιιό, 314, 268-270; Τηηφικίιί е! а1., заявка на европейский патент № 171496 (опубликована 19 февраля 1985 г.); Мотков е! а1., заявка на европейский патент № 173494 (опубликована 5 марта 1986 г.); №иЬегдег е! а1., заявка РСТ \УО 8601533 (опубликована 13 марта 1986 г.); Кибо е! а1., заявка на европейский патент № 184187 (опубликована 11 июня 1986 г.); 8айадан е! а1., 1986, 1. Iттиηо1, 137, 10661074; КоЬшкоп е! а1., заявка на международный патент XVО 8702671 (опубликована 7 мая 1987 г.); Ь1и е! а1., 1987, Ргос. №й1. Асаб. 8с! И8А, 84, 3439-3443; 8ип е! а1., 1987, Ргос. Νη11. Асаб. 8с! И8А, 84, 214-218; Ве!!ег е! а1., 1988, Зсюпсс, 240: 1041-1043; и Наг1оте & Ьам, АпйЬо61ск: А ЬаЬога!огу Маша! цитировано выше. Эти работы полностью включены в данный текст в виде ссылок.

Антиидиотипическое (анти-1б) антитело это антитело, которое распознаёт уникальные детерминанты, в принципе связанные с антиген53 связывающим сайтом антитела. Антиидиотипическое антитело может быть приготовлено путем иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, инбредной линии мышей) в качестве источника моноклонального антитела, по отношению к которому получают антиидиотипическое антитело. Иммунизованное животное должно распознавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путём выработки антитела по отношению к этим идиотипическим детерминантам (анти-Ιά антитело). См., например, патент США 4699880, который включен в виде ссылки.

Антиидиотипическое антитело также может быть получено в виде иммуногена с целью индукции иммунного ответа еще в одном животном, вырабатывающем т.н. антиантиидиотипическое антитело. Антиантиидиотипическое антитело может быть по параметрам эпитопа идентичным исходному моноклональному антителу, которое индуцировало анти-Ιά. Таким образом, с помощью использования антител к идиотипическим детерминантам моноклонального антитела возможным является идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела, которые обладают идентичной специфичностью.

Соответственно, моноклональные антитела, сформированные к белкам 61, их аналогам, фрагментам или производным по настоящему изобретению, могут быть использованы для индукции антиидиотипических антител в подходящих животных, таких как мыши линии ΒΑΕΒ/с. Клетки селезенки таких иммунизованных мышей используют для получения анти-Ιά гибридом, секретирующих антиидиотипические моноклональные антитела. Далее, антиидиотипические моноклональные антитела могут быть соединены с носителем, таким как гемоцианин слизня (КЬН), и использованы для иммунизации новых мышей линии ΒΑΕΒ/с. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-антиидиотипические антитела, которые обладают свойствами связываться с исходным моноклональным антителом, специфичным в отношении эпитопа вышеописанного белка 61 или его аналогов, фрагментов или производных.

Антиидиотипические моноклональные антитела, таким образом, обладают своими собственными идиотипическими эпитопами, т. е. идиотопами, сходными по структуре с эпитопом, который оценивали, таким как 6ΚΒ белка-а.

Термин антитело также обозначает как интактные молекулы, так и их фрагменты, такие как, например, ЕаЬ и Е(аЬ')2, которые способны связываться с антигеном. Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2 лишены Ес-домена интактного антитела, легче освобождаются из циркуляции и могут обладать меньшим уровнем неспецифического тканевого связывания в сравнении с интактным антителом (\Уа111 е! а1., 1983, 1. №с1. Μеά., 24, 316-325).

Должно быть понятно, что ЕаЬ и Е(аЬ')2 и другие фрагменты антител, применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы для выявления и количественнного анализа белка 61 в соответствии со способами, описанными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают путем протеолитического расщепления, используя такие ферменты, как папаин (при получении фрагментов ЕаЬ) или пепсин (при получении фрагментов Е(аЬ')2).

Если говорится, что антитело способно к связыванию, то это означает способность специфически реагировать с молекулой таким образом, что происходит связывание этой молекулы с антителом. Термин эпитоп обозначает ту часть любой молекулы, которая может быть связана антителом и которая также может распознаваться этим антителом. Эпитопы или антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, равно как и специфическими параметрами заряда.

Антиген - это молекула или часть молекулы, способная быть связанной с антителом и к тому же способная индуцировать у животного выработку антитела, способного связываться с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь или один, или большее число эпитопов. Специфическая реакция, упоминавшаяся выше, обозначает, что антиген будет реагировать при соблюдении высокого уровня избирательности с соответствующим ему антителом и с одним из множества других антител, которые могут связываться другими антигенами.

Антитела, включая фрагменты антител, применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы для качественного и количественного иного выявления белка 61 в пробе или для выявления присутствия клеток, которые экспрессируют белок 61 по настоящему изобретению. Это может сопровождаться иммунофлуоресцентными методиками, использующими помеченное флуоресцентным образом антитело (см. ниже), сопряжённое с применением световой микроскопии, проточной цитометрии или флуорометрии для такого выявления.

Антитела (или их фрагменты), применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы на гистологическом уровне с применением иммунофлуоресцентного или иммуноэлектронного микроскопов для выявления ίη 81!и белка 61 по настоящему изобретению. Выявление ίη я!и может сопровождаться выделением гистологического образца у пациента и переноса помеченного флуоресцентным способом антитела на такой образец. Предпочтителен перенос антитела (или фрагмента) путем внесения помеченного антитела (или фрагмента) в биологический образец. Путем использования такой процедуры становится возможным определить не только присутствие белка 61, но и оценить его распределение в исследуемой ткани. С использованием настоящего изобретения специалисты в данной области техники могут легко понять, что любой из большой группы гистологических методов (таких как методики окрашивания тканей) могут быть модифицированы с целью проведения подобного выявления ίη δίΐιι.

Такие тесты на выявление белка 61 по настоящему изобретению обычно включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт, свежеполученные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые инкубировались в тканевой культуре, в присутствие маркируемого помеченного антитела, способного идентифицировать белок 61 и выявление антитела любым из ряда методов, хорошо известных в данной области техники.

Биологический образец может быть обработан с помощью твердой подложки или носителем, таким как нитроцеллюлоза, или иной твердой подложкой или носителем, которые способны иммобилизовать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Подложка или носитель могут затем быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой выявляемым помеченным антителом в соответствии с настоящим изобретением, так, как это было описано выше. Твердофазная подложка или носитель могут затем быть промыты буфером во второй раз с целью удаления несвязавшегося антитела. Количество связанной метки на упомянутых твёрдой подложке или носителе может быть затем определено с помощью стандартных методик.

Под твердофазной подложкой, твердофазным носителем, твердой подложкой, твердым носителем, подложкой или носителем понимаются любые подложки или носители, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирен, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон-амилазы, естественные и синтетические целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Природа носителя может быть или частично растворимой, или он может быть нерастворимым, исходя из целей настоящего изобретения. Материал подложки визуально может иметь любую возможную структурную конфигурацию до тех пор, пока присоединённая молекула способна связывать антиген или антитело. Таким образом, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, шарообразной, цилиндрической, как внутренняя поверхность тестпробирки или внешняя поверхность палочки. С другой стороны, поверхность может быть плоской, такой как у пластинки, тест-ленты и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистиреновые гранулы (шарики). Специалисты в данной области техники могут подобрать другие подходящие носители для связывания антигена или антитела, или же могут это установить с помощью рутинных экспериментов.

Активность по связыванию данного набора антител, в соответствии с вышеизложенным в настоящем изобретении, может быть определена с использованием хорошо известных методов. Специалисты в данной области техники могут определить условия проведения быстрых и оптимальных тестов для каждого из определений, исходя из проведения рутинных экспериментов.

Другие этапы, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрование и подобное может быть добавлено в тесты так, как рекомендуется производителями или требуется конкретной ситуацией.

Одним из способов, которым антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть помечены, является соединение антитела с ферментом с использованием в ферментативном иммунотестировании (Е1Л). Этот фермент, в свою очередь, когда впоследствии подвергается воздействию соответствующего субстрата, будет реагировать с этим субстратом таким образом, чтобы образовывать химический компонент, который может быть выявлен, например, спектрофотометрически, флуорометрически или визуально. Ферменты, которые могут быть использованы для выявления помеченных антител, включают, не ограничиваясь этим, малатдегидрогеназу, нуклеазу стафилококка, изомеразу Д5-стероидов, алкогольдегидрогеназу дрожжей, α-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу редьки, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, βгалактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Выявление может сопровождаться колориметрическим методом, который основан на использовании субстрата, хромогенного для данного фермента. Выявление также может сопровождаться визуальным сравнением степени ферментной реакции субстрата в сравнении со стандартами, приготовленными аналогичным образом.

Выявление может сопровождаться использованием любого из ряда других иммунотестов. Например, путём применения изотопного мечения антител или фрагментов антител становится возможным выявлять В-РТРазу с применением В1Л (радиоиммуноанализа). Качественное описание метода ΚΙΑ можно найти в руководстве ЬаЬогаШгу Τесйη^^ие8 & Вюсйешгайу ίη Μο1еси1аг Вю1оду (Аогк, Τ.8. е1 а1., 1978, ΝοΠίι

Но11апб РиЬ1. Со., ΝΥ) с конкретным вниманием к разделу, озаглавленному Введение в радиоиммунный анализ и сходные методики, написанному Т. Чардом (Т. СНагб), включенному здесь в виде ссылки. Радиоактивные изотопы могут быть выявлены такими способами, как использование счетчика Гейгера или сцинтилляционного счетчика, или с помощью авторадиографического анализа.

Также возможным является пометить антитело в соответствии с настоящим изобретением с помощью флуоресцентного соединения. Когда помеченное флуоресцентным способом антитело подвергают воздействию света с подходящей длиной волны, его присутствие может быть выявлено по флуоресценции. Среди наиболее часто используемых для мечения флуоресцентных соединений - флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллоцикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин.

Антитело также может быть выявлено путем мечения с использованием флуоресцирующих металлов-эмитентов, таких как ¹⁵²Еи или других из группы лантаноидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких хелатируюших металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА).

Антитело также может быть получено путем его соединения с хемолюминисцентным веществом. Затем присутствие помеченного по хемолюминисцентному типу антитела определяют путем выявления наличия люминисценции, которая возникает в процессе прохождения химической реакции. Примерами конкретно применяемых для мечения хемолюминисцирующих соединений являются, люминол, изолюминол, тероматический акридиновый эфир, имидазол, акридиновая соль и щавелевый эфир.

Также для мечения антитела по настоящему изобретению могут быть использованы биолюминисцентные соединения. Биолюминисценция является вариантом хемолюминисценции, обнаруживаемым в биологических системах, в которых обладающий каталитической активностью белок повышает эффективность хемолюминисцентной реакции. Присутствие биолюминисцентного белка определяют по выявлению наличия люминисценции. Важными биолюминицентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и экворин.

Молекула антитела по настоящему изобретению может быть адаптирована для использования в иммунометрическом тестировании, также известном как двухсайтовое или сэндвич-тестирование. В типичном иммунометрическом тесте некоторое количество непомеченного антитела (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или носителем и некоторое количество помеченного растворимого антитела добавляют таким образом, чтобы было возможно выявлять и(или) количественно оце нивать тройной комплекс между антителом на твёрдой фазе, антигеном и помеченным антителом.

Обычно и предпочтительно иммунометрические тесты включают форвардтесты, в которых антитело, связанное с твердой фазой, в первую очередь, контактирует с тестируемым образцом с целью выделения антигена из образца и образования бинарного комплекса антигенантитело в твердой фазе. После подходящего периода инкубации твёрдую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкой пробы, включая непрореагировавший антиген, если он остался, и затем контактируют с раствором, содержащим неизвестное количество помеченного антитела (которое функционирует в качестве репортерной молекулы). После периода второй инкубации, необходимой для формирования комплекса помеченного антитела и антигена, связанного с твёрдой подложкой или носителем через непомеченное антитело, твёрдую подложку или носитель промывают во второй раз с целью удаления непрореагировавшего помеченного антитела.

Другой тип сэндвич-метода, который также может быть использован с антигенами по настоящему изобретению, - это применение так называемых одновременных и обратных тестов. Одновременный тест включает однократный этап инкубации, в котором и антитело, связанное с твёрдой подложкой или носителем, и помеченное антитело добавляют к тестируемому образцу в одно и то же время. После завершения инкубации твердую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкого образца и не вошедшего в состав комплекса помеченного антитела. Присутствие помеченного антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, затем определяют так, как это осуществляется в стандартном форвард-сэндвич-тесте.

В обратном тесте используется постепенное добавление сначала раствора помеченного антитела к жидкому образцу с последующим добавлением непомеченного антитела, связанного с твердой подложкой или носителем после подходящего периода инкубации. После второй инкубации твердую подложку промывают стандартным образом до освобождения ее от остатков тестируемого образца и раствора непрореагировавшего помеченного антитела. Определение помеченного антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, затем осуществляют так же, как и в одновременном и форвард-тестах.

Белки 61 по настоящему изобретению могут быть получены с применением любой из существующих стандартных процедур рекомбинантной ДНК (см., например, ЗатЬгоок е1 а1.,

1989 и АикиЬе1 е! а1., 1987-95, цитировано выше), в которых подходящие эукариотические и прокариотические клетки-хозяева, хорошо из59 вестные в данной области техники, трансформируют с использованием подходящих эукариотических и прокариотических векторов, включающих последовательности, кодирующие данные белки. Соответственно, настоящее изобретение также касается таких экспрессирующих векторов и трансформированных организмовхозяев, предназначенных для выработки этих белков по настоящему изобретению. Как отмечалось выше, эти белки также включают их активные аналоги, фрагменты и производные, и таким образом векторы, кодирующие их, также включают векторы, кодирующие аналоги и фрагменты этих белков, а трансформированные организмы-хозяева включают такие, которые вырабатывают эти аналоги и фрагменты. Производные этих белков, вырабатываемые такими трансформированными организмами-хозяевами, являются производными, полученными путем стандартной модификации этих белков или их аналогов или фрагментов.

Настоящее изобретение также касается фармацевтических композиций, включающих рекомбинантные векторы на основе вирусов животных, кодирующие белки 61, так, что такой вектор также кодирует поверхностный вирусный антиген, способный связываться на специфической клетке-мишени (например, на опухолевых клетках) с поверхностными белками с целью направления внесения последовательностей белков 61 внутрь клеток. Дополнительно фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают в качестве активного компонента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность по отношению к последовательности, кодирующей белок 61, или (Ь) лекарства, которые блокируют протеолитическую активность белка 61 или его изоформ.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают количество активного компонента, достаточное для достижения поставленной перед ним цели. Дополнительно фармацевтические композиции могут включать подходящие, фармацевтические приемлемые носители, включающие наполнители и подходящие компоненты, которые облегчают процессинг активных компонентов в составе препаратов, которые могут быть использованы фармацевтическими способами и которые могут стабилизировать такие препараты, предназначенные для введения пациентам, которые в них нуждаются, в соответствии с хорошо известными специалистам в данной области техники приемами.

Белок 61 и его изоформы или изотипы, как предполагается, должны экспрессироваться в различных тканях на отчётливо неодинаковом уровне и, по-видимому, при различных параметрах изотипов аналогично экспрессии белка МАСН и его различных изотипов, как это описано в упомянутых выше совместных, находя щихся на стадии рассмотрения заявках. Эти различия могут, по-видимому, обусловливать тканеспецифичные параметры ответа на лиганд ΡΑ8/ΑΡ01 и ΊΝΓ. Как и в случае с другими гомологами СЕЭ3/1СЕ (ЭДапд е1 а1., 1994; Αίικιηπ е1 а1., 1995), заявители ранее уже показали (в соответствии с вышеупоминавшимися патентными заявками), что у изоформ МАСН, которые включают неполные сегменты гомологии с СЕЭ3/1СЕ (например, МАСНа3), обнаруживается эффект ингибирования активности одновременно экспрессирующихся молекул МΑСΗα и МАСНа2; для них тоже было установлено блокирование индукции гибели с участием ΡΑ8/ΑΡ01 и р55-К. Экспресия таких ингибиторных изоформ в клетках может определять механизм клеточной самозащиты от цитотоксичности, опосредуемой ΡΑ8/ΑΡ01 и ТИЕ. Аналогичный ингибиторный эффект также предполагается, по крайней мере, у одной из изоформ белка 61. Высокий уровень гетерогенности изоформ МАСН и также предполагаемая аналогичная гетерогенность изоформ 61, которая по уровню существенно превосходит гетерогенность изоформ любых других протеаз семейства СЕО3/1СЕ, должны позволять осуществление тонкой настройки функций активных изоформ МАСН, а по аналогии также и у активных изоформ 61 в соответствии с настоящим изобретением.

Также возможным является то, что некоторые из вероятных изоформ 61 проявляют иные функции. Например, ранее обнаруженная заявителями (что отмечалось выше), способность МΑСΗβ1 связываться и с МОКТ-1, и МΑСΗα1 подтверждает, что эта изоформа может действительно усиливать активность каталитически активных изоформ. Средняя цитотоксичность, наблюдаемая в культурах линий 293-ΞΒΝΑ и МСΡ7, трансфицированных этой изоформой, и более существенный цитотоксический эффект, который проявляется в клетках НеЬа, по-видимому отражает активацию эндогенно экспрессируемых молекул МАСНа по связыванию с трансфицированными молекулами МΑСНβ1. Возможно, некоторые из изоформ МАСН также могут действовать как депосайты для молекул, которые участвуют в других, не связанных с цитотоксичностью, проявлениях рецепторов ΡΑ8/ΑΡ01 и ТИЕ. Следовательно, аналогичным образом белок-61 и(или) его изоформы также могут обладать такой же усиливающей активностью или служить в качестве депо-сайтов для других таких молекул.

Благодаря уникальной способности рецепторов ΡΑ8/ΑΡ01 и ТИЕ обусловливать гибель клеток, равно как и способности рецепторов

ТИР опосредовать другие типы активности, связанные с повреждениями тканей, нарушения функций этих рецепторов могут быть отрицательными для организма. Тем не менее, и для избыточной, и для недостаточной функций этих рецепторов было продемонстрировано участие в патогенезе некоторых заболеваний (Уакка111, 1992; №1§а1а & 6о1к!еш, 1995). Идентификация молекул, которые участвуют в сигнальной функции рецепторов и обнаружение путей модуляции активности таких молекул могут привести к новым лечебным подходам. С точки зрения предполагаемой ключевой роли белка 61 в токсичности, опосредуемой Е А δ/АРО 1 и ΤΝΕ, представляется важным создавать лекарственные средства, которые бы блокировали возможную протеолитическую функцию белка 61, что ранее было уже сделано для других белков из состава семейства СЕЭ3/1СЕ (ПюгпЬеггу е! а1., 1994; Μί1^Γ е! а1., 1995; Μакй^та е! а1., 1995; Μ^11^даη е! а1., 1995; Епап е! а1., 1995; Ьок е! а1., 1995). Уникальные параметры последовательности гомолога СЕЭ3/1СЕ, по-видимому, присутствующего в молекулах 61, могут позволить приготовить лекарственные средства, которые специфическим образом подавляли бы их активность. Такие лекарства могут обеспечивать защиту от избыточной, связанной с иммунитетом цитотоксичности с участием 61 без какихлибо помех физиологическим процессам клеточной гибели, в которых принимают участие другие протеазы семейства СЕЭ3/1СЕ.

Другие аспекты настоящего изобретения будут видны из нижеследующих примеров.

Теперь изобретение будет более подробно описывать следующие, не являющиеся его ограничением, примеры и сопутствующие им чертежи.

Также надо заметить, что следующие процедуры: (ί) дигибридный скрининг и дигибридный тест на экспрессию β-галактозидазы; (ίί) индуцированная экспрессия, метаболическое мечение и иммунопреципитация белков; (ш) связывание ш νί!Γο; (ίν) оценка цитотоксичности; и (ν) Нозерн-блоттинг и секвенирование, перечисленные ниже в ссылочных примерах 1 (см. также Во1бш е! а1., 1995Ь), 2 и 3 (см. также Во1б1п е! а1., 1996), по отношению к ΜΟΚΤ-1 и ΜΟΚΤΊ-связывающимся белкам (например, МАСН) соответственно, в равной степени применимы (с некоторыми модификациями) для соответствующего выделения, клонирования и охарактеризования 61 и его вероятных изоформ по настоящему изобретению. Эти процедуры, таким образом, должны быть приняты как полное представление таких процедур, использовавшихся для выделения, клонирования и охарактеризования 61 в соответствии с настоящим изобретением, что детально рассмотрено ниже в примере 1. (Приведенные ниже ссылочные примеры 1-3 также даны в форме, сходной или эквивалентной той, которая характерна для совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявок на израильский патент №№ 114615, 114986, 115319, 116588 и 117932, равно как и для соответствующей РСТ-заявки № РСТ/υδ

96/10521). Более того, в вышерасположенном разделе Краткое описание чертежей уже были включены некоторые подробности экспериментальных процедур, осуществлённых в соответствии с настоящим изобретением, и они образуют часть нижеприведённого примера 1 с точки зрения полного представления настоящего изобретения, соответственно, и должны рассматриваться вместе с тем, что изложено в примере 1.

Ссылочный пример 1. Клонирование и выделение белка ΜΟΚΤ-1, который связывается с внутриклеточным доменом рецептора ЕА8-К (ί) Дигибридный скрининг и дигибридный тест на экспрессию β-галактозидазы.

С целью выделения белков, взаимодействующих с внутриклеточным доменом рецептора ЕА8-К, была использована дигибридная дрожжевая система (Е1е1бк & 8опд, 1989). Коротко, эта дигибридная система является основанным на дрожжах генетическим тестом, предназначенным для выявления специфических межбелковых взаимодействий ш νίνο путем восстановления эукариотического активатора транскрипции, такого как 6АЬ4, который включает два разделенных домена - ДНК-связывающего и активаторного доменов; эти домены в случае экспрессии взаимосвязывания образуют восстановленный белок 6АЬ4 и способны связываться с вышерасположенной активаторной последовательностью, которая, в свою очередь, активирует промотор, который контролирует экспрессию гена-репортера, такого как 1ас2 или Н183, экспрессия которого может быть легко выявлена в культивируемых клетках. В этой системе гены, кодирующие предполагаемые взаимодействующие белки, клонируют в отдельные экспрессирующие векторы. В составе одного экспрессирующего вектора последовательность гена одного из предполагаемых белков клонирована наряду с последовательностью, кодирующей ДНК-связывающий домен 6АЬ4 с целью образования гибридного белка, имеющего в составе ДНК-связывающий домен 6АЬ4; в составе другого вектора имеется последовательность, кодирующая второй предполагаемый белок наряду с последовательностью, кодирующей активаторный домен 6АЬ4 с целью получения гибридного белка, включающего активаторный домен 6АЬ4. Два гибридных вектора затем одновременно трансформируют в клетки-хозяева дрожжей штамма, несущих ген-репортер 1;·κΖ или Н183, находящийся под контролем промоторного сегмента, имеющего сайты связывания 6АЬ4. Только те трансформированные клеткихозяева (котрансформанты), в которых два гибридных белка экспрессированы и способны взаимодействовать друг с другом, оказываются способными экспрессировать ген-репортер. В случае использования гена-репортера 1·κΖ клетки-хозяева, экспрессирующие этот ген, окрашиваются в синий цвет при добавлении в культу63 ральную среду Х-да1. Следовательно, синие колонии являются индикаторами того факта, что два клонированных белка-кандидата способны взаимодействовать друг с другом.

С использованием дигибридной системы внутриклеточный домен РА8-1С был отдельно клонирован в состав вектора р0ВТ9 (несущий последовательность, кодирующую ДНКсвязывающий домен 0АЬ4, предоставленную С1оп!есЕ, США, см. ниже) с целью получения слитого белка, включающего ДНК-связывающий домен 0АЬ4. Для клонирования РА8-Н в состав р0ВТ9 был использован клон, кодирующий полноразмерную последовательность кДНК РА8-Н (\УО 95/31544), из состава которого внутриклеточный домен (1С) был вырезан с применением стандартных процедур с использованием различных рестриктаз, затем выделен с применением стандартных процедур и встроен в вектор р0ВТ9, открытый по своим множественным сайтам клонирования (МС8) с использованием соответствующих подходящих рестриктаз. Необходимо заметить, что домен РА81С занимает аминокислотные остатки 175-319 интактного РА8-Н; этот сегмент, включающий аминокислоты 175-319, являющиеся доменом РА8-1С, и был встроен в состав вектора р0ВТ9.

Описанный выше гибридный (химерный) вектор затем котрансфицировали наряду с элементами библиотеки кДНК клеток НеЬа человека, клонированными в вектор р0Λ^-0Н, несущий активаторный домен САЕД, в клеткихозяева дрожжей штама НР7с (все вышеназванные векторы р0ВТ9 и р0АП-0Н, включающий части библиотеки кДНК клеток НеЬа, а также штамм дрожжей, были приобретены в фирме С1оп!есЕ ЬаЬ. 1пс., США, в виде компонентов дигибридной системы Ма!сЕтакег № РТ1265-1). Котрансфицированные дрожжи выбирали по их способности расти в среде без гистидила (Н18 среда), выращенные колонии выявлялись положительными трансформантами. Выбранные дрожжевые клоны затем тестировали по их способности экспрессировать ген ΕκΖ, т.е. по активности ЕАС^ у них, которую определяли добавлением Х-да1 в культуральную среду, который катаболизировался β-галактозидазой (ферментом, кодируемым геном ΕκΖ) в окрашенный в синий цвет продукт. Таким образом, синие колонии являются индикатором активного гена Ε^Ζ. Для обеспечения активности гена 1;κΖ необходимым является то, чтобы активатор транскрипции 0АЕ4 присутствовал в активной форме в составе трансформированных клонов, а именно, чтобы ДНК-связывающий домен СΛ^4. кодируемый вышеобозначенным гибридным вектором, точно сочетался с активаторным доменом СΛ^4. кодируемым другим гибридным вектором. Такое сочетание возможно только тогда, когда два белка, слитых с каждым из доменов СΛ^4. способны стабильно взаимодействовать (связываться) друг с другом. Таким образом, гистидин-позитивные и синие (^АСΖ⁺) колонии, которые были выделены, - это колонии, которые были котрансфицированы вектором, кодирующим домен РА8-1С, и вектором, кодирующим белковый продукт, связанный происхождением с клетками НеЬа человека, способный стабильно связываться с РА8-1С.

Плазмидная ДНК из вышеназванных дрожжевых колоний с Н1з⁺, ^АСΖ⁺ была выделена и элекропорирована в клетки Р.соб штамма НВ 101 с помощью стандартных процедур с последующим отбором трансформантов Ьеи⁺ и ампициллин-резистентных: эти трансформанты являются теми, которые несут гибридный вектор р0Λ^-0Н, который включает кодирующие последовательности и Атр^Н и Ьеи2. Такие трансформанты, таким образом, являются клонами, несущими последовательности, кодирующие новые идентифицированные белки, способные связываться с РА8-1С. Затем плазмидную ДНК выделяли из этих трансформированных клеток Р.соб и повторно тестировали путем (a) их ретрансформации с использованием исходной гибридной плазмиды, включающей внутриклеточный домен РА8-Н (гибридная плазмида р0ВТ9, несущая РА8-1С) штамма дрожжей НР7 так, как это было описано выше. В качестве контроля векторы, несущие постороннюю белок-кодирующую последовательность, например, р0ВТ9 или рАСТ-ламин, использовали для котрансформации вместе с плазмидой, кодирующей РА8-1С-связывающийся белок (т.е. МОНТ-1). Затем котрансформированные клетки дрожжей тестировали по росту в безгистидиновой среде без или с различным содержанием 3-аминотриазола; и (b) ретрансформации плазмидной ДНК и исходной гибридной плазмиды с РА8-1С и контрольных плазмид, описанных в п.(а), в дрожжевые клетки-хозяева штамма 8ΡΥ526 и анализ активности ЕАС^' эффективность образования β-галактозидазы, т.е. окрашивание в синий цвет).

Результаты вышеописанных тестов показали, что параметры роста колоний на среде без гистидина были идентичными параметрами активности ^ΛСΖ. оценивавшимися по появлению окрашенности колоний: т.е. колонии Н1з⁺ оказывались тоже ЕАС^'. Далее активность Б АСУ в жидкой культуре (как предпочтительных условиях культивирования) оценивали после трансфекции гибридами, кодирующими ДНКсвязывающий и активаторный домены СΛ^4. клеток-хозяев дрожжей штамма 8ΡΥ526, которые характеризуются лучшей индуцируемостью ^АСΖ при участии транскрипционного активатора 0АЕ4 по сравнению с таковым процессом в клетках-хозяевах дрожжей штамма НР7.

С использованием вышеописанной процедуры был идентифицирован, выделен и охарактеризован белок, первоначально названный

НЕ1, а теперь обозначаемый как ΜΟΚΤ-1 - ’^еάίαΙΟΓ о£ ^есеρΐо^-^ηбисеб ΙοχίάΙν (медиатор индуцируемой рецепторами токсичности).

Более того, также необходимо отметить, что в ряде вышеописанных дигибридных тестов на экспрессию β-галактозидазы эта экспрессия также оценивалась в являющемся предпочтительным фильтрационном тесте. Проведенный скрининг показал, что пять из 3 миллионов кДНК содержали вставку ΜΟΚΤ-1. Затем совместно выделенные клонированные вставки кДНК ΜΟΚΤ-1 секвенировали с использованием стандартных процедур секвенирования ДНК. Аминокислотная последовательность ΜΟΚΤ-1 была расшифрована по последовательности ДНК (для ознакомления с нуклеотидной и аминокислотной последовательностями ΜΟΚΤ-1, см. совместные, находящиеся на стадии рассмотрения заявки на израильский патент №№ 112022, 112692 и 114615 и соответствующую им заявку РСТ № XVΟ 96/18641). Нумерация аминокислотных остатков в составе белков, кодируемых вставками кДНК, дана в соответствии с базой данных 8\νίχχ-ΡΐΌΕ Делеционные мутанты были получены с применением ПЦР, а точковые мутанты - с помощью техники олигонуклеотиднаправленного мутагенеза (Сиггеп! РгоЮсо1х ίη Μο^ϋ13Γ В1о1оду, 1994).

(ίί) Индуцированная экспрессия, метаболическое мечение и иммунопреципитация белков.

Сцепленный по Ν-концу с ΕΕΑ6октопептидом ΜΟΚΤ-1 (ΕΕΑ6-ΜΟΚΤ1, ЕаЧшап Кобак, \ο'ν Науеп, СТ, США), ΕΑδ-Ιϋ, ΕΑ8-Κ ρ55-Κ, химера, включающая внеклеточный домен ρ55-Κ (аминокислоты 1-168), слитый с трансмембранным и внутриклеточным доменами ΕΑ8-Κ (аминокислоты 153-319), и кДНК люциферазы, являющаяся контролем, были экспрессированы в клетках НеЬа. Экспрессия была осуществлена с использованием контролируемого тетрациклином экспрессирующего вектора в клоне клеток НеЬа (ΗΐΤΑ-1), экспрессирующем контролируемый тетрациклином трансактиватор (Соххеп & Вщагб, 1992; также см. Во1б1п е1 а1., 1995). Метаболическое мечение с использованием [³⁵8]-метионина и [³⁵8]цистеина (^иρоηΐ, ГСПттЦоп, ΌΕ, США и Αтегхкат, ВисктдйаткЫге, Великобритания) было проведено спустя 18 ч после трансфекции путем дополнительной 4-часовой инкубации при 37°С в модифицированной по Дальбекко среде Игла, без метионина и цистеина, но с добавлением 2% диализованной плодной телячьей сыворотки. Затем клетки лизировали буфером ΚΙΡΑ (10 мМ Трис-НС1 - рН 7,5, 150 мМ №С1, 1% ΝΡ-40, 1% дезоксихолата, 0,1% 8Ό8 и 1 мМ ΕΌΤΑ), а лизат предварительно осветляли путем инкубации с посторонней кроличьей антисывороткой (3 мкл/мл) и шариками сефарозы с белком-6 (Рйагтас1а, υρρ8а1а, Швеция; 60 мкл/мл). Иммунопреципитацию проводили путем часовой инкубации при 4°С аликвот лизата по 0,3 мл с мышиными моноклональными антителами (5 мкл на аликвоту) к октопептиду ΕΕΑ6 (Μ2; Еайтап Кобак), к ρ55-Κ (№ 18 и 20; Епде1тапи е1 а1., 1990) или к ΕΑ8-Κ (2В4; Кат1уа 8ои1капб ΟοΚχ, СΑ, США) или используемыми в качестве контроля радиоактивными антителами мыши с последующей инкубацией еще в течение 1 ч с шариками сефарозы с белком-6 (30 мкл на аликвоту).

(ш) Связывание ίη νίίΐΌ.

Глутатион-8-трансферазные (68Τ) слияния с ΕΑ8-ΙΟ дикого типа или мутантного ΕΑ81С, были получены и адсорбированы глутатионагарозными шариками (см. Во1бт е1 а1., 1995; Сиггеп! Рго1осо1х ίη Μо1еси1а^ Вю1оду, 1994; Ргапдюш & №е1, 1993). Связывание метаболически помеченного слитого белка ΕΌΑ6ΜΟΚΤ1 с Ο8Τ-ΕΑ8-Κ.’ оценивали путем инубации шариков в течение 2 ч при 4°С с экстрактами клеток НеЬа, метаболически помеченных [³⁵8]-метионином (60 мкКи/мл), которые экспрессируют ΕΕΑ6-ΜΟΚΤ1. Эти экстракты были приготовлены в буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1 - рН 7,5, 150 мМ №С1, 0,1% ΝΡ-40, 1 мМ дитиотреитола, 1 мМ ΕΌΤΑ, 1 мΜ фенилметилсульфонилфторида, 20 мкг/мл апротонина, 20 мкг/мл лейпептина, 10 мМ фторида натрия и 0,1 мМ ванадата натрия (1 мл на 5х 10⁵ клеток).

(ίν) Оценка цитотоксичности, опосредуемой индуцированной экспрессией ΜΟΚΤ-1.

кДНК ΜΟΚΤ-1, ΕΑδ-ГС р55-1С и люциферазы были встроены в контролируемый тетрациклином экспрессируемый вектор и трансфицированы в клетки ΗΐΤΑ-1 (сублиния клеток НеЬа) (Соххеп & Вщагб, 1992) вместе с кДНК секретируемой плацентарной щелочной фосфатазой, помещенной под контроль промотора 8У40 (вектор ρ8ВС-2; Эикк е1 а1., 1993). Гибель клеток оценивали через 40 ч после трансфекции либо с применением теста на поглощение нейтрального красного (^абасй 1984), либо в случае специфической оценки гибели тех клеток, которые экспрессируют трансфицированные кДНК, с помощью определения количества плацентарной щелочной фосфатазы (Вегдег е1 а1., 1988), секретируемой в культуральную среду в последние 5 ч инкубации.

В другой серии экспериментов, призванных проанализировать участок белка ΜΟΚΤ-1, который вовлечен в связывание с ΕΑ8-ΙΟ следующие белки были экспрессированы по перемежающемуся типу с контролируемого тетрациклином экспрессирующего вектора ρϋΗΌ103 в клетках НеЬа, которые несут контролируемый тетрациклином трансактиватор (№1^.-1): только ΕΑ8-Κ человека; ΕΑ8-Κ человека наряду с Ν-концевой частью ΜΟΚΤ-1 (аминокислоты 1117 т.н. голова ΜΟΚΤ-1); ΕΑ8-Κ человека наряду с С-концевой частью ΜΟΚΤ-1, которая включает участок гомологии с гибельдоменом (аминокислоты 130-245 - ΜΟΚΤ-1

ΌΌ); РЬА0-55.11 (аминокислоты 309-900 белка 55.11, соединенные с Ν-концом октопептида РЬА0, при том, что белок 55.11 является белком, специфически связывающимся с р55-1С). Через 12 ч после трансфекции клетки обрабатывали трипсином и пересевали в концентрации 30 тысяч клеток на лунку. После 24-часовой инкубации клетки обрабатывали в течение 6 ч моноклональным антителом к внеклеточному домену РА8-К (моноклональное антитело СН-11: Опсог, 0аййег8Ьигд, МО, США) при различных его концентрациях (0,001-10 мкг/мл моноклонального антитела) в присутствии 10 мкг/мл циклогексимида. Затем определяли жизнеспособность клеток с использованием теста на поглощение нейтрального красного, а результаты представляли в процентах выживших клеток в сравнении с общим числом клеток, которые были проинкубированы только с циклогексимидом (т.е. в отсутствие моноклонального антитела СН-11 к РА8-К).

(ν) Нозерн-блоттинг и секвенирование.

Полиаденилированная РНК была выделена из полной РНК клеток НеЬа (набор реактивов Ойдо!ех-йТ пМА кй. О|адеп, Нййеп, Германия). Нозерн-блоттинг с использованием кДНК МОКТ-1 в качестве зонда был осуществлен с помощью стандартных процедур (см. Во1й1п е! а1., 1995). Нуклеотидная последовательность МОКТ-1 была определена в обоих направлениях по методу дидеокси цепной терминации.

Данные проведенного секвенирования кДНК МОКТ-1, клонированной в дигибридном тесте, показали, что эта кДНК кодирует новый белок. Дальнейшее применение дигибридного теста с целью оценки специфичности связывания этого белка (МОКТ-1 = Мей1а!ог о£ Кесер!ог-шйисей Тохюйу) с РА8-1С и установления конкретного сегмента в составе РА8-1С, с которым он связывается, привело к получению следующих результатов: (а) белок МОКТ-1 связывается с РА8-1С и человека, и мыши, но не с рядом других тестированных белков, включая три рецептора семейства рецепторов Т№Ж0Р (рецепторы р55-Т№, и р75-Т№, и СО40); (Ь) мутации по замещению аминокислоты-225 (изолейцин) в составе гибель-домена РА8-К приводили к исчезновению сигнала и ш ν 11го, и 1п νί\Ό (мутация 1рг^сд [^а!апаЬе-Рикипада е! а1., 1992; Ной & N ада 1а, 1993]), что также предотвращает связывание МОКТ-1 с РА8-1С; (с) сайт связывания с белком МОКТ-1 в составе РА8-К приходится на гибель-домен этого рецептора; и (й) МОКТ-1 способен связываться сам с собой. Такое самосвязывание и связывание МОКТ-1 с РА8-К вовлекает разные участки данного белка: фрагмент МОКТ-1, соответствующий аминокислотным остаткам 1-117, связывается с полноразмерным МОКТ-1, но не связывается ни сам с собой, ни с РА8-1С. С другой стороны, фрагмент, соответствующий аминокислотным остаткам 130-245, связывается с

РА8-К, но при этом не связывается с МОКТ-1. Более того, из полученных результатов ясно, что участок гибель-домена в составе РА8-К является критическим по самосвязыванию РА81С, что характерно и для гибель-домена в составе р55-К по самосвязыванию у р55-1С. Делеции по обе стороны от этих гибель-доменов ни в коей мере не нарушают их способности к самосвязыванию, в то время как, однако, делеция в пределах гибель-доменов подавляет самосвязывание. В случае с МОКТ-1 связывание МОКТ-1 с РА8-1С также оказывается зависимым от полноты гибель-домена РА8-К, в то время как он также не зависит от сегментов за пределами гибель-домена РА8-К по связыванию с РА8-1С.

Взаимодействие белков, кодируемых конструкциями, несущими ДНК-связывающий домен и активаторный домен 0АТ4 (р0ВТ9 и рСАО-СН), в трансфицированных клетках дрожжей штамма 8РУ526, оценивали в фильтрационном тесте с β-галактозидазной экспрессией. Конструкции с ДНК-связывающим доменом включали 4 конструкции с РА8-1С человека, четыре конструкции с РА8-1С мыши, включая две полноразмерные конструкции, несущие замещающие мутации изолейцин лейцин и изолейцин аланин в 225-м положении (соответственно 1225Ν и 1225А) и три конструкции с МОКТ-1. Конструкции, несущие активаторный домен, включали три конструкции МОКТ-1 притом, что часть МОКТ-1 была такой же, как и в конструкции, несущей последовательность, кодирующую ДНК-связывающий домен и полноразмерную конструкцию РА8-1С человека, часть РА8-1С была такой же, как и в предыдущей конструкции, несущей ДНКсвязывающий домен. Внутриклеточные домены рецептора р55-Т№ человека (р55-1С: остатки 206-426), СЭ40 человека (СО40-1С: остатки 216277) и рецептора р75-Т№ человека (р75-1С: остатки 287-461), равно как и ламина, циклинаΌ и пустые 0АТ4 (р0ВТ9) векторы были взяты в качестве негативного контроля в форме конструкций, несущих ДНК-связывающийся домен. В качестве позитивного контроля служили 8ΝΕ1 и 8NР4, взятые в форме конструкции с ДНК-связывающим доменом (в случае с 8ΝΕ1) и с активаторным доменом (8ΝΕ4). Пустые 0АТ4 векторы (р0АЭ-0Н) также служили в качестве негативного контроля в форме конструкций, несущих активаторный домен. Символы ++ и +, использованные в представлении полученных результатов описанного выше анализа, обозначают появление отчетливого окрашивания в течение 30 и 90 мин теста соответственно; знак обозначает отсутствие окрашивания в течение 24 ч.

Экспрессия молекул МОКТ-1, соединенных по их Ν-концу с октопептидом РЬА0 (РЬА0-МОКТ-1), приводит к выходу в клетках

НеЬа четырех белков определенного размера примерно 27, 28, 32 и 34 кД. Взаимодействие МОКЫ с ЕА8-1С ίη уйго было выявлено путем проведения иммунопреципитации белков из экстрактов клеток НеЬа, трансфицированных слитым белком ЕЬА6-МОКЫ или кДНК люциферазы в качестве контроля: иммунопреципитацию проводили с использованием антитела к ЕЬА6 (аЕЬА6). Взаимодействие ίη νίίτο также было продемонстрировано между МОКЫ и ЕА8-1С при том, что МОКЫ находился в форме метаболически помеченных ³⁵§-метионином слитых белков ЕЬА6-МОКЫ, выделенных из экстрактов трансфицированных клеток НеЬа, а ЕА8-1С находится в форме слитых белков 6δΤЕА8-1С человека и мыши, включая один из вариантов, несущий мутацию по положению 225 полипептида ЕА8-1С, а все слитые белки 6δΤЕА8-1С были получены в клетках Е.соН. Слитые по 68Τ белки были присоединены к глутатионовым шарикам перед взаимодействием с экстрактами, содержащими слитый белок ЕЬА6МОКЫ, а после осуществления такого взаимодействия был проведен δΌδ-электрофорез в ПААГ. Таким образом, взаимодействие ίη νί!το было оценено авторадиографически с последующим δΌδ-электрофорезом в ПААГ, как связывание метаболически помеченного ³⁵δметионином МОКЫ, выработанного в клетках НеЬа в виде слияний с октопептидом ЕЬА6 (ЕЬА6-МОКЫ) с 6δΤ, входящим в слияние на ряду с ΕΑδ-IС человека или мыши (6δΤ-1ΡΆδ1С или 6δΤ-тΕΑδ-IС), или с 6δΤ в слиянии с ΕΑδ-IС, включающим замещение изолейцина на аланин в 225-м положении полипептида. Было показано, что все четыре белка ЕЬА6-МОКЫ проявляли способность связываться с ΕΑδ-IС в условиях инкубации со слитым белком 6δΤΕΑδ-IС. Как и в дрожжевом дигибридном тесте, МОКЫ не связывался со слитым белком 6δΤΕΑδ-IС, характеризующимся замещением по мутантному сайту 1рг^сд (1225А).

Белки, кодируемые кДНК ЕЬА6-МОКЫ, также продемонстрировали способность связываться с внутриклеточным доменом рецептора ΕΑδ-Κ, равно как и с внутриклеточным доменом химеры ΕΑδ-Κ, в которой внеклеточный домен замещён рецептором р55-К (р55-ΕΑδ), в случае коэкспрессии с этими рецепторами в клетках НеЬа. В этом случае взаимодействие МОКЫ с ΕΑδ-IС в трансфицированных клетках НеЬа, т.е. ίη νίνο, было продемонстрировано с применением иммунопреципитации различных вариантов трансфицированных клеток НеЬа, как взаимодействие ίη νίνο и специфичность взаимодействия между МОКЫ и ΕΑδ-IС в клетках, котрансфицированных конструкциями, кодирующими эти белки. Таким образом, слитый белок ЕЬА6-МОКЫ был экспрессирован и метаболически помечен ³^-цистеином (20 мкКи/мл) и ³^-метионином (40 мкКи/мл) в клетках НеЬа отдельно или вместе с ΕΑδ-Κ че ловека, химерой ΕΑδ-Κ, в которой внеклеточный домен ΕΑδ-Κ был замещен соответствующим участком рецептора р55-К человека (р55ΕΑδ), или р55-К человека, взятого в качестве негативного контроля. Перекрёстная иммунопреципитация МОКЫ с совместно экспрессируемым рецептором была проведена с использованием различных специфических антител. Полученные результаты показали, что ЕЬА6МОКЫ способен связываться с внутриклеточным доменом ΕΑδ-Κ, равно как и с внутриклеточным доменом химеры ΕΑδ-Κ-р55-Κ, включающим внеклеточный домен рецептора р55-К и внутриклеточный домен ΕΑδ-Κ, в случае коэкспрессии с этими рецепторами в клетках НеЬа. Далее иммунопреципитация ЕЬА6МОКЫ из экстрактов трансфицированных клеток также приводит к осаждению коэкспрессированного рецептора ΕΑδ-Κ или коэкспрессированной химеры р55-ΕΑδ. С другой стороны, иммунопреципитация этих рецепторов приводит к одновременной преципитации ЕЬА6МОКЫ.

Нозерн-блоттинг с использованием кДНК МОКЫ в качестве зонда указывает на наличие в клетках НеЬа единственного гибридизующего транскрипта. В Нозерн-блоте, в котором полиаденилированная РНК (0,3 мкг) из трансфицированных клеток гибридизовала с кДНК МОКК 1, размер РНК-транскрипта (примерно 1800 нуклеотидов) был установлен, как очень близкий к таковому у кДНК МОКЫ (примерно 1702 нуклеотида).

При проведении секвенирования было установлено, что кДНК включает открытую рамку считывания, кодирующую примерно 250 аминокислот. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности МОКЫ были показаны в совместной, находящейся на стадии рассмотрения, заявке (см. ГСО 96/18641). В этих последовательностях мотив гибель-домена подчеркнут, как и вероятные старт-кодон метионина (49-е положение: жирная, подчёркнутая буква М) и стоп-код трансляции (звездочка под кодоном в положении 769-771). Этот гибель-домен мотив проявляет сходство с известными гибельдоменами мотивами в составе р55-К и ΕΑδ-Κ (р55ЬЬ и ΕΑδ-^^). С целью определения точного С-конца в составе МОКЫ и получения убедительных доказательств точности определения Ν-конца (исходного остатка метионина) в МОКЫ дополнительные эксперименты были проведены следующим образом.

С использованием описанных выше методов ряд конструкций, кодирующих молекулы МОКЫ, слитый по своему Ν-концу с октопептидом ЕЬА6 (ЕЬА6-МОКЫ), были сформированы и экспрессированы в клетках НеЬа с применением метаболического мечения экспрессируемых белков с использованием ³Ч-цистеина и ³^-метионина. Молекулы ЕЬА6-МОКЫ кодировались следующими кДНК, включающими различные части последовательности, кодирующей МОКТ-1:

(ΐ) кДНК октопептида РЬА6, соединенная с 5'-концом кДНК МОКТ-1, из состава которой делегированы нуклеотиды 1-145;

(ίί) кДНК октопептида РЬА6, соединенная с 5'-концом полноразмерной кДНК МОКТ-1;

(ΐϊϊ) кДНК октопептида РЬА6, соединённая с 5'-концом кДНК МОКТ-1, из состава которой нуклеотиды 1-145, а также нуклеотиды 832-1701 были делетированы, а кодон 6СС в положении 142-144 мутирован в кодон ТСС с целью предотвращения начала трансляции по этому сайту.

После экспрессии вышеописанных слитых продуктов РЬА6-МОКТ-1 иммунопреципитацию осуществляли так же, как было описано выше, используя либо моноклональные антитела к РЬА6, либо, в качестве контроля, антитела к р75-ТИР-К, с последующими 8Ь8-электрофорезом в 10%-м ПААГ и авторадиографией. Результаты анализа вышеописанных слитых продуктов РЬА6-МОЬТ-1 подтвердили положение С-конца МОКТ-1 и дали доказательства того, что И-конец полипептида МОКТ-1 может находиться в положении 49 данной последовательности.

Кроме того, путем дополнительных экспериментов по экспрессии белка МОКТ-1 без присоединения октопептида РЬА6 по 5'-концу, было показано, что остаток Мек⁹ служит в качестве эффективного сайта инициации трансляции.

Проведённый поиск в базах данных 6епеВапк и Рго1ет Вапк показал, что к настоящему времени в них отсутствуют последовательности, которые бы соответствовали описанной выше выделенной последовательности МОКТ-1. Таким образом, МОКТ-1 представляет новый белок, специфичный по связыванию с РА84С.

Интенсивная экспрессия р55-1С приводит к опосредованию губительного эффекта на клетки (Во1бт еί а1., 1995). Экспрессия РА84С в клетках НеЬа также обладает таким эффектом, хотя и выраженным в меньшей степени, который может быть из-за этого выявлен только при применении чувствительного теста. Таким образом, независимое от лигандов опосредование губительного эффекта при трансфекции клеток МОКТ-1, а также р554С и РА84С, было подвергнуто анализу. Влияние перемежающейся экспрессии МОКТ-1, РА84С человека, р554С человека или взятой в качестве контроля люциферазы на жизнеспособность клеток НеЬа было оценено с использованием контролируемого тетрациклином экспрессирующего вектора. Жизнеспособность клеток оценивали спустя 40 мин после трансфекции этими кДНК либо в присутствии, либо в отсутствие тетрациклина (1 мкг/мл, с целью блокирования экспрессии), вместе с кДНК, кодирующей секретируемую плацентарную щелочную фосфатазу. Жизнеспособность клеток определяли либо с использова нием теста на поглощение нейтрального красного, либо при специальном определении жизнеспособности тех конкретных клеток, которые экспрессируют трансфицированную ДНК, путем измерения количества плацентарной щелочной фосфатазы, секретируемой в культуральную среду.

Описанный выше анализ показал, что экспрессия МОКТ-1 в клетках НеЬа в результате обусловливает существенную гибель клеток, более значительную, чем та, которая обусловливается экспрессией РА84С. Эти цитотоксические проявления всех факторов р554С, РА84С и МОКТ-1, по-видимому, связаны с сегментами гибель-доменов, присутствующих в составе всех этих белков, притом, что гибель-домены обладают свойством самосвязывания и тем самым, вероятно, побуждают проявление цитотоксических эффектов.

С точки зрения вышеописанных характеристик МОКТ-1, а именно специфического связывания МОКТ-1 с конкретным сегментом РА8К, который вовлечён в индукцию клеточной гибели, и того факта, что даже слабое изменение структуры этого сегмента, которое прекращает сигнал (мутация 1рг°⁸) и также предотвращает связывание с МОКТ-1, определяет то, что этот белок играет некую роль в передаче сигнала о или же прямом опосредовании им гибели клеток. Это соображение также подтверждается выявленной способностью самого МОКТ-1 опосредовать губительный эффект на клетки. Таким образом, белок МОКТ-1 может функционировать как (1) модулятор самосвязывания РА8К за счет его собственной способности связываться с РА8-К так же, как он может связываться сам с собой, или (2) служить депо-сайтом для дополнительных белков, которые участвуют в сигнальном механизме с участием РА8-К, т.е. МОКТ-1 может быть белком-депо и тем самым может связывать другие рецепторы, помимо РА8-К, или (3) составлять часть обособленной сигнальной системы, которая взаимодействует с сигнальной системой РА8-К.

С целью дальнейшего анализа участков МОКТ-1, вовлеченных в связывание с РА84С и модуляцию клеточных проявлений, опосредуемых РА8-К (цитотоксичности), описанные выше эксперименты были проведены с использованием векторов, кодирующих части МОКТ-1 (голова МОКТ-1 - аминокислоты 1-117, и МОКТ-1 ΌΌ - аминокислоты 130-245) (раздельно), и вектора, кодирующего РА8-К человека, предназначенного для котрансфекции клеток НеЬа. В этих экспериментах различные белки и сочетания белков экспрессировались по перемежающемуся типу в клетках НеЬа, которые включали контролируемый тетрациклином трансактиватор (линия Н£Та-1) путем встраивания последовательностей, кодирующих белки, в контролируемый тетрациклином экспрессирующий вектор рЬ НЬЮ-3. Контрольную трансфекцию проводили с использованием векторов, кодирующих только ЕА8-К и векторов, кодирующих слитый белок ЕЬ АО-5 5.11 (белок 55.11 является специфичным по связыванию с р55-1С белком, часть которого, включающая аминокислоты 309-900, была слита по его Νконцу с октопептидом ЕЬАО).

После этапов трансфекции и инкубации трансфицированные клетки были обработаны различными концентрациями моноклонального антитела СН-11 к ЕА8-К, которое специфически связывается с внеклеточным доменом рецептора ЕА8-К, экспрессируемого этими клетками. Такое связывание антитела к ЕА8-К индуцирует агрегацию ЕА8-К на клеточной поверхности (с большей вероятностью, чем с лигандом ЕА8-К) и индуцирует включение внутриклеточного сигнального механизма, опосредуемого ЕА8-1С, что, в конечном счете, приводит к гибели клеток (т.е. опосредованной ЕА8-К клеточной цитотоксичности). Использовавшиеся концентрации моноклонального антитела СН-11 к ЕА8-К находились в пределах от 0,01 до 10 мкг/мл: обычно концентрации были такими: 0,005, 0,05, 0,5 и 5 мкг/мл. Клетки были обработаны антителом к ЕА8-К в присутствии 10 мкг/мл циклогексимида.

Результаты описанного выше анализа показывают, что экспрессия рецептора ЕА8-К в трансфицированных клетках обусловливает повышенную чувствительность к цитотоксическому проявлению антител к ЕА8-К. Далее коэкспрессия сегмента ΜΟΚΤ-1, который включает участок гомологии с гибель-доменом, и ЕА8-К вступает в жесткие противоречия с индуцируемой ЕА8 (т.е. опосредуемой ЕА8-К) клеточной гибелью, чего и можно ожидать, исходя из способности гибель-домена (ΌΌ) ΜΟΚΤ-1 связываться с гибель-доменом (ЕА8ΌΌ) ЕА8-К. Более того, коэкспрессия Νконцевой части ΜΟΚΤ-1 и ЕА8-К не нарушает опосредованную ЕА8-К гибель клеток и, если такое и происходит, в некоторой степени усиливает цитотоксичность (т.е. наблюдается слабое усиление клеточной гибели).

Таким образом, приведенные выше результаты отчетливо указывают на то, что белок ΜΟΚΤ-1 имеет два разных сегмента, функционирующие по связыванию с ЕА8-1С и опосредованию цитотоксической активности ЕА8-1С.

Эти результаты, таким образом, также представляют основу для использования различных частей (т.е. активных фрагментов или аналогов) белка ΜΟΚΤ-1 для различных фармацевтических применений. Например, аналоги или фрагменты, или производные белка ΜΟΚΤ1, которые включают по сути только Сконцевую часть ΜΟΚΤ-1, содержащую его гибель-домен, могут быть использованы для ингибирования цитотоксического влияния, опосредуемого ЕА8-К в клетках или тканях, несущих рецептор ЕА8-К, и тем самым защиты этих клеток или тканей от повреждающего действия лиганда ЕА8-К в таких случаях, как при остром гепатите. С другой стороны, аналоги или фрагменты, или производные белка ΜΟΚΤ-1, которые по сути включают только Ν-концевую часть ΜΟΚΤ-1, могут быть использованы для усиления опосредованного рецептором ЕА8-К цитотоксического действия в клетках или тканях, несущих ЕА8-К, что тем самым приводит к усилению разрушения таких клеток или тканей, когда это является желательным, например, в таких случаях, как опухолевые клетки и автореактивные Т- и В-клетки. Как было подробно описано выше, такое применение различных сегментов ΜΟΚΤ-1 может быть осуществлено с использованием различных рекомбинантных вирусов (например, Уасаша) с целью внесения последовательностей, кодирующих сегменты ΜΟΚΤ-1, в специфические клетки или ткани, которые желательно подвергнуть такой обработке.

Кроме того, также возможным является получение и использование различных молекул, таких как антитела, пептиды и органические соединения, которые включают последовательности или молекулярные структуры, соответствующие вышеописанным сегментам ΜΟΚΤ-1 с целью достижения того же желательного эффекта, опосредуемого этими сегментами ΜΟΚΤ-1.

Более того, белок ΜΟΚΤ-1 может быть использован для специфической идентификации, выделения и охарактеризования других белков, которые способны связываться с ΜΟΚΤ-1 (т.е. ΜΟΚΤΊ-связывающимися белками), см. ссылочные примеры 2 и 3.

Ссылочный пример 2. Выделение ΜΟΚΤ1связывающегося белка.

(ί) Дигибридный скрининг и дигибридный тест с экспрессией β-глактозидазы.

Аналогично процедурам, описанным в ссылочном примере 1, используя внутриклеточный домен рецептора р55-ΤNΕ-Κ (р55-1С) и ΜΟΚΤ-1 в качестве приманки и осуществляя скрининг библиотеки В-лимфоцитов человека, были выделены два клона кДНК, которые кодируют белковый продукт, способный связываться и с ΜΟΚΤ-1, и с р55-1С. Для обоих клонов было показано наличие идентичных с 5'-конца нуклеотидных последовательностей (см. совместные, находящиеся на стадии заявки XV Ο 96/18641 и РСТ/ϋδ 96/10521).

(ίί) Параметры связывания новых клонированных кДНК при дигибридном скрининге.

С использованием вышеописанного дигибридного дрожжевого теста конструкция, включающая кДНК нового ΜΟΚΤ1связывающегося белка, была использована в качестве жертвы, к которой добавляли конструкции нескольких приманок в различных реакциях, с целью определения специфичности по связыванию ΜΟΚΤ1-связывающегося белка, кодируемого этой кДНК. Эти приманки включали конструкции, кодирующие белок ΜΟΚΤ1, части белка ΜΟΚΤ-1 (голова ΜΟΚΤ-1 - аминокислоты 1-117; хвост ΜΟΚΤ-1 - аминокислоты 130-245), р55-1С (аминокислоты 206-426 ρ55-Κ) или его часть аминокислоты 326-426 гибель-домен в составе ρ55-Κ; или другие домены, расположенные выше гибель-домена аминокислоты 206-326). Полученные результаты показаны ниже в табл. 2.

Таблица 2

Приманка	Данные экспрессии β-галактазы
ΜΟΚΤ-1	+++
аа 130-245 ΜΟΚΤ-1	+
аа 1-117 ΜΟΚΤ-1	-
аа 206-426 р55	+++
аа 326-426 р55	+++
аа 206-326 р55
аа 206-308 р55
аа 206-345 р55
р55 Τ35ΙΝΙ
ΕΑ8-Ή
аа 233-319 ΕΑ8
р75-1С
СЭ40 1С
РСΒΤ10
8ΝΕΊ
циклин-Ό
ламин

Приведенные выше данные дигибридного теста с экспрессией β-галактозидазы по связыванию клона с большим набором приманок подтвердили, что белок, кодируемый этим клоном, специфически связывается с гибельдоменами и рецептора ρ55-ΤΝΕ-Κ, и белка ΜΟΚΤ-1.

В целом, ΜΟΚΤ1-связывающийся белок может быть использован напрямую с целью модулирования или опосредования связанного с ΜΟΚΤ-1 влияния на клетки, или косвенно с целью модулирования или опосредования влияния лиганда рецептора ΕΑ8-Κ на клетки, когда такое влияние модулируется или опосредуется белком ΜΟΚΤ-1. То же самое остаётся справедливым и в отношении других внутриклеточных белков или внутриклеточных доменов трансмембранных белков, что специально было продемонстрировано здесь для рецептора ρ55-ΤΝΕ-Κ.

ΜΟΚ'Π-связывающиеся белки включают те белки, которые специфически связываются с полным белком ΜΟΚΤ-1, или те белки, которые связываются с различными сегментами белка ΜΟΚΤ-1, например, с вышеописанными Ν- и Сконцевым сегментами белка ΜΟΚΤ-1. ΜΟΚΤ1связывающиеся белки, которые специфически связываются с такими сегментами, могут быть использованы для модулирования активности этих сегментов и, следовательно, специфиче ской активности ΜΟΚΤ-1, которая детерминирована этими сегментами.

Ссылочный пример 3. Выделение и характеристика белка МАСН, другого ΜΟΚΤ1связывающегося белка.

(ί) Дигибридный скрининг, дигибридный тест с экспрессией β-галактозидазы, секвенирование и анализ последовательности.

С использованием процедуры, описанной выше в ссылочных примерах 1 и 2, полноразмерная конструкция, кодирующая белок ΜΟΚΤ1 человека, была использована в качестве приманки в дигибридной дрожжевой системе с целью выделения клона кДНК, кодирующего дополнительный новый ΜΟΚΤ1-связывающийся белок. Этот новый белок был изначально обозначен ΜΟΚΤ-2, а затем переименован и обозначен как МАСН (аббревиатура ΜΟΚΤ1а88ос1а!еб СЕЭ3 йото1од -связывающийся с ΜΟΚΤ-1 гомолог ίΈΌ3), исходя из его характеристик, которые подробно рассматриваются ниже.

Этот клон кДНК был секвенирован с помощью стандартных процедур, которые были выше описаны в ссылочных примерах 1 и 2. Анализ данных секвенирования с помощью стандартных методик и компьютерного моделирования (см. ссылочные примеры 1 и 2) показали, что эта кДНК включает новую последовательность и кодирует новый белок (ни ДНК, ни аминокислотная последовательности в базах данных СепВапк или Рго!етВапк не обнаружены). Далее кДНК, кодирующая МАСН, включает открытую рамку считывания ΟΚΕ-Β, которая проявляет существенную степень гомологии с сегментом, предваряющим (т.е. фланкирующим с 5'-стороны) гибель-домен в составе белка ΜΟΚΤ-1 (см. ссылочный пример 1). В совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявках на израильский патент №№ 114615, 114986, 115319, 116588 и 117932, а также в соответствующей им РСТ-заявке № РСТ/ϋδ 96/10521 показана структура той части клона кДНК МАСН, которая включает ΟΚΕ-Β (кодирует 235 аминокислотных остатков), расшифрованная аминокислотная последовательность МАСН ΟΚΕ-Β и нуклеотидная последовательность молекулы кДНК МАСН. Участок, соответствующий ΟΚΕ-Β, проявляет высокий уровень гомологии с сегментом ΜΟΚΤ-1, расположенным выше гибель-доменного мотива ΜΟΚΤ-1.

Дополнительно дигибридный дрожжевой тест был проведен с целью оценки специфичности связывания МАСН с ΜΟΚΤ-1, в частности, с целью установления того сегмента в составе ΜΟΚΤ-1, к которому присоединяется МАСН, а также с целью определения, какая из открытых рамок МАСН взаимодействует с ΜΟΚΤ-1: соответствующие процедуры были описаны выше в ссылочных примерах 1 и 2. Вкратце, различные конструкции ΜΟΚΤ-1 и МАСН были получены для тестирования взаимодействия белков, коди руемых конструкциями, включающими последовательности, кодирующие ДНК-связывающий и активаторный домены транскрипционного активатора 6ΑΤ4, в пределах трансфицированных клеткок дрожжей штамма 8ΕΥ526 с оценкой в фильтрационном тесте по экспрессии βгалактозидазы. Конструкции с ДНК-связывающим доменом были получены на основе векторов ρ6ΒΤ9, а конструкции с активаторным доменом были получены на основе векторов ρ6ΑΌ-6Μ. Для конструкции с активаторным доменом была использована полноразмерная кДНК МАСН, что стало конструкцией, кодирующей только сегмент, соответствующий ΟΚΕ-Β (МАСН-В). Контрольные конструкции с активаторным доменом были теми конструкциями, которые включали полноразмерную кодирующую последовательность ΜΟΚΤ-1 (ΜΟΚΤ-1 - позитивный контроль), а также теми, которые не имели вставок, т.е. были пустыми векторами (ρ6ΑΌ-6Μ). Для конструкций с ДНК-связывающим доменом была использована полноразмерная кДНК (ΜΟΚΤ-1), т.е. они были конструкциями, кодирующими только верхний сегмент ΜΟΚΤ-1 (т.е. ΜΟΚΤ-1 ΌΌ: аминокислоты 130-245). Контрольные конструкции с ДНК-связывающим доменом, которые были сформированы с целью определения специфичности МАСН-связывания, включали конструкции, кодирующие ламин, аминокислотные остатки 287-461 внутриклеточного домена рецептора ρ75-ΤΝΕ-Κ человека (р75-1С человека), циклический-Ό (сусЭ). 8ΝΕ1, аминокислотные остатки 206-426 внутриклеточного домена рецептора ρ55-ΤΝΕ-Κ человека (р55-1С человека), сегмент гибель-домена во внутриклеточном домене ΕΑ8-Κ человека (ΕΑ8-ΌΌ человека), аминокислотные остатки 216-277 внутриклеточного домена ί.Ό40 человека (СЭ40 1С человека), векторы без вставки или пустые векторы ρ6ΒΤ9 (ρ6ΒΤ9 - негативный контроль) и конструкция, кодирующая сегмент ΟΚΕ-Β МАСН (МАСН-В). В этом тесте определяли проявление окрашивания: при этом, чем интенсивнее проявлялось окрашивание, тем более сильным является взаимодействие между конструкциями, кодирующими ДНК-связывающий домен и активаторный домен. Проявление окрашивания обозначали символами, среди которых +++ и + определяют проявление отчетливого окрашивания через 30 и 90 мин теста, соответственно, а знак --- определяет отсутствие проявления окрашивания в течение 24 ч теста. В случаях, когда взаимодействие не было протестировано, никакие символы не проставлялись. Полученные результаты оценки различных взаимодействий вышеописанных тестов приведены ниже в табл. 3, а результаты различных взаимодействий изоформ МАСН показаны в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявке РСТ/и8

96/10521 и соответствующих заявках, поданных в Израиле.

Таблица 3

ДНК-связывающий домен
МАСН	МАСН-В	ΜΟΚΤ-1	Р6.Ш-611
Гибрид
ΜΟΚΤ-1	+++	+++	+++	---
Связывающий сегмент ΜΟΚΤ-1
ΜΟΚΤ1-(-117)
ΜΟΚΤ-1 ϋϋ (аа 130-245)	...	---
Тесты на специфичность
Ламин	---	---
Р75-1С человека	---
СусЭ
8ΝΕ1
Р55-1С человека
ΕΑ8-ϋϋ человека	---
СЭ401С человека	---
Ρ6ΒΤ9	---
МАСН-В		+	+	---

Таким образом, как явствует из результатов табл. 3, понятно, что (a) МАСН связывается с ΜΟΚΤ-1 очень жестко и по специфическому типу;

(b) МАСН-связывающий сайт в ΜΟΚΤ-1 находится перед (т. е. выше по последовательности) гибель-доменного мотива ΜΟΚΤ-1, т.е. он попадает в сегмент ΜΟΚΤ-1, соответствующий аминокислотам 1-117 в составе ΜΟΚΤ-1;

(c) сегмент ΟΚΕ-Β в составе МАСН является участком взаимодействия с ΜΟΚΤ-1 белка МАСН;

(ά) сегмент ΟΚΕ-Β в МАСН способен к самосвязыванию.

(ίί) Цитотоксическое действие, опосредуемое способностью белка МАСН к самосвязыванию.

Выявление того, что белок МАСН способен самосвязываться, в частности, что самосвязывается сегмент, соответствующий ΟΚΕ-Β, и учитывая, что ранее выявленные корреляции между самосвязываемостью и цитотоксичностью, установленные для внутриклеточных доменов рецепторов ρ55-ΤΝΕ-Κ и ΕΑ8-Κ, а также той, которая была обнаружена для ΜΟΚΤ-1 (см. ссылочный пример 1) - все это подтверждает, что самосвязывание у МАСН также может быть вовлечено в проявление цитотоксичности.

С целью тестирования такой возможности конструкции, кодирующие МАСН, были получены на основе контролируемого тетрациклином вектора (подробности см. в ссылочном примере 1). Эти конструкции были использованы для трансфекции клеток НеЬа, в которых эти векторы экспрессировались по перемежающемуся типу. Помимо МАСН-несущих конструкций, другие контрольные конструкции были использованы для оценки влияния перемежающейся экспрессии на жизнеспособность клеток НеЬа, влияние на которые МАСН-несущих конструкций может быть определено с целью срав нения. Эти другие конструкции включают МОВТ-1, РА8-1С человека и бис (люцифераза). Дополнительно котрансфекция клеток Неба была также протестирована с использованием конструкций, несущих МОВТ-1 и МАСН, с целью определения того, какой эффект может обусловливать взаимодействие между этими белками. После трансфекции клетки Неба инкубировали и жизнеспособность клеток оценивали через 48 ч после трансфекции либо в присутствии, либо в отсутствие тетрациклина (1 мкг/мл), предназначенного для блокировки экспрессии. Жизнеспособность клеток определяли с помощью теста на поглощение нейтрального красного.

Исходя из результатов описанного выше анализа, стало ясно, что белок МАСН индуцирует очень мощный цитотоксический эффект в отношении клеток Неба, т.е. индуцируемая сверхэкспрессия кДНК МАСН в клетках Неба в результате обусловливает мощное цитотоксическое проявление. По-видимому, данное проявление цитотоксичности обусловлено способностью МАСН к самосвязыванию.

(ΐϊϊ) Нозерн-блоттинг.

С использованием хорошо известных процедур (см. ссылочный пример 1), анализ ряда клеточных линий методом Нозерн-блоттинга был проведён с использованием кДНК МАСН в качестве зонда. Результаты этого анализа показывают, что большое число клеточных линий, в частности, клеточные линии СЕМ, Ва_ц, Паи61, Неба, А1ехап6ег, 1игка! и А673, проявляют по два гибридизующих транскрипта длиной примерно по 3200 нуклеотидов.

С точки зрения сказанного выше, белок МАСН, в частности, МАСНβ1 (т.е. ОВР-В как часть МАСН) может быть использован напрямую для модулирования или опосредования связанного с МОВТ-1 влияния на клетки, или косвенно для модулирования или опосредования влияния лиганда рецептора РА8-В на клетки тогда, когда это влияние модулируется или опосредуется белком МОВТ-1. Тот факт, что МАСН специфически связывается с верхним сегментом МОВТ-1 и проявляет гомологию с МОВТ-1, определяет специфический путь, в соответствии с которым МАСН или МАСН ОВР-В могут быть использованы для модулирования этого специфического сегмента в составе МОВТ-1 и, следовательно, специфической активности МОВТ-1, определяемой этим верхним сегментом. Далее, МАСН или МАСН ОВР-В могут быть использованы в качестве модулятора или медиатора внутриклеточных проявлений аналогично тому пути, который характерен и для самого МОВТ-1 (см. выше), исходя из способности белка МАСН к самосвязыванию и индукции им самим проявления цитотоксичности.

Дальнейший анализ белка МАСН и последовательностей ДНК, его кодирующих, был проведен в соответствии с описанным ниже.

Кроме того, было показано, что ОВР-В из состава МАСН представляет не только одну из серии изоформ МАСН. Следовательно, белок МАСН и кодирующие его последовательности ДНК теперь переименованы, причины чего станут понятными из нижеизложенного.

(а) Дигибридный скрининг белков, которые связываются с МОВТ-1, определяет новый белок, имеющий мотив последовательности, сходный с МОВТ-1.

Как отмечалось выше, для идентификации белков, которые принимают участие в индукции белком МОВТ-1 клеточной гибели, дигибридный тест был применен для скрининга библиотек кДНК с целью поиска белков, которые связываются с МОВТ-1. Дигибридный скрининг библиотеки В-лимфоцитов человека (ЭшТее е! а1., 1993) с использованием кДНК МОВТ-1 в качестве приманки привел к выделению клонов кДНК, соответствующих самому белку МОВТ-1, что отражает способность этого белка к самосвязыванию, а также клонов, соответствующих белку ТВАОО, с которым МОВТ-1 эффективно связывается (см. ссылочный пример 2). Также проведенный скрининг привёл к выделению клонов кДНК с новой последовательностью, которая кодирует продукт, специфически связывающийся с белком МОВТ-1. Этот белок, изначально обозначенный МАСН, а затем, после обнаружения того, что он встречается в виде множественных изоформ (см. ниже), переименованный в МАСНβ1, также продемонстрировал в дигибридном тесте способность связываться сам с собой, но при этом не был способен связываться с рецептором РА8-В (см. отмечавшиеся выше совместную, находящуюся на стадии рассмотрения заявку РСТ/ϋδ 96/10521, которая также включает все следующие анализы и полученные в них результаты).

МОВТ-1 и МАСНβ1 и их делеционные конструкции, равно как и изоформа МАСНа1 (МАСНа1 является мутантным вариантом, в котором каталитический цистеин-360 замещен серином - МАСНа1 (С3608)), и внутриклеточный домен РА8-В (РА8-1С) человека были экспрессированы в трансфицированных клетках дрожжей штамма 8РУ526 в составе конструкций, включающих последовательности, кодирующие ДНК-связывающий и активаторный домены трансактиватора транскрипции 0АЕ4 (соответственно, р0ВТ9 и р0АЭ-0Н). Их взаимодействие оценивали в фильтрационном тесте с экспрессией β-галактозидазы в соответствии с описанным у Болдина с соавт. (Во16ш е! а1., 1995Ь). Результаты представляются в виде периодов времени, необходимых для образования устойчивого окрашивания. Ни одна из тестированных вставок не взаимодействовала с серией вариантов негативного контроля, включая векторы, несущие внутриклеточные домены рецептора р55-Т№-В человека, рецептора р75-Т№ и

СИ40, а также ламин, циклин-Ό, и пустой вектор с 6АЬ4. МАСНβ1 был клонирован с помощью дигибиридного скрининга 6АЬ4-АИпомеченной библиотеки В-лимфоцитов человека (ИигГее е! а1., 1993) с целью выявления белков, связывающихся с МОВТ-1, используя репортерный штамм дрожжей НГ7с. За исключением специально оговорённых случаев, все экспериментальные процедуры такого поиска были описаны выше (также см. Во1б1п е! а1., 1995). Делеционный анализ показал, что МАСНЩ связывается с Ν-концевой частью МОВТ-1, которая вовлечена в индукцию клеточной гибели (СЫппа1уап е! а1., 1995). Также МАСЩ1 способен самосвязываться в трансфицированных клетках дрожжей. Однако он не связывается с некоторыми контрольными белками и, в отличие от белка МОВТ-1, он не способен связываться с рецептором ЕА8-В. Экспрессия молекул МАСНβ1 в клетках млекопитающих приводит к получению белка с молекулярной массой 34 кД, который связывается с молекулами МОВТ-1, одновременно с ним экспрессирующимися. Он также был способен связываться со слитым белком 68Т-МОВТ-1 ΐπ тйго.

Сравнение аминокислотных последовательностей МАСЩ1 и МОВТ-1 показало общий для этих двух белков мотив последовательности (обозначенный как МОВТ-модуль), отличающийся от гибель-доменного мотива, опосредованно через который белок МОВТ-1 связывается с рецептором ГА8-В. Этот мотив имеется в единственной копии в составе МОВТ1 и в двух копиях в последовательности МАСИХЕ Такой же мотив также обнаруживается в составе РЕА-15-фосфопротеина астроцитов, функции которого пока неизвестны. Предварительные данные подтверждают, что мотив МОВТ-модуля вовлечён в связывание МАСНβ1 (и других изоформ белков МАСН) с белком МОВТ-1.

Расшифрованная аминокислотная последовательность МАСНЩ представлена в упоминавшейся выше заявке РСТ/И8 96/10521 и соответствующих ей заявках на израильский патент, в частности, заявке 1Ь 117932. Два МОВТмодуля показаны, а также определены С-концы двух использовавшихся делеционных мутантов МАСНβ1. Гомология последовательностей модулей в составе МАСНβ1, МОВТ-1 и гена РЕА15 (депозитарный № Х86809) также была представлена в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявках, в которых идентичные и сходные аминокислотные остатки были помечены помещением в замкнутые линии и затенены соответственно.

Также в упоминавшихся выше совместных заявках представлены в виде диаграмм гибельдомен и МОВТ-модули и участки ГА8/АР01, МАСНβ1 и МАСНа1, проявляющие гомологию с протеазами СЕИ3/1СЕ.

Для сегмента МОВТ-1, который включает такой МОВТ-модуль, было показано участие в индукции клеточной гибели с участием этого белка (см. приведенный выше ссылочный пример 1). Также было показано его участие в самосвязывании белка МОВТ-1, хотя он и недостаточен для этого (см. ссылочный пример 1). Анализ параметров связывания у делеционных конструкций МАСНβ1 в трансфицированных клетках дрожжей показал сходное участие МОВТ-модулей в самосвязывании МАСЩС равно как и в его связывании с белком МОВТ-1: делеционные конструкции, в которых отсутствовал сегмент, расположенный после (т.е. ниже по последовательности) МОВТ-модуля, были неспособны связываться друг с другом, но поддерживали способность связываться с полноразмерным белком МОВТ-1 и с полноразмерным МАС^Ь Дальнейшее укорочение, при котором также была делетирована часть последовательности МОВТ-модуля, привело в результате к утрате способности связываться с этими белками. Для дальнейшей оценки участия МОВТ-модулей в этих взаимодействиях делеционные мутантные МАСНβ1, слитые с октопептидом ЕЬА6 (ЕЬА6-МОВТ-1), были экспрессированы в клетках НеЬа с последующей оценкой их связывания ш ν 11го с вырабатываемым бактериями слитым белком, состоящим из глутатион-8-трансферазы и белка МОВТ-1 (68Т-МОВТ-1). Сходным образом со связыванием, выявляемым в дигибридном дрожжевом тесте, было обнаружено, что такое связывание 1п νίΙΐΌ оказывается зависимым от взаимодействия сегмента в пределах модулей МАСНβ1. Метаболически помеченные с использованием ³⁵8ΥМАСНβ1, МАСЩС слитый по его Ν-концу с октопептидом ЕЬА6 (Г^А6-МАСНβ1), мутантные по укорочению С-концу ЕЬА6МАСЩ1 и люцифераза в качестве контроля были получены в трансфицированных клетках НеЬа. Экспрессия была осуществлена с использованием контролируемого тетрациклином экспрессирующего вектора в клеточном клоне Н!ТА-1 клеток НеЬа, который экспрессирует контролируемый тетрациклином трансактиватор.

Оценка экспрессии белков и определение их молекулярных масс были проведены с помощью иммунопреципитации клеточных лизатов с использованием антител к ГЬА6. Использовавшиеся антитела были следующими: кроличья антисыворотка к МАСЩ1 и к МОВТ-1 была сформирована против слитых белков 68ТМАСЩ1 и 68Т-МОВТ-1. Мышиные моноклональные антитела к октопептиду ГЬА6 (М2) и к ГА8/АР01 (СН11) (УопеКага е! а1., 1989) были приобретены в фирмах Еак!тап Кобак и Опсог (6аййегкЬигд, МИ, США) соответственно. Мышиные моноклональные антитела к эпитопу НА (12СА5: Ие1б е! а1., 1988) и антитела к ТИГ бы ли получены в лаборатории заявителей в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными в данной области техники. Результаты, показывающие аффинное связывание белков с 68Τ-ΜΟВΤ-1, адсорбированной на глутатион-агарозных шариках (или в качестве контроля с 68Τ или слитых 68Τ и внутриклеточным доменом ΡΑ8/-ΑΓ01) и данные иммунопреципитации различных слитых конструкций с участием ΜΟВΤ-1 и МАСН с использованием различных специфических антител, представлены в отмечавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявках, в частности в заявках РСТ/и8 96/10521 и Ιί 117932.

(Ь) Существование МАСН в виде множественных изоформ.

Применение метода Нозерн-блоттинга с использованием кДНК ΜΑί,Ήβ 1 в качестве зонда показало небольшое количество транскрипта (транскриптов) длиной приблизительно 3000 нуклеотидов в ряде различных клеточных линий. Вкратце, метод Нозерн-блоттинга тотального пула РНК (14 мкг на линию) или полиаденилированной РНК (2 мкг), выделенных из некоторых клеточных линий был применен с использованием кДНК ΜΑί,Ήβ 1 в качестве зонда. Все тестированные клеточные линии Τ47Ό, СЕМ, Ва_р, ОаиШ. НеЬа, ΑΕχηηώ;!'. 1игка1 и А673 происходят от тканей человека и были сформированы, соответственно, на материале карциномы молочной железы, острого лимфобластоидного Т-клеточного лейкоза, лимфомы Беркитта, эпителиоидной карциномы, гепатомы человека, острого Т-клеточного лейкоза и рабдомиосаркомы. Достаточно размытая форма бэндов гибридизации на Нозерн-блоттах свидетельствует о том, что эти транскрипты характеризуются гетерогенностью размеров в пределах от 2,85 до 3,5 тысяч пар нуклеотидов. Признаки и количества, и размеров транскриптов варьируются при сравнении различных тканей человека и при этом не коррелируют с уровнями экспрессии белков ΜΟВΤ-1 или ΡΑ8/ΑР01 (Аа1апаЬе е1 а1., 1992). В семенниках и скелетных мышцах, например, транскрипты МАСН были слабовыявляемыми, даже при том, что эти ткани экспрессируют существенные количества белка ΜΟВΤ1. С другой стороны, в покоящихся моноядерных лейкоцитах периферической крови, в которых уровень экспрессии ΜΟВΤ-1 чрезвычайно низок, был обнаружен очень высокий уровень экспрессии МАСН. Активация лейкоцитов лектином приводит в результате к существенному изменению размерных параметров транскриптов МАСН наряду с индукцией ΜΟВΤ-1.

Учитывая природу такой размерной гетерогенности, библиотеки кДНК были подвергнуты скринингу на выявление транскриптов, которые бы гибридизовали с зондом кДНК ΜΑΟΗβΡ ΜΑΟΗα1 и ΜΑΟΗα2 были клонированы из библиотеки кДНК СЬагоп-В8, производной от мРНК, выделенной из тимуса человека. Библиотека была скринирована в жестких условиях с зондом кДНК ΜΑΟΗβ1, помеченным с использованием набора реактивов для случайного прайминга Вапйот-Рпшшд кй (Воейппдег Μηηηΐκίιη). Другие изоформы МАСН были клонированы с применением ПЦР с ревертированием, проведенной на основе тотальной РНК, выделенной из клеток линии Ва_р (ΜΑΟΈα, α2, α3, β3 и β4) и клеток линии ЭаиШ (МАСНа2, β2, β3, β4 и β5), являющихся лимфобластоидными клетками человека. Реакция обратной транскриптазы была осуществлена с использованием олиго-дТ адапторной затравки 5'-6ΑСΤС6Α6ΤСΤΑ6Α6ΤС6ΑС(Т)₁₇-3' - и обратной транскриптазы 8ирег8спр1-11 (61ЬсоВВЬ) на основе рекомендаций, изложенных в инструкции производителей. Первый раунд ПЦР был проведен с использованием реактивов Ехраий Ьоид Τетρ1аΐе РСВ 8у51еш (Воейгтдег ΜаηηЬе^т) и следующих смысловой и антисмысловой затравок: 5'-ΑΑ6Τ6Α6СΑ6ΑΤСΑ6ΑΑΤΤ6Α6-3' (соответствует нуклеотидам 530551 в составе кДНК ΜΑΟΗβ1) и 5'-6ΑСΤС6Α6ΤСΤΑ6Α6ΤС6ΑС-3' соответственно. Второй раунд был осуществлен с использованием УеШ-полимеразы (NΕВ) и следующих смысловой и антисмысловой затравок: 5'6Α66ΑΤССССΑΑΑΤ6СΑΑΑСΤ66ΑΤ6ΑΤ6Α^3' и 5'-6ССΑССΑ6СΤΑΑΑΑΑСΑΤΤСΤСΑΑ-3', производных от последовательности кДНК ΜΑ^β1 соответственно. Для подтверждения наличия в составе МАСЩ3 и МАСЩ4 инициирующих трансляцию кодонов было осуществлено клонирование более длинных 5'участков этих изоформ из состава пулов РНК клеток Ва_р. Реакция ПЦР с ревертированием, проведённая с использованием адапторной олиго-дТ затравки, описанной выше, была завершена двумя раундами ПЦР с использованием УегИполимеразы (№В) и следующих смысловой и несмысловой затравок: 5'-ΤΤ66ΑΤ^Α6ΑΤ66ΑСΤΤСΑ6СΑ6ΑΑΑΤСΤΤ-3' и 5'-АТТСТСАААСССΤ6СΑΤССΑΑ6Τ6-3', производных от последовательности ΜΑΟΗβΡ Последний из олигонуклеотидов является специфичным для β-изоформ. Среди клонов, полученных таким путем, те, которые включают нуклеотиды, кодирующие аминокислоты второго блока (по присутствию-отсутствию которого МАСНβ3 и ΜΑΡΉβ отличаются от ΜΑ^β1 и МАСНβ2), были полностью секвенированы. Нуклеотидные последовательности всех клонированных изоформ были определены в обоих направлениях с применением метода Сэйнджера. Были получены только частичные клоны кДНК, соответствующие МАСНа3 и ΜΑΟΉβΙ. В целом, проведённый скрининг подтвердил существование множественных изоформ белка МАСН. Аминокислотные последовательности семи из этих изоформ были исследованы в деталях. Результа ты этого анализа в виде диаграмм и иллюстративных примеров приведены в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявках РСТ/И8 96/10521 и 1Ь 117932, где аминокислотные последовательности трех этих изоформ сравниваются с известными гомологами.

Утрата 65 нуклеотидов, которые в составе МАСНа1 кодируют второй блок, обусловливает изменение нуклеотидов, кодирующих третий блок в составе МАСНв1 и МАСНв2. Таким образом, в этих изоформах эти нуклеотиды кодируют другие аминокислоты, которые вместе составляют их уникальный С-концевой участок. С другой стороны, в составе открытых рамок МАСНв3 и МАСНв4 третий блок сохраняется, но при этом отсутствие нуклеотидов, которые кодируют сегмент гомологии с СЕО3/1СЕ, и части 3'-некодирующего сегмента, в результате приводят к изменению в составе открытой рамки нуклеотидов, расположенных ниже. В результате такого изменения большая 5'-часть этого некодирующего нижерасположенного сегмента кодирует 10 аминокислот, которые превращают С-концевую часть этих двух изоформ в уникальную.

Изоформы были клонированы из библиотеки кДНК В-лимфоцитов человека (МАСНв1), из библиотеки кДНК тимуса человека (МАСНа1 и а2) и из мРНК лимфобластоидных клеток Ка_р (МАСНа1, а2, а3, β3, β4 и β5) и клеток линии ЭаиБ| человека (МАСНа2, β2, β3, β4 и β5). Клонирование мРНК из клеток Ка_р и ОаиБ1 было осуществлено с применением ПЦР с ревертированием с использованием олигонуклеотидов, соответствующих 3'-некодирующему сегменту и последовательности в пределах второго МОКТ-модуля в составе МАСНβ1. Таким образом, старт-кодон в выделенных таким образом клонах локализован в пределах второго МОКТ-модуля.

Последовательности различных изоформ соотносятся друг с другом следующим образом: (а) все изоформы МАСН характеризуются общим 182-аминокислотным Ν-концевым сегментом, который включает МОКТ-модули, при том, что расположенные ближе к С-концу (т. е. с 3'конца ниже) к этим модулям, равно как и некодирующие сегменты варьируются; (Ь) по параметрам их С-концевых последовательностей эти изоформы разделяются на две подгруппы - четыре изоформы, определяемые как подгруппа β, имеют отличающиеся С-концы изза изменения кодирующей рамки; две изоформы (МАСЩ1 и МАСЩ2) имеют общий С-конец, обнаруженный в изоформе, исходно клонированной в ходе дигибридного скрининга, а еще две изоформы (МΑСНβ3 и МΑСНβ4) имеют общий отличающийся С-конец; три изоформы, определенные как подгруппа α, имеют более длинный С-концевой сегмент, который в значи тельной степени напоминает параметры семейства протеаз ί.ΈΌ3/Ιί.Έ (см. ниже); (с) сегменты, расположенные между участком МОКТмодуля и С-концевым сегментом, по которому определяются подгруппы, варьируется от одной изоформы к другой. Однако аналогичное тестирование показало, что эти промежуточные участки включают различные сочетания одних и тех же трех аминокислотных блоков (блоки 1, 2 и 3). Изменчивость аминокислотных последовательностей среди различных клонов отражает два типа изменчивости нуклеотидных последовательностей, которые, что наиболее вероятно, происходят в результате альтернативного сплайсинга: (а) вставка или отсутствие либо любой из двух нуклеотидных последовательностей - одна длиной 45 нуклеотидов и другая длиной 65 нуклеотидов, либо их обеих, расположенных ниже нуклеотидов, кодирующих остаток лизина-184; (Ь) присутствие дополнительной вставки в пределах участка, который в составе МАСНШ представляет 3'-некодирующий сегмент. Эта изменчивость влияет как на состав открытой рамки, так и длину кодируемого полипептида.

Часть изоформ МАСН включает участок гомолог с ί.ΈΌ3/Ιί.Έ. Анализ банков данных показал, что С-концевой сегмент изоформ подгруппы МАСНа, включающий третий блок и последовательность, протяжённую вниз от него, в значительной степени напоминает протеазы семейства ί.ΈΌ3/Ιί.Έ. Было проведено сравнение последовательностей этого сегмента в составе МАСН и различных известных членов этого семейства, представляющих организм человека, равно как и белка сеБ3 нематоды СаеиогйаЬБШк е1едаи8 (ЕШ§ & Ногуйх, 1986; Υиаи е1 а1., 1993), а также известных протеаз человека из протеазного семейства ί.ΈΌ3/Ιί.Έ: СРР32 (ЕетаиБе8-А1иетп е1 а1., 1994), также называемый апопаином (№сйо1§ои е1 а1., 1995) и Υата (Те\\^гап е1 а1., 1995Ь), Мсй2а, (ЕетаиБе8-А1иетп е1 а1., 1995), 1сй-1 (^аид е1 а1., 1994), белок человека, гомологичный белку ЫеББ2 мыши (Китаг е1 а1., 1994), 1СЕ_ге111 (МииБау е1 а1., 1995), также называемый ТХ и 1сй2 (Еаисйеи е1 а1., 1995; Катеик е1 а1., 1995), и 1СЕ (ТйогиЬеггу е1 а1., 1992; СеггеШ е1 а1., 1992).

Отмеченный выше С-концевой сегмент МАСН в наибольшей степени сходен с СРР32 (при 41% идентичности и 62% гомологии) и ί.ΈΌ3 (при 34% идентичности и 56% гомологии). Показано существенно меньшее сходство с 1СЕ (при 28% идентичности и 50% гомологии) с его наиболее близкородственными гомологами 1СЕ_ге111 (также называемым ТХ и 1сй2) и 1СЕ_ге1111. Сходство было выявлено практически по всему сегменту, начинающемуся от тирозина-226 в пределах третьего блока вплоть до С-конца изоформы МАСНа.

Обращают на себя внимание две конкретные особенности такого сходства:

(a) Все известные протеазы семейства СЕЭ3/1СЕ расщепляют белки по сайтам, определяемым наличием в них остатка Ακρ в положении Р1 и наличием небольшого гидрофобного аминокислотного остатка в положении Р1'. Однако их специфичность различается в связи с другими структурными особенностями субстрата, включая природу остатков, находящихся в положениях Р2-Р4. Соответственно, остатки активных сайтов, вовлеченные в катализ (соответствующие остаткам гистидина-237, глицина238 и цистеина-285 в составе 1СЕ), и остатки, образующие связывающий карман для карбоксилатной боковой цепи Ρί-Ακρ (аргинин-179, глутамин-283, аргинин-341 и, по-видимому, серин-347), являются у этих протеаз консервативными. Эти остатки также хранятся в МΑСНα1. Имеется единственное исключение, хотя и связанное с консервативной заменой серина на треонин в сайте, соответствующем серину-347 в составе 1СЕ. Другим небольшим, но потенциально важным различием последовательностей между изоформами МАСНа и другими членами протеазного семейства, является замена аргинина на глутамин в сайте, соответствующем остатку аргинина-286 в составе 1СЕ. Этот остаток, который соседствует с потенциальным каталитическим цистеиновым остатком, характеризуется полной инвариантностью у всех других представителей семейства СЕЭ3/1СЕ. Также часть остатков в сайтах, локализованных вблизи субстратных остатков Р2-Р4, отличается у изоформ МАСНа от таковых, обнаруженных у других членов семейства СЕО3/1СЕ.

(b) Протеазы семейства СЕЭ3/1СЕ включают сайты авторасщепления. Для некоторых протеаз действительно известно прохождение этапа самопроцессинга, а у других - зависимость этого процессинга на проявления максимальной каталитической активности. Их полная по биологической активности форма состоит из двух связанных нековалентным образом продуктов расщепления, которые различаются по размерам (р20 и р17 у 1СЕ; р17 и р12 у СРР32). Присутствие потенциальных сайтов авторасщепления у других членов данного семейства подтверждает, что они являются субъектами для сходного процессинга, и сходным образом имеется зависимость проявления максимальной каталитической активности от такого процессинга. Такие потенциальные сайты авторасщепления имеются в составе МΑСНα1 почти в тех же положениях, что и в составе СРР32. Сайт, соответствующий Ν-концу субъединицы р17 СРР32, расположен во втором консервативном блоке аминокислот, лишь в нескольких аминокислотных остатках выше Ν-конца участка гомологии с СЕЭ3/1СЕ (ниже остатка аспарагино вой кислоты-216). Сайт, соответствующий точке расщепления между двумя субъединицами СРР32, расположен, как и во всех других членах семейства СЕО3/1СЕ, у которых известно расщепление, в нескольких аминокислотных остатках ниже каталитического цистеинового остатка (ниже аспарагиновой кислоты-374). Этот консерватизм подтверждает, что участок гомологии СЕЭ3/1СЕ в составе МΑСНα1 является субъектом протеолитического процессинга. Размер двух предполагаемых продуктов такого расщепления очень близок к таковому у двух субъединиц процессированной молекулы СРР32.

(с) Наличие протеолитической активности у участка гомологии с СЕЭ3/1СЕ в составе МАСН.

Для выяснения того, проявляет ли протеолитическую активность сегмент гомологии с СЕЭ3/1СЕ в составе МАСНа, заявителями были проведены эксперименты по экспрессии сегмента, который протянулся от сайта потенциального расщепления вверх до этого участка, между остатками Ακρ-216 и 8ег-217, вплоть до С-конца этого белка, в клетках бактерии в виде слитого белка, 68Т. Бактериальные лизаты были протестированы по способности расщеплять флуорогенные пептидные субстраты, для которых ранее было показано расщепление другими гомологами СЕЭ3/1СЕ. Были использованы два пептидных субстрата. Во-первых, это ацетилΑ8ρ-61и-Vа1-Α8ρ-а-(4-метилкумарил-7-амид) (ΑС-^ЕV^-ΛМС), соответствующий последовательности АДФ-рибозополимеразы (ΡΑΗΡ) ядерного белка, для которого установлена его расщепляемость в клетках почти сразу после стимуляции ΡΑδ-К (Теетаг! е1 а1., 1995Ь), равно как и при других апоптопических процессах (КаиТтапп, 1989; КаиТтапп е1 а1., 1993; Ьа/еЬшк е1 а1., 1994). Этот флуорогенный субстрат эффективно расщепляется протеазой СРР32. Второй флуорогенный субстрат - ацетил-Туг-Уа1Α1а-Α8ρ-ЛМС (Αс-ΥVЛ^-ЛМС), - соответствующий субстратному сайту для протеазы 1СЕ в последовательности предшественника ΙΕ-1β. Этот флуорогенный субстрат расщепляется протеазой 1СЕ. Лизаты бактерий, экспрессирующих сегмент гомологии с СЕЭ3/1СЕ из состава МΑСНα1, эффективно расщепляет производный от ΡΑ&Ρ флуорогенный субстрат. Однако у них не наблюдалось видимой протеолитической активности по отношению производной от предшественника интерлейкина-1в последовательности как флуорогенного субстрата (контроль) Лс-ΥVЛ^-ЛМС. которая является сайтом расщепления для протеазы 1СЕ в составе про-1Ь-1в (ТйогпЬепу е1 а1., 1992). Протеолитическая активность блокировалась йодуксусной кислотой (5 мМ): это подтверждает, что она опосредуется тиоловой протеазой. Не наблюдалось расщепления при тестировании лизатов, содержащих с 68Т-слитый участок МАСН, го89 мологичный протеазам СЕЬ3ЛСЕ, в котором каталитический остаток цистеина-360 был замещен серином. Также бактериальные лизаты, которые экспрессировали полноразмерный белок МАСНа1 в виде 68Т-слитого белка не расщепляют субстрат Ас-ЭЕ'^-АМС, повидимому, из-за отсутствия бактериальных ферментов, способных процессировать полноразмерную молекулу. Не происходило расщепления при тестировании лизатов, включающих любой из двух потенциальных продуктов расщепления сегмента гомологии с протеазами СЕЬ3/4СЕ.

Кинетика расщепления производного от последовательности РАКР флуорогенного субстрата Ас-ЭЕ'^-АМС (50 мкМ) экстрактом Е. со11, экспрессирующих 68Т-слитый белок сегмента гомологии СЕЬ3ЛСЕ МАСНа1 (от серина-217 до С-конца этого полипептида), была выявлена в сравнении с отсутствием такого расщепления экстрактом бактерий, экспрессирующих 68Т-слитые белки, полноразмерной молекулы МАСНа1 или любой один из двух продуктов протеолитического расщепления сегмента гомологии с СЕЬ3ЛСЕ (от серина-217 до аспарагиновой кислоты-374 и от аспарагиновой кислоты-374 до С-конца этого полипептида).

Далее была продемонстрирована зависимость расщепления субстрата Ас-ЭЕ'^-АМС от его концентрации, инкубируемого в течение 180 мин с экстрактом бактерий, экспрессирующих сегмент гомологии с СЕЬ3ЛСЕ из состава МАСНа1, слитый с 68Т. Не выявлено расщепления в случае присутствия йодуксусной кислоты (5 мМ). Экстракты не проявляли активности в отношении Ас-ΥVА^-АМС - флуорогенного субстрата, соответствующего сайту в составе предшественника Γ6-1β, являющемуся субстратом для протеазы ΚΈ.

Коротко, 68Т-слитые белки были получены в ХЬ1-синих бактериях с использованием экспрессирующего вектора р6ЕХ3. Бактерии лизировали ультразвуком в буфере, содержащем 25 мМ НЕРЕ8 (рН 7,5), 0,1% 3-[3-(холамидопропил)диметиламино]- 1-пропансульфоната, 5 мМ ЕЬТА и 2 мМ ЬЬТ с последующим центрифугированием при 16000д в течение 10 мин. Анализ с помощью 8Ь 8-электрофореза в ПААГ подтвердил присутствие сходного содержания различных слитых белков в лизатах. Аликвоты экстрактов по 50 мкл (4 мг/мл общего белка) инкубировали при комнатной температуре в течение определенного периода при общем объеме реакционной смеси 500 мкл с флуорогенным субстратом при определенных концентрациях. Выход АМС определяли спектрофлуорометрически при длинах волн 380 нм (возбуждение) и 460 нм (эмиссия). Концентрацию АМС определяли по калибровочным кривым. Оба пептида, использовавшихся в качестве флуоро генных субстратов, были получены от РерРбе ТпзЙЛе Кс. (Окака, Япония). Для других протеаз СЕЬ3ЛСЕ было показано проявление полной активности только после протеолитического процессинга, который происходит либо по механизму саморасщепления, либо путём расщепления другими протеазами (см. обзор Китаг, 1995; НепкаП, 1996). Полученные заявителями данные о том, что лизаты бактерий, экспрессирующих молекулы 68Т-МАСНа1, не проявляют ферментативной активности в противоположность активности, проявляемой лизатами бактерий, экспрессирующих сегмент гомологии с СЕЬ3ЛСЕ, подтверждают, что для активности МАСНа также необходим процессинг. Путь, по которому процессинг МАСНа происходит в клетках млекопитающих и то, как этот процессинг может опосредоваться рецепторами РА8-К или р55-К, пока неясно. Для МОКТ-1 было показано связывание в клетках с активированным РА8-К наряду с некоторыми другими белками (К1ксйке1 еί а1., 1995). Эти белки, по-видимому, включают МАСНа1 и другие изоформы МАСН. Представляется весьма вероятным, что связывание МОКТ-1 с РА8-К в комплексе с МАСНа удерживает вместе некоторые молекулы МАСН или индуцирует их конформационные преобразования и что эти изменения либо опосредуют автолитический процессинг МАСНа, либо делают МАСНа восприимчивым к расщеплению другими протеазами. Стимуляция рецептора р55-К может опосредовать саморасщепление МАСНа сходным, хотя и в меньшей степени направленным образом за счет удерживания вместе нескольких молекул ТКАЭЬ или индуцирования их конформационных преобразований, которые, в свою очередь, индуцируют изменение в формировании или статусе, или агрегируемости белка МОКТ-1 и связанной с ним молекулы.

Субстратная специфичность МАСНа представляется весьма ориентированной на гибель. Хотя он мог бы расщеплять пептидный субстрат, соответствующий сайту расщепления в составе гибель-субстрата РАКР (Ас-ЭЕ'^АМС), МАСНа не проявляет протеолитической активности по отношению к пептиду, соответствующему сайту процессинга предшественника интерлейкина-^ протеазой ΚΈ (Ас-ΥVА^АМС). Идентификация клеточных белков, которые бы служили субстратами для расщепления белком МАСНа, позволит определить более отдалённые события в процессе индукции этой протеазой гибели клеток. Вероятными субстратами для расщепления белком

МАСНа являются другие члены семейства

СЕЬ3ЛСЕ, такие как СРР32 и ΚΈ. Некоторые из этих протеаз действительно процессируются после опосредования рецепторами РА8-К или

ТИР-К (Мшга еί а1., 1995; 8с111еде1 еί а1., 1996;

СЫппа1уап еί а1., 1996). Не исключено, что и протеазы, не входящие в состав семейства ΟΈΩ-Ι/ΚΈ, также активируются белком МАСНа либо напрямую, либо опосредованно через активность других протеаз 0ΈΩ3/ΚΈ. Вовлечение множества протеаз в процессы клеточной гибели согласуется с известной способностью ингибиторов различных протеаз, включая ингибиторы сериновых протеаз и ингибитор расщепления ΚΈ, равно как и антисмысловой кДНК Κ'Έ, защищать клетки от проявления токсичности, индуцируемой рецепторами РА8-Н и ЮТ-Н (ХУейхеп & 0гапдег, 1980; Нидд1его е! а1., 1987; Επηπ е! а1., 1995; Ьоз е! а1., 1995).

Различные группы других ферментов, включая фосфолипазы, сфингомиелазы и протеинкиназы, могут участовать в индукции гибели клеток, опосредуемой рецепторами Т№ и РА8Н (см. р1зсЕеп е! а1., 1994; УапбепаЬее1е е! а1., 1995; С1£опе е! а1., 1995, и библиография в этих статьях). Некоторые из этих ферментов могут быть активированы путем протеолитического расщепления, инициируемого белком МАСНа. Также кажется возможным, однако, что, по крайней мере, часть этих других гибельсвязанных активностей стимулируется обособленными сигнальными механизмами, не зависящими от стимуляции с участием МАСНа. Вовлечение более чем одного сигнального каскада в индукцию гибели клеток - некоторых обычных для р55-Н и РА8/АР01 и некоторых, индуцируемых только одним из них, - должно согласовываться с сообщением о существовании как общих, так и различающихся характеристик процессов гибели клеток, индуцируемых этими двумя типами рецепторов (0ге11 е! а1., 1994; 8сЕике-Оз!Ео££ е! а1., 1994; \Уопд & 0оеббе1, 1994; С1етеп! & 8!атепкоу1с, 1994).

(б) МАСНа 1 связывается и с МОНТ-1, и с МАСНв1.

Для обнаружения того, может ли МАСНа1 связываться с МОНТ-1 так, как он связывается с МАСНв1, было сначала исследовано взаимодействие этих белков в трансфицированных клетках дрожжей. Данный эффект проявлялся в существенном уменьшении выхода колоний дрожжей, которые бы экспрессировали белок, кодируемый вектором, включающим активаторный домен (АО) (уровень экспрессии которого выше, чем уровень экспрессии вектора, включающего ДНК-связывающий домен ПВО). С другой стороны, МАСНв1, в составе которого каталитический остаток цистеина-360 был замещен на серин (МАСНа1 [С360З]), не проявлял цитотоксичности ни в отношении клеток млекопитающих (см. ниже), ни в отношении дрожжей. Как и МАСНв1, МАСНа 1 [С360З] связывался в трансфицированных клетках дрожжей с МОНТ-1 и сам с собой. Он также связывался с МАСНв1. Также клетки дрожжей, экспрессирующие МАСНа1 дикого типа вместе с МОНТ-1 или МАСНв1, проявляли взаимодей ствие трансфицированных белков. Однако интенсивность цвета, обусловленного ΕκΖпродуктом, варьировалась между колониями дрожжей: у дрожжей, трансфицированных МАСНа1 в составе обоих векторов (АО и ПВО) окрашенный продукт не выявлялся вовсе, вероятно, из-за цитотоксического проявления МАСНа1 дикого типа. К тому же, несмотря на такую вариабельность, дрожжи, экспрессировавшие МАСНа1 либо в комбинации с МОНТ1, либо в комбинации с МАСНв1, проявляли отчётливую позитивную реакцию по взаимодействию трансфицированных белков. В отличие от МАСНв1, МАСНа 1 не проявил в дигибридном тесте взаимодействия по типу сам с собой.

И МАСНа1 [С360З], и МАСНв1 иммунопреципитировались одновременно с МОНТ-1 из лизатов эмбриональных почечных клеток 293ΕВNА человека, что указывает на их связывание с МОНТ-1 также и в клетках млекопитающих. Проводили дальнейшее тестирование МАСНа1 на возможность связывания с МОНТ-1 также в клетках млекопитающих, осуществляли экспрессию МАСНа 1 или МАСНв1, слитых с октопептидом РЬА0, наряду с молекулами МОНТ-1, помеченными эпитопом НА. Метаболически помеченные с помощью ³⁵З МАСНа 1 и МАСНв1, слитые по своим Ν-концам с октопептидом РЬА0 (РЬА0-МАСНа1 и β1), и МОНТ-1, слитый по своему Ν-концу с эпитопом НА (Р1е1б е! а1., 1988), были экспрессированы в клетках НеЬа. Иммунопреципитация белков из лизатов этих клеток была осуществлена с использованием моноклональных антител мыши к октопептиду РЬА0 (М2: Εазΐтаη Кобак), эпитопу НА (12С5: Р1е1б е! а1., 1988) или рецептору р75-Т№-Н (№ 9: В1дба е! а1., 1994), взятому в качестве контроля. Белки были проанализированы с применением δΌδ-электрофореза в 12%полиакриламидном геле с последующей авторадиографией. И МАСНа 1, и МАСНв1 иммунопреципитировались вместе с МОНТ-1 из лизатов клеток, что подтверждает их связывание с белком МОНТ-1. Эффективность взаимодействия МАСНа1 с белком МОНТ-1 представляется меньшей по сравнению с таковой у МАСНв 1.

(е) Способность опосредовать клеточную гибель молекулами МАСН, содержащими сегмент гомологии с ΕΈΩ3/ΚΈ.

С целью оценки участия МАСН в индукции клеточной гибели было исследовано влияние сверхэкспрессии различных изоформ МАСН на жизнеспособность клеток. Анализ был проведен путем трансфекции экспрессирующих МАСН векторов вместе с вектором, экспрессирующим β-галактозидазу, взятым в качестве маркера трансфекции, в эмбриональные почечные клетки 293-ΕВNА человека и клетки карциномы молочной железы МСР7 человека.

Коротко, клетки 293-ΕΒNА, клетки карциномы молочной железы ΜСΕ7 человека и клетки НеЬа НПА-1 выращивали в модифицированной по Дальбекко минимальной среде Игла с добавлением 10% плодной телячьей сыворотки, заменимых аминокислот, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мг стрептомицина. Чашки с клеточными культурами (5х10⁵ клеток 293-ΕΒNА, 3х10⁵ клеток ΜСΕ7 или 3х10⁵ клеток НеЬа на 6 см чашках) трансфицировали по перемежающемуся типу с использованием метода осаждения с фосфатом кальция, используя кДНК определённого белка вместе с вектором, экспрессирующим β-галактозидазу. В одной группе экспериментов каждую чашку трансфицировали 3,5 мкг конструкции МАСН и 1,5 мкг р8У-в-Са1, а в другой группе экспериментов каждую чашку трансфицировали 2,5 мкг указанного варианта МАСН и конструкцией ΜΟΚΤ-1 (или в качестве контроля пустым вектором) и 1,5 мкг рЗУ-β6а1. Клетки промывали через 6-10 ч после трансфекции. Клетки 293-ΕΒNА и ΜСΕ7 затем инкубировали еще на протяжении 18 ч без дополнительной обработки. Клетки НеЬа инкубировали после трансфекции в течение 26 ч и затем еще 5 ч в присутствии либо антитела к ЕА8/АР01 (СН11: 0,5 мкг/мл), либо к ΤΝΕ (100 нг/мл), в обоих случаях с добавлением циклогексимида (10 мкг/мл). Интенсивность гибели клеток по окончании периода инкубации оценивали по уровню экспрессии Р-галактозидазы в соответствии с описанным у Китаг е! а1., 1994.

Культуры, трансфицированные векторами, экспрессирующими ΜАСНα1 или ΜАСНα2, проявляли массовую гибель клеток, что проявлялось в округлении, ссыхании клеток, образовании шероховатости их поверхности и в конце концов отрыве клеток от поверхности чашки. Спустя 20 ч после трансфекции большинство трансфицированных клеток, идентифицированных по β-галактозидазному окрашиванию (X6а1), проявляли отчётливую морфологическую конденсированность, типичную для процесса апоптоза. С другой стороны, клетки, экспрессирующие пустой вектор, выживали.

Для оценки участия сегмента гомологии с СЕЭ3/1СЕ в составе изоформ МАСНа в проявлении такого апоптотического эффекта клетки были трансфицированы вектором, экспрессирующим изоформу МАСЩГ которая лишена сегмента гомологии с СЕЭ3/1СЕ, равно как и вектором, экспрессирующим изоформу МАСНа3, которая лишена Ν-концевой части этого сегмента, и вектором, экспрессирующим ΜАСНα1 [С3608], и вектором, экспрессирующим укороченную по С-концу мутантную форму ΜАСНα1 [ΜАСНα1(1-415)], которые лишены одного из аминокислотных остатков, считающегося критическим по обеспечению СЕО8/1СЕ-протеазной функции (соответствует серину-347 в составе 1СЕ). Никакой гибели (за исключением очень низкого ее уровня, выявленного при трансфекции пустым экспрессионным вектором) не было отмечено в клетках 293-ΕΒNА или ΜСΕ7, трансфицированных векторами, экспрессирующими МАСНа3,

ΜΆίΉα^Μ^) или ΜАСНα1 [С3608]. Более того, клетки, трансфицированные ΜАСНα1 одновременно с этими векторами, проявляли очень слабую клеточную гибель: это указывает на проявление молекулами МАСН, включающими неполный сегмент гомологии с СЕЭ3/1СЕ, негативного доминантного эффекта по отношению к активности молекул дикого типа. Культуры, экспрессирующие ΜАСНβ1, которые вообще лишены сегмента гомологии с СЕЭ3/1СЕ, проявляли слабую степень клеточной гибели. Такое проявление ΜАСНβ1, которое, что наиболее вероятно, является результатом активации эндогенных молекул ΜАСНα1, было по ряду причин более выраженным в трансфицированных клетках НеЬа. Более того, в клетках НеЬа варианты МАСНа3, ΜАСНα1(1415) или ΜАСНα1 [С3608] также в некоторой степени были цитотоксичными.

Активность МАСНа, по-видимому, составляет наиболее ранний каталитический этап в каскаде сигналов цитотоксического проявления ЕА8/АР01 и р55-К. Способность МАСЩ1 связываться с ΜΟΚΤ-1 и ΜАСНα1 подтверждает, что эта изоформа усиливает активность каталитически активных изоформ. Вполне вероятно, что некоторые изоформы МАСН обладают дополнительными функциями. Способность ΜАСНβ1 связываться и с ΜΟΚΤ-1, и с ΜАСНα1 подтверждает то, что эта изоформа должна усиливать активность каталитически активных изоформ. Средняя цитотоксичность, наблюдаемая в культурах клеток 293-ΕΒNА и ΜСΕ7, трансфицированных этой изоформой, и достаточно более выраженный цитотоксический эффект, который она проявляет в клетках НеЬа, вероятно, отражает активацию эндогенно экспрессируемых молекул МАСНа по их связыванию с трансфицированными молекулами ΜАСНβ1. Предположительно, некоторые из изоформ МАСН могут также действовать в качестве депо-сайтов для молекул, которые вовлечены в иные, не связанные с цитотоксичностью проявления рецепторов ЕА8/АР01 и ΤΝΕ.

(ί) Блокировка функции МАСНа препятствуют индукции клеточной гибели рецепторами ЕА8/АР01 и р55-К.

Для оценки вклада МАСНа в цитотоксичность, опосредуемую ЕА8/АР01 и р55-К, МАСНа3, а также нефункциональные мутанты ΜАСНα1 (1-415) или ΜАСНα [С3608] были экспрессированы в клетках, в которых индуцировали проявление цитотоксичности. Цитотоксичность, индуцируемая р55-К, включалась в клетках 293-ΕΒNА в результате перемежаю щейся сверхэкспрессии этого рецептора (Во1бш е! а1., 1995а), а цитотоксичность, обусловленная РА8/АР01, сверхэкспрессией химерных молекул, включающих внеклеточный домен р55-К и трансмембранный и внутриклеточный домены РА8/АР01. Эта химера обладала существенно более сильным цитотоксическим действием в сравнении с нормальным рецептором РА8/АР01. Цитотоксическая активность в клетках НеЬа также индуцировалась обработкой их ΤΝΕ или антителом к РА8/АР01 в присутствие циклогексимида, являющегося блокиратором белкового синтеза. Клетки НеЬа становились восприимчивыми к РА8/АР01 вследствие перемежающейся экспрессии этого рецептора. Во всех протестированных системах МАСНа3 и нефункциональные мутанты МАСНа1 обеспечивали эффективную защиту от цитотоксичности, индуцируемой действием РА8/АР01 или р55-К. Такая защита также была выявлена, как и раньше было описано (Нки е! а1., 1996; Οιίηηηίуан е! а1., 1996), в клетках, трансфицированных делеционным по Ν-концевой части мутантным вариантом МОКΤ-1, который лишён МАСНсвязывающего сегмента МОКЛ1 (92-208). Эти защитные проявления указывают на то, что МАСНа является необходимым компонентом для сигнальных каскадов по индукции клеточной гибели с участием и РА8/АР01, и р55-К.

Белок МАСН экспрессирован в различных тканях на значительно различающихся уровнях и, по-видимому, при значительно дифференцированном изотипическом составе. Вероятно, что эти различия обусловливают тканеспецифичные параметры реакции на лиганд РА8/АР01 и на ΤΝΕ. Как и в случаях с другими гомологами СЕЭ3/АСЕ Шаид е! а1., 1994; А1петп е! а1., 1995), изоформы МАСН, содержащие неполный сегмент гомологии с СЕЭ3/1СЕ (например, МАСНа3), как обнаружено, подавляют активность одновременно экспрессирующихся молекул МАСНа1 или МАСНа2: для них также была обнаружена блокировка индукции клеточной гибели факторами РА8/АР01 и р55-К. Экспрессия таких ингибиторных изоформ в клетках может представлять собой механизм клеточной самозащиты от цитотоксичности, опосредуемой РА8/АР01 и ΤΝΕ. Широкий спектр гетерогенности изоформ МАСН, существенно больший в сравнении с любыми другими протеазами семейства СЕЭ3/1СЕ, должен обусловливать наличие более узких функциональных специализаций у конкретных изоформ МАСН.

Пример 1. Клонирование и выделение белка С1, который связывается с МОКЛсвязывающимся белком Мсй4.

(ί) Дигибридный скрининг и дигибридный тест с экспрессией β-галактозидазы.

С использованием процедур, описанных в данном тексте выше в ссылочных примерах 1-3, был выделен новый белок, обозначенный С1, который, по-видимому, гомологичен и, следовательно, вероятно, является членом семейства протеаз СЕЭ3/1СЕ. Белок С1 включает два модуля, проявляющие гомологию с модулями в составе МОКЦ а именно гомологию с Νконцевой частью МОКЛ1, модулями МОКΤ белков МАСН (см. описанные выше ссылочные примеры 1-3 и Во1бт е! а1., 1996) и с модулями МОЭТ другого родственного МОКЛсвязывающегося белка Мсй4 (см. Εе^ηаηбекА1петп е! а1., 1996; 8гш1уаки1а е! а1., 1996). Кроме того, белок С1 включает каталитический (протеазоподобный) сегмент, который оказывается гомологичным каталитическим (протеазным) сегментам протеаз семейства СЕЭ3/1СЕ (например, протеазным сегментам белков МАСН и Мсй4 и других).

Коротко, клон белка С (клон С1) был получен после дигибридного скрининга библиотеки кДНК Т-клеток 1игка! человека с использованием белка Мсй в качестве приманки. Была использована библиотека кДНК Т-клеток Лгка! человека, помеченная активаторным доменом САЬ4; скрининг осуществляли с использованием репортерного штамма дрожжей НЕ7с (С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА, США) в отсутствие 3аминотриазола в соответствии с протоколом Ма!сйтакег™ Τтео-НуЬ^^б 8ук!ет Рго!осо1 (С1оп!ссй). Последовательность Мсй4 была взята из базы данных ЕМВЬ. Используя эту выделенную последовательность, затравки для ПЦР были сформированы на основе программы ОЫСО™, а фрагмент ДНК, соответствующий кодирующей части Мсй4, был выделен с применением ПЦР с ревертированием (ΗΤ-РСК) на материале тотальной РНК, полученной стандартными методами из линии первичных клеток эндотелия пуповинной вены человека (НИУЕ). Кодирующая часть Мсй4 затем была клонирована в состав вектора рСАЭСН (С1оп!ссй) и использована в качестве приманки так, как это описано выше, для процедуры дигибридного скрининга. В ходе этого дигибридного скрининга были получены 11 клонов: все они кодировали белок, который, по-видимому, является сплайсинговым вариантом белка, включающего два мотива гомологии с МОКЛ1. Анализ предварительной частичной последовательности С1 последовательностей базы данных бВек! и базы данных геном человека (уровень 1) позволил выявить несколько Е8Τ-последовательностей (неидентифицированные транскрибируемые метки), включающие фрагменты последовательности клона С1. Секвенирование этих Е8Τ показало, что, возможно, имеется серия сплайсинговых вариантов белка С1, которые включают последовательность, кодирующую полипептидный мотив, гомологичный 1СЕподобным протеазам, и что эта последовательность расположена с 3'-стороны от последовательности С1, выявленной в ходе дигибридного скрининга.

Для выделения полной последовательности изоформы 01, включающей протеазоподобный каталитический сегмент, реакция обратной транскрипции была проведена на основе тотальной РНК, выделенной из различных клеточных линий, с использованием в качестве затравки олигонуклеотида, включающего мотив дТ15 и адапторную последовательность с целью формирования молекул кДНК. Эти молекулы кДНК затем были использованы в качестве матриц для ПЦР, в которой затравки были подобраны и синтезированы в форме олигонуклеотидов, включающих последовательность, полученную от 5'-некодирующей части 01, и адапторную последовательность: эти затравки были использованы в первом раунде реакции ПЦР. После этого во втором раунде ПЦР были использованы дополнительные олигонуклеотидные затравки, включающие последовательность 5'-кодирующей части 01, включая старт-кодон АТ0, равно как и адапторную последовательность. В этом случае было возможным получить полную последовательность предполагаемого сплайсингового варианта белка 01, который включает каталитический (протеазоподобный) сегмент. Он представляет все кроме одной из предполагаемых изоформ 01.

Предварительно определённая последовательность одной такой изоформы 01 - сплайсингового варианта 01 - представлена на фиг. 1. В ней верхняя последовательность - это нуклеотидная последовательность, а нижняя - расшифрованная аминокислотная последовательность по ОВР, начинающейся с кодона АТ0 (482-й нуклеотид) и заканчивающейся ТАА (нуклеотид 1921) - эти начальный и конечный нуклеотиды в приведённой нуклеотидной последовательности помечены звездочками (*). Сплайсинговый вариант 01, показанный на фиг. 1, также предварительно обозначен как 01а.

На фиг. 2 схематически изображена предварительно определенная последовательность другой изоформы 01 - короткий сплайсинговый вариант 01, включающий два МОВТмодуля, предварительно обозначенный как 01 β, на котором верхняя последовательность является нуклеотидной последовательностью, а нижняя - расшифрованной аминокислотной последовательностью по ОВР, начинающейся с 482-го нуклеотида (старт-кодон АТ0) и заканчивающейся 1145-м нуклеотидом (стоп-кодон Т0А): старт- и стоп-кодоны в нуклеотидной последовательности помечены звёздочками (*).

Кроме того, необходимо заметить, что исходно выделенный 01 клон, полученный с помощью последовательности Мс114, взятой в качестве приманки, был, по крайней мере, частью короткого варианта 01, названного 01β (см. фиг. 2). Этот исходно выделенный 01 клон являлся частью клона новой кДНК, которая, как и МАСН (СА8Р-8), и Мсй4 (СА8Р-10), включает два гибель-доменных мотива - МОВТмодуля (или гибель-эффекторного домена ΌΕΌ), расположенных сразу ниже его Ν-конца (см. также фиг. 3). С использованием исходного клона было возможным затем выделить и охарактеризовать клоны кДНК, соответствующие более крупному сплайсинговому варианту - 01а и более короткому сплайсинговому варианту 01β. Более крупный сплайсинговый вариант включает С-концевой сегмент, гомологичный протеазному сегменту каспаз, и следовательно, он является вероятным новым членом семейства каспаз. Поэтому 01 был также обозначен аббревиатурой СА8Н, используемой для обозначения каспазных гомологов. Было проведено сравнение последовательностей 01а (СА8На) и 01 β (СА8Щ) с последовательностями других каспаз (для больших подробностей, особенно по выделению последовательности 01 мыши, см. ниже, а также выше раздел описания чертежей в части комментариев к фиг. 3). Результаты такого сравнения схематически представлены на фиг. 3: все подробности, в частности ключ для определения принадлежности последовательностей на этой фигуре, включены в раздел Краткое описание чертежей.

После описанного выше исходного клонирования и секвенирования 01, в частности его изоформ 01а и 01β, был проведен дальнейший анализ этих белков.

(ίί) Анализ с помощью Нозерн-блоттинга и дополнительное секвенирование.

Анализ методом Нозерн-блоттинга показал, что белок 01 существует, по крайней мере, в трех размерных вариантах транскриптов 2000, 2400 и 4400 нуклеотидов, соотношение которых в разных тканях варьируется в значительной степени (фиг. 4). Для получения полноразмерной кДНК белка 01 (СА8Н), для скрининга использовали библиотеку кДНК фибробластов кожи человека (С1оп!есй) с зондом в виде кДНК, соответствующей последовательности 01. Были выявлены два типа кДНК, соответствующие двум сплайсинговым вариантам 01 (также см. выше). Белки, кодируемые этими кДНК, имеют общий Ν-концевой участок, включающий гибель-эффекторный домен, однако их С-концевые участки различались. Один из них (01β=СА8Нβ) имеет короткий Сконец, соответствующий тому, который имеется в составе исходной клонированной кДНК. Другой вариант (01а=СА8На) имел длинный Сконец.

Аминокислотная последовательность этого длинного С-концевого сегмента 01а показала достаточно высокий уровень гомологии с таковым в являющихся предшествующими для протеазных доменов сегментах в составе МАСН (СА8Р-8) и Мсй4 (СА8Р-10) (фиг. 3). Однако 01а утратил некоторые аминокислоты, которые считаются критическими для протеазной актив

100 ности: это подтверждает то, что этот белок может быть лишен активности цистеиновой протеазы. Считается интересным, что С 1α включает каспазо-субстратную последовательность в сайте, соответствующем сайту протеолитического процессинга в составе протеазного сегмента ΜΑΕΉ (С/\ЗР-8) и Мсй4 (ΟΑδΡ-ΣΘ) (затенены на фиг. 3). Предварительные данные подтверждают, что С1а действительно может быть расщеплен по этому сайту с участием ΜΑΟΗ (данные не показаны).

Основываясь на нуклеотидной последовательности клона ЕЗГ для которой было выявлено соответствие гомологу мыши в части участка гибель-домена (ΌΞΩ) в составе С1, кДНК обоих сплайсинговых вариантов мыши - СΑЗΗα и СΑЗΗβ - были клонированы из библиотеки мРНК клеток печени мыши с применением ПЦР с ревертированием. Клон ЕЕН (депозитарный № АА198928 базы данных СепБапк) был идентифицирован, как гомолог мыши по отношению к части сегмента ПЕП из состава С1. Основываясь на этой последовательности, сплайсинговые варианты С1а (САЗНа) и СI β (ΕΑδΗβ) мыши были клонированы из библиотеки мРНК клеток печени с применением ПЦР с ревертированием. Реакция обратной транскриптазы была проведена с использованием олигодезокситимидиновой адапторной затравки 5'-СΑСΤССΑСΤСΤΑСΑСΤССΑС-(Τ)17-3' и обратной транскриптазы ΑΜν (Рготеда), используя рекомендации производителей. Первый раунд ПЦР был осуществлен с использованием Ехрапб Ьопд Τетρ1а!е РСТ Зук!ет ^оейн^е!^- Маппйе1т) и следующих смысловой и антисмысловой затравок: 5'СССΤΤСΤССΤССΤΤСССΑСΑСС-3' и 5'СΑСΤССΑСΤСΤΑСΑСΤССΑС-3' (адаптер) соответственно. Второй раунд был проведен с использованием полимеразы Vеη! (NΕΒ) и смысловой концентрированной затравки 5'ΤССΤСΤΤССΤСΤСΤΑСΑСΑΤС-3' и адаптера.

Сравнение последовательностей показало высокий уровень консерватизма по длине молекулы С1а (САЗНа (71% идентичности по сегменту ПЕО и 59% по сегменту протеазной гомологии): это подтверждает, что и домен ПЕО, и сегмент протеазной гомологии этого белка существенны по определению его функций (см. фиг. 3).

(ш) Дигибридный анализ специфичности связывания изоформ С1.

Дигибридный анализ параметров взаимодействия вариантов С 1а (САЗНа) и СЦ (ΕΑδΗβ) (фиг. 5) показал, что оба этих варианта взаимодействуют с ΜΟΚΤ-1/ΕΑΩΌ и ΜΑ№ ΉΑ3Ρ-8), наиболее вероятно опосредованно через их общий домен ПЕП. Хотя исходно клонированные с помощью дигибридного скрининга белки связываются с Мсй4 (САЗР-И)), С1 β ΉΑ3Ρβ), было обнаружено, что в этом тесте связь с Мсй4 (СΑЗΡ-10) оказалась непрочной, а также С1а (СΑЗΗα), также непрочно связывался с Мсй4. Однако необходимо отметить, что исходный дигибридный скрининг привел к клонированию белков С1, различающихся по специфичности их связывания при дигибридном скрининге: следовательно, на самом деле можно предположить, что и С1а, и С1 β связываются с ΜΑΟΉ и Мсй4 так же, как это показало и исходное клонирование. Два варианта С1 также проявляют самосвязываемость и связываются друг с другом, но при этом не связываются с ШР или ΤΚΑΌΌ (адапторные белки, которые, наподобие ΜΟΚΤ-1/ΕΑΩΌ, включают гибельдомены, но лишены ПЕО) и не связываются с рядом не относящихся к делу белков (например, с ламином), которые использовались в качестве специфического контроля.

Для дальнейшего анализа функций С1 два его варианта были экспрессированы по перемежающемуся типу в клетках НеЬа и 293-Т, и в них проводили оценку влияния трансфицированных белков на сигнальный механизм, индуцируемый ρ55-Κ (СО 120а) и вовлеченный в проявление цитотоксичности, включаемой участием ΤΝΕ или сверхэкспрессией этого рецептора, равно как на сигнальный механизм, индуцируемый ΕΑ3-Κ (СЛ95) и вовлеченный в проявление цитотоксичности, включаемой антителом, перекрестно связывающимся с ΕΑ3-Κ, или сверхэкспрессией химерного рецептора, включающего внеклеточный домен ρ55-Κ (СЛ120а) и внутриклеточный домен ΕΑ3-Κ (СП95) (см. фиг. 6). В обеих клеточных линиях экспрессия СЦ (ΟΑδ^) сама по себе не влияет на жизнеспособность клеток, но в значительной степени подавляет индукцию клеточной гибели с участием ρ55-Κ (СЛ120а), а также рецептором ΕΑ3Κ (СО95). Экспрессия варианта С1а (ΟΑδ^) влияет на две тестированные клеточные линии в значительной степени неодинаково. В клетках НеЬа он ингибирует цитотоксическое влияние ρ55-Κ (СО120а) и ΕΑ3-Κ (СО95), сходную с таковой у СЦ (СΑЗΗβ). Однако в клетках 293-Т он обусловливает существенную цитотоксичность. Сходная цитотоксичность была выявлена тогда, когда белок С1а был экспрессирован в клетках 293-ΕΒNΑ (не показано). Этот цитотоксический эффект мог быть полностью заблокирован путем коэкспрессии р35 - ингибитора каспаз, производного от бакуловирусов (о р35 см. также С1ет е! а1., 1991; Хие & Ногуй/, 1995).

Для оценки вклада участка протеазной гомологии в составе С1а (СΑЗΗα) в проявляемый им губительный для клеток эффект были исследованы функции двух мутантных вариантов этого белка. Эти мутанты таковы: С1/СΑЗΗα(1385) и С1/СΑЗΗα(1-408), т.е. они имеют Сконцевые делеции в сегменте, соответствующем части протеазного домена, от которого является производной малая субъединица зрелой протеазы. Оба мутанта не обладали каким-либо цито

101

102 токсическим эффектом. Более того, как и 61β ^ΑδΗβ), они защищали клетки линии 293 от индукции гибели рецепторами ρ55-Κ (СЭ120а) и ΕΑδ-Κ (СО95) (фиг. 6С и 6Ό).

Необходимо заметить, что для проведения описанных выше процедур были использованы следующие методы и материалы.

(1) Делеционные мутанты 61α (САЗН/.) и химера ρ55-Κ/ΕΑδ-Κ (СЭ120а/СЭ95) были получены с помощью метода ПЦР и(или) стандартного клонирования. Сплайсинговые варианты 61 (САЗН), белки сигнального каскада ΕΑδΚ (СО95) и ρ55-Κ (СО 120а) (все происходят из тканей человека) и бакуловирусный белок р35 были экспрессированы в клетках млекопитающих с использованием экспрессирующего вектора ρс^NΑ3 (ΙηνίϋΌ^η). β-Галактозидазу экспрессировали с использованием вектора ρСΜVв-6а1 (Рготеда).

(2) Клетки эмбриональной почки человека 293-Т и 293-ΕΒΝΑ и клетки карциномы шейки матки человека НеЬа (НеЬа-ΕΑδ: клон ΗίΗΑ-1), стабильно экспрессирующие трансфицированный ΕΑδ-Κ (СЭ95) человека (разработанные в лаборатории заявителей), выращивали в модифицированной по Дальбекко минимальной среде Игла с добавлением 10% плодной телячьей сыворотки, заменимых аминокислот, 100 ед./мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.

Описанные выше результаты показывают, что белок 61 может взаимодействовать с компонентами сигнальных комплексов ρ55-Κ и ΕΑδ-Κ и что он подавляет индукцию гибели по такому пути, который может быть различным в зависимости от типа сплайсингового варианта 61 и от типа клеток, в котором он экспрессируется.

Подавление вариантом 61β индукции цитотоксичности, а в случае с клетками НеЬа также и вариантом 61α, по-видимому, опосредуется сегментом гибель-домена (ΌΕΌ) этого белка. Это, возможно, отражает наличие конкуренции ΌΕΌ в составе 61 с соответствующими сегментами в составе ΜΑΟΉ ^Α8Ρ-8) и Μ6ι4 ΉΑ8Ρ-10) по связыванию с ΜΟΚΤ-1/ΕЛ^^.

С точки зрения пути, по которому СΑ§Ηα обусловливает гибель клеток 293, способность белка р35 блокировать цитотоксический эффект определяет, что цитотоксичность опосредуется активностью каспаз. Однако 61α даже при проявлении существенной гомологии с последовательностями каспаз действительно может утрачивать цистеино-протеазную активность ввиду того, что в его составе отсутствуют несколько консервативных для каспазы аминокислот в составе активного сайта. Таким образом, 61α может действовать путем активирования других молекул, которые обладают каспазной активностью.

Другая возможность связана с тем, что 61α, хотя и не способен сам действовать в каче стве протеазы, может, тем не менее, составлять часть активной протеазной молекулы. Кристаллографический анализ структуры С.А8Р-1 и ΕΆδΡ-.Ι указывает на то, что малая и большая субъединицы протеазы в составе каждого процессированного фермента являются производными от разных проферментных молекулпредшественников (\Уа1кег е! а1., 1994; ΧνίΕοη е! а1., 1994; Μί!ίί е! а1., 1997; ΚοΙοηάη е! а1., 1996). В связи с обнаруженной зависимостью цитотоксической активности 61α от интактности сегмента, соответствующего малой субъединице протеазы (фиг. 6С), может быть такое, что данный сегмент в составе 61α ^Α^α) способен связаться с большой субъединицей некоторых каспаз (каспазы) по такому пути, который в результате приводит к перестройке каталитически активной молекулы. Образующийся в результате активный гетеротетрамер должен в дальнейшем быть способен активировать другие каспазы, тем самым включая механизм клеточной гибели.

Далее также было установлено (результаты не показаны), что белок 61 имеет, по крайней мере, определенный уровень гомологии с другим белком, названным ΜΎΏ88, который вовлечён в сигнальный механизм, опосредуемый интерлейкином-1. Таким образом, белок 61 также может быть вовлечен в другие механизмы, инициируемые/опосредуемые другими цитокинами.

С точки зрения сказанного выше относительно клонирования и выделения белка 61 (по крайней мере, двух его изоформ), отмечаются следующие характеристики и возможности использования 61:

(1) Белок 61 был клонирован с применением дигибридного скрининга в виде молекулы, которая связывается с ΜΟΚΤ1-связывающимся белком Μ6ι4 и, следовательно, возможно его участие в модулировании активности белков Μ6ι4 и ΜΟΚΤ-1 соответственно, по определённым выше механизмам белок 61 очевидно вовлечен в модулирование клеточных процессов, инициируемых рецепторами ΕΑδ-Κ и ρ55-Κ. Поскольку Μ6ι4 способен связываться с ΜΟΚΤ-1 и напрямую участвует в проявлении цитотоксичности и, в конечном счёте, индукции гибели клеток и поскольку некоторые изоформы Μ6ι4 известны как ингибиторы клеточной гибели, отмечается, что белок 61, включая его различные изоформы, может быть напрямую или опосредованно вовлечен и в проявление цитотоксичности и клеточной гибели, и, равным образом, в подавление гибели клеток.

(2) Очевидно, что белок 61 характеризуется Ν-концом, который включает два ΜΟΚΤмодуля, гомологичным двум ΜΟΚΤ-модулям в составе МАСН (см. описанные выше ссылочные примеры 1-3) и Μ6ι4. Присутствие этих ΜΟΚΤ-модулей в составе 61 свидетельствует,

103

104 таким образом, о его способности связываться с Мск4, а также, возможно, о связывании 61 (или, по крайней мере, некоторых из его изоформ) с МАСН (или некоторыми его изоформами), равно как и с МОКЫ напрямую. Соответственно, 61 может быть способен модулировать активность МОКЫ (и, в свою очередь, активность рецепторов ΕΑδ-Κ и р55-К) напрямую, путем прямого связывания с МОКЫ, или же косвенно путем связывания с Мск4 и(или) с МАСН, которые, в свою очередь, известны благодаря своей способности связываться с МОКЫ.

(3) Анализ последовательности 61 по описанным выше базам данных и их скрининг показал, что ген, кодирующий белок 61, очевидно локализован в непосредственной близости от локусов Мск4 и МАСН на хромосоме 2 человека: это определяет тесное родство между генами, кодирующими все эти белки также и на хромосомном уровне.

(4) По крайней мере, некоторые из изоформ 61 (например, изоформа 61α - показана на фиг. 1) включает сегмент, расположенный ниже ΜΟΚΤ-модулей, который проявляет сходство с каталитическим, т.е. протеазным участком МАСН и Мск4, а раз так, то белок 61 может являться членом протеазного семейства СЕП3/1СЕ.

(5) Присутствие протеазоподобного сегмента, по крайней мере, в некоторых изоформах белка 61 (например, 61α) определяет, что 61 или такие его изоформы могут быть напрямую вовлечены в проявление цитотоксичности и воспалительные процессы, обусловливаемые различными стимулами, включая рецепторы из семейства рецепторов ΤΝΕ/Ν6Ε (например, ΕΑδ-Κ и р55-К) и другими факторами, которые действуют напрямую или ненапрямую опосредованно через активность клеточных протеаз по индукции цитотоксичности и воспалений.

(6) Белок 61 может действовать как усилитель или обусловливатель активности других белков, таких как, например, белки МАСН и Мск4 (включая различные их изоформы), в объеме внутриклеточных механизмов, обеспечивающих проявление цитотоксичности, развития воспалительного процесса и других близких эффектов, которые опосредуются рецепторами из семейства рецепторов ΤΝΕ/Ν6Ε и другими факторами, имеющими общие внутриклеточные эффекторы. Усиливающий или обуславливающий эффект белка 61 (или, по крайней мере, некоторых из его изоформ) может определять его связывание с такими другими белками (по типу отмечавшегося выше связывания 61 с Мск4 и также возможного связывания с белками МАСН и МОКЫ), тем самым обеспечивая его связывание с МОКЫ (включая самосвязывание МОКЫ) или его действие независимо от МОКЫ.

(7) Белок 61 также может действовать в качестве ингибитора активности других белков, и это может стать путем вхождения 61 частью в комплекс других белков, с которым он связывается (например, Мск4 и, возможно, также МАСН и МОКЫ), тем самым нарушая их цитотоксический эффект до степени, характерной для подавления такой активности. Далее, аналогичным образом тому, что было описано выше для некоторых изоформ МАСН, равно как и некоторых изоформ Мск4, также могут существовать изоформы белка 61, которые специфически проявляют ингибиторную активность. Одной такой изоформой 61 может быть изоформа 61β, показанная на фиг. 2, которая включает два ΜΟΚΤ-модуля, но лишена отчетливого протеазоподобного сегмента, сходного с таковыми у других известных протеаз.

Закончив полное описание настоящего изобретения, должно стать ясным специалистам в данной области техники, что то же самое может быть осуществлено для широкого круга эквивалентных параметров, концентраций и условий без какого-либо отхода от духа и масштаба настоящего изобретения и без незапланированных экспериментов.

Поскольку настоящее изобретение было описано в связи с его специфическими вариантами, должно быть понятно, что оно допускает его дальнейшие модификации. Данная заявка призвана охватить любые вариации, использования или приложения настоящего изобретения, в основном следуя принципам настоящего изобретения и включая такие отклонения от настоящего представления, которые находятся в рамках известной или привычной практики данной области техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены по сути в соответствии с широтой нижеизложенной формулы изобретения.

Все материалы, цитированные в данном тексте, включая журнальные статьи и тезисы, опубликованные или соответствующие американские или иностранные заявки, выданные американские или зарубежные патенты включены в данную заявку в качестве ссылок, включающей все данные, таблицы, фигуры и текст, имеющиеся в цитируемых публикациях. Кроме того, полное содержание ссылок, цитированных в пределах цитируемых работ, также полностью включено в библиографический перечень.

Ссылки на известные методические этапы, стандартные методические этапы, известные методы и стандартные методы никоим образом не говорят о том, что какой-либо заявляемый аспект, описание и вариант настоящего изобретения уже был заявлен, представлен или поддержан в данной области техники.

Предшествующее описание специфических вариантов должно было настолько полно осветить основное содержание настоящего изобретения, чтобы кто бы то ни было мог, исполь105

106 зуя знания в данной области техники (включая информацию, содержащуюся в ссылках), легко модифицировать и(или) адаптировать его для различных типов применения таких специфичных вариантов без незапланированных экспериментов и без отклонения от базовой концепции настоящего изобретения. Таким образом, такие адаптации и модификации подразумеваются как находящиеся в пределах сути и диапазона эквивалентов заявляемых вариантов, основанных на представленных здесь руководствах и описаниях. Должно быть понятно, что фразеология или терминология данного текста использована с целью описания, но не какого-либо ограничения, т.е. такая терминология или фразеология настоящей спецификации должна быть интерпретирована специалистами в свете представленных здесь объясняющих и руководствующих описаний в сочетании со знаниями, которыми обладает специалист в данной области техники.

Ссылки

Айтай, М. е! а1., (1997) Сапсег Кезеагсй 57, 615-620

А1петп, Е.8. е! а1., (1995) 1. Вю1. Сйет. 270:4312-4317

Ваппада, М. (1993) 8с1епсе 262:1512-1514

Ве1й1ег, 1. е! а1., (1995) 1. Вю1. Сйет. 270:16526-16528

Вегдег, 1. е! а1., (1988) 0епе 66:1-10

Веи!1ег, В. апй Сегат1, С. (1987) №!М. 316:379-385

В1дйа, 1. е! а1. (1994) 1. Ехр. Мей. 180:445460

Во1йт, М.Р. е! а1. (1995а) 1. Вю1. Сйет. 270:337-341

Во1йт, М.Р. е! а1. (1995Ь) 1. Вю1. Сйет. 270:7795-7798

Во1йт, М.Р. е! а1. (1996) Се11 85:803-815

ВгакеЬизсй, С. е! а1. (1992) ЕМВО 1., 11:943-950

Вгоскйаиз, М. е! а1. (1990) Ргос. Асай. δοΐ. И8А, 87:3127-3131

Сап!ог, 0.Н. е! а1. (1993) Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А 90:10932-6

Сеггей, ΌΡ. е! а1. (1992) 8с1епсе 256:97-100 Сйеп, С.1. е! а1. (1992) Апп. Ν.Υ. Асай. 8с! 660:271-3

Сй1ппа1уап е! а1. (1995) Се11 81:505-512

СЫппауап е! а1. (1996) 1. Вю1. Сйет. 271:4961-4965

СТопе, М.0. е! а1. (1995) ЕМВО 1. 14:58595868

С1ет, К.1. е! а1. (1991) 8с1епсе 254, 13881390

С1етеп!, М.У. е! а1. (1994) 1. Ехр. Мей. 180:557-567

Спзе11, Р. е! а1., (1993) №с1ек Ас1йз Кез. (Епд1апй) 21 (22):5251-5

Сшгеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг В1о1оду (АизиЬе1, Р.М., Вгеп!, К., Кшдз!оп, К.Е., Мооге, Ό.Ό., 8е1йтап, 1.0., 8тйй, 1.А., 8!гий1, К., А1

Ьпдй!, Ь.М., Соеп, О.М. & Уагкд А., ейз.), (1994) рр. 8.1.1-8.1.6 апй 16.7-16.7.8, 0геепе РиЬНзЫпд Аззос1а!ез, 1пс. апй \Уйеу & 8опз, 1пс., №\ν Υο^к ϋΐιΚδ, №., е! а1., (1993) 0епе 128:247-249

Оиап, Н. апй Όίχί!, У.М. (1997) №1й1ге 385, 86-89

ПигТее, Т. е! а1. (1993) 0епез Эст. 7:555-569

Е1зсйеп, С.М. е! а1., (1994) 1. 1ттипо1. 153:1947-1954

ЕШз, Н.М. е! а1. (1986) Се11 44:817-829

Епап, М. е! а1. (1995) №1й1ге 375:78-81

Епде1тапп, Н. е! а1. (1990) 1. Вю1. Сйет., 265:1531-1536

Раисйеи, С. е! а1. (1995) ЕМВО 1. 14:19141922

Ретапйез-А1петп, Т. е! а1. (1994) 1. Вю1. Сйет. 269:30761-30764

Ретапйез-А1петп, Т. е! а1. (1995) Сапсег Кез. 55:2737-2742

Ретапйез-А1петп, Т. е! а1. (1996) Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 93:7464-7469

Р1е1й, 1. е! а1. (1988) Мо1. Се11 Вю1. 8:21592165

Р1е1йз, 8. апй 8опд, О. (1989) №-1й1ге. 340:245-246

Ргапдюш, 1.У. апй №е1, В.0. (1993) Апа1. Вюсйет. 210:179-187

0еузеп, Н.М. (1985) 1ттипо1. Тойау 6:364369

0еузеп, Н.М. е! а1. (1987) 1. 1ттипо1. Ме!й. 102:259-274

0оззеп, М. апй Вои)агй, Н. (1992) Ргос.

Асай. 8с! И8А, 89:5547-5551

0ге11, М. е! а1. (1994) Еиг. 1. 1ттипо1. 24:2563-2566

Не11ег, К.А. е! а1. (1990) Ргос. Νη11. Асай. 8с1. И8А, 87:6151-6155

Непкай, Р.А. (1996) 1ттипйу 4:195-201

Нойтапп, Н.-Р. е! а1. (1989) 1. Вю1. Сйет., 264:14927-14934

Но^агй, АЛ. е! а1. (1991) 1. 1ттипо1. 147:2964-2969

Нзи, Н. е! а1. (1995) Се11 81:495-504

Нзи, Н. е! а1. (1996) Се11 84:299-308

Ной, Ν. е! а1. (1991) Се11 66:233

1!ой, Ν. апй МщаЩ 8. (1993) 1. Вю1. Сйет. 268:10932-7

1озерй, 8. апй Вигке, 1.М. (1993) 1. Вю1. Сйет. 268:24515-8

Катепз, 1. е! а1. (1995) 1. Вю1. Сйет. 270:15250-15256

КаиТтапп, 8.Н. (1989) Сапсег Кез. 49:58705878

КаиТтапп, 8.Н. (1993) Сапсег Кез. 53:39763985

К1зсйке1, Р.С. е! а1. (1995) ЕМВО 1.

14:5579-5588

Ко17ит1, М. е! а1. (1993) Вю1. Рйагт. Ви11

Царап) 16 (9): 879-83

Китаг, 8. е! а1. (1994) 0епез Ое\'. 8:16131626

107

108

Китаг, 8. (1995) Тгепбк ВюсКет 8с1. 20:198-202

Ьа/еЬпк, У.А. е! а1. (1994) Иа!иге 371:346347

Ьеййаикег, Г. е! а1. (1993) ЬаЬ йкекк 69:415-429

Ьое!ксКег, Н. е! а1. (1990) Се11, 61:351-359 Ьок, М. е! а1. (1995) Иа!иге 375:81-83 Магбп, 8.1. е! а1. (1995) I. Вю1. СКет. 270:6425-6428

МакЫта, Т. е! а1. (1995) ВюсКет. ВюрКук. Век. Соттип. 209:907-915

МШег, В.Е. е! а1. (1995) I. 1ттипо1. 154:1331-1338.

М1Шдап, С.Е. е! а1. (1995) Иеигоп 15:385393

Мйй, Р.В.Е. е! а1., (1997) I. Вю1. СКет. 272, 6539-6547

Мшга, М. е! а1. (1995) Ргос. Иа!1. Асаб. 8сй И8А 92:8318-8322

Мипбау, И.А. е! а1. (1995) I. Вю1. СКет. 270:15870-15876

МигаткЫ. 8. е! а1. (1991) РКагт. ВекеагсК 8:649

Ми/ю, М. е! а1. (1996) Се11 8, 817-827

Иада!а, 8. апб 6о1к!еш, Р. (1995) 8аепсе 267, 1449-1456

И1сКо1коп, И.ЭД. е! а1. (1995) Иа!иге 376:3743

ИорКаг, Υ. е! а1. (1990) ЕМВО I., 9:32693278

Р1С]ие(, Р.Г. е! а1. (1987) I. Ехр. Меб., 166:1280-89

Вау е! а1. (1992) Се11 69:597-604

Во!опба, I. е! а1., (1996) Иа!-81гис!-Вю1. 3, 619-25

Видд1его, V. е! а1. (1987) Се11 1ттипо1. 107:317-325

8атЬгоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8ргтд НагЬог, ΝΥ

8сКа11, Т.1. е! а1. (1990) Се11, 61:361-370 8сК1еде1, е! а1. (1996) I. Вю1. СКет. 271:1841-1844

8с11и1/.е-Ок111о1Г. К. е! а1. (1994) ЕМВО I. 13:4587-4596

8Ытауата, Т. е! а1., (1993) Иис1ек Ас1бк 8утр. 8ег. 29:177-8

8Коге, 8.К. е! а1. (1993) Опсодепе 8:3183-8

81еаШ, Р.В. е! а1. (1990) I. Вю1. СКет. 265:14526-14528

8тйК, С.А. е! а1. (1990) 8с1епсе, 248:10191023

8опд, НА. е! а1. (1994) I. Вю1. СКет. 269:22492-22495

8гт«аки1а, 8.М. е! а1. (1996) Ргос. ИаЙ. Асаб. 8сй И8А 93:14486-14491

8!апдег, В.2. е! а1. (1995) Се11, 81:513-523 ТаПадйа, Ь. А. е! а1. (1993) Се11, 74:845-853 Тетап, М. е! а1. (1995) I. Вю1. СКет. 270:3255-3260

Те^ап, М. е! а1. (1995а) I. Вю1. СКет. 270:18738-18741

Те^ап, М. е! а1. (1995Ь) Се11 81:1-20

ТКотЬеггу, И.А. е! а1. (1992) Иа!иге 356:768-774

ТКотЬеггу, И.А. е! а1. (1994) ВюсКеткйу 13:3934-3940

Тгасеу, 1.Т. е! а1. (1987) Иа!иге, 330:662-664

Vаπ Спекшде, ЭД. е! а1. (1996) I. Вю1. СКет. 271, 27245-8

VаπбеπаЬее1е, Р. е! а1. (1995) Тгепбк Се11 Вю1. 5:392-400

Vакка11^, Р. (1992) Апп. Веν. 1ттипо1. 10:411-452 ^псеп!, С. апб Όίχί!, УМ. (1997) 1.В.С. 272, 6578-6583.

ЭДа1кег, И.Р. е! а1. (1994) Се11 78, 343-352. ЭДа11асК, Ό. (1984) I. 1ттипо1. 132:2464-9

ЭДа11асК, Ό. (1986) 1п: 1п!ег£егоп 7 (1оп 6геккег, еб.), рр. 83-122, Асабетю Ргекк, Ьопбоп

ЭДа11асК, Ό. е! а1. (1994) Су!ок1пе 6:556 ЭДапд, Ь. е! а1. (1994) Се11 78:739-750

ЭДа1апаЬе-Гикипада, В. е! а1. (1992) Иа!иге, 356:314-317

ЭДа1апаЬе, Г.В. е! а1. (1992) I. 1ттипо1. 148:1274-1279

ЭДей/еи М. е! а1. (1980) I. 1ттипо1. 125:719-724

ЭДйкк, А.Г. е! а1. (1989) Ргос. Иа!1. Асаб. 8с1. И8А, 86: 1603-1607

ЭДйкоп, К.Р. е! а1., (1994) Иа!иге 370, 270-5

ЭДопд е! а1. (1994) I. 1ттипо1. 152:17511755

Хие, И. е! а1. (1995) Иа!иге 377:248-251

ΥоπеКа^а, 8. е! а1. (1989) I. Ехр. Меб. 169:1747-1756

Υиаπ, I. е! а1. (1993) Се11 27:641-652

2ассЬапа, 8. е! а1. (1991) Еиг. I. РКагтасо1. 203:353-357

2Као, И апб Р1ск, Ь. (1993) Иа!иге (Епд1апб) 365:448-51

Claims (43)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Последовательность ДНК, кодирующая полипептид, обладающего активностью белка 61, притом что указанный полипептид (ί) способен связываться или взаимодействовать напрямую или не напрямую с МОВТ-1 и(или) с любым из МОВТ-1-связывающихся белков, или с другими внутриклеточными белками-медиаторами/модуляторами; и (й) способен опосредовать внутриклеточное влияние, опосредованное ГА8-В или р55ТИГ-В, или других цитотоксических медиаторов или индукторов;

   притом что указанная последовательность

   ДНК выбрана из группы, включающей:

   (а) последовательность ДНК, кодирующую изоформу 61, имеющую аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1;

   109

   110 (b) последовательность ДНК, кодирующую изоформу 01, имеющую аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2;

   (c) последовательность ДНК, кодирующую, по крайней мере, часть полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1 или 2;

   (б) последовательность ДНК, включающую, по крайней мере, часть последовательности, представленной на фиг. 1 и кодирующую, по крайней мере, одну изоформу белка 01 изоформу 01α;

   (е) последовательность ДНК, включающую, по крайней мере, часть последовательности, представленной на фиг. 2 и кодирующую, по крайней мере, одну изоформу белка 01 изоформу 01β;

   (ί) последовательность кДНК, производную от кодирующего сегмента нативной изоформы белка 01;

   (д) последовательность ДНК, кодирующую фрагмент, аналог или производное полипептида, кодируемого последовательностью ДНК по любому из (а)-(£);

   (й) последовательность ДНК, способную гибридизоваться с последовательностью по любому из (а)-(д) в условиях средней жёсткости и которая кодирует биологически активную изоформу белка 01; и (ί) последовательность ДНК, которая является вырожденной в соответствии с генетическим кодом по отношению к последовательностям ДНК по любому из (а)-(й) и которая кодирует биологически активную изоформу белка 01.
2. 2. Вектор, включающий последовательность ДНК по п.1.
3. 3. Вектор по п.2, способный экспрессироваться в эукариотической или в прокариотической клетке-хозяине.
4. 4. Вектор по п.2 или 3, представляющий собой рекомбинантный вектор на основе вируса животного, несущий последовательность ДНК, кодирующую поверхностный вирусный белок (лиганд), который способен связываться со специфическим поверхностно-клеточным рецептором на поверхности клетки, несущей ЕА8-К или р55-К, и вторую последовательность, включающую последовательность ДНК по п.1.
5. 5. Вектор по п.4, отличающийся тем, что поверхностно-клеточный рецептор специфичен в отношении опухолевых клеток, ВИЧинфицированных клеток или других больных клеток.
6. 6. Трансформированный эукариотический штамм клетки-хозяина, несущий вектор по любому из пп.2-5.
7. 7. Трансформированный прокариотический штамм клетки-хозяина, несущий вектор по любому из пп.2-5.
8. 8. Способ получения полипептида, обладающего активностью белка 01, включающий выращивание трансформированного штамма клетки-хозяина по п.6 или 7 в условиях, пригодных для экспрессии указанного полипептида, обеспечение посттрансляционных модификаций, если они необходимы для получения полипептида, и выделения полипептида.
9. 9. Полипептид, обладающий активностью белка 01, который (ί) способен связываться или взаимодействовать напрямую или не напрямую с ΜΟΚΤ-1 и/или с любым из ΜΟΚΤ-1-связывающихся белков, или с другими внутриклеточными белкамимедиаторами/модуляторами; и (ίί) способен опосредовать внутриклеточное влияние, опосредованное ЕА8-К или р55ΤΝΡ-Κ, или других цитотоксических медиаторов или индукторов;

   притом что указанный полипептид выбран из группы, состоящей из (a) изоформы 01, имеющей аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1;

   (b) изоформы 01, имеющей аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2;

   (c) по крайней мере, части полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1 или фиг. 2;

   (б) по крайней мере, части последовательности, представленной на фиг. 1, включающей, по крайней мере, одну изоформу белка 01 изоформу 01α;

   (е) по крайней мере, части последовательности, представленной на фиг. 2, включающей, по крайней мере, одну изоформу белка 01 изоформу 01β; и (ί) фрагмента, аналога или производного полипептида по любому из (а)-(е);

   или полученный способом по п.8.
10. 10. Антитело, специфичное в отношении полипептида по п.9.
11. 11. Способ модулирования гибели клеток или воспалительных процессов т уйго, включающий обработку указанных клеток одним или большим числом полипептидов по п.9, притом что указанная обработка клеток включает доставку внутрь клеток указанного одного или большего числа полипептидов в форме, подходящей для их внутриклеточного введения, или доставку внутрь клеток последовательности ДНК по п.1 в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, притом что вектор способен обеспечивать доставку указанной последовательности внутрь клетки таким образом, что указанная последовательность ДНК экспрессируется в клетках.
12. 12. Способ модулирования влияния лиганда ЕА8-К или ΤΝΡ на клетки, несущие ЕА8-К или р55-К ш уйго, включающий обработку ука

    111

    112 занных клеток одним или большим числом полипептидов по п.9, притом что указанная обработка клеток включает доставку внутрь клеток указанных одного или большего числа полипептидов в форме, подходящей для их внутриклеточного введения, или доставку внутрь клеток последовательности ДНК по п.1, кодирующей указанные один или большее число полипептидов в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, притом что указанный вектор способен обеспечивать доставку указанной последовательности внутрь клеток таким образом, что указанная последовательность ДНК экспрессируется в клетках.
13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанная обработка клеток включает доставку внутрь клеток одного из указанных полипептидов, последовательности ДНК, кодирующей один из указанных полипептидов в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, притом что вектор способен обеспечивать доставку указанной последовательности внутрь клеток таким образом, что указанная последовательность ДНК экспрессируется в клетках.
14. 14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что указанная обработка указанных клеток осуществляется путём трансфекции клеток рекомбинантным вектором на основе вируса животного по п.4.
15. 15. Способ модулирования клеточной гибели или воспалительных процессов ίη νίίΐΌ, включающий обработку указанных клеток одним или большим числом ингибиторов одного или большего числа белков/ферментов, опосредующих указанные клеточную гибель или воспалительные процессы, притом что указанные ингибиторы выбирают из группы, включающей:

    (ί) один или большее число полипептидов по п.9, способных подавлять клеточную гибель или воспалительные процессы; и (ίί) ингибиторы одного или большего числа полипептидов по п.9, притом что указанные один или большее число полипептидов усиливают/обусловливают или опосредуют клеточную гибель или воспалительные процессы.
16. 16. Способ модулирования влияния лиганда ΕΑ8-Κ или ΤΝΕ на клетки, несущие ΕΑ8-Κ или ρ55-Κ, ίη νίΐΐΌ, включающий обработку указанных клеток антителом по п.10, притом что указанная обработка проводится с использованием подходящей композиции, включающей указанное антитело в отношении указанных клеток, притом что, когда белок 61 или его части расположены на внешней поверхности клеток, указанная композиция приготавливается для внеклеточного применения, а когда указанные белки 61 являются внутриклеточными, то указанная композиция приготавливается для внутриклеточного применения.
17. 17. Способ модулирования влияния лиганда ΕΑ8-Κ или ΤΝΕ на клетки, несущие ΕΑ8-Κ или ρ55-Κ, ίη νίΙΐΌ, включающий обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по отношению, по крайней мере, к части последовательности ДНК, по п.1, притом что указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка 61.
18. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанная олигонуклеотидная последовательность доставляется в указанные клетки с помощью вектора по п.4, притом что вторая последовательность вируса кодирует указанную олигонуклеотидную последовательность.
19. 19. Способ модулирования влияния лиганда ΕΑ8-Κ или ΤΝΕ на клетки ίη νίΙΐΌ, включающий использование рибозимной процедуры, в которой вектор, кодирующий рибозимную последовательность, способную взаимодействовать с последовательностью клеточной мРНК, кодирующей полипептид по п.9, доставляют внутрь клеток в форме, которая обеспечивает экспрессию указанной рибозимной последовательности в клетках, и притом что, когда рибозимная последовательность экспрессируется в клетках, то она взаимодействует с последовательностью клеточной мРНК и расщепляет указанную последовательность мРНК, приводя к ингибированию экспрессии полипептида в клетках.
20. 20. Способ по п.11 или 15, отличающийся тем, что указанный полипептид способен связываться напрямую или не напрямую с ΜΟΚΤ-1 и(или) с любым из ΜΟΚΤ-1-связывающихся белков, при том, что ΜΟΚΤ-1, в свою очередь, специфически связывается с ΕΑδ-Ιί.', или которые способны связываться напрямую или не напрямую с ΜΟΚΤ-1 и/или с любым из ΜΟΚΤ1-связывающихся белков, притом что ΜΟΚΤ-1, в свою очередь, связывается с ΤΚΑΌΌ, который, в свою очередь, связывается с р55-1С.
21. 21. Способ по любому из пп.12, 16 или 19, отличающийся тем, что указанный полипептид способен связываться напрямую или не напрямую с ΜΟΚΤ-1 и(или) с любым из ΜΟΚΤ-1связывающихся белков, притом что ΜΟΚΤ-1, в свою очередь, специфически связывается с ΕΑ81С, или которые способны связываться напрямую или не напрямую с ΜΟΚΤ-1 и/или с любым из ΜΟΚΤ-1-связывающихся белков, притом что ΜΟΚΤ-1, в свою очередь, связывается с ΤΚΑΌΌ, который, в свою очередь, связывается с р55-1С.
22. 22. Способ выделения и идентификации полипептида по п.9, включающий использование дигибридного дрожжевого теста, в котором последовательность, кодирующая указанный белок ΜΟΚΤ-1 и/или ΜΟΚΤ-1-связывающийся белок, находится в составе одного гибридного вектора, а последовательность из состава кДНК или из геномной библиотеки ДНК находится в составе второго гибридного вектора, притом что

    113

    114 векторы затем используют для трансформации дрожжевых клеток-хозяев, и позитивно трансформированные клетки выделяют путем последующей экстракции указанного второго гибридного вектора с целью получения последовательности, кодирующей белок, который связывается с белком МОВТ-1 и/или с МОВТ-1связывающимися белками.
23. 23. Способ по п.11 или 14, отличающийся тем, что указанный полипептид является, по крайней мере, одной из изоформ 01, одним из его аналогов, фрагментом или производным.
24. 24. Способ по любому из пп.12, 16-19, отличающийся тем, что указанный полипептид является, по крайней мере, одной из изоформ 01, одним из его аналогов, фрагментом или производным.
25. 25. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный полипептид является, по крайней мере, одной из изоформ 01, одним из его аналогов, фрагментом или производным.
26. 26. Способ модулирования индуцируемого МОВТ-1 влияния или влияния МОВТ-1связывающегося белка или индуцируемого другими белками влияния на клетки ш ν 11го, включающий обработку клеток согласно способу по любому из пп.11-25 последовательностью ДНК по п.1 или полипептидом по п.9, притом что указанная обработка приводит к усилению или подавлению указанного влияния, опосредуемого МОВТ-1 или МОВТ-1-связывающимся белком, или другого влияния, опосредуемого белками и тем самым также влияния РА8-В или р55-В или других цитотоксических медиаторов или индукторов, опосредующих это влияние.
27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанный полипептид является той частью полипептида, которая специфически вовлечена в связывание с МОВТ-1 или с МОВТ-1связывающимся белком, или с другим белком.
28. 28. Способ по п.26 или 27, отличающийся тем, что указанный полипептид является любой из изоформ 01, способной усиливать влияние, обусловленное МОВТ-1 или МОВТ-1связывающимся белком, или другое влияние на клетки, связанное с белками, и тем самым влияние РА8-В или р55-В или других цитотоксических медиаторов или индукторов, влияющих на клетки.
29. 29. Способ модулирования апоптотических процессов или процессов запрограммированной гибели клеток ш νί!ΐΌ, включающий обработку указанных клеток одним или большим числом полипептидов по п.9, притом что указанная обработка клеток включает доставку внутрь указанных клеток указанных одного или большего числа полипептидов в форме, подходящей для их внутриклеточного введения, или доставку внутрь клеток последовательности ДНК по п.1 в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, притом что вектор способен обеспечивать доставку указанной по следовательности внутрь клеток таким образом, что последовательность ДНК экспрессируется в указанных клетках.
30. 30. Способ скрининга лиганда, способного связываться с полипептидом по п.9, включающий контактирование аффинного хроматографического матрикса, к которому присоединён указанный полипептид, с клеточным экстрактом так, что лиганд связывается с указанным матриксом с последующей элюцией, выделением и анализом указанного лиганда.
31. 31. Способ скрининга последовательности ДНК, кодирующей лиганд, способный связываться с полипептидом по п.9, включающий использование дигибридного дрожжевого теста, в котором последовательность ДНК, кодирующая указанный полипептид, входит в состав одного гибридного вектора, а последовательности из состава кДНК или геномной библиотеки ДНК входят в состав второго гибридного вектора, трансформацию указанными векторами указанных дрожжевых клеток-хозяев, выделение позитивно трансформированных клеток и экстракцию указанного второго гибридного вектора с целью получения последовательности ДНК, кодирующей указанный лиганд.
32. 32. Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую/опосредуемую

    МОВТ-1 или МОВТ-1-связывающимися белками, включающий:

    (a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим, по крайней мере, часть МОВТ-1 или МОВТ-1связывающихся белков, выбираемых из белков МАСН, белков Мс114 и других МОВТ-1 связывающихся белков;

    (b) идентификацию и охарактеризовывание лиганда, другого, нежели МОВТ-1 или указанных МОВТ-1-связывающихся белков или частей рецептора из семейства рецепторов Т№Ж0Р, обнаруженного при проведении указанного скрининга по способности к указанному связыванию; и (c) получение указанного лиганда, по существу, в выделенной и очищенной форме.
33. 33. Способ идентификации и выделения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую или опосредуемую полипептидом по п.9, включающий:

    (a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим полипептид, кодируемый ДНК по любому из (а)-(с) по п.1;

    (b) идентификацию и охарактеризовывание лиганда, иного, нежели МОВТ-1 или МОВТ-1-связывающихся белков, или частей рецептора из семейства рецепторов ЮТЖ0Р, обнаруженных при указанном скрининге по способности к указанному связыванию; и (c) получение указанного лиганда, по существу, в выделенной и очищенной форме.

    115

    116
34. 34. Способ идентификации и выработки лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую/опосредуемую белком 61, включающий:

    (a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим полипептид, кодируемый ДНК по любому из (а)-(с) по п.1;

    (b) идентификацию и охарактеризовывание лиганда, другого, нежели МОКТ-1 или МОКТ-1-связывающихся белков, или частей рецептора из семейства рецепторов ТЫЕ/Ы6Е, обнаруженных при указанном скрининге по способности к указанному связыванию; и (c) получение указанного лиганда, по существу, в выделенной и очищенной форме.
35. 35. Способ идентификации и выделения молекулы, способной напрямую или не напрямую модулировать клеточную активность, модулируемую/опосредуемую белком 61, включающий:

    (a) скрининг молекулы, способной модулировать активности, модулируемые/опосредуемые белком 61;

    (b) идентификацию и охарактеризовывание указанной молекулы; и (c) получение указанной молекулы, по существу, в выделенной и очищенной форме.
36. 36. Способ идентификации и выделения молекулы, способной напрямую или не напрямую модулировать клеточную активность, модулируемую/опосредуемую полипептидом по п.9, включающий:

    (a) скрининг молекулы, способной модулировать активности, модулируемые/опосредуемые полипептидом по п.9;

    (b) идентификацию и охарактеризование указанной молекулы; и (c) получение указанной молекулы, по существу, в выделенной и очищенной форме.
37. 37. Фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного ингредиента вещество, выбранное из группы, состоящей из (a) последовательности ДНК по п.1;

    (b) вектора по п.4 или 5;

    (c) полипептида по п.9; и (Б) антитела по п.10 и необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.
38. 38. Применение вектора по п.5 для приготовления фармацевтической композиции для лечения опухолей, СПИДа или других заболеваний, проявляющихся в выделении специфических поверхностно-клеточных рецепторов.
39. 39. Применение последовательности ДНК по п.1 для приготовления фармацевтической композиции для модуляции влияния на клетки лиганда ЕАЗ-К или ТЫЕ или других белков для лечения септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, диабета, рассеянного склероза или СПИДа.
40. 40. Применение вектора по п.4, для приготовления фармацевтической композиции для модуляции влияния на клетки лиганда ЕАЗ-К или ТЫЕ или других белков для лечения септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, диабета, рассеянного склероза или СПИДа.
41. 41. Применение полипептида по п.9 для приготовления фармацевтической композиции для модуляции влияния на клетки лиганда ЕАЗК или ТЫЕ или других белков для лечения септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, диабета, рассеянного склероза или СПИДа.
42. 42. Применение антитела по п.10, для приготовления фармацевтической композиции для модуляции влияния на клетки лиганда ЕАЗ-К или ТЫЕ или других белков для лечения септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, диабета, рассеянного склероза или СПИДа.
43. 43. Диагностическая композиция, включающая антитело по п.10.