SK117599A3 - Dna sequence, a vector containing it, a host cell, isoform of g1 protein, method for producing isoform of g1 protein, pharmaceutical composition containing it and its use - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka receptorov patriacich do TNF/NGF superrodiny receptorov a riadenia ich biologických funkcií. TNF/NGF superrodina receptorov zahŕňa receptory ako napríklad p55 a p75 receptory tumor nekrotického faktora (TNF-Rs, pričom p55 sa tiež nazýva CD120a a p75 sa tiež nazýva CD 120b, avšak tu ďalej sa budú nazývať p55-R a p75-R) a receptor FAS ligandu (tiež nazývaný FAS/APO1 alebo FAS-R alebo CD95, ale ďalej bude nazývaný FAS-R) a iné. Konkrétnejšie sa predložený vynález ďalej týka nových proteínov viažucich sa na iné proteíny, ktoré sa viažu na proteín MORT-1 (alebo FADD), tiež nazývané MORT-1-viažuce proteíny, alebo, ktoré sa tiež môžu viazať na MORT-1 priamo, a konkrétnejšie sa týka jedného takéhoto proteínu, tu označovaného ako G1, (ktorý sa teraz tiež označuje CASH ako kaspázový homológ, ale, ktorý tu v celom texte bude nazývaný G1), ktorý sa viaže na MORT-1-viažuci proteín Mch4 (tiež označovaný/nazývaný CASP-10) a možno tiež na iné MORT-1-viažuce proteíny nazývané MACH (tiež označované/nazývané CASP-8) a možno tiež priamo na samotný MORT-1.

V súlade s tým, sa predložený vynález vo všeobecnosti týka nových proteínov, ktoré sú schopné modulovať alebo sprostredkovať priamo alebo nepriamo funkciu MORT-1 alebo iných proteínov, ktoré sa priamo alebo nepriamo viažu s MORT-1. Predložený vynález sa hlavne týka G1, jeho prípravy a použitia, ako aj rôznych nových izoforiem G1, ich prípravy a použitia.

Doterajší stav techniky

Tumor nekrotický faktor (TNF-α) a lymfotoxín (TNF-β) (nižšie sa TNF

vzťahuje tak na TNF-α ako aj na TNF-β) sú viacfunkčné pro-zápalové cytokíny vytvárané hlavne mononukleárnymi fagocytmi, ktoré v mnohých smeroch ovplyvňujú bunky (Wallach, D. (1986) v Interferon 7 (lon Gresser, vyd.), str. 83 až 122, Academic Press, London; a Beutler a Cerami (1987)). Tak TNF-α ako aj TNF-β iniciujú svoje účinky väzbou na špecifické bunkové povrchové receptory. Niektoré z týchto účinkov sú pravdepodobne prospešné pre organizmus: môžu napríklad deštruovať nádorové bunky alebo bunky infikované vírusom a zvýšiť antibakteriálne aktivity granulocytov. Týmto spôsobom sa TNF podieľa na obrane organizmu voči nádorom a infekčným činidlám a podieľa sa na zotavení zo zranenia. Takže TNF môže byť použitý ako protinádorové činidlo, pri ktorého aplikácii sa TNF viaže na svoje receptory na povrchu nádorových buniek, a tým iniciuje kroky vedúce k smrti nádorových buniek. TNF môže byť tiež použitý ako anti-infekčné činidlo.

Avšak tak TNF-α ako aj TNF-β majú aj škodlivé účinky. Je zrejmé, že nadprodukcia TNF-α môže hrať hlavnú patogénnu úlohu v niekoľkých chorobách. Napríklad je známe, že účinky TNF-α, najmä na vaskulatúru, sú hlavnou príčinou symptómov septického šoku (Tracey et al., 1986). Pri niektorých chorobách môže TNF spôsobovať nadmerný úbytok hmotnosti (kachexia) prostredníctvom potláčania aktivít adipocytov a spôsobením anorexie, a preto bol TNF-α nazývaný kachetín. Tiež bol opísaný ako mediátor poškodzovania tkanív pri reumatických ochoreniach (Beutler a Cerami, 1987) a ako hlavný mediátor poškodenia pozorovaného pri reakciách štep-versus-hostiteľ (Piquet et al., 1987). Navyše je známe, že TNF sa zúčastňuje na zápalovom procese a na mnohých iných chorobách.

Vyššie uvedené biologické účinky TNF iniciujú a/alebo sprostredkúvajú dva rozličné, nezávisle exprimované receptory p55 a p75 TNF-Rs, ktoré špecificky viažu tak TNF-α ako aj TNF-β. Tieto dva receptory majú štrukturálne rozličné intracelulárne domény, čo naznačuje, že signalizujú rôzne (viď Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990, Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; a Heller et al., 1990). Avšak bunkové mechanizmy, napríklad rôzne proteíny a iné možné faktory, ktoré sú zahrnuté vo vnútrobunkovej signalizácii p55 a p75 TNF-Rs, ešte musia byť objasnené. Práve

táto vnútrobunková signalizácia, ktorá nastáva zvyčajne po naviazaní ligandu, tzn. TNF (a alebo β), na receptor, je zodpovedná za začatie kaskády reakcií, ktorej konečným výsledkom je pozorovaná odpoveď bunky na TNF.

Čo sa týka vyššie uvedeného cytocídneho účinku TNF, vo väčšine v tomto ohľade študovaných buniek, je tento účinok spúšťaný najmä p55 TNF-R. Protilátky proti extracelulárnej doméne (ligand viažuca doména) p55 TNF-R môžu sami spustiť cytocídny účinok (pozri EP 412486), ktorý koreluje s účinnosťou vzájomného spojenia receptorov prostredníctvom protilátok, čo sa považuje za prvý krok pri generovaní vnútrobunkového signalizačného procesu. Ďalej mutačné štúdie (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) ukázali, že biologická funkcia p55 TNF-R závisí na integrite jeho vnútrobunkovej domény, a v súlade s tým bolo navrhnuté, že iniciácia vnútrobunkovej signalizácie vedúca k cytocídnemu účinku TNF nastáva ako dôsledok spojenia dvoch a viacerých vnútrobunkových domén p55 TNF-R. Navyše TNF (a alebo β) sa vyskytuje ako homotrimér, a bolo navrhnuté, že v tejto forme indukuje vnútrobunkovú signalizáciu cez p55 TNF-R prostredníctvom jeho schopnosti viazať a navzájom spájať receptorové molekuly, tzn. spôsobovať receptorovú agregáciu.

Iným členom TNF/NGF superrodiny receptorov je FAS receptor (FAS-R), ktorý je nazývaný aj FAS antigén, bunkový povrchový proteín exprimovaný v rôznych tkanivách a zdieľajúci homológiu s množstvom bunkových povrchových receptorov, vrátane TNF-R a NGF-R. FAS-R sprostredkúva bunkovú smrť vo forme apoptózy (Itoh et al., 1991) a ukázalo sa, že slúži ako negatívny selektor autoreaktívnych T buniek, tzn. že počas zretia T buniek FAS-R sprostredkúva apoptickú smrť T buniek, ktoré rozoznávajú vlastné antigény. Tiež sa zistilo, že mutácie vo FAS-R géne (Ιρή spôsobujú poruchy lymfoproliferácie v myšiach, ktoré sú podobné s humánnou autoimunitnou chorobou - systémovou lupus erytremathosus ((SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Ukázalo sa, že ligand pre FAS-R je molekula spojená s bunkovým povrchom, ktorá je nesená, okrem iných, zabíjajúcimi T bunkami (alebo cytotoxickými T lymfocytmi -CTLs), a tak, keď sa CTLs dostanú do kontaktu s bunkami nesúcimi FAS-R, sú schopné indukovať apoptickú bunkovú

smrť buniek nesúcich FAS-R. Ďalej, boli pripravené monoklonálne protilátky schopné indukovať apoptickú bunkovú smrť v bunkách nesúcich FAS-R, vrátane myších buniek transformovaných cDNA kódujúcou humánny FAS-R (Itoh et. al., 1991).

Zatiaľ čo cytotoxické účinky lymfocytov sú sprostredkované interakciou lymfocytom vytvoreného Ugandu s vo veľkej miere sa vyskytujúcim bunkovým povrchovým receptorom FAS-R (CD95), ktorý je schopný spustiť bunkovú smrť, zistilo sa, že rôzne iné normálne bunky, okrem T lymfocytov, exprimujú FAS-R na svojom povrchu a môžu byť zabité spustením tohto receptora. Predpokladá sa, že nekontrolovaná indukcia takéhoto usmrcovacieho procesu sa podieľa na poškodení tkaniva pri určitých chorobách, príklad na deštrukcii pečeňových buniek pri akútnej hepatitíde. Z toho vyplýva, že určenie spôsobov na potláčanie cytotoxických aktivít FAS-R môže mať terapeutický potenciál.

Naopak, keďže sa tiež zistilo, že určité malígne bunky a bunky infikované HIV nesú na svojom povrchu FAS-R, protilátky proti FAS-R alebo FAS-R ligand, môžu byť použité na spustenie FAS-R sprostredkovaných cytotoxických účinkov v týchto bunkách a tak môžu poskytnúť prostriedok na boj proti takýmto malígnym bunkám alebo bunkám infikovaným HIV (pozri Itoh et al., 1991). Takže nájdenie ešte iných spôsobov na zosilnenie cytotoxickej aktivity FAS-R môže mať tiež terapeutický potenciál.

Dlho bola pociťovaná potreba poskytnúť spôsob modulácie bunkovej odpovede na TNF (a alebo β) a FAS-R ligand. Napríklad vo vyššie uvedených patologických situáciách, kde sa nadmerne exprimuje TNF alebo FAS-R ligand, je žiaduce inhibovať cytocídne účinky indukované TNF-R alebo FAS-R ligandom, zatiaľ čo v iných situáciách, napr. pri použitiach na liečenie rán, je žiaduce zosilniť TNF účinok, alebo v prípade FAS-R v nádorových bunkách alebo bunkách infikovaných HIV, je žiaduce zosilniť účinok sprostredkovaný FAS-R.

Prihlasovatelia použili mnoho prístupov (pozri napríklad európske prihlášky č. EP 186833, EP 308378, EP 398327 a EP 412486) na reguláciu škodlivých účinkov TNF prostredníctvom inhibície naviazania TNF na jeho receptory použitím anti-TNF protilátok alebo použitím rozpustných TNF receptorov (pričom ide v podstate o

rozpustné extracelulárne domény receptorov), ktoré konkurujú naviazaniu TNF na TNF-Rs naviazané na bunkovom povrchu. Ďalej na základe toho, že na indukciu bunkových účinkov prostredníctvom TNF je potrebné naviazanie TNF na svoj receptor, prihlasovatelia (pozri napríklad EPO 568925) použili prístupy na moduláciu TNF účinku prostredníctvom modulácie aktivity TNF-Rs.

V stručnosti, EPO 568925 sa týka spôsobu modulácie prenosu signálu a/alebo štiepenia TNF-Rs, pričom peptidy alebo iné molekuly môžu interagovať buď so samotným receptorom alebo s efektorovými proteínmi interagujúcimi s receptorom, čím modulujú normálnu funkciu TNF-Rs. V EPO 568925 je opísaná konštrukcia a charakterizácia rôznych mutantov p55 TNF-Rs, ktoré majú mutácie v extracelulárnych, transmembránových a vnútrobunkových doménach p55 TNF-R. Týmto spôsobom sa identifikovali oblasti vo vnútri týchto domén p55 TNF-R, ktoré sú nevyhnutné pre funkciu receptora, tzn. pre naviazanie ligandu (TNF) a následný prenos signálu a vnútrobunkovú signalizáciu, ktorých konečným výsledkom je pozorovaný TNF-účinok na bunky. Ďalej je tiež opísané množstvo prístupov na izoláciu a identifikáciu proteínov, peptidov alebo iných faktorov, ktoré sú schopné viazať sa na rôzne oblasti vyššie uvedených domén TNF-R, pričom tieto proteíny, peptidy a iné faktory sa môžu zúčastňovať na regulácii alebo modulácii aktivity TNF-R. V EPO 568925 je tiež uvedené množstvo prístupov na izoláciu a klonovanie DNA sekvencii kódujúcich takéto proteíny a peptidy; na konštrukciu expresných vektorov na produkciu týchto proteínov a peptidov; a na prípravu protilátok alebo ich fragmentov, ktoré interagujú s TNF-R alebo s vyššie uvedenými proteínmi a peptidmi, ktoré viažu rôzne oblasti TNF-R. Avšak EPO 568925 nešpecifikuje skutočné proteíny a peptidy, ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs (napr. p55 TNF-R), ani neopisuje kvasinkový dvoj hybridný postup izolácie a identifikácie takýchto proteínov a peptidov, ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs. Podobne, v EPO 568925 nie je žiadny opis proteínov alebo peptidov schopných viazať sa na vnútrobunkovú doménu FAS-R.

Takže ak je žiaduce inhibovať účinok THF alebo FAS-R ligandu, bolo by želateľné znížiť množstvo alebo aktivitu TNF-Rs alebo FAS-R na bunkovom povrchu, zatiaľ čo zvýšenie množstva alebo aktivity TNF-Rs alebo FAS-R by bolo

žiaduce pri snahe o zosilnenie účinku TNF alebo FAS-R ligandu. Za týmto účelom sa promótory tak p55 TNF-R ako aj p75TNF-R sekvenovali, analyzovali a našlo sa množstvo kľúčových sekvenčných motívov, ktoré sú špecifické pre rôzne transkripčné regulačné faktory, a tým môže byť kontrolovaná expresia týchto TNFRs na úrovni ich promótorov, tzn. inhibíciou transkripcie z promótorov na zníženie množstva receptorov a zosilnením transkripcie z promótorov na zvýšenie množstva receptorov (EP 606869 a WO 9531206). Zodpovedajúce štúdie týkajúce sa kontroly FAS-R na úrovni promótora FAS-R génu musia byť ešte publikované.

Zatiaľ čo je známe, že receptory tumorového nekrotického faktora (TNF) a štrukturálne príbuzného receptora FAS-R spúšťajú v bunkách, po stimulácii ligandami vyprodukovanými leukocytmi, deštruktívne aktivity, ktoré vedú k ich vlastnému zániku, mechanizmus tohto spúšťania je ešte málo pochopený. Mutačné štúdie dokazujú, že vo FAS-R a p55 TNF receptorovej (p55-R) signalizácii pre cytotoxicitu sú zahrnuté rôzne oblasti vo vnútri ich vnútrobunkových domén (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Tieto oblasti (smrtiace domény alebo smrtiace efektorové domény nazývané DED) sú sekvenčne podobné. Smrtiace domény oboch, tak FAS-R ako aj p55-R, majú tendenciu navzájom sa spájať. Toto vzájomné spájanie očividne napomáha agregácii receptorov, ktorá je nevyhnutná na iniciáciu signalizácie (pozri Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995) a pri vysokých hladinách receptorovej expresie môže byť jej výsledkom spustenie signalizácie, ktorá je nezávislá od ligandu (Boldin et al., 1995).

Niektoré z cytotoxických účinkov lymfocytov sú sprostredkované interakciou lymfocytmi vyprodukovaného ligandu s FAS-R (CD-95), s vo veľkej miere sa vyskytujúcim bunkovým povrchovým receptorom, ktorý má schopnosť spustiť bunkovú smrť (pozri tiež Nagata a Golstein, 1995); a toto bunkové zabíjanie mononukleárnymi fagocytmi zahŕňa pár ligand-receptor, TNF a jeho receptor p55-R (CD120), ktorý je štrukturálne príbuzný s FAS-R a jeho ligand (pozri tiež Vandenabeele et al., 1995). Podobne ako iné účinky indukované receptorom, indukcia bunkovej smrti TNF receptormi a FAS-R nastáva cez sériu proteín-proteín interakcií, ktoré vedú od naviazania ligandu na receptor k eventuálnej aktivácii

enzymatických efektorových funkcií, ktoré v štúdiách týkajúcich sa tohto prípadu objasnili neenzymatické proteín-proteín interakcie, ktoré iniciujú signalizáciu pre bunkovú smrť: naviazaním trimerických TNF alebo FAS-R ligandových molekúl na receptory, ktoré sú výsledkom interakcií ich vnútrobunkových domén (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993) zvýšených náchylnosťou motívov smrtiacich domén (alebo smrtiacich efektorových domén, DED) na vzájomné spájanie (Boldin et al., 1995a) a indukovaných naviazaním dvoch cytoplazmatických proteínov (ktoré sa tiež môžu viazať navzájom) na receptorové vnútrobunkové domény - MORT-1 (alebo FADD) na FAS-R (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) a TRADD na p55-R (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Prostredníctvom postupu kvasinkového dvojhybridného vyhľadávania boli identifikované tri proteíny, ktoré sa viažu na vnútrobunkovú doménu FAS-R a p55-R, na oblasť smrtiacej domény, ktorá sa zúčastňuje na indukcii bunkovej smrti prostredníctvom receptorov cez spájanie ich homologických oblastí, ktoré sú tiež schopné nezávisle spustiť bunkovú smrť. Jedným z týchto je proteín MORT-1 (Boldin et al. 1995b), tiež známy ako FADD (Chinnaiyan et al., 1995), ktorý sa špecificky viaže na FAS-R. Druhý TRADD (pozri tiež Hsu et al., 1995, 1996) sa viaže na p55-R a tretí, RIP (pozri tiež Stanger et al., 1995) sa viaže tak na FAS-R ako aj na p55-R. Okrem viazania sa na FAS-R a p55-R, sú tieto proteíny schopné aj viazať sa navzájom, čo poskytuje funkčnú krížovú komunikáciu medzi FAS-R a p55-R. Tieto väzby sa uskutočňujú cez konzervatívny sekvenčný motív, modul smrtiacej domény (tiež nazývaný DED odvodené od death effector domain'j, ktorý je spoločný pre receptory a ich asociované proteíny. Navyše, hoci sa v kvasinkovom dvojhybridnom teste zistilo, že MORT-1 sa spontánne viaže na FAS-R v cicavčích bunkách, toto naviazanie sa uskutočňuje len po stimulácii receptora, čo naznačuje, že MORT-1 sa zúčastňuje na iniciácii dejov FAS-R signalizácie. MORT-1 neobsahuje žiadny sekvenčný motív charakteristický pre enzymatickú aktivitu, takže sa zdá, že jeho schopnosť spustiť bunkovú smrť nezahŕňa vlastnú aktivitu MORT-1, ale aktiváciu nejakého iného proteínu(nov), ktoré sa viažu na MORT-1 a účinkujú ďalej v nasledujúcich krokoch kaskády. Bunková expresia MORT-1 mutantov, ktorým chýbala N-terminálna časť

molekuly, ukázala, že je blokovaná cytotoxická indukcia FAS/APO1 (FAS-R) alebo p55-R (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), čo naznačuje, že táto Nterminálna oblasť prenáša signalizáciu cytocídneho účinku oboch receptorov prostredníctvom proteín-proteín interakcií.

Súčasné štúdie začlenili skupinu cytoplazmatických tiolových proetáz, ktoré sú štrukturálne príbuzné z Caenorhabditis elegans proteázou CED3 a cicavčím interleukín-ΐβ konvertujúcim enzýmom (ICE), do začiatku rôznych fyziologických procesov bunkovej smrti (zhrnuté v Kumar, 1995 a Henkart, 1996). Existujú tiež určité indikácie, že proteáza(y) z tejto rodiny sa môžu zúčastňovať na bunkovej cytotoxicite indukovanej FAS-R a TNF-Rs. Zistilo sa, že špecifické peptidové inhibítory proteáz a dva vírusom kódované proteíny, ktoré blokujú ich funkcie, proteín kravských kiahní crmA a baculovírus p35 proteín, poskytujú bunke ochranu proti tejto bunkovej cytotoxicite (Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Krátko po stimulácii FAS-R alebo TNFRs môže byť v bunke demonštrované rýchle štiepenie určitých špecifických bunkových proteínov, očividne sprostredkované proteázou(ázami) CED3/ICE rodiny.

Treba poznamenať, že tieto CED3/ICE proteázy, tiež nazývané kaspázy, sú vytvárané ako inaktívne prekurzory a stávajú sa aktívnymi spracovaním pri indukcii smrti. Tieto kaspázy sú konzervatívne cysteínové proteázy, ktoré štiepia špecifické bunkové proteíny smerom nadol od asparátových zvyškov, a tým hrajú kľúčovú úlohu vo všetkých známych procesoch programovanej bunkovej smrti. Prekurzorové proteíny obsahujú okrem ich homologických C-terminálnych oblastí, od ktorých sú odvodené zrelé proteázy, unikátne N-terminále oblasti. Interakcie týchto prodomén so špecifickými regulačnými molekulami umožňujú diferencovanú aktiváciu rôznych kaspáz prostredníctvom rôznych smrť indukujúcich signálov (Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Duan and Dixit, 1997; Van Criekinge et al., 1996; Ahmad et al., 1997).

V súčasnosti bola izolovaná, klonovaná, charakterizovaná a boli tiež opísané možné použitia jednej takejto proteázy a jej rôznych izoforiem (vrátane inhibičných proteáz) označovanej ako MACH (tiež nazývanej CASP-8), ktorá je MORT-1

viažucim proteínom, a ktorá slúži na moduláciu aktivity MORT-1, a tým FAS-R a p55-R, a ktorá môže tiež účinkovať nezávisle od MORT-1, ako je podrobne uvedené v spoločne vlastnených izraelských prihláškach vynálezu č. IL 114615, 114976, 115319, 116588 a 117932, ktoré sú paralelne v konaní a sú tu celé uvedené ako citácia, ako aj v ich korešpondujúcom PCT náprotivku č. PCT/US96/10521 a v súčasnej publikácii terajších pôvodcov (Boldin et al., 1996). Iné takéto proteázy a ich rôzne izoformy (vrátane inhibičných proteáz), označované Mch4 (tiež nazývané CASP-10), sa v súčasnosti tiež izolovali a charakterizovali terajšími pôvodcami (nepublikované) a inými (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996). Tento Mch4 proteín je tiež MORT-1 viažuci proteín, ktorý slúži na moduláciu aktivity MORT-1, a tým pravdepodobne aj na reguláciu FAS-R a p55-R, a ktorý môže účinkovať aj nezávisle na MORT-1. Takže detaily týkajúce sa všetkých aspektov, znakov, charakteristík a použití Mch4 sú uvedené vo vyššie uvedených publikáciách, ktoré sú tu všetky zahrnuté celé ako citácia.

Treba tiež poznamenať, že kaspázy, MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10), ktoré majú podobné prodomény (pozri Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincent and Dixit, 1997), interagujú prostredníctvom ich prodomén s MORT-1, pričom táto interakcia je cez motív smrtiacej domény alebo smrtiacu efektorovú doménu, DED, prítomnú v N-terminálnej časti MORT-1 a prítomnú dvojmo v MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) (pozri Boldin et al., 1995b; Chinnalyan et al., 1995).

Treba tiež poznamenať vzhľadom na vyššie uvedené, že rôzne proteíny/enzýmy/receptory zahrnuté vo vnútrobunkovom signalizačnom procese vedúcom k bunkovej smrti obdržali rôzne mená.

Aby sme predišli zmätku, nasleduje zoznam rôznych mien pre každý z týchto proteínov alebo ich častí, vrátane nových mien určených podľa novej konvencie a mien, ktoré sú tu ďalej použité.

Bežné alebo tu prvé meno	Iné mená	Nové meno podľa konvencie	Používané meno
p55 TNF receptor	p55-R	CD120a	p55-R
p75 TNF receptor	p75-R	CD120b	p75-R
FAS receptor	FAS-R, FAS/APO1	CD95	FAS-R
MORT-1	FADD	-	MORT-1
MACH	FLICE1, Mch5	CASP-8	MACH
Mch4	FLICE2	CASP-10	Mch4
G1	-	CASH	G1
smrtiaca doména	motív smrtiacej domény, smrtiaca efektorová doména (DED), MORT moduly		smrtiaca doména/MORT motív, motív smrtiacej domény, MORT moduly
CED3/ICE proteázy	kaspázy	CASP	CED3/ICE proteázy

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je poskytnúť nové proteíny, vrátane ich všetkých izoforiem, fragmentov alebo derivátov, ktoré sú schopné viazať sa na MORT-1viažuce proteíny, napríklad na vyššie uvedené Mch4 a MACH proteíny a ich izoformy, alebo ktoré sú schopné viazať sa na samotný MORT-1. Keďže sa samotný MORT-1 viaže na vnútrobunkovú doménu FAS-R, nové proteíny podľa predloženého vynálezu sú schopné prostredníctvom naviazania sa na MORT-1viažuce proteíny, a tak nepriamo na MORT-1, alebo prostredníctvom priameho naviazania sa na MORT-1 proteín, ovplyvňovať vnútrobunkový signalizačný proces, ktorý je iniciovaný naviazaním FAS ligandu na jeho receptor, a ako také sú nové

proteíny podľa predloženého vynálezu modulátormi FAS-R-sprostredkovaného účinku na bunky. MORT-1 sa tiež zúčastňuje na modulácii TNF účinku na bunky prostredníctvom jeho zapojenia do modulácie p55-R, takže sa predpokladá, že nové proteíny podľa predloženého vynálezu sú aj modulátormi TNF-účinku na bunky, ktorý je sprostredkovaný p55-R. Podobným spôsobom, analogicky s vyššie opísanou moduláciou účinku na bunky, ktorá je sprostredkovaná FAS-R a p55-R, môžu byť proteíny podľa predloženého vynálezu mediátory alebo modulátory iných cytotoxických mediátorov alebo indukčných činidiel pôsobeným cez spoločné alebo príbuzné vnútrobunkové signalizačné dráhy, v ktorých sú proteíny zahrnuté (napr. G1 a jeho izoformy). Tieto nové proteíny podľa predloženého vynálezu sú označované ako G1 proteíny, a ako bolo poznamenané vyššie zahŕňajú G1 proteín (ich príklady sú uvedené nižšie), všetky jeho izoformy, analógy, fragmenty alebo ich deriváty.

Iným predmetom vynálezu je poskytnúť antagonisty (napr. protilátky, peptidy, organické zlúčeniny alebo aj nejaké izoformy) k vyššie uvedeným G1 proteínom, ich izoformám, analógom, fragmentom a derivátom, ktoré môžu byť použité, ak je to žiaduce, na inhibíciu signalizačného procesu, alebo konkrétnejšie na inhibíciu bunkovej cytotoxicity.

Ďalším predmetom vynálezu je použitie vyššie uvedených nových G1 proteínov, ich izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov na izoláciu a charakterizáciu ďalších proteínov alebo faktorov, ktoré môžu byť zahrnuté v regulácii aktivity receptora, napr. iných proteáz, ktoré štiepia nové proteíny, aby boli biologicky aktívne a/alebo na izoláciu a identifikáciu iných receptorov, ktoré sú začlenené v predchádzajúcich dejoch signalizačného procesu, na ktoré sa tieto nové proteíny, analógy, fragmenty a deriváty viažu (napr. iné FAS-Rs alebo príbuzné receptory), a na ktorých funkcii sa tým podieľajú.

Ešte ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť inhibítory, ktoré môžu byť zavedené do bunky za účelom naviazania sa alebo interakcie s G1 proteínom a možnými G1 izoformami, ktoré majú proteázovú aktivitu (G1 proteín má oblasť, ktorá je homologická s proteolytickými oblasťami Mch4 a MACH), a aby inhibovali

ich vnútrobunkovú aktivitu, ktorá, aspoň v prípade niektorých možných G1 izoforiem, môže byť proteolytickou aktivitou.

Navyše je predmetom predloženého vynálezu použitie vyššie uvedených nových G1 proteínov, izoforiem a analógov, ich fragmentov a derivátov ako antigénov na prípravu polyklonálnych a/alebo monoklonálnych protilátok proti nim. Spätne, protilátky môžu byť použité napríklad na purifkáciu nových proteínov z odlišných zdrojov, ako napríklad z bunkových extraktov alebo z transformovaných bunkových línií.

Navyše tieto protilátky môžu byť použité na diagnostické účely, napr. na identifikáciu porúch týkajúcich sa abnormálneho fungovania bunkových účinkov sprostredkovaných FAS-R alebo inými príbuznými receptormi.

Ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť farmaceutické prostriedky obsahujúce vyššie uvedené nové G1 proteíny, izoformy alebo analógy, ich fragmenty alebo deriváty, ako aj farmaceutické prostriedky obsahujúce vyššie uvedené protilátky alebo iné antagonisty.

V súlade s predloženým vynálezom bol izolovaný nový proteín G1, ktorý je schopný viazať sa na alebo interagovať s Mch4, ktorý sa viaže na MORT-1, ktorý sa viaže na vnútrobunkovú doménu FAS-R. G1 môže interagovať aj s iným MORT1-viažucim proteínom nazývaným MACH a môže byť tiež schopný viazať sa alebo interagovať priamo s MORT-1. G1 pravdepodobne funguje ako modulátorový komponent dráhy bunkovej smrti, ktorá je iniciovaná naviazaním FAS ligandu na FAS-R na bunkovom povrchu, a to na základe faktu, že má proteolytickú oblasť podobnú s proteolytickými oblasťami Mch4 a MACH, takže G1 môže byť tiež aktívnou vnútrobunkovou proteázou. Ďalej, v závislosti od transkripčno/translačných procesov pri expresii G1, hlavne jeho proteolytickej oblasti, môžu byť niektoré izoformy G1 exprimované bez aktívnej proteolytickej oblasti a ako také môžu slúžiť ako antagonisty proteolytickej aktivity sprostredkovanej napríklad Mch4 a MACH. Proteázy CED3/ICE rodiny boli zahrnuté do apoptických procesov spúšťaných prostredníctvom FAS-R. MORT-1 (alebo FADD) sa viaže na vnútrobunkovú doménu FAS-R pri aktivácii tohto receptora a nový G1 proteín podľa predloženého vynálezu sa viaže na MORT-1-viažuce proteíny ako napríklad Mch4 a možno aj na

MACH alebo možno priamo na MORT-1. G1 proteín klonovaný a charakterizovaný podľa predloženého vynálezu môže existovať v mnohých izoformách, z ktorých niektoré majú oblasť CED3/ICE homológie, ktorá má proteolytickú aktivity (proteolytickú doménu), ktorá je podobná s doménami v Mch4 a v niektorých izoformách MACH, a ktorý môže spôsobovať bunkovú smrť, keď sa exprimuje v bunkách. Takže sa ukázalo, že aktivácia tohoto nového CED3/ICE homológu (tzn. rôznych G1 izoforiem, ktoré majú proteolytickú doménu) prostredníctvom FAS-R (cez priamu alebo nepriamu interakciu s MORT-1) predstavuje účinnú zložku FASR-sprostredkovanej dráhy bunkovej smrti.

Navyše sa ukázalo, že G1 funguje aj ako efektorový komponent dráhy bunkovej smrti, ktorá je iniciovaná naviazaním TNF na p55-R na bunkovom povrchu, a to nepriamym mechanizmom naviazania sa MORT-1 na TRADD, proteín, ktorý sa viaže na vnútrobunkovú doménu p55-R (Hsu et al., 1995) a následne alebo zároveň s naviazaním G1 na MORT-1-viažuce proteíny ako napríklad Mch4 alebo MACH, alebo priamo naviazaním na MORT-1, s aktiváciou G1 na aktívnu proteázu podieľajúcu sa na ovplyvňovaní bunkovej smrti.

Treba tiež poznamenať, že hoci G1 vykazuje aspoň nejaké znaky sekvencie, ktoré sú kritické pre funkciu CED3/ICE proteáz, má však určité vlastné dištinktívne sekvenčné znaky, ktoré mu môžu umožňovať unikátny a možno tkanivovo/bunkovo špecifický spôsob činnosti.

Takže podľa predloženého vynálezu je poskytnutý nový proteín označený ako G1. Tento G1 proteín bol izolovaný a klonovaný dvojhybridným vyhľadávacím postupom a bol charakterizovaný ako molekula, ktorá viaže Mch4. Mch4, ako bolo uvedené vyššie, je MORT-1-viažuci proteín, ktorý je schopný ovplyvniť bunkovú smrť, hoci treba tiež poznamenať, že niektoré izoformy Mch4 majú opačný účinok, konkrétne inhibujú usmrcovanie buniek. Ďalej, sekvenovaním G1 sa zistilo, že má vo svojej N-terminálnej oblasti dva takzvané MORT MODULY (MM), ktoré sa tiež našli v MORT-1-viažucich proteínoch MACH a Mch4. Ukázalo sa, že tieto MORT MODULY v G1 zabezpečujú jeho schopnosť viazať sa na MACH alebo na špecifické MACH izoformy (špecifické zostrihové varianty MACH). Ukázalo sa, že G1 sekvencia smerom nadol od N-terminálnej oblasti obsahujúcej MORT MODULY

je dlhá oblasť vykazujúca podobnosť s proteolytickou oblasťou MACH a Mch4. Navyše sa začiatočnou analýzou možného umiestnenia G1 sekvencie v humánnych chromozómoch zistilo, že G1 je umiestnený na chromozóme č. 2, veľmi blízko pozícií Mch4 a MACH, čo tiež naznačuje príbuznosť medzi G1, MACH a Mch4.

Konkrétnejšie, našli sa najmenej tri možné izoformy G1 podľa predloženého vynálezu (pozri príklad 1 nižšie). Dve z nich boli izolované a klonované a ukazuje sa, že predstavujú dva zostrihové varianty nového proteínu označeného ako G1 (alebo CASH). Tieto dve izoformy sú nazývané G1a (alebo CASHa) dlhšia izoforma a Gip (alebo CASH3) kratšia izoforma (hoci sa ukazuje, že je viac ako jedna krátka izoforma, takže ΰ1β je tiež označovaná ako Gipi a iná krátka izoforma je označovaná ako Θ1β2 - pozri príklad 1 nižšie). Každá z týchto G1a a β izoforiem obsahuje dve N-terminálne motívy smrtiacej domény/MORT MODULY a môžu sa navzájom viazať prostredníctvom týchto motívov smrtiacich domén a cez tieto motívy smrtiacich domén sa môžu viazať aj na MORT 1, MACH a Mch4. Dlhšia G1a izoforma má unikátnu C-terminálnu časť (v porovnaní s kratšou ΰ1β izoformou), pričom táto unikátna C-terminálna časť má sekvenciu homologickú s oblasťou kaspázovej proteázovej aktivity. Čo sa týka biologickej aktivity, kratšia Gip izoforma inhibuje bunkovú smrť/cytotoxicitu sprostredkovanú p55-R a FAS-R, zatiaľ čo naproti tomu má dlhšia G1a izoforma cytotoxický účinok na aspoň niektoré typy buniek (napr. 239 bunky), pričom v tejto cytotoxicite je zahrnutá oblasť homologická s proteázou. Avšak treba tiež poznamenať, že dlhšia G1a izoforma je tiež schopná v iných typoch buniek (napr. v HeLa bunkách) inhibovať cytotoxicitu sprostredkovanú FAS-R a p55-R. Tieto výsledky naznačujú, že G1 (konkrétne jeho rôzne izoformy) účinkujú ako zoslabovače/inhibitory a/alebo iniciátory/zosilňovače p55-Ra FAS-R-sprostredkovanej signalizácie pre bunkovú smrť.

Treba tiež poznamenať, že na kvôli zrejmosti tu budú rôzne izoformy G1, napríklad G1a a G1p, často označované jednoducho ako G1, ale treba tomu rozumieť tak, že v takých prípadoch majú byť zahrnuté do významu G1 všetky izoformy G1, takže by mohol znamenať tak induktory/zosilňovače bunkovej cytotoxicity ako ja inhibítory/zoslabovače bunkovej cytotoxicity. Ak bude mienená špecifická G1 izoforma, potom bude menovaná konkrétne napr. G1a alebo ΰΐβ, (podľa situácie). Ak sa G1 použije v kolektívnom význame na označenie rôznych izoforiem, bude tu tiež často označovaný ako modulátor, čo znamená, že môže mať inhibičný alebo povzbudzujúci účinok vo vzťahu k predmetnej biologickej aktivite.

Z vyššie uvedeného vyplýva, že ako bolo poznamenané vyššie a ako bude uvedené nižšie, G1 je zjavne modulátorom MORT-1 aktivity, a teda modulátorom bunkových účinkov sprostredkovaných FAS-R a tiež p55-R, ako aj možnými inými receptormi TNF/NGF receptorovej rodiny a inými, ako aj účinkov, ktoré môžu zdieľať spoločné vnútrobunkové signalizačné komponenty a mechanizmy.

Takže, keďže má G1 zjavne proteáze podobnú oblasť (aspoň dlhá izoforma), môže byť priamo zodpovedný za bunkovú cytotoxicitu a zápal, spôsobené alebo indukované rôznymi stimulmi vrátane tých, ktoré sú prenášané cez receptory TNF/NGF receptorovej rodiny a možno aj inými.

G1 môže tiež slúžiť ako inhibítor bunkovej cytotoxicity a zápalu tým, že je prítomný ako časť komplexu iných proteínov, a ako taký môže ovplyvňovať cytotoxické alebo zápalové účinky týchto proteínov (napr. MACH a Mch4 alebo aj MORT-1), čoho konečným výsledkom je inhibícia ich cytotoxickej aktivity alebo ich aktivity pri zápale.

G1 môže tiež slúžiť ako zosilňovač alebo zoslabovač bunkovej cytotoxicity a zápalu a to oslabovaním aktivity iných proteínov (napr. Mch4 a MACH ale aj MORT1), tým, že sa na nich naviaže a akumuluje ich pre viazanie s MORT-1 alebo účinkuje nezávisle od MORT-1. V každom prípade akumulácia slúži na oslabenie cytotoxickej aktivity rôznych proteínov alebo na oslabenie ich zápalových účinkov.

Podobne, analogickým spôsobom, G1 môže tiež slúžiť ako inhibítor alebo zoslabovač iných vnútrobunkových mediátorov alebo modulátorov, v ktorých dráhach je G1 aktívne zapojený.

MORT-1 (skratka z Mediator of Receptor Toxicity, Boldin et al., 1995) je schopný viazať sa na vnútrobunkovú doménu FAS-R. Ukázalo sa, že tento FASviažuci proteín účinkuje ako mediátor alebo modulátor účinku FAS-R ligandu na bunky, prostredníctvom sprostredkovania alebo modulovania vnútrobunkového

signalizačného procesu, ktorý zvyčajne prebieha po naviazaní sa FAS-R ligandu na bunkový povrch. Ukázalo sa, že okrem FAS-väzobnej špecificity, má MORT-1 iné charakteristiky (pozri príklad 1), napríklad má oblasť homologickú s oblasťami smrtiacej domény (DD) p55-TNF-R a FAS-R (p55-DD a FAS-DD), a je teda tiež schopný vzájomného spájania sa. MORT-1 je tiež schopný sám aktivovať bunkovú cytotoxicitu, pričom táto aktivita sa možno týka jeho schopnosti spájať sa. Tiež sa zistilo, že ko-expresiou oblasti v MORT-1, ktorá obsahuje sekvenciu homologickú so smrtiacou doménou (MORT-DD, prítomná v C-terminálnej časti MORT-1), silne interferuje s FAS-indukovanou bunkovou smrťou, ako sa dalo očakávať vzhľadom na jeho schopnosť viazať sa na smrtiacu doménu FAS-IC. Navyše v rovnakých experimentálnych podmienkach sa zistilo, že výsledkom ko-expresie časti MORT-1, ktorá neobsahuje MORT-DD oblasť (N-terminálna časť MORT-1, aminokyseliny 1 až 117, MORT-1 hlava), nie je žiadna interferencia s FAS-indukovanou bunkovou smrťou, a ak nejaká je, potom o niečo zosilňuje FAS-indukovaný bunkovú cytotoxicitu.

Z toho vyplýva, že je pravdepodobné, že MORT-1 sa viaže aj na iné proteíny, ktoré sú zahrnuté vo vnútrobunkovom signalizačnom procese. Tieto MORT-1-viažuce proteíny môžu teda účinkovať tiež ako nepriame mediátory alebo modulátory účinku FAS-R ligandu na bunky prostredníctvom sprostredkovania alebo modulovania aktivity MORT-1; alebo tieto MORT-1-viažuce proteíny môžu pôsobiť priamo ako mediátory alebo modulátory vnútrobunkového signalizačného procesu spojeného s MORT-1 prostredníctvom sprostredkovania alebo modulovania aktivity MORT-1, ktorý, ako bolo poznamenané vyššie, je zjavne schopný nezávisle aktivovať bunkovú cytotoxicitu. Tieto MORT-1-viažuce proteíny môžu byť tiež použité v ktorejkoľvek štandardnej vyhľadávacej procedúre na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu ďalších proteínov, peptidov, faktorov, protilátok, atď., ktoré môžu byť zahrnuté v signalizačnom procese spojenom s MORT-1 alebo FAS-R, alebo môžu byť zložkami iných vnútrobunkových signalizačných procesov. Takéto MORT-1-viažuce proteíny boli izolované a opísané ako bolo uvedené vyššie v spoločne vlastnených izraelských prihláškach č. IL 114615, 114976, 115319,116588,117932, ktoré sú paralelne v konaní, ako aj v ich

korešpondujúcej PCT prihláške č. PCT/US96/10521 (čo sa týka MACH a jeho izoforiem) a inými, ako napríklad Fernandes-Alnemri et al. (1996) a Srinivasula et al. (1996) (čo sa týka Mch4 a iných takýchto Mch proteínov). Jeden z týchto MORT-1-viažucich proteínov, vyššie uvedený MACH, bol najprv klonovaný, sekvenovaný a čiastočne charakterizovaný ako proteín majúci nasledujúce vlastnosti: MACH cDNA kóduje ORF-B otvorený čítací rámec; MACH sa viaže na MORT-1 veľmi silno a špecifickým spôsobom; MACH-viažuce miesto v MORT-1 sa nachádza nad MORT-1 motívom smrtiacej domény; ORF-B oblasť v MACH je jeho MORT-1-interagujúcou doménou; a MACH je schopný sám sa spájať a samostatne indukovať bunkovú cytotoxicitu. Ďalej neskoršie analýzy uvedené vo vyššie uvedených spoločne vlastnených prihláškach vynálezu, ktoré sú paralelne v konaní, ako aj v Boldin et al. (1996), ukázali, že MACH v skutočnosti existuje v množstve izoforiem. Navyše MACH ORF-B spomenutý vyššie je v skutočnosti jednou z MACH izoforiem označenou ako ΜΑΟΗβΙ. Vo vyššie uvedených publikáciách týkajúcich sa Mch4 sa tiež ukázalo, že tento proteín sa tiež viaže na MORT-1 (alebo FADD) a je priamo zahrnutý v bunkovej cytotoxicite s MORT-1 alebo je od neho nezávislý, a to prostredníctvom proteolytickej aktivity.

Z toho vyplýva, že predložený vynález poskytuje DNA sekvenciu kódujúcu G1 proteín, jeho analógy alebo fragmenty, schopné viazať sa na, alebo interagovať priamo alebo nepriamo s MORT-1 a/alebo na akýkoľvek z MORT-1-viažucich proteínov, ako napríklad Mch4 alebo MACH, pričom G1 proteín, jeho analógy alebo fragmenty sú schopné sprostredkovať vnútrobunkový účinok sprostredkovaný FASR alebo p55-TNF-R, pričom uvedený G1 proteín, jeho analógy alebo fragmenty sú tiež schopné modulovať alebo sprostredkovať vnútrobunkový účinok na iné vnútrobunkové proteíny, na ktoré sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo.

Predložený vynález hlavne poskytuje DNA sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej z:

a) cDNA sekvencie odvodenej z kódujúcej oblasti prirodzeného G1 proteínu;

b) DNA sekvencií schopných hybridizovať so sekvenciou a) v mierne prísnych podmienkach, a ktoré kódujú biologicky aktívny G1 proteín; a

c) DNA sekvencii, ktoré sú degenerované vzhľadom na DNA sekvencie definované v a) a b) v dôsledku genetického kódu, a ktoré kódujú biologicky aktívny G1 proteín.

Iným konkrétnym uskutočnením vyššie uvedenej DNA sekvencie podľa vynálezu je DNA sekvencia obsahujúca aspoň časť sekvencie kódujúcej najmenej jednu izoformu G1 proteínu. Iným uskutočnením vyššie uvedenej DNA sekvencie je sekvencia kódujúca G1 proteín, ktorá je znázornená na obr. 1, (G1a izoforma). Iným takýmto uskutočnením je druhá G1 izoforma znázornená na obr. 2 (G10 izoforma).

Predložený vynález poskytuje G1 proteíny a ich analógy, fragmenty alebo deriváty, ktoré sú kódované ktoroukoľvek z vyššie uvedených sekvencii podľa vynálezu, pričom uvedené proteíny, analógy, fragmenty a deriváty sú schopné viazať sa na, alebo interagovať priamo alebo nepriamo s MORT-1 a/alebo s ktorýmkoľvek z MORT-1-viažucich proteínov ako napríklad Mch4 alebo MACH, a sprostredkovať vnútrobunkový účinok sprostredkovaný FAS-R alebo p55 TNF-R alebo iným cytotoxickým mediátorom alebo indukčným činidlom, na ktoré sú uvedené G1 proteíny, analógy, fragmenty alebo deriváty schopné sa viazať priamo alebo nepriamo.

Špecifickým uskutočnením vynálezu je G1 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty. Iným uskutočnením je akákoľvek izoforma G1 proteínu, jeho analógov, fragmentov a derivátov.

Predložený vynález tiež poskytuje vektory kódujúce vyššie uvedený G1 proteín a analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu, ktoré obsahujú vyššie uvedenú DNA sekvenciu podľa vynálezu, pričom tieto vektory môžu byť exprimované vo vhodných eukaryotických alebo prokaryotických hostiteľských bunkách; transformované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky obsahujúce takéto vektory; a spôsob výroby G1 proteínu alebo analógov, fragmentov alebo derivátov podľa vynálezu prostredníctvom pestovania takýchto transformovaných hostiteľských buniek v podmienkach, ktoré sú vhodné na expresiu uvedeného proteínu, analógov, fragmentov alebo derivátov, ovplyvňovaním post-translačných modifikácií uvedeného proteínu, čo je nevyhnutné na

získanie proteínu a extrakciou exprimovaného proteínu, analógov, fragmentov alebo derivátov z kultivačného média transformovaných buniek alebo z bunkového extraktu transformovaných buniek. Vyššie uvedené definície sú mienené tak, že zahŕňajú všetky izoformy G1 proteínu.

V inom aspekte predložený vynález tiež poskytuje protilátky alebo ich aktívne deriváty alebo fragmenty, ktoré sú špecifické pre G1 proteín a jeho analógy, fragmenty a deriváty podľa vynálezu.

V ešte jednom aspekte vynález poskytuje rôzne použitia vyššie uvedených DNA sekvencii alebo proteínov, ktoré kódujú podľa vynálezu, pričom použitia zahŕňajú okrem iných vo všeobecnosti:

(A) Spôsob modulácie bunkovej smrti alebo zápalových procesov, ktorý zahŕňa ošetrenie uvedených buniek jedným alebo viacerými G1 proteínmi, analógmi, fragmentmi alebo derivátmi podľa vynálezu, ako bolo uvedené vyššie, pričom ošetrenie buniek zahŕňa začlenenie jedného alebo viacerých proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná na vnútrobunkové začlenenie, alebo začlenenie nukleotidovej sekvencie kódujúcej uvedený jeden alebo viacero proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do bunky vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom vektor je schopný uskutočniť inzerciu uvedenej sekvencie do buniek takým spôsobom, že sekvencia je v bunkách exprimovaná; a (B) Spôsob modulácie bunkovej smrti alebo zápalových procesov zahŕňajúci ošetrenie buniek jedným alebo viacerými inhibítormi jedného alebo viacerých proteínov/enzýmov sprostredkujúcich bunkovú smrť alebo zápalové procesy, pričom uvedené inhibítory sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z: (i) jedného alebo viacerých G1 proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov podľa vynálezu, ktoré sú schopné inhibovať bunkovú smrť alebo zápalové procesy; a (ii) inhibítorov jedného alebo viacerých G1 proteínov podľa vynálezu, ak jeden alebo viacero G1 proteínov zoslabuje/zosilňuje alebo sprostredkováva bunkovú smrť alebo zápalové procesy.

Konkrétnejšie, vyššie uvedené spôsoby podľa predloženého vynálezu zahŕňajú nasledujúce špecifické uskutočnenia:

(i) Spôsob modulácie účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R, zahŕňajúci ošetrenie buniek jedným alebo viacerými G1 proteínmi, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi podľa vynálezu, ktoré sú schopné priamo alebo nepriamo viazať sa na MORT-1, alebo na vyššie uvedené MORT-1 viažuce proteíny, pričom MORT-1 sa viaže na TRADD, ktorý sa viaže na vnútrobunkovú doménu p55-R, a tým je schopný modulovať/sprostredkovať aktivitu FAS-R alebo p55 TNF-R, pričom toto ošetrovanie buniek zahŕňa vnesenie jedného alebo viacerých proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná na ich vnútrobunkové inkorporovanie, alebo vnesenie DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom vektor je schopný uskutočniť inzerciu sekvencie do buniek takým spôsobom, že sekvencia sa v bunkách exprimuje.

(ii) Spôsob na moduláciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky podľa (i) vyššie, spočívajúci v tom, že ošetrovanie buniek zahŕňa vnesenie G1 proteínu alebo jeho analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná na vnútrobunkové začlenenie, alebo vnesenie DNA sekvencie kódujúcej G1 proteín alebo analógy, fragmenty alebo deriváty do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom vektor je schopný uskutočniť inzerciu sekvencie do buniek takým spôsobom, že sekvencia sa v bunkách exprimuje.

(iii) Spôsob ako v (ii) vyššie, spočívajúci v tom, že ošetrenie buniek sa uskutočňuje transfekciou buniek rekombinantnými živočíšnymi vektormi, ktorá zahŕňa nasledujúce kroky:

a) skonštruovanie rekombinantného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín (ligand), ktorý je schopný špecificky sa viazať na bunkový povrchový receptor na povrchu FAS-R- alebo p55-R-nesúcej bunky a druhú sekvenciu kódujúcu proteín vybraný z G1 proteínu a jeho analógov, fragmentov a derivátov, ktoré, keď sú exprimované v bunkách, sú schopné modulovať/sprostredkovávať aktivitu FAS-R alebo p55-R;

a

b) infikovanie buniek vektorom podľa a).

(iv) Spôsob modulovania účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R zahŕňajúci ošetrenie buniek protilátkami alebo ich aktívnymi fragmentárni alebo derivátmi podľa vynálezu, pričom ošetrenie sa uskutočňuje aplikáciou vhodnej kompozície obsahujúcej protilátky alebo ich aktívne fragmenty alebo deriváty na bunky, pričom ak je aspoň časť G1 proteinu exponovaná na extracelulárnom povrchu, je kompozícia formulovaná na extracelulárnu aplikáciu, a keď sú G1 proteíny úplne vnútrobunkové, je kompozícia formulovaná na vnútrobunkovú aplikáciu.

(v) Spôsob modulovania účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R zahŕňajúci ošetrenie buniek oligonukleotidovou sekvenciou kódujúcou antisense sekvenciu aspoň časti sekvencie G1 proteinu podľa vynálezu, pričom oligonukleotidová sekvencia je schopná blokovať expresiu G1 proteinu.

(vi) Spôsob ako v (ii) vyššie na ošetrovanie nádorových buniek alebo buniek infikovaných HIV alebo iných chorých buniek, ktorý zahŕňa:

a) skonštruovanie rekombinantného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu kódujúcu vírusový proteín schopný viazať sa so špecifickým povrchovým receptorom nádorovej bunky alebo povrchovým receptorom bunky infikovanej HIV alebo receptorom neseným inými chorými bunkami a sekvenciu kódujúcu proteín vybraný z G1 proteinu, analógov, fragmentov a derivátov podľa vynálezu tak, že keď sa exprimuje v nádorových HlV-infikovaných alebo iných chorých bunkách, je schopný zabiť uvedené bunky; a

b) infikovanie nádorových buniek alebo buniek infikovaných HIV alebo iných chorých buniek s uvedeným vektorom podľa a).

(vii) Spôsob modulácie účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky zahŕňajúci aplikovanie ribozýmovej procedúry, v ktorom sa vnesie do buniek vektor kódujúci ribozýmovú sekvenciu schopnú interagovať s bunkovou mRNA sekvenciou kódujúcou G1 proteín podľa vynálezu, vo forme, ktorá dovoľuje expresiu ribozýmovej sekvencie v bunkách, pričom, keď sa exprimuje ribozýmová sekvenciu v bunkách, interaguje s bunkovou mRNA a štiepi mRNA sekvenciu, čoho výsledkom je inhibícia expresie G1 proteinu v bunkách.

(viii) Spôsob vybraný zo spôsobov podľa vynálezu, spočívajúci v tom, že sekvencia kódujúca G1 proteín obsahuje najmenej jednu z ktorýchkoľvek G1 izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov podľa vynálezu, ktoré sú schopné priamo alebo nepriamo sa viazať na MORT-1 alebo na MORT-1 -viažuce proteíny ako napríklad Mch4 a MACH, pričom MORT-1 sa špecificky viaže na FAS-IC, alebo, ktoré sú schopné priamo alebo nepriamo sa viazať na MORT-1 alebo na MORT-1 viažuce proteíny, pričom MORT-1 sa viaže na TRADD, ktorý sa viaže na p55-IC.

(ix) Spôsob izolácie a identifikácie proteínov podľa vynálezu, ktoré sú schopné priamo alebo nepriamo sa viazať na MORT-1 proteín alebo na MORT-1viažuce proteíny, zahŕňajúci použitie kvasinkového dvojhybridného postupu, v ktorom je sekvencia kódujúca MORT-1 proteín alebo MORT-1-viažuce proteíny nesená jedným hybridným vektorom a sekvencia z cDNA knižnice alebo z knižnice genomickej DNA je nesená druhým hybridným vektorom, pričom vektory sú potom použité na transformovanie kvasinkových hostiteľských buniek a pozitívne transformované bunky sa izolujú, následne sa extrahuje druhý hybridný vektor, čím sa získa sekvencia kódujúca proteín, ktorý sa viaže na MORT-1 proteín alebo na MORT-1-viažuce proteíny.

(x) Spôsob podľa ktoréhokoľvek z (i) až (ix) vyššie, v ktorom je G1 proteín ktorýmkoľvek z izoforiem G1, ich analógov, fragmentov a derivátov.

(xi) Spôsob podľa ktoréhokoľvek z vyššie uvedených (i) až (x), pričom G1 proteín alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov sú zahrnuté v modulácii bunkového účinku sprostredkovaného alebo modulovaného iným cytotoxickým mediátorom alebo indukčným činidlom, na ktoré sa môže priamo alebo nepriamo viazať G1 proteín, izoforma, analóg, fragment alebo derivát.

(xii) Spôsob vyhľadávania iných látok ako napríklad peptidov, organických zlúčenín, protilátok, atd'., na získanie špeciálnych liečiv, ktoré sú schopné inhibovať aktivitu G1, napr. inhibovať G1a proteázovú aktivitu, a tým inhibovať bunkovú cytotoxicitu alebo inhibovať Gip aktivitu, a tým zosilňovať bunkovú cytotoxicitu.

Uskutočnenia vyššie uvedeného spôsobu vyhľadávania podľa (xii) zahŕňa:

(1) Spôsob vyhľadávania ligandu schopného viazať sa na G1 proteín podľa vynálezu, ako bolo uvedené vyššie, zahŕňa kontaktovanie afinitnej chromatografickej matrice, na ktorej je pripojený uvedený proteín, s bunkovým extraktom, čím dochádza k naviazaniu ligandu na uvedenú matricu a eluovanie, izolovanie a analyzovanie uvedeného ligandu.

(2) Spôsob vyhľadávania DNA sekvencie kódujúcej ligand schopný viazať sa na G1 proteín podľa vynálezu, zahŕňajúci použitie kvasinkového dvojhybridného postupu, v ktorom je sekvencia kódujúca uvedený proteín nesená jedným hybridným vektorom a sekvencie z cDNA knižnice alebo z knižnice genomickej DNA sú nesené druhým hybridným vektorom, transformovanie kvasinkových hostiteľských buniek uvedenými vektormi, izoláciu pozitívne transformovaných buniek a extrakciu druhého hybridného vektora na získanie sekvencie kódujúcej ligand.

(3) Spôsob identifikácie a výroby ligandu schopného modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú MORT-1 alebo MORT-1-viažucimi proteínmi, ktorý zahŕňa:

a) vyhľadávanie ligandu schopného viazať sa na polypeptid obsahujúci aspoň časť MORT-1 alebo MORT-1-viažucich proteínov, ktoré sú vybrané z MACH proteínov, Mch4 proteínov a iných MORT-1-viažucich proteínov;

b) identifikáciu a charakterizáciu ligandu, ktorý sa líši od MORT-1 alebo MORT-1-viažucich proteínov alebo časti receptora TNF/NGF receptorovej rodiny, a ktorý bol nájdený v uvedenom vyhľadávacom kroku, ako taký, ktorý je schopný väzby; a

c) výrobu ligandu v podstate v izolovanej a purifikovanej forme.

(4) Spôsob identifikácie a výroby ligandu schopného modulovať bunkovú aktivitu modulovanú alebo sprostredkovanú G1 proteínom podľa vynálezu, ktorý zahŕňa:

a) vyhľadávanie ligandu schopného viazať sa na polypeptid obsahujúci aspoň časť G1a sekvencie znázornenej na obr.1 alebo aspoň časť Gip sekvencie znázornenej na obr. 2;

b) identifikáciu a charakterizáciu ligandu, ktorý sa líši od MORT-1 alebo MORT-1-viažucich proteínov alebo častí receptora TNF/NGF receptorovej rodiny, a

ktorý bol nájdený v uvedenom vyhľadávacom kroku, ako taký, ktorý je schopný väzby; a

c) výrobu ligandu v podstate v izolovanej a purifikovanej forme.

(5) Spôsob identifikácie a výroby ligandu schopného modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú G1, ktorý zahŕňa:

a) vyhľadávanie ligandu schopného viazať sa aspoň na časť G1a sekvencie znázornenej na obr.1 alebo Gip sekvencie znázornenej na obr. 2;

b) identifikáciu a charakterizáciu ligandu, ktorý sa líši od MORT-1 alebo MORT-1-viažucich proteínov alebo častí receptora TNF/NGF receptorovej rodiny, a ktorý bol nájdený v uvedenom vyhľadávacom kroku, ako taký, ktorý je schopný väzby; a

c) výrobu ligandu v podstate v izolovanej a purifikovanej forme.

(6) Spôsob identifikácie a výroby molekuly, ktorá je schopná priamo alebo nepriamo modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú G1, zahŕňajúci:

a) vyhľadávanie molekuly schopnej modulovať aktivity modulované/sprostredkované prostredníctvom G1

b) identifikáciu a charakterizáciu uvedenej molekuly; a

c) výrobu uvedenej molekuly v podstate v izolovanej a purifikovanej forme.

(7) Spôsob identifikácie a výroby molekuly, ktorá je schopná priamo alebo nepriamo modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú G1 proteínom podľa vynálezu, zahŕňajúci:

a) vyhľadávanie molekuly schopnej modulovať aktivity modulované/sprostredkované prostredníctvom G1 proteínu

b) identifikáciu a charakterizáciu uvedenej molekuly; a

c) výrobu uvedenej molekuly v podstate v izolovanej a purifikovanej forme.

Predložený vynález tiež poskytuje farmaceutický prostriedok na moduláciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky alebo účinku iných cytotoxických mediátorov alebo indukčných činidiel na bunky, ako bolo uvedené vyššie, ktorá ako aktívnu zložku zahŕňa ktorýkoľvek z nasledujúcich:

(i) G1 proteín podľa vynálezu a biologicky aktívne fragmenty, analógy, deriváty alebo ich zmesi, (ii) rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci proteín schopný viazať sa na bunkový povrchový receptor a kódujúci G1 proteín alebo biologicky aktívne fragmenty alebo analógy podľa vynálezu;

(iii) oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu antisense sekvenciu G1 proteínovej sekvencie podľa vynálezu, pričom uvedený oligonukleotid môže byť druhou sekvenciou rekombinantného živočíšneho vírusového vektora podľa vyššie uvedeného (ii).

Predložený vynález tiež poskytuje:

I. Spôsob modulácie MORT-1-indukovaného účinku alebo MORT-1-viažucim proteínom-indukovaného účinku alebo účinku akéhokoľvek iného cytotoxického mediátora alebo indukčného činidla na bunky, zahŕňajúci pôsobenie na bunky podľa ktoréhokoľvek z vyššie uvedených spôsobov (i) až (x), G1 proteínmi, ich analógmi, fragmentmi alebo derivátmi alebo sekvenciami kódujúcimi G1 proteíny, ich analógy alebo fragmenty, pričom výsledkom pôsobenia je zosilnenie alebo inhibícia MORT1-sprostredkovaného účinku, a tým tiež FAS-R alebo p55-R-sprostredkovaného účinku alebo účinku iného cytotoxického mediátora alebo indukčného činidla.

II. Spôsob ako bol opísaný vyššie, pričom G1 proteín, jeho analóg, fragment alebo derivát je tou časťou G1 proteínu, ktorá je špecificky zahrnutá vo viazaní na MORT-1 alebo MORT-1-viažuce proteíny, alebo na iný cytotoxický mediátor alebo indukčné činidlo, alebo uvedená G1 proteínová sekvencia kóduje tú časť G1 proteínu, ktorá je zahrnutá vo viazaní na MORT-1 alebo MORT-1-viažuce proteíny, alebo na iný cytotoxický mediátor alebo indukčné činidlo.

III. Spôsob ako bol opísaný vyššie, pričom G1 proteín je ktoroukoľvek z G1 izoforiem, pričom uvedené izoformy sú schopné zosilňovať účinok spojený s MORT1, alebo účinok, ktorý je spojený s iným cytotoxickým mediátorom alebo indukčným činidlom na buky, a tým sú tiež schopné zosilňovať FAS-R- alebo p55-R-asociovaný účinok na bunky alebo účinok iného cytotoxického mediátora alebo indukčného činidla na bunky.

IV. Spôsob ako bol opísaný vyššie, pričom G1 proteín je ktoroukoľvek z G1 izoforiem, pričom uvedené izoformy sú schopné inhibovať účinok spojený s MORT1, alebo účinok, ktorý je spojený s iným cytotoxickým mediátorom alebo indukčným činidlom na buky, a tým sú tiež schopné inhibovať FAS-R- alebo p55-R-asociovaný účinok na bunky alebo účinok iného cytotoxického mediátora alebo indukčného činidla na bunky.

Ako vyplýva z vyššie uvedeného, ako aj z podrobného opisu nižšie, G1 môže byť tiež použitý v MORT-1 nezávislom spôsobe pôsobenia na bunky alebo tkanivá. Izolácia G1 proteinov, ich identifikácia a charakterizácia sa môže uskutočňovať prostredníctvom ktorejkoľvek zo štandardných vyhľadávacích techník používaných na izoláciu a identifikáciu proteinov, napríklad kvasinkovým dvojhybridným spôsobom, metódami afinitnej chromatografie, a ktorýmkoľvek z iných dobre známych štandardných postupov používaných na tento účel.

Ďalej, niektoré izoformy G1 môžu mať len proteáze podobnú oblasť (homologickú s vyššie uvedenými proteázovými oblasťami iných známych proteáz), zatiaľ čo nemajú skutočnú proteázovú aktivitu, takže dôsledkom je, že takéto izoformy môžu slúžiť hlavne ako inhibítory, ako bolo uvedené vyššie.

Navyše, keďže G1 alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem môžu byť zahrnuté v modulovaní MORT-1-nezávislých vnútrobunkových dráh, môže byť G1 alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem zahrnutá v modulácii signalizácie ktorejkoľvek z iných vnútrobunkových dráh alebo mechanizmov.

Predložený vynález tiež poskytuje iné aspekty a uskutočnenia, ktoré vyplývajú z nasledujúceho podrobného opisu vynálezu.

Treba poznamenať, že tam, kde sú ďalej použité nasledujúce výrazy: Modulácia účinku FAS-ligandu alebo TNF na bunky; a Modulácia účinku MORT-1 alebo MORT-1-viažuceho proteínu na bunky, sú mienené významy, ktoré zahŕňajú in vitro ako aj in vivo pôsobenie a navyše tiež zahŕňajú inhibíciu alebo zosilnenie/zoslabenie.

Predložený vynález sa v jednom aspekte týka nových G1 proteinov, ktoré sú schopné viazať sa na alebo interagovať priamo alebo nepriamo s MORT-1 alebo s MORT-1-viažucimi proteínmi ako napríklad s Mch4 a MACH a tým, sa viazať na

vnútrobunkovú doménu FAS-R receptora, na ktorý sa viaže MORT-1 alebo sa viazať na vnútrobunkovú doménu p55 TNF-R, na ktorý sa viaže TRADD, pričom na TRADD proteín sa viaže MORT-1. Takže G1 proteíny podľa predloženého vynálezu sú považované za mediátory alebo modulátory FAS-R, majúce úlohu napríklad v signalizačnom procese, ktorý je iniciovaný väzbou FAS-R ligandu na FAS-R, a podobne tiež majúce úlohu v signalizačnom procese, ktorý je iniciovaný väzbou TNF na p55-R. Medzi G1 proteíny podľa predloženého vynálezu sú zahrnuté novo nájdený G1 a jeho izoformy.

Bližšie, podľa predloženého vynálezu bol opísaný nový proteín (tiež nazývaný CASH), ktorý je podľa všetkého homológ nematódovej proteázy CED3. Tento nový G1 proteín, ktorý, napriek tomu, že je veľmi príbuzný, vykazuje však niektoré rozdiely v štruktúre a substrátovej špecificite a ako taký, môže v cicavčích bunkách slúžiť na nejaké odlišné funkcie. V skutočnosti sú známe dve rozličné aktivity proteáz. Zdá sa, že hlavnou úlohou ICE (tiež nazývanej CASP-1) je spracovanie IL-1 β prekurzora, zatiaľ čo sa jednoznačne ukázalo, že CED3 slúži ako efektor programovanej bunkovej smrti. Táto efektorová úloha je podľa všetkého úlohou aspoň niektorých cicavčích homológov, napríklad niektorej z MACH (tiež nazývaný CASP-8) izoforiem podľa vyššie uvedených spoločne vlastnených prihlášok vynálezov, ktoré sú zároveň v konaní, ako aj vyššie uvedeného príbuzného Mch4 (tiež nazývaného CASP-10), na ktorý sa viaže G1 podľa predloženého vynálezu. Aminokyselinová sekvencia MACHal vykazuje najbližšiu podobnosť s CPP32 (tiež nazývaným CASP-3), ktorý je najbližším známym cicavčím homológom CED3. Substrátová špecificita MACH je podobná substrátovej špecificite CPP32, s výnimkou toho, že MACHal substrátová špecificita sa zdá byť obmedzenejšia ako CPP32 špecificita. CPP32 preferenčne štiepi substrátový peptid zodpovedajúci štiepnemu miestu v poly(ADP ribóza)polymeráze (PARP), má ešte nejakú proteolytickú aktivitu proti peptidu korešpondujúcemu s ICE štiepiacim miestom v IL-β prekurzore. Avšak zdá sa, že MACHal je sám schopný štiepiť sekvencie odvodené od PARP. Tieto príbuzenské vzťahy MACHal s CPP32 a CED3, a jeho nepodobnosť s ICE, sú v súlade s myšlienkou, že MACHal slúži,

podobne ako CED3, ako regulátor bunkovej smrti. MACHal predsa len vykazuje určité sekvenčné znaky, ktoré ho odlišujú od CED3 a od CPP32, ako aj od všetkých iných členov CED3/ICE rodiny. C-terminálna časť MACHal, smerom nahor od CED3/ICE homologickej oblasti, nevykazuje žiadnu podobnosť so žiadnou z horných oblastí ktoréhokoľvek z iných homológov. V CED3/ICE homologickej oblasti proteínu sa tiež vyskytujú určité jedinečné sekvenčné znaky. Tieto rozdiely naznačujú, že MACHal patrí do odlišnej evolučnej vetvy rodiny, a že jeho podiel na bunkovej smrti sa tak trochu líši od podielu vyššie opísaných CED3/ICE homológov. Podobne G1 proteín podľa predloženého vynálezu a jeho možné izoformy tiež vykazujú nejaké rozdiely v CED3/ICE homologickej oblasti vo vnútri G1 sekvencie, a ako také môžu tieto rozdiely predstavovať znaky reflektujúce špecificitu aktivity G1 v cicavčích bunkách.

Jeden dôležitý rozdiel sa môže týkať spôsobu akým je regulovaná funkcia proteázy. Pri zapojení sa tak procesov vývojovej bunkovej smrti ako aj receptorom indukovanej imunitnej cytolýzy, malo by byť štiepenie proteínov proteázou CED3/ICE rodiny prístupné regulácii tak prostredníctvom signálov, ktoré sa vytvárajú vo vnútri bunky ako aj signálov, ktoré prúdia z bunkových povrchových receptorov. Zdá sa, že v procesoch vývojovej bunkovej smrti zahŕňa aktivácia takýchto proteáz mechanizmy, ktoré ovplyvňujú génovú expresiu, čoho výsledkom je zosilnená syntéza proteáz, ako aj je znížená syntéza proteínov ako napríklad BCL-2, ktoré sú antagonistami ich apoptického účinku. Avšak toto jednoznačne nie je prípad cytotoxicity spustenej FAS-R alebo TNF receptormi. Bunky môžu byť zabité TNF alebo FAS-R ligandom aj keď je ich aktivita proteínovej syntézy úplne blokovaná (v skutočnosti sú potom zabíjané efektívnejšie) a zostáva v týchto podmienkach závislá na podnete. Aktivácia proteáz z CED3/ICE rodiny TNF receptormi a FAS-R teda môže nastať mechanizmom, ktorý je nezávislý na syntéze proteínov. Jedinečné sekvenčné vlastnosti MACHal mu môžu umožniť, aby sa zúčastnil v takomto mechanizme. Podobne, jedinečné sekvenčné vlastnosti G1 proteínu podľa predloženého vynálezu, ho tiež môžu vybaviť schopnosťou zúčastniť sa v takomto mechanizme.

Takže nový G1 proteín môže byť ešte ďalším členom v súčasnosti nájdenej skupiny proteáz, ktorá zahŕňa vyššie uvedený MACH (a jeho izoformy) a Mch4, o ktorých sa zistilo, že sú spojené, buď priamo alebo cez adaptorový proteín, s vnútrobunkovou doménou bunkového povrchového receptora. Na základe spôsobu účinkovania proteínov asociovaných s receptorom, ktoré majú iné enzymatické aktivity, sa zdá byť pravdepodobným, že viazanie sa G1 na Mch4 alebo G1 na MACH (alebo na izoformu Machal) a naopak viazanie sa Mch4 z Mach na MORT1, alebo priame viazanie sa G1 na MORT-1, umožňuje stimuláciu G1 a/alebo MACH proteázovej aktivity prostredníctvom spustenia FAS-R cez Fas ligand. Môže to tiež umožňovať aktiváciu proteázy prostredníctvom p55-R cez viazanie sa M0RT1 na TRADD, ktorý viaže p55-R.

Boli nájdené iné členy CED3/ICE rodiny, ktoré vykazujú úplnú aktivitu len po proteolytickom spracovaní, ktoré nastáva buď prostredníctvom ich vlastného štiepenia alebo prostredníctvom účinkov iných proteáz z tejto rodiny (zhrnuté v Kumas, 1995; Henkart, 1996). Napríklad, ako je bližšie opísané vo vyššie uvedených spoločne vlastnených prihláškach vynálezov, ktoré sú paralelne v konaní, týkajúcich sa MACH, cytotoxický účinok, ktorý je výsledkom ko-expresie dvoch hlavných potenciálnych samostatne sa štiepiacich produktov, naproti neprítomnosti cytotoxicity v bunkách, ktoré exprimujú CED3/ICE homologickú oblasť v úplnej dĺžke, je v súlade s možnosťou, že aj MACHal získava úplnú aktivitu len po jeho spracovaní. Enzymatická aktivita pozorovaná v lyzátoch baktérií, ktorí exprimujú oblasť s úplnou dĺžkou zjavne odzrkadľuje vlastné spracovanie proteínu vytvoreného v týchto podmienkach alebo spracovanie prostredníctvom nejakých bakteriálnych proteáz. Akým spôsobom nastáva toto spracovanie vo vnútri cicavčej bunky, a ako to môže spôsobiť spustenie FAS-R a p55-R nie je známe, ani nie je ešte zrejmé aký je relatívny podiel proteázovej aktivity MACHal na FAS-R- a TNF-indukovanej cytotoxicite. Stanovenie tohto podielu je komplikované faktom, že aj výsledkom expresie MACHpl, ktorému chýba CED3/ICE homologická oblasť, je výrazná cytotoxicita. Táto cytotoxicita pravdepodobne odzrkadľuje schopnosť MACHpi viazať sa na MACHal. Kvôli tejto schopnosti môžu transfekované MACH

molekuly spôsobiť prostredníctvom agregácie konformačné zmeny v MACHal molekulách, ktoré sú vo vnútri transfekovanej bunky. Takýto mechanizmus môže byť dobrým vysvetlením aj pre cytotoxicitu pozorovanú v prípade, že sú molekuly, ktoré pôsobia pred MACH, (MORT1, TRADD alebo smrtiace domény buď p55-R alebo FAS-R) nadmerne exprimované v bunkách. Avšak v súčasnosti nemožno vylúčiť, že cytotoxicita pozorovaná pri indukcii expresie MACH alebo molekúl, ktoré účinkujú pred ním, odzrkadľuje, okrem proteolytickej aktivity CED3/ICE homologickej oblasti v MACH, aj aktiváciu niektorých iných mechanizmov, ktoré sa považujú za také, ktoré sa podieľajú na FAS-R a p55-R cytotoxickom účinku (napríklad aktivácia neutrálnej alebo kyslej sfingomyelinázy). Nemožno tiež vylúčiť, že proteolytická aktivita CED3/ICE homologickej oblasti má aj iné funkcie okrem cytotoxickej indukcie. Jasná predstava o funkcii MACHal by sa mala získať identifikáciou endogénnych substrátových proteínov, ktoré sa štiepia prostredníctvom aktivácie MACHal. Nájdenie spôsobov ako voliteľne odňať aktivitu MACHal, napríklad expresiou inhibítorových molekúl, by tiež prispelo k pochopeniu funkcie tohto proteínu a slúžilo by ako spôsob regulácie aktivity, keď by to bolo želateľné.

Teda G1 proteín podľa predloženého vynálezu a jeho možné izoformy sa môžu správať analogickým spôsobom aký bol uvedený pre vyššie opísané MACH proteíny, s alebo bez priamej interakcie s inými proteínmi, konkrétne G1 môže pôsobiť priamo prostredníctvom viazania sa na MORT-1 alebo môže pôsobiť nepriamo prostredníctvom viazania sa na Mch4 a/alebo MACH a následne viazaním sa Mch4 a/alebo MACH na MORT1 alebo nejakým iným, ešte neobjasneným mechanizmom, ktorý je špecifický pre G1. Podobne, regulácia G1 aktivity môže byť analogická s reguláciou navrhnutou pre vyššie uvedenú reguláciu MACH proteínu.

Vo vnútri buniek, ktoré exprimujú G1 môžu kľudne existovať prirodzené inhibítory proteázy, ktorá je obsiahnutá v tomto proteíne. Ukázalo sa, že existencia alternatívne zostrihnutých izoforiem niektorých z iných členov CED3/ICE rodiny predstavuje spôsob fyziologického obmedzenia funkcie týchto proteáz. Niektoré z

izoforiem týchto iných proteáz boli opísané ako také, ktoré pôsobia ako prirodzené inhibítory izoforiem s úplnou dĺžkou, podľa všetkého tak, že s nimi vytvárajú neaktívne heterodiméry. To tiež môže byť prípad G1 a niektorých z jeho možných izoforiem, napríklad tých izoforiem, v ktorých chýba potencionálne N-terminálne štiepiace miesto. Expresia takýchto inhibičných izoforiem môže predstavovať mechanizmus vlastnej ochrany bunky voči FAS-R a TNF cytotoxicite.

G1 môže mať ešte iné funkcie, napríklad G1 alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem môže mať zosilňujúci alebo zoslabujúci účinok na iné proteíny s enzymatickou aktivitou, napr. na proteolytické aktivity rôznych Mch4 a MACH izoforiem, pričom toto zosilňujúce alebo zoslabujúce pôsobenie sa uskutočňuje prostredníctvom mechanizmu, v ktorom G1 slúži na zhromažďovanie iných proteínov na viazanie MORT-1 (napr. Mch4 a MACH proteínov). Ďalej G1 alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem môže tiež slúžiť v úlohách, ktoré nesúvisia s cytotoxicitou, ale môžu pôsobiť ako kotviace miesta pre molekuly, ktoré sú zahrnuté v iných, nie-cytotoxických, účinkoch FAS-R a TNF.

Príklady niektorých špecifických G1 izoforiem podľa predloženého vynálezu sú uvedené v príklade 1 nižšie. Jedna z týchto izoforiem, G1a (CASHa ), izolovaná z človeka a myši (hG1a/hCASHa a m G1a/hCASHa), je podľa všetkého 1 mg zostrihový variant majúci oblasť proteázovej homológie a aspoň v niektorých bunkách (napr. 293 bunkách) má cytotoxickú aktivitu. Druhá z týchto izoforiem, ktorá sa nazýva Gip (CASHp) a je izolovaná z človeka, je podľa všetkého krátkym zostrihovým variantom bez oblasti proteázovej homológie a v skutočnosti inhibuje signalizačné dráhy bunkovej smrti.

Kvôli jedinečnej schopnosti FAS-R a TNF receptorov spôsobiť bunkovú smrť, ako aj schopnosti TNF receptorov spustiť rôzne iné aktivity poškodzujúce tkanivá, anomália funkcie týchto receptorov môže byť veľmi škodlivá pre organizmus. V skutočnosti sa ukázalo, že tak nadbytočná ako aj chýbajúca funkcia týchto receptorov sa podieľa na patologickej manifestácii rôznych chorôb. Identifikácia molekúl, ktoré sa podieľajú na signalizačnej aktivite týchto receptorov a zistenie spôsobov na moduláciu funkcie týchto molekúl predstavuje potencionálny kľúč pre

nové terapeutické prístupy v týchto chorobách. Vzhľadom na predpokladanú dôležitú úlohu G1 vo FAS-R a TNF toxicite sa zdá byť dôležitým hlavne navrhnutie liečiv, ktoré môžu blokovať proteolytickú funkciu tejto molekuly, ako tomu bolo pri niektorých iných členoch CED3/ICE rodiny. Jedinečné sekvenčné znaky CED3/ICE homológu, ktoré sú obsiahnuté v G1 molekulách, môžu umožniť navrhnutie liečiv, ktoré môžu ovplyvniť jeho ochranu voči nadmernej imunitné sprostredkovanej cytotoxicite bez interferovania s fyziologickými procesmi bunkovej smrti, v ktorých sú zahrnuté iné členy CED3/ICE rodiny.

Ako bolo uvedené vyššie, G1 alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem môže byť tiež zahrnutá v modulácii iných vnútrobunkových signalizačných dráh, ako napríklad v dráhach iných cytotoxických mediátorov alebo induktorov alebo iných proteínov spôsobom, ktorý nie je závislý od MORT-1 alebo od MORT-1-viažucich proteínov. Navyše, G1 alebo aspoň jeho izoformy, ktoré majú proteáze podobnú oblasť bez skutočnej proteázovej aktivity, sa môžu podieľať hlavne na inhibičnej funkcii, konkrétne na inhibícii tých dráh, napr. hlavne signalizačných dráh vo všeobecných alebo cytotoxických dráhach, v ktorých je zahrnutý G1 alebo jeho izoformy, buď priamym viazaním sa na členov týchto dráh, alebo viazaním sa nepriamo cez iné proteíny, ktoré sa následne viažu na členy týchto dráh.

Takže predložený vynález sa týka aj DNA sekvencii kódujúcich G1 proteín a G1 proteínov kódovaných týmito DNA sekvenciami.

Navyše predložený vynález sa ďalej týka DNA sekvencii kódujúcich biologicky aktívne analógy, fragmenty a deriváty G1 proteínu a nimi kódovaných analógov, fragmentov a derivátov. Príprava takýchto analógov, fragmentov a derivátov je štandardným postupom (pozri napríklad Sambrook et al., 1989), podľa ktorého môže byť v DNA sekvencii kódujúcej G1 proteín jeden alebo viacero kodónov deletovaných, pridaných alebo substituovaných iným kodónom, za účelom získania analógov, v ktorých je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok zmenený v porovnaní s prirodzeným proteínom.

Polypeptid alebo proteín v podstate zodpovedajúci” G1 proteínu zahŕňa nie len G1 proteín ale aj polypeptidy alebo proteíny, ktoré sú analogické s G1.

Analógy, ktoré v podstate zodpovedajú G1 proteínu sú tie polypeptidy, v ktorých je jedna alebo viacero aminokyselín G1 proteínovej aminokyselinovej sekvencie nahradená inou aminokyselinou, deletovaná a/alebo inzertovaná, s podmienkou, že výsledný proteín vykazuje v podstate rovnako vysokú biologickú aktivitu ako G1 proteín s ktorým korešponduje.

Aby analóg v podstate zodpovedal G1 proteínu, zmeny v sekvencií G1 proteínov, napríklad izoforiem sú vo všeobecnosti relatívne malé. Hoci počet zmien môže byť väčší ako desať, výhodne nie je viac ako desať zmien, výhodnejšie nie je viac ako päť zmien a najvýhodnejšie sa nevyskytujú viac ako tri takéto zmeny. Hoci na vyhľadanie potenciálnych biologicky aktívnych proteínov, ktoré v podstate zodpovedajú G1 proteínom, možno použiť ktorúkoľvek techniku, výsledkom jednej z týchto techník, ktorou je použitie bežných mutagenizačných techník na DNA kódujúcej proteín, je niekoľko modifikácií. Proteíny exprimované takýmito klonmi môžu byť potom prehľadávané z hľadiska ich schopnosti viazať sa na rôzne MORT1-viažuce proteíny, ako napríklad na Mch4 a MACH, alebo priamo na MORT-1 a/alebo FAS-R a p55-R, ktoré sprostredkúvajú aktivitu, a/alebo z hľadiska ich schopnosti sprostredkovať aktivitu ktorejkoľvek inej vnútrobunkovej dráhy spôsobom uvedeným vyššie.

Konzervatívne” zmeny sú také zmeny, od ktorých sa neočakáva, že by zmenili aktivitu proteínu a zvyčajne sa vyhľadajú ako prvé, keďže sa neočakáva, že by podstatne zmenili veľkosť, náboj alebo konfiguráciu proteínu, a teda sa neočakáva že by zmenili jeho biologické vlastnosti.

Konzervatívne substitúcie G1 proteínov zahŕňajú analóg, v ktorom je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v polypeptide konzervatívne nahradený odlišnou aminokyselinou. Takéto substitúcie sa výhodne uskutočňujú v súlade s nasledujúcim zoznamom, ktorý je uvedený v tabuľke IA, pričom tieto substitúcie sa môžu determinovať bežnými experimentálnymi postupmi, čím sa poskytnú modifikované štrukturálne a funkčné vlastnosti syntetizovanej polypeptidovej molekuly, pričom ostáva zachovaná biologická aktivita charakteristická pre G1 proteín.

-34Tabuľka ΙΑ

Pôvodný zvyšok	Príklad substitúcie
Ala	Gly; Ser
Arg	Lys
Asn	Gin; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala; Pro
His	Asn; Gin
lle	Leu; Val
Leu	lle; Val
Lys	Arg; Gin; Glu
Met	Leu; Tyr; lle
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	lle; Leu

Alternatívne je inou skupinou substitúcii G1 proteínu tá, v ktorej bol najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v polypeptide odstránený a na jeho miesto bol začlenený odlišný zvyšok v súlade s nasledujúcou tabuľkou IB. Typy substitúcií, ktoré sa môžu uskutočniť v polypeptide, môžu byť založené na analýze frekvencií aminokyselinových zmien medzi homologickými proteínmi rôznych druhov, napríklad substitúcie uvedené v tabuľkách 1-2 podľa Schulza et al., G.E. Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 a na obrázkoch 3 až 9 v

Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Na základe takejto analýzy sú tu definované alternatívne konzervatívne substitúcie ako zámeny v rámci nasledujúcich piatich skupín:

1. Malé alifatické, nepoláme alebo mierne polárne zvyšky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Polárne záporne nabité zvyšky a ich amidy: Asp, Asn, Glu, Gin;

3. Polárne, kladne nabité zvyšky: His, Arg, Lys;

4. Veľké, alifatické nepoláme zvyšky: Met, Leu, lle, Val (Cys); a

5. Veľké aromatické zvyšky: Phe, Tyr, Trp.

Tri aminokyselinové zvyšky, ktoré sú v tabuľke uvedené zátvorkách majú špeciálnu úlohu v architektúre proteínu. Gly je jediným zvyškom, ktorý nemá žiadny bočný reťazec, a tým dáva reťazcu flexibilitu. Toto však podporuje tendenciu vytvárať inú ako α-helix sekundárnu štruktúru. Pro, kvôli jeho nezvyčajnej geometrii, mierne spútava reťazec a vo všeobecnosti má tendenciu napomáhať štruktúre βskladaného listu, hoci v niektorých prípadoch môže byť Cys schopný podieľať sa na vytváraní disulfidovej väzby, ktorá je dôležitá pre skladanie proteínu. Treba poznamenať, že Schulz et al., vyššie, by spojil skupiny 1 a 2 uvedené vyššie. Treba tiež poznamenať, že Tyr, kvôli jeho potenciálu vytvárať vodíkové väzby, je významne príbuzný so Ser a Thr a pod.

Konzervatívne aminokyselinové substitúcie podľa predloženého vynálezu, napr. ako bolo uvedené vyššie, sú známe z doterajšieho stavu techniky a očakáva sa, že by mali zachovávať biologické a štrukturálne vlastnosti polypeptidu po aminokyselinovej substitúcii. Väčšina delécií a substitúcií podľa predloženého vynálezu nevytvára radikálne zmeny v charakteristikách proteínovej alebo polypeptidovej molekuly. Charakteristiky” sú definované ako zmeny v sekundárnej štruktúre napr. v štruktúre α-helixu alebo štruktúre β-skladaného listu, ako aj zmeny v biologickej aktivite, napr. vo väzbe s MORT-1-viažucimi proteínmi alebo s MORT1 alebo v sprostredkovaní účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky.

Príklady vytvorenia aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité na získanie analógov G1 proteínov na použitie v predloženom vynáleze zahŕňajú ktorýkoľvek zo známych spôsobových krokov, ktoré sú prezentované

napríklad v US patentoch 33 653, 4 959 314, 4 588 585 a 4 737 462 v mene Mark et al.; v 5 116 943 v mene Koths et al., v 4 965 195 v mene Namen et al.; v 4 879 111 v mene Chong et al.; a v 5 017 691 v mene Lee et al.; a lyzínom substituované proteíny prezentované v US patente č. 4 904 584 (Shaw et al.).

Okrem konzervatívnych substitúcií diskutovaných vyššie, ktoré by nemali významne zmeniť aktivitu G1 proteínu, spadajú do rozsahu vynálezu aj konzervatívne substitúcie alebo menej konzervatívne alebo náhodnejšie zmeny, ktoré vedú k zvýšeniu biologickej aktivity analógov G1 proteínov.

Ak je potrebné overiť presný účinok substitúcie alebo delécie, pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že účinok substitúcie(ií), delécie(ií), atď., sa dá stanoviť rutinnými väzobnými testami a testami bunkovej smrti.

Prijateľnými analógmi sú také, ktoré si zachovávajú aspoň schopnosť viazať sa na MORT-1-viažuce proteíny, ktoré boli uvedené vyššie, alebo sa viazať na MORT-1 alebo na iné proteíny, a tým, ako bolo uvedené vyššie, sprostredkovať aktivitu FAS-R a p55-R alebo iných proteínov. Takýmto spôsobom sa môžu vytvoriť analógy, ktoré majú takzvaný dominant-negatívny účinok, konkrétne, analóg, ktorý má defekt buď vo viazaní sa na MORT-1-viažuce proteíny (napr. Mch4 alebo MACH) alebo vo viazaní sa na MORT-1 alebo iné proteíny, alebo v následnej signalizačnej alebo proteázovej aktivite, ktorá nasleduje po takomto viazaní sa. Takéto analógy môžu byť použité napríklad na inhibíciu účinku FAS-ligandu alebo účinok iných proteínov prostredníctvom kompetície s prirodzenými MORT-1 viažucimi proteínmi alebo inými proteínmi. Napríklad sa zdá pravdepodobným, že MACH izoformy, MACHa2 a MACHa3 sú prirodzenými” analógmi, ktoré slúžia na inhibíciu MACH aktivity prostredníctvom kompetície pri viazaní sa aktívnych (proteázových) MACH izoforiem na MORT-1, ktoré sa zdá byť nevyhnutným pre aktiváciu týchto MACH izoforiem. Len čo sa aktívne MACH izoformy nemôžu viazať na MORT-1, je tým inhibovaná aj vnútrobunková signalizačná dráha sprostredkovaná prostredníctvom FAS-R a p55-R. Podobným spôsobom môže G1 alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem slúžiť ako inhibítor účinku FAS-ligandu prostredníctvom kompetície s rôznymi MORT-1-viažucimi proteínmi pri väzbe na MORT-1 alebo prostredníctvom interakcie s nimi takým spôsobom, ktorý zabráni ich

naviazaniu sa na MORT-1. Podobne môžu byť vytvorené takzvané dominantpozitívne G1 analógy, ktoré by slúžili na zosilnenie účinku FAS ligandu alebo TNF účinku. Tieto by mohli mať rovnakú alebo lepšiu schopnosť viazať sa na MORT-1 viažuce proteíny alebo aj rovnaké alebo lepšie MORT-1-viažuce vlastnosti a rovnaké alebo lepšie signalizačné vlastnosti prirodzených G1 proteínov.

Na genetickej úrovni sa tieto analógy vo všeobecnosti pripravujú miestne špecifickou mutagenézou nukleotidov v DNA kódujúcej G1 proteín, čím sa vytvára DNA kódujúca analóg, a potom syntetizovaním DNA a expresiou polypeptidu v rekombinantnej bunkovej kultúre. Analógy typicky vykazujú rovnakú alebo zvýšenú kvalitatívnu biologickú aktivitu v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim proteínom, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Príprava G1 proteinu podľa vynálezu alebo alternatívnej nukleotidovej sekvencie kódujúcej rovnaký polypeptid, ktorá sa ale líši od prirodzenej sekvencie vďaka zmenám, ktoré umožňuje degenerovaný genetický kód, môže byť dosiahnutá miestne-špecifickou mutagenézou DNA, ktorá kóduje skôr pripravený analóg alebo prirodzenú verziu G1 proteinu. Miestne-špecifická mutagenéza umožňuje produkciu analógov prostredníctvom použitia špecifických oligonukleotidových sekvencii, ktoré kódujú DNA sekvenciu s požadovanou mutáciou, ako aj dostatočné množstvo priľahlých nukleotidov na poskytnutie dostatočnej veľkosti a zložitosti sekvencie, aby sa vytvoril stabilný duplex na oboch stranách delečného spojenia, ktoré sa má preklenúť. Typicky je výhodný primér s dĺžkou približne 20 až 25 nukleotidov, s približne 5 až 10 komplementárnymi nukleotidmi na každej strane sekvencie, ktorá má byť zmenená. Vo všeobecnosti sú techniky miestne-špecifickej mutagenézy dobre známe zo stavu techniky, ako napríklad z publikácií Adelman et al., DNA 2:183 (1983), ktorej opis je tu začlenený ako citácia.

Ako bude zrejmé, techniky miestne-špecifickej mutagenézy typicky používajú fágový vektor, ktorý existuje tak v jednovláknovej, ako aj v dvojvláknovej forme. Typické vektory užitočné pre miestne-špecifickú mutagenézu zahŕňajú vektory ako

napríklad M13 fág, ako opisuje napríklad Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, vydavateľ A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), ktorej obsah je tu začlenený ako citácia. Tieto fágy sú bežne komerčne dostupné a ich použitie je všeobecne dobre známe priemerným odborníkom v oblasti. Na získanie jednovláknovej DNA môžu byť alternatívne použité plazmidové vektory, ktoré obsahujú počiatok replikácie jednovláknového fága (Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3,1987).

Vo všeobecnosti sa miestne-špecifická mutagenéza podľa vynálezu uskutočňuje tak, že sa najprv získa jednovláknový vektor, ktorý obsahuje vo svojej sekvencií DNA sekvenciu, ktorá kóduje relevantný polypeptid. Oligonukleotidový primer nesúci požadovanú mutovanú sekvenciu sa pripraví synteticky automatickou DNA/oligonukleotidovou syntézou. Tento primer sa potom aneluje s jednovláknovým vektorom obsahujúcim proteínovú sekvenciu a pôsobí sa naň DNA-polymerizujúcimi enzýmami ako napríklad Klenowovým fragmentom E. coli polymerázy, aby sa skompletizovala syntéza vlákna nesúceho mutáciu. Takže mutovaná sekvencia a druhé vlákno nesú požadovanú mutáciu. Tento heteroduplexný vektor je potom použitý na transformáciu vhodných buniek ako napríklad E. coli JM101 buniek a selektujú sa klony, ktoré obsahujú rekombinantné vektory nesúce zostavu mutovanej sekvencie.

Po takejto selekcii klonov sa môže mutovaný G1 proteín vybrať a umiestniť do vhodného vektora, vo všeobecnosti do transferového alebo expresného vektora takého typu, ktorý môže byť použitý na transfekciu vhodného hostiteľa.

V súlade s tým môže byť aj gén alebo nukleová kyselina kódujúca G1 proteín detegovaný, získaný a/alebo modifikovaný in vitro, in situ a/alebo in vivo použitím známych technik DNA alebo RNA amplifikácie, ako napríklad použitím PCR a chemickej oligonukleotidovej syntézy. PCR umožňuje amplifikáciu (zvýšenie množstva) špecifických DNA sekvencií opakovanými DNA polymerázovými reakciami. Táto reakcia môže byť použitá ako náhrada klonovania; potrebná je len znalosť sekvencie nukleovej kyseliny. Za účelom uskutočnenia PCR boli navrhnuté primery, ktoré sú komplementárne so sekvenciou, o ktorú je záujem. Primery sa potom generujú automatizovanou DNA syntézou. Pretože primery môžu byť navrhnuté tak, aby hybridizovali s ktoroukoľvek časťou génu, je možné vytvoriť také podmienky, že môžu byť tolerované nezhody pri komplementárnom párovaní báz. Amplifikácia týchto nesúhlasiacich oblasti môže viesť ku syntéze mutovaného produktu, ktorého výsledkom je vytvorenie peptidu s novými vlastnosťami (tzn. miestne-špecifická mutagenéza). Pozri tiež napr. Ausubel, vyššie, Ch. 16. Pri spojení syntézy komplementárnej DNA (cDNA) použitím reverznej transkriptázy, s PCR, môže byť ako východiskový materiál na syntézu domény prolaktínového receptoru bez klonovania použitá RNA.

Navyše PCR primery môžu byť navrhnuté tak, aby obsahovali nové reštrikčné miesta alebo iné znaky ako napríklad terminačné kodóny na koncoch génového segmentu, ktorý má byť amplifikovaný. Toto umiestnenie reštrikčných miesť na 5 a 3'konce amplifikovanej génovej sekvencie umožňuje, aby boli génové segmenty kódujúce G1 proteín alebo jeho fragment vhodne navrhnuté pre ligáciu s inými sekvenciami a/alebo klonovacími miestami vektorov.

PCR a iné spôsoby amplifikácie RNA a/alebo DNA sú v odbore dobre známe a môžu byť použité podľa predloženého vynálezu bez prílišného experimentovania, na základe tu uvedeného opisu a návodu. Známe spôsoby DNA alebo RNA amplifikácie zahŕňajú, ale nie sú limitované na, polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) a príbuzné amplifikačné postupy (pozri, napr. US patenty č. 4 683 195, 4 683 202, 4 800 159, 4 965 188 v mene Mullis et al.; 4 795 699 a 4 921 794 v mene Tábor et al.; 5 142 033 v mene Innis; 5 122 464 v mene Wilson et al.; 5 091 310 v mene Innis; 5 066 584 v mene Gyllensten et al.; 4 889 818 v mene Gelfand et al.; 4 994 370 v mene Silver et al.; 4 766 067 v mene Biswas; 4 656 134 v mene Ringold; a Innis et al., vyd. PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a RNA sprostredkovanú amplifikáciu, ktorá využíva antisense RNA k cieľovej sekvencií ako templát na syntézu dvojvláknovej DNA (US patent č. 5 130 238 v mene Malek et al., s obchodným menom NASBA); a imuno-PCR, ktorá kombinuje použitie DNA amplifikácie so značením protilátok (Ružička et al., Science 260: 487 (1993); Sano et al., Science 258: 120 (1992); Sano et al., Biotechniques 9: 1378 (1991)), pričom obsah týchto patentov je tu celý začlenený ako citácia.

Analogickým spôsobom ako bolo uvedené s ohľadom na analógy G1 proteínov môžu byť pripravené biologicky aktívne fragmenty G1 proteínov (napr. ktorékoľvek z izoforiem G1). Vhodnými fragmentmi G1 proteínov sú tie, ktoré si zachovávajú G1 spôsobilosť, a ktoré môžu sprostredkovať biologickú aktivitu FAS-R a p55-R alebo iných vyššie uvedených proteínov. V súlade s tým, môžu byť pripravené fragmenty G1 proteínu, ktoré majú dominant-negativny alebo dominantpozitívny účinok, ako bolo uvedené vyššie, v súvislosti s analógmi. Treba poznamenať, že tieto fragmenty predstavujú špeciálnu triedu analógov podľa vynálezu, konkrétne, sú definovanými časťami G1 proteínov, ktoré sú odvodené od úplnej sekvencie G1 proteínu (napr. od sekvencie ktorejkoľvek z izoforiem G1 proteínu), pričom každá takáto časť alebo fragment má ktorúkoľvek z vyššie uvedených požadovaných aktivít. Takýmto fragmentom môže byť napr. peptid.

Podobne, deriváty môžu byť pripravené štandardnými modifikáciami bočných skupín jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov G1 proteínu, jeho analógov alebo fragmentov alebo konjugáciou G1 proteínu, jeho analógov alebo fragmentov s inou molekulou, napr. protilátkou, enzýmom, receptorom a pod., čo je v odbore dobre známe. V súlade s tým, pokrýva termín deriváty”, tak ako je použitý tu, deriváty, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín, ktoré sa vyskytujú ako bočné reťazce zvyškov N- alebo C-terminálnych skupín, prostriedkami známymi v oblasti, pričom sú zahrnuté do rozsahu vynálezu. Deriváty môžu mať chemické časti ako napríklad uhľovodíkové alebo fosfátové zvyšky, s podmienkou, že takáto frakcia má rovnakú alebo väčšiu biologickú aktivitu G1 proteínov.

Deriváty môžu zahŕňať napríklad alifatické esterové alebo karboxylové skupiny, amidy karboxylových skupín vzniknuté reakciou s amoniakom alebo primárnymi alebo sekundárnymi amínmi, N-acylové deriváty alebo voľné amino skupiny aminokyselinových zvyškov vytvorených s acylovými časťami (napr. alkanoylovými alebo karbocyklickými arylovými skupinami) alebo O-acyl deriváty voľnej hydroxylovej skupiny (napríklad serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorených s acylovými časťami.

Termín deriváty je mienený tak, že zahŕňa len tie deriváty, ktoré nemenia jednu aminokyselinu na inú, ktorá patrí medzi dvadsať bežne sa vyskytujúcich prirodzených aminokyselín.

Či už je G1 proteín proteínom alebo polypeptidom, je sekvenciou aminokyselinových zvyškov. Polypeptid pozostávajúci z väčšej sekvencie, pričom táto sekvencia zahŕňa aj celú sekvenciu G1 proteínu, podľa definície uvedenej tu vyššie, je považovaný za spadajúci do rozsahu vynálezu, pokiaľ prídavky neovplyvňujú základné nové charakteristiky vynálezu, tzn. ak si buď zachováva alebo má zvýšenú aktivitu G1 proteínu. Takže predložený vynález napríklad zahŕňa fúzované proteíny obsahujúce G1 proteín s inými aminokyselinami alebo peptidmi.

Nové G1 proteíny, ich analógy, fragmenty a deriváty majú množstvo použití, napríklad:

(i) G1 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty môžu byť použité na napodobňovanie alebo zosilnenie funkcie MORT-1-viažucich proteínov, ako napríklad Mch4 a MACH (vrátane jeho rôznych izoforiem) alebo aj samotného MORT-1, a tým funkcie FAS-R ligandu alebo TNF alebo iných proteínov, v situáciách kde je požadovaný zosilnený účinok FAS-R ligandu alebo TNF alebo iných proteínov, ako napríklad pri protinádorových, protizápalových, anti-HIV a podobných aplikáciách, kde je želateľné, aby účinok FAS-R ligandu alebo TNF alebo iných proteínov indukoval cytotoxicitu. V takom prípade môže byť G1 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty, ktoré zosilňujú účinok FAS-R ligandu alebo TNF alebo iného proteínu, tzn. cytotoxický účinok, začlenené do buniek prostredníctvom štandardných postupov, ktoré sú známe per se. Napríklad, ak je G1 proteín úplne intracelulárny (ako sa predpokladá) a má byť zavedený len do tých buniek, v ktorých sa požaduje účinok FAS-R ligandu alebo TNF alebo iného proteínu, je potrebný systém špecifického začlenenia tohto proteínu do buniek. Jedným spôsobom ako to uskutočniť je vytvorenie rekombinantného živočíšneho vírusu, napr. vírusu odvodeného od Vaccinia, do ktorého DNA boli začlenené nasledujúce dva gény: gén kódujúci ligand, ktorý sa viaže na bunkové povrchové proteíny špecificky exprimované bunkami, napr. proteíny ako AIDS (HIV) vírusový gp120 proteín, ktorý sa špecificky viaže na niektoré bunky (CD4 lymfocyty a bunky

vzťahujúce sa k leukémiám) alebo gén kódujúci akýkoľvek iný ligand, ktorý sa špecificky viaže na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R tak, že rekombinantný vírusový vektor bude schopný viazať takéto FAS-R- alebo p55-R-nesúce bunky; a gén kódujúci G1 proteín. Takže expresia proteínu, ktorý viaže bunkový povrchový proteín, na povrchu vírusu nasmeruje vírus špecificky na nádorovú bunku alebo na iné bunky nesúce FAS-R alebo p55-R, a následne sa sekvencia kódujúce G1 proteín (napr. G1a sekvencia) začlení do buniek prostredníctvom vírusu. A ak sa táto sekvencia exprimuje v bunkách, vyústi do zosilnenia účinku FAS-R ligandu alebo TNF, čo vedie k smrti nádorových buniek alebo iných buniek, ktoré nesú FASR alebo p55-R, a ktoré majú byť zabité. Konštrukcia takéhoto rekombinantného živočíšneho vírusu je štandardným postupom (pozri, napríklad Sambrook et al., 1989). Inou možnosťou je začleniť sekvenciu G1 proteínu (napr. ktorýkoľvek z G1 alebo jeho izoforiem) vo forme oligonukleotidov, ktoré sa môžu absorbovať na bunky a exprimovať sa v nich.

Ďalším spôsobom ako zosilniť takúto bunkovú cytotoxicitu by bolo inhibovať aktivitu G1 izoforiem (napr. Gip), ktoré samotné sú inhibítormi bunkovej cytotoxicity. Spôsobov inhibície takýchto G1 izoforiem je veľa a zahŕňajú spôsoby uvedené pod bodom (ii) nižšie, pričom sú špecificky aplikované na inhibíciu G1 izoforiem ako napríklad Gip.

(ii) Môžu byť použité na inhibíciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF alebo iného proteínu, napr. v prípadoch ako poškodenie tkaniva pri septickom šoku, pri odmietnutí štepu hostiteľom alebo pri akútnej hepatitíde, pri ktorých je želateľné, aby bola blokovaná FAS-R alebo p55-R vnútrobunková signalizácia indukovaná FAS-R ligandom alebo TNF alebo signalizácia sprostredkovaná inými proteínmi. V tejto situácii je napríklad možné zaviesť do buniek štandardnými postupmi oligonukleotidy, ktoré majú antisense kódujúcu sekvenciu pre G1 proteín, ktorá by účinne blokovala transláciu mRNA kódujúcej G1 proteín, a tým blokovala jej expresiu a viedla ku inhibícii účinku FAS-R ligandu alebo TNF alebo iného proteínu. Takéto oligonukleotidy môžu byť zavedené do buniek použitím vyššie

uvedeného rekombinantného vírusu, pričom druhou sekvenciou, ktorú nesie je oligonukleotidové sekvencia.

Ďalej, ako bolo poznamenané vyššie a ako bude ilustrované nižšie, bola izolovaná najmenej jedna izoforma, ktorá je prirodzeným inhibitorom bunkovej cytotoxicity, konkrétne Gip. Takže takáto izoforma môže byť podávaná priamo do buniek alebo do buniek môže byť zavedený vhodný vektor nesúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu túto izoformu, tak, že keď sa táto G1 izoforma v bunkách exprimuje, slúži na inhibíciu bunkovej cytotoxicity.

Inou možnosťou je na inhibíciu jeho vnútrobunkovej signalizačnej aktivity použiť protilátky špecifické pre G1 proteín.

Ešte iným spôsobom inhibície účinku FAS-R ligandu alebo TNF je inhibícia prostredníctvom v súčasnosti vyvinutého ribozýmového prístupu. Ribozýmy sú katalytické RNA molekuly, ktoré špecificky štiepia RNA. Ribozýmy môžu byť skonštruované tak, aby štiepili zvolené RNA, napr. mRNA kódujúce G1 proteín podľa vynálezu. Takéto ribozými by mali sekvenciu špecifickú pre G1 proteínovú mRNA a boli by schopné s ňou interagovať (komplementárne spájanie) a následne štiepiť mRNA, čo by vyústilo do zníženia expresie v závislosti na hladine ribozýmovej expresie v cieľovej bunke. Na zavedenie ribozýmu do vybraných buniek (napr. tých, ktoré nesú FAS-R alebo p55-R) môže byť použitý akýkoľvek vektor, napr. plazmidové vektory, živočíšne vírusové (retrovírusové) vektory, ktoré sú zvyčajne používané na tieto účely (pozri tiež (i) vyššie, kde vírus nesie ako druhú sekvenciu cDNA kódujúcu vybranú ribozýmovú sekvenciu). (Ako prehľad, metódy atď. týkajúce sa ribozýmov pozri Chen et al., 1992; Zhao a Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph a Búrke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 a Koizumi et al., 1993).

(iii) G1 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty môžu byť použité aj na izoláciu, identifikáciu a klonovanie iných proteinov, ktoré patria do rovnakej triedy, tzn. proteinov, ktoré sa viažu na FAS-R vnútrobunkovú doménu alebo na funkčne príbuzné receptory alebo tie, ktoré sa viažu na vyššie uvedené MORT-1 viažuce proteíny, alebo tie, ktoré sa viažu na MORT-1, a tým na funkčne príbuzné receptory ako FAS-R a p55-R, a sú zahrnuté vo vnútrobunkovom signalizačnom

procese. Pri tejto aplikácii môže byť použitý vyššie uvedený dvojhybridný systém, alebo môže byť použitý v súčasnosti vyvinutý systém zahŕňajúci nepresnú Southern hybridizáciu, po ktorej nasleduje PCR klonovanie (Wilks et al., 1989). V publikácii Wilks et al. je opísaná identifikácia a klonovanie dvoch predpokladaných proteíntyrozín kináz prostredníctvom aplikácie nepresnej Southern hybridizácie a následne klonovaním prostredníctvom PCR založenej na známej sekvencií kinázového motívu predpokladanej kinázovej sekvencie. Tento prístup môže byť aplikovaný v súlade s predloženým vynálezom použitím sekvencie G1 proteínu na identifikáciu a klonovanie tých proteínov, ktoré sú príbuzné s MORT-1-viažucimi proteínmi.

(iv) Ešte iným prístupom na využitie G1 proteínu alebo jeho analógov, fragmentov alebo derivátov podľa vynálezu je použiť ich v metódach afinitnej chromatografie na izoláciu a identifikáciu iných proteínov alebo faktorov, na ktoré sú schopné sa viazať, napr. MORT-1, MORT-1-viažucich proteínov alebo iných proteínov alebo faktorov zahrnutých vo vnútrobunkovom signalizačnom procese. V tejto aplikácii sa môže G1 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa predloženého vynálezu jednotlivo pripojiť na matrice afinitnej chromatografie, a potom sa môžu uviesť do kontaktu s bunkovými extraktmi alebo izolovanými proteínmi alebo faktormi, o ktorých sa predpokladá, že sú zahrnuté vo vnútrobunkovom signalizačnom procese. Po procese afinitnej chromatografie je možné eluovať, izolovať a charakterizovať iné proteíny alebo faktory, ktoré sa viažu na G1 proteín alebo jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu.

(v) Ako bolo poznamenané vyššie G1 proteín alebo jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu môžu byť použité aj ako imunogény (antigény) na výrobu špecifických protilátok proti nim. Tieto protilátky môžu byť použité aj na účely purifikácie G1 proteínu (napr. G1 alebo akýchkoľvek jeho izoforiem), buď z bunkových extraktov alebo z transformovaných bunkových línií produkujúcich G1 proteín alebo jeho analógy alebo fragmenty. Ďalej tieto protilátky môžu byť použité na diagnostické účely na identifikáciu porúch týkajúcich sa abnormálnej funkcie FAS-R ligandu alebo TNF systému, napr. nadmernej aktivity alebo nízkej aktivity bunkových účinkov indukovaných FAS-R ligandom alebo TNF. Takže ak by sa tieto poruchy týkali chybného fungovania vnútrobunkového signalizačného systému

zahŕňajúceho MORT-1 proteín alebo rôzne iné, vyššie uvedené MORT-1-viažuce proteíny alebo samotný G1 proteín, slúžili by takéto protilátky ako dôležitý diagnostický nástroj.

Je potrebné tiež poznamenať, že izolácia, identifikácia a charakterizácia G1 proteínu podľa vynálezu sa môže uskutočňovať prostredníctvom ktoréhokoľvek z dobre známych štandardných postupov. Napríklad jeden z týchto vyhľadávacích postupov, kvasinkový dvojhybridný postup, ako je opísaný nižšie, bol použitý na identifikáciu MORT-1 proteínu a následne rôznych MORT-1-viažucich proteínov a G1 proteínu podľa vynálezu. Podobne, ako je uvedené vyššie a nižšie, je možné použiť na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu G1 proteínu podľa vynálezu alebo na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu ďalších proteínov, faktorov, receptorov atď., ktoré sú schopné viazať sa na G1 proteíny podľa vynálezu, iné postupy, ako napríklad afinitnú chromatografiu, DNA hybridizačné postupy, a pod., ktoré sú dobre známe v oblasti.

Ako bolo uvedené vyššie, G1 proteín môže byť použitý na generovanie protilátok, ktoré sú špecifické pre G1 proteín, napr. G1 a jeho izoformy. Tieto jeho protilátky alebo fragmenty môžu byť použité ako je podrobne uvedené tu nižšie, pričom v týchto aplikáciách sú protilátkami alebo ich fragmentárni protilátky špecifické pre G1 proteíny.

Na základe zistení v súlade s predloženým vynálezom, a to, že najmenej G1 alebo jeho možné izoformy sú proteázami, ktoré sú príbuzné s proteázami CED3/ICE rodiny proteáz, je možné predpokladať nasledujúce medicínske použitia pre tieto G1 proteíny a izoformy: zistilo sa, že už existujú špecifické inhibítory iných CED3/ICE proteáz, z ktorých niektoré bunka prepúšťa, a ktoré môžu účinne blokovať procesy programovanej bunkovej smrti. Takže je v súlade s predloženým vynálezom možné navrhnúť inhibítory, ktoré môžu zabrániť bunkovej smrti, ktorá je indukovaná FAS-R ligandom alebo TNF, teda inhibítory dráh, v ktorých sú zahrnuté G1 proteázové izoformy. Ďalej, vzhľadom na unikátne sekvenčné znaky týchto nových G1 proteáz sa zdá možné navrhnúť inhibítory, ktoré budú vysoko špecifické pre účinky indukované TNF a FAS-R ligandom. Zistenia podľa predloženého vynálezu tiež poskytujú spôsob študovania mechanizmu, v ktorom je aktivovaná

smrtiaca proteáza ako odpoveď na FAS-R ligand a TNF, čo umožňuje následný vývoj liečiv, ktoré môžu riadiť rozsah tejto aktivácie. Existuje mnoho chorôb, pri ktorých môžu byť takéto liečivá veľmi nápomocné. Okrem iných pri akútnej hepatitíde, kde sa zdá, že akútne poškodenie pečene reflektuje smrť pečeňových buniek, ktorá je sprostredkovaná FAS-R ligandom; pri autoimunitne indukovanej bunkovej smrti ako napríklad smrti β Langerhansových buniek pankreasu, čoho výsledkom je cukrovka; smrti buniek pri odmietnutí štepu (napr. obličky, srdca a pečene); smrti oligodendrocytov pri mozgovej skleróze multiplex; a pri AIDSinhibovanej smrti T buniek, ktorá spôsobuje proliferáciu AIDS vírusu, a tým AIDS ochorenie.

Ako bolo uvedené vyššie, je možné, že G1 alebo jedna alebo viacero z jeho možných izoforiem (napr. G1p izoforma) môžu slúžiť ako prirodzené inhibítory G1 proteázy alebo G1 proteázových izoforiem a tieto tak môžu byť použité ako vyššie uvedené špecifické inhibítory týchto G1 proteáz. Podobne môžu byť prehľadávané iné látky, ako napríklad peptidy, organické zlúčeniny, protilátky atď. za účelom získania špecifických liečiv, ktoré sú schopné inhibovať G1 proteázy.

Neobmedzujúci príklad toho ako môžu byť navrhnuté a prehľadávané peptidové G1 proteázy je založený na predchádzajúcich štúdiách peptidových inhibítorov ICE alebo ICE-podobných proteáz, na substrátovej špecificite ICE a na stratégiách epitopovej analýzy použitím peptidovej syntézy. Zistilo sa, že minimálna požiadavka pre účinné štiepenie peptidu prostredníctvom ICE zahŕňa štyri aminokyseliny naľavo od štiepneho miesta so silnou preferenciou kyseliny asparágovej v P₁ polohe, pričom postačujúcim je mety lamí n vpravo od P₁ polohy (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thomberry et al., 1992). Navyše fluorogénny substrátový peptid (tetrapeptid), acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metylkumaryl-7-amid) so skratkou Ac-DEVD-AMC korešponduje so sekvenciou v poly(ADP-ribóza)polymeráze (PARP), o ktorej sa zistilo, že štiepi v bunkách krátko po FAS-R stimulácii, ako aj iné apoptické procesy (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994) a účinne sa štiepi s CPP32 (členom CED3/ICE proteázovej rodiny) a MACH proteázami (a podobne možno aj G1 proteázami).

Keďže je zrejmé, že Asp v P, polohe substrátu je dôležitá, je možné rýchlo prehľadávať tetrapeptidy, ktoré majú Asp ako štvrtý aminokyselinový zvyšok a rôzne kombinácie aminokyselín na prvých troch polohách, z hľadiska ich väzby na aktívne miesto G1 proteáz, použitím napríklad metódy vyvinutej Geysenom (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987), kde sa prehľadávalo veľké množstvo peptidov na pevných podkladoch z hľadiska špecifických interakcií s protilátkami. Viazanie sa MACH proteáz na špecifické peptidy je možné detegovať rôznymi detekčnými metódami, ktoré sú v oblasti dobre známe, ako napríklad rádioaktívnymi značením G1 proteáz, atď. Ukázalo sa, že týmto spôsobom podľa Geysena je možné testovať najmenej 4000 peptidov každý pracovný deň.

Keďže môže byť výhodné navrhnúť peptidové inhibítory, ktoré selektívne inhibujú G1 proteázy bez toho, že by interferovali s fyziologickými procesmi bunkovej smrti, v ktorých sú zahrnuté iné členy CED3/ICE rodiny proteáz, je možné ďalej syntetizovať zásobu peptidov viažucich sa na G1 proteázy vo forme fluorogénnych substrátových peptidov, napríklad postupom, ktorý bol uvedený vyššie, na testovanie selektívneho štiepenia G1 proteázami bez toho, aby boli štiepené inými CED3/ICE proteázami. Peptidy, o ktorých sa zistí, že sú špecificky štiepené G1 proteázami, je možné potom modifikovať za účelom zvýšenia bunkovej priepustnosti a za účelom inhibície aktivity G1 súvisiacej s bunkovou smrťou a to buď reverzibilne alebo ireverzibilné. Thomberry et al. (1994) publikoval, že tetrapeptid (acyloxy)metylketón Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH₂OC-(O)-[2,6-(CF₃)₂]Ph je potencionálny inaktivátor ICE. Podobne, Milligan et al. (1995) publikoval, že tetrapeptidové inhibítory, ktoré majú chlórmetylketónové (ireverzibilné) alebo aldehydové (reverzibilne) skupiny, inhibujú ICE. Navyše sa ukázalo, že benzyloxykarboxyl-Asp-CH₂OC-(O)-2,6-dichlórbenzén (DCB) inhibuje ICE (Mashima et al., 1995). Z toho vyplýva, že tetrapeptidy, ktoré sa selektívne viažu na G1 proteázy, je možné modifikovať napríklad s aldehydovou skupinou, chlórmetylketónom, (acyloxy)metylketónom alebo CH₂OC-(O)-DCB skupinou, aby sa vytvoril peptidový inhibítor s G1 proteázovou aktivitou.

Zatiaľ čo niektoré špecifické inhibítory iných CED3/ICE proteáz bunka prepúšťa, môže byť potrebné aj zosilniť priepustnosť bunky pre peptid. Napríklad, je

možné chemicky modifikovať alebo derivovať peptidy, aby sa zvýšila ich permeabilita cez bunkovú membránu, a tak sa uľahčil transport peptidov cez membránu do cytoplazmy. Muranishi et al. (1991) publikoval pozmenenie tyrotropín-vylučovaného hormónu kyselinou laurínovou, čím sa vytvoril lipofilný laurylový derivát s dobrými charakteristikami čo sa týka penetrácie cez bunkové membrány. Zacharia et al. (1991) tiež publikoval, že oxidácia metionínu na sulfoxid a zámena peptidovej väzby za jej ketometylénizoester (COCH₂) uľahčuje transport peptidov cez bunkovú membránu. Toto sú len niektoré za známych modifikácií a derivátov, ktoré sú dobre známe priemernému odborníkovi v oblasti.

Navyše, liečivá alebo peptidové inhibítory, ktoré sú schopné inhibovať aktivitu G1 alebo jeho možných izoforiem týkajúcu sa bunkovej smrti, môžu byť konjugované alebo môžu vytvárať komplex s molekulami, ktoré uľahčujú vstup do bunky.

US patent č. 5 149 782 opisuje konjugáciu molekuly, ktorá má byť transportovaná cez bunkovú membránu, s membránovo miešateľným činidlom ako napríklad fusogénnymi polypeptidmi, polypeptidmi vytvárajúcimi iónový kanál, inými membránovými polypeptidmi a mastnými kyselinami s dlhým reťazcom, napr. kyselinou mirisovou, kyselinou palmitovou. Tieto membránovo miešateľné činidlá začleňujú konjugáty do lipidickej dvojvrstvy bunkových membrán a uľahčujú ich vstup do cytoplazmy.

Low et al., US patent 5 108 921 zhŕňa dostupné metódy na transmembránový prenos molekúl ako napríklad, ale bez obmedzenia na, proteíny a nukleové kyseliny, mechanizmom receptorom sprostredkovanej endocytotickej aktivity. Tieto receptorové systémy zahŕňajú systémy rozoznávajúce galaktózu, manózu, manóza-6-fosfát, transferín, asialoglykoproteín, transkobaltamín (vitamín B₁₂), a-2 makroglobulíny, inzulín a iné peptidové rastové faktory ako napríklad epidermálny rastový faktor (EGF). Low et al. opisuje, že nutričné receptory, ako napríklad receptory pre biotín a folát, je možné výhodne použiť na zosilnenie transportu cez bunkovú membránu vďaka umiestneniu a množstvu biotínových a folátových receptorov na membránovom povrchu väčšiny buniek a vďaka asociovanému receptoru, ktorý sprostredkúva procesy transmembránového

transportu. Takže komplex vytvorený medzi zlúčeninou, ktorá sa má dodať do cytoplazmy, a ligandom ako napríklad biotínom alebo folátom, sa kontaktuje s bunkovou membránou, ktorá nesie biotínové alebo folátové receptory, aby sa inicioval mechanizmus sprostredkovaný trans-membránovým transportom, a tým sa umožní vstup požadovanej zlúčeniny do bunky.

Je známe, že ICE má schopnosť tolerovať liberálne substitúcie v P₂ polohe a táto jeho tolerancia k liberálnym substitúciám sa využila na vývoj účinnej a vysoko selektívnej afinitnej značky obsahujúcej biotínový prívesok (Thornberry et al., 1994). Z toho vyplýva, že P₂ polohu a možno N-koniec tetrapeptidového inhibítora je možné modifikovať alebo je možné vytvárať ich deriváty, ako napríklad pridaním biotínovej molekuly na zosilnenie priepustnosti týchto peptidových inhibítorov cez bunkovú membránu.

Navyše, z doterajšieho stavu techniky je známe, že fúzovanie peptidovej sekvencie so sekvenciou vedúceho/signálneho peptidu za účelom vytvorenia chimerického peptidu umožní, aby bol takýto chimerický peptid transportovaný cez bunkovú membránu do cytoplazmy.

Priemerný odborník v oblasti peptidov musí chápať, že peptidové inhibítory G1 proteolytickej aktivity podľa predloženého vynálezu sú mienené tak, že zahŕňajú peptidomimetické liečivá alebo inhibítory, ktoré môžu byť aj rýchlo prehľadávané z hľadiska viazania sa na G1 proteázu, za účelom navrhnutia možno stabilnejších inhibítorov.

Je potrebné tiež pochopiť, že rovnaké prostriedky na uľahčenie alebo zosilnenie transportu peptidových inhibítorov cez bunkové membrány, ktoré boli diskutované vyššie, sú použiteľné aj pre G1 alebo jeho izoformy ako aj iné peptidy a proteíny, ktoré vnútrobunkovo vykazujú ich účinky.

Čo sa týka tu uvedených protilátok, výraz protilátky zahŕňa polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky (mAbs), chimerické protilátky, anit-idiotypové (anti-ld) protilátky voči protilátkam, ktoré môžu byť značené v rozpustnej alebo viazanej forme, ako aj ich fragmenty pripravené akoukoľvek známou technikou, ako napríklad, ale bez obmedzenia, enzymatickým štiepením, peptidovou syntézou alebo rekombinantnými technikami.

Polyklonálne protilátky sú heterogénne populácie protilátkových molekúl odvodených zo séra živočíchov imunizovaných antigénov. Monoklonálna protilátka obsahuje v podstate homogénnu populáciu protilátok špecifických ku antigénom, ktorých populácia obsahuje v podstate podobné epitop viažuce miesta. MAbs je možné získať spôsobmi, ktoré sú pre priemerného odborníka v oblasti známe. Pozri napríklad Kohler a Milstein, Náture, 256: 495-497 (1975); US patent č. 4 376 110; Ausubel et al., vyd., Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan et al., vyd., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. a Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), pričom obsah týchto publikácií je tu celý začlenený ako citácia. Takéto protilátky môžu byť z ktorejkoľvek imunoglobulínovej triedy vrátane IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a z ktorejkoľvek ich podtriedy. Hybridom produkujúci mAb podľa predloženého vynálezu je možné kultivovať in vitro, in situ alebo in vivo. Produkcia vysokých titrov mAbs in vivo alebo in situ činí v súčasnosti tieto metódy výhodnými.

Chimerické protilátky sú molekuly, ktorých rôzne časti sú odvodené od rôznych živočíšnych druhov, napríklad protilátky, ktorých variabilná oblasť je odvodená od mAb hlodavcov a obsahujú ľudskú imunoglobulínovú konštantnú oblasť. Chimerické protilátky sú primárne používané na zníženie imunogenicity pri aplikácii a na zvýšenie výťažku pri produkcii. Napríklad, tam, kde majú hlodavčie mAbs vyššie výťažky z hybridómov, ale aj vyššiu imunogenicitu u ľudí, sú použité ľudské/hlodavčie chimerické mAbs. Chimerické protilátky a spôsoby ich výroby sú v oblasti známe (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Náture 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., európska prihláška vynálezu 125023 (zverejnená 14. novembra 1984); Neuberger et al., Náture 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., európska prihláška vynálezu 171496 (zverejnená 19. februára

1985) ; Morrison et al., európska prihláška vynálezu 173494 (zverejnená 5. marca

1986) ; Neuberger et al., PCT prihláška WO 8601533 (zverejnená 13. marca 1986); Kudo et al., európska prihláška vynálezu 184187 (zverejnená 11. júna 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., medzinárodná prihláška vynálezu č. WO8702671) (zverejnená 7. mája 1987); Liu et al., Proc. Natl.

Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); a Harlow a Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, vyššie. Tieto publikácie sú tu celé zaradené ako citácia.

Anti-idiotypová (anti-ld) protilátka je protilátka, ktorá rozoznáva jedinečné determinanty, vo všeobecnosti asociované s antigén-viažucim miestom protilátky. Id protilátka môže byť pripravená imunizáciou živočícha rovnakého druhu a genetického typu (napr. myšieho kmeňa) ako zdroj mAb, ku ktorej sa pripravuje anti-ld. Imunizované zviera bude rozoznávať a odpovedať na idiotypové determinanty imunizačnej protilátky vytváraním protilátky proti týmto idiotypovým determinantom (anti-ld protilátky). Pozri, napríklad, US patent č. 4 699 880, ktorý je tu celý zahrnutý ako citácia.

Anti-ld protilátka môže byť použitá aj ako imunogén na indukciu imunitnej odpovede v inom živočíchovi, ktorý produkuje tak zvanú anti-anti-ld protilátku. Antianti-ld môže byť epitopicky identická s pôvodnou mAb, ktorá indukovala anti-ld. Takže použitím protilátok voči idiotypovým determinantám mAb je možné identifikovať iné klony, ktoré exprimujú protilátky s rovnakou špecificitou.

Z toho vyplýva, že mAbs generované proti G1 proteínom, jeho analógom, fragmentom alebo derivátom podľa predloženého vynálezu, môžu byť použité na indukciu anti-ld protilátok vo vhodných živočíchoch, ako napríklad BALB/c myšiach. Bunky sleziny z takto imunizovaných myší sú použité na produkciu anti-ld hybridómov vylučujúcich anti-ld mAbs. Anti-ld mAbs môžu byť ďalej spojené s nosičom, ako napríklad kliešťovým hemocyanínom (KLH) a použité na imunizáciu ďalších BALB/c myší. Séra z týchto myší budú obsahovať anti-anti-ld protilátky, ktoré majú väzobné vlastnosti pôvodnej mAb špecifickej pre epitop vyššie uvedeného G1 proteínu alebo jeho analógov, fragmentov a derivátov.

Takže anti-ld mAbs majú vlastné idiotypové epitopy alebo idiotopy, ktoré sú štrukturálne podobné s epitopmi, ktoré sú vyhodnocované, ako napríklad GRB proteín-a.

Výraz protilátka je mienený aj ako termín, ktorý zahŕňa tak intaktné molekuly, ako aj ich fragmenty, ako napríklad Fab a F(ab')₂, ktoré sú schopné

viazať antigén. Fab a F(ab')₂ fragmentom chýba Fc fragment intaktnej protilátky, rýchlejšie sa strácajú z obehu a môžu sa menej nešpecifický tkanivovo viazať v porovnaní s intaktnou protilátkou (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Je potrebné uviesť, že Fab a F(ab')₂ a iné fragmenty protilátok užitočné v predloženom vynáleze, môžu byť použité na detekciu a kvantifikáciu G1 proteínu spôsobmi, ktoré sú tu opísané pre intaktné molekuly protilátok. Takáto fragmenty sa štandardne vytvárajú proteolytickým štiepením použitím enzýmov ako napríklad papaínu (na výrobu Fab fragmentov) alebo pepsínu (na výrobu F(ab')₂ fragmentov.

Protilátka sa nazýva molekulou schopnou viazania sa, ak je schopná špecificky reagovať s molekulou, na ktorú sa viaže molekula protilátky. Výraz epitop je mienený ako taký, ktorý sa týka časti ktorejkoľvek molekuly, ktorá je schopná byť viazaná protilátkou, a ktorá môže byť tiež touto protilátkou rozoznávaná. Epitopy alebo antigénne determinanty zvyčajne pozostávajú z chemicky aktívnych povrchových zoskupení molekúl ako napríklad aminokyselín alebo sacharidových bočných reťazcov a majú špecifické trojrozmerné štrukturálne charakteristiky ako aj špecifické nábojové charakteristiky.

Antigén je molekula alebo časť molekuly, ktorá je schopná byť viazaná protilátkou, a ktorá je navyše schopná indukovať produkciu protilátok schopných viazať epitop tohto antigénu v živočíchovi. Antigén môže mať jeden alebo viac ako jeden epitop. Špecifická reakcia uvedená vyššie vyjadruje, že antigén bude reagovať vysoko selektívnym spôsobom s jeho zodpovedajúcou protilátkou a nie s množstvom iných protilátok, ktoré môžu byť vyvolané inými antigénmi.

Protilátky, vrátane fragmentov protilátok, užitočné v predloženom vynáleze, môžu byť použité na kvantitatívnu alebo kvalitatívnu detekciu G1 proteínu vo vzorke alebo na detekciu prítomnosti buniek, ktoré exprimujú G1 proteín podľa predloženého vynálezu. Toto sa dá uskutočniť imunoflorescenčnými technikami využívajúcimi fluorescenčné značenú protilátku (pozri nižšie) spolu so svetelnou mikroskopiou, prietokovou cytometriou alebo fluorometrickou detekciou.

Protilátky (alebo ich fragmenty) užitočné v predloženom vynáleze môžu byť použité histologický, napríklad v imunofluorescenčnej alebo imunitnej elektrónovej mikroskopii na in situ detekciu G1 proteínu podľa predloženého vynálezu. In situ detekcia sa môže uskutočňovať odobratím histologickej vzorky od pacienta a poskytnutím značenej protilátky podľa predloženého vynálezu pre takúto vzorku. Protilátka (alebo fragment) je výhodne poskytnutá nanesením alebo zaliatím biologickej vzorky protilátkou (alebo fragmentom). Prostredníctvom použitia takéhoto postupu je možné určiť nie len prítomnosť G1 proteínu, ale aj jeho distribúciu v skúmanom tkanive. Použitím predloženého vynálezu je pre priemerného odborníka v oblasti zrejmé, že ktorákoľvek zo širokého množstva histologických metód (ako napríklad farbiace postupy) môže byť modifikovaná na dosiahnutie in situ detekcie.

Takéto testy pre G1 proteín podľa predloženého vynálezu typicky zahŕňajú inkubáciu biologickej vzorky, ako napríklad biologickej kvapaliny, tkanivového extraktu, čerstvo zozbieraných buniek, ako napríklad lymfocytov alebo leukocytov, alebo buniek, ktoré boli inkubované v tkanivovej kultúre, v prítomnosti detegovateľne značenej protilátky schopnej identifikovať G1 proteín, a detekciu protilátky prostredníctvom ktoréhokoľvek z množstva techník dobre známych v oblasti.

Na biologickú vzorku sa môže pôsobiť pevným fázovým podkladom alebo nosičom, ako napríklad nitrocelulózou alebo iným pevným podkladom alebo nosičom, ktorý je schopný imobilizovať bunky, bunkové častice alebo rozpustné proteíny. Podklad alebo nosič sa potom môže premyť vhodnými tlmivými roztokmi a následne sa môže pôsobiť detegovateľne značenou protilátkou podľa predloženého vynálezu, ako bolo uvedené vyššie. Pevný fázový podklad alebo nosič potom môže byť druhý krát premytý tlmivým roztokom, aby sa odstránila nenaviazaná protilátka. Množstvo značky naviazanej na pevnom podklade alebo nosiči potom môže byť detegované bežnými prostriedkami.

Termínmi pevný fázový podklad, pevný fázový nosič, pevný podklad, pevný nosič, podklad alebo nosič je mienený akýkoľvek podklad alebo nosič, ktorý je schopný viazať antigén alebo protilátky. Dobre známe podklady alebo nosiče zahŕňajú sklo, polystyrén, polypropylén, polyetylén, dextrán, nylonové amylázy, prirodzené a modifikované celulózy, polyakrylamidy, gabro alebo magnetit. Pre účely predloženého vynálezu môže byť nosič buď do určitej miery

rozpustný, alebo nerozpustný. Podkladový materiál môže mať v skutočnosti akúkoľvek možnú štrukturálnu konfiguráciu, pokiaľ je spájacia molekula schopná viazať sa na antigén alebo protilátku. Takže konfigurácia podkladu alebo nosiča môže byť sférická ako pri guličkách, valcovitá, ako na vnútornej ploche skúmavky alebo vonkajšej ploche tyčinky. Alternatívne môžu byť povrchy ploché, ako napríklad fólia, testovací pás, a pod. Výhodné podklady alebo nosiče zahŕňajú polystyrénové guličky. Odborník v oblasti bude vedieť o iných možných vhodných nosičoch na viazanie protilátky alebo antigénu, alebo to bude schopný určiť použitím rutinných experimentov.

Väzobná aktivita daného množstva protilátky podľa vynálezu môže byť, ako bolo uvedené vyššie, určená podľa známych metód. Odborník v oblasti bude schopný určiť operačné a optimálne testovacie podmienky pre každú determináciu použitím rutinných experimentov.

Ku testu môžu byť pridané iné takéto kroky ako premývanie, miešanie, trepanie, filtrovanie a podobne, ktoré sú bežné alebo nevyhnutné pre konkrétnu situáciu.

Jedným zo spôsobov, ktorým môže byť protilátka podľa predloženého vynálezu detegovateľne značená, je spojenie protilátky s enzýmom a jej použitie v enzymatickom imunoteste (EIA). Keď sa tento enzým spätne vystaví príslušnému substrátu, bude reagovať so substrátom takým spôsobom, že sa vytvorí chemická entita, ktorá môže byť detegovaná, napríklad spektrofotometrickými, fluorometrickými alebo vizuálnymi prostriedkami. Enzýmy, ktoré môžu byť použité na detekovateľné značenie protilátky zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: malát dehydrogenázu, stafylokokovú nukleázu, delta-5-steroid izomerázy, kvasinkovú alkoholdehydrogenázu, α-glycerofosfátdehydrogenázu, trifosfátizomerázu, chrenovú peroxidázu, alkalickú fosfatázu, asparaginázu, glukózooxidázu, β-galaktozidázu, ribonukleázu, ureázu, katalázu, glukózo-6-fosfátdehydrogenázu, glukoamylázu a acetylcholínesterázu. Detekcia sa môže uskutočňovať kolorimetrickými metódami, ktoré používajú chromogénny substrát pre enzým. Detekcia sa môže uskutočňovať

aj vizuálne porovnaním rozsahu enzymatickej reakcie substrátu v porovnaní s podobne pripravenými štandardami.

Detekcia sa môže uskutočňovať použitím rôznych iných imunotestov. Napríklad rádioaktívnym značením protilátok alebo protilátkových fragmentov je možné detegovať R-PTPázu prostredníctvom použitia rádioimunotestu (RIA). Dobrý opis RIA je možné nájsť v Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, od Work, T.S et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), konkrétne v kapitole nazvanej Úvod do rádioimunitného testu a príbuzných techník od Chard, T., ktorá je tu začlenená ako citácia. Rádioaktívny izotop je možné detegovať použitím g odčítavača alebo scintilačného odčítavača alebo autorádiograficky.

Možné je tiež značiť protilátku podľa predloženého vynálezu fluorescenčnou zlúčeninou. Keď sa fluorescenčné značená protilátka exponuje svetlom správnej vlnovej dĺžky, je možné vďaka fluorescencii detegovať jej prítomnosť. Medzí najbežnejšie používané fluorescenčné značkovacie zlúčeniny patrí fluoresceín izotiokyanát, rodamín, fýkoerytrín, pykokyanín, alofýkokyanín, o-ftaldehyd a fluoreskamín.

Protilátka môže byť tiež detegovateľne značená použitím flurescenciu emitujúcich kovov, ako napríklad ¹⁵²E, alebo iných kovov z lantanoidnej rady. Tieto kovy je možné pripojiť na protilátku použitím takých kovových chelatačných skupín ako kyselina dietyléntriamínpentaoctová (ETPA).

Protilátka môže byť tiež detegovateľne značená jej spájaním schemiluminiscenčnou zlúčeninou. Prítomnosť protilátky s chemiluminiscenčným príveskom sa potom určuje detegovaním prítomnosti luminiscencie, ktorá vzniká počas chemickej reakcie. Príkladmi hlavných užitočných chemiluminiscenčných značiacich zlúčenín sú luminol, izoluminol, ester teromaakridínia, imidazol, akridínová soľ a oxalát ester.

Podobne môže byť použitá na značenie protilátky podľa vynálezu bioluminiscenčná zlúčenina. Bioluminiscencia je typ chemiluminiscencie, ktorá je prítomná v biologických systémoch, v ktorých je účinnosť chemiluminiscenčnej reakcie zvyšovaná katalytickým proteínom. Prítomnosť bioluminiscenčného

proteínu sa determinuje detekciou prítomnosti luminiscencie. Pre účely značenia sú dôležitými bioluminiscenčnými zlúčeninami luciferín, luciferáza a aequorín.

Molekula protilátky podľa predloženého vynálezu môže byť upravená na použitie v imunometrickom teste, tiež známom ako dvojmiesty alebo sendvičový test. V typickom imunometrickom teste sa určité množstvo neznačenej protilátky (alebo fragmentu protilátky) naviaže na pevný podklad alebo nosič a pridá sa určité množstvo detegovateľne značenej rozpustnej protilátky, aby sa umožnila detekcia a/alebo kvantifikácia ternárneho komplexu vytvoreného medzi protilátkou na pevnej fáze, antigénom a značenou protilátkou.

Typicky a výhodne zahŕňajú imunometrické testy priame testy, v ktorých sa protilátka naviazaná na pevnú fázu najprv kontaktuje so vzorkou, ktorá sa testuje, aby sa extrahoval antigén zo vzorky prostredníctvom vytvorenia binárneho komplexu pozostávajúceho z protilátky na pevnej fáze a antigénu. Po vhodnej inkubačnej dobe sa pevný podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránil zvyšok kvapalnej vzorky vrátane nereagujúceho antigénu, ak sa tam nejaký nachádza, a potom sa kontaktuje s roztokom obsahujúcim neznáme množstvo značenej protilátky (ktorá slúži ako reportérová molekula). Po druhej inkubačnej dobe, ktorá umožňuje, aby značená protilátka vytvorila komplex s antigénom naviazaným na pevnom podklade alebo nosiči cez neznačenú protilátku, sa pevný podklad alebo nosič druhý raz premyje, aby sa odstránila nezreagovaná značená protilátka.

V inom type sendvičového testu, ktorý môže byť užitočný aj pre antigény podľa predloženého vynálezu, sú použité takzvané simultánne a obrátené testy. Simultánny test zahŕňa jediný inkubačný krok, pretože protilátka naviazaná na pevnom podklade alebo nosiči a značená protilátka sa obe pridávajú do vzorky, ktorá má byť testovaná, zároveň. Po ukončení inkubácie sa pevný podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránil zvyšok kvapalnej vzorky a značená protilátka, ktorá nevytvorila komplex. Prítomnosť značenej protilátky spojenej s pevným podkladom alebo nosičom sa potom determinuje ako by išlo o bežný priamy sendvičový test.

V obrátenom” teste sa používa postupné pridávanie najprv roztoku značenej protilátky do kvapalnej vzorky, a potom nasleduje, po vhodnej inkubačnej dobe, pridanie neznačenej protilátky naviazanej na pevný podklad alebo nosič. Po

druhej inkubácii sa pevná fáza premyje bežným spôsobom, aby sa zbavila zvyškov vzorky, ktorá je testovaná, a roztoku nezreagovanej značenej protilátky. Determinácia značenej protilátky, ktorá je spojená s pevným podkladom alebo nosičom, sa potom uskutočňuje ako v simultánnom a priamom teste.

G1 proteíny podľa vynálezu môžu byť produkované ktorýmkoľvek štandardným rekombinantným DNA postupom (pozri napríklad Sambrook, et al., 1989 a Ansabel et al., 1987-1995, vyššie), v ktorých sa vhodné eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky známe zo stavu techniky transformujú príslušnými eukaryotickými alebo prokaryotickými vektormi, ktoré obsahujú sekvencie kódujúce proteíny. Z toho vyplýva, že predložený vynález sa týka aj takýchto expresných vektorov a transformovaných hostiteľov na výrobu proteínov podľa vynálezu. Ako bolo uvedené vyššie, tieto proteíny tiež zahŕňajú ich biologicky aktívne analógy, fragmenty a deriváty, takže vektory, ktoré ich kódujú, tiež zahŕňajú vektory kódujúce analógy a fragmenty týchto proteínov a transformovaných hostiteľov, ktorí ich obsahujú a produkujú takéto analógy a fragmenty. Deriváty týchto proteínov, vyprodukované transformovanými hostiteľmi, sú derivátmi vytvorenými štandardnou modifikáciou proteínov alebo ich analógov alebo fragmentov.

Predložený vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci G1 proteíny, ktorý tiež kóduje vírusový povrchový proteín, ktorý je schopný viazať sa na špecifické povrchové proteíny cieľovej bunky (napr. nádorovej bunky), ktoré riadia začlenenie G1 proteínovej sekvencie do buniek. Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu ďalej obsahujú ako aktívnu zložku (a) oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu G1 proteínovú sekvenciu alebo (b) liečivo, ktoré blokuje proteolytickú aktivitu G1 alebo jeho izoforiem.

Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu zahŕňajú dostatočné množstvo účinnej zložky na dosiahnutie plánovaného cieľa. Navyše, farmaceutické prostriedky môžu obsahovať vhodné farmaceutický prijateľné nosiče obsahujúce excipienty a pomocné činidlá, ktoré uľahčujú zapracovanie aktívnej zlúčeniny do prípravkov, ktoré môžu byť farmaceutický použité, a ktoré môžu

stabilizovať takéto prípravky na podávanie subjektu, ktorý ich potrebuje, čo je dobre známe pre odborníka v oblasti.

Predpokladá sa, že G1 proteín a jeho izoformy a izotypy sú exprimované v rôznych tkanivách vo významne rozličných hladinách a pravdepodobne tiež s rôznymi vzormi izotypov, analogickým spôsobom ako expresia MACH proteínu a jeho rôznych izotypov, ako bolo opisané vo vyššie uvedenom zozname spoločne vlastnených prihlášok vynálezov, ktoré sú zároveň v konaní. Tieto odlišnosti sa môžu podieľať na tkanivovo špecifických znakoch odpovede na Fas/APO1-ligand a TNF. Tak ako v prípade iných CED3/ICE homológov (Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995) pôvodcovia predloženej prihlášky vynálezu predtým dokázali (vo vyššie uvedených prihláškach vynálezov) zistenie, že MACH izoformy, ktoré obsahujú nekompletné CED3/ICE oblasti (napr. MACHa3), majú inhibičný účinok na aktivitu koexprimovaných MACHal alebo MACHa2 molekúl; zistili tiež, že blokujú smrť indukovanú prostredníctvom Fas/APO1 a p55-R. Expresia takýchto inhibičných izoforiem v bunkách môže predstavovať mechanizmus vlastnej bunkovej ochrany voči cytotoxicite sprostredkovanej Fas/APO1 a TNF. Takže sa predpokladá analogický inhibičný účinok aspoň niektorých G1 izoforiem. Široká heterogenita MACH izoforiem a podobne aj predpokladaná analogická heterogenita G1 izoforiem, ktorá značne presahuje heterogenitu pozorovanú pre akékoľvek iné proteázy CED3/ICE rodiny, by mala umožniť veľmi jemné ladenie funkcie MACH izoforiem a analogicky aj aktívnych G1 izoforiem podľa predloženého vynálezu.

Je tiež možné, že niektoré možné G1 izoformy majú iné funkcie. Napríklad, predtým zistená (ako bolo uvedené vyššie pôvodcami predloženej prihlášky vynálezu) schopnosť MACHpi viazať sa tak na MORT1, ako aj na MACHal naznačuje, že táto izoforma by mohla v skutočnosti zosilňovať aktivitu enzymaticky aktívnych izoforiem. Mierna cytotoxicita pozorovaná v 293-EBNA a MCF7 kultúrach transfekovaných s touto izoformou a dosť významný cytotoxický účinok, ktorý vykazujú HeLa bunky, pravdepodobne odzrkadľuje aktiváciu endogénne exprimovaných MACHa molekúl prostredníctvom viazania sa na MACHpi molekuly. Prípadne by mohli niektoré z MACH izoforiem účinkovať aj ako ukotvovacie miesta

pre molekuly, ktoré sú zahrnuté v iných, necytotoxických účinkoch Fas/APO1 a TNF receptorov. Takže analogicky môžu mať aj G1 a/alebo jeho izoformy takéto zosilňujúce účinky, alebo môžu slúžiť ako kotviace miesta pre iné takéto molekuly.

Kvôli unikátnej schopnosti Fas/APO1 a TNF receptorov spôsobiť bunkovú smrť, ako aj schopnosti TNF receptora spustiť iné tkanivá poškodzujúce aktivity, aberácie vo funkcii týchto receptorov by mohli byť veľmi škodlivé pre organizmus. V skutočnosti sa ukázalo, že tak nadbytočná, ako aj nedostatočná funkcia týchto receptorov sa podieľa na patologických prejavoch rôznych chorôb (Vassalli, 1992; Nagata a Golstein, 1995). Identifikácia molekúl, ktoré sa podieľajú na signalizačnej aktivite receptorov, a zistenie spôsobov na moduláciu aktivity týchto molekúl by mohlo rozvinúť nové terapeutické postupy. Vzhľadom na pravdepodobnú hlavnú úlohu G1 v toxicite sprostredkovanej Fas/APO1 a TNF, sa javí ako dôležité navrhnúť liečivá, ktoré môžu blokovať možné proteolytické funkcie G1, ako sa uskutočnilo pre niektoré iné proteíny CED3/ICE rodiny (Thornberry et al., 1994; Miller et al., 1995; Mashima et al., 1995; Milligan et al., 1995; Enari et al., 1995; Los et al., 1995). Unikátne sekvenčné znaky CED3/ICE homológu, ktoré sa zjavne nachádzajú v G1 molekulách, by mohli umožniť navrhnutie liečiv, ktoré by špecificky ovplyvňovali ich aktivitu. Takéto liečivá by mohli poskytnúť ochranu voči nadmernej imunitne-sprostredkovanej cytotoxicite zahŕňajúcej G1, bez toho, aby dochádzalo k interferencii s fyziologickými procesmi bunkovej smrti, v ktorých sú zahrnuté iné členy CED3/ICE rodiny.

Iné aspekty vynálezu budú zrejmé z nasledujúcich príkladov.

Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi a na pripojených výkresoch.

Treba tiež poznamenať že:

(i) dvojhybridné vyhľadávanie a dvojhybridný β-galaktozidázový expresný test; (ii) indukovaná expresia, metabolické značenie a imunoprecipitácia proteínov; (iii) in vitro viazanie sa; (iv) stanovenie cytotoxicity; a (v) Northern a sekvenčné analýzy, ako sú uvedené v citácii v príklade 1 (pozri aj Boldin et al., 1995b) 2, a 3 (pozri aj Boldin et al., 1996) nižšie, s ohľadom na MORT-1 a MORT-1-viažuci proteín, (napr. MACH), sú rovnako aplikovateľné (s nejakými modifikáciami) pre príslušnú izoláciu,

klonovanie a charakterizáciu G1 a jeho možných izoforiem podľa predloženého vynálezu. Takže tieto postupy musia tvoriť opis rovnakých postupov použitých na izoláciu, klonovanie a charakterizáciu G1 podľa predloženého vynálezu, ako sú podrobne uvedené v príklade 1 nižšie. (Príklady 1 až 3 nižšie sa tiež nachádzajú v rovnakej forme v spoločne vlastnených izraelských prihláškach vynálezu č. 114615, 114987, 115319, 116588 a 117932, ktoré sú paralelne v konaní, ako aj v korešpondujúcej PCT prihláške č. PCT/US96/10521). Navyše, vyššie uvedená časť s názvom opis obrázkov na výkresoch tiež obsahuje viac podrobností o experimentálnych postupoch, ktoré sa uskutočňujú v súlade s predloženým vynálezom a tvoria časť príkladu 1, nižšie, s ohľadom na úplný opis predloženého vynálezu, a tak sa musí brať do úvahy spolu s opisom v príklade 1.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1A schematicky znázorňuje predbežnú nukleotidovú sekvenciu jednej izoformy G1 proteínu ako je podrobne uvedené v príklade 1.

Obrázok 1B schematicky znázorňuje odvodenú aminokyselinovú sekvenciu izoformy znázornenej na obrázku 1A.

Obrázok 2 schematicky znázorňuje predbežnú nukleotidovú sekvenciu a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu druhej izoformy G1 proteínu ako je podrobne uvedené v príklade 1.

Obrázok 3 schematicky znázorňuje porovnanie aminokyselinových sekvencií ľudských (hCASHa, hCASH3) G1 (alebo CASH) a myšacích (mCASHa) zostrihových variantov, a konzervatívnych motívov nájdených v týchto proteínoch. Obrázok 3 znázorňuje kolineárne zoradenie aminokyselinovej sekvencie myšieho G1a (mCASHa), ľudského G1a (hCASHa) a Gip (hCASHp), CASP-8 (MACH/FLICE10/Mch5), CASP-10 (Mch4/FLICE2), CASP-3 (CPP32/Apopain/Yama) a CASP1 (ICE). CASP-1 a CASP-3 sú znázornené bez svojich prodoménových oblastí. Aminokyselinové zvyšky sú v každej sekvencií očíslované smerom doprava. Bodkované čiary označujú medzery v sekvencií, ktoré umožňujú optimálne

zoradenie. Moduly smrtiacej domény (DED) sú tieňované. Aminokyseliny, ktoré sú identické vo viac ako troch proteínoch, sú znázornené v rámikoch. Vo vnútri oblastí proteázovej homológie, sú aminokyseliny zosúladené s CASP-1 zvyškami, ktoré sa zúčastňujú katalytickej aktivity, čo bolo zistené rôntgenovou kryštalografiou, označované nasledovne: Zvyšky, ktoré sa pravdepodobne zúčastňujú na katalýze, korešpondujúce s His237 a Cys285 v CASP-1, sú tmavo tieňované a označené vyplnenými krúžkami pod zoradením. Zvyšky tvoriace väzobný priečinok pre karboxylátovú stranu reťazca P1 Asp, korešpondujúce s Arg 179, Gin 238, Arg341 a Ser347 v CASP-1, sú menej tieňované a označené nevyplnenými krúžkami. Známe a navrhnuté Asp-X štiepiace miesta a potenciálne miesto štiepenia nájdené v podobnej pozícii v G1 (CASH) sú tieňované. Horizontálne šípky označujú N- a Cterminálne konce malej a veľkej podjednotky CASP-1. C-konce proteínov sú označené hviezdičkami.

Obrázok 4 (A, B) znázorňuje reprodukcie autorádiográmov Northern blotov znázorňujúcich identifikáciu G1 transkriptov v rôznych ľudských tkanivách (srdce, mozog, placenta, pľúca, pečeň, kostrový sval, obličky, pankreas, slezina, týmus, prostata, semenník, vaječník, tenké črevo, hrubé črevo a periférne krvné lymfocytyPBL). Northern blot analýza sa uskutočňovala nasledovne: Rádiologický značená mRNA sonda korešpondujúca s oblasťou modulu smrtiacej domény (DED) G1 (od nukleotidu č. 482 až 1070 v Gip (pozri, obr. 2), oblasti, ktorá je spoločná pre obe klonované G1 (CASH) zostrihové varianty) sa pripravila použitím T7 RNA polymerázy (Promega) a použila sa na analýzu ľudských blotov z mnohých tkanív (Clontech), obsahujúcich poly(A)+RNA (2pg na dráhu) rôznych ľudských tkanív.

Obrázok 5 je schematickou prezentáciou výsledkov znázorňujúcich interakciu G1a (CASHa) a Gip (CASHp) s inými proteínmi obsahujúcimi smrtiacu doménu (DED) vo vnútri transfekovaných kvasiniek (napr. MORT1/FADD, MACHal (CASP-8a1), MACHpl (CASP-ββΙ), ΜΑ0Ηβ4 (ΟΑ8Ρ-8β4), Mch4 (CASP10), G1a (CASHa), Θ1β (ΟΑεΗβ), p55-R (p55ic), RIP, TRADD a Lamín (negatívna kontrola)). Väzobné vlastnosti Θ1β (0Α8Ηβ) ako aj G1a (CASHa) boli stanovené v kvasinkovom SFY526 reportérovom kmeni (Clontech), použitím vektora pGBT9-62GAL4 s DNA-viažucou doménou, vektora pGAD1318 a vektora pGADGH-GAL4 s aktivačnou doménou. Kvantifikácia viazania sa v kvasinkách sa uskutočňovala podľa príkladov 1 až 3, a to β-galaktozidázovým expresným filtračným testom. Výsledky sú vyjadrené ako čas potrebný na vývin tmavej farby. Vo všetkých testovaných prípadoch sa získali rovnaké výsledky, keď sa umiestnili testované inzerty v oboch kombináciách do konštruktu s DNA-viažucou doménou a konštruktu s aktivačnou doménou. Žiadny z testovaných inzertov neinteragoval so žiadnym z niekoľkých kontrolných proteínov, ktoré zahŕňali vnútrobunkové domény ľudského p55-R (CD120a), p75-R (CD120b), CD40, lamín a prázdne Gal4 vektory.

Obrázok 6 (A až D) predstavuje výsledky znázorňujúce účinky G1a (CASHa), ΰ1β (ΟΑβΗβ) a G1a (CASHa) mutantov na bunkovú životaschopnosť a na indukciu bunkovej smrti. Kvantifikácia bunkovej smrti, ktorá bola indukovaná v HeLa-Fas bunkách (výsledky sú schematicky znázornené ako čiarový graf na obr. 6A) a v 293-T bunkách (výsledky sú schematicky znázornené ako čiarový graf na obrázkoch 6B a 6C) prostredníctvom transfekcie týchto buniek s cDNA uvedených proteínov spolu s pCMV-p-gal, použitím metódy precipitácie s fosforečnanom vápenatým. Každá miska sa transfekovala 5 gg pcDNA3 konštruktu inzertu alebo, ak sa transfekovali dva rozličné konštrukty, 2,5 gg z každého a 1,5 gg βgalaktozidázového expresného vektora. 6 až 10 hodín po transfekcii sa bunky premyli a potom sa inkubovali ďalších 14 hodín bez ďalšieho ošetrenia. Na bunky sa aplikovala anti-CD95 (anti-Fas-R) monoklonálna protilátka (CH11 (Oncor (Gaithersburg, M D)), 0,5 pg/ml) a ľudský rekombinantný TNFa (100 ng/ml) spolu s cykloheximidom (CHX, 10 pg/ml) a inkubovali sa ďalšie 4 hodiny. Bunky sa potom farbili 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl^-D-galaktopyranozidom (X-Gal) a skúmali sa fázovou kontrastnou mikroskopiou. Vo všetkých znázornených experimentoch sa stanovila smrť nasledovne: 24 hodín po transfekcii pre HeLa-Fas bunky a 20 hodín po transfekcii pre 293T bunky. Uvedené údaje (priemer ± SD; n sa rovná najmenej trom experimentom) predstavujú percentá spočítaných modrých buniek, ktoré vykazovali vytváranie membránových bublín.

-63Na obrázku 6D sú znázornené reprodukcie mikrografov znázorňujúcich morfológiu 293-T buniek, ktoré prechodne exprimujú uvedené konštrukty. Fotografie boli urobené 20 hodín po transfekcii.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Referenčný príklad 1

Klonovanie a izolácia MORT-1 proteínu, ktorý sa viaže na vnútrobunkovú doménu FAS-R

(i) Dvojhybridný vyhľadávací a d voj hybridný β-galaktozidázový expresný test

Na izoláciu proteínov, ktoré interagujú s vnútrobunkovou doménou FAS-R bol použitý dvojhybridný systém (Fields a Song, 1989). V stručnosti, tento dvojhybridný systém je genetickým testom, ktorý je založený na detekcii špecifických proteín-proteín interakcií in vivo prostredníctvom obnovenia eukaryotického transkripčného aktivátora, ako napríklad GAL4, ktorý má dve oddelené domény, DNA viažucu a aktivačnú doménu, pričom tieto domény, keď sa spolu exprimujú a viažu, vytvárajú obnovený GAL4 proteín, ktorý je schopný viazať sa na upstream aktivačnú sekvenciu, ktorá spätne aktivuje promótor, ktorý riadi expresiu reporterového génu, ako napríklad lacZ alebo HIS3, ktorého expresia sa dá jednoducho pozorovať v kultivovaných bunkách. V tomto systéme sa gény pre kandidátne interagujúce proteíny klonujú do oddelených expresných vektorov. V jednom expresnom vektore je klonovaná sekvencia jedného kandidátneho proteínu vo fáze so sekvenciou GAL4 DNA-viažucou doménou, aby sa vytvoril hybridný proteín s GAL4 DNA-viažucou doménou, a do ďalšieho vektora je klonovaná sekvencia druhého kandidátskeho proteínu vo fáze s GAL4 aktivačnou doménou, aby sa vytvoril hybridný proteín s GAL4-aktivačnou doménou. Dva hybridné vektory sa potom kotransformujú do kvasinkového hostiteľského kmeňa, ktorý má lacZ alebo HIS3 reporterový gén pod kontrolou upstream GAL4 väzobných miest. Len tie transformované hostiteľské bunky (kotransformanty) budú schopné exprimovať reporterový gén, v ktorých sa exprimujú dva hybridné proteíny, a v ktorých sú tieto

proteíny schopné navzájom interagovať. V prípade lacZ reporterového génu sa hostiteľské bunky exprimujúce tento gén zmodrajú, keď sa do kultúr pridá X-gal. Takže modré kolónie indikujú skutočnosť, že dva klonované kandidátne proteíny sú schopné navzájom interagovať.

Použitím dvojhybridného systému bola do vektora pGBT9 (nesúceho GAL4 DNA-viažucu sekvenciu, poskytnutého CLONTECH, USA, pozri nižšie) klonovaná vnútrobunková doména FAS-IC, aby sa vytvorili fuzované proteíny s GAL4 DNAviažucou doménou. Na klonovanie FAS-R do pGBT9 bol použitý kloň kódujúci úplnú cDNA sekvenciu FAS-R (WO 9531544), z ktorého bola štandardnými postupmi vystrihnutá vnútrobunková doména (IC), použitím rôznych reštrikčných enzýmov, a potom sa štandardnými postupmi izolovala a začlenila do pGBT9 vektora, ktorý bol otvorený v oblasti polyklonovacieho miesta (MCS) vhodnými korešpondujúcimi reštrikčnými enzýmami. Treba poznamenať, že FAS-IC zaberá aminokyselinové zvyšky 175 až 319 intaktnej FAS-R, pričom táto časť obsahuje zvyšky 175 až 319, ktoré predstavujú FAS-IC integrovaný do pGBT9 vektora.

Vyššie uvedený hybridný (chimerický) vektor sa potom kotransformoval spolu s cDNA knižnicou ľudských HeLa buniek klonovaných do pGAD GH vektora nesúceho GAL4 aktivačnú doménu, do HF7c kvasinkového hostiteľského kmeňa (všetky vyššie uvedené vektory, pGBT9 a pGAD GH nesúce cDNA knižnicu z HeLa bunky, a kvasinkový kmeň boli kúpené od Clontech Laboratories, Inc., USA ako časť MATCHMAKER dvojhybridného systému, PT1265-1). Kotransformované kvasinky boli selektované z hľadiska ich schopnosti rásť na médiu, v ktorom chýba histidín (His' médium), pričom rastúce kolónie indikovali pozitívne transformanty. Vybrané kvasinkové klony boli potom testované z hľadiska ich schopnosti exprimovať lacZ gén, tzn. z hľadiska ich LACZ aktivity, a to pridaním X-gal do kultivačného média, ktorý je katabolizovaný β-galaktozidázou, enzýmom kódovaným lacZ génom, a vytvára modrý produkt. Takže modré kolónie indikujú aktívny lacZ gén. Pre aktivitu lacZ génu je potrebné, aby bol GAL4 transkripčný aktivátor prítomný v aktívnej forme v transformovaných klonoch, konkrétne, aby sa GAL4 DNA-viažuca doména kódovaná vyššie uvedeným hybridným vektorom správne skombinovala s GAL4 aktivačnou doménou kódovanou druhým hybridným

vektorom. Takáto kombinácia je možná len vtedy, ak sú dva proteíny fúzované na každú z GAL4 domén schopné navzájom stabilne interagovať (viazať sa). Takže His* a modré (LACZ*) kolónie, ktoré boli izolované, sú kolónie, ktoré boli kotransformované vektorom kódujúcim proteínový produkt pochádzajúci z ľudskej HeLa bunky, ktorý je schopný stabilne viazať FAS-IC.

Plazmidová DNA z vyššie uvedených His*, LACZ* kvasinkových kolónií sa izolovala a elektroporovala do E. coli kmeňa HB101 štandardnými postupmi, a nasledovala selekcia Leu* a ampicilín rezistentných transformantov, pričom tieto transformanty niesli hybridný pGAD GH vektor, ktorý má tak Amp^R, ako aj Leu2 kódujúce sekvencie. Takže takéto transformanty sú klonmi, ktoré nesú sekvencie kódujúce novo identifikované proteíny schopné viazať FAS-IC. Plazmidová DNA sa potom izolovala z týchto transformovaných E. coli a znovu sa testovala prostredníctvom:

(a) ich spätnou transformáciou s hybridným plazmidom nesúcim FAS-R vnútrobunkovú doménu (s hybridným pGTB9 nesúcim FAS-IC) do kvasinkového kmeňa HF7 ako je uvedené tu vyššie. Vektory nesúce sekvencie kódujúce irelevantný proteín, napr. pACT-lamín alebo samotný pGBT9 sa použili ako kontroly na kotransformáciu s plazmidom kódujúcim FAS-IC-viažuci proteín (tzn. MORT-1). Kotransformované kvasinky sa potom testovali z hľadiska ich rastu na His' samostatne alebo s rôznymi hladinami 3-aminotriazolu; a (b) spätnou transformáciou plazmidovej DNA a pôvodného FAS-IC hybridného plazmidu a kontrolných plazmidov opísaných v (a) do kvasinkových hostiteľských buniek kmeňa SFY526 a určením LACZ* aktivity (účinnosti vytvárania β-gal, tzn. vytvárania modrej farby).

Výsledky vyššie uvedených testov odhalili, že spôsob rastu kolónií v His' médiu je identický so vzorom LACZ aktivity, ktorá je vyhodnocovaná prostredníctvom farby kolónie, tzn. His* kolónie boli aj LACZ*. Navyše sa vyhodnocovala LACZ aktivita v tekutej kultúre (výhodné kultivačné podmienky) po transfekcii GAL4 DNA-viažuceho hybridu a hybridu obsahujúceho aktivačnú doménu do SFY526 kvasinkových hostiteľov, ktoré majú lepšiu LACZ inducibilitu s GAL4 transkripčným aktivátorom ako HF7 kvasinkové hostiteľské bunky.

Použitím vyššie uvedeného postupu sa identifikoval, izoloval a charakterizoval proteín, predtým označovaný ako HF1 a teraz uvádzaný ako MORT-1, čo je skratka od mediátor receptorom indukovanej toxicity.

Ďalej treba spomenúť, že v množstve vyššie uvedených β-galaktozidázových expresných testov sa expresia β-galaktozidázy vyhodnocovala aj výhodným filtračným testom. Pri vyhľadávaní sa našlo päť z približne 3x10® cDNAs, ktoré obsahovali MORT-1 inzert. Takto izolované, klonované MORT-1 cDNA inzerty sa potom sekvenovali použitím štandardných DNA sekvenčných postupov. Aminokyselinová sekvencia MORT-1 sa odvodila od DNA sekvencie (pre MORT-1 DNA a aminokyselinové sekvencie pozri spoločne vlastnené izraelské prihlášky vynálezov č. 112 022, 112 692 a 114 615 a korešpondujúcu PCT prihlášku č. WO96/18641, ktoré sú paralelne v konaní). Číslovanie zvyškov v proteínoch kódovaných cDNA inzertmi je v súlade so Swiss-Prot databankou. Delečné mutanty sa vytvorili prostredníctvom PCR a bodové mutanty prostredníctvom oligonukleotidom riadenej mutagenézy (Current Protocols in Molec. Biol., 1994).

(ii) Indukovaná expresia, metabolické značenie a imunoprecipitácia proteínov

V HeLa bunkách sa exprimovali MORT-1 spojený N-koncom s FI_AG oktapeptidom (FLA3-MORT-1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R, chiméra obsahujúca extracelulárnu doménu p55-R (aminokyseliny 1 až 168) fúzovanú na transmembránovú a vnútrobunkovú doménu FAS-R (aminokyseliny 153 až 319) a lucifezázová cDNA, ktorá slúžila ako kontrola. Expresia sa uskutočňovala použitím tetracyklínom kontrolovaného expresného vektora v HeLa bunkovom klone (HtTA-1), ktorý exprimuje tetracyklínom kontrolovaný transaktivátor (Gossen a Bujard, 1992; pozri tiež Boldin et al., 1995). 18 hodín po transfekcii sa uskutočnilo metabolické značenie s [³⁵S]metionínom a [³⁵S]cysteínom (DUPONT, Wilmington, DE, USA a Amersham, Buckinghamshire, England) prostredníctvom ďalšej 4-hodinovej inkubácie pri 37 °C v Dulbecco modifikovanom Eagle médiu, v ktorom chýba metionín a cysteín, ktoré ale bolo doplnené 2% dialyzovaným fetálnym hovädzím sérom. Bunky sa potom lyžovali v

-67RIPA tlmivom roztoku (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 1% NP-40, 1% deoxycholát, 0,1% SDS a 1mM EDTA) a lyzát sa prečistil s irelevantným králičím antisérom (3 μΙ/ml) a proteín G sefarózovými guličkami (Pharmacia, Upsala, Švédsko; 60 μΙ/ml). Imunoprecipitácia sa uskutočňovala 1 hodinovou inkubáciou 0,3 ml alikvot lyzátu pri 4°C s myšími monoklonálnymi protilátkami (5 μΙ/alikvotu) proti FLAG oktapeptidu (M2; Eastman Kodak), p55-R (č. 18 a č. 20; Engelmann et al., 1990) alebo FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA) alebo s izotypovo zhodnými myšími protilátkami ako kontrola, a nasledovala ďalšia hodinová inkubácia s proteínovými G sefarózovými guličkami (30 μΙ/alikvotu).

(iii) In vitro viazanie sa

Glutatión S-transferázové (GST) fúzie s prirodzeným typom alebo s mutantným Fas-IC sa vytvorili adsorbovaním na glutatión-agarózové guličky; (pozri Boldin et al., 1995; Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Frangioni a Neel,

1993). Väzba metabolicky-značeného FALG-MORT-1 fúzovaného proteínu na GST-Fas-IC sa stanovila inkubáciou guličiek počas 2 hodín pri 4°C s extraktmi HeLa buniek, metabolický značenými s [³⁵S]metionínom (60 pCi/ml), ktoré exprimovali FLAG-MORT-1. Extrakty sa pripravili v tlmivom roztoku obsahujúcom 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1% NP-40, 1 mM ditiotreitol, 1mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 20 μg/ml aprotonín, 20 pg/ml leupeptínu, 10 mM fluorid sodný a 0,1 mM vanadičnan sodný (1 ml na 5x10⁵ buniek).

(iv) Stanovenie cytotoxicity spustenej prostredníctvom indukcie expresie MORT-1

MORT-1, Fas-IC, p55-IC a luciferázová cDNA sa včlenili do tetracyklínom kontrolovaného expresného vektora a transfekovali sa do HtTA-1 buniek (línia HeLa buniek) (Gossen a Bujard, 1992) spolu s cDNA vylučovanej placentárnej alkalickej fosfatázy, ktorá bola daná pod kontrolu SV40 promótora (pSBC-2 vektor, Dirks et al., 1993). Bunková smrť sa vyhodnocovala 40 hodín po transfekcii, buď testom príjmu neutrálnej červene (Wallach, 1984), alebo špecifickým vyhodnotením smrti tých buniek, ktoré exprimujú transfekované cDNAs prostredníctvom určenia

množstva placentárnej alkalickej fosfatázy (Berger et al., 1988) vylučovanej do rastového média posledných 5 hodín inkubácie.

V inej sade experimentov na analyzovanie oblasti MORT-1 proteínu zúčastňujúcej sa viazania na FAS-IC, sa nasledujúce proteíny prechodne exprimovali v HeLa bunkách, ktoré obsahujú tetracyklínom kontrolovaný transaktivátor (HtTA-1) použitím tetracyklínom kontrolovaného expresného vektora (pUHD 10-3): samostatný ľudský FAS-R; ľudský FAS-R ako aj N-koncová časť MORT-1 (aminokyseliny 1 až 117, MORT-1 hlava); ľudský FAS-R ako aj Ckoncová časť MORT-1, ktorá obsahuje oblasť homológie so smrtiacou doménou (aminokyseliny 130 až 245, MORT-1 DD); FI_AG-55.11 (aminokyseliny 309 až 900) proteínu 55.11 fúzovaného na N-koniec FALG oktapeptidu, pričom proteín 55.11 je p55-IC-špecificky viažuci proteín. Dvanásť hodín po transfekcii sa bunky trypsínovali a znovu nasadili v koncentrácii 30 000 buniek na jamku. Po 24 hodinách ďalšej inkubácie sa na bunky pôsobilo 6 hodín monoklonálnou protilátkou proti extracelulárnej doméne FAS-R (monoklonálna protilátka CH-11, Oncor, Gaithersburg, MD, USA), rôznymi koncentráciami (0,001 až 10 pg/ml monoklonálnej protilátky v prítomnosti 10 pg/ml cykloheximidu. Bunková životnosť sa potom určila testom príjmu neutrálnej červene a výsledky sa prezentovali ako % prežívajúcich buniek v porovnaní s bunkami, ktoré boli inkubované len s cykloheximidom (bez anti-FAS-R monoklonálnej protilátky CH-11).

(v) Northern analýza a sekvenčná analýza

Poly A⁺RNA sa izolovala z celkovej RNA HeLa buniek (Oligotex-dT mRNA kit, QIAGEN, Hilden, Nemecko). Northern analýza sa uskutočňovala použitím MORT-1 cDNA ako sondy, prostredníctvom bežných metód (pozri Boldin et al., 1995). Nukleotidová sekvencia MORT-1 sa určila z oboch strán dideoxy reťazovou terminačnou metódou.

Zo sekvenčnej analýzy MORT-1 cDNA klonovanej dvojhybridným postupom vyplynulo, že kóduje nový proteín. Použitím dvojhybridného testu na ďalšie stanovenie špecificity viazania sa tohto proteínu (MORT-1 z mediátor receptorom

indukovanej toxicity) na Fas-IC, a na definovanie konkrétnej oblasti vo Fas-IC, na ktorú sa viaže, viedli k nasledujúcim zisteniam: (a) MORT-1 proteín sa viaže tak na ľúdský, ako aj na myší Fas-IC, ale nie na niekoľko iných testovaných proteínov, vrátane troch receptorov z TNF/NGF receptorovej rodiny (p55 a P75 TNF receptory a CD40); (b) Ukázalo sa, že zámenné mutácie v polohe 225 (lle) v smrtiacej doméne FAS-R rušia signalizáciu tak in vitro, ako aj in vivo (Ipŕ⁹ mutácia (Watanabe-Fukunaga et al., 1992; Itoh a Nagata, 1993), a táto mutácia zabraňuje aj viazaniu sa MORT-1 na FAS-R; (c) MORT-1 viažuce miesto sa nachádza vo FAS-R vo vnútri smrtiacej domény tohto receptora; a (d) MORT-1 sa viaže sám na seba. Vzájomné viazanie sa a viazanie sa MORT-1 na FAS-R zahŕňa rôzne oblasti proteínu: Fragment MORT-1 zodpovedajúci zvyškom 1 až 117 sa viaže na úplný MORT-1, ale neviaže sa navzájom, ani na FAS-IC. Naproti tomu fragment zodpovedajúci zvyškom 130 až 245 sa viaže na FAS-R, a neviaže sa na MORT-1. Navyše, z výsledkov tiež vyplynulo, že oblasť smrtiacej domény FAS-R je kritická pre vzájomné spájanie FAS-IC, ako aj oblasť smrtiacej domény p55-R pre vzájomné spájanie sa p55-IC. Delécie na oboch stranách týchto smrtiacich domén neovplyvňujú schopnosť ich vzájomného spájania sa, avšak delécie vo vnútri týchto smrtiacich domén ovplyvňujú vzájomné spájanie sa. V prípade MORT-1 závisí viazanie sa MORT-1 na FAS-IC aj na kompletnosti (úplnosti) smrtiacej domény FAS-R, avšak nie je závislé na oblastiach mimo oblasti FAS-R smrtiacej domény pre väzbu na FAS-IC.

Interakcia proteínov kódovaných konštruktami obsahujúcimi Gal4 DNA viažucu doménu a aktivačnú doménu (pGBT9 a pGAD-GH) vo vnútri transfekovaných SFY526 kvasiniek bola stanovená β-galaktozidázovým expresným filtračným testom. Konštrukty obsahujúce DNA-viažucu doménu zahŕňali štyri konštrukty ľudskej Fas-IC, štyri konštrukty myšej Fas-IC vrátane dvoch úplných konštruktov, ktoré majú lle na Leu alebo lle na Ala zámenné mutácie v polohe 225 (I225N a I225A) a tri MORT-1 konštrukty. Konštrukty s aktivačnou doménou zahŕňali tri MORT-1 konštrukty, pričom MORT-1 časti boli ako pri konštruktoch s DNA-viažucou doménou; a konštrukt s úplnou ľudskou Fas-IC, pričom Fas-IC časť bola rovnaká ako vo vyššie opísaných konštruktoch s DNA-viažucou doménou.

Vnútrobunkové domény ľudského p55 TNF receptora (p55-IC zvyšky 206 až 426), ľudský CD40 (CD40-IC, zvyšky 216 až 277) a ľudský p75 TNF receptor (p75-IC, zvyšky 287 až 461), ako aj lamín, cyklín D a prázdny Gal4 (pGBT9) vektor, slúžili ako negatívna kontrola vo forme konštruktov s DNA-viažucou doménou. SNF-1 a SNF4 slúžili ako pozitívne kontroly vo forme konštruktov s DNA-viažucou doménou (SNF1) a aktivačnou doménou (SNF4). Prázdne Gal4 vektory (pGAD-GH) slúžili aj ako negatívne kontroly vo forme konštruktov s aktivačnou doménou. Symboly ++ a + používané pri prezentácii výsledkov vyššie uvedenej analýzy označujú vyvinutie silnej farby počas 30 respektíve 90 minút testu; a označuje, že sa nevyvinula žiadna farba počas 24 hodín.

Výsledkom expresie MORT-1 molekúl, ktoré boli na svojom N-konci fúzované s FLAG oktapeptidom (FLAG-MORT-1) v HeLa bunkách, boli proteíny so štyrmi rozličnými veľkosťami - približne 27, 28, 32 a 34 kD. Interakcia MORT-1 s Fas-lc in vitro bola pozorovaná uskutočňovaním imunoprecipitácie proteínov z extraktu HeLa buniek, ktoré boli transfekované s FLAG-MORT-1 fúzovaným proteínom alebo s luciferázovou cDNA ako kontrolou, pričom imunoprecipitácia sa uskutočňovala s anti-FLAG protilátkou (aFLAG). Medzi MORT-1 a FAS-IC bola tiež demonštrovaná interakcia in vitro, pričom MORT-1 bol vo forme [³⁵SJ metionín-metabolicky značených fúzovaných proteínov získaných z extraktov transfekovaných HeLa buniek a FAS-IC bol vo forme ľudského a myšacieho GST-FAS-IC fúzovaných proteínov obsahujúcich jednu alebo viacero zámenných mutácií v polohe 225 vo FAS-IC, pričom všetky z GST-FAS-IC fúzovaných proteínov boli produkované v E. coli. Pred interakciou s extraktami obsahujúcimi MORT-1-FLAG fúzovaný proteín boli GST-fúzované proteíny pripojené ku glutatiónovým guličkám, pričom po interakcii nasledovalo uskutočňovanie SDS-PAGE. Takže in vitro interakcia sa stanovila autorádiografiou po SDS-PAGE, pričom sa hodnotilo viazanie sa [³⁵S] metionín-metabolicky značeného MORT-1, vytvoreného v transfekovaných HeLa bunkách ako fúzia s FLAG oktapeptidom (FLAG-MORT-1), na GST, GST fúziu s ľudským alebo myšacím Fas-IC (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) alebo na GST fúziu s Fas-IC obsahujúcim lle na Ala zámennú mutáciu v polohe 225. Ukázalo sa, že štyri FLAG-MORT-1 proteíny vykázali schopnosť viazať sa na Fas-IC pri inkubácii s

GST-Fas-IC fúzovaným proteínom. Tak ako v kvasinkovom dvojhybridnom teste, MORT-1 sa neviazal na GST-Fas-IC fúzovaný proteín so zámenou na Ipŕ⁵ mutačnom mieste (I225A).

Proteíny kódované FLAG-MORT-1 cDNA vykazujú aj schopnosť viazať sa na vnútrobunkovú doménu FAS-R, ako aj na vnútrobunkovú doménu FAS-R chiméry, ktorej extracelulárna doména bola nahradená doménou z p55-R (p55-FAS), ak sú koexprimované s týmito receptormi v HeLa bunkách. V tomto prípade, interakcia MORT-1 s FAS-IC v transfekovaných HeLa bunkách, tzn. in vivo, ako bola pozorovaná v imunoprecipitátoch rôznych transfekovaných HeLa buniek, demonštrovala in vivo interakciu a špecificitu interakcie medzi MORT-1 a FAS-IC v bunkách ko-transformovaných konštruktami kódujúcimi tieto proteíny. Takže FLAGMORT-1 fúzovaný proteín sa exprimoval a metabolický označili s [³⁵S] cysteínom (20 pCi/ml) a [³⁵S] metionínom (40 pCi/ml) v HeLa bunkách, a to buď samostatne alebo spolu s ľudským FAS-R, s FAS-R chimérou, v ktorej je extracelulárna doména FAS-R nahradená zodpovedajúcou oblasťou v ľudskom p55-R (p55-FAS), alebo s ľudským p55 ako negatívnou kontrolou. Použitím rôznych špecifických protilátok sa uskutočnila krížová imunoprecipitácia MORT-1 s ko-exprimovaným receptorom. Výsledky indikovali, že FLAG-MORT-1 je schopný viazať sa na vnútrobunkovú doménu FAS-R, ako aj na vnútrobunkovú doménu FAS-R-p55-R chiméry, ktorá mala extracelulárnu doménu z p55-R a vnútrobunkovú doménu z FAS-R, ak sa koexprimuje s týmito receptormi v HeLa bunkách. Navyše, výsledkom imunoprecipitácie FLAG-MORT-1 z extraktov transfekovaných buniek bola aj precipitácia ko-exprimovaného FAS-R alebo ko-exprimovanej p55-FAS chiméry. Naopak, výsledkom imunoprecipitácie týchto receptorov bola koprecipitácia FLAG-MORT-1.

Northern analýza použitím MORT-1 cDNA ako sondy odhalila jediný hybridizačný transkript v HeLa bunkách. V Northern blote, v ktorom sa polyA⁺RNA (0,3 gg) z transfekovaných buniek hybridizovala s MORT-1 cDNA, sa zistilo, že veľkosť RNA transkriptu (okolo 1,8 kb) je blízko veľkosti MORT-1 cDNA (okolo 1702 nukleotidov).

Sekvenčnou analýzou sa zistilo, že cDNA obsahuje otvorený čítací rámec s veľkosťou približne 250 aminokyselín. DNA a aminokyselinová sekvencia MORT-1 je uvedená vo vyššie uvedených spoločne vlastnených prihláškach vynálezov, ktoré sú súčasne v konaní (pozri aj WO96/18641). V týchto sekvenciách je podčiarknutý motív smrtiacej domény, je označený Met zvyšok ako možný štart (poloha 49; hrubo vytlačené, podčiarknuté M) a translačný stop kodón (hviezdičkou pod kodónom, v polohe 769 až 771). Tento motív smrtiacej domény zdieľa homológiu so známymi motívmi smrtiacich domén z p55-R a FAS-R (p55DD a FAS-DD). Kvôli zisteniu presného C-konca MORT-1, a aby sa získal dôkaz týkajúci sa presného N-konca (iniciačného Met zvyšku) MORT1, uskutočnili sa ďalšie nasledovné experimenty:

Použitím spôsobov opísaných vyššie sa skonštruovalo množstvo konštruktov kódujúcich MORT-1 molekuly fúzované na N-konci s FLAG oktapeptidom (FLAGMORT-1) a exprimovali sa v HeLa bunkách, pričom exprimované proteíny boli metabolický značené s ³⁵S-cysteínom a ³⁵S-metionínom. MORT-1-FLAG molekuly boli kódované nasledujúcimi cDNA, ktoré obsahovali rôzne časti MORT-1 kódujúcej sekvencie:

i) FLAG oktapeptidovú cDNA spojenú s 5'-koncom MORT-1 cDNA, z ktorej boli deletované nukleotidy 1 až 145;

ii) FLAG oktapeptidovú cDNA spojenú s 5'-koncom MORT-1 cDNA s úplnou dĺžkou iii) FLAG oktapeptidovú cDNA spojenú s 5'-koncom MORT-1 cDNA, z ktorej boli deletované nukleotidy 1 až 145, ako aj nukleotidy 832 až 1701 a kodón GCC v polohe 142 až 144 bol mutovaný na TCC, aby sa zabránilo štartu translácie z tohto miesta.

Po expresii vyššie uvedených FLAG-MORT-1 fúzovaných produktov sa imunoprecipitácia uskutočňovala ako bolo uvedené vyššie použitím buď anti-FLAG monoklonálnych protilátok alebo ako kontroly anti-p75 TNF-R protilátok, po čom nasledovala SDS-PAGE (10% akrylamid) autoradiografia. Výsledky analýzy s vyššie uvedenými FLAG-MORT-1 fúzovaných produktov potvrdili (stanovili) Cterminálny koniec MORT-1 a poskytli dôkaz, že N-terminálny koniec MORT-1 môže byť v polohe 49 sekvencie.

-73V skutočnosti sa ukázalo ďalšími expresnými experimentami s MORT-1 bez FLAG oktapeptidu fúzovanom na jeho 5'-konci, že Met⁴⁹ slúži ako účinné miesto pre iniciáciu translácie.

Prieskum uskutočnený v Gene Bank a v Protein Bank databázach odhalil, že v tom čase neexistovala žiadna sekvencia korešpondujúca so sekvenciou vyššie izolovanej MORT-1 sekvencie. Takže MORT-1 predstavoval nový FAS-ICEšpecificky viažuci proteín.

Výsledkom expresie p55-IC je spustenie cytocídneho účinku (Boldin et al., 1995). Expresia p55-IC v HeLa bunkách má tiež takýto účinok, hoci v nižšom rozsahu, ktorý môže byť detegovaný len použitím senzitívneho testu. Takže bolo analyzované spustenie cytocídnych účinkov, nezávislých od ligandu, v bunkách transfekovaných s MORT-1 ako aj ľudským p55-IC a FAS-IC. Účinok prechodnej expresie MORT-1, ľudského Fas-IC, ľudského p55-IC alebo luciferázy, ktorá slúži ako kontrola, na životaschopnosť HeLa buniek bola stanovená použitím tetracyklínom kontrolovaného expresného vektora. Bunková životaschopnosť bola stanovená 40 minút po transfekcii týchto cDNA, buď v prítomnosti alebo bez tetracyklínu (1 pg/ml, na blokovanie expresie), spolu s cDNA kódujúcou placentárnu alkalickú fosfatázu. Životaschopnosť buniek bola určená, buď prostredníctvom testu príjmu neutrálnej červene, alebo špecifickou determináciou životaschopnosti tých konkrétnych buniek, ktoré exprimujú transfekovanú DNA, meraním množstva placentárnej alkalickej fosfatázy vylučovanej do rastového média.

Vyššie uvedená analýza odhalila, že výsledkom expresie MORT-1 v HeLa bunkách je signifikantná bunková smrť, vyššia ako tá, ktorá je spôsobená FAS-IC expresiou. Zdá sa, že tieto cytotoxické účinky všetkých p55-IC, FAS-IC a MORT-1 sa týkajú oblastí smrtiacej domény, ktoré sú prítomné vo všetkých týchto proteínoch, pričom tieto smrtiace domény sú náchylné navzájom sa spájať, a tým možno napomáhajú cytotoxickým účinkom.

Vzhľadom na vyššie uvedené charakteristiky MORT-1, konkrétne špecifickú asociáciu MORT-1 s určitou oblasťou vo FAS-R, ktorá je zahrnutá v indukcii bunkovej smrti, a fakt, že aj malá zmena v štruktúre tejto oblasti, ktorá zabráni signalizácii (Ipr®⁹ mutácia) poruší aj viazanie sa MORT-1, indikuje, že tento proteín

hrá úlohu v signalizácii alebo pri spustení bunkovej smrti. Tento poznatok je ďalej podporený pozorovaním schopnosti MORT-1 samostatne spustiť cytocídny účinok. Takže MORT-1 môže fungovať ako (i) modulátor vzájomnej asociácie FAS-R vďaka jeho vlastnej schopnosti viazať sa na FAS-R ako aj navzájom, alebo (ii) slúži ako ukotvovacie miesto pre ďalšie proteíny, ktoré sú zahrnuté vo FAS-R signalizácii, tzn. MORT-1 môže byť ukotvovacím proteínom a môže tak viazať iné receptory okrem FAS-R, alebo (iii) tvorí časť samostatného signalizačného systému, ktorý interaguje s FAS-R signalizáciou.

Na ďalšiu analýzu oblastí MORT-1, ktoré sa podieľajú na FAS-R viazaní a modulácii FAS-R sprostredkovaných bunkových účinkov (cytotoxicity), sa uskutočňovali vyššie uvedené experimenty, použitím vektorov kódujúcich časti MORT-1 (MORT-1 hlavu, aminokyseliny 1 až 117 a MORT-1 dd, aminokyseliny 130 až 245) (oddelene) s vektorom kódujúcim ľudský FAS-R pre kotransfekciu HeLa buniek. V týchto experimentoch sa proteíny a kombinácie proteínov exprimovali prechodne v HeLa bunkách, ktoré obsahovali tetracyklínom kontrolovaný transaktivátor (HtTA-1) inzerciou sekvencii kódujúcich proteíny do tetracyklínom kontrolovaného expresného vektora pUHD10-3. Kontrolné transfekcie používali vektory kódujúce len FAS-R a vektory kódujúce FLAG-55.11 fúzovaný proteín (55.11 proteín, je p55-IC špecificky viažuci proteín, ktorého časť obsahujúca aminokyseliny 309 až 900 bola fúzovaná (na jeho N-koniec) na FLAG oktapeptid).

Po transfekcii a inkubácii sa tranfekované bunky ošetrili s rôznymi koncentráciami anti-FAS-R monoklonálnej protilátky (CH-11), ktorá sa špecificky viaže na extracelulárnu doménu FAS-R exprimovanú v bunkách. Toto viazanie sa anti-FAS-R protilátky indukuje agregáciu FAS-R na bunkovom povrchu (veľmi podobne ako FAS-R ligand) a indukuje vnútrobunkovú signalizačnú dráhu sprostredkovanú FAS-IC, a nevyhnutným výsledkom je bunková smrť (FAS-R sprostredkovaná bunková cytotoxicity). Koncentrácie anti-FAS-R monoklonálnej protilátky (CH-11) boli použité v rozsahu od 0,01 až 10 gg/ml, zvyčajne v koncentráciách ako 0,005; 0,05; 0,5 a 5 gg/ml. Bunky boli ošetrené anti-FAS protilátkou v prítomnosti 10 μg/ml cykloheximidu.

Výsledky vyššie uvedenej analýzy ukazujú, že expresia FAS-R v transfekovaných bunkách spôsobuje zvýšenie citlivosti voči cytocídnym účinkom anti-FAS-R protilátok. Ďalej, koexpresia oblasti MORT-1, ktorá obsahuje oblasť homológie so smrtiacou doménou, a FAS-R, silne interferuje s FAS-indukovanou (tzn. FAS-R sprostredkovanou) bunkovou smrťou, čo by sa dalo očakávať na základe schopnosti MORT-1 smrtiacej domény, (DD) oblasti, viazať sa na FAS-R smrtiacu doménu (FAS-DD). Navyše koexpresia N-koncovej časti MORT-1 a FASR neinterferuje s FAS-R sprostredkovanou bunkovou smrťou a ak áno, o niečo zvyšuje cyotoxicitu (tzn., mierne zvyšuje bunkovú smrť).

Takže vyššie uvedené výsledky jasne indikujú, že MORT-1 proteín má dve rozličné oblasti, a to oblasť, ktorá sa týka viazania sa na FAS-IC a oblasť sprostredkovania bunkovej cytotoxickej aktivity FAS-IC.

Takže tieto výsledky tiež poskytujú základ pre použitie rôznych častí (tzn. aktívnych fragmentov alebo analógov) MORT-1 proteinu na rôzne farmaceutické aplikácie. Napríklad, analógy alebo fragmenty alebo deriváty MORT-1 proteinu, ktoré obsahujú v podstate len C-koncovú časť MORT1 vrátane jeho oblasti smrtiacej domény môžu byť použité na inhibíciu FAS-R sprostredkovaných cytotoxických účinkov v bunkách alebo tkanivách obsahujúcich FAS-R, čo môže viesť k zosilneniu deštrukcie v týchto bunkách alebo tkanivách, ak je to želateľné, v prípadoch ako napríklad pri tumorových bunkách alebo pri autoreaktívnych T a B bunkách. Ako je podrobnejšie vysvetlené vyššie, vyššie uvedené použitia rôznych oblastí MORT-1 sa môžu uskutočňovať použitím rôznych rekombinantných vírusov (napr. vakcín) na inzerciu MORT-1 oblasť kódujúcej sekvencie do špecifických buniek alebo tkanív, ktoré majú byť ošetrené.

Navyše je tiež možné pripraviť a použiť rôzne iné molekuly ako napríklad protilátky, peptidy a organické molekuly, ktoré majú sekvencie alebo molekulové štruktúry korešpondujúce s vyššie uvedenými MORT-1 oblasťami, aby sa dosiahli rovnaké požadované účinky sprostredkované týmito MORT-1 oblasťami.

Navyše MORT-1 môže byť použitý na špecifickú identifikáciu, izoláciu a charakterizáciu iných proteínov, ktoré sú schopné viazať sa na MORT-1 (tzn. MORT-1-viažucich proteínov); pozri referenčné príklady 2 a 3.

-76Referenčný príklad 2

Izolácia MORT-1 viažuceho proteínu

(i) Dvojhybridné vyhľadávanie a dvojhybridný β-galaktozidázový expresný test

Boli získané dva cDNA klony, ktoré kódujú proteínový produkt schopný viazať sa tak na MORT-1 ako aj na p55-IC, spôsobom analogickým s postupmi opísanými v referenčnom príklade 1, použitím vnútrobunkovej domény p55 TNF-R (p55 IC) a MORT-1 ako návnad, a prehľadávaním knižnice ľudských B-buniek. Ukázalo sa, že oba klony majú identické nukleotidové sekvencie na 5'konci (pozri spoločne vlastnené WO96/18641 a PCT/US96/10521).

(ii) Väzobné vlastnosti novo klonovaných cDNA v dvojhybridných vyhľadávaniach

Použitím vyššie uvedeného kvasinkového dvojhybridného postupu, bol konštrukt obsahujúci nové cDNA MORT-1 viažuce proteíny použitý ako úlovok, ku ktorému boli pridané konštrukty množstva návnad v separovaných reakciách, aby sa určila väzobná špecificita MORT-1 viažuceho proteínu kódovaného touto cDNA. Tieto návnady zahŕňali konštrukty kódujúce MORT-1, časti MORT-1 (MORT hlavu, aminokyseliny 1 až 117, MORT chvost, aminokyseliny 130 až 245), p55 IC (206 až 426 p55) alebo ich časti (smrtiaca doména, 326 až 426 p55; a iné sekvencie smerom nahor od smrtiacej domény tzn. 206 až 326). Výsledky sú uvedené nižšie v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Návnada	β-galaktozidázové expresné údaje
MORT-1	+++
130-245 MORT-1	+
1-117 MORT-1	-
206-426 p55	+++
326-426 p55	+++

206-326 p55
206-308 p55
206-345 p55
p55 L35INI
Fas IC
233-319 Fas
p75 IC
CD40 IC
pGBTIO
SNF1
Cyklín D
Lamín

Vyššie uvedené výsledky dvojhybridného β-galaktozidázového expresného testu viazania sa klonu na veľký panel návnad potvrdili, že proteín kódovaný týmto klonom sa špecificky viaže na smrtiacu doménu tak p55 TNF-R, ako aj MORT-1.

Vo všeobecnosti môže byť MORT-1 viažuci proteín použitý priamo na moduláciu alebo sprostredkovanie MORT-1 asociovaných účinkov na bunky alebo, nepriamo, na moduláciu alebo sprostredkovanie účinku FAS-R ligandu na bunky, ak je tento účinok modulovaný alebo sprostredkovaný MORT-1. To isté platí pre iné vnútrobunkové proteíny alebo pre vnútrobunkové domény transmembránových proteínov, ako tu bolo konkrétne demonštrované pre p55 TNF-R.

MORT-1 viažuce proteíny zahŕňajú proteíny, ktoré sa viažu špecificky na MORT-1 proteín, alebo proteíny, ktoré sa viažu na rôzne oblasti MORT-1 proteínu, napr. na vyššie uvedené N- a C- koncové oblasti MORT-1. MORT-1 viažuce proteíny, ktoré sa špecificky viažu na takéto oblasti, môžu byť použité na moduláciu aktivity týchto oblastí, a tým na moduláciu špecifickej aktivity MORT-1, ktorá bola určená pre tieto oblasti.

-78Referenčný príklad 3

Izolácia a charakterizácia MACH proteínu, ďalšieho MORT-1 viažuceho proteínu

(i) Dvojhybridné vyhľadávanie, dvojhybridný β-galaktozidázový test, sekvenovanie a sekvenčná analýza

Použitím postupu uvedeného vyššie v referenčných príkladoch 1 a 2 sa na izoláciu cDNA klonu kódujúceho ďalší nový MORT-1 viažuci proteín použil konštrukt kódujúci úplný ľudský MORT-1 proteín ako návnada v kvasinkovom dvojhybridnom systéme. Tento nový proteín bol pôvodne označený ako MORT-2 a teraz sa označuje ako MACH (z MORT-1 asociovaný CED3 homológ) na základe jeho charakteristík ako je podrobne uvedené nižšie.

Tento cDNA kloň bol sekvenovaný štandardnými postupmi ako je uvedené v referenčných príkladoch 1 a 2 vyššie. Sekvenčná analýza štandardnými postupmi a prostredníctvom počítačových programov (pozri referenčné príklady 1 a 2) odhalila, že táto cDNA má novú sekvenciu a kóduje nový proteín (ani DNA ani aminokyselinová sekvencia sa nenašli v GENBANK alebo PROTEÍN BANK sekvenčných databázach). Ďalej cDNA kódujúca MACH odhalila ORF-B, otvorený čítací rámec, ktorý má silnú homológiu s oblasťou pred motívom smrtiacej domény (5' upstream) MORT-1 proteínu (pozri referenčný príklad 1). V spoločne vlastnených izraelských prihláškach č. 114615, 114986, 115319, 116588 a 117932 ako aj v korešpondujúcej PCT prihláške č. PCT/US96/10521, ktoré sú zároveň v konaní, je uvedená štruktúra časti MACH cDNA klonu, ktorá obsahuje ORF-B (235 aminokyselinových zvyškov); odvodená aminokyselinová sekvencia MACH ORF-B; a nukleotidová sekvencia MACH cDNA molekuly. Oblasť ORF-B zdieľa vysokú homológiu s oblasťou MORT-1 smerom hore od MORT-1 motívu smrtiacej domény.

Ďalej sa použil kvasinkový dvojhybridný test na stanovenie špecificity viazania sa MACH na MORT-1, hlavne na definíciu oblasti v MORT-1, ktorá viaže MACH, ako aj na určenie, ktorý z MACH ORFs interaguje s MORT-1, pričom postupy boli rovnaké ako v referenčných príkladoch 1 a 2. V stručnosti, pripravili sa rôzne MORT-1 a MACH konštrukty na testovanie interakcie rôznych proteínov

kódovaných Gal4 DNA-viažucou doménou a konštrukty s aktivačnou doménou vo vnútri transfekovaných SFY526 kvasinkových buniek, čo bolo stanovené βgalaktozidázovým expresným filtračným testom. Konštrukty s DNA-viažucou doménou boli pripravené v pGBT9 vektoroch a konštrukty s aktivačnou doménou boli pripravené v pGAD-GM vektoroch. Pre konštrukty s aktivačnou doménou boli použité cDNA s úplným MACH (MACH), ako aj konštrukt kódujúci len ORF-B (MACH B) oblasť. Kontrolné konštrukty s aktivačnou doménou boli konštrukty, ktoré obsahovali úplnú MORT-1 kódujúcu sekvenciu (MORT-1, pozitívna kontrola) a konštrukty, ktoré nemali žiadny inzert, tzn. prázdne vektory (pGAD-GM). Pre konštrukty s DNA-viažucou doménou bola použitá cDNA úplného MORT-1 (MORT1), ako aj konštrukty kódujúce len MORT-1 upstream oblasť (MORT-1 DD, aminokyseliny 130 až 245). Kontrolné konštrukty s DNA-viažucou doménou, ktoré boli konštruovaná aj na určenie špecificity MACH viazania sa, zahŕňali konštrukty kódujúce lamín (lamín), zvyšky 286 až 461 vnútrobunkovej domény ľudského p75 TNF-R (ľudský p75 IC), cyklín D (cycD), SNF1, zvyšky 206 až 426 vnútrobunkovej domény ľudského p55 TNF-R (ľudský p55 IC), oblasť smrtiacej domény vnútrobunkovej domény ľudského CD40 (ľudský CD40 IC), vektory bez inzertu alebo prázdne pGBT9 vektory (pGBT9, negatívna kontrola) a konštrukt kódujúci ORF-B oblasť MACH (MACH B). V teste bolo určované vyfarbenie. Viac farby znamenalo zvýšenú interakciu medzi konštruktami kódujúcimi DNA-viažucu doménu a aktivačnú doménu. Vyfarbenie bolo označené symbolmi, kde +++ a + indikujú silné vyfarbenie počas testu v rámci 30, respektíve 90 minút a indikuje, že nedošlo k zafarbeniu počas 24 hodín testu. V prípade, že interakcia nebola testovaná, nie je uvedený žiadny symbol. Výsledky rôznych interakcií pre vyššie uvedené prípady sú uvedené v tabuľke 3 nižšie, a výsledky rôznych interakcií pre MACH izoformy sú uvedené vo vyššie spomenutej spoločne vlastnenej PCT/US96/10521 a jej korešpondujúcich IL prihláškach, ktoré sú zároveň v konaní.

-80Tabuľka 3

DOMÉNOVÝ HYBRID

Hybrid s DNA-viažucou doménou	MACH	MACH B	MORT1	pGAD-GH
MORT-1	+++	+++	+++	—
Viažuca oblasť v MORT-1
MORT1 (-117)
MORT1DD (130-245)	—	—
Testy špecificity
lamín	—	—
ľudský p75 IC	—
cyc D
SNF
ľudský p55 IC
ľudský FAS DD	—
ľudský CD40 IC	—
pGBT9	—
MACH B		+	+	—

Takže ako vyplýva z výsledkov uvedených v tabuľke 3 vyššie, je zrejmé, že:

(a) MACH sa viaže na MORT-1 veľmi silným a špecifickým spôsobom;

(b) MACH viažuce miesto sa v MORT-1 nachádza pred (upstream) motívom smrtiacej domény v MORT-1, tzn. v oblasti MORT-1 definovanej aminokyselinami 1 až 117 MORT-1;

(c) ORF-B oblasť MACH je MORT-1 interagujúca oblasť MACH proteínu; a (d) MACH ORF-B oblasť je schopná vzájomného spájania sa.

(ii) Bunkové cytotoxické účinky sprostredkované schopnosťou MACH proteínu viazať sa sám na seba

Pozorovanie, že MACH sa môže spájať sám so sebou, a hlavne, že ORF-B oblasť MACH sa spája sama so sebou a predchádzajúca korelácia medzi vlastným spájaním sa a bunkovou cytotoxicitou, ako bola pozorovaná pri vnútrobunkových doménach p55 TNF a FAS-R, a pri MORT-1 (pozri referenčný príklad 1), naznačila, že MACH vzájomné spájanie sa môže byť zahrnuté v bunkovej cytotoxicite.

Na otestovanie tejto možnosti boli pripravené konštrukty kódujúce MACH s tetracyklínom kontrolovaným expresným vektorom (podrobnosti pozri v referenčnom príklade 1). Tieto konštrukty boli použité na transfekciu HeLa buniek, v ktorých sa tieto vektory prechodne exprimovali. Na stanovenie účinku prechodnej expresie na životaschopnosť HeLa buniek boli okrem MACH konštruktov použité iné kontrolné konštrukty, s ktorými by mohol byť porovnaný účinok MACH konštruktov. Tieto iné konštrukty zahŕňali MORT-1, ľudský FAS-IC a luciferázu (Luc). Navyše bola kotransfekcia HeLa buniek testovaná aj použitím MORT-1 a MACH konštruktov, aby sa určilo aké účinky by spôsobí interakcia medzi týmito proteinmi. Po transfekcii boli HeLa bunky inkubované a bunková životaschopnosť sa stanovila 48 hodín po transfekcii, a to buď v prítomnosti alebo bez tetracyklínu (1 pg/ml) na blokovanie expresie. Bunková životaschopnosť bola určená testom príjmu neutrálnej červene.

Z výsledkov vyššie uvedenej analýzy je zrejmé, že MACH indukuje dramatický cytotoxický účinok v HeLa bunkách, tzn. indukuje nadmernú expresiu MACH cDNA v HeLa bunkách, ktorej výsledkom je dramatický cytotoxický účinok. Tento cytotoxický účinok sa pravdepodobne týka schopnosti MACH spájať sa sám so sebou.

(iii) Northern analýza

Použitím dobre známych postupov (pozri referenčný príklad 1) sa uskutočnili Northern analýzy niekoľkých bunkových línií použitím MACH cDNA ako sondy. Výsledky týchto analýz ukazujú, že vo veľkom množstve bunkových línií, hlavne v CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat a A673 bunkových líniách, existujú dva hybridizačné transkripty s veľkosťou približne 3,2 kb.

Na základe vyššie uvedeného môže byť MACH proteín, hlavne ΜΑΟΗβΙ proteín (ORF-B z MACH) použitý priamo na moduláciu alebo sprostredkovanie MORT-1 asociovaných účinkov na bunky alebo, nepriamo, na moduláciu alebo sprostredkovanie účinku FAS-R ligandu na bunky, ak je tento účinok modulovaný alebo sprostredkovaný MORT-1. Fakt, že sa MACH špecificky viaže na hornú oblasť MORT-1 a zdieľa homológiu s MORT-1, poskytuje špecifický spôsob, v ktorom môže byť MACH alebo MACH ORF-B použitý na moduláciu tejto špecifickej oblasti MORT-1, a tým špecifickej aktivity MORT-1, ktorá je determinovaná touto hornou oblasťou. Ďalej môžu byť MACH alebo MACH ORF-B použité ako modulátor alebo mediátor vnútrobunkových účinkov analogickým spôsobom ako samotný MORT-1 (pozri vyššie), na základe schopnosti MACH viazať sa sám na seba a samostatne indukovať bunkovú cytotoxicitu.

Ako je uvedené nižšie uskutočnili sa ďalšie analýzy MACH proteínu a jeho DNA kódujúcej sekvencie. Ďalej sa odhalilo, že ORF-B z MACH predstavuje len jednu z množstva MACH izoforiem. Takže MACH proteín a DNA sekvencia, ktorá ho kóduje sa premenovali, ako bude zrejmé z nasledujúceho.

(a) Dvojhybridné prehľadávanie proteínov, ktoré sa viažu na MORT-1, odhalilo nový proteín, ktorý má spoločný sekvenčný motív s MORT-1:

Ako bolo uvedené vyššie bola na identifikáciu proteínov, ktoré sa podieľajú na indukcii bunkovej smrti prostredníctvom MORT-1 použitá dvojhybridná technika na prehľadávanie cDNA knižníc z hľadiska proteínov, ktoré sa viažu na MORT-1. Dvojhybridné prehľadávanie knižnice ľudských B buniek (Dufee et al., 1993) použitím MORT-1 cDNA ako návnady odhalilo cDNA klony samotného MORT-1, čo odráža schopnosť tohto proteínu viazať sa sám na seba, ako aj klony TRADD, na ktorý sa MORT-1 účinne viaže (pozri referenčný príklad 2). Prehľadávanie tiež zachytilo cDNA klony s novou sekvenciou, ktorých produkty sa špecificky viažu na MORT-1. Ukázalo sa, že proteín, ktorý sa najprv nazýval MACH a neskôr, po zistení, že sa náchádza vo viacerých izoformách (pozri nižšie), sa premenoval na ΜΑΟΗβΙ, má tiež schopnosť viazať sa v dvojhybridnom teste sám na seba, ale nie

je schopný viazať sa na FAS-R (pozri vyššie uvedenú spoločne vlastnenú PCT/US96/10521, ktorá je zároveň v konaní, ktorá tiež zahŕňa všetky nasledujúce analýzy a výsledky, ktoré sa nimi získali).

MORT-1 a ΜΑΟΗβΙ a ich delečné konštrukty, ako aj MACHal, MACHal mutant, v ktorom je nahradení katalytický cysteín Cys₃₀₆ serínom Ser (MACHal (C360S)) a vnútrobunkové doména ľudského FAS-R (Fas-IC) sa exprimovali vo vnútri transfekovanej SFY526 kvasinky v konštruktoch obsahujúcich Gal4 DNA viažucu doménu a aktivačnú doménu (pGBT9 a pGAD-GH). Ich interakcie boli stanovené β-galaktozidázovým expresným filtračným testom ako opisuje Boldin et al., (1995b). Výsledky sú prezentované ako čas potrebný na silné vyfarbenie. Žiadny zo skúmaných inzertov neinteragoval so žiadnou z množstva negatívnych kontrol vrátane vnútrobunkových domén ľudského p55 TNF receptora, p75 TNF receptora a CD40, a lamínu, cyklínu D a prázdnych Gal4 vektorov. ΜΑΟΗβΙ bol klonovaný prostredníctvom dvojhybridného prehľadávania knižnice ľudských B buniek s Gal4 AD príveskom (Durfee et al., 1993), kde sa vyhľadávali proteíny, ktoré viažu MORT-1 použitím HF7c kvasinkového reporterového kmeňa. Ak nie je uvedené inak, sú všetky experimentálne postupy pre uvedené zistenia, rovnaké ako bolo opísané vyššie (pozri aj Boldin et al., 1995). Delečné analýzy ukázali, že ΜΑΟΗβΙ sa viaže na N-koncovú časť MORT-1, ktorá sa podieľa na indukcii bunkovej smrti (Chinnaiyan et al., 1995). ΜΑΟΗβΙ sa tiež spájal sám so sebou v transfekovaných kvasinkách. Avšak neviazal sa na niekoľko kontrolných proteínov a na rozdiel od MORT-1 nebol schopný viazať sa na FAS-R. Výsledkom expresie ΜΑΟΗβΙ molekúl v cicavčích bunkách bol 34 kDa proteín, ktorý sa viazal na MORT-1 molekuly, ktoré sa s ním koexprimovali. Bol tiež schopný viazať sa na GST-MORT-1 fúzovaný proteín in vitro.

Porovnanie aminokyselinových sekvencií ΜΑΟΗβΙ a MORT-1 odhalilo spoločný sekvenčný motív (označený ako mort modul) v týchto dvoch proteínoch, ktorý sa líšil od smrtiaceho motívu, prostredníctvom ktorého sa MORT-1 viaže na FAS-R. Tento motív sa nachádza jeden krát v MORT-1 a dva krát v ΜΑΟΗβΙ. Rovnaký motív sa našiel aj v PEA-15, asterocytovom fosfoproteíne s neznámou

funkciou. Predbežné údaje naznačujú, že MORT motív je zahrnutý vo viazaní ΜΑΟΗβΙ (a iných MACH izoforiem) na MORT-1.

Vo vyššie uvedenej PCT/US96/10521 a v korešpondujúcich izraelských prihláškach, hlavne v IL 117932, je prezentovaná odvodená aminokyselinová sekvencia ΜΑΟΗβΙ. Uvedené sú dva MORT moduly a použitie C-konca dvoch ΜΑΟΗβΙ delečných mutantov. Vo vyššie uvedených spoločne vlastnených prihláškach, ktoré sú zároveň v konaní, bola tiež prezentovaná sekvenčná homológia modulov v ΜΑΟΗβΙ, MORT-1 A PEA-15 géne (katalógové číslo X86809), v ktorých boli identické alebo podobné zvyšky označené rámikmi, respektíve tieňovanými oblasťami.

Vo vyššie uvedených spoločne vlastnených prihláškach je tiež uvedené schematické znázornenie smrtiacej domény a MORT modulov a CED3/ICE homologickej oblasti vo Fas/APO1, ΜΑΟΗβΙ a MACHal.

Ukázalo sa, že oblasť MORT-1, ktorá obsahuje MORT modul, sa zúčastňuje na indukcii bunkovej smrti týmto proteínom (pozri referenčný príklad 1, vyššie). Tiež sa ukázalo, že sa podieľa, hoci nie je postačujúca, na vzájomnom spájaní sa MORT-1 (pozri referenčný príklad 1). Analýza väzobných vlastností delečných konštruktov ΜΑΟΗβΙ v transfekovaných kvasinkách odhalila podobné podieľanie sa MORT modulov na vzájomnej asociácii ΜΑΟΗβΙ, ako aj na jeho viazaní sa na MORT-1: Delečné konštrukty, ktorým chýbala oblasť pod (downstream) MORT modulom, neboli schopné viazať sa navzájom, pričom si ešte zachovali schopnosť viazať sa na úplný MORT-1 a úplný ΜΑΟΗβΙ. Výsledkom ďalšieho skrátenia, v ktorom sa deletovali aj časti sekvencie MORT modulu, bola strata väzobnej schopnosti týchto proteínov. Na podrobnejšie stanovenie podielu MORT modulov na týchto interakciách sa v HeLa bunkách exprimovali delečné mutanty ΜΑΟΗβΙ fúzované s FLAG oktapeptidom (FLAG-MACHpi) a stanovila s ich in vitro väzba na bakteriálne vyrobený glutatión-S-transferáza-MORT-1 fúzovaný proteín (GST-MORT-1). Zistilo sa, že podobne ako viazanie pozorované v kvasinkovom dvojhybridnom teste, závisí táto in vitro väzba na interakcii s oblasťou vo vnútri ΜΑΟΗβΙ modulov. V transfekovaných HeLa bunkách boli vyprodukované

³⁵[S]-metabolicky značený MACHpi, ΜΑΟΗβΙ fúzovaný na jeho N-konci na FLAG oktapeptid (FLAG-MACHpi), mutanty FLAG-MACHpi so skrátenými C-koncami, a ako kontrola luciferáza. Expresia sa uskutočnila pomocou tetracyklínom kontrolovaného expresného vektora v HeLa bunkovom klone (HtTA-1), ktorý exprimuje tetracyklínom kontrolovaný transaktivátor.

Stanovenie expresie proteínov a ich molekulových veľkostí sa uskutočnilo imunoprecipitáciou z bunkových lyzátov použitím anti-FLAG protilátky. Protilátky boli použité nasledovne: Králičie anti-ΜΑΟΗβΙ a anti-MORT1 antiséra boli použité proti GST-MACHpi a GST-MORT1 fúzovaným proteínov. Myšie monoklonálne protilátky proti FLAG oktapeptidu (M2) a proti FAS/APO1 (CH11, Yonehara et al., 1989) sa kúpili od Eastman Kodak, respektíve od Oncor (Gaithersburg, MD). Myšia monoklonálna anti-HA epitopová protilátka (12CA5, Field et al., 1988) a anti-TNF protilátka boli vyrobené v našom laboratóriu podľa štandardných postupov známych v oblasti. Výsledky opisujúce afinitné viazanie sa proteínov na GST-MORT-1, ktorý je absorbovaný na glutatión-agarózových guličkách (alebo, ako kontrola na GST alebo GST fúzovaný na vnútrobunkovú doménu Fas-APO1); a imunoprecipitácie rôznych MORT-1 a MACH fúzovaných konštruktov použitím rôznych špecifických protilátok sú prezentované vo vyššie uvedených spoločne vlastnených prihláškach, ktoré sú súčasne v konaní, hlavne v PCT/US96/10521 a IL 117932.

(b) MACH sa vyskytuje vo viacerých izoformách:

Northern analýza použitím ΜΑΟΗβΙ cDNA ako sondy odhalila v niekoľkých odlišných bunkových líniách malý transkript(y) vo veľkom množstve s približnou veľkosťou 3 kb. V stručnosti, uskutočnila sa Northern blot analýza celkovej RNA (14 pg/dráhu) alebo polyA⁺RNA (2 pg) z niekoľkých bunkových línií použitím ΜΑΟΗβΙ cDNA ako sondy. Bunkové línie, ktoré boli skúmané, T47D, CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat a A673, sú všetko bunkové línie ľudského pôvodu a boli odvodené (poradie zachované) od duktálneho karcinómu prsníka, akútnej lymfoblastickej T bunkovej leukémie, Burkittovho lymfómu, Burkittovho lymfómu, epiteloidného karcinómu, ľudského hepatómu, akútnej T bunkovej leukémie,

respektive od rabdomyosarkómu. Dosť difúzny tvar hybridizačného pásu na Northern blotoch naznačil, že tieto transkripty majú heterogénnu veľkosť v rozsahu medzi 2,85 a 3,5 kb. Tak množstvo ako aj veľkosť transkriptov varírovali v rôznych ľudských tkanivách a nekorelovali s expresiou M0RT1 alebo FAS/APO1 (Watanabe et al., 1992). Napríklad v semenníkoch a v kostrových svaloch boli MACH transkripty sotva detegovateľné, napriek tomu, že tieto tkanivá exprimujú významné množstvá M0RT1. Naopak sa zistilo, že zvyšné periférne krvné mononukleárne leukocyty, v ktorých je expresia M0RT1 veľmi nízka, exprimujú MACH vo vysokých hladinách. Výsledkom aktivácie leukocytov je zaznamenateľná zmena vo veľkostnom vzore MACH transkriptov, spolu s indukciou MORT-1.

Pri skúmaní povahy tejto veľkostnej heterogenity boli prehľadávané cDNA knižnice z hľadiska transkriptov, ktoré hybridizujú s ΜΑΟΗβΙ cDNA sondou. MACHal a MACHa2 boli klonované z Charon BS cDNA knižnice odvodenej od mRNA ľudského týmusu. Knižnica bola prehľadávaná v prísnych podmienkach s MACHpl cDNA sondou značenou použitím náhodne-primovacieho kitu (Boehringer Mannheim). Iné MACH izoformy sa klonovali prostredníctvom RT-PCR, ktorá sa uskutočňovala s celkovou RNA z Raji (MACHal, a2, β3 a β4) a Daudi (MACHa2, β2, β3, β4 a β5) ľudských lymfoblastických buniek. Reakcia s reverznou transkriptázou sa uskutočňovala s oligo-dT adapterovým primerom (5'GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)₁₇-3') a SuperScript II reverznou transkriptázou (GIBCO-BRL) použitím inštrukcií výrobcu. Prvé kolo PCR sa uskutočňovalo s Expand Long Template PCR systémom (Boehringer Mannheim) použitím nasledujúcich sense a antisense primerov: 5'-AAGTGAGCAGATCAGAATTGAG-3', ktorý zodpovedá nukleotidom 530 až 551 ΜΑΰΗβΙ cDNA, a 5'GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'. Druhé kolo sa uskutočňovalo s Vent polymerázou (MEB) použitím nasledujúceho sense a antisense primeru: 5'GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC-3' a 5-GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3', odvodených od ΜΑϋΗβΙ cDNA sekvencie. Na potvrdenie faktu, že ΜΑϋΗβ3 a MACHp4 majú iniciačné kodóny bolo klonovaných viacero 5'sekvencií týchto izoforiem z RNA Raji buniek. Po dvoch kolách PCR (s Vent

polymerázou (NEB)) nasledovala RT-PCR reakcia uskutočňovaná použitím oligo-dT adaptérového primeru ako bol opísaný vyššie, pričom sa použili nasledujúci sense a antisense oligonukleotidy: 5'-TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3' a 5'-ATTCTCAAACCCTGC-ATCCAAGTG-3', odvodené od sekvencie MACHpl. Antisense oligonukleotid je špecifický pre β-izoformy. Z tých klonov, ktoré boli získané týmto spôsobom, sa tie klony, o ktorých sa zistilo, že obsahujú nukleotidy kódujúce aminokyseliny bloku 2 (prítomnosť tohto bloku odlišuje ΜΑΟΗβ3 a MACH β4 od MACH β1 a MACH β2) úplne sekvenovali. Nukleotidové sekvencie vo všetkých týchto klonovaných izoformách boli determinované z oboch smerov dideoxy-reťazovou terminačnou metódou. Získali sa len klony parciálnej cDNA MACHa3 a ΜΑΟΗβ2. Toto prehľadávanie odhalilo viacnásobnú existenciu MACH. Podrobne bolo študovaných sedem z týchto izoforiem. Výsledky sú graficky ilustrované a spríkladované vo vyššie uvedených spoločne vlastnených prihláškach, ktoré sú zároveň v konaní, najme v PCT/US96/10521 a IL 117932, kde sú aminokyselinové sekvencie troch izoforiem porovnané so známymi homológmi.

Chýbanie 65 nukleotidov, ktoré v MACHal kódujú blok 2 spôsobuje zmenu čítacieho rámca nukleotidov, ktoré kódujú blok 3 v ΜΑΰΗβΙ a v MAC^2. Takže v týchto izoformách tieto nukleotidy kódujú iné aminokyseliny, ktoré spolu tvoria unikátnu C-koncovú oblasť. Na druhej strane ostáva v MACHP3 a v MACHp4 čítací rámec bloku 3 zachovaný, ale chýbajú tu nukleotidy, ktoré kódujú CED3/ICE oblasť a časť 3'nekódujúcej oblasti, čoho výsledkom je zmena čítacieho rámca nukleotidov ďalej downstream. Kvôli tejto zmene kóduje väčšina 5' časti tejto nekódujúcej downstream oblasti 10 aminokyselín, ktoré tvoria C-koncovú oblasť, ktorá je unikátna pre tieto dve izoformy.

Izoformy boli klonované z cDNA knižnice ľudských B buniek (MACHpl), z cDNA knižnice ľudského týmusu (MACHal a a2) a z mRNA ľudských lymfoblastických buniek Raji (MACH2a1, a2, cc3, β3, β4 a β5) a Daudi (MACHa2, β2, β3, β4 a β5). Klonovanie mRNA z Raji a Daudi buniek sa uskutočnilo prostredníctvom RT-PCR použitím oligonukleotidov korešpondujúcich s 3'nekódujúcou oblasťou a so sekvenciou vo vnútri druhého MORT modulu v

ΜΑΟΗβΙ. Takže štartovací kodón klonov izolovaných týmto spôsobom je lokalizovaný vo vnútri MORT modulu.

Sekvencie v rôznych izoformách sú navzájom príbuzné ako nasleduje: (a) Všetky MACH izoformy zdieľajú spoločnú 182-aminokyselinovú N-koncovú oblasť, ktorá zahŕňa MORT moduly, ale líšia sa v karboxy koncoch (3'downstream) pod týmito modulmi, ako aj v ich nekódujúcich oblastiach, (b) Na základe ich Ckoncových sekvencii sa izoformy rozdeľujú so dvoch podskupín: štyri izoformy definované ako podskupina β majú rôzne C-konce kvôli zmene v čítacom rámci. Dve (ΜΑΟΗβΙ a β2) zdieľajú C-koniec, čo bolo zistené pri prvom klonovaní izoforiem pri dvojhybridnom prehľadávaní a dve (ΜΑΟΗβ3 a β4) majú rozdielne Ckonce; tri izoformy, definované ako podskupina a, majú oveľa dlhšiu C-koncovú oblasť, ktorá sa veľmi podobá na proteázy CED3/ICE rodiny (pozri nižšie); (c) Oblasti nachádzajúce sa medzi oblasťou MORT modulu a C koncovou oblasťou, ktoré definujú podskupiny, varírujú v rámci jednotlivých izoforiem. Avšak podrobný prieskum ukázal, že tieto medzioblasti pozostávajú z rôznych kombinácii sekvenčných blokov troch rovnakých aminokyselín (bloky 1, 2 a 3). Rozdiely aminokyselinovej sekvencie v rámci rôznych klonov odrážajú dva typy variácií v nukleotidovej sekvencii, ktoré najpravdepodobnejšie nastávajú pri alternatívnom zostrihu: (a) inzerciu alebo neprítomnosť buď dvoch nukleotidových sekvencii, z ktorých jedna má 45 nukleotidov (nts) a druhá 65 nts, alebo oboch nižšie uvedených nukleotidov kódujúcich Lys184; (b) prítomnosť ďalšieho inzertu vo vnútri oblasti, ktorá v ΜΑΟΗβΙ tvorí 3' nekódujúcu časť. Tieto variácie ovplyvňujú tak čítací rámec, ako aj dĺžku proteínu.

Časť MACH izoforiem zahŕňa CED3/ICE homológ. Prieskum databázy odhalil, že C-koncová oblasť MACHa izoforiem obsahujúca blok 3 a sekvenciu za týmto blokom, je veľmi podobná proteázam CED3/ICE rodiny. Uskutočnilo sa porovnanie sekvencie tejto oblasti v MACH a sekvencie rôznych známych ľudských členov tejto rodiny ako aj sekvencie Caenorhabditis elegans ced3 proteínu (Ellis a Horvitz, 1986; Yuan et al., 1993) a porovnanie so sekvenciou známych ľudských proteáz CED3/ICE proteázovej rodiny: CPP32 (Fernandes-Alnemri et al., 1994), tiež

nazývaný apopaín (Nicholson et al., 1995) a Yama (Tewari et al., 1995b), Mch2a (Fernandes-Alnemri et al., 1995), lch-1 (Wang et al., 1994; ľudský homológ myšieho Nedd2 proteinu, Kumar et al., 1994), ICE_re,ll (Mumday et al., 1995) tiež nazývaný TX a Ich2 (Faucheu et al., 1995; Kamens et al., 1995), a ICE (Thornberry et al., 1992; Cerretti et al., 1992).

Vyššie uvedená C-koncová oblasť MACH sa najviac podobá s CPP32 (so 41% zhodnosťou a 62% homológiou) a s CED3 (s 34 % zhodnosťou a 56% homológiou). Je signifikantne menej podobná s ICE (s 28 % zhodnosťou a 50 % homológiou) a s jej veľmi príbuzným homológmi ICE_re,lI (tiež nazývaným TX a Ich2) a ICE_re|lll. Homológia bola pozorovaná v rámci skoro celej oblasti začínajúcej od Tyr226 vo vnútri bloku 3 až po C-koniec MACHa izoforiem.

Najpozoruhodnejšie sú dva body podobnosti:

(a) Všetky známe proteázy CED3/ICE rodiny štiepia proteiny v miestach, ktoré sú definované výskytom Asp v P1 polohe a malého hydrofóbneho aminokyselinového zvyšku v polohe ΡΓ. Čo sa týka iných štrukturálnych znakov substrátu, vrátane povahy zvyškov v polohách P2 až P4, ich špecificita sa líši. Z toho vyplýva, že zvyšky aktívneho miesta zahrnuté v katalýze (zodpovedajúce His237, Gly238 a Cys285 v ICE) a vo väzobnej oblasti pre karboxylový bočný reťazec P1 Asp (Arg179, Gln283, Arg341 a pravdepodobne aj ser347) sú v rámci proteáz konzervatívne. Tieto zvyšky sú tiež konzervatívne v MACHal. Existuje jedna výnimka v konzervatívnej zmene Ser na Thr v mieste korešpondujúcom so Ser347 ICE. Iným miernym, ešte potencionálne dôležitým sekvenčným rozdielom medzi MACHa izoformami a inými členmi proteázovej rodiny je zámena Arg za Gin v zvyšku zodpovedajúcom Arg286 v ICE. Tento zvyšok, ktorý je priľahlý k pravdepodobnému katalytickému cysteínovému zvyšku, je úplne konzervovaný u všetkých iných členoch CED3/ICE rodiny. Tiež časť zvyškov v miestach lokalizovaných blízko substrátových P2-P4 zvyškov sa líši v MACHa izoformách od zvyškov nájdených v iných členoch CED3/ICE rodiny.

(b) Proteázy CED3/ICE rodiny obsahujú miesta pre autoštiepenie. Je známych niekoľko proteáz, ktoré v skutočnosti spracovávajú samé seba a

vykázanie ich maximálnej katalytickej aktivity je závislé na tomto spracovaní. Ich plne bioaktívna forma je zložená z dvoch nekovalente spojených produktov štiepenia, ktoré sa líšia vo veľkosti (p20 a p17 v ICE; p17 a p12 v CPP32). Prítomnosť potencionálnych miest pre autoštiepenie v iných členoch rodiny naznačuje, že môžu byť podrobené podobnému spracovaniu, a že uskutočnenie ich maximálnej aktivity môže podobne závisieť na tomto spracovaní. Takéto potencionálne miesta pre autoštiepenie sa v MACHal nachádzajú skoro v rovnakých polohách ako v CPP32. Miesto korešpondujúce s N-koncom p17 podjednotky CPP32 je umiestnené v druhom konzervatívnom bloku aminokyselín, len niekoľko aminokyselín pred N-koncom CED3/ICE homologickej oblasti (pod Asp216). Miesto korešpondujúce s bodom štiepenia medzi dvoma podjednotkami CPP32 je umiestnené, ako aj vo všetkých iných členoch CED3/ICE rodiny, o ktorých je známe, že majú byť štiepené, niekoľko aminokyselín pod katalytickým cysteínovým zvyškom (pod Asp374). Táto konzervatívnosť naznačuje, že CED3/ICE homologická oblasť v MACHal sa podrobuje proteolytickému spracovaniu. Veľkosť dvoch očakávaných produktov tohto štiepenia je veľmi blízka veľkosti dvoch podjednotiek spracovanej CPP32 molekuly.

(c) CED3/ICE homologická oblasť v MACH má proteolytickú aktivitu

Aby sa zistilo, či CED3/ICE homologická oblasť v MACHa má proteolytickú aktivitu, prihlasovatelia exprimovali oblasť, ktorá sa nachádza od potencionálneho štiepiaceho miesta smerom hore od tejto oblasti, medzi Asp216 a Ser217, po Ckoniec proteínu v baktérii, ako GST fúzovaný proteín. Bakteriálne lyzáty sa skúmali z hľadiska ich schopnosti štiepiť fluorogénne peptidové substráty, pre ktoré bolo dokázané, že sú štiepené inými CED3/ICE homológmi. Boli použité dva substrátové peptidy: Prvý acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metyl-kumaryl-7-amid) (AC-DEVD-AMC), korešponduje so sekvenciou v poly(ADP-ribóza)polymeráze (PARP), čo je jadrový proteín, o ktorom sa zistilo, že štiepi v bunkách krátko po FAS-R stimulácii (Tewari et al., 1995b), ako aj v iných apoptických procesoch (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994). Tento fluorogénny substrát je účinne štiepený

CPP32. Druhý fluorogénny substrát, acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC (Ac-YVAD-AMC), zodpovedá substrátovému miestu pre ICE v IL-1 β prekurzora. Tento fluorogénny substrát je štiepený prostredníctvom ICE. Lyzáty baktérií exprimujúcich CED3/ICE homologickú oblasť v MACHal účinne štiepia fluorogénny substrát odvodený od PARP sekvencie. Avšak nemajú žiadnu merateľnú proteolytickú aktivitu pri fluorogénnom substráte (kontroly) odvodenom od sekvencie IL-1 β-prekurzora, AcYVAD-AMC, čo je ICE štiepiace miesto v IL-1 β prekurzora (Thornberry et al., 1992). Proteolytická aktivita bola blokovaná kyselinou jódoctovou (5 mM), čo potvrdilo, že je sprostredkovaná tiolovou proteázou. Žiadne štiepenie nebolo pozorované s lyzátmi obsahujúcimi GST-fúzovanú MACH CED3/ICE homologickú oblasť, v ktorej bol katalytický cysteínový zvyšok Cys₃₆₀ nahradený Ser. Aj lyzáty z baktérií, ktoré exprimovali úplný MACHal proteín ako GST-fúzovaný proteín, neštiepili Ac-DEVDAMC, pravdepodobne kvôli neprítomnosti bakteriálnych enzýmov schopných spracovať úplnú molekulu. Štiepenie nenastalo ani lyzátmi obsahujúcimi niektorý z dvoch potencionálnych štiepnych produktov CED3/ICE homologickej oblasti.

Zistila sa kinetika štiepenia fluorogénneho substrátu odvodeného od PARP sekvencie, Ac-DEVD-AMC (50 μΜ), extraktami E. coli exprimujúcimi GST-fúzovaný proteín CED3/ICE homologickej oblasti v MACHal (Ser217 až C-koniec proteínu), pričom k štiepeniu nedochádzalo prostredníctvom extraktov baktérií exprimujúcich GST-fúzované proteíny s úplnou dĺžkou MACHal molekuly alebo buď jednou alebo dvoma potencionálnymi proteolytickými produktmi CED3/ICE homologickej oblasti (Ser217 až Asp374 a Asp374 až C-koniec proteínu).

Ďalej, zistila sa závislosť štiepenia na koncentrácii substrátu pri štiepení AcDEVD-AMC inkubáciou počas 180 minút s extraktami exprimujúcimi MACHal CED3/ICE homologickú oblasť fúzovanú s GST. Nepozorovalo sa žiadne štiepenie v prítomnosti jodooctovej kyseliny (5 mM). Extrakty nemajú žiadnu aktivitu na AcYVAD-AMC, fluorogénnom substráte korešpondujúcom so substrátovým miestom pre ICE v IL-1 β prekurzora.

V stručnosti, produkovali sa GST-fúzované proteíny v XL1-blue baktériách použitím pGEX3 expresného vektora. Baktérie sa lyžovali sonifikáciou v tlmivom

roztoku obsahujúcom 25 mM HEPES (pH 7,5), 0,1% 3-[3-(cholamido-propyl)dimetylamino]-1-propánsulfonát, 5 mM EDTA a 2 mM DDT, a následne boli centrifugované pri 16 000 x g počas 10 minút. SDS-PAGE analýza potvrdila prítomnosť podobných hladín rôznych fúzovaných proteínov v lyzátoch. 50 μΙ alikvoty extraktov (4 mg/ml celkového proteínu) sa inkubovalo pri laboratórnej teplote počas určenej periódy v reakčných zmesiach v celkovom množstve 500 μΙ s fluorogénnym substrátom v určených koncentráciách. Spektro-fluorometricky pri excitačnej vlnovej dĺžke 380 nm a emisnej vlnovej dĺžke 460 nm sa meralo vylučovanie AMC. Oba fluorogénne substráty boli získané od Peptid Inštitúte Inc. (Osaka, Japan). Ukázalo sa, že iné CED3/ICE proteázy sú úplne aktívne len po proteolytickom spracovaní, ktoré nastáva buď vlastným štiepením, alebo prostredníctvom štiepenia inými proteázami (zhrnuté v Kumar, 1995; Henkart, 1996). Pozorovanie prihlasovateľov, že lyzáty baktérií, ktoré exprimujú GSTMACHal molekuly, nemajú enzymatickú aktivitu, oproti aktivite pozorovanej v lyzátoch baktérií, ktoré exprimujú CED3/ICE homologickú oblasť, naznačuje, že spracovanie je tiež nevyhnutné pre aktivitu MACHa. Spôsob akým nastáva spracovanie MACHa v cicavčích bunkách, a ako je toto spracovanie ovplyvnené prostredníctvom FAS-R alebo p55-R spustenia nie je známy. Ukázalo sa, že MORT-1 sa viaže v bunkách na aktivovaný FAS-R spolu s niektorými inými proteínmi (Kischkel et al., 1995). Tieto proteíny pravdepodobne zahŕňajú MACHal a iné MACH izoformy. Zdá sa byť možným, že viazanie MORT-1 spolu s MACHa na FAS-R spája dohromady niekoľko MACH molekúl, alebo v nich indukuje konformačné zmeny, a že tieto zmeny buď spúšťajú autolytické spracovanie MACHa alebo robia MACHa prístupným pre štiepenie inými proteázami. Podobným, hoci menej priamym spôsobom, môže stimulácia p55-R spustiť vlastné spracovanie MACHa prostredníctvom viazania niekoľkých TRADD molekúl dohromady alebo indukovaním ich konformačných zmien, čo spätne indukuje zmenu vo formácii alebo stave alebo agregácii MORT-1 a jeho asociovaných MACH molekúl.

Substrátová špecificita MACHa sa zdá byť dosť smrtiaco orientovaná. Hoci mohol štiepiť substrátový peptid korešpondujúci so štiepiacim miestom v smrtiacom substráte PARP (Ac-DEVD-AMC), nevykazoval MACHa žiadnu proteolytickú aktivitu smerom k peptidu korešpondujúcemu s miestom spracovania IL-Ιβ prekurzora prostredníctvom ICE (Ac-YVAD-AMC). Identifikácia bunkových proteínov, ktoré slúžia ako substráty pre štiepenie prostredníctvom MACHa objasní viacero nasledujúcich javov v indukcii smrti touto proteázou. Pravdepodobnými substrátmi pre MACHa štiepenie sú iné člene CED3/ICE rodiny, ako CPP32 a ICE. Niektoré z týchto proteáz sú naozaj spracovávané po FAS-R alebo TNF receptorovom spustení (Miura et al., 1995; Schlegel et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996). Je možné, že aj proteázy, ktoré nepatria do CED3/ICE rodiny, sú aktivované prostredníctvom MACHa, buď priamo alebo prostredníctvom aktivity iných CED3/ICE proteáz. Podieľanie sa mnohých proteáz na procesoch bunkovej smrti je v súlade s publikovanou schopnosťou inhibítorov rôznych proteáz, vrátane inhibítorov serínových proteáz a inhibítora ICE štiepenia ako aj antisense ICE cDNA, chrániť bunky od FAS-R a TNF receptorom-indukovanej toxicity (Weitzen a Granger, 1980; Ruggiero et al., 1987; Enari et al., 1995; Los et al., 1995).

Rôzne iné enzýmy, vrátane fosfolipáz, sfingomyelináz a proteín kináz, môžu participovať na indukcii bunkovej smrti prostredníctvom TNF receptorov a FAS-R (pozri Eischen et al., 1994; Vandenabeele et al., 1995; Cifone et al., 1995 a citácie v nich uvedené). Niektoré z týchto enzýmov sa môžu aktivovať proteolytickým štiepením iniciovaným prostredníctvom MACHa. Avšak tiež sa zdá možným, že aspoň časť týchto iných aktivít týkajúcich sa smrti, je stimulovaná odlišnými signalizačnými cestami, nezávisle na MACHa stimulácii. Zahrnutie viac ako jednej signalizačnej kaskády pri indukcii bunkovej smrti, niektorých, ktoré sú bežné pre p55-R a FAS/APO1 a niektorých indukovaných len jedným z nich, by mohli byť v súlade s opisom tak spoločných, ako aj rozličných znakov procesov bunkovej smrti, ktoré sú indukované receptormi (Grell et al., 1994; Schulze-Osthoff et al., 1994; Wong a Goeddel, 1994; Clement a Stamenkovic, 1994).

(d) MACHal sa viaže na M0RT1, ako aj na MACHpi:

Aby sa zistilo, či sa MACHal môže viazať, tak ako MACHpl, skúmala sa najprv interakcia proteínov vo vnútri transfekovaných kvasiniek. Zistilo sa, že MACHal má signifikantný cytotoxický účinok na tieto kvasinky. Tento účinok sa manifestoval značným poklesom výťažku kolónií v kvasinkách, ktoré exprimovali proteín vo vektore (AD) s aktivačnou doménou (ktorých hladina expresie je vyššia ako hladina vektora (DBD) s DNA viažucou doménou). Na druhej strane, MACHpi, v ktorom bol zvyšok katalytického cysteínu Cys₃₆₀ nahradený serínom Ser (MACHal (C360S), nebol cytotoxický ani pre cicavčie bunky (pozri nižšie), ani pre kvasinky. Podobne ako MACHp'’, MACHal (C360S) sa viazal v transfekovaných kvasinkách na MORT-1 a tiež navzájom. Viazal sa aj na ΜΑΟΗβΙ. Aj kvasinky exprimujúce divý typ MACHal spolu s MORT-1 alebo ΜΑΟΗβΙ vykazovali interakciu transfekovaných proteínov. Avšak intenzita lacZ-produktovej farby sa menila medzi kvasinkovými kolóniami; v kvasinkách, ktoré boli transfekované s MACHal, tak v AD, ako aj v DBD vektore, nebol pozorovaný žiadny produkt, pravdepodobne kvôli cytotoxickému účinku divého typu MACHal. Napriek týmto odchýlkam, kvasinky exprimujúce MACHal buď v kombinácii s M0RT1 alebo v kombinácii s ΜΑΟΗβΙ boli jasne pozitívne z hľadiska interakcie transfekovaných proteínov. Na rozdiel od ΜΑΟΗβΙ, MACHal nevykazoval v dvojhybridnom teste interakciu so samým sebou.

Koprecipitácia tak MACHal (C360S) ako aj ΜΑΟΗβΙ s MORT-1 z lyzátov ľudských embryonálnych obličkových 293-EBNA buniek, indikovala, že sa viažu na MORT-1 aj v cicavčích bunkách. Ďalej, aby sa otestovalo, či sa MACHal môže viazať na M0RT1 aj v cicavčích bunkách, exprimovali sa MACHal alebo ΜΑΟΗβΙ fúzované s FLAG oktapeptidom spolu s M0RT1 molekulami s HA epitopovým príveskom. V HeLa bunkách sa exprimovali ³⁵[S] metabolický značené MACHal a ΜΑΟΗβΙ fúzované na ich N-konci s FLAG oktapeptidom (FLAG-MACHa1 a β1) a MORT1 fúzovaný na jeho N-konci na HA epitop (Field et al., 1988). Imunoprecipitácia proteínov z lyzátov buniek sa uskutočnila použitím myších monoklonálnych protilátok proti FLAG oktapeptidu (M2; Eastman Kodak), HA

epitopu (12CA5, Field et al., 1988) alebo proti p75 TNF receptoru (č.9, Bigda et al.,

1994) ako kontrola. Proteíny sa analyzovali prostredníctvom SDS-polyakrylamidovej gólovej elektroforézy (12% akrylamid), a následne boli podrobené autoradiografii. Koprecipitácia tak MACHa, ako aj ΜΑΟΗβΙ s M0RT1 z lyzátov buniek naznačuje, že sa viažu na M0RT1. Zistilo sa, že účinnosť interakcie MACHal s M0RT1 je nižšia ako účinnosť ΜΑΟΗβΙ.

V stručnosti, 293-EBNA bunky, MCF7 ľudské bunky karcinómu prsníka a HeLa HtTA-1 bunky rástli na Dulbecom modifikovanom Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu doplnenom s 10 % fetálnym hovädzím sérom, neesenciálnymi aminokyselinami, 100 U/ml penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu. Platne s bunkovými tkanivovými kultúrami (5 x 10⁵ 293-EBNA buniek, 3 x 10⁵ MCF7 buniek alebo 3 x 10⁵ HeLa buniek na 6 cm platniach) sa prechodne transfekovali použitím precipitačnej metódy s fosforečnanom vápenatým, s cDNA uvedených proteínov spolu s β-galaktozidázovým expresným vektorom. V jednej sade experimentov sa každá platňa transfekovala s 3,5 pg MACH konštruktu a 1,5 pg pSV-p-gal; a v druhej sade experimentov sa každá platňa transfekovala s 2,5 pg uvedeného MACH alebo MORT1 konštruktu (alebo ako kontrola s prázdnym vektorom) a s 1,5 pg pSV-p-gal. 6 až 10 hodín po transfekcii sa bunky premyli. HeLa bunky sa inkubovali 26 hodín po transfekcii a potom 5 hodín v prítomnosti buď anti-Fas.APO1 protilátky (CH11, 0,5 pg/ml) alebo TNF (100 ng/ml) spolu s cykloheximidom (10 pg/ml). Rozsah bunkovej smrti sa na konci inkubačnej doby stanovil determináciou expresie β-galaktozidázy, ako opisuje Kumar et al., 1994.

Kultúry transfekované expresným vektorom, nesúcim buď MACHal alebo MACHa2, vykazovali značnú bunkovú smrť, manifestovanú zaguľatením buniek, bublinkovaním, kontrakciou a nakoniec oddelením sa buniek od platne. 20 hodín po transfekcie vykazovala väčšina transfekovaných buniek, ktoré boli identifikované βgalaktozidázovým farbením (X-Gal), kondenzovanú morfológiu typickú pre apoptózu. Naproti tomu, bunky exprimujúce prázdny vektor zostávali životaschopné.

Aby sa preskúmal podiel CED3/ICE homologickej oblasti vo vnútri MACHa izoforiem na ich apoptických účinkoch, transfekovali sa bunky s expresnými vektormi pre MACHpl izoformu, ktorej chýbala oblasť CED3/ICE homológie, ako aj expresnými vektormi pre MACHal (C360S) a pre mutant so skráteným C-koncom, MACHal (MACHal (1-415), ktorému chýba jeden zo zvyškov, ktorý sa považuje za kritický pre CED3/ICE proteázovú funkciu (korešponduje so Ser₃₄₇ v ICE). Nenastala žiadna smrť (okrem malého množstva pozorovaného v bunkách transfekovaných prázdnym vektorom) v 293-EBNA alebo v MCF7 bunkách transfekovaných expresnými vektormi nesúcimi MACHa3, MACHa1(1-415) alebo MACHal (C360s). Navyše bunky transfekované s MACHal spolu s týmito vektormi tiež vykazovali len veľmi malú bunkovú smrť, čo naznačovalo, že MACH molekuly, ktoré obsahujú nekompletnú CED3/ICE oblasť majú negatívny dominantný účinok na aktivitu divého typu molekúl. Kultúry exprimujúce MACHpi, ktorý neobsahoval vôbec CED3/ICE homologickú oblasť, vykazovali určitú miernu bunkovú smrť. Tento účinok MACHpi, ktorý je najpravdepodobnejšie výsledkom aktivácie endogénnych MACHal molekúl, sa z nejakého dôvodu viac objavoval v transfekovaných HeLa bunkách. Navyše, v HeLa bunkách boli MACHa3, MACHal (1-415) a MACHal (C360S) aj trochu cytotoxické.

Zdá sa, že MACHa aktivita tvorí najvrchnejší krok v kaskáde signalizácie pre cytocídne účinky FAS/APO1 a p55-R. Schopnosť MAC^1 viazať sa tak na MORT1, ako aj na MACHal naznačuje, že táto izoforma zosilňuje aktivitu enzymaticky aktívnych izoforiem. Je možné, že niektoré z MACH izoforiem majú ďalšie funkcie. Mierna cytotoxicita pozorovaná v 293-EBNA a MCF7 kultúrach transfekovaných touto izoformou a dosť významný cytotoxický účinok, ktorý vykonáva v HeLa bunkách, pravdepodobne odzrkadľuje aktiváciu endogénne exprimovaných MACHa molekúl prostredníctvom viazania sa na transfekované MACHpi molekuly. Prípadne by mohli niektoré z MACH izoforiem účinkovať aj ako ukotvovacie miesta pre molekuly, ktoré sú zahrnuté v iných, necytotoxických účinkoch FAS/APO1 a TNF receptorov.

(f) Blokovanie MACHa funkcie interferuje s indukciou bunkovej smrti prostredníctvom Fas/APO1 a p55-R

Aby sa stanovil podiel MACHa na Fas/APO1 a p55-R cytotoxicite, exprimovali sa MACHa3, ako aj nefunkčné MACHal mutanty, MACHa1(1-415) a MACHa(C360S), v bunkách, ktoré boli indukované na vykázanie tejto cytotoxicity. p55-R-indukovaná cytotoxicita sa spustila v 293-EBNA bunkách prechodnou nadexpresiou tohto receptora (Boldin et al., 1995a), a Fas/AP01 cytotoxicita prostredníctvom nadexpresie uhimerických molekúl pozostávajúcich z extracelulárnej domény p55-R a ťansmembránovej a vnútrobunkovej domény Fas/APO1. Cytotoxické aktivity v HeLa bunkách boli tiež indukované ich ošetrením s TNF alebo anti-Fas/APO1 protilátkou v prítomnosti blokátora proteínovej syntézy cykloheximidu. HeLa bunky boli upravené tak, aby boli citlivé na Fas/APO1, prechodnou expresiou tohoto receptora. Vo všetkých skúmaných systémoch poskytovali MACHa3 a nefunkčné mutanty MACHal účinnú ochranu proti cytotoxicite indukovanej prostredr ctvom spustenia Fas/APO1 alebo p55-R. Takáto ochrana bola tiež pozorovaná, so bolo ’redtým publikované (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), v bunkách s MORT-1 N-koncovým delečným mutantom, ktorému chýbala MACH-viažuca oblasť (M0RT1 (92-208)). Tieto účinky proteínov naznačujú, že MACHa je nevyhnutnou zložkou tak Fas/APO1-, ako aj p55-Rindukovaných signalizačných kaskád pre bunkovú smrť.

MACH sa exprimuje v rôznych tkanivách v značne rozličných hladinách a zjavne aj v rozličných izotypových vzoroch. Tieto rozdiely sa pravdepodobne podieľajú na tkanivovo špecifických znakoch odpovede na FAS/APO1 ligand a TNF. Tak ako v prípade iných CED3/ICE homológov (Wang et al., 1994; Alnemri et al.,

1995), zistilo sa, že MACH izoformy, ktoré obsahujú nekompletné CED3/ICE oblasti (napr. MACHa3), inhibujú aktivity koexprimovaných MACHal alebo MACHa2 molekúl; tiež sa zistilo, že blokujú indukciu bunkovej smrti sprostredkovanú FAS/APO1 a p55-R. Expresia takýchto inhibičných izoforiem v bunkách môže predstavovať mechanizmus bunkovej vlastnej ochrany proti FAS/APO1- a TNFsprostredkovanej cytotoxicite. Široká heterogenita MACH izoforiem, ktorá vysoko prekračuje heterogenitu pozorovanú pri akýchkoľvek iných proteázach CED3/ICE rodiny, by mala umožniť veľmi jemné ladenie funkcie aktívnych MACH izoforiem.

Príklad 1

Klonovanie a izolácia G1 proteínu, ktorý sa viaže na MORT-1-viažuci proteín Mch4

(i) Dvojhybridné prehľadávanie a dvojhybridný β-galaktozidázový expresný test

Použitím postupov uvedených vyššie v referenčných príkladoch 1 až 3, izoloval sa nový proteín označený ako G1, ktorý je zjavne homologický s, a teda možno je členom rodiny ICE-podobných proteáz. G1 proteín obsahuje dva moduly homologické s MORT modulmi, konkrétne s homológiou k MORT-1 N-koncovej časti, MORT moduly MACH proteínov (pozri vyššie uvedené referenčné príklady 13 a Boldin et al., 1996) a MORT moduly iného príbuzného MORT-1-viažuceho proteínu Mch4 (pozri Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996). Ďalej má G1 enzymatickú (proteáze podobnú) oblasť, ktorá je homologická s enzymatickými (proteázovými) oblasťami proteáza CED3/ICE rodiny (napríklad proteázovými oblasťami MACH proteínov a Mch4, a iných).

V stručnosti, kloň proteínu G1 (kloň G1) sa získal nasledujúcim dvojhybridným prehľadávaním cDNA knižnice ľudských Jurkat T buniek použitím proteínu Mch4 ako návnady. Použila sa cDNA knižnica ľudských Jurkat T buniek s napojeným príveskom Gal4 aktivačnej domény, a prehľadávanie sa uskutočňovalo použitím HF7c kvasinkového reporterového kmeňa (Clontech, Palo Alto, Ca.) bez prítomnosti 3-aminotriazolu v súlade s Matchmaker™ dvojhybridným systémovým protokolom (Clontech). Mch4 sekvencia bola získaná z EMBL databázy. Použitím takto získanej sekvencie boli navrhnuté prostredníctvom OLIGO™ softweru PCR primery a DNA fragment zodpovedajúci kódujúcej časti Mch4 sa získal PCR s reverznou transkriptázou (RT-PCR) z celkovej RNA získanej (štandardnými metódami) z primárnych ľudských endoteliálnych buniek z pupočnej cievy. Táto kódujúca časť Mch4 sa potom klonovala do pGAD-GH vektora (Clontech) a použila sa ako návnada, ako bolo uvedené vyššie, v dvojhybridnom prehľadávacom postupe. Týmto dvojhybridným prehľadávaním sa získalo 11 klonov, všetko

kódujúcich proteín, ktorý bol zjavne zostrihovým variantom proteínu kódujúceho dva motívy homológie s MORT-1. Analýza predbežnej čiastočnej sekvencie G1 a sekvencii v sbest databáze a v ľudskej genomickej databáze na úrovni 1 umožnila získanie množstva exprimovaných sekvenčných príveskov (est) obsahujúcich časti sekvencie klonu G1. Sekvenčná analýza týchto est odhalila, že existuje možnosť množstva zostrihových variantov proteínu G1, ktorý obsahuje sekvenčný rozsah kódujúci proteínový motív, ktorý je homologický s ICE-podobnými proteázami, a že tento sekvenčný rozsah je lokalizovaný smerom 3' od G1 sekvencie získanej dvojhybridným prehľadávaním.

Aby sa získala úplná sekvencia izoformy G1, ktorá obsahuje proteáze podobnú enzymatickú oblasť, uskutočnila sa reverzná transkripčná reakcia na celkovej RNA získanej z rôznych bunkových línií použitím oligonukleotidu obsahujúceho sekvenciu s rozsahom 15dT a adaptorovú sekvenciu ako primer, na získanie cDNA molekúl. Tieto cDNA molekuly boli potom použité ako templáty v PCR reakcii, v ktorej boli PCR primery navrhnuté a syntetizované vo forme oligonukleotidov majúcich sekvenciu získanú z 5'nekódujúcej časti G1 a adaptorovú sekvenciu, pričom tieto primery boli použité v prvom kole PCR reakcie. Následne, v druhom kole vyššie uvedenej PCR reakcie, boli použité ďalšie oligonukleotidové primery, ktoré mali sekvenciu z 5'kódujúcej časti G1, vrátane iniciátora ATG, ako aj adaptorovej sekvencie. Týmto spôsobom je možné získať úplnú sekvenciu zjavného zostrihového variantu G1 proteínu, ktorý obsahuje enzymatickú (proteáze podobnú) oblasť. Táto predstavuje len jednu z predpokladaných G1 izoforiem.

Predbežná sekvencia jednej takejto G1 izoformy, G1 zostrihový variant, je znázornený na obrázku 1, na ktorom horná sekvencia je nukleotidová sekvencia a dolná sekvencia je odvodená aminokyselinová sekvencia ORF začínajúceho od ATG (nukleotid č. 482) a končiaceho na TAA (nukleotid 1921), pričom tento štartovací a terminačný nukleotid sú v nukleotidovej sekvencii označené hviezdičkou (*). G1 zostrihový variant na obrázku 1 bol predbežne označený aj ako G1a.

Na obrázku 2 je schematicky znázornená predbežná sekvencia inej G1 izoformy, krátkeho G1 zostrihového variantu, ktorý má MORT MODULY, predbežne

- 100 -

označený ako G1p, v ktorom je horná sekvencia nukleotidová sekvencia a dolná sekvencia je odvodená aminokyselinová sekvencia ORF začínajúceho nukleotidom

č. 482 (ATG) a končiaceho na nukleotide č. 1145 (TGA), pričom štartovací a terminačný kodón sú v nukleotidovej sekvencií označené hviezdičkami (*).

Navyše treba poznamenať, že pôvodne izolovaný G1 kloň získaný použitím Mch4 sekvencie ako návnady bol aspoň časťou krátkeho zostrihového variantu G1, nazývaného G1p (pozri obrázok 2). Tento pôvodne izolovaný G1 kloň bol čiastočným klonom novej cDNA, ktorá podobne ako MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) obsahuje dva motívy smrtiacej domény/mort moduly (alebo smrtiace efektorové domény - DED), hneď smerom dolu od jeho N-konca (pozri aj obrázok 3). Použitím tohto pôvodného kloň u bolo potom možné izolovať a charakterizovať cDNA klony väčšieho zostrihového variantu G1a a kratšieho zostrihového variantu Gip. Väčší zostrihový variant mal C-koncovú oblasť s homológiou k proteázovej oblasti kaspáz, a teda je pravdepodobne novým členom kaspázovej rodiny. Ako taký bol G1 označený ako CASH z kaspázový homológ. Uskutočnilo sa porovnanie G1a (CASHa) a Gip (CASHp) sekvencií (podrobnosti, hlavne izoláciu myšej G1 sekvencie pozri nižšie a vyššie v prehľad obrázkov na výkresoch ku obrázku 3). Výsledky tohto porovnania sú schematicky uvedené na obrázku 3, všetky podrobnosti, najmä kľúč k uvedeným sekvenciám na tomto obrázku sú uvedené vyššie v stručnom prehľade obrázkov na výkresoch.

Po vyššie opísanom počiatočnom klonovaní a sekvenovaní G1, hlavne G1a a Gip izoforiem, sa uskutočnili ďalšie analýzy týchto proteinov.

(ii) Northern analýza a ďalšia sekvenčná analýza:

Northern blot analýza odhalila, že G1 proteín existuje najmenej v troch odlišných transkripčných veľkostiach, 2, 2,4 a 4,4 kb, ktorých pomer veľmi varíruje v rámci rôznych tkanív (obrázok 4). Aby sa získala cDNA G1 (CASH) s úplnou dĺžkou, prehľadávala sa ľudská cDNA knižnica kožných fibroblastov (Clontech) s cDNA sondou zodpovedajúcou G1 sekvencií. Boli získané dva cDNA druhy, zjavne korešpondujúce s dvoma zostrihovými variantmi G1 (pozri vyššie). Proteíny

-101 -

kódované týmito dvoma cDNA mali spoločnú N-koncovú oblasť obsahujúcu smrtiacu efektorovú doménu, ale ich C-konce sa líšili. Jeden (Gip=CASHp) mal krátky C-koniec zodpovedajúci koncu pôvodne klonovanej cDNA. Druhý (G1a=CASHa) mal dlhý C-koniec.

Aminokyselinová sekvencia tejto dlhšej C-koncovej oblasti G1a vykazovala dosť vysokú homológiu so sekvenciami v oblastiach proteázového prekurzora v MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) (pozri aj obrázok 3). Avšak v G1a chýbalo niekoľko zvyškov považovaných za kritické pre proteázovú aktivitu, čo naznačuje, že proteín môže postrádať cysteín-proteázovú aktivitu. Zaujímavé je, že G1a obsahuje kaspázovú substrátovú sekvenciu v mieste korešpondujúcom s proteolytickým spracovávacím miestom vo vnútri proteázových oblastí v MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) (vytieňované na obrázku 3). Predbežné údaje naznačujú, že G1a môže byť naozaj štiepený v tomto mieste prostredníctvom MACH (údaje nie sú znázornené).

Na základe nukleotidovej sekvencie EST klonu, o ktorom sa zistilo, že korešponduje s myším homológom časti oblasti smrtiacej domény (DED) v G1, boli klonované cDNA oboch myších CASHa a CASHp zostrihových variantov z myšacej pečeňovej mRNA prostredníctvom RT-PCR. EST kloň (GenBank č. katalógu AA198928) bol identifikovaný ako myší homológ časti DED oblasti v G1. Na základe tejto sekvencie boli klonované myšie G1a (CASHa) a Gip (CASHp) zostrihové varianty z myšacej pečeňovej mRNA prostredníctvom RT-PCR. Reverzná transkriptázová reakcia sa uskutočňovala s oligo-dT adaptorovým primerom (S'-GACTCGAGTCTAGAGTCGACCT),?-³) a AMV reverznou transkriptázou (Promega) použitím v súlade s inštrukciami výrobcu. Prvé kolo PCR sa uskutočňovalo s Expand Long Template PCR systémom (Boehringer Mannheim) použitím nasledujúcich sense a antisense primerov: 5-GGCTTCTCGTGGTTCCCAGAGC-3', a 5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'(adaptor). Druhé kolo sa uskutočňovalo s Vent polymerázou (NEB) použitím ukotvovacieho sense primeru: 5 -TGCTCTTCCTGTGTAGAGATG-3' a adaptora.

-102 Porovnanie sekvencii odhalilo vysokú konzervatívnosť v rámci G1a (CASHa) molekuly (71 % zhodnosť v DED oblasti a 59 % v proteázovej homologickej oblasti), čo naznačuje, že tak DED, ako aj proteázová homologické oblasti sa podieľajú na jeho funkcii (pozri obrázok 3).

(iii) Dvojhybridná analýza väzobnej špecificity G1 izoforiem:

Dvojhybridné testovanie interakčných vlastností G1a (CASHa) a Gip (CASHp) (obrázok 5) odhalilo, že oba varianty interagujú s MORT1/FADD a MACH (CASP-8), najpravdepodobnejšie prostredníctvom ich vytieňovaných DED oblastí. Je pozoruhodné, že hoci boli na začiatku klonované dvojhybridným vyhľadávaním proteínov, ktoré sa viažu na Mch4 (CASP-10), zistilo sa, že v testoch sa G1p (CASPp) viaže slabo na Mch4 (CASP-10) a G1a (CASHa) sa viaže len slabo na Mch 4. Treba však poznamenať, že počiatočné dvojhybridné vyhľadávanie za účelom klonovania G1 proteínov sa líšilo od tohto dvojhybridného prehľadávanie na testovanie väzobnej špecificity, a teda sa zdá, že v skutočnosti sa tak G1a, ako aj G1p viažu oba na MACH a Mch4, ako ukazujú výsledky pôvodného klonovania. Dva G1 varianty sa tiež spájajú samí so sebou a navzájom, ale neviažu sa na RIP alebo TRADD (adaptorové proteiny, ktoré podobne ako MORT1/FADD obsahujú smrtiace domény, ale chýbajú im DED), ani sa neviažu na množstvo irelevantných proteínov (napr. lamí n) použitých ako špecifické kontroly.

Aby sa ďalej preskúmala funkcia G1, exprimovali sa jeho dva varianty prechodne v HeLa a v 293-T bunkách a stanovili sa účinky transfekovaných proteínov na ρ-55-R (CD120a)-indukovanú signalizáciu pre cytotoxicitu spustenú prostredníctvom TNF, alebo nadexpresiou receptora, ako aj na FAS-R (CD95)indukovanú signalizáciu pre cytotoxicitu spustenú protilátkovým krížovým spojením s FAS-R, alebo nadexpresiou chimerického receptora pozostávajúceho z extracelulárnej domény p55-R (CD120a) a vnútrobunkovej domény FAS-R (CD95) (pozri obrázok 6). V oboch bunkových líniách, expresia Gip (CASHp) ako taká, nemala žiadny vplyv na bunkovú životaschopnosť, ale silno inhibovala indukciu bunkovej smrti prostredníctvom p55-R (CD120a), ako aj prostredníctvom FAS-R

-103 -

(CD95). Expresia G1a (CASHa) variantu ovplyvňovala dve bunkové línie veľmi rozdielne. V HeLa bunkách inhibovala cytotoxicitu p55-R (CD 120a) a FAS-R (CD95), podobne ako G1p (CASHp). Avšak v 293-T bunkách vyústila do značnej cytotoxicity. Podobná cytotoxicita bola pozorovaná, keď sa G1a proteín exprimoval v 293-EBNA bunkách (nie je znázornené). Tento cytotoxický účinok mohol byť úplne blokovaný ko-expresiou s p35, čo je od bakulovírusu odvodený kaspázový inhibítor (pre p35 pozri aj Clem et al., 1991; Xue a Horvitz, 1995).

Aby sa stanovil podiel oblasti proteázovej homológie v G1a (CASHa) na jeho cytocídnom účinku, boli skúmané funkcie dvoch mutantov proteínu. Tieto mutanty boli: G1/CASHa(1-385) a G1/CASHa(1-408) s C-koncovými deléciami v oblasti korešpondujúcej s časťou proteázovej domény, od ktorej je odvodená malá podjednotka zrelej proteázy. Oba mutanty nemali cytotoxický účinok. Navyše, podobne ako Gip (CASHp), chránili 293 bunky pred indukciou bunkovej smrti prostredníctvom p55-R (CD120a) a FAS-R (cd95) (obrázok 6C a D).

Je potrebné uviesť, že pre vyššie uvedené postupy boli použité nasledujúce metódy a materiály:

(i) G1a (CASHa) delečné mutanty a p55-R/FAS-R (CD120a/CD95) chiméry boli pripravené prostredníctvom PCR a/alebo bežnými klonovacími technikami. G1 (CASH) zostrihové varianty, FAS-R (CD95) alebo p55-R (CD120a) proteíny signalizačnej kaskády (všetky ľudského pôvodu) a bakulovírusový p35 proteín sa exprimovali v cicavčích bunkách použitím pcDNA3 expresného vektora (Invitrogen). β-galaktozidáza sa exprimovala použitím pCMV-p-gal vektora (Promega).

(ii) Ľudské embryonálne obličkové 293-T a 293 EBNA bunky a ľudské cervikálne nádorové HeLa bunky (HeLa-Fas; HtTA-1 kloň) stabilne exprimujúce transfekovaný ľudský FAS-R (CD95) (založené v laboratóriu prihlasovateľa) rástli v Dulbeccom modifikovanom Eagle minimálnom esenciálnom médiu doplnenom s 10 % fetálnym hovädzím sérom, neesenciálnymi aminokyselinami, 100 U/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu.

Vyššie uvedené zistenia naznačujú, že G1 môže interagovať so zložkami signalizačných komplexov p55-R a FAS-R, a že ovplyvňuje indukciu smrti

- 104-

spôsobom, ktorý sa môže líšiť v závislosti na identifikovanom zostrihovom variante

G1 a na type bunky, v ktorej je exprimovaný.

Inhibícia indukcie cytotoxicity prostredníctvom Gip, a v prípade HeLa buniek aj prostredníctvom G1a, je zjavne sprostredkovaná oblasťou smrtiacej domény (DED) v tomto proteíne. Pravdepodobne odráža kompetíciu DED v G1 s korešpondujúcimi oblasťami v MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) pre viazanie MORT1/FADD.

Čo sa týka spôsobu ktorým CASHa spôsobuje smrť 293 buniek, schopnosť p35 proteínu blokovať tento cytotoxický účinok naznačuje, že cytotoxicita je sprostredkovaná aktivitou kaspáz. Avšak aj keď G1a vykazuje značnú sekvenčnú homológiu s kaspázami, môže mu v skutočnosti chýbať cysteín proteázová aktivita, pretože nemá niekoľko konzervatívnych zvyškov kaspázového aktívneho miesta. G1a preto môže účinkovať aktiváciou iných molekúl, ktoré majú kaspázovú aktivitu.

Inou možnosťou je, že G1a, hoci nie je schopný účinkovať samostatne ako proteáza, môže ešte tvoriť časť aktívnej proteázovej molekuly. Kryštalografické štúdie CASP-1 a CASP-3 štruktúry naznačujú, že malé a veľké proteázové podjednotky v každom spracovávacom enzýme sú odvodené od rozličných proenzýmových molekúl (Walker et al., 1994; Wilson et al., 1994; Mittl et al., 1997; Rotonda et al., 1996). Vzhľadom na pozorovanú závislosť G1a cytotoxickej aktivity na neporušenosti oblasti korešpondujúcej s malou proteázovou podjednotkou (obrázok 6C), je možné, že táto oblasť v G1a (CASPa) sa môže spájať s oblasťou veľkej podjednotky určitej kaspázy/kaspáz spôsobom, ktorého výsledkom je rekonštitúcia enzymaticky aktívnej molekuly. Výsledný heterotetramér by mal byť potom schopný aktivovať iné kaspázy, a tým spustiť bunkovú smrť.

Zistilo sa tiež (výsledky nie sú uvedené), že G1 má aspoň nejakú homológiu s iným proteínom nazývaným MYD88, ktorý je zahrnutý v signalizačnej dráhe sprostredkovanej IL-1. Takže G1 môže byť zahrnutý aj v iných dráhach iniciovaných/sprostredkovaných inými cytokínmi.

Vzhľadom na vyššie uvedené, čo sa týkalo klonovania a izolácie G1 proteínu (aspoň dvoch jeho izoforiem), vyplynuli nasledujúce charakteristiky a použitia G1:

-105-

(i) G1 bol klonovaný dvojhybridným vyhľadávaním ako molekula, ktorá sa viaže na MORT-1-viažuci proteín Mch4, a teda je možné, že sa podieľa na modulácii aktivity Mch4 a MORT-1, a teda prostredníctvom vyššie opísaných mechanizmov je G1 možno zahrnutý v modulácii bunkových javov iniciovaných prostredníctvom FAS-R a p55-R. Z toho, že Mch4 je schopný viazať sa na MORT-1 a je priamo zahrnutý v bunkovej cytotoxicite a v závere bunkovej smrti a tiež z toho, že niektoré izoformy Mch4 sú známe ako inhibítory bunkovej smrti, vyplýva, že G1 vrátane jeho rôznych izoforiem môže byť priamo alebo nepriamo zahrnutý tak v bunkovej cytotoxicite, ako aj v bunkovej smrti, ako aj v inhibícii bunkovej smrti.

(ii) G1 má zjavne N-koncovú oblasť, ktorá obsahuje dva MORT modulové homológy k dvom MORT modulom MACH (pozri referenčné príklady 1-3) a Mch4. Takže sa zdá, že prítomnosť týchto MORT modulov v G1 zabezpečuje G1 schopnosť viazať Mch4 a možno umožňuje aj viazanie sa G1 (alebo aspoň niektorých z jeho izoforiem) na MACH (alebo niektoré jeho izoformy), ako aj na MORT-1 priamo. Z toho vyplýva, že G1 môže byť schopný modulovať aktivitu MORT-1 (a tým aktivitu FAS-R a p55-R) priamo, priamym viazaním sa na MORT-1, alebo nepriamo viazaním sa na Mch4 a/alebo na MACH, o ktorých je známe, že sa viažu na MORT-1.

(iii) Analýza G1 sekvencie vo vyššie uvedených databázach a prehľadávanie odhalilo aj skutočnosť, že G1 je zjavne umiestnený blízko Mch4 a MACH lokusu na ľudskom chromozóme č. 2, čo naznačuje blízky vzťah medzi génmi kódujúcimi všetky tieto proteíny aj na chromozomálnej úrovni.

(iv) Aspoň niektoré z G1 izoforiem (napr. G1a izoforma na obrázku 1) majú oblasť pod oblasťou MORT modulov, ktorá je podobná s enzymatickou tzn. proteázovou oblasťou MACH a Mch4, a ako taký môže byť G1 členom CED3/ICE proteázovej rodiny.

(v) Prítomnosť proteáze podobnej oblasti aspoň v niektorých G1 izoformách (napr. G1a) naznačuje, že G1 alebo takéto jeho izoformy môžu byť priamo zahrnuté v bunkovej cytotoxicite a v zápale spôsobenom rôznymi stimulmi vrátane receptorov TNF/NGF receptorovej rodiny (napr. FAS-R a p55-R) a tiež inými, ktoré účinkujú

-106 -

priamo alebo nepriamo prostredníctvom vnútrobunkovej proteázovej aktivity, ktorá vyvoláva bunkovú cytotoxicitu a zápal.

(vi) G1 môže účinkovať ako zosilňovač alebo zoslabovač aktivity iných proteínov, ako napríklad MACH a Mch4 proteínov (vrátane ich rôznych izoforiem) vo vnútrobunkových mechanizmoch vedúcich k bunkovej cytotoxicite, zápalu a iným príbuzným účinkom, ktoré sú sprostredkované receptormi TNF/NGF receptorovej rodiny a v iných mechanizmoch zdieľajúcich spoločné vnútrobunková efektory. Zosilňovací alebo zoslabovací účinok G1 (alebo aspoň niektorých jeho izoforiem) môže prebiehať prostredníctvom viazania sa G1 na tieto iné proteíny (ako bolo uvedené vyššie G1 sa viaže na Mch4 a možno sa viaže aj na MACH a MORT-1), a tým ich zozbierava pre väzbu na MORT-1 (vrátane vlastnej asociácie MORT-1) alebo účinkuje nezávisle od MORT-1.

(vii) G1 môže účinkovať aj ako inhibítor aktivity iných proteínov a to spôsobom kedy je G1 časťou komplexu iných proteínov, na ktoré sa viaže (napr. Mch4 a možno aj MACH a MORT-1), čím ovplyvňuje cytotoxicitu v rozsahu inhibície tejto aktivity. Ďalej, spôsobom analogickým so spôsobom uvedeným vyššie týkajúcim sa niektorých MACH izoforiem, ako aj niektorých izoforiem Mch4, môžu existovať aj G1 izoformy, ktoré majú špecificky inhibičnú aktivitu. Jednou takouto G1 izoformou môže byť Gip izoforma zobrazená na obrázku 2, ktorá má dva MORT moduly, ale zjavne nemá žiadnu proteáze podobnú oblasť podobnú so známymi proteázami.

Po úplnom opise tohto vynálezu bude priemernému odborníkovi v oblasti zrejmé, že to isté môže byť vykonané v rámci širokého rozsahu parametrov, koncentrácií a podmienok, bez toho aby sa vybočilo z rozsahu vynálezu, a bez zbytočného experimentovania.

Hoci bol vynález opísaný v spojitosti s jeho špecifickými uskutočneniami, treba to chápať tak, že môže byť podrobený ďalším modifikáciám. Prihláška je mienená tak, aby pokrývala akýkoľvek variant, použitia alebo adaptácie vynálezov, ktoré vo všeobecnosti vyplývajú z princípov vynálezu a zahŕňajú len také odchýlky od predloženého opisu, ktoré spadajú do známej alebo bežnej praxe v oblasti, do

-107 -

ktorej vynález patrí, a ktoré môžu byť aplikované s tu uvedenými základnými znakmi vyplývajúcimi z rozsahu pripojených nárokov.

Všetky tu citované publikácie vrátane časopisových článkov alebo anotácií, publikovaných alebo korešpondujúcich s US alebo zahraničnými prihláškami vynálezov, udelenými US alebo zahraničnými patentami alebo akékoľvek iné publikácie sú tu celé začlenené ako citácie, vrátane údajov, tabuliek, obrázkov a textov nachádzajúcich sa v citovaných publikáciách. Navyše celý obsah publikácií citovaných v publikáciách je tu tiež začlenený ako citácia.

Z citácie známych spôsobových krokov, bežných spôsobových krokov, známych spôsobov alebo bežných spôsobov nijakým spôsobom nevyplýva, že by ktorýkoľvek aspekt, opis alebo uskutočnenie predloženého vynálezu bolo nárokované, opísané alebo navrhnuté v príslušnom odbore.

Predchádzajúci opis špecifických uskutočnení úplne objasní všeobecnú povahu vynálezu, ktorú môžu iný použitím znalostí v rámci oblasti (vrátane obsahov tu citovaných publikácií) jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať pre rôzne aplikácie takýchto špecifických uskutočnení bez zbytočného experimentovania, bez toho, aby vybočili zo všeobecného konceptu predloženého vynálezu. Takže takéto adaptácie a modifikácie sú mienené ako také, ktoré sú v rámci významu a rozsahu ekvivalentov nárokovaných uskutočnení, na základe tu prezentovaného opisu a návodu. Treba to chápať tak, že tu použitá frazeológia a terminológia je pre účely opisu a nie na limitáciu, takže terminológia alebo frazeológia predloženého opisu má byť interpretovaná odborníkom z ohľadom na tu uvedený opis a návod v kombinácii s vedomosťami priemerného odborníka v oblasti.

Claims (43)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. DNA sekvencia kódujúca najmenej jednu izoformu G1 proteínu alebo jej fragmenty a analógy, pričom uvedená G1 izoforma alebo jej fragmenty a analógy sú schopné viazať sa na alebo interagovať priamo alebo nepriamo s MORT-1 a/alebo s ktorýmkoľvek z MORT-1-viažucich proteínov alebo inými vnútrobunkovými mediátorovými/modulátorovými proteínmi a sú schopné sprostredkovať vnútrobunkový účinok sprostredkovaný prostredníctvom FAS-R alebo p55-TNF-R alebo inými cytotoxickými mediátormi alebo indukčnými činidlami.
2. 2. DNA sekvencia podľa nároku 1 vybraná zo skupiny, ktorú tvorí:

   (a) cDNA sekvencia odvodená od kódujúcej oblasti prirodzenej izoformy G1 proteínu;

   (b) DNA sekvencie, ktoré sú schopné hybridizovať so sekvenciou (a) v mierne prísnych podmienkach, a ktoré kódujú biologicky aktívnu izoformu G1 proteínu; a (c) DNA sekvencie, ktoré sú degenerované následkom genetického kódu vzhľadom k DNA sekvenciám definovaným v (a) a (b), a ktoré kódujú biologicky aktívnu izoformu G1 proteínu.
3. 3. DNA sekvencia podľa nároku 1 alebo 2, ktorá obsahuje aspoň časť sekvencie zobrazenej na obrázku 1 a kóduje najmenej jednu izoformu G1 proteínu, G1a izoformu.
4. 4. DNA sekvencia podľa nároku 1 alebo 2, ktorá obsahuje aspoň časť sekvencie zobrazenej na obrázku 2 a kóduje najmenej jednu izoformu G1 proteínu, G1p izoformu.
5. 5. DNA sekvencia podľa nároku 3 kódujúca G1 izoformu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu zobrazenú na obrázku 1, jej fragmenty a analógy.

   -109 -
6. 6. DNA sekvencia podľa nároku 4 kódujúca G1 izoformu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu zobrazenú na obrázku 2, jej fragmenty a analógy.
7. 7. Vektor, ktorý obsahuje DNA sekvenciu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.
8. 8. Vektor podľa nároku 7, ktorý je schopný byť exprimovaný v eukaryotickej hostiteľskej bunke.
9. 9. Vektor podľa nároku 7, ktorý je schopný byť exprimovaný v prokaryotickej hostiteľskej bunke.
10. 10. Transformovaná eukaryotická alebo prokaryotická hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že obsahuje vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 9.
11. 11. Izoforma G1 proteínu, jej fragmenty alebo funkčné analógy alebo deriváty kódované DNA sekvenciou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, pričom uvedený proteín, jeho fragmenty, analógy alebo deriváty sú schopné viazať sa na alebo interagovať priamo alebo nepriamo s MORT-1 a/alebo s ktorýmkoľvek z MORT-1-viažucich proteínov alebo s inými vnútrobunkovými mediátorovými/modulátorovými proteínmi a sú schopné sprostredkovať vnútrobunkový účinok sprostredkovaný prostredníctvom FAS-R alebo p55-TNF-R alebo inými cytotoxickými mediátormi alebo indukčnými činidlami.
12. 12. G1 izoforma, jej fragmenty, analógy a deriváty podľa nároku 11, ktoré obsahujú aspoň časť aminokyselinovej sekvencie znázornenej na obrázku 1.
13. 13. G1 izoforma, jej fragmenty, analógy a deriváty podľa nároku 11, ktoré obsahujú aspoň časť aminokyselinovej sekvencie znázornenej na obrázku 2.

    -110 -
14. 14. Spôsob výroby najmenej jednej izoformy G1 proteínu, jeho fragmentov, analógov alebo derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúci sa t ý, že zahŕňa rast transformovanej hostiteľskej bunky podľa nároku 10 v podmienkach vhodných pre expresiu uvedeného proteínu, jeho analógov alebo derivátov, uskutočnenie post-translačných modifikácii, ak je to nevyhnutné pre získanie uvedeného proteínu, fragmentov, analógov alebo derivátov, a izoláciu uvedeného exprimovaného proteínu, fragmentov, analógov alebo derivátov.
15. 15. Protilátky alebo ich aktívne fragmenty alebo deriváty, ktoré sú špecifické voči G1 proteínu, fragmentom, analógom alebo derivátom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13.
16. 16. Spôsob modulácie procesov bunkovej smrti alebo zápalových procesov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie uvedených buniek jedným alebo viacerými G1 proteínmi, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, pričom toto ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo viacerých uvedených proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná pre ich vnútrobunkové zavedenie, alebo zavedenie nukleotidovej sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero uvedených proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu uvedenej sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa sekvencia v bunkách exprimuje.
17. 17. Spôsob modulácie účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek s jednými alebo viacerými G1 proteínmi, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktoré sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo na MORT-1 a/alebo na ktorýkoľvek z MORT-1-viažucich proteínov, pričom MORT-1 sa viaže na vnútrobunkovú doménu FAS-R, alebo sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo na MORT-1, ktorý sa viaže na TRADD, a ten sa

    -111 - viaže na vnútrobunkovú doménu p55-R, a tým sú schopné modulovať/sprostredkovať aktivitu FAS-R alebo p55 TNF-R, pričom toto ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo viacerých uvedených proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná pre ich vnútrobunkové zavedenie, alebo zavedenie nukleotidovej sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero uvedených proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu uvedenej sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa sekvencia v bunkách exprimuje.
18. 18. Spôsob modulácie účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky podľa nároku 17, vyznačuj úci sa t ý m, že ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie G1 proteínu, analógov, fragmentov alebo derivátov, DNA sekvencie kódujúcej G1 proteín, analógy, fragmenty alebo deriváty do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu uvedenej sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa sekvencia v bunkách exprimuje.
19. 19. Spôsob podľa nároku 17 alebo 18, kde ošetrením buniek je transfekcia buniek rekombinantným živočíšnym vírusovým vektorom, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa kroky:

    (a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín (ligand), ktorý je schopný viazať sa na špecifický bunkový povrchový receptor na povrchu buniek nesúcich FAS-R alebo p55-R a druhú sekvenciu kódujúcu proteín vybraný z G1 proteínu, analógov, fragmentov a derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktorý, keď sa exprimuje v bunkách, je schopný modulovať/sprostredkovať aktivitu FAS-R alebo p55-R; a (b) infikovanie buniek vektorom (a).

    -112 -
20. 20. Spôsob modulácie procesov bunkovej smrti a zápalových procesov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými inhibítormi jedného alebo viacerých proteinov/enzýmov sprostredkujúcich uvedené procesy bunkovej smrti alebo zápalové procesy, pričom tieto inhibítory sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z: (i) jedného alebo viacerých G1 proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktoré sú schopné inhibovať procesy bunkovej smrti alebo zápalové procesy; a (ii) inhibítory jedného alebo viacerých G1 proteínov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, pričom uvedený jeden alebo viacero G1 proteínov zoslabuje/zosilňuje alebo sprostredkúva uvedené procesy bunkovej smrti alebo zápalové procesy.
21. 21. Spôsob modulácie účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek protilátkami alebo ich aktívnymi fragmentárni alebo derivátmi podľa nároku 15, pričom uvedeným ošetrením je aplikácia vhodnej kompozície obsahujúcej protilátky alebo ich aktívne fragmenty alebo deriváty na bunky, pričom ak sú G1 proteín alebo jeho časti prislúchajúce uvedeným bunkám vystavené na extracelulárnom povrchu, je uvedená kompozícia formulovaná na extracelulárnu aplikáciu, a keď sú G1 proteíny vnútrobunkové, je kompozícia formulovaná na vnútrobunkovú aplikáciu.
22. 22. Spôsob modulácie účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek oligonukleotidovou sekvenciou kódujúcou antisense sekvenciu aspoň časti DNA sekvencie kódujúcej G1 proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, pričom oligonukleotidová sekvencia je schopná blokovať expresiu G1 proteínu.
23. 23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotidová sekvencia je zavedená do buniek prostredníctvom vírusu podľa nároku 19, ktorého druhá sekvencia kóduje uvedenú oligonukleotidovú sekvenciu.

    -113-
24. 24. Spôsob ošetrenia nádorových buniek alebo buniek infikovaných HIV alebo iných chorých buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    (a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín, ktorý je schopný viazať sa na špecifický nádorový bunkový povrchový receptor alebo na povrchový receptor bunky infikovanej HIV alebo na receptor nesený inými chorými bunkami a sekvenciu kódujúcu proteín vybraný z G1 proteínu, analógov, fragmentov a derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktorý, keď sa exprimuje v nádorových, HIVinfikovaných a iných chorých bunkách, je schopný ich usmrtiť; a (b) infikovanie uvedených nádorových alebo HlV-infikovaných alebo iných chorých buniek vektorom (a).
25. 25. Spôsob modulácie účinku FAS-R ligandu alebo TNF na bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa použitie ribozýmovej procedúry, v ktorej sa vektor kódujúci ribozýmovú sekvenciu schopnú interagovať s bunkovou mRNA sekvenciou kódujúcou G1 proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, zavedie do buniek vo forme, ktorá dovoľuje expresiu ribozýmovej sekvencie v bunkách, pričom keď sa ribozýmová sekvencia exprimuje v bunkách, interaguje s uvedenou bunkovou mRNA sekvenciou a štiepi túto mRNA sekvenciu, a tak inhibuje expresiu uvedeného G1 proteínu v bunkách.
26. 26. Spôsob vybraný zo spôsobov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 25, vyznačujúci sa tým,žeG1 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo na MORT-1 a/alebo na ktorýkoľvek MORT-1-viažuci proteín, pričom MORT-1 sa špecificky viaže na FAS-ICE, alebo sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo na MORT-1 a/alebo na ktorýkoľvek z MORT-1-viažucich proteínov, pričom MORT-1 sa viaže na TRADD a ten sa viaže na ρ-55-IC.
27. 27. Spôsob izolácie a identifikácie proteínov podľa ktoréhokoľvek z nárokov

    11 až 13, ktoré sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo na MORT-1 proteín

    - 114 a/alebo na ktorýkoľvek MORT-1-viažuci proteín, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa použitie dvojhybridného postupu, v ktorom je sekvencia kódujúca MORT-1 proteín a/alebo MORT-1-viažuci proteín nesená jedným hybridným vektorom a sekvencia z cDNA alebo genomickej DNA knižnice je nesená druhým hybridným vektorom, pričom vektory sú potom použité na transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek a pozitívne transformované bunky sú izolované, následne sa extrahuje druhý hybridný vektor, aby sa získala sekvencia kódujúca proteín, ktorý sa viaže na MORT-1 proteín a/alebo na MORT-1-viažuce proteíny.
28. 28. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 27, vyznačujúci sa tým, že proteín je aspoň jednou z G1 izoforiem, ich analógov, fragmentov a derivátov.
29. 29. Farmaceutický prostriedok na moduláciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF alebo iných proteínov na bunky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej jednu izoformu G1 proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, jej biologicky aktívne fragmenty, analógy, deriváty alebo zmesi, ako aktívnu zložku.
30. 30. Farmaceutický prostriedok na moduláciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF alebo iných proteínov na bunky, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje ako aktívnu zložku rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci proteín schopný viazať sa na bunkový povrchový receptor a kódujúci najmenej jednu izoformu G1 proteínu alebo jej biologicky aktívne fragmenty alebo analógy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13.
31. 31. Farmaceutický prostriedok na moduláciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF alebo iných proteínov na bunky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako aktívnu zložku oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu antisense sekvenciu G1 proteínovej mRNA sekvencie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.

    -115 -
32. 32. Spôsob modulácie MORT-1-indukovaného účinku alebo účinku indukovaného MORT-1-viažucim proteínom alebo iným proteínom na bunky, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 28, s G1 proteínmi, ich analógmi, fragmentárni alebo derivátmi alebo sekvenciami kódujúcimi G1 proteíny, ich analógy alebo fragmenty, vyznačujúci sa tým, že výsledkom tohto ošetrenia je zosilnenie alebo inhibícia účinku sprostredkovaného MORT-1 alebo MORT-1-viažucim proteínom alebo iným proteínom, a tým aj účinku sprostredkovaného FAS-R alebo p55-R alebo iným cytotoxickým mediátorom alebo indukčným činidlom.
33. 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým,žeG1 proteín, jeho analóg, fragment alebo derivát je tá časť G1 proteínu, ktorá sa špecificky podieľa na viazaní sa na MORT-1 alebo na MORT-1-viažuci proteín alebo na iný proteín.
34. 34. Spôsob podľa nároku 32 alebo 33, vyznačujúci sa tým,žeG1 proteín je ktorákoľvek z G1 izoforiem schopných zosilniť účinok na bunky, ktorý je asociovaný s MORT-1 alebo s MORT-1-viažucim proteínom alebo iným proteínom, a tým aj účinok na bunky, ktorý je asociovaný s FAS-R alebo s p55-R alebo s iným cytotoxickým mediátorom alebo indukčným činidlom.
35. 35. Spôsob modulácie apoptických procesov alebo procesov programovanej bunkovej smrti, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými G1 proteínmi, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktoré sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo na MORT-1 a/alebo na ktorýkoľvek z MORT-1-viažucich proteínov, pričom MORT-1 sa viaže na vnútrobunkovú doménu FAS-R, alebo sú schopné viazať sa priamo alebo nepriamo na MORT-1 a/alebo na ktorýkoľvek z MORT-1 viažucich proteínov, pričom MORT-1 sa viaže na TRADD, ktorý sa viaže na vnútrobunkovú doménu p55-R, a tým sú schopné modulovať/sprostredkovať aktivitu FAS-R alebo p55 TNF-R, pričom ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo

    -116- viacerých uvedených proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodnej na vnútrobunkové zavedenie alebo zavedenie DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero uvedených proteínov, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu uvedenej sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa sekvencia v bunkách exprimuje.
36. 36. Fragment podľa nároku 11, ktorý je peptidom.
37. 37. Spôsob vyhľadávania ligandu, ktorý je schopný viazať sa na proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uvedenie afinitnej chromatografickej matrice, na ktorú je pripojený uvedený proteín, do kontaktu s bunkovým extraktom, čím sa ligand naviaže na matricu, eluovanie, izolovanie a analyzovanie uvedeného ligandu.
38. 38. Spôsob vyhľadávania DNA sekvencie kódujúcej ligand schopný viazať sa na proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa použite kvasinkového dvojhybridného postupu, v ktorom je sekvencia kódujúca uvedený proteín nesená jedným hybridným vektorom a sekvencie z cDNA alebo genomickej DNA knižnice sú nesené druhým hybridným vektorom, transformovanie kvasinkových hostiteľských buniek uvedenými vektormi, izoláciu pozitívne transformovaných buniek, a extrakciu druhého hybridného vektora, aby sa získala sekvencia kódujúca uvedený ligand.
39. 39. Spôsob identifikácie a výroby ligandu schopného modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú prostredníctvom MORT-1 alebo MORT-1viažucich proteínov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    (a) vyhľadávanie ligandu schopného viazať sa na polypeptid obsahujúci aspoň časť MORT-1 alebo MORT-1-viažucich proteínov vybraných z MACH proteínov, Mch4 proteínov a iných MORT-1-viažucich proteínov;

    -117 - (b) identifikáciu a charakterizáciu ligandu, ktorý sa líši od MORT-1 alebo od uvedených MORT-1-viažucich proteinov alebo častí receptora patriaceho do TNF/NGF receptorovej rodiny, o ktorom sa vo vyhľadávacom kroku zistilo, že je schopný uvedenej väzby; a (c) výrobu ligandu v podstate izolovanej a purifikovanej forme.
40. 40. Spôsob identifikácie a výroby ligandu schopného modulovať bunkovú aktivitu modulovanú alebo sprostredkovanú proteínom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    (a) vyhľadávanie ligandu schopného viazať sa na polypeptid obsahujúci aspoň časť G1a sekvencie znázornenej na obrázku 1 alebo aspoň časť Θ1β sekvencie znázornenej na obrázku 2;

    (b) identifikáciu a charakterizáciu ligandu, ktorý sa líši od MORT-1 alebo od MORT1-viažucich proteinov alebo častí receptora patriaceho do TNF/NGF receptorovej rodiny, o ktorom sa vo vyhľadávacom kroku zistilo, že je schopný uvedenej väzby; a (c) výrobu ligandu v podstate izolovanej a purifikovanej forme.
41. 41. Spôsob identifikácie a výroby ligandu schopného modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú prostredníctvom G1, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa:

    (a) vyhľadávanie ligandu schopného viazať sa na aspoň časť G1a sekvencie znázornenej na obrázku 1 alebo aspoň časť ΰ1β sekvencie znázornenej na obrázku 2;

    (b) identifikáciu a charakterizáciu ligandu, ktorý sa líši od MORT-1 alebo od MORT1-viažucich proteinov alebo častí receptora patriaceho do TNF/NGF receptorovej rodiny, o ktorom sa vo vyhľadávacom kroku zistilo, že je schopný uvedenej väzby; a (c) výrobu ligandu v podstate izolovanej a purifikovanej forme.

    -118-
42. 42. Spôsob identifikácie a výroby ligandu schopného priamo alebo nepriamo modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú prostredníctvom G1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    (a) vyhľadávanie molekuly schopnej modulovať aktivity modulované/sprostredkované prostredníctvom G1;

    (b) identifikáciu a charakterizáciu uvedenej molekuly; a (c) výrobu molekuly v podstate izolovanej a purifikovanej forme.
43. 43. Spôsob identifikácie a výroby molekuly schopnej priamo alebo nepriamo modulovať bunkovú aktivitu modulovanú/sprostredkovanú proteínom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    (a) vyhľadávanie molekuly schopnej modulovať aktivity modulované/sprostredkované proteínom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13;

    (b) identifikáciu a charakterizáciu uvedenej molekuly; a (c) výrobu molekuly v podstate izolovanej a purifikovanej forme.