PL193394B1

PL193394B1 - Sekwencja DNA, jej zastosowanie, wektor i jego zastosowanie, transformowana komórka, polipeptyd o aktywności białka G1 i sposoby jego wytwarzania, izolowania i identyfikowania, oraz jego zastosowanie, sposoby modulowania działania liganda FAS-R lub TNF in vitro, sposoby przesiewowego badania liganda i sekwencji DNA kodującej ten ligand, sposoby jego identyfikacji wytwarzania oraz izolowania i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL193394B1
Application number: PL98335448A
Authority: PL
Inventors: David Wallach; Yura Goltsev; Andrei Kovalenko; Eugene Varfolomeev; Vadim Brodianski
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2007-02-28
Also published as: AU740223B2; WO1998039435A1; EE9900384A; SK117599A3; NZ337143A; PL335448A1; US7419804B2; BG64799B1; IL131247A; JP2002500508A; NO994250D0; AU6112698A; KR100544776B1; HK1024508A1; HUP0000913A2; CN1249780A; HUP0000913A3; EP0977842A1; BG103693A; IL131247A0

Abstract

1. Sekwencja DNA, kodujaca polipeptyd majacy aktywnosc bialka G1, który (i) ma zdolnosc wiazania sie lub interakcji bezposrednio lub posrednio z MORT-1 i/lub z bialkami wia- zacymi MORT-1, lub innymi wewnatrzkomórkowymi bialkami bedacymi mediatorami/modulatorami; i (ii) ma zdolnosc posredniczenia w wewnatrzkomórkowym dzialaniu, zachodzacym za posrednictwem FAS-R albo p55-TNF-R, albo innych cytotoksycznych mediatorów albo induktorów; wybrana z grupy skladaja- cej sie z: (a) sekwencji DNA kodujacej izoforme G1 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 1; (b) sekwencji DNA kodujacej izoforme G1 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 2 (c) sekwencji DNA kodujacej przynajmniej czesc polipeptydu o sekwencji aminokwasowej jak przed- stawiona na Fig. 1 lub Fig. 2. (d) sekwencji DNA obejmujacej przynajmniej czesc sekwencji przedstawionej na Fig. 1 i kodujacej przynajmniej jedna izoforme bialka G1, izoforme G1a; (e) sekwencji DNA obejmujacej przynajmniej czesc sekwencji przedstawionej na Fig. 2 kodujacej przy- najmniej jedna izoforme bialka G1, izoforme G1ß; (f) sekwencji cDNA pochodzacej z regionu kodujacego natywna izoforme bialka G1; (g) sekwencji DNA kodujacej fragment, analog lub pochodna polipeptydu kodowanego przez sekwencje DNA wybrana sposród (a) do (f); (h) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencja wybrana sposród (a) do (g) w umiarkowanie ostrych warunkach i która koduje biologicznie aktywna izoforme bialka G1; i (i) sekwencji DNA, która w wyniku wlasciwosci kodu genetycznego jest zdegenerowana do sekwencji DNA okreslonych w (a) do (h) i która koduje biologicznie aktywna izoforme bialka G1. 2. Wektor zdolny do ulegania ekspresji w komórce eukariotycznego lub prokariotycznego gospodarza, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje DNA okreslona w zastrz. 1. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA, jej zastosowanie, wektor i jego zastosowanie, transformowana komórka, polipeptyd o aktywności białka G1 i sposoby jego wytwarzania, izolowania i identyfikowania, oraz jego zastosowanie, sposoby modulowania działania liganda FAS-R lub TNF in vitro, sposoby przesiewowego badania liganda i sekwencji DNA kodującej ten ligand, sposoby jego identyfikacji wytwarzania oraz izolowania i kompozycja farmaceutyczna.

Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny receptorów należących do nadrodziny receptorów TNF/NGF i sterowania ich funkcją biologiczną. Do nadrodziny receptorów TNF/NGF należą receptory takie jak receptory czynnika martwicy nowotworów p55 ip75 (TNF-R, zwane również CD120a i CD120b odpowiednio, ale w niniejszym opisie nazywane dalej p55-R i p75-R) oraz receptor liganda FAS (zwany również FAS/APO1 albo FAS-R albo CD95, ale w niniejszym opisie dalej nazywany FAS-R) i inne. Niniejszy wynalazek obejmuje też nowe białka, wiążące się z innymi białkami, które same wiążą się z białkiem MORT-1 (albo FADD) i zwane są również białkami wiążącymi MORT-1, albo również wiążące się z MORT-1 bezpośrednio, a bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy jednego takiego białka, oznaczanego tu jako G1, (które obecnie oznaczono również jako „CASH” w skrócie od angielskiej nazwy „CASPASE HOMOLOG”, ale które będzie w niniejszym opisie nazywane dalej „G1”), które wiąże się z białkiem Mch4 wiążącym MORT-1 (zwanym również CASP-10), i może także wiązać się z innym białkiem wiążącym MORT-1 zwanym MACH (zwanym również CASP-8), oraz może również wiązać się bezpośrednio z samym białkiem MORT-1.

Ogólnie wynalazek dotyczy, nowych białek, które zdolne są do modulacji albo pośredniczenia w funkcji MORT-1 bezpośrednio albo pośrednio albo innych białek, które wiążą się z MORT-1 bezpośrednio albo pośrednio, w szczególności dotyczy białka G1, jego wytwarzania i zastosowania, jak również różnych nowych izoform G1, ich wytwarzania i zastosowania.

Czynnik Martwicy Nowotworów (TNF-a) i Limfotoksyna (TNF-b) (w niniejszym opisie TNF odnosi się zarówno do TNF-a jak i TNF-b) są wielofunkcyjnymi cytokinami prozapalnymi wytwarzanymi głównie przez fagocyty jednojądrzaste, które mogą mieć liczne efekty działania na komórki (Wallach,

D. (1986) w: Interferon 7 (łon Gresser, red.), str. 83 - 122, Academic Press, London; oraz Beutler i Cerami (1987)). Zarówno TNF-a jak i TNF-b rozpoczynają swe działanie przez związanie ze swoistymi receptorami na powierzchni komórek. Niektóreztych działań są zdużym prawdopodobieństwem korzystne dla organizmu: mogą one zniszczyć, na przykład, komórki nowotworowe albo komórkizakażonewirusemorazwzmócprzeciwbakteryjną aktywność granulocytów. W ten sposób, TNF przyczynia się do obronyorganizmuprzednowotworamiiczynnikamizakaźnymiiprzyczyniasiędo zdrowieniapourazie.Azatem,TNFmożebyć stosowany jako środek przeciwnowotworowy, w którym tozastosowaniuwiążesięonzreceptoraminapowierzchnikomórek nowotworowych i tym samym inicjujezdarzenia,prowadzącedo śmierci komórek nowotworu. TNF można również stosować jako środek przeciwzakaźny.

JednakżezarównoTNF-a jakiTNF-b mogą mieć również działania szkodliwe. Istniejądowody nato,żenadmierne wytwarzanie TNF-a może odgrywać ważną rolę patogenną w kilku chorobach.Na przykład, działanie TNF-a, głównie na naczynia, jak wiadomo stanowi główną przyczynę objawów wstrząsu septycznego (Tracey i wsp., 1986). W niektórych chorobach, TNF może spowodować nadmierną utratę wagi (kacheksję) przez zniesienieaktywnościadipocytówiprzezwywołanieanoreksji, stądTNF-a nazywanokachektyną.Opisanogorównieżjako mediatora uszkodzenia tkanek w chorobach reumatycznych (Beutler i Cerami, 1987) ijako głównego mediatora uszkodzenia obserwowanego w reakcjach przeszczep przeciwko gospodarzowi (Piquet i wsp. 1987).W dodatku, wiadomo iż TNF jest zaangażowany w proces zapalny i wwieleinnychchorób.

Dwaoddzielne,wytwarzanewwynikuniezależnejekspresji,receptory,TNF-Rp55ip75,które wiążą się swoiście zarówno z TNF-a jaki zTNF-b, inicjują i/lub pośredniczą wwyżej wspomnianych efektach biologicznych TNF. Te dwa receptory mają strukturalnie niepodobne domeny wewnątrzkomórkowe, co sugeruje, iż przekazują sygnał inaczej (patrz Hohmann i wsp., 1989; Englemann i wsp., 1990;Brockhausiwsp.,1990; orazHelleriwsp.,1990), Jednakże, mechanizmy komórkowe, na przykład różne białka i być może inne czynniki, które zaangażowane są w wewnątrzkomórkową sygnalizacjęTNF-Rp55ip75, pozostają nieznane. Ta właśnie wewnątrzkomórkowa sygnalizacja, która zachodzizwyklepozwiązaniusięligandu,tj. TNF(a albo b), z receptorem, odpowiedzialna jest za początek kaskady reakcji, które ostatecznie powodują obserwowaną odpowiedź komórki na TNF.

PL 193 394 B1

Jeśli chodzi o wyżej wspomniany komórkobójczy efekt działania TNF, w większości badanych dotąd komórek efekt ten jest wyzwalany głównie przez p55 TNF-R. Przeciwciała przeciwko zewnątrzkomórkowej domenie (domenie wiążącej ligand) p55 TNF-R mogą same wyzwolić działanie komórkobójcze (patrz europejski opis patentowy EP 412486), co koreluje ze skutecznością sieciowania receptorów przez przeciwciała, co uważa się za pierwszy etap w wytwarzaniu wewnątrzkomórkowego procesu sygnalizacji. Ponadto, badania mutacji (Brakebusch i wsp., 1992; Tartaglia i wsp., 1993) wykazały, iż biologiczna funkcja p55 TNF-R zależy od integralności jego domeny wewnątrzkomórkowej i zgodnie z tym zasugerowano, iż początek sygnalizacji wewnątrzkomórkowej prowadzącej do działania komórkobójczego TNF zachodzi w konsekwencji związania się dwóch lub więcej domen wewnątrzkomórkowych p55 TNF-R. Ponadto, TNF (a i b) występuje jako homotrimer i jako taki, jak sugerowano, wzbudza sygnalizację wewnątrzkomórkową poprzez p55 TNF-R na drodze zdolności do związania się z receptorem i sieciowania cząsteczek receptora, tj. spowodowania agregacji receptorów.

Innym członkiem nadrodziny receptorów TNF/NGF jest receptor FAS (FAS-R), który zwano również antygenem FAS, białko powierzchniowe komórek wyrażane w różnych tkankach o homologii z wieloma receptorami powierzchni komórek, wtym TNF-R i NGF-R. FAS-R pośredniczy w śmierci komórkowej w postaci apoptozy (Itoh i wsp., 1991) i wydaje się służyć jako negatywny czynnik selekcyjny dla autoreaktywnych limfocytów T, tj. w czasie dojrzewania limfocytów T, FAS-R pośredniczy w śmierci apoptotycznej limfocytów T rozpoznających autoantygeny. Stwierdzono również, że mutacje w genie FAS-R ( 1pr) powodują chorobę limfoproliferacyjną u myszy, która przypomina ludzką chorobę z autoagresji - toczeń trzewny układowy (SLE) (Watanabe-Fukunaga i wsp., 1992). Ligandem dla FAS-R wydaje się być cząsteczka związana z powierzchnią komórki, przenoszona przez, między innymi, limfocyty zabójcze T (killer, albo cytotoksyczne limfocyty T - CTL), a stąd gdy takie CTL zetkną się z komórkami posiadającymi FAS-R, zdolne są do wywołania apoptotycznej śmierci komórkowej komórek posiadających FAS-R. Ponadto, wytworzono przeciwciało monoklonalne, które jest swoiste względem FAS-R, przy czym to przeciwciało monoklonalne zdolne jest do wywoływania apoptotycznej śmierci komórkowej w komórkach posiadających FAS-R, w tym komórkach myszy transformowanych cDNA kodującym ludzki FAS-R (Itoh i wsp., 1991).

Choć pewne działania cytotoksyczne limfocytów zachodzą za pośrednictwem interakcji wytworzonego przez limfocyt ligandu z powszechnie występującym receptorem powierzchniowym komórek FAS-R (CD95), który ma zdolność wyzwalania śmierci komórkowej, stwierdzono również, że różne inne normalne komórki, poza limfocytami T, wytwarzają FAS-R na swej powierzchni i mogą być zabite przez aktywację tego receptora. Niekontrolowane pobudzenie takiego procesu zabijania, jak się podejrzewa, przyczynia się do uszkodzenia tkanek w pewnych chorobach, na przykład do zniszczenia komórek wątroby w ostrym zapaleniu wątroby. Zgodnie z tym, znalezienie sposobów zahamowania aktywności cytotoksycznej FAS-R może mieć potencjał terapeutyczny.

Odwrotnie, ponieważ stwierdzono również, że pewne komórki złośliwe i komórki zakażone HIV posiadają na powierzchni FAS-R, przeciwciała przeciwko FAS-R, albo ligand FAS-R, można wykorzystać do wyzwolenia zachodzących za pośrednictwem FAS-R działań cytotoksycznych w tych komórkach, jak również dostarczenia środków do walki z takimi komórkami złośliwymi albo komórkami zakażonymi HIV (patrz Itoh i wsp., 1991). Znalezienie jeszcze innych sposobów wzmożenia aktywności cytotoksycznej FAS-R może zatem mieć również potencjał terapeutyczny.

Od dawna odczuwano potrzebę dostarczenia sposobu modulacji odpowiedzi komórkowej na TNF(a albo b) oraz ligand FAS-R. Na przykład, w sytuacjach patologicznych wspomnianych powyżej, w których TNF albo FAS-R jest wytwarzany w nadmiarze, pożądane jest zahamowanie wywoływanych przez TNF albo FAS-R działań komórkobójczych, choć w innych sytuacjach, np. w zastosowaniach do gojenia ran, pożądane jest wzmożenie działania TNF, albo w przypadku FAS-R, w komórkach nowotworowych albo komórkach zakażonych HIV, pożądane jest wzmożenie działania za pośrednictwem FAS-R.

Zgłaszający podjęli wiele prób (patrz na przykład, europejskie opisy patentowe nr EP 186833, EP 308378, EP 398327 i EP 412486) regulacji szkodliwych działań TNF przez zahamowanie wiązania TNF z jego receptorami przy użyciu przeciwciał anty-TNF albo przez zastosowanie rozpuszczalnych receptorów TNF (którymi są zasadniczo rozpuszczalne pozakomórkowe domeny receptorów) wcelu współzawodnictwa o wiązanie TNF z TNF-R związanymi z powierzchnią komórek. Ponadto, na podstawie tego, że wiązanie TNF z jego receptorami wymagane jest dla wywoływanych przez TNF działań komórkowych, zgłaszający podjęli próby (patrz na przykład europejski opis patentowy 568925) modulowania działania TNF przez modulację aktywności TNF-R.

PL 193 394 B1

W skrócie, EPO 568925 dotyczy sposobu modulacji przenoszenia sygnału i/lub oczyszczania z TNF-R, dzięki czemu peptydy albo inne cząsteczki mogą współdziałać albo z samym receptorem albo z białkami efektorowymi współdziałającymi z receptorem, w ten sposób modulując funkcję TNF-R. WEPO 568925, opisano budowę i charakterystykę różnych mutantów p55 TNF-R, mających mutacje w zewnątrzkomórkowej, śródbłonowej i wewnątrzkomórkowej domenie p55 TNF-R. W ten sposób, zidentyfikowano rejony wewnątrz powyższych domen p55 TNF-R jako zasadnicze dla funkcjonowania receptora, tj. wiązania ligandu (TNF) i następnie przenoszenia sygnału oraz sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, która ostatecznie powoduje obserwowane działanie TNF na komórki. Ponadto, opisano również wiele prób izolacji i identyfikacji białek, peptydów i innych czynników, które są zdolne do wiązania się z różnymi rejonami w powyższych domenach TNF-R, które to białka, peptydy i inne czynniki mogą być zaangażowane w regulację albo modulację czynności TNF-R. Ponadto w EPO 568925 opisano także wiele prób izolacji i klonowania sekwencji DNA kodujących takie białka i peptydy; konstrukcji wektorów ekspresyjnych do wytwarzania tych białek i peptydów; oraz do wytwarzania przeciwciał albo ich fragmentów, które współdziałają z TNF-R albo z powyższymi białkami i peptydami, które wiążą się z różnymi rejonami TNF-R. Jednakże, EPO 568925 nie określa rzeczywistych białek i peptydów, które wiążą się z wewnątrzkomórkowymi domenami TNF-R (np. p55 TNF-R), ani nie opisuje podejścia z podwójną hybrydą drożdżową w celu izolacji i identyfikacji takich białek i peptydów, które wiążą się z wewnątrzkomórkowymi domenami TNF-R. Podobnie, w EPO 568925 nie ma opisu białek ani peptydów zdolnych do wiązania się z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R.

A zatem, gdy pożądane jest zahamowanie działania TNF, albo ligandu FAS-R, pożądane byłoby zmniejszenie ilości lub aktywności TNF-R albo FAS-R na powierzchni komórki, natomiast zwiększenie ilości albo aktywności TNF-R albo FAS-R byłoby pożądane, gdy dąży się do nasilenia działania TNF albo FAS-R. W tym celu zsekwencjonowano promotory zarówno p55 TNF-R jak i FAS-R, zanalizowano je i znaleziono pewną liczbę kluczowych motywów sekwencji, które są swoiste dla różnych czynników regulacji transkrypcji, i jako taka, ekspresja tych TNF-R może być kontrolowana na poziomie ich promotora, tj. przez zahamowanie transkrypcji spod promotorów dla zmniejszenia liczby receptorów i wzmożenie transkrypcji spod promotorów w celu zwiększenia liczby receptorów (opisy patentowe EP 606869 i WO 9531206). Na publikację czekają odpowiednie badania dotyczące sterowania FAS-R na poziomie promotora genu FAS-R.

Choć wiadomo, że receptory czynnika martwicy nowotworów (TNF) oraz strukturalnie pokrewny receptor FAS-R wyzwalają w komórkach, przy stymulacji przez ligandy wytwarzane przez leukocyty, działania destrukcyjne, które prowadzą do ich własnego zniszczenia, mechanizmy tego wyzwalania są wciąż słabo poznane. Badania mutacyjne wskazują, iż w receptorze FAS-R i p55 TNF (p55-R), sygnał cytotoksyczny obejmuje oddzielne rejony w obrębie domen wewnątrzkomórkowych (Brakebusch i wsp., 1992; Tartaglia i wsp., 1993; Itoh i Nagata, 1993). Rejony te („domeny śmierci” albo „efektorowe domeny śmierci”, nazywane „DED” od ang. death effector domains) wykazują podobieństwo sekwencji. „Domeny śmierci” zarówno FAS-R jak i p55-R mają tendencję do wiązania się ze sobą. Ich wiązanie się ze sobą wydaje się ułatwiać agregację receptora, która jest konieczna do rozpoczęcia sygnalizacji (patrz Song i wsp., 1994; Wallach i wsp., 1994; Boldin i wsp., 1995) i przy wysokich poziomach ekspresji receptora może spowodować wyzwolenie sygnalizacji niezależnej od ligandu (Boldin i wsp., 1995).

Niektóre z działań cytotoksycznych limfocytów zachodzą za pośrednictwem interakcji wytwarzanego przez limfocyty ligandu z FAS-R (CD-95), powszechnie występującym receptorem powierzchni komórkowej, który ma zdolność do wyzwalania śmierci komórki (patrz również Nagata i Golstein, 1995); a zabijanie komórek przez jednojądrzaste fagocyty obejmuje parę ligand-receptor, TNF i jego receptor p55-R (CD120), który jest strukturalnie spokrewniony z FAS-R ijego ligandem (patrz również Vandenabeele i wsp., 1995). Podobnie jak inne działania wzbudzane przez receptor, indukcja śmierci komórkowej przez receptory TNF i FAS-R zachodzi poprzez serię interakcji białkobiałko, prowadząc od związania ligand-receptor do ostatecznej aktywacji enzymatycznych funkcji efektorowych, których badania wtym przypadku zidentyfikowały jako nieenzymatyczne interakcje białko-białko, rozpoczynające sygnalizację śmierci komórki: wiązanie trimeru TNF albo cząsteczek ligandu FAS-R z receptorami, powstające interakcje ich wewnątrzkomórkowych domen (Brakebusch i wsp., 1992; Tartaglia i wsp., 1993; Itoh i Nagata, 1993) wzmocnione przez skłonność motywów domen śmierci (albo efektorowych domen śmierci, DED) do wiązania się ze sobą (Boldin i wsp., 1995a) oraz wzbudzanie związania dwóch białek cytoplazmatycznych (które mogą również wiązać się ze sobą) do domen wewnątrzkomórkowych receptorów - MORT-1 (albo FADD) z FAS-R (Boldin i wsp.,

PL 193 394 B1

1995b; Chinnaiyan i wsp., 1995; Kischkel i wsp., 1995) oraz TRADD z p55-R (Hsu i wsp., 1995; Hsu i wsp., 1996). Trzy białka, które wiążą się z domeną wewnątrzkomórkową FAS-R i p55-R w rejonie „domeny śmierci” zaangażowane w indukcję śmierci komórki przez receptory przez heteroasocjację rejonów homologicznych i które niezależnie są również zdolne do wyzwalania śmierci komórkowej zidentyfikowano dzięki procedurze przesiewu podwójnych hybryd drożdżowych. Jednym znich jest białko MORT-1 (Boldin i wsp., 1995b), znane również jako FADD (Chinnaiyan i wsp., 1995), które wiąże się swoiście z FAS-R. Drugie, TRADD (patrz również Hsu i wsp., 1995, 1996), wiąże się z p55-R, a trzecie, RIP (patrz również Stanger i wsp., 1995) wiąże się zarówno z FAS-R jak i p55-R. Poza wiązaniem się z FAS-R i p55-R, białka te zdolne są również do wiązania się ze sobą, co zapewnia funkcjonalne przekaźnictwo pomiędzy FAS-R a p55-R. Wiązania te mogą zachodzić przez zachowany motyw sekwencji, „moduł domeny śmierci” (zwanej również DED, efektorowa domena śmierci), wspólny dla receptorów i związanych z nimi białek. Ponadto, choć w teście podwójnej hybrydy drożdżowej wykazano, iż MORT-1 spontanicznie wiąże się z FAS-R, w komórkach ssaków wiązanie to zachodzi tylko po stymulacji receptora, co sugeruje, że MORT-1 uczestniczy w zdarzeniach inicjujących sygnalizację FAS-R. MORT-1 nie zawiera żadnego motywu sekwencji charakterystycznego dla aktywności enzymatycznej i dlatego też jego zdolność do wyzwalania śmierci komórkowej wydaje się nie obejmować jakiejś wewnętrznej aktywności samego MORT-1, ale raczej aktywację jakiegoś innego białka (białek), które wiążą się z MORT-1 i działają w dalszej kolejności w kaskadzie sygnalizacyjnej. Ekspresja komórkowa mutantów MORT-1, którym brakuje części N-końcowej cząsteczki, jak wykazano, blokuje indukcję cytotoksyczności przez FAS/APO1 (FAS-R) albo p55-R (Hsu i wsp., 1996; Chinnaiyan i wsp., 1996), co wskazuje, iż ten rejon N-końcowy przenosi sygnał dla komórkobójczego działania obydwu receptorów poprzez interakcje białko-białko.

Niedawne badania zasugerowały, iż grupa cytoplazmatycznych proteaz tiolowych, które strukturalnie spokrewnione są z proteazą Caenorhabditis elegans CED3 oraz ze ssaczym enzymem konwertującym interleukinę-1b (ICE) bierze udział w zapoczątkowaniu różnych procesów fizjologicznej śmierci komórkowej (przegląd w publikacji Kumar, 1995 i Henkart, 1996). Istniały również pewne wskazówki, iż proteaza(y) ztej rodziny może(gą) brać udział w cytotoksyczności wywoływanej przez FAS-R i TNF-R. Stwierdzono, że swoiste peptydowe inhibitory tych proteaz oraz dwa kodowane przez wirusy białka, które blokują ich funkcję, białko wirusa krowianki crmA oraz białko Baculovirusa p35, zapewniają ochronę komórkom wobec tej komórkowej cytotoksycznosci (Enari i wsp., 1995; Los i wsp., 1995; Tewari i wsp., 1995; Xue i wsp., 1995; Beidler i wsp., 1995). Szybkie cięcie pewnych swoistych białek komórkowych, jak się wydaje zachodzące za pośrednictwem proteaz(y) z rodziny CED3/ICE, można było wykazać w komórkach wkrótce po stymulacji FAS-R albo TNF-R.

Należy zauważyć, iż te proteazy CED3/ICE, zwane również kaspazami, wytwarzane są jako nieaktywne prekursory i ulegają aktywacji przez obróbkę proteolityczną po włączeniu programu śmierci. Kaspazy te są konserwatywnymi proteazami cysteinowymi, które przecinają swoiste białka komórkowe wdół od reszt asparaginianowych, tym samym odgrywając krytyczną rolę we wszystkich znanych procesach programowanej śmierci komórkowej. W dodatku do ich homologicznego rejonu C-końcowego, z którego pochodzą dojrzałe proteazy, białka prekursorowe zawierają unikalne rejony N-końcowe. Interakcje tych „prodomen” ze swoistymi cząsteczkami regulacyjnymi umożliwiają różnicową aktywację różnych kaspaz przez różne sygnały wywoływania śmierci (Boldin i wsp., 1996; Muzzio i wsp., 1996; Duan i Dixit, 1997; Van Criekinge i wsp., 1996; Ahmad i wsp, 1997).

Jedna z takich proteaz ijej różne izoformy (wliczając izoformy hamujące), oznaczona MACH (zwana również CASP-8), która jest białkiem wiążącym MORT-1 i która służy do modulowania aktywności MORT-1, a stąd i FAS-R i p55-R, i która może również działać niezależnie od MORT-1, została ostatnio wyizolowana, sklonowana, scharakteryzowana, opisano również jej możliwe zastosowania, jak przedstawiono szczegółowo i zawarto niniejszym w całości przez odniesienie, we wspólnym, równoległym Izraelskim Zgłoszeniu Patentowym nr IL 114615, 114986, 115379, 116588 i 117932, jak również w odpowiadającym im zgłoszeniu PCT nr PCT/US96/10521 oraz w niedawnej publikacji niniejszych wynalazców (Boldin i wsp., 1996). Inna taka proteaza i jej różne izoformy (wliczając izoformy hamujące), oznaczona Mch4 (zwana również CASP-10) została niedawno wyizolowana i scharakteryzowana przez niniejszych wynalazców (dane niepublikowane) i przez innych (Fernandes-Alnemri i wsp., 1996; Srinivasula i wsp., 1996). To białko Mch4 jest również białkiem wiążącym MORT-1, które służy do modulacji aktywności MORT-1, a stąd prawdopodobnie również FAS-R i p55-R, i które może również działać niezależnie od MORT-1. A zatem, szczegóły dotyczące wszystkich aspektów, cech,

PL 193 394 B1 charakterystyk i zastosowań Mch4 zostały przedstawione w wyżej wspomnianych publikacjach, z których wszystkie zostały włączone niniejszym przez odniesienie.

Należy również zauważyć, że te kaspazy, MACH (CASP-8) i Mch4 (CASP-10), które mają podobne prodomeny (patrz Boldin i wsp., 1996; Muzio i wsp., 1996; Fernandes-Alnemri i wsp., 1996; Vincent i Dixit, 1997), współdziałają przez swe prodomeny z MORT-1, przy czym interakcja ta zachodzi przez „motyw domeny śmierci” albo „efektorową domenę śmierci”, DED, obecną w N-końcowej części MORT-1 i obecną w kopii wMACH (CASP-8) i Mch4 (CASP-10) (patrz Boldin i wsp., 1995b; Chinnaiyan i wsp., 1995).

Należy również wspomnieć, mając na względzie powyższe, że różne białka/enzymy/receptory zaangażowane w procesy sygnalizacji wewnątrzkomórkowej prowadzącej do śmierci komórkowej, otrzymały różne nazwy. W celu zapobieżenia pomyłkom, poniżej prezentujemy listę różnych nazw, włącznie z nowymi nazwami, o których zadecydowano na podstawie nowej konwencji, każdego z tych białek, albo ich części, oraz nazwy, które stosujemy w niniejszym dla wygody:

Powszechna albo pierwotna nazwa w niniejszym opisie	Inne nazwy	Nowa nazwa wg konwencji	Nazwa stosowana
Receptor TNF p55	P55-R	CD120a	P55-R
Receptor TNF p75	P75-R	CD120b	P75-R
Receptor FAS	FAS-R FAS/APO1	CD95	FAS-R
MORT-1	FADD	-	MORT-1
MACH	FLICE1, Mch5	CASP-8	MACH
Mch4	FLICE2	CASP-10	Mch4
G1	-	CASH	G1
„domena śmierci”	motyw domeny śmierci, motyw MORT, efektorowa domena śmierci (DED, moduły MORT	-	dDomena śmierci/motyw domeny śmierci moduły MORT
Proteazy CED3/ICE	kaspazy	CASP	Proteazy CED3/ICE

Sekwencja DNA według wynalazku, koduje polipeptyd o aktywności białka G1, który (i) ma zdolność wiązania lub interakcji bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub dowolnym z białek wiążących MORT-1, lub innych wewnątrzkomórkowych białek będących mediatorami/modulatorami; i (ii) ma zdolność pośredniczenia w wewnątrzkomórkowym działaniu, zachodzącym za pośrednictwem FAS-R albo p55-TNF-R, albo innych cytotoksycznych mediatorów albo induktorów;

i wybrana jest z grupy składającej się z:

(a) sekwencji DNA kodującej izoformę G mającą sekwencję aminokwasową przedstawioną na Fig. 1;

(b) sekwencji DNA kodującej izoformę G1 mającą sekwencję aminokwasową przedstawioną na Fig. 2 (c) sekwencji DNA kodującej przynajmniej część polipeptydu mającego sekwencję aminokwasową jak pokazana na Fig. 1 lub Fig. 2.

(d) sekwencji DNA obejmującej przynajmniej część sekwencji przedstawionej na Fig. 1 i kodującej przynajmniej jedną izoformę białka G1, izoformę G1a;

(e) sekwencji DNA obejmującej przynajmniej część sekwencji przedstawionej na Fig. 2 kodującej przynajmniej jedną izoformę białka G1, izoformę G1b;

(f) sekwencji cDNA pochodzącej z regionu kodującego natywnej izoformy białka G1;

(g) sekwencji DNA kodującej fragment, analog lub pochodną polipeptydu kodowanego przez dowolną z sekwencji DNAz (a) do (f);

(h) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji dowolną sekwencją z (a) do (g) w umiarkowanie ostrych warunkach i która koduje biologicznie aktywną izoformę białka G1;i (i) sekwencji DNA, która w wyniku właściwości kodu genetycznego jest zdegenerowana do sekwencji DNA określonych w (a) do (h) i która koduje biologicznie aktywną izoformę białka G1.

PL 193 394 B1

Ponadto wynalazek dotyczy wektora zdolnego do ulegania ekspresji w komórce eukariotycznego lub prokariotycznego gospodarza, który obejmuje określoną powyżej sekwencję DNA według wynalazku.

Korzystnie wektor jest rekombinowanym wirusem zwierzęcym niosącym sekwencję DNA kodującą wirusowe białko powierzchniowe (ligand), zdolne do wiązania ze swoistym receptorem powierzchniowym komórki na powierzchni komórek niosących FAS-R lub p55-R i drugą sekwencję obejmującą sekwencję DNA według wynalazku. Korzystnie receptor powierzchniowy komórki jest specyficzny dla komórek nowotworowych, komórek zakażonych HIV lub innych chorych komórek.

W zakres wynalazku wchodzi również szczep transformowanej komórki gospodarza eukariotycznego zawierającej wektor według wynalazku oraz szczep transformowanej komórki gospodarza prokariotycznego zawierającej wektor według wynalazku.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polipeptydu o aktywności białka G1, obejmującego hodowanie szczepu transformowanej komórki gospodarza według wynalazku zawierającej określony powyżej wektor według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji polipeptydu umożliwiających post-translacyjne modyfikacje, jeżeli to konieczne dla otrzymania i izolowania polipeptydu.

W zakres wynalazku wchodzi również polipeptyd o aktywności białka G1, wybrany z grupy obejmującej:

i. izoformę G1 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 1;

ii. izoformę G1 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 2;

iii. przynajmniej część polipeptydu o sekwencji aminokwasowej jak pokazana na Fig. 1 lub Fig. 2;

iv. przynajmniej część sekwencji przedstawionej na Fig. 1 obejmującej przynajmniej jedną izoformę białka G1, izoformę G1a;

który ma następujące własności:

a. ma zdolność wiązania lub interakcji bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub dowolnym z białek wiążących MORT-1, albo innymi wewnątrzkomórkowymi białkami mediatorowymi/modulatorowymi; i

b. ma zdolność pośredniczenia w wewnątrzkomórkowym działaniu zachodzącym za pośrednictwem FAS-R lub p55-TNF-R, lub innych cytotoksycznych mediatorów lub induktorów.

Wynalazek dotyczy też sposobu in vitro modulowania śmierci komórkowej albo procesów zapalnych obejmującego traktowanie komórek jednym bądź wieloma polipeptydami według wynalazku, przy czym traktowanie komórek obejmuje dostarczenie do komórek jednego lub więcej polipeptydów w postaci odpowiedniej do ich wewnątrzkomórkowego wprowadzenia lub dostarczenie do komórek sekwencji DNA według wynalazku w postaci odpowiedniego wektora niosącego tę sekwencję, który jest zdolny do skutecznego jej dostarczenia do komórek tak, że sekwencja DNA jest wyrażana wkomórkach.

Korzystnie polipeptyd ma zdolność bezpośredniego lub pośredniego wiązania z MORT-1 i/lub z dowolnym białkiem wiążącym MORT-1, który to MORT-1 z kolei wiąże się swoiście z FAS-IC, albo który jest zdolny do wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub dowolnym z białek wiążących MORT-1, przy czym MORT-1 z kolei wiąże się z TRADD, które z kolei wiąże się z p55-IC.

Korzystnie, polipeptyd jest przynajmniej jedną z izoform G1, jej analogiem, fragmentem lub pochodną.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu in vitro modulowania działania liganda FAS-R albo TNF na komórki posiadające FAS-R albo p55-R obejmującego traktowanie komórek jednym albo wieloma polipeptydami określonymi powyżej według wynalazku, przy czym traktowanie komórek obejmuje dostarczenie do komórek jednego lub więcej polipeptydów w postaci odpowiedniej do ich wewnątrzkomórkowego wprowadzenia, lub dostarczenie do komórek sekwencji DNA według wynalazku kodującej jeden lub więcej polipeptydów, w postaci odpowiedniego wektora niosącego tę sekwencję, który ma zdolność skutecznego dostarczania sekwencji do komórek tak, że sekwencja DNA jest wyrażana w komórkach.

Korzystnie traktowanie komórek obejmuje dostarczanie do komórek polipeptydów, sekwencji DNA kodującej jeden ztych polipeptydów w postaci odpowiedniego wektora nosącego tę sekwencję, który ma zdolność skutecznego dostarczania sekwencji do komórek tak, że sekwencja DNA jest wyra8

PL 193 394 B1 żana w komórkach. Bardziej korzystnie traktowanie komórek odbywa się przez transfekcję komórek rekombinowanym zwierzęcym wirusem jako wektorem według wynalazku.

Korzystnie polipeptyd ma zdolność wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub z dowolnym białkiem wiążącym MORT-1, który to MORT-1 z kolei wiąże się swoiście z FAS-IC, albo który jest zdolny do wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub dowolnym z białek wiążących MORT-1, który to MORT-1 z kolei wiąże się z TRADD, które z kolei wiąże się z p5-54C.

Korzystnie polipeptyd jest przynajmniej jedną z izoform G1, jej analogiem, fragmentem lub pochodną.

Wynalazek dotyczy również sposobu in vitro modulowania śmierci komórkowej lub procesów zapalnych, obejmującego traktowanie komórek jednym lub więcej inhibitorami białek/enzymów pośredniczących w śmierci komórkowej lubw procesach zapalnych, które są wybrane z grupy obejmującej:

(i) jeden lub więcej polipeptydów według wynalazku określonych powyżej zdolnych do hamowania śmierci komórkowej lub procesów zapalnych i (ii) inhibitory jednego lub więcej polipeptydów według wynalazku, które nasilają/wzmagają lub pośredniczą w śmierci komórkowej lub procesach zapalnych.

Korzystnie polipeptyd ma zdolność bezpośredniego lub pośredniego wiązania z MORT-1 i/lub z dowolnym białkiem wiążącym MORT-1, który to MORT-1 z kolei wiąże się swoiście z FAS-IC, albo który jest zdolny do wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub dowolnym z białek wiążących MORT-1, przy czym MORT-1 z kolei wiąże sięz TRADD, które z kolei wiąże się z p55-IC.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób in vitro modulowania działania liganda FAS-R lub TNF na komórki niosące FAS-R lub p55-R obejmujący traktowanie tych komórek sekwencją oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną dla przynajmniej jednej części sekwencji DNA według wynalazku, przy czym sekwencja oligonukleotydowa jest zdolna do blokowania ekspresji białka G1.

Korzystnie sekwencja oligonukleotydowa jest dostarczona do komórek przez korzystny wektor według wynalazku, który jest rekombinowanym wirusem zwierzęcym niosącym sekwencję DNA kodującą wirusowe białko powierzchniowe (ligand), zdolne do wiązania ze swoistym receptorem powierzchniowym komórki na powierzchni komórek niosących FAS-R lub p55-R i drugą sekwencję, a druga sekwencja wirusowa koduje sekwencję oligonukleotydową.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób in vitro modulowania działania liganda FAS-R lub TNF na komórki niosące FAS-R lub p55-R, który obejmuje stosowanie procedury rybozymu, w której wektor kodujący sekwencję rybozymu zdolną do interakcji z komórkową sekwencją mRNA kodującą polipeptyd według wynalazku wprowadza się do komórek w postaci, która umożliwia ekspresję sekwencji rybozymu w komórkach i w którym wytwarzana w komórkach sekwencja rybozymu ulega interakcji z komórkową sekwencją mRNA i przecina tę sekwencję mRNA powodując zahamowanie wyrażania polipeptydu w komórkach.

Inny sposób według wynalazku dotyczy izolowania i identyfikowania polipeptydu według wynalazku i obejmuje stosowanie procedury podwójnej hybrydy drożdżowej, w której drożdżowe komórki gospodarza transformuje się dwoma wektorami hybrydowymi, z których jeden niesie sekwencję kodującą białko MORT-1 i/lub białko wiążące MORT-1, a drugi wektor hybrydowy niesie sekwencję z biblioteki cDNA albo genomowego DNA, po czym stransformowane komórki izoluje się, następnie ekstrahuje drugi wektor hybrydowy w celu uzyskania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z białkiem MORT-1 i/lub białkami wiążącymi MORT-1.

Wynalazek obejmuje też sposób in vitro modulacji wywoływanego przez MORT-1 działania na komórki białka wiążącego MORT-1 albo działania wywoływanego przez inne białko, w którym komórki traktuje się sekwencją DNA według wynalazku w postaci odpowiedniego wektora niosącego taką sekwencję lub polipeptydem według wynalazku w postaci odpowiedniej do wprowadzenia do komórek, przy czym traktowanie powoduje wzmocnienie albo hamowanie działania zachodzącego za pośrednictwem MORT-1 albo białka wiążącego MORT-1 albo innego białka, a tym samym również działania

PL 193 394 B1 zachodzącego za pośrednictwem FAS-R albo p55-R, albo innego mediatora albo induktora cytotoksycznego.

Korzystnie polipeptyd jest tą częścią polipeptydu, która jest swoiście zaangażowana w wiązanie się z MORT-1 albo białkiem wiążącym MORT-1 albo innym białkiem.

Bardziej korzystnie polipeptyd jest dowolną z izoform G1 zdolną do wzmacniania działania na komórki związanego z działaniem MORT-1 albo białka wiążącego MORT-1 albo innego białka, a tym samym również działania na komórki FAS-R albo p55-R albo innego mediatora bądź induktora cytotoksycznego.

Innym sposobem według wynalazku jest sposób in vitro modulowania procesów apoptozy albo procesów programowanej śmierci komórkowej obejmujący traktowanie komórek jednym lub wieloma polipeptydami według wynalazku, przy czym traktowanie obejmuje dostarczenie do komórek jednego lub więcej polipeptydów w postaci odpowiedniej do jej wewnątrzkomórkowego wprowadzenia, lub dostarczenie komórkom sekwencji DNA według wynalazku w postaci odpowiedniego wektora niosącego tę sekwencję, który jest zdolny do skutecznego dostarczenia tej sekwencji do komórek wtaki sposób, że sekwencja DNA jest wyrażana w tych komórkach.

Innym sposobem według wynalazku jest sposób przesiewowego badania ligandu zdolnego do wiązania się z polipeptydem o aktywności białka G1 według wynalazku obejmujący kontaktowanie matrycy do chromatografii powinowactwa, do której przyłączony jest polipeptyd, z wyciągiem komórkowym, dzięki czemu ligand zostaje związany z matrycą, po czym wymywa się, izoluje i analizuje ligand.

Jeszcze innym sposobem według wynalazku jest sposób przesiewowego badania sekwencji DNA kodującej ligand zdolny do wiązania się z polipeptydem według wynalazku obejmujący stosowanie procedury podwójnej hybrydy drożdżowej, w której drożdżowe komórki gospodarza transformuje się dwoma wektorami hybrydowymi, z których jeden niesie sekwencję kodującą białko MORT-1 i/lub białko wiążące MORT-1, a drugi wektor hybrydowy niesie sekwencję z biblioteki cDNA albo genomowego DNA, po czym stransformowane komórki izoluje się, następnie ekstrahuje się drugi wektor hybrydowy wcelu uzyskania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z białkiem MORT-1 i/lub białkami wiążącymi MORT-1.

Sposób według wynalazku dotyczy również identyfikacji i wytwarzania liganda zdolnego do modulowania komórkowej aktywności modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem MORT-1 albo za pośrednictwem białek wiążących MORT-1, i obejmuje:

(a) badanie przesiewowe na ligand zdolny do wiązania się z polipeptydem zawierającym przynajmniej część MORT-1 albo białek wiążących MORT-1, wybranych spośród białek MACH, białek Mch4 i innych białek wiążących MORT-1;

(b) identyfikację i scharakteryzowanie liganda, innego niż MORT-1 albo białka wiążące MORT-1 albo części receptora z rodziny receptorów TNF/NGF, znalezionego na etapie przesiewania, zdolnego do wymienionego wiązania; oraz (c) wytwarzanie liganda w zasadniczo izolowanej i oczyszczonej postaci.

Sposób według wynalazku dotyczy również identyfikacji i izolowania liganda zdolnego do modulowania aktywności komórkowej modulowanej lub zachodzącej za pośrednictwem polipeptydu według wynalazku i obejmuje:

(a) badanie przesiewowe na ligand zdolny do wiązania się z polipeptydem obejmującym polipeptyd kodowany przez DNA o sekwencji wybranej z grupy składającej się z:

i) sekwencji DNA kodującej izoformę G1 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 1;

ii) sekwencji DNA kodującej izoformę G1 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 2 iii) sekwencji DNA kodującej przynajmniej część polipeptydu o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 1 lub Fig. 2.

(b) identyfikację i scharakteryzowanie liganda innego niż MORT-1 albo białka wiążące MORT-1 albo części receptora z rodziny receptorów TNF/NGF, znalezionego na etapie przesiewania, zdolnego do wymienionego wiązania; oraz (c) wytwarzanie liganda w zasadniczo izolowanej i oczyszczonej postaci.

Ponadto sposób według wynalazku dotyczy identyfikacji i wytwarzania liganda zdolnego do modulowania aktywności komórkowej modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem G1 i obejmuje:

PL 193 394 B1 (a) badanieprzesiewowenaligandzdolnydowiązaniasięzpolipeptydemkodowanymprzez DNAosekwencji wybranej z grupy składającej się z:

(i) sekwencjiDNAkodującejizoformęG1osekwencjiaminokwasowejprzedstawionej naFig.1;

(ii) sekwencjiDNAkodującejizoformęG1osekwencjiaminokwasowejprzedstawionej naFig.2 (iii) sekwencjiDNAkodującejprzynajmniej częśćpolipeptyduosekwencjiaminokwa-sowej przedstawionejnaFig.1lubFig.2.

(b) identyfikację i scharakteryzowanie liganda innego niż MORT-1 albo białka wiążące MORT-1 albo części receptora z rodziny receptorów TNF/NGF, znalezionego na etapie przesiewania,zdolnegodowymienionegowiązania;oraz (c) wytwarzanie liganda w zasadniczo izolowanej i oczyszczonej postaci.

Sposób według wynalazku dotyczy również identyfikacji i izolacji cząsteczki zdolnej do modulowania aktywności komórkowej modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem G1, i obejmuje:

(a) badanie przesiewowe na cząsteczkę zdolną do modulowania aktywności modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem G1 ;

(b) identyfikację i scharakteryzowanie cząsteczki i (c) wytwarzanie cząsteczki w zasadniczo izolowanej i oczyszczonej postaci.

Sposób według wynalazku dotyczy też identyfikacji i izolacji cząsteczki zdolnej do bezpośredniego albo pośredniego modulowania aktywności komórkowej modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem polipeptydu według wynalazkuiobejmuje:

(a) badanie przesiewowe na cząsteczkę zdolną do modulowania aktywności modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem polipeptydu według wynalazku;

Ponadtowynalazekdotyczykompozycjifarmaceutycznej zawierającejskładnikaktywnyiewentualniefarmaceutycznie dopuszczalnynośnik,którajakoskładnikaktywnyzawiera substancjęwybraną z grupy składającej się z:

(a) sekwencji DNA według wynalazku;

(b) korzystnegowektorawedługwynalazku,któryjest rekombinowanymwirusemzwierzęcym niosącym sekwencjęDNAkodującąwirusowebiałkopowierzchniowe(ligand),zdolnedowiązaniaze swoistym receptorem powierzchniowym komórki na powierzchni komórek FAS-R lub p55-R idrugą sekwencję obejmującą sekwencję DNA według wynalazku;

(c) polipeptydu według wynalazku.

Gdy składnikiem aktywnym kompozycji według wynalazku jestrekombinowanywiruszwierzęcy, wówczas korzystnie DNA kodujeliganda,któryjestzdolnydowiązaniazreceptorem powierzchniowym komórki specyficznym dla komórek nowotworowych,komórekzakażonychHIVlubinnychchorych komórek.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie wektora zdolnegodowiązaniasięzreceptorem powierzchniowym komórki specyficznym dla komórek nowotworowych, komórek zakażonych HIVlubinnychchorychkomórekdowytwarzaniakompozycji farmaceutycznej do leczenia nowotworów,AIDSlubinnych choróbeksponującychswoistereceptorynapowierzchnikomórek oraz zastosowaniesekwencjiDNAwedługwynalazkudowytwarzaniakompozycjifarmaceutycznejdomodulowaniadziałania liganda FAS-R lub TNF lub innego białka działającego na komórkilubdoleczeniaszoku septycznego, odrzucania przeszczepu, ostrego zapalenia wątroby, cukrzycy, stwardnienia rozsianego lubAIDS.

Wynalazek obejmuje też zastosowania wektora, który jest rekombinowanym wirusem zwierzęcym niosącym sekwencję DNA kodującąwirusowebiałkopowierzchniowe,(ligand),zdolnedo wiązania ze swoistym receptorem powierzchniowym komórki na powierzchni komórek niosących FAS-R lub p55-R i drugą sekwencję DNA obejmującą sekwencję według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania działania liganda FAS-R lub TNF lub innego białka na komórki lub do leczenia szoku septycznego, odrzucania przeszczepu, ostrego zapalenia wątroby, cukrzycy, stwardnienia rozsianego lubAIDS.

W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie polipeptydu według wynalazku do wytwarzania kompozycjifarmaceutycznejdo modulowania działania liganda FAS-R lub TNF lub innego białka na

PL 193 394 B1 komórki lub do leczenia szoku septycznego, odrzucania przeszczepu, ostrego zapalenia wątroby, cukrzycy, stwardnienia rozsianego lub AIDS.

Nowe wyizolowane białko według wynalazku, G1, jest zdolne do wiązania się z, albo do interakcji z Mch4, które samo wiąże się z MORT-1, które wiąże się z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R. G1 może współdziałać z innym białkiem wiążącym MORT-1, zwanym MACH i może również być zdolne do bezpośredniego wiązania się albo interakcji z MORT-1. G1 prawdopodobnie funkcjonuje jako składnik modulatorowy szlaku śmierci komórkowej zapoczątkowanego przez związanie liganda FAS z FAS-R na powierzchni komórki, a to dzięki temu, że ma rejon proteolityczny podobny do rejonów proteolitycznych Mch4 i MACH, i dlatego G1 może również być aktywną proteazą wewnątrzkomórkową. Ponadto, zależnie od procesów transkrypcji/translacji w ekspresji G1, zwłaszcza jego rejonu proteolitycznego, mogą powstawać w wyniku ekspresji pewne izoformy G1 bez aktywnego rejonu proteolitycznego i jako takie mogą służyć jako antagoniści aktywności proteolitycznej, zachodzącej za pośrednictwem, na przykład Mch4 i MACH. Sugerowano udział proteaz z rodziny CED3/ICE w procesach apoptozy wyzwalanych przez FAS-R. MORT-1 (albo FADD) wiąże się z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R po aktywacji tego receptora, a nowe białko G1 według niniejszego wynalazku wiąże się z białkami wiążącymi MORT-1, takimi jak Mch4 i może również wiązać się z MACH, albo bezpośrednio z MORT-1. Białko G1, sklonowane i scharakteryzowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, może istnieć w licznych izoformach, z których niektóre mają rejon homologiczny z CED3/ICE, który ma aktywność proteolityczną (domenę proteolityczną), podobną do domen Mch4 i pewnych izoform MACH, i mogą spowodować śmierć komórki, gdy są wyrażone w komórkach. W ten sposób, aktywacja tego nowego homologu CED3/ICE (tj. różnych izoform G1 mających domenę proteolityczną) przez FAS-R (poprzez bezpośrednią albo pośrednią interakcję z MORT-1) wydaje się stanowić składową efektorową szlaku śmierci komórkowej, w którym bierze udział FAS-R.

Ponadto, G1 wydaje się działać jako składowa efektorowa szlaku śmierci komórkowej inicjowanego przez związanie TNF z p55-R na powierzchni komórki, a to przez pośredni mechanizm wiązania MORT-1 z TRADD, białkiem, które wiąże się z wewnątrzkomórkową domeną p55-R (Hsu i wsp., 1995), następnie, albo równocześnie, następuje związanie się G1 z białkami wiążącymi MORT-1, takimi jak na przykład Mch4 albo MACH, albo wiązanie się z MORT-1 bezpośrednio, z aktywacją G1 do aktywnej proteazy zaangażowanej w śmierć komórki.

Należy również zauważyć, iż choć G1 wykazuje przynajmniej pewne cechy sekwencji krytyczne dla funkcji proteaz CED3/ICE, posiada ono jednak pewne odmienne własne cechy sekwencji, które mogą wyposażać je w unikalny i możliwie tkankowo/komórkowo swoisty mechanizm działania.

A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza nowego białka oznaczonego jako G1. To białko G1 wyizolowano i sklonowano metodą testu przesiewowego podwójnej hybrydy i scharakteryzowano jako cząsteczkę, która wiąże się z Mch4. Mch4, jak zauważono powyżej, jest białkiem wiążącym MORT-1, które zdolne jest do wywołania śmierci komórkowej, choć jednak należy również zauważyć, iż pewne izoformy Mch4 mają przeciwny efekt, mianowicie hamują one zabijanie komórki. Ponadto, sekwencjonowanie G1 ujawniło do tej pory, że ma ono w swym rejonie N-końcowym dwa tak zwane „MODUŁY MORT” (MM), które również znajdują się w białkach wiążących MORT-1 MACH i Mch4. Te MODUŁY MORT w G1 wydają się odpowiadać za jego zdolność do wiązania się z Mch4 i mogą również stanowić podstawę dla jego możliwego wiązania się z MORT-1 bezpośrednio oraz dla jego wiązania się z MACH albo swoistymi izoformami MACH (swoistymi wariantami składania MACH). W sekwencji G1 poniżej rejonu N-końcowego, zawierającego MODUŁY MORT wydaje się również znajdować długi rejon wykazujący podobieństwo do proteolitycznego rejonu MACH i Mch4. Ponadto, z początkowej analizy możliwego umiejscowienia sekwencji G1 w ludzkich chromosomach, wydaje się, iż G1 umieszczone jest na chromosomie 2 bardzo blisko położenia Mch4 i MACH, co również wskazuje na pokrewieństwo pomiędzy G1, MACH i Mch4.

Bardziej szczegółowo, znaleziono przynajmniej trzy możliwe izoformy G1 według niniejszego wynalazku (patrz Przykład 1 poniżej). Dwie z nich wyizolowano i sklonowano i wydają się one reprezentować dwa warianty składania nowego białka, oznaczonego G1 (albo CASH). Te dwie izoformy zwane są G1a (albo CASHa) dla izoformy większej oraz G1b (albo CASHb) dla krótszej izoformy (choć wydaje się istnieć więcej niż jedna krótka izoforma, stąd G1b jest również oznaczana G1b, a druga krótka izoforma oznaczana jest G1b 2 - patrz Przykład 1 poniżej). Każda z tych izoform G1a i b zawiera dwa N-końcowe motywy domeny śmierci/ MODUŁY MORT i może wiązać się ze sobą przez te motywy domeny śmierci i może również wiązać się z MORT-1, MACH i Mch4 poprzez te motywy domeny śmierci. Dłuższa izoforma G1a ma unikalną część C-końcową (w porównaniu z krótszą

PL 193 394 B1 izoformą G1b), przy czym ta unikalna część C-końcowa wykazuje homologię sekwencji z rejonem aktywności proteazowej kaspazy. W odniesieniu do biologicznej aktywności, krótsza izoforma G1b hamuje śmierć komórkową/cytotoksyczność zachodzącą za pośrednictwem p55-R i FAS-R, zaś, przeciwnie, dłuższa izoforma G1a wywiera działanie cytotoksyczne na przynajmniej pewne typy komórek (np. komórki 293), w którą to cytotoksyczność zaangażowany jest jej rejon o homologii z proteazą. Jednakże, należy również zauważyć, iż dłuższa izoforma G1 jest również zdolna do hamowania cytotoksyczności zachodzącej za pośrednictwem FAS-R i p55-R w innych typach komórek (np. komórkach HeLa). Te wyniki wskazują, iż G1 (mianowicie, jego różne izoformy) działają jako osłabiacz/inhibitor i/lub inicjator/wzmacniacz zachodzącej za pośrednictwem p55-R i FAS-R sygnalizacji śmierci komórkowej.

Należy również zauważyć, iż dla jasności różne izoformy G1, na przykład G1a i G1b, będą często określane tu po prostu jako „G1”, ale należy rozumieć wtych przypadkach, że wszystkie izoformy G1 należy objąć znaczeniem „G1” tak, że może to oznaczać zarówno induktory/wzmacniacze cytotoksyczności komórkowej, jak również inhibitory/osłabiacze cytotoksyczności komórkowej. Gdy ma się na myśli swoistą izoformę G1, zostanie ona nazwana swoiście, np. G1a albo G1b, zależnie od przypadku. Zatem, gdy „G1” jest stosowane zbiorczo do określenia różnych izoform będzie również często określane tutaj jako „modulator”, co oznacza, że może być hamujące albo wzmacniające względem omawianej aktywności biologicznej.

W świetle powyższego wynika jak zauważono powyżej, i jak przedstawiono poniżej, że G1 jest najwyraźniej modulatorem aktywności MORT-1, a stąd modulatorem działań komórkowych zachodzących za pośrednictwem FAS-R jak również p55-R, a także być może innych receptorów z rodziny receptorów TNF/NGF, a także innych, które mogą mieć wspólne składniki i mechanizmy sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.

A zatem, ponieważ G1 ma rejon proteazopodobny (przynajmniej izoforma długa), może być ono odpowiedzialne bezpośrednio za cytotoksyczność komórkową i zapalenie powodowane albo wzbudzane przez różne bodźce, wtym bodźce przekazywane przez receptory z rodziny receptorów TNF/NGF, a także być może inne.

G1 może również służyć jako inhibitor cytotoksyczności komórkowej i zapalenia dzięki obecności jako część kompleksu innych białek i jako takie może wpływać na działania cytotoksyczne i zapalne tych innych białek (np. MACH i Mch4 albo nawet MORT-1), ostatecznie powodując zahamowanie aktywności cytotoksycznej albo ich aktywności w zapaleniu.

G1 może również służyć jako wzmacniacz albo intensyfikator cytotoksyczności komórkowej i zapalenia, a to przez wzmocnienie aktywności innych białek (np. Mch4 i MACH albo nawet MORT-1) przez związanie się z nimi i zaangażowanie ich w wiązanie się z MORT-1 albo działając niezależnie od MORT-1, przy czym w każdym przypadku to zaangażowanie służy do wzmożenia aktywności cytotoksycznej różnych białek albo wzmożeniu ich działań zapalnych.

Podobnie, w analogiczny sposób G1 może również służyć jako inhibitor albo wzmacniacz innych mediatorów albo modulatorów wewnątrzkomórkowych, mających szlaki, w których aktywnie uczestniczy G1.

MORT-1 (skrót od ang. „Mediator of Receptor Toxicity”, Boldin i wsp., 1995b) zdolny jest do wiązania się z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R. To białko wiążące FAS wydaje się działać jako mediator albo modulator działania ligandu FAS-R na komórki poprzez pośredniczenie walbo modulowanie wewnątrzkomórkowego procesu sygnalizacyjnego, co zwykle zachodzi po związaniu się ligandu FAS-R z powierzchnią komórki. W dodatku do swoistości względem wiązania się zFAS, MORT-1, jak wykazano, ma inne cechy charakterystyczne (patrz Przykład Odniesienia 1), na przykład ma rejon homologiczny z rejonami „domeny śmierci” (DD) p55-TNF-R i FAS-R (p55-DD i FAS-DD) i tym samym zdolny jest również do samowiązania się. MORT-1 jest również zdolny do aktywowania cytotoksyczności komórkowej samodzielnie, aktywności być może związanej z jego zdolnością do samowiązania się. Stwierdzono, że wspólna ekspresja rejonu w MORT-1, który zawiera sekwencję homologiczną do „domeny śmierci” (MORT-DD, obecna w C-końcowej części MORT-1) bardzo utrudnia indukowaną przez FAS śmierć komórkową, jak należałoby oczekiwać z jej zdolności do wiązania się z „domeną śmierci” FAS-IC. Ponadto, wtych samych warunkach doświadczalnych, stwierdzono, iż wspólna ekspresja części MORT-1, która nie zawiera rejonu MORT-DD (N-końcowej części MORT-1, aminokwasy 1-117, „głowa MORT-1”) powodowała brak zakłóceń w indukowanej przez FAS śmierci komórkowej i, o ile w ogóle, nieco wzmagała cytotoksyczność komórkową wywoływaną przez FAS.

PL 193 394 B1

Zgodnie ztym, prawdopodobne jest, że MORT-1 wiąże się również z innymi białkami, zaangażowanymi w proces sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Te białka wiążące MORT-1 mogą zatem działać jako pośrednie mediatory albo modulatory działania ligandu FAS-R na komórki poprzez pośredniczenie albo modulowanie aktywności MORT-1; albo też te białka wiążące MORT-1 mogą działać bezpośrednio jako mediatory albo modulatory związanego z MORT-1 procesu sygnalizacji wewnątrzkomórkowej poprzez pośredniczenie albo modulację aktywności MORT-1, które, jak zauważono powyżej, ma, rzecz jasna, niezależną zdolność do aktywowania cytotoksyczności komórkowej. Te białka wiążące MORT-1 mogą również być wykorzystywane w dowolnych standardowych procedurach przesiewowych wcelu izolacji, identyfikacji i charakteryzacji dodatkowych białek, peptydów, czynników, przeciwciał itp., które mogą być zaangażowane w związany z MORT-1 albo związany z FAS-R proces sygnalizacji albo mogą być elementami innych wewnątrzkomórkowych procesów sygnalizacyjnych. Takie białka wiążące MORT-1 wyizolowano i opisano jak wspomniano powyżej we wspólnym, równoległym izraelskim zgłoszeniu nr IL 114,615, 114,986, 115,319, 116,588, 117,932 oraz odpowiadającym im zgłoszeniu patentowym PCT PCT/US96/10521 (jeśli chodzi o MACH i jego izoformy) jak również przez innych, Fernandes-Alnemri i wsp. (1996) i Srinivasula i wsp. (1996) (jeśli chodzi o Mch4 i inne takie białka Mch). Jedno z tych białek wiążących MORT-1, oraz wyżej wspomniane MACH, początkowo sklonowano, zsekwencjonowano i częściowo scharakteryzowano jako posiadające następujące właściwości: cDNA MACH koduje otwartą ramkę odczytu ORF-B; MACH wiąże się z MORT-1 w bardzo silny i swoisty sposób; miejsce wiążące MACH na MORT-1 występuje wgórę od motywu „domeny śmierci” MORT-1; rejon ORF-B MACH jest jego częścią współdziałającą z MORT-1; i MACH jest zdolny do samowiązania się i wywoływania cytotoksyczności komórkowej samodzielnie. Ponadto, dalsza analiza jak przedstawiono w powyższych wspólnych, równoległych zgłoszeniach patentowych, jak również w publikacji Boldin i wsp., (1996) wykazała, że MACH w rzeczywistości istnieje w wielu izoformach. Ponadto, MACH ORF-B powyżej wymieniany jest w rzeczywistości jedną z izoform MACH, oznaczoną jako MACHb1. W powyższych publikacjach dotyczących Mch4 wykazano również, że to białko także wiąże się z MORT-1 (albo FADD) i jest bezpośrednio zaangażowane w cytotoksyczność komórkową z MORT-1 lub niezależnie od niego, a to dzięki swej aktywności proteolitycznej.

Ponadto, pewne izoformy G1 mogą mieć tylko rejon proteazopodobny (z homologią do wyżej wspomnianych rejonów proteazowych innych znanych proteaz), ale który nie ma rzeczywistej aktywności proteazy, a w rezultacie takie izoformy mogą odgrywać głównie rolę hamującą jak wspomniano powyżej.

Ponadto, ponieważ G1 albo dowolna z jego izoform może być zaangażowana w modulowanie niezależnych od MORT-1 szlaków przekaźnictwa komórkowego, G1 albo dowolna zjego izoform może być zaangażowana w modulowanie sygnalizacji dowolnych innych wewnątrzkomórkowych szlaków albo mechanizmów.

Inne aspekty i przykładowe wykonania niniejszego wynalazku zostaną również podane, ponieważ wynikają z następującego szczegółowego opisu wynalazku.

Należy zauważyć, iż stosowane tu następujące terminy: „Modulacja działania ligandu FAS albo TNF na komórki”; oraz „Modulacja działania MORT-1 albo białka wiążącego MORT-1 na komórki” należy rozumieć jako obejmujące traktowanie in vitro i, dodatkowo, obejmujące także hamowanie albo wzmacnianie/intensyfikację.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

Na Fig. 1A przedstawiono schematycznie wstępną sekwencję nukleotydową jednej z izoform białkaG1jak wyszczególniono w Przykładzie 1.

Na Fig. 1B przedstawiono schematycznie wywnioskowaną sekwencję aminokwasową izoformy przedstawionej na Fig. 1A. Na Fig. 2 przedstawiono schematycznie wstępną nukleotydową i wywnioskowaną aminokwasową sekwencję drugiej izoformy białka G1jakprzedstawionowPrzykładzie1.

Na Fig. 3 przedstawiono schematycznie porównanie sekwencji aminokwasowych ludzkich (hCASHa, hCASHb) G1 (albo CASH) i mysich (mCASHa) wariantów składanieowych i konserwatywne motywy znajdowane wtych białkach. Na Fig. 3 przedstawiono współliniowy układ sekwencji aminokwasów mysiego G1a (mCASHa), ludzkiego G1a (hCASHa) i G1b (hCASHb), CASP-8 (MACH/FLICE1/Mch5), CASP-10 (Mch4/FLICE2), CASP-3 (CPP32/Apopain/Yama) i CASP-1 (ICE). CASP-1 i CASP-3 przedstawiono bez ich rejonów prodomen. Reszty aminokwasowe ponumerowano doprawej strony każdej sekwencji.Linie przerywane wskazują przerwy wsekwencji w celu umożliwienia optymalnego układu. Zacieniowano moduły „domen śmierci” (DED). Aminokwasy, które są identyczne wponad trzech przedstawionych białkach są wramkach. Wewnątrz rejonu homologii prote14

PL 193 394 B1 azowej, aminokwasy ustawione z resztami CASP-1, w przypadku których zasugerowano rolę w aktywności katalitycznej na podstawie krystalografii rentgenowskiej oznaczono jak następuje: Reszty potencjalnie zaangażowane w katalizę, odpowiadające His237 i Cys285 w CASP-1 są zacieniowane i oznaczone przez zamalowane kółka poniżej układu. Reszty stanowiące kieszonkę wiążącą dla karboksylanowego łańcucha bocznego P1 Asp, odpowiadające Arg179, Gln238, Arg341 i Ser347 w CASP-1 są mniej zacieniowane i oznaczone pustymi kółkami. Znane i sugerowane miejsca przecięcia Asp-X oraz potencjalne miejsce cięcia znalezione w podobnym położeniu w G1 (CASH) zacieniowano. Poziome strzałki wskazują N-końce i C-końce małej i dużej podjednostki CASp-1. C-końce białek oznaczono gwiazdkami.

Na Fig.4 (A, B) przedstawiono reprodukcje autoradiogramów z Northern blotów, ukazujące identyfikację transkryptów G1 w różnych tkankach ludzkich (serce, mózg, łożysko, płuco, wątroba, mięsień szkieletowy, nerka, trzustka, śledziona, grasica, prostata, jądro, jajnik, jelito cienkie, jelito grube i limfocyty krwi obwodowej - PBL). Analizę Northern blot przeprowadzono jak następuje: Wytworzono wyznakowaną izotopem sondę mRNA odpowiadającą rejonowi modułu „domeny śmierci” (DED) G1 (z nukleotydów nr 482-1070 w G1b (patrz Fig. 2), rejonu wspólnego dla obydwu sklonowanych wariantów składania G1 (CASH)) przy użyciu polimerazy RNA T7 (Promega) i zastosowano do analizy licznych ludzkich blotów tkankowych (Clontech), zawierających poli(A)⁺RNA (2 mg na ścieżkę) różnych tkanek ludzkich.

Na Fig. 5 przedstawiono schematycznie wyniki, ukazujące interakcję G1a (CASHa) iG1b (CASHb) z innymi białkami zawierającymi „domenę śmierci” (DED) wewnątrz transfekowanych drożdży (np. MORT-1/FADD, MACHa1 (CASP-8a1), MACHb1 (CASP-8b1), MACHb4 (CASP-8b4), Mch4 (CASP-10), G1b (CASHa), G1b (CASHb), p55-R (p55ic), RIP, TRADD i Laminina (kontrola negatywna)). Właściwości wiążące G1b (CASHb), jak również G1a (CASHa) oceniono w szczepie reporterowym drożdży SFY526 (Clontech), przy użyciu domeny wiążącej DNA pGBT9-GAL4 oraz wektorów aktywujących domenę pGAD1318 i pGADGH-GAL4. Ilościową ocenę wiązania w drożdżach przez test filtrowania ekspresji b-galaktozydazy przeprowadzono jak podano w Przykładach Odniesienia 1-3. Wyniki wyrażono jako czas wymagany dla osiągnięcia mocnego koloru. We wszystkich testowanych przypadkach, uzyskano identyczne wyniki, gdy umieszczono testowane wstawki w konstruktach domeny wiążącej DNA i domeny aktywacyjnej w obydwu połączeniach. Żadna z badanych wstawek nie wykazywała interakcji z kilkoma białkami kontrolnymi, do których należały wewnątrzkomórkowe domeny ludzkiego p55-R (CD120a), p75-R (CD120b), CD40, laminina, i puste wektory Gal4.

Na Fig. 6 (A-D) przedstawiono wyniki, ukazujące działanie G1a (CASHa), G1b (CASHb), i mutantów G1a (CASHa) na żywotność komórek i wzbudzanie śmierci komórkowej. Ilościowa ocena śmierci komórek wywołanej w komórkach HeLa-Fas (wyniki przedstawiono schematycznie jako wykresy słupkowe na Fig. 6A) i komórkach 293-T (wyniki przedstawiono schematycznie jako wykresy słupkowe na Fig. 6B i 6C) poprzez transfekcję tych komórek wskazanymi konstruktami została przeprowadzona jak podano w Przykładzie 1. Komórki (5x10⁵ komórek 293T albo 3x10⁵ komórek HeLa na 6 cm płytki) przejściowo stransfekowano cDNA wskazanych białek wraz z pCMV- b -gal, przy użyciu metody precypitacji fosforanem wapnia. Każdą płytkę stransfekowano przy użyciu 5 mg danego konstruktu pcDNA3 albo, gdy transfekowano dwoma różnymi konstruktami, po 2,5 mg każdego oraz 1,5 mg wektora ekspresyjnego b-galaktozydazy. Komórki przepłukano 6 do 10 godzin po transfekcji, a następnie inkubowano przez dalszych 14 godzin bez dodatkowej obróbki. Przeciwciało monoklonalne anty-CD95 (anty-FAS-R) (CH11 (Oncor (Gaithersburg, MD)), 0,5 mg.ml) oraz ludzki rekombinowany TNFa (100 ng/ml) nałożono na komórki wraz z cykloheksimidem (CHX, 10 mg/ml) i inkubowano przez dodatkowe 4 godziny. Komórki następnie zabarwiono 5-bromo-4-chloro-3-indoksylo-b-D-galaktopiranozydem (X-Gal) i zbadano w mikroskopie fazowo-kontrastowym. We wszystkich przedstawionych doświadczeniach, śmierć oceniano 24 godziny po transfekcji dla komórek HeLa-Fas i 20 godzin po transfekcji dla komórek 293T. Przedstawione dane (średnia ± SD; n równa się przynajmniej trzem doświadczeniom) są odsetkiem naliczonych niebieskich komórek, który wykazywał pęcherzyki na błonach.

Na Fig. 6D przedstawiono reprodukcje mikrofotografii ukazujące morfologię komórek 293-T, przejściowo wykazujących ekspresję wskazanych konstruktów. Zdjęcia wykonano 20 godzin po transfekcji.

Nowe białka G1 według wynalazku, jak wspomniano powyżej, zdolne są do wiązania się z albo do bezpośredniej bądź pośredniej interakcji z MORT-1 albo białkami wiążącymi MORT-1, takimi jak na przykład Mch4 i MACH, a tym samym wiązania się z wewnątrzkomórkową domeną receptora FAS-R, z którą wiąże się MORT-1, albo wiązania się z wewnątrzkomórkową domeną p55 TNF-R, z którą wiąPL 193 394 B1 że się białko TRADD i z którym to białkiem TRADD wiąże się MORT-1. Stąd, białka G1 według niniejszego wynalazku uważa się za mediatory albo modulatory FAS-R, odgrywające rolę, na przykład, w procesie sygnalizacyjnym, który zapoczątkowany jest przez związanie się ligandu FAS z FAS-R, i podobnie odgrywające rolę w procesie sygnalizacyjnym, który zapoczątkowany jest przez związanie TNF z p55-R. Białko G1 według niniejszego wynalazku obejmuje również jego izoformy.

Nowe białko G1 według niniejszego wynalazku (zwane również CASH) jest oczywiście homologiem proteazy nicienia CED3. To nowe białko G1, choć jest blisko spokrewnione, wykazuje jednak pewne różnice w strukturze i specyficzności substratowej, ijako takie może służyć nieco innym funkcjom w komórkach ssaków. Faktycznie, znane są dwie różne aktywności proteaz. Główną rolą ICE (zwanej również CASP-1) wydaje się być obróbka prekursora IL-1b, zaś CED3, jak jasno wykazano, służy jako efektor w programowanej śmierci komórkowej. Ta ostatnia rola wydaje się być również rolą przynajmniej niektórych homologów ssaczych, na przykład pewnych izoform MACH (zwanego również CASP-8) znanych z wyżej wspomnianych wspólnych i równoległych zgłoszeń patentowych, jak również wyżej wspomnianego spokrewnionego Mch4 (zwanego również CASP-10), z którym wiąże się G1 według niniejszego wynalazku. Sekwencja aminokwasów MACHa1 wykazuje największe podobieństwo do CPP32 (zwanego również CASP-3), najbliższego znanego ssaczego homologu CED3. Swoistość substratowa MACH jest również podobna do swoistości CPP32, z wyjątkiem tego, że MACHa1 wydaje się mieć bardziej ograniczoną swoistość substratową niż CPP32. CPP32 przecina preferencyjnie peptyd substratowy odpowiadający miejscu cięcia w polimerazie poli(ADP rybozy) (PARP), jednak ma również pewną aktywność proteolityczną wobec peptydu odpowiadającą miejscu cięcia ICE w prekursorze IL-1b. MACHa1 wydaje się jednak być jedynie zdolne do przecinania sekwencji pochodzącej z PARP. Te zależności MACHa1 z CPP32 i CED3, i jego różnice wobec ICE, są zgodne z ideą, iż MACHa1 służy, podobnie jak CED3, jako regulator śmierci komórkowej. MACHa1 wykazuje jednak pewne cechy sekwencji, które odróżniają je od CED3 i od CPP32, jak również od innych członków rodziny CED3/ICE. C-końcowa część MACHa1, w górę od jego rejonu homologii z CED3/ICE, nie wykazuje w ogóle podobieństwa do górnego rejonu jakiegokolwiek z innych homologów. Istnieją również pewne unikalne cechy sekwencji w rejonie homologii CED3/ICE tego białka. Te różnice sugerują, iż MACHa1 należy do oddzielnej gałęzi ewolucyjnej rodziny iże jego udział w śmierci komórkowej nieco różni się od uprzednio opisanych homologów CED3/ICE. Podobnie, białko G1 według niniejszego wynalazku ijego możliwe izoformy również wykazują pewne istotne różnice w rejonie homologii CED3/ICE wewnątrz sekwencji G1 ijako takie różnice te mogą reprezentować unikalne cechy, odzwierciedlające swoistość aktywności G1 w komórkach ssaków.

Jedna z ważnych różnic może dotyczyć sposobu, wjaki regulowana jest funkcja proteazy. Z uwagi na uczestnictwo zarówno w związanych z rozwojem procesach śmierci komórkowej oraz w indukowanej przez receptory cytolizie immunologicznej, cięcie białek przez proteazy z rodziny CED3/ICE powinno poddawać się regulacji zarówno przez sygnały, które tworzą się wewnątrz komórki, jak i przez sygnały pochodzące z receptorów powierzchni komórki. W rozwojowych procesach śmierci komórkowej, aktywacja takich proteaz wydaje się obejmować mechanizmy, które wpływają na ekspresję genu, co powoduje wzmożoną syntezę proteaz, jak również zmniejszoną syntezę białek takich jak BCL-2, które antagonizują ich działanie apoptotyczne. Nie ma tu jednak bez wątpienia miejsca dla cytotoksyczności wyzwalanej przez FAS-R albo receptory TNF. Komórki mogą być zabite przez TNF albo ligand FAS-R nawet, gdy ich aktywność syntezy białek jest w pełni zablokowana (są one wówczas w rzeczywistości zabijane nawet skuteczniej) i pozostają zależne od bodźca w takich warunkach. Aktywacja proteaz z rodziny CED3/ICE przez receptory TNF i FAS-R może zatem zachodzić poprzez mechanizm, który jest niezależny od syntezy białek. Unikalne właściwości sekwencji MACHa1 mogą umożliwiać mu wzięcie udziału w takim mechanizmie. Podobnie, unikalne cechy sekwencji białka G1 według niniejszego wynalazku mogą również wyposażać je w zdolność do wzięcia udziału w takim mechanizmie.

A zatem, nowe białko G1 może być jeszcze jednym członkiem ostatnio znalezionej grupy proteaz, obejmującej wyżej wspomniane MACH (i jego izoformy) oraz Mch4, które jak stwierdzono skojarzone są, bezpośrednio lub poprzez białko adaptorowe, z wewnątrzkomórkową domeną receptora na powierzchni komórki. Poprzez wnioskowanie ze sposobu działania związanych z receptorem białek, które mają inne właściwości enzymatyczne, wydaje się, że wiązanie się G1 z Mch4 albo G1 z MACH (bądź izoformą MACHa1) oraz, z kolei, wiązanie Mch4 albo MACH z MORT-1, albo też bezpośrednie wiązanie się G1 z MORT-1 pozwala na stymulację aktywności proteazowej G1 i/lub Mch4 i/lub MACH

PL 193 394 B1 po uruchomieniu FAS-R przez ligand Fas. Może to również pozwalać na aktywację proteazy przez p55-R, poprzez związanie MORT-1 z TRADD, które wiąże się z p55-R.

Inni członkowie rodziny CED3/ICE, jak stwierdzono, wykazują pełną aktywność dopiero po obróbce proteolitycznej, która zachodzi albo przez samoprzecięcie albo pod wpływem działania innych proteaz z tej rodziny (przegląd w publikacji Kumas, 1995; Henkart, 1996). Na przykład, jak szczegółowo omówiono w wyżej wspomnianych wspólnych i równoległych zgłoszeniach dotyczących MACH, działanie cytotoksyczne wynikające ze wspólnego wytwarzania dwóch głównych potencjalnych produktów samoprzecięcia MACHa1, w przeciwieństwie do braku cytotoksyczności w komórkach, w których ulega ekspresji pełna długość rejonu homologii CED3/ICE, jest zgodne z możliwością, iżMACHa1 uzyskuje pełną aktywność dopiero po jego obróbce. Aktywność enzymatyczna obserwowana w lizatach bakteryjnych, w których dochodzi do ekspresji pełnej długości rejonu, wydaje się odzwierciedlać samo-obróbkę białka wytwarzanego wtych warunkach albo obróbkę przez jakieś proteazy bakteryjne. W jaki sposób dochodzi do tej obróbki w komórkach ssaków i jak można ją wywołać przez uruchomienie FAS-R i p55-R, nie wiadomo ani też nie jest jasne jeszcze, jaki względny udział ma aktywność proteolityczna MACHa1 w cytotoksyczności wywoływanej przez FAS-R i TNF. Ocena tego udziału jest skomplikowana przez fakt, iż również wytwarzanie MACHb1, któremu brakuje rejonu homologii z CED3/ICE, powoduje znaczną cytotoksyczność. Być może cytotoksyczność ta odzwierciedla zdolność MACHb1 do wiązania się z MACHa1. Z uwagi na tę zdolność, transfekowane cząsteczki MACH mogą wywierać, po agregacji, zmianę konformacyjną na cząsteczkach MACHa1, które są endogenne w komórce transfekowanej. Taki mechanizm może dobrze odpowiadać również za obserwowaną cytotoksyczność, gdy cząsteczki, które działają powyżej MACH, (MORT-1, TRADD albo domeny śmierci albo p55-R albo FAS-R) ulegają nadmiernemu wyrażaniu w komórkach. W tym momencie jednak nie można wykluczyć, iż cytotoksyczność obserwowano po wzbudzeniu wytwarzania MACH albo cząsteczek, które działają powyżej odzwierciedla, poza aktywnością proteolityczną rejonu homologii CED3/ICE w MACH, również aktywację jakichś innych mechanizmów, które jak się uważa biorą udział w działaniu cytotoksycznym FAS-R i p55-R (na przykład, aktywacji obojętnej albo kwaśnej sfingomielinazy). Nie można również wykluczyć, iż aktywność proteolityczna rejonu homologii CED3/ICE służy innym funkcjom poza wywoływaniem cytotoksyczności. Bardziej przejrzystą ideę funkcji MACHa1 powinno się uzyskać przez identyfikację endogennych białek substratowych, które zostają przecięte po aktywacji MACHa1. Znalezienie sposobów na wyłączenie aktywności MACHa1 na życzenie, na przykład przez wytwarzanie cząsteczek hamujących, również przyczyni się do zrozumienia funkcji tego białka i posłuży jako sposób regulowania jego aktywności, gdy jest to pożądane.

Stąd, białko G1 według niniejszego wynalazku i jego możliwe izoformy mogą zachowywać się w sposób analogiczny do wspomnianego dla powyższych białek MACH z albo bez bezpośredniej interakcji z innymi białkami, mianowicie, G1 może działać bezpośrednio przez wiązanie z MORT-1 albo może działać pośrednio przez wiązanie się z Mch4 i/lub MACH i z kolei przez wiązanie Mch4 i/lub MACH z MORT-1 albo w jakiś inny, jak dotąd niewyjaśniony mechanizm swoisty dla G1. Podobnie, regulacja aktywności G1 może być analogiczna do przewidywanej powyżej regulacji białka MACH.

Mogą też istnieć w pewnych komórkach, w których zachodzi wytwarzanie G1, naturalne inhibitory proteazy zawartej w tym białku. Istnienie podlegających alternatywnemu składaniu izoform dla niektórych innych członków rodziny CED3/ICE, jak wykazano, stanowi sposób fizjologicznego ograniczania funkcji tych proteaz. Pewne z tych izoform tych innych proteaz, jak doniesiono, działają jako naturalne inhibitory izoform o pełnej długości, jak się wydaje przez tworzenie z nimi nieaktywnych heterodimerów. Może być tak również w przypadku G1 i pewnych jego możliwych izoform, na przykład tych izoform, w których brakuje potencjalnego miejsca cięcia N-końca. Wytwarzanie takich hamujących izoform może stanowić mechanizm komórkowej samoobrony przed cytotoksycznością FAS-R i TNF.

G1 może mieć jeszcze inne funkcje, na przykład G1 albo dowolna z jego izoform może mieć wpływ wzmacniający albo intensyfikujący na inne białka o aktywności enzymatycznej, np. proteolityczną aktywność różnych izoform Mch4 i MACH, przy czym ta aktywność wzmacniająca albo intensyfikująca zachodzi poprzez mechanizm, dzięki któremu G1 służy do rekrutacji innych białek, które mają związać się z MORT-1 (np. białek Mch4 i MACH). Ponadto, G1 albo dowolna z jego izoform mogą również odgrywać role niezwiązane z cytotoksycznością i mogą działać jako miejsca dokowania dla cząsteczek, które są zaangażowane w inne niż cytotoksyczne efekty działania FAS-R i TNF.

Pewne swoiste izoformy G1 według niniejszego wynalazku przykładowo przedstawiono w Przykładzie 1 poniżej. Jedna z nich, zwana G1a (CASHa), wyizolowana od człowieka i myszy (odpowiednio hG1a/hCASHa i mG1a/mCASHa) wydaje się być 1 mg wariantem składania, mającym rejon hoPL 193 394 B1 mologiiproteazoweji, przynajmniej w pewnych komórkach (np. komórkach 293), ma aktywność cytotoksyczną. Inna z nich zwanaG1b (CASHb), wyizolowana od człowieka, wydaje się być krótszym wariantem składania bez rejonu homologii proteazowej i w rzeczywistości hamuje szlaki sygnalizacji śmierci komórkowej.

ZuwaginaunikalnązdolnośćreceptorówFAS-RiTNFdo powodowania śmierci komórkowej, jak również zdolność receptorów TNF do wyzwalania różnych innych aktywności uszkadzających tkanki, uszkodzenie działania tych receptorów może być szczególnie niszczące dla organizmu. Faktycznie, zarównonadmiernajakiniedostatecznafunkcjatych receptorów, jak wykazano, przyczynia się do patologicznych manifestacji różnych chorób. Zidentyfikowanie cząsteczek, którebiorąudział w aktywności sygnalizacyjnej tych receptorów,iznalezieniesposobówmodulacjifunkcjonowaniatych cząsteczek, stanowi potencjalną wskazówkę dla nowych podejść terapeutycznych do tych chorób. Mając na względzie podejrzewaną ważną rolę G1 w toksyczności FAS-R i TNF, wydaje się szczególnie ważne zaprojektowanie leków, które mogą blokować proteolitycznąfunkcję tej cząsteczki, jak zrobiono dla pewnych innych członków rodziny CED3/ICE. Unikalne cechy sekwencji homologu CED3/ICE, zawarte w cząsteczkach G1 mogą pozwalać na zaprojektowanie leków, które mogą wpływać na jego ochronę przed nadmierną cytotoksycznością za pośrednictwem układuodpornościowego bezwpływanianafizjologiczneprocesy śmierci komórkowej, w które zaangażowani są inni członkowie rodzinyCED3/ICE.

Jakwspomnianopowyżej,G1 albo dowolna zjego izoform mogą być również zaangażowane w modulację innych wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów, takich jaknaprzykład inne mediatory albo induktory cytotoksyczne, albo inne białka, w sposób niezależny od MORT-1 albo białek wiążących MORT-1. Ponadto, G1 albo przynajmniej jego izoformy,któremająrejonproteazopodobny bez rzeczywistej aktywności proteazowej, mogą być zaangażowane wfunkcje główniehamujące,mianowicie,hamującteszlaki,np.szlaki przekazywania sygnału w ogóle albo szlaki cytotoksyczne w szczególności, w które G1 albo jego izoformy są zaangażowane czy to przez bezpośrednie związanie z członkami tych szlaków czy też przez pośrednie związanie z innymi białkami, które z kolei wiążąsięzczłonkamitychszlaków.

Polipeptyd albo białko „zasadniczo odpowiadające” białku G1 obejmuje nie tylko białko G1, ale również polipeptydy albo białka, które są analogami dla G1.

Analogi, które zasadniczo odpowiadają białku G1 sątymi polipeptydami,wktórychjedenalbo wieleaminokwasówzsekwencjibiałkaG1 zastąpionoinnymaminokwasem,usuniętoi/lubwstawiono, przy założeniu, że otrzymane białko wykazuje zasadniczotęsamąalbowyższąbiologicznąaktywność,co białko G1 , któremuodpowiada.

Aby zasadniczo odpowiadać białku G1, zmiany w sekwencji białekG1, takie jak izoformy, są zasadniczo stosunkowo małe. Choć liczba zmian może być większa niż dziesięć, zaleca się by było nie więcej niż dziesięć zmian, korzystniej nie więcej niż pięć, a najkorzystniej nie więcej niż trzy takie zmiany. Choć można zastosować dowolną technikę do znajdowania potencjalniebiologicznieaktywnychbiałek, które zasadniczo odpowiadająbiałkomG1, jednąztakichtechnikjest wykorzystaniekonwencjonalnychtechnikmutagenezynaDNA kodującym białko, co powoduje kilka modyfikacji. Białko wytwarzanewwynikuekspresjiwtakichklonachmożna następnie badać przesiewowo na ich zdolność do wiązania się z różnymi białkami wiążącymi MORT-1, takimi jak na przykład Mch4iMACH, albo nawet bezpośrednio MORT-1 , i/lub aktywność pośredniczącą dla FAS-R albo p55-R, i/lub aktywność pośredniczącą dla dowolnego innego szlaku wewnątrzkomórkowego metodami omówionymi powyżej.

Zmiany „konserwatywne” są tymi zmianami, co do których nie należy się spodziewać zmiany aktywności białka i zwykle są one pierwszymi wbadaniach przesiewowych, gdyż nie należysięspodziewaćzmianyprzeznierozmiaru,ładunkualbo konfiguracji białka, a tym samym nie należy się spodziewać zmianyjegowłaściwościbiologicznych.

KonserwatywnepodstawieniabiałekG1 obejmująanalog,wktórymprzynajmniejjednareszta aminokwasuwpolipeptydzie zostałakonserwatywniezamienionanainnyaminokwas.Takie podstawienia korzystnie wykonuje się według następującej listy jak przedstawiono wTabeli IA, przy czym możnaje określić przez rutynowe doświadczenie w celu uzyskania zmodyfikowanych strukturalnych ifunkcjonalnych właściwości zsyntetyzowanej cząsteczki polipeptydu, jednocześnie utrzymując aktywność biologiczną charakterystyczną dla białka G1.

PL 193 394 B1

T ab el a IA

Reszta oryginalna Przykładowe podstawienie

Ala	Gly; Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala; Pro
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Tyr; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

Alternatywnie, inną grupą podstawień białka G1 są te, w których przynajmniej jedna reszta aminokwasowa w polipeptydzie zostanie usunięta, a inna reszta wstawiona wjej miejsce według następującej Tabeli IB. Te typy podstawień, które można wykonać w polipeptydzie, mogą być oparte na analizie częstotliwości zmian aminokwasowych pomiędzy homologicznym białkiem różnych gatunków, takich jak te przedstawione w Tabeli 1-2 w publikacji Schulz i wsp., G.E. Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798, oraz Fig. 3-9 w Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. W oparciu otaką analizę, określono tu alternatywne konserwatywne podstawienia jako wymiany w jednej z następujących pięciu grup:

T a b e l a IB

1. Małe, alifatyczne, niepolarne albo słabo polarne reszty: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Polarne, ujemnie naładowane reszty i ich amidy: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. Polarne, dodatnio naładowane reszty: His, Arg, Lys;

4. Duże alifatyczne niepolarne reszty: Met, Leu, Ile, Val (Cys); oraz

5. Duże reszty aromatyczne: Phe, Tyr, Trp.

Trzy reszty aminokwasowe w nawiasach powyżej mają specjalną rolę w architekturze białek. Gly jest jedyną resztą, której brakuje jakiegokolwiek łańcucha bocznego i wten sposób dodaje ona giętkości łańcuchowi. Ma to jednak tendencję do ułatwiania tworzenia się drugorzędowej struktury innej niż a-helikalna. Pro, z uwagi na swą nietypową geometrię, ściśle ograniczą łańcuch i ogólnie ma tendencję do ułatwiania powstawania struktur typu b, choć w pewnych przypadkach Cys może być zdolna do uczestniczenia w tworzeniu wiązania disiarczkowego, które jest ważne dla zwijania się białka. Należy zwrócić uwagę, iż Schulz i wsp., supra, połączyłby Grupy 1 i 2 powyżej. Należy również zwrócić uwagę, iż Tyr, z uwagi na swój potencjał wiązań wodorowych, ma znaczące pokrewieństwo z Seri Thr itp.

Konserwatywne podstawienia aminokwasów np. jak zaprezentowano powyżej, znane są w stanie techniki i należy spodziewać się, że zachowają one biologiczne i strukturalne właściwości polipeptydu po podstawieniu aminokwasu. Większość delecji i substytucji według niniejszego wynalazku to te,

PL 193 394 B1 które nie wytwarzają radykalnych zmian w charakterystyce cząsteczki białka albo polipeptydu. „Charakterystyka” oznacza tu określenie zarówno zmian w strukturze drugorzędowej, np. a-heliks albo arkusz b, jak również zmian w biologicznej aktywności, np. wiązanie się z białkami wiążącymi MORT-1 albo MORT-1 albo pośredniczenie w oddziaływaniach ligandu FAS-R albo TNF na komórki.

Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasów w białkach, które można wykorzystać do uzyskania analogów białek G1 do zastosowania w niniejszym wynalazku, obejmują dowolne znane etapy metody, takie jak przedstawiono w amerykańskich patentach RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462 Marka i wsp; 5,116,943 Kothsa i wsp., 4,965,195 Namena i wsp.; 4,879,111 Chonga i wsp.; oraz 5,017,691 Lee i wsp.; oraz białka z podstawieniami lizynowymi przedstawione w amerykańskim opisie patentowym nr 4,904,584 (Shaw i wsp.).

Poza konserwatywnymi podstawieniami omówionymi powyżej, które nie zmieniłyby znacząco aktywności białka G1, w zakres wynalazku wchodzą analogi z konserwatywnymi substytucjami lub mniej konserwatywnymi i bardziej przypadkowymi zmianami, które prowadzą do zwiększenia aktywności biologicznej białek G1.

Dokładny efekt podstawienia albo delecji, specjalista może ocenić rutynowymi testami wiązania i śmierci komórkowej. Badanie przesiewowe przy użyciu takiego standardowego testu nie obejmuje nadmiernych doświadczeń.

Dopuszczalnymi analogami są te, które zachowują przynajmniej zdolność do wiązania się z białkami wiążącymi MORT-1, jak wspomniano powyżej, albo wiązania z MORT-1 albo innymi białkami i tym samym, jak wspomniano powyżej, pośredniczą w aktywności FAS-R i p55-R albo innych białek, jak wspomniano powyżej. W taki sposób można wytworzyć analogi, które mają tak zwany efekt dominujący negatywny, mianowicie analog, który jest defektywny pod względem wiązania się z białkami wiążącymi MORT-1 (np. Mch4 albo MACH) albo wiązania się z MORT-1, albo z innymi białkami, albo w późniejszej sygnalizacji albo aktywności proteazowej po takim związaniu. Takie analogi można zastosować na przykład w celu hamowania działania ligandu FAS albo działania innych białek przez współzawodniczenie z naturalnymi białkami wiążącymi MORT-1 albo innymi białkami. Na przykład wydaje się prawdopodobne, że izoformy MACH, MACHa2 i MACHa3, są „naturalnymi” analogami, które służą do hamowania aktywności MACH przez współzawodniczenie z wiązaniem aktywnych (proteazowych) izoform MACH z MORT-1, co wydaje się mieć zasadnicze znaczenie dla aktywacji tych izoform MACH. Gdy aktywne izoformy MACH nie mogą związać się z MORT-1, wewnątrzkomórkowe szlaki przekaźnictwa sygnału za pośrednictwem FAS-R i p55-R ulegną tym samym również zahamowaniu. W podobny sposób, G1 albo dowolna z jego izoform mogą również służyć jako inhibitory działania ligandu FAS przez współzawodniczenie z różnymi białkami wiążącymi MORT-1 w celu związania się z MORT-1 albo przez interakcję z nimi w sposób, który zapobiega ich wiązaniu się z MORT-1. Podobnie można wytworzyć tak zwane dominujące pozytywne analogi G1, które posłużyłyby do wzmocnienia działania ligandu FAS albo TNF. Miałyby one taką samą albo lepszą zdolność do wiązania białek wiążących MORT-1 albo nawet takie same albo lepsze właściwości wiązania MORT-1 i takie same albo lepsze właściwości sygnalizacyjne jak naturalne białka G1.

Na poziomie genetyki, analogi te ogólnie wytwarza się przez mutagenezę ukierunkowaną nukleotydów w DNA kodującym białko G1, tym samym wytwarzając DNA kodujący analog, a następnie syntetyzowanie DNA i wytwarzanie polipeptydu w hodowli komórek rekombinacyjnych. Te analogi typowo wykazują tę samą albo zwiększoną jakościową aktywność biologiczną jak naturalnie występujące białko, Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publication and Wiley Interscience, New York, NY 1987-1995; Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Wytworzenie białka G1 zgodnie z tym, albo alternatywnej sekwencji nukleotydowej kodującej ten sam polipeptyd, ale różniący się od naturalnej sekwencji z uwagi na zmiany dopuszczalne przez znaną degenerację kodu genetycznego, można uzyskać przez ukierunkowaną mutagenezę DNA, który koduje wcześniej wytworzony analog albo natywną wersję białka G1. Ukierunkowana mutageneza pozwala na wytwarzanie analogów przez zastosowanie swoistych sekwencji oligonukleotydowych, które kodują sekwencję DNA pożądanej mutacji, jak również wystarczającą liczbę sąsiednich nukleotydów, w celu wytworzenia sekwencji startera o wystarczającym wymiarze i złożoności sekwencji dla utworzenia stabilnego dupleksu po obu stronach połączenia delecyjnego, które jest przecięte. Zwykle, korzystny jest starter o długości około 20 do 25 nukleotydów z około 5 do 10 nukleotydami uzupełniającymi po każdej stronie zmienianej sekwencji. Ogólnie, technika ukierunkowanej mutagenezy jest

PL 193 394 B1 dobrze znana wstanie techniki, czego przykładowo dowodzą publikacje takie jak Adelman i wsp., DNA 2:183 (1983), którego opis jest tu włączony przez odniesienie.

Jakbędziemożnazauważyć, technikaukierunkowanej mutagenezy zwykle wykorzystuje wektor fagowy, który istnieje zarówno w postaci jednoniciowej jak i dwuniciowej. Typowe wektory użyteczne wukierunkowanej mutagenezie obejmują wektory takie jak fag M13, na przykład, jak przedstawiono wMessing i wsp., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Redaktor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), którego opis jest tu włączony przez odniesienie. Te fagi są łatwo dostępne komercyjnie, aich zastosowanie jest ogólnie dobrze znane specjalistom. Alternatywnie, do uzyskania jednoniciowego DNA mogą być również zastosowane wektory plazmidowe, które zawierają początek replikacji faga jednoniciowego (Veira i wsp., Meth. Enzymol. 153:3, 1987).

Ogólnie, ukierunkowaną mutagenezę zgodnie z powyższym przeprowadza się tu najpierw przez uzyskanie jednoniciowego wektora, który zawiera w swej sekwencji sekwencję DNA, która koduje odnośny polipeptyd.Starter oligonukleotydowy, przenoszący żądaną sekwencję zmutowaną wytwarza się syntetycznie przez zautomatyzowaną syntezę DNA/oligonukleotydu. Ten starter sprzęga się z jednoniciowym wektorem zawierającym sekwencję białka i poddaje się działaniu enzymówpolimeryzujących DNA, takich jakfragment Klenowa polimerazy I E.coli, wcelu ukończenia syntezy nici przenoszącej mutację. A zatem, zmutowana sekwencja i druga nić przenosi żądaną mutację. Ten wektor typu heterodupleks wykorzystuje się następnie do transformacji odpowiednich komórek, takich jak komórki E. coli JM101 i wybiera się klony, które zawierają wektory rekombinantowe przenoszące układsekwencji zmutowanej.

Po wybraniu takiego klonu, zmutowane białko G1 można usunąć i umieścić wodpowiednim wektorze, ogólnie wektorze transferowym albo ekspresyjnym typu, który można zastosować do transfekcji odpowiedniego gospodarza.

Zgodnie z tym, gen albo kwasnukleinowy kodujący białko G1 można również wykryć, uzyskać i/lub zmodyfikować, in vitro, in situ i/lub in vivo, poprzez zastosowanie znanych technik amplifikacji DNA albo RNA, takich jak PCR albo chemiczna synteza oligonukleotydów. PCR pozwala na amplifikację (zwiększenie liczby) swoistych sekwencji DNA przez powtarzane reakcje polimerazy DNA. Tę reakcję można wykorzystać jako zastąpienie klonowania; wszystko, czego potrzebna to tylko znajomość sekwencji kwasu nukleinowego. W celu przeprowadzenia PCR, projektuje się startery, które są komplementarne do żądanej sekwencji. Następnie startery te wytwarza się przez zautomatyzowaną syntezę DNA. Ponieważ można zaprojektować startery tak, by hybrydyzowały z dowolną częścią genu, można wytworzyć takie warunki, że można będzie zaakceptować niedopasowania wkomplementarnym parowaniu się zasad. Amplifikacja tych niedopasowanych rejonówmoże prowadzić do syntezy produktu zmutowanego, co powoduje wytworzenie peptydu o nowych właściwościach (tj.mutagenezę ukierunkowaną). Patrz również np. Ausubel, supra, Rozdz. 16. Ponadto, poprzez sprzężenie syntezy komplementarnego DNA (cDNA), przy użyciu odwrotnej transkryptazy, zPCR, można zastosować RNA jakomateriał wyjściowy do syntezy zewnątrzkomórkowej domeny receptora prolaktynowego bez klonowania.

Ponadto, można zaprojektować startery PCR tak, by zawierały nowe miejsca restrykcji albo inne cechy takie, jak kodony terminacyjne przy końcach amplifikowanego segmentu genu. To umieszczeniemiejscrestrykcji przy końcach 5' i 3' amplifikowanej sekwencji genupozwalana dowolnezaprojektowanie segmentów genu kodujących białko G1 albo jego fragment dla ligacji zinnymi sekwencjami i/lub miejscami klonowaniaw wektorach.

PCR i inne metody amplifikacji RNA i/lub DNA są dobrze znane wstanie techniki i można jezastosować wniniejszym wynalazku bez nadmiernego eksperymentowania, woparciu o informacje i wskazówki zaprezentowane tutaj. Znane metody amplifikacji DNA lub RNA obejmują, ale nie są ograniczone do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i pokrewnych procesów amplifikacji (patrz np. amerykańskie opisy patentowe nr 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, Mullisa i wsp.; 4,795,699 i 4,921,794 Tabora i wsp.; 5,142,033 Innisa; 5,122,464 Wilsona i wsp” 4,994,370 Silvera i wsp.; 4,766,067 Biswasa; 4,656,134 Ringolda; oraz Innis i wsp., red., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) oraz amplifikacji za pośrednictwem RNA, która wykorzystuje antysensownyRNAdla sekwencji docelowej jako matrycę dla syntezy dwuniciowego DNA (amerykański opis patentowy nr 5,130,238 Malek i wsp., o nazwie handlowej NASBA); oraz immuno-PCR, która łączy zastosowanie amplifikacji DNA ze znakowaniem przeciwciałami (Ruzicka i wsp., Science 260:487 (1993); Sano i wsp., Science 258:120 (1992); Sano i wsp., Biotechnigues 9:1378 (1991)), które powołuje się tutaj jako literaturę.

PL 193 394 B1

W analogiczny sposób, biologicznie aktywne fragmenty białek G1 (np. fragmenty dowolnych G1 albo jego izoform) można wytworzyć jak wspomniano powyżej w odniesieniu do analogów białek G1. Odpowiednimi fragmentami białek G1 są te, które zachowują zdolność G1 i które mogą pośredniczyć w aktywności biologicznej FAS-R i p55-R albo innych białek jak wspomniano powyżej. Zgodnie z tym, można wytworzyć fragmenty białka G1, które mają efekt dominujący negatywny albo dominujący pozytywny jak wspomniano powyżej w odniesieniu do analogów. Należy zauważyć, iż te fragmenty reprezentują specjalną klasę analogów według wynalazku, mianowicie, są one określonymi częściami białek G1 pochodzącymi od pełnej sekwencji białka G1 (np. od sekwencji dowolnego spośród G1 lub jego izoform), przy czym każda taka część lub fragment ma dowolną z wyżej wspomnianych pożądanych aktywności. Taki fragment może być np. peptydem.

Podobnie, można wytworzyć pochodne poprzez standardowe modyfikacje grup bocznych jednej bądź wielu reszt aminokwasowych białka G1, jego analogów albo fragmentów, albo przez koniugację białka G1, jego analogów albo fragmentów, zinną cząsteczką np. przeciwciałem, enzymem, receptorem itp., jak to jest dobrze znane w stanie techniki. Stosowany tu termin „pochodne” obejmuje pochodne, które mogą być wytworzone z funkcjonalnych grup, które występują jako łańcuchy boczne w resztach grup N- albo C-końcowych, metodami znanymi w stanie techniki, i wchodzą w zakres wynalazku. Pochodne mogą mieć grupy chemiczne, takie jak reszty węglowodanowe albo fosforanowe, przy założeniu, że taka frakcja ma taką samą albo wyższą aktywność biologiczną jak białka G1.

Na przykład, pochodne mogą obejmować estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych wytworzone przez reakcję z amoniakiem albo z pierwszorzędowymi bądź drugorzędowymi aminami, pochodne N-acylowe wolnych grup aminowych reszt aminokwasów utworzone z grupami acylowymi (np. grupą alkanoilową albo karboksycykliczną aroilową) albo pochodne O-acylowe wolnych grup hydroksylowych (na przykład reszt serylowych albo treonylowych) utworzone z grupami acylowymi.

Termin „pochodne” ma obejmować tylko te pochodne, których zmiana aminokwasu nie dotyczy zmiany na inny spośród dwudziestu powszechnie występujących naturalnych aminokwasów.

Niezależnie od tego, czy białko G1 jest białkiem czy polipeptydem, jest ono sekwencją reszt aminokwasowych. W zakres takiego polipeptydu wchodzi też polipeptyd składający się z większej sekwencji, która obejmuje całą sekwencję białka G1, zgodnie z podanymi tu definicjami oile dodatkowe sekwencje nie wpływają niekorzystnie na podstawowe i nowe cechy charakterystyczne wynalazku, tj. jeżeli zachowują albo zwiększają biologiczną aktywność białka G1 albo mogą zostać odcięte, pozostawiając białko albo polipeptyd, mający aktywność biologiczną białka G1. A zatem białko G1 może być w postaci fuzji białkowych z innymi aminokwasami albo peptydami.

Nowe białka G1, ich analogi, fragmenty i pochodne, mają wiele możliwych zastosowań, na przykład:

(i) białko G1, jego analogi, fragmenty i pochodne, można zastosować wcelu naśladowania albo wzmacniania funkcji białek wiążących MORT-1, takich jak na przykład Mch4 i MACH (włącznie zich różnymi izoformami), albo nawet samego MORT-1, astąd ligandu FAS-R albo TNF, albo innych białek, w sytuacjach, w których pożądane jest wzmocnienie działania ligandu FAS-R albo TNF albo innego białka, takich jak zastosowania przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, przeciw wirusowi HIV itd., w których pożądana jest cytotoksyczność wywoływana przez ligand FAS-R, TNF albo inne białko. W tym przypadku białko G1, jego analogi, fragmenty albo pochodne, które wzmagają działanie ligandu FAS-R, TNF albo innego białka, tj. efekt cytotoksyczny, można wprowadzić do komórek stosując standardowe procedury znane per se. Na przykład, gdy białko G1 jest całkowicie wewnątrzkomórkowe (jak to się podejrzewa) i powinno być wprowadzane tylko do komórek, w których pożądane jest działanie ligandu FAS-R albo TNF albo innego białka, konieczny jest układ do swoistego wprowadzania tego białka do tych komórek. Jednym ze sposobów przeprowadzenia tego jest wytworzenie rekombinantowego wirusa zwierzęcego, np. pochodzącego od krowianki, do którego wprowadza się DNA następujących dwóch genów: genu kodującego ligand, który wiąże się z białkami powierzchniowymi komórki ulegającymi swoistemu wyrażaniu na powierzchni komórek, np. takimi jak białko gp120 wirusa AIDS (HIV), które wiąże się swoiście z pewnymi komórkami (limfocytami CD4 i komórkami białaczkowymi), albo dowolny inny ligand, który wiąże się z komórkami niosącymi FAS-R albo p55-R, tak, że wirusowy wektor rekombinantowy będzie zdolny do związania się z takimi komórkami posiadającymi FAS-R albo p55-R; oraz genu kodującego białko G1. A zatem, wyrażania białka wiążącego się z powierzchnią komórki na powierzchni wirusa nakieruje wirusa swoiście na komórkę nowotworową albo inną komórkę posiadającą FAS-R albo p55-R, po czym sekwencja kodująca białko G1 (np. sekwencja G1a) zostanie wprowadzona do komórek przez wirusa, a po rozpoczęciu ekspresji w komórkach, da

PL 193 394 B1 w rezultacie wzmocnienie działania ligandu FAS-R albo TNF, prowadzące do śmierci komórek nowotworowych albo innych komórek posiadających FAS-R albo p55-R, których zabicie jest pożądane. Taki zwierzęcy wirus rekombinantowy konstruuje się przy użyciu standardowych procedur (patrz na przykład, Sambrook i wsp., 1989). Inną możliwością jest wprowadzenie sekwencji białka G1 (np. G1 albo jego dowolnej izoformy) w postaci oligonukleotydów, które mogą zostać zaabsorbowane przez komórki i ulegać w nich ekspresji.

Dalszym sposobem wzmożenia takiej cytotoksyczności komórkowej byłoby zahamowanie aktywności izoform G1 (np. G1b), które same są inhibitorami cytotoksyczności komórkowej. Sposoby zahamowania takich izoform G1 są liczne i obejmują te wyliczone w(ii) poniżej jako stosowane swoiście w celu zahamowania takich inhibitorowych izoform G1, jak na przykład G1b.

(ii) Można użyć ich do zahamowania działania ligandu FAS-R albo TNF albo innego białka, np. w przypadkach takich jak uszkodzenie tkanek we wstrząsie septycznym, odrzucaniu typu przeszczep przeciwko gospodarzowi, albo ostrym zapaleniu wątroby, w których pożądane jest zablokowanie wewnątrzkomórkowej sygnalizacji FAS-R albo p55-R wzbudzanej przez ligand FAS-R albo TNF, albo innej sygnalizacji za pośrednictwem białek. W tej sytuacji, możliwe jest na przykład wprowadzenie do komórek, przy użyciu standardowych procedur, oligonukleotydów mających antysensowną sekwencję kodującą dla białka G1, które skutecznie zablokowałyby translację mRNA kodujących białko G1 i tym samym zablokowałyby jego wytwarzanie i doprowadziłyby do zahamowania działania ligandu FAS-R albo TNF albo innego białka. Takie oligonukleotydy można wprowadzić do komórek przy użyciu powyższego podejścia z wirusem rekombinantowym, przy czym drugą sekwencją przenoszoną przez wirusa jest sekwencja oligonukleotydowa.

Ponadto, jak zauważono powyżej ijak przykładowo omówiono poniżej, wyizolowano przynajmniej jedną izoformę G1, która jest „naturalnym inhibitorem” komórkowej cytotoksyczności, a mianowicie G1b. Stąd, taka izoforma G1 może być podawana bezpośrednio do komórek, albo też można wprowadzić do komórek odpowiedni wektor przenoszący sekwencję nukleotydową kodującą tę izoformę, tak że gdy w komórkach zajdzie ekspresja, ta izoforma G1 posłuży do zahamowania cytotoksyczności komórkowej.

Inną możliwością jest wykorzystanie przeciwciał swoistych względem białka G1 wcelu zahamowania jego aktywności sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.

Jeszcze innym sposobem hamowania działania ligandu FAS-R albo TNF jest ostatnio opracowana metoda z rybozymami. Rybozymy są katalitycznymi cząsteczkami RNA, które swoiście przecinają RNA. Rybozymy można poddać obróbce wcelu przecięcia wybranych docelowych RNA, np. mRNA kodujących białko G1 według wynalazku. Takie rybozymy miałyby sekwencję swoistą dla mRNA białka G1 i byłyby zdolne do interakcji znim (wiązania komplementarnego), po którym następowałoby cięcie mRNA, a w rezultacie zmniejszenie (lub całkowita utrata) wytwarzania białka G1 w wyniku ekspresji, przy czym poziom zmniejszenia tej ekspresji zależałby od poziomu ekspresji rybozymu w komórce docelowej. W celu wprowadzenia rybozymów do wybranych komórek (np. niosących FAS-R albo p55-R), można zastosować dowolny odpowiedni wektor, np. plazmid, wirusy zwierzęce (retrowirusy), które zwykle wykorzystuje się do tego celu (patrz również (i) powyżej, gdzie wirus ma, jako drugą sekwencję, cDNA, kodujący wybraną sekwencję rybozymu). (Przegląd sposobów itp. dotyczących rybozymów, patrz Chen i wsp., 1992; Zhao i Pick, 1993; Shore i wsp., 1993; Joseph i Burke, 1993; Shimayama i wsp., 1993; Cantor i wsp., 1993; Barinaga, 1993; Crisell i wsp.; 1993 i Koizumi i wsp., 1993).

(iii) Białko G1, jego analogi, fragmenty albo pochodne można również zastosować do wyizolowania, identyfikowania i klonowania innych białek ztej samej klasy, tj. wiążących się z domeną wewnątrzkomórkową FAS-R albo z funkcjonalnie spokrewnionymi receptorami, albo wiążących się z wyżej wspomnianymi białkami wiążącymi MORT-1, albo wiążących się z MORT-1 itym samym z funkcjonalnie powiązanymi receptorami, takimi jak FAS-R i p55-R, i zaangażowanych w proces sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. W tym zastosowaniu, można użyć wyżej wspomnianego układu podwójnej hybrydy drożdżowej, albo można zastosować niedawno opracowany układ, wykorzystujący nierygorystyczną hybrydyzację Southern, po której następuje klonowanie PCR (Wilks i wsp., 1989). W publikacji Wilksa i wsp., opisano identyfikację i klonowanie dwóch przypuszczalnych białek - kinaz tyrozynowych przez zastosowanie nieostrej hybrydyzacji Southern, po której następuje klonowanie metodą PCR w oparciu o znaną sekwencję motywu kinazy, domyślną sekwencję kinazy. Podejście to można zastosować, według niniejszego wynalazku, przy użyciu sekwencji białka G1 w celu identyfikacjii klonowania tych spokrewnionych białek wiążących MORT-1.

PL 193 394 B1 (iv) Jeszcze inne podejście do wykorzystania białka G1, jego analogów, fragmentów i pochodnych, według wynalazku, polega na zastosowaniu ich w metodach chromatografii powinowactwa, wcelu wyizolowania i zidentyfikowania innych białek albo czynników, z którymi mogą się one wiązać, np. MORT-1, białek wiążących MORT-1, albo innych białek albo czynników zaangażowanych wwewnątrzkomórkowy proces sygnalizacyjny. W tym zastosowaniu, białka G1, jego analogi, fragmenty albo pochodne, według niniejszego wynalazku, można pojedynczo przymocować do matryc chromatografii powinowactwa, a następnie doprowadzić do kontaktu z wyciągami komórkowymi albo wyizolowanymi białkami albo czynnikami podejrzanymi o uczestnictwo w procesie wewnątrzkomórkowej sygnalizacji. Po procedurze chromatografii powinowactwa, inne białka albo czynniki, które wiążą się z białkiem G1, albo jego analogami, fragmentami albo pochodnymi według wynalazku, można wypłukać, wyizolować i scharakteryzować.

(v) Jak zauważono powyżej, białko G1, jego analogi, fragmenty albo pochodne według wynalazku można również zastosować jako immunogeny (antygeny) wcelu wytworzenia przeciwciał swoistych względem niego. Te przeciwciała można również stosować w celach oczyszczenia białka G1 (np. G1 albo dowolnej z jego izoform), czy to z wyciągów komórkowych czy też z transformowanych linii komórkowych, wytwarzających białko G1, albo jego analogi czy też fragmenty. Ponadto, przeciwciała te można zastosować do celów diagnostycznych do identyfikacji chorób związanych z nienormalnym funkcjonowaniem ligandu FAS-R albo układu TNF, np. nadmiernie albo niedostatecznie aktywnych działań komórkowych wzbudzanych przez ligand FAS-R albo TNF. A zatem, o ile takie choroby byłyby związane ze źle funkcjonującym wewnątrzkomórkowym układem sygnalizacyjnym, obejmującym białko MORT-1, albo różne inne, wyżej wspomniane białka wiążące MORT-1 albo samo białko G1, takie przeciwciała służyłyby jako ważne narzędzie diagnostyczne.

Należy zauważyć, iż izolacja, identyfikacja i charakteryzacja białka G1 według wynalazku może być przeprowadzona przy użyciu dowolnej ze znanych standardowych procedur przesiewowych. Na przykład, jedna z tych procedur przesiewowych, procedura podwójnej hybrydy drożdżowej, jak to przedstawiono poniżej, została zastosowana do identyfikacji białka MORT-1, a następnie różnych białek wiążących MORT-1 oraz białka G1 według wynalazku. Podobnie, jak wspomniano powyżej i poniżej, można zastosować inne procedury, takie jak chromatografia powinowactwa, procedury hybrydyzacyjne DNA itd., jakie są dobrze znane w stanie techniki, wcelu wyizolowania, identyfikacji i charakteryzacji białka G1 według wynalazku albo wcelu wyizolowania, identyfikacji i charakteryzacji dodatkowych białek, czynników itd., które zdolne są do wiązania się z białkami G1 według wynalazku.

Jak przedstawiono tu powyżej, białko G1 można zastosować do wytworzenia przeciwciał swoistych względem białek G1, np. G1i jego izoform. Te przeciwciała albo ich fragmenty można wykorzystać jak przedstawiono poniżej szczegółowo, rozumiejąc iż wtych zastosowaniach przeciwciała albo ich fragmenty są przeciwciałami swoistymi wobec białek G1.

Opierając się na stwierdzeniu niniejszych wynalazców, iż przynajmniej niektóre z G1 albo ich możliwe izoformy są proteazami spokrewnionymi z proteazami z rodziny proteaz CED3/ICE, przewiduje się następujące konkretne zastosowania medyczne dla tych białek G1 i izoform: stwierdzono, iż istnieją już swoiste inhibitory innych protez CED3/ICE, niektóre przenikające do komórek, które mogą blokować procesy zaprogramowanej śmierci komórkowej. Stąd wykorzystując niniejszy wynalazek można zaprojektować inhibitory, które mogą zapobiegać wzbudzanej przez ligand FAS-R albo TNF śmierci komórkowej, w szlaki której zaangażowane są izoformy proteazy G1. Ponadto, mając na względzie unikalne cechy sekwencji tych nowych proteaz G1, wydaje się możliwe zaprojektowanie inhibitorów, które będą wysoce swoiste wobec działań wywoływanych przez TNF albo ligand FAS-R. Dane, których dostarcza wynalazek umożliwiają badanie mechanizmu, w którym „proteaza zabójcza” ulega aktywacji w odpowiedzi na ligand FAS-R albo TNF, co umożliwia następnie opracowanie leków, które mogą kontrolować stopień tej aktywacji. Istnieje wiele chorób, w których takie leki mogą być wielce pomocne. Między innymi, ostre zapalenie wątroby, w którym ostre uszkodzenie wątroby wydaje się odzwierciedlać zachodzącą za pośrednictwem ligandu FAS-R śmierć komórek wątroby; autoimmunologicznie wywoływana śmierć komórkowa, taka jak śmierć komórek b Langerhansa trzustki, która powoduje cukrzycę, śmierć komórek przy odrzucaniu przeszczepu (np. nerki, serca i wątroby); śmierć oligodendrocytów w mózgu w stwardnieniu rozsianym; oraz zahamowane przez AIDS samobójstwo limfocytów T, które powoduje namnażanie się wirusa AIDS, a coza tym idzie chorobę AIDS.

Jak wspomniano tu powyżej, możliwe jest, że G1 albo jedna bądź wiele z jego możliwych izoform (np. izoforma G1b) mogą służyć jako „naturalne” inhibitory proteazy G1 albo izoform proteazy G1, i można je zatem zastosować jako wyżej wspomniane swoiste inhibitory tych proteaz G1. Podobnie

PL 193 394 B1 inne substancje, takie jak peptydy, związki organiczne, przeciwciała itp. można również badać przesiewowowceluuzyskania swoistychleków,którezdolnesądohamowaniaproteazG1.

Nieograniczający przykład tego, jak inhibitory proteaz G1 można byłoby zaprojektować i poddać badaniuprzesiewowemu, oparty jest na uprzednich badaniach inhibitorów peptydowych ICEalboproteaz ICE-podobnych, swoistości substratowej ICE oraz strategie analizy epitopów przy użyciu syntezy peptydów. Minimalne wymagania dla wydajnego cięcia peptydu przez ICE, jakstwierdzono,obejmują cztery aminokwasy na lewo od miejscacięciazsilnąpreferencjądlakwasuasparaginowegowpołożeniuP1 i Zmetylaminą, która wystarcza zprawej strony pozycji P1 (Sleatch iwsp., 1990; Howard iwsp.,1991); Thornberry i wsp., 1992). Ponadto, fluorogenny substrat peptydowy (tetrapeptyd) acetylo-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metylokumarylo-7-amid), wskrócie Ac-DEVD-AMC, odpowiada sekwencji w poli (ADP-rybozo)polimerazie (PARP), która, jak stwierdzono, podlega cięciu w komórkach wkrótce po stymulacji FAS-R, jak również w innych procesach apoptotycznych (Kauffman 1989; Kaufmann i wsp., 1993; Lazebnik i wsp., 1994), oraz podlega wydajnemu cięciu przez CPP32 (członka rodziny proteaz CED3/ICE) i proteaz MACH (i podobnie również być może proteaz G1).

Ponieważ Asp w położeniu P1 substratu wydaje się być ważny, tetrapeptydy, zawierające Asp jako czwartą resztę aminokwasowąiróżnekombinacjeaminokwasówwpierwszych trzech pozycjach, można poddać szybkiemu badaniu przesiewowemu poprzez związanie centrum aktywnego proteaz G1 przy użyciu, na przykład, metody opracowanej przez Geysena (Geysen, 1985; Geysen iwsp., 1987),wktórejdużąliczbę peptydów na stałym podłożu poddawano badaniu przesiewowemu na swoiste interakcje z przeciwciałami. Wiązanie się proteaz MACH ze swoistymi peptydami można wykryć przy użyciu różnych dobrze znanych metod wykrywania wzakresie wiedzy specjalistów, takich jak znakowanie izotopowe proteaz G1 itp. Tą metodą Geysena, jakwykazano, można przetestować przynajmniej 4000 peptydów każdego dnia roboczego.

Ponieważ może być korzystne zaprojektowanie inhibitorów peptydowych, które wybiórczo hamująproteazyG1 bez zakłócania fizjologicznych procesów śmierci komórkowej, w które zaangażowani są członkowie rodziny proteaz CED3/ICE, pula peptydów wiążących się z proteazami G1 w takim teście, jak opisany powyżej, może być ponadto zsyntetyzowana jako fluorogenny substrat peptydowy w celu przetestowania swoistego cięcia przez proteazy G1 bez cięcia przez inne proteazy CED3/ICE. Peptydy, które, jak to zostanie określone, są wybiórczo cięte przez proteazy G1, można następnie zmodyfikować wcelu wzmocnienia przepuszczalności komórkowej i zahamowania aktywności G1 związanej ze śmiercią komórkową odwracalnie albo nieodwracalnie. Thornberry i wsp. (1994) doniósł, iż tetrapeptyd (acyloksy)metyloketon Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[(2,6-(CF3)2)]Ph był silnym inaktywatorem ICE. Podobnie, Milligan iwsp. (1995) doniósł, iż inhibitory tetrapeptydowe, zawierające grupy chlorometyloketonowe (nieodwracalnie) bądź aldehydowe (odwracalnie) hamowały ICE. Dodatkowo, jak wykazano, benzyloksykarboksylo-Asp-CH2OC(O)-2,6-dichlorobenzen (DCB), hamuje ICE (Machima iwsp., 1985). Zgodnie ztym, tetrapeptydy, które wybiórczo wiążą się z proteazami G1 można zmodyfikować, na przykład, grupą aldehydową, chlorometyloketonową, (acyloksy)metyloketonową albo grupą CH2OC(O)-DCB w celu wytworzenia peptydowego inhibitora aktywności proteazowej G1 .

Choć pewne swoiste inhibitory innych proteaz CED3/ICE są przepuszczalne przez komórki, przepuszczalnośćkomórkowa inhibitorów peptydowych może wymagać wzmocnienia. Na przykład, peptydymożnapoddaćchemicznejmodyfikacjialbo wytwarzaniupochodnychwceluwzmocnieniaich przechodzenia przez błonę komórkową i ułatwienia transportu takich peptydów przez błonę i do cytoplazmy. Muranishi i wsp. (1991) doniósł o wytworzeniu pochodnej hormonu uwalniającego tyreotropinę z kwasem laurylowym zwytworzeniem lipofilowej pochodnej lauroilowejodobrejcharakterystyce przenikania przez błony komórkowe.Zachariaiwsp.(1991)doniósłrównieżoutlenieniumetioninydo sulfotlenku i zastąpieniu wiązania peptydowego jego izoestrem ketometylenowym (COCH2) wcelu ułatwienia transportu peptydów przez błonę komórkową. Są to tylko niektóre ze znanych modyfikacji i pochodnych, które sąw zakresie wiedzy specjalisty.

Ponadto, leki albo inhibitory peptydowe, które zdolne są do hamowania aktywności G1 albojego możliwych izoform, związanej ze śmiercią komórkową, można skoniugować albo skompleksować z cząsteczkami, które ułatwiająwejście do komórki.

W opisie patentowym USA nr 5,149,782 przedstawiono koniugację cząsteczki, która ma zostać przetransportowana przez błonę komórkową ze środkiem zlewającym się z błoną, takimjakpolipeptydyfuzogenne,polipeptydytworzącekanały jonowe, inne polipeptydy błonowe oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, np. kwas mirystynowy, kwas palmitynowy. Te środki zlewającesięzbłonąumieszPL 193 394 B1 czają koniugaty cząsteczki w podwójnej warstwie lipidowej błon komórkowych i ułatwiają ich wejście do cytoplazmy.

Low i wsp., w opisie patentowym USA 5,108,921, dokonują przeglądu dostępnych metod dostarczania przezbłonowego cząsteczek, takich jak, ale nie wyłącznie, białka i kwasy nukleinowe, przez mechanizm aktywności endocytotycznej za pośrednictwem receptora. Te układy receptorowe obejmują układy rozpoznające galaktozę, mannozę, 6-fosforan mannozy, transferynę, asialoglikoproteinę, transkobalaminę (witaminę B12), a-2 makroglobuliny, insulinę i inne peptydowe czynniki wzrostu, takie jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF). Low i wsp. stwierdzają, iż receptory składników odżywczych, takie jak receptory biotyny i folanu, można korzystnie zastosować do wzmożenia transportu przez błonę komórkową z uwagi na lokalizację i liczbę receptorów biotyny i folanu na powierzchniach większości komórek i związane z tym procesy transportu przezbłonowego, zachodzące za pośrednictwem receptora. A zatem, kompleks utworzony pomiędzy związkiem dostarczanym do cytoplazmy a ligandem, takim jak biotyna albo folan, kontaktuje się z błoną komórkową, posiadającą receptory biotyny bądź folanu, wcelu rozpoczęcia zachodzącego za pośrednictwem receptora mechanizmu transportu przezbłonowego, i tym samym umożliwienia wejścia pożądanego związku do komórki.

Jak wiadomo, ICE ma zdolność do tolerowania liberalnych podstawień w położeniu P2 itatolerancja na liberalne podstawienia została wykorzystana wcelu opracowania silnego i wysoce wybiórczego wyznakowania powinowactwa, zawierającego znacznik biotynowy (Thornberry i wsp., 1994). W konsekwencji, położenie P2, jak również być może N-koniec inhibitora tetrapeptydowego można zmodyfikować albo wytworzyć jego pochodną, tak by wraz z dodaniem cząsteczki biotyny, wzmóc przepuszczalność tych inhibitorów peptydowych przez błonę komórkową.

Dodatkowo, wiadomo w stanie techniki, iż fuzja żądanej sekwencji peptydowej z sekwencją peptydową liderową/sygnałową w celu wytworzenia „peptydu chimerowego” umożliwi transport takiego „peptydu chimerowego” przez błonę komórkową do cytoplazmy.

Jak to doceni specjalista w dziedzinie peptydów, inhibitory peptydowe o aktywności proteolitycznej G1 według niniejszego wynalazku obejmują peptydomimetyczne leki albo inhibitory, które można również poddać szybkiemu badaniu przesiewowemu pod kątem wiązania się z proteazą G1 wcelu zaprojektowania być może stabilniejszych inhibitorów.

Należy również zauważyć, iż ten sam sposób ułatwienia albo wzmocnienia transportu inhibitorów peptydowych przez błony komórkowe, jak omówiono powyżej, nadaje się również do zastosowania wobec samych G1 albo ich izoform, jak również innych peptydów i białek, które wywierają działaniawe wnętrzu komórki.

Jeśli chodzi o wymienione tu przeciwciała, termin „przeciwciało” ma obejmować przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne (mAb), przeciwciała chimeryczne, przeciwciała antyidiotypowe (anty-Id) względem przeciwciał, które można wyznakować w postaci rozpuszczalnej albo związanej, jak również ich fragmenty, wytworzone dowolną znaną techniką, taką jak, ale nie wyłącznie, cięcie enzymatyczne, synteza peptydów albo techniki rekombinantowe.

Przeciwciała poliklonalne są heterogenną populacją cząsteczek przeciwciał, pochodzących z surowic zwierząt immunizowanych antygenem. Przeciwciało monoklonalne zawiera zasadniczo homogenną populację przeciwciał swoistych wobec antygenów, które to populacje zawierają zasadniczo podobne miejsca wiązania epitopu. MAb można uzyskać metodami znanymi specjalistom. Patrz na przykład Kohler i Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); amerykański opis patentowy nr 4,376,110; Ausubel i wsp., red., Harlow i Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); oraz Colligan iwsp., red., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. oraz Wiley Interscience N.Y., (1992-1996). Takie przeciwciała mogą byćimmunoglobulinami dowolnejklasy,wtymIgG,IgM,IgE,IgA,GILDidowolneichpodklasy. Hybrydoma wytwarzający mAb według niniejszego wynalazku może byćhodowany in vitro, in situ albo in vivo. Wytwarzanie wysokich mianmAb invivoalbo insituczynitęmetodę korzystną metodą produkcji.

Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami, których różne części pochodzą z różnych gatunków zwierząt, takie jak cząsteczki mające rejon zmienny pochodzący z mysich mAb iludzki stały rejon immunoglobulinowy. Przeciwciała chimeryczne są głównie stosowane do zmniejszenia immunogenności wzastosowaniu oraz do zwiększenia efektywności wytwarzania, na przykład, tam gdzie mysie mAb dająwyższe osiągi niż hybrydoma,alewyższąimmunogennośćuludzi,takżestosuje sięchimeryczne mAb ludzkie/mysie. Chimeryczne przeciwciała i sposoby ich wytwarzania są znane wstanie techniki (Cabilly i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277(1984);Morrisoniwsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne iwsp., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly iwsp.,

PL 193 394 B1 europejski opis patentowy 125023 (opublikowany 14 listopada 1984); Neuberger i wsp., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi i wsp., europejski opis patentowy 171496 (opublikowany 19 lutego 1985); Morrison i wsp., europejski opis patentowy 173494 (opublikowany 5 marca 1986); Neuberger i wsp., opis patentowy PCT WO 8601533 (opublikowany 13 Marca 1986); Kudo i wsp., europejski opis patentowy 184187 (opublikowany 11 czerwca, 1986); Sahagan i wsp., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); robinson i wsp., Międzynarodowy Opis Patentowy Nr WO8702671 (opublikowany 7 maja 1987); Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better i wsp., Science 240:1041-1043 (1988); oraz Harlow i Lane, ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, supra.

Przeciwciało antyidiotypowe (anty-Id) jest przeciwciałem, które rozpoznaje unikalne determinanty, ogólnie związane z miejscem wiążącym antygen przeciwciała. Przeciwciało Id można wytworzyć przez immunizację zwierzęcia tego samego gatunku i typu genetycznego (np. szczepu myszy), co źródło mAb, na które przygotowuje się anty-Id. Immunizowane zwierzę rozpozna i odpowie na idiotypowe determinanty przeciwciała immunizującego przez wytworzenie przeciwciała na te idiotypowe determinanty (przeciwciała anty-Id). Patrz na przykład, amerykański opis patentowy nr 4,699,880.

Przeciwciało anty-Id można również zastosować jako „immunogen” w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej u jeszcze innego zwierzęcia, wytwarzając tak zwane przeciwciało anty-anty-Id. Anty-anty-Id może być epitopowo identyczne z początkowym mAb, które wzbudziło wytwarzanie antyId. W ten sposób, dzięki zastosowaniu przeciwciał na idiotypowe determinanty mAb, możliwa jest identyfikacja innych klonów, produkujących przeciwciała o identycznej swoistości.

Zgodnie z tym, mAb wytworzone przeciwko białkom G1, ich analogom, fragmentom albo pochodnym, ujawnione w niniejszym wynalazku, można zastosować do wywołania wytwarzania przeciwciał anty-Id u odpowiednich zwierząt, takich jak myszy BALB/c. Komórki śledziony od takich immunizowanych myszy stosuje się do wytworzenia hybrydoma anty-Id, wydzielających mAb anty-Id. Ponadto, mAb anty-Id można sprzęgać z nośnikiem, takim jak hemocyjanina skałoczepu (ang. keyhole limpet hemocyanine, KLH)i wykorzystywać do immunizowania dodatkowych myszy BALB/c. Surowice od takich myszy zawierają przeciwciała anty-anty-ld, które mają właściwości wiążące oryginalne mAb swoiste względem epitopu powyższego białka G1, albo jego analogów, fragmentów i pochodnych.

Anty-Id mAb mają zatem swe własne epitopy idiotypowe, albo „idiotopy”, strukturalnie podobne do ocenianego epitopu, takiego jak GRB białko-a.

Termin „przeciwciało” obejmuje także nienaruszone cząsteczki przeciwciał, jak również ich fragmenty, takie jak na przykład Fab i F(ab')2, które są zdolne do wiązania się z antygenem. Fragmentom Fab i F(ab')2 brakuje fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała, ulegają one szybszemu usunięciu z krążenia i mogą mieć mniej nieswoistego tkankowo wiązania niż nienaruszone przeciwciało (Wahl i wsp., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Fab i F(ab')2 i inne fragmenty przeciwciał można zastosować do wykrywania i ilościowej oceny białka G1 według przedstawionych tu sposobów dla nienaruszonych cząsteczek przeciwciał. Takie fragmenty typowo wytwarza się przez cięcie proteolityczne, przy użyciu enzymów takich jak papaina (w celu wytworzenia fragmentów Fab) albo pepsyna (w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2).

Przeciwciało jest „zdolne do wiązania” cząsteczki, jeżeli jest zdolne do swoistej reakcji z tą cząsteczką i związania się cząsteczki z przeciwciałem. Termin „epitop” ma odnosić się do tej części dowolnej cząsteczki zdolnej do związania się z przeciwciałem, która również może być rozpoznana przez to przeciwciało. Epitopy albo „determinanty antygenowe” zwykle zawierają aktywne chemicznie ugrupowania powierzchniowe cząsteczki, takie jak aminokwasy albo łańcuchy boczne cukrowe i mają swoistą charakterystykę struktury trójwymiarowej, jak również swoistą charakterystykę ładunku.

„Antygen” jest cząsteczką albo częścią cząsteczki zdolną do wiązania się z przeciwciałem, która jest dodatkowo zdolna do wywoływania u zwierzęcia wytwarzania przeciwciała zdolnego do wiązania się z epitopem tego antygenu. Antygen może mieć jeden bądź więcej epitopów. Swoista reakcja, do której odniesiono się powyżej, oznacza wskazanie, iż antygen będzie reagować, w wysoce wybiórczy sposób, z jego odpowiednim przeciwciałem, a nie z wieloma innymi przeciwciałami, które mogą być wywołane przez inne antygeny.

Przeciwciała, w tym fragmenty przeciwciał przydatne w niniejszym wynalazku można zastosować do ilościowego albo jakościowego wykrywania białka G1w próbce albo do wykrywania obecności komórek, które wytwarzają białko G1 według niniejszego wynalazku. Można tego dokonać technikami immunofluorescencji, wykorzystując wyznakowane fluorescencyjnie przeciwciała (patrz poniżej) sprzężone z mikroskopem świetlnym, cytometrią przepływową albo wykrywaniem fluorometrycznym.

PL 193 394 B1

Przeciwciała (albo ich fragmenty) przydatne w niniejszym wynalazku można zastosować histologicznie, jak na przykład w immunofluorescencji albo mikroskopii immunoelektronowej, do wykrywania in situ białka G1 według niniejszego wynalazku. Wykrywanie in situ można przeprowadzić przez pobranie próbki histologicznej od pacjenta i podanie znakowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku na taką próbkę. Przeciwciało (albo fragment) korzystnie podaje się przez naniesienie albo nałożenie znakowanego przeciwciała (albo fragmentu) na próbkę biologiczną. Poprzez zastosowanie takiej procedury, możliwe jest określenie nie tylko obecności białka G1, ale również jego rozkładu w badanej tkance. Przy zastosowaniu niniejszego wynalazku, osoby o przeciętnej biegłości łatwo dostrzegą, iż dowolną z wielu różnych metod histologicznych (takich jak procedury barwienia) można zmodyfikować w celu uzyskania takiej detekcji in situ.

Takie testy na obecność białka G1 według niniejszego wynalazku zwykle obejmują inkubację próbki biologicznej, takiej jak płyn biologiczny, wyciąg tkankowy, świeżo pobrane komórki, takie jak limfocyty albo leukocyty, albo komórki, które inkubowano w hodowli tkankowej, w obecności wyznakowanego w sposób dający się wykryć przeciwciała zdolnego do identyfikacji białka G1, oraz wykrywanie przeciwciała przy pomocy dowolnej z wielu technik znanych dobrze w stanie techniki.

Próbkę biologiczną można skontaktować z podłożem albo nośnikiem w fazie stałej, takim jak nitroceluloza, albo innym podłożem stałym albo nośnikiem, który jest zdolny do unieruchomienia komórek, cząstek komórek albo rozpuszczalnych białek. Podłoże albo nośnik można następnie przepłukać przy użyciu odpowiednich buforów, po czym poddać obróbce wyznakowanymi w sposób dający się wykryć przeciwciałami, jak omówiono powyżej. Podłoże albo nośnik można następnie przepłukać buforem po raz drugi w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Ilość związanego znacznika na podłożu stałym albo nośniku można następnie wykryć metodami konwencjonalnymi.

Przez „podłoże fazy stałej”, „nośnik fazy stałej”, „podłoże stałe”, „nośnik stały”, „podłoże”, „nośnik” rozumie się dowolne podłoże albo nośnik zdolne do wiązania się z antygenem albo przeciwciałami. Do dobrze znanych podłóż albo nośników należą szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, amylazy nylonowe, naturalne i modyfikowane celulozy, poliakrylamidy, gabbros i magnetyt. Dla celów niniejszego wynalazku nośnik może być albo rozpuszczalny w pewnym stopniu albo nierozpuszczalny. Materiał podłoża może mieć praktycznie dowolną możliwą konfigurację strukturalną, o ile sprzężona cząsteczka zdolna jest do wiązania się z antygenem albo przeciwciałem. A zatem, konfiguracja podłoża albo nośnika może być sferyczna, jak w kulkach, cylindryczna, jak na wewnętrznej powierzchni probówki, albo zewnętrznej powierzchni pręta. Alternatywnie, powierzchnia może być płaska, taka jak arkusz, pasek testowy itp. Korzystne podłoża albo nośniki obejmują perełki polistyrenowe. Specjaliści znają wiele innych dogodnych nośników do wiązania przeciwciała albo antygenu, albo będą w stanie dobrać je na drodze rutynowych doświadczeń.

Aktywność wiązania danej partii przeciwciała można określić dobrze znanymi metodami. Specjaliści mogą określić robocze i optymalne warunki testowe dla każdego oznaczenia poprzez zastosowanie rutynowych doświadczeń.

W razie potrzeby i jak to zwykle ma miejsce, w testach można dodać inne etapy, jak przemywanie, mieszanie, wstrząsanie, filtrowanie itp.

Jednym ze sposobów, w którym przeciwciało można w sposób dający się wykryć wyznakować, jest połączenie tego z enzymem i zastosowanie w teście immunoenzymatycznym (EIA). Ten enzym, z kolei, gdy zostanie później wystawiony na działanie odpowiedniego substratu, przereaguje z substratem w taki sposób, by wytworzyć grupę chemiczną, którą można wykryć, na przykład metodą spektrofotometryczną, fluorometryczną albo wizualną. Enzymy, które można zastosować w celu dającego się wykryć wyznakowania przeciwciała, obejmują, ale nie wyłącznie, dehydrogenazę maleinianową, nukleazę gronkowcową, izomerazę delta-steoidową, drożdżową dehydrogenazę alkoholową, dehydrogenazę alfa-glicerofosforanową, izomerazę triozofosforanową, peroksydazę chrzanową, fosfatazę zasadową, asparaginazę, oksydazę glukozową, beta-galaktozydazę, rybonukleazę, ureazę, katalazę, dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, glukoamylazę i esterazę acetylo-cholinową. Wykrywanie można przeprowadzić metodami kolorymetrycznymi, w których wykorzystuje się substrat chromogenny dla enzymu. Wykrywanie można również przeprowadzić przez wzrokowe porównanie stopnia reakcji enzymatycznej substratu w porównaniu z podobnie przygotowanymi wzorcami.

Wykrywanie można przeprowadzić przy użyciu dowolnego z wielu różnych innych testów immunologicznych. Na przykład, dzięki radioaktywnemu wyznakowaniu przeciwciał albo fragmentów przeciwciał, możliwe jest wykrycie R-PTPazy poprzez zastosowanie testu radioimmunologicznego (RIA). Dobry opis RIA można znaleźć w Laboratory Techiques and Biochemistry in Molecular biology, Work,

PL 193 394 B1

T.S. i wsp., North Holland Publishing Company, NY (1978), ze szczególnym odniesieniem do rozdziału zatytułowanego „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques” autorstwa T. Charda. Izotop radioaktywny można wykryć takimi metodami jak zastosowanie licznika g albo licznikascyntylacjialboprzez autoradiografię.

Możliwe jest również wyznakowanie przeciwciała związkiem fluorescencyjnym. Gdy wyznakowane fluorescencyjnie przeciwciało wystawi się na światło o odpowiedniej długości fali, jego obecność można wykryć dzięki fluorescencji. Do najpowszechniej używanych związków do znakowania fluorescencyjnego należą: izotiocyjanianfluoresceiny, rodamina, fikoerytryna, pikocyjanina, allofikocyjanina, aldehydoftalowyorazfluorescamina.

Przeciwciało można również wyznakować w sposób dający się wykryćprzyużyciumetali emitu152 jącychfluorescencję, takich jak ¹⁵²Eu, albo inne z grupy lantanowców. Metale te można przymocować do przeciwciała przy użyciu takich grup chelatujących metalejak kwas dietylenotetraaminopentaoctowy (ETPA).

Przeciwciało można również wyznakować w sposób dający się wykryć poprzez sprzężenie go ze związkiem chemiluminescencyjnym. Obecność przeciwciała wyznakowanego chemiluminescenyjnie określa się następnie przez wykrycie obecności luminescencji, która powstaje wtrakcie reakcji chemicznej. Przykładami szczególnie użytecznych związków znakujących chemoluminescencyjnie są luminol,izoluminol, esterteromatycznyakrydyny,imidazol,sól akrydyniowa i ester szczawianowy.

Podobnie można zastosować związek bioluminescencyjny wcelu wyznakowania przeciwciała. Bioluminescencja jest typem chemoluminescencji znajdowanym wukładach biologicznych, w których białko katalityczne zwiększa wydajność reakcji chemoluminescencyjnych. Obecność białka bioluminescencyjnego określa się przez wykrycie obecności luminescencji. Ważnymi związkami bioluminescencyjnymidlacelówznakowaniasą lucyferyna,lucyferazai ekworyna.

Cząsteczka przeciwciała może być dostosowana do wykorzystania wteście immunometrycznym, znanym również jako test „dwumiejscowy” albo „kanapkowy”. W typowym teście immunometrycznym, pewną ilość niewyznakowanego przeciwciała (albo fragmentu przeciwciała) wiąże się z podłożem stałym albo nośnikiem, a pewną ilość wyznakowanego wsposób wykrywalny, rozpuszczalnego przeciwciała dodaje się wcelu umożliwienia wykrycia i/lub ilościowego pomiaru potrójnego kompleksuutworzonegopomiędzyprzeciwciałemfazystałej, antygenemiprzeciwciałemznakowanym.

Do typowych, i zalecanych, testów immunometrycznych należą testy typu „forward”, w których przeciwciało, związane zfazą stałą, kontaktuje się najpierw z testowaną próbką wcelu wychwytu antygenu z próbki przez utworzenie podwójnego kompleksu przeciwciało fazy stałej - antygen. Po odpowiednim okresie inkubacji, podłoże stałe albo nośnik przepłukuje się wcelu usunięcia pozostałości płynnej próbki, wtym antygenu, który nie przereagował, o ile taki pozostał, a następnie kontaktuje się je z roztworem, zawierającym nieznaną ilość wyznakowanego przeciwciała (które działa jako „cząsteczka reporterowa”). Po drugim okresie inkubacji w celu umożliwienia wyznakowanemu przeciwciału utworzenia kompleksów z antygenem związanym ze stałym podłożem albo nośnikiem poprzez niewyznakowane przeciwciało, stałe podłoże albo nośnik przepłukuje się po raz drugi wcelu usunięcia wyznakowanego przeciwciała, które nie przereagowało.

W innym typie testu „kanapkowego”, który może być również użyteczny z antygenami według niniejszego wynalazku, stosuje się testy typu tak zwanego „równoczesnego” albo „odwróconego”. Test równoczesnyobejmujejedenetapinkubacji, wktórymprzeciwciałozwiązaneze stałym podłożemalbo nośnikiem oraz przeciwciało wyznakowane dodaje się razem do testowanej próbki wtym samym czasie. Po zakończeniu inkubacji, stałe podłoże albo nośnik przepłukuje się wcelu usunięcia pozostałości próbki płynnej oraz nieskompleksowanego przeciwciała wyznakowanego. Obecność wyznakowanego przeciwciała połączonego ze stałym podłożem albo nośnikiem określa się wówczas tak, jak wkonwencjonalnymteście kanapkowymtypu „forward”.

W teście „odwrotnym”, stosuje się kolejne dodawanie najpierw roztworu wyznakowanego przeciwciała do próbki płynu, po którym następuje dodawanie niewyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym podłożem albo nośnikiem po odpowiednim okresie inkubacji. Po drugiej inkubacji, fazę stałą przepłukuje się wsposób konwencjonalny wcelu uwolnienia jej od pozostałości testowanej próbki oraz roztworu przeciwciała wyznakowanego, które nie przereagowało. Określenie wyznakowanego przeciwciała, związanego ze stałym podłożem albonośnikiem określasię wówczasjakwtestach typu „równoczesnego” i „forward”.

Białka G1 według wynalazku można wytworzyć dowolną standardową procedurą rekombinacji DNA (patrz na przykład, Sambrook i wsp., 1989 oraz Ansabel i wsp., 1987-1995, supra), wktórej odPL 193 394 B1 powiednie eukariotyczne bądź prokariotyczne komórki-gospodarza, dobrze znane w stanie techniki, transformuje się odpowiednimi eukariotycznymi bądź prokariotycznymi wektorami, zawierającymi sekwencje kodujące białka. Jak wspomniano powyżej, do białek tych należą również ich biologicznie aktywne analogi, fragmenty bądź pochodne, a zatem wektory kodujące je obejmują również wektory kodujące analogi i fragmenty tych białek, a transformowani gospodarze obejmują również tych, którzy produkują takie analogi i fragmenty. Pochodne tych białek, wytwarzane przez transformowanych gospodarzy, są pochodnymi wytwarzanymi przez standardowe modyfikacje białek albo ich analogów bądź fragmentów.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne, zawierające rekombinantowe zwierzęce wektory wirusowe, kodujące białka G1, które kodują również białko powierzchniowe wirusa, zdolne do wiązania się ze swoistymi białkami powierzchniowymi komórki docelowej (np. komórki nowotworowej) w celu skierowania insercji sekwencji białka G1 do tych komórek. Dalsze kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają jako składnik aktywny sekwencję oligonukleotydu, kodującą sekwencję antysensowną sekwencji białka G1.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku zawierają wystarczającą ilość aktywnego składnika w celu uzyskania ich zamierzonego celu. Dodatkowo, kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać odpowiednie, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, obejmujące zaróbki i substancje pomocnicze, które ułatwiają przeprowadzenie aktywnych składników w preparaty, które mogą być stosowane farmaceutycznie i które mogą stabilizować takie preparaty przeznaczone do podawania osobie, która ich potrzebuje.

Białko G1 i jego izoformy albo izotypy, jak się podejrzewa, podlegają zależnemu od ekspresji wytwarzaniu w różnych tkankach na znacząco różniących się poziomach i, jak się wydaje, również z różnymi wzorcami izotypów w sposób analogiczny do wytwarzania białka MACH i jego różnych izotypów, jak wskazano w wyżej wymienionych wspólnych, równoległych zgłoszeniach patentowych. Różnice te, być może, mogą się przyczyniać do swoistych tkankowo cech odpowiedzi na ligand Fas/APO1 i TNF. Tak jak w przypadku innych homologów CED3/ICE (Wang i wsp., 1994; Alnemri i wsp., 1995), wynalazcy niniejszego wynalazku wykazali uprzednio (w wyżej wspomnianych zgłoszeniach patentowych), iż izoformy MACH, które zawierają niekompletne rejony CED3/ICE (np. MACHa3), mają wpływ hamujący na aktywność równocześnie wytwarzanych cząsteczek MACHa1 albo MACHa2; stwierdzono również, iż blokują one indukcję śmierci komórkowej przez Fas/APO1 i p55-R. Wytwarzanie takich hamujących izoform w komórkach może stanowić mechanizm komórkowej samoobrony przeciwko cytotoksyczności zachodzącej za pośrednictwem Fas/APO1 i TNF. Podejrzewa się zatem analogiczne działanie hamujące przynajmniej niektórych izoform G1. Szeroka heterogenność izoform MACH, i podobnie, jak się podejrzewa, analogiczna heterogenność izoform G1, która znacznie przekracza obserwowaną dla jakichkolwiek innych proteaz z rodziny CED3/ICE, powinna pozwalać na szczególnie dokładną regulację funkcji aktywnych izoform MACH, a przez analogię również aktywnych izoform G1 według niniejszego wynalazku.

Możliwe jest również, że pewne możliwe izoformy G1 pełnią inne funkcje. Na przykład, uprzednio znaleziona (przez niniejszych wynalazców, jak wspomniano powyżej) zdolność MACHb1 do wiązania się zarówno z MORT-1 jak i MACHa1 sugeruje, iż izoforma ta mogłaby w rzeczywistości wzmagać aktywność enzymatycznie aktywnych izoform. Łagodna cytotoksyczność obserwowana w hodowlach 293-EBNA i MCF7 transfekowanych tą izoformą i raczej znaczne działanie cytotoksyczne, które wywiera ona w komórkach HeLa, prawdopodobnie odzwierciedlają aktywację endogennie produkowanych cząsteczek MACHa po związaniu się z transfekowanymi cząsteczkami MACHb1. Można sobie wyobrazić, że pewne izoformy MACH mogłyby również działać jako miejsca zakotwiczenia dla cząsteczek, które są zaangażowane w inne, nie cytotoksyczne efekty działania receptorów Fas/APO1 i TNF. Stąd, w analogiczny sposób G1 i/lub jego izoformy mogą również mieć takie właściwości wzmagające albo służyć jako miejsca zakotwiczenia dla innych takich cząsteczek.

Z uwagi na unikalną zdolność receptorów Fas/APO1 i TNF do powodowania śmierci komórkowej, jak również zdolność receptorów TNF do wyzwalania innych czynności uszkadzających tkanki, zakłócenia w działaniu tych receptorów mogłyby być szczególnie szkodliwe dla organizmu. Rzeczywiście, zarówno nadmierne jak i niedostateczne działanie tych receptorów, jak wykazano, przyczynia się do patologicznych manifestacji różnych chorób (Vassalli, 1992; Nagata i Golstein, 1995). Zidentyfikowanie cząsteczek, które uczestniczą w aktywności sygnalizacyjnej tych receptorów i znalezienie sposobów modulowania aktywności tych cząsteczek mogłyby nadać kierunek nowym próbom terapeutycznym. Mając na względzie centralną rolę G1 w toksyczności zachodzącej za pośrednictwem

PL 193 394 B1

Fas/APO1 i TNF, wydaje się szczególnie ważne zaprojektowanie leków, które mogą blokować możliwe działanie proteolityczne G1, jak to przeprowadzono dla niektórych innych białek z rodziny CED3/ICE (Thornberry i wsp., 1994; Miller i wsp., 1995; Mashima i wsp., 1995; Milligan i wsp., 1995; Enari i wsp., 1995; Los i wsp., 1995). Unikalne cechy sekwencji homologa CED3/ICE, jak się wydaje, istniejące w obrębie cząsteczki G1 pozwalałyby na zaprojektowanie leków, które swoiście wpływałyby na jego aktywność. Takie leki mogłyby zapewnić ochronę przed nadmierną cytotoksycznością zachodzącą za pośrednictwem układu immunologicznego, w której uczestniczy G1, bez zakłócania fizjologicznych procesów śmierci komórkowej, w które zaangażowani są inni członkowie rodziny CED3/ICE.

Wynalazek zostanie obecnie opisany bardziej szczegółowo w następujących nieograniczających przykładach i na towarzyszących rysunkach.

Należy również zauważyć, iż procedury:

(i) testu przesiewowego podwójnej hybrydy oraz testu ekspresji b-galaktozydazy z podwójnej hybrydy; (ii) wzbudzanej ekspresji, znakowania metabolicznego i immunoprecypitacji białek; (iii) wiązania in vitro; (iv) oceny cytotoksyczności; i (v) analizy Northern i analizy sekwencji, jak przedstawiono w Przykładach Odnosienie 1 (patrz również Boldin i wsp., 1995b), 2 i3 (patrz również Boldin i wsp., 1996) poniżej, względem MORT-1 i białek wiążących MORT-1 (np. MACH), odpowiednio, nadają się również do zastosowania (z pewnymi modyfikacjami) do odpowiedniej izolacji, klonowania i charakteryzacji G1 ijego możliwych izoform według niniejszego wynalazku. Procedury te należy zatem rozważać jako pełny opis tych samych procedur stosowanych do izolacji, klonowania i charakteryzacji G1 według niniejszego wynalazku, jak to szczegółowo przedstawiono w Przykładzie 1 poniżej. (Przykłady Odniesienia 1-3 poniżej pojawiają się również wtej samej bądź równoważnej postaci we wspólnym, równoległym Izraelskim zgłoszeniu nr 114,615, 114,986, 115,319, 116588 i 117939, jak również w odpowiadającym im zgłoszeniu patentowym PCT nr PCT/US96/10521). Ponadto, w powyższej sekcji zatytułowanej „Krótki opis rysunków”, włączono również pewne szczegóły procedur doświadczalnych przeprowadzonych według niniejszego wynalazku i stanowią one część poniższego Przykładu 1 w odniesieniu do pełnego opisu niniejszego wynalazku, astąd powinny być rozważane wraz z treścią Przykładu 1.

PRZYKŁAD ODNIESIENIA 1:

Klonowanie i izolacja białka MORT-1, które wiąże się z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R (i) Test przesiewowy podwójnej hybrydy i test ekspresji b-galaktozydazy z podwójnej hybrydy

W celu wyizolowania białek, ulegających interakcji z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R, zastosowano układ podwójnej hybrydydrożdżowej (Fields i Song, 1989). Krótko mówiąc, ten układ podwójnej hybrydy jest testem genetycznym opartym na drożdżach, służącym do wykrycia swoistych interakcji białko-białko in vivo poprzez odtworzenie eukariotycznego aktywatora transkrypcji, takiego jakGAL4, który ma dwie oddzielne domeny,domenęwiążącąDNAidomenęaktywacyjną,które,gdy ulegająekspresjiizwiązaniu,tworząodtworzonebiałkoGAL4, zdolnedowiązaniasięzleżącąwyżej sekwencją aktywującą, która zkolei aktywuje promotor, który steruje ekspresją genu reporterowego, takiego jak lacZ albo HIS3, których ekspresja jest łatwo obserwowana whodowanych komórkach. Wtym układzie,genydlakandydującychbiałekulegającychinterakcjiklonujesiędooddzielnychwektorów ekspresyjnych. W jednym z wektorów ekspresyjnych, sekwencja białka kandydującego jest klonowana wfazie zsekwencją domeny wiążącej DNA GAL4, wcelu utworzenia białka hybrydowego zdomeną wiążącą DNA GAL4, awdrugim wektorze, sekwencję drugiego białka kandydującego klonuje się wfazie z sekwencją domeny aktywacyjnej GAL4 wcelu utworzenia białka hybrydowego zdomeną aktywacyjną GAL4. Wektory dwuhybrydowe następnie wspólnie wprowadza się do drożdżowego gospodarza, zawierającego gen reporterowy lacZ albo HIS3 pod kontrolą leżących powyżej miejsc wiążących GAL4. Tylko tekomórki transformowane (kotransformanty), w których wytwarzane są dwa białka hybrydowe i które zdolne są do interakcji ze sobą, będą zdolnedoekspresjigenureporterowego.W przypadku genu reporterowego lacZ, komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja tegogenuzabarwiąsięnaniebiesko,gdydohodowli dodasięX-gal.Stąd,błękitnekoloniewskazują nafakt,że dwasklonowanebiałkakandydującesązdolnedointerakcjize sobą.

Przy użyciu układu podwójnej hybrydy, wklonowano oddzielnie wewnątrzkomórkową domenę FAS-IC do wektora pGBT9 (niosącego sekwencję wiążącą DNA GAL4, wyprodukowanego przez CLONTECH,USA,patrzniżej)wceluwytworzeniafuzjibiałkowejzdomenąwiążącąDNAGAL4.Dla wklonowaniaFAS-RwpGBT9,wykorzystanoklonkodującysekwencjęcDNAFAS-Ropełnejdługości (WO 9531544), z którego wycięto domenę wewnątrzkomórkową (IC) według standardowych procedur, wykorzystując różne enzymy restrykcyjne, anastępnie wyizolowano ją przy użyciu standardowych

PL 193 394 B1 procedur i wstawiono do wektora pGBT9, otwartego w rejonie miejsca wielokrotnego klonowania (MCS), przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Należy zauważyć, iż FAS-IC rozciąga się od reszt aminokwasów 175-319 nienaruszonego FAS-R, przy czym część ta zawiera reszty 175-319, które stanowią FAS-IC wstawiony do wektora pGBT9.

Powyższy hybrydowy (chimeryczny) wektor poddano następnie kotransfekcji z biblioteką cDNA z ludzkich komórek HeLa, wklonowanych w wektor pGAD GH, niosący domenę aktywacyjną GAL4, do szczepu-gospodarza drożdżowego HF7c (wszystkie wyżej wspomniane wektory, pGBT9 i pGAD GH przenoszące bibliotekę komórkowego cDNA HeLa, oraz szczep drożdży zakupiono od Clontech Laboratories, Inc. USA, jako część układu podwójnej hybrydy MATCHMAKER #PT 1265-1). Poddane kotransfekcji drożdże wybrano według ich zdolności do wzrostu w podłożu pozbawionym histydyny (podłoże His^-), i wówczas kolonie rosnące wskazywały na pozytywny przebieg transformacji. Wybrane klony drożdżowe testowano następnie na ich zdolność do ekspresji genu lacZ, tj. na ich aktywność LACZ, przez dodanie X-gal do podłoża hodowlanego, który ulega katabolizmowi, tworząc niebiesko zabarwiony produkt dzięki b-galaktozydazie, enzymowi kodowanemu przez gen lacZ. A zatem, niebieskie kolonie wskazują na aktywny gen lacZ. Dla aktywności genu lacZ konieczne jest, by aktywator transkrypcji GAL4 był obecny w postaci aktywnej w klonach transformowanych, mianowicie by domena wiążąca DNA GAL4 kodowana przez powyższy wektor hybrydowy była właściwie połączona z domeną aktywacyjną GAL4, kodowaną przez drugi wektor hybrydowy. Takie połączenie możliwe jest jedynie, jeżeli dwa białka połączone z każdą z domen GAL4 zdolne są do stabilnej interakcji (wiązania) ze sobą. A zatem, kolonie His⁺ i niebieskie (LACZ⁺), które wyizolowano, są koloniami, które poddano kontransfekcji wektorem, kodującym FAS-IC oraz wektorem kodującym produkt białkowy pochodzący z ludzkiej komórki HeLa, który zdolny jest do stabilnego wiązania sięz FAS-IC.

Plazmid DNA z powyższych kolonii drożdżowych His⁺, LACZ⁺ wyizolowano i poddano elektroporacji do szczepu E. coli HB101 standardowymi procedurami, po których nastąpiła selekcja transformantów Leu⁺ i opornych na ampicylinę, przy czym były to transformanty, które niosły wektor hybrydowy pGAD GH, który ma zarówno sekwencje kodujące Amp^R jak i Leu2. Takie transformanty były zatem klonami, które niosły sekwencje kodujące nowo zidentyfikowane białka zdolne do wiązania się z FAS-IC. Następnie z tych transformowanych komórek E. coli wyizolowano plazmid DNA i poddano ponownemu testowaniu przez:

(a) ich retransformację plazmidem hybrydowym oryginalnej wewnątrzkomórkowej domeny FAS-R (hybrydowym pGBT9 niosącym FAS-IC) do szczepu drożdżowego HF7 jak podano powyżej. Jako kontrole do kotransformacji z plazmidem kodującym białko wiążące FAS-IC (tj. MORT-1) stosowano wektory niosące sekwencje kodujące inne, niezwiązane tematycznie białka np. pACT-lamininę albo sam pGBT9. Kotransformowane drożdże testowano następnie na wzrost w samym podłożu His^-, albo przy różnych poziomach 3-aminotriazolu; i (b) ponowną transformację plazmidowego DNA i oryginalnego plazmidu hybrydowego FAS-IC oraz plazmidów kontrolnych opisanych w (a) do drożdżowych komórek gospodarzy szczepu SFY526 oraz określanie aktywności LACZ⁺ (efektywności tworzenia b-gal, tj. wytwarzania koloru niebieskiego).

Wyniki powyższych testów ujawniły, iż wzorzec wzrostu kolonii na podłożu His^- był identyczny z wzorcem aktywności LACZ, ocenianym przez kolor kolonii tj. kolonie His⁺ były również LACZ⁺. Ponadto, aktywność LACZ w płynnej hodowli (zalecane warunki hodowlane) była oceniana po transfekcji hybrydami domeny wiążącej DNA i aktywacyjnej GAL4 do gospodarza - drożdży SFY526, które miały lepszą indukowalność LACZ z aktywatorem transkrypcji GAL4, niż komórki gospodarza drożdży HF7.

Przy użyciu powyższej procedury, zidentyfikowano, wyizolowano i scharakteryzowano białko uprzednio oznaczane HF1, a obecnie określane jako MORT-1 w skrócie od „Mediator of Receptorinduced Toxicity”.

Ponadto, należy również wspomnieć, iż w wielu powyższych testach podwójnej hybrydy ekspresji b-galaktozydazy, wytwarzanie b-galaktozydazy oceniano również przez zalecany test filtracyjny. W czasie badania przesiewowego okazało się, że pięć z około 3x10⁶ cDNA zawiera wstawkę MORT-1. Wyizolowane w ten sposób wstawki cDNA MORT-1 poddano następnie sekwencjonowaniu przy użyciu standardowych procedur sekwencjonowania DNA. Sekwencję aminokwasów MORT-1 wywnioskowano z sekwencji DNA (dla sekwencji DNA i aminokwasów MORT-1 patrz wspólne, równoległe izraelskie zgłoszenie nr 112,022, 112,692 i 114,615 oraz odpowiadające im zgłoszenie patentowe PCT nr WO96/18641). Numeracja reszt w białkach kodowanych przez wstawki DNA jest taka, jak w banku danych Swiss-Prot. Mutanty delecyjne wytworzono przez PCR, a mutanty punktowe przez mutagenezę ukierunkowaną przez oligonukleotydy (Current Protocols in Molec. Biol. 1994).

PL 193 394 B1 (ii) Wzbudzana ekspresja, metaboliczne znakowanie i immunoprecypitacja białek

Przez ekspresję cDNA w komórkach HeLa wytworzono MORT-1, N-związane z oktapeptydem FLAG (FLAG-MORT-1; Eastman Kodak, New Haven, Ct. USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R, chimerę złożonązpozakomórkowejdomenyp55-R(aminokwasy1-168)zfuzowanejze śródbłonową i wewnątrzkomórkowądomenąFAS-R(aminokwasy153-319)orazlucyferazę,którasłużyjakokontrola.Ekspresję przeprowadzano stosując kontrolowany przez tetracyklinę wektorekspresyjny,wkloniekomórek HeLa(HtTA-1),który produkuje przez ekspresję transaktywator kontrolowany przez tetracyklinę (Gossen and Bujard, 1992; patrz również Boldin iwsp., 1995). Metaboliczne znakowanie przy użyciu

35

[³⁵S]metioniny oraz [³⁵S] cysteiny(DUPONT,Wilmongton,DE,USAoraz Amersham,Buckinghamshire, Wielka Brytania) przeprowadzono 18 godzinpotransfekcji,przezdalszą4-godzinnąinkubację w 37°C w zmodyfikowanym przez Dulbecco's podłożu Eagle'a pozbawionym metioniny i cysteiny, ale z dodatkiem 2% dializowanejpłodowejsurowicycielęcej.Komórkipoddano następnie lizie w buforze RIPA(10mMTris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1%NP-40, 1%deoksycholan, 0,1%SDSi1 mM EDTA), alizat wstępnie sklarowano przez inkubację zniezwiązaną tematycznie króliczą przeciwsurowicą(3 ml/ml)orazkulkami SefarozyzBiałkiemG(Pharmacia,Uppsala,Szwecja, 60. ml/ml). Immunoprecypitację przeprowadzono przez 1-godzinną inkubacjęw4°C0,3mlpróbeklizatuzmysimi monoklonalnymi przeciwciałami (5 ml/ml/próbkę) przeciwko oktapeptydowi FLAG (M2; Eastman Kodak), p55-R (#18 i#20, Engelmann iwsp., 1990), albo FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA) albo z izotypowo dopasowanymi przeciwciałami mysimi jako kontrolą, po czym nastąpiła dalsza 1-godzinnainkubacjazkulkami Sefarozy z Białkiem G (30 ml/próbka).

(iii) Wiązanie in vitro

Wytworzono fuzje S-transferazy glutiationu (GST) z dzikimi albo zmutowanymi Fas-IC i zabsorbowanonakulkach glutationo-agarozowych; (patrz Boldin i wsp., 1995; Current ProtocolsinMolecular Biology,1994;FrangioniiNel,1993). Wiązaniesięwyznakowanegometaboliczniebiałkafuzyjnego

FLAG-MORT-1 z GST-Fas-IC oceniano przez inkubację kulek przez 2godzinyw4°Czekstraktami komórekHeLa,metabolicznie wyznakowanymi [³⁵S]metioniną (60 mCi/ml), którewykazywały wytwarzaniewwynikuekspresjiFLAG-MORT-1.Ekstrakty przygotowanowbuforzezawierającym50mM Tris-HCl, pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1%NP.-40, 1 mM ditiotreitolu, 1 mMEDTA, 1 mM fluorkufenylometylosulfonylu, 20 mg/ml Aprotoniny, 20 mg/ml Leupeptyny,10mMfluorkusodui0,1mMwanadianu sodu(1ml na5x10⁵komórek).

(iv) Ocena cytotoksyczności wyzwalanej przez zaindukowaną ekspresję MORT-1 cDNA MORT-1, Fas-IC, p55-IC i lucyferazy wstawiono do kontrolowanego tetracykliną wektora ekspresyjnego itransfekowano do komórek HtTA-1 (linia komórek HeLa) (Gossen iBujard, 1992) wraz z cDNA wydzielanej łożyskowej fosfatazy zasadowej, umieszczonego pod kontrolą promotora SV40(wektor pSBC-2, Dirks i wsp., 1993). Śmierćkomórkowąoceniano40 godzinpotransfekcji,albo przez test wychwytu czerwieni obojętnej (Wallach, 1984), albo, dla oceny swoiście śmierci wtych komórkach,któredokonywałyekspresjitransferowanych cDNA, przez określenie ilości łożyskowej fosfatazy zasadowej (Berger iwsp,. 1988) wydzielanej do podłoża hodowlanego po przynajmniej 5godzinachinkubacji.

Winnymzestawiedoświadczeńwceluanalizyrejonu białkaMORT-1zaangażowanegowwiązanie zFAS-IC, następujące białka poddano przejściowemu wytwarzaniu wwyniku ekspresji wkomórkachHeLa,którezawierająkontrolowanytetracykliną transaktywator (HtTA-1), przy użyciu kontrolowanego tetracyklinąwektoraekspresyjnego(pUHD10-3):samludzki FAS-R; ludzki FAS-Rjak również N-końcowa część MORT-1 (aminokwasy 1-117, „głowa MORT-1”); ludzki FAS-R jakrównież C-końcowa część MORT-1, która zawiera jego rejon homologii z„domeną śmierci” (aminokwasy 130-245, „MORT-1 DD”); FLAG-55.11 (aminokwasy 309-900 białka 55.11 zfuzowane zN-końcem oktapeptydu FLAG, przy czym białko 55.11 jest białkiem wiążącym się swoiście z p55-IC). Dwanaście godzinpo transfekcji,komórkipoddanotrypsynizacjiiponownemu wysianiu przy stężeniu 30 000 komórek/płytkę. Po 24 godzinach dalszejinkubacji,komórkipoddanoprzez6godzindziałaniu monoklonalnego przeciwciała przeciwko zewnątrzkomórkowej domenie FAS-R (monoklonalne przeciwciało CH-11,Oncor, Gaithesburg, MD, USA) przy różnych stężeniach (0,001-10 mg/ml przeciwciała monoklonalnego), w obecności 10 mg/ml cykloheksimidu. Żywotność komórek oceniano następnie przez test wychwytu czerwieni obojętnej, a wyniki przedstawiono w postaci % żywych komórek w porównaniu z komórkami, które inkubowanozsamymcykloheksimidem(wnieobecności przeciwciała monoklonalnegoanty-FAS-RCH-11).

PL 193 394 B1 (v) Analiza Northern i analiza sekwencji

Poli A+ RNA wyizolowano z całkowitego RNA komórek HeLa (zestaw Oligotex-dT mRNA, QIAGEN,Hilden,Niemcy).Analizę Northern przy użyciu cDNA MORT-1 jako sondy przeprowadzono konwencjonalnymimetodami(patrzBoldiniwsp.,1995). SekwencjęnukleotydowąMORT-1określono w obydwu kierunkach metodąterminacjiłańcuchadideoksy.

AnalizasekwencjicDNAMORT-1sklonowanegometodą procedury podwójnej hybrydy wykazała, iżkoduje ono nowe białko. Dalsze zastosowanie testu podwójnej hybrydy w celu oszacowaniaswoistości wiązania się tego białka (MORT-1 od „Mediatorwzbudzanejreceptorem toksyczności”) z FasIC, oraz wcelu określenia szczególnego rejonu wFas-IC, zktórym ono się wiąże, doprowadziło do następujących stwierdzeń: (a) Białko MORT-1 wiąże się zarówno z ludzkim jak i zmysimFas-IC, ale niewiążesięzkilkomainnymitestowanymibiałkami,wtymtrzemareceptoramizrodzinyreceptorów TNF/NGF (receptory TNF p55 ip75 oraz CD40); (b) Mutacje zastąpienia w pozycji 225 (Ile) w„domenie śmierci”FAS-R, jak wykazano, znoszą sygnalizację zarówno in vitro jaki in vivo (mutacja lpr^cg(Watanabe-Fukunaga iwsp., 1992; Itoh iNagata, 1993) zapobiega również wiązaniu się MORT-1 zFAS-IC;(c)Miejsce wiążące MORT-1 w FAS-R występuje wewnątrz „domeny śmierci” tego receptora;i(d)MORT-1 wiąże się sam ze sobą. To samowiązaniesięoraz wiązanie sięMORT-1 zFAS-R angażuje różne rejony w białku: Fragment MORT-1 odpowiadający resztom 1-1 17 wiąże się z pełną długością MORT-1 , ale nie wiąże się ze sobą ani z FAS-IC. Odwrotnie, fragment odpowiadający resztom 130-245 wiąże się z FAS-R, jednak nie wiąże się z MORT-1 . Ponadto, z rezultatów wynikło również,iżrejon „domeny śmierci” FAS-R jest krytyczny dla samo-łączenia się FAS-IC,takjakrejon„domeny śmierci” p55-R dla samo-łączenia się p55-IC. Delecje po obu stronach tych „domen śmierci”nie wpływająnaichzdolnośćdosamowiązania, natomiast delecja wewnątrz tych „domen śmierci” wpływa na samo-łączeniesię. W przypadku MORT-1 , wiązanie się MORT-1 z FAS-IC zależy również od całej (pełnej)„domenyśmierci”FAS-R,natomiastjednakniezależyrównieżodrejonównazewnątrz rejonu „domenyśmierciFAS-RdlawiązaniaFAS-IC.

Interakcja białek kodowanych przez konstrukty domeny wiążącej DNA idomeny aktywacyjnej Gal4 (pGBT9 i pGAD-GH) wewnątrz transfekowanych drożdży SFY526 była oceniana przez test filtracyjny ekspresji b-galaktozydazy. Konstrukty domeny wiążącej DNA obejmowały cztery konstrukty ludzkiegoFas-IC, cztery konstrukty mysiego Fas-IC, obejmujące dwa konstrukty pełnejdługości,mające mutacje zastępujące Ile na Leu albo Ile na Alawpołożeniu 225 (odpowiednio I225N iI225A), oraz trzy konstrukty MORT-1. Konstrukty domeny aktywacyjnej obejmowały trzy konstrukty MORT-1, przyczymczęśćMORT-1 była jak w konstruktach domeny wiążącej DNA; orazpełnej długości konstrukt ludzkiego Fas-IC, przy czym częśćFas-IC była taka sama jak w powyższym konstrukcie domeny wiążącej DNA. Wewnątrzkomórkowe domeny ludzkiego receptora p55 TNF (reszty 206-426 p55-IC), ludzkiego CD40 (CD40-IC, reszty 216-277) oraz ludzkiego receptora p75 TNF (p75-IC, reszty 287-461), jak również laminina, cyklina D i „puste” wektory Gal4 (pGBT9) służyły jako negatywne kontrole w postaci konstruktów domeny wiążącej DNA. SNF-1 iSNF-4 służyły jako kontrole pozytywne w postaci konstruktów domeny wiążącej DNA (SNF-1) oraz domeny aktywacyjnej (SNF-4). „Puste” wektory Gla4 (pGAD-GH) służyły również jako negatywne kontrole w postaci konstruktów domeny aktywacyjnej. Symbole„++”i„+”stosowane w prezentacji wyników powyższej analizyoznaczająpojawienie się silnego zabarwienia w 30 i 90 minucie testu, odpowiednio; zaś „-” oznacza brak pojawieniasięzabarwieniawciągu24 godzin.

Ekspresja cząsteczek MORT-1 zfuzowanych przy ichN-końcu zoktapeptydem FLAG (FLAG-MORT-1)daławkomórkachHeLa białka o czterech różnych rozmiarach - około27, 28, 32i34 kD.

Interakcja MORT-1 zFas-IC in vitro obserwowana była przez przeprowadzenie immunoprecypitacji białek z ekstraktów komórekHeLatransfekowanychcDNAbiałkafuzyjnegoFLAG-MORT-1 albolucyferazyjakokontrolą,przyczymimmunoprecypitację przeprowadzano przy pomocy przeciwciała antyFLAG (aFLAG). Interakcję in vitro wykazanorównieżpomiędzyMORT-1aFAS-IC,przyczymMORT-1 35 jest w postaci wyznakowanych metabolicznie [³⁵S] metioniną białek fuzyjnych FLAG-MORT-1, uzyskanych z ekstraktów transfekowanych komórek HeLa, a FAS-IC jest w postaci ludzkich i mysich białek fuzyjnych GST-FAS-IC, wtym jednego mającego mutację zastąpienia wpołożeniu 225 FAS-IC, przy czym wszystka białka fuzyjne GST-FAS-IC wszystkie wytworzono w E. coli. Białka fuzyjne zGST były przymocowane do kulek glutationowych przed interakcją zekstraktami zawierającymi białko fuzyjne MORT-1-FLAG, a po tejinterakcjiprzeprowadzonoSDS-PAGE.Azatem,interakcję in vitro oceniano przez oszacowanie, przez autoradiografię po SDS-PAGE, wiązania metabolicznie wyznakowa35 nego [³⁵S] MORT-1, wytworzonego w transfekowanych komórkach HeLa jako fuzję zoktapeptydem

PL 193 394 B1

FLAG (FLAG-MORT-1), zGST, fuzją GST z ludzkim albomysim Fas-C (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) albo zfuzją GST zFas-IC, zawierającym mutację zastąpienia Ile na Ala a pozycji 225. Wykazano, że wszystkie cztery białka FLAG-MORT-1 wykazywały zdolności do wiązania się z Fas-IC po inkubacji z białkiem fuzyjnym GST-Fas-IC. Podobnie jak wteście podwójnej hybrydy drożdżowej, MORT-1 nie wiązałsięz białkiem GST-Fas-IC z zastąpieniem w miejscu mutacji 1pr^cg (I225A).

Białka kodowane przez cDNA FLAG-MORT-1 wykazywały również zdolność do wiązania się z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R, jak również z wewnątrzkomórkową domeną chimery FAS-R, której zewnątrzkomórkową domenę zastąpiono domeną z p55-R (p55-FAS), gdy ulegały one wspólnemu wytwarzaniu w wyniku ekspresji z tymi receptorami wkomórkach HeLa. W tym przypadku, interakcja MORT-1 z FAS-IC w transfekowanych komórkach HeLa, tj. invivo, obserwowana przy pomocy immunoprecypitatówróżnych transfekowanych komórek HeLa, wykazała interakcję invivo i swoistość interakcji pomiędzy MORT-1 aFAS-IC wkomórkach poddanych wspólnej transfekcji konstruktami kodującymi te białka. A zatem, białko fuzyjne FLAG-MORT-1 podlegało ekspresji i było metabolicznie

35 znakowane [³⁵S]cysteiną (20 mCi/ml) oraz [³⁵S]metioniną (40 mCi/ml) wkomórkach HeLa, samo, albo wraz z ludzkim FAS-R, chimerą FAS-R, wktórej zewnątrzkomórkową domenę FAS-R zastąpiono odpowiadającym rejonem wludzkim p55-R (p55-FAS), albo ludzkim p55-R jako kontrolą negatywną. Krzyżowa immunoprecypitacja MORT-1 z podlegającym wspólnej ekspresji receptorem została przeprowadzona przy użyciu różnych swoistych przeciwciał. Wyniki wykazały, iż FLAG-MORT-1 zdolne jest do wiązania się zwewnątrzkomórkową domeną FAS-R, jak również z wewnątrzkomórkową domeną chimery FAS-R-p55-R, mającej zewnątrzkomórkową domenę p55-R i wewnątrzkomórkową domenę FAS-R, gdy ulegało ono wspólnemu wytwarzaniu wwyniku ekspresji z tymi receptorami wkomórkach HeLa. Ponadto, immunoprecypitacja FLAG-MORT-1 z ekstraktów komórek transfekowanych dała również w rezultacie precypitację podlegającego wspólnemu wytwarzaniu wwyniku ekspresji FAS-R albo podlegającej wspólnemu wytwarzaniu wwyniku ekspresji chimery p55-FAS. Odwrotnie, immunoprecypitacjatych receptorów dała wrezultaciekoprecypitacjęFLAG-MORT-1.

Analiza Northern przy użyciu cDNA MORT-1 jako sondy ujawniła pojedynczy hybrydyzujący transkrypt wkomórkach HeLa. W Northern blocie, wktórym poli A⁺RNA (0,3 mg) z komórek transformowanych hybrydyzowano z cDNA MORT-1, rozmiar transkryptu RNA (około 1,8 kb) okazał się być bliski rozmiarowi cDNAMORT-1 (około 1702 nukleotydów).

W analizie sekwencyjnej, stwierdzono, iż cDNA zawiera otwartą ramkę odczytu dla około 250 aminokwasów. W wyżej wspomnianych wspólnych, równoległych zgłoszeniach patentowych, podano sekwencje DNA i aminokwasów MORT-1 (patrz WO96/18641). W tych sekwencjach podkreślono motyw „domeny śmierci”, jak również możliwą początkową resztę Met (pozycja 49; pogrubione, podkreślone M) oraz kodon stop translacji (gwiazdka pod kodonem wpołożeniu 769-771). Ten motyw „domeny śmierci” ma wspólną homologię ze znanymi motywami „domeny śmierci” z p55-R i FAS-R (p55DD i FFAS-DD). W celu określenia dokładnie C-końca MORT-1 oraz uzyskania dowodów dotyczących dokładnego końca N-końca (początkowej reszty Met) MORT-1, przeprowadzono dodatkowe doświadczeniawnastępującysposób:

Przy użyciu metod opisanych powyżej, skonstruowano kilka konstruktów kodujących cząsteczki MORT-1 sfuzowane przy ich N-końcu z oktapeptydem FLAG (FLAG-MORT-1), a następnie przeprowadzono ich ekspresję wkomórkach HeLa zmetabolicznym znakowaniem wytwarzanych białek przy

35 użyciu ³⁵S-cysteiny i ³⁵S-metioniny. Cząsteczki FLAG-MORT-1 były kodowane przez następujące cDNA, zawierające różne części sekwencji kodującej MORT-1 :

i) cDNA oktapeptydu FLAG, połączone z końcem 5' cDNA MORT-1, zktórego usunięto nukleotydy1-145;

ii) cDNA oktapeptydu FLAG, połączone z końcem5'pełnej długości cDNAMORT-1;

iii) cDNA oktapeptydu FLAG, połączone z końcem 5' cDNA MORT-1, zktórego usunięto nukleotydy 1-145, jak również 832-1701, a kodon GCC wpozycji 142-144 zmutowano do TCC wcelu zapobieżenia początkowi translacji wtymmiejscu.

Po ekspresji powyższych produktówfuzji FLAG-MORT-1, przeprowadzono immunoprecypitację jak wspomniano powyżej, przy użyciu albomonoklonalnych przeciwciał anty-FLAG albo, jako kontroli, przeciwciał anty-p75 TNF-R, po czym przeprowadzono SDS-PAGE (10% akrylamid) i autoradiografię. Wyniki analizy powyższych produktów fuzji FLAG-MORT-1 potwierdziły (uwiarygodniły) C-koniec MORT-1i dałydowód, iż N-koniecMORT-1 może byćw położeniu 49 sekwencji.

Rzeczywiście, wykazano przez dodatkowe doświadczenia z ekspresją MORT-1 bez oktapeptydu FLAGzfuzowanego z jegokońcem 5', żeMet⁴⁹ służyjakoefektywnemiejsceinicjacji translacji.

PL 193 394 B1

Wyszukiwanie przeprowadzone w bazach danych „Gene Bank” i„Protein Bank” ujawniło, iż wtym czasie nie było żadnej sekwencji, odpowiadającej wyżej wyizolowanej sekwencji MORT-1. A zatem, MORT-1 stanowiło nowe białko wiążące się swoiście z FAS-IC.

Wysoka ekspresja p55-IC powoduje wyzwolenie działania komórkobójczego (Boldin iwsp., 1995). Ekspresja Fas-IC w komórkach HeLa marównież takie działanie, choć wmniejszym stopniu, które można wykryć tylko przy użyciu czułego testu. Poddano zatem analizie niezależne od ligandu wyzwolenie działań komórkobójczych w komórkach transfekowanych MORT-1, jak również ludzkim p55-lC iFAS-IC. Wpływ przejściowego wytwarzania wwyniku ekspresji MORT-1, ludzkiego Fas-IC, ludzkiegop55-IC,albolucyferazy,którasłużyłajako kontrola,nażywotnośćkomórekHeLaoceniano przy użyciu kontrolowanego tetracykliną wektora ekspresyjnego. Żywotność komórek oceniano 40minutpoichtransfekcji cDNA albo w obecności albownieobecności tetracykliny (1 mg/ml, wcelu zablokowania ekspresji), wraz z cDNA kodującym wydzielaną łożyskową fosfatazę zasadową. Żywotność komórek oceniano albo przez test wychwytu czerwieni obojętnej, albo, dla określenia swoiście żywotności tych komórek, które wykazywały ekspresję transfekowanegoDNA,przezzmierzenieilości łożyskowej fosfatazy zasadowej wydzielanej do podłoża hodowlanego.

Powyższa analiza ujawniła, iż wytwarzanie MORT-1 w komórkach HeLa spowodowało znaczną śmierć komórek, większą niż spowodowana przez wytwarzanie FAS-IC. Te działania cytotoksyczne wszystkich z p55-lC, FAS-IC iMORT-1 wydająsię być związanezrejonami „domenyśmierci”, obecnymi we wszystkich tych białkach, które mają tendencję do samowiązania, atym samym być może przyspieszaniadziałań cytotoksycznych.

Mającnawzględziewyżejwspomnianącharakterystykę MORT-1, a mianowicie, swoiste wiązanie się MORT-1 ztym szczególnymrejonemFAS-R, który zaangażowany jest windukcję śmierci komórkowej,orazfakt,żenawetniewielkazmianawstrukturzetegorejonu,którazapobiegasygnalizacji (mutacja lpr^cg) znosi również wiązanie MORT-1, wskazuje, iż białko to odgrywa rolę wsygnalizacji albowyzwalaniu śmierci komórkowej. Poglądtenjestponadtowspartyprzezobserwowaną zdolność MORT-1 do wyzwalania samemu działania komórkobójczego. A zatem, MORT-1 może działać jako (i) modulator samo-łączenia się FAS-R poprzez jego własną zdolność do wiązania się zFAS-R, jak również ze sobą, albo (ii) służy jako miejsce zakotwiczenia dla dodatkowych białek, które są zaangażowane w sygnalizację FAS-R, tj. MORT-1 może być białkiem „kotwiczącym” imoże zatem wiązać innereceptorypoza FAS-R,albo(iii)stanowiczęśćoddzielnegoukładusygnalizacyjnego,któryulega interakcji z sygnalizacją FAS-R.

WceludalszejanalizyrejonówMORT-1zaangażowanychwwiązaniezFAS-ICorazmodulację związanych zFAS-R działań komórkowych (cytotoksyczności), przeprowadzono wyżej wspomniane doświadczenia, przy użyciu wektorów kodujących części MORT-1 („głowę MORT-1”, aminokwasy 1-117oraz„MORT-1 dd”,aminokwasy130-245)(oddzielnie),zwektoremkodującym ludzki FAS-R dla kotransfekcji komórek HeLa. W tych doświadczeniach, różne białka i kombinacje białek ulegały przejściowej ekspresji w komórkach HeLa, które zawierają kontrolowanytetracyklinątransaktywator(HtTA-1) przez wstawieniesekwencjikodującychbiałkadokontrolowanego tetracyklinąwektoraekspresyjnego pUHD10-3. W kontrolnych transfekcjach wykorzystywano wektory kodujące tylko FAS-R albowektory kodujące białko fuzyjne FLAG-55.11 (białko 55.11 jest białkiem wiążącym swoiście p55-IC, którego część, zawierającąaminokwasy309-900poddanofuzji(przyjegoN-końcu)zoktapeptydemFLAG).

Po okresach transfekcji i inkubacji, transfekowane komórki poddano obróbce różnymi stężeniami przeciwciała monoklonalnego anty-FAS-R (CH-11), które wiąże się swoiście zzewnątrzkomórkową domeną FAS-R wyrażanego przez komórki. To wiązanie się przeciwciała anty-FAS-R wywołuje agregację FAS-R napowierzchnikomórki (podobnie jak ligand FAS-R) i wzbudza wewnątrzkomórkowy szlak sygnalizacyjny, działający za pośrednictwem FAS-IC, powodujący, w ostateczności, śmierć komórkową (cytotoksyczność komórkowa za pośrednictwem FAS-R). Stosowane stężenia przeciwciałamonoklonalnegoanty-FAS-R (CH-11)byływzakresie0,01-10mg/ml,azwyklebyłyto stężenia takie jak0,005;0,05;0,5i5 mg/ml. Komórki poddano działaniu przeciwciała anty-FAS w obecności 10 mg/ml cykloheksimidu.

Wyniki powyższej analizy wykazują, iż wyrażanie FAS-R wtransfekowanych komórkach doprowadza do zwiększonej wrażliwości na komórkobójcze działanie przeciwciał anty-FAS-R. Ponadto, wspólna ekspresja rejonu wMORT-1, który zawiera rejon homologii z„domeną śmierci” orazFAS-R silniezakłócawywoływanąprzezFAS-R (tj. zachodzącą za pośrednictwem FAS-R) śmierć komórkową, jak należałoby spodziewać się po zdolności rejonu „domenyśmierci”(DD) MORT-1 do wiązania się z„domeną śmierci” FAS-R (FAS-DD). Ponadto, wspólna ekspresja N-końcowej części MORT-1

PL 193 394 B1 i FAS-R nie zakłóca zachodzącej za pośrednictwem FAS-R śmierci komórkowej i, o ile w ogóle, nieco wzmaga cytotoksyczność (tj. nieco zwiększyła śmierć komórek).

A zatem, powyższe wyniki jasno wskazały, iż białko MORT-1 ma dwa oddzielne rejony jeśli chodzi o wiązanie się z FAS-IC i pośredniczenie w cytotoksycznej komórkowo aktywności FAS-IC.

Wyniki te stwarzają zatem podstawę do wykorzystania różnych części (tj. aktywnych fragmentów albo analogów) białka MORT-1 do różnych zastosowań farmaceutycznych. Na przykład, analogi albo fragmenty białka MORT-1 albo ich pochodne, które zawierają zasadniczo tylko część C-końcową MORT-1, włącznie zjego rejonem „domeny śmierci”, można zastosować do hamowania zachodzących za pośrednictwem FAS-R działań cytotoksycznych w komórkach albo tkankach zawierających FAS-R i wten sposób chronić te komórki lub tkanki przed szkodliwym działaniem ligandu FAS-R w przypadkach takich, jak na przykład ostre zapalenie wątroby. Alternatywnie, analogi albo fragmenty białka MORT-1 albo ich pochodne, które zawierają zasadniczo tylko część N-końcową MORT-1 można zastosować do wzmocnienia zachodzących za pośrednictwem FAS-R działań cytotoksycznych w komórkach albo tkankach zawierających FAS-R, tym samym prowadząc do wzmożenia niszczenia tych komórek albo tkanek, gdy jest to pożądane w przypadkach takich jak, na przykład, komórki nowotworowe albo autoreaktywne limfocyty T iB. Jak to szczegółowo przedstawiono powyżej, powyższe zastosowania różnych rejonów MORT-1 można zrealizować przy użyciu różnych wirusów rekombinantowych (np. krowianki) wcelu wstawienia sekwencji kodującej rejon MORT-1 do swoistych komórek albo tkanek, których leczenie jest pożądane.

Ponadto, możliwe jest również przygotowanie i zastosowanie różnych innych cząsteczek, takich jak przeciwciała, peptydy i cząsteczki organiczne, które mają sekwencje albo struktury molekularne odpowiadające wyżej wymienionym rejonom MORT-1 wcelu uzyskania tych samych pożądanych działań zachodzących za pośrednictwem tych rejonów MORT-1.

Ponadto, MORT-1 można zastosować do swoistej identyfikacji, izolacji i charakteryzacji innych białek, które zdolne są do wiązania się z MORT-1 (tj. białek wiążących MORT-1); patrz Przykłady Odniesienia 2 i 3.

PRZYKŁAD ODNIESIENIA 2: Izolacja białka wiążącego MORT-1 (i) Test przesiewowy podwójnej hybrydy i test ekspresji b-galaktozydazy z podwójnej hybrydy

W sposób analogiczny do procedury opisanej w Przykładzie Odniesienia 1, przy zastosowaniu wewnątrzkomórkowej domeny p55 TNF-R (p55-IC) oraz MORT-1 jako przynęt, i przesiewowego badania biblioteki ludzkich limfocytów B, otrzymano dwa klony cDNA, które kodują produkt białkowy zdolny do wiązania się zarówno zMORT-1 jaki p55-IC. Obydwa klony, jakwykazano, mają identyczne sekwencje nukleotydów przy końcu 5' (patrz wspólne, równoległe zgłoszenia WO96/18641 i PCT/US96/10521).

(ii) Właściwości wiązania nowo sklonowanych cDNA, w testach podwójnej hybrydy

Przy zastosowaniu wyżej wspomnianej procedury podwójnej hybrydy drożdżowej, zastosowano konstrukt, zawierający nowe cDNA białek wiążących MORT-1 jako „ofiarę”, do której dodawano konstrukty wielu „przynęt” w oddzielnych reakcjach, wcelu określenia swoistości wiązania białka wiążącego MORT-1 kodowanego przez to cDNA. Te „przynęty” obejmowały konstrukty kodujące MORT-1, częściMORT-1(„głowę” MORT-1,aa 1-117, „ogon” MORT-1, aa 130-245), p55-IC (206-426 p55) albo jego części („domenę śmierci”, 326-426 p55; iinne, wgórę od „domeny śmierci”, tj. 206-326). Wyniki przedstawionoponiżejwTabeli2.

PL 193 394 B1

Tab e l a 2

Przynęta	Dane o ekspresji b-galaktozy
MORT-1	++ +
130-245 MORT-1	+
1-117 MORT-1	-
206-426 p55	+++
326-426 p55	+++
206-326 p55	-
206-308 p55	-
206-345 p55	-
p55 L35INI	-
Fas IC	-
233-319 Fas	-
p75 IC	-
CD40 IC	-
PGBT10	-
SNF1	-
Cyklina D	-
Lamina	-

Powyższe wyniki dwuhybrydowego testu ekspresji b-galaktozydazy wiązania się klonu z dużym panelem przynęt potwierdziły, iż białko kodowane przez ten klon swoiście wiąże się z domenami śmierci zarówno p55 TNF-R jak i MORT-1.

Ogólnie, białko wiążące MORT-1 można wykorzystać bezpośrednio do modulacji albo pośredniczenia w związanych z MORT-1 działaniach na komórkę, albo pośrednio do modulowania albo pośredniczenia w działaniu ligandu FAS-R na komórki, gdy efekt ten jest modulowany albo zachodzi za pośrednictwem MORT-1. Jest to również prawdziwe w odniesieniu do innych białek wewnątrzkomórkowych albo wewnątrzkomórkowych domen białek śródbłonowych, jak to swoiście wykazano dla p55 TNF-R w niniejszym.

Do białek wiążących MORT-1 należą te, które wiążą się swoiście z całym białkiem MORT-1 albo te, które wiążą się z różnymi rejonami białka MORT-1, np. wyżej wspomnianymi rejonami Ni C-końcowym MORT-1. Białka wiążące MORT-1, które wiążą się swoiście z takimi rejonami można zastosować do modulowania aktywności tych rejonów, a stąd swoistej aktywności MORT-1, jaka określona jest przez te rejony.

PRZYKŁAD ODNIESIENIA 3: Izolacja i Charakteryzacja białka MACH, innego białka wiążącegoMORT-1 (i) Test przesiewowy podwójnej hybrydy, test dwuhybrydowy D-galaktozydazy, sekwencjonowanie i analiza sekwencji

Przy użyciu procedury przedstawionej w powyższych Przykładach Odniesienia 1 i 2, zastosowano pełnej długości konstrukt, kodujący ludzkie białko MORT-1 jako „przynętę”w układzie podwójnej hybrydydrożdżowej wceluizolacjiklonu cDNA kodującego dodatkowe nowe białko wiążące MORT-1. To nowe białko oznaczono początkowo MORT-2, aobecnie oznacza się je i określa jako MACH (w skrócie od „MORT-1 associated CED3 Homolog”, związany z MORT-1 homolog CED3), z uwagi na jego cechy charakterystyczne omówione szczegółowo poniżej.

PL 193 394 B1

Ten klon cDNA poddano sekwencjonowaniu przy użyciu standardowych procedur, jak podano w Przykładach Odniesienia 1 i 2 powyżej. Analiza sekwencji metodą standardowych procedur i programów komputerowych (patrz Przykłady Odniesienia 1 i 2) ujawniła, iż to cDNA ma nową sekwencję i koduje nowe białko (ani sekwencji DNA ani aminokwasowej nie znaleziono w bazach danych sekwencji GENBANK ani PROTEIN BANK). Ponadto, cDNA kodujące MACH ujawniło otwartą ramkę odczytu ORF-B, która ma silną homologię z rejonem poprzedzającym (5' w górę) motyw „domeny śmierci” białka MORT-1 (patrz Przykład Odniesienia 1). We wspólnych, równoległych izraelskich zgłoszeniach nr 114615, 114986, 115319, 116588 i 117932, jak również w odpowiadającym im zgłoszeniu patentowym PCT nr PCT/US96/10521 przedstawiono strukturę tej części klonu cDNA MACH, która zawiera ORF-B (235 reszty aa); wywnioskowaną sekwencję aminokwasów MACH ORF-B; oraz sekwencję nukleotydów cząsteczki cDNA MACH. Rejon ORF-B wykazuje wysoką homologię z rejonem MORT-1 w górę od motywu „domeny śmierci” MORT-1.

Następnie zastosowano test podwójnej hybrydy drożdżowej w celu oceny swoistości wiązania się MACH z MORT-1, w szczególności w celu określenia rejonu w MORT-1, z którym wiąże się MACH, jak również określenia, które z ORF MACH ulegają interakcji z MORT-1, przy czym procedury były takie, jak przedstawiono tu powyżej w Przykładach Odniesienia 1 i 2. W skrócie, wytworzono różne konstrukty MORT-1 i MACH w celu testowania interakcji białek, kodowanych przez konstrukty domeny wiążącej DNA i domeny aktywacyjnej Gal4 wewnątrz transfekowanych komórek drożdży SFY526, co oceniano przez test filtracyjny ekspresji b-galaktozydazy. Konstrukty domeny wiążącej DNA wytworzono w wektorach pGBT9, a konstrukty domeny aktywacyjnej wytworzono w wektorach pGAD-GM. Dla konstruktów domeny aktywacyjnej, zastosowano pełnej długości cDNA MACH (MACH), jak również konstrukt kodujący tylko rejon ORF-B (MACH B). Kontrolne konstrukty domeny aktywacyjnej obejmowały konstrukty zawierające pełnej długości sekwencję kodującą MORT-1 (MORT-1, kontrola pozytywna) oraz konstrukty, które nie miały żadnych wstawek, tj. wektory „puste” (pGAD-GM). Dla konstruktów domeny wiążącej DNA, zastosowano pełnej długości cDNA MORT-1 (MORT-1), jak również konstrukty, kodujące tylko rejon górny MORT-1 (MORT-1 DD aa 130-245). Konstrukty kontrolne domeny wiążącej DNA, które były skonstruowane tak, by określały również swoistość wiązania MACH, obejmowały konstrukty kodujące laminę (Lamin), reszty 287-461 wewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego p75 TNF-R (ludzkie p75 IC), cyklinę D (cycD), SNF1, reszty 206-426 wewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego p55 TNF-R (ludzkie p55-IC), rejon „domeny śmierci” wewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego Fas-R (ludzkie Fas DD), reszty 216-277 wewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego CD40 (ludzkie CD40 IC), wektory bez wstawki albo „puste” wektory pGBT9 (pGBT9, negatywna kontrola), oraz konstrukt kodujący rejon ORF-B MACH (MACH B). W teście, określano pojawienie się koloru, przy czym im silniejsze pojawienie się koloru, tym większa interakcja pomiędzy konstruktami kodowanymi przez domenę wiążącą DNA i domenę aktywacyjną. Pojawienie się koloru zobrazowano symbolami, gdzie „+++” i „+” oznaczają pojawienie się silnego koloru w ciągu 30 i 90 min. testu, odpowiednio, a „- - -” oznacza brak koloru w ciągu 24 godzin testu. W przypadkach, w których nie testowano interakcji, nie pokazano żadnego symbolu. Wyniki różnych interakcji dla powyższego przypadku przedstawiono w Tabeli 3 poniżej, a wyniki różnych interakcji izoform MACH przedstawiono w wyżej wspomnianym wspólnym, równoległym zgłoszeniu PCT/US96/10521 i jego odpowiednikach IL.

Tab e la 3 HYBRYDA DOMENY

Hybryda domeny wiążącej DNA	MACH	MACH B	MORT1	PGAD-GH
1	2	3	4	5
MORT-1	+ + +	+++	+++	---
Rejon wiążący MORT-1
MORT-1 (-117)
MORT1DD (130-245)	---	---

PL 193 394 B1 cd. tabeli

Testy swoistości
1	2	3	4	5
Lamina	...	...
Ludzkie p75 IC	...
Cyc D
SNF1
Ludzkie p55 IC
Ludzkie FAS DD	---
Ludzkie CD40 IC	...
PGBT9	...
MACH B		+	+	...

A zatem, jak wynika z rezultatów przedstawionych w powyższej Tabeli 3, jasne jest, iż:

(a) MACHwiążesięzMORT-1wbardzosilnyiswoistysposób;

(b) Miejsce wiążące MACH na MORT-1 występuje przed (w górę od) motywu „domeny śmierci” wMORT-1,tj.znajdujesięonowrejonieMORT-1wyznaczonymprzezaa1-117MORT-1;

(c) RejonORF-BMACHjestrejonembiałkaMACHwchodzącymwinterakcjęzMORT-1;i (d) RejonMACHORF-Bjestzdolnydowiązaniasięzesobą samym.

(ii) Efekty cytotoksyczności komórkowej zachodzące za pośrednictwem zdolności do samowiązania się białka MACH

Obserwacja, iż MACH może samo siebie wiązać, w szczególności, iż rejon ORF-B MACH wiąże samsiebieoraz uprzedniakorelacjapomiędzysamowiązaniemsięacytotoksycznościąkomórkową, co obserwowano dla wewnątrzkomórkowych domen p55 TNF-R iFAS-R, ico obserwowano dla MORT-1 (patrz Przykład Odniesienia 1), zasugerowały, iż samowiązaniesięMACHmożerównieżbyć zaangażowane w cytotoksyczność komórkową.

W celu sprawdzenia tej możliwości, wytworzono konstrukty, kodujące MACH z kontrolowanym tetracykliną wektoremekspresyjnym(szczegółypatrzPrzykładOdniesienia 1).TekonstruktyzastosowanodotransfekcjikomórekHeLa,wktórychwektoryulegająprzejściowejekspresji.Poza konstruktamiMACH,zastosowanoinnekonstruktykontrolnewceluocenywpływuprzejściowejekspresji nażywotnośćkomórek HeLa,zktórymmożnabyporównaćwpływkonstruktówMACH.Te innekonstrukty obejmowały MORT-1, ludzkie FAS-IC oraz lucyferazę (Luc). Dodatkowo, przetestowano też kotransfekcję komórekHeLaprzyużyciukonstruktówMORT-1iMACHwcelu określenia, jakie efekty spowodowałaby interakcja pomiędzy tymi białkami. Po transfekcji, komórki HeLa inkubowano, ażywotnośćkomórekoceniano48godzinpotransfekcjialbowobecnościalbownieobecnościtetracykliny(1 mg/ml)wcelu zablokowaniaekspresji.Żywotnośćkomórekokreślonoprzez test wychwytu czerwieniobojętnej.

Z wynikówpowyższej analizyjest oczywiste, iżMACH wywołuje dramatyczny efekt cytotoksyczny wkomórkach HeLa, tj.wywołananadekspresjacDNAMACHwkomórkachHeLapowoduje dramatyczny efekt cytotoksyczny. Ten efekt cytotoksyczny jest prawdopodobniezwiązanyzezdolnościąMACHdosamozwiązania się.

(iii) Analiza Northern

Przy zastosowaniu dobrze znanych procedur (patrz Przykład Odniesienia 1), przeprowadzono analizęNorthern kilkuliniikomórkowychprzyużyciucDNAMACHjakosondy. Wynikitejanalizyukazują,iżwwieluliniachkomórkowych,wszczególnościwliniachkomórkowychCEM,Raji,Daudi,HeLa, Alexander,JukatiA673,istniejądwahybrydyzujące transkryptyorozmiarzeokoło3,2kb.

Mając na względzie powyższe, białko MACH, szczególnie białko MACHb1 (ORF-B MACH) można wykorzystać bezpośrednio do modulacji albo pośredniczenia w efektach związanych z działaniemMORT-1nakomórkę,albopośrednio,domodulowania albo pośredniczenia w efekcie działania liganduFAS-Rna komórki, gdy efekt ten jest modulowany albo zachodzi za pośrednictwem MORT-1.

PL 193 394 B1

Fakt, iż MACH wiąże się swoiście zrejonem górnym MORT-1 iwykazuje homologię zMORT-1 dostarcza swoistego sposobu, w którym można wykorzystać MACH albo MACH ORF-B do modulowania tego swoistego rejonu MORT-1 astąd modulowania swoistej aktywności MORT-1 determinowanej przez ten rejon górny. Ponadto, MACH albo MACH ORF-B można zastosować jako modulator albo pośrednik w działaniach wewnątrzkomórkowychwanalogicznysposób,jaksamMORT-1 (patrz powyżej) dzięki zdolności MACH do samowiązania się i wywoływania cytotoksyczności komórkowej samodzielnie.

DalszeanalizybiałkaMACHikodującychjesekwencjiDNA przeprowadzanojakprzedstawiono tu poniżej. Ponadto, ujawniono, iż ORF-B MACH stanowi tylko jedną zwielu izoform MACH. Stąd, białkoMACHikodującejesekwencjeDNA przemianowanoobecnie,jaktostaniesięjasneznastępującego tekstu.

(a) Test przesiewowy podwójnej hybrydy na białka, które wiążą się z MORT-1 ujawnia nowe białko, które ma wspólny motyw sekwencyjny z MORT-1;

Jak wspomniano powyżej, w celu zidentyfikowania białek, które uczestniczą w indukcji śmierci komórkowej przez MORT-1, zastosowano technikę podwójnej hybrydy w celu przesiewowego badania bibliotek cDNA na białka, które wiążą się zMORT-1. Test przesiewowy podwójnej hybrydy biblioteki ludzkich limfocytów B (Dufeeiwsp., 1993) przy zastosowaniu cDNA MORT-1 jako przynęty wykazał klony cDNA samego MORT-1, co odzwierciedla zdolność tego białka do samowiązania, jak również klonyTRADD,zktórymwydajniewiążesięMORT-1(patrzPrzykładOdniesienia2). Badanie przesiewowe wykazało również obecność klonów cDNA nowej sekwencji, których produkt swoiściewiązałsię zMORT-1. Białko to, które początkowo nazwano MACH, anastępnie, po stwierdzeniu, iż występuje wwielu izoformach (patrz poniżej) przemianowano na MACHb1, wykazywało również zdolność do wiązania się ze sobą samym wteście podwójnej hybrydy, jednak było niezdolne do wiązania się zFAS-R (patrz wyżej wspomniane wspólne, równoległe zgłoszenie PCT/US96/10521, który zawiera również wszystkie z poniższych analiz i uzyskane z nich wyniki).

MORT-1 iMACHb1 oraz ich konstrukty delecyjne, jak również MACHa1, mutant MACHa1, wktórym katalityczna cysteina Cys360 została zastąpiona przez Ser (MACHa1 (C360S)) oraz wewnątrzkomórkowa domena ludzkiego FAS-R (Fas-IC), podlegały wytwarzaniu wwyniku ekspresji wtransfekowanych drożdżachSFY526wkonstruktachdomenywiążącejDNAidomeny aktywacyjnej Gal4 (pGBT9 i pGAD-GH). Ich interakcję oceniano przeztestfiltracyjnyekspresji b-galaktozydazy,jak opisano w Boldin i wsp., (1995b). Wyniki zaprezentowano jako czas wymaganydoosiągnięciasilnego zabarwienia. Żadna z badanych wstawek nie ulegała interakcji zwieloma badanymi kontrolami negatywnymi, do których należały wewnątrzkomórkowe domeny ludzkiego receptora p55 TNF, receptor p75TNFiCD40,oraz lamina,cyklinaDi„puste”wektoryGal4.MACHb1sklonowano przez test przesiewowy podwójnej hybrydy biblioteki ludzkich limfocytów B wyznakowanej Gal4 AD (Durfee iwsp., 1993) na białka, które wiążą się z MORT-1, przy użyciu szczepu reporterowego drożdży HF7c. Z wyjątkiemmiejsc,wktórych zaznaczonoinaczej,wszystkieproceduryeksperymentalnedla odkryćsąjak opisano powyżej (patrz także Boldin iwsp., 1995). Analiza delecji wykazała, iż MACHb1 wiąże się z N-końcową częścią MORT-1 , która jest zaangażowana w indukcję śmiercikomórkowej (Chinnaiyan iwsp.,1995).MACHb1wiązał się również sam ze sobą w transfekowanych drożdżach. Jednakże nie wiązałsięonzkilkomainnymibiałkamikontrolnymii wodróżnieniuodMORT-1byłniezdolnydowiązaniasięzFAS-R. Produkcja cząsteczek MACHb1 przez ekspresją w komórkach ssaków dostarczyła białka 34 kDa, które wiązało się z cząsteczkami MORT-1 ulegającymirównoczesnemuznimi wytwarzaniu. Było ono również zdolne do wiązania się z białkiem fuzyjnym GST-MORT-1 in vitro.

Porównanie sekwencji aminokwasowych wMACHb1 iMORT-1 ujawniło wspólny motyw sekwencji (oznaczony jako „moduł MORT”) wtych dwóch białkach, różny od motywu zabójczego, przez który MORT-1 wiąże się zFAS-R. Motyw ten występuje raz wMORT-1 idwa razy wMACHb1. Ten sam motywznaleziono równieżwPEA-15,fosforoproteinieastrocytarnejonieznanej funkcji. Wstępne danesugerują,iżmotywMORTjest zaangażowany w wiązanie MACHb1 (albo innych izoform MACH) zMORT-1.

Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa MACHb1 jest przedstawiona wwyżej wspomnianym zgłoszeniu patentowym PCT/US96/10521 i odpowiadających mu odpowiednikach izraelskich, w szczególności IL 1 17932. Przedstawiono dwa moduły MORT i C-końce dwóch zastosowanych mutantów delecyjnych MACHb1. Homologia sekwencji modułów wMACHb1, MORT-1 igenie PEA-15 (numer dostępu X86809) została również przedstawiona w powyższych wspólnych, równoległych

PL 193 394 B1 zgłoszeniach, w których identyczne i podobne reszty oznaczono odpowiednio obramowanymi i zacienionym obszarami.

Schematyczne przedstawienie domeny śmierci imodułów MORT oraz rejonu homologii CED3/ICE wFas/APO1, MACHb1 i ] MACHa1 zostało również przedstawione w powyższych wspólnych zgłoszeniach.

Rejon wMORT-1, który zawiera ten „moduł MORT”, jak wykazano, bierze udział windukcji śmierci komórkowej przez to białko (patrz Przykład Odniesienia 1 powyżej). Wykazano również, iż przyczynia się on, choć nie wystarcza do, samowiązania się MORT-1 (patrz Przykład Odniesienia 1). Analiza właściwości wiązania konstruktów delecyjnych MACHb1 w transfekowanych drożdżach ujawniła podobne zaangażowanie modułów MORT wsamowiązaniu się MACHb1, jak również wjego wiązaniu się z MORT-1: konstrukty delecyjne, wktórych brakowało rejonu poniżej (w dół od) modułu MORT, były niezdolnedo wiązaniasięze sobą, jednak utrzymywały zdolnośćdo wiązaniasięz pełnej długości MORT-1 oraz z pełnej długości MACHb1. Dalsze pofragmentowanie, wktórym usunięto również część sekwencji modułu MORT, spowodowało utratę zdolności wiązania się tych białek. W celu dalszej oceny zaangażowania modułów MORT wte interakcje, mutanty delecyjne MACHb1, poddane fuzji zoktapeptydem FLAG (FLAG-MACHb1), wytwarzano przez ekspresję wkomórkach HeLa i oceniano pod kątem ich wiązania się in vitro z wytwarzanym przez bakterie białkiem fuzyjnym glutationoS-transferaza-MORT-1 (GST-MORT-1). Podobnie do wiązania obserwowanego wteście podwójnej hybrydy drożdżowej, to wiązanie in vitro, jak stwierdzono, zależało od interakcji rejonu w obrębie modułów MACHb1 . Wyznakowane metabolicznie ³⁵[S] MACHb1, MACHb1 sfuzowane przy jego końcu N z oktapeptydem FLAG (FLAG- MACHb1), mutanty z odciętym C-końcem FLAG-MACHb1 oraz, jako kontrola, lucyferaza, zostały wytworzone w transfekowanych komórkach HeLa. Ekspresję przeprowadzono przy użyciu kontrolowanego tetracykliną wektora ekspresyjnego, wklonie komórek HeLa (HtTA-1), który wykazujeekspresję transaktywatora kontrolowanego tetracykliną.

Ocenę wytwarzania białek przez ekspresję oraz ich rozmiarów cząsteczkowych przeprowadzono przez immunoprecypitację zlizatów komórkowych, przy użyciu przeciwciała anty-FLAG. Stosowano następujące przeciwciała: wytworzono królicze surowice anty-MACHb1 i anty-MORT-1 przeciwko białkom fuzyjnym GST-MACHb1 i GST-MORT-1. Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko oktapeptydowi FLAG (M2) i przeciwko FAS/APO1 (CH11, Yonehara i wsp., 1989) zakupiono od Eastman Kodak i Oncor (Gaithesburg, MD), odpowiednio. Mysie monoklonalne przeciwciało na epitop anty-HA (12CA5, Field i wsp., 1988) oraz przeciwciało anty-TNF wytworzono wnaszym laboratorium zwykłymi metodami znanymi wstanie techniki. Wyniki, przedstawiające powinowactwo wiązania białek doGST-MORT-1, zaadsorbowanego na perełkach glutationowo-agarozowych (albo, jako kontrola, do GST albo GST zfuzowanego z wewnątrzkomórkowądomenąFas-APO1)l orazimmunoprecypitację różnych kontruktów fuzyjnych MORT-1 i MACH przy użyciu różnych swoistych przeciwciał, przedstawiono w wyżej wspomnianych wspólnych równoległych zgłoszeniach, w szczególności wPCT/US96/10521 i IL 117932.

(b) MACH występuje w wielu izoformach;

Analiza Northern przy użyciu cDNA MACHb1 jako sondy ujawniła występujące w niewielkiej ilości transkrypty o rozmiarze około 3 kb wkilku różnych liniach komórkowych. W skrócie, przeprowadzona została analiza Northern blot całkowitego RNA (14 mg/ścieżkę) albo poliA⁺RNA (2 mg) z kilku linii komórkowych, przy użyciu cDNA MACHb1 jako sondy. Wszystkie badane linie komórkowe, T47D, CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat i A673 są ludzkiego pochodzenia i pochodzą odpowiednio z raka przewodowego sutka, ostrej białaczki limfoblastycznej zlimfocytów T, chłoniaka Burkitta, raka nabłokowatego, ludzkiego wątrobiaka, ostrej białaczki T-limfocytarnej i mięsaka prążkowanego. Raczej rozmyty kształt pasma hybrydyzacyjnego na Northern blotach sugerował, że te transkrypty mają heterogenne rozmiary pomiędzy 2,85 a 3,5 kb. Zarówno ilości jak i rozmiary transkryptów zmieniały się wśród tkanek ludzkich i nie były skorelowane z ekspresją MORT-1 albo FAS/APO1 (Watanabe i wsp., 1992). W jądrze i mięśniu szkieletowym, na przykład, transkrypty MACH były ledwo wykrywalne, pomimo tego, że tkanki te produkują znaczne ilości MORT-1. Przeciwnie, stwierdzono, że spoczynkowe leukocyty jednojądrzaste krwi obwodowej, w których ekspresja MORT-1 jest bardzo niska, produkują MACH na wysokich poziomach. Aktywacja lektyną leukocytów powoduje znaczną zmianę we wzorcu rozmiarów transkryptów MACH, wraz z indukcjąMORT-1.

Badając naturę tej heterogenności rozmiarów, poddano badaniu przesiewowemu biblioteki cDNA w poszukiwaniu transkryptów, które hybrydyzują z sondą cDNA MACHb1. MACHa1 i MACHa2 sklonowano z biblioteki cDNA Charon BS, pochodzącej zmRNA zludzkiej grasicy. Bibliotekę podda42

PL 193 394 B1 no przesiewowi w ostrych warunkach zsondą cDNA MACHb1, wyznakowaną przy użyciu zestawu zlosowymistarterami(BoehringerMannheim). InneizoformyMACHsklonowanoprzezRT-PCR, przeprowadzone na całkowitym RNA zludzkich komórek limfoblastoidalnych Raji (MACHa1, a2, a3, b3 i b4) orazDaudi (MAXHa2, b2, b3, b4 i b5). Przeprowadzono reakcję odwrotnej transkryptazy ze starterem adapterowym oligo-dT (5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC (T)17-3') oraz odwrotną transkryptazą SuperScript II (GIBCO-BRL), stosowaną według instrukcji producenta. Pierwszą rundę PCR przeprowadzono przy użyciu układu Expand Long Template PCR (Boehringer Mannheim) przy użyciu następującychsensownychi antysensownych starterów:

5'-AAGTGAGCAGATCAGAATTGAG-3', odpowiadających nukleotydom 530-551 cDNA MACHb1,oraz, odpowiednio,

5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'. Drugą rundę przeprowadzono przy użyciu polimerazy Vent (NEB), przy użyciu następujących sensownych, i odpowiednio, antysensownych, starterów zagnieżdżonych:

5'GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC-3' i

5'-GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3', pochodzących zsekwencji DNA MACHb1. W celu potwierdzenia, iż MACHb3 iMACHb4 mają kodony inicjacyjne, sklonowano więcej sekwencji 5' tych izoformzRNAkomórekRaji.PoreakcjiRT-PCR,przeprowadzonejprzy użyciu startera adapterowego oligo-dT jak opisano powyżej, nastąpiły dwie rundy PCR (z polimerazą Vent (NEB)) przy użyciu następujących oligonukleotydów sensownych i antysensownych:

5'-TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3' i 5'-ATTCTCAAACCCTGCATCC AAGTG-3', pochodzących do sekwencji MACHb1. Ostatni oligonukleotyd jest swoisty względem izoform .b. Wśród klonów uzyskanych wten sposób, te, wktórych stwierdzono obecność nukleotydów kodujących aminokwasy „bloku 2” (których obecność odróżnia MACHb3 i MACHb4 od MACHb1 iMACHb2) poddano pełnemu sekwencjonowaniu. Sekwencje nukleotydowe we wszystkich sklonowanych izoformach określono wobydwu kierunkach metodą terminacji łańcucha dideoksy. Uzyskano jedynie częściowe klony cDNA MACHa3 i MACHb2. To badanie przesiewowe ujawniło istnienie licznych izoform MACH. Sekwencje aminokwasowe siedmiu ztych izoform przebadano szczegółowo. Wyniki przedstawiono schematycznie i przykładowo podano w powyższych wspólnych, równoległych zgłoszeniach, szczególnie w PCT/US96/10521 i IL 1 17932, gdziesekwencje aminokwasów trzech izoform porównanozeznanymihomologami.

Brak 65 nukleotydów, które wMACHa1 kodują „blok 2” powoduje wMACHb1 i MACHb2 zmianę w ramce odczytu nukleotydów, które kodują„blok3”. Dlatego też, w tych izoformach, nukleotydyte kodują inne aminokwasy, które razem tworzą ich unikalny rejon C-końcowy. Z drugiej strony, ramka odczytu bloku 3 w MACHb3 iMACHb4 jest zachowana, ale brak nukleotydów, które kodują rejon CED3/ICE iczęść niekodującego rejonu 3' powoduje zmianę ramki odczytu nukleotydów leżących wdół. Z powodu tej zmiany, większość części 5' tego niekodującego rejonu dalszego koduje 10 aminokwasów, które stanowią rejon C-końcowy unikalny dla tych dwóch izoform.

Sklonowano izoformy zbiblioteki cDNA ludzkich limfocytów B (MACHb1), zbiblioteki cDNA ludzkiej grasicy (MACHa1 i MACHa2) i zmRNA ludzkich limfoblastoidalnych komórek Raji (MACH2a1, a2, a3, b3, b4 i b5) oraz Daudi (MACH2a2, b2, b3, b4 i b5). Klonowanie zmRNA komórek Raji i Daudi przeprowadzono przez RT-PCR, przy użyciu oligonukleotydów odpowiadających niekodującemu rejonowi 3' i sekwencji wobrębie drugiego modułu MORT wMACHb1. Kodon startowy wyizolowanych w ten sposób klonów jest zatem umieszczony w obrębie drugiego modułu MORT.

Sekwencjeinnychizoformmająnastępującecechy:

(a) WszystkieizoformyMACHmająwspólnyrejonN-końcowy182aminokwasów,któryobejmujemodułyMORT,jednakróżniąsię końcem karboksy (w kierunku 3') w stosunku do tych modułów, jak również ich rejonami niekodującymi. (b) Na podstawie ich sekwencji C-końcowych, izoformy można podzielićnadwie podgrupy: cztery izoformy określone jako podgrupa b mająinne C-końce z uwagi na zmianę wramce odczytu. Dwie (MACHb1 i.b2) mają wspólny C-koniec, znaleziony wizoformie początkowo sklonowanej wteście przesiewowym podwójnej hybrydy, a dwie (MACHb3 i b4)mająwspólny inny C-koniec; trzy izoformy, określone jako podgrupa a, mają owiele dłuższy rejon C-końcowy, który bardzo przypomina proteazy zrodziny CED3/ICE (patrz poniżej); (c) Rejony przebiegające pomiędzy rejonem modułu MORT arejonem C-końcowym, który wyznacza podgrupy zmieniają się w zależności od izoformy. Jednakże, bliższe badanie wykazało, iż te pośrednie rejony składają się zróżnychkombinacji takich samych trzech blokówsekwencji aminokwasowych(bloki 1, 2 i3).Zmienność sekwencji aminokwasowej pomiędzy różnymi klonami odzwierciedla dwa rodzaje zmienności

PL 193 394 B1 w sekwencji nukleotydów, które najprawdopodobniej spowodowane są przez alternatywne składanie: (a) insercja albo brak jednej z dwóch sekwencji nukleotydowych, jednej z 45 nukleotydów (nts) i drugiej z 65 nts, albo obu, poniżej nukleotydów kodujących Lys184; (b) obecność dodatkowej wstawki w obrębie rejonu, który w MACHb1 stanowi niekodującą część 3'. Te zmienności wpływają zarówno na ramkę odczytu jak i długość białka.

Część izoform MACH obejmuje homolog CED3/ICE. Wyszukiwanie w banku danych ujawniło, iż C-końcowy rejon izoform MACHa, zawierający blok C i sekwencję biegnącą w dół od niego, ściśle przypomina proteazy z rodziny CED3/ICE. Przeprowadzono porównanie sekwencji tego rejonu w MACH i różnych znanych ludzkich członków tej rodziny, jak również białka ced3 Caenorhabditis elegans (Ellis i Horvitz, 1986; Yuan i wsp., 1993), oraz w znanych ludzkich proteazach z rodziny proteaz CED3/ICE: CPP32 (Fernandes-Alnemri i wsp., 1994), zwane również apopainą (Nicholsoon i wsp., 1995) i Yama (Tewari i wsp., 1995b), Mch2a (Fernandes-Alnemri i wsp., 1995), Ich-1 (Wang i wsp., 1994; ludzki homolog mysiego białka Nedd2, Kumar i wsp., 1994), ICErelII (Munday i wsp., 1995), zwane również TX i Ich2 (Faucheu i wsp., 1995; Kamens i wsp., 1995) oraz ICE (Thornberry i wsp., 1992; Cerretti i wsp., 1992).

Powyższy C-końcowy rejon MACH najbardziej przypomina CPP32 (z identycznością 41% i homologią 62%) i CED3 (z identycznością 34% i homologią 56%). Wykazuje znacznie mniejsze podobieństwo do ICE (z identycznością 28% i homologią 50%) oraz z jego blisko spokrewnionymi homologami ICErelII (zwanymi również TX i Ich2) oraz ICErelIII. Podobieństwo obserwowano niemal w całym rejonie, poczynając od Tyr226 w obrębie bloku 3, do C-końca izoform MACHa.

Można zauważyć dwa punkty podobieństwa:

(a) Wszystkie znane proteazy z rodziny CED3/ICE przecinają białka w miejscach określonych przez występowanie Asp w pozycji P1 i małej, hydrofobowej reszty aminokwasowej w P1'. Ich swoistość różni się jednak, w stosunku do innych cech strukturalnych substratu, w tym natury reszt w położeniach P2-P4. Zgodnie z tym, reszty centrum aktywnego, zaangażowane w katalizę (odpowiadające His237, Gly238 i Cys285 w ICE) oraz w kieszonce wiążącej po stronie karboksylowej łańcucha P1 Asp (Arg179, Gln283, Arg341 i być może również Ser347) są zachowane wśród tych proteaz. Te reszty są również zachowane w MACHa1. Istnieje jednak jeden wyjątek - konserwatywna zmiana Ser na Thr w miejscu odpowiadającym Ser347 w ICE. Inna niewielka, lecz potencjalnie ważna, różnica sekwencji pomiędzy izoformami MACH a innymi członkami rodziny proteaz polega na zastąpieniu Arg przez Gln w reszcie odpowiadającej Arg286 ICE. Ta reszta, która sąsiaduje z prawdopodobnie katalityczną resztą cysteinową, jest w pełni zachowana u wszystkich innych członków rodziny CED3/ICE. Również część reszt w miejscach umieszczonych w pobliżu reszt substratu P2-P4 różni się w izoformach MACHa od tych znalezionych u innych członków rodziny CED3/ICE.

(b) Proteazy z rodziny CED3/ICE zawierają miejsca samoprzecinania. O kilku z tych proteaz wiadomo, iż rzeczywiście podlegają samoobrabianiu, i zależą od tej obróbki jeśli chodzi o wykazywanie maksymalnej aktywności katalitycznej. Ich w pełni bioaktywna postać jest złożona z dwóch niekowalencyjnie związanych produktów przecięcia, które różnią się wielkością (p20 i p17 w ICE; p17 i p12 w CPP32). Obecność potencjalnych miejsc samoprzecinania u innych członków rodziny sugeruje, iż poddane są one podobnej obróbce, i podobnie zależą, od tej obróbki jeśli chodzi o wykazywanie maksymalnej aktywności. Takie potencjalne miejsca samoprzecinania występują w MACHa1 niemal w tych samych miejscach jak w CPP32. Miejsce odpowiadające końcowi N podjednostki p17 CPP32 jest umieszczone w drugim zachowanym bloku aminokwasów, zaledwie kilka aminokwasów w górę od N-końca rejonu homologii CCED3/ICE (poniżej Asp216). Miejsce odpowiadające punktowi przecięcia pomiędzy dwiema podjednostkami CPP32 jest umieszczone, jak u wszystkich innych członków rodziny CED3/ICE, o których wiadomo, iż są przecinane, kilka aminokwasów w dół od katalitycznej reszty cysteinowej (poniżej Asp374). Ta zachowawczość sugeruje, iż rejon homologii CED3/ICE w MACHa1 poddany jest obróbce proteolitycznej. Rozmiary dwóch oczekiwanych produktów tego cięcia są bardzo zbliżone do rozmiarów dwóch podjednostek poddanej obróbce cząsteczki CPP32.

(c) Rejon homologii CED3/ICE w MACH ma aktywność proteolityczną

Aby dowiedzieć się, czy regon homologii CED3/ICE w MACHa ma aktywność proteolityczną, zgłaszający wytwarzali przez ekspresję rejon, który rozciąga się od potencjalnego miejsca przecięcia w górę od tego rejonu, pomiędzy Asp216 a Ser217, aż do C-końca białka w bakterii, jako białko fuzyjne z GST. Lizaty bakteryjne poddano badaniu na obecność zdolności do cięcia fluorogennych substratów peptydowych, które jak wykazano wcześniej były cięte przez inne homologi CED3/ICE. Zastosowano dwa substraty peptydowe. Pierwszy, acetylo-Asp-Glu-Val-Asp-a(4-metylo-kumarylo-7-amid)

PL 193 394 B1 (AC-DEVD-AMC), odpowiada sekwencji w poli(ADP-rybozo)polimerazie (PARP), białku jądrowym, które jak stwierdzono, cięte jest w komórkach wkrótce po stymulacji FAS-R (Tewari i wsp., 1995b), jak również winnych procesach apoptotycznych (Kaufmann, 1989; Kaufmann i wsp., 1993; Lazebnik i wsp., 1994).Ten fluorogenny substrat jest cięty skutecznie przez CPP32. Drugi substrat fluorogenny, acetylo-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC (Ac-YVAD-AMC) odpowiada miejscu substratowemu dla ICE wprekursorze IL-1 b.Ten substrat fluorogennyjest cięty przez ICE. Lizaty bakteryjne, wykazującewytwarzanie wwyniku ekspresji rejonu homologii CED3/ICE w MACHa1 cięły skutecznie substrat fluorogenny pochodzący od sekwencji PARP. Niemiały one jednak żadnej dającej się zmierzyć aktywności proteolitycznej wobec substratu fluorogennego pochodzącego od sekwencji prekursora Il-1b. (kontrola), Ac-YVAD-AMC, która jest miejscem cięcia ICE w prekursorze Il-1b. (Thornberry i wsp., 1992). Aktywność proteolityczna była blokowana przez kwas jodooctowy (5 mM), potwierdzając, iż zachodzi za pośrednictwem proteazy tiolowej. Nie obserwowano cięcia w lizatach zawierających rejon homologii CED3/ICEMACHwpostacifuzjizGST,wktórym katalityczną resztę cysteiny Cys360 zastąpiono przez Ser. Ponadto, lizaty zbakterii, które wykazywały wytwarzanie wwyniku ekspresji pełnej długości białka MACHa1 jako białka fuzyjnego zGST, nie przecinały Ac-DEVD-AMC, prawdopodobnie z powodu braku enzymówbakteryjnych, zdolnych do obróbki cząsteczki pełnej długości. Nie zachodziło też cięcie wlizatach, zawierających inne z dwóch potencjalnych produktów cięcia rejonu homologii CED3/ICE.

Kinetyka cięcia substratu fluorogennego pochodzącego od sekwencji PARP, Ac-DEVD-AMC (50 mM) przez ekstrakty E. coli, wykazujące wytwarzanie wwyniku ekspresji białka fuzyjnego GST zrejonem homologii CED3/ICE w MACHa1 (Ser217 do końca C białka) została przedstawiona wporównaniu z brakiem cięcia przez ekstrakty bakterii, w których w wyniku ekspresji powstają białka fuzyjne GST zpełnej długości cząsteczką MACHa1 albo zjednym z dwóch potencjalnych produktów proteolizyrejonuhomologiiCED3/ICE(Ser217doAsp374i Asp374 do C-końca białka).

Ponadto, wykazano zależność od stężenia substratu dla cięcia Ac-DEVD-AMC, inkubowanego przez 180 min. zekstraktami bakterii produkujących rejon homologii CED3/ICE MACHa1 wfuzji zGST.Nieobserwowano cięcia w obecności kwasu jodooctowego (5 mM). Ekstrakty niemiały żadnej aktywności wobec Ac-YVAD-AMC, fluorogennego substratu odpowiadającego miejscu substratowemu dlaICEwprekursorzeIL-1b.

W skrócie, wytworzono białka fuzyjne GST w bakteriach Xl1-błękit przy użyciu wektora ekspresyjnego pGEX3. Bakterie poddano lizie przez rozbicie ultradźwiękami wbuforze zawierającym 25mM HEPES (pH 7,5), 0,1% 3-[3-cholamidopropylo)dimetyloamino)-1-propanosulfonian, 5 mM EDTA i 2 mM DDT, po czym wirowano przy 16000 x g przez10 min. Analiza SDS-PAGE potwierdziła obecność podobnych poziomów różnych białek fuzyjnych w lizatach. 50 ml próbek ekstraktów (4 mg/ml całkowitego białka) inkubowano w temperaturze pokojowej przez wskazane okresy w 500 ml całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej zfluorogennymi substratami, we wskazanych stężeniach. Uwalnianie AMC mierzono metodą spektro-fluorometrii przy długości fali wzbudzenia 380 nm i długości fali emisyjnej 460 nm. Stężenie AMC określono zkrzywej wzorcowej. Obydwa fluorogenne peptydy substratowe otrzymano zPeptide Institute Inc. (Osaka, Japonia). Inne proteazy CED3/ICE, jak wykazano, wykazywały pełną aktywność dopiero po obróbce proteolitycznej, która zachodzi albo przez samoprzecięcie, albo przez ich cięcie przezinne proteazy (przegląd wpublikacjach Kumar, 1995; Henkart, 1996). Obserwacja zgłaszających, iż lizaty bakterii, które wykazują wytwarzanie wskutek ekspresji cząsteczek GST-MACHa1 nie mają aktywności enzymatycznej, wprzeciwieństwie do aktywności obserwowanej w lizatach bakterii, które wykazują ekspresję rejonu homologii CED3/ICE, sugeruje, iż obróbka jest również wymaganadlaaktywności MACHa1. Sposób, wjaki zachodzi obróbka MACHa1 w komórce ssaka, i jak ta obróbka wywoływana jest przez wyzwolenie FAS-R albo p55-R, nie jest znany. Wykazano, iżMORT-1 wiąże się w komórkach z aktywowanym FAS-R wraz zinnymi białkami (Kischkel iwsp., 1995). Białka teprawdopodobnie obejmują MACHa1 iinne izoformy MACH.Wydaje się prawdopodobne, iż wiązanie MORT-1 w połączeniu z MACHa do FAS-R zbliża do siebie kilka cząsteczek MACH, albo wywołuje wnichkonformacyjnezmiany,iże zmianyte albo wyzwalająautolityczną obróbkę MACHa albo czynią MACHa podatnym na cięcie przez inne proteazy. Stymulacja p55-R może wyzwolić samoczynną obróbkę MACHa wpodobny, choć mniej bezpośredni sposób, przez zbliżenie do siebie kilku cząsteczek TRADD, albo przez wzbudzenie wnich zmiany konformacyjnej,którazkolei wywołuje zmianę w tworzeniu sięalbowstanieagregacji MORT-1ijego skojarzonej cząsteczki MACH.

PL 193 394 B1

Swoistość substratowa MACHa wydaje się być raczej „zorientowana ku śmierci”. Choćmoże ona ciąć substrat peptydowy odpowiadający miejscu cięcia wsubstracie śmierci PARP (Ac-DEVD-AMC), MACHa nie wykazał aktywności proteolitycznej względem peptydu odpowiadającego miejscu obróbki prekursora IL-1b przez ICE (Ac-YVAD-AMC). Identyfikacja białek komórkowych, które służą jako substraty do cięcia przez MACHa wyjaśni dalsze zdarzenia w indukcji śmierci przez tę proteazę. Prawdopodobnymi substratami dla cięcia przez MACHa są inni członkowie rodziny CED3/ICE, jak CPP32 i ICE. Niektóre z tych proteaz rzeczywiście ulegają obróbcepowyzwoleniureceptoraFAS-R albo TNF(Miura iwsp., 1995, Schlegel iwsp., 1996; Chinnaiyan iwsp., 1996). Być może proteazy, które nienależądorodzinyCED3/ICErównież ulegająaktywacji przez MACHa, bezpośrednio bądź poprzez działanie innych proteaz CED3/ICE. Zaangażowanie wielu proteaz w proces śmierci komórkowej jest zgodne zdoniesioną zdolnością inhibitorów różnych proteaz, wtym inhibitorów proteaz serynowych i inhibitora cięcia ICE jak również antysensownegocDNAICE,doochronykomórekprzed cytotoksycznością wywoływaną przez receptory FAS-R iTNF (Weitzen iGranger, 1980; Ruggiero i wsp., 1987; Enari i wsp., 1995; Los i wsp., 1995).

Różne inne enzymy, wtym fosfolipazy, sfingomielinazy ikinazy białkowe mogą uczestniczyć windukcjiśmierci komórkowej przez receptory TNF i FAS-R (patrz Eischen i wsp., 1994;Vandenabeele iwsp., 1995; Cifone iwsp., 1995 oraz odniesieniawtychpublikacjach).Niektóreztychenzymów mogą być aktywowane przez cięcie proteolityczne inicjowane przez MACHa. Wydajesięjednakrównież możliwe, że przynajmniej część tych innych aktywności związanych ze śmiercią, stymulowana jest przez inne szlaki sygnalizacji, niezależnie od stymulacji MACHa. Zaangażowanie więcej niż jednej kaskady sygnalizacyjnej w indukcję śmierci komórkowej, niektórych wspólnych dla p55-R i FAS/APO1 iniektórych wzbudzanychtylkoprzezjednąznich,wydajesiębyćzgodnezdoniesieniemozarówno wspólnychjakioddzielnychcechach procesów śmierci komórkowej wzbudzanej przez te dwa receptory (Grell i wsp., 1994; Schulze-Osthoff i wsp., 1994;Wong iGoeddel, 1994; Clement i Stamenkovic, 1994).

(d) MACHa1 wiąże się z MORT-1 jak również z MACHb1

Aby dowiedzieć się, czy MACHa1 może się wiązać z MORT-1, tak jak MACHP1, badano najpierwinterakcjębiałekwtransformowanychdrożdżach.Wydajesię,żeMACHa1ma znacznedziałanie cytotoksyczne na drożdże. Działanie to manifestowało się znacznym zmniejszeniem wydajności kolonii drożdży, w których zachodziło wytwarzanie białka wwyniku ekspresji wwektorzedomenyaktywującej (AD) (którego poziom ekspresjijestwyższyniżdla wektoradomenywiążącejDNA (DBD)). Z drugiej strony, MACHb1, wktórym resztę katalityczną cysteiny, Cys360, zastąpiono przez Ser (MACHa1 (C360S)) nie był cytotoksyczny ani dla komórek ssaków (patrz poniżej) ani dla drożdży. Podobnie jak MACHb1, MACHa1 (C360S) wiązał się w transfekowanych drożdżach zMORT-1, jak również ze sobą samym. Wiązał się on również z MACHb1. Ponadto, drożdże wykazujące wytwarzaniewwynikuekspresjiMACHa1typudzikiegowrazzMORT-1albozMACHa1wykazywały interakcję zbiałkami transfekowanymi. Intensywność zabarwienia produktem lacZ zmieniała się jednak wśród kolonii drożdży;udrożdżytransfekowanychMACHa1zarównowwektorachADjakiDBDnieobserwowano żadnego barwnego produktu,prawdopodobniezuwaginacytotoksycznedziałanie MACHa1 typu dzikiego. Jednak pomimo tej zmienności, drożdże produkujące MACHa1 czy to wpołączeniu z MORT-1 czy też w połączeniu z MACHb1 dawały wynik wyraźnie dodatni dla interakcji transfekowanych białek. Inaczej niż MACHb1, MACHa1 nie wykazywał interakcji z samym sobą w teście podwójnej hybrydy.

Zarówno MACHa1 (C360S) jak iMACHb1 ulegały koimmunoprecypitacji zMORT-1 z lizatów komórekludzkiej nerki płodowej 293-EBNA,co wskazuje, iżwiążąsięonezMORT-1 równieżwkomórkachssaków.Badającdalej,czyMACHa1możewiązaćsięzMORT-1równieżwkomórkachssaków, wytworzono wwyniku ekspresji MACHa1 albo MACHb1, wfuzji zoktapeptydem FLAG, wraz z wyznakowanymi epitopem HA cząsteczkami MORT-1. Metabolicznie wyznakowane ³⁵[S] MACHa1 albo MACHb1 poddane fuzji przy ich N-końcach zoktapeptydem FLAG (FLAG-MACHa1 i b1) oraz MORT-1 poddane fuzji przyjego końcu N zepitopem HA (Fieldiwsp., 1988) wytworzono wwyniku ekspresji w komórkach HeLa. Immunoprecypitację białek z lizatów komórek przeprowadzono przy użyciu mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko oktapeptydowi FLAG (M2; Eastman Kodak), epitopowi HA (12CA5, Field i wsp., 1988) albo receptorowi TNF p75 (#9, Bigda i wsp., 1994) jako kontroli. Białka analizowano elektroforezą wżelu SDS-polakrylamidowym (12% akrylamidu), po czym nastąpiła autoradiografia. Zarówno MACHa1jakiMACHb1 ulegałykoimmunoprecypitacji zMORT-1 z lizatów komórek, co wskazuje, iż wiążą się one zMORT-1. Skuteczność interakcji MACHa1 z MORT-1 wydawała się niższa niżdlaMACHb1.

PL 193 394 B1 (e) Cząsteczki MACH, które zawierają rejon homologii CED3/ICE mogą pośredniczyć w śmierci komórkowej

W celu zbadania zaangażowania MACH w indukcję śmierci komórkowej, badano działanie nadmiernego wytwarzania różnych izoform MACH na żywotność komórek. Test ten przeprowadzono poprzeztransfekcjęwektorówekspresyjnychMACHwrazzwektoremekspresyjnym b.galaktozydazy jakomarkerem transfekcjidokomórekludzkiejnerkipłodowej293.EBNAoraz komórek raka sutka MCF7.

Komórki293.EBNA,komórkiludzkiegorakasutkaMCF7oraz komórkiHeLaHtTA.1hodowano w zmodyfikowanym przez Dulbecco minimalnym zasadniczym podłożu Eagle'a, z dodatkiem 10% płodowejsurowicycielęcej,nieegzogennychaminokwasów,100 U/ml penicyliny i 100 mg/mlstrepto.

mycyny. Naczynia do hodowli tkankowej ikomórkowej (5x10⁵ komórek293.EBNA, 3x10⁵ komórek MCF7albo3x10⁵ komórekHeLawnaczyniach6cm) poddano przejściowej transfekcji, przy użyciu metody precypitacjifosforanemwapnia,zcDNA wskazanych białek wraz zwektorem ekspresyjnym b.galaktozydazy. Wjednym zestawie doświadczeń,każdenaczyniepoddanotransfekcji3,5 mgkon. struktu MACH i 1,5 mg pSV.b.gal; awinnym zestawie doświadczeń,każdenaczyniepoddanotrans. fekcjiprzyużyciu 2,5 mgwskazanegokonstruktuMACHalboMORT.1(albo,jako kontrola, pustego wektora) oraz 1,5 mg pSV.b.gal. Komórki płukano 6.10 godzin po transfekcji. Komórki 293.EBNA iMCF7 inkubowanoprzezdalszych18godzinbezdodatkowejobróbki. KomórkiHeLainkubowano przez 26 godzin po transfekcji, anastępnie przez 5 godzin w obecności albo przeciwciała anty. Fas/APO1 (CH11, 0,5 mg/ml) albo TNF (100 ng/ml) wraz zcykloheksimidem (10 mg/ml). Stopień śmiercikomórekprzykońcuokresówinkubacjiocenianoprzezokreślenieekspresji b.galaktozydazy, jakopisanowpublikacjiKumariwsp.,1994.

HodowlepoddanetransfekcjiwektoremekspresyjnymMACHa1lubMACHa2wykazywałyma. sywną śmierć komórkową, co manifestowało się zaokrągleniem komórek, powstaniem pęcherzyków, obkurczeniem, awreszcie odłączeniem się komórek od naczynia. W ciągu 20 godzin po transfekcji, większość komórek stransfekowanych, zidentyfikowanych przez barwienie na b.galaktozydazę (X.Gal) wykazywała skondensowaną morfologię typową dla apoptozy. Natomiast komórki wykazujące ekspre. sję pustego wektora pozostawały żywe.

WceluzbadaniazaangażowaniarejonuhomologiiCED3/ICEwizoformachMACHawichdzia. łania apoptotyczne, komórki transfekowanowektoremekspresyjnymdlaizoformyMACHb1, któremu brak rejonu homologii CED3/ICE, jak również wektorami ekspresyjnymi dla MACHa3, której brak N.końcowej części rejonu,orazwektorami ekspresyjnymi dlaMACHa1 (C360S) oraz dlamutanta z odciętym C.końcem MACHa1 (MACHa1 (1.415)), któremu brakujejednej z reszt, które uważa się za krytyczne dla funkcji proteazowej CED3/ICE (odpowiadającej Ser347 ICE). Żadnaśmierć(pozanie. wielkąilościąobserwowanąwkomórkach transfekowanychpustymwektoremekspresyjnym)nieza. szła w komórkach 293.EBNA albo MCF7, transfekowanych wektorami ekspresyjnymi zMACHa3, MACHa1 (1.415) albo MACHa1 (C360S). Ponadto, komórki transfekowane MACHa1 wraz ztymi wektorami wykazywały również bardzo niewiele śmierci komórek, co wskazuje, iż cząsteczki MACH, którezawierająniekompletny rejonCED3/ICEmająwpływnegatywnydominującynaaktywność czą. steczek typu dzikiego. Hodowle wyrażające MACHb1, które nie zawierają rejonu CED3/ICE w ogóle, wykazywały nieco śmiercikomórkowej. TenefektdziałaniaMACHb1,który prawdopodobniewynika zaktywacji endogennych cząsteczek MACHa1, był zjakiegoś względu bardziej wyrażony wtransfekowanychkomórkachHeLa.Ponadto,wkomórkachHeLa MACHa3, MACHa1 (1.415) oraz MACHa1 (C360S) były również nieco cytotoksyczne.

Wydajesię,żeaktywnośćMACHa stanowi najwyższy etap enzymatyczny w kaskadzie sygnali. zacyjnejdladziałańkomórkobójczychFAS/APO1ip55.R.ZdolnośćMACHb1dowiązaniasięzarów. nozMORT.1jakiMACHa1sugeruje,iżtaizoformawzmagaaktywnośćizoformaktywnychenzyma. tycznie. Możliwe jest, że niektóre z izoform MACH pełnią dodatkowe funkcje. Zdolność MACHb1 do wiązaniasięzarównozMORT.1jakiMACHa1sugeruje,iżizoformatamogłabywzmagaćaktywność izoform aktywnych enzymatycznie. Łagodna cytotoksyczność obserwowana w hodowlach 293.EBNA iMCF7transfekowanychtąizoformąorazraczejznacznedziałaniecytotoksyczne,którewywieraona w komórkach HeLa, prawdopodobnie odzwierciedla aktywację produkowanych endogennie cząste. czekMACHa pozwiązaniusięztransfekowanymicząsteczkamiMACHb1.Możnasobiewyobrazić,iż niektóre z izoform MACH mogłyby również działaćjako miejsca kotwiczące dla cząsteczek, które są zaangażowanewinne,niecytotoksyczneefektydziałaniareceptorówFAS/APO1iTNF.

PL 193 394 B1

f) Blokowanie funkcji MACHa zakłóca wywoływanie śmierci komórkowej przez Fas/APO1 i p55-R

W celu oceny stopnia uczestnictwa MACHa w cytotoksyczności Fas/APO1 i p55-R, MACHa3, jakrównieżniefunkcjonalnychmutantówMACHa1,MACHa1(1-415)oraz MACHa1(C360S), otrzymanojewwynikuekspresjiwkomórkach, które pobudzono w celu wykazania tej cytotoksyczności. Cytotoksyczność indukowaną przez p55-R wywoływano wkomórkach 293-EBNA przez przejściową nadekspresję tego receptora (Boldin iwsp,. 1995a), a cytotoksyczność Fas/APO1 przez nadekspresję chimerycznych cząsteczek, złożonych z zewnątrzkomórkowej domeny p55-R iśródbłonowej iwewnątrzkomórkowej domeny Fas/APO1. Chimera ta miała o wiele większedziałaniecytotoksyczneniż działanie normalnego Fas/APO1. Aktywność cytotoksyczną w komórkach HeLa wzbudzano również przez poddanie ich działaniu TNF albo przeciwciała anty-Fas/APO1 w obecności cykloheksimidu - blokerasyntezy białek.Komórki HeLa zaczęły odpowiadać na Fas/APO1 dzięki przejściowemuwytwarzaniu tego receptora wwyniku ekspresji. We wszystkich badanych układach, MACHa3 orazniefunkcjonalne mutanty MACHa1 zapewniały skuteczną ochronę wobec cytotoksyczności wywoływanej przez Fas/APO1 albo wyzwalanie p55-R. Taką ochronę obserwowano również, jak wcześniej donoszono(Hsuiwsp.,1996;Chinnaiyaniwsp.,1996),wkomórkachtransfekowanychmutantemMORT-1 z N-końcową delecją, któremu brakowało rejonu wiążącego MACH (MORT1(92-208)). Te działania ochronne wskazują, iż MACHa jest koniecznym składnikiem wywoływanych zarówno przez Fas/APO1 jak i p55-R kaskad sygnalizacyjnych dla śmierci komórkowej.

MACH jest wyrażany w różnych tkankach przy znacznie różniących się poziomach irównież z różnymi wzorcami izotypowymi. Te różnice prawdopodobnie przyczyniająsię do swoistych tkankowo cech odpowiedzi na ligand FAS/APO1 iTNF. Tak jak w przypadku homologów CED3/ICE (Wang iwsp., 1994; Alnemri iwsp., 1995), stwierdzono, ze izoformy MACH zawierające niecałkowite rejony CED3/ICE (np. MACHa3) hamują aktywność równocześnie produkowanych cząsteczek MACHa1 albo MACHa2; stwierdzonorównież, że blokują one indukcję śmierci komórkowej przez FAS/APO1 i p55-R. Wytwarzaniewwyniku ekspresjitakichhamującychizoformwkomórkachmożestanowić mechanizm komórkowej samoobrony przed cytotoksycznością zachodzącą za pośrednictwem FAS/APO1 iTNF. Szeroka heterogenność izoform MACH, która znacznie przekracza obserwowaną dla dowolnych innych proteaz zrodziny CED3/ICE, powinna pozwalać na szczególnie dokładne dostrojenie funkcji aktywnych izoform MACH.

Przykład 1:

Klonowanie i izolacja białka G1, które wiąże się z białkiem wiążącym MORT-1 Mch4 (i) Test przesiewowy podwójnej hybrydy oraz test ekspresji b-galaktozydazy z podwójnej hybrydy

Przy użyciu procedur przedstawionych w powyższych Przykładach Odniesienia 1-3, wyizolowano nowe białko, oznaczone G1, które jest widocznie homologiczne, astąd być może jest członkiem rodziny proteaz ICE-podobnych. Białko G1 zawiera dwa moduły homologiczne do modułów MORT, mianowiciezhomologiądoczęściN-końcowejMORT-1,modułówMORTbiałek MACH (patrz powyższe przykłady odniesienia 1-3 oraz publikacja Boldin iwsp., 1996) oraz modułów MORT innego pokrewnegobiałkawiążącegoMORT-1Mch4(patrzFernandes-Alnemriiwsp.,1996;Srinivasulaiwsp., 1996). Ponadto, białko G1 ma rejon enzymatyczny (proteazopodobny), który jest homologiczny do enzymatycznych (proteazowych) rejonów proteaz rodziny CED3/ICE (na przykład rejonów proteazowychbiałek MACH i Mch4 i innych).

Uzyskano klon białka G1 („klon G1”) po teście przesiewowym podwójnej hybrydy wbibliotece cDNAludzkich limfocytówT Jurkat, przy użyciu białka Mch4 jako „przynęty”. Zastosowano bibliotekę cDNAludzkichlimfocytówT JurkatzdołączonądomenąaktywacyjnąGal4, atest przesiewowy przeprowadzono przy użyciu drożdżowego szczepu reporterowego HF7c (Clontech, Pało Alto, Ca.) w nieobecności 3-aminotriazolu według Protokołu Układu Podwójnej Hybrydy Matchmaker™ (Clontech). SekwencjęMch4uzyskanozbazydanych EMBL.Przyużyciutejuzyskanejsekwencji,zaprojektowano startery PCR stosując oprogramowania OLIGO4™, a fragment DNA odpowiadający kodującej części Mch4 uzyskano przez PCR zodwrotną transkryptazą (RT-PCR) z całkowitego RNA uzyskanego (standardowymimetodami)zpierwotnychkomórekLudzkiego Endotelium Żyły Płodowej. Tę kodującą częśćMch4wklonowano następnie do wektora pGADGH (Clontech) i zastosowano jako przynętę, jak wspomniano powyżej, wprocedurze przesiewowej podwójnej hybrydy. W tym teście przesiewowym podwójnej hybrydy otrzymano 11 klonów, wszystkie kodujące białko,które było prawdopodobnie odmianą składania transkryptu zawierającą dwa motywy homologiczne zMORT-1. Analiza wstępnej częściowej sekwencjiG1isekwencjiwbaziedanych„dbest”orazBazie DanychLudzkiegoGenomu, poziom 1, umożliwiła uzyskanie kilku EST-ów(„sekwencje ulegające ekspresji)zawierających części

PL 193 394 B1 sekwencji. Analiza sekwencyjna tych EST-ów ujawniła, iż istnieje prawdopodobnie wiele odmian białka G1, wynikających z odmian składania transkryptu (wariant „składania”) które zawierają odcinek sekwencji, kodujący motyw białkowy, który jest homologiczny z proteazami ICE-podobnymi i że ten odcinek sekwencji umieszczony jest wkierunku 3'do sekwencji G1 uzyskanej wteście przesiewowym podwójnej hybrydy.

W celu uzyskania pełnej sekwencji izoformy G1, która zawiera proteazopodobny rejon enzymatyczny, przeprowadzono reakcję odwrotnej transkryptazy na całkowitym RNA uzyskanym z różnych linii komórkowych, używając jako startera oligonukleotydu, zawierającego odcinek 15dT i sekwencję adaptorową wcelu dostarczenia cząsteczek cDNA. Te cząsteczki cDNA zastosowano następnie jako matryce wreakcji PCR, wktórej zaprojektowano i zsyntetyzowano startery PCR w postaci oligonukleotydów, mających sekwencję uzyskaną z 5' niekodującej części G1 oraz sekwencję adaptorową, przy czym startery te zastosowano wpierwszej rundzie reakcji PCR. Następnie, wdrugiej rundzie powyższej reakcji PCR zastosowano dodatkowe startery oligonukleotydowe, mające sekwencjęod 5' części kodującej G1, włącznie z inicjatorowym kodonem ATG, jak również sekwencją adaptorową. W ten sposób można było uzyskać pełną sekwencję oczywistego wariantu składania białka G1, która zawierarejonenzymatyczny (proteazopodobny). Reprezentujeontylkojednąz podejrzanych izoform G1 .

Wstępna sekwencja jednej takiej izoformy G1, wariantu składaniowego G1, przedstawiona jest na Fig. 1, na której górna sekwencja jest sekwencją nukleotydów, a dolna sekwencja jest wywnioskowaną sekwencją aminokwasówORF poczynając od ATG (nukleotydnr 482)i kończąc na TAA (nukleotyd 1921), przy czym te nukleotydy starterowy i terminacyjny są zaznaczone gwiazdkami (*) w sekwencji nukleotydowej. Wariant składaniaG1zFig.1oznaczono„G1 a”.

Na Fig. 2 przedstawiono schematycznie wstępną sekwencję innej izoformy G1, krótkiego wariantu składania G1, mającego dwa MODUŁY MORT, prowizorycznie oznaczonego „G1b”, gdzie górna sekwencja jest sekwencją nukleotydową a dolna sekwencja jest wywnioskowaną sekwencją aminokwasów ORF, poczynając od nukleotydu nr 482 (ATG) i kończąc na nukleotydzie nr 1145 (TGA), przy czym kodony startowy i terminacyjnyzaznaczono gwiazdkami(*)wsekwencji nukleotydowej.

Ponadto, należy zauważyć, iż początkowo wyizolowanyklonG1, uzyskanyprzyużyciusekwencji Mch4 jako „przynęty”, był przynajmniej częścią krótkiego wariantu składania G1, zwanego G1b (patrzFig.2). Ten początkowo wyizolowany klonG1 był częściowym klonem nowego cDNA,który, jak MACH (CASP-8) i Mch4 (CASP-10), zawierał dwa „motywy domeny śmierci/Moduły MORT” (albo „efektorowe domeny śmierci” -DED) tuż poniżej swego N-końca (patrz również Fig. 3). Przy użyciu tego początkowego klonu można było wyizolować i scharakteryzować klony cDNA dla większego wariantu składanieowego G1a i krótszego wariantu składanieowego G1b. Większy wariant składanieowy miał rejon C-końcowy homologiczny z rejonem proteazowym kaspaz i stąd jest prawdopodobnie nowym członkiem rodziny kaspaz. Jako takie, G1 oznaczono również jako CASH wskrócie od „caspase homolog” (homolog kaspazy). Przeprowadzono porównanie sekwencji G1a (CASHa) i G1b (CASHb) z sekwencjami innych kaspaz (dla dalszych szczegółów, a zwłaszcza co do izolacji mysiej sekwencji G1, patrz poniżej i powyżej w„Krótkim opisie rysunków” wodniesieniu do Fig. 3). Wyniki tego porównania przedstawiono schematycznie na Fig. 3, której szczegółowy opis, w szczególności, klucz do wskazanych na tym rysunku sekwencji,podanopowyżej w „Krótkim opisie rysunków”.

Po powyższym początkowym klonowaniu i sekwencjonowaniu G1, wszczególności izoform G1 a i G1b, przeprowadzono dalszą analizętych białek:

(ii) Analiza Northern i dodatkowa analiza sekwencyjna:

Analiza Northern blotów ujawniła, iż białko G1 istnieje w transkryptach przynajmniej trzech rozmiarów, 2, 2,4 i 4,4 kb, których proporcje bardzo różnią się w różnych tkankach (Fig. 4). W celu uzyskania pełnej długości cDNA G1 (CASH), bibliotekę cDNA ludzkichfibroblastów skóry (Clontech) poddano badaniu przesiewowemu sondą cDNA, odpowiadającą sekwencji G1. Otrzymano dwa klony cDNA, oczywiście odpowiadające dwóm wariantom składania G1 (patrz również powyżej). Białka kodowane przez te dwa cDNA miały taki sam rejonN-końcowy, zawierający efektorowądomenę śmierci, ale ich C-końce różniły się. Jedno (G1b=CASHb) miało krótki C-koniec, odpowiadający początkowo sklonowanemucDNA.Drugie (G1 a=CASHa) miało długi C-koniec.

Sekwencja aminokwasów w tym dłuższym rejonie C-końcowym G1 □ wykazywała raczej wysoką homologię z sekwencjami rejonów prekursorów proteazowych wMACH (CASP-8) i Mch4 (CASP-10) (patrz również Fig. 3). Jednakże, G1 a brakuje kilku reszt, uważanych za kluczowe dla aktywności proteazowej, co sugeruje, że białko może być pozbawione aktywności cysteinowej. Co ciekawe, G1 a zawiera sekwencję substratu kaspazy w miejscu, odpowiadającym miejscu obróbki proteolitycznej

PL 193 394 B1 wobrębie rejonów proteazowych wMACH (CASP-8) iMch4 (CASP-10) (zacieniowane na Fig. 3). Wstępnedane sugerują, iżG1 a może rzeczywiście podlegać przecinaniu w tym miejscu przez MACH (danenieprzedstawione).

W oparciu osekwencję nukleotydową klonu EST, która, jak stwierdzono, odpowiada mysiemu homologowi części rejonu „domeny zabójczej” (DED) w G1 , cDNA zarówno mysich wariantów składanieowych CASHa i CASHb poddano klonowaniu zmRNA wątroby mysiej przez RT-PCR. Klon EST (nr dostępu GenBank AA198928) zidentyfikowano jako mysi homolog części rejonu DED wG1. W oparciu otę sekwencję, warianty składanieowe mysiego G1 a (CASHa) i G1 b (CASHb) zmRNA mysiej wątroby sklonowano metodą RT-PCR. Reakcję odwrotnej transkryptazy przeprowadzono przy użyciu startera adaptorowego oligo-dT (5'GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)17-3') oraz odwrotnej transkryptazy AMV (Promega), stosowanej według instrukcji producenta. Pierwszą rundę PCR przeprowadzono przy użyciu systemu Expand Long Template PCR (Boehringer Mannheim), przy użyciu następujących starterów, odpowiednio sensownego i antysensownego: 5'-GGCTTCTCGTGGTTCCCAGAGC-3' i

5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3' (adaptor). Drugą rundę przeprowadzono przy użyciu polimerazyVent (NEB), stosując zagnieżdżony startersensowny:

5'-TGCTCTTCCTGTGTAGAGATG-3' i adaptora.

Porównanie sekwencji ujawniło wysoką zachowawczość wcałej cząsteczce G1 a (CASHa) (71% identyczności wrejonie DED i 59% wrejonie homologii proteazowej), co sugeruje, iż zarówno DED jak i rejony homologii proteazowej w białku przyczyniają się do jego funkcji (patrz Fig. 3).

(iii) Analiza swoistości wiązania izoform G1 metodą podwójnej hybrydy:

Test podwójnej hybrydy właściwości interakcji G1a (CASHa) i G1b (CASHb) (Fig. 5) ujawnił, iż obydwawarianty ulegająinterakcji z MORT-1/FADD i MACH (CASP-8), najprawdopodobniej przez ich wspólne rejony DED. Warto wspomnieć, iż G1b (CASHb), choć początkowo sklonowane wteście przesiewowym podwójnej hybrydy na białka, które wiążą się zMch4 (CASP-10), jak stwierdzono wtym teście, wiąże się słabo zMch4 (CASP-10), aG1 a (CASHa) wydaje się wiązać tylko słabo zMch4. Należy jednak zauważyć, że początkowy test przesiewowy podwójnej hybrydy służący do sklonowania białekG1 różnił się od testu przesiewowego podwójnej hybrydy służącego do oceny swoistości wiązania, astąd, w rzeczywistości wydawałoby się, iż zarówno G1a jak i G1b wiążą się zMACH iMch4, jak wykazują wyniki początkowego klonowania. Dwa warianty G1 również ulegają samowiązaniu iwiążą się ze sobą wzajemnie, ale nie wiążą się zRIP ani zTRADD (białkami adaptorowymi, które, tak jak MORT-1/FADD, zawierają domeny śmierci, ale nie zawierają DED), ani też nie wiążą się zwieloma niezwiązanymi tematycznie białkami (np. laminą), stosowanymi jako kontrole swoistości.

W celu dalszego zbadania funkcji G1, jego dwa warianty wytwarzano przez przejściową ekspresję wkomórkach HeLa i 293-T ioceniono działanietransfekowanych białek na wywoływaną przez p55-R (CD120a) sygnalizację cytotoksyczności, wyzwalanej przez TNF, albo też przez nadekspresję receptora oraz na wywołaną przez FAS-R (CD95) sygnalizację cytotoksyczności wyzwalanej przez sieciowanie FAS-R przeciwciałem albo przez nadekspresję receptora chimerycznego, złożonego z zewnątrzkomórkowej domeny p55-R (CD120a) i wewnątrzkomórkowej domeny FAS-R (CD95) (patrz Fig. 6). W obydwu liniach komórkowych, sama ekspresja G1 b (CASHb) nie miała wpływu na żywotność komórek, ale silnie hamowała indukcję śmierci komórkowej przez p55-R (CD120a) jak również przez FAS-R (CD95).Wytwarzanie wwynikuekspresjiwariantu G1 a (CASHa) wpływało na dwie linie komórkowe bardzo różnie. W komórkach HeLa hamował on cytotoksyczność p55-R (CD120a) iFAS-R (CD95), podobnie do G1 b (CASHb),jednakże wkomórkach 293-T, powodował znaczną cytotoksyczność. Podobną cytotoksyczność obserwowano, gdy białko G1 a powstawało wwyniku ekspresji wkomórkach 293-EBNA (nie przedstawiono). Ten efekt cytotoksyczny można było całkowicie zablokować przez koekspresję p35, pochodzącego zbakulowirusa inhibitora kaspazy (co do p35, patrz równieżpublikacjaClem i wsp., 1991; Xuei Horvitz, 1995).

W celu oceny udziału rejonu homologii protezowej G1a (CASHa) wjego działaniu komórkobójczym, zbadano funkcje dwóch mutantów tego białka. Mutantami tymi były: G1/CASHa (1-385) oraz G1/CASHa(1-408), zC-końcowymi delecjami wrejonie, odpowiadającym tej części domeny proteazowej, zktórej pochodzi mniejsza podjednostka dojrzałej proteazy. Obydwa mutanty były pozbawione jakiegokolwiek działania cytotoksycznego. Ponadto, podobnie jak G1b (CASHb), chroniły one komórki 293 przed wywoływaniem śmierci przez p55-R (CD120a) i FAS-R (cd95) (Fig. 6C i D).

PL 193 394 B1

Należy zauważyć, iż dla powyższych procedur zastosowano następującemetodyimateriały:

(i) Mutanty delecyjne G1 a (CASHa) oraz chimerę p55-R/FAS-R (CD120a/CD95) wytworzono metodą PCR i/lub konwencjonalnymi technikami klonowania. Warianty składanieowe G1 (CASH), białka kaskady sygnalizacyjnej FAS-R (CD95) albo p55-R (CD120a) (wszystkie pochodzenia ludzkiego)orazbiałko bakulowirusa p35 wytwarzano przez ekspresję w komórkach ssaków przy użyciu wektora ekspresyjnego pcDNA3 (Invitrogen). b-galaktozydazę wytwarzano przez ekspresję przy użyciu wektora pCMV-b-gal (Promega).

(ii) Ludzkie komórki nerki płodowej 293-T i 293 EBNA oraz ludzkie komórki raka szyjki macicy HeLa (HeLa-Fas; klon HtTA-1), w których stale przebiegała ekspresja z wytwarzaniem transfekowanego ludzkiego FAS-R (CD95) (otrzymanego wlaboratorium niniejszego wynalazcy) hodowano wzmodyfikowanym przez Dulbecco minimalnym zasadniczym podłożu Eagle'a, z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej, nieegzogennych aminokwasów, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.

Powyższe obserwacje wskazują, iż G1 może ulegać interakcji ze składnikami kompleksów sygnalizacyjnychp55-RiFAS-Ri żewpływana wywoływanie śmierci komórkowej w sposób, którymoże się różnić zależnie od tożsamości wariantu składania G1 oraz od typu komórki, wktórej przebiega ekspresja.

Zahamowanie wywoływania cytotoksyczności przez G1b, oraz w przypadku komórekHeLa równieżprzezG1 a, zachodzi oczywiścieza pośrednictwem rejonu„domeny śmierci” (DED)wtym białku. Prawdopodobnie odzwierciedla to współzawodnictwo DED wG1 z odpowiadającymi jej rejonami wMACH(CASP-8)iMch4(CASP-10)owiązaniezMORT-1/FADD.

Jeśli chodzi osposób, wjaki CASHa powoduje śmierć komórek 293, zdolność białka p35 do blokowania tego efektu cytotoksycznego wskazuje, iż cytotoksyczność zachodzi za pośrednictwem kaspaz. JednakżeG1 a, pomimotego, że wykazuje znacznąhomologięsekwencji z kaspazami, może nie posiadać w rzeczywistości aktywności proteazy cysteinowej, ponieważ nie makilku zachowanych reszt centrum aktywnego kaspazy. G1a może zatem działać przez aktywację innych cząsteczek, które mająaktywnośćkaspazy.

Inną możliwością jest, iż G1 a, choć niezdolne samo do działania jako proteaza, może jednak stanowićczęść aktywnej cząsteczki proteazowej. Krystalograficzne badania struktury CASP-1i CASP-3 wskazują, iż mała iduża podjednostka proteazy wkażdym zobrabianych enzymów pochodzi zoddzielnychcząsteczekproenzymu (Walkeriwsp,, 1994); Wilsoni wsp., 1994; Mittli wsp., 1997; Rotonda i wsp., 1996). Mając na względzie zaobserwowaną zależność cytotoksycznej aktywności G1 a od nienaruszenia rejonu, odpowiadającego mniejszej podjednostce proteazy (Fig. 6C), może być tak, że ten rejon wG1 a (CASHa) może łączyć się zrejonem dużej podjednostki pewnej kaspazy(kaspaz) wsposób, którego rezultatem jest odtworzenie enzymatycznie aktywnej cząsteczki. Powstający aktywny heterotetramer powinien wówczas być zdolny do aktywowania innych kaspaz, wten sposób wyzwalającśmierćkomórki.

Ponadto, okazuje się też (wyniki nie przedstawione), iż G1 ma przynajmniej jakąś homologię zinnym białkiem, zwanym MYD88, które jest zaangażowane wszlak sygnalizacyjny, zachodzący za pośrednictwem IL-1. A zatem, G1 może być również zaangażowane winne szlaki inicjowane/zachodzące za pośrednictwem innych cytokin.

W oparciuoprzedstawionefaktydotycząceklonowaniaiizolacji białka G1 (przynajmniej dwóch jego izoform), nasuwają się następujące cechy charakterystyczne i zastosowania G1 :

(i) G1 sklonowano wteście przesiewowym podwójnej hybrydy jako cząsteczkę, która wiąże się zbiałkiem wiążącym MORT-1, Mch4, astąd być może zaangażowane jest w modulację aktywności Mch4 iMORT-1, astąd, poprzez mechanizmy wskazane powyżej, G1 być może zaangażowane jest wmodulacjęzjawisk komórkowych inicjowanych przez FAS-Ri p55-R. Ponieważ Mch4 zdolnejest do wiązania się zMORT-1 ijest bezpośrednio zaangażowane w cytotoksyczność komórkową, a ostatecznie w śmierć komórkową, a również ponieważ pewne izoformy Mch4, jak wiadomo,hamująśmierć komórkową, okazuje się, iż G1, włącznie zjego różnymi izoformami, może być bezpośrednio albo pośrednio zaangażowane zarówno w cytotoksyczność komórkową jak i śmierć komórkową, jak równieżwhamowanie śmierci komórkowej.

(ii) G1 najwidoczniejmarejonN-końcowy,któryzawiera modułyMORT,homologicznezdwoma modułami MORT MACH (patrz powyższe przykłady odniesienia z1-3) oraz Mch4.Wydajesię zatem, że obecność tych modułówMORT wG1 odpowiada za zdolność G1 do wiązania się zMch4, amoże również pozwalać na wiązanie się G1 (albo przynajmniej niektórych zjego izoform) zMACH (albo

PL 193 394 B1 z pewnymi jego izoformami), jak również bezpośrednio z MORT-1. G1 może być zatem zdolne do modulowania aktywności MORT-1 (i, z kolei, aktywności FAS-R i p55-R) bezpośrednio, przez wiązanie się z MORT-1, albo pośrednio, przez wiązanie się z Mch4 i/lub MACH, które z kolei wiążą się, jak wiadomo, z MORT-1.

(iii) Analiza sekwencji G1 w wyżej wspomnianych bankach danych oraz w testach przesiewowych wykazała również, iż G1 jest umiejscowione w pobliżu loci Mch4 i MACH na ludzkim chromosomienr 2, co wskazuje na bliskie pokrewieństwo pomiędzy genami, kodującymi wszystkie z tych białek, również na poziomiechromosomalnym.

(iv) Przynajmniej niektóre z izoform G1 (np. izoforma G1a z Fig. 1) mają rejon poniżej rejonu modułów MORT-1, który wykazuje podobieństwo z enzymatycznym, tj. proteazowym, rejonem MACH i Mch4, i jako takieG1 może być członkiem rodziny proteaz CED3/ICE.

(v) Obecność rejonu proteazopodobnego w przynajmniej niektórych z izoform G1 (np. G1a) wskazuje, iż G1 albo takie jego izoformy mogą być bezpośrednio zaangażowane w cytotoksyczność komórkową i zapalenie, powodowane przez różne bodźce, w tym receptory z rodziny receptorów TNF/NGF (np. FAS-R i p55-R) oraz inne, jak również które działają bezpośrednio albo pośrednio przez aktywność wewnątrzkomórkowych proteaz w celu wywołania komórkowej cytotoksyczności i zapalenia.

(vi) G1 może działać jako wzmacniacz albo intensyfikator aktywności innych białek, takich jak np. białka MACH i Mch4 (włącznie z ich różnymi izoformami), w mechanizmach wewnątrzkomórkowych prowadzących do cytotoksyczności komórkowej, zapalenia i innych związanych efektów, zachodzących za pośrednictwem receptorów z rodziny receptorów TNF/NGF i innych, które mają wspólne efektory wewnątrzkomórkowe. Efekt wzmacniający albo nasilający G1 (albo przynajmniej niektórych z jego izoform) może zachodzić poprzez związanie się G1 z tymi innymi białkami (jak wspomniano powyżej G1 wiąże się z Mch4 i być może wiąże się również z MACH i MORT-1) i nadanie im w ten sposób zdolności do wiązania się z MORT-1 (włącznie z samowiązaniem się MORT-1), albo działania niezależnie od MORT-1.

(vii) G1 możerównież działać jako inhibitor aktywności innych białek, a możetozachodzić dzięki temu, że G1 jest częścią kompleksu innych białek, z którymi się wiąże (np. Mch4, a być może również MACH i MORT-1), tym samym wpływając na ich cytotoksyczność w stopniu hamującym tę aktywność. Ponadto, w sposób analogiczny do wspomnianego powyżej, dotyczącego pewnych izoform MACH, jak również pewnych izoform Mch4, mogą również istnieć izoformy G1, które swoiście mają aktywność hamującą. Jedną z takich izoform G1 może być izoforma G1b, przedstawiona na Fig. 2, która ma dwa MODUŁY MORT-1, ale żadnego oczywistego rejonu proteazopodobnego o podobieństwie do innych znanych proteaz.

Po przeczytaniu niniejszego opisu dla specjalisty oczywiste będzie, że wynalazek można przeprowadzić przy szerokim zakresie równoważnych parametrów, stężeń i warunków, bez wykraczania poza jego zakres i bez nadmiernych doświadczeń.

Choć wynalazek ten opisano w połączeniu z jego konkretnymi wykonaniami, należy rozumieć, iż można go dalej modyfikować. To zgłoszenie patentowe obejmuje też wszelkie odmiany, zastosowania albo adaptacje wynalazków podlegające, w ogólności, zasadom wynalazku, włącznie z takimi odchyleniami od niniejszego ujawnienia, jakie wchodzą w zakres znanej albo powszechnej praktyki w dziedzinie, której dotyczy wynalazek i jakie można zastosować do zasadniczych cech podanych tu powyżej, jakprzedstawiono zakresie załączonych zastrzeżeń.

Wszystkie cytowane tu odniesienia, w tym artykuły albo skróty z czasopism, opublikowane albo amerykańskie albo zagraniczne zgłoszenia patentowe, udzielone amerykańskie albo zagraniczne patenty, albo wszelkie inne odniesienia, są w całości zawarte tu przez odniesienie, włącznie z wszystkimi danymi, tabelami, rysunkami i tekstem przedstawionym w cytowanych odniesieniach. Wszystkie cytowane odniesienia powołano tujakoliteraturę.

Odniesienie do etapów znanych sposobów, etapów konwencjonalnych sposobów, znanych sposobów albo konwencjonalnych sposobów nie jest w żaden sposób przyznaniem iż jakikolwiek aspekt, opis albo przykładowa realizacja niniejszego wynalazku jest przedstawiona, wyłożona albo zasugerowana w odnośnym stanietechniki.

Powyższy opis konkretnych realizacji w pełni ujawnia charakter wynalazku, tak że można go stosować wykorzystując tylko znaną wiedzę (włącznie z cytowanymi tu odniesieniami), łatwo zmodyfikować i/lub dostosować do różnych zastosowań takie konkretne realizacje, bez nadmiernych doświadczeń, bez wykraczania poza ogólną koncepcję wynalazku. Dlatego też takie dostosowania

PL 193 394 B1 i modyfikacje wchodzą wobręb znaczenia izakresu równoważników przedstawionych konkretnych realizacji,woparciuoprzedstawionetuwykładnieiwskazówki.Należy rozumieć,iżtutejszafrazeologiaiterminologiasłużącelowi opisuanieograniczenia,takżeterminologiaalbo frazeologia niniejszego opisu ma być interpretowana przez specjalistę wświetle zawartych tu wykładni i wskazówek i w połączeniu z wiedzą specjalisty.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1.SekwencjaDNA,kodującapolipeptydmającyaktywnośćbiałkaG1, który (i) ma zdolność wiązania się lub interakcji bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub z białkami wiążącymi MORT-1, lub innymi wewnątrzkomórkowymi białkami będącymi mediatorami/modulatorami;i (ii) ma zdolność pośredniczenia wwewnątrzkomórkowym działaniu, zachodzącym za pośrednictwemFAS-R albo p55-TNF-R, alboinnych cytotoksycznych mediatorów albo induktorów; wybrana zgrupyskładającejsięz:

(a) sekwencjiDNAkodującejizoformęG1osekwencjiaminokwasowejprzedstawionejnaFig.1;

(b) sekwencjiDNAkodującejizoformęG1osekwencjiaminokwasowejprzedstawionejnaFig.2 (c) sekwencji DNA kodującej przynajmniej część polipeptydu osekwencji aminokwasowej jak przedstawiona naFig. 1 lubFig. 2.

(d) sekwencjiDNAobejmującejprzynajmniejczęśćsekwencjiprzedstawionejnaFig.1ikodującejprzynajmniejjednąizoformębiałkaG1, izoformę G1a;

(e) sekwencjiDNAobejmującejprzynajmniejczęśćsekwencjiprzedstawionejnaFig.2kodującejprzynajmniejjednąizoformębiałkaG1, izoformę G1 b;

(f) sekwencji cDNA pochodzącej z regionu kodującego natywną izoformę białka G1 ;

(g) sekwencji DNA kodującej fragment, analog lub pochodną polipeptydu kodowanego przez sekwencjęDNAwybranąspośród(a)do(f);

(h) sekwencjiDNAzdolnejdohybrydyzacjizsekwencjąwybranąspośród(a)do(g)wumiarkowanie ostrych warunkach i która koduje biologicznieaktywnąizoformębiałkaG1;i (i) sekwencji DNA, która w wyniku właściwości kodu genetycznego jest zdegenerowanadosekwencjiDNA określonych w (a) do (h) i która koduje biologicznieaktywnąizoformębiałka G1.

2. Wektor zdolny do ulegania ekspresji wkomórce eukariotycznego lub prokariotycznego gospodarza, znamienny tym, że obejmuje sekwencję DNA określoną w zastrz. 1 .

3. Wektor według zastrz. 2, znamienny tym, że jest rekombinowanym wirusem zwierzęcym niosącym sekwencję DNA kodującąwirusowe białko powierzchniowe (ligand), zdolne do wiązania ze swoistymreceptorempowierzchniowymkomórkinapowierzchnikomórekniosącychFAS-Rlubp55-R idrugąsekwencjęobejmującąsekwencjęDNAokreślonąwzastrz.1.

4. Wektor według zastrz. 3, znamienny tym, że receptor powierzchniowy komórki jest specyficznydlakomóreknowotworowych,komórekzakażonychHIVlubinnychchorychkomórek.

5. Szczeptransformowanejkomórkigospodarzaeukariotycznegozawierającejwektorokreślony w zastrz. 2 albo 3.

6. Szczeptransformowanejkomórkigospodarzaprokariotycznegozawierającejwektorokreślony w zastrz. 2 albo 3.

7. Sposób wytwarzania polipeptydu o aktywności białka G1, znamienny tym,żeobejmujehodowanie szczepu transformowanej komórki gospodarza eukariotycznego lub prokariotycznego, zawierającejwektorokreślonywzastrz.2albo3wwarunkachodpowiednichdoekspresjipolipeptydu umożliwiających potranslacyjnemodyfikacje, jeżeli tokonieczne dla otrzymania i izolowania polipeptydu.

8. Polipeptyd o aktywności białka G1 , znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej:

i. izoformęG1osekwencjiaminokwasowejprzedstawionejnaFig.1;

ii. izoformęG1osekwencjiaminokwasowejprzedstawionejnaFig.2;

iii. przynajmniejczęśćpolipeptyduosekwencjiaminokwasowejjakpokazananaFig.1lubFig. 2;

iv. przynajmniejczęśćsekwencji przedstawionej na Fig.1 obejmującaprzynajmniejjedną izoformę białkaG1, izoformę G1 a;

PL 193 394 B1 i ma następujące własności:

a. mazdolnośćwiązanialubinterakcjibezpośredniolubpośredniozMORT.1i/lubzbiałkiem wiążącymMORT.1,alboinnymiwewnątrzkomórkowymibiałkamimediatorowymi/modulatorowymi;i

b. ma zdolność pośredniczenia w wewnątrzkomórkowym działaniu zachodzącym za pośrednic. twem FAS.R lub p55.TNF.R, lub innych cytotoksycznych mediatorów lub induktorów.

9. Sposób modulowania śmierci komórkowej albo procesów zapalnych in vitro, znamienny tym,żeobejmujetraktowaniekomórekjednymbądźwielomapolipeptydamiokreślonymiwzastrz.8, przyczymtraktowaniekomórekobejmujedostarczeniedokomórekjednegolubwięcejpolipeptydów wpostaci odpowiedniej do ich wewnątrzkomórkowego wprowadzenia lub dostarczenie do komórek sekwencji DNA określonej wzastrz. 1 w postaci odpowiedniego wektora niosącego tę sekwencję, któryjestzdolnydoskutecznegojejdostarczeniadokomórektak,żesekwencjaDNAjestwyrażana w komórkach.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że polipeptyd ma zdolność bezpośredniego lub pośredniego wiązania z MORT.1 i/lub z białkiem wiążącym MORT.1, który to MORT.1 z kolei wiąże się swoiście z FAS.IC, albo który jest zdolny do wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT.1 i/lubzbiałkiemwiążącymMORT.1,przyczymMORT.1zkoleiwiążesięzTRADD,którezkoleiwiąże sięzp55.IC.

11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że polipeptyd jest przynajmniej jedną z izoform G1 , jejanalogiem,fragmentemlubpochodną.

12. Sposób modulowania in vitro działania liganda FAS.R albo TNF na komórki posiadające FAS.R albo p55.R, znamienny tym,żeobejmujetraktowaniekomórekjednymalbowielomapolipep. tydamiokreślonymiwzastrz.8,przyczymtraktowaniekomórekobejmujedostarczeniedokomórek jednego lub więcej polipeptydów w postaci odpowiedniej do ich wewnątrzkomórkowego wprowadze. nia, lub dostarczenie do komórek sekwencji DNA określonej wzastrz. 1 kodującej jeden lub więcej polipeptydów w postaci odpowiedniego wektora niosącego tę sekwencję, który ma zdolność skutecz. negodostarczaniasekwencjidokomórektak,żesekwencjaDNAjestwyrażanawkomórkach.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że traktowanie komórek obejmuje dostarczenie do komórek polipeptydów, sekwencji DNA kodującej jeden ztych polipeptydów w postaci odpowied. niegowektoraniosącegotęsekwencję,którymazdolnośćskutecznegodostarczaniasekwencjido komórektak,żesekwencjaDNAjestwyrażanawkomórkach.

14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że traktowanie komórek odbywa się przez transfekcjękomórekrekombinowanymzwierzęcymwirusemjakowektoremokreślonymwzastrz.3.

15. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że polipeptyd ma zdolność wiązania się bezpo. średnio lub pośrednio z MORT.1 i/lub z białkiem wiążącym MORT.1, który to MORT.1 z kolei wiąże się swoiście z FAS.IC, albo który jest zdolny do wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT.1 i/lub z białkiem wiążącym MORT.1, który to MORT.1 z kolei wiąże się z TRADD, które z kolei wiąże się z p5.54C.

16. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym,żepolipeptydjestprzynajmniejjednązizoformG1, jejanalogiem,fragmentemlubpochodną.

17. Sposóbmodulowaniaśmiercikomórkowejlubprocesówzapalnych in vitro, znamienny tym, że obejmuje traktowanie komórek jednym lub więcej inhibitorami białek/enzymów pośredniczących w śmierci komórkowej lub w procesach zapalnych, które sąwybrane z grupy obejmującej:

(i) jeden lub więcej polipeptydów określonych wzastrz. 8 zdolnych do hamowania śmierci ko. mórkowej lub procesów zapalnych i (ii) inhibitoryjednego lub więcej polipeptydów określonych wzastrz. 8, które nasilają/wzmagają lub pośrednicząw śmierci komórkowej lub procesach zapalnych.

18. Sposób według zastrz. 17, znamiennytym, że polipeptyd ma zdolność bezpośredniego lub pośredniego wiązania z MORT.1 i/lub z białkiem wiążącym MORT.1, który to MORT.1 z kolei wiąże się swoiście z FAS.IC, albo który jest zdolny do wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT.1 i/lubzbiałkiemwiążącymMORT.1,przyczymMORT.1zkoleiwiążesięzTRADD,którezkoleiwiąże sięzp55.IC.

19. Sposób modulowania in vitro działanialigandaFAS.RlubTNFnakomórkiniosąceFAS.R lub p55.R, znamienny tym, że obejmuje traktowanie tych komórek sekwencją oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną dlaprzynajmniejczęści sekwencji DNAokreślonej wzastrz. 1, przyczymsekwencjaoligonukleotydowajestzdolnadoblokowaniaekspresjibiałka G1.

PL 193 394 B1

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że sekwencja oligonukleotydowa jest dostarczona do komórek przez wektor określony wzastrz. 3, wktórym druga sekwencja wirusowa koduje sekwencjęoligonukleotydową.

21. Sposób modulowania in vitro działanialigandaFAS-R lubTNF nakomórki niosące FAS-R lub p55-R, znamienny tym, że obejmuje stosowanie procedury rybozymu, wktórej wektor kodujący sekwencjęrybozymuzdolnądointerakcjizsekwencjąkomórkowegomRNAkodującąpolipeptydokreślonywzastrz. 8 wprowadza siędokomórekwpostaci,która umożliwiaekspresjęsekwencji rybozymu w komórkach i wktórym wytworzona w komórkach sekwencja rybozymu reaguje zkomórkową sekwencją mRNA iprzecina tę sekwencję mRNA powodując zahamowanie wyrażania polipeptydu wkomórkach.

22. Sposób według zastrz. 21 , znamienny tym, że polipeptyd ma zdolność wiązania się bezpośrednio lub pośrednio zMORT-1 i/lub zbiałkiem wiążącym MORT-1, który toMORT-1 zkolei wiąże się swoiście z FAS-IC, alboktóry jest zdolnydo wiązania się bezpośrednio lub pośrednio z MORT-1 i/lub zbiałkiem wiążącym MORT-1, który toMORT-1 zkolei wiąże się zTRADD, które zkolei wiąże sięzp5-54C.

23. Sposób według zastrz. 21 , znamienny tym,żepolipeptydjestprzynajmniejjednązizoformG1, jejanalogiem,fragmentemlubpochodną.

24. Sposóbizolowaniaiidentyfikowaniapolipeptyduokreślonego w zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje stosowanie procedury podwójnej hybrydy drożdżowej, wktórej drożdżowe komórki gospodarzatransformujesiędwomawektoramihybrydowymi,zktórychjedenniesiesekwencjękodującą białko MORT-1 i/lub białko wiążące MORT-1, a drugi wektor hybrydowy niesiesekwencjęzbiblioteki cDNA albo genomowego DNA, po czym stransformowane komórki izoluje się, następnie ekstrahuje się drugi wektor hybrydowy wcelu uzyskania sekwencji kodującej białko, które wiąże się zbiałkiem MORT-1 i/lub białkami wiążącymi MORT-1.

25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym,żepolipeptydjestprzynajmniejjednązizoformG1, jejanalogiem,fragmentemlubpochodną.

26. Sposób in vitro modulacjiwywoływanegoprzezMORT-1działanianakomórkibiałkawiążącegoMORT-1 albodziałaniawywoływanego przez inne białko, znamienny tym, że obejmujetraktowanie komórek sekwencją DNA określoną wzastrz. 1 w postaci odpowiedniego wektora niosącego taką sekwencję lub polipeptydem określonym wzastrz. 8, w postaci odpowiedniej do wprowadzenia dokomórek,przyczym traktowaniepowodujewzmocnieniealbohamowaniedziałaniazachodzącego za pośrednictwem MORT-1 albo białka wiążącego MORT-1 albo innego białka, a tym samym również działania zachodzącego za pośrednictwem FAS-R albo p55-R, albo innego mediatora alboinduktora cytotoksycznego.

27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że polipeptyd jest tą częścią polipeptydu, która jest swoiście zaangażowana wwiązanie się zMORT-1 albo białkiem wiążącym MORT-1 alboinnym białkiem.

28. Sposób według zastrz. 26 albo 27, znamienny tym,żepolipeptydjestdowolnązizoformG1 zdolną do wzmocnienia działania na komórki związanegozMORT-1 albo działania białka wiążącego MORT-1alboinnegobiałka,atymsamymrównieżdziałanianakomórkiFAS-Ralbop55-Ralboinnego mediatora bądź induktora cytotoksycznego.

29. Sposób in vitro modulowania procesów apoptozy albo procesów programowanej śmierci komórkowej, znamienny tym, że obejmuje traktowanie komórek jednym lub wieloma polipeptydami określonymiwzastrz.8,przyczymtraktowanieobejmujedostarczeniedokomórekjednegolubwięcej polipeptydów w postaci odpowiedniej do jego wewnątrzkomórkowego wprowadzenia, lub dostarczenie komórkom sekwencji DNAokreślonej w zastrz. 1 w postaci odpowiedniego wektora niosącego tę sekwencję, przy czym wektorjest zdolnydoskutecznegodostarczeniatejsekwencji do komórekwtaki sposób,żesekwencjaDNAjestwyrażanawtychkomórkach.

30. Sposóbprzesiewowegobadanialigandazdolnegodowiązaniasięzpolipeptydemoaktywności białka G1 określonym w zastrz. 8, znamienny tym, że kontaktuje się matrycę do chromatografii powinowactwa, doktórej przyłączony jest polipeptyd, zwyciągiem komórkowym, dzięki czemuligand zostajezwiązanyzmatrycą,poczymwymywasię,izolujeianalizujeligand.

31. Sposób przesiewowego badania sekwencji DNA kodującej ligand zdolny do wiązania się zpolipeptydemokreślonymwzastrz.8, znamienny tym, że obejmuje stosowanie procedury podwójnej hybrydydrożdżowej, wktórej drożdżowekomórkigospodarzatransformujesiędwomawektorami hybrydowymi z których jeden niesie sekwencję kodującą białko MORT-1 i/lub białko wiążące MORT-1

PL 193 394 B1 adrugi wektor hybrydowy niesie sekwencję zbiblioteki cDNA albo genomowego DNA, po czym stransformowanekomórkiizolujesięnastępnieekstrahujesiędrugiwektorhybrydowywceluuzyskania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z białkiem MORT-1 i/lub białkami wiążącymiMORT-1.

32.Sposóbidentyfikacjiiwytwarzanialigandazdolnegodomodulowaniakomórkowejaktywności modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem MORT-1 albo za pośrednictwem białek wiążących MORT-1, znamienny tym , ż e o b e j m u j e :

(a) badanieprzesiewowenaligandzdolnydowiązaniasięzpolipeptydemzawierającym przynajmniej część MORT-1 albo białkami wiążącymi MORT-1, wybranymi spośród białek MACH, białek Mch4iinnychbiałekwiążącychMORT-1;

(b) identyfikacjęischarakteryzowanieliganda,innegoniżMORT-1albobiałkawiążąceMORT-1 alboczęścireceptorazrodzinyreceptorówTNF/NGF,znalezionegonaetapieprzesiewania,zdolnego dowymienionegowiązania;oraz (c) wytwarzanie liganda w zasadniczo izolowanej i oczyszczonej postaci.

33.Sposóbidentyfikacjiiizolowanialigandazdolnegodomodulowaniaaktywnościkomórkowej modulowanej lub zachodzącej za pośrednictwem polipeptydu określonego wzastrz. 8, znamienny tym,żeobejmuje:

(a) badanie przesiewowe na ligand zdolny do wiązania się zpolipeptydem obejmującym polipeptyd kodowany przez DNA wybrany spośród (a) do (c) w zastrz. 1 ;

(b) identyfikacjęischarakteryzowanieligandainnegoniżMORT-1albobiałkawiążąceMORT-1 alboczęścireceptorazrodzinyreceptorówTNF/NGF,znalezionegonaetapieprzesiewania,zdolnego dowymienionegowiązania;oraz (c) wytwarzanie liganda w zasadniczo izolowanej i oczyszczonej postaci.

34.Sposóbidentyfikacjiiwytwarzanialigandazdolnegodo modulowania aktywności komórkowej modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem G1 , znamiennytym,żeobejmuje:

(a) badanie przesiewowe na ligand zdolny do wiązania się zpolipeptydem kodowanym przez DNA wybrany spośród (a) do (c) w zastrz. 1 (b) identyfikacjęischarakteryzowanieligandainnegoniżMORT-1albobiałkawiążąceMORT-1 alboczęścireceptorazrodzinyreceptorówTNF/NGF,znalezionegonaetapieprzesiewania,zdolnego dowymienionegowiązania;oraz (c) wytwarzanie liganda w zasadniczo izolowanej i oczyszczonej postaci.

35. Sposób identyfikacji i izolacji cząsteczki zdolnej do modulowania aktywności komórkowej modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem G1 , znamiennytym,żeobejmuje:

36.Sposóbidentyfikacjiiizolacjicząsteczkizdolnejdo bezpośredniego albo pośredniego modulowania aktywności komórkowej modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem polipeptyduokreślonego w zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje:

(a) badanie przesiewowe na cząsteczkę zdolną do modulowania aktywności modulowanej/zachodzącej za pośrednictwem polipeptydu określonego w zastrz. 8;

37. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalnynośnik, znamienna tym,żejakoskładnikaktywnyzawierasubstancjęwybranązgrupy składającejsięz:

(a) sekwencjiDNAokreślonejwzastrz.1;

(b) wektoraokreślonegowzastrz.3albo4;

(c) polipeptydu określonego w zastrz. 8.

38. Zastosowaniewektoraokreślonegowzastrz.4dowytwarzaniakompozycjifarmaceutycznej do leczenia nowotworów, AIDS lub innych chorób eksponujących swoiste receptory na powierzchni komórek.

39. ZastosowaniesekwencjiDNAokreślonejwzastrz.1dowytwarzaniakompozycjifarmaceutycznejdomodulowaniadziałanialigandaFAS-RlubTNFlubinnegobiałkadziałającegonakomórki lub do leczenia szoku septycznego, odrzucania przeszczepu, ostrego zapalenia wątroby, cukrzycy, stwardnienia rozsianego lub AIDS.

PL 193 394 B1

40. Zastosowanie wektora określonego w zastrz. 3 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania działania liganda FAS-R lub TNF lub innego białka na komórki lub do leczenia szoku septycznego, odrzucania przeszczepu, ostrego zapalenia wątroby, cukrzycy, stwardnienia rozsianego lub AIDS.

41. Zastosowanie polipeptydu o aktywności białka G1 określonego w zastrz. 8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania działania liganda FAS-R lub TNF lub innego białka na komórki lub do leczenia szoku septycznego, odrzucania przeszczepu, ostrego zapalenia wątroby, cukrzycy, stwardnienia rozsianego lub AIDS.