KR100544776B1

KR100544776B1 - 사멸 효과물질 도메인을 가진 ｃａｓｈ 및 ｆａｓ 수용체 기능을 조절하는 조절물질

Info

Publication number: KR100544776B1
Application number: KR1019997007790A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 왈치; 유라 고르체브; 안드레이 코발렌코; 유진 바르폴로미브; 바딤 브로디안스키
Original assignee: 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2006-01-23
Also published as: EA199900794A1; CA2281484A1; BG64799B1; NO994250D0; US20060216788A1; HK1024508A1; IL120759A0; NZ337143A; HUP0000913A3; EP0977842A1; WO1998039435A1; AU740223B2; NO994250L; HUP0000913A2; EE9900384A; SK117599A3; CN1148446C; US7419804B2; BR9808173A; CN1249780A

Abstract

MORT-1의 기능을 조절하는 단백질에 대해 설명한다. 또한, 이들 단백질을 인코드하는 DNA 서열 및 이들 단백질을 재조합에 의해 생산하는 것과 이들의 용도에 대해서도 설명한다.

Description

사멸 효과물질 도메인을 가진 ＣＡＳＨ 및 ＦＡＳ 수용체 기능을 조절하는 조절물질{CASH(CASPASE HOMOLOGUE) WITH DEATH EFFECTOR DOMAIN, MODULATORS OF THE FUNCTION OF FAS RECEPTORS}

본 발명은 TNF/NGF 슈퍼페밀리 수용체에 속하는 수용체 분야에 관한 것으로, 이들의 생물학적 기능을 조절하는 것에 관계한다. TNF/NGF 슈퍼페밀리 수용체에는 p55 및 p75 종양 괴사 인자 수용체(TNF-Rs는 CD120a 및 CD120b로 불리기도 하지만, 여기에서는 p55-R 및 p75-R로 통칭함), FAS 리간드 수용체(FAS/APO1 또는 FAS-R 또는 CD95로 불리기도 하지만, 이하에서는 FAS-R로 칭함)등의 수용체를 포함한다. 좀 더 구체적으로는 본 발명은 단백질 MORT-1(또는 FADD)에 결합하는 다른 단백질에 결합할 수 있는 신규한 단백질에 관한 것(이들은 소위 MORT-1-결합 단백질이라고 부름)이나 직접적으로 MORT-1에 결합하는 단백질에 관한 것으로써, 좀더 구체적으로는, G1이라고 통칭한 단백질에 관계하는데(현재까지 'CASPASE HOMOLOG'의 'CASH'라고 지정하였으나, 여기에서는 "G1"으로 통칭함), G1은 MORT-1-결합 단백질 Mch4(CASP-10로 지정함) 및 MACH라고 불리는 또 다른 MORT-1-결합 단백질(CASP-8라고도 함)에 결합하고, MORT-1 자체에 직접 결합할 수도 있다.

따라서, 본 발명은 일반적으로 MORT-1의 기능을 직접 간접적으로 조절 또는 중개할 수 있는 또는 MORT-1에 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질에 관계한다. 특히, 본 발명은 G1, 이를 만드는 방법 및 이의 용도뿐만 아니라, 다양한 G1의 새로운 동소체 및 이를 만드는 방법, 이의 용도에 관계한다.

종양 괴사 인자(TNF-α)와 임파톡신(TNF-β)(이하 TNF는 TNF-α와 TNF-β를 모두 말하는 것이다)는 단핵 식세포에 의해 주로 만들어지는 다기능 전(pro)-염증성 사이토킨으로 세포에 많은 영향을 준다(Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; and Beutler and Cerami (1987)). TNF-α와 TNF-β는 특정 세포 표면 수용체에 결합함으로써 이들의 영향이 나타난다. 일부 효과는 유기체에 유익한 것으로, 예를 들면, 이들은 종양 세포 또는 바이러스에 감염된 세포를 파괴하고, 입상세포의 항균 활성을 증가시킨다. 이와 같은 방식으로, TNF는 종양 및 감염성 물질에 대해 유기체의 방어기작에 관여하고, 이러한 손상으로부터 회복할 수 있도록 한다. 따라서, TNF는 항-종양 물질로 이용되어, 종양 세포 표면에 있는 이들 수용체에 결합함으로써, 종양 세포를 사멸에 이르게 한다. TNF는 또한 항-감염성 물질로 이용될 수도 있다.

그러나, TNF-α 및 TNF-β는 유해한 효과를 가지기도 한다. 몇 가지 질병에서는 TNF-α의 과도한 생산으로 인하여 주요 병인 역할을 한다는 증거가 있다. 예를 들면, 맥관구조에서 주로 TNF-α의 효과는 폐혈증 쇼크 증상의 주요 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Tracey et al., 1986). 일부 질병에서, TNF는 지방세포의 활성을 억제하여, 식욕감퇴를 일으켜 괴도하게 체중이 감소되는 원인(악액질)이 되어, TNF-α를 카테친(cachetin)이라고도 한다. 또한, 류마티스 질환에서는 조직 파괴를 조적하는 중개물질로 설명되고(Beutler and Cerami, 1987), 이식편-숙주 반응에서 관찰되는 손상의 주요 중개물질이라고도 한다(Piquet et al., 1987). 또한, TNF는 염증 과정 및 많은 다른 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다.

두 개 별개의 독립적으로 발현되는 수용체인 p55 및 p75 TNF-Rs(각각 특이적으로 TNF-α 및 TNF-β에 결합됨)는 상기에서 설명하는 TNF의 생물학적 효과를 개시하고 조절한다. 이와 같은 두 개 수용체는 구조적으로 다른 세포내 도메인을 가지고 있기 때문에 이들은 다른 시그날을 만든다고 한다(Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; and Heller et al., 1990)). 그러나, 예를 들면, p55 및 p75 TNF-Rs의 세포내 시그날 발생에 관계하는 다양한 단백질 및 다른 가능한 인다의 세포내 메카니즘에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. TNF(α또는 β)와 같은 리간드가 수용체에 결합한 후에 발생하는 세포내 시그날은 일련 반응이 시작되도록 하여 결국 TNF에 대해 세포의 관찰된 반응이 나타나게 하는 것이다.

현재까지 연구된 대부분 세포에서 상기에서 설명하는 TNF의 세포파괴 효과에 있어서, 이와 같은 효과는 주로 p55 TNF-R에 의해 촉진되었다. p55 TNF-R의 세포외 도메인(리간드 결합 도메인)에 대한 항체 자체가 세포파괴 효과를 촉진하는데(EP 412486참고), 이는 항체에 의해 수용체 교차 연결의 효과와 관련이 있는 것으로 세포내 시그날 발생 과정의 발달의 처음 단계로 보인다. 또한, 돌연변이 연구에 따르면(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993), p55 TNF- R의 생물학적 기능은 세포내 도메인의 보전성에 따라 달라지고, 따라서, TNF의 세포파괴 효과를 유도하는 세포내 시그날는 p55 TNF-R의 두 개 이상 세포내 도메인이 연합된 결과로 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, TNF(α및 β)은 동종삼량체로 발생되기 때문에, 수용체 분자에 결합하여, 교차 연결되는 방법(가령, 수용체 응집을 일으키는)으로 p55 TNF-R를 통하여 세포내 시그날을 유도하는 것으로 알려져 있다.

TNF/NGF 슈퍼패밀리 수용체의 또 다른 요소는 FAS 수용체(FAS-R)로 이는 FAS 항원으로 불리기도 하였는데, 이는 다양한 조직에서 발현되는 세포 표면 단백질로써, TNF-R 및 NGF-R를 포함하는 다수의 세포-표면 수용체와 상동성을 공유한다. FAS-R는 아포프토시스 형태로 세포 사멸을 중개하고(Itoh et al., 1991), T 세포가 성숙되는 동안에 자가활성을 가지는 T 세포의 네가티브 선택물질로써 작용하는 것으로 보인다. FAS-R는 자체-항원을 인지하는 T 세포의 아포프토시스성 사멸을 중개한다. FAS-R 유전자(lpr)에서 돌연변이는 쥐에서 임파증식 질환을 일으키는 것으로 알려져 있는데, 이 질환은 사람의 자가면역 질환 전신 홍반성 낭창(SLE)(Watanabe-Fukunaga et al., 1992)과 유사하다. FAS-R에 대한 리간드는 킬러 T 세포(또는 세포독성 T 임파세포-CTLs)에 의해 운반되는 세포-표면 연합된 분자인 것으로 보이고, CTLs이 FAS-R를 가지는 세포와 접촉하였을 때, FAS-R를 가지는 세포의 아포프토시스성 세포 사멸을 유도할 수 있다. 또한, FAS-R에 특이적인 단클론 항체를 준비하고, 이와 같은 단클론 항체는 사람 FAS-R를 인코드하는 cDNA에 의해 형질변환된 생쥐 세포를 포함하는 FAS-R를 가지는 세포에서 아포프토시스성 세포 사멸을 유도할 수 있다(Itoh et al., 1991).

임파세포의 일부 세포독성 효과는 광범위하게 발생되는 세포 표면 수용체 FAS-R(CD95)와 임파세포가 생산하는 리간드의 상호작용에 의해 중개되어, 세포 사멸을 촉진시키는데, T 임파세포이외의 다른 다양한 정성 세포는 이들의 표면에 FAS-R를 발현시키고, 이들 수용체에 의해 자극을 받아 죽게된다는 것을 알았다. 특정 질환에서 이와 같은 치사 과정이 무절제하게 유도되어 세포 손상을 시키는 것으로 보이는데, 예를 들면, 급성 간염에서 간 세포가 파괴되는 경우가 된다. 따라서, FAS-R의 세포 독성 활성을 억제하는 길을 찾는 것이 치료요법적으로 유익한 것이다.

역으로, 특정 악성 종양 세포 및 HIV-감염된 세포는 이들의 표면에 FAS-R을 가지고 있다는 것을 알았기 때문에, FAS-R에 대한 항체 또는 FAS-R 리간드를 이용하여 이들 세포에서 FAS-R에 의해 중개되는 세포독성 효과를 자극할 수 있어, HIV-감염된 세포 또는 악성 종양 세포와 싸울 수 있는 수단을 제공한다(Itoh et al., 1991). 따라서, FAS-R의 세포독성 활성을 강화시키는 또 다른 방법을 찾는 것이 치료요법적으로 효과가 있다.

TNF (α또는 β) 및 FAS-R 리간드에 대한 세포 반응을 조절하는 방법을 제공하는 것이 오랜 숙원 사업이었다. 예를 들면, 상기에서 설명하는 질병상태에서, TNF 또는 FAS-R가 과다 발현된 경우에, TNF- 또는 FAS-R 리간드에 의해 유도되는 세포파괴 효과를 저해하는 것이 바람직하고, 다른 상황 가령, 상처 치유 과정에서는 종양 세포 또는 HIV-감염된 세포에서 TNF 효과를 강화하거나, FAS-R의 경우에는 FAS-R 중개된 효과를 강화시키는 것이 바람직하다.

출원인은 다수의 출원(EP 186833, EP 308378, EP 398327, EP 412486)에서 TNF 수용체에 이것이 결하보디는 것을 저해하여 TNF의 유해한 효과를 조절하는 것에 대해 연구를 하였는데, 이때 세포 표면에 결합된 TNF-Rs에 TNF가 결합되는 것과 경쟁을 시키기 위해 가용성 TNF 수용체(수용체의 가용성 세포외 도메인이 필수적)를 이용하거나 항-TNF 항체를 이용하였다. 또한, TNF의해 효과를 유도하기 위해서는 TNF 수용체에 TNF가 결합해야 한다는 기본 조건하에, 출원인은 TNF-Rs의 활성을 조절함으로써 TNF 효과를 조절하도록 하였다(EPO 568925).

간단하게 설명하면, EPO 568925는 TNF-Rs에서 시그날 변환을 조절 또는 절단하는 방법에 관한 것으로, 펩티드 또는 다른 분자는 수용체 자체 또는 단백질과 상호작용할 수 있는 다른 효과물질과 상호작용하여, TNF-Rs의 정상 기능을 조절한다. EPO 568925에서는 p55 TNF-R의 세포외 도메인, 막통과 도메인, 세포내 도메인에 돌연변이을 가지는 다양한 p55 TNF-Rs 돌연변이를 작제하고, 이의 특징을 조사하였다. 이와 같은 방식으로, 수용체의 기능가령, 리간드(TNF)의 결합, 이어서 시그날 변환 및 세포내 시그날 생성시켜, 종국에는 세포에서 TNF에 의해 유도되는 효과가 발생하는데 있어서 필수적인 p55 TNF-R의 상기 도메인에 있는 부분이 있다는 것을 확인하였다. 또한, TNF-R의 상기 다양한 도메인에 결합할 수 있는 단백질, 펩티드 또는 다른 인자를 분리 및 확인하는 여러 가지 방법에 대해 설명하는데, 단백질, 펩티드 및 다른 인자는 TNF-R의 활성을 조절 또는 변조하는데 관계한다. 이와 같은 단백질 및 펩티드를 인코드하는 DNA 서열의 분리 및 클로닝하는 방법; 이들 단 백질 및 펩티드를 생산하기 위한 발현 벡터의 작제 방법; TNF-R의 다양한 부분에 겨랍하는 상기 단백질 및 펩티드 또는 TNF-R와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편을 준비하는 방법등이 EPO 568925에 설명되어 있다. 그러나, EPO 568925에서는 TNF-Rs의 세포내 도메인(가령 p55 TNF-R)에 결합할 수 있는 실제 단백질 및 펩티드를 특정화시키지 못하였고, TNF-Rs의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 이와 같은 단백질 및 펩티드를 분리 및 확인하기 위해 이스트 두 개 하이브리드 방법에 대해서도 설명하지 않았다. 유사하게, EPO 568925에서는 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 대해서 설명하지 못하였다.

따라서, TNF EH는 FAS-R의 효과를 저해하고자 할 경우에, 세포 표면에서 TNF-Rs 또는 FAS-R의 활성 양을 감소시키는 것이 바람직하고, TNF 또는 FAS-R 리간드의 효과를 강화시킬 필요가 있을 경우에는 TNF-Rs 또는 FAS-R의 활성 양을 증가시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서, p55 TNF-R 및 p75 TNF-R의 프로모터를 서열화하고, 분석하여, 다양한 전사 조절 인자에 특이적인 다수의 주요 서열 모티프를 발견하였고, 프로모터 수준에서 TNF-Rs의 발현을 조절할 수 있는데, 예를 들면, 수용체 수를 감소시키기 위해서는 프로모터로부터 전사를 저해하고, 수용체 수를 증가시키기 위해서는 프로모터로부터 전사를 강화시킨다(EP 606869 및 WO 9531206). FAS-R 유전자의 프로모터 수준에서 FAS-R를 조절하는 것에 관한 연구는 현재 진행중이다.

종양 괴사 인자(TNF) 수용체 및 세포에서 구조적으로 관련된 수용체 FAS-R가 백혈구 세포에 의해 생산되는 리간드에 의해 파괴 활성을 촉진시켜, 소멸되도록 하는 것은 공지되어 있지만, 이와 같은 자극 메카니즘에 대해서는 아는 것이 별로 없다. 돌연변이 연구에 따르면, 세포 독성을 위한 FAS-R 및 p55 TNF 수용체(p55-R) 시그날 발생은 세포내 도메인내에 별개 부분이 관여한다는 것을 알았다(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). 이들 부분("사멸 도메인" 또는 'DED'이라고 불리는 "사멸 효과 물질 도메인")은 유사한 서명을 가진다. FAS-R 및 p55-R의 "사멸 도메인"은 자체-연합하는 경향이 있다. 이와 같은 자체-연합이 실제 수용체 응집을 촉진시키고, 이와 같은 응집은 시그날 발생을 개시하는데 필수적이며(see Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), 상당 수준의 수용체가 발현되는 경우에 리간드와는 무관한 시그날 발생이 일어난다(Boldin et al., 1995).

임파세포의 일부 세포독성 효과는 임파세포에 의해 생성되는 리간드와 세포 사멸을 촉진시키는 능력을 가지는 광범위하게 발생되는 세포 표면 수용체인 FAS-R (CD-95)와의 상호작용에 의해 중개되고(Nagata and Golstein, 1995); 단핵 식세포에 의한 세포 사멸은 리간드-수용체 결합, TNF 및 이의 수용체 p55-R(CD120)이 관련되는데, 이는 FAS-R 및 이의 리간드와 구조적으로 관련이 있다(Vandenabeele et al., 1995). 다른 수용체에 의해 유도되는 효과와 같이, TNF 수용체 및 FAS-R에 의해 유도되는 세포 족음 유도는 리간드-수용체 결합으로 시작되는 일련의 단백질-단백질 상호작용을 통하여, 결국 효소 효과물질의 기능이 활성화됨으로써 발생되는 것으로, 수용체에 삼량체 TNF 또는 FAS-R 리간드 분자가 결합하여 세포를 죽게하는 시그날이 개시되는 비-효소 단백질-단백질 상호작용을 설명하였는데, 자체 연합하는 사멸-도메인 모티프(또는 즉음 효과물질 도메인, DED)의 성질(Boldin et al., 1995a)에 의해 증가되고, 수용체의 세포내 도메인에 대해 두 개 세포질 단백질 즉, MORT-1(또는 FADD)가 FAS-R에 결합(Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) 및 TRADD가 p55-R에 결합(Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996)되는 것을 유도하여 이들 세포내 도메인의 상호작용이 나타나게 된다는 것이다(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). 이스트 두 개 하브리드 스크리닝 과정을 통하여, 연합된 상동 부분을 통하여 수용체에 의해 세포 사멸이 유도되는데에는 "사멸-도메인" 부분에서 FAS-R 및 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 세 가지 단백질이 관련된다는 것과 독립적으로 세포 사멸을 촉진할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 단백질 중에 하나는 MORT-1 (Boldin et al. 1995b)로써, FAS-R에 특이적으로 결합하는 FADD(Chinnaiyan et al., 1995)으로도 알려진 것이다. 두 번째 것은 p55-R에 결합하는 TRADD(see also Hsu et al., 1995, 1996)이고, 세 번째 것은 FAS-R 및 p55-R에 결합하는 RIP(see also Stanger et al., 1995)이다. FAS-R 및 p55-R에 결합하는 것이외에도, 이들 단백질은 서로 결합하여, FAS-R 및 p55-R 사이에 기능적으로 "교차"할 수 있는 능력을 가진다. 이와 같은 결합은 수용체 및 연합 단백질에 공통인 "사멸 도메인 모듈"("사멸 효과물질 도메인"의 약어인'DED'라고 부름)인 보존된 서열 모티프를 통하여 발생된다. 또한, 이스트 두 개 하이브리드 테스트에서, MORT-1는 포유류 세포에서 자발적으로 FAS-R에 결합하나, 이와 같은 결합은 수용체의 자극이 있어야만 발생되기 때문에, MORT-1가 FAS-R 시그날 발생의 초기 단계에 관여하고, MORT-1에는 효소 활성 특징이 있는 임의 서열 모티프를 가지고 있지 않으며, 따라서, 세포 사멸을 촉진시키는 이들의 능력은 MORT-1 자체의 고유 활성이 관여되는 것이 아니라, MORT-1에 결합하여 시그날발생 일련 반응의 하류에서 작용하는 일부 다른 단백질의 활성에 의한 것이 아닌가 하는 제안을 하였다. 분자의 N-말단이 없는 MORT-1 돌연변이를 세포내에 발현시키면, FAS/APO1(FAS-R) 또는 p55-R에 의한 세포 독성 유도가 차단되는 것을 볼 수 있기 때문에(Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), N-말단이 단백질-단백질 상호작용을 통하여 수용체의 세포파괴 효과에 대한 시그날을 전달하는 것임을 알 수 있다.

최근 연구에 따르면, 생리학적으로 다양한 세포 사멸 과정의 개시에서 케노르하브디키스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 프로테아제 CED3 및 포유류 인터루킨-1β전환 효소(ICE)와 구조적으로 관련이 있는 세포질 티올 프로테아제 집단이 관련된다는 것이다(Kumar, 1995 and Henkart, 1996). 또한, 이들 페밀리에 속하는 프로테아제는 FAS-R 및 TNF-Rs에 의해 유도되는 세포-독성에 참여한다는 것이다. 특정 펩티드 저해물질 프로테아제 및 이들의 기능을 차단하는 두 개 바이러스에 인코드된 단백질 즉, 우두 단백질 crmA 및 베큘로바이러스 p35 단백질은 이와 같은 세포 독성에 대해 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다(Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). CED3/ICE 페밀리의 프로테아제에 의해 중개되는 특정 세포 단백질의 신속한 절단은 FAS-R 또는 TNF-Rs의 자극후에 바로 세포에서 설명될 수 있을 것이다.

카스파제(caspases)라고 불리는 이와 같은 CED3/ICE 프로테아제는 비활성 전구물질로 생성되어, 사멸 유도시에 단백질 분해 과정에 의해 활성화되는 것을 알 수 있다. 이와 같은 카스파제는 아스파라테이트 잔기의 특정 세포 단백질을 절단하는 보존된 시스테인 프로테아제로써, 모든 공지의 예정된 세포 사멸 과정에서 중요한 역할을 한다. 성숙한 프로테아제가 유도되는 상동성 C-말단 부분에 추가하여, 전구체 단백질에는 독특한 N-말단 부분을 포함한다. 특이적인 조절 분자와 함께 이들의 "프로도메인" 상호작용으로 인하여 다른 사멸-유도 시그날에 의해 다야안 카스파제가 차별적으로 활성화되는 것이 가능하도록 한다(Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Duan and Dixit, 1997; Van Criekinge et al., 1996; Ahmad et al., 1997).

MORT-1 결합 단백질이고, MORT-1의 활성을 조절하고, MORT-1과는 독립적으로 작용하는 MACH(CASP-8라고도 함) 이와 같은 프로테아제 및 이의 다양한 동소체, 이후로는 FAS-R 및 p55-R라고 통칭하는 것을 최근에 분리하여, 클론시켜 특징을 조사하였고, 이의 용도는 현재 공동 출원중인 IL 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 및 PCT출원 PCT/US96/10521 그리고 발명자의 최근 논문(Boldin et al., 1996)에서 설명하고 있다. Mch4(CASP-10라고도 함)라고 칭하는 또 다른 프로테아제 및 이의 다양한 동소체(저해제 포함)도 본 발명자 및 다른 이들(Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996)에 의해 분리되고 특징이 조사되었다. 이와 같은 Mch4는 MORT-1의 활성을 조절하는 MORT-1 결합 단백질로써 FAS-R 및 p55-R와 같은 것으로 이또한 MORT-1와는 별개로 작용한다. 따라서, 상기 공보에는 Mch4의 모든 특징, 용도등이 상세하게 기술되어 있다.

카스파제 MACH(CASP-8) 및 Mch4(CASP-10)는 유사한 프로도메인을 가지는데(see Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincent and Dixit, 1997), MORT-1과 프로도메인의 상호작용을 하는데, 이때 상호작용은 MACH(CASP-8) 및 Mch4(CASP-10)에 중복하여 준재하고, MORT-1의 N-말단에 존재하는 "사멸 도메인 모티프" 또는 "사멸 효과물질 도메인", DED를 통하여 이루어지는 것이다(Boldin et al., 1995b; Chinnalyan et al., 1995).

상기에서 세포 사멸을 유도하는 세포내 시그날 발생 과정에 관여하는 다양한 단백질/효소/수용체는 다양한 이름을 가지고 있다. 혼란을 방지하기 위해서, 새로운 규정에 의해 결정된 새로운 이름을 포함하는 여기에서 사용되는 각 단백질, 그 일부분 등의 다양한 이름을 정리하였다.

통상적인 이름 또는 처음 사용된 이름	다른이름	새로운 규정에 의한 이름	사용된 이름
p55 TNF receptor	p55-R	CD120a	p55-R
p75 TNF receptor	p75-R	CD120b	p75-R
FAS receptor	FAS-R, FAS/AP01	CD95	FAS-R
MORT-1	FADD
MORT-1
MACH	FLICE1, Mch5	CASP-8
MACH
Mch4	FLICE2	CASP-10	Mach4
G1	-	CASH	G1
'사멸 도메인'	사멸 도메인 모티프	-	사멸도메인/
	MORT 모티프, 사멸		사멸 도메인 모티프
효과물질 도메인(DED)			MORT 모듈
	MORT 모듈
CED3/ICE 프로테아제	카스파제	CASP	CED3/ICE 프로테아제

발명의 요약

본 발명의 목적은 MORT-1-결합 단백질에 결합할 수 있는 또는 MORT-1 자체에 결합할 수 있는 신규한 단백질(모든 동소체, 유사체, 유도체, 이의 단편을 포함)에 관한 것으로 예를 들면, 상기에서 언급한 것과 같은 Mch4 및 MACH 단백질 및 이의 동소체를 제공하는 것이다. MORT-1 자체는 FAS-R의 세포내 도메인에 결합하기 때문에, 본 발명의 신규한 단백질은 MORT-1 결합 단백질에 결합하여 또는 MORT-1에 간접적으로 결합하여 또는 MORT-1 단백질에 직접적으로 결합하여, FAS 수용체에 FAS 리간드가 결합되어 개시되는 세포내 시그날 발생 과정에 영향을 줄수 있고, 본 발명의 이와 같은 단백질은 세포에서 FAS-R가 중개하는 효과의 조절물질이 된다. MORT-1는 또한 p55-R 조절에 관계하여 세포에서 TNF 조절에 관련하여, 본 발명의 신규한 단백질은 세포에서 p55-R에 의해 중개되는 TNF-효과의 조절물질이 된다. 유사하게, 세포에서 FAS-R 및 p55-R의 조절을 분석함으로써, 본 발명의 단백질이 관련된 통상의 또는 관련된 세포내 시그날 발생 과정을 통하여, 본 발명의 단백질(G1 및 이의 동소체)은 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질의 조절물질 또는 중개물질이 된다. 본 발명의 이와 같은 신규한 단백질은 "G1" 단백질이라고 하고, 상기에서 언급한 것과 같이, "G1"(하기에서 예를 든 것) 및 이의 모든 동소체, 유사체, 단편 또는 유도체를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 G1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 유도체에 대한 길항물질(가령, 항체, 펩티드, 유기 화합물 또는 일부 경우에 동소체)을 제공하여 시그날 발생 과정 좀더 구체적으로는 원하는 경우에 세포-독성을 저해하는데 이용한다.

본 발명의 또 다른 목적은 수용체 활성을 조절하는데 관련된 추가 단백질 또는 인자를 분리하고 특징화하는데 있어서, 신규한 G1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체를 이용하고, 그리고 신규한 G1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체가 결합하는 시그날 발생 과정의 상류에 있는 다른 수용체(가령, FAS-Rs 및 관련 수용체)를 분리 및 확인하는데 이용하고, 이와 같은 단백질로는 신규한 단백질이 생물학적으로 활성을 가질 수 있도록 절단하는 다른 프로테아제등이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 G1 단백질 및 프로테아제 활성을 가지는 G1 동소체(G1 단백질은 Mch4 및 MACH의 단백질 분해 부분에 상동인 부분을 가지는)에 결합하거나 상호작용하여, 이들의 세포내 활성을 저해하는 저해물질을 제공하는데, 일부 G1 동소체의 경우에는 단백질분해성 활성을 가진다.

또한, 본 발명의 목적은 다클론성 또는 단클론성 항체를 만드는데 항원으로 신규한 G1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체를 이용하는 것에 관계한다. 이와 같이 만들어진 항체는 세포 추출물 또는 형질변환된 세포주와 같은 다른 소스로부터 새로운 단백질을 정제하는데 이용된다.

또한, 이와 같은 항체를 진단 목적으로 이용하는데, 가령, FAS-R 또는 다른 관련 수용체에 의해 중개되는 비정상적인 세포 기능과 연관된 질환을 확인하는데 이용된다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 구성된 제약학적 조성물 뿐만 아니라 상기 항체 또는 다른 길항물질로 구성된 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, MORT-1에 결합하는 Mch4에 결합하거나 상호작용할 수 있고, FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 신규한 단백질 G1을 분리하였다. G1은 MACH라고 불리는 또 다른 MORT-1-결합 단백질과도 상호작용을 하는데, 이는 MORT-1와 직접적으로 결합하거나 상호작용할 수 있다. G1은 세포 표면에서 FAS-R에 FAS-리간드가 결합함으로써 개시되는 세포-사멸 과정의 조절 성분으로 작용하고, Mch4 및 MACH의 단백질분해성 부분과 유사한 단백질분해 부분을 가지기 때문에 G1은 세포내 활성 프로테아제일 것이다. 또한, G1의 발현 특히, 단백질분해성 부분에서 전사.해독 과정에 따라, 일부 G1 동소체는 단백질분해성 부분없이 발현될 수도 있고, 이는 Mch4 및 MACH에 의해 중개되는 단백질분해 활성의 길항물질로 작용할 수 있다. FAS-R에 의해 촉진되는 아포프토시스성 과정에 CED3/ICE 페밀리 프로테아제가 관련되어 있다. MORT-1(또는 FADD)는 수용체가 활성화될 때, FAS-R의 세포내 도메인에 결합되어, 본발명의 신규한 G1 단백질은 Mch4와 같은 MORT-1-결합 단백질, MACH 및 MORT-1에 직접적으로 결합한다. 본 발명에 따라 클론되고, 특징화된 G1 단백질은 여러 가지 동소체로 존재할 수 있는데, 일부 동소체는 단백질분해성 활성(단백질분해성 도메인)을 가지는 CED3/ICE 상동부분을 가지는데, 이는 Mch4 및 일부 MACH 동소체의 것과 유사하고, 이들이 세포에서 발현되는 경우에는 세포 사멸의 원인이 된다. 따라서, FAS-R에 의해 이와 같은 신규한 CED3/ICE 상동부분(가령, 다양한 G1 동소체는 단백질분해성 도메인을 가짐)이 활성화되면 FAS-R-중개된 세포 사멸 경로의 효과 성분으로 구성된 것으로 알 수 있다.

또한, G1은 세포 표면에 p55-R에 TNF가 결합되어 개시되는 세포-사멸 과정의 효과 성분으로 작용을 하는데, 이과정은 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 단백질인 TRADD에 MORT-1이 간접적으로 결합하고(Hsu et al., 1995), 이후에, Mch4 또는 MACH와 같은 MORT-1-결합 단백질에 G1이 결합하거나 또는 G1이 MORT-1에 직접적으로 결합하여, G1이 활성 프로테아제로 활성화됨으로써 세포를 죽게하는데 관련된다.

G1은 CED3/ICE 프로테아제 기능의 중요한 특징을 발휘하지만, 독특한 조직/세포 특이적인 작용방식을 제공하기 위해 고유의 별개 서열 특징을 가지는 것으로 보인다.

따라서, 본 발명에 따라, G1으로 지칭한 신규한 단백질을 제공한다. 이와 같은 G1 단백질은 두가지 하이브리드 스크리닝 검사를 이용하여 분리 및 클로닝하였고, 이는 Mch4에 결합하는 분자라는 것을 알았다. 상기에서 설명한 것과 같이 Mch4는 세포 사멸에 영향을 줄 수 있는 MORT-1-결합 단백질인데, 일부 경우에 Mch4 동소체는 세포를 죽이는 것을 방해하는 반대 효과를 가질 수도 있다. 또한, G1의 서열이 밝혀졌는데, 서열에는 MORT-1-결합 단백질 MACH 및 Mch4에서도 발견되는 소의 'MORT MODULES'(MM)로 불리는 N-말단 부분을 가진다는 것이다. G1에 이와 같은 MORT MODULES은 Mch4에 결합하는 능력을 설명하고, MORT-1에 직접적으로 결합하는 가능성 및 MACH 또는 특정 MACH 동소체(MACH의 특정 접합 변이체)에 결합에 대한 기초가 된다. G1 서열에서 MORT MODULES을 포함하는 N-말단 부분의 하류에는 MACH 및 Mch4의 단백질분해 부분과 유사한 것을 나타내는 긴 부분이 있는 것으로 보인다. 또한, 사람 염색체에서 G1 서열의 위치를 처음 분석하였을 때, G1은 Mch4 및 MACH의 위치에 매우 가까운 염색체 2에 위치하는 것으로 나타나, G1, MACH, Mch4사이에 관계를 암시한다.

좀더 구체적으로는, 본 발명에 따르면, 적어도 3가지 가능성있는 G1 동소체가 발견되었다(하기 실시예 1 참고). 이들중 두 개를 분리하여 클론하였는데, 이들은 G1(또는 CASH)로 지정한 신규 단백질의 두 가지 접합 변이체로 나타났다. 이와 같은 두 가지 동소체중에서 더 큰 것은 G1α(또는 CASHα)라 하고, 더 작은 것은 G1β(또는 CASHβ)라고 한다(더 작은 동소체는 한 개 작은 동소체보다 많지만, G1β는 G1β1으로 지정하고, 다른 작은 동소체는 G1β2로 지정한다; 하기 실시예 1 참고). 이와 같은 G1α 및 β동소체에는 각각 N-말단 사멸 도메인 모티프/MORT MODULES을 포함하고, 이들 사멸 도메인 모티프를 통하여 서로 결합할 수 있고, 또한 이들 사멸 도메인 모티프를 통하여 MORT1, MACH, Mch4에 결합할 수도 있다. 더 긴 G1α동소체는 독측한 C-말단 부분(더 작은 G1β동소체에 비교하여)을 가지는데, 이와 같은 독특한 C-말단 부분은 카스파제 프로테아제 활성 부분과 상동인 서열을 가진다. 생물학적 활성에 있어서, 더 작은 G1β동소체는 p55-R 및 FAS-R에 의해 중개되는 세포 사멸/세포 독성을 저해하지만, 대조적으로 더 긴 G1α동소체는 적어도 일부 세포에서(가령, 293세포) 세포 독성 효과를 나타내는 것으로 보아서, 더 긴 G1α동소체는 다른 세포 형(HeLa 세포)에서 FAS-R 및 p55-R에 의해 중개되는 세포독성을 저해할 수 있다는 것을 알 수 있다. 이와 같은 결과에 따르면, G1(즉, 이의 다양한 동소체)는 p55-R 및 FAS-R의 감쇠기/저해물질 또는 개시물질/강화물질로 작용한다는 것이다.

분명하게 하기 위해, G1α 및 G1β와 같은 다양한 G1 동소체는 간단하게 'G1'로 칭하나 이들 경우에도, "G1"에는 G1의 모든 동소체가 포함되며, 이는 세포 독성의 유도물질/증강물질 뿐만 아니라 저해물질/감쇠물질을 의미한다. 특정 G1 동소체를 나타내고자 할 경우에는 특정하게 G1α 또는 G1β로 명명한다. 다양한 동소체를 집합적으로 언급할 때 'G1'은 조절물질이라고 하지만, 이 의미에는 문제의 생물학적 활성을 저해 또는 증강시킨다는 것도 포함된다.

전술한 관점에서 볼 때, G1은 MORT-1 활성의 조절물질이 분명하고, FAS-R 및 p55-R에 의해 중개되는 세포 효과의 조절물질 뿐만 아니라 공통적인 세포내 시그날발생 성분 및 메카니즘을 공유하는 TNF/NGF 수용체 페밀리 및 다른 패밀리의 다른 수용체에 의해 조절되는 세포 효과를 조절하는 것이다.

따라서, G1은 프로테아제와 비슷한 부분(적어도 긴 동소체의 경우)을 가지고 있기 때문에, TNF/NGF 수용체 페밀리 및 다른 수용체를 통하여 전달되는 자극등을 포함하는 다양한 자극에 의해 또는 유도되는 세포 독성 및 염증에 직접적으로 반응을 하는 것이다.

G1은 다른 복합 단백질의 일부분으로 존재하여 세포 독성 및 염증의 저해물질로도 작용하여, 이들 다른 단백질(가령, MACH, Mch4, MORT-1)의 세포 독성 및 염증 효과에 영향을 주고, 결국에는 세포독성 활성의 방해 또는 염증반응에서 이들의 활성을 방해하게 된다.

G1은 또한 세포 독성 및 염증의 강화 또는 보강 물질로 작용하는데, 다른 단백질(Mch4, MACH, MORT-1)에 결합하고, 이들을 다시 보충시켜 MORT-1에 결합하도록 하거나 MORT-1와는 무관하게 작용하도록 하여, 이들 다른 단백질(Mch4, MACH, MORT-1)의 활성을 증강시키는데, 어느 경우이든 간에, 보충과정은 다양한 단백질의 세포 독성 활성증 증가시키거나 또는 이들의 염증 효과를 증가시키는 것이 된다.

유사하게, G1은 G1이 관련된 경로를 가지는 다른 세포내 중개물질 또는 조절물질의 증강물질 또는 저해물질로 작용한다.

MORT-1('Mediator of Receptor Toxicity', Boldin et al., 1995b)은 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있다. 이와 같은 FAS-결합 단백질은 세포 표면에 FAS-R 리간드의 결합 후에 통상적으로 발생되는 세포내 시그날 발생 과정을 중재 또는 조절함으로써 세포에서 FAS-R 리간드 효과의 조절물질 또는 중개물질로 작용하는 것으로 보인다. FAS-결합 특이성에 추가하여, MORT-1는 또 다른 특징을 가지는 것으로 보이는데(실시예 1 참고), 예를 들면, p55-TNF-R 및 FAS-R(p55-DD 및 FAS-DD)의 "사멸 도메인"(DD)에 상동인 부분을 가지고 있어, 자체 연합할 수 있다. MORT-1는 또한 자체에서 세포 독성을 활성화시키는 능력이 있고, 즉, 자가연합 능력에 관련된 활성을 가진다. 또한, MORT-1부분에서 "사멸 도메인" 상동 서열(MORT-1의 C-말단에 있는 MORT-DD)을 포함하는 부분이 동시에 발현되면, FAS-유도된 세포 사멸을 강하게 간섭하는 것을 알 수 있는데, 이는 FAS-IC의 "사멸 도메인"에 결합하는 능력으로 예측할 수 있는 것이다. 또한, 동일한 실험 조건에서, MORT-DD를 포함하지 않는 MORT-1의 부분(MORT-1의 N-말단 부분, 아미노산 1-117, "MORT-1 머리부")가 공동 발현되면, FAS-유도된 세포 사멸을 간섭하지 않으며, FAS-유도된 세포 독성을 강화시킨다.

따라서, MORT-1는 세포내 시그날발생 과정에 관련된 다른 단백질에 결합할 수 있을 것이다. 이와 같은 MORT-1-결합 단백질은 MORT-1의 활성을 중개 또는 조절함으로써 세포에서 FAS-R 리간드 효과를 간접적으로 조절하는 중개물질 또는 조절물질로 작용하고; 이와 같은 MORT-1 결합 단백질은 MORT-1의 활성을 조절 또는 중개함으로써 MORT-1-연합된 세포내 시그날발생 과정을 조절 또는 중개하는 물질로 작용할 수 있으며, 이는 상기에서 언급한 바와 같이 세포 독성을 활성화시키는 능력과는 별개의 것으로 보인다. 이와 같은 MORT-1-결합 단백질을 표준 스크리닝 과정에서 이용하여, MORT-1-연합된 또는 FAS-R 연합된 시그날발생 과정에 관련된 또는 다른 세포내 시그날발생 과정의 성분이 될 수도 있는 추가 단백질, 펩티드, 인자, 항체등을 분리, 확인 및 특징을 조사할 수 있다. 이와 같은 MORT-1-결합 단백질을 분리하고, 설명한 내용이 이스라엘 특허 IL 114,615, 114,986, 115,319, 116,588, 117,932 및 이에 상응하는 PCT 출원 PCT/US96/10521(MACH 및 이의 동소체에 관련됨) 및 Fernandes-Alnemr et al(1996), Srinivasula et al(1996)(Mch4 및 다른 'Mch'단백질에 관련됨)에서 설명하고 있다. 이들 MORT-1-결합 단백질중 한 개와 상기에서 설명하는 MACH를 처음으로 클론하고, 서열화하여 부분적으로 다음과 같은 특징이 있다는 것을 알았다; MACH cDNA는 ORF-B 오픈-리딩 프레임을 인코드하고; MACH는 매우 강력하고 특이적인 방식으로 MORT-1에 결합하고; MORT-1에서 MACH 결합 부분은 MORT-1 "사멸 도메인"의 상류에 있고, MACH의 ORF-B 부분은 MORT-1의 상호작용하는 부분이고; MACH는 자체 연합할 수 있는 것으로 자체에서 세포 독성을 유도할 수 있다. 또한, 상기에서 언급한 것과 같은 공동 출원에서 제시된 추가 분석 및 Boldin et al. (1996)의 의견에 따르면, MACH는 실제 여러 가지 동소체형으로 존재한다는 것이다. 또한, 상기에서 언급한 것과 같이 MACH ORF-B는 MACH 동소체 중의 한 개(MACHβ1로 지정)이다. Mch4에 관계된 내용에 따르면, 이들 단백질은 MORT-1(또는 FADD)에 결합하고, MORT-1와 함께 또는 이와는 독립적으로 단백질 분해 활성을 통하여 세포-독성에 직접적으로 관련된다.

따라서, 본 발명은 MORT-1에 결합하는 또는 직간접적으로 상호작용할 수 있는 또는 Mch4, MACH와 같은 임의 MORT-1-결합 단백질에 결합하거나 상호작용할 수 있는 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 DNA 서열을 제공하는데, 이때 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 FAS-R 또는 p55-TNF-R에 의해 중개되는 세포내 효과를 중개할 수 있고, G1 단백질, 동 소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 직접 또는 간접적으로 다른 세포내 단백질의 세포내 효과를 중개 또는 조절할 수 있다.

특히, 본 발명은 다음과 같이 구성된 DNA 서열을 제공한다;

(a) 고유 G1 단백질의 코딩 부분에서 유도된 cDNA 서열;

(b) 생물학적으로 활성이 있는 G1 단백질을 인코드하고, 중간정도의 스트린젼트 조건하에서 (a)서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열; 그리고

(c) 생물학적으로 활성이 있는 G1 단백질을 인코드한고, (a) 및 (b)에서 정의된 것과 같은 DNA 서열에 대한 유전자 코드로 축중할 수 있는 DNA 서열.

본 발명의 상기 DNA 서열의 또 다른 구체예는 G1의 적어도 한 개의 동소체를 인코드하는 서열의 일부분으로 구성된 DNA서열이다. 상기 DNA 서열의 또 다른 구체예는 도 1에서 나타낸 것과 같은 G1 단백질을 인코드하는 서열(G1α동소체)이다. 또다른 구체예는 도 2에서 나타낸 것과 같은 제 2 G1 동소체(G1β동소체)이다.

본 발명은 본 발명의 서열에 의해 인코드된 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 제공하는데, 이와 같은 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 MORT-1에 결합하거나 또는 직간접적으로 상호작용할 수 있고 또는 Mch4 또는 MACH와 같은 MORT-1-결합 단백질에 결합하거나 또는 직간접적으로 상호작용할 수 있고, FAS-R 또는 p55 TNF-R에 의해 중개되는 세포내 효과를 중개하거나 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체가 직간접적으로 결합할 수 있는 유도물질의 임의 다른 세포독성 중개물질에 의한 세포내 효과를 중개한다.

본 발명의 특정 구체예는 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유 도체이다. 또 다른 구체예는 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체의 동소체이다.

또한 본 발명은 상기 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 벡터를 제공하는데, 벡터에는 본 발명의 DNA 서열을 포함하며, 이들 벡터는 진핵 또는 원핵 숙주 세포에서 발현할 수 있으며; 이와 같은 벡터를 포함하는 형질변환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포; 본 발명의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이때 생산하는 방법은 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 발현시키기 위한 적절한 조건하에서 형질변환된 숙주 세포를 생장시키고, 이와 같은 단백질을 얻는데 필수적인 해독후 변형을 제공하고; 형질변환된 세포의 배양 배지 또는 형질변환된 세포 추출물로부터 발현된 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 추출하는 단계로 구성된다.

또 다른 측면에서는 본 발명은 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에 특이적인 항체 또는 이의 활성 유도체 및 단편을 제공한다.

발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명의 DNA 서열 또는 단백질의 다양한 용도를 제공하는데, 일반적으로는 다음에 이용된다;

(A) 세포 사멸 또는 염증 과정을 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 세포를 본 발명의 한가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 처리하고, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내에 한가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하는데 적합한 형태로 하여, 이들을 도입하거나 또는 한가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 가지는 벡터를 이용하여 이들을 인코드하는 서열을 세포로 도입하는데, 이들 벡터는 서열이 세포내에서 발현될 수 있도록 세포로 서열을 삽입할 수 있어야 한다; 그리고

(B) 세포 사멸 또는 염증 반응을 조절하는 방법에 이용하는데, 이 방법은 세포 사멸 또는 염증 반응을 조절할 수 있는 한 가지 이상의 단백질/효소의 조해물질로 세포를 처리하는데, 이때 저해물질은 (i) 세포 사멸 또는 염증 반응을 저해할 수 있는 한 가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체; (ii) 한 가지 이상의 G1 단백질이 세포 사멸 또는 염증 반응을 보강/강화 또는 중개할 경우에 한가지 이상의 G1 단백질의 저해물질에서 선택된다.

좀더 구체적으로는 본 발명의 방법은 다음의 구체예를 포함한다;

(i) FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포에 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 MORT-1에 결합하는 또는 Mch4 또는 MACH와 같은 MORT-1-결합 단백질에 직간접적으로 결합하는 능력을 가지는 한 가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체로 세포를 처리하는 것으로 구성되는데, 이때 MORT-1은 FAS-R의 세포내 도메인에 바로 결합하거나 MORT-1 또는 상기에서 언급한 것과 같은 MORT-1-결합 단백질에 직간접적으로 결합하고; MORT-1는 또한 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 TRADD에 결합하여, FAS-R 또는 p55 TNF-R의 활성을 조절 또는 중개할 수 있고, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내로 도입하는데 적합한 형으로 한 가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하거나 또는 한가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 가지는 적합한 벡터를 이용하여 세포내로 이들을 인코드하는 뉴클레오티드를 도입하고, 이때 벡터는 서열이 세포내에서 발현될 수 있도록 세포에 서열을 삽입할 수 있는 능력을 가진다;

(ii) 상기 (i)에 따른 세포에서 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절하는 방법에 이용되는데, 이때 세포를 처리하는 방법은 세포내로 도입하는데 적합한 형으로 한 가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 도입하거나 또는 한가지 이상의 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열을 가지는 적합한 벡터를 이용하여 세포내로 이들을 인코드하는 뉴클레오티드를 도입하고, 이때 벡터는 서열이 세포내에서 발현될 수 있도록 세포에 서열을 삽입할 수 있는 능력을 가진다;

(iii) 상기(ii) 방법으로, 이때 세포를 처리하는 방법은 재조합 동물 바이러스 벡터로 세포에 트랜스펙트시키는데, 이 단계는 다음과 같다;

(a) 재조합 동물 바이러스 벡터를 작제하는데, 벡터는 FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포의 표면에서 특이적인 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 바이러스성 표면 단백질(리간드)를 인코드하는 서열과 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에서 선택된 단백질을 인코드하는 제 2 서열을 가지는데, 이때 제 2 서열은 세포에서 발현되었을 때, FAS-R 또는 p55-R의 활성을 조절 또는 중개할 수 있는 능력을 가지고;

(b) (a)벡터를 세포에 감염시킨다.

(iv) FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포에서 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 본 발명에 따른 항체, 이의 활성 단편 또는 이의 유도체로 세포를 처리하는데, 처리하는 방법은 세포에 항체, 이의 단편 및 이의 활성 유도체를 포함하는 적절한 조성물을 제공하고, G1단백질의 일부분이 세포외 표면에 노출될 경우에, 조성물은 세포외로 적용할 수 있도록 제조하고, G1 단백질이 전적으로 세포내에 있는 경우에는 조성물은 세포내 제공용으로 제조한다.

(v) FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포에서 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 본 발명의 G1 단백질 서열의 적어도 일부분의 안티센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열로 세포를 처리하고, 이때 올리고뉴클레오티드 서열은 G1 단백질의 발현을 차단할 수 있다.

(vi) 종양 세포 또는 HIV-감염된 세포 또는 다른 질병에 걸린 세포를 치료하기 위한 (ii)에서와 같은 방법에 이용되는데, 이때 그 방법은 다음과 같다;

(a) 재조합 동물 바이러스 벡터를 작제하는데, 벡터는 특이적인 종양 세포 표면 수용체 또는 HIV-감염된 세포 표면 수용체 또는 다른 질환이 있는 세포가 가지는 수용체에 결합하는 바이러스성 표면 단백질을 인코드하는 서열과 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에서 선택된 단백질을 인코드하는 제 2 서열을 가지는데, 이때 제 2 서열은 종양, HIV-감염된 세포 또는 다른 질병이 있는 세포에서 발현되었을 때, 세포를 죽일 수 있는 능력을 가지고;

(b) (a)벡터를 세포에 감염시킨다.

(vii) 세포에서 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 방법에 이용되는데, 이는 리보자임 과정을 이용하는 것으로써, 본 발명에 따른 G1 단백질을 인코드하는 세포 mRNA 서열과 상호작용할 수 있는 리보자임 서열을 인코드하는 벡터를 세포에 도입시켜, 세포에서 리보자임 서열이 발현될 수 있도록 하고, 리보자임 서열이 세포에서 발현되었을 경우에, 세포 mRNA 서열과 상호작용하여, mRNA 서열을 절단하게 하여, 세포에서 G1 단백질의 발현을 저해하게 한다.

(viii) 본 발명에 따른 방법에서 선택된 방법에 이용되는데, 이때 G1 단백질을 인코드하는 서열은 본 발명에 따른 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체중 하나로 구성되는데, 이와 같은 단백질은 MORT-1에 직간접적으로 결합할 수 있거나 또는 Mch4 및 MACH와 같은 MORT-1-결합 단백질에 직간접적으로 결합할 수 있고, 이때 MORT-1는 FAS-IC에 특이적으로 결합하고, MORT-1는 p55-IC에 결합하는 TRADD에 결합한다.

(xi) MORT-1 단백질 또는 MORT-1-결합 단백질에 직간접적으로 결합할 수 있는 본 발명에 따른 단백질을 분리하고, 확인하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 이스트 두 개 하이브리드 과정을 이용하는데, 한 개 하이브리드 벡터에는 MORT-1 단백질 또는 MORT-1-결합 단백질을 인코드하는 서열이 있고, 두 번째 하이브리드 벡터에는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리의 서열을 가지고 있어, 이 벡터를 이용하여 이스트 숙주 세포를 형질변환시키고, 양성으로 형질변환된 세포를 분리하고, 제 2 하이브리드 벡터를 추출하여, MORT-1 단백질 또는 MORT-1-결합 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 인코드하는 서열을 얻는다.

(x) (i)-(ⅸ)중 임의 방법에 이용되는데, 이때 G1 단백질은 G1 단백질, 동소 체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체중 하나가 된다.

(xi) (i)-(ⅸ)중 임의 방법에 이용되는데, G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체가 직간접적으로 결합할 수 있는 임의 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질에 의해 조절 또는 중개되는 세포 효과를 조절하는데 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체이 관련된다.

(xii) 펩티드, 유기 화합물, 항체등과 같은 다른 물질을 스크리닝하는 방법에 이용되는데, 예를 들면, G1 활성을 저해할 수 있는 특정 약물을 얻을 수 있는데, 가령, G1α프로테아제 활성을 저해하여, 세포 독성을 저해하거나 G1β활성을 저해하여, 세포 독성을 강화시킨다.

상기 (xii) 스크리닝 방법으로는 다음의 예를 포함한다;

(1) 상기에서 언급하는 것과 같이, G1 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하는 방법이 있는데, 이 방법은 단백질이 부착된 친화력 크로마토그래피 매트릭스에 세포 추출물을 접촉시켜, 리간드가 매트릭스에 부착되게 하여, 리간드를 용출시키고, 분리시켜, 분석하는 것으로 구성된다.

(2) 본 발명의 G1 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 인코드하는 DNA 서열을 스크리닝하는 방법이 있는데, 이 방법은 이스트 두 개 하이브리드 과정을 이용하는데, 한 개 하이브리드 벡터에는 단백질을 인코드하는 서열을 포함하고, 제 2 하이브리드 벡터에는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 선택된 서열을 포함하고, 이들 벡터를 이스트 숙주 세포에 형질도입시키고, 양성적으로 형질변환된 세포를 분리하여, 세포 하이브리드 벡터를 추출하여, 리간드를 인코드하는 서열을 얻는다.

(3) MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질에 의해 조절/중개되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하고 생산하는 방법이 있는데, 이 방법은 다음과 같이 구성된다;

a) MACH 단백질, Mch4 단백질, 다른 MORT-1-결합 단백질에서 선택된 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질의 일부분으로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 스크린하고;

b) 스크린 단계에서 결합할 수 있는 것으로 발견된 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 또는 TNF/NGF 수용체 페밀리의 수용체의 일부분 이외의 리간드를 확인하고, 특징화하고; 그리고

c) 실제 분리된 정제된 형태의 리간드를 생산한다.

4) 본 발명의 G1 단백질에 의해 중재 또는 조절되는 세포 활성을 조절하는 리간드를 확인하고 생산하는 방법이 있는데, 이는 다음과 같이 구성된다;

a) 도 1에 설명하는 G1α서열의 일부분 또는 도 2에 설명하는 G1β서열의 일부분으로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하고;

c) 실제 분리된 정제된 형태의 리간드를 생산한다.

5) G1 단백질에 의해 중재 또는 조절되는 세포 활성을 조절하는 리간드를 확인하고 생산하는 방법이 있는데, 이는 다음과 같이 구성된다;

a) 도 1에 설명하는 G1α서열의 일부분 또는 도 2에 설명하는 G1β서열의 일부분에 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하고;

c) 실제 분리된 정제된 형태의 리간드를 생산한다.

6) G1 단백질에 의해 중재 또는 조절되는 세포 활성을 직간접적으로 조절하는 분자를 확인하고 생산하는 방법이 있는데, 이는 다음과 같이 구성된다;

a) G1에 의해 중개되는 활성을 조절할 수 있는 분자를 스크리닝하고;

b) 분자를 확인하고, 특징화하고; 그리고

c) 실제 분리된 정제된 형태의 분자를 생산한다.

7) 본 발명의 G1 단백질에 의해 중재 또는 조절되는 세포 활성을 직간접적으로 조절하는 분자를 확인하고 생산하는 방법이 있는데, 이는 다음과 같이 구성된다;

b) 분자를 확인하고, 특징화하고; 그리고

c) 실제 분리된 정제된 형태의 분자를 생산한다.

본 발명은 또한, 세포에서 FAS-R 리간드 또는 TNF-효과를 조절하는 제약학적 조성물을 제공하거나 또는 상기에서 언급한 것과 같이 세포에서 임의 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질의 효과를 조절하는 제약학적 조성물을 제공하는데, 이 때 제약학적 조성물은 다음중 하나를 활성 성분으로 포함한다;

(i) 본 발명에 따른 G1 단백질, 생물학적으로 활성을 가지는 단편, 유사체, 유도체;

(ii) 본 발명에 따른 G1 단백질, 생물학적으로 활성을 가지는 단편, 유사체, 유도체를 인코드하고, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 인코드하는 재조합 동물 바이러스성 벡터;

(iii) 본 발명에 따른 G1 단백질 서열의 안티-센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열, 이때 올리고뉴클레오티드는 상기(ii)의 재조합 동물 바이러스 벡터의 제 2 서열이 된다.

본 발명은 다음을 제공한다;

I. 세포에서 MORT-1에 의해 유도된 효과 또는 MORT-1-결합 단백질에 의해 유도된 효과 또는 임의 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질에 의한 효과를 조절하는 방법으로, 상기 (i)-(x)중 임의 방법에 따라, 세포를 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체 또는 G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 서열로 처리하여, MORT-1-중개된 효과를 강화 또는 저해하여, FAS-R 또는 p55-R-중개된 효과 또는 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질의 효과를 강화 또는 저해한다.

Ⅱ. 상기 방법에서, G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 또는 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질에 결합하는데 있어서, 특별하게 관계하는 G1 단백질의 일부분이 되고, 또는 G1 단백질 서열은 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 또는 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질에 결합하는데 있어서, 특별하게 관계하는 G1 단백질의 일부분을 인코드한다.

Ⅲ. 상기 방법에서, G1 단백질은 G1 동소체로, 이때 동소체는 MORT-1-연합된 효과 또는 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질 연합된 효과를 강화시킬 수 있어, 세포에서 FAS-R- 또는 p55-R-연합된 효과를 강화시키거나 또는 세포에서 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질 효과를 강화시킨다.

Ⅳ. 상기 방법에서, G1 단백질은 G1 동소체로, 이때 동소체는 MORT-1-연합된 효과 또는 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질 연합된 효과를 저해시킬 수 있어, 세포에서 FAS-R- 또는 p55-R-연합된 효과를 저해시키거나 또는 세포에서 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질 효과를 저해시킨다.

상기에서 설명된 것과 하기에서 설명할 것에서, G1은 MORT-1와는 독립된 방식으로 세포 또는 조직을 치료하는데 이용될 수 있다. 단백질을 분리 및 확인하는데 이용되는 표준 스크리닝 기술을 이용하여 G1 단백질의 분리, 확인 및 특징화를 실행하는데, 예를 들면, 이스트 두 개 하이브리드 방법, 친화력 크로마토그래피 방법 및 이와 같은 목적에 이용되는 임의 공지된 다른 표준 과정을 이용할 수 있다.

또한, 일부 G1 동소체는 단백질과 유사한 부분(다른 공지의 프로테아제의 전술한 프로테아제 부분에 상동인)을 가지나, 실제 프로테아제 활성을 가지지 못하기 때문에, 이와 같은 동소체는 주로 상기에서 언급한 것과 같이 저해 역할을 한다.

또한, G1 또는 이의 임의 동소체는 MORT-1-무관한 세포내 경로를 조절하는데 관여하는 것으로, G1 또는 이의 임의 동소체는 임의 다른 세포내 경로 또는 메카니즘의 시그날 발생의 조절에도 관여할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 구체예는 다음의 발명의 상세한 설명에 기술한다.

여기에서 사용된 용어중, "세포에서 FAS-리간드 또는 TNF 효과 조절" 및 "세포에서 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 효과의 조절"은 in vitro 및 in vivo 처리를 모두 포함하고, 조절에는 저해, 강화 및 증강 작용이 포함된다.

도 1A는 실시예 1에서 설명하는 G1 단백질의 한가지 동소체의 예비 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 1B는 도 1A의 동소체의 유추된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2는 실시예 1에서 설명하는 G1 단백질의 제 2 동소체의 예비 뉴클레오티드 서열 및 유추된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 사람(hCASHα, hCASHβ) G1(또는 CASH) 및 생쥐(mCASHα) 접합 변이체의 아미노산 서열을 비교하였고, 이들 단백질에서 발견되는 보존된 모티프를 나타내었다. 도 3에서는 생쥐 G1α(mCASHα), 사람 G1α(hCASHα) 및 G1β(hCASHβ), CASP-8(MACH/FLICE1/Mch5), CASP-10(Mch4/FLICE2), CASP-3(CPP32/Apopain/Yama), CASP-1(ICE)의 아미노산 서열을 동일선상에 배열하였다. CASP-1 및 CASP-3는 프로도메인 부분없이 나타내었다. 아미노산 잔기는 각 서열의 우측에 번호를 매겼다. 점선은 서열에서 틈을 나타내는 것으로 배열을 최적으로 할 수 있도록 한다. "사멸 도메인"(DED)은 빗금으로 나타내었다. 나타낸 단백질중 세 개 이상에서 동일한 아미노산은 박스로 표시하였다. 프로테아제 상동성 부분내에, X-선 결정에 의해 촉매 활성이 있는 것으로 보이는 CASP-1 잔기와 배열된 아미노산은 다음과 같이 나타낸다; CASP-1에서 His237 및 Cys285에 상응하는 촉매에 관련된 잔기는 어둡게 표시하고, 배열 아래에 원으로 표시를 하였다. CASP-1에서 Arg 179, Gln 238, Arg 341, Ser347에 상응하는 P1 Asp의 카르복실레이트 측쇄용 결합 주머니로 구성된 잔기는 다소 옅은 색으로 표시하고, 열린 원으로 표시하였다. G1(CASH)에서 유사한 위치에서 발견된 공지의 Asp-X 절단 부위 및 가능성이 있는 절단 부위는 빗금으로 표시하였다. 수평 화살은 CASP-1의 크고 작은 유닛의 N-맏람 및 C-말단을 나타낸다. 단백질의 C-말단은 *를 하였다.

도 4(A, B)는 사람의 다양한 조직(심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골근육, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 결장, 말초 혈액 임파세포-PBL)에서 G1 전사체를 확인하는 노던 블랏의 방사능사진을 재생한 것이다. 노던 블랏 분석은 다음과 같이 한다; T7 RNA 폴리메라제(Promaga)를 이용하여, G1의 "사멸 도메인"(DED) 모듈 부분(G1β에서 뉴클레오티드 482-1070(도 2)에 상응하는 부분으로 클론된 G1(CASH) 접합 변이체에 공통인 부분)에 상응하는 방사능라벨된 mRNA 프로브를 준비하고, 이를 이용하여 사람의 다양한 조직의 폴리(A)+ RNA(2㎍ per lane)을 포함하는 사람의 다중 조직 블랏(Clontech)을 분석한다.

도 5는 트랜스펙트된 이스트(가령, MORT1/FADD, MACHα1 (CASp-8α1), MACHβ1(CASP-8β1), MACHβ4(CASP-8β4), Mch4 (CASP-10), Glα(CASHα), G1β(CASHβ), p55-R (p55ic), RIP, TRADD , 라민(음성 기준))내에 다른 "사멸 도메인"(DED)-를 포함하는 단백질과 G1α(CASHα) 및 G1β(CASHβ)의 상호작용 결과를 나타낸 것이다. pGBT9-GAL4 DNA-결합 도메인, pGAD1318, pGADGH-GAL4 활성화-도메인 벡터를 이용하여 이스트 SFY526 균주(Clontech)에서 G1β(CASHβ) 및 G1α(CASHα)의 결합 성질을 평가하였다. 실시예 1-3에서 볼 수 있는 것과 같이 β-갈락토시다제 발현 필터 검사에 의해 이스트에서 결합된 양을 측정한다. 결과는 강한 색깔이 발생되는데 필요한 시간으로 나타낸다. 테스트된 모든 경우에서, DNA-결합 도메인 및 활성화-도메인 수조에 테스트 삽입물을 배치하였을 때 동일한 결과를 얻는다. 검사된 삽입물은 몇 가지 기준 단백질 가령, 사람의 세포내 도메인 p55-R(CD120a), p75-R(CD120b), CD40, 라민, 빈 Gal4 벡터를 포함하는 것과는 상호작용을 하지 않았다.

도 6(A-D)은 세포 생존 및 세포 사멸 유도에서 G1α(CASHα), G1β(CASHβ), G1α(CASHα) 돌연변이의 효과를 나타내는 결과를 나타낸다. 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 지적한 구조를 세포에 트랜스펙트시켜, HeLa-Fas 세포(결과는 도 6A의 막대 그래프로 나타냄), 293-T 세포(결과는 도 6B 및 6C에 막대 그래프로 나타냄)에서 유도된 세포 둑음을 정량화하였다. 인산칼슘 침전방법을 이용하여, 세포(5 ×10⁵ 293T 세포 또는 3 ×10⁵ HeLa 세포/6-㎝ 접시 기준)에 지적한 단백질의 cDNA와 pCMV-β-gal를 함께 일시적으로 트랜스펙트시킨다. 각 접시에는 관심이 있는 5㎍ pcDNA3를 트랜스펙트시키고, 두 개 다른 구조를 트랜스펙트시킬 경우에는 각 2.5㎍ 및 1.5㎍ β-갈락토시다제 발현 벡터로 트랜스펙트시킨다. 세포는 트랜스펙션후 6-10시간 후에 씻어내고, 추가 처리 없이 14시간 동안 배양한다. 항-CD95(Anti-Fas-R) 단클론 항체(CH11 (Oncor (Gaithersburg, MD))), 0.5㎍.㎖) 및 사람 재조합 TNFα(100ng/㎖)를 사이클로헥시미드(CHX, 10㎍/㎖)와 함께 세포에 제공하고, 추가 4시간동안 배양한다. 그 다음 세포는 5-브로모-4-클로로-3-인독실-β-D-갈락토피라노시드(X-Gal)로 착색시키고, 상 대비 현미경으로 검사한다. 나타낸 모든 실험에서 HeLa-Fas 세포의 경우에는 트랜스펙션후 24시간에 사멸을 평가하였고, 293T 세포의 경우에는 트랜스펙션후 20시간에 사멸을 평가하였다. 나타낸 데이타(평균 ±SD; n은 적어도 세 가지 실험과 동일함)은 막에 수포가 나타나는 푸른색 세포의 비율로 나타낸다.

도 6D에서는 지적한 구조체를 일시적으로 발현시키는 293-T 세포의 형태를 나타내는 사진이다. 사진은 트랜스펙션 후 20시간에 찍은 것이다.

본 발명은 MORT-1 또는 Mch4 및 MACH와 같은 MORT-1-결합 단백질에 직간접적으로 결합할 수 있어, MORT-1가 결합하는 FAS-R 수용체에 결합할 수 있고, 단백질 TRADD가 결합하는 그리고 TRADD 단백질 MORT-1가 결합하는 p55 TNF-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 신규한 단백질 G1에 관계한다. 여기에서, 본 발명의 G1 단백질은 FAS-R에 FAS-R 리간드가 결합하여 개시되는 시그날 발생 과정에 중요한 역할을 하는, 또한 p55-R에 TNF가 결합하여 개시되는 시그날 발생 과정에 중요한 역할을 하는 FAS-R 중개물질 또는 조절물질이다. 본 발명의 G1 단백질에는 새로 발견된 G1 및 이의 동소체가 포함된다.

좀더 구체적으로는 본 발명에 따르면, 선충류 프로테아제 CED3과 실제 상동인 신규한 단백질 G1(CASH)에 대해 설명한다. 매우 밀접한 관계에 있기는 하나, 신규한 단백질 G1은 구조 및 기질 특이성에서 약간 상이하고, 포유류 세포에서 다소 다른 기능을 한다. 또한, 두 가지 다른 프로테아제 성질은 이미 공지된 사실이다. ICE(CASP-1라고도 부름)의 주요 역할은 IL-1β전구물질을 프로세싱하는 것이도, CED3는 예정된 세포 사멸의 효과물질로 작용하는 것이 분명하다. 후자의 역할은 일부 포유류 유사체 역할을 하는 것으로 보이는데, 예를 들면, 공동 계류중인 출원에서 언급한 MACH(CASP-8라고도 부름)의 동소체 뿐만 아니라 본 발명의 G1이 결합하는 관련된 Mch4(CASP-10라고도 부름)의 역할을 한다. MACHα1의 아미노산 서열은 CED3의 가장 가까운 동소체로 알려진 CPP32(CASP-3라고도 부름)와 매우 닮은 것으로 나타났으나, 단 MACHα1은 CPP32보다는 기질 특이성이 다소 제한된 것이 차이점이다. CPP32는 폴리(ADP 리보즈)폴리메라제(PARP)에 절단부위에 상응하는 기질 펩티드를 선호적으로 절단하나, IL-1β전구물질에 있는 ICE 절단 부위에 상응하는 펩티드에 대해 어느정도 단백질분해성 활성을 가진다. 그러나, MACHα1는 PARP-유도된 서열을 유일하게 절단하는 것으로 보인다. CPP32 및 CED3에 대한 MACHα1의 관계 및 ICE와 차이는 CED3와 유사하게 MACHα1이 세포 사멸의 조절물질로 작용할 것이라는 생각과 일치한다. MACHα1은 CED3, CPP32 뿐만 아니라 CED3/ICE 페밀리와는 구별되는 성질을 가진다. CED3/ICE 상동 부분의 상류인 MACHα1의 C-말단은 임의 다른 상동체의 상류 부분과 전혀 닮지 않았다. 단백질의 CED3/ICE 상동 부분에 일부 독특한 서열이 있다. 이와 같은 차이는 MACHα1가 페밀리에서 별개의 진화 가지를 가진다는 것을 의미하고, 이는 CED3/ICE 페밀리에서 설명된 것과는 다소 차이가 있는 세포 사멸에 관여한다는 것을 의미한다. 본 발명의 G1 단백질과 유사하게 G1 서열내에 CED3/ICE 상동 부분에 어느 정도 별개의 차이를 가지고, 이와 같은 차이는 포유류 세포에서 활성의 특이성을 반영하는 독특한 성질을 나타낸다.

한 가지 중요한 차이는 프로테아제 기능을 조절하는 방법에 관한 것이다. 발생학적으로 관련된 세포 사멸 과정 및 수용체에 의해 유도되는 면역 세포용해과정에서 관련되었고, CED3/ICE 페밀리의 프로테아제에 의해 단백질 절단은 세포내에서 형성된 시그날에 의해 그리고, 세포 표면 수용체에 의해 발생되는 시그날에 의해 조절되어야 한다. 발생학적 세포 사멸 과정에서, 이와 같은 프로테아제 활성은 유전자 발현에 영향을 주는 메카니즘이 관여하여, 프로테아제 합성을 강화시키고, 뿐만 아니라 이들의 아포프토시스 효과에 길항하는 BCL-2와 같은 단백질 합성을 감소시킨다. 이는 FAS-R 또는 TNF 수용체에 의해 촉진되는 세포독성 과정은 아니다. 단백질 합성이 완전하게 차단되어, 이와 같은 조건하에 자극에 의존하도록 유지되었을 경우에도 TNF 또는 FAS-R 리간드는 세포를 죽인다(이들은 실제 더 효과적으로 죽는다). TNF 수용체 및 FAS-Rdp 의한 CED3/ICE 페밀리 프로테아제의 활성화는 단백질-합성과는 무관한 메카니즘에 의해 발생될 것이다. MACHα1의 독특한 서열 특징으로 인하여 이와 같은 메카니즘에 관여하게 된다. 유사하게, 본 발명의 G1 단백질의 독특한 서열 특징으로 이와 같은 메카니즘에 참여할 수 있다.

따라서, 신규한 G1 단백질은 세포 표면 수용체에 직접적으로 또는 어뎁터 단 백질을 통하여 간접적으로 연합되는 것으로 밝혀진 전술한 MACH(및 이의 동소체)와 Mch4를 포함하는 최근에 발견된 프로테아제 집단의 또 다른 구성원이 되는 것이다. 다른 효소 활성을 가지는 수용체-연합된 단백질 작용으로부터, Mch4 또는 MACH (동소체 Machα1)에 G1이 결합하는 것과 MORT-1에 Mach의 Mch4의 결합 또는 MORT1에 G1의 직접적인 결합으로 Fas 리간드에 의한 FAS-R를 자극할 때, G1/Mch4/MACH 프로테아제 활성이 자극될 수 있다는 것이다. p55-R에 결합하는 TRADD에 MORT-1가 결합함으로써 p55-R에 의해 프로테아제가 활성화된다.

CED3/ICE의 다른 구성원은 단백질분해 프로세싱이 끝난 후에만 완전한 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌는데, 프로세싱은 제체 절단 또는 이 페밀리의 다른 프로테아제에 의해 일어난다(Kumas, 1995; Henkart, 1996). 예를 들면, MACH에 대해 상세하게 설명하는 공동 계류중인 출원에서와 같이, 완전한 길이의 CED3/ICE 상동 부분을 발현하는 세포에서 세포독성의 부족과는 반대되게, MACHα1의 두 개 주요 자체-절단되는 생성물이 공동 발현되어 발생하는 세포 독성 효과는 MACHα1이 프로세싱후에 완전한 활성을 얻는다는 것과 일치한다. 완전한 길이를 발현시키는 박테리아 용해물에서 관찰된 효소 활성은 이와 같은 조건하에서 생성된 단백질의 자체-프로세싱을 반영하거나 일부 박테리아 프로테아제에 의한 프로세싱을 반영한다. 이와 같은 프로세싱이 포유류 세포에서 발생되는 것과 같이, 어떻게, FAS-R 및 p55-R이 촉진시키는지에 대해서는 알려진 바 없고, MACHα1 프로테아제 활성이 FAS-R 및 TNF-유도된 세포 독성을 만드는지에 대해서도 알려진 바가 없다. CED3/ICE 상동부분이 부족한 MACHβ1가 발현되면 세포독성이 두드러진다는 사실과 이와 같은 현상의 평가가 복합되어 있다. 추정하면, 이와 같은 세포 독성은 MACHβ1가 MACHα1에 결합하는 능력을 반영한다. 이와 같은 능력 때문에, 응집시에, 트랜스펙트된 MACH 분자는 트랜스팩트된 세포내에 내생인 MACHα1 분자로 모양을 변화하게 된다. 이와 같은 메카니즘은 MACH(MORT1, TRADD 또는 p55-R 또는 FAS-R의 사멸 도메인)의 상류에 작용하는 분자가 세포에서 과발현되었을 때 관찰되는 세포 독성을 잘 설명한다. 그러나, MACH, 또는 이의의 상류에 작용하는 분자가 유도 발현되었을 때 관찰되는 세포독성은 MACH에 CED3/ICE 상동 부분의 단백질분해성 활성이외에도, FAS-R 및 p55-R 세포독성 효과(가령, 중성 또는 산성 스핑고미엘리나제의 활성화)에 참여하는 것으로 보이는 일부 다른 메카니즘의 활성화를 반영한다는 것을 배제할 수 없다. 또한, CED3/ICE 상동 부분의 단백질분해성 활성은 세포독성 유도이외의 다른 기능을 가진다는 것도 배제할 수 없다. MACHα1가 활성화되었을 때 절단되는 내생 기질 단백질을 확인하면, MACHα1의 분명한 기능을 알 수 있을 것이다. 저해분자의 발현에 의해 MACHα1의 활성을 제거하는 길을 찾는 것이 이들 단백질의 기능을 이해하는데 도움이 될 것이고, 원하는 경우에 이들의 활성을 조절하는 방법으로 이용할 수 있을 것이다.

여기에서, 본 발명의 G1 단백질 및 이의 가능한 동소체는 다른 단백질과 직접적인 상호작용을 가지면서, 또는 이러한 작용없이 상기 MACH 단백질에서 언급한 것과 같은 유사한 방식으로 거동하여, 즉, G1이 직접적으로 MORT-1의 결합에 작용하거나 또는 Mch4 또는 MACH에 결합을 하여 간접적으로 작용하거나 또는 MORT-1에 Mch4 또는 MACH의 결합을 통하여 작용하거나 또는 일부 경우에는 G1에 대한 특이적 인 메카니즘이 아직 밝혀지지 않고 있다. 유사하게, G1 활성 조절은 MACH 단백질 조절에서 볼 수 있는 것과 유사한 것이다.

G1을 발현하는 세포내에 단백질에 포함되는 천연 저해물질이 있을 것이다. CED3/ICE 페밀리의 다른 구성 요소중 일부에 대한 또 다르게 접하된 동소체는 이들 프로테아제의 기능을 생리학적으로 제한하는 방법으로 구성된다는 것을 보여준다. 이들 다른 단백질의 일부 동소체는 비활성 이형이량체를 형성하여, 전체 길이의 동소체의 천연 저해물질로 작용한다고 한다. G1 및 일부 가능한 동소체의 경우가 되는데, 예를 들면, N-말단 절단 부위가 손실된 동소체가 된다. 이와 같은 저해 동소체의 발현은 FAS-R 및 TNF 세포독성에 대해 세포의 자가-보호 기작으로 구성될 것이다.

G1은 또 다른 기능을 가지는데, 예를 들면, G1 또는 다른 임의 동소체는 효소 활성을 가지는 단백질에 강화 효과 또는 증강 효과, 예를 들면, 다양한 Mch4 및 MACH 동소체의 단백질분해 활성을 가지는데, 이와같은 강화 또는 증가 활성은 G1이 MORT-1(가령, Mch4 및 MACH 단백질)에 결합하는 다른 단백질을 모집하는 메카니즘에 의한 것이다. 또한, G1 또는 임의 다른 동소체는 세포독성에만 관련된 기능을 하는 것이 아니고, FAS-R 및 TNF의 다른 비-세포독성 효과에 관계하는 분자의 결합 부위로 작용한다.

본 발명에 따른 특정 G1 동소체 일부는 하기 실시예 1에서 예시화하였다. 사람 및 생쥐에서 분리한 소위 G1α(CASHα)(사람의 경우 hG1α/hCASHα 생쥐의 경우 mG1α/mCASHα)중 하나는 프로테아제 상동 부분을 가지는 1㎎ 접합 변이체이고, 적어도 일부 세포(293 세포)에서는 세포독성 활성을 가진다. 이들중 또 다른 것은 사람에서 분리한 G1β(CASHβ)로 불리는 것으로 프로테아제 상동 부분이 없는 짧은 접합 변이체로, 실제 세포-사멸 시그날발생 경로를 저해한다.

세포를 죽게하는 FAS-R 및 TNF 수용체의 독특한 능력 뿐만 아니라 다양한 다른 조직-손상 활성을 촉진시키는 TNF의 능력 때문에, 이들 수용체의 기능이 변형되는 것은 특히 유기체에 유해하게 된다. 또한, 이들 수용체의 과도한 또는 부족한 기능은 다양한 질병의 병인이 나타나게 하는 원인이 되는 것으로 보인다. 이들 수용체의 시그날 발생 활성에 참여하는 분자를 확인하고, 이들 분자의 기능을 조절하는 방법을 찾는 것은 이들 질병에 대한 새로운 치료요법적 접근방법을 제공하는 것이다. FAS-R 및 TNF 독성에서 주요한 역할은, CED3/ICE 페밀리의 일부 다른 구성원에서 실행한 것과 같이, 이들 분자의 단백질분해 기능을 차단할 수 있는 약물을 고안하는 것이 특히 중요한 것으로 보인다. G1에 포함되는 CED3/ICE 페밀리의 독특한 서열 특징으로 세포의 생리학적 세포 사멸 과정에 간섭없이 과도한 면역에 의해 중개되는 세포독성으로부터 보호할 수 있는 약물을 고안할 수 있는데, 이때 CED3/ICE 페밀리의 다른 구성원들이 관여한다.

언급한 바와 같이, G1 또는 임의 다른 동소체는 다른 세포내 시그날 발생 과정을 조절하는데 관여하는 것으로 보이는데, 예를 들면, MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질과는 무관한 방식으로 다른 세포독성 중개물질 또는 유도물질 또는 다른 단백질을 조절하는데 관여한다. 또한, G1 또는 실제 프로테아제 활성이 없는 프로테아제와 유사한 부분을 가지는 이의 동소체는 주로 저해 기능에 관여하는데, 즉, 이 들의 경로를 방해하는 가령, 예를 들면 일반적인 또는 세포독성 과정에서 시그날발생 과정을 방해하는데, 특히 G1 또는 이의 동소체는 이들 경로의 구성원에 직접 결합하거나 다른 단백질에 간접적으로 결합하여, 이들 경로의 구성원에 결합하는 방법으로 관여한다.

따라서, 본 발명은 G1 단백질을 인코드하는 DNA 서열 및 이 서열에 의해 인코드된 G1 단백질에 관계한다.

또한, 본 발명은 G1 단백질의 생물학적으로 활성이 있는 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체를 인코드하는 DNA 서열 및 이 서열에 의해 인코드된 G1 단백질의 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체에 관계한다. 이와 같은 유사체, 단편 및 이의 유도체는 표준 방법(Sambrook, et al., 1989)으로 준비할 수 있는데, G1 단백질을 인코드하는 DNA 서열에 한 개 이상의 코돈을 결손, 또는 다른 것을 추가 또는 대체하여 고유 단백질에 대해 적어도 한 가지 이상의 단백질 잔기가 변화된 유사체를 만드는 것이다.

G1 단백질에 "실제 상응하는" 단백질 또는 폴리펩티드에는 G1 단백질 또는 G1 유사체인 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.

G1 단백질에 상응하는 유사체는 G1 단백질의 아미노산중 한 가지 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 결손되거나 삽입되어 생성된 단백질이 G1 단백질에 상응하는 생물학적 활성이 동일한 또는 더 큰 단백질이 되어야 한다.

G1-결합 단백질에 실제 상응하도록 하기 위해서는 동소체와 같은 G1 단백질의 서열에 만들어지는 변화는 아주 적은 것이다. 변화의 수는 10미만이고 적절하 게는 5이하의 변화, 가장 적절한 수는 3이하가 된다. 임의 기술을 이용하여 실제 G1 단백질에 상응하는 생물학적으로 활성을 가지는 단백질을 만들 수 있는데, 한 가지 기술은 단백질을 인코드하는 DNA에 통상적인 돌연변이 기술을 이용하는 것으로 약간의 변화가 있다. 이와 같은 클론에 의해 발현되는 단백질들은 Mch4 또는 MACH와 같은 다양한 MORT-1-결합 단백질에 결합하는 능력, 또는 MORT-1에 바로 결합하는 능력 또는 FAS-R 및 p55-R 중개 활성 또는 상기에서 언급한 것과 같은 이?? 다른 세포내 경로의 활성을 조절하는 능력등으로 스크리닝한다.

"보존성" 변화는 단백질의 활성에 변화를 주지 않고, 단백질의 크기, 전하, 모양을 변화시키지는 않는 것으로 우선 스크리닝하여 생물학적 활성에 변화를 주지 않는 것이 된다.

G1 단백질의 보존성 치환체는 폴리펩티드에 있는 적어도 한 개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열로 보존성을 유지하면서 치환된 유사체이다. 이와 같은 치환은 적절하게는 표 1b에서 제시하는 것에 따라 이루어지는데, 치환체는 G1 단백질의 생물학적 활성 특징을 유지하면서 합성된 폴리펩티드 분자의 변형된 구조적 그리고 기능적 성질을 제공하는 일상적인 실험에 의해 결정한다.

원래 아미노산	예시적인 치환제
Ala	Gly; Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala; Pro
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Tyr; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

또는 G1 단백질의 치환체의 또 다른 그룹은 다음의 표 1c에 있는 것과 같이 폴리펩티드에 있는 적어도 하나의 아미노산을 제거하고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이 된다. 폴리펩티드에서 이루어진 이와 같은 치환은 Schulz et al., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 and Figs. 3-9 of Creighton, T.E. Protein; Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983의 표 1-2에 제시한 것과 같은 상이한 종간의 단백질 유사성에서 아미노산 변화 빈도를 분석한 결과를 기초로 한 것이다. 이와 같은 분석을 기초로 하여 또 다른 보존성 치환체는 다음의 다섯 가지 그룹중 하나에서 교환이 이루어진 것이다.

1. 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기; Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly)

2. 극성 음전하를 띈 잔기와 이의 아미드; Asp, Asn, Glu, Gln

3. 극성 양전하를 띈 잔기; His, Arg, Lys

4. 큰 지방족 비극성 잔기; Met, Leu, Ile, Val(Cys)

5. 큰 방향족 잔기; Phe, Tyr, Trp

괄호안에 있는 세 가지 아미노산은 단백질 구조에 중요한 역할을 한다. Gly는 어떠한 측쇄도 가지지 않는 유일한 것이고 따라서 사슬에 유연성을 부여한다. 그러나 이는 α사슬이외의 제2차 구조 형성을 촉진시키는 경향이 있다. Pro는 이의 구조적인 특징으로 인하여, 사슬을 단단하게 억압하고 일반적으로 β-회전과 같은 구조를 만드는 경향이 있고, 일부 경우에는 Cys는 단백질의 폴딩에 중요한 역할을 하는 이황화결합에 참가할 수 있다. Tyr은 이의 수소결합 가능성 때문에 Ser, Thr와 상당히 유사한 특징을 가진다.

본 발명에 따른 전술한 것과 같은 보존성 아미노산 치환은 본 기술분야에 공지된 것이고, 아미노산 치환 후에 폴리펩티드의 생물학적 그리고 구조상의 성질을 유지할 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 대부분의 결손 및 치환은 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 특징에 파격적인 변화를 주지는 않는다. " 특징"은 α-사슬, β-쉬트 등의 2차 구조에서의 변화 및 세포에서 MORT-1-결합 단백질 또는 MORT-1에 결합하는 것, 또는 세포에서 FAS-R 리간드 또는 TNF-효과 등의 생물학적 활성에 변화 등을 포함한 포괄적인 것을 의미한다.

본 발명에 이용할 수 있는 G1 단백질의 유사체를 만들기 위해 이용될 수 있는 단백질에 아미노산 치환제를 만드는 예는 임의 공지의 방법을 포함하는데 이는 미국 특허 RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585; 4,737,462(Mart et al.,); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,) 및 리신 치환된 단백질은 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에 상술하고 있다.

전술한 G1 단백질의 활성에 큰 변화를 주지 않는 보존성 치환이외에, G1 단백질의 활성이 상당히 증가되도록 하는 보존성이 약한 치환 및 다소 무작위 치환도 본원 발명의 범위에 속한다.

치환 또는 결손의 정확한 효과를 확인하였을 경우에, 당업자는 치환, 결손 등의 효과를 일상적인 결합 및 세포 사멸 검사를 통하여 평가할 수 있음을 인지할 것이다. 이와 같은 표준 테스트를 이용하는 스크리닝은 과도한 실험을 요하지는 않는다.

수용가능한 유사체에는 MORT-1 EH는 다른 단백질에 결합하는 MORT-1-결합 단백질의 능력, 상기에서 언급한 바와 같은 FAS-R 및 p55-R 또는 다른 단백질의 활성을 조절하는 능력을 적어도 일부분 가지는 것이다. 이와 같은 방식에서, 유사체는 소위 우성-음성 효과를 가지는데, 즉, MORT-1-결합 단백질(즉, Mch4 또는 MACH)에 결합하는 또는 MORT-1 또는 다른 단백질에 결합하는 능력이 결손되어, 연속적으로 이와 같은 결합후에 시그날발생 또는 프로테아제 활성에 결손이 있는 유사체가 생성될 수도 있다. 이와 같은 유사체를 이용하여 자연 MORT-1-결합 단백질 또는 다른 단백질과 경쟁하도록 하여 FAS-리간드 효과 또는 다른 단백질 효과를 저해할 수 있다. 예를 들면, MACH 동소체, MACHα3, MACHα3는 이와 같은 MACH 동소체의 활성화에 필수적인 과정이 되는 MORT-1에 활성(프로테아제) MACH 동소체와 결합하는 것을 경쟁함으로써 MACH 활성을 저해하는 "천연" 유사체가 된다. 일단 활성 MACH 동소체가 MORT-1에 결합하지 못하면, FAS-R 및 p55-R에 의해 중개되는 세포내 시그날 발생 과정이 중단될 것이다. 이와 유사한 방식으로, G1 또는 이의 임의 동소체는 MORT-1에 결합하는 다양한 MORT-1-결합 단백질과 경쟁하거나 MORT-1에 결합하는 것을 방해하는 방식으로 상호작용하여 FAS-R 리간드 효과의 저해물질로 작용할 수 있다. 유사하게, 소위 우성-양성 G1 유사체는 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 강화시키도록 만들어지는 것이다. 이들은 MORT-1-결합 단백질에 결합하는 능력이 동일하거나 또는 더 뛰어나거나 천연 G1 단백질의 동일한 시그날 발생 성질 또는 더 뛰어난 시그날 발생 성질을 가진다.

유전자 수준에서, 이와 같은 유사체는 G1 단백질을 인코드하는 DNA 서열의 뉴클레오티드에 부위-직접적인 돌연변이를 이용하여 유사체를 인코드하는 DNA 서열을 만들고, DNA을 합성하고 재조합 세포 배양물에서 폴리펩티드를 발현시켜 만들 수 있다. 일반적으로 유사체는 천연 발생 단백질과 동일한 또는 생물학적 활성이 양적으로 증가된다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologu, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989).

G1 단백질 고유 또는 초기 준비된 유사체를 인코드하는 DNA의 부위-돌연변이를 이용하여, 동일한 폴리펩티드를 인코드하는 또는 천연 서열과는 다른(공지의 유전자 코드의 축중으로 인한 변화 때문에) 서열을 가지는 G1 단백질을 준비할 수 있 다. 부위-특이적인 돌연변이는 원하는 돌연변이를 가지는 DNA 서열을 인코드하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열과 인접한 상당수의 뉴클레오티드을 이용하여 유사체를 만들 수 있는데 유사체는 반대로 된 결손 양측에 안정한 이중 나선을 만들기 위해 충분한 크기의 프라이머 서열을 제공한다. 일반적으로 길이가 20 내지 25개 뉴클레오티드로 된 프라이머가 적절한데 서열의 각 측면에는 약 5 내지 10개의 상보 뉴클레오티드가 바뀔 수 있다. 일반적으로, 부위-특이적인 돌연변이 기술은 당업자에게 공지된 기술이고, 이는 Adelman et al., DNA 2;183(1983)에 예시하고 있다.

인지하는 바와 같이, 부위 특이적인 돌연변이 기술은 일반적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 형으로 존재하는 파아지 벡터를 이용한다. 부위-특이적인 돌연변이에 유용한 전형적인 벡터는 Messing et al., Third Cleveland Symposim on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor, A. Walton, Elsevier, Amsterdam(1981)에 상술하고 있는 M13 파아지이다. 이들 파아지는 시판되는 것을 이용할 수 있고 일반적으로 당업자에게 공지된 것이다. 또는 복제원점을 포함하는 한가닥 파아지를 포함하는 벡터를 이용하여 단일-가닥 DNA를 얻을 수 있다(Veira et al., Meth. Enzymol. 153;3, 1987).

일반적으로, 본 발명에 따르는 부위-직접적인 돌연변이는 관련 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 한 가닥 벡터를 얻어야 한다. 원하는 돌연변이된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 자동화된 DNA/올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 준비한다. 이와 같은 프라이머를 단일가닥 단백질 서열을 포함하는 벡터에 어닐링하고 대장균 폴리메라제 I Klenow 단편과 같은 DNA 중합효소로 처리하여 돌연변이을 포함하는 가닥을 완전히 합성한다. 따라서, 돌연변이된 서열과 제2가닥은 원하는 돌연변이를 가진다. 이와 같은 이형이중 벡터를 이용하여 대장균(E. coli) JM101와 같은 적절한 세포에 형질 도입시키고 돌연변이된 서열을 가지는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.

이와 같은 클론을 선택한 후에, 돌연변이된 G1 단백질 서열을 제거하여 적절한 벡터에 옮기고, 이때 벡터는 일반적으로 적절한 숙주에 트랜스펙션을 위해 이용되는 형태의 발현 벡터가 된다.

따라서, G1 단백질을 인코드하는 유전자 또는 핵산은 PCR 및 화학적 올리고뉴클레오티드 합성과 같은 공지의 DNA 또는 RNA 증폭 기술을 이용하여 in vitro, in vivo에서 감지, 수득 및 변형된 것이다. PCR을 이용하면 반복된 DNA 폴리메라제 반응에 의해 특정 DNA를 증폭(수를 증가)시킬 수 있다. 이와 같은 반응은 클로닝을 대신할 수 있는데; 이때 모든 핵산 서열을 알아야 한다. PCR을 실행하기 위해, 원하는 서열에 상보적인 프라이머를 만든다. 일반적으로 자동화된 DNA 합성에 의해 프라이머를 만들 수 있다. 프라이머는 유전자의 임의 부분에 하이브리드할 수 있도록 만들어진 것이기 때문에, 상보적인 염기 쌍에 짝이 잘못진 것(mismatch)을 견딜 수 있도록 환경을 만든다. 이와 같은 잘못이룬 쌍을 증폭시키면 돌연변이된 생성물을 만들게 되고 새로운 성질을 가지는 펩티드가 형성된다(가령, 부위 특이적인 돌연변이)(Ausubel., Ch.16). 또한, PCR에서 역전사효소를 이용하여 커플링 상보적인 DNA(cDNA) 합성하여, 클로닝없이 프로락틴 수용체의 세포외 도메인 합성을 위한 출발물질로 RNA를 이용한다.

또한, PCR 프라이머는 증폭된 유전자 부분의 양단에 종료 코돈이 있는 것과 같은 특징 및 새로운 제한효소 절단 부위를 가지는 등과 같이 만든다. 증폭된 유전자 서열의 5'와 3'단부에 제한효소 절단부위가 위치하면, G1 단백질 또는 이의 단편을 인코드하는 유전자 단편이 벡터에 다른 서열 및 클로닝 부위를 결찰하도록 만들 수 있다.

PCR 또는 RNA 및 DNA를 증폭시키는 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 야기에서 제시하는 기술에 따라 과도한 실험없이도 본 발명에 따라 이용될 수 있다. DNA 또는 RNA를 증폭시키는 공지된 방법은 폴리메라제 사슬 연쇄반응(PCR)과 관련된 증폭 과정(참고; 미국 특허, 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188(Mullis et al.,); 4,921,794(Tobor et al.,); 5,142,033(Innis et al.,); 5,122,464(Wilson et al.,); 5,091,310(Innis); 5,066,584(Gyllensten et al.,); 4,889,818(Gelfand et al,); 4,994,370(Silver et al.,); 4,766,067(Biswas); 4,656,134(Ringold); Innis et al., eds, PCR Protocols; A Guide to Method and Applications) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위해 주형으로 표적 서열에 안티센스 RNS를 이용하여 RNA 중개된 증폭(미국 특허 5,130,238(Malek et al., NASBA) 및 항체 라벨링이 된 DNA 증폭을 이용하여 복합된 면역-PCR(Ruzick et al., Science 260;487(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotechniques 9;1378(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotchnique 9;1378(1991)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.

유사한 방식으로 G1 단백질의 생물학적으로 활성 단편(가령, G1의 동소체)을 G1 단백질의 유사체에대해 전술한 것과 같이 만들 수 있다. G1 단백질의 적절한 단편은 G1 단백질 능력을 보유하고, 상기에서 언급한 것과 같이 FAS-R 및 p55-R 및 다른 단백질의 생물학적 활성을 중재할 수 있는 것을 말한다. 따라서, G1 단백질 단편은 유사체에 대해 전술한 것과 같이 도미넌트-네가키브 또는 도미넌트-포지티브 효과를 가지도록 만든다. 이와 같은 단편은 본 발명의 유사체의 특정 부류를 나타내는데 즉, 이들은 완전한 G1 단백질에서 유도된 G1 단백질의 일부이고(가령, G1 또는 이의 동소체중 하나), 이와 같은 일부분 또는 단편은 원하는 활성의 일부를 가진다. 이와 같은 단편은 펩티드가 될 수 있다.

유사하게, 당업자에게 공지된 것과 같이, G1 단백질, 이의 유사체, 단편의 하나이상의 아미노산 잔기의 측쇄에 표준 변화 또는 다른 분자 가령, 항체, 효소, 수용체 등에 G1 단백질, 유사체 또는 단편을 결합시켜 유도체를 만들 수 있다. 따라서, 여기에서 언급하는 "유도체"는 당업자에게 공지된 방법으로 잔기의 측쇄 또는 N- 또는 C-단부 그룹에 있는 기능기로부터 만든 유도체를 포함하고 이 또한 본 발명의 범위에 속한다. 유도체는 이와 같은 단편이 G1 단백질으로 동일한 또는 더 큰 생물학적 활성을 가진다면 탄수화물 도는 인산 잔기와 같은 화학적 부분을 가질 수 있다.

가령, 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 2차 아민과 반응한 카르복실기의 아미드, 아실 부분을 형성한 아미노산의 자유 아미노시 또는 N-아실 유도체(가령, 알카노일 또는 카르복실 아로일 기) 또는 아실 부분을 형성하는 자유 히드록실 기의 O-아실 유도체(가령, 세릴 또는 트레오닐 잔기) 를 포함한다.

"유도체"는 한 아미노산이 20개의 자연 발생 아미노산중 하나로 변화되지 않은 유도체만을 포함하는 것이다.

G1 단백질은 단백질 또는 폴리펩티드 즉, 아미노산 서열이다. 정의에 따르면, G1 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하는 큰 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드는 본 발명의 기초적인 그리고 신규한 특징에 영향을 주지 않는 한 이와 같은 폴리펩티드도 본 발명의 범위에 속하는데 가령, 이들은 G1 단백질의 생물학적 활성을 보유하거나 증가된 활성을 가지고 또는 G1 단백질의 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 남기기 위해 절단될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 다른 아미노산 또는 펩티드와 G1 단백질로된 융합 단백질을 포함한다.

신규한 G1, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체는 다음과 같은 용도를 가질 수 있다;

(i) G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 Mch4 및 MACH(가양한 형태의 동소체 포함)와 같은 MORT-1-결합 단백질의 기능 또는 MORT-1 자체그리고 FAS-R 리간드 또는 TNF 또는 다른 단백질의 기능을 모방하는 또는 강화시키는데 이용되는데, FAS-R 리간드 또는 TNF 또는 다른 단백질 효과를 강화시키기를 원하는 경우에, 예를 들면, 항-종양, 항-염증, 항-HIV 치료시에 FAS-R 리간드, 또는 TNF- 또는 다른 단백질에 의해 유도되는 세포독성 활성이 비람직하다. 이와 같은 경우에, 세포독성 효과와 같은 FAS-R 리간드 또는 TNF 또는 다른 단백질의 효과를 강화시키는 본 발명의 G1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체 는 공지된 방법을 이용하여 세포내로 유도한다. 가령, 단백질이 세포내 단백질인 경우에 이들은 FAS-R 리간드 또는 TNF- 또는 다른 단백질 효과를 원하는 세포안으로만 유도해야 하고, 세포에는 이들 단백질을 특정하게 유도할 수 있는 시스템이 필수적이다. 이와 같은 것을 실시하는 한 가지 방법은 벡시니아(Vaccinia)에서 유도된 것과 같은 재조합 동물 바이러스를 만들고, 다음의 두가지 유전자를 도입하는데; 세포에 의해 특이적으로 발현될 세포 표면에 결합될 수 있는 리간드를 인코드하는 유전자 가령, 일부 세포(CD4 임파세포와 관련된 백혈구종)에 특이적으로 결합할 수 있는 AIDs(HIV) 바이러스 gp120 또는 재조합 바이러스 벡터가 FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포에 결합할 수 있도록 하기 위해, FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포에 특이적으로 결합하는 임의 다른 리간드를 인코드하는 유전자와 G1 단백질을 인코드하는 유전자를 도입한다. 따라서, 바이러스를 통하여 G1 단백질을 인코드하는 서열(가령 G1α서열)을 세포내로 유입시키면, 바이러스 표면에 세포-표면 결합 단백질의 발현하여 바이러스가 특이적으로 종양세포 또는 다른 FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포를 표적으로 하고, 일단 세포내에서 발현되면, FAS-R 리간드 또는 TNF-효과를 강화시켜, 종양 세포 또는 죽이고자 하는 FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포를 죽게 한다. 이와 같은 재조합 동물 바이러스의 작제는 표준과정에 따른다(가령 Sambrook et al., 1989). 또 다른 가능성은 세포에 의해 흡수되고 그 안에서 발현되는 올리고뉴클레오티드형의 G1 단백질이 인코드된 서열을 도입시키는 것이다.

이와 같은 세포 독성을 강화시키는 또 다른 방법은 세포 독성에 저해가 되는 G1 동소체(가령 G1β) 활성을 저해시킨다. 이와 같은 G1 동소체를 저해시키는 방법은 상당히 많고, G1β와 같은 저해성 G1 동소체를 저해하는데 특이적으로 이용되는 것과 같은 (ii)의 것을 포함한다.

(ii) FAS-R 리간드 또는 TNF-유도된 FAS-R 또는 p55-R 세포내 시그날발생 또는 다른 단백질이 중개하는 시그날 발생과정을 차단해야하는 폐혈증 쇼크, 이식편대 숙주 반응 또는 급성 간염과 같은 조직 손상의 경우에, FAS-R 리간드 또는 TNF 또는 다른 단백질 효과를 저해시키는데 이용한다. 이와 같은 상황에서는 표준 공정에 따라 G1 단백질을 인코드하는 mRNA의 해독을 효과적으로 방해하는 본 발명의 G1 단백질에 대한 안티-센스 코딩 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 세포내로 유도할 수 있고 따라서 이들의 발현을 차단하여, FAS-R 리간드 또는 TNF- 또는 다른 단백질 효과를 저해한다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 상기 재조합 바이러스 방식을 이용하여 세포내로 유입시킬 수 있고 바이러스에 의해 운반되는 제 2 서열이 올리고뉴클레오티드 서열이다.

또한, 상기에서 언급한 것과 같이, 적어도 한가지 G1 동소체는 세포 독성의 "자연 저해물질" 즉 G1β로 분리된다. 여기에서, 이와 같은 G1 동소체는 세포에 직접 투여되거나 또는 이와 같은 동소체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 적절한 벡터를 이용하여 세포내로 도입되어, 세포에서 발현되었을 경우에, G1 동소체가 세포 독성을 저해하도록 한다.

또 다른 가능성은 세포내 시그날 활성을 방해하기 위해 본 발명의 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것이다.

FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 저해하는 또 다른 방법은 최근에 개발된 라이소자임 방식이다. 라이소자임은 특이적으로 RNA를 절단하는 촉매 RNA 분자이다. 라이소자임은 선택된 표적 RNA를 절단하도록 만들 수 있는데 가령, 본 발명의 G1 단백질을 인코드하는 mRNA를 절단하도록 만들 수 있다. 이와 같은 라이소자임은 G1 단백질의 mRNA에 특이적인 서열을 가지고, mRNA의 절단 후에 이와 상호작용하여(상보적인 결합), G1 단백질 발현을 감소 또는 완전히 못하도록 할 수 있는데, 발현 감소 정도는 표적 세포에 있는 라이소자임 발현정도에따라 달라진다. 선택된 세포(가령, FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포)내로 라이소자임을 유도시키기 위해, 플라스미드, 동물 바이러스(레트로바이러스) 벡터등과 같은 적절한 벡터를 이용하는데 이들은 i) 바이러스가 라이소자임을 인코드하는 cDNA와 같은 제 2 서열을 가지도록 하는 목적에 이용된다(Methods etc., concerning ribozymes see Chen et al., 1992;Zhao and Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph and Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 and Koizumi et al., 1993)

(iii) G1 단백질, 동소체, 유사체 또는 이의 단편 및 유도체는 동일한 종류의 다른 단백질을 분리하고 확인하고 클론하는데 이용되는데, 가령, FAS-R 세포내 도메인에 결합하는 또는 기능적으로 관련된 수용체에 결합하는 단백질; 상기에서 언급한 것과 같은 MORT-1-결합 단백질에 결합 또는 MORT-1에 결합하여, FAS-R 및 p55-R와 같은 기능적으로 관련이 있는 수용체에 결합하는 단백질 그리고 세포내 시그날 발생과정에 관여하는 단백질을 분리, 확인, 클론하는데 이용된다. 이와 같 은 경우에, 상기에서 언급한 것과 같은 이스트 두 개-하이브리드 시스템을 이용하거나 최근에 개발된 PCR 클로닝 후에 엄격하지 않은(non-stringent) 서던 하이브리드반응을 이용하는 시스템을 이용할 수 있다(Wilks et al., 1989). Wilks et al., 에서는 비-스트린젼트 서든 하이브리드반응후에, 카이나제 모티프의 공지된 서열에 기초하여 PCR에 의해 클로닝하여, 두 개 가상 단백질-티로신 카이나제를 확인하고, 클로닝하는 것에 대해 설명한다. 이와 같은 방법을 이용하여, G1 단백질 서열을 이용하여, 관련된 MORT-1 결합 단백질을 확인하고 클론한다.

iv) 본 발명의 G1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 이용하는 또 다른 방법은 MORT-1, MORT-1-결합 단백질 또는 세포내 시그날 과정에 관계하는 다른 단백질 또는 인자에 결합할 수 있는 능력을 가지는 다른 단백질 또는 인자를 분리 및 확인하기 위한 친화성 크로마토그래피 방법에 사용하는 것이다. 이와 같은 용도에서, 본 발명의 G1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체는 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 개별적으로 부착시키고 그 다음 세포 추출물 또는 세포내 시그날 공정에 관계하는 것으로 보이는 분리된 단백질 또는 인자와 접촉시킨다. 친화력 크로카토그래피후에 G1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체에 결합된 다른 단백질 또는 인자를 용출시키고, 분리하여 특징을 조사한다.

(v) 전술한 것과 같이, 본 발명의 G1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 이뮤노겐(항원)으로 이용하여 이에 대한 특이적인 항체를 만들 수 있다. 이와 같은 항체를 이용하여 세포 추출물 또는 이와 같은 G1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 생산하는 형질변환된 세포로부터 본 발명의 G1 단백질을 정제할 수 있다. 또한, 이들 항체를 이용하여 과도한 또는 과소한 FAS-R 리간드 또는 TNF-유도된 세포 효과를 가지는 FAS-R 리간드 또는 TNF-시스템의 이상이 있는 것과 연관된 질병을 확인하기 위한 진단을 할 수 있다. 따라서, MORT-1 단백질, 다양한 단백질, MORT-1-결합 단백질 또는 G1 단백질 자체가 관련된 기능이상의 세포내 시그날 시스템과 질병이 연관이 있는 경우에 이와 같은 항체들은 중요한 진단 도구가 될 수 있다.

공지의 표준 스크리닝 과정을 이용하여 본 발명의 G1 단백질을 분리, 확인 및 특징화할 수 있다. 예를 들면, 하기에서 제시하는 바와 같이, 스크리닝 과정중 하나는 이스트 두 개-하이브리드 과정을 이용하여, MORT-1 단백질을 확인하고, 이어서 본 발명의 G1 단백질 및 다양한 MORT-1-결합 단백질을 확인할 수 있다. 상기에서 그리고 하기에서 언급하는 것과 같이, 당분야에 공지된 친화력 크로마토그래피, DNA 하이브리드 과정등을 이용하여, 본 발명의 G1 단백질을 분리, 확인 및 특징화하거나, 본 발명의 G1 단백질에 결합할 수 있는 추가 단백질, 인자. 수용체등을 분리, 확인, 특징화할 수 있다.

여기에서 제시된 바와 같이, G1 단백질을 이용하여 G1에 특이적인 항체 가령, G1 및 이의 동소체에 특이적인 항체를 만든다. 이와 같은 항체 또는 이의 단편은 하기에서 상세히 설명하고, 이들은 G1 단백질에 특이적이라는 것을 인지할 것이다.

G1 또는 이의 가능한 동소체는 CED3/ICE 페밀리 프로테아제와 관련된 프로테아제라는 본 발명에 따른 발견에 기초하여, 이들 G1 단백질 및 이의 동소체는 다음의 특정 의료 용도를 가진다; 예정된 세포 사멸 과정을 효과적으로 차단할 수 있는 일부는 세포 침투적인 다른 CED3/ICE 프로테아제 특정 저해물질이 이미 존재한다는 것을 발견하였다. 여기에서, G1 프로테아제 동소체가 관련된 FAS-R 리간드 또는 TNF-유도된 세포 사멸 과정을 저해하는 저해물질을 고안하는 것도 가능하다. 또한, 이와 같은 신규한 G1 프로테아제의 독특한 서열 특징으로, TNF- 및 FAS-R 리간드-유도된 효과에 매우 특이적인 저해물질을 고안하는 것도 가능할 것이다. 본 발명의 방법은 FAS-R 리간드 또는 TNF에 반응하여 "치사 프로테아제"가 활성화되는 메카니즘을 연구하는 방법도 제공하여, 이와 같은 활성을 어느 정도 조절할 수 있는 약물을 개발할 수 있게 된다. 이와 같은 약물이 도움을 줄 수 있는 질병은 수없이 많다. 이들 가운데에는, 간에 급성 손상은 간 세포의 FAS-R 리간드-중개된 사멸이라는 것을 반영하는 급성 간염; 췌장의 β랑게르한스샘 세포의 사멸과 같은 자가면역-유도된 세포 사멸으로 인하여, 진성 당뇨병이 되고; 이식편 거부로 인한 세포 사멸(신장, 심장, 간); 다발성 경색에서 핍지신경교의 사멸; AIDS-저해된 T 세포 자살로 인하여 AIDS 바이러스를 증식하게 하고, AIDS 질병이 된다.

여기에서 언급한 것과 같이, G1 또는 이의 가능한 동소체(가령, G1β동소체)는 G1 프로테아제 또는 G1 프로테아제 동소체의 "자연" 저해물질로 작용하고, 이들을 상기 특정 G1 프로테아제 저해물질로 이용할 수 있다. 유사하게, 펩티드, 유기 화합물, 항체등과 같은 다른 물질을 스크린하여, G1 프로테아제를 저해할 수 있는 특정 약물을 수득한다.

G1 프로테아제의 펩티드 방해물질을 어떻게 만들고 스크리닝하는지의 예는 ICE 또는 ICE-유사 프로테아제의 펩티드 방해물질에 대한 기존 연구, 펩티드 합성을 이용하여 에피토프 분석을 위한 전략과 ICE 기질 특이성에 대한 연구를 기초로 한다. ICE에 의한 펩티드의 효과적인 절단에 필요한 최소 조건은 P₁ 위치에 아스파르트산을 선호하는 절단 위치의 우측에 네 가지 아미노산과 P₁ 위치에 우측에 메틸아민이 절단위치에 관계한다는 것을 알았다(Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). 또한, 프로로로젠 지질 펩티드(테트라펩티드) 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-메틸-코마릴-7-아미드)[약어 Ac-DEVD-AMC]는 FAS-R 자극후에 그리고 다른 아포토틱 과정후에(Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994) 세포에서 절단되는 것으로 밝혀진 폴리(A에-리보즈) 폴리메라제(PARP)에 있는 서열에 상응하고 CPP32(CED/ICE 프로테아제 족의 한 구성원)와 MACH 프로테아제(및 G1 프로테아제에 의해 가능한 것)에 의해 효과적으로 절단된다.

기질의 P1 위치에 Asp가 중요한 것으로 보이기 때문에, 4번째 아미노산이 Asp를 가지는 테트라펩티드와 처음 세 개 잔기 위치에 다양한 아미노산 복합물을 Gelyson(Geysen, 1985; Geysen et al., 1987)이 개발한 방법을 이용하여 프로테아제의 활성 부위에 결합하는 지를 스크리닝하는데 이 방법은 여러 가지 많은 펩티드를 고형 서포트에 붙이고 항체와 특이적인 상호작용을 하는 지를 스크리닝하였다. 특정 펩티드에 MACH 프로테아제가 결합하는 것은 방사능라벨링과 같은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여 감지할 수 있다. Geysen의 방법은 각 하루 작업일동안 적어도 4000펩티드를 테스트할 수 있다.

CED3/ICE 프로테아제족의 다른 구성원이 관련된 생리적인 세포 사멸 과정을 방해하지 않으면서, G1 프로테아제를 선택적으로 방해하는 펩티드 방해물질을 고안하는 것이 유익하기 때문에, 다른 CED3/ICE 프로테아제에 의해 절단되지 않고 G1 프로테아제에의해 선택적으로 절단되는 지를 테스트하기 위해, 상기에서 언급한 것과 같은 검사에서 G1 프로테아제에 결합되는 펩티드 푸울을 플로로젠 기질 펩티드로 합성할 수 있다. G1 프로테아제에 의해 선택적으로 절단되는 것으로 보이는 펩티드는 세포 침투성을 강화시키고, 가역적 또는 비가역적으로 G1의 세포 사멸 활성을 방해할 수 있도록 변형시킨다. Thornberry et al.,(1994)는 테트라펩티드(아실옥시) 메틸 케톤 Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH₂OC(O)-[2,6-(CF₃)₂]Ph가 ICE의 강력한 방해물질이라고 보고하였다. 유사하게, Milligan et al.,(1992)는 클로로메틸케톤(비가역적) 또는 알데히드(가역적)기를 가지는 테트라펩티드 방해물질이 ICE를 저해하였다고 보고하였다. 또한, 벤질옥시카르복실-Asp-CH₂OC(O)-2,6-디클로로벤젠(DCB)가 ICE를 방해하는 것으로 나타났다(Mashima et al., 1995). 따라서, G1 프로테아제에 선택적으로 결합하는 테트라펩티드는 알데히드기, 클로로메틸케톤(아실옥시)메틸 케톤 또는 CH₂OC(O)-DCB기를 가지도록 변형시켜, G1 프로테아제 활성의 펩티드 저해물질을 만든다.

다른 CED3/ICE 프로테아제의 일부 특정 저해물질은 세포 침투성이 있으나, 펩티드 저해물질의 세포 침투성을 강화시킬 필요가 있다. 예를 들면, 펩티드의 세포막 통과성을 강화시킬 수 있도록 화학적으로 변형시키거나 유도시켜 이와 같은 펩티드가 막을 통하여 세포질로 들어갈 수 있도록 한다. Muranishi et al.,(1991)은 세포 막을 통과하는 성질을 개선시킨 친지성 라우릴 유도체를 만들기 위해 라우린산이 있는 티로트로핀-방출 호르몬을 유도하는 것에 대해 보고하였다. Zachria et al.,(1991)은 메티오닌의 설폭시드 산화와 펩티드 결합을 이의 케토메틸렌 이소에스테르(COCH₂)로 대체하여 세포막을 통한 펩티드의 수송을 실행하였다. 이는 당업자가 잘 인지할 수 있는 공지의 변형 및 유도과정의 일부이다.

또한, G1 또는 가능한 동소체의 세포 사멸 활성을 저해할 수 있는 약물 또는 펩티드 방해물질은 세포로 들어갈 수 있는 분자와 결합하거나 복합시킬 수 있다.

미국 특허 5,149,782에서는 세포막을 통하여 이동될 분자에 퓨소제닉(fusogenic) 폴리펩티드, 이온-채널 형성 폴리펩티드, 다른 막 폴리펩티드, 미리스틱산, 팔미드산과 같은 긴 사슬 지방산등과 같은 막 혼합물질과 결합시킬 수 있다. 이와 같은 막 혼합 물질은 세포 막의 지질 이중층에 분자 결합물질을 삽입하여 세포질로 이들을 들어가게 할 수 있다고 상술하고 있다.

Low et al.,의 미국 특허 5,108,921에서는 수용체 중개된 엔도사이토시스 활성 메카니즘에 의해 단백질 및 핵산을 포함하나 이에 국한시키지 않는 분자를 막을 통하여 수송하는 방법에 대해 언급하고 있다. 이와 같은 수용체 시스템에는 이들을 인지하는 갈락토즈, 만노즈, 만노즈-6-포스페이트, 트랜스페린, 아시알글리토프 로테인, 트란스코발민(비타민 B₁₂), α-2 마크로글로불린, 인슐린 및 상피 성장 인자(EGF)와 같은 다른 펩티드 성장 인자 등을 포함한다. Low et al.,은 바이오틴 및 폴레이트(folate)와 같은 영양소 수용체를 이용하면 대부분의 세포 표면에 바이오틴 및 폴레이트가 다수 위치하고 막 수용체 중개된 연합적인 막 통과 과정으로 인하여 막을 통한 수송을 강화시킬 수 있다. 따라서, 세포질로 수송할 화합물과 바이오틴 또는 폴레이트와 같은 리간드간사이에 형성된 복합체는 바이오틴 또는 폴레이트를 포함하는 세포 막과 접촉하게 되어 수용체 중개된 막-통과 수송을 개시하고 세포안으로 원하는 화합물이 들어가게 된다.

ICD는 P₂ 위치에 자유로운 치환을 허용하는 능력을 가진 것으로 알려져 있고, 이와 같은 치환을 견딜 수 있기 때문에 바이오틴을 가진 강력하고 매우 선택성이 큰 친화성 라벨로 예측하고 있다(Thornberry et al., 1994). 결과적으로, P₂ 위치와 테트라펩티드 방해물질의 N-단부를 변형 또는 유도하여 바이오틴 분자를 추가하여 세포막을 통하여 이와 같은 펩티드 방해물질의 침투성을 강화한다.

또한, 본 기술에 공지된 바와 같이, 원하는 펩티드 서열에 리더/시그날 펩티드 서열을 융합시켜 "키메라 펩티드"를 만들면 이와 같은 키메라 펩티드는 세포막을 통하여 세포질로 수송될 수 있다.

펩티드 분야에 숙지의 지식을 가진 자는 본 발명에 따른 G1 단백질분해성 활성의 펩티드 방해물질이란 좀더 안정적인 방해물질을 만들기 위해 G1 프로테아제에 결합하는 지를 신속하에 스크리닝할 수 있는 펩티드를 모방한 약물 또는 방해물질 을 포함한다는 것을 인지할 것이다.

전술한 것과 같이 세포막을 통하여 펩티드 방해물질의 수송을 실행하거나 강화한다는 의미는 G1 또는 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 이와 같은 효과를 세포내에서 발휘할 수 있는 다른 펩티드 및 단백질에 적용한다는 것을 의미한다.

며엣서를 통하여 언급된 "항체"에 대해서는 다클론성 항체, 단클론성 항체(mAbs), 키메라 항체, 가용성 또는 결합형의 라벨이 된 항체에 대한 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 효소에의한 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기술등과 같이 임의 공지된 기술에 의해 만들 수 있는 항체 단편을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

다클론성 항체는 항원으로 면역 처리한 동물의 혈장으로부터 유도한 이형 집단 항체 분자를 말한다. 단클론성 항체는 항원에 특이적인 실제 동종의 항체 집단을 의미하는데 이들 집단에는 실제 유사한 에피토프 결합 부위를 가진다. MAbs는 Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975); 미국 특허 4,376,110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES; A LABORATORY MANAUAL, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); and Colligan et al., eds, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y.,(1992-199)에 상술한 기술을 이용하여 만들 수 있다. 이와 같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, GILD 및 이의 하류를 포함하는 임의 이뮤노글로블린이 된다. 본 발명의 mAb를 만드는 하이브리도마는 in vitro, in vivo, in situ에서 배양할 수 있다. in vivo 또는 in situ의 고역가의 단클론항체 생산이 적절한 방법이다.

키메라 항체는 상이한 부분을 가지는 분자로 뮤린(murin) mAb와 사람 이뮤노글로블린 항상부분에서 유도한 다양한 부분을 가지는 다른 동물종에서 유도할 수 있는 것이다. 주로 키메라 항체는 면역원성을 감소시키는데 이용되고 생산성을 증가시키는데 이용되는데 가령 뮤린 mAb는 하이브리도마에서 높은 역가를 가지나 사람에서는 높은 면역원성을 가지기 때문에 사람/뮤린 키메라 mAb를 이용한다. 키메라 항체와 이를 생산하는 방법에 대해서는 본 분야에 공지되어 있다(Cabily et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81;3273-3277(1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646(1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270(1985); Taniguchi et al., European Patent Application 171496(published Feb 19, 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494(published Mar 13, 1996); Kudo et al., European Patent Application 184187(published June 11, 1986); Sahagan et al., J. Immunol 137;1066-1074(1986); Robinson et al., International Patent Application No. Wo 8702671(published May 7, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 3439-3443(1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84-214-218(1987); Better et al., Science 240;1041-1043(1988) and Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, supra.

항-이디오타입(항-Id) 항체는 항체의 항원 결합 부위와 일반적으로 연합하는 독특한 결정 부위를 인지하는 항체이다. Id 항체는 항-Id를 만든 mAb원으로써 동일 종 그리고 동일한 유전자형의 동물(가령, 쥐 strain)에 면역처리하여 준비할 수 있다. 면역처리된 동물은 이와 같은 이들 이디오타입 항원결정기에 대한 항체를 준비함으로써 면역처리된 항체의 이디오타입 결정부위를 인지하고 반응한다(참고 미국 특허 4,699,880).

항-id 항체는 다른 동물에서 소위 항-항-id 항체를 만드는 면역 반응을 유도하는 "이뮤노겐"으로 이용될 수 있다. 항-항-id는 항-ID를 유도한 원래 mAb의 에피토프와 동일하다. 따라서, mAb의 이디오타입 결정부위에 대한 항체를 이용함으로써 동일한 특이성을 가지는 항체를 발현시키는 다른 클론을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 G1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체(가령, NIK 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체)에 대항하여 발생된 mAb을 이용하여 BALB/c 쥐과 같은 적절한 동물에서 항-Id 항체를 유도할 수 있다. 이와 같은 면역처리된 쥐의 췌장 세포를 이용하여 항-Id mAb를 분비하는 항-Id 하이브리드를 생산한다. 또한, 항-Id mAb를 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 결합시켜 추가 BALB/c 쥐를 면역처리한다. 이들 쥐의 혈청에는 상기 G1 단백질 또는 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체의 에피토프에 특이적인 고유 mAb의 결합 성질을 가지는 항-항-Id 항체를 포함할 수 있다.

따라서, 항-Id mAbs에는 이들 고유의 이디오타입 에피토프 또는 GRB 단백질-a와 같은 평가할 에피토프와 구조적으로 유사한 "이디오토프(idiotopes)"를 가진다.

"항체"는 고유 항체뿐만 아니라 항원에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')₂와 같은 단편을 포함한다. Fab와 F(ab')₂ 단편은 고유 항체의 Fc 단편이 부족하고 순환계로 부터 더 빨리 제거되고 고유 항체보다는 다소 특이성이 적은 조직 결합을 가진다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24;316-325(1983)).

Fab와 F(ab')₂ 및 본 발명의 항체의 다른 단편을 이용하면 고유 항체 분자에 대해 본 발명에서 상술하고 있는 G1 단백질의 감지와 정량을 할 수 있다. 이와 같은 단편은 일반적으로 파파인(Fab 단편을 만듬) 또는 펩신(F(ab')₂ 단편을 만듬)과 같은 효소를 이용하여 단백질 분해에 의해 만들 수 있다.

항체는 분자에 특이적으로 반응한다면 특이적으로 분자에 결합할 수 있는 능력이 있는 항체에 분자가 결합한다. "에티토프"는 항체에 의해 인지되어 항체가 분자의 임의 부분에 결합할 수 있는 부분을 말한다. 에피토프 또는 "항원 결정부위"는 일반적으로 아미노산 또는 당의 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성이 있는 표면 그룹으로 구성되고 3차 구조적인 특징 및 특이적인 전하 특징을 가진다.

"항원"은 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 만들기 위해 동물에 추가 유도할 수 있는 항체에 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가진다. 상기에서 언급한 특이적인 반응은 매우 특이적인 방식으로 항원에 상응하는 항체에 반응을 하고 다른 항원에 의해 야기되는 다른 항체에는 반응하지 않는다는 것을 말한다.

본 발명에 유용한 항체의 일부분을 포함하는 항체를 이용하여 샘플에서 G1 단백질을 정량 또는 정성적으로 감지하거나 본 발명의 G1 단백질을 발현시키는 세 포의 존재를 확인할 수 있다. 이는 광 현미경, 흐름 세포 계산기 또는 형광측정 감지기가 결합된 형광 라벨된 항체(하기 참조)를 이용한 면역형광 기술을 이용한다.

본 발명의 항체(또는 이의 단편)를 조직학적으로 이용하여 면역형광 또는 면역전자 현미경에서 본 발명의 G1 단백질의 in situ 감지한다. In situ 감지는 환자에서 조직학적 견본을 떼내고, 본 발명의 라벨된 항체를 견본에 제공하여 이루어진다. 항체(또는 이의 단편)은 생물학적 샘플에 라벨된 항체(또는 이의 단편)을 제공하거나 겹치게 하여 적절하게 제공할 수 있다. 이와 같은 과정을 이용하여 G1 단백질의 존재를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 검사한 조직에서 이의 분포를 알 수 있다. 본 발명을 이용하면, 당업자는 이와 같은 in situ 감지를 위해 광범위한 다양한 조직학적 방법(가령 착색 과정)을 변형시킬 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 G1 단백질의 생물학적 검사는 일반적으로 G1 단백질을 확인할 수 있는 감지 가능한 라벨된 항체 존재하에 생물학적 유체, 조직 추출물, 임파세포 또는 백혈구세포와 같은 새로 수득한 조직 또는 조직 배양물에서 배양된 세포를 배양하고, 공지의 여러 가지 방법을 이용하여 항체를 감지하는 것으로 구성된다.

생물학적 샘플은 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 니트로셀룰로오즈 또는 다른 서포트 또는 담체와 같은 고형상 서포트 또는 담체로 처리한다. 서포트 또는 담체는 전술한 것과 같이 본 발명에 따른 감지 가능한 라벨링된 항체로 처리한 후에 적절한 완충액으로 세척한다. 고형상 서포트 또는 담체를 다시 세척하여 결합안된 항체를 제거한다. 고형상 서포트 또는 담체에 결합 된 라벨의 양을 통상적인 방법을 이용하여 감지한다.

"고형성 서포트", "고형상 담체", "고형 서포트", "고형 담체", "서포트" 또는 "담체"는 항원 또는 항체가 결합할 수 있는 임의 서포트 또는 담체를 의미한다. 공지의 서포트 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나이론 아밀라제, 천연 또는 변형된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철광을 포함한다. 천연 담체는 본 발명의 목적을 위해 어느 정도의 가용성 또는 불용성일 수 있다. 서포트 물질은 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한 임의 가능한 구조적인 모양을 가질 수 있다. 따라서, 서포트 또는 담체 모양은 비드와 같은 원형, 시험관의 내부 또는 막대의 외부와 같은 실린더형이 될 수 있다. 또는 표면은 쉬트, 테스트 스트립등과 같은 편평한 것일 수 있다. 적절한 서포트 또는 담체는 폴리스테렌 비드를 포함한다. 당업자는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 다른 적절한 담체를 이용할 수 있고 임의 실험을 통하여 결정할 수 있다.

상기에서 언급한 것과 같이 본 발명의 주어진 항체에 대한 결합 활성은 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 당업자는 일상적인 실험을 이용하여 각 측정에 적합한 실험 조건을 결정할 수 있다.

세척, 교반, 혼합, 여과등과 같은 다른 과정은 특정 상황에따라 또는 통성적인 과정에 따라 추가할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 효소를 연결하여 감지가능한 라벨링을 하는 한 가지 방법으로 효소 면역검사(EIA)에 이용할 수 있다. 다시 이와 같은 효소는 적절한 기질에 노출되었을 때, 분광광도계, 형광 측정 또는 다른 시각적 수단등으로 감지 할 수 있는 화학적 부분을 만드는 방식으로 기질과 반응한다. 항체에 감지가능한 라벨링을 하는데 이용되는 효소로는 말레이트 디하이드로게나제, 스타필로코커스 핵산분해효소, 델타-5-스테로이드 이소메라제, 이스트 알코올 디하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 디하이드로게나제, 트리오즈 포스페이트 이소메라제, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, 아스파라기나제, 포도당 산화효소, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레이즈, 카탈라제, 포도당-6-??스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라제, 아세틸콜린-에스테라제 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 효소에 대한 발색 기질을 이용하는 발색 방법으로 감지할 수 있다. 유사하게 준비된 표준과 비교하여 기질의 효소반응의 정도를 시각적으로 비교함으로써 감지할 수 있다.

다양한 다른 면역검사를 이용하여 감지할 수 있다. 가령, 항체 또는 항체 단편에 방사능활성 라벨링을 함으로써, 방사능 면역검사(RIA)를 통한 R-PTPase를 감지할 수 있다. RIA에 대해서는 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY(1978) with particular reference to the chapter entitled "An Imtroduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard. T.에 상세하게 기술하고 있다. 방사능활성 에피토프는 카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 자가방사 등에 의해 감지될 수 있다.

형광 화합물로 본 발명에 따른 항체를 라벨할 수 있다. 형광 라벨된 항체를 적절한 파장의 빛에 노출시키면, 형광이 존재하기 때문에 존재를 확인할 수 있다. 흔히 이용되는 형광 라벨링 화합물중에는 형광 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리틴, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플로로카민 등을 포함한다.

항체는 ¹⁵²Eu 또는 다른 란탄이드과 같은 형광을 발생하는 금속을 이용하여 라벨링을 할 수 있다. 이와 같은 금속은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(ETPA)과 같은 금속 킬레이트 기를 이용하여 항체에 결합할 수 있다.

항체는 화학적 발광 화합물에 결합시켜 감지 가능한 라벨링을 할 수 있다. 화학적 발광 화합물이 결합된 항체는 화학 반응 과정동안에 발생하는 발광을 존재를 감지함으로써 결정할 수 있다. 특히 유용한 화학적 발광 라벨링 화합물의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 트레오마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리딘염 및 옥살레이트 에스테르이다.

유사하게, 생물학적 발광 화합물을 이용하여 본 발명의 항체를 라벨링시킬 수 있다. 생물학적 발광은 촉매 단백질이 화학적 발광 반응의 효과를 증가시키는 생물계에서 볼 수 있는 일종의 화학적 발광이다. 생물학적 발광의 존재는 발광의 존재를 감지하여 결정할 수 있다. 라벨링을 목적으로 하는 중요한 생물학적 발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿠오린이 있다.

본 발명의 항체 분자는 "two-site" 또는"sandwich" 검사로 공지된 면역측정 검사에 이용할 수 있다. 일반적인 면역측정 검사에서 라벨안된 항체(또는 항체의 단편)의 양은 고형 서포트 또는 담체에 결합된 것이고 감지 가능한 라벨된 가용성 항체를 첨가하면 고형상 항체, 항원 및 라벨된 항체간에 형성된 세 가지 복합체의 감지 및 정량할 수 있다.

일반적인 그리고 적절한 면역측정 검사에는 "forward" 검사를 포함하는데 이는 고형상에 결합된 항체를 우선 고형상과 항원 복합체를 형성할 수 있도록 샘플에서 항원을 추출하기 위해 샘플과 접촉시킨다. 적절한 배양 기간 후에, 고형상 서포트 또는 담체를 세척하여 반응 안한 항원을 포함하는 유체 샘플 잔류물을 제거하고 양을 모르는 라벨된 항체를 포함하는 용액과 접촉시킨다(이는 "reporter" 분자로 작용을 함). 고형 서포트 또는 담체에 결합된 항원 복합체에 라벨된 항체를 결합시키기 위한 제2배양 기간 후에, 고형 서포트 또는 담체는 2번째로 세척하여 반응 안된 라벨링 항체를 제거한다.

또 다른 형태의 "sandwich" 검사는 본 발명의 항원을 유용하게 이용하는 것으로 소위 "simultaneous" 또는 "reverse" 검사를 이용한다. 동시검사는 고형상 서포트에 결합된 항체와 라벨된 항체를 동시에 테스트할 샘플에 첨가하는 1단계 배양 단계로 구성된다. 배양이 완료된 후에, 고형상 서포트 또는 담체를 세척하여 유체 샘플 잔류물과 결합 안된 라벨된 항체를 제거한다. 고형상 서포트 또는 담체와 연합된 라벨된 항체는 "forward" 샌드위치 검사와 같이 결정된다.

"reverse" 검사에서, 유체 샘플에 라벨된 항체 용액을 우선 첨가하고 적절한 배양 시간 후에 고형 서포트 또는 담체에 라벨 안된 항체를 첨가한다. 제2배양 후에, 고형상은 통상의 방식으로 세척하여 테스트할 샘플에 잔류물과 반응 안된 라벨링된 항체 용액을 제거한다. 고형 서포트 또는 담체와 연합된 라벨된 항체는 "simultaneous" 또는 "forward" 검사와 같이 결정할 수 있다.

본 발명의 G1 단백질은 임의 표준 재조합 DNA 과정(Sambrook et al., 1989, and Ansabel et al., 1987-1995, supra)을 이용하여 생산할 수 있는데, 즉 본 발명의 단백질을 인코드하는 진핵 또는 원핵 벡터를 당분야에 공지된 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 형질도입시킨다. 따라서, 본 발명은 이와 같이 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 이용되는 발현 벡터 및 형질변환된 숙주에 관계한다. 전술한 것과 같이, 이와 같은 단백질에는 이들의 생물학적 활성 유사체, 단편, 유도체등이 포함되고, 이들을 인코드하는 벡터에는 이와 같은 유도체 및 단편을 인코드하는 것도 포함되고, 형질변환된 숙주에는 이와 같은 유도체 및 단편을 생산하는 것도 포함된다. 형질변환된 숙주에 의해 생산되는 이와 같은 단백질의 유도체는 단백질 또는 이의 유사체 및 단편을 표준 방법에 따라 변형된 유도체가 된다.

본 발명은 또한 G1 단백질을 인코드하는 재조합 동물 바이러스로 구성된 제약학적 조성물에 관계하는데, 벡터에는 세포에 G1 서열을 삽입하기 위한 특정 표적 세포(암 세포) 표면 단백질에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질을 인코드한다. 또한 본 발명의 제약학적 조성물에는 활성성분으로써 G1 단백질 서열의 안티-센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드(a)과 G1 단백질 또는 동소체의 단백질분해 활성을 차단하는 약물(b)로 구성된다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물에는 원하는 목적을 실행하기 위해 충분한 양의 활성성분을 포함한다. 또한, 제약학적 조성물은 제약학적으로 이용할 수 있는 조제물에 활성화합물을 프로세싱할 수 있는 그리고 환자에게 투약할 조제물을 안정화시킬 수 있는 부형제 및 보조제로 구성된 제약학적 조성물 수용 가능한 담체로 구성되는데 이는 당업자에게 공지되어 있다.

G1 단백질 및 이의 동소체 또는 이소타입은 공동 출원에서 언급하고 있는 것과 같이, 세포내 시그날발생 경로에 관여하는 다양한 다른 단백질의 발현에는 유사한 방식으로 상이한 패턴의 이소타입과 함께 여러 조직에서 상당히 다른 수준으로 발현되는 것으로 보인다. 이와 같은 차이는 Fas/APO1-리간드와 TNF에 반응하는 조직-특이적 반응을 일으키게 한다. 다른 CED3/ICE 동사체의 경우와 같이(Wanh etal.,; Alnemri et al., 1995), 본 발명은 불완전한 CED3/ICE부분(가령, MACHα3)을 포함하는 MACH 동소체는 공동 발현된 MACHα1-MACHα2 분자의 활성에 방해효과를 가지는 것으로 밝혀졌고; 이는 Fas/APO1과 p55-R에 의한 세포 사멸을 유도하는 것을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 세포에서 이와 같은 저해성 동소체의 발현은 Fas/APO1 및 TNF-중개된 세포독성에 대해 세포의 자가-방어 기작에 관여한다. 적어도 일부 G1 동소체의 유사한 방해 효과를 예측할 수 있다. CED3/ICE 족의 다른 프로테아제에서 관찰되는 것보다 상당히 초과한 MACH 동소체의 광범위한 이형성(heterogeneity)으로 인하여 활성 MACH 동소체의 기능을 매우 정교하게 조절할 수 있도록 한다.

가능한 G1 단백질중의 일부는 다른 기능을 할 수 있다. 예를 들면, MORT-1 및 MACHα1 모두에 결합하는 기존에 발견된 MACHβ1의 능력은 이와 같은 동소체가 실제 효소적으로 활성이 있는 동소체의 활성을 강화시킨다는 것이다. 이와 같은 동소체에 의해 형질변환된 293-EBNA 및 MCF7에서는 약한 세포독성이 관찰되었고, HeLa 세포에서는 상당한 세포독성이 나타났는데, 이는 트랜스펙트된 MACHβ분자에 결합하는데 있어서, 내생적으로 발현된 MACHα분자의 활성화를 반영하는 것이다. 일부 MACH 동소체는 다른 Fas/APO1 및 TNF 수용체의 비독성 효과에 관여하는 분자의 결합 부위로 작용할 수 있다. 유사한 방식으로, G1 또는 이의 동소체는 이와 같은 다른 분자의 결합 부위로써 작용하거나 이와 같은 활성을 증가시킬 수 있다.

세포 사멸의 원인이 되는 Fas/APO 수용체 능력 및 다른 조직-손상 활성을 자극하는 TNF 수용체의 능력으로 인하여 이들 수용체의 기능의 변형은 유기체에 상당히 유해하다. 또한, 이들 수용체의 과도한 또는 결핍된 기능은 다양한 질병의 병인에 기여한다(Vassalli, 1992, Nagata and Golstein, 1995). 수용체의 시그날 발생에 참여하는 분자의 확인 및 이들 분자의 활성을 조절하는 방법을 발견하는 것이 새로운 치료요법을 발견하는 것이다. TNF- 또는 Fas/APO1-중재된 독성에서 G1의 중추 역할로 보이는 것중에서, 일부 다른 CED3/ICE 페밀이 단백질에서 실시한 것과 같이(Thornberry et al., 1994; Miller et al., 1995; Machima et al., 1995; Milligan et al., 1995; 뚬갸 et al., 1995; Los et al., 1995), G1의 가능한 단백질 분해 기능을 차단할 수 있는 약물을 고안하는 것이다. G1 분자내에 분명하게 존재하는 CED3/ICE 상동부분의 톡특한 서열은 이 활성에 특이적으로 영향을 줄 수 있는 약물을 고안할 수 있도록 한다. 이와 같은 약물은 다른 CED3/ICE 페밀 리가 관련된 생리학적 세포-사멸 과정에 간섭없이 G1이 관계된 과도한 면역-중개된 세포독성으로부터 보호를 한다.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명을 하는데 이에 국한시키지는 않는 다.

i) 두 가지 하이브리드 스크린과 두 가지 하이브리드 β-갈락토시다제 발현 테스트; (ii) 단백질의 유도된 발현, 대사적 라벨링 면역침전; (iii) in vitro 결합; (iv) 세포독성의 평가; (v) 노던 분석 및 서열 분석; 참고 실시예 1(Boldin et al., 1995b) 및 실시예 2, 3(Boldin et al., 1996)에서는 MORT-1 및 MORT-1 결합 단백질에 대한 것으로 본 발명의 G1 및 이의 동소체의 이에 상응하는 분리, 클로닝, 특징화에 동일하게 적용할 수 있다. 이와 같은 과정은 하기 실시예 1에서 설명하는 것과 같이 본 발명에 따른 G1의 분리, 클로닝, 특징화와 동일하다(하기 참고 실시예 1-3은 공동 출원중인 이스라엘 출원 114615, 114986, 115319, 116588, 117932, 120367 및 PCT/US96/10521에 상세하게 설명을 하고 있다. 또한, "도면의 간단한 설명"은 본 발명의 상세한 설명에 대해 실시예 1의 일부분과 본 발명에 따라 실행되었고, 실시예 1의 내용으로 간주한다.

참고 실시예 1: FAS-R의 세포내 도메인에 결합하는 MORT-1을 클로닝 및 분리

(i) 이중-하이브리드 스크린 및 이중-하이브리드 β-갈락토시다제 발현 테스트

FAS-R의 세포내 도메인과 상호작용하는 단백질을 분리하기 위해, 이스트 이중-하이브리드 시스템을 이용한다(Fields and Song, 1989). 간략하게 설명하면, 이와 같은 이중-하이브리드 시스템은 두 개 별도 도메인, DNA 결합 도메인, 활성 도메인을 가지는 GAL4과 같은 진핵 전사 활성물질을 복원시켜 in vivo에서 특이적인 단백질-단백질 상호작용을 감지하는 이스트계 유전자 검사로써, 이때 발현되어, 함께 결합함으로써 복원된 GAL4 단백질을 형성하면, 도메인은 상류 활성화 서열에 결합할 수 있고, 따라서, lacZ 또는 HIS3와 같은 리포터 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 활성화시키는데, 이와 같은 발현은 배양된 세포에서 바로 관찰된다. 이와 같은 시스템에서, 추천되는 상호작용하는 단백질의 서열을 별도 발현 벡터로 클론시킨다. 한 개 발현 벡터에서, 한가지 권장된 단백질의 서열은 GAL4 DNA-결합 도메인 서열과 동일한 상으로 클론되어, GAL4 DNA-결합 도메인을 가지는 하이브리드 단백질이 생성되고, 다른 벡터에서는 두 번째로 권장되는 단백질 서열이 GAl4 활성화 도메인 서열과 동일한 상에 클론되어, GAL4-활성화 도메인을 가지는 하이브리드 단백질을 만든다. 이와 같은 이중-하이브리드 벡터는 상류 GAL4 결합 부위의 조절하에, lacZ 또는 HIS3 리포터 유전자을 가지는 이스트 숙주 균주에 공동-형질도입시킨다. 두 개 하이브리드 단백질을 발현시키고, 서로 상호작용 할 수 있는 형질변환된 숙주 세포(공동 형질변환체)는 리포터 유전자를 발현시킬 수 있다. LacZ 리포터 유전자의 경우에, 이와 같은 유전자를 발현하는 숙주 세포는 X-gal이 첨가된 배양에서는 푸른 색을 띈다. 푸른 색 콜로니는 두 개 클론된 추천 단백질은 서로 상호작용한다는 것을 나타낸다.

이와 같은 두 개 하이브리드 시스템을 이용하면, 세포내 도메인, FAS-IC이 벡터 pGBT9(GAL4 DNA-결합 서열을 가짐; CLONTECH, USA)내로 별도로 클론되어, GAL4 DNA-결합 도메인을 가지는 융합 단백질을 만든다. FAS-R를 pGBT9로 클로닝 하는 경우에, FAS-R(WO 9531544)의 전체 길이 cDNA를 인코드하는 클론을 이용하는데, 이때 세포내 도메인(IC)은 다양한 제한효소를 이용한 표준 과정으로 절단하고, 이를 분리하여, 다중 클로닝 부분(MCS)에 개방된 pGBT9의 적절한 제한 효소 부위로 클론시킨다. FAS-IC는 고유 FAS-R의 아미노산 잔기 175-319에서 이어지고, FAS-IC인 아미노산 잔기 175-319를 포함하는 부분이 pGBT9 벡터에 클론된다.

이와 같은 하이브리드(키메라) 벡터를 GAL4 활성화 도메인을 가지는 pGAD GH 벡터에 클론된 사람 HeLa 세포의 cDNA 라이브러리와 함께 HF7c 이스트 숙주 균주에 공동 트랜스펙트시킨다(상기 모든 벡터, HeLa 세포 cDNA를 가지는 pGBT9, pGAD GH 및 이스트 균주는 Clontech Laboratories, Inc., USA, MATCHMAKER Two-Hybrid System, #PT1265-1에서 구입하였다). LACZ 활성을 위해, 베양 배지에 X-gal을 참가하여 lacZ 유전자를 발현시키는 능력에 대해 테스트를 받는데, 이때 X-gal은 β-갈락토시다제에 의해 푸른색 생성물로 대사된다. EK라서, 푸른 색 콜로니는 활성 lacZ 유전자를 나타낸다. lacZ 유전자의 경우에, 형질변환된 클론에서 GAL4 저사 활성물질은 활성형으로 존재해야 하는데, 즉, 하이브리드 벡터에 의해 인코드된 GAL4 DNA-결합 도메인은 또 다른 하이브리드 벡터에 의해 인코드되는 GAL4 활성 도메인과 적절하게 복합되어야 한다. 각 GAL4 도메인에 융합된 두 개 단백질이 서로 안정적으로 상호작용(결합)하는 경우에만 이와 같은 복합이 가능하다. 따라서, 분리된 His⁺ 및 푸른색(LACZ⁺) 콜로니는 FAS-IC를 인코드하는 벡터 및 FAS-IC에 안정적으로 결합할 수 있는 사람 HeLa 세포의 단백질 생성물을 인코드하는 벡터로 동시에 트랜스펙트된 콜로니이다.

상기 His⁺, LACZ⁺ 이스트 콜로니의 플라스미드 DNA를 분리하고, 대장균(E. coli) 균주 HB101에 표준 방법에 따라 전기천공시키고, 그 다음 Leu⁺ 및 암피실린 저항성 형질변환체를 선택하는데, 이때 이와 같은 형질변환체는 하이브리드 pGAD GH 벡터를 가지는 것으로, 이 벡터에는 Amp^R 및 Leu2 코딩 서열을 모두 가진다. 따라서, 이와 같은 형질변환체는 FAS-IC에 결합할 수 있는 새로 확인된 단백질을 인코드하는 서열을 가지는 클론이다. 그 다음 이와 같은 형질변환된 대장균(E. coli )으로부터 플라스미드 DNA을 분리하고, 다음을 테스트한다;

a) 상기에서 제시한 것과 같이 고유 FAS-R 세포내 도메인 하이브리드 플라스미드(하이브리드 pTGB9는 FAS-IC를 가짐)와 함께 이를 이스트 균주 HF7에 동시에 트랜스펙트시킨다. 기준으로는 무관한 단백질 인코드 서열을 가지는 벡터를 이용하는데, 가령, pACT-라민 또는 pGBT9를 이용하여 FAS-IC-결합 단백질(가령, MORT-1)-인코드 플라스미드와 함께 동시에 트랜스펙트시킨다. 동시에 트랜스펙트된 이스트는 그 다음 His^- 배지에서 생장 또는 상이한 수준의 3-아미노트리아졸에 대해 생장을 테스트하고;

b) (a)에서 설명하는 기준 플라시미드 및 플라스미드 DNA 및 고유 FAS-IC 하이브리드를 다시 이스트 숙주 세포 SFY526에 형질도입시켜, LACZ⁺ 활성(β-gal 형성 효과 즉, 푸른 색의 형성)을 결정한다.

상기의 테스트 결과에서는 콜리니 색으로 판단하였을 때, His^- 배지에 있는 콜로니 생장 패턴이 LACZ 활성 패턴과 동일하였고, 이는 His⁺ 콜로니는 LACZ⁺ 라는 것을 말한다. 또한, 액체 배지(적절한 배양 조건)에서 LACZ 활성은 SFY526 이스트 숙주로 GAL4 DNA-결합 및 활성화 도메인 하이브리드를 트랜스펙트시킨 후에, 평가하는데, 이때 숙주는 HF7 이스트 숙주 세포보다 GAL4 전사 활성물질과 LACZ 유도성이 더 크다.

상기 과정을 이용하여, HF1으로 기존에 기정된 단백질과 "수용체-중개된 독성"을 가지는 MORT-1를 확인하고, 분리하고, 특징을 조사하였다.

또한, 다수의 이중-하이브리드 β-갈락토시다제 발현 테스트에서, β갈락토시다제 발현은 적절한 필터 검사를 통하여 평가된다는 것이다. 스크리닝에서, 약 3 ×10⁶ cDNAs중 다섯 개에서 MORT-1 삽입체가 있다는 것이 밝혀졌다. 이와 같이 분리 클론된 MORT-1 cDNA 삽입체는 표준 DNA 서열 과정을 이용하여 서열화한다. MORT-1의 서열은 DNA 서열로부터 유추한다(MORT-1 DNA 및 아미노산 서열의 경우는 공동 이스라엘 출원 112,022, 112,692, 114,615 및 이에 상응하는 PCT 출원 No. WO96/18641을 참고로 한다). cDNA 삽입체에 의해 인코드된 단백질에 잔기 번호는 Swiss-Prot data bank의 것과 같다). PCR을 이용하여 결손 돌연변이을 만들고, 올리고뉴클레오티드-직접적인 돌연변이 발생에 의해 접 돌연변이를 만든다(Current Protocols in Molec. Biol., 1994).

(ii) 유도된 발현, 대사 라벨링 및 단백질의 면역침전

FAS-R의 막통과 및 세포내 도메인(아미노산 153-319)에 p55-R의 세포외 도메인(아미노산 1-168)으로 구성된 키메라인 MORT-1 N-연결된 FLAG 옥타펩티드(FLAG-MORT-1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R 및 기준으로 작용하는 루시페라제 cDNA를 HeLa 세포에 발현시켰다. 테트라사이클린-조절된 트랜스활성물질을 발현하는 HeLa 세포 클론(HtTA-1)에서, 테트라사이클린-조절된 발현 벡터를 이용하여 발현시킨다(Gossen and Bujard, 1992; see also Boldin et al., 1995). 트랜스펙션후에, 메티오닌 및 시스테인이 부족하나 2% 투석된 태아 송아지 혈청이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 37℃ 4시간 동안 추가 배양하여, [³⁵S]메티오닌 및 [³⁵S]시스테인(DUPONT, Wilmington, DE, USA and Amersham, Buckinghamshire, England)으로 대사 라벨링을 18시간동안 실시한다. 그 다음 세포는 RIPA 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1mM EDTA)로 용해시키고, 용해물질은 무관한 토끼 항혈청(3㎕/㎖) 및 단백질 G 세파로즈 비드(Pharmacia, Uppsala, Sweden; 60 ㎕/㎖)와 함께 배양하여 미리 제거한다. FLAG 옥토펩티드(M2; Eastman Kodak), p55-R (#18 and #20, Engelmann et al., 1990), FAS-R(ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca, USA)에 대한 생쥐 단클론 항체(5㎕/aliquot)와 용해물질 0.3㎖을 4℃에서 1시간 배양시켜 면역 침전을 시키는데, 기준으로는 이소타입이 일치되는 생쥐 항체를 이용하였고, 이어서 단백질 G 세파로즈 비드(30㎕/aliquot)로 추가 1시간동안 배양하였다.

(iii) in vitro 결합

야생형 또는 돌연변이된 Fas-IC와 클루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)를 생산하고, 글루타티온-아가로즈 비드에 흡착시킨다(Boldin et al., 1995; Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Frangioni and Neel, 1993). GST-Fas-IC에 대사적으로 라벨된 FLAG-MORT-1 융합 단백질이 결합되는 것은 FLAG-MORT-1를 발현시키는, [³⁵S]메티오닌으로(60μCi/㎖) 대사적으로 라벨된 HeLa 세포 추출물과 비드를 2시간동안 4℃에 배양하여 평가한다. 추출물을 준비한 완충액은 다음으로 구성된다; 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% NP-40, 1mM 디티오트레톨, 1mM EDTA, imM 페닐메틸설포닐 플로라이드, 20㎍/㎖ 아프로토닌, 20㎍/㎖ 루페틴, 10mM 플로오르 나트륨, 0.1mM 바나데이트 나트륨(1㎖ per 5 ×10⁵ cells).

iv) 유도된 MORT-1의 발현에 의해 촉진되는 세포독성 평가

테트라사이클론-조절된 발현벡터로 MORT-1, Fas-IC, p55-IC, 루시페라제 cDNAs를 섭입시키고, 분비되는 태반 알칼리 프로테아제 cDNA와 함께 HtTA-1 세포(HeLa 세포)(Gossen and Bujard, 1992)에 트랜스펙트시키는데, SV40 프로모터 제어하에 둔다(pSBC-2 vector, Dirks et al., 1993). 트랙스펙션 후 40시간뒤에, 중성-레드 수용 검사(Wallach, 1984)를 이용하여 세포 사멸을 평가하거나, 배양 최종 5시간에 생장 베지로 분비되는 태반 알칼리 포스포타제(Berger et al., 1988)의 양을 측정하여, 트랜스펙트된 cDNAs를 발현시키는 세포에서 특정 사멸을 평가한다.

FAS-IC에 결합하는데 관련되는 MORT-1 단백질 부분을 분석하기 위해 또 다른 일련의 실험에서, 테트라사이클린-조절된 발현 벡터(HtTA-1)를 이용하여, 테트라사이클린-조절된 트랜스활성물질(HtTA-1)를 포함하는 HeLa 세포에 일시적으로 다음 단백질을 발현시킨다; 사람 FAS-R; 사람 FAS-R와 MORT-1의 N-말단 부분("MORT-1 머리"에서 아미노산 1-117); 사람 FAS-R 및 MORT-1의 C-말단, 여기에는 "사멸 도메인"("MORT-1 DD"에서 아미노산 130-245); FLAG-55.11(FLAG 옥타펩티드의 N-말단에 bd합된 단백질 55.11의 아미노산 309-900, 단백질 55.11는 p55-IC-특이적인 결합 단백질이다). 트랜스펙션후 12시간 뒤에, 세포는 트립신으로 처리하고, 30,000 cells/well 농도로 재접종한다. 24시간 동안 추가로 배양한 후에, 세포는 6시간동안 10㎍/㎖ 사이클로헥시미드 존재하에, 다양한 농도(0.001-10㎍/㎖)의 단클론항체에서 FAS-R(monoclonal antibody CH-11, Oncor, Gaithersburg, MD, USA)의 세포외 도메인에 대한 단클론 항체로 6시간동안 처리한다. 중성-레드 수용 검사를 이용하여 세포 사멸을 평가하였는데, 그 결과는 사이클로헥시미드만으로 배양한(항-FAS-R 단클론 항체 CH-11 없이) 세포와 비교하였을 때, 살아있는 세포 %로 나타낸다.

v) 노던 및 서열 분석

HeLa 세포의 전체 RNA에서 Poly A⁺ RNA를 분리하였다(Oligotex-dT mRNA kit. QIAGEN, Hilden, Germany). 통상적인 방법을 이용하여, MORT-1 cDNA를 프로브로 하여 노던 분석을 한다(Bolding et al., 1995). 디데옥시 사슬 종료 방법을 이용하여 양방향에서 MORT-1의 뉴클레오티드 서열을 결정한다.

이중 하이브리드 과정에 의해 클론된 MORT-1 cDNA의 서열을 분석한 결과 신규한 단백질을 인코드한다는 것이 밝혀졌다. Fas-IC에 대해 단백질의 특이적인 결합을 평가하기 위해("수용체-중개된 세포독성의 중개물질"에 대해 MORT-1), 이중 하이브리드 테스트를 실시하고, 이것이 결합되는 Fas-IC의 특정 부분을 밝히는 실험에서 다음과 같은 사항을 발견하였다; (a) MORT-1 단백질은 사람 및 생쥐의 Fas-IC에 모두 결합하나, TNF/NGF 수용체 페밀리의 세가지 수용체(가령, p55, p75 TNF 수용체 및 CD40)을 포함하는 다른 테스트된 단백질에는 결합하지 않았다; (b) FAS-R의 "사멸 도메인"에서 위치 225(Ile)에 치환시키면, in vitro 및 in vivo의 시그날을 제거하였고(lpr ^cg 돌연변이(Watanabe-Fukunaga et al., 1992; Itoh and Nagata, 1993), FAS-IC에 MORT-1가 결합하는 것을 방해하였다; (c) FAS-R에 있는 MORT-1 결합 부위는 이 수용체의 "사멸 도메인"내에 있다; (d) MORT-1는 자체에도 결합한다. 이와 같은 자체 결합 및 FAS-R에 MORT-1의 결합은 단백질의 다른 부분이 관여한다; 잔기 1-117에 상응하는 MORT-1의 단편은 전체 길이의 MORT-1에 결합하나, 이 자체 또는 FAS-IC에는 결합하지 않는다. 역으로, FAS-R에 결합하는 잔기 130-245에 상응하는 단편은 MORT-1에는 결합하지 않는다. 또한, p55-IC 자체 연합에 p55-R가 중요한 것과 같이, FAS-R의 "사멸 도메인"은 FAS-R 자체-연합에 중요하다. 이들 "사멸 도메인"의 양측을 결손시키도 이들의 자체-연합에는 영향을 주지않지만, "사멸 도메인"내부에 결손이 있는 경우에, 자체-연합에 영향을 받는다. MORT-1의 경우에, FAC-IC에 MORT-1가 결합하는 것은 FAS-R의 완전한 "사멸 도메인"에 따라 달라지나, FAS-IC 결합의 경우에 FAS-R "사멸 도메인"의 외부와 관련된다.

β-갈락토시다제 발현 필터 검사를 이용하여, 트랜스??트된 SFY526 이스트내에 Gal4 DNA 결합 도메인 및 활성화-도메인 구조(pGBT9 및 pGAD-GH)에 의해 인코드된 단백질의 상호작용을 평가한다. DNA-결합 도메인에는 사람의 Fas-IC 4개 구조, 225위치에서 Ile이 Leu로, Ile이 Ala로 각각 치환된 두 개 전체 길이 구조(I225N, I225A)를 포함하는 생쥐 Fas-IC의 4개 구조, 세가지 MORT-1 구조를 포함한다. 활성화된 도메인 구조에는 세가지 MORT-1 구조; 전체 길이의 사람 Fas-IC 구조를 포함하는데; MORT-1 부분은 DNA-결합 도메인 구조와 같고, Fas-IC 부분은 DNA-결합 도메인 구조와 같다. 사람 p55 TNF 수용체(p55-IC 잔기 206-426), 사람 CD40(CD40-IC, 잔기 216-277), 사람 p75 TNF 수용체(p75-IC, 잔기 287-461), 라민, 사이클린 D, "빈" Gal4(pGBT9) 벡터는 DNA-결합 도메인 구조에서 음성 기준으로 작용한다. SNF-1 및 SNF4는 DNA 결합-도메인(SNF1) 및 활성화-도메인 구조(SNF4)형에서 양성 기준으로 작용한다. "빈" Gal4 벡터(pGAD-GH) 또한, 활성화 도메인 구조에서 음성 기준으로 작용한다. 상기 분석 결과를 나타내는데 이용된 심볼 "++" 및 "+"는 검사후 30분 및 90분에 짙은 색을 발생한다는 것을 의미하고, "-"는 24시간이내에 색이 발생되지 않는다는 것을 의미한다.

FLAG 옥타펩티드(FLAG-MORT-1)의 N-말단에 융합된 MORT-1 분자는 HeLa 세포에서 네 가지 별개 크기 즉, 27, 28, 32, 34kD 단백질을 만든다. FLAG-MORT-1 융합 단백질로 트랜스펙트된 HeLa 세포 추출물로부터 면역침전을 실시하여 Fas-IC와 MORT-1의 상호작용을 in vitro에서 관찰하는데, 기준으로는 루시페라제 cDNA를 이 용하여 항-FLAG 항체(aFLAG)로 면역침전을 실시한다. MORT-1 및 FAS-IC사이에 in vitro에서 상호작용을 설명하는데, 이때 MORT-1는 트랜스펙트된 HeLa 세포 추출물에서 얻은 [³⁵S]메티오닌-대사적으로 라벨된 FLAG-MORT-1 융합 단백질형태가 되고, FAS-IC는 FAS-IC의 225위치에서 치환 돌연변이를 가지는 사람 및 생쥐 GST-FAS-IC 융합 단백질 형이고, 모든 GST-FAS-IC 융합 단백질은 대장균(E. coli)에서 생산된다. 이후에 MORT-1-FLAG 융합 단백질을 포함하는 추출물과 상호작용 시키기전에 GST-융합 단백질을 글루타티온에 부착시키고, SDS-PAGE를 한다. SDS-PAGE후에, 트랜스펙트된 HeLa 세포에서 FLAG 옥타펩티드와 융합되어 생산되는 [³⁵S] 라벨된 MORT-1(FLAG-MORT-1)가 GST, 사람 또는 생쥐 Fas-IC와 융합된 GST(GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) 또는 225위치에서 Ile가 Ala로 치환된 돌연변이를 포함하는 Fas-IC와 융합된 GST에 결합하는 것을 in vitro 상호작용으로 평가한다. 네가지 모든 FLAG-MORT-1 단백질에서 GST-Fas-IC 단백질과 배양하였을 경우에 Fas-IC에 결합하는 능력이 있는 것으로 나타났다. 이스트 이중-하이브리드 테스트에서, MORT-1는 lpr ^cg 돌연변이 부위(I225A)에서 치환된 GST-Fas-IC 융합 단백질에는 결합하지 않았다.

FLAG-MORT-1 cDNA에 의해 인코드되는 단백질은 FAS-R의 세포내 도메인에도 결합하고, FAS-R 키메라의 세포내 도메인에도 결합하는데, 이의 세포외 도메인이 HeLa 세포에서 이들 수용체와 공동 발현될 때 p55-R(p55-FAS)의 것으로 대체되었다. 이와 같은 경우에, 다양하게 트랜스펙트된 HeLa 세포의 면역 침전에서 관찰된 것과 같이, 트랜스펙트된 HeLa 세포에서 FAS-IC와 MORT-1의 상호작용은 이들 두 가지 단백질을 인코드하는 구조로 공동 트랜스펙트된 세포에서 MORT-1 및 FAS-IC간의 상호작용의 특이성을 설명한다. 따라서, FLAG-MORT-1 융합 단백질을 발현시키고, HeLa 세포에서 또는 사람 FAS-R, FAS-R 키메라에서 [³⁵S]시스테인(20

/㎖) 및[³⁵S]메티오닌(40

/㎖)으로 대사적으로 라벨을 시키는데, 이때 FAS-R의 세포외 도메인은 사람 p55-R(p55-FAS) 또는 사람 p55-R에서 이에 상응하는 부분으로 치환되고, 이를 음성 기준으로 삼는다. 다양한 특정 항체를 이용하여 공동 발현된 수용체와 교차 MORT-1를 통신시킨다. 나타난 결과에 따르면, FLAG-MORT-1는 FAS-R의 세포내 도메인에 결합하는 능력이 있고, 뿐만 아니라 HeLa 세포에서 이들 수용체와 동시에 발현되었을 경우에, p55-R의 세포외 도메인과 FAS-R의 세포내 도메인을 가지는 FAS-R-p55-R 키메라의 세포내 도메인에도 결합할 수 있다. 또한, 트랜스펙트된 세포 추출물에서 FLAG-MORT-1를 면역침전시키면, 공동 발현된 FAS-R 또는 공동 발현된 p55-FAS 키메라가 침전된다. 역으로, 이들 수용체를 면역침전시키면, FLAG-MORT-1가 공동 침전된다.

프로브로 MORT-1 cDNA를 이용하는 노던 분석에 따르면, HeLa 세포에서 한 개의 하이브리드 전사체가 나타난다. 트랜스펙트된 세포로부터 poly A⁺ RNA(0.3㎍)를 MORT-1 cDNA와 하이브리드시킨 노든 블랏에서, RNA 전사체의 크기(약 1.8 kb)는 MORT-1 cDNA의 크기(약 1702개 뉴클레오티드)와 근접한 것으로 밝혀졌다.

서열 분석에서, cDNA는 약 250개 아미노산의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 상기 공동 계류중인 출원에서, MORT-1 DNA 및 아미노산 서열을 나타내고 있다(WO96/18641). 이 서열에서 "사멸 도메인" 모티프에 밑줄을 쳐놓았는데, 시작하는 Met 잔기(위치 19, 굵은 M) 및 종료 코돈(769-771에 *표). 이와 같은 "사멸 모티프"는 공지의 p55-R 및 FAS-R "사멸 도메인" 모티프(p55DD 및 FAS-DD)와 상동성을 공유한다. MORT-1의 정확한 C-말단을 결정하고, MORT-1의 정확한 N-말단(처음 Met 잔기)에 관련된 증거를 얻기 위해, 다음과 같은 추가 실험을 실시한다;

상기에서 설명하는 방법을 이용하여, FLAG 옥타펩티드가 N-말단에 융합된 MORT-1 분자(FLAG-MORT-1)를 인코드하는 여러 가지 구조체를 만들고, HeLa 세포에서 발현시키는데, 여기에는 ³⁵S-시스테인 및 ³⁵S-메티오닌을 이용하여 발현된 단백질에 대사적으로 라벨을 시킨다. MORT-1-인코드 서열의 여러 다른 부분을 포함하는 cDNA에 의해 MORT-1-FLAG 분자가 인코드된다;

i) 뉴클레오티드 1-145가 결손된 MORT-1의 cDNA의 5'말단에 연결된 FLAG 옥타펩티드;

ii) MORT-1 전체 길이 cDNA의 5'말단에 연결된 FLAG 옥타펩티드;

iii) 뉴클레오티드 1-145 및 832-1701가 결손되고, 142-144 위치의 코돈 GCC가 TCC로 돌연변이되어, 이 부위에서 해독을 시작하지 못하게 되는 MORT-1의 cDNA의 5'말단에 연결된 FLAG 옥타펩티드;

상기 FLAG-MORT-1 융합 단백질의 발현 후에, 항-FLAG 단클론 항체 또는 기준 으로 항-p75 TNF-R을 이용하여 전술한 것과 같이 면역침전시키고, SDS-PAGE(10% 아크릴아미드)후에, 자가방사능사진을 찍는다. FLAG-MORT-1 융합 단백질을 분석한 결과, MORT-1의 C-말단으로 확인되었고, MORT-1의 N-말단이 서열의 49위치에 있다는 증가를 제공하였다.

또한, 5'말단에 FLAG 옥타펩티드를 융합하지 않고, MORT-1 발현 시험을 추가로 실시하여, Met⁴⁹이 해독개시에 효과적인 부위라는 것을 보여주었다.

'Gene Bank' 및 'Protein Bank' 데이터베이스에서 실시한 연구에 따르면, 분리된 MORT-1 서열에 상응하는 서열은 없었다. 따라서, MORT-1는 신규한 FAS-IC-특이적인 결합 단백질이 되는 것이다.

p55-IC이 많이 발현되면, 세포치사 효과를 촉진하게 된다(Boldin et al., 1995). HeLa 세포에서 Fas-IC가 발현되면, 그 정도가 비록 낮더라도 감응성 검사를 이용하여 감지되는 효과를 가진다. MORT-1 및 사람 p55-IC, FAS-IC로 트랜스펙트된 세포에서 세포치사 효고를 자극하는 것과 무관한 리간드에 대해서도 분석하였다. 테트라사이클린-조절된 발현 벡터를 이용하여, MORT-1, 사람 Fas-IC, 사람 p55-IC의 일시적인 발현 효과를 평가하였는데, 이때 기준은 루시페라제를 이용하였다. 테트라사이클린 유무하에(발현을 중단시키는데에는 1㎍/㎖), 분비된 태반 알칼리 포스포타제를 인코드하는 cDNAs를 이용하여, 이를 트랜스펙트한 후 40분경에 세포 생존능을 평가하였다. 세포 생존능은 중성-레드 수용 검사를 이용하여 평가하고, 트랜스펙트된 DNA를 발현하는 이들 세포의 특이적인 생존능력을 평가하기 위 해 생장 배지로 분비되는 태반 알칼리 포스포타제의 양을 측정한다.

상기 분석 결과에 따르면, HeLa 세포에서 MORT-1 발현이 되면, FAS-IC 발현에 의한 것보다 휠씬 많은 세포 사멸을 유도하게 된다는 것이다. 이와 같은 p55-IC, FAS-IC, MORT-1의 세포독성 효과는 모든 단백질에 존재하는 "사멸 도메인"과 관련이 있는 것으로 보이는데, "사멸 도메인"은 자체-연합하는 성질이 있고, 따라서, 세포 독성 효과를 촉진한다.

전술한 MORT-1의 특징을 보면, 즉, FAS-R의 특정 부분과 MORT-1가 연합하면 세포 사멸 유도에 관여한다는 특징으로, 이 부분에 구조적으로 약간의 변화를 주면, 가령, MORT-1에 결합을 없애는 시그날 발생을 하지 못하게 하면(lpr ^cg 돌연변이), 이 단백질이 세포사멸의 시그날 또는 촉진에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 이는 자체 세포독성 효과에 의해 촉진되는 MORT-1의 관찰된 능력으로 뒷받침된다. 따라서, MORT-1는 (i) FAS-R에 결합하는 자체 능력으로 FAS-R의 자체-연합을 조절하는 기능물질; (ii) FAS-R 시그날발생에 관여하는 추가 단백질의 결합 부분으로 작용 예를 들면, MORT-1는 "도킹" 단백질이고, 따라서 FAS-R이외의 다른 수용체에 결합할 수 있고; (iii) FAS-R 시그날 발생과 상호작용하는 별개 시그날 발생 시스템의 일부분으로 구성된다.

FAS-IC 결합 및 FAS-R-중개된 세포 효과(세포독성) 조절에 관련된 MORT-1 부분을 추가 분석하기 위해서, MORT-1의 일부분("MORT-1 머리", 아미노산 1-117 및 'MORT-1 dd' 아미노산 130-245, 별도로)을 인코드하는 벡터 또는 HeLa 세포에 공 동 트랜스펙트시키기 위해 사람 FAS-R를 인코드하는 벡터를 이용하여 상기 언급한 실험을 한다. 이들 실험에서, 다양한 단백질 및 단백질 복합물질이 HeLa 세포에서 일시적으로 발현되는데, 이때 HeLa 세포는 테트라사이클린-조절된 발현 벡터 pUHD 10-3안으로 단백질을 인코드하는 서열을 삽입하여 테트라사이클린-조절된 트랜스활성물질(HtTA-1)을 가지고 있다. FAS-R만을 인코드하는 벡터와 FLAG-55.11 융합 단백질(55.11 단백질은 아미노산 309-900 부분을 포함하는 부분이 FLAG 옥타펩티드에 융합된 p55-IC-특이적인 결합 단백질이다)을 인코드하는 벡터를 이용하여, 기준을 트랜스펙트시킨다.

트랜스펙션 및 배양 후에, 트랜스펙트된 세포는 세포가 발현시키는 FAS-R의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 다양한 농도의 항-FAS-R 단클론항체(CH-11)로 처리한다. 이와 같이 항-FAS-R 항체가 결합되면, 세포 표면(FAS-R 리간드와 유사하게)에서 FAS-R의 응집을 유도하고, FAS-IC에 의해 중개되는 세포내 시그날 발생 경로를 유도하여 종국에는 세포를 죽게한다(FAS-R에 의해 유도된 세포 독성). 이용된 항-FAS-R 단클론항체(CH-11)의 농도는 0.01-10㎍/㎖이고, 통상 0.005㎍/㎖; 0.05㎍/㎖; 0.5㎍/㎖; 5㎍/㎖이 된다. 세포는 10㎍/㎖ 사이클로헥시미드 존재하에 항-FAS 항체로 처리한다.

상기 분석 결과에서는 트랜스펙트된 FAS-R가 발현되면, 항-FAS-R 항체의 세포치사 효과에 대한 감응성이 증가된다는 것을 나타낸다. 또한, FAS-R와 "사멸 도메인" 상동 부분을 포함하는 MORT-1에 있는 부분이 공동 발현되면, FAS-유도된 북음을 강력하게 간섭하여(FAS-R이 중개하는), FAS-R "사멸 도메인"에 결합하는 MORT-1 "사멸 도메인"(DD) 부분의 능력으로 예상된다. 또한, MORT-1의 N-말단과 FAS-R이 공동 발현되면, FAS-R-중개된 세포 사멸을 간섭하지 않고, 어느정도 세포독성을 강화시킨다(세포 사멸이 약간 증가됨).

따라서, 위의 결과로 MORT-1 단백질에는 두 개 별개 부분이 있는데, 이는 FAS-IC에 결합하고, FAS-IC의 세포 독성 활성에 관여하는 부분이다.

따라서, 이와 같은 결과는 여러 가지 다른 제약학적 분야에 이용할 수 있는 MORT-1의 다른 단백질 부분(활성 단편 또는 유사체)을 이용하는 기본을 제공한다. 예를 들면, "사멸 도메인" 부분을 포함하는 MORT-1의 C-말단 부분만을 필수적으로 포함하는 MORT-1 단백질의 유사체, 단편 또는 유도체를 이용하여 FAS-R를 포함하는 세포 또는 조직에서 FAS-R-중개된 세포독성 효과를 저해하고, 급성 간염과 같은 FAS-R fl에 유해한 효과로부터 이들 세포 또는 조직으로 보호한다. 또는, MORT-1의 N-말단 부분만을 포함하는 MORT-1 단백질의 유사체 또는 단편 또는 유도체를 이용하여, FAS-R을 포함하는 세포 및 조직에서 FAS-R-중개된 세포독성 효솨를 강화시켜, 종양 세포 및 자가반응성 T 및 B 세포와 같은 경우에, 이들 세포 또는 조직 파괴를 강화시킨다. 상기에서 언급한 바와 같이, MORT-1의 다른 부분을 이용하는 것은 다양한 재조합 바이러스(가령 백시니아)를 이용하여 치료를 원하는 특정 세포 또는 조직으로 MORT-1 부분을 포함하는 서열을 삽입시키는 것이다.

또한, MORT-1 부분에 의해 중개되는 동일한 효과를 얻기 위해, 상기 MORT-1 부분에 상응하는 서열 또는 분자 구조를 가지는 항체, 펩티드, 유기분자와 같은 다양한 다른 분자를 준비하여 이용하는 것도 가능하다.

또한, MORT-1을 이용하여 MORT-1에 결합할 수 있는 다른 단백질(가령, MORT-1 결합 단백질)을 확인, 분리 및 특징을 조사하는 것도 가능하다. 참고 실시예 2, 3참고.

참고실시예 2: MORT-1 결합 단백질의 분리

(i) 이중 하이브리드 스크린 및 이중-하이브리드 β-갈락토시다제 발현 테스트

참고 실시예 1과 유사한 과정으로, "미끼"로 p55 TNF-R(p55 IC) 및 MORT-1의 세포내 도메인을 이용하여, 사람 B-세포를 스크리닝하고, 두 개 cDNA를 얻는데, 이들은 MORT-1 및 p55-IC에 결합할 수 있는 단백질 생성물을 인코드한다. 이들 클론은 5'말단에 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지는 것으로 나타났다(공동 계류중인 출원 WO96/18641, PCT/US96/10521).

(ii) 이중 하이브리드 스크린에서 새로 클론된 cDNA의 결합 성질

전술한 이스트 이중-하이브리드 과정을 이용하여, 새로운 MORT-1-결합 단백질 cDNA를 포함하는 구조를 "먹이"로 이용하여, 별도의 반응으로 다수의 "미끼" 구조에 첨가하여, cDNA에 의해 인코드된 MORT-1의 결합 특이성을 결정한다. 이들 "미끼"에는 MORT-1을 인코드하는 구조, MORT-1의 일부분(MORT '머리', aal-117, MORT '꼬리' aa130-245), p55 IC(206-426 p55), 이의 일부분('사멸 도메인', 326-426 p55; "사멸 도메인"의 다른 상류 206-326)를 포함한다. 그 결과는 다음의 표 2에 나타낸다.

미끼	β-갈락토시다제 발현 데이타
MORT-1	+++
130-245 MORT-1	+
1-117 MORT-1	-
206-426 p55	+++
326-426 p55	+++
206-326 p55	-
206-308 p55	-
206-345 p55	-
p55 L35INI	-
Fas IC	-
233-319 Fas	-
p75 IC	-
CD40 IC	-
pGBT10	-
SNF1	-
Cycline D	-
Lamin	-

큰 미끼 패널에 클론의 이중 하이브리드 β갈락토시다제 발현 테스트의 결과로부터, 이들 클론에 의해 인코드된 단백질은 p55 TNF-R 및 MORT-1의 사멸 도메인에 특이적으로 결합한다는 것을 확인하였다.

일반적으로, MORT-1 결합 단백질을 직접적으로 이용하여 세포에서 MORT-1-연합된 효과를 조절 또는 중개하거나 또는 간접적으로 이용하여 FAS-R 리간드 효과가 MORT-1에 의해 조절 또는 중개될 때 세포에서 FAS-R 리간드 효과를 조절 또는 중개한다. 여기에서 p55-R TNF-R에 대해 특별하게 설명한 것과 같이 막통과 단백질의 세포내 도메인 또는 다른 세포내 단백질에 대해서도 동일하다.

MORT-1 결합 단백질에는 전제 MORT-1 단백질에 특이적으로 결합하는 것과 MORT-1의 상이한 부분 가령, MORT-1의 N- 및 C-말단 부분에 결합하는 것들이 포함된다. 이와 같은 부분에 특이적으로 결합하는 MORT-1 결합 단백질을 이용하여, 이들 부분 활성을 조절하고, 이들 부분에 의해 결정되는 MORT-1의 특이적인 활성을 조절한다.

참고 실시예 3: MORT-1 단백질, 또 다른 MORT-1 결합 단백질의 분리 및 특징화

(i) 이중 하이브리드 스크린, 이중 하이브리드 β-갈락토시다제 테스트, 서열 및 서열 분석

상기 참고실시예 1, 2에서 제시한 과정을 이용하여, 사람 MORT-1 단백질을 인코드하는 구조를 이스트 이중 하이브리드 시스템에 "미끼"로 이용하여, 추가 새로운 MORT-1 결합 단백질을 인코드하는 cDNA를 분리한다. 이와 같은 신규한 단백질은 원래 MORT-2로 지정하였으나, 하기에서는 MACH(MORT-1 연합된 CED3 상동부분)으로 지칭한다.

cDNA 클론은 상기 실시예 1과 2에서 제시한 것과 같은 표준 과정을 이요??여 서열화한다. 표준 과정 및 컴퓨터 프로그램을 이용한 서열 분석(참고 실시예 1, 2)에 따르면, 이와 같은 cDNA는 신규한 서열을 가지고, 신규한 단백질(GENBANK 또는 PROTEIN BANK 서열 데이터베이스에서 볼 수 없는 DNA 또는 아미노산 서열)을 인코드한다. 또한, MACH를 인코드하는 cDNA는 MORT-1 단백질의 "사멸 도메인"의 선행 부분(5' 상류)에 상당히 상동성이 있는 ORF-B 오픈 리딩 프레임으로 나타났다. 공동 계류중인 이스라엘 출원 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 및 PCT 출원 PCT/US96/10521에서는, ORF-B(235 아미노산 잔기)를 포함하는 MACH cDNA 클론의 일부; MACH ORF-B의 유추된 아미노산 서열; MACH cDNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 구조를 나타내었다. ORF-B 부분은 MORT-1 "사멸 도메인" 모티프의 상류 MORT-1 부분과 상동성을 공유한다.

이스트 이중 하이브리드 테스트를 이용하여, MORT-1에 MACH의 결합 특이성을 평가하고, 특히 MACH가 결합하는 MORT-1의 부분을 확인하고, MORT-1와 상호작용하는 MACH ORFs의 부분을 결정하는데, 그 과정은 참고 실시예 1, 2에 제시하는 것과 같다. Gal 4 DNA-결합 도메인에 의해 인코드되는 단백질의 상호작용을 테스트하고, β-갈락토시다제 발현 필터 검사에 의해 검사된 것과 같이 트랜스펙트된 SFY256 이스트 세포내에 활성화 도메인 구조를 확인하기 위해 다양한 MORT-1 및 MACH 구조를 준비한다. DNA-결합 도메인 구조는 pGBT9 벡터에서 준비하고, 활성화 도메인 구조는 pGAD-GM 벡터에서 준비한다. 활성화 도메인 구조를 위해서는 전체 길이 MACH cDNA(MACH)를 이용하는데, 이는 ORF-B(MACH B) 부분을 인코드하는 구조이다. 기준 활성화 도메인 구조는 MORT-1 cDNA의 전체 길이 서열(MORT 1, 양성 기준)을 포함하는 것으로 이들에는 삽입체를 가지지 않는데, 가령, "빈" 벡터(pGAD-GM)이다. DNA-결합 도메인 구조체의 경우에, MORT-1 cDNA 전체 길이를 이용하는데, 이는 MORT-1 상류 부분(MORT-1 aa 130-245)을 인코드한다. 기준 DNA-결합 도메인 구조는 이용하여 MACH 결합의 특이성을 결정하는데, 여기에는 라민(Lamin); 사람 p75 TNF-R(사람 p75 IC)의 세포내 도메인 잔기 287-461; 사이클 D(cycD), SNF1, 사람 p55 TNF-R(사람 p55 IC)의 세포내 도메인 잔기 206-426; 사람 FAS-R(사람 Fas DD)의 세포내 도메인의 "사멸 도메인" 부분, 사람 CD40(사람 CD40 IC)의 세포내 도메인 잔기 216-277, 삽입체 없는 또는 "빈" pGBT9 벡터(pGBT9, 음성 기준) 벡터, MACH(MACH B)의 ORF-B 부분을 인코드하는 기준이 포함된다. 검사에서, 색깔 발생을 측정하는데, 많은 색이 발생되면, DNA-결합 도메인과 활성 도메인에 의해 인코드되는 구조체 간에 상호작용이 크다는 것이다. 색깔 발생은 기호로 나타내는데, "+++" 및 "+"는 30분과 90분에 강한 색이 발생된다는 것을 의미하고, "---"는 24시간이내에 색이 발생되지 않는다는 것을 의미한다. 상호작용이 테스트되지 않은 경우는 기호로 나타내지 않았다. 상기 경우에 다양한 상호작용 결과를 하기 표 3에 나타내었는데, MACH 동소체의 다양한 상호작용 결과는 PCT/US96/10521 및 이의 이스라엘 출원에서 나타내었다.

도메인 하이브리드
결합 도메인 하이브리드	MACH	MACH B	MORT 1	pGAD-GH
MORT-1	+++	+++	+++	---
Binding region in MORT-1의 결합부분
MORT1(-117)
MORT1DD(130-245)	---	---
특이성 테스트
Lamin	---	---
사람 p75 IC	---
cyc D
SNF1
사람 p55 IC	---
사람 FAS DD	---
사람 CD40 IC	---
MACH B		+	+	---

따라서, 상기 표 3에서 나타난 결과로 볼 때,

(a) 매우 강하고 특이적인 방법으로 MACH가 MORT-1에 결합하고;

(b) MORT-1에 있는 "사멸 도메인" 모티프의 상류에 MORT-1의 MACH 결합 부위가 있고; 가령, MORT-1의 아미노산 잔기 1-117로 정의되는 MORT-1 부분내에 있고;

(c) MACH의 ORF-B 부분은 MACH 단백질의 MORT-1 상호작용 부분이고;

(d) MACH ORF-B 부분은 자체-연합할 수 있다.

(ii) MACH 단백질의 자체 연합 능력에 세포-독성 효과가 중개됨

MACH가 자체 연합할 수 있다는 관찰 특히, MACH의 ORF-B 부분이 자체 연합하고, MORT-1에서 관찰된 것과(참고 실시예 1), p55 TNF-R 및 FAS-R의 세포내 도메인에서 관찰된 것과 같이 자체-연합과 세포-세포독성간에 기존의 상관관계로 MACH 자체-연합은 세포-세포독성에 관련될 것이라는 것이다.

이와 같은 가능성을 테스트하기 위해, MACH를 인코드하는 구조체를 테트라사이클린-조절된 발현 벡터로 준비한다(상세한 것은 참고 실시예 1을 참고). 이와 같은 구조체를 이용하여 벡터가 일시적으로 발현되는 HeLa 세포 세포에 트랜스펙트시킨다. MACH 구조이외에 다른 기준 구조체를 이용하여, HeLa 세포의 생존능에 일시적인 발현 효과를 평가하는데, MORT-1 구조체의 효과와 비교한다. 이와 같은 다른 구조체에는 MORT-1, 사람 FAS-IC, 루시페라제(Luc)가 포함된다. 또한, MORT-1 및 MACH 구조체를 이용하여 HeLa 세포의 공동-트랜스펙트를 테스트하여, 이들 단백질간에 일어나는 상호작용의 효과를 측정한다. 트랜스펙션후에, HeLa 세포를 배양하고, 세포 생존능은 트랜스펙션후 48시간에 발현을 중단시키기 위해 테트라사이클린(1㎍/㎖) 존재하에 또는 없이 측정한다. 중성 레드 수용 검사를 이용하여 세포 생존을 평가한다.

상기 분석 결과로부터, MACH에는 HeLa 세포에서 극적인 세포 독성 효과를 포함하는데, 즉, HeLa 세포에서 MACH cDNA가 과다 발현되면 상당한 세포 독성 효과를 일으킨다는 것이 분명하다. 이와 같은 세포독성 효과는 MACH의 자체 연합 능력과 관련이 있는 것으로 보인다.

(iii) 노던 분석

공지된 과정을 이용하여(참고 실시예 1), 프로브로 MACH cDNA을 이용하여, 몇 가지 세포주의 노던 분석한다. 이 분석 결과에 따르면, 다양한 세포주, 특히 CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat, A673 세포주에서, 약 3.2kb의 이중 하이브리드 전사체가 존재한다는 것이다.

상기 관점에서, MACH 단백질, 특히 MACH

단백질(MACH의 ORF-B)를 직접적으로 이용하여, 세포에서 MORT-1 연합된 효과를 조절 또는 중개하고, 또는 간접적으 로 이용하여 MORT-1에 의해 FAS-R 리간드 효과가 조절 또는 중개되는 경우에, 세포에서 FAS-R 리간드 효과를 조절 또는 중개한다. MACH는 MORT-1의 상류 부분에 특이적으로 결합하고, MORT-1와 상동성을 공유하여 MACH 또는 MACH ORF-B를 이용하여 MORT-1의 특정 부분을 조절하는 방식을 제공한다. 또한, MACH 또는 MACH ORF-B는 MACH가 자체 연합하고, 세포-독성을 유도하는 것처럼 MORT-1 자체와 유사한 방식으로 세포내 효과 조절 또는 중개물질로 이용된다.

하기에서 제시하는 것과 같이 MACH 단백질 및 이를 인코드하는 DNA 서열 분석을 실시한다. MACH의 ORF-B는 여러 가지 MACH 동소체중 하나라는 것이 밝혀졌다. 여기에서, MACH 단백질 및 이를 인코드하는 DNA 서열을 다시 명명한다.

(a) MORT-1에 결합하는 단백질의 이중 하이브리드 스크린에서 MORT-1와 서열 모피트를 공유하는 신규한 단백질이 나타났다.

전술한 것과 같이, MORT-1에 의해 세포 사멸이 유도되는 것에 관계하는 단백질을 확인하기 위해, MORT-1에 결합하는 단백질의 cDNA 라이브러리를 스크린하는데, 이중 하이브리드 기술을 이용한다. 미끼로 MORT-1 cDNA를 이용하여 사람 B 세포 라이브러리의 이중 하이브리드 스크린에서는 자체 연합하는 이 단백질의 능력을 반영하는 MORT-1 자체의 cDNA 클론 뿐만 아니라 MORT-1가 효과적으로 결합하는 TRADD 클론을 만단다(참고 실시예 2). 스크린으로 MORT-1에 특이적으로 결합하는 생성물의 신규한 서열의 cDNA 클론도 만든다. 초기에 MACH라고 불린 단백질, 후에는 여러 가지 동소체에서 발생되는 것으로 확인되어, MACH

로 재명명된 단백질은 이중 하이브리드 테스트에서 자기에 결합하나, FAS-R에는 결합할 수 없는 것으로 나타났다(이는 PCT/US96/10521에서 설명하고 있음).

MORT-1, MACH

및 이의 결손 구조 뿐만 아니라, MACH

, MACH

의 돌연변이(촉매 시스테인 Cys₃₆₀이 세린으로 치환된 것(MACH

(C360S)), 사람 FAS-R(Fas-IC)의 세포내 도메인이 트랜스펙트된 SFY526 이스트에서 Gal4 DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인 구조(pGBT9 및 pGAD-GH)에서 발현되었다. 이들의 상호작용은

-갈락토시다제 발현 필터 검사에 의해 평가한다(Boldin et al., (1995b)). 그 결과는 강한 색을 발생시키는데 필요한 시간으로 나타낸다. 검사된 삽입체와 다수의 테스트된 음성 기준(사람 p55 TNF 수용체의 세포내 도메인, p75 TNF 수용체, CD40, 라민, 사이클린 D, "빈" Gal4 벡터를 포함)간에는 상호작용이 없었다. HF7c 이스트 리포트 균주를 이용하여 MORT-1에 결합하는 단백질에 대해 Gal4 AD-가 붙은 사람 B 세포 라이브러리의 이중 하이브리드 스크린에 의해(Durfee et al., 1993), MACH

를 클론한다. 다른 말이 없는 하, 제시한 실험 과정은 Boldin et al., 1995에서 설명하는 것과 같다. 결손 분석에 따르면, MACH

는 MORT-1의 N-말단 부분에 결합하는데, 이 부분이 세포 사멸 유도에 관계한다(Chinnaiyan et al., 1995). MACH

는 트랜스펙트된 이스트에서 자체-연합한다. 그러나, 몇 가지 기준 단백질에는 결합하지 않고, MORT-1는 FAS-R에 결합하지 않는다. 포유류 세포에서 MACHβ1 분자를 발현시키면, 공동 발현되는 MORT-1 분자에 결합하는 34 kDa 단백질을 생산한다. 이는 in vitro에서 GST-MORT-1 융합 단백질에 결합할 수 있다.

MACH

와 MORT-1의 아미노산 서열을 비교하면, MORT-1이 FAS-R에 결합하는 사멸 모티프와는 별도로 이들 두 개 단백질에는 공유하는 서열 모티프("Mort module")가 있다는 것이다. 이 모티프는 MORT-1에는 한 개, MACH

에는 두 개가 있다. 기능을 알 수 없는 성상세포 포스포단백질인 PEA-15에도 동일한 모티프가 발현되었다. 기존 데이테에 따르면, MORT-1 모티프는 MORT-1에 MACH

(및 이의 다른 MACH 동소체)가 결합하는데 관여한다는 것이다.

PCT/US96/10521 및 IL 117932에는 유추된 MACH

의 아미노산 서열을 제공한다. 두 개 MORT-1 모듈이 있고, 이용된 두 개의 MACH

결손 돌연변이의 C-말단을 나타내었다. 상기 출원에는 MACH

, MORT-1, PEA-15 유전자(기탁번호 X-86809)의 모듈의 서열 상동성을 나타내는데, 동일한 부분은 박스로 표시하고, 유사한 부분은 빗금으로 표시하였다.

사멸 도메인, MORT-1 모듈, Fas/APO1, MACH

및 MACH

에서 CED3/ICE 상동 부분을 상기 출원에 나타내었다.

"MORT-1 모듈"을 포함하는 MORT 부분이 이 단백질에 의해 유도되는 세포 둑음에 관여하는 것으로 보인다. 이는 또한 MORT-1의 자체 연합에도 관여한다(참고 실시예 1). 트랜스펙트된 이스트에서 MACH

결손 구조의 결합 성질을 분석한 것에 따르면, MACH

의 자체 연합에 MORT-1 모듈이 유사하게 관여하고, MORT-1에 결합하는 것에도 관여하는 것으로 보인다; MORT-1의 하류부분이 손실된 결손 구조체는 서로 결합하는 능력이 상실되나, 전체 길이의 MORT 및 MACH

에는 여전히 결합할 수 있다. MORT-1 서열의 일부를 결손시키면, 단백질의 결합 능력이 없어진다. 이와 같은 상호작용에 MORT-1 모듈이 관여하는지를 평가하기 위해, FLAG 옥타펩티드와 융합된 MACH

의 결손 돌연변이(FLAG-MACH

)를 HeLa 세포에 발현시키고, 박테리아에서 생산되는 글루타티온-S-전이효소-MORT-1 융합 단백질(GST-MORT-1)에 in vitro에서 결합을 평가한다. 이스트 이중 하이브리드 테스트에서 관찰된 것과 유사하게, in vitro 결합은 MACH

모듈내에 부분의 상호작용에 따라 달라진다는 것을 발견하였다. ³⁵[S]-대사적으로 라벨된 MACH

, MACH

가 FLAG 옥타펩티드의 N-말단에 융합된 단백질(FLAG-MACH

), FLAG-MACH

의 C-말단 절두형 돌연변이, 기준으로 루시페라제를 트랜스펙트된 HeLa 세포에서 생산하였다. 테트라사이클린-조절된 트랜스활성물질을 발현하는 HeLa 세포 클론(HtTA-1)에서 테트라사이클린-조절된 발현 벡터를 이용하여 발현시킨다.

항-FLAG 항체를 이용하여, 세포 용해물질로부터 면역침전에 의해 단백질의 발현 평가 및 이들의 분자량 평가를 한다. 이용된 항체는 다음과 같다; 토끼 항-MACH

및 항-MORT1 항혈청은 GST-MACH

및 GST-MORT 융합 단백질에 대해서 발생된 것이다. FLAG 옥타펩티드(M2) 및 FAS/APO1(CH11, Yonehara et al., 1989)에 대한 생쥐 단클론 항체는 Eastman Kodak and Oncor(Gaithersburg, MD)에서 구입하였다. 생쥐 단클론 항-HA 에피토프 항체(12CA5, Field et al., 1988) 및 항-TNF 항체는 당분야에 공지된 통상의 방법을 이용하여 실험실에서 생산하였다. 결과에 따르면, 글루타티온-아가로즈 비드에 흡수된 GST-MORT-1에 단백질의 친화력 결합 및 다양한 특정 항체를 이용한 다양한 MORT-1 및 MACH 융합 구조의 면역 침전이 PCT/US96/10521 및 IL 117932에 제시하고 있다(기준으로는 GST 또는 Fas-APO1의 세포내 도메인에 융합된 GST를 이용한다).

(b) 다중 동소체에서 MACH 발생

프로브로 MACH

cDNA를 이용하여 노던 분석을 하면, 몇 가지 다른 세포주에서 약 3kb의 전사체가 나타난다. 간략하게 설명하면, 프로브로 MACH

cDNA를 이용하여 몇 가지 세포주로부터 총 RNA(14㎍/lane) 또는 poly A⁺ RNA(2㎍)의 노던 분석을 실행하였다. 검사된 세포주는 T47D, CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat, A673는 모든 사람에서 기인한 것이고, 이는 유방의 관 육종, 급성 임파 ?? 세포 백혈병, Burkitt 임파종, 유상피 암종, 사람 간종, 급성 T 세포 백혈병, 횡문근종에서 유도하였다. 노던 블랏에서 하이브리드 밴드의 확산 모양으로 이들 전사체는 2.85 내지 3.5Kb의 이형 크기라는 것을 알 수 있다. 다양한 전사체 양과 크기는 상이한 사람 조직에서 다양하고, MORT1 또는 FAS/APO1(Watanabe et al., 1992)의 발현과 무관하다. 예를 들면, 고환과 골근육에서, MACH 전사체는 거의 감지할 수 없었으나, 이들 조직에서 상당량의 MORT1가 발현되었다, 역으로, MORT1의 발현이 매우 낮은 나머지 말초 혈액 단핵 백혈구세포는 상당수준의 MACH를 발현하는 것으로 나타났다. 백혈구 세포의 렉틴이 활성화되어, MORT-1의 유도와 함께 MACH의 크기에 상당한 변화가 있는 것으로 나타났다.

이와 같은 크기 이형성의 특징을 조사하면서, MACH

cDNA 프로브와 하이브리드하는 전사체에 대해 cDNA를 스크린하였다. 사람 흉선 mRNA로부터 유도된 Charon BS cDNA으로부터 MACH

및 MACH

를 클론하였다. 라이브러리는 무작위 프라임-키트(Boehringer Mannheim)를 이용하여, 라벨된 MACH

cDNA 프로브와 스트린젼트 조건하에서 스크린된다. 다른 MACH 동소체는 RT-PCR에 의해 Raji(MACH

,

), Daudi(MACH

,

) 사람 임파아구 세포의 총 RNA에서 실시한다. 역 전사효소 반응은 제조업자의 지시에 따라 올리고-dT 어뎁터 프라이머(5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)₁₇-3')와 SuperScript Ⅱ 역전사효소(GIBCO-BRL)를 이용하여 실행하였다. 제 1라운드 PCR은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 Expand Long Template PCR System(Boehringer Mannheim)으로 실행하였다; 센스 프라이머는 MACH

cDNA의 뉴클레오티드 530-551에 상응하는 5'-AAGTGAGCAGATCAGAATTGAG-3'이고;

안티센스 프라이머는 5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'이다. 두 번째 PCR 라운드는 다음과 같은 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 Vent 폴리메라제(NEB)로 실행하였다; 센스 프라이머는 5'GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC-3'이고, 안티센스 프라이머는 5'-GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3'인데, 각각 MACH

cDNA에서 유도되었다. MACH

및 MACH

가 개시 코돈을 가지는 지를 확인하기 위해, Raji 세포의 RNA로부터 이들 동소체의 5'서열을 클론하였다. 다음의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 2라운드 PCR(Vent 폴리메라제(NEB))를 하고; 센스 프라이머는 5'-TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3'이고, 안티센스 프라이머는 5'-ATTCTCAAACCCTGCATCCAAGTG-3'인데 이들은 각각 MACH

에서 유도된 것이다. 이어 서, 상기에서 설명하는 것과 같이 올리고-dT 어뎁터 프라이머를 이용하여 실시한 RT-PCR 반응을 하였다. 후자 올리고뉴클레오티드는 β-동소체에 특이적이다. 이와 같은 방식으로 수득된 클론중에, 블록 w의 아미노산을 인코드하는 서열이 포함되어 있다는 것을 발견하였는데, 이는 MACH

및 MACH

로부터 MACHβ3 및 MACH

로 구별하였다. 모든 클론된 동소체에 뉴클레오티드 서열은 디데옥시-사슬 종료 방법을 이용하여 양 방향으로 결정하였다. MACH

및 MACH

의 부분적인 cDNA 클론을 얻었다. 이와 같은 스크린에서는 MACH MACH의 다중 동소체가 존재하는 것으로 나타났다. 이들 동소체중 일곱 개 아미노산 서열에 대해서 연구되었다. 그 결과는 PCT/US96/10521 및 IL 117932에서 설명하고 있는데, 여기에서는 세 개 동소체의 아미노산 서열을 공지의 서열과 비교하였다.

"블럭 2"를 인코드하는 MACH

에서 65개 뉴클레오티드가 부족하면, "블럭 3"을 인코드하는 뉴클레오티드의 리딩 프레임의 MACH 및 MACH

가 변화하게 된다. 따라서, 이들 동소체에서, 이와 같은 뉴클레오티드는 이들의 독특한 C-말단 부분으로 구서오딘 다른 아미노산을 인코드한다. 한편, MACH

및 MACH

에서는 블록 3의 리딩 프레임이 유지되나, CED3/ICE 부분과 3'비코딩 부분을 인코드하는 뉴클레오티드가 없어, 하류의 뉴클레오티드의 리딩 프레임에 변화가 생긴다. 이와 같은 변화로 인하여, 넌코딩 부분의 대부분 5'부분이 10개 아미노산을 인코드하고, 이는 이들 두 가지 동소체의 C- 말단 부분으로 구성된다.

사람 B 세포 cDNA 라이브러리(MACH

), 사람 흉선 cDNA 라이브러리(MACH

및

), 사람 임파블라스토이즈 세포 Raji(MACH2

,

) 및 Daudi(MACH

,

)로부터 동소체를 클론한다. Raji 및 Daudi 세포의 mRNA 클로닝은 MACH

의 3'넌코딩 부분 및 두 번째 MORT-1 분자내에 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 이용한 RT-PCR에 의해 실행하였다. 이와 같은 방법으로 분리된 클론의 시작 코돈은 두 번째 MORT 모듈내에 위치한다.

상이한 동소체에 서열은 다음과 같이 서로 연관된다; (a) 모든 동소체는 MORT-1 모듈을 포함하는 통상의 182-아미노산 N-말단 부분을 공유하는데, 이 모듈에 대한 카르복시 단부(3'하류) 및 넌코딩 부분은 매우 다양하다; (b) C-말단 서열에 기초하여, 동소체는 두 개 그룹으로 나뉜다; 서브그룹 β로 나타내는 4개 동소체는 리딩 프레임에 변화로 인하여 상이한 C-말단을 가진다. 두 개 MACH

및

는 이중 하이브리드 스크린에서 처음으로 클론된 동소체에 있는 C-말단을 공유하고, 두 개 MACH

및

는 상이한 C-말단을 공유하고, 서브그룹 α로 지정한 세가지 동소체는 CED3/ICE 페밀리의 프로테아제와 상당히 닮은 휠씬 긴 C-말단을 가진다; (c) MORT 모듈 부분과 서브그룹을 정의하는 C 말단 부분사이에 이어지는 부분은 동소체마다 다양하다. 그러나, 실험에 따르면, 이와 같은 중간 부분은 동일한 세 가지 아미노산산 블록(블럭 1, 2, 3)이 다르게 복합된 것으로 구성된다. 상이한 클론간에 아미노산 서열이 다양한 것은 뉴클레오티드 서열에 두 종류의 변화가 있다는 것을 말하는 것으로 상이한 접합에 의해 발생할 수 있다; (a) Lys184를 인코드하는 뉴클레오티드의 아래에 있는 45개 뉴클레오티드 한 개와 65뉴클레오티드인 두 개 뉴클레오티드 서열이 삽입되거나 제거되고; (b) 3'넌코딩부분으로 구성된 MACH

내에 추가 삽입된 것이다. 이와 같은 변화는 리딩 프레임 및 단백질의 길이 에도 영향을 준다.

MACH 동소체의 일부네은 CED3/ICE 상동부분이 포함된다. Data Bank 조사에 따르면, 블록 3 및 이의 하류로 이어지는 서열을 포함하는 MACH

동소체의 C-말단 부분은 CED3/ICE 페밀리의 프로테아제와 상당히 닮은 것으로 나타났다. MACH 및 다양한 여러 가지 사람 구성요소에 있는 서열 및 Caenorhabditis elegans ced3 단백질의 서열을 비교하였고(Ellis and Horvitz, 1986; Yuan et al., 1993), CED3/ICE 페밀리의 공지된 사람 프로테아제; CPP32(Fernandes-Alnemri et al., 1994)(아포파인으로도 불림)(Nicholson et al., 1995); Yama(Tewari et al., 1995b), Mch2α(Fernandes-Alnemri et al., 1995), Ich-1(Wang et al., 1994; the human homolog of the mouse Nedd2 protein, Kumar et al., 1994), ICE_relⅡ(<umday et al., 1995), ICE_relⅡ (Munday et al., 1995)(TX라고도 불림), Ich2(Faucheu et al., 1995; Kamens et al., 1995), ICE(Thornberry et al., 1992; Cerretti et al., 1992)의 것도 비교하였다.

MACH의 C-말단은 CPP32(41% 동일, 62% 상동) 및 CED3(34% 동일, 56% 상동)와 가장 닮은 것으로 나타났고; ICE와 ICE_relⅡ(TX, Ich2라고도 함), ICE_relⅢ와는 는 다소 유사성이 떨어지는 것으로 나타났다(28% 동일, 50% 상동). 블록 3의 Tyr226부터 MACHα동소체의 C-말단까지 유사성이 나타났다.

두 가지 점에서 유사성을 주목할 만하다;

(a) CED3/ICE 페밀리의 모든 공지의 프로테아제는 P1위치에서 Asp 발생과 P1'에서 소수성 아미노산 잔기가 되는 위치에서 단백질을 절단한다. 이들의 특이성은 P2-P4 위치의 잔기 특징을 포함하는 기즐의 다른 구조상 특징에 따라 달라진다. 따라서, 이들 프로테아제간에 촉매에 관련된 활성 부위 잔기(ICE에서 His237, Gly238, Cys285에 상응) 및 P1 Asp의 카르복실 측쇄의 결합 주머니에 관련된 활성 부위 잔기(Arg179, Gln283, Arg341, Ser347)가 보존된다. ICE의 Ser347에 상응하는 부위에 Ser이 Thr로 변화된 것만 예외이다. MACHa 동소체와 다른 프로테아제 간에 서열 차이는 ICE의 Arg286에 상응하는 잔기가 Arg에서 Gln로 치환된 것이다. 가상 촉매 시스테인 잔기에 인접한 이 잔기는 모든 다른 CED3/ICE 페밀리에서는 완전하게 보존되어 있다. P2-P4 기질에 인접하여 위치한 부위에서 잔기의 일부는 다른 CED3/ICE 페밀리에서 볼 수 있는 MACHα동소체와는 다르다.

(b) CED3/ICE 페밀리 프로테아제에는 자가절단 부위를 포함한다. 몇 가지 프로테아제는 자체-프로세싱하는 것으로 공지되어 있는데, 이는 최대 촉매 활성을 나타내는 공정에 따라 달라진다. 이들의 완전한 생활성 형태는 크기는 다르지만 비공유적으로 연합된 두 개 절단 생성물로 구성된다(ICE에서는 p20 및 p17; CPP32에서는 p17 및 p12). 페밀리의 다른 요소에서 자가절단 가능성이 있는 부위가 존재한다는 것은 유사한 프로세싱을 거친다는 것을 말하고, 이는 최대 활성을 나타내는 공정에 따라 달라진다는 것을 말한다. 이와 같은 자가절단 가능성이 있는 부위는 CPP32에서와 같은 동일한 MACH

위치가 된다. CPP32의 p17 서브유닛의 N-말단에 상응하는 부위는 CED3/ICE-상동 부분의 N말단의 상류 몇 개 아미노산이 되는 두 번째 보존된 아미노산 블록에 위치한다(Asp216이하). CPP32의 두 개 서브유싯사이 에 절단 부위에 상응하는 부분은 CED3/ICE 페밀리의 모든 다른 요소에서와 마찬가지로 촉매 시스테인 잔기의 아래 아미노산에 위치한다(Asp374이하). 이와 같은 보존은 MACH

에 있는 CED3/ICE 상동성 부분이 단백질 분해성 프로세싱을 거친다는 것을 말한다. 이와 같은 두 가지 예상된 절단 생성물의 크기는 프로세스된 CPP32 분자의 두 개 서브유닛의 것과 매우 유사하다.

(c) MACH에 CED3/ICE 상동 부분은 단백질 분해 활성을 가진다.

MACHα에 있는 CED3/ICE 상동 부분이 단백질 분해 활성을 가지는지를 확인하기 위해, 출원인은 GST 융합 단백질과 같이, Asp216 및 Ser217사이 부분의 상류 절단 가능성이 있는 부분으로부터 박테리아의 C-말단 까지 이어지는 부분을 발현시켰다. 박테이라 용해물질은 다른 CED3/ICE 상동부분에 의해 절단되는 것으로 알려진 플로로게닉 펩티드 기질을 절단하는 능력이 있는지에 대해 검사하였다. 두 가지 기질 펩티드를 이용하였다; 첫째는 폴리 (ADP-ribose) 폴리메라제(PARP)에 있는 서열에 상응하는 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-메틸-쿠마르일-7-아미드)(AC-DEVD-AMC)것으로, FAS-R 자극후(Tewari et al., 1995b)에 바로 세포에서 절단되고, 다른 아포프토시스 과정에서 절단되는 것(Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994)으로 알려진 핵 단백질이다. 이와 같은 플로로게닉 기질은 CPP32에 의해 효과적으로 절단된다. 두 번째 플로로게닉 기질은 IL-1β전구물질에서 ICE에 대한 기질 부위에 상응하는 아세틸-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC (Ac-YVAD-AMC)것이다. 이와 같은 플로로게닉 기질은 ICE에 의해 절단된다. MACH

에 있는 CED3/ICE 상동 부분을 발현시키는 박테리아의 용해물질은 PARP 서열 유도된 플로로 게닉 기질을 효과적으로 절단한다. IL-1β전구물질 서열 유도된 플로로게닉 기질, Ac-YVAD-AMC(IL-1β전구물질에서 ICE의 절단부위)(Thornberry et al., 1992)에 대한 단백질 분해 활성은 감지되지 않았다. 단백질 분해 활성은 요오드아세트산(5mM)에 의해 차단되는데, 이는 티올 프로테아제가 중개한다는 것을 확인시켜주는 것이다. 촉매 시스테입 잔기 Cys₃₆₀ 가 Ser으로 치환된 GST-융합된 MACH CED3/ICE 상동 부분을 포함하는 용해물질에는 절단 부위가 관찰되지 않았다. 또한, GST-융합 단백질로써 전체 길이의 MACHα1을 발현시키는 박테리아의 용해물질은 Ac-DEVD-AMC를 절단하지 않았는데, 그 이유는 전체 길이 분자를 프로세싱할 수 있는 세균성 효소가 없기 때문일 것이다. CED3/ICE 상동 부분의 두 가지 가능한 절단 생성물중 어느 것이라도 포함하는 용해물에서는 절단이 일어나지 않았다.

MACHα1에 CED3/ICE 상동 부분의 GST-융합 단백질(Ser217부터 단백질의 C-말단)을 발현시키는 대장균(E. coli) 추출물에 의한 PARP 서열 유도된 플로로게닉 기질, Ac-DEVD-AMC(50

)의 절단 역학을 전체 길이 MACHα1분자의 GST-융합 단백질 또는 CED3/ICE 상동 부분의 단백질 분해 생성물중 하나(Ser217부터 Asp374 및Asp374부터 단백질의 C-말단)를 발현시키는 박테리아 추출물에 의한 절단이 부족한 것과 비교하였다.

또한, GST와 융합된 MACHα1 CED3/ICE 상동부분을 발현하는 박테리아 추출물과 180분간 배양된 Ac-DEVD-AMC 절단에서 기질 농도와의 관계를 나타냈다. 요오드아세트산 존재하에(5mM)서는 절단이 일어나지 않았다. 추출물은 IL-1β 전구물질 인 ICE에 대한 기질 부위에 상응하는 Ac-YVAD-AMC, 플로로게닉 기질에서는 활성을 가지지 않았다.

간략하게 설명하면, pGEX3 발현 벡터를 이용한 XL-1 블루 박테리아에서 GST-융합 단백질이 생성된다. 박테리아는 완충액(25mM HEPES(pH 7.5), 0.1% 3-[3-콜아미드프로필)디메틸아미노]-1-프로판설포네이트, 5mM EDTA, 2mM DDT를 포함)에서 초음파분새시켜 용해시키고, 16,000Xg에서 10분간 원심분리시킨다. SDS-PAGE 분석에 따르면, 용해물질에는 다양한 융합 단백질이 비슷한 수준으로 존재한다는 것을 확인할 수 있다. 50㎕ 추출물(총 단백질의 4㎎/㎖)을 플로로게닉 기질과 500㎕ 반응 용적으로 지정한 시간동안 실온에서 배양시켰다. 380㎚ 여기 파장 및 460㎚ 방출 파장에서 스펙트로-플로로메터에 의해 AMC 방출을 측정한다. 표준 곡선으로부터 AMC의 농도를 결정한다. Peptide Institute Inc.(Osaka, Japan)으로부터 플로로게닉 기질 펩티드를 구한다. 다른 CED3/ICE 프로테아제는 자가 절단 또는 다른 프로테아제에 의한 절단을 통한 단백질 분해 프로세싱후에만 완전한 활성을 나타내는 것으로 나타났다(Kumar, 1995; Henkart, 1996). 출원인이 관찰한 바에 따르면, GST-MACH

분자를 발현시키는 박테리아 용해물질에는 효소 활성이 없는데, 이는 CED3/ICE 상동 부분을 발현시키는 박테리아 용해물질에서 관찰되는 활성과 상반되는 것으로써 이는 MACHα활성에는 프로세싱이 필요하다는 것을 나타낸다. 포유류 세포에서 발생되는 MACHα프로세싱 과정 및 FAS-R 또는 p55-R에 의해 이와 같은 프로세싱이 어떻게 진행되는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. MORT-1은 일부 다른 단백질과 활성화된 FAS-R에 결합하는 것으로 알려졌다(Kischkel et al., 1995). 이와 같은 단백질에는 MACH

및 다른 MACH 동소체를 포함한다. MORT-1가 MACHα와 연합하여 FAS-R에 결합하면, 몇 가지 MACH 분자를 가져오거나 또는 모양상의 변화를 유도하고, 이와 같은 변화는 MACHα의 자가분해 프로세싱을 촉진시키거나 다른 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 MACHα로 만든다. p55-R 자극은 유사한 방식으로 MACHα의 자체 프로세싱을 촉진하는데, 이는 몇 가지 TRADD 분자를 함께 가져오거나 또는 이들의 모양에 변화를 유도하여, MORT-1 및 MORT-1 분자의 형성 또는 응집에 변화를 유도한다.

MACHα의 기질 특이성은 다소 "사멸을 일으키는" 것으로 보인다. 사멸 기질 PARP(Ac-DEVD-AMC)에서 절단 부위에 상응하는 기질 펩티드가 절단되나, MACHα는 ICE(Ac-YVAD-AMC)에 의한 IL-1β전구물질의 프로세싱 부분에 상응하는 펩티드에 단백질 분해 활성이 없는 것으로 나타났다. MACHα에 의한 절단 기질로 작용하는 세포 단백질을 확인하면, 프로테아제에 의한 사멸 유도시에 하류 사건으로 밝혀졌다. 유사하게, MACHα절단 기질은 CPP32 및 ICE와 같이 다른 CED3/ICE 페밀리다. 이들 프로테아제의 일부는 FAS-R 또는 TNF 수용체-촉진후에 프로세스된다(Miura et al., 1995; Schlegel et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996). CED3/ICE 페밀리에 속하지 않는 프로테아제는 다른 CED3/ICE 프로테아제 작용에 의해 간접적으로 또는 직접적으로 MACHα에 의해 활성화된다. 세포 사멸 과정에 다중 프로테아제과 관련되는 것은 다양한 프로테아제의 보고된 저해 능력과 일치하는데, 예를 들면, 세린 프로테아제 저해물질, ICE 저해물질, 안티센스 ICE cDNA를 포함하여, FAS-R 및 TNF 수용체-중개된 독성으로부터 세포를 보호한다(Weitzen and Granger, 1980; Ruggiero et al., 1987; Enari et al., 1995; Los et al., 1995).

포스포리파제, 스핑고미엘리나제. 단백질 카이나제를 포함하는 다른 다양한 효소는 TNF 수용체 및 FAS-R에 의한 세포 사멸을 유도하는데 참가한다(Eischen et al., 1994; Vandenabeele et al., 1995; Cifone et al., 1995 and references therein). 이들 효소중 일부는 MACHα에 의해 개시되는 단백질 분해성 절단에 의해 활성화된다. 그러나, 이들 사멸과 관련된 활성의 적어도 일부는 MACHα자극과는 무관하게 별도의 시그날 발생 과정에 의해 자극되는 것으로 보인다. 세포 사멸을 유도하는 과정에서 한 가지이상의 시그날 발생 일련 과정이 관여하는데, 이들중 일부는 p55-R 및 FAS/APO1에 공통적인 것이고, 일부는 이들만에 의해 유도되는 것으로 두 가지 수용체에 의해 유도되는 세포 사멸 과정의 별개 특징 및 공유 특징이 있다는 보고와 일치한다(Grell et al., 1994; Schulze-Osthoff et al., 1994; Wong and Goeddel, 1994; Clement and Stamenkovic, 1994).

(d) MACH

는 MORT1 및 MACH

에 결합한다

MACH

에서와 같이, MACH

이 MORT-1에 결합되는지를 발견하기 위해, 트랜스펙트된 이스트에서 단백질의 상호작용을 우선 검사하였다. MACH

는 이스트에서 상당한 세포독성 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 효과는 활성화 도메인(AD) 벡터에서 단백질을 발현시키는 이스트에 있는 콜로니 수를 상당히 감소시킨다(이의 발현 수준은 DNA 결합 도메인(DBD) 벡터의 것보다 휠씬 높다). 한편, 촉매성 시스테인 잔기 Cys₃₆₀가 Ser(MACH

(C360S))으로 치환된 MACH

에서는 포유류 세포(아래) 또는 이스트에 대해 세포독성을 나타내지 못한다. MACH

와 비슷하게, MACH

(C360S)는 트랜스펙트된 이스트에서 MORT-1에 결합하고 그 자체에도 결합하였다. 또한 MACH

에도 결합하였다. 또한, MORT-1 또는 MACH

와 함께 야생형 MACH

를 발현시키는 이스트는 트랜스펙트된 단백질의 상호작용을 나타내었다. 그러나, 이들 이스트 콜로니중에서도 lacZ-생성물의 색의 강도는 다양하였다; AD 및 DBD 벡터로 MACH

에 형질감염된 이스트에서는 색을 가진 생성물이 관찰되지 않는데, 이는 아마도 야생형 MACH

의 세포 독성 효과 때문인 것으로 보인다. 이와 같은 다양성에도 불구하고, MORT-1 또는 MACH

와 복합하여 MACH

를 발현시키는 이스트는 트랜스펙트된 단백질의 상호작용에 대해 양성으로 기록된다. MACH

와는 달리, MACH

는 이중 하이브리드 테스트에서 자체-상호작용을 나타내지는 않는다.

MACH

(C360S) 및 MACH

는 사람 배 신장 293-EBNA 세포 용해물질에서 나온 MORT-1와 공동 면역침전하는데 이는 포유류 세포에서 MORT-1에 결합한다는 것을 말한다. MACH

가 포유류 세포내에 MORT1에 결합하는지를 테스트하기 위해, FLAG 옥타펩티드와 융합된 MACH

또는 MACH

가 HA 에피토프-꼬리가 붙은 MORT1 분자와 함께 발현된다. HeLa 세포에서 FLAG 옥타펩티드의 N-말단에 융합된 ³⁵[S] 대사적으로 라벨된 MACH

및 MACH

(FLAG-MACH

및

), HA 에피토프의 N-말단에 융합된 MORT1(Field et al., 1988)를 발현시킨다. 세포 용해물질로부터 단백질의 면역침전은 FLAG 옥타펩티드(M2; Eastman Kodak), HA 에피토프(12CA5, Field et al., 1988), 또는 기준으로 p75 TNF 수용체(#9, Bigda et al., 1994)에 대한 생쥐 단클 론 항체를 이용하여 실행한다. 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(12% 아크릴아미드)한 후에, 자가방사사진을 찍는다. MACH

및 MACH

가 세포 용해물질의 MORT1와 면역침전하는데, 이는 MORT1에 결합한다는 것을 의미한다. MACH

가 MORT1에 상호작용하는 효과는 MACH

의 것보다는 낮은 것으로 나타났다.

(e) CED3/ICE 상동성 부분을 포함하는 MACH 분자는 세포 사멸을 중개한다.

세포 사멸 유도에서 MACH의 관련성을 조사하기 위해, 다양한 MACH 동소체의 과다발현 효과를 검사하였다. 트랜스펙션 표식으로 β-갈락토시다제 발현 벡터와 함께 MACH 발현 벡터를 사람 배 신장 293-EBNA 세포 및 유방 암종 MCF7 세포에 트랜스펙트시켜 테스트를 실행한다.

간략하게 설명하면, 293-EBNA 세포, MCF7 사람 유방 암종 세포, HeLa HtTA-1 세포를 Dulbecco's 변형 Eagle's 최소 필수 배지(10% 태아 송아지 혈청, 비필수 아미노산, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충됨)에서 생장시킨다. 인산칼슘 침전법을 이용하여 β-갈락토시다제 발현 벡터와 함께 지시된 단백질의 cDNA로 세포 조직 배양 접시(5 ×10⁵ 293-EBNA 세포, 3 ×10⁵ MCF7 세포, 3 ×10⁵ HeLa 세포, 6-㎝ 접시)에 일시적으로 트랜스펙션시킨다. 한 실험에서, 각 접시에는 3.5㎍ MACH 구조체, 1.5㎍ pSV-

-gal을 트랜스펙션시키고, 또 다른 실험에서는 2.5㎍ MACH 또는 MORT1 구조(기준, 빈 벡터), 1.5㎍ pSV-

-gal로 트랜스펙트시킨다. 세포는 트랜스펙션후 6 내지 10시간후에 세척한다. 추가 처리없이 18시간동안 293-EBNA 및 MCF7 세포를 배양한다. HeLa 세포는 트랜스펙션 후에 26시간동안 배양하고, 그 다음 5시간 동안은 항-Fas.APO1 항체(CH11, 0.5㎍/㎖) 또는 TNF (100ng/㎖)와 사이클로헥시미드(10㎍/㎖) 존재 하에 배양시킨다. 배양 종료시점에서 세포 사멸 정도는 Kumar et al., 1994에서 설명하는 것과 같이, β-갈락토시다제 발현으로 결정한다. MACH

또는 MACH

발현 벡터로 트랜스펙트된 배양물은 상당한 세포 사멸이 나타나는데, 세포 라운딩, 수포, 수축, 최종적으로 접시로부터 세포가 떨어지게 된다. 트랜스펙션 후 20시간 경에는 β-갈락토시다제 착색(X-Gal)에 의해 확인되는 대부분의 트랜스펙트된 세포는 아포프토시스의 전형적인 압축된 형태를 나타낸다. 대조적으로, 빈 벡터를 발현시키는 세포는 살아남아 있다.

아포프토시스 효과에서 MACHα동소체내에 CED3/ICE 상동 부분이 관련되는 지를 검사하기 위해, CED3/ICE 상동 부분이 부족한 MACH

동소체의 발현 벡터 뿐만 아니라 N-말단이 부족한 MACH

발현 벡터, MACH

(C360S) 발현 벡터, CED3/ICE 프로테아제 기능(ICE에서 Ser₃₄₇)에 중요한 것으로 보이는 잔기중 하나가 없는 MACH

(MACHa1(1-415)) C-말단 절두형 돌연변이의 발현 벡터를 세포에 트랜스펙트시킨다. MACH

, MACH

(1-415), MACH

(C360S)의 발현 벡터로 트랜스펙트된 293-EBNA 또는 MCF7 세포에서는 사멸이 일어나지 않는다(빈 발현 벡터로 트랜스펙트된 세포에서 약간 관찰됨). 또한, 이와 같은 벡터와 함께 MACH

로 트랜스펙트된 세포는 거의 사멸을 나타내지 않는데, 이는 불완전한 CED3/ICE 부분을 포함하는 MACH가 야생형 분자의 활성에 대해 음성 우세 효과를 가진다는 것을 의미한다. CED3/ICE 부분을 전혀 포함하지 않는 MACH

를 발현시키는 배양물에는 어느 정도 세포 사멸이 나타났다. 내생 MACH

의 활성화로 인하여 발생되는 MACH

효과는 트랜스펙트된 HeLa 세포에서 상당히 분명한 것으로 나타났다. 또한, HeLa 세포에서는 MACH

, MACH

(1-415), MACH

(C360S)이 세포독성이 있었다.

MACHα활성은 FAS/APO1 및 p55-R의 세포치사 효과의 시그날 발생 과정에 가장 상류의 효소 단계로 구성되는 것을 알 수 있다. MORT-1 및 MACH

에 모두 결합하는 MACH

능력으로 이와 같은 동소체는 효소적으로 활성을 가지는 동소체의 활성을 강화시킨다는 것을 암시한다. 일부 MACH 동소체는 추가 기능을 하는 것도 가능하다. MACH

가 MORT-1 및 MACH

에 결합하는 능력으로 이와 같은 동소체는 효소적으로 활성을 가지는 동소체의 활성을 강화시킨다는 것을 암시한다. 이와 같은 동소체로 트랜스펙트된 293-EBNA 및 MCF7 배양물에서 관찰되는 약한 세포독성 및 HeLa 세포에서 발휘되는 상당한 세포독성 효과는 트랜스펙트된 MACH

분자에 결합시에 내생적으로 발현된 MACHα분자의 활성화를 반영하는 것이다. 일부 MACH 동소체는 FAS/APO1 및 TNF 수용체의 비-세포독성 효과에 관련된 다른 분자의 도킹 부분으로도 작용할 수 있다.

(f) MACHα기능을 차단시키면 Fas/APO1 및 p55-R에 의해 유도되는 세포 사멸이 간섭받는다.

Fas/APO1, p55-R 세포독성, MACH

뿐만 아니라 기능을 하지 않는 MACH

돌연변이에 대한 MACHα의 기여를 평가하기 위해, MACH

(1-415) 및 MACH

(C360S)를 세포독성을 나타내도록 유도된 세포에서 발현시킨다. 293-EBNA 세포에서 이와 같은 수용체의 일시적인 과다발현에 의해 p55-R-유도된 세포독성이 촉진되고(Boldin et al., 1995a), Fas/APO1 세포독성은 p55-R의 세포외 도메인 및 Fas/APO1의 막통과 및 세포내 도메인으로 구성된 키메라 분자의 과다발현에 의해 촉진된다. 이와 같은 키메라는 정상적인 Fas/APO1의 세포독성 보다 더 큰 독성을 가진다. HeLa 세포에서 세포독성 활성은 단백질-합성 차단물질인 사이클로헥시미드 존재하에 TNF 또는 항-Fas/APO1 항체로 처리하여 유도한다. HeLa 세포는 이들 수용체의 일시적인 발현에 의해 Fas/APO1에 반응성을 가지도록 한다. 검사한 모든 시스템에서, MACH

및 기능을 하지 않는 MACH

돌연변이는 Fas/APO1 또는 p55-R 촉진에 의해 유도되는 세포독성에 대해 효과적인 보호를 제공한다. 이와 같은 보호는 MACH-결합 부분이 부족한 MORT-1 N-말단 결손 돌연변이(MORT1(92-208))로 트랜스펙트된 세포에서 이미 보고된 바 있다(Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996). 이와 같은 보호 효과는 MACHα가 세포 사멸을 위한 Fas/APO1 및 p55-R-유도된 시그날 발생 과정의 필수 성분이라는 것을 의미한다.

MACH는 상이한 조직에서 상당히 다른 수준으로 발현되고 실제 상이한 이소타입 패턴으로 발현된다. 이와 같은 차이는 FAS/APO1 리간드 및 TNF에 대한 조직-특이적인 특징에 기여하는 것이다. 다른 CED3/ICE 상동부분의 경우와 마찬가지로(Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995), 불완전한 CED3/ICE 부분(MACH

)을 포함하는 MACH 동소체는 공동 발현되는 MACH

또는 MACH

분자의 활성을 저해하는 것으로 나타났다; 이들은 FAS/APO1 및 p55-R에 의해 유도되는 세포 사멸을 차단하는 것으로 나타났다. 세포에서 이와 같은 저해성 동소체의 발현은 FAS/APO1- 및 TNF-중개된 세포독성에 대해 세포 자체 보호 기작으로 구성된다. CED3/ICE 페밀리의 다른 프로테아제에서 관찰되는 것보다 초과되는 MACH 동소체의 광범위한 이형성은 활성 MACH 동소체의 기능을 특별하게 조절할 수 있도록 한다.

실시예 1: MORT-1-결합 단백질 Mch4에 결합하는 G1 단백질의 클로닝 및 분리

(i) 이중 하이브리드 스크린 및 이중 하이브리드 β-갈락토시다제 발현 테스트

참고 실시예 1-3에서 제시하는 과정을 이용하여, ICE-유사 프로테아제와 실제 상동인 그래서 이의 요소가 되는 신규한 단백질인 G1을 분리하였다. G1 단백질에는 MORT-1 모듈에 상동인 즉, MORT-1의 N-말단 부분에 상동인 두 개 모듈이 포함되는데, 하나는 MACH 단백질의 MORT-1 모듈(참고 실시예 1-3, Boldin et al., 1996), 또 다른 관련된 MORT-1-결합 단백질 Mch4(Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996)이 된다. 또한, G1 단백질은 CED3/ICE 페밀리의 프로테아제의 효소 활성부분에 상동인 효소(프로테아제와 같은)활성 부분을 가진다(예를 들면, MACH의 프로테아제 부분, Mch4 및 기타).

간략하게 설명하면, "미끼"로 단백질 Mch4를 이용하여 사람 Jurkat T 세포 cDNA의 이중 하이브리드-스크리닝후에 단백질 G1('클론 G1')을 얻는다. Gal4 활 성화 도메인이 붙은 사람 Jurkat T 세포 cDNA 라이브러리를 이용하고, Matchmaker^TM 이중-하이브리드 시스템 과정(Clontech)에 따라 3-아미노트리아졸 없이 HF7c 이스트 리포터 균주를 이용하여 스크리닝을 실시한다(Clontech, Palo Alto, Ca.). EMBL 데이터베이스로부터 Mch4 서열을 얻었다. 수득된 서열을 이용하여, PCR-프라이머는 OLIGO4^TM 소프트웨어로 고안하고, Mch4의 코딩 부분에 상응하는 DNA 단편은 주요 Human Umbilical Vein Endothelial으로 부터 구한 총 RNA(표준 방법으로)으로부터 역 전사효소-PCR(RT-PCR)을 이용하여 얻는다. 그 다음 Mch4의 코딩 부분은 pGADGH 벡터(Clontech)로 클론시키고, 이를 상기에서 언급한 것과 같이, 이중-하이브리드 스크리닝 과정에 "미끼"로 이용한다. 이와 같은 이중-하이브리드 스크린에서 11개 클론이 수득되는데, MORT-1에 상동인 두 개 모티프를 포함하는 접합 변이체 단백질 부분을 코딩한다. G1의 예비 부분 서열, "dbest" 데이터베이스 및 사람 Genome database 1의 서열을 분석하면, 클론 G1의 일부 서열을 포함하는 발현된 서열 tags(est)를 얻을 수 있다. 이와 같은 est 서열을 분석하면, ICE-유사한 프로테아제에 상동인 단백질 모티프를 코딩하는 서열을 포함하는 다수의 접합 변이체인 단백질 G1을 얻는데, 이 서열은 이중 하이브리드 스크리닝에서 얻은 G1 서열의 3'에 위치한다.

프로테아제-유사 효소 부분을 포함하는 G1 동소체 전체 서열을 얻기 위해, cDNA 분자를 생산하기 위해, 15dT 스트레치를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 및 어뎁터 서열을 이용하여 다양한 세포주로부터 수득된 총 RNA에서 역 전사 반응을 실시한다. 그 다음 이와 같은 cDNA 분자를 PCR 반응에서 주형으로 이용하는데, PCR 프라어머는 G1의 5'넌코딩 부분에서 수득한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 형태로 합성되고, 어뎁터 서열과 함께 이들 프라이머를 이용하여 제 1 라운드 PCR 반응을 실시한다. 연속하여, 제 2 라운드 PCR 반응에서, 개시 ATG 및 어뎁터 서열을 포함하는 G1의 5' 코딩 부분의 서열을 가지는 추가 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. 이와 같은 방식으로, 효소작용(프로테아제와 유사한) 부분을 포함하는 다양한 접합 변이체 G1 단백질의 전체 수열을 얻는 것이 가능하다. 이는 예상한 G1 동소체의 하나이다.

이와 같은 G1 동소체의 예비 서열, G1 접합 변이체는 도 1에 나타내었는데, 윗 서열은 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 아래는 ATG(뉴클레오티드 No. 482)에서 시작하여 TAA(뉴클레오티드 1921)에서 종료되는 ORF의 유추된 아미노산 서열을 나타낸다. 이들 시작 및 종료 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열에서 *로 나타내었다. 도 1의 G1 접합 변이체는 가상적으로 "Gl

"으로 지정하였다.

도 2에서는 또 다른 G1 동소체의 예비 서열을 나타내었는데, 짧은 G1 접합 변이체는 두 개의 "MORT MODULES"를 가지는데, 이를 'G1

'로 지정하였다. 윗 서열은 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 아래는 ATG(뉴클레오티드 No. 482)에서 시작하여 TGA(뉴클레오티드 1145)에서 종료되는 ORF의 유추된 아미노산 서열을 나타낸다. 이들 시작 및 종료 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열에서 *로 나타내었다.

또한, "미끼'로 Mch4 서열을 이용하여 수득한 원래 분리된 G1 클론은 G1β라고 불리는 짧은 접합 변이체의 일부분이라는 것을 알아야 한다(도 2). 이와 같은 원래 분리된 G1 클론은 신규한 cDNA의 부분 클론으로, MACH(CASP-8) 및 Mch4(CASP-10)와 유사하게, N-말단의 하류에 두 개의 "사멸 도메인/Mort Modules(또는 "사멸 효과물질 도메인"(DED)을 가진다(도 3). 이와 같은 클론을 이용하여, 더 큰 접합 변이체 G1α또는 더 짧은 접합 변이체 G1β의 cDNA 클론을 분리하고 특징화시킨다. 더 큰 접합 변이체는 카스파베의 프로테아제 부분에 상동인 C-말단 부분을 가지있어, 카스파제 페밀리의 새로운 요소가 된다. 이와 같은 G1은 "카스파제 상동부분"에 대해 CASH으로 지정하였다. 다른 카스파제 서열과 G1α(CASH

) 및 G1β(CASH

) 서열을 비교하였다(특히 생쥐 G1 서열을 분리하고, 도 3에 대해서는 도면의 간단한 설명란을 참고한다). 비교 결과는 도 3에 나타내었고, 이 서열의 주요 부분은 도면의 간단한 설명란에서 부가 설명하였다.

G1의 클로닝 및 서열화후에, 특히 G1α및 G1β동소체의 클로닝 및 서열화 후에, 이들 단백질을 추가 분석하였다.

(ii) 노던 분석 및 추가 서열 분석

노던 블랏 분석에 따르면, G1 단백질은 세가지 별개의 전사체로 2, 3.4, 4.4kb로 존재하는데, 조직마다 그 비율이 상당히 다르다(도 4). G1의 전체 길이cDNA(CASH)를 얻기 위해, 사람 피부 섬유아세포 cDNA 라이브러리(Clontech)를 G1 서열에 상응하는 cDNA 프로브로 스크린한다. G1의 두 가지 접합 변이체에 실제 상응하는 두 개 cDNA 종을 얻는다(상기 참고). 이와 같은 두 개 cDNAs에 의해 인코드된 단백질은 사멸 효과물질 도메인을 포함하는 N-말단 부분을 공유하나, C-말단은 상이하가. 한 개(G1

=CASH

)는 짧은 C-말단을 가지는데, 이는 원래 클론된 cDNA의 것에 상응한다. 다른 한 개(G1

=CASH

)는 긴 C-말단을 가진다.

G1α의 긴 C-말단에 있는 아미노산 서열은 MACH(CASP-8) 및 Mch4(CASP-10)에 있는 프로테아제-전구물질 부분의 것과 상동성이 다소 높은 것으로 나타났다(도 3). 그러나, G1α는 프로테아제 활성에 중요한 것으로 보이는 부분이 부족하고, 이로써, 단백질은 시스테인 프로테아제 활성이 없게 된다. 흥미로운 것은, G1α에는 MACH(CASP-8) 및 Mch4(CASP-10)에서 프로테아제 부분내에 단백질 분해-프로세싱 부분에 상응하는 부위에 카스파제-기질 서열을 포함한다(도 3에서 빗금친 부분). 예비 데이터에 따르면, G1α는 MACH에 의해 이부분이 절단된다(데이타로 나타내지 않음).

G1의 "사멸 도메인"(DED)의 일부 생쥐의 상동 부분에 상응하는 것으로 밝혀진 EST 클론의 뉴클레오티드 서열에 기초하여, RT-PCR를 이용하여 생쥐 간 mRNA로부터 생쥐 CASHα 및 CASHβ접합 변이체의 cDNAs를 클론하였다. EST 클론(GenBank accession no. AA198928)은 G1의 DED 부분의 생쥐 상동 부분으로 확인되었다. 이 서열에 기초하여, 생쥐 간 mRNA로부터 생쥐 G1

(CASH

) 및 G1

(CASH

) 접합 변이체를 RT-PCR로 클론하였다. 제조업자의 지시에 따라 이용된 올리고-dT 프라이머(5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)₁ 7-^3')와 AMV 역 전사효소(Promega)로 역 전사효소 반응을 실시하였다. PCR 제 1 라운드는 다음의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 Expand Long Template PCR System(Boehringer Mannheim)을 이용하여 실시하였다; 센스 프라이머는 5'-GGCTTCTCGTGGTTCCCAGAGC-3'이고, 안티센스 프라이머는 5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'이다. 제 2 라운드는 Vent polymerase(NEB)로 실시하는데, 이때 센스 프라이머 5'-TGCTCTTCCTGTGTAGAGATG-3' 및 어뎁터를 이용한다.

서열을 비교하면, G1

(CASH

) 분자에 상당한 부분이 보존되어 있다는 것을 알 수 있는데(DED 부분에서 71% 동일, 프로테아제 상동 부분에서는 59% 동일), 이는 단백질에서 DED 및 프로테아제-상동 부분이 이 기능에 참여한다는 것을 의미한다(도 3).

(iii) G1 동소체의 결합 특이성에 대한 이중 하이브리드 분석

G1

(CASH

) 및 G1

(CASH

)의 상호작용 성질을 이중-하이브리드 테스트하면(도 5) 이들 변이체는 MORT1/FADD 및 MACH(CASP-8)와 상호작용하는 것으로 나타났는데, 거의 대부분은 이들이 공유하는 DED 부분을 통하여 이루어진다. 분명한 것은 Mch4(CASP-10)에 결합하는 단백질의 이중-하이브리드 스크린에 의해 클론되었으나, G1

(CASH

)는 Mch4(CASP-10)에 약하게 결합하고, G1

(CASH

)는 Mch4에만 약하게 결합하는 것으로 나타났다. 그러나, G1 단백질을 클론하기 위한 이중-하이브리드 스크린은 결합 특이성을 검사하기 위한 이중-하이브리드 스크린과는 다른 것으로 나타났는데, 실제 G1α 및 G1β가 원래 클로닝 결과에서 나타낸 것과 같이 MACH 및 Mch4에 결합하는 것으로 나타났다. 두 가지 G1 변이체는 자체-연합할 수 있고, 서로간에도 결합할 수 있으나, RIP 또는 TRADD(어뎁터 단백질, MORT1/FADD와 유사하게, 사멸 도메인은 가지고 있으나, DED는 부족하다)에는 결합하지 않고, 특이성 기준으로 이용된 여러 가지 무관한 단백질(라민)에도 결합하지 않는다.

추가 G1의 기능을 검사하기 위해, 이들 두 개 변이체를 HeLa 세포 및 293-T 세포에 일시적으로 발현시켜, TNF 또는 수용체의 과다발현에 의해 촉진되는 세포 독성에 대한 p55-R(CD120a)-유도된 시그날 발생시에 트랜스펙트된 단백질의 효과를 평가하고, 뿐만 아니라, FAS-R의 항체 교차 연결에 의해 촉진되는 세포독성에 대한 FAS-R(CD95)- 유도된 시그날 발생 또는 p55-R(CD120a)의 세포외 도메인 및 FAS-R(CD95)의 세포내 도메인으로 구성된 키메라 수용체의 과다 발현에 의해 촉진되는 세포독성에 대한 FAS-R(CD95)- 유도된 시그날 발생 시에 트랜스펙트된 단백질의 효과를 평가한다(도 6). 이들 두 가지 세포주에서, G1

(CASH

)의 자체 발현이 세포 생존능에는 영향을 주지 못하나, p55-R(CD120a) 및 FAS-R(CD95)에 의한 세포 사멸을 유도하는 것에는 강하게 저해한다. G1

(CASH

) 변이체의 발현은 이들 두 세포주에 매우 다르게 영향을 준다. HeLa 세포에서는 G1

(CASH

)에서와 비슷하게, p55-R(CD120a) 및 FAS-R(CD95)의 세포독성을 저해한다. 그러나, 293-T 세포의 경우에, 상당한 세포독성이 나타난다. G1α단백질이 293-EBNA 세포에서 발현되는 경우에, 유사한 세포독성이 관찰된다(데이터로 나타내지 않음). 이와 같은 세포독성 효과는 p35의 공동 발현에 의해 완전히 차단되는데, p35는 베큘로바이러스에서 유도된 카스파제 저해물질이다(p35는 Clem et al., 1991; Xue and Horvitz, 1995를 참고한다).

G1

(CASH

)에 프로테아제 상동성 부분이 세포치사 효과에 기여하는 바를 평가하기 위해서는 단백질의 두 개 돌연변이 기능에 대해 검사하였다. 이들 돌연변이는 G1/CASHα(1-385) 및 G1/CASHα(1-408)으로, 완숙한 프로테아제중 소 단위가 결손된 프로테아제 도메인의 일부에 상응하는 부분에서 C-말단이 결손된 것이다. 이들 두 개 돌연변이는 임의 세포독성 효과가 없다. 또한, G1

(CASH

)와 유사하게, 이들은 p55-R(CD120a) 및 FAS-R(cd95)에 의한 사멸 유도로부터 293 세포를 보호하였다(도 6C 및 D).

상기 과정에는 다음과 같은 방법 및 물질을 이용한다;

(i) PCR 및 통상적인 클로닝 기술을 이용하여, G1

(CASH

) 결손 돌연변이 및 p55-R/FAS-R(CD120a/CD95) 키메라를 생산한다. pcDNA3 발현 벡터(Invitrogen)를 이용하여 포유류 세포에서 G1(CASH) 접합 변이체, FAS-R(CD95) 또는 p55-R(CD120a) 시그날 발생 단백질(모두 사람에서 기인한 것), 베큘로바이러스 p35 단백질을 발현시켰다. β-갈락토시다제는 pCMV-

-gal 벡터(Promega)를 이용하여 발현시킨다.

(ii) 안정적으로 트랜스펙트된 사람 FAS-R(CD95)(본 발명의 실험실에서 정립한)을 발현시키는 사람 배 신장 293-T 및 293 EBNA 세포 및 사람 뇌 암종 HeLa 세포(HeLa-Fas; HtTA-1 클론)은 10% 태아 송아지 혈청, 비필수 아미노산, 100 U/㎖ 페니실린, 100㎎/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's 변형된 Eagle 최소 필수 배지에 생장시킨다.

상기에서 발견한 것은 G1이 p55-R 및 FAS-R 시그날 발생 복합체 성분과 상호작용하고, 세포 사멸 유도에 영향을 미치는데, 이 방법은 G1의 접합 변이체 및 발현되는 세포 타입에 따라 달라진다.

HeLa 세포의 경우에, G1β 및 G1α에 의해 유도되는 세포독성의 저해는 이들 단백질에 있는 "사멸 도메인"(DED)에 의해 중개된다는 것이다. 아마도, MORT1/FADD에 결합하기 위해 MACH(CASP-8) 및 Mch4(CASP-10)에 있는 상응하는 부분과 G1의 DED가 경쟁한다는 것을 반영한다.

CASHα가 293 세포의 사멸의 원인이 되는 방식으로, 세포 독성 효과를 차단하는 p35 단백질의 능력은 세포독성이 카스파제 활성에 의해 중개된다는 것을 의미한다. 그러나, 카스파제와 상당한 서열 상동성을 나타내지만, G1α는 실제는 시스테인-프로테아제 활성이 부족한데, 그 이유는 보존된 카스파제 활성 부위 잔기 일부를 가지고 있지 않기 때문이다. 따라서, G1α는 카스파제 활성을 가지는 다른 분자의 활성화에 의해 작용하는 것으로 보인다.

또 다른 가능성은, G1α가 단독으로 프로테아제로 작용할 수는 없지만, 활성 프로테아제 분자의 일부를 이룬다는 것이다. CASP-1 및 CASP-3 구조를 결정체 연구한 결과, 각 프로세스된 효소에 있는 크고 작은 프로테아제 서브유닛은 별개의 프로효소 분자에서 유도되었다는 것을 알 수 있다(Walker et al., 1994; Wilson et al., 1994; Mittl et al., 1997; Rotonda et al., 1996). 작은 프로테아제 소단위에 상응하는 부분에 완전성에서 G1α세포독성 활성의 관찰된 의존성에 있어서, G1

(CASH

)의 이 부분은 특정 카스파제의 큰 소단위와 연합되어, 효소적으로 활성이 있는 분자로 재구성하게 된다. 생성된 활성이 있는 이형사량체는 다른 카스파제를 활성화시킬 수 있어, 세포 사멸을 촉진시키게 된다.

또한, G1은 IL-1에 의해 중개되는 시그날 발생 과정에 관련된 MYD88라고 불리는 또 다른 단백질에 어느 정도 상동성을 가지는 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, G1은 다른 사이토킨에 의해 중개 또는 개시되는 다른 경로에 관련될 수도 있다.

G1 단백질(적어도 이들의 두 가지 동소체)의 클로닝 및 분리에 관계하여, 다음과 같은 G1 특징 및 용도를 가진다;

(i) 이중-하이브리드 스트린에 의해 G1은 MORT-1 결합 단백질인 Mch4에 결합하는 분자로 클론되고, 이는 Mch4 및 MORT-1의 활성 조절에 관여하고, 상기 언급한 메카니즘에 의해 G1은 FAS-R 및 p55-R에 의해 개시되는 세포 과정의 중개에 관여하는 것으로 보인다. Mch4는 MORT-1에 결합할 수 있기 때문에, 직접적으로 세포 독성에 관여하여 종국에는 세포를 죽게하고, 또한 일부 Mch4 동소체는 세포 사멸을 저해하는 것으로 알려져, 다양한 동소체를 포함하는 G1은 세포 독성, 세포 사멸 뿐만 아니라 세포 사멸을 저해하는데에 직간접적으로 관련되어 있다.

(ii) G1은 MACH 및 Mch 4의 두 개 MORT 모듈에 상동성인 두 개 MORT 모듈을 포함하는 N-말단 부분을 가진다(참고 실시예1-3). G1에 있는 이와 같은 MORT 모듈이 존재하는 것은 Mch4에 G1이 결합하는 능력 및 G1(적어도 이들의 일부 동소체)이 MACH(또는 일부 동소체) 뿐만 아니라 MORT-1에 직접적으로 결합하도록 한다. 따라서, G1은 MORT-1에 직접 결합함으로써 직접적으로 MORT-1(이어서, FAS-R 및 p55-R의 활성)의 활성을 조절하고, MORT-1에 결합하는 것으로 공지된 Mch4 또는 MACH에 간접적으로 결합하여, 간접적으로 이들 활성을 조절한다.

(iii) 상기 데이터 베이스 및 스크리닝에서 G1 서열을 분석한 것에 따르면, G1은 실제 사람 염색체 2에서 Mch4 및 MACH 위치에 근접하게 위치하여, 염색체 수준에서 이들 모든 단백질을 인코드하는 유전자간에 밀접한 관계가 있음을 나타낸 다.

(iv) 일부 G1 동소체(가령, 도 1에서 G1α)는 MACH 및 Mch4의 프로테아제 부분과 같은 효소와 유사성을 나타내는 MORT-1 모듈의 하류 부분을 가지고, 이와 같은 G1은 CED3/ICE 페밀리의 구성원이 된다.

(v) 적어도 일부 G1 동소체(가령, G1α)에서 프로테아제와 유사한 부분이 존재한다는 것은 G1 또는 이와 같은 동소체가 TNF/NGF 수용체 페밀리(가령, FAS-R 및 p55-R) 및 다른 수용체 뿐만 아니라 세포 독성 및 염증을 야기하는 세포내 프로테아제 활성을 통하여 직간접적으로 작용하는 다른 수용체를 포함하는 다양한 자극에 의해 일어나는 세포 독성 및 염증에 직접적으로 관여한다는 것을 의미한다.

(vi) G1은 세포 독성, 염증 및 TNF/NGF 수용체에 의해 중개되는 다른 관련된 효과 및 공통적인 세포내 효과물질을 공유하는 다른 것을 유도하는 세포내 메카니즘에서 MACH 및 Mch4 단백질(이들의 다양한 동소체를 포함)과 같은 다른 단백질의 활성을 증강시키는 또는 강화시키는 물질로 작용한다. 이들 단백질에 G1이 결합하여(상기에서 언급한 바와 같이, G1이 Mch4에 결합하고, 또한 MACH 및 MORT-1에 결합하여), G1(또는 적어도 일부 동소체)의 증강 또는 보강 효과가 나타나고, MORT-1에 결합하는 것을 새로 모으고(MORT-1 자체 연합을 포함) 또는 MORT-1와는 독립적으로 작용한다.

(vii) G1은 다른 단백질의 활성을 저해하는 저해물질로도 작용하는데, 이는 G1이 결합하는 다른 단백질(가령, Mch4 및 MACH, MORT-1)의 복합체 일부로 작용하여, 이들의 활성을 저해하는 정도로 이들의 세포독성에 영향을 준다. 또한, 일부 MACH 동소체 및 일부 Mch4 동소체에 관련된 언급된 것과 유사한 방식으로, 저해 활성을 특이적으로 가지는 G1의 동소체가 있다. 이와 같은 동소체중 하나는 도 2에서 나타낸 것과 같은 G1β인데, 두 개 MORT MODULES를 가지나, 다른 공지의 프로테아제와 유사한 프로테아제 유사 부분이 없는 것으로 보인다.

본 발명을 충분하게 설명하면서, 당업자는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고, 과도한 실험없이도 등가의 변수, 농도, 조건내에서 실시할 수 있다.

본 발명은 특정 구체예로 설명하였으나, 추가 변형이 가능하다는 것을 인지할 것이다. 본 출원은 본 발명의 원리등을 포함한 다용한 용도, 적용 범위를 수용하고, 이들은 청구범위에서 제시한 기본적인 특징을 가진다.

여기에서 이용한 문헌(모든 문헌, 요약서, 공고된 미국 또는 다른 외국 출원, 또는 임의 다른 문헌)을 참고문헌으로 하여 제시한다. 또한, 전체 내용도 첨부한다.

공지의 방법, 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본 발명의 구체예에서 기재하는데 있어서 임의 동의를 받지 않았다.

특정 구체예의 설명은 본 발명의 일반적인 특징을 충분히 제시하는 것으로, 당분야에 숙지된 지식을 가진 자는 실험없이 다양하데 변형 및 조절할 수 있을 것이다. 따라서, 이와 같은 변형 및 수정도 여기에서 제시하는 범위에 등가이다. 여기에서 이용한 기술적인 용어는 설명을 하기 위함이고, 이에 한정하고자 함은 아니고, 본 발명의 용어는 당업자가 이해하고, 실시할 수 있도록 설명하였다.

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Claims

G1 단백질 활성을 보유하는 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열에 있어서, 이때 폴리펩티드는

i) MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질에 직간접적으로 결합할 수 있고;

ii) FAS-R 또는 p55-TNF-R에 의해 중개되는 세포내 효과를 중개할 수 있으며;

DNA 서열은

i) 도 1의 아미노산 서열을 가지는 G1 동소체를 인코드하는 DNA 서열 또는

ii) 도 2의 아미노산 서열을 가지는 G1 동소체를 인코드하는 DNA 서열에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 1 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 2 항에 있어서, 벡터는 진핵 또는 원핵세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 2 항 또는 3항에 있어서, FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포의 표면에 있는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질(리간드)를 인코드하는 서열과 제 1 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 재조합 동물 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 4 항에 있어서, 세포 표면 수용체는 종양 세포, HIV-감염 세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 2항, 제3항, 제5항중 어느 한 항에 따른 벡터에 의해 형질변환된 것을 특징으로 하는 진핵 세포.
제 2항, 제3항, 제5항중 어느 한 항에 따른 벡터에 의해 형질변환된 것을 특징으로 하는 원핵 세포.
G1 단백질 활성을 가지는 폴리펩티드를 생산하는 방법에 있어서,

제 6 항 또는 제 7 항에 따른 형질 변환된 숙주 세포를 벡터에 인코드된 단백질이 발현될 수 있도록 생장시키고, 발현된 폴리펩티드를 분리시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
G1 단백질 활성을 보유하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 폴리펩티드는

i) MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질에 직간접적으로 결합할 수 있고;

ii) FAS-R 또는 p55-TNF-R에 의해 중개되는 세포내 효과를 중개할 수 있으며;

상기 폴리펩티드는

i) 도 1의 아미노산 서열을 가지는 G1 동소체; 그리고

ii) 도 2의 아미노산 서열을 가지는 G1 동소체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 9 항에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체.
세포 사멸 또는 염증 과정을 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 세포를 제 9 항에 따른 폴리펩티드로 처리하고, 이때 세포 처리는 세포내로 도입시킬 수 있는 적합한 형태의 폴리펩티드를 세포로 전달하거나 상기 폴리펩티드 서열을 인코드하는 제1항의 DNA를 포함하는 벡터를 세포내 주입시키는 단계로 구성되고, 상기 벡터에 의해 DNA 서열이 세포내에서 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 세포를 제 9 항에 따른 폴리펩티드로 처리하고, 이때 세포의 처리는 세포내로 도입시킬 수 있는 적합한 형태의 폴리펩티드를 세포로 전달하거나 상기 폴리펩티드 서열을 인코드하는 제1항의 DNA를 포함하는 벡터를 세포내 주입시키는 단계로 구성되고, 상기 벡터에 의해 DNA 서열이 세포내에서 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
삭제
제 12 항에 있어서, 제4항에 따른 재조합 동물 바이러스 벡터를 이용하여 세포를 형질변환시키는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
세포 사멸 또는 염증 과정을 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 세포의 사멸 또는 염증 과정을 조절하는 단백질 또는 효소의 저해물질로 세포를 처리하고, 이때 저해물질은

i) 세포 사멸 또는 염증 과정을 저해할 수 있는 제9항에 따른 폴리펩티드; 그리고

ii) 세포 사멸 또는 염증을 강화시키거나 증가시키는 제9항에 따른 폴리펩티드의 저해물질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 제10항에 따른 항체를 포함하는 조성물로 세포를 처리하고, 상기 조성물은 G1 단백질이 세포의 세포외표면에 노출되는 경우에는 세포외(extracelluar) 조성물로 만들어지고, G1 단백질이 세포내부에 있는 경우에는 세포내(intracelluar) 조성물로 만들어지는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
FAS-R 또는 p55-R를 가지는 세포에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 제1항에 따른 DNA 서열의 안티센스 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열로 세포를 처리하고, 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 G1 단백질의 발현을 차단할 수 있는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
제17항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열은 제4항에 따른 벡터에 인코드되어 벡터를 통하여 세포로 전달되는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
세포에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 제 9 항에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 세포 mRNA와 함께 전달될 수 있는 리보자임 서열을 인코드하는 벡터를 세포에 전달하고, 이때 세포는 리보자임 서열을 발현시킬 수 있으며, 리보자임 서열이 세포에서 발현되면, 세포 mRNA 서열을 절단하여 세포에서 벡터에 인코드된 제9항에 따른 폴리펩티드 발현이 저해되는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
제 11 항 또는 제 15 항에 있어서, 폴리펩티드는 MORT-1또는 MORT-1-결합단백질에 직간접적으로 결합될 수 있고, MORT-1는 FAS-IC에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 TRADD에 결합되고, 다시 p55-IC에 결합되는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
제 12항, 16항 내지 19항중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질에 직간접적으로 결합할 수 있고, MORT-1은 FAS-IC에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 TRADD에 결합되고, 다시 p5 54C에 결합되는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
제 9 항에 따른 폴리펩티드를 분리 및 확인하는 방법에 있어서, 이스트 이중-하이브리드 과정(two hybrid procedure)을 이용하는데 제 1 하이브리드 벡터에는 MORT-1 단백질 또는 MORT-1 결합 단백질을 인코드하는 서열이 포함되고, 제 2 하이브리드 벡터에는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 유래된 서열이 포함되고, 이들 두 벡터를 이용하여 이스트 숙주 세포를 형질변환시키고, 포지티브 형질변환된 세포를 모두 분리하고, 제2하이브리드 벡터를 추출하여 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질에 결합하는 단백질을 인코드하는 서열을 수득하는 과정으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
세포에 대한 MORT-1 결합 단백질의 MORT-1 유도 효과를 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 제 11항, 15항, 16항, 17항, 19항중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 제 1 항에 따른 DNA 서열 또는 제 9 항에 따른 폴리펩티드로 세포를 처리하면 MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질 중개된 효과가 강화 또는 저해되고, FAS-R 또는 p55-R 효과도 강화 또는 저해되는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
제 26 항에 있어서, 폴리펩티드는 MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질에 대한 결합에 특이적으로 관여하는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
삭제
아포프톱시스(apoptosis) 또는 예정된 세포 사멸을 조절하는 in vitro 방법에 있어서, 세포를 제 9 항에 따른 폴리펩티드로 처리하고, 이때 세포 처리는 상기 폴리펩티드를 세포내에 전달하거나 상기 폴리펩티드 서열을 인코드하는 제 1 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 벡터를 세포내로 도입하는 단계로 구성되고, 상기 벡터에 의해 세포에서 DNA 서열이 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 in vitro 방법.
제 9 항에 따른 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하는 방법에 있어서, 상기 폴리펩티드가 부착된 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 세포 추출물을 접촉시키고, 매트릭스에 결합된 리간드를 용출, 분리 및 분석하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 9 항에 따른 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 인코드하는 DNA 서열을 스크리닝하는 방법에 있어서, 이스트 이중-하이브리드 과정(two hybrid procedure)을 이용하는데 제 1 하이브리드 벡터에는 상기 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열이 포함되고, 제 2 하이브리드 벡터에는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 유래된 서열이 포함되고, 이들 두 벡터를 이용하여 이스트 숙주 세포를 형질변환시키고, 포지티브 형질변환된 세포를 모두 분리하고, 제2하이브리드 벡터를 추출하여 상기 리간드를 인코드하는 서열을 수득하는 과정으로 구성된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질에 의해 조절되는 세포 활성을 조절하는 리간드를 동정 및 생산하는 방법에 있어서,

a) MACH 단백질, Mch4 단백질에서 선택된 MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하고;

b) MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질 또는 TNF/NGF 수용체 패밀리이외에 a)의 스크리닝 방법에 의해 확인된 리간드를 확인하고 특징을 조사하고;

c) 리간드를 분리 정제하여 만드는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 따른 폴리펩티드에 의해 중개되는 세포 활성을 조절하는 리간드를 동정하고 분리하는 방법에 있어서,

a) 제 1 항에 (i) 또는 (ii)의 DNA 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하고;

b) MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질 또는 TNF-NGF 수용체 패밀리이외에 a)의 스크리닝 방법에 의해 확인된 리간드를 확인하고 특징을 조사하고;

c) 리간드를 분리 정제하여 만드는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
G1에 의해 조절되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 동정하고 분리하는 방법에 있어서,

a) 제 1 항에 (i) 또는 (ii)의 DNA 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하고;

b) MORT-1 또는 MORT-1 결합 단백질 또는 TNF-NGF 수용체 패밀리이외에 a)의 스크리닝 방법에 의해 확인된 리간드를 확인하고 특징을 조사하고;

c) 리간드를 분리 정제하여 만드는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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종양, AIDS, 폐혈증 쇼크, 이식 거부, 급성 간염, 당뇨병 또는 다발성 경색을 치료하기 위해,

a) 제 1 항에 따른 DNA 서열;

b) 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 벡터;

c) 제 9 항에 따른 폴리펩티드;

d) 제 10 항에 따른 항체에서 선택되는 활성 성분을 포함하는 약학 조성물.
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종양, AIDS, 폐혈증 쇼크, 이식 거부, 급성 간염, 당뇨병 또는 다발성 경색을 진단하기 위해, 활성 성분으로 제 10 항에 따른 항체를 포함하는 진단 조성물.