EA005775B1

EA005775B1 - Белок iren, его получение и использование

Info

Publication number: EA005775B1
Application number: EA200200319A
Authority: EA
Inventors: Дэвид Уоллах; Николай Малинин; Индранил Синха; Стефан Леу
Original assignee: Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд.
Priority date: 1999-09-02
Filing date: 2000-08-31
Publication date: 2005-06-30
Also published as: MXPA02002391A; NO20020919D0; EA200200319A1; AR025482A1; US7429648B1; BR0014167A; AU784582B2; AU6723100A; KR100820526B1; NO20020919L; IL131719A0; WO2001016314A1; EE200200096A; KR20020059386A; US20090075889A1; JP2003508053A; EP1208197A1; ZA200201401B; HK1051876A1; CA2383606A1

Abstract

Описаны ДНК-последовательности, кодирующие TRAF-связывающие белки, белки, кодируемые этими последовательностями, и их использование для лечения или профилактики патологических состояний, связанных с индукцией NF-κB или с активностью, опосредованной TRAF.

Description

Настоящее изобретение относится к ДНК-последовательностям, кодирующим белок, связывающийся с фактором, ассоциированным с рецептором ΤΝΕ (ТИЛЕ). Более конкретно, настоящее изобретение относится к кДНК-последовательностям, кодирующим биологически активный белок, обозначенный в настоящем описании ΙΚΕΝ, и его изоформы, способные связываться с ΤΚΑΕ2. Настоящее изобретение также относится к белкам, кодируемым вышеуказанными ДНК, и к использованию указанных белков и ДНК-последовательностей для лечения или профилактики патологических состояний, ассоциированных с индукцией ΝΕ-кВ или с любой другой активностью, опосредованной ТЕАЕ2, или с другими молекулами, с которыми связываются указанные белки.

Предшествующий уровень техники

Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли/фактора роста нервной ткани (ΤΝΕ/ΝΟΕ) представляет собой растущее семейство, состоящее из 20 членов, идентифицированных в настоящее время в клетках млекопитающих. Хотя рецепторы этого семейства отличаются по первичной последовательности своих внеклеточных доменов, члены суперсемейства рецептора ΤΝΡ/ΝΟΕ имеют общий субдомен, богатый цистеином, что, как считается, определяет, в основном, сходную третичную структуру (Вахап. 1993; Веи!1ег & уаи Нийе1, 1994; 8шйй е! а1., 1994). За исключением двух рецепторов, рецептора р55 ΤΝΕ и Еак/АР01, различные члены этого семейства рецепторов могут иметь варьирующиеся структурные отличия. Тем не менее, эти рецепторы имеют большое функциональное сходство, что указывает на то, что они имеют общие пути передачи сигналов. Одним из примеров такого сходства является способность некоторых рецепторов семейства ΤΝΤ/ΝΟΕ активировать фактор транскрипции ΝΕ-кВ (см. ниже).

ΤΚΑΕ2 представляет собой член недавно описанного семейства белков, обозначенных ΤΚΑΕ (фактор, ассоциированный с рецептором ΤΝΕ), которое включает несколько белков, идентифицированных как, например, ΤΚΑΕ1, ΤΚΑΕ2 (Ио1йе, М., е! а1., (1994); опубликованная заявка РСТ XVО 95/33051), ΤΚΑΕ3 (Скеид, С. е! а1. (1995), ΤΚΑΕ4 (САКГ1, С-богатый мотив, ассоциированный с доменами ΚΙΝΟ и ΤΚΑΕ, Кедшег е! а1. 1995), ΤΚΑΕ5 (Шиба е! а1., 1996а, Nакаио е! а1., 1996) и ΤΚΑΕ6 (см. Сао е! а1., 1996а, Шиба е! а1. 1996Ь). Все белки, принадлежащие к семейству ΤΚΑΕ, имеют высокую степень идентичности аминокислот в своих С-концевых доменах, тогда как их Ν-концевые домены могут быть неродственными. Как показано на схематической иллюстрации ΤΚΑΕ2 (фиг. 1 данной заявки), указанная молекула, у своего Ν-конца, содержит мотив кольцевого пальца и два ΤΕΙΙΙΑ-подобных мотива цинковых пальцев. С-концевая половина данной молекулы включает область, известную как домен ΤΚΑΕ и содержащую возможную область лейциновой молнии, простирающуюся между аминокислотами 264-358 (называемую Ν-ΤΚΑΕ). Другой домен, находящийся ближе к карбокси-концу данной молекулы, между аминокислотами 359-501, (называемый С-ΤΚΑΕ), ответственен за связывание ΤΚΑΕ с рецепторами и другими молекулами ΤΚΑΕ с образованием гомо- или гетеродимеров.

Рекрутинг белков-адаптеров ΤΚΑΕ в цитоплазматические домены молекул-рецепторов может приводить к сборке более крупных передающих сигнал комплексов, которые состоят из отличающихся молекул-адаптеров ΤΚΑΕ и других эффекторных белков с ферментативными функциями. Во многих работах сообщается об оценке активации внутриклеточных киназ в ответ на ΤΚΑΕ-зависимую передачу сигнала. В частности, было показано, что киназы семейства активированных митогеном протеинкиназ (МАРК) играют ключевую роль в каскадах реакций передачи сигнала, стимулируемых ΤΚΑΕсодержащими комплексами. Очевидно, что кульминацией этих каскадов реакций является активация амино-(^-концевой киназы с-1ии (1ΝΚ) (ЕешЕагб е! а1., 1997; 8оид е! а1., 1997). Таким образом, белки ΤΚΑΕ могут служить модуляторами способности рецепторов запускать различные каскады реакций передачи сигналов, которые приводят к фосфорилированию и активации протеинкиназ, а затем к активации факторов транскрипции семейства Κ^ и АР-1.

Фактор транскрипции е-1ии фосфорилируется у своего аминоконца киназой 1ΝΚ, самым последним членом одного из путей передачи сигналов МАРК (Н1Ь1 е! а1., 1993). Для активации 1ΝΚ необходимо, чтобы он был фосфорилирован киназой МАРК (МАРКК, 8ΕΚ, МЕК). Эта киназа сама фосфорилируется МАРККК (МЕКК1), которая может быть активирована посредством фосфорилирования белком ССКЯ (дегшша1 сеи!ег кшаке ге1а!еб - родственный киназе зародышевого центра), киназой, участвующей на самой ранней стадии этого каскада реакций (Мшбеи е! а1. 1994; Ьш е! а1. 1995; 81ιί & Кекг1 1997). Доминантно-негативные мутанты любого из этих белков, у которых отсутствует киназная активность, блокируют ΤΚΑΕ-опосредованную активацию 1ΝΚ, индуцируемую членами суперсемейства ΤNΕ/NСΕΚ. Таким образом, очевидно, что белки ΤΚΑΕ регулируют каскад реакций активации 1ΝΚ на самой ранней стадии (Ыи е! а1. 1996; Бее е! а1. 1997; Ретйагб е! а1. 1997). Клетки от мышей, дефицитных по ΤΚΑΕ2, не способны активировать 1ΝΚ в ответ на ΤΝΕ-α (Уеи е! а1. 1997). Было продемонстрировано, что 1ΝΚ опосредуют интеграцию костимулирующего сигнала, передаваемого СО28 во время активации Тлимфоцитов (8и е! а1., 1994). Эти результаты, взятые вместе, позволяют предположить, что при костимуляции посредством СО28 и ΤΚΑΕ-опосредованной костимуляции, после лигирования ΤΝΕΚассоциированных молекул, используются те же самые компоненты дистальной передачи сигнала.

- 1 005775

Очевидно также, что белки ΤΚΑΡ играют важную роль в модуляции ранней стадии индуцированной рецептором активации ΝΡ-кВ (Ко111с е! а1. 1995Ь; Сао е! а1. 1996; Ыакапо е! а1., 1996). ΝΡ-кВ представляет члены семейства димеробразующих белков, гомологичных онкогену Кс1. который в своей димерной форме действует как факторы транскрипции. Эти факторы присутствуют повсюду и участвуют в регуляции экспрессии множества генов. Хотя ΝΡ-кВ был первоначально идентифицирован как фактор, который конститутивно присутствует в В-клетках на стадии экспрессии легкой к-цепи 1дО (1дк), однако, он известен, главным образом, как фактор, действующий в качестве индуцибельного активатора транскрипции. В наиболее известных случаях- ΝΡ-кВ ведет себя как главный фактор, а именно индуцирование его активности происходит путем активации молекул-предшественников, присутствующих в клетке в своей неактивной форме, но не путем бе-поуо-синтеза, который, в свою очередь, зависит от индуцибельных факторов транскрипции, а они, в свою очередь, зависят от гена ΝΡ-кВ.

Действие ΝΡ-кВ является в высокой степени плейотропным. Большинство из этих многочисленных эффектов имеют общие особенности, заключающиеся в быстром индуцировании в ответ на внеклеточную стимуляцию. Большинство из ΝΡ-кВ-активирующих агентов являются индукторами иммунной защиты, включая компоненты вирусов и бактерий, цитокины, которые регулируют иммунный ответ, УФизлучение и другие. В соответствии с этим, многие из генов, регулируемых ΝΡ-кВ, играют важную роль в иммунной защите (см. В1апк е! а1., 1992; ОпШ е! а1., 1993; Ваеиег1е & Непке1 1994).

Одна из главных особенностей ΝΡ-кВ-регуляции заключается в том, что этот фактор присутствует в цитоплазматической не связанной с ДНК форме, которая может быть индуцирована для переноса в ядро, для связывания с ДНК и для активации транскрипции. Эта дуальная форма белков ΝΡ-кВ регулируется белками семейства Ι-кВ, содержащими повторы доменов, которые были первоначально идентифицированы в эритроцитном белке анкирине (Ойшоте & Мопп, 1993) . В нестимулированной форме димер ΝΡ-кВ находится в ассоциации с молекулой Ι-кВ, которая сообщает ему цитоплазматическую локализацию, предупреждая тем самым его взаимодействие с ΝΡ-кВ-связывающей ДНК-последовательностью и активацию транскрипции. Отделение Ι-кВ от димера ΝΡ-кВ представляет критическую стадию его активации многими индуцирующими его агентами (ЭтОопаФ е! а1., 1995). В настоящее время существует очень мало сведений о способах определения специфичности клетки в отношении ее восприимчивости к различным ΝΡ-кВ-индуцирующим агентам.

О способности белков ΤΚΑΡ влиять на опосредованную рецептором активацию ΝΡ-кВ свидетельствовал тот факт, что доминантно-негативные формы ΤΚΑΡ2 могут ингибировать активацию ΝΡ-кВ в ответ на олигомеризацию нескольких ΤΝΡΚ-ассоциированных молекул, включая ΤΝΡΚΙΙ, СЭ40, СЭ30, 4-1ВВ и 0x40 (Ко111е е! а1., 1994, 1995Ь; Эиске!! е! а1., 1997; Агсй & Тйошркоп 1998). Однако в исследованиях по элиминации генов у мышей не удалось выявить необходимую роль специфического ΤΚΑΡ в активации ΝΡ-кВ любым из этих рецепторов (Бее е! а1. 1997; Уей е! а1., 1997). Это дало основание предположить, что контактирование с рецептором может активировать ΝΡ-кВ более чем одним путями.

Одним из наиболее сильных агентов, индуцирующих, ΝΡ-кВ, является цитокин, такой, как фактор некроза опухоли (ΤΝΡ). Существует два различных рецептора ΤΝΡ: рецепторы р55 и р75. В различных клетках уровни их экспрессии варьируются независимо друг от друга (УапбепаЬее1е е! а1., 1995). Рецептор р75 реагирует преимущественно с клеточно-связанной формой ΤΝΡ (ΤΝΡ экспрессируется как трансмембранный белок типа ΙΙ и как растворимый белок), а рецептор р55 также эффективно реагирует с растворимыми молекулами ΤΝΡ (Оте11 е! а1., 1995). Внутриклеточные домены этих двух рецепторов являются структурно неродственными и связываются с различными цитоплазматическими белками. Тем не менее, по крайней мере, часть эффектов ΤΝΡ, включая разрушающий клетки эффект ΤΝΡ и индуцирование ΝΡ-кВ, могут быть индуцированы обоими рецепторами. Эта характерная особенность заключается в клеточной специфичности. Рецептор р55 способен индуцировать разрушающий клетки эффект или активацию ΝΡ-кВ во всех клетках, которые обнаруживают указанные эффекты в ответ на ΤΝΡ. р75-К обладает такими эффектами только в некоторых клетках. В остальном, хотя р75-К экспрессируется на высоком уровне, однако, он индуцирует эти эффекты только в ответ на стимуляцию р55-К (УапбепаЬее1е е! а1., 1995). В отличие от рецепторов ΤΝΡ, различные другие рецепторы семейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΡ: СЭ30 (МсЭопа1б е! а1., 1995), СЭ40 (ВетЬепсй е! а1., 1994; Ьа1тапасй-61гагб е! а1., 1993), рецептор лимфотоксина-бета, а, в некоторых типах клеток, Так/АР01 (Кепктд-ЕЫ е! а1., 1995) также способны индуцировать активацию ΝΡ-кВ. Рецептор ΙΡ-1 типа Ι, также эффективно запускающий активацию ΝΡ-кВ, обладает, по большей части, такими же эффектами, как и рецепторы ΤΝΡ, несмотря на то, что он не имеет с ними структурного сходства. Недавно были клонированы новые субъединицы рецепторного комплекса ΙΡ-18 и было показано, что они запускают транслокацию ΝΡ-кВ и активацию в ответ на ΙΠ-18 (Вогп е! а1., 1998). Кгр ΙΕ-1, а также новый белок семейства рецепторов ΙΕ-1, обозначенный АсРЬ (Ассеккогу Рто!еш Ыке - подобный вспомогательному белку) необходимы для передачи сигнала Ш-18.

Активация ΝΡ-кВ после запуска указанных различных рецепторов происходит в результате индуцированного фосфорилирования ассоциированных с ним молекул Ι-кВ. Недавно было идентифицировано несколько компонентов каскада реакций передачи специфических сигналов, активированных в ответ

- 2 005775 на провоспалительные цитокины ΤΝΕ-α или ΙΠ-1 β. Первым из этих компонентов была идентифицирована новая протеинкиназа для ΝΕ-кВ, обозначенная ΝΙΚ (ΝΕ-кВ 1ибиетд Ките - ΝΕ-кВ-индуцирующая киназа) (см. одновременно рассматриваемую и принадлежащую нескольким владельцам патентную заявку \νϋ 97/37016, Майшп с1 а1. 1996). Было обнаружено, что ΝΙΚ связывается с ΤΒΑΕ2 и стимулирует активацию ΝΕ-кВ. ΝΙΚ имеет последовательность, сходную с последовательностью киназ МАР3К и участвует в каскаде реакций передачи ΝΕ-кВ-индуцирующих сигналов, которые являются общими для рецепторов семейства ΤΝΕ/ΝΟΕ и для рецептора ΙΠ-1 типа I. ΤΝΕ-α и ΙΠ-1 β инициируют каскад реакций передачи сигналов, приводящий к активации двух киназ Ι-кВ, ΙΚΚ-1 [ΙΚΚ-α] и ΙΚΚ-2 [ΙΚΚ-β], которые фосфорилируют Ι-кВ в специфических Ν-концевых сериновых остатках [832 и 836 для ШВа и 819 и 823 для Ι^β] (см. Мегеигю Ε. & Мапшпд А.М., 1999). Эти киназы были идентифицированы как компоненты высокомолекулярного белкового комплекса, названного сигналосомой ΙΚΚ.

Фосфорилированный ШВ подвергается селективному убихитинированию убихитин-лигазой Е3, последним членом каскада убихитин-конъюгирующих ферментов. В этой последней стадии каскада передачи сигналов фосфорилированный и убихитинированный ШВ, который еще ассоциирован с ΝΕ-кВ в цитоплазме, селективно разлагается протеосомой 268. Этот процесс открывает доступ к ΝΌ8, а поэтому позволяет ΝΕ-кВ взаимодействовать с комплексом ядерного импорта и транслоцируется в ядро, где он связывается с его генами-мишенями для инициации транскрипции.

Идентификация нескольких дополнительных компонентов сигналосомы ΙΚΚ дает ключ к выявлению возможных механизмов, которые помогут установить связь между активацией рецептора и активацией ΙΚΚ. Одним из них является главный модулятор ΝΕ-κΒ, обозначенный БЕМО. Было обнаружено, что этот мышиный белок играет важную роль в активации ΝΕ-кВ в плоскоклеточном варианте НТЬУ-1 Тах-трансформированных фибробластов, которые невосприимчивы ко всем тестируемым ΝΕ-кВстимуляторам (Уатаока е1 а1. 1998). Было обнаружено, что кЕМО способен к гомодимеризации и к непосредственному взаимодействию с ΙΚΚ2. Такой же белок был независимо клонирован Коуа1епко еЕ а1. (см. совместно рассматриваемую и принадлежащую нескольким владельцам заявку на патент Израиля №№ 123758 и 126024) как ΒΙΡ-связывающий белок и был обозначен ВАР-2. Позднее кЕМО был независимо клонирован двумя другими группами ученых в качестве некиназного компонента сигналосомы ΙΚΚ, и обозначен ΙΚΚΑΡ-1 (Мегеигю Ε. е1 а1. 1999Й, Ро111\\шТ Э.М. е1 а1. 1998). Тот же самый белок был также клонирован как белок, взаимодействующий с Е3, который представляет собой аденовирусный белок, кодируемый ранней областью транскрипции, и действует как ингибитор цитолитических эффектов ΤΝΕ, и было показано, что он взаимодействует с киназой ΒΙΡ (Ь1 Υ е1 а1. 1998). Эти исследования показали, что ЫЕМО опосредует основную стадию пути передачи сигнала ΝΕ-кВ. Как оказалось, в инициации каскада реакции фосфорилирования участвуют три ассоциированных с рецептором белка (см. диаграмму на фиг. 2). ΤΚΑΕ2, который, при его экспрессии на высоких уровнях, может сам запускать активацию ΝΕ-кВ, связывается с активированным ΤΝΕ-Β р75 (ВоЕйе е1 а1., 1994), рецептором лимфотоксина-бета (Моща1о8 е1 а1., 1995), СЭ40 (ВоЕйе еЕ а1., 1995а) и СЭ30 (неопубликованные данные) и опосредует индуцирование ими ΝΕ-кВ. ΤΒΑΕ2 не связывается ни с рецептором р55 ΤΝΕ, ни с Εа8/ΑΡО1, однако, он может связываться с рецептор-ассоциированным белком р55, названным ΤΒΑΌΌ, и этот ΤΒΑΌΌ обладает способностью связываться с Εа8/ΑΡО1-ассоциированным белком, названным МОРМ (или ΕΑΌΌ - см. Во1б1и еЕ а1. 1995Й и 1996). Другой белок, содержащий домен гибели и взаимодействующий с рецептором сериновой/треониновой киназы, который был обозначен ΒΙΡ (см. 8Еапдег еЕ а1., 1995) также способен взаимодействовать с ΤΒΑΕ2, а также с Εа8/ΑΡО1, ΤΒΑΌΌ, рецептором ΤΝΕ р55 и с МОВГОТ Таким образом, хотя ΒΙΡ сначала ассоциировался с индукцией клеточной цитотоксичности (гибелью клеток), однако был сделан вывод, что его способность взаимодействовать с ΤΒΑΕ2 также приводит к активации ΝΕ-кВ.

Как оказалось, молекулы ΤΒΑΕ участвуют к каскаде реакций, приводящих к активации ΝΕ-кВ. Эти взаимодействия, очевидно, позволяют рецептору ΤΝΕ р55 и Εа8/ΑΡО1 запускать активацию ΝΕ-кВ (Н§ц еЕ а1., 1995; Во1бш еЕ а1., 1995; Сйшпа1уап еЕ а1., 1995; УагТо1отееу еЕ а1., 1996; Н§ц еЕ а1., 1996). Запуск активации ΝΕ-кВ рецептором ΙΠ-1 происходит независимо от ΤΒΑΕ2 и может вовлекать в реакцию гомолог ΤΒΑΕ2, а именно ΤΒΑΕ6, и недавно клонированную протеинкиназу, ассоциированную с рецептором ΙΠ-1 и обозначенную ΙΒΑΚ (СгокЕоп еЕ а1., 1995). Было также показано, что ΤΒΑΕ6 и ΙΒΑΚ играют важную роль в ΙΕ-18-индуцированных реакциях и функции передачи сигнала (Капагакага_) еЕ а1. 1999).

Каскады реакций передачи сигналов, инициируемые рекрутингом рецепторов либо молекул ΤΒΑΕ, либо белков-адапторов, содержащих домен гибели, регулируются белками, которые могут препятствовать осуществлению специфических стадий посредством модификации состава комплексов, состоящих из множества белков, и/или путем блокирования взаимодействий белок-белок и последующих эффекторных функций. Было идентифицировано несколько цитоплазматических молекул, которые связываются с ΤΒΑΕ. Из них А20 были идентифицированы с-ΙΑΡ (се11и1аг [пЫЬйоге оТ ΑрорЕо8^8 - ингибиторы апоптоза клеток), ΤΒΙΡ (ΤΒΑΕ шЕегасЕшд ргоЕеш - белок, взаимодействующий с ΤΒΑΕ) и Ι-ΤΒΑΕ/ΤΑΝΚ (белок, взаимодействующий с ΤΒΑΕ, активатор ΝΕ-кВ, ассоциированный с членами семейства ΤΒΑΕ, (Ро111е еЕ а1. , 1994; ΒоЕйе еЕ а1., 1995Й; Сйепд & Ва1Е1тоге 1996; Бее еЕ а1., 1997; Βоу еЕ а1., 1997) и две дру

- 3 005775 гие молекулы, одна из которых была названа клоном 9, который обнаруживает некоторую гомологию последовательности с последовательностью белков настоящего изобретения, а другая была названа клоном 15 (см. совместно рассматриваемую и принадлежащую нескольким владельцам патентную заявку XVО 97/37016). Было показано, что каждый из этих белков обладает способностью, по крайней мере, к связыванию, а также, в определенной степени, к взаимодействию с членами семейства ТКАР. Кроме того, было продемонстрировано, что функциональные роли указанных взаимодействий являются абсолютно различными. Эти белки могут быть важным звеном в ТКАР-зависимой передаче сигнала для модуляции пути выживания клеток. Действительно, еще не ясно, каким образом ТКАР могут запускать фосфорилирование Ι-кВ. Отсутствует также информация о механизмах, которые определяют клеточноспецифический характер активации ТКАР различными рецепторами, например, такой, который наблюдается при индуцировании ΝΡ-кВ двумя рецепторами ΤΝΡ. Недавно была определена кристаллическая структура домена ТКАР человеческого ТКАР (Рагк Υ.Ο. е! а1. 1999). Эта структура выявила самосборку тримерной структуры домена ТКАР, что объясняет, исходя из авидности, зависимость рекрутинга ТКАР от олигомеризации рецепторов, опосредованной их тримерными внеклеточными лигандами.

Таким образом, что касается активации ΝΤ-кВ и ее роли в сохранении жизнеспособности клеток, то различные внутриклеточные механизмы, участвующие в этой активации, ранее не были достаточно ясными, например, не было известно, является ли участие различных белков ТКАР прямым или опосредованным.

Кроме того, в настоящее время известно, что различные члены семейства рецепторов ТИР/ИОР и ассоциированные с ними каскады передачи внутриклеточных сигналов, включая различные адапторы, белки-медиаторы/модуляторы (краткие обзоры и ссылки см. например, в одновременно рассматриваемой и принадлежащей нескольким владельцам заявке на патенты Израиля №№ 114615, 114986, 115319, 116588), ТИР и лиганд РаУАРОР например, могут оказывать как благоприятное, так и неблагоприятное действие на клетки. Так, например, ТИР вносит определенный вклад в защиту организма от опухолей и инфекционных агентов и играет определенную роль в восстановлении ткани вследствие повреждения путем индуцирования гибели опухолевых клеток и инфицированных вирусом клеток, и в усилении антибактериальной активности гранулоцитов, а поэтому в этих случаях ТИР-индуцированная гибель клеток является желательной. Однако избыток ТИР может оказаться нежелательным, поскольку известно, что указанный ТИР играет главную патогенную роль в ряде заболеваний, таких как септический шок, анорексия, ревматические болезни, воспаление и реакции трансплантат против хозяина. В этих случаях ТИР-индуцированная гибель клеток является нежелательной. Так, например, лиганд Ра§/АРО1, также оказывает как желательное, так и неблагоприятное действие. Лиганд Ра§/АРО1 индуцирует посредством своего рецептора гибель аутореактивных Т-клеток в процессе созревания Т-клеток, т.е. гибель Т-клеток, которые в процессе их развития распознают аутоантигены, и, таким образом, предупреждают аутоиммунные заболевания. Кроме того, различные злокачественные клетки и ВИЧ-инфицированные клетки несут на своей поверхности рецептор Ра§/АРО1 и, таким образом, могут быть разрушены путем активации этого рецептора его лигандом или специфичными к нему антителами, что приводит к активации внутриклеточных механизмов гибели (апоптоза) клеток, опосредованных этим рецептором. Однако рецептор Ра§/АРО1 может опосредовать и нежелательные эффекты, например, неконтролируемая гибель ткани, которая наблюдается при некоторых заболеваниях, таких, как острый гепатит, сопровождающийся разрушением клеток печени.

Если принять во внимание вышеизложенное, т.е. тот факт, что, с одной стороны, рецепторы семейства ТИР/ИОР могут индуцировать пути клеточной гибели, а с другой стороны, они могут индуцировать пути выживания клеток (посредством индуцирования ИР-кВ), то, очевидно, что внутри клетки существует тонкое равновесие между эти двумя противоположными механизмами. Так, например, если необходимо достигнуть максимального разрушения раковых клеток или других инфицированных или аномальных клеток, то желательно присутствие ТИР и/или лиганда Ра§/АРО1, индуцирующих лишь механизм клеточной гибели без индуцирования ИР-кВ. И наоборот, если необходима защита клеток, таких, которые участвуют в воспалении, реакциях трансплантат против хозяина, остром гепатите, то желательно блокировать индукцию гибели клеток фактором ТИР и/или лигандами Ра§/АРО1, и вместо этого усиливать индукцию ИР-кВ. Аналогичным образом, при некоторых патологиях желательно блокировать пути передачи внутриклеточных сигналов, опосредованной рецептором ТИР р75 и рецептором 1Ь-1, тогда как в других случаях желательно стимулировать эти каскады внутриклеточных реакций.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является получение биологически активного белка, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных, способных связываться с белками фактора, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (ТКАР). Поскольку ТКАР-связывающие белки участвуют в модуляции или опосредовании активации транскрипции фактора ИР-кВ, которая инициируется некоторыми рецепторами ТИР/ИОР, а также другими вышеуказанными рецепторами, то, следовательно, белок настоящего изобретения способен посредством его связывания с белками ТКАР модулировать или опосредовать процессы передачи внутриклеточных сигналов, инициированные различными лигандами, связы

- 4 005775 вающимися с их рецепторами. Такими лигандами являются, например, ΤΝΤ, лиганд СЭ40. лиганд ΤΑ8 и др., а модуляцией/опосредованием может быть, например, активация ΝΤ-кВ посредством прямого или опосредованного взаимодействия с белком ΤΚΑΤ (например, индуцирование активации ΝΤ-кВ белками ΤΚΑΤ2 и ΤΚΑΤ6 и ингибирование активации ΝΤ-кВ белком ΤΚΑΤ3).

Биологически активный белок настоящего изобретения и его изоформы, аналоги, фрагменты или производные могут быть также непрямыми модуляторами/медиаторами внутриклеточной биологической активности различных других белков, которые способны прямо или опосредованно взаимодействовать с белками ΤΚΑΤ (например, рецептора Та8/ЛРО1, рецептора ΤΝΤ р55, рецептора ΤΝΤ р75, рецептора 1Ь-1 и ассоциированных с ним белков, таких как, например, ΜΟΚ.Τ-1, ΤΚΑΌΌ, ΚΙΡ).

Другой целью настоящего изобретения является получение антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений или даже некоторых изоформ) по отношению к вышеуказанному новому ΤΚΑΤ-связывающему белку, его изоформам, аналогам, фрагментам или производным, которые могут быть использованы для ингибирования процессов передачи сигнала, или, более конкретно, для ингибирования активации ΝΤ-кВ и связанного с ней участия в процессах выживания клеток, если это желательно. Аналогичным образом, в случае, когда ΤΚΑΤ-связывающий белок настоящего изобретения или белок ΤΚΑΤ, с которым он связывается (например, ΤΚΑΤ3), сами являются ингибиторами активации ΝΤ-κΒ (либо непосредственно, либо посредством модуляции транспорта или стабильности белков, с которыми они связываются), то целью настоящего изобретения является получение антагонистов ΤΚΑΤсвязывающего белка в целях активации процессов передачи сигналов, или, более конкретно, в целях блокирования ингибирования активации ΝΤ-кВ, и тем самым стимуляции активации ΝΤ-кВ, если это необходимо.

Другой целью настоящего изобретения является использование вышеуказанного нового ΤΚΑΤсвязывающего белка, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных, для выделения и характеризации других белков и факторов, которые могут участвовать в регуляции активности белка ΤΚΑΤ и/или вышеуказанной рецепторной активности, например, других белков, которые могут связываться с белками ΤΚΑΤ и влиять на их активность, и/или для выделения и идентификации других рецепторов или других клеточных белков, которые участвуют в более ранних или более поздних процессах каскада передачи сигналов, и с которыми связываются эти новые белки, их аналоги, фрагменты или производные, а следовательно, на функции которых они также могут влиять.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение ингибиторов, которые могут быть введены в клетки для их связывания или взаимодействия с новым ΤΚΑΤ-связывающим белком и его возможными изоформами, ингибиторы которых могут ингибировать активность, ассоциированную с белком ΤΚΑΤ, направленную, например, на активацию ΝΤ-кВ, а следовательно, если это необходимо, ингибировать активацию ΝΤ-кВ; или, которые могут ингибировать ингибирующую ΤΚΑΤ-ассоциированную активность (например, ΤΚΑΤ3), направленную на активацию ΝΤ-кВ, а следовательно, если это необходимо, усиливать активацию ΝΤ-кВ.

Кроме того, целью настоящего изобретения является использование вышеупомянутого ΤΚΑΤсвязывающего белка, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных в качестве антигенов для продуцирования поликлональных и/или моноклональных антител против этих антигенов. Эти антитела, в свою очередь, могут быть использованы например, для очистки новых белков из различных источников, таких, как клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии.

Кроме того, указанные антитела могут быть использованы в диагностических целях, например, для идентификации нарушений, связанных с аномальными клеточными эффектами, непосредственно опосредуемыми белками ΤΚΑΤ или опосредуемыми рецептором ΤΝΤ р55, рецептором Ταδ/ΛΡΟΙ или другими родственными рецепторами и ассоциированными с ними клеточными белками (например, ΜΟΚΤ-1, ΤΚΑΌΌ, ΚΙΡ), которые прямо или опосредованно модулируют/ опосредуют внутриклеточные процессы путем взаимодействия с белками ΤΚΑΤ.

Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, включающих вышеуказанный новый белок ΙΚΕΝ, его изоформы, аналоги, фрагменты или производные, а также фармацевтических композиций, включающих вышеуказанные антитела или другие антагонисты.

Настоящее изобретение также относится к новому белку ΙΚΕΝ, связывающемуся, по крайней мере, с ΤΚΑΤ2 и обладающему высокой специфичностью связывания с ΤΚΑΤ2. Следовательно, этот белок является модулятором или медиатором внутриклеточной активности ΤΚΑΤ2. ΤΚΑΤ2 участвует в модуляции или опосредовании по крайней мере одного внутриклеточного пути передачи сигнала, являющегося путем, ассоциированным с выживанием или жизнеспособностью клеток, в котором ΤΚΑΤ2 непосредственно участвует в активации ΝΤ-кВ, играющей главную роль в выживании клеток.

Действительно, белок, обозначенный ΙΚΕΝ (1кВ ΚΕ^ιιΕιΙογ - регулятор 1кВ) связывается с ΤΚΑΤ2 и очевидно участвует в пути передачи сигнала ΝΤ-кВ позднее, чем ΝΙΚ, но раньше, чем ΝΕΜΟ и ΙΚΚ1 и стимулирует ΙΚΚΙ-фосфорилирование Е<В. Кроме того, ΤΚΑΤ2, благодаря своей способности прямо или опосредованно взаимодействовать с вышеуказанными рецептором ΤΝΤ р55, рецептором ΤΝΤ р75, рецепторами Ταδ/ΑΡΟ! и ассоциированными с ними белками ΜΟΚΤ-1, ΤΚΑΌΌ и ΚΙΡ, также является медиа- 5 005775 тором или модулятором индукции или активации активности ΝΡ-κΒ, свойственной этим рецепторам. Поэтому ТКАЕ2 является модулятором/медиатором механизмов выживания клетки (в противоположность механизмам гибели клеток), опосредованных этими рецепторами и ассоциированными с ними белками, а поэтому степень взаимодействия этих рецепторов и/или белков с ТКАЕ2 является важным фактором, влияющим на результат активности этих рецепторов (после активации их лигандами), а именно, активности, направленной на выживание или гибель клеток. В соответствии с этим, белки настоящего изобретения играют ключевую роль во взаимодействии между ТКАР2 и другими белками/рецепторами, с которыми взаимодействует ТКАЕ2, поскольку такие белки, как ΙΒΕΝ, благодаря их специфическому связыванию с ТКАЕ2, модулируют его активность и/или сами обладают активностью, модулированной взаимодействием с ТКАЕ2.

Используемый в настоящем описании термин активность белка ТКАВ, например, активность ТКАВ2, означает его активность в модуляции/опосредовании пути выживания клеток, например, в индуцировании/активации ΝΡ-кВ. Аналогичным образом, используемый здесь термин активность ТКАВсвязывающего белка, а в частности, активность ТКАВ2-связывающего белка означает модуляцию/опосредование ТКАВ, а в частности, активности ТКАВ, посредством специфического связывания с белками ТКАВ, а в частности, с белками ТКАВ2, где эта модуляция/опосредование охватывает модуляцию/опосредование механизмов выживания клеток, а в частности, механизмов, ассоциированных с активацией/индуцированием ΝΡ-кВ, в которых прямо или опосредованно участвуют белки ТКАВ, а в частности, белки ТКАВ2. Таким образом, белки ΙΚΕΝ могут рассматриваться как непрямые модуляторы/ медиаторы всех вышеупомянутых белков, и, возможно, ряда других белков, которые участвуют в процессах, направленных на выживание клеток, таких, как активация/индуцирование ΝΡ-кВ, и с которыми связываются ТКАВ2 (или другие белки ТКАВ) или с которыми ТКАВ2 (или другие белки ТКАВ) взаимодействуют прямо или опосредованно. Аналогичным образом, ТКАВ2 участвует в регуляции фактора транскрипции АР1 посредством активации каскада реакций киназы Бит и, таким образом, ΙΚΕΝ может играть определенную роль в пути активации киназы .Тип или в регуляции путей активации других генов, например, реакций киназы р38. Поэтому он может играть важную роль в борьбе против воспалений или других неапоптозных эффектов ΨΝΡ, а также в борьбе против апоптоза клеток.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей белок, способный связываться с ТКАР, выбранной из (a) кДНК-последовательности, обозначенной здесь ΙΚΕΝ и включающей нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 3;

(b) кДНК-последовательности, обозначенной здесь изоформой ΙΚΕΝ-10Β и включающей нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 4;

(c) кДНК-последовательности, обозначенной здесь изоформой-ΙΚΕΝ-Ε и включающей нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 5;

(б) фрагмента последовательности (а)-(с), который кодирует биологически активный белок, способный связываться, по крайней мере, с остатками 225-501 аминокислотной последовательности ТКАЕ2;

(е) ДНК-последовательности, способной гибридизоваться с последовательностью (а)-(б) в умеренно строгих условиях и кодирующей биологически активный белок, способный связываться, по крайней мере, с остатками 225-501 аминркислртной последовательности ТКАЕ2; и (ί) ДНК-последовательности, которая является вырожденней в результате вырожденности генетического кода для ДНК-последовательностей, определенных в (а)-(е), и которая кодирует биологически активный белок, способный связываться, по крайней мере, с остатками 225-501 аминокислотной последовательности ТКАЕ2.

Варианты вышеуказанной ДНК-последовательности настоящего изобретения, кодирующей белок, обозначенный ΙΡΕΝ, включают (ί) ДНК-последовательность, кодирующую белок ΙΡΕΝ, его биологически активные изоформы, фрагменты или аналоги, способные связываться с ТКАЕ2 и способные модулировать активность ΝΡ-кВ, и изоформы ΙΒΕΝ, его фрагменты или аналоги;

(ίί) ДНК-последовательность, описанную выше в (ί), и выбранную из группы, состоящей из

a) ДНК-последовательности, происходящей от кодирующей области нативного белка ΙΡΕΝ;

b) ДНК-последовательностей, способных гибридизоваться с последовательностью (а) в умеренно строгих условиях и кодирующих биологически активный белок ΙΒΕΝ; и

c) ДНК-последовательностей, которые являются вырожденными в результате вырожденности генетического кода последовательностей, определенных в (а) и (Ь), и которые кодируют биологически активный белок ΙΒΕΝ;

(ίίί) ДНК-последовательность, определенную выше в (ί) или (и) и включающую по крайней мере часть последовательности, описанной в фиг. 3 и кодирующей по крайней мере один активный белок ΙΒΕΝ, его изоформу, аналог или фрагмент;

(ίν) ДНК-последовательность, определенную выше в (ίίί) и кодирующую белок ΙΒΕΝ, его изоформу, аналог или фрагмент, имеющие, по крайней мере, часть аминокислотной последовательности, пока

- 6 005775 занной на фиг. 3.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к белкам или полипептидам, кодируемым вышеуказанной ДНК, при условии, что они способны связываться с ТКАЕ2, а предпочтительно по крайней мере с 225-501 остатками аминокислотной последовательности ТКАЕ2, и к изоформам, аналогам, фрагментам и производным указанных белков и полипептидов. Вариантами этих белков/полипептидов настоящего изобретения являются:

(a) белок, являющийся белком, обозначенным ΙΚΕΝ;

(b) его изоформы, фрагменты, аналоги и производные; и (c) белок ΙΚΕΝ, его изоформы, фрагменты, аналоги и производные, имеющие по крайней мере часть аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 6.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему любую из вышеуказанных ДНК-последовательностей настоящего изобретения, способных эспрессироваться в клетках-хозяевах, выбранных из прокариотических и эукариотических клеток, а также из трансформированных прокариотических и эукариотических клеток, содержащих указанный вектор.

Настоящее изобретение также относится к способу получения белка, его изоформы, аналога, фрагмента или производного, кодируемых любой из вышеуказанных ДНК-последовательностей настоящего изобретения, включая культивирование вышеупомянутых трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии указанного белка, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных; осуществление посттрансляционной модификации, если это необходимо, для получения указанного белка, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных; и выделение указанного экспрессированного белка, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителам или их активным фрагментам или производным, специфичным для вышеуказанных ТКАЕ-связывающихся белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных, или специфичным для белка ΙΚΕΝ, его изоформы, аналога, фрагмента или производного, указанных выше.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к следующим способам скрининга:

(ί) к способу скрининга лиганда, способного связываться с белком настоящего изобретения, определенного выще, включая его изоформы, аналоги, фрагменты или производные, включающему контактирование аффинно-хроматографической матрицы, к которой присоединен указанный белок, его изоформа, аналог, фрагмент или производное, с клеточным экстрактом, в результате чего указанный лиганд связывается с указанной матрицей; и элюирование, выделение и анализ указанного лиганда;

(й) к способу скрининга ДНК-последовательности, кодирующей лиганд, способный связываться с белком настоящего изобретения, его изоформой, аналогом, фрагментом или производным, указанными выше, включающему осуществление процедуры с получением дрожжевого двухкомпонентного гибрида, в котором последовательность, кодирующая указанный белок, его изоформу, аналог, производное или фрагмент, содержится в одном гибридном векторе, а последовательности из кДНК- или геномной ДНКбибдиотеки содержатся во втором гибридном векторе; трансформацию дрожжевых клеток-хозяев указанными векторами; выделение положительно трансформированных клеток; и экстракцию указанного второго гибридного вектора с получением последовательности, кодирующей указанный лиганд.

Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к способу выделения и идентификации белков, вышеуказанных изоформ, аналогов и фрагментов настоящего изобретения, способных непосредственно связываться с ТКАЕ2, включающему осуществление процедуры с получением двухкомпонентного дрожжевого гибрида, в котором последовательность, кодирующая указанный ТКАЕ2, содержится в одном гибридном векторе, а последовательности из кДНК- или геномной ДНК-библиотеки содержатся во втором гибридном векторе; последующее использование указанных векторов для трансформации дрожжевых клеток-хозяев; выделение положительно трансформированных клеток; и последующую экстракцию указанного второго гибридного вектора с получением последовательности, кодирующей белок, который связывается с указанным ТКАЕ2.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу модуляции или опосредования в клетках активности ΝΕ-κΒ или любой другой активности внутриклеточной передачи сигнала, модулированной или опосредованной ТКАЕ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок настоящего изобретения, его изоформа, аналог, фрагмент или производное, указанные выше, где указанный способ включает обработку указанных клеток посредством введения в указанные клетки одного или более указанных белков, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, подходящей для их внутриклеточного введения, или введения в указанные клетки ДНК-последовательности, кодирующей указанный один или более белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, где указанный вектор способен вводить указанную последовательность в указанные клетки так, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках.

Вариантами осуществления вышеуказанного способа модуляции/опосредования в клетках активности ΝΕ-кВ или любой другой активности, направленной на передачу внутриклеточного сигнала, модули

- 7 005775 рованную или опосредованную ТКЛР2 или другими молекулами, являются:

(ί) способ, указанный выше, где указанная обработка клеток включает введение в указанные клетки ДНК-последовательности, кодирующей указанный белок ΙΚΕΝ, его изоформу, фрагмент, аналог или производное в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, где указанный вектор способен вводить указанную последовательность в указанные клетки так, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках;

(ίί) способ, описанный выше, где указанная обработка клеток осуществляется путем трансфекции указанных клеток рекомбинантным вирусным вектором животного, включающий стадии:

(a) конструирования рекомбинантного вирусного вектора животного, несущего последовательность, кодирующую поверхностный белок вируса (лиганд), способный связываться со специфическим рецептором клеточной поверхности, присутствующим на поверхности обрабатываемых клеток, и вторую последовательность, кодирующую указанный белок ΙΚΕΝ, его изоформы, аналоги, фрагменты и производные настоящего изобретения, которые при их экспрессии в указанных клетках способны модулировать/опосредовать активность ΝΕ-кВ или любую другую активность, направленную на передачу внутриклеточного сигнала, модулированную или опосредованную ТКЛВ2 или другими указанными молекулами; и (b) инфицирования указанных клеток указанным вектором стадии (а).

Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к способу модуляции ТКАВ2модулированного/опосредованного действия на клетки, включающему обработку указанных клеток антителами или их активными фрагментами или производными настоящего изобретения, как описано выше, где указанную обработку осуществляют путем введения подходящей композиции, содержащей указанные антитела, их активные фрагменты или производные, в указанные клетки, где, в том случае, если белок ΙΚΕΝ или его части находятся на внеклеточной поверхности указанных клеток, то указанную композицию приготавливают для внеклеточного применения, а если указанный белок ΙΚΕΝ является внутриклеточным, то указанную композицию приготавливают для внутриклеточного применения.

Другими способами настоящего изобретения для модуляции ТКАЕ2-модулированного/опосредованного действия на клетки являются:

(ί) способ, включающий обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность, по крайней мере, для части ДНК-последовательности, кодирующей указанный белок ΙΚΕΝ, где эта ДНК-последовательность является любой из вышеупомянутых последовательностей настоящего изобретения и где указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию указанного белка ΙΚΕΝ;

(ίί) способ, описанный выше в (ί) , где указанную олигонуклеотидную последовательность вводят в указанные клетки с помощью вышеописанного рекомбинантного вируса и где указанная вторая последовательность указанного вируса кодирует указанную олигонуклеотидную последовательность;

(ίίί) способ, включающий осуществление процедуры с использованием рибозима, где вектор, кодирующий последовательность рибозима, способную взаимодействовать с клеточной мРНК-последовательностью, кодирующей указанный белок ΙΚΕΝ настоящего изобретения, его изоформу, аналог, фрагмент или производное, указанные выше, вводят в указанные клетки в форме, которая позволяет экспрессировать указанную последовательность рибозима в указанных клетках, и где, в случае, если указанная последовательность рибозима экспрессируется в указанных клетках, то она взаимодействует с указанной клеточной мРНК-последрвательностью и расщепляет указанную мРНК-последовательность, что приводит к ингибированию экспрессии указанного белка ΙΚΕΝ в указанных клетках.

Вышеуказанные способы и варианты настоящего изобретения также включают способ профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индуцированием ΝΕ-кВ или с какойлибо другой активностью, опосредованной ТКАЕ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок, его изоформа, аналог, фрагмент или производное настоящего изобретения, где указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества белка, его изоформы, аналога, фрагмента или производного настоящего изобретения, или молекулы ДНК, кодирующей этот белок, или молекулы, способной препятствовать взаимодействию указанного белка, его изоформы, аналога., фрагмента или производного с ТКАЕ2 или любой другой молекулой, с которой связывается указанный белок, его изоформа, аналог, фрагмент или производное. В этом способе настоящего изобретения указанный белок настоящего изобретения, введенный пациенту, нуждающемуся в этом, может быть, в частности, белком ΙΚΕΝ или ДНК-молекулой, кодирующей данный белок. Очевидно, что белок, обозначенный ΙΚΕΝ, в данном случае, модулирует ΙΚΚ-1- и ΝΙΚ-индукцию ΝΕ-κΒ, В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для модуляции ТΚАΕ2модулированного/опосредованного действия на клетки, включающей, в качестве активного ингредиента ΙΚΕΝ, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или смеси.

В соответствии с настоящим изобретением, другими фармацевтическими композициями или их вариантами являются:

(ί) фармацевтическая композиция для модуляции ТΚАΕ2-модулированного/опосредованного дейст

- 8 005775 вия на клетки, включающая, в качестве активного ингредиента, рекомбинантный вирусный вектор животного, кодирующий белок, способный связываться с рецептором клеточной поверхности и ΙΚΕΝ, его биологически активными изоформами, активными фрагментами или аналогами настоящего изобретения;

(ίί) фармацевтическая композиция для модуляции ТКЛР2-модулированного/опосредованного действия на клетки, включающая, в качестве активного ингредиента, олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность мРНК-последрвательности ΙΚΕΝ настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления изобретения вышеуказанная фармацевтическая композиция представляет собой, в частности, фармацевтическую композицию для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индуцированием ΝΡ-кВ или с какой-либо другой активностью, опосредованной ΤΚΆΕ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок, его аналог, изоформа, фрагмент или производное настоящего изобретения, где указанная композиция включает эффективное количество белка, его аналога, изоформы, фрагмента или производного настоящего изобретения, или молекулы ДНК, кодирующей вышеуказанное, или молекулы, способной препятствовать взаимодействию указанного белка, его аналора, изоформы, фрагмента или производного с ΤΚΑΡ2 или любой другой молекулой, с которой связывается указанный белок, его аналог, изоформа, фрагмент или производное. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная фармацевтическая композиция включает эффективное количество белка, обозначенного ΙΒΕΝ, изоформы, аналога, производного или фрагмента ΙΚΕΝ, или ДНК-молекулы, кодирующей этот белок.

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к фармацевтический композиции для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индукцией ΝΡ-кВ или с какой-либо другой активностью, опосредованной ΤΚΑΡ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок ΙΚΕΝ, где указанная композиция, включает молекулу, способную препятствовать активности ΙΚΕΝ. В этой композиции указанной молекулой, препятствующей активности ΙΚΕΝ, может быть эффективное количество белка ΙΚΕΝ, мутированного в остатках активного центра, где указанный мутированный ΙΚΕΝ служит для блокирования действия нативного ΙΚΕΝ.

Одним из известных состояний, ассоциированных с индукцией ΝΡ-кВ (аномальной), является СПИД, а другими состояниями являются, например, аутоиммунные заболевания, а также опухоли.

Другими аспектами и вариантами осуществления изобретения являются:

(ί) способ идентификации и продуцирования лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулированную/ опосредованную белком, его изоформой, аналогом, фрагментом или производным настоящего изобретения, включающий

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим, по крайней мере, часть последовательности ΙΚΕΝ, показанной на фиг. 6;

b) идентификацию и характеризацию лиганда, не являющегося ΤΚΑΡ2 или частями рецептора семейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΕ, и способного, как было обнаружено в указанной стадии скрининга, к вышеуказанному связыванию; и

c) продуцирование указанного лиганда, по-существу, в выделенной и очищенной форме;

(ίί) способ идентификации и продуцирования лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную ΙΚΕΝ, включающий

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающий, по крайней мере, часть последовательности ΙΚΕΝ, показанной на фиг. 6.

b) идентификацию и характеризацию лиганда, не являющегося ΤΚΑΡ2 или частями рецептора семейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΕ и способного, как было обнаружено в указанной стадии скрининга, к указанному связыванию; и

(ΐϊϊ) способ идентификации и продуцирования лиганда, способного прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную ΙΚΕΝ, включающий

a) скрининг молекулы, способный модулировать активности, модулированные/опосредованные ΙΚΕΝ;

b) идентификацию и характеризацию указанной молекулы; и

c) продуцирование указанной молекулы, по-существу, в выделенной и очищенной форме;

(ίν) способ идентификации и продуцирования молекулы, способной прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную белком, его изоформой, аналогом, фрагментом или производным настоящего изобретения, включающий:

a) скрининг молекулы, способной модулировать активности, модулированные/опосредованные белком ΙΚΕΝ, его изоформой, аналогом, фрагментом или производным настоящего изобретения;

c) продуцирование указанной молекулы, по-существу, в выделенной и очищенной форме.

Другие аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания настоящего изобретения.

- 9 005775

Следует отметить, что используемые в настоящей заявке термины: модуляция/опосредование действия ТКАЕ (или ТКАЕ2) на клетки и любой другой термин модуляция/опосредование, упомянутый в данной заявке, следует рассматривать как термин, охватывающий ίη νίίτο-, и ίη νίνο-обработку, а также охватывающий ингибирование или усиление/увеличение.

Описание графического материала

На фиг. 1 показана диаграмма, иллюстрирующая структуру молекулы ТКАЕ2.

На фиг. 2 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая некоторые из белков, участвующих в активации ΝΕ-κΒ.

На фиг. ЗА показана нуклеотидная последовательность 5'-иТК ΙΚΕΝ (от начала последовательности до АТС с последовательностью Κο/ак). которая является идентичной во всех 3 изоформах сплайсинга ΙΚΕΝ (8ΕΟ ΙΌ N0:3).

На фиг. ЗВ показана нуклеотидная последовательность ΙΚΕΝ (8Ε0 ΙΌ N0:4).

На фиг. 4 показана нуклеотидная последовательность ΙΚΕΝ-10Β (8Ε0 ΙΌ N0:5).

На фиг. 5 показана нуклеотидная последовательность ΙΚΕΝ-Ε (8Ε0 ΙΌ Ν0:6).

На фиг. 6 показана аминокислотная последовательность ΙΚΕΝ (8Ε0 ΙΌ Ν0:7).

На фиг. 7 показана аминокислотная последовательность ΙΚΕΝ-ЮВ (8Ε0 ΙΌ Ν0:8).

На фиг. 8 показана аминокислотная последовательность ΙΚΕΝ-Ε (8Ε0 ΙΌ Ν0:9).

На фиг. 9 показано сравнение последовательности ΙΚΕΝ и его изоформ ΙΚΕΝ-10Β и ΙΚΕΝ-Ε.

На фиг. 10 представлена диаграмма, которая иллюстрирует результаты индуцирования активации ΝΕ-кВ белками ΙΚΚ-1, ΙΚΕΝ дикого типа, ΝΙΚ и ΝΕΜ0 и их мутантами.

На фиг. 11 представлена ауторадиограмма для ЕЬАС-ККЦ С8Т-ШВ и ΝΕΜ0, полученных после трансфекции клеток 293 плазмидой рсЕЬАС СНиК (кодирующей мышиный ΙΚΚ1) и плазмидой рс20.4 (кодирующей белок ΝΕΜ0) вместе с ρ^Ιδ-ΙΚΕΝΔΝ (ρ^Ιδ-ΙΚΕΝ_198-541, левая дорожка), ρ^Ιδ-ΙΚΕΝ (средняя дорожка) или с пустым вектором рсЭНАЗ (правая дорожка) в качестве контроля. Анализ на иммунопреципитацию и киназный анализ осуществляют, как описано в примере 3. Размеры видимых полос соответствуют молекулярным массам, определенным для ΕΈΑ&ΙΚΚ1, СЗТ-ΙκΒ и ΝΕΜ0.

На фиг. 12 показаны ауторадиограмма (слева) и иммунное окрашивание (справа) в ДСН-ПААГанализе на ΙΚΕΝ 10Β и ΙΚΕΝ, которые были подвергнуты иммунопреципитации из трансфецированных клеток, а затем киназному ίη νίΐτο-тесту. На этой фигуре продемонстрировано, что ΙΚΕΝ-10Β ассоциируется в клетках с протеинкиназой, которая может фосфорилировать указанный вариант сплайсинга ΙΚΕΝ.

На фиг. 13 показаны результаты анализов с использованием банка данных генов, которые дают основание предположить, что гены, родственные гену ΙΚΕΝ, присутствуют на нескольких хромосомах человека.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к кДНК-последовательности, обозначаемой здесь ΙΚΕΝ (показанной на фиг. 3), которая кодирует белок, способный связываться с ТЯАЕ2, и к белкам, кодируемым этими ДНК-последовательностями. Настоящее изобретение также относится к кДНК-последовательностям изоформ ΙΚΕΝ-10Β и ΙΚΕΝ-Ε (изображенным на фиг. 4 и 5, соответственно).

Вышеупомянутые ДНК-последовательности и выведенные аминокислотные последовательности отсутствуют в банках данных ’ΌΕΝΒΑΝΚ или ΡΚ0ΊΈΙΝ ΒΑΝΚ ДНК-последовательностей или аминокислотных последовательностей, а поэтому они представляют собой неизвестные до сих пор последовательности.

В объем настоящего изобретения также входят фрагменты вышеупомянутых ДНК-последовательностей и ДНК-последовательностей, способных гибридизоваться с указанными последовательностями или с их частью в условиях умеренной строгости, при условии, что они кодируют биологически активный белок или полипептид, способный связываться, по крайней мере, с аминокислотной последовательностью 225-501 ТРАЕ2.

Настоящее изобретение также относится к ДНК-последовательности, которая является вырожденной в результате вырожденности генетического кода для вышеупомянутых ДНК-последовательностей, и которая кодирует биологически активный белок или полипептид, способный связываться, по крайней мере, с аминокислотной последовательностью 225-501 ΈΚΑΕ2.

Что касается ΕΚΑΕ2, то в этой связи следует отметить, что некоторые члены семейства рецепторов ΨΝΕ/ΝΟΕ активируют фактор транскрипции ΝΕ-кВ путем прямого или опосредованного связывания с ТЕАЕ2, а поэтому он представляет собой адаптерный белок для этих рецепторов и, таким образом, может рассматриваться как модулятор/медиатор индукции активности указанных рецепторов ΨΝΕ/ΝΟΕ, направленной на активацию ΝΕ-кВ (см. схему на фиг. 2). Другой рецептор, рецептор ΙΕ-1, активирует ΝΕ-кВ независимо от ТΚΑΕ2. Аналоги или мутеины ΙΚΕΝ, продуцированные в соответствии с настоящим изобретением (см. примеры) тем или иным способом модулируют активацию ΝΕ-кВ, в случае если эти аналоги/мутеины экспрессируются в клетках.

Таким образом, настоящее изобретение относится к белку ΙΚΕΝ, а также к его биологически активным изоформам, аналогам, фрагментам и производным, и к генам, кодирующим указанный белок, его

- 10 005775 изоформы, аналоги, фрагменты и производные. Получение указанных аналогов, фрагментов и производных стандартными методами (см., например, 8атЬгоок с1 а1., 1989), где в ДНК, кодирующей эти последовательности, один или несколько кодонов могут быть делетированы, добавлены или заменены другими кодонами в целях получения кодируемых аналогов, имеющих, по крайней мере, одну модификацию аминокислотного остатка по сравнению с нативным белком, Подходящими аналогами являются такие аналоги, которые сохраняют, по крайней мере, способность связываться с ТКАТ2 с опосредованием или без опосредования любого другого связывания или ферментативной активности, например, аналоги, которые связываются с ТКАТ2, но не передают сигнал, т.е., не связываются с белком или другим фактором, участвующим в более поздней реакции, или не катализируют сигнал-зависимую реакцию. Таким образом, могут быть продуцированы аналоги, которые обладают так называемым доминантно-негативным действием, а именно, аналог, который является дефектным либо по связыванию с ТКАТ2, либо по последующей передаче сигнала после такого связывания, как показано выше. Такие аналоги могут быть использованы, например, для ингибирования ί.Ό40. ΤΝΤ р55 и ΤΝΤ р75 (эффектов Еак/АРО1 и других родственных рецепторов, а также эффектов, опосредованных различными белками, ассоциированными с рецепторами (адаптерами), указанными выше), посредством конкуренции с природными белками ΙΚΕΝ. Аналогичным образом могут быть продуцированы так называемые доминантно-позитивные аналоги, которые должны служить для усиления ТКАР2-эффекта. Они могут обладать аналогичными или лучшими ТКАР2-связывающими свойствами, чем природные ТКАР2-связывающие белки. Аналогичным образом, биологически активные фрагменты клонов настоящего изобретения могут быть получены, как указано выше для получения аналогов. Подходящими фрагментами ДНК-последовательностей настоящего изобретения являются фрагменты, которые кодируют белок или полипептид, сохраняющий способность связываться с ТКАР2, или которые могут опосредовать любое другое связывание или ферментативную активность, описанные выше. В соответствии с этим могут быть получены фрагменты кодированных белков настоящего изобретения, которые обладают доминатно-негативным или доминантно-позитивным эффектом, описанным выше в отношении указанных аналогов. Аналогичным образом, производные могут быть получены посредством стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков указанных белков, их аналогов или фрагментов, или посредством конъюгирования белков, их аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором, и т.п., хорошо известными специалистам.

Помимо вышеуказанных ДНК-последовательноетей настоящего изобретения, кодирующих ТКАРсвязывающий белок ΙΚΕΝ, его биологически активные изоформы, аналоги, фрагменты или производные, настоящее изобретение, в одном из своих вариантов, также включает ДНК-последовательности, способные гибридизоваться с кДНК-последовательностью, происходящей от кодирующей области нативного ТКАР-свяаывающего белка, где указанную гибридизацию осуществляют в умеренно строгих условиях, и где гибридизируемая ДНК-последовательность кодирует биологически активный ТКАТ-связывающий белок. Поэтому указанные гибридизируемые ДНК-последовательности включают ДНК-последовательности, которые обладают относительно высокой гомологией с нативной кДНК-последовательностью ΙΚΕΝ и представляют собой последовательности, подобные последовательности ТКАТ-связывающего белка, которые могут быть, например, природными последовательностями, кодирующими различные изоформы ΙΚΕΝ, или природными последовательностями, кодирующими белки, принадлежащие к группе последовательностей, подобных последовательностям ТКАТ-связывающего белка, и кодирующие ΙΚΕΝ. Кроме того, этими последовательностями могут быть также, например, неприродные синтезированные последовательности, которые являются аналогичными кДНК-последовательности нативного ΙΚΕΝ, но которые включают ряд нужных модификаций. Следовательно, такими синтетическими последовательностями являются все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные ΙΚΕΝ, каждый из которых обладает активностью ТКАР-связывающих белков.

Используемые здесь строгие условия зависят от температуры, используемой в эксперименте с гибридизацией, от молярности одновалентных катионов и от процентного содержания формамида в растворе для гибридизации. Для определения степени строгости условий, включенных в данную серию условий, сначала, по уравнению Мешко1й с1 а1., (1984), определяют стабильность гибридов со 100%-ной идентичностью, выражаемую как температура плавления Тт гибрида ДНК-ДНК:

Тт = 81,5°С + 16,6 (ЬодМ) + 0,41 (%СС) - 0,61 (% форм,) = 500/Ь, где М означает молярность одновалентных катионов, % ОС означает процент нуклеотидов С и С в ДНК, % форма означает процент формамида в растворе для гибридизации, а Ь означает длину гибрида в парах нуклеотидов. Для каждого 1°С, на который снижается Тт, исходя из вычисленной Тт для 100% идентичного гибрида, количество допустимых несоответствий может быть увеличено примерно на 1%. Таким образом, если Тт, используемая для любого данного эксперимента по гибридизации при конкретных концентрациях соли и формамида, на 10°С ниже Тт, вычисленной для 100% гибрида по уравнению Ме1пко1й, то гибридизация будет происходить даже в том случае, когда несоответствия будут составлять вплоть до около 10%.

Таким образом, условия высокой строгости являются такими условиями, при которых Тт не более, чем на 10°С ниже Тт, которая должна быть использована для образования полного дуплекса с по

- 11 005775 следовательностью-мишенью, и которую определяют путем вычисления по вышеуказанной формуле, либо путем непосредственных измерений. Условия умеренной строгости являются такими условиями, при которых Тт не более чем на 20°С ниже Тт, которая должна быть использована для образования полного дуплекса с последовательностью-мишенью, и которую определяют либо путем вычисления по вышеуказанной формуле, либо путем непосредственных измерений. Неограничивающими примерами условий высокой строгости (температура на 5-10°С ниже вычисленной или измеренной Тт гибрида) и умеренной строгости (температура на 15-20°С ниже вычисленной или измеренной Тт гибрида) являются использование промывочного раствора 2 х 88С (стандартного забуференного цитратом физиологического раствора) и 0,5% ДСН (додецилсульфат натрия) при соответствующей температуре, которая является ниже вычисленной Тт гибрида. Условия крайней строгости, главным образом, определяются условиями промывки, а в частности, если используемыми условиями гибридизации являются такие условия, которые, наряду со стабильными гибридами, допускают образование менее стабильных гибридов. Условия промывки при более высокой строгости позволяют затем удалить менее стабильные гибриды.

Обычным условием гибридизации, которое может быть использовано с условиями промывки от высокой до умеренной строгости, описанными выше, является гибридизация в растворе 6 х 88С (или 6 х 88РЕ (стандартный физиологический раствор-фосфат-ЕОТА)), 5 х реагента Денхардта, 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре, которая примерно на 20-25°С ниже Тт. При применении смешанных зондов предпочтительно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С (АикиЬе1 1987, 1999).

Для получения различных вышеуказанных природных ΙΚΕΝ-подобных последовательностей стандартные процедуры скрининга и выделения природных ДНК- или РНК-образцов от различных тканей могут быть осуществлены с использованием природной ΙΡΕΝ-кДНК или ее части в качестве зонда (см, например, стандартные процедуры, описанные 8атЬгоок и др., 1989).

Аналогичным образом, для получения вышеуказанных различных синтетических последовательностей, подобных последовательности ТКАЕ-связывающего белка и кодирующих аналоги, фрагменты и производные ΙΚΕΝ, может быть использован ряд стандартных процедур, которые подробно описаны ниже для получения указанных аналогов, фрагментов и производных.

Полипептид или белок по-существу, соответствующий ΙΚΕΝ, включает не только сам ΙΚΕΝ, но также полипептиды или белки, которые являются аналогами ΙΚΕΝ.

Аналоги, которые, по-существу, соответствуют ΙΚΕΝ, представляют собой полипептиды, в которых одна или более аминокислот аминокислотной последовательности ΙΚΕΝ заменены другой аминокислотой, делетированы и/или инсертированы, при условии, что полученный белок обладает, в основном, такой же или более высокой биологической активностью, как и ΙΚΕΝ.

Для того, чтобы белок, в основном, соответствовал ΙΚΕΝ, эти изменения в последовательности белков, таких, как изоформы, должны быть, в основном, относительно небольшими. Хотя число модификаций может быть больше десяти, однако предпочтительно, чтобы оно было не более десяти, а более предпочтительно - не более пяти, а наиболее предпочтительно - не более трех. Хотя для поиска потенциальных биологически активных белков, которые, в основном, соответствуют ΙΚΕΝ, могут быть использованы любые методы, однако одним из таких методов является использование стандартной техники мутагенеза ДНК, кодирующей указанный белок, приводящего к нескольким модификациям. Затем белки, экспрессируемые такими клонами, могут быть скринированы на их способность связываться с белками ТРАЕ (например, ТРАЕ2) и модулировать активность белка ТРАТ (например, ТРАЕ2), направленную на модулирование/опосредование внутриклеточных путей, описанных выше.

Консервативными заменами являются замены, которые, как предполагается, не должны влиять на активность белка, и обычно их сначала скринируют как замены, которые, как предполагается, не должны приводить к значительному изменению размера, заряда или конфигурации белка, а следовательно, как предполагается, они не должны приводить к изменению их биологических свойств.

ΙΚΕΝ с консервативными заменами представляет собой аналог, в котором, по крайней мере, один аминокислотный остаток в данном полипептиде консервативно заменен другой аминокислотой. Указанные замены предпочтительно осуществляют в соответствии с нижеприведенным списком, представленным в табл. 1А, где указанные замены могут быть определены рутинным экспериментированием с получением модифицированных структурных или функциональных свойств синтезированной полипептидной молекулой при сохранении биологической активности, характерной для ΙΚΕΝ.

- 12 005775

Таблица ΙΑ

Исходный остаток	Примеры замен
А1а	С1у; Зег
Агд	Ьуз
Азп	С1п; Ηίε
Азр	С1и
Суз	Зег
С1п	Азп
С1и	Азр
С1у	А1а; Рго
Ηί3	Азп; С1п
Не	Ьеи; Уа1
Ьеи	Не; Уа1
Ьу®	Агд; С1п; С1и
Μθΐ.	Ьеи; Туг; 11е
РЬе	МеГ; Ьеи; Туг
Зег	ТЬг
ТЬг	Зег
Тгр	Туг
Туд	Тгр; РЬе
Уз4	11е; Ьеи

Альтернативно, другой группой замен в ΙΒΕΝ являются группы, в которых по крайней мере один аминокислотный остаток данного полипептида был удален, а на его место был введен другой остаток в соответствии с нижеследующей табл. 1В. Типы замен, которые могут быть сделаны в данном полипептиде, могут быть осуществлены, исходя из анализа частоты аминокислотных замен между гомологичными белками других видов, которые, например, показаны в таблице 1-2 в работе 8с1тк с1 а1., С.Е., Ρπηοίр1ек οί Ρτοΐείη 81гис1иге 8ргшдег-Уег1ад, Νε\ν Уогк, ΝΥ, 1798 и на фиг. 3-9 в работе СгадЫои Т.Е., Рпйешк: 81гис1иге апб Мо1еси1аг РгорегЬек, XV. Н. Ргеешап & Со. 8ап Егапс18со, СА 1983. Исходя из указанного анализа, альтернативные консервативные замены определены в этих работах как замены в пределах одной из нижеследующих пяти групп:

Таблица 1В

1. Небольшие алифатические неполярные или слегка полярные остатки: А1а, 8ег, ТЬг (Рго, С1у).

2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Акр, Аки, С1и, С1и.

3. Полярные положительно заряженные остатки: Ηίκ, Агд, Ьук.

4. Крупные алифатические неполярные остатки: Ме1, Ьеи, 11е, Уа1 (Сук) и

5. Крупные ароматические остатки: РЬе, Туг, Тгр.

Три аминокислотных остатка, показанные выше в скобках, играют особую роль в архитектуре белка. С1у представляет собой остаток, лишь один не имеющий боковой цепи, и, таким образом, придающий этой цели гибкость. Однако это способствует стимуляции образования вторичных структур, а не осспирали. Рго, вследствие его необычной геометрической структуры, жестко ограничивает данную цепь и обычно стимулирует образование структур, подобных β-складке, однако Сук в некоторых случаях может обладать способностью участвовать в образовании дисульфидной связи, что является важным фактором при укладке белка. Следует отметить, что в работе 8сЬу1г и др., см. выше, вышеуказанные группы 1 и 2 должны быть объединены. Следует также отметить, что Туг, вследствие его потенциальной способности связываться с водородом, обладает значительным сходством с 8ег, Т1п и т.п.

Консервативные аминокислотные замены настоящего изобретения, например, представленные выше, известны специалистам и, как предполагается, должны сохранять биологические и структурные свойства полипептида после проведения аминокислотных замен. Большинство делеций и замен настоящего изобретения представляют собой делеции и замены, которые не приводят к радикальным изменениям свойств данных молекул белка или полипептида. Свойства определяют не включающим способом для определения изменений вторичной структуры, например, α-спирали или β-складки, а также изменений биологической активности, например, связывания с белками ТКАЕ и/или опосредования влияния белков ТКАЕ на гибель клетки.

Примерами продуцирования аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения аналогов ΙΚΕΝ для их использования в настоящем изобретении, являются любые известные методы, описанные, например, в патенте США КЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Магк с1 а1.; 5116943, Κοίΐικ с1 а1., 4965195, Машей с1 а1., 4879111, Скоид с1 а1., и 5017691, Бее с1 а1.; и методы получе

-13 005775 ния белков с заменой лизином, описанные в патенте США № 4904584 (8йате е! а1.).

Помимо обсуждаемых выше консервативных замен, которые не должны значительно изменять активность ΙΚΕΝ, в объем настоящего изобретения входят либо консервативные, либо менее консервативные замены и более случайные замены, которые приводят к повышению биологической активности указанных аналогов ΙΚΕΝ.

При точном подтверждении эффекта замены или делеций специалисту очевидно, что этот эффект замены(замен), делеции(делеций) и т.п., может быть оценен путем проведения рутинных анализов на связывание и гибель клеток. Скрининг с использованием такого стандартного теста может быть проведен без излишнего экспериментирования.

На генном уровне указанные аналоги обычно получают посредством сайт-направленного мутагенеза нуклеотидов в указанной ДНК, кодирующей ΙΚΕΝ, с продуцированием ДНК, кодирующей данный аналог, и последующего синтеза этой ДНК и экспрессии указанного полипептида в рекомбинантной клеточной культуре. Указанные аналоги обычно обладают той же самой или повышенной качественной биологической активностью, что и природный белок, см. Аи8иЬе1 е! а1., Сиггеи! Рго!осоЕ ίη Мо1еси1аг Βίо1оду, Сгеепе РиЬйсайопк апб \УПеу ЩегАепсе, №\ν Уогк, Ν.Υ., 1987-1995; 8атЬгоок е! а1.,(1989), Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б Зрппд НаГЬог, ΝΥ, 1989.

Получение мутеина ΙΚΕΝ в соответствии с настоящим изобретением или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же самый полипептид, но отличающейся от природной последовательности модификациями, обусловленными известной вырожденностью генетического кода, может быть достигнуто посредством сайт-специфического мутагенеза ДНК, кодирующей ранее полученный аналог или природный вариант ΙΚΕΝ. Сайт-специфический мутагенез позволяет продуцировать аналоги с использованием специфических олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих ДНКпоследовательность с нужной мутацией, а также достаточное число смежных нуклеотидов, в целях получения праймерной последовательности достаточного размера и достаточной вариабельности с образованием стабильного дуплекса на обеих сторонах делеционного участка стыка. Обычно предпочтительным является праймер длиной приблизительно 20-25 нуклеотидов, причем на каждой стороне данной последовательности, 5-10 комплементирующих нуклеотидов являются модифицированными. В основном, метод сайт-специфического мутагенеза хорошо известен специалистам и описан в публикациях, таких как Айе1тап е! а1., ΌΝΑ 2:183 (1983), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Следует отметить, что в методе сайт-специфического мутагенеза обычно используют фаговый вектор, который присутствует как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме.

Типичными векторами, используемыми в сайт-направленном мутагенезе, являются векторы, такие, как фаг М13, описанный, например, в работе МеАпд е! а1., Пигб С1е\'е1апб Зутройшп оп Масгото1еси1е8 апб РесотЫпап! ΌΝΑ, Εб^ιо^ Α. ^а1!оп, В1^1ег, ЛтЦегбат (1981), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Эти фаги являются коммерчески доступными и их использование, в основном, хорошо известно каждому специалисту. Альтернативно, плазмидные векторы, содержащие одноцепочечный фаговый сайт инициации репликации (Уепа е! а1. Ме111. Εηζуто1. 153:3, 1987), могут быть использованы для получения одноцепочечной ДНК.

В соответствии с настоящим изобретением, в основном, сайт-направленный мутагенез осуществляют сначала путем получения одноцепочечного вектора, последовательность которого включает ДНКпоследовательность, кодирующую соответствующий полипептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий нужную мутированную последовательность, получают методом автоматизированного синтеза ДНК/олигонуклеотида. Затем этот праймер отжигают с одноцепочечным вектором, содержащим последовательность белка, и обрабатывают ДНК-полимеризующими ферментами, такими, как фрагмент Кленова, полимераза Ι Б.со11, для завершения синтеза цепи, несущей нужную мутацию. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь имеют нужную мутацию. Затем указанный гетеродуплексный вектор используют для трансформации соответствующих клеток, таких как клетки 1М101 Б.сой, и отбирают клоны, которые включают рекомбинантные векторы, несущие нужную реаранжировку мутированной последовательности.

После отбора такого клона мутированная последовательность ΙΚΕΝ может быть удалена и встроена в соответствующий вектор, обычно в вектор переноса или зкспрессирующий вектор такого типа, который может быть использован для трансфекции соответствующего хозяина.

В соответствии с этим, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие белок ΙΚΕΝ, могут быть также детектированы, получены и/или модифицированы ш νιΙΐΌ, ш δίΐη и/или ш νί\Ό с использованием известных методов амплификации ДНК или РНК, таких как ПЦР и химический олигонуклеотидный синтез. ПЦР позволяет амплифицировать (увеличить число) конкретных ДНК-последовательностей путем проведения повторных ДНК-полимеразных реакций. Эта реакция может быть использована вместо клонирования; причем все эти способы требуют знания последовательности нуклеиновой кислоты. Для осуществления ПЦР конструируют праймеры, которые являются комплементарными нужной последовательности. Затем указанные праймеры генерируют с помощью автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку праймеры могут быть сконструированы для гибридизации с любой частью гена, то могут быть созданы такие условия, при которых несоответствия в спаривании комплементарных оснований могут быть до

- 14 005775 пустимыми. Амплификация этих несоответствующих областей может приводить к синтезу мутагенизированного продукта, который приводит к генерированию пептида с новыми свойствами (т.е., сайтнаправленный мутагенез). См., также, например, Аи8иЬе1, см, выше, гл, 16, кроме того, благодаря синтезу путем спаривания комплементарных ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы в ПЦР, РНК может быть использована в качестве исходного материала для синтеза внеклеточного домена пролактинового рецептора без клонирования.

Кроме того, ПЦР-праймеры могут быть сконструированы для включения новых рестрикционных сайтов или других признаков, таких, как кодоны терминации на концах амплифицируемого генного сегмента. Это введение рестрикционных сайтов у 5'- и 3'-концов амплифицированной генной последовательности позволяет осуществлять обычное конструирование генных сегментов, кодирующих белок ΙΚΕΝ или его фрагмент, для лигирования других последовательностей и/или сайтов клонирования в векторы.

ПЦР и другие методы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны специалистам и могут быть использованы без излишнего экспериментирования в соответствии с настоящим изобретением, исходя из сведений и указаний, представленных в его описании. Известными методами амплификации ДНК или РНК являются, но не ограничиваются ими, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и аналогичные способы амплификации (см., например, патенты США № 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 Ми1Ш е! а1; 4795699 и 4921794 ТаЬог е! а1.; 5142033 Ιηηίκ; 5122464 \\'Шоп е! а1.,; 5091310 Ιηηίκ; 5066584 Су11еп81еи е! а1.; 4889818 Сейа^ е! а1., 4994370 ЗПгег е! а1,; 4766067 Βί5\ν;·ΐ5; 4656134 Кшдо1б; и Ιηηίδ е! а1., еШ. РСК Рго!осок: А Сшбе !о Ме!йоб ηηά Аррйсаиощ) и РНК-опосредованная амплификация, которая предусматривает использование антисмысловой РНК для последовательности-мишени в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238 Ма1ек е! а1., тооговый знак ΝΑ8ΒΑ); и иммуно-ПЦР, которая предусматривает комбинированное использование амплификации ДНК и мечение антителом (Ки/юка е! а1., Заенсе 260:487 (1993); Зано е! а1., Заенсе 258:120 (1992); Зано е! а1., Вю1ес11шс.|ие5 9:1378 (1991)), при этом полное содержание патентов и работ во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Аналогичным образом, биологически активные фрагменты ΙΚΕΝ или его изоформы могут быть получены, как описано выше для аналогов ТКАЕ-связывающихся белков. Подходящими фрагментами ТКАР-связывающихся белков являются фрагменты, которые сохраняют способность белка связываться с ТКАЕ, и которые могут опосредовать биологическую активность белков ТКАР или других белков, ассоциированных с белками ТКАР либо прямо, либо опосредованно. В соответствии с этим, могут быть получены фрагменты ΙΡΕΝ, которые обладают доминантно-негативным или доминантно-позитивным действием, как указано выше для аналогов. Следует отметить, что эти фрагменты представляют собой особый класс аналогов настоящего изобретения, а именно, они представляют собой определенные части ΙΡΕΝ, происходящие от полной последовательности ΙΡΕΝ или от его изоформ, причем каждая такая часть или фрагмент обладают любой из вышеуказанных нужных активностей. Таким фрагментом может быть, например, пептид.

Аналогично, производные могут быть получены посредством стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков ΙΡΕΝ, его аналогов или фрагментов, или посредством конъюгирования данного ΙΡΕΝ, его аналогов или фрагментов, с другой молекулой, например, с антителом, ферментом, рецептором, и т.п., способом, хорошо известным специалистам. В соответствии с этим используемый здесь термин производные охватывает производные, которые могут быть получены из функциональных групп, которые присутствуют в качестве боковых цепей на остатках Ν- или Сконцевых групп, методами, известными специалистам, и указанные производные входят в объем настоящего изобретения. Производные могут иметь химические группы, такие, как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция имеет ту же или белее, высокую биологическую активность, чем белки ΙΒΕΝ.

Так, например, производными могут быть алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные посредством реакции аммиака с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные или свободные аминогруппы указанных аминокислотных остатков, образованных ацильными частями (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами) или О-ацильные производные свободной гидроксильной группы (например, группы серильных или треонильных остатков), образованные ацильными частями.

Термин производные означает только те производные, которые не содержат замен одной аминокислоты на другую аминокислоту, входящую в число двадцати обычно встречающихся в природе аминокислот.

Белок ΙΗΕΝ представляет собой белок или полипептид, т.е., последовательность аминокислотных остатков. В понятие такого полипептида входит также полипептид, состоящий из более крупной последовательности, которая включает полную последовательность белка ΙΡΕΝ, в соответствии с приведенными здесь определениями, при условии, что указанные добавления не влияют на основные и новые свойства белка настоящего изобретения, т.е., биологическая активность ΙΗΕΝ либо сохраняется, либо повышается, либо эти добавления могут быть отщеплены с образованием белка или полипептида, обла

- 15 005775 дающего указанной биологической активностью ΙΚΕΝ. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят гибридные белки ΙΚΕΝ с другими аминокислотами или пептидами.

Как было упомянуто выше, следует отметить, что вышеуказанный ΙΚΕΝ, его изоформы, фрагменты, производные, мутеины и т.п. настоящего изобретения представляют собой любые белки, которые могут связываться с любым внутриклеточным белком ТКАЕ и/или могут опосредовать/модулировать активность любого из этих белков. В частности, примерами таких белков являются белки, которые могут модулировать или опосредовать ТКАЕ2-ассоциированную активность передачи внутриклеточного сигнала, как было упомянуто выше, а особенно, это относится к участию ТКАЕ2 в модуляции активности ΝΕ-кВ, в частности, после взаимодействия между ТКАЕ2 и различными членами семейства рецепторов ΎΝΕ/ΝΟΕ и/или ассоциированных с ними адаптерных белков, как подробно описано выше и ниже. Очевидно, что ΙΚΕΝ настоящего изобретения и различные его изоформы, аналоги, фрагменты и т.п. (см. примеры) в высокой степени специфично связываются с ТКАЕ2 и обладают действием, направленным на модуляцию активности ΝΡ-кВ, при этом указанная активность модулируется доминантно-негативными аналогами/мутеинами ΙΚΕΝ.

Все вышеупомянутые модификации входят в объем настоящего изобретения, при условии, что они сохраняют способность кодируемых белков или полипептидов, или их аналогов и производных двязыватьдя, по крайней мере, с аминокислотной последовательностью 225-501 ТКАЕ2.

Все белки и полипептиды настоящего изобретения благодаря своей способности связываться с ТКАЕ2, рассматриваются как медиаторы или модуляторы передачи сигнала ТКАЕ2. Указанные молекулы настоящего изобретения, сами по себе, играют определенную роль, например, в процессе передачи сигнала, в котором связывание лиганда ТКАЕ2 с ΟΌ30, ΟΌ40, рецептором лимфотоксина-бета (ЬТ-β), рецепторами Т№ р55 и р75, а также с другими рецепторами и адапторными белками, указанными выше, приводит к активации фактора транскрипции ΝΕ-кВ. В этом отношении особый интерес представляет белок ΙΚΕΝ настоящего изобретения и его изоформы.

Новые клоны, белки, их аналоги, фрагменты и производные могут иметь ряд полезных применений, например:

(ί) они могут быть использованы для модуляции активности ΝΡ-кВ, функции ТКАЕ2 и рецепторов, с которыми они связываются, в тех случаях, когда модуляция этих функций является желательной, например, для использования в противоопухолевой терапии или для иммуностимуляции, где ТКАЕ2индуцированные эффекты являются желательными. В этом случае белки настоящего изобретения, их аналоги, фрагменты или производные, которые модулируют эффекты ТКАЕ2 или рецепторов, могут быть введены в клетки стандартными методами, известными рег 8е. Так, например, поскольку белки, кодируемые ДНК-клонами настоящего изобретения, являются внутриклеточными и они должны быть введены только в те клетки, в которых желательны эффекты ТКАЕ2, то необходимо разработать систему для специфического введения белков в эти клетки. Одним из способов получения такой системы является создание рекомбинантного вируса животного, например, происходящего от вируса коровьей оспы, в ДНК которого могут быть введены два следующих гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с белками клеточной поверхности, специфически экспрессируемыми этими клетками, например, такими, как белок до 120 вируса, вызывающего СПИД, (ВИЧ), который специфически связывается с некоторыми клетками (СЭ4-лимфоцитами и родственными клетками лейкоза) или любой другой лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими рецептор, связывающийся с ТКАЕ2, так, чтобы указанный рекомбинантный вирусный вектор был способен связываться с указанными клетками; и ген, кодирующий белки настоящего изобретения. Таким образом, экспрессия связывающихся с клеточной поверхностью белков на поверхности этого вируса будет способствовать направленной доставке этого вируса в опухолевую клетку или в другую рецептор-несущую клетку, после чего указанные кодирующие белки последовательности будут встроены в эти клетки с помощью этого вируса, а после экспрессии в данных клетках они будут способствовать усилению действия рецептора или ТКАЕ2, что приводит к нужному иммуностимулирующему эффекту в этих клетках. Конструирование указанного рекомбинантного вируса животного осуществляют стандартными методами (см., например, ЗатЬгоок е1 а1., 1989). Другим возможным способом является введение последовательностей кодируемых белков в форме олигонуклеотидов, которые могут абсорбироваться клетками и экспрессироватьря в них.

(ίί) Они могут быть использованы для модуляции активности ΝΡ-кВ, функции ТКАЕ2 и рецепторов, с которыми они связываются, например, в случаях повреждения ткани при СПИД'е, септическом шоке или в реакции трансплантат против хозяина'', где необходимо блокировать индуцированную внутриклеточную передачу сигнала. В этом случае можно, например, стандартными методами вводить в клетки олигонуклеотиды, имеющие антисмысловые кодирующие последовательности для белков настоящего изобретения, которые должны эффективно блокировать трансляцию мРНК, кодирующих белки, и тем самым блокировать их экспрессию и приводить к ингибированию нежелательного эффекта. Альтернативно, могут быть использованы другие олигонуклеотиды; олигонуклеотиды, которые сохраняют свою способность связываться с ТКАЕ2, что препятствует связыванию других молекул с этим белком, и в то же самое время не приводит к какой-либо активации или модуляции этой молекулы. При на

- 16 005775 личии этих свойств указанные молекулы могут нарушать взаимодействие ТКАЕ2 с его природным лигандом и действовать, тем самым, как ингибиторы, способные отменять действия, опосредованные ТКАЕ2, такие как, например, активация ΝΡ-κΒ. Такие олигонуклеотиды могут быть введены в клетки с использованием вышеуказанного подхода с использованием рекомбинатного вируса, где второй последовательностью, присутствующей в этом вирусе, является олигонуклеотидная последовательность.

Другим возможным подходом является использование антител, специфичных для белков настоящего изобретения в целях ингибирования их активности, направленной на передачу внутриклеточного сигнала.

Еще одним способом ингибирования нежелательного эффекта является недавно разработанный рибозимный метод. Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК, которые специфически расщепляют РНК. Рибозимы могут быть сконструированы для расщепления любых выбранных РНКмишеней, например, мРНК, кодирующих белки настоящего изобретения. Такие рибозимы должны иметь последовательность, специфичную для мРНК данных белков, и должны обладать способностью взаимодействовать с ними (комплементарное связывание) с последующим расщеплением мРНК, что приводит к снижению (или полному прекращению) экспрессии этих белков, причем пониженный уровень экспрессии зависит от уровня экспрессии рибозима в указанной клетке-мишени. Для введения рибозимов в любые нужные клетки (например, клетки, несущие белки ΙΡΕΝ) может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмида, вирусные (ретровирусные) векторы животных, которые обычно используются для этой цели (см. также выше (ί), где данный вирус в качестве второй последовательности имеет кДНК, кодирующую выбранную рибозимную последовательность), (Обзор методов и т.п., относящихся к рибозимам см. Сйеп е1 а1., 1992; Ζΐιηο & Р1ск, 1993).

(ίίί) Они могут быть использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков, которые обладают способностью связываться с ними, например, других белков, участвующих в процессах внутриклеточной передачи сигнала на более поздней стадии, чем ТКАЕ2. Так, например, ДНКпоследовательности, кодирующие белки настоящего изобретения, могут быть использованы в дрожжевой двухкомпонентной гибридной системе, в которой указанные кодированные белки могут быть использованы в качестве приманки для выделения., клонирования и идентификации других последовательностей из кДНК или геномных ДНК-библиотек (добычи), кодирующих белки, которые могут связываться с клонированными белками. Аналогичным образом может быть также определено, могут ли белки настоящего изобретения связываться с другими клеточными белками, например, другими рецепторами суперсемейств ΈΝΡ/ΝΟΡ.

(ίν) Кодируемые белки, их аналоги, фрагменты или производные могут быть также использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е. белков, связывающихся с ТКАЕ2 или с функционально связанными белками и участвующих в процессе внутриклеточной передачи сигнала. В этой заявке может быть использована вышеуказанная дрожжевая двухкомпонентная гибридная система, либо может быть использована недавно разработанная система, в которой применяется Саузерн-гибридизация в нестрогих условиях с последующим ПЦР-клонированием (А11к§ е1 а1., 1989).

(ν) В другом методе использования кодируемых белков настоящего изобретения, их изоформы, аналоги, фрагменты или производные предназначены для использования в методах аффинной хроматографии в целях выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они способны связываться, например, белков, родственных ТКАЕ2 или других белков или факторов, участвующих в процессе внутриклеточной передачи сигнала. В этой заявке белок, его изоформы, аналоги, фрагменты или производные настоящего изобретения могут быть отдельно присоединены к матрицам для аффинной хроматографии, а затем подвергнуты контакту с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые, как предполагается, участвуют в процессе внутриклеточной передачи сигнала. После проведения аффинной хроматографии другие белки или факторы, которые связываются с указанными белками, их аналогами, фрагментами или производными настоящего изобретения, могут быть проэлюированы, выделены и охарактеризованы.

(νί) Как описано выше, белки, их аналоги, фрагменты или производные настоящего изобретения могут быть также использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для продуцирования специфичных к ним антител. Эти антитела могут быть также использованы для очистки белка настоящего изобретения либо из клеточных экстрактов, либо из трансформированных клеточных линий, продуцирующих такие экстракты, а также их аналогов или фрагментов. Кроме того, эти антитела могут быть использованы в диагностических целях для идентификации расстройств, ассоциированных с аномальным функционированием системы рецепторов, в которой они функционируют, например, клеточных эффектов, индуцированных избыточной активностью или недостаточной активностью ТКАЕ2. Таким образом, указанные расстройства должны быть ассоциированы с многофункциональной системой внутриклеточной передачи сигнала, в которой участвуют белки настоящего изобретения, при этом указанные антитела должны служить важным диагностическим средством. Термин антитело означает поликлональные антитела, моноклональные антитела (тАЬ), химерные антитела, антиидиотипические (анти-И) антитела против антител, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, такие как,

- 17 005775 например, РаЬ и Р(аЬ')₂-фрагменты, в которых отсутствует Рс-фрагмент интактного антитела, и которые способны связаться с антигеном, (νίί) Антитела, включая фрагменты антител настоящего изобретения, могут быть использованы для количественной или качественной детекции клонов настоящего изобретения в образце или для детекции присутствия клеток, экспрессирующих клоны настоящего изобретения. Это может быть осуществленно иммунофлуоресцентными методами с использованием флуоресцентно меченного антитела в сочетании с методами световой микроскопии, проточной цитометрии или флуорометрической детекции.

Антитела (или их фрагменты) настоящего изобретения могут быть использованы для гистологии в иммунофлуоресцентной или в иммуноэлектронной микроскопии, для ίη 8Йи-детекции клонов настоящего изобретения. Ιη кйи-детекция может быть проведена путем взятия гистологического образца у пациента и получения меченного антитела настоящего изобретения для указанного образца. Антитело (или его фрагмент), предпочтительно, получают путем введения меченного антитела (или его фрагмента) в биологический образец или путем его нанесения на этот образец. С использованием указанной процедуры можно определить не только присутствие данных клонов, но также и их распределение по оцениваемой ткани. В соответствии с настоящим изобретением, для каждого специалиста очевидно, что для достижения указанной ίη кйи-детекции, в любых гистологических методах широкого ряда (таких, как методы окрашивания) могут быть внесены модификации.

Такие анализы на присутствие клонов настоящего изобретения обычно включают инкубирование биологического образца, такого как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в тканевой культуре в присутствии меченного антитела, способного идентифицировать кодируемые белки, и детекцию данного антитела любыми методами, хорошо известными специалистам.

(νίίί) Кодируемые белки настоящего изобретения, благодаря их способности связываться с другими внутриклеточными белками, могут быть использованы как непрямые модуляторы ряда других белков, причем другие внутриклеточные белки, в свою очередь, непосредственно связываются с другими внутриклеточными белками или внутриклеточным доменом трансмембранного белка.

Для модуляции указанных других внутриклеточных белков или внутриклеточных доменов трансмембранных белков белки настоящего изобретения могут быть введены в клетки различными путями, упомянутыми выше в (ίί).

Следует также отметить, что выделение, идентификация и характеризация белков настоящего изобретения может быть осуществлена любыми хорошо известными стандартными процедурами скрининга. Так, например, одним из этих методов скрининга является метод с использованием двойного дрожжевого гибрида, который был применен для идентификации белков настоящего изобретения. Для выделения, идентификации и характеризации белков настоящего изобретения или для выделения, идентификации и характеризации дополнительных белков, факторов, рецепторов и т.п., которые способны связываться с белками настоящего изобретения, могут быть использованы другие аналогичные процедуры, такие как аффинная хроматография, методы ДНК-гибридизации и т. п., хорошо известные специалистам.

Кроме того, белки, которые, как было обнаружено, связываются с белками настоящего изобретения, сами по себе могут быть использованы в способе, аналогичном способу, в котором белки настоящего изобретения были использованы, как это описано выше и ниже, для выделения, идентификации и характеризации других белков, факторов и т.п., которые способны связываться с белками, связывающихся с белками настоящего изобретения, и которые могут представлять собой факторы, участвующие в дальнейшем процессе ассоциированной передачи сигнала, или которые могут обладать их активностями в передаче сигнала, и, следовательно, должны представлять собой белки, участвующие в определенном процессе передачи сигнала.

ДНК-последовательности и кодируемые белки настоящего изобретения могут быть продуцированы любым стандартным методом рекомбинантных ДНК (см., например, 8ашЬгоок с1 а1., 1989), в котором подходящие эукариотические или прокариотические клетки-хозяева трансформируют соответствующими эукариотическими или прокариотическими векторами, содержащими последовательности, кодирующие указанные белки. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к указанным экспрессирующим векторам и трансформированным хозяевам для продуцирования белков настоящего изобретения. Как было упомянуто выше, указанными белками также являются их биологически активные аналоги, фрагменты и производные, а поэтому векторами, кодирующими эти белки, также являются векторы, кодирующие аналоги и фрагменты этих белков, а трансформированными хозяевами являются хозяева, продуцирующие указанные аналоги и фрагменты. Производными этих белков являются производные, продуцированные посредством стандартной модификации белков или их аналогов или фрагментов, продуцированных трансформированными хозяевами.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям для модуляции эффектов, опосредованных ΤΚΑΤ2. Фармацевтические композиции включают в качестве активного ингредиента любой один или более из следующих компонентов: (ί) одну или более ДНК-последовательностей настоящего изобретения или их частей, субклонированных в соответствующий экспрессирующий вектор; (ίί) белок настоящего изобретения, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их

- 18 005775 смесь; (ίίί) рекомбинантный вирусный вектор животного, кодирующий белок настоящего изобретения, его биологически активные фрагменты, аналоги или производные.

Фармацевтические композиции используются для лечения заболевания в количествах, эффективных для данного пациента и определяемых врачом в зависимости от массы тела и других факторов.

Как указывалось выше, одним из конкретных вариантов ТКАР-связывающих белков настоящего изобретения является ТКАР2-связывающий белок 1КЕИ. Исходя из обнаружения, в соответствии с настоящим изобретением, того факта, что 1КЕИ специфически связывается с ТКАР2 и является медиатором/модулятором ТКАР2, а поэтому может опосредовать/модулировать ТКАР2-актавность, направленную на активацию ИР-кВ, можно сделать вывод, что его возможная роль в каскаде реакций, способствующих выживанию клеток, в которых ТКАР2 функционирует независимо или в сочетании с другими белками (например, рецепторами ТИР р55 и ТИР р75, рецептором Ра§/АРО1, МОКТ-1, К1Р и ТКЛОЭ). имеет важное значение для разработки лекарственных средств, которые могут усиливать или ингибировать взаимодействие ТКАР2-1КЕИ, если это необходимо. Так, например, если необходимо модулировать клеточную цитотоксичность, индуцированную ТИР, то желательно модулировать индукцию ИР-кВ посредством модуляции взаимодействия ТКАР2-1КЕИ или посредством специфической модуляции ТКАР2 и/или 1КЕИ. Аналогичным образом, например, если необходимо модулировать клеточную цитотоксичность, индуцированную ТИР, то желательно модулировать индукцию ИР-кВ посредством модуляции взаимодействия ТКАР2-1КЕИ или посредством ТКАР2- и/или 1КЕИ-специфической модуляции ИР-кВ. Существует много заболеваний, для лечения которых указанные лекарственные средства могут быть очень эффективными. Среди прочих (см. также вышепривиденное обсуждение) такими заболеваниями являются острый гепатит, при котором острое поражение печени, очевидно, обусловлено гибелью клеток печени, опосредованной рецептором Ра8/АРО1 после индукции Рак-лиганда; гибель клеток, таких как βклетки Лангерганса поджелудочной железы, индуцированная аутоиммунными заболеваниями и приводящая к диабету; гибель клеток при отторжении трансплантата (например, почек, сердца и печени); гибель олигодендроцитов в головном мозге при рассеянном склерозе; и индуцированное СПИДом самоубийство Т-клеток, которое вызывает пролиферацию вируса ВИЧ и тем самым приводит к заболеванию СПИДом.

Возможно, что 1КЕИ или один или более из его возможных биологически активных изоформ, аналогов или фрагментов могут служить в качестве природных ингибиторов самого 1КЕИ или взаимодействия IКЕИ-ΤКЛР2, а поэтому они могут служить модуляторами активации ИР-кВ. Таким образом, указанные модуляторы могут служить в качестве вышеуказанных специфических модуляторов, например, модуляторов, которые могут быть использованы в том случае, если желательно модулировать клеточные цитотоксические эффекты ТИР. Действительно, как проиллюстрировано ниже, были выделены различные аналоги и мутеины 1КЕИ настоящего изобретения, которые обладают способностью модулировать индукцию активации ИР-кВ, опосредованной И1К, ИЕМО, ΙΚΚ1 или их фрагментами. Это индуцирование также опосредуется бактериальным эндотоксином (ЕР8), ацетатом форболмиристиновой кислоты и белком ТАХ НТЬУ-1. Аналогичным образом, для получения специфических лекарственных средств, которые способны ингибировать взаимодействие ТКАР2-1КЕИ или активность 1КЕИ, могут быть также скринированы и другие вещества, такие, как пептиды, органические соединения, антитела и т.п.

Аналогичным образом, если необходимо модулировать активацию ИР-кВ в различных ситуациях, описанных выше, можно, например, модулировать количество 1КЕИ и/или ТКАР2 в клетках различными стандартными методами, описанными выше (например, путем введения ДНК, кодирующей 1КЕИ и/или ТКАР2, в клетки для модуляции экспрессии, или путем получения подходящих композиций, содержащих 1КЕИ и/или ТКАР2, для прямого введения в клетки, или любым другим способом, известным специалистам). Аналогичным образом, для получения специфических лекарственных средств, которые способны усиливать активность 1КЕИ или стимулировать взаимодействие ТКАР2-1КЕИ, могут быть также скринированы и другие вещества, такие как пептиды, органические соединения и т. п.

Неограничивающие примеры конструирования и скрининга пептидов, являющихся модуляторами взаимодействия ТКАР2-1КЕИ, основаны на предварительных исследованиях пептидных ингибиторов 1СЕ или 1СЕ-подобных протеаз, субстратной специфичности 1СЕ и стратегий для анализа эпитопа с использованием пептидного синтеза. Было обнаружено, что минимальным требованием для эффективного 1СЕ-расщепления пептида является присутствие четырех аминокислот слева от сайта расщепления, где наиболее предпочтительной является аспарагиновая кислота в положении Р_ь а справа от положения Р₁достаточно присутствия метиламина (81еа111 е! а1., 1990; Но\гагй е! а1., 1991; ТйогпЬепу е! а1., 1992). Кроме того, было обнаружено, что флуорогенный субстратный пептид (тетрапептид), ацетил-Акр-С1и-Уа1-Акра-(4-метилкумарил-7-амид), сокращенно называемой Ас-ПЕУО-АМС, и соответствующий последовательности поли(АОР-рибоза)полимеразы (РАКР), расщепляется в клетках сразу после стимуляции РА8К, а также после других процессов апоптоза (КаиТтапп 1989; КаиТтапп е! а1., 1993; РахеЬшк е! а1., 1994) и эффективно расщепляется под действием СРР32 (члена семейства протеаз СЕЭ3/1СЕ) и протеаз МАСН.

Поскольку очевидно, что Акр в положении Р₁ указанного субстрата имеет важное значение, то тет

- 19 005775 рапептиды, имеющие Акр в качестве четвертого аминокислотного остатка и различные комбинации аминокислот в первых трех положениях остатков, могут быть быстро скринированы на связывание с активным центром протеаз методом, описанным, например, Гейзеном (Сеукеп 1985; Сеукеп е1 а1., 1987), где большое число пептидов на твердых носителях были скринированы на специфические взаимодействия с антителами. Связывание протеаз МАСН со специфическими пептидами может быть детектировано рядом хорошо известных методов детекции, таких как радиоактивное течение и т.п. Было показано, что этот метод Гейзена позволяет проводить тестирование по крайней мере 4000 пептидов за каждый рабочий день.

Аналогичным образом может быть точно установлена область связывания или область гомологии, которая определяет взаимодействие между таАЕТ и ΙΚΕΝ (или какого-либо другого белка ΙΚΕΝ и ТΚАΕ-связывающего белка), а затем могут быть скринированы пептиды, которые могут блокировать указанное взаимодействие, например, синтезированные пептиды, имеющие последовательность, аналогичную последовательности области связывания или комплементарной ей области, которые могут конкурировать с природным ΙΚΕΝ (или ТЕЛЕ-связывающим белком) за связывание с ТЕЛЕ2 (или ТЕЛЕ).

Поскольку может оказаться предпочтительным конструировать пептидные ингибиторы, которые селективно ингибируют взаимодействия ТΚАΕ2-IЕΕN (или ТΚАΕ-ТΚАΕ-связывающего белка), не оказывая при этом влияния на процессы физиологической гибели клеток, в которых участвуют другие члены каскада реакций внутриклеточной передачи сигнала, например, протеазы МАСН, участвующей в реакциях гибели клеток, которые являются членами семейства протеаз СБЭЗ/ЮБ, то пул пептидов, связывающихся с ТΚАΕ2 (или ТСАЕ) или ΙΚΕΝ (или ТΚАΕ-связывающих белков) в анализе, таком, как анализ, описанный выше, может быть затем синтезирован как флуорогенный субстратный пептид для проведения теста на селективное связывание с указанными другими белками в целях отбора только тех белков, которые являются специфичными для ТΚАΕ2/IЕΕN (или ТΚАΕ-ТΚАΕ-связывающего белка). Пептиды, которые, как было определено, являются специфичными, например, для ТΚАΕ2/IЕΕN, могут быть затем модифицированы для усиления клеточной проницаемости и обратимого или необратимого ингибирования активности ТΚАΕ2 и/или ΙΚΕΝ, ТНогпЬеггу и др. (1994) сообщали, что тетрапептидный (ацилокси)метилкетон Ас-Туг-Уа1-А1а-Акр-СН₂ОС (О)-[2,б-(СЕ₃)₂]РН является сильным инактиватором Ι0Έ. Аналогичным образом М1Шдаи и др. (1995) сообщали, что тетрапептидные ингибиторы, имеющие хлорметилкетоновые (необратимые) или альдегидные (обратимые) группы, ингибируют ΙίΈ. Кроме того, было показано, что бензилоксикарбоксил-Акр-СН₂ОС-(О)-2,б-дихлорбензол (ЭСВ) ингибирует ΙίΈ (МакЫша е1 а1., 1995). В соответствии с этим, аналогичным образом, тетрапептиды, которые селективно связываются, например, с ТΚАΕ2 или ΙΚΕΝ, могут быть модифицированы, например, альдегидной группой, хлорметилкетоновой группой, (ацилокси)метилкетоновой группой или группой СН₂ОС(О)-ЭСВ с получением пептидного ингибитора активности ТΚАΕ2/IΚΕN. Кроме того, в целях улучшения проницаемости, пептиды могут быть, например, химически модифицированы или дериватизированы для усиления их проницаемости через клеточную мембрану и для облегчения транспорта указанных пептидов через мембрану и в цитоплазму. МигашкЫ и др. (1991) сообщали о дериватизации тиротропинвысвобождающего гормона лауриновой кислотой с получением липофильного лауроил-производного с хорошей способностью к проницаемости через клеточные мембраны. 2асйапа и др. (1991) также сообщали об окислении метионина в сульфоксид и замене пептидной связи на ее сложный кетометиленизоэфир (СОСН₂) для облегчения транспорта пептидов через клеточную мембрану. Имеется лишь немного модификаций и производных, которые вполне доступны специалистам.

Кроме того, лекарственное средство или пептидные ингибиторы, способные ингибировать активность, например, ΙΚΕΝ, путем ингибирования взаимодействия IЕΕN-ТΚАΕ2, а также взаимодействия между белками ТСАЕ и ТΚАΕ-связывающими белками, могут быть конъюгированы или могут образовывать комплексы с молекулами, которые облегчают их проникновение в клетку.

В патенте США № 5149782 описано конъюгирование молекулы, транспортируемой через клеточную мембрану, с мембраносвязывающим агентом, таким, как фузогенные полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды и длинноцепочечные жирные кислоты, например, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота. Указанные мембраносвязывающие агенты вводят молекулярные конъюгаты в липидный бислой клеточных мембран и облегчают их проникновение в цитоплазму.

Боте и др. в патенте США № 5108921 описали доступные методы трансмембранной доставки молекул, которыми являются, но не ограничиваются ими, например, белки и нуклеиновые кислоты, посредством механизма опосредованной рецептором эндоцитотической активности. Такими системами рецепторов являются системы, распознающие галактозу, маннозу, маннозо-б-фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин В₁₂), α-2-макроглобулины, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие, как эпидермальный фактор роста (ЕСЕ). Боте и др. сообщали, что рецепторы питательных веществ, такие как рецепторы для биотина и фолата, преимущественно могут быть использованы для усиления транспорта через клеточную мембрану, что обусловлено локализацией и множественностью биотиновых и фолатных рецепторов на мембранных поверхностях большинства клеток, и процессами трансмембранного транспорта, опосредованного ассоциированным рецептором. Таким образом, ком

- 20 005775 плекс, образованный между соединением, доставляемым в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, контактирует с клеточной мембраной, несущей биотиновые или фолатные рецепторы, и инициирует опосредованный рецептором механизм трансмембранного транспорта, и тем самым позволяет осуществлять проникновение нужного соединения в клетку.

Известно, что Ιί,Έ обладает толерантностью к вольным заменам в положении Р₂ и эта толерантность к вольным заменам была использована для разработки сильной и в высокой степени селективной аффинной метки, содержащей биотиновую метку (ТйогиЬеггу е! а1., 1994). Затем положение Р₂, а также возможно, Ν-конец указанного тетрапептидного ингибитора могут быть модифицированы или дериватизированы, так, чтобы, при присоединении биотиновой молекулы усиливалась проницаемость этих пептидных ингибиторов через клеточную мембрану.

Кроме того, известно, что гибридизация нужной пептидной последовательности с лидерной/сигнальной пептидной последовательностью с образованием химерного пептида позволит указанному химерному пептиду транспортироваться через клеточную мембрану в цитоплазму.

Для каждого специалиста в области пептидов очевидно, что пептидными ингибиторами взаимодействия ТΚΆЕ-ТΚ.ΆЕ-связывающих белков, например, взаимодействия ΊΚΆΕ^-ΙΚΕΝ настоящего изобретения, являются пептид-имитирующие лекарственные средства или ингибиторы, которые могут быть также быстро скринированы на их связывание, например, с ТΚАЕ2/IΚΕN, в целях получения, вероятно, более стабильных ингибиторов.

Следует также отметить, что аналогичные способы облегчения или усиления транспорта пептидных ингибиторов через клеточные мембраны, обсуждаемые выше, также применимы для ТИАЕ-связывающих белков, например, ΙΚΕΝ, его аналогов, фрагментов или изоформ, а также для других пептидов и белков, которые обладают присущими им внутриклеточными эффектами.

Что касается антител, упомянутых в настоящем описании, то термин антитело включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (тАЬк), химерные антитела, антиидиотипические (анти-И) антитела против антител, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, а также, их фрагменты, полученные любыми известными методами, такими, как, но не ограничивающимися ими, методы ферментативного расщепления, методы пептидного синтеза или рекомбинантные методы.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученных из сывороток животных, иммунизированных антигеном. Моноклональное антитело содержит, в основном, гомогенную популяцию антител, специфичных к антигенам, где указанные популяции содержат, в основном, аналогичные эпитоп-связывающие сайты. МаЬк могут быть получены методами, хорошо известными специалистам. См. например, работы КоЫег & М11к1ет, №11иге. 256:495-497 (1975); патент США № 4376110; АикиЬе1 е! а1., ебк., Пабом апб Ьапе ААПВООНА: А ^ΆВОΚΆТОΚΥ МА^АЬ, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу (1988); и СоШдап е! а1., ебк., СиггеШ Рго1осо1к ίη Iттиηо1оду, Сгеепе РиЬНкЫпд Аккос. & \УПеу Шегкшепсе Ν.Υ., (1992-1996), содержание которых вводится в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки. Указанными антителами могут быть иммуноглобулины любого класса, включая ЦС, ΙβΜ, Ι§Ε, ΙβΑ СГОЭ и любого их подкласса. Гибридомы, продуцирующие тАЬ настоящего изобретения, могут быть культивированы ш νίΙΐΌ, ш кйи или ш у1уо. Продуцирование высоких титров тАЬк ш у1уо или т кйи в настоящее время делает этот способ продуцирования предпочтительным.

Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых происходят от животных различных видов, такие, как молекулы, имеющие вариабельную область, происходящую от мышиного тАЬ, и константную область иммуноглобулина человека. Химерные антитела используются, главным образом, для снижения иммуногенности, при их введении, и для увеличения уровней их продуцирования; так, например, если мышиные тАЬ имеют более высокие выходы из гибридом, но при этом более высокую иммуногенность у человека, то используются химерные тАЬк человек/мышь. Химерные антитела и методы их получения известны специалистам (СаЬШу е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ст И8А 81:3273-3277 (1984); Моткоп е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ст И8А 81:6851-6855 (1984); ВоиНаппе е! а1., №Ш1ге 312:643-646 (1984); СаЬ111у е! а1., Европейская патентная заявка 125023 (опубликованная 14 ноября 1984); е! а1., ΝιΙιιιό 314:268-270 (1985); ТашдисЫ е! а1., Европейская патентная заявка 171496 (опубликованная 19 февраля 1985); Моткоп е! а1., Европейская патентная заявка 173494 (опубликованная 5 марта 1986); е! а1., заявка РСТ \УО 8601533 (опубликованная 13 марта 1986); Кибо е! а1., Европейская патентная заявка 184187 (опубликованная 11 июня 1986); 8айадап е! а1., Нттипо1. 137:10661074 (1986); ЕоЬшкоп е! а1., Международная патентная заявка № \¥О 8702671 (опубликованная 7 мая 1987); Ьщ е! а1. , Ргос. Νοί1. Асаб. 8с1. И8А 84:3439-3443 (1987); 8ип е! а1., Ргос. Νοί1. 8οΐ. И8А 84:214-218 (1987); Вебег е! а1., 8аепсе 240:1041-1043 (1988); и Пабом & Ьапе, ΆNТIВО^IΕ8: А ВАВОНАТО^ МАИЦАЕ, см. выше. Эти работы вводятся в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки.

Антиидиотипическим (анти-И) антителом является антитело, распознающее уникальные детерминанты, в основном, ассоциированные с антиген-связывающим сайтом антитела. И-Антитело может быть получено путем иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, штамм мыщей), как источника тАЬ, против которого получают анти-И. Иммунизованное животное будет распознавать и

- 21 005775 отвечать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела посредством продуцирования антитела против этих идиотипических детерминант (анти-И антитело). См., например, патент США № 4699880, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Это анти-И антитело может быть также использовано в качестве иммуногена для индуцирования иммунного ответа у другого животного, у которого продуцируется так называемое анти-анти-И антитело. Указанное анти-анти-И антитело в отношении эпитопа может быть идентично исходному шАЬ, которое индуцирует анти-И. Таким образом, с использованием антител к идиотипическим детерминантам тАЬ, можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела с идентичной специфичностью.

В соответствии с этим, тАЬ, генерированные против ΙΚΕΝ, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения могут быть использованы для индуцирования анти-И антител у подходящих животных, таких, как мыши ВАЬВ/с. Клетки селезенки от таких иммунизованных мышей используют для продуцирования анти-И гибридом, секретирующих анти-И тАЬ. Кроме того, указанные анти-И тАЬ могут быть связаны с носителем, таким, как гемоцианин слизня (КЬН), и использованы для дополнительной иммунизации мышей ВАЬВ/с. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-анти-И антитела, которые обладают связывающими свойствами исходного тАЬ, специфичного для эпитопа вышеуказанного белка ΙΚΕΝ, или его аналогов, фрагментов или производных.

Таким образом, анти-И тАЬ имеет свои собственные идиотипические эпитопы, или идиотопы, структурно сходные с оцениваемым эпитопом, таким, как белок-а СКВ.

Термин антитело также означает как интактные молекулы, так и их фрагменты, такие как, например, ТаЬ и Т(аЬ')2-фрагменты, способные связываться с антигеном. ТаЬ и Т(аЬ')2-фрагменты не имеют Тсфрагмент интактного антитела, более быстро выводятся из кровотока и могут иметь меньшую тканенеспецифичность связывания, чем интактное антитело (^аИ с1 а1., I. Νυ:1. Меб. 24:316-325 (1983)).

Следует отметить, что ТаЬ и Т(аЬ')₂-фрагменты и другие фрагменты антител настоящего изобретения могут быть использованы для детекции и количественного определения белка ΙΚΕΝ методами, описанными для интактных молекул антитела. Указанные фрагменты обычно получают путем протеолитического расщепления с использованием ферментов, таких как папаин (для продуцирования ТаЬфрагментов) или пепсин (для продуцирования Т(аЬ')₂-фрагментов).

Говорят, что антитело способно связываться с молекулой, если оно способно специфически реагировать с указанной молекулой, что приводит к связыванию этой молекулы с указанным антителом. Термин эпитоп означает часть любой молекулы, которая способна связываться с антителом и которая может также распознаваться этим антителом. Эпитопы или антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких, как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и имеют специфическую трехмерную структуру, а также определенный заряд.

Антиген представляет собой молекулу или часть молекулы, которая способна связываться с антителом, и которая, кроме того, способна индуцировать у животного вырабатывание антитела, способного связываться с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов. Специфическая реакция, упомянутая выше, означает, что данный антиген будет реагировать с высокой степенью селективности с соответствующим антителом, а не с множеством других антител, которые могут продуцироваться другими антигенами.

Антитела, включая фрагменты антител, применяемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для количественной или качественной детекции белков ΙΚΕΝ в данном образце или для детекции присутствия клеток, которые экспрессируют белки ΙΚΕΝ настоящего изобретения. Это может быть осуществлено иммунофлуоресцентными методами с использованием флуоресцентно меченного антитела (см. ниже) в сочетании с детекцией на световом микроскопе, проточной цитометрией или флуорометрической детекцией.

Антитела (или их фрагменты), применяемые в настоящем изобретении, могут быть использованы в гистологии, в иммунофлуоролюминесцентной или иммуноэлектронной микроскопии для ίη 8Йи-детекции белков ΙΚΕΝ настоящего изобретения. Ιη 5Ш.1-детекция может быть осуществлена путем взятия гистологического образца у пациента, и получения меченного антитела настоящего изобретения, специфичного для такого образца. Это антитело (или его фрагмент) предпочтительно наносят на биологический образец или наносят поверх меченного антитела (или его фрагмента), специфичного к этому образцу. Используя эту процедуру, можно определить не только присутствие белков ΙΚΕΝ, но также и их распределение на исследуемой ткани. Любому специалисту понятно, что для осуществления ίη Щи-детекции с использованием настоящего изобретения могут быть модифицированы любые гистологические методы широкого ряда (такие, как процедуры окрашивания).

Указанные анализы на белки ΙΚΕΝ настоящего изобретения, в основном, включают инкубирование биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в тканевой культуре в присутствии меченного антитела, способного идентифицировать белки ΙΚΕΝ, и детектирование антитела любым способом, известным специалистам.

Биологический образец может быть нанесен на твердофазную подложку или обработан твердофаз

- 22 005775 ным носителем, таким как нитроцеллюлоза, или другим твердым носителем, который способен иммобилизовывать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Эта подложка или носитель могут быть затем промыты подходящими буферами, а затем обработаны меченным антителом в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше. Твердофазная подложка или твердофазный носитель могут быть затем промыты буфером во второй раз для удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки на указанной твердой подложке или твердом носителе может быть затем детектировано стандартными методами.

Термины твердофазная подложка, твердофазный носитель, твердая подложка, твердый носитель, подложка или носитель означают любую подложку или любой носитель, способные связываться с антигеном или антителами. Хорошо известными подложками или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлонамилазы, натуральные или модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнит. По своей природе данный носитель может быть либо растворимым до некоторой степени, либо нерастворимым, как того требуют цели настоящего изобретения. Материал подложки может иметь практически любую возможную структурную конфигурацию, при условии, что присоединенная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Так, например, подложка или носитель могут иметь сферическую конфигурацию, такую как шарики; цилиндрическую конфигурацию, как, например, внутренняя поверхность лабораторной пробирки или внешняя поверхность стержня. Альтернативно, эта поверхность может быть плоской, как, например, лист, тест-полоска и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистироловые шарики. Специалистам известны и другие подходящие носители, которые могут быть использованы для связывания антитела или антигена, либо такие носители могут быть получены самими специалистами путем рутинного экспериментирования.

Связывающая активность данной группы антител настоящего изобретения, описанных выше, может быть определена хорошо известными методами. Каждый специалист может сам установить функциональные и оптимальные условия для каждого определения посредством рутинного экспрериментирования.

В данных анализах могут быть, кроме того, проведены другие дополнительные стадии, такие, как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрация и т.п., как это обычно предусмотрено или если это необходимо в данном конкретном случае.

Один из способов мечения антитела настоящего изобретения предусматривает связывание этого антитела с ферментом и его использование в иммуноферментном анализе (ИФА). Этот фермент, в свою очередь, при его последующей обработке соответствующим субстратом, будет реагировать с субстратом так, что при этом будет продуцироваться химическая молекула, которая может быть детектирована, например, путем спектрофотометрии, флуорометрии или визуально. Ферментами, которые могут быть использованы для детектируемого мечения антитела, являются, но не ограничиваются ими, малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-5-стероидизомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфаглицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, бета-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза. Детекция может быть осуществлена колориметрическими методами, в которых применяется хромогенный субстрат для данного фермента. Детекция может быть также осуществлена путем визуального сравнения уровня ферментативной реакции субстрата с аналогично полученными стандартами.

Детекция может быть осуществлена с использованием любых других иммуноанализов. Так, например, путем радиоактивного мечения антител или фрагментов антител можно детектировать К-РТРазу с использованием радиоиммуноанализа (РИА). Подробное описание РИА можно найти в ЬаЬога!огу Τесйшциек апб ВюсйетЦйу т Мо1еси1аг Вю1оду, \Уогк Τ.8. е! а1., ЫоПй Но11апб РиЬйкЫпд Сотрапу, ΝΥ (1978) с конкретной ссылкой на главу, озаглавленную Ап И'ИгобисЬоп !о Вабюпптипе Аккау апб Ве1а!еб Τесйп^^иек Сйагб Т., которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Радиоактивный изотоп может быть детектирован указанными методами, например, с использованием гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика, или с помощью авторадиографии.

Мечение антитела настоящего изобретения может быть также осуществлено флуоресцентным соединением. Если флуоресцентно меченное антитело экспонировано светом нужной длины волны, присутствие этого антитела может быть затем детектировано благодаря его флуоресценции. Наиболее широко используемыми соединениями для флуоресцентного мечения являются флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуоресцамин.

Антитело может быть также подвергнуто детектируемому мечению с использованием флуоресцентных металлов, таких, как ¹⁵²Е или других металлов лантанидного ряда. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием групп, образующих хелатные комплексы с металлами, таких как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА).

Антитело может быть также подвергнуто детектируемому мечению путем его связывания с хемилюминесцентным соединением. Затем присутствие хемилюминесцентно меченного антитела определяют путем детекции люминесценции, которая возникает в процессе химической реакции. Примерами особен

- 23 005775 но ценных соединений для хемилюминесцентного мечения являются люминол, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.

Аналогичным образом, для мечения антитела настоящего изобретения может быть использовано биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция представляет собой тип хемилюминесценции, обнаруженный в биологических системах, в которых каталитический белок повышает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют путем детекции присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для мечения являются люциферин, люцифераза и акворин.

Молекула антитела настоящего изобретения может быть адаптирована для ее применения в иммунометрическом анализе, также известном как двухсторонний или сэндвич-анализ. В обычном иммунометрическом анализе определенное количество немеченного антитела (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или носителем, а затем добавляют определенное количество детектируемого меченного растворимого антитела для детекции и/или количественного определения трехкомпонентного комплекса, образованного между твердофазным антителом, антигеном и меченным антителом.

Типичными и предпочтительными иммунометрическими анализами являются прямые анализы, в которых антитело, связанное с твердой фазой, сначала подвергают контакту с тестируемым образцом для экстракции антигена из образца путем образования бинарного твердофазного комплекса антителоантиген. По истечении подходящего периода инкубирования твердую подложку или носитель промывают для удаления остатка жидкого образца, включающего непрореагировавший антиген, если он присутствует, а затем подвергают контакту с раствором, содержащим неизвестное количество меченного антитела (которое функционирует как молекула-репортер). По истечении второго периода инкубирования, проводимого для связывания указанного меченного антитела с комплексом, содержащим антиген, связанный с твердой подложкой или носителем посредством немеченного антитела, твердую подложку или носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавшего меченного антитела.

Во втором типе сэндвич-анализа, который может быть также использован с антигенами настоящего изобретения, используются так называемые одновременные и обратные анализы. Одновременный анализ предусматривает проведение одной стадии инкубирования, в которой антитело, связанное с твердой подложкой или носителем, и меченное антитело добавляют к тестируемому образцу в одно и то же время. После завершения инкубирования твердую подложку или носитель промывают для удаления остатка жидкого образца и не связанного с комплексом меченного антитела. Затем определяют присутствие меченного антитела, ассоциированного с твердой подложкой или носителем, как это должно быть осуществлено в стандартном прямом сэндвич-анализе.

В обратном анализе сначала поэтапно добавляют раствор меченного антитела к жидкому образцу, а затем добавляют немеченное антитело, связанное с твердой подложкой или носителем после прохождения соответствующего периода инкубирования. После второго инкубирования твердую фазу промывают стандартным способом для ее отделения от остатка тестируемого образца и раствора непрореагировавшего меченного антитела. Определение меченного антитела, ассоциированного с твердой подложкой или носителем, затем осуществляют как и в одновременном и прямом анализах.

Как было упомянуто выше, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим рекомбинантные вирусные векторы животного, кодирующие белок ΙΚΕΝ, где вектор также кодирует поверхностный белок вируса, способный специфически связываться с поверхностными белками клетки-мишени (например, раковых клеток) и целенаправленно вводить вставку последовательностей белка ΙΚΕΝ в клетки. Далее фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат в качестве активного ингредиента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность белковой последовательности ΙΚΕΝ или (Ь) лекарственные средства, блокирующие взаимодействие белка ΙΚΕΝ и ТКАР.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения включают достаточное количество активного ингредиента, необходимое для достижения нужных целей. Кроме того, указанные фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие наполнители и добавки, которые облегчают обработку активных соединений для их введения в препараты, используемые в фармацевтике, и которые могут стабилизировать указанные препараты для их введения пациенту, нуждающемуся в этом, методами, хорошо известными специалистам.

Предполагается, что белок ΙΚΕΝ его изоформы или изотипы экспрессируются в различных тканях на заметно различных уровнях, а также, вероятно, с различным профилем изотипов аналогично экспрессии различных других белков, участвующих в путях внутриклеточной передачи сигнала, как показано в перечисленных выше совместно рассматриваемых и принадлежащих нескольким владельцам заявках. Эти различия могут, вероятно, вносить вклад в тканеспецифические особенности ответа на Ра8/ЛРО1лиганд и Т№. Как и в случае других гомологов ί.Έ03/Ιί.Έ (^аид е1 а1., 1994; АЫетп е1 а1., 1995), авторами настоящего изобретения ранее было обнаружено (в вышеупомянутых патентных заявках), что изоформы МАСН, которые содержат неполные области ί.Έ03/Ιί.Έ (например, МАСНаЗ), обладают ингибирующим действием на активность коэкспрессированных молекул МАСНа1 или МАСНа2; и было также

- 24 005775 обнаружено, что они блокируют индуцирование гибели клеток посредством Ε;·ΐδ/ΑΡ01 и ρ55-Κ. Экспрессия указанных ингибирующих изоформ в клетках может представлять собой механизм клеточной самозащиты от Ε;·ΐδ/ΑΡ01- и ΤΝΕ-опосредованной цитотоксичности. Широкая гетерогенность изоформ МАСН, которая значительно превышает гетерогенность, наблюдаемую для любой из других протеаз семейства СЕО3/1СЕ, должна обеспечивать особенно тонкую настройку функции активных изоформ МАСН.

В соответствии с настоящим изобретением были также выделены аналоги/мутеины ΈΚΑΕ2связывающего белка ΙΚΕΝ. Некоторые из этих аналогов/мутеинов ΙΚΕΝ (см. выше и примеры ниже), такие, как делеционные мутеины ΙΚΕΝ, модулируют активацию ΝΕ-кВ. Следовательно, как указывалось выше, белки ΙΚΕΝ или их возможные изоформы могут, в различных тканях, оказывать различное действие на взаимодействие с белками ΤΚΑΕ и, тем самым, влиять на активность белков ΤΚΑΕ или внутриклеточную передачу сигнала, опосредованную указанными белками ΤΚΑΕ.

Также вероятно, что некоторые из этих возможных изоформ ΙΚΕΝ имеют другие функции. Так, например, ΙΚΕΝ или некоторые аналоги или изоформы ΙΚΕΝ могут также действовать как сайты причаливания для молекул, которые участвуют в других не-цитотоксических эффектах, например, рецепторов Εηκ/ΑΡ01 и ΤΝΕ путем взаимодействия с ΤΚΑΕ2 или даже независимо от ΤΚΑΕ2.

Вследствие уникальной способности рецепторов Εηκ/ΑΡ01 и ΤΝΕ вызывать гибель клеток, а также способности указанных рецепторов ΤΝΕ стимулировать другие повреждающие ткань активности, нарушения функций этих рецепторов могут, в частности, оказывать неблагоприятное действие на организм. Действительно, было показано, что избыточное и недостаточное функционирование этих рецепторов вносит определенный вклад в патологические проявления различных заболеваний (Уакка111, 1992; №1да1а & Со1к!еш, 1995). Идентификация молекул, участвующих в активности данных рецепторов в передаче сигналов, и выявление путей модуляции активности этих молекул может привести к разработке новых терапевтических подходов. Исходя из предполагаемой важной роли белков ΤΚΑΕ, например, ΤΚΑΕ2, а следовательно, и взаимодействия ΤΚΑΕ2-ΙΚΕΝ, в модуляции активации ΝΕ-кВ, представляется особенно важным разработать лекарственные средства, которые могут модулировать взаимодействие таАЕТΙΚΕΝ, если это необходимо для гибели клеток (путем ингибирования активации ΝΕ-кВ) и, наоборот, если это необходимо для сохранения клеток (путем усиления активации ΝΕ-кВ).

Настоящее изобретение также относится к белкам или другим лигандам, которые могут связываться с белками ΙΚΕΝ настоящего изобретения, и тем самым, модулировать/опосредовать активность белков ΙΚΕΝ. Такие белки или лиганды могут быть скринированы, выделены и продуцированы любым из вышеупомянутых методов. Так, например, может быть выделен ряд новых лигандов, включая белки, способные связываться с белками ΙΚΕΝ настоящего изобретения (такими, как новые белки/лиганды за исключением известных ΤΚΑΕ2 и ΤΚΑΕ1).

Как подробно описано выше, указанные новые белки/лиганды, связывающиеся с белком ΙΚΕΝ, например, ΙΚΕΝ-связывающие белки, могут служить в качестве, например, ингибиторов или стимуляторов ΙΚΕΝ-опосредованной активности или активности, опосредованной, например, взаимодействием ΤΚΑΕ2ΙΚΕΝ, и таким образом, они играют важную роль в различных патологических и других состояниях, подробно описанных выше. Другая функция ΙΚΕΝ-связывающих белков/лигандов заключается в том, что они служат в качестве специфических агентов для очистки белков ΙΚΕΝ, например, путем аффинной хроматографии, где эти новые связывающие белки/лиганды присоединяются к подходящим хроматографическим матрицам с образованием твердых или аффинных подложек/матриц, через которые могут быть пропущены раствор, экстракт или т.п., содержащие, например, ΙΚΕΝ, что облегчает их очистку. Указанные методы аффинной хроматографии хорошо известны и являются, в основном, рутинными процедурами.

Аналогичным образом, все вышеупомянутые белки ΙΚΕΝ, их аналоги, фрагменты, изоформы и производные настоящего изобретения могут быть использованы для очистки аффинной хроматографией различных белков ΤΚΑΕ, с которыми они связываются. Так, например, ΙΚΕΝ и аналоги, фрагменты и мутеины ΙΚΕΝ (см. нижеприведенные примеры) могут быть использованы для очистки ΤΚΑΕ2 с помощью аффинной хроматографии.

Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих неограничивающих примерах и в сопровождающем их графическом материале.

Следует также отметить, что процедуры: (ί) скрининга двухкомпонентного гибрида и теста на экспрессию двухкомпонентного гибрида β-галактозидазы; (ίί) индуцированной экспрессии, метаболического мечения и иммунопреципитации белков; (ίίί) ш νίϋΌ-связывания; (ίν) оценки цитотоксичности; и (ν) Нозерн-анализа и анализа последовательности, а также другие процедуры, используемые в нижеследующих примерах были подробно описаны в предшествующих публикациях авторов настоящего изобретения, относящихся к другим белкам и путям передачи внутриклеточного сигнала (см., например, Во1бш е! а1., 1995а, 1995Ь и Во1бт е! а1., 1996). Эти процедуры также подробно описаны в совместно рассматриваемой и принадлежащей нескольким владельцам заявке Израиля № 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 и 120367, а также в соответствующей заявке РСТ № РСТ/и§ 96/10521). В соответствии с этим в

- 25 005775 настоящую заявку вводится полное описание всех указанных публикаций и патентных заявок во всей своей полноте, и, по крайней мере, та их часть, которая относится к подробному описанию экспериментальных процедур.

Примеры

Материалы и методы

ί) кДНК-библиотеки.

a) Библиотека кДНК В-клеток.

Была использована олиго-бТ-праймированная библиотека, сконструированная из В-клеток человека (ЭнгГее е! а1., 1993). кДНК указанной библиотеки вводили в ΧΙιοΙ-сайт вектора р8БН07 на основе рАСТ, гибридизованного с доменом активации САБ-4.

b) кДНК-библдотека λ§!10 яичек.

Была использована кДНК-библиотека яичек человека. Указанная библиотека представляла собой рандомизированную праймированную гексануклеотидом библиотеку со средним размером вставки от 200 до 400 д.н.

ίί) Дрожжевые штаммы.

Для трансформации и скрининга в качестве штаммов-хозяев были использованы два дрожжевых штамма: штамм ΗΕ7α который был использован в скрининге двухкомпонентного гибрида, и штамм δΕΥ526, который был использован в анализах на β-галактозидазу. Оба этих штамма несли ауксотрофные маркеры ίτρί и 1еи2, а именно, эти дрожжевые штаммы не могли быть культивированы в минимальной синтетической среде, не содержащей триптофана и лейцина, если только они не были трансформированы плазмидой, несущей варианты указанных генов дикого типа (ТНР1, ББи2). Указанные два дрожжевых штамма несли делеционные мутации в своих генах САБ4 и САБ80 (мутации да 14-542 и да 180-538, соответственно).

Штаммы 8ΕΥ526 и №7с несли ген-репортер 1асЛ в своих генотипах; в штамме 8ΕΥ526 этот ген был гибридизован с ИА8 и ТАТА-частью промотора САБ1, а в штамме №7с три копии 17-мерной консенсусной последовательности САБ4 и ТАТА-части промотора СΥС1 были гибридизованы с 1ас2. ИА8 САБ1 и 17-меры САБ4 были восприимчивыми к активатору транскрипции САБ4. Кроме того, штамм ЭТ7с нес репортер ΗΙ83, гибридизованный с ИА8 И ТАТА-частью промотора САБ1.

ίίί) Клонирование человеческого ТΚΑΕ2.

Человеческий ТΚΑΕ2 клонировали с помощью ПЦР из кДНК-библиотеки НБ60 (для последовательности ТΚΑΕ2 и т.п., подробно см. ЕцШе е! а1., 1994; ЕШЬе е! а1., 1995а; Сйепд е! а1., 1996; Н§ц е! а1., 1996; и \Уа11ас11, 1996). Были использованы следующие праймеры: а) 30-мерный прямой праймер САССАТССТСАТСССТССАССТАСССТСАС (δΕΟ ΙΌ Ν0:1), соответствующий кодирующей последовательности 11ТΚΑΕ2. начиная от кодона для первого метионина (подчеркнут) и включая линкер с ΒатΗIсайтом и Ь) 32-мерный обратный праймер ССТССАСТТАСАССССТСТСАССТССАСААТС (δΕΟ ΙΌ Ν0:2), который включает стоп-кодон гена 11ТΚΑΕ2 (подчеркнут) и рестрикционный 8ай-сайт в своем линкере. ПЦР-программа включала стадию первоначальной денатурации в течение 2 мин при 94°С, с последующим проведением 3Ό циклов: 1 мин при 94^оС, 1 мин при 64°С, 1 мин и 40 с при 72°С. Затем амплифицированный человеческий ТΚΑΕ2 встраивали в ΒатΗI-δа1I-сайты вектора ρСΒТ9 в сочетании с доменом связывания ДНК САБ4.

ίν) Скрининг двухкомпонентного гибрида В-клеточной библиотеки.

Скрининг двухкомпонентного гибрида представляет собой метод (подробное описание см. в вышеуказанных публикациях и патентных заявках), используемый для идентификации факторов, ассоциированных с конкретной молекулой, которая служит в качестве приманки. В настоящем изобретении ТΚΑΕ2, который был клонирован в вектор ρСΒТ9, служил в качестве приманки. ТΚΑΕ2 был коэкспрессирован вместе со скринированной В-клеточной кДНК-библиотекой в дрожжевом штамме №7с. ПЦРклонированный ТΚΑΕ2 представлял собой рекомбинантный гибрид с ДНК-связывающим доменом САБ4, а скринированная кДНК-библиотека была гибридизована с доменом активации САБ4 в векторе ρδΕ1107. Репортерный ген в №7с представлял собой Ш83, гибридизованный с вышерасположенной активирующей последовательностью (ИА8) промотора САБ1, который является восприимчивым к активатору транскрипции САБ4. Трансформанты, которые содержали плазмиды ρСΒТ9 и ρδΕ1107, были отобраны на их рост на планшетах без триптофана и лейцина. Во второй стадии позитивные клоны, которые экспрессировали двухгибридные белки, взаимодействующие друг с другом, а поэтому активировали САБ1-НШ3, собирали из планшетов, которые не содержали триптофан, лейцин и гистидин, и содержали 50 мМ 3-аминотриазол (3АТ).

ν) Анализ на β-галактозидазу.

Позитивные клоны, собранные при скрининге двухкомпонентного гибрида, подвергали тесту на окрашивание 1асЛ в дрожжевых клетках δΕΥ526 в соответствии с руководством СЦШесй ΕιΦοπιΙο^δ (подробности см. в вышеупомянутых публикациях и патентных заявках). Вкратце, трансформанты оставляли для роста при 30°С в течение 2-4 дней до тех пор, пока их диаметр не достигал примерно 2 мм, а затем переносили на фильтры \У11а(тап. Затем фильтры подвергали замораживанию/оттаиванию для обеспече

- 26 005775 ния проницаемости клеток, после чего их смачивали в буфере (16,1 мг/мл НагОТО^НЮ; 5,5 мг/мл NаН₂ΡО₄ · Н₂О; 0,75 мг/мл КС1; 0,75 мг/мл Мд8О₄ · 7Н₂О, рН=7), содержащем 0,33 мг/мл Х-да1 и 0,35 мМ β-меркаптоэтанол. Колонии наблюдали на проявление синей окраски, которая указывала на индуцирование β-галактозидазы.

νί) Экспрессия клонированных кДНК.

Были сконструированы два вида экспрессирующих векторов:

a) векторы на основе ρϋΉΌ10-3, содержащие открытую рамку считывания (ОРС) ΙΒΕΝ, гибридизованную с эпитопом гемаглютинина (ГА);

b) вектор на основе ρϋΉΌ10-3, в котором октапептидная последовательность ΕΓΑΟ была введена непосредственно перед клонированным ΤΒΑΕ2 и была соответственно обозначена Ε^Α6/Β6/ΤΒΑΕ2.

Конструкции, содержащие ОРС ΙΒΕΝ, были трансфецированы в клон ΗΙΤΑ1 клеток НеЬа (для этих клеток см., Со55еп. М. & Вщагб. М. (1992)) либо отдельно, либо вместе с Ε^Α6/Β6/ΤΒΑΕ2 стандартным методом с использованием фосфата кальция (см., например, СштепЕ ΡιόΦ^Ρ ш Мо1еси1аг Вю1оду, еШ. Αι.ΐ5ΐ.^1 еЕ а1., ΕΜ. еЕ а1.).

νίί) Люциферазный анализ.

В основном 5 х 10⁵ трансфецированных клеток собирали, промывали три раза холодным ΡΒ8 и ресуспендировали в 400 мкл экстрагирующего буфера (0,1М Κ₂НΡО₄/ΚН₂ΡО₄, рН=7,8; 1 мМ ΌΤΤ). Лизис этих клеток осуществляли путем трехкратного замораживания в жидком азоте и оттаивании. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования (5 мин при 10000 х д). Для люциферазного анализа 200 мкл люциферазного буфера (25 мМ глицилглицина, 15 мМ К₂НРО₄/КН₂РО₄, рН=7,8; 15 мМ Мд8О₄, 4 мМ ΕΟΤΑ, 2 мМ АТР, 1 мМ ΌΤΤ) добавляли к 50 мкл лизата. Затем к реакционной смеси добавляли 100 мкл 0,2 мМ Ό-люциферина, 2 5 мМ глицилглицина, 1 мМ ΌΤΤ. Люциферазную активность определяли путем считывания излучения света на люминометре Ьитйгоп, установленном всего на 10 с. (более подробно см. вышеуказанные публикации и патентные заявки).

Пример 1. Клонирование ΙΒΕΝ и тест на двухкомпонентный гибрид.

кДНК-библиотеку, полученную от В-клеток, скринировали на белки, ассоциирующиеся с ΤΒΑΕ2, методом двойного гибрида, как описано в п. (ίν) Материалы и методы. Только у трансформантов, которые экспрессировали как ΤΒΑΕ2, так и белок, способный взаимодействовать с ним, ДНК-связывающийся домен ΟΑΓ4 и домен активации транскрипции были объединены вместе. Результат выражали в активации и экспрессии репортерного гена, в данном случае Ш83, гибридизованного с υΑ8 и с ТАТА-частью промотора 6ΑΓ1.

Указанный скрининг давал приблизительно 2000 клонов, которые были способны расти на Τιρ-, Ьеи-, НБ-3АТ-планшетах. ДНК, полученные из 165 произвольно отобранных позитивных клонов, служили для временной ко-трансфекции дрожжевого штамма 8ΕΥ526 вместе с ΤΒΑΕ2, клонированным в вектор ρСΒΤ9. Анализ на (3-галактозидазную активность осуществляли на трансформированных дрожжевых колониях 8ΕΥ526, как описано в разделе Материалы и Методы (ν). Развивающаяся синяя окраска указывала на дрожжевые колонии, содержащие кДНК, кодирующую белок или полипептид, который связывается с ΤΒΑΕ2.

независимых клонов, кодирующих новый белок ΙΒΕΝ, идентифицировали по их способности расти на 3АТ-чашках и индуцировать 1ас2, как было измерено в тесте на окрашивание. Из всех клонов, оцененных как позитивные, два клона представляли собой кДНК, кодирующие известные белки; сам ΤΒΑΕ2, который способен к самоассоциации и образованию гомодимеров, и рецептор лимфотоксинабета, внутриклеточные домены которого, как было показано, связываются с ΤΒΑΕ2.

Затем позитивные клоны анализировали в тесте на специфичность связывания, а именно, на их взаимодействие с нерелевантными приманками. Как показано в табл. ΙΙ, ΙΒΕΝ реагирует только с ΤΒΑΕ2 и ΤΒΑΕ1 и не связывается ни с одним из ряда проанализированных нерелевантных белков, таких как ламин и циклин Ό. ΙΒΕΝ не связывается ни с внутриклеточными доменами рецепторов ΤΝΕ р55 и р75, ни с МОΒΤ, ни с ΝΙΚ, ни с ΝΙΚ-мутантом^^, ни с А20.

Для сужения области на молекуле ΤΒΑΕ2, которая взаимодействует с ΙΒΕΝ, были созданы две дополнительные конструкции. Одна конструкция содержала Ν-концевую часть молекулы ΤΒΑΕ2, аминокислоты 1-224, обозначенную ΒΙΝΟι_-224 и содержащую мотивы пальца Рюд (кольцевого пальца) и цинкового пальца. Вторая конструкция включала только С-концевую часть ΤΒΑΕ2, аминокислоты 225-501, охватывающую ΤΒΑΕ-домен, а также дополнительные 42 аминокислоты. Эти две конструкции были использованы как приманки в тестах с двойным гибридом. Эти результаты явно показали, что ΙΒΕΝ не взаимодействует с конструкцией, содержащей аминокислоты 1-224 молекулы ΤΒΑΕ2, однако, он связывается с С-концевой конструкцией, содержащей ΤΒΑΕ-домен с той же самой эффективностью, с которой он связывается с полноразмерным ΤΒΑΕ2 (табл. ΙΙ). Делеционный анализ продемонстрировал, что ΤΒΑΕ2-связывающая область в ΙΒΕΝ и его изоформах ограничена областью между аминокислотами 198 и 388 (табл. ΙΙ).

- 27 005775

Таблица II. Тест на взаимодействие ΙΚΕΝ с использованием 2-компонентного дрожжевого гибрида

Приманка	Жертва	Взаимодействие
ТКАЕ2	ΙΚΕΝ	+++
ТКАГ2 225.501	ΙΚΕΝ	+-Η-
БИМО	ΙΚΕΝ	-
ТКАР2	ΙΗΕΝι-197	-
Ламин	ΙΚΕΝ\|.\|97	-
ТКАГ2	1КЕЫ[98-ш	+++
Ламин	ΙΚΕΝ 198-3 88	-
ТКАР2	1ΚΕΝ398-541	+/-
Ламин	ΙΚΕΝ398-ΐ4ΐ	+/-
ТКАЕ2	ΙΚΕΝ 198-541	+++
Ламин	ΙΚΕΝ 198-541	-
ТКАР2	ΙΚΕΝ 10Β	++
1ΪΗΕΝ 10В	ΙΚΕΝ 10Β	++
ΙΚΕΝ 10В	ΙΚΕΝ	-
Ламин	ΙΚΕΝ Ι0Β	-
Ламин	ΙΚΕΝ	-
Сус£)	ΙΚΕΝ	-
р751С	ΙΚΕΝ	-
р551С	ΙΚΕΝ	-
мокт	ΙΚΕΝ	-
ТКАгЗ	ΙΚΕΝ '	-
ΝΙΚ	ΙΚΕΝ	-
ΝΙΚ 1-400	ΙΚΕΝ	-
ТКАГ1	ΙΚΕΝ	+++
А20	ΙΚΕΝ	-
ТКАГб	ΙΚΕΝ	-

Открытая рамка считывания кДНК ΙΚΕΝ кодирует белок из 541 аминокислоты. кДНК также содержит короткую 3ΉΤΚ, а также поли(А)(фиг. ЗА и ЗВ).

Было обнаружено, что 5'-домен открытой рамки считывания ΙΚΕΝ (ОРС) содержит область, гомологичную области другого известного белка (ГО: 1173941), клонированного при 2-гибридном скрининге на связывающие белки Кар2 (Енюисгх-Бсгоксу I с1 а1., 1988), а также области других неизвестных белков, обнаруженных в базах данных: два гена человека (ΚΙΑΑ0871, ΚΙΑΑ0842) и один ген С.Е1едаи8 (ГО САА21666).

-28005775

Было обнаружено, что последовательность ΙΒΕΝ содержит пептидную последовательность [ГО8Ь8Ь 326-331], которая также присутствует в домене, состоящем из 51 аминокислоты, от аминокислоты 769 до аминокислоты 820 ΝΙΚ, которая является необходимой для связывания ΙΚΚ-1 с ΝΙΚ в 2гибридном анализе и для активации ΝΡ-кВ путем сверхэкспрессии ΝΙΚ (данные не приводятся).

Пример 2. Дополнительные исследования и функциональные характеристики ΙΒΕΝ.

кДНК ΙΒΕΝ, гибридизованную с эпитопом ГА, экспрессировали в клеточных линиях человеческой почки 293, с использованием вектора на основе рсОНА3, содержащего ОРС ΙΒΕΝ, гибридизованную с эпитопом гемаглютинина (ГА). Затем ΙΒΕΝ подвергали иммунопреципитации с использованием анти-ГА антитела. Клетки трансфецировали гибридным белком IΚΕN-ГА стандартным методом с использованием фосфата кальция (см., например, Сштеп! РгоЮсоК ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν, еб§. Ли8иЬе1, Ρ.Μ. е1 а1.). Клетки культивировали в течение 24 ч в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ), дополнительно содержащей 10% телячью сыворотку. После завершения инкубирования клетки лизировали в буфере для радиоиммунной преципитации (10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 150 мМ ЫаС1, 1% ЫошбеШ Р-40, 1% дезоксихолат, 0,1% ДСН и 1 мМ БОТА; 1 мл/ 5х10⁵ клеток) и лизат предварительно осветляли путем инкубирования с нерелевантной кроличьей антисывороткой и сферами с комплексом белок Ο-сефароза (Рйагтас1а, 8\\^гебеп). Иммунопреципитацию осуществляли путем 1-часового инкубирования, при 4°С, аликвот лизата с моноклональными антителами против ГА (клон 12СА5)(Ε^е1б, б.е! а1., 1988). Экспрессированные белки анализировали на ПААГ-геле с ДСН, а затем с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием анти-ГА антител. Белок, кодируемый геном ΙΒΕΝ, очевидно, представлял собой полосу приблизительно в 60 кДа.

Исследование влияния ΙΒΕΝ на активацию ΝΡ-кВ осуществляли в анализе с использованием репортерного гена. Клетки ΕΒΝΑ 293 котрансфецировали вектором рсННАЛ, содержащим длинные концевые повторы (ЬТК) ВИЧ, связанные с репортерным геном люциферазы вместе либо с плазмидой рсННАЛ, содержащей лишь одну кДНК ΙΒΕΝ, либо с плазмидой рсННАЛ, содержащей кДНК, кодирующую следующие белки: ΙΚΚ-1, полноразмерный ΝΕΜΟ, ΝΕΜΟ с С-концевой делецией, ΝΙΚ, дефицитный по киназе мутант ΝΙΚ (ΝΙΚιηιιΙ), мутант ΙΒΕΝ с С-концевой делецией (ГКВК₁.₁9₇) или мутант ΙΒΕΝ с Νконцевой делецией (Ι^ΕΝ^^).

Трансфекцию осуществляли стандартным методом с использованием фосфата кальция (см., например, Сиггеп! РгоЮсоК ίη Μο1еси1а^ ΒΟ^βν, еб§. АищЬек Ρ.Μ. е1 а1.), как описано выше в разделе Материалы и методы (νίί).

При котрансфекции мышиным ΙΚΚ-1, известным субстратом для ферментативной активности ΝΙΚ (Кедшет С.Н, е1 а1., 1997), было обнаружено, что человеческий ΙΒΕΝ эффективно индуцирует ΝΡ-кВ в клетках 293, как было определено в люциферазном анализе (см. фиг. 10).

Было обнаружено, что ко-трансфекция С-концевого делеционного мутанта ΝΕΜΟ (аминокислоты 1-30 9 СΔNΕΜΟ), который, как сообщалось, способен блокировать ферментативную активность ΙΚΚ (Ко111\\'агГ Ό.Μ., е1 а1., 1998), приводит к ингибированию ΝΡ-кВ, индуцированного котрансфекцией ΙΒΕΝ и ΙΚΚ1 (фиг. 10).

Активность ΝΡ-кВ, индуцированная котрансфекцией ΙΒΕΝ и ΙΚΚ1, была сопоставима с активностью, индуцированной коэкспрессией полноразмерного ΝΕΜΟ и ΙΚΚ1. Кроме того, ΝΕΜΟ был неспособен потенцировать активность ΝΡ-кВ, индуцированную ΙΒΕΝ и ΙΚΚ1 (фиг. 10) .

В отличие от СЛNΕΜΟ, котрансфекция мутанта ΝΙΚ, дефицитного по киназе (ΝΙΚιηιιΙ, аминокислоты (см., одновременно рассматриваемую и принадлежащую нескольким владельцам патентную заявку XVΟ 97/37016, Μа1^η^η е1 а1. 1996), была неспособна блокировать индукцию ΝΡ-кВ посредством котрансфекции ΙΒΕΝ и ΙΚΚ1 (фиг. 10).

ΙΒΕΝ, коэкспрессированный, в отношении 2:1, с ДНК ΝΙΚ, эффективно потенцирует индукцию ΝΡкВ. Коэкспрессия полноразмерного ΝΕΜΟ с ΝΙΚ блокирует активацию ΝΕ-кЕ, индуцируемую ΝΙΚ. Это ингибирование может быть подвергнуто реверсии посредством экспрессии ΙΒΕΝ (фиг. 10). Как было показано ранее (см. одновременно рассматриваемую и принадлежащую нескольким владельцам патентную заявку XVΟ 97/37016, Μа1^η^η е1 а1. 1996), ΝΙΚηπΐ эффективно блокирует ΝΡ-кВ, индуцированный сверхэкспрессией СЭ120а. На этот эффект не влияла коэкспрессия ΙΒΕΝ (фиг. 10).

Суммируя вышепривиденные данные, можно предположить, что ΙΒΕΝ участвует в пути передачи сигналов ΝΡ-кВ, действуя позже ΝΙΚ, но раньше ΝΕΜΟ и ΙΚΚ1, и может быть модулятором взаимодействия между ΝΙΚ и ΙΚΚ1.

Поэтому была высказана гипотеза, что определенный делеционный мутант ΙΒΕΝ может препятствовать передаче сигнала от киназы ΝΙΚ комплексу ΝΕΜΟ-ΙΚΚ. С-концевой делеционный мутант ΚΕΝ^ не оказывает какого-либо воздействия на ΝΙΚ-индуцированную активацию ΝΡ-кВ (данные не приводятся). Однако Ν-концевой делеционный мутант ΙΒΕΝ (ΙΒΕΝΔΝ; ΚΕΝ^^ι) Β значительной степени ингибирует ΝΙΚ-индуцированный ΝΡ-кВ до уровня, сравнимого с уровнем ΝΕΜΟ (фиг. 10).

Пример 3. Киназный анализ.

293-Т-клетки (2х10⁶) трансфецировали плазмидой ρсΕ^Л6 СНиК. (кодирующей мышиный ΙΚΚ1), взятой отдельно или в комбинации с плазмидой ροΝΙΚ, рс20.4 (кодирующей белок ΝΕΜΟ) или рсШ8

- 29 005775

ΙΚΕΝ (кодирующей Ηίδ-меченный ΙΚΕΝ), или с плазмидой ρ^Ιδ-ΙΚΕΝΔΝ (рсН 18-ΙΚΕΝ |_98-54|, кодирующей Ηίδ-меченный Ν-концевой делеционный мутант ΙΚΕΝ, действующий как доминантно-негативный). Через 24 ч после трансфекции клетки собирали, лизировали в буфере для лизиса, содержащем 1% ΝΡ-40, 50 мМ Нерек, рН 7,5, 100 мМ №1С1. 10% глицерин, 1 мМ БОТА, 20 мМ β-глицерофосфата, 20 мМ ΡΝΡΡ, 1мМ №1₃УаО₄, 1 мМ №1Е, 1 мМ Να-метабисульфита, 1 мМ бензамидин, 1 мМ ОТТ, полный набор ингибиторов протеазы (Воейппдег).

Затем клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования. После добавления №1С1 к смеси вплоть до 250 нМ белки подвергали иммунопреципитации с использованием моноклональных антител против ЕБАС, тщательно промывали в промывочном буфере, содержащем буфер для лизиса с 0,1% ΝΡ-40 и 250 мМ №1С1, и элюировали 30 мкл промывочного буфера, содержащего 1 мг/мл пептида ЕБАС. Аликвоты этих элюатов использовали для киназных ίη уйго-реакций с Е.сой-продуцированным СЗТЧкВ в качестве субстрата в присутствии ³²Р-гамма АТР в киназном буфере, содержащем 50 мМ β-глицерофосфата, 2 мМ ОТТ, 20 мМ МдС1₂, 1мМ ЫазУаО₄, 1мМ Ε^ТА/ΕСТА. Реакционные смеси разделяли с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и фосфорилирование белков детектировали после экспонирования с рентгеновской пленкой. В качестве контроля количество белка в лизате определяли с помощью Вестерн-блотанализа с использованием антитела против ЕБАС.

Было обнаружено, что Ν-концевой делеционный мутант ΙΚΕΝ действует как доминантнонегативная молекула и блокирует активность ΙΚΚ1 в киназном анализе в том случае, когда ΙΚΕΝ и ΙΚΚ1 были коэкспрессированы с ΝΕΜΟ.

Сверхэкспрессия ΙΚΚ1 и ΝΕΜΟ, но не одного ΙΚΚ1, индуцирует сильную киназную активность ΙΚΚ1 (как было оценено с помощью аутофосфорилирования и фосфорилирования Е. сой-продуцированного гибридного белка СЗТЧ-кВ). Коэкспрессия ΙΚΕΝι_98-54ι с ΙΚΚ1 и ΝΕΜΟ приводит к значительному снижению активности (фиг. 11), не влияя на уровень экспрессии ΙΚΚ1 и ΝΕΜΟ. Полноразмерный ΙΚΕΝ не обладает таким действием (фиг. 11, средняя дорожка).

Пример 4. Клонирование и секвенирование ΙΚΕΝ-10Β и ΙΚΕΝ-Ε.

Для идентификации вариантов сплайсинга ΙΚΕΝ, фаговую кДНК-библиотеку, происходящую от вышеупомянутой клеточной линии ΜСΕ7, скринировали с использованием первых 600 п.н. ΙΚΕΝ в качестве зонда. Были идентифицированы два независимых клона, которые, очевидно, представляли собой два различных варианта ΙΚΕΝ. Эти два клона, по своим первым 5'-1595 п.н., были идентичны ΙΚΕΝ и имели дополнительные кодирующие последовательности у 3'-конца. Эта область содержит домен РХ, консервативный домен с неизвестной функцией (предположительно домен взаимодействия белок-белок), который также был обнаружен в некоторых передающих сигнал молекулах, включая РВ-киназу. В клоне 10В и в клоне Е указанный домен РХ был фланкирован двумя короткими идентичными областями. Область, расположенная ниже указанных областей, отличается двумя клонами. Сравнение двух вариантов сплайсинга с ΙΚΕΝ проиллюстрировано на фиг. 9.

Предварительное секвенирование 5'-υΕΚ (от начала данной последовательности и вплоть до первого кодона АТС с использованием последовательности Κθζοφ показало, что эти последовательности идентичны в отношении ΙΚΕΝ и изоформ ΙΚΕΝ-10Β и ΙΚΕΝ-Ε.

Область связывания с ТΚАΕ2 картировали для ΙΚΕΝι_98-388, и эта область была идентична для всех трех указанных сплайсированных изоформ (фиг. 9). В соответствии с этим, ΙΚΕΝ-10Β также взаимодействовал с ТΚАΕ2 в анализе с двойным гибридом. Хотя какой-либо самосборки ΙΚΕΝ не наблюдалось, однако ΙΚΕΝ-10Β подвергался самосборке в тесте с двойным гибридом, но при этом он не взаимодействовал с ΙΚΕΝ (табл. ΙΙ).

Делеционный мутант ΙΚΕΝ-10Β, не содержащий домена РХ, но включающий суперспирализованный мотив, который не присутствовал в ΙΚΕΝ, был способен к самосборке. Это указывало на то, что данный суперспирализованный домен ответственен за аутовзаимодействие ΙΚΕΝ 10Β.

Пример 5. Белки, взаимодействующие с ΙΚΕΝ 10Β и ΙΚΕΝ.

Библиотеку В-клеток скринировали на ΙΚΕΝ 10В с использованием дрожжевой двухкомпонентной гибридной системы, описанной выше, для идентификации других белков, взаимодействующих с ΙΚΕΝ 10В. Были идентифицированы три таких белка, которые сильно и специфически взаимодействуют с ΙΚΕΝ 10Β:

1) субъединица ти 1 белка сборки клатрина 2 (АР50, С^АΡΜ1; банк генов, номер доступа υ36188), которая сильно взаимодействует с ΙΚΕΝ 10Β, но лишь слабо взаимодействует с ΙΚΕΝ;

2) ген ЕВ1 или Апийа, который сильно и специфически взаимодействует с ΙΚΕΝ 10В, а также с ΙΚΕΝ. Этот ген был первоначально идентифицирован как последовательность, гибридизованная с геном Е2А в клетках пре-В-лейкоза детей (ВгатЬШакса е1 а1., Ьеикет1а 13(3), 369-375, 1999). Недавно было обнаружено, что он индуцирует апоптоз при сверхэкспрессии. Он локализуется в ядре и участвует в транслокации нейрон-специфического предраннего гена, названного Агс (!г1е е1 а1., ί. Вю1.Сйет. 275, (2000) 2647-2653);

3) ген та АХ, который сильно взаимодействует с ΙΚΕΝ 10В, но очень слабо взаимодействует с ΙΚΕΝ. Этот ген в высокой степени гомологичен ДНК-связывающему белку транслину и может участво

- 30 005775 вать в ядерной локализации транслина Аок! е! а1, ΤΕΒδ Ьей 401, 109-112, 1997).

Исходя из того факта, что ΙΚΕΝ 10В сильно и специфически взаимодействует с вышеуказанными белками, ΙΚΕΝ может быть также активным в регуляции транспорта сигнальных белков, например, ΤΚΑΤ-2.

Пример 6. ΙΚΕΝ 10В сильно взаимодействует с неидентифицированной киназой, фосфорилирующей ΙΚΕΝ 10Β.

ΙΚΕΝ 10В, а также ΙΚΕΝ, гибридизованные с Ν-концевой 6-Н18-меткой, были экспрессированы в клетках 293-Т путем кратковременной трансфекции. Через 24 ч после трансфекции белки очищали посредством иммунопреципитации. Иммунопреципитаты подвергали электрофорезу в ПААГ, и иммуноокрашивание антителами против Ηίδ показал, что оба белка экспрессировались в одинаковой степени. Киназные реакции осуществляли с использованием обоих иммунопреципитатов. Белок ΙΚΕΝ 10В подвергался сильному фосфорилированию, что свидетельствовало о том, что этот белок был ассоциирован с неидентифицированной киназой, субстратом для которой является ΙΚΕΝ 10В. Сам ΙΚΕΝ подвергался лишь слабому фосфорилированию, возможно, под действием неспецифически связанных киназ. Это указывало на то, что вышеупомянутые киназы взаимодействуют с С-концевыми последовательностями ΙΚΕΝ 10В, возможно, с их доменом РХ (фиг. 12).

Пример 7. ΙΚΕΝ, очевидно, является членом генного семейства.

Поиск, проводимый с использованием программы ΒΌΑδΤ, в новом доступном банке генов, содержащем большинство из почти полностью идентифицированных геномных последовательностей человека, выявил, что, по крайней мере, неполные копии гена ΙΚΕΝ, а также наиболее близкородственные его изоформы с 97-98%-ной идентичностью на нуклеотидном уровне присутствуют в нескольких положениях на 5 хромосомах с сохранением структуры экзона. Было обнаружено, что экзоны 4-7 любой из двух изоформ, кодирующих аминокислоты 113-406 (соответствующие нуклеотидам 559-759 последовательностей, представленных на фиг. 3В, 4 и 5 [δΕφ ΙΌ ΝΟ:4, δΕφ ΙΌ ΝΟ:5 и δΕφ ΙΌ ΝΟ:6, соответственно], а значит и ΤΚΛР2-связывающие домены, сохранялись на 4 различных хромосомах, тогда как дополнительные экзоны были обнаружены лишь на одной или двух таких хромосомах. Эти данные показывают, что варианты ΙΚΕΝ экспрессируются в варьирующихся размерах и с различными Ν-и С-концевыми удлинениями в виде молекул, которые регулируют пути ΕΚΑΤΌ или ТΚΛР2-зависимой передачи сигнала (фиг. 13 А).

Оценка банка данных Ε8Τ с использованием ΒΌΑδΤ выявила, что по крайней мере, части ΙΚΕΝ экспрессируются в высококонсервативной форме у мышей и коров. ΕδΤ, соответствующие обеим изоформам гена ΙΚΕΝ, одна из которых описана в данном патенте, а одна найдена в других хромосомных локализациях, упомянутых выше, обнаружены в банке данных ΕδΤ, что свидетельствует о том, что обе эти близкородственные изоформы представляют собой активные гены (фиг. 13В).

Ссылки

1. Αйе1таη е! а1.,(1983) ΌΝΑ2, 183.

2. Α1^-π, Ε.3. е! а1. (1995) 1. Βΐο1. Сйет. 270, 4312-4317.

3. Αι-сй. Κ.Η. е! а1 (1998). Сенек 1)е\. Зер 15;12(18):2821-30.

4. Αι-сй, Κ.Η. апй СВ. ’Гйотрюп (1998) Β. Мо1 Се11 Βΐο1 18, 558-565.

5. Απδπ^1, Τ.Μ. е! а1. ейк., СиггеШ Рго1осок ίη Мо1еси1аг Βίο1ο§γ.

6. Βаеие^1е, Р. Α., анй Ηеηке1, Τ. (1994) Αηηυ Κν Iттиηο1.

7. Βаζаη, 1. Τ. (1993). СиггеШ Βώ^^γ 3, 603-606.

8. Βе^Ье^^сй, Ι., Зйи, С. Ь., анй С1агк, Ε. Α. (1994). 1 Iттиηο1 153, 4357-66.

9. Βеиΐ1е^, Β., авй νаη Нийе1, С. (1994). Заеме 264, 667-8.

10. Β1аηк, V., Κοиπкку, Р., авй Вгае^ Α, (1992). Τγο^8 Β^οсйет. δα 17, 135-40.

11. Βο1й^η, М.Р. е! а1. (1995а) 1. Β^. Сйет. 270,337-341.

12. Βο1й^н. М. Р., Vа^Γο1οтееν. Ε. Ε., Ратет, Ζ., Мей, Ι. Ь, Сатошк, 1. Н., аий ^а11асй, Ό. (1995Ь). 1. Βω! Сйет. 270, 7795-7798.

13. Βο1й^η, М.Р. е! а1. (1996) Се11 85, 803-815.

14. Βο^а Τ1. е! а1. (1998) 1 Βώ1 Сйет. 273, 29445-50.

15. Сао, Ζ. е! а1. (1996а) Ханне 383,443-446.

16. Сао, Ζ. е! а1. (1996Ь) Заетое 271,1128-1131.

17. Сйещ С.1. е! а1. (1992) Αηη. Ν.Υ. Αсай. δοΐ. 660:271-273.

18. Οκη§, С., С1еагу, ΑΛΙ, Υ6, Ζ-δ., Ноад, Ό.Ι., кейет-кт, δ. аий ΒаЙ^тο^е, Ό. (1995) Заеисе 267:1494-1498.

19. Οκη§, С. аий ΒаЙ^тο^е, Ό. (1996) Сенек Оее. 10, 963-973.

20. СЫηηа1уаη, Α. М., Ο'^υ^, Κ., Τе\νа^^. М., авй Όίχίΐ, V. М. (1995) Се11 81, 505-512.

21. СгефШощ Τ.Ε., Рго1еш8 : 81гис1иге авй Мо1еси1аг Ргорегйек, \С.Н. Р^еетаη & Со., δаη Τι-αιαδ^, Са. 1983.

22. Сго81оп, С. Ε., Сао, Ζ., аЫ Соеййе1, Ό. V. (1995). 1 Βώ1 Сйет 270,16514-7.

23. ОЮопнЮ, 1. Α., Мегсипо Τ., аЫ Κίίπη, М. (1995). Мо1 Се11 Βώ1 15, 1302-11.

24. Оискей С.З., Κ.Ψ. Сейпсй, М.С. СШШащ а^ СВ. ^отркою (1997) Мо1 Се11. Βω! 17,1535- 31 005775

1542.

25. ОигГее, Τ. е! а1. (1993) Сепек 1)е\. 7:555-569.

26. Е1е1б, 1. е! а1. (1988) Мо1. Се11 Вю1. 8:2159-2165.

27. Сеукеп, Н.М. (1985) ШтипоЕ Шбау 6, 364-369.

28. Сеукеп, Н.М. е! а1. (1987) 1. ]ттипо1. Ме!к. 102, 259-274.

29. Сйтоге, Τ. Ό., апб Мопп, Р. 1. (1993). Τιόπ6κ Сепе! 9, 427-33.

30. Соккеп, М. апб Вгуагб, М. (1992) ΡΝΑ8 89:5547-5551.

31. Сге11, М., Поит, Ε., ^а_)ап!, Н., Ьокбеп, М., С1аикк, М., Вахетег, В., Сеогдорои1ок, 8., Ьекк1аиег, V., КоШак, С., РЙ7епта1ег, К., апб 8скеипск, Р. (1995). Се11 83, 793-802.

32. СпШ, М, СЫи, 1. 1., апб Ьепагбо, М. 1. (1993). Ш ΚеνСу!о1.

33. Напкк, 8. К., Отпи Α. М, апб Нип!ег, Τ. (1988). 8с1епсе 241, 42-52.

34. Н1Ь1, М., Ьш, Α. 8теа1,Т Мтбеп, Α. апб Капп М.(1993) Сепек & Ое1.7, 2135-2148.

35. Но^агб, Α.Ό. е! а1. (1991) 1. ]ттипо1. 147, 2964-2969.

36. Нки, Н., 8ки, Н.-В., Рап, М.-С., апб Соеббе1, ϋ. V. (1996). Се11 84, 299-308.

37. Нки, Н., Хопд, 1., апб Соеббе1, ϋ. V. (1995). Се11 81, 495-504.

38. Шиба Τ е! а1. (1996а) Ргос №!1 Αсаб 8οΐ υ8Α. 93, 9437-42.

39. Шиба Τ е! а1. (1996Ь) 1 Вю1 Скет. 271, 28745-8.

40. 1апоие1х-Еегокеу Ι е! а1 Биг 1 Вюскет (1998) Маг 1 ;252(2):290-8

41. Капакага.) Р е! а1 (1999) 1 Εχρ Меб 189,1129-38

42. КаиГтапп, 8,Н. (1989) Сапсег ^8. 49, 5870-5878.

43. КаиГтапп, 8.Н. (1993) Сапсег ^к. 53, 3976-3985.

44. Ьа1тапаск-С1гагб, Α. С., Скйек, Τ. С., Рагкег, Ό. С., апб Καύ^ώ, Τ. Ь. (1993). 1 Εχρ Меб 177, 1215-1219.

45. ЬахеЬшк, Υ.Α. е! а1. (1994) Ханне 371,346-347.

46. Ьее, 8.Υ., С.С. Рагк, апб Υ. Ско1, 1996 1. Εχρ. Меб. 183, 669-674.

47. Ьее, 8.Υ., Α. ^ΕΝώ, Α. 8ап!апа, ΙΧ.Α. 8око1, М.С. Nиκκеηζνе^д, апб Υ. СкоЕ (1997) Iттишίу 7, 703-713.

48. Ы Υ е! а1 (1998) Мо1 Се11 ВюЕ 18, 1601-10.

49. Ьш, Α., Α. Мтбеп, Н. Магйпе!!о, Ρ.Χ. С1аге!, С. Ьапде-Сайег, Ρ. Мегсипо, С.Ь. 1окпкоп, апб М. Капп. (1995) 8с1епсе 268, 286-290.

50. Ьщ, Ζ.-С., Нки, Н. Соеббе1 ϋ.ν., апб Капп М.. 1996. Се11 87, 565-576.

51. МакЫта, Τ. е! а1. (1995) Вюскет. Вюркук. Иек. Соттип. 209, 907-915.

52. МсОопа1б, Р. Р., Сакка!е11а, М. Α., Ва1б, Α., Мад§1, Ε., Κотадηаη^, 8.. Сгикк, Н. 1., апб Р17/о1о, С. (1995). Εμ 1 Iттиηо1 25, 2870-6.

53. Мегсипо Ρ апб Мапптд Α1Μ (1999а) Сигг Орт Се11 Вю1. 1999 11, 226-32.

54. Мегсипо Ρ е! а1 (1999Ь) Мо1 Се11 Вю1, 19, 1526-38.

55. Мекктд е! а1., Τ1πγ6 С1е\^ге1апб 8утрокшт оп Масгото1еси1ек апб ЯесотЬтагИ ΌΝΑ, Ε6. Α.

^а1!оп, Αιη^Α-ιΐ!! (1981).

56. Мтбеп, Α., Ьш Α., МсМакоп М., Ьапде-Сайег С, Оегуагб В., Этик Κ.Ε, 1окпкоп, С.Ь. апб. Капп М. 1994. 8с1епсе 266, 1719-1723.

57. Мйкдап, Ο.Ε. е! а1. (1995) ^шоп 15, 385-393.

58. Мок1а1ок, С., ВпкепЬаск, М., Υа1атаηск^1^, Κ., VаηΑ^кба1е, Τ., ^аге, С., апб К1еГГ, Ε. (1995). Се11 80, 389-399.

59. МигаткЫ, 8. е! а1. (1991) Ркагт. ^кетск 8, 649.

60. Νη§η!η, 8. апб Со1к!ет, Р. (1995) 8аепсе 267, 1449-1456.

61. Nакаηо Н (1996) 1 Вю1 Скет. 271, 14661-4.

62. Рагк, Υ.Ο. (1999) Νοίπκ. 398, 533-8.

63. Яеткагб С., 8катооп, В.8куата1аА апб VШ^атκ.^.Τ.1997. ΕМΒО 1. 16, 1080-1092.

64. Κ^» С.Н. (1995) 1 Вю1 Скет. 270,25715-21.

65. Κ^» С.Н., 8опд НУ., Сао X., Соеббе1 ϋ.ν., Сао Ζ., Κоΐке М. (1997) Се11 90, 373-383.

66. Κеηκ^ηд-Εк1, Α., Некк, 8., Ζ^ед1е^-Не^!Ь^оск, Н. V. Ь., Κ^е!ктϋ11е^, С., апб Εηде1таηη, Н. (1995). Е Шатт. 45, 161-174.

67. ^^, М., Рап, М-С, Неп2е1, V. 1., Αу^ек, Τ. М., апб Соеббе1, ϋ. V. (1995Ь). Се11 83, 1243-1252.

68. ^^, М., 8агта, V., ϋίχί!, V. М., апб Соеббе1, ϋ. V. (1995а). 8с1епсе 269, 1424-1427.

69. ^^, М., Уопд 8. С., Неп7е1, V. 1., апб Соеббе1, ϋ. V. (1994). Се11 78, 681-692.

70. ^(йс, М. е! а1. (1996) Ргос. №11. Αсаб. 8сЕ υ.8.Α. 93, 8241-8246.

71. Ро11т;пТ О.М. е! а1. (1998) №1^. 395,297-300.

72. Ноу, Ν., р.Ь. □етегаих, Κ. Τакакакк^, С.8. 8акекеп, апб ЕС. Яееб. (1997). ΕМΒО 1. 16,6914-6925.

73. Κиζ^ска е! а1., (1993) 8с1епсе 260, 487.

74. 8атЬгоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг с1ошпд: а 1аЬога!огу тапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ.

75. 8апо е!. а1., (1992) 8с1епсе 258, 120.

- 32 005775

76. 8апо с1 ай, (1991) ΒίοΙεοΙιηίςιιεκ 9, 1378.

77. 8сйге1Ьег, Е., МайЫак, Р., Мийег, М.М. апб 8сйайпег. XV. (1989), Ыис. Ас1бк Век. 17:6419.

78. 8сйи1г с1 а1., С.Е., Ρπηοίρίεκ οί Ρτοΐείη §1гис1иге, 8рппдег-Уег1ад, Νε\ν Уогк, Ν.Υ. 1798.

79. 81еаб1, Р.В. е! ай (1990) 1. ΒίοΙ. Сйеш. 265, 14526-14528.

80. 8Ы, С.-8. апб ΙΗ. Ксйгй (1997) 1. ΒίοΙ. Сйеш. 272, 32102-32107.

81. 8шйй, С. А., Раггай, Т., апб 6οο6\νίη, В. 6. (1994). Сей 76, 959-962.

82. 8опд, Η.Υ., С.Н. Ведшег, СЛ. Киксйшпд, ϋ.ν. Соеббей апб М. Во1йе. (1997). Ргос. №11 Асаб δει. 9, 9792-9796

83. 81апдег, Β.Ζ. е!ай (1995) Сей 81, 513-523.

84. 8и, В., Е. ΡιοίηΙο. Μ. Ηώί, Т. Ка11ипк1, М. Капп, апб У. Веп-Ыепай. (1994) Се1177, 727-736.

85. ТйотЬепу, Ν.Α. е! а1. (1992) Ма1иге 356, 768-774.

86. ТйотЬепу, Ν.Α. с1 а1. (1994) Вюсйепйкйу 33, 3934-3940.

87. УапбепаЬее1е, Р., Осс1сгсс|. XV., ВеуаеП, В., апбР1егк, XV. (1995). Тгепбк Сей ΒίοΙ. 5, 392-400.

88. УагГо1отсс\. Е. Е., Вокйп, Μ. Р., Сопсйагоу, Т. М., апб ХУаПасй. ϋ. (1996). 1. Ехр. Меб. 183, 12715.

89. УаккаШ. Р. (1992) Апп. Βεν. 1ттипо1. 10, 411-452.

90. Уепа с1 ай, (1987) Мс111. Епгутой 153, 3.

91. \УаИасй, ϋ. (1996) Еиг. СуЮкте Νεΐ. 7, 713-724.

92. ХУапд. Ь. е! ай (1994) Се1178, 739-750.

93. ХУИкк. А.Р. е! ай (1989) Ргос. Иаб. Асаб. 8сй И8А, 86:1603-1607.

94. Уатаока 8 е! ай (1998) Сей. 93, 1231-40.

95. Уей, XV.-С.’.. А. 8йаЫшап, ϋ. δρείκετ, 1. Кгаипик, Р. ВбНа, А. ХУакскат. РЬ. бе 1аРотра, ϋ. Ретск, В. Нит, Ν. Ικεονε, Р. ОйакЫ, М. Во1йе, ϋ.ν. Соеббей апб Т.ХУ. Мак. (1997) 1ттипйу 7, 715-725.

96. 2ассйапа, 8. с1 ай (1991) Еиг. 1. Рйагтасой 203, 353-357.

97. Ζΐιηο. II апбР1ск, Ь. (1993) №11игс 365: 448-451.

Список последовательностей <110> ТеОа ЯезеагсЬ апр ОеуеЗоршелг СО. 1Л0 иаПасЬ, Μν-ίά ма11лтп. м'коЗау

5тпЬа, 1пйгаш!

1еи, 5τβΐ3ίΐ <120> Белок ΙΡΕΝ, его получение и использование <130> 399 <150> 131719 <151> 1999-09-02 <160> 9 <170> Расепххп оегэтоп 3.1 <гю> ι <211> зо <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Синтетическая ДНК-последовательность <400>1 саддатссгс асддстдсад стадсд1дас30 <210> 2 <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <400>2 .ддгсдассга дадссстдтс аддсссасаа сд32

-33 005775

<210>	3
<211»	143
<212>	днк
<213>	Ното 5ар1епа

<400>3 ддхассдадс хсддахссас еадсаасддс сдссадхдхд схддааххсх дсддахдхас 60 ссахасдахд ххссадахас дсхдаахххс даддссасда аддссддсдд сдсддсдсад 120 дсассддссс ддддададдс асе143 <210>4 <211>1782 <212* ДНК <?13> Ното 5артеп5

<400> 4 ахдадеддах	сасадаасаа	хдасаааада	саахххсхдс	Хддадсдасх	дееддахдеа	60
дхдааасадх	дссадахссд	ехххддаддд	адаааддада	ххдссхсдда	ХХссдасадс	120
адддхсассх	дхехдхдхде	ссадхххдаа	дссдхссхдс	адсахддсхх	даададдадХ	130
сдаддаххдд	сасхсасадс	ддсадсдахс	аадсаддсад	едддехххде	садсаааасс	240
дааасададс	ссдхдххсхд	дхасхасдхд	ааддаддхсс	хсаасаадса	сдадсхдсад	300
сдсххсхасх	сссхдсдсса	сахсдссхса	дасдхдддсс	ддддхсдсдс	схддсхдсдс	360
хдхдсссхса	асдаасасхс	ссхддадсдс	хассхдсаса	хдсхссхддс	сдассдсхдс	420
аддсхдадса	ехххххахда	адаехддхех	хххдхдахдд	ахдаадааад	дхссадхахд	480
сххссхасса	хддсадсадд	хсхдаасхсс	ахасхсхххд	сдаххаасах	сдасаасдад	540
дахххдаасд	ддсададхаа	дхххдсхссс	ассдхххсад	ассхсххааа	ддадхсаасд	600
садаасдхда	ссхссххдсх	дааддадхсс	аедсааддад	хдадсадссх	дххеадддад	660
ахсасадссх	ссхсхдссдх	схссахссхс	ахсааассхд	аасаддадас	сдассссхХд	7 20
ссХдХСдгдх	ссаддаахдх	садхдсхдах	дссааахдса	ааааддадсд	даадаадаДД	780
аадааадхда	ссаасахаах	схсахххдах	дахдаддаад	ахдадсадаа	схсхддддас	840
дхдхсхаааа	адасассхдд	ддсаддддад	адсхсададд	асаасгссда	ссдсхссхсх	900
дхсаахахса	хдхссдссхх	хдааадсссс	ххсдддссха	асхссаахдд	аадхсададс	960
адсаасхсаг	ддааааххда	схсссхдхсх	ххдааедддд	адхххдддха	ссадаадехх	1020
дахдхдаааа	дсаХсдахда	хдаадахдхд	дахдаааасд	аадахдаедх	дхахддааас	1080
* хсахсаддаа	ддаадсасад	дддссасхсд	дадхсдсссд	адаадссасх	ддаадддаас	1140

-34005775 асстдссхсс сссадасдса садссдддсх ссдс^даадд хдсхдсасаа хдасхссдас агсстсисс стдссадхдд сдхдддсис хасадсссад еадахдсссс ссхсддаадс «ддадааед ддасаддасс ададдассас дтгстсссдд ахссхддасх хеддхасадх дгддаадсса дсгсгссадд ссасддаадг ссгсгдадса дсссдгтасс ггсгдссгса дсдссададх ссагдасаах тадхдаасхд сдссаддсса схдхддссах дахдаасадд ааддахдадс сддаддадда даасадахса схдедааасс хдсхсдасдд гдадасддад сасхсадссд сдсхссддса ададдхддас ассххдаааа ддааддхддс хдаасаддад дадсддсадд дсахдааддх ссаддсдехд дссадсхахс хххдсхаххх хдхдаддада ххсхаасхсс асдхдадаас сахдсддхдд адааахддад ддадададаа ахссаасадх хссхдахадх схсахххдад схссхддахс садхсхххсс хдаадсхдхд ххтссхсхдд асххххсахд хахдхдадсс. аахаааххдс Шсаши хд <210> 5 <211> 3139

1200

1260

1320

1360

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1782

<212> ДНК
<213> Нота	ί заснепз
<400> 5 ахдадсддат	сасадаасаа	хдасаааада	саахтхсхдс	хддадсдасх	дсхддахдса
дхдааасадх	дссадахссд	схххддаддд	адаааддада	тлдссхсдда	тсссдасадс
адддссассх	дхсхдхдгдс	ссадхххдаа	дссдхссхдс	адсахддсхх	даададдадг
сдаддаигдд	сасхсасадс	ддсадсдахс	аадсаддсад	сдддсхххдс	садсаааасс
дааасададс	ссдхдххсхд	дхасхасдхд	ааддаддхсс	Хсаасаадса	сдадсХдсад
сдсххсхасх	сссхдсдсса	сахсдссхса	дасдгдддсс	ддддхсдсдс	сХддсхдсдс
хдсдсссхса	асдаасасхс	ссхддадсдс	хассхдсаса	хдсхссхддс	сдассдсхдс
аддсгдадса	сххсххахда	адасхддхсх	ХХХдХдаХдд	аХдаадааад	дтссадхахд
ссхссхасса	хддсадсадд	хсхдаасхсс	ахасхсхххд	сд ах на ас ах	сдасаасаад
дахххдаасд	ддсададгаа	дхххдсхссс	ассдхсхсад	ассхсххааа	ддадхсаасд
садаасдхда	ссхсссхдсх	дааддадхсс	асдсааддад	хдадсадссх	дххсадддад
ахсасадссх	ссхсхдссдх	схссахссхс	аХсааассгд	аасаддадас	сдассссхгд
сссдхсдхдх	ссаддаахдх	садхдсхдах	дссааагдса	ааааддадсд	даадаадааа
аадааадхда	ссаасасаах	схсаххтдах	дахдаддаад	ахдадсадаа	стсхддддас
дхдхххаааа	адасассгдд	ддсаддддад	адсхсададд	асаасХссда	ссдсхссхсх
дхсаахахса	хдхссдссхх	хдааадсссс	ххсдддссха	асхссааХдд	аадссададс
адсаасхсах	ддааааххда	ттсссгдгсг	ххдаасдддд	адгххдддха	ссадаадсхх

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

-35 005775

да^дгдаааа	д;агсдагда	гдаадагдтд	дахдаааасд	аадахдаедх	дхагддадас	1080
хсахеаддаа	ддаадсасад	дддесасхсд	дадидсесд	адаадесасх	ддаадддаас	1140
ассхдссхсх	сссадахдса	садсхдддсх	ссдсхдаадд	хдсхдсасаа	тдасхседас	1200
ахссхсххсс	схдхсадхдд	сдхдддсхсс	хасадсссад	садахдсссс	ссхсддаадс	1260
схддадаасд	ддасаддасс	ададдассас	дххсхсссдд	ахссхддасх	хсддхасадх	1320
дгддаадсса	дсхсхссадд	ссасддаадх	ссХсХдадса	дссхдххасс	ххсхдссхса	1380
дхдссададх	ссахдасаах	Тадгдаасгд	сдссаддсса	сгдХддссаХ	дахдаасадд	1440
ааддахдадс	хддаддадда	даасадахса	сХдсдааасс	хдсхсдасдд	Гдадахддад	1500
сасхсадссд	сдсхссддса	ададдхддас	ассххдаааа	ддааддхддс	хдаасаддад	1560
дадсддсадд	дсаСдааддх	ссаддсдсхд	дссададада	асдаддхдсх	сааадхссаа	1620
схдаадааах	ахдхаддадс	Хдхссадахд	схдаааадад	ааддхсааас	адсхдаадхд	1680
ссааахсххх	ддадхдххда	хддадаадхх	асадхадсхд	аасадаадсс	дддадааахх	1740
дсхдаадаас	хсдсаадсхс	схасдааада	аадсхсахсд	аддхддсада	дахдсахддс	1800
дадсхдаххд	адххсаасда	дсдссхдсас	адддсссхдд	хадссаадда	адсссхсдхд	1860
хсссадахда	ддсаддадсх	сахсдахсхс	сддддассдд	ХдссХддада	хххдадхсаа	1920
асдхссдаад	ассададххх	дхсддахсхх	дааахахсаа	ассдддсдсх	дахсаасдхс	1980
хддахсссст	садхдхххсх	ссддддсааа	дсадсааахд	саххссасдх	дхахсаддхс	2040
хасахссдда	хаааадасда	хдаахддаах	ахххагсдсс	ддхахасада	дххсаддадх	2100
ХХдсассаса	адххасаааа	саадхасссх	саадХдаддд	ссхасаасхт	сссасссааа	2160
ааддссаххд	дааасаадда	сдссаадххх	дхддаддаас	ддадааадса	дсхссадаах	2220
хассхдсдса	дсдхсахдаа	сааадхсахс	садахддхсс	ссдадххсдс	хдссадсссс	2280
аадааддада	сссхсахсса	дсГдахдссс	ххсххсдхсд	асахсасесс	дсссддадад	2 340
ссхдхдааса	дссддсссаа	адсадсххсс	сдсгххссса	аасхдхсссд	дддхсадссс	2400
сдддадассс	дсаасдхдда	дссссададс	ддхдассхст	дассхсдаса	ааассдсадс	2460
сасдддсссх	дхдсдхддса	ссадсхдсдх	ссассссадс	сасхдссдсх	ддссссХсас	2520
схсадсдхда	саассасдтс	ссасхддтда	хссхдададс	асасдаххсс	саасадххас	2580
асаасасссс	даххааасха	ахсадхсххс	дадссдсахд	ахассдхдас	ссдададасс	2640
ааддсадсас	схсдсхддад	адасхдддас	асасадхссх	хсхдсхтсхд	дддхсхассс	2700
хдддсгдсаа	дддсХдХХсс	хссассххсс	хахадххсад	ддсхддсадд	аддд*ддес^а	2760
ссаддхсадд	схдддгдсдс	сахддгхдад	аддсаааддх	дахссссхах	ахаддааддх	2820
хсахдсадад	ссадссхсхс	сасхсхххсс	сахдхдддда	схадаахдас	хаххадссхс	2880
ххссхххдсх	ххххааддхх	аххассхддс	схаассхадд	дахддсхддс	^дгддддддд	2940
дддддгдддс	ахддгтссхх	хсасхдсахт	ххссассаас	адхсаххада	сассхддсас	3000
.хд1сасадсх	сасххтхсса	дадддахахх	ссхдхддсхх	хддсааддад	ссаххадхда	3060

-36005775

гдхдсаасхх дадххсадад аасххссссх ассхссесса хддсхддсхх саддааддас садхдсссхс сахадссхд	3120 3139
<210>	6
<211>	2873
<212>	ДНК
<213>	кото зартепх

<400> 6 ахдадсддах	сасадаасаа	хдасаааада	саахххсхдс	хддадсдасх	дсхддахдса	60
дхдааасадх	дссадахссд	схххддаддд	адаааддада	ххдссхсдда	ххссдасадс	120
адддхсассх	дхсхдхдхдс	ссадХХХдаа	дссдхссхдс	адсахддсхх	даададдадх	180
сдаддаххдд	сасхсасадс	ддсадсдаХс	аадсаддсад	сдддсхххдс	садсаааасс	240
дааасададс	ссдхдххсхд	дхасхасдхд	ааддаддхсс	хсаасаадса	сдадсхдсад	300
сдсххсхасх	сссхдсдсса	сахсдссхса	дасдхдддсс	ддддхсдсдс	схддсхдсдс	360
хдхдсссхса	асдаасасхс	ссхддадсдс	Хассхдсаса	хдсхссхддс	сдассдсХдс	420
аддсхдадса	схххххахда	адасхддхсх	хххдхдахдд	ахдаадааад	дхссадГаХд	480
сххссхасса	хддсадсадд	хсхдаасхсс	ахасхсхххд	сдаххаасах	сдасаасаад	540
дахххдаасд	ддсададхаа	дхххдсхссс	ассдхххсад	ассхсххааа	ддадхсаасд	600
садаасдхда	ссхссххдсх	дааддадхсс	асдсааддад	хдадсадссх	дххсадддад	660
ассасадссх	ссхсхдссдх	схссахссхс	ахсааассхд	аасаддадас	сдассссххд	720
ссхдхсдхдх	ссаддаатдх	садхдсхдах	дссааахдса	ааааддадсд	даадаадааа	780
аадааадхда	ссаасахаах	схсахххдах	дахдаддаад	ахдадсадаа	схсхддддас	840
дхдхххаааа	адасассхдд	ддсаддддад	адсхсададд	асаасхссда	ссдсхссхсх	900
дссаахахса	хдхссдссхх	хдааадсссс	ххсдддссха	асхссаахдд	аадхсададс	960
адсаасхсах	ддааааххда	ххсссхдхсх	ххдаасдддд	адхххдддха	ссадаадсхх	1020
дахдхдаааа	дсахсдахда	хдаадахдхд	даХдаааасд	аадахдасдх	дхахддааас	1080
хсахсаддаа	ддаадсасад	дддссасхсд	дадхсдсссд	адаадссасх	ддаадддаас	1140
ассхдссхсх	сссадахдса	садсхдддсх	ссдсхдаадд	хдсхдсасаа	хдасхссдас	1200
ахссхсххсс	схдхсадхдд	сдхдддсхсс	хасадсссад	садахдсссс	ссхсддаадс	1260
схддадаасд	ддасаддасс	ададдассас	дххсхсссдд	ахссхддасх	хсддхасадх	1320
дхддаадсса	дсхсхссадд	ссасддаадх	ссхсхдадса	дссхдххасс	ххсхдссхса	1380
дХдссададх	ссахдасаах	хадхдаасхд	сдссаддсса	схдхддссах	дахдаасадд	1440
ааддахдадс	^ддаддадда	даасадахса	схдсдааасс	хдсхсдасдд	хдадаХддад	1500
сасХсадссд	сдсхссддса	ададдхддас	ассххдаааа	ддааддхддс	хдаасаддад	1560

-37005775

дадсддсадд	дсахдааддх	сеаддсдсхд	дссададада	аедаддхдех	сааадхссаа	1620
схдаадааах	ахдтаддадс	хдхссадахд	сгдаааадад	ааддхсааас	адсхдаадхд	1680
ссааахсххх	ддадгдттда	гддадаадхх	асадхадсхд	аасадаадсс	дддадааахх	1740
дсХдаадаас	гсдсаадсхс	стасдааада	аадсхсахсд	аддгддсада	дахдсахддс	1800
дадсхдахгд	адХХсаасда	дсдссхдсас	адддсссгдд	гадссаадда	адсссхсдгд	1860
хсссадахда	ддсаддадст	сахсдахсхс	сддддассдд	хдссхддада	хгхдадгсаа	1920
асдхссдаад	ассададххг	дхсддахххх	дааахагсаа	ассдддсдсг	дагсаасдхс	1980
хддахссссх	садхдхххсх	ссддддсааа	дсадсааахд	сагхссасдх	дхахсаддхс	2040
хасахссдда	хаааадасда	хдаахддаах	ахххахсдсс	ддхагасада	дххсаддадх	2100
ггдсассаса	адхгасаааа	саадХасссг	саадхдаддд	ссхасаасхх	сссасссааа	2160
ааддссаххд	дааасаадда	хдссаадххг	дхддаддаас	ддадааадса	дсхссадаах	2220
хассхдсдса	дсдхсахдаа	сааадтсахс	садахддхсс	ссдадххсдс	Хдссадсссс	2280
аадааддада	сссхсахсса	дсгдахдссс	ггсгхсдхсд	асхддахсхс	ас«дххгдд	2340
ааагддссдс	дагадххсас	дхдаддадхх	схсахссхсх	хадсддсахс	сссахддссс	2400
адддХдсасд	ддддаагхад	ссхсхсдсдд	адхсахсасд	сахсдасгда	аххсссхддх	2460
даааастдад	гхадссадхг	дххссхаада	гасхссхдах	дсХдададгд	л'' Хдадсаддад	2520
дсдсхдсссс	ахссдсаадх	садтдхсссс	сасссссгдс	ддддхссаса	дсссаддсаг	2580
сгссддхсса	дгдгггссса	аасаггсдсд	гдссдааххд	хааааадхдс	асдххаагдс	2640
дадссХдхсд	дхдгдасахд	ааХСХсадсс	агдсХддггд	ссагсадгса	дсасддадад	2700
адааасссхх	Хдхдсссаах	хадсасдсад	аасадаасас	адддХХсдаг	ххахддасхх	2760
ХХсаааасда	даахххсадх	дддадасхдг	ддсааахдас	асадхдххда	сасхддаагх	2820
ггдасхасаг	дгсддХсХад	адсддссдсс	ассдсддгдд	адсхссаагх	сдх	2873

<210>7 <211>541 <212> рят <213> ното 5ар1еп5 <400>7

МеГ 1

5ег

С1у

5ег

01 п 5

А5П

А5Р

ЕУ5

лгд 10

С1п

РЬе

1еи

сеи

С1и 15

Дгд

ьеи

[.ей

А5Р

А1а

νβΊ

1У5

С1п

Су 5

С1п

11е

лгд

РЬе

С1 у

С1у

лгд

суэ

20

25

30

С1и

Не

А1а

5ег

Акр

5ег

А5Р

5ег

дгд

уа!

ТЬг

Суз

цеи

Суз

А1а

01 η

35

40

45

-38005775

ΡΐΊβ

61 и

а] а

уа!

ьеи

61 п

ΗΪ 5

61 у

Ь$и

Ьуз

Агд Зег

Агд

61 у

Ьеи

А1а

50

55

6?

Ьеи

ТЙГ

А1а

Не

иуэ

61л

д1а

А1а

б1у Рйе

А1 а

Зег

ьу*

ТЙГ

65

70

75

80

б1и

ТЙГ

61 и

Рго

Уа1

рке

тгр

Туг

уа1

Суз б1и

уа!

ьеи

АЗП

Ьуз

85

90

95

Ηΐ 5

С1и

Ьеи

61η 100

Агд

рке

Туг

Зег

ьеи 105

дгд

нт$ 11 е

А1а

Зег 110

АЗР

Уа1

С1у

дгд

С1у

Дгд

А1а

Тгр

ьеи

дгд

Суз

д1а

Ьеи Азл

б1и

НТ 5

Зег

ьеи

115

120

125

01и

дгд

Туг

ьеи

НТ 5

мег

Ьеи

ьеи

д!а

АЗр

Агд суз

Агд

ьеи

Зег

ТЙГ

130

135

140

Рйе

Туг

С1и

АЗр

Тгр

Зег

РЪе

Уа1

Мех

АЗр

б!и б1и

Агд

Зег

5ег

мех

145

150

155

160

Рви

РГ0

ТНг

мег

А1а

д1а

«1у

ьеи

А5П

Зег

11е ьеи

РНе

А1а

Не

А5П

165

170

175

Не

Аар

дал

ЬУ5 180

Аар

ьеи

Аап

61у

С1п 185

Зег

Ьуз РНе

А1а

Рго 190

тНг

Уа!

5ег

дар

Ьеи

ьеи

ьуз

61и

Зег

ТЙГ

61п

АЗЛ

Уа1 тйг

Зег

ьеи

Ьеи

Ьуз

195

200

205

с! и

зег

тНг

61л

С1у

νβΐ

Зег

ьеи

рКе

Агд 61 и

11е

ТЙГ

д!а

зег

210

215

220

Зег

А1а

Уа1

Зег

Не

ьеи

Не

ЬуЗ

Рго

61 и

61 η 61 и

ТЬг

АЗР

Рго

Ьеи

225

230

235

240

РГО

νβΐ

Уа1

Зег

Агд 245

А5П

Уа!

Зег

А1а

Аар 250

А1а ьуз

Суз

ьуа

Ьуз 255

61 и

дгд

ЬУ5

ьуз

Уа1

Тйг

АЗП

Не

Не Зег

Р(те

АЗр

01и

260

265

270

61 и

А5р

С1и 275

61 η

Лап

Зег

61 у

Аар 280

Уа!

РИе

Ьу5 Ьу$

У ТЙг 285

Рго

61у

А1а

61у

С1и

Зег

61 и

Аар

АЗП

Зег

АЗр

дгд

Зег зег

Уа1

АЗП

Не

мех

290

295

300

бег

А1а

РНе

61 и

Зег

Рго

РЬе

61 у

рго

Азл

Зег Азп

61 у

Зег

61 л

Зег

305

310

315

320

-39005775

5ег

АЗЛ

5ег

трр

ЬУ5

И е

А5р

5ег

ьеи

5ег

кеи

АЗО

61 у

б!и

РЬе

61У

325

330

335

Туг

СЗ г»

куз

ьеи

АЗр

Уа1

ьуз

5ег

11 е

А$Р

АЗр

61 и

Азр

уа!

Азр

61ц

340

345

350

АЗЛ

61 и

АЗр

АЗР

Уа1

Туг

61 у

АЗП

Зег

61 у

Агд

ЬУ5

НТ 5

Агд

61у

355

360

365

НТ 5

Зег

С1и

$ег

Рго

61 и

ьуз

рге

Ьеи

61 и

61у

Азп

ТЬг

Суз

Ьеи

Зег

370

375

380

61п

мег

Ηί 5

5ег

Тгр

А1а

РГ0

Ьеи

ЬУ5

Уа1

ьеи

Нт 5

АЗП

АЗр

5ег

АЗр

385

390

395

400

Не

ьеи

РЬе

РГО

Уа1

Зег

61у

Уа1

61 у

Зег

Туг

5ег

Рго

А1а

Азр

А1а

405

410

415

РГО

ьеи

61 у

Зег

ьеи

6)и

А5П

61 у

ТЙГ

61у

Рго

61 и

АЗР

ΗΊ 5

Уа1

Ьеи

420

425

430

Рго

Азр

Рго

61у

ьеи

Агд

Туг

5ег

Уа1

61 и

А)а

Зег

рго

б1у

НТ 5

435

440

445

61 у

5ег

Рго

1еи

Зег

ьеи

РГО

Зег

А1а

Зег

νβΐ

Рго

61 и

Зег

450

455

460

мег

ТЫ

Не

Зег

61и

Ьеи

дгд

61 η

л1а

ТЫ

Уа1

А1а

ме-с

меь

Азп

Агд

465

470

475

480

ЬУ5

АЗр

61 и

ьеи

б1и

С1и

61 и

АЗП

Агд

Зег

ьеи

Агд

АЗП

ьеи

АЗр

485

490

495

61 у

61и

мег

б1и

НТЗ

Зег

А1 а

А1а

ьеи

Агд

61л

61и

уа1

АЗр

ТЬг

ьеи

500

505

510

ЬуЗ

дгд

ьуз

уа!

А1а

61и

51л

61 и

61и

Агд

61п

б!у

меь

Ьуз

Уа1

61п

515

520

525

д!а

Ьеи 530

αΊ а

5ег

Туг

Ьеи

СУЗ 535

Туг

рйе

Уа1

Агд

дгд 540

РЬе

<210>	8
<211>	813
<212>	РКТ
<213>	Ното

-40005775 <400> 8

мег 1

бег

61 у

бег

61п 5

АЗП

АЗП АЗР ЬуЗ

Агд 61 η РЬе ьеи ьеи С1и

Агд

10

15

ьеи

А5р

А1 а

Уа1

Ьу5

61 л

СУб

61 η

Не

Агд

₽Не

01 у

61у

Агд

ьуз

20

25

30

С1и

Ле

А1 а

бе?

А5р

бег

Αδρ

бег

Агд

Уа1

тНг

Суз

Ьеи

Суз

А1а

61 п

35

40

45

рИе

61 и

А1а

Уа1

ьеи

61 и

Н15

61у

ьеи

ЬУ5

Агд

бег

дгд

б!у

ьеи

Д1а

50

55

60

ьеи

ТЬр

А1а

Не

ЬУ5

6ΐη

А1а

«1а

61 у

РЬе

А1а

бе?

ьуз

ТЬг

65

70

75

80

61 и

ТЬг

61и

РГО

Уа1 85

₽Ье

Тгр

тур

Уа1 90

Ьуз

С1и

Уа!

Ьеи

АЗП 95

ЬУЗ

ΜΪ5

61и

ьеи

6ΐη

Агд

РЬе

тур

бет

Ьеи

Агд

Юз

Не

А1а

бег

Азр

Уа1

1оо

105

110

61 у

Ард

61У

Ард

Д1а

Тгр

ьеи

Агд

еуз

А1а

ьеи

АЗП

61 и

Ю з

бег

ьеи

115

120

125

61 и

Агд

Туг

ьеи

ΗΊ5

мех

ьеи

А1а

АЗР

Ард

суз

Агд

ьеи

бег

ТЬг

130

135

140

РЬе

Тур

61 и

АЗр

тгр

бег

₽ье

уа1

мег

А5Р

б1и

61ц

Агд

бег

мег

145

150

155

160

Ьец

Рго

ТЬг

мек

А1а

А1 а

61 у

ьеи

АЗП

бег

Не

ьеи

РЬе

А1а

Не

АЗП

165

170

175

Ле

АЗр

А$И

ьуз

А5Р

ьеи

АЗП

61 у

б1п

бег

ьуз

РЬе

А1а

Рго

тЬг

ν$1

180

185

190

5ег

АЗр

ьеи

Ьеи

ьуз

61 и

бег

ТЬг

61 η

АЗП

Уа1

ТЬг

бег

Ьеи

ьуз

195

200

205

б1и

бег

ТЬр

61а

61 у

Уа1

5йр

бег

ьеи

РЬе

Агд

б1и

Не

ТЬг

51а

бег

210

215

220

5вг

А1 а

уа1

бег

Ле

Ьеи

Не

ьуз

₽РО

61 и

61 й

61 и

тЬг

Азр

РГО

ьеи

225

250

235

240

Рпр

уа!

уа1

бег

Агд

АЗП

¥а!

бег

А1а

АЗР

А1а

ьуз

Суз

ЬУЗ

61 и

245

250

255

Агд

куб

ЬУ6

!·«

ЬУЗ

ьуз

Уа!

ТЬг

АЗП

Не

бег

РЬе

А5Р

АЗР

б1и

260 265 270

-41 005775

61 и

АЗр

61и

61 η

АЗП

зег

61 у

Азр

Уа1

₽Ье

куб

куз

ТЬг

РГО

61у

А1а

275

280

285

С1 у

61ц

Зег

61 и

Азр

АЗП

Зег

Азр

Агд

зег

Зег

уа1

А5П

Не

мех

290

295

300

5ег

А1 а

РЬе

61 и

зег

РГО

РЬе

61 у

рго

Азп

зег

АЗП

б1у

Зег

61 п

зег

305

310

315

320

Зег

АЗП

Зег

Тгр

ку5

Не

АЗр

5ег

кеи

5ег

кеи

АЗП

61у

61 и

РЬе

61у

325

330

335

туг

61 η

куз

кеи

АЗр

Уа1

куз

Зег

И е

Азр

61 и

АЗр

Уа1

Азр

61 и

340

345

350

АЗП

61 и

АЗР 355

Азр

Уа1

туг

61 у

А5П 360

Зег

61у

Агд

куз 365

Н1 5

Агд

61у

Н1 5

5ег

61 и

Зег

Рго

61 и

куб

РГО

кеи

61 и

61 у

АЗП

ТЬг

Суз

кеи

Зег

370

375

380

61 η

мет

ΗΊ5

Зег

Тгр

А1а

₽го

кеи

куб

Уа1

кеи

ΗΊ 5

АЗП

АЗР

Зег

А5Р

385

390

395

400

11е

кеи

РЬе

Рго

Уа1

зег

61у

уа!

61у

Зег

Туг

Зег

рго

А1а

Азр

А1а

405

410

415

РГО

ьеи

61 у

Зег

кеи

61 и

АЗП

61 у

ТЬг

61у

Рго

61 и

АЗр

ΗΪ5

Уа1

кеи

420

425

430

Рго

Азр

Рго

61 у

кеи

Агд

Туг

Зег

Уа1

61 и

А1а

Зег

рго

61 у

ΗΊ5

435

440

445

61у

Зег

Рго

кеи

Зег

кеи

Рго

Зег

А1а

Зег

7а1

Рго

61 и

5ег

450

455

460

мег

ТЬг

11 е

5ег

61и

кеи

Агд

61 п

А1а

ТЬг

ν»1

А1а

мех

АЗП

Агд

465

470

475

480

куб

А$р

61и

кеи

61 и

АЗП

Агд

Зег

кеи

Агд

АЗН

кеи

Азр

485

490

495

61 у

61 и

мех

61 и

ΗΪ5

5ег

А1а

кеи

Агд

61 η

61 и

νβΐ

АЗр

ТЬг

кеи

500

505

510

кУЗ

Агд

кУ5

ν»Ί

А1а

б1и

61 п

61 и

Агд

61 η

61у

мех

иу«

Уа1

61 η

515

520

525

А1а

кеи

А1а

Агд

61 и

АЗП

61 и

Уа1

кеи

1У5

Уа1

61 η

кеи

кУб

куб

Туг

530 535 540

- 42 005775

ν$1

61 у

А1а

уа!

61л

мех

ьеи

ьуз

Агд

61υ

О1у

61 η

ТЬг

41а

61 и

Уа1

545

550

555

560

Рго

АЗП

цеи

тгр

5« Г

Уа1

АЗР

61 у

б1и

Уа1

ТЬг

ν&1

А1а

61 и

61п

ьуз

565

570

575

РГО

61 у

б1и

11е 580

А1а

б!и

<51 и

ьеи

А1а 585

5ег

туг

51 и

Агд 590

ьуз

ьеи

Не

С1ц

уа1

А1д

б1и

мег

ΗΊ5

61 у

61ц

Ьеи

Не

61 и

РЬе

Азп

С1и

Агд

595

600

605

йен

ΗΊ 5

Агд

А1а

ьеи

Уа1

а 1а

ьуз

51и

А1а

ьеи

уа!

бег

61 л

мет

Агд

610

615

620

61 η

С1и

Юн

11 е

А5Р

ьеи

Агд

01 у

Рго

уа!

Рго

с1у

Азр

ьеи

бег

61 η

625

630

635

640

ТЬг

$ег

61и

Азр

δ1Π

5ег

Ьеи

бег

А5Р

РЬе

61 и

Не

5ег

Азп

Агд

А1а

645

650

655

ьеи

Не

АЗП

Уа1

Тгр

Не

РРО

5ег

ν&1

РЬе

ьеи

Агд

61 у

Ьу5

А1а

660

665

670

АЗЛ

А1а

РЬе 675

Нзз

уа!

Туг

?1п

УЭ1 680

туг

Не

Агд

11е

ьуз 685

А5р

Азр

61 и

Тгр

А5П 690

11е

Туг

Агд

дгд

туг 695

ТЬг

б!и

РЬе

Агд

5ег 700

ьеи

ΗΪ 5

ΗΪ5

ьуз

ьеи

61 η

АЗП

Ьуз

Туг

Рго

С1п

уа!

дгд

А1а

Туг

А5П

рЬе

Рго

ьуз

705

710

715

720

ьуз

А1а

Не

е1у

АЗП 725

ЬУЗ

А5р

А1а

Ьуз

₽Ье 730

Уа1

61и

б1и

Агд

дгд 735

ьуз

61 п

ьеи

61 л

АЗЛ

туг

ьеи

Агд

5ег

уа1

мет

Азп

ьуз

ν$1

Не

61 п

мет

740

745

750

7а1

₽го

61 и

РЬе

А1а

$ег

₽рд

ьуз

61 и

ТЬг

ьеи

Не

61 η

ьеи

755

760

765

мет

РГ0

рне

РЬе

νβΐ

АЗР

Не

тИг

Рго

РГО

61У

61 и

РГО

Уа1

АЗЛ

5е?

770

775

780

дгд

РГО

иу5

А1а

5ег

Агд

₽Ие

Рго

Ьуз

ьеи

5ег

дгд

61 у

61 я

РГО

785

790

795

800

Агд

61 и

ТЬг

дгд

АЗГ)

Уа1

е!и

РГО

61 я

Зег

61 у

Азр

ьеи

805

810

-43 005775

<210>	9
<2}1>	784
<212>	Р8Т
<213>	Ното
<400>	9

Мех 1

5ег

С1у ?§г

61а АЗЛ АЗП 5'

А5Р 1У5

Агд 10

61И

₽Ье

кем

Кеи

с1и 15

Агд

ΧβΙ>

хеи

АЗР

4¼ 20

ν51

ХУЗ

61 η

€У5

61 п 25

Не

Ард

е!те

С1 у

01у 30

Агд

КУЗ

61υ

Не

А1а 35

бег

АЗр

бег

А5р

5вР 4р

Агд

уа1

ТЙГ

СУЗ

иеи 45

Суз

А1а

61 η

Рйе

<51 и

А14

иа!

Цеи

61п

НТ 5

61 у

хеи

Цуа

Агд

бег

Ард

61 у

Кеи

А1а

50

55

60

Цеи

Тйп

А1а

Не

Куз

61 п

А1 а

А1а

61 у

Рйе

А1 а

бег

ХУ⁵

ТЙР

65

70

75

80

61 и

ТИ г

61 и

ВРР

уа1

Рйе

Тгр

Туг

туг

Уа1

хуз

61Ц

уа!

хеи

Д5П

хуз

85

90

95

НТ 5

61 и

цец

61 η

Агд

вйе

Туг

хер

Апд

Нт 5

Не

Д1а

бег

Азр

Уа1

100

105

110

61 у

Агд

61 у

Агд

А1$

Трр

Х£У

Агд

суз

А1а

Хеи

А5П

б!и

Ηί$

бег

хец

115

120

125

<31 и

Ард

Тур

кец

Ы1 Б

мех

Кеи

|_еи

А1а

А5Р

дрд

еуз

Агд

Кеи

бег

ТЙР

130

135

140

₽Ье

Туг

61ц

АЗр

ТР₽

5ег

Рйе

У$1

мех

АЗР

61 и

Агд

бег

мех

145

150

155

160

Хеи

Ргр

ТЙГ

мех

41а

А1а

61 у

Хеи

АЗ η

§ег

Не

Кеи

р(те

А1а

Не

АЗ η

165

170

175

Не

АЗР

А$П

ХуЗ

А£Р

и во

азв

61 у

б1в

5ер

КУЗ

₽Ье

А1а

₽Рр

ТНг

ν*Ί

180

185

190

бег

АЗр

К£и

Кеи

ХУ*

£51Ц

Τί,Γ

61п

45 В

V?!

ТЬг

бег

кем

хеи

цу?

195

200

205

61 и

бег

ТЙГ

61 в

61 у ν$1

бег

кеи

РЙв

Агд

61и

Не

ТЙГ

а1 а

бе?

210

215

220

-44005775

зег

А1«

Уа1

Зег

11е

ьеи

Не

куз

₽ГО

61 и

61 п

61и

ТЙГ

Азр

Рго

Ьеи

225

230

235

240

Рго

Уа1

иа1

Агд

АЗП

Уа1

Зег

А1а

Азр

А1а

кУ5

СУ 5

куз

ьуз

61 и

?45

250

255

Агд

ЬУЗ

ьуз

кУЗ

иуз

Ьуз

удЗ

ТЬг

Азп

11е

Не

Зег

РЬе

Азр

АЗр

61и

?6Р

265

270

61 и

Азр

С1и

61 η

А5П

§е?

£1у

АЗр

Уа1

РЬе

Еуз

ьуз

тЬг

РГО

С1у

А1а

275

?80

2§5

С1у

С1и

Зег

$ег

61 и

А5₽

АЗП

Зег

АЗР

Агд

Зег

Уа1

А§п

11 е

мех

290

295

300

Зег

А1а

РЬе

61 и

зег

Рго

РЬе

61 у

Рго

Азп

Зег

Азп

С1у

Зег

С1п

Зег

305

310

3X5

320

Зег

А5П

Зег

Тгр

кУЗ

Не

АЗР

зег

ьеи

Зег

Ьеи

АЗП

61 у

61и

₽Ке

61 у

325

Ззо

335

Туг

61 п

Ьуз

Ьеи

АЗР

иа!

иуз

Зег

Не

Азр

61ц

Азр

Уа1

АЗР

61 и

340

345

350

АЗП

61 и

А5Р

АЗР

Уа1

Туг

01у

Азп

5ег

Зег

61у

Агд

Ьуз

НТ 5

Агд

61 у

355

360

365

Нт 5

Зег

61 и

бег

ЙГр

б1 и

ЬуЗ

Рго

ьеи

61 и

61у

Азп

ТЫ

Суз

ьеи

Зег

370

375

3§0

61 п

Мех

НТ 5

Зег

Тгр

А1а

его

ьеи

ьуз

Уа1

ьеи

ΗΊ 5

АЗП

АЗР

зег

Азр

385

390

395

400

Пе

ьец

рьр

ЯРО

¥Д1

Зег

01у

Уа1

61 у

Зег

туг

5ег

Рго

А1а

АЗр

А1а

405

410

4X5

Рго

ьеи

61у

Зег

Ьеи

¢1 и

Азп

61 у

ТЬг

61У

Вго

61 и

АЗР

ΗΪ3

иа!

ьеи

420

425

430

₽РО

АЗр

Рго

61 у

ьеи

Агд

Туг

59?

61 и

А1а

Зег

зет

Рго

61У

НТ 5

4?5

440

445

«Ну

Зег

В Г©

Ьеи

5«г

5ы

ьеи

Ьеи

рго

Зег

А1а

5ег

Уа1

вро

61 и

Зег

455

460

мет

ТЬг

зп?

61У

Ьеи

Агд

АН

ТЬг

уа!

А1а

мех

ме$

АЗП

Ард

465

470

475

480

ЦУЗ

АЗР

<51 μ

кем

01м

сНи

АЗА

Апд

Зег

Ьеи

Агд

Азп

кеи

ьеи

АЗР

485

490

495

-45 005775

01 у

61 и мех

61 и 500

ΗΊ5

Зег

А1а

Ьеи 505

Агд

610 61 и Уа1

АЗР 510

ТЬг

ьеи

иуз

Агд

ьуз

Уа1

А1а

61 и

61п

61 и

Агд

61 η

61 у

мет

Ьу5

ν&1

61 п

515

529

5?5

д!а

ьеи

А1а

Агд

61 и

Азп

61 и

Уа1

ьем

ьуз

Ма1

61п

цем

ьуз

СУ?

туг

530

535

540

уа!

61у

а! а

УД1

61 п

мет

ьеи

ьу$

Агд

сПи

61у

61П

Ткг

А1а

61 и

Уа1

545

550

555

560

Рго

АЗП

ьеи

Тгр

бег

Уа1

Азр

61 у

61 и

Уа!

Ткг

Уа!

А1а

61 и

61 п

ьуз

565

570

575

Рго

61 у

61 и

Не

а! а

с1и

61 и

ьеи

а!д

5ег

Зег

Тур

61и

Агд

ьуз

ьеи

580

585

590

Не

61 и

уа!

А1а

61 и

мег

Ηί з

61 у

61 и

ьеи

Не

61и

рИе

А5Л

61 и

Агд

595

600

605

ьеи

Н15 610

Агд

А1а

ьеи

Уа1

А1а 615

ЬУ5

61 и

А1а

кем

Уа1 620

Зег

61 п

мет

Агд

61 п

01и

ьеи

Не

Азр

ьеи

Агд

61 у

Рго

Уа1

Рго

01 у

А$р

Ьеи

5ег

61п

625

630

635

640

ТВ г

бег

61 и

АЗр

61л

Зег

Ьеи

бег

АЗр

₽Ме

61 и

Не

Зег

А2П

Агд

А1а

645

650

655

ьеи

Не

А5П

Уа1

Тгр

Не

РГО

5е?

Уа1

рИе

Ьеи

Агд

61 у

ьуз

А1а

а! а

660

665

670

АЗП

А1а

Рке

Н1 5

Уа1

туг

61п

У31

тур

Не

АРд

Не

ьуз

АЗР

61 и

675

680

685

Тгр

А5П

Не

Туг

Агд

дгд

Тур

тКг

61 и

рНе

Агд

Зег

ьеи

Н1 3

Ηΐ$

ьуз

690

695

700

Ьеи

61 п

АЗП

ьуз

туг

РГО

61 η

уа!

Агд

д1а

Туг

АЗП

₽ке

Рго

(?го

ьуз

705

7X0

715

720

Ьу$

д1а

Не

(Ну

АЗП

1У5

АЗр

А1а

1.У5

Уа1

61 и

,* 61ц

Агд

ьуз

725

730

735

61П

ьеи

61 и

туг

ьеи

Агд

5«р

¥Д1

мет

Азп

ьуз

Уа1

Не

61п

мет

740

745

750

уа!

₽РР

61 и

РИе

А1а

Д1а

5ер

ΡΡΘ

ьуз

ЬуЗ

61 и

ткг

ьеи

Не

б1п

иеи

755

760

765

мег

рго

рНе

еке

Уа1

АЗр

тгр

Не

Зег

Ьеи

уа!

Тгр

Ьу5

Тгр

Рго

Агд

770

775

7β9

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. ДНК-последовательность, кодирующая белок, способный связываться с ΤΚΑΤ, выбранная из группы, состоящей из

a) кДНК-последовательности, обозначенной здесь ΙΚΕΝ (регулятор белка семейства ΙκΕ), включающей нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 3;

b) кДНК-последовательности, обозначенной здесь ΙΚΕΝ-10Β, включающей нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 4;

c) кДНК-последовательности, обозначенной здесь ΙΚΕΝ-Ε, включающей нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 5;

й) кДНК последовательности, кодирующей белок, способный связываться с ΤΚΑΤ, включающий до 10 изменений в аминокислотной последовательности, кодируемой кДНК-последовательностью (а)-(с);

е) ДНК-последовательности, которая является вырожденной в результате вырожденности генетического кода ДНК-последовательностей, определенных в (а)-(й).
2. ДНК-последовательность по п.1, выбранная из кДНК-последовательностей, обозначенных здесь ΙΚΕΝ, ΙΚΕΝ 10Β и ΙΚΕΝ-Е.
3. ДНК-последовательность по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный белок модулирует активность ΝΤ-κΒ.
4. ДНК-последовательность по любому из предшествующих пунктов, включающая ДНКпоследовательность, кодирующую белок ΙΚΕΝ.
5. ДНК-последовательность, включающая нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 3В, кодирующая белок ΙΚΕΝ или аналог, включающий до 10 изменений в аминокислотной последовательности, при этом указанный ΙΚΕΝ или его аналог способны связываться с ΤΚΑΤ2 и модулировать активность ΝΤ-κΒ.
6. ДНК-последовательность по п.5, отличающаяся тем, что является вырожденной в результате вырожденности генетического кода.
7. ДНК-последовательность по п.5 или 6, кодирующая белок ΙΚΕΝ с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 6.
8. Вектор, включающий ДНК-последовательность по любому из пп.1-7.
9. Вектор по п.8, способный экспрессироваться в эукариотической клетке-хозяине.
10. Вектор по п.8, способный экспрессироваться в прокариотической клетке-хозяине.
11. Трансформированная эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по любому из п.8-10.
12. Белок ΙΚΕΝ, кодируемый ДНК-последовательностью по любому из п.1-7.
13. Белок по п.12, отличающийся тем, что указанный белок кодируется вышеуказанным клоном 10В.
14. Белок по п.13, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 6.
15. Способ продуцирования белка по п.12 или 13, включающий выращивание трансформированной клетки-хозяина по п.11 в условиях, подходящих для экспрессии указанного белка, осуществление посттрансляционной модификации, если это необходимо, для получения указанного белка и выделение указанного экспрессированного белка.
16. Антитело или его активные фрагменты или производные, специфически связывающееся с белком ΙΚΕΝ по п.12 или 13 или специфически связывающееся с белком ΙΚΕΝ по п.14.
17. Способ модуляции или опосредования в клетках активности ΝΤ-кВ или любой другой активности внутриклеточной передачи сигнала, модулированной или опосредованной ΤΚΑΤ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок по любому из пп.12-14, включающий обработку указанных клеток путем введения в эти клетки одного или более указанного белка в форме, подходящей для его внутриклеточного введения, или путем введения в указанные клетки ДНК-последовательности, кодирующей указанный один или более белок в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, при этом указанный вектор способен осуществлять введение указанной последовательности в указанные клетки так, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанная обработка клеток включает введение в указанные клетки ДНК-последовательности, кодирующей указанный белок в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность, при этом указанный вектор способен осуществлять введение указанной последовательности в указанные клетки так, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках.
19. Способ по п.17 или 18, отличающийся тем, что указанная обработка указанных клеток осуществляется путем трансфекции указанных клеток рекомбинантным вирусным вектором животного, включающий стадии (а) конструирования рекомбинантного вирусного вектора животного, несущего последовательность, кодирующую поверхностный белок вируса (лиганд), способный связываться со специфическим

- 47 005775 рецептором клеточной поверхности, присутствующим на поверхности указанных обрабатываемых клеток, и вторую последовательность, кодирующую белок по любому из пп.12-14, который при экспрессии в указанных клетках способен модулировать/опосредовать активность ΝΕ-кВ или любую другую активность в передаче внутриклеточного сигнала, модулированную/опосредованную ΤΚΑΕ2 или другими указанными молекулами; и (Ь) инфицирования указанных клеток указанным вектором со стадии (а).
20. Способ модуляции ТΚΑΕ2-модулированного/опосредованного действия на клетки, включающий обработку указанных клеток антителом по п.16, при этом указанную обработку осуществляют путем введения подходящей композиции, содержащей указанное антитело, в указанные клетки, причем, если белок ΙΚΕΝ в указанных клетках находятся на внеклеточной поверхности, то указанную композицию приготавливают для внеклеточного применения, а если указанный белок ΙΚΕΝ является внутриклеточным, то указанную композицию приготавливают для внутриклеточного применения.
21. Способ модуляции ТΚΑΕ2-модулированного/опосредованного действия на клетки, включающий обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность ДНК-последовательности, кодирующей белок ΙΚΕΝ, по любому из пп.1-6, при этом указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка ΙΚΕΝ.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанную олигонуклеотидную последовательность вводят в указанные клетки с помощью вируса в соответствии со способом по п.19, при этом указанная вторая последовательность указанного вируса кодирует указанную олигонуклеотидную последовательность.
23. Способ модуляции ТΚΑΕ2-модулированного/опосредованного действия на клетки, включающий осуществление процедуры с использованием рибозима, в которой вектор, кодирующий рибозимную последовательность, способную взаимодействовать с клеточной мРНК-последовательностью, кодирующей белок ΙΚΕΝ по любому из пп.12-14, вводят в указанные клетки в форме, которая позволяет экспрессировать указанную рибозимную последовательность в указанных клетках, и при этом, если указанная рибозимная последовательность экспрессируется в указанных клетках, то она взаимодействует с указанной клеточной мРНК-последовательностью и расщепляет указанную мРНК-последовательность, что приводит к ингибированию экспрессии указанного белка ΙΚΕΝ в указанных клетках.
24. Способ выделения и идентификации белка по любому из пп.12-14, способного непосредственно связываться с ΤΚΑΕ2, включающий осуществление процедуры с использованием двухкомпонентного дрожжевого гибрида, в котором последовательность, кодирующая указанный ΤΚΑΕ2, содержится в одном гибридном векторе, а последовательности из кДНК- или геномной ДНК-библиотеки содержатся во втором гибридном векторе, с последующим использованием указанных векторов для трансформации дрожжевых клеток-хозяев и выделение положительно трансформированных клеток с последующей экстракцией указанного второго гибридного вектора с получением последовательности, кодирующей белок, который связывается с указанным ΤΚΑΕ2.
25. Фармацевтическая композиция для модуляции ΤΚΑΕ2-модулированного/опосредованного действия на клетки, включающая в качестве активного ингредиента белок ΙΚΕΝ по любому из пп.12-14.
26. Фармацевтическая композиция для модуляции ΤΚΑΕ2-модулированного/опосредованного действия на клетки, включающая в качестве активного ингредиента рекомбинантный вирусный вектор животного, кодирующий белок, способный связываться с рецептором клеточной поверхности, и кодирующий белок ΙΚΕΝ по любому из пп.12-14.
27. Фармацевтическая композиция для модуляции ΤΚΑΕ2-модулированного/опосредованного действия на клетки, включающая, в качестве активного ингредиента олигонуклеотидную последовательность, включающую антисмысловую мРНК-последовательность белка ΙΚΕΝ по любому из пп.12-14.
28. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индуцированием ΝΕ-кВ или с какой-либо другой активностью, опосредованной ΤΚΑΕ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок по любому из пп.12-14, включающая эффективное количество белка ΙΚΕΝ 10В или молекулы ДНК, его кодирующей.
29. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индуцированием ΝΕ-кВ или с какой-либо другой активностью, опосредованной ΤΚΑΕ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок по любому из пп.12-14, включающая эффективное количество указанного белка или молекулы ДНК, его кодирующей.
30. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индуцированием ΝΕ-кВ или с какой-либо другой активностью, опосредованной ΤΚΑΕ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок, кодируемый ΙΚΕΝ-10Β по п.13, включающая эффективное количество белка ΙΚΕΝ-10Β или молекулы ДНК, его кодирующей.
31. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индуцированием ΝΕ-кВ или с какой-либо другой активностью, опосредованной ΤΚΑΕ2 или другими молекулами, с которыми связывается белок п.14, включающая эффективное количество указанного белка или молекулы ДНК, его кодирующей.

- 48 005775
32. Способ профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с индуцированием ΝΡ-κΒ или с какой-либо другой активностью, опосредованной ТКАР2 или другими молекулами, с которыми связывается белок по любому из пи. 12-14, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества белка по любому из пи. 12-14 или молекулы ДНК его кодирующей.
33. Способ скрининга лиганда, способного связываться с белком по любому из пп.12-14, включающий контактирование матрицы для аффинной хроматографии, к которой присоединен указанный белок, с клеточным экстрактом, в результате чего указанный лиганд связывается с указанной матрицей, и элюирование, выделение и анализ указанного лиганда.
34. Способ скрининга ДНК-последовательности, кодирующей лиганд, способный связываться с белком по любому из пп.12-14, включающий осуществление процедуры с использованием двухкомпонентного дрожжевого гибрида, в котором последовательность, кодирующая указанный белок, содержится в одном гибридном векторе, а последовательности из кДНК- или геномной ДНК-библиотеки содержатся во втором гибридном векторе, трансформацию дрожжевых клеток-хозяев указанными векторами, выделение положительно трансформированных клеток и экстракцию указанного второго гибридного вектора с получением последовательности, кодирующей указанный лиганд.
35. Способ идентификации и продуцирования лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную белком по любому из пп.12-14, включающий

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим по крайней мере часть последовательности ΙΚΕΝ, показанной на фиг. 6;

b) идентификацию и характеризацию лиганда, не являющегося ТКАР2 или частями рецептора семейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΕ и способного к указанному связыванию, как было обнаружено в указанной стадии скрининга, и

c) продуцирование указанного лиганда, по существу, в выделенной и очищенной форме.
36. Способ идентификации и продуцирования молекулы, способной прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную белком по любому из пп.12-14, включающий

a) скрининг молекулы, способной модулировать активности, модулированные/опосредованные белком по любому из пи. 12-14;

b) идентификацию и характеризацию указанной молекулы и

c) продуцирование указанной молекулы, по существу, в выделенной и очищенной форме.