JP3444585B2 - 抗Ｆａｓ抗体 - Google Patents

抗Ｆａｓ抗体

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアポトーシスに関与
する細胞膜分子であるＦａｓ抗原を認識する抗Ｆａｓ抗
体およびその可変領域をコードするＤＮＡ等に関する。
【０００２】さらに本発明は、抗Ｆａｓ抗体を有効成分
とするＦａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患
に対する予防または治療剤、特に自己免疫疾患治療剤ま
たはリウマチ治療剤に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】生体内において、正常な細胞交代のため
に生じる生理的な細胞死はアポトーシスと呼ばれ、病理
的な細胞死である壊死（ネクローシス）とは区別される
［Kerr, et al. (1972) Br. J. Cancer 26, 239 参
照］。いわゆるプログラム細胞死は、生体内において予
め死滅するべくプログラム化されている、ある種の細胞
にみられる細胞死であるが、アポトーシスもその一つで
ある。アポトーシスにおいては細胞表面の湾曲、核クロ
マチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化等の現象が特徴的
に観察される。
【０００４】アポトーシスは、リンパ球（Ｔ細胞および
Ｂ細胞）の分化において、自己抗原を認識する細胞を排
除する役割を果たしている。実際、Ｔリンパ球の成熟過
程において、自己と反応する細胞など９５％以上の細胞
が胸腺において死滅することが知られている［長田重一
（1993）タンパク質 核酸 酵素38、2208-2218 参
照］。いわゆる自己免疫疾患の発症は、リンパ球分化に
おけるアポトーシスの不全によって自己反応性リンパ球
が生じることによるものと考えられている［中山ら、(1
995) Mebio 12 巻10号、79-86 参照］。
【０００５】このようなアポトーシスに関与する分子と
してはＦａｓ［Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. M
ed. 169, 1747-1756 参照］をはじめとして、腫瘍壊死
因子受容体（Tumor Necrosis Factor Receptor）［Loet
scher,H. et al. (1990) Cell 61, 351-359 参照］、Ｃ
Ｄ４０［Tsubata, T. et al. (1993) Nature 364, 645-
648 参照］やパーフォリン／グランザイムＡ［Jenne,
D. E. et al. (1988) Immunol. Rev. 103, 53-71 参
照］など種々の分子が同定されてきた。Ｆａｓは細胞表
面に存在する膜貫通型タンパク質で、Ｆａｓリガンドと
呼ばれるタンパク質がその細胞外領域に結合するとその
細胞にアポトーシスを誘導する。このＦａｓ／Ｆａｓリ
ガンド系に異常があると、本来アポトーシスにより除去
されるべき、恒常性の維持に悪影響を及ぼす細胞が除去
されずに残ったり、逆に恒常性の維持に不可欠な細胞に
アポトーシスが誘導されたりすることにより、様々な障
害が起こる。本発明においては、それらを総称して「Ｆ
ａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患」とい
う。
【０００６】Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因す
る疾患の発症もしくは病態進行においては、次のような
共通した機序を見出すことができる。すなわち、Ｆａｓ
を発現していながら除去されない異常な細胞（以下「異
常細胞」という）が、他の正常な組織または細胞を攻撃
したり、異常増殖することにより、正常な組織または細
胞に障害が起こり、それぞれの症状の原因となる。場合
によっては、これらの障害は異常細胞からの刺激を受け
た正常な組織または細胞がＦａｓを発現し、アポトーシ
スを起こすことにより生じるかまたは増悪する。具体的
には、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患
として、例えば以下に記載するものを挙げることができ
る。
【０００７】自己免疫疾患： ヒトの各種自己免疫疾患
（橋本病、全身性エリテマトーデス、シューグレン症候
群、悪性貧血、アジソン氏病、インスリン依存型糖尿
病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン氏病、
自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発
性硬化症、バセドー病、特発性血小板減少性紫斑病、慢
性関節リウマチ）とＦａｓ／Ｆａｓリガンド系との関連
は多数報告されている。Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の遺
伝的異常として、マウスではＦａｓに異常のあるｌｐｒ
（lymphoproliferation ）マウス、ｌｐｒcg（lpr gene
complementing gld gene ）マウスやＦａｓリガンドに
異常のあるｇｌｄ（generalized lymphoproliferative
disease ）が知られており、いずれも特異な全身リンパ
節腫脹を伴った種々の自己免疫疾患症状を呈することが
明らかとなっている。ヒト全身性エリテマトーデスの自
然発症モデルマウスであるＭＲＬｌｐｒマウスでは、著
明なリンパ節腫大とともに自己抗体を産生し、免疫複合
体による腎炎を発症する。このマウスは、Ｆａｓ遺伝子
に異常を有しているために、末梢においてＦａｓを介し
たアポトーシスによる自己抗原に対する免疫寛容が起こ
らず、活性化された自己反応性Ｔ細胞が持続的に集積し
た結果、上記病態を呈するものと推察されている［Stra
sser, A., Nature 373, 385 (1995)参照］。またヒトで
もリンパ節腫脹、高ガンマグロブリン血症、ＣＤ４-Ｃ
Ｄ８-Ｔ細胞の著明な増大を呈した２小児症例［Snelle
r, MC. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90, 334 参
照］をはじめとする自己免疫疾患様症例が、Ｆａｓ遺伝
子の異常に起因するものであることが報告され［Fishe
r, GH. et al. (1995) Cell, 81, 935 およびRieux-Lau
cat, F.et al. (1995) Science, 268, 1347 参照］、自
己免疫性リンパ球増殖症候群（Autoimmune Lymphoproli
ferative Syndrome ；ＡＬＰＳ）と命名されている。従
って、マウスのみならずヒトにおいても、自己抗原に対
する免疫寛容の成立・維持においてＦａｓを介するアポ
トーシス誘導システムが大きく関与しており、その異常
により種々の自己免疫疾患が誘発されると考えられる。
【０００８】また、慢性関節リウマチ患者の患部に浸潤
して組織破壊に関与しているＴ細胞の大多数がＦａｓを
発現していることから、慢性関節リウマチが自己免疫疾
患としての側面を併せ持つことが知られている［Hoa,
T. T. M., et al. (1996) J.Rheumatol. 23, 1332-1337
参照］。
【０００９】インスリン依存性糖尿病の多くは、自己反
応性Ｔ細胞による膵ベータ細胞の破壊がインスリン分泌
の絶対的不足状態を招くことにより発症することから、
自己反応性Ｔ細胞の除去が病態の根本的な治療に重要で
ある。
【００１０】さらに、骨髄移植後の移植片対宿主病で
は、障害を受ける標的臓器においてＦａｓの発現が増大
しており、その発現増大の程度と標的臓器障害の程度が
相関する［Chu, J. L., et al. (1995) J. Exp. Med. 1
81, 393 参照］。従ってこの疾患の予防または治療にあ
たっては、標的臓器の細胞のアポトーシスを阻止し、か
つ標的臓器を攻撃する細胞を減少させることが必要であ
る。
【００１１】アレルギー性疾患： アレルギー性疾患に
関与する炎症細胞は、通常は活性化されて病巣に浸潤し
ており、アポトーシスが抑制された状態となって細胞寿
命が延長し、局所により長く集族してその機能を発揮す
る。マウスに好酸球性の気道炎症を起こさせる実験モデ
ルで、アポトーシス誘導活性を有する抗Ｆａｓ抗体を経
気道的に投与すると、アレルゲン吸入後にみられる粘膜
下への好酸球浸潤が消失することが知られている［Tsuy
uki, S., et al. (1995) J. Clin. Invest. 96, 2924参
照］。したがって、炎症細胞にアポトーシスを誘導する
ことにより、症状を軽減することが可能である。
【００１２】慢性関節リウマチ： 前述した慢性関節リ
ウマチの自己免疫疾患的側面とは別に、患部において異
常増殖している滑膜細胞がＦａｓを発現していることが
知られている［Hoa, T. T. M., et al. (1996) J. Rheu
matol. 23, 1332 参照］。この患部由来の滑膜細胞をア
ポトーシス誘導活性を有する抗Ｆａｓ抗体で刺激する
と、アポトーシスが誘導される［Nakajima, T. et al.
(1995) Arthritis Rheum. 38, 485 参照］。すなわち、
慢性関節リウマチ患者の患部においてはＦａｓ／Ｆａｓ
リガンド系が正常に機能しておらず、自己反応性Ｔ細胞
も異常増殖する滑膜細胞も、Ｆａｓを発現していながら
除去されない状態に陥っている。
【００１３】動脈硬化： 動脈硬化病変の中心部の細胞
死の最終像は壊死（ネクローシス）であるが、その進展
過程および退縮過程におけるアポトーシスの関与が報告
されている［原田賢治（1997）現代医療、29、 109 参
照］。動脈硬化病変の電子顕微鏡所見では核の濃縮を伴
う平滑筋細胞のアポトーシス像が認められる［Isner,
J. M., et al. (1995) Circulation 91, 2703参照］。
また、動脈硬化の初期病変において動脈内膜層に集まっ
て脂肪を貪食するマクロファージの一種である泡沫細胞
がＦａｓを発現しており、アポトーシス誘導活性を有す
る抗Ｆａｓ抗体によりアポトーシスを起こすことが報告
されている［Richardson, B. C., et al. (1994) Eur.
J. Immunol. 24, 2640参照］。動脈硬化病変は、リンパ
球浸潤を伴う場合が多く、Ｔ細胞のＦａｓリガンドとマ
クロファージのＦａｓが動脈硬化をコントロールしてい
る可能性が示唆されている［原田賢治（1997）現代医療
29, 109参照］。
【００１４】心筋炎・心筋症： 虚血性心疾患、ウイル
ス性心疾患や拡張型心筋症・ 慢性心筋症などの自己免疫
性心疾患などの病態発症過程にもＦａｓ／Ｆａｓリガン
ド系が関与している可能性が高い。心筋炎は、コクサッ
キーウイルスなどのウイルスが主な原因と考えられる心
筋の炎症で、典型的には感冒様症状に引き続いて胸痛や
不整脈、心不全、ショックなどにより発症する。また心
筋症は「原因不明の心筋疾患」と定義されるが、その原
因もウイルス感染であると考えられる。心不全を伴うマ
ウスの心筋炎モデルの検討において、ウイルス接種後の
マウス心臓でアポトーシスを起こしている細胞（核の濃
縮、断片化）が観察される。またマウス心臓でもＦａｓ
の発現増大が認められ、リンパ球を中心とした浸潤炎症
細胞由来のＦａｓリガンドによりアポトーシスが誘導さ
れているものと推察された［山田武彦ら、現代医療（19
97）29、 119 参照］。ラット培養心筋細胞が虚血により
アポトーシスを起こし、同時に該細胞においてＦａｓを
コードするｍＲＮＡが増加することが知られている［Ta
naka M., et al. (1994) Circ. Res. 75, 426 参照］。
【００１５】腎疾患： 多くの慢性腎疾患においては、
糸球体内組織の再構築が細胞外基質の糸球体内蓄積をも
たらすことにより、糸球体硬化が進行し、濾過機能の廃
絶から慢性腎不全の病態を呈するに至る。進行性糸球体
硬化モデルにおいては、電子顕微鏡レベルで硬化部分に
典型的なアポトーシス像が観察され、また硬化の進展に
伴う糸球体細胞数の減少に一致して糸球体内アポトーシ
スの増大が認められる［Sugiyama H., et al. (1996) K
idney Int. 49, 103参照］。また急性糸球体腎炎では、
過剰に増殖したメサンギウム細胞がアポトーシスにより
減少することで腎炎が回復に向かうことが知られている
［Shimizu A., et al. (1995) Kidney Int. 47, 114 お
よび Baker A. J., et al. (1994) J. Clin. Invest. 9
4, 2105参照］。さらに紫斑病性腎炎やループス腎炎な
どにおいて糸球体内にＦａｓを発現する細胞が顕著に増
加していることが報告されている［Takemura T, et al.
(1995) Kidney Int. 48, 1886参照］。
【００１６】再生不良性貧血： 再生不良性貧血患者の
造血前駆細胞表面においては、正常人に比較してＦａｓ
の発現が顕著であることから、造血幹細胞の減少にＦａ
ｓが関与していることが示唆されている［Maciejewski,
J. P., et al. (1995) Br.J. Haematol. 91, 245参
照］。
【００１７】肝炎： 劇症肝炎では、多くの肝細胞にア
ポトーシスが誘導されていることが知られており、また
抗Ｆａｓ抗体Ｊｏ２をマウスの腹腔内に投与すると劇症
肝炎様の広範な肝細胞死が認められることから、Ｆａｓ
を介した肝細胞のアポトーシスがその発症に関与すると
考えられている［Kamogawa, Y., et al. (1996) Molecu
lar Medicine 33, 1284 参照］［Ogasawara, J., et a
l. (1993) Nature 364,806参照］。免疫組織学的検討で
は、慢性肝炎病巣の肝細胞壊死の強い部分の肝細胞質
に、また脂肪肝などの肝疾患病巣の肝細胞膜にそれぞれ
Ｆａｓ発現の増強が認められた［Hiramatsu, N., et a
l. (1994) Hepatology 19, 1354およびTakatani, M., e
t al. (1996) International Hepatology Commun. 4, 3
34 参照］。また、ＦａｓはＣ型慢性持続性肝炎、慢性
活動性肝炎の病巣に発現しており、いずれも肝細胞が散
在性に染色され、周囲に細胞障害性Ｔ細胞とみられる浸
潤リンパ球を伴っている［Mita, E., et al. (1994) Bi
ochem. Biophys. Res. Commun. 204, 468 参照］。細胞
障害性Ｔ細胞はその細胞表面のＦａｓリガンドにより感
染細胞にアポトーシスを誘導する機能を有するが、同様
に近傍の正常な細胞にもアポトーシスを誘導する。この
近傍者障害と呼ばれる現象は、体内の多くの細胞が、自
身または近傍の細胞が感染した際にＦａｓを発現するこ
とに起因する。なお、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフ
ェロン投与により、Ｃ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡが消
失した症例では、肝組織のＦａｓの発現が顕著に減少す
る。
【００１８】急性肝不全患者の肝細胞では細胞表面のＦ
ａｓが増加しており、該細胞はアポトーシス誘導活性を
有する抗Ｆａｓ抗体によりアポトーシスを起こす。さら
にアルコール性肝炎では偽小葉内部の肝細胞自身にもＦ
ａｓリガンドが発現している［Galle, P. R., et al.
(1995) J. Exp. Med. 182, 1223参照］。Ｆａｓリガン
ド遺伝子発現のin situ ハイブリダイゼーションによる
検討からは、急性肝不全例では肝浸潤リンパ球に、アル
コール肝硬変例では偽小葉内部の肝細胞自体にそれぞれ
発現が認められることから、ウイルス性肝硬変とアルコ
ール性肝硬変では異なる機序でアポトーシスが誘導され
ると考えられるが、いずれの場合もＦａｓ／Ｆａｓリガ
ンド系に異常をきたしていると推測されている。また肝
炎モデルマウスにおいて、ＦａｓリガンドのＦａｓに対
する結合を阻害する性質を有する物質の投与により肝障
害が阻害されることが知られている［Kondo, T., et a
l. (1997) Nature Medicine 3, 409 参照］。
【００１９】後天性免疫不全症候群： ヒト免疫不全ウ
イルス（以下「ＨＩＶ」という）感染患者が免疫不全に
陥る原因として、ＨＩＶに感染していない極めて多数の
免疫細胞がアポトーシスにより細胞死することが挙げら
れる。ヘルパーＴ細胞はＨＩＶとの接触により細胞死す
るが、ヘルパーＴ細胞由来の成長因子が細胞障害性Ｔ細
胞のアポトーシス抑制に必須であるため、ヘルパーＴ細
胞が消失すると細胞障害性Ｔ細胞がアポトーシスを起こ
す。ＨＩＶ感染者の末梢血リンパ球でのＦａｓの発現は
病態の進行に相関していること［Dhein, J., et al. (1
995) Behring Inst. Mitt. 96, 13,および McCloskey,
T. W., et al. (1995) Cytometry 22, 111参照］、非感
染者ではＦａｓ陽性の末梢血リンパ球はＦａｓ刺激によ
り容易にアポトーシスになることはないが、感染者の末
梢血リンパ球ではＦａｓを介して短時間のうちにアポト
ーシスが誘導されること［Owen-Schaub, L. B. et al.
(1992) Cell Immunol. 140, 197 参照］などから、ＨＩ
Ｖ感染者における免疫細胞のアポトーシスもＦａｓ／Ｆ
ａｓリガンド系の異常によるものであると考えられる。
【００２０】臓器移植後の拒絶反応： 臓器移植後の拒
絶反応も、細胞障害性Ｔ細胞の攻撃対象である移植臓器
が供与者由来である点を除けば、現象自体は自己免疫疾
患と類似しているので、細胞障害性Ｔ細胞の機能を抑制
することにより症状の改善を期待することができる。
【００２１】これら各疾患に対しては、異常細胞（例え
ば自己免疫疾患における自己反応性Ｔ細胞、動脈硬化に
おける泡沫細胞、急性糸球体腎炎におけるメサンギウム
細胞、ウイルス感染症における感染細胞、慢性関節リウ
マチにおける滑膜細胞等を指す）を除去し、正常組織ま
たは細胞を保護することが有効な治療手段となるが、Ｆ
ａｓを介するアポトーシスを誘導するのみの薬物では異
常細胞を除去できても正常組織に障害を起こす可能性が
高く、またＦａｓを介するアポトーシスを阻害するのみ
の薬物では正常細胞を保護することはできても異常細胞
を除去することができない。実際、アポトーシス誘導活
性を有する抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２は
マウスに劇症肝炎を発症させる［Ogasawara, J., et a
l. (1993)Nature 364, 806-809参照］。これまでに、ア
ポトーシス誘導活性を有しながら、マウスに投与した際
に肝臓障害を誘発しないことが確認された抗Ｆａｓ抗体
は知られていない。
【００２２】免疫グロブリンＧ（以下、単に「ＩｇＧ」
という。）は、分子量約２３０００の軽ポリペプチド鎖
（以下「軽鎖」という。）、分子量約５００００の重ポ
リペプチド鎖（以下「重鎖」という。）各２本づつから
構成される。重鎖、軽鎖とも約１１０残基からなる、ア
ミノ酸配列が保存されている領域のくり返し構造を持
ち、これらはＩｇＧの３次元構造の基本単位（以下、
「ドメイン」という。）を構成する。重鎖および軽鎖
は、それぞれ連続した４個、および２個のドメインから
構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ
末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間での
アミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメ
イン（variable domain : 以下、「Ｖドメイン」とい
う。）と呼ばれる。ＩｇＧのアミノ末端においては、重
鎖、軽鎖のＶドメインが相補的に会合し可変領域を形成
している。これに対し、残余のドメインは、全体として
定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な
配列を有し、例えば、マウスＩｇＧの定常領域はヒトＩ
ｇＧの定常領域とは異なっているので、マウスＩｇＧは
ヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、
ヒト抗マウス抗体（Human Anti Mouse Antibody ：以下
「ＨＡＭＡ」という。）応答が起こる（シュロッフら、
Cancer Res., 45, 879-85 (1985)参照）。従って、マウ
ス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このよ
うな抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保
持したままＨＡＭＡ応答を起こさないように抗体分子を
修飾する必要がある。
【００２３】Ｘ線結晶構造解析の結果によれば、一般
に、このようなドメインは３本から５本のβ鎖からなる
逆平行βシートが二層重なり合った長円筒状の構造をと
る。可変領域では、重鎖、軽鎖のＶドメインそれぞれに
つき各３個のループが集合し、抗原結合部位を形成す
る。この各ループは相補性決定領域（complementarity
determining region : 以下、「ＣＤＲ」という。）と
呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域の
ＣＤＲ以外の部分は、一般に、ＣＤＲの構造を保持する
役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトら
は、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配
列の保存性に基づき、それぞれの一次配列をＣＤＲおよ
びフレームワークに分類した表を作成した（カバトら、
SEQUENCES OFIMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, N
IH publication, No.91-3242, E.A.Kabatt et al. 参
照）。また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通
の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さら
に、ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在
することも見いだされた。
【００２４】このようなＩｇＧの構造的特徴に関する研
究から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。
【００２５】研究初期の段階では、マウス由来抗体の可
変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提
案された（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6
855,(1984) 参照）。しかし、そのようなキメラ抗体
は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むの
で、特に長期間投与した場合にはＨＡＭＡ応答を誘導し
うる（Begentら Br. J. Cancer, 62, 487, (1990) 参
照）。
【００２６】ヒトに対しＨＡＭＡ応答を発現する可能性
のある、非ヒトほ乳動物由来のアミノ酸残基を更に少な
くする方法として、ＣＤＲ部分のみをヒト由来の抗体に
組み込む方法が提案された（Nature, 321, 522-525, (1
986)参照）が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活
性を保持するにはＣＤＲのみの移植では不十分であっ
た。
【００２７】一方、チョッチアらは、1987年、Ｘ線結晶
構造解析データを用い、(i) ＣＤＲのアミノ酸配列中に
は、抗原に直接結合する部位とＣＤＲ自体の構造を維持
する部位とが存在し、ＣＤＲの取り得る三次元構造は、
複数の典型的なパターン（カノニカル構造）に分類され
ること、(ii)カノニカル構造のクラスは、ＣＤＲのみな
らずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類
によって決定されること、を見いだした（ J. Mol. Bio
l., 196, 901-917, (1987)参照）。
【００２８】この知見に基づき、ＣＤＲ移植法を用いる
場合、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミ
ノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（特
表平4-502408号参照）。
【００２９】一般に、移植すべきＣＤＲを有する非ヒト
哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、ＣＤＲが移植される
側のヒト抗体は「アクセプター」と定義されるが、本発
明もこの定義に従うことにする。
【００３０】ＣＤＲ移植法を実施する際に考慮すべき点
は、可能な限りＣＤＲの構造を保存し、免疫グロブリン
分子の活性を保持することにある。この目的を達成する
ため： (i) アクセプターは、いずれのサブグループに属するも
のを選択すべきか； (ii)ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基
を選択すべきか の２点に留意する必要がある。
【００３１】クィーンらは、ドナーのフレームワークの
アミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当
する場合、ＣＤＲ配列とともにアクセプターに移植する
デザインの方法を提唱した（特表平4-502408号参照）： (a) アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸が
その位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸
がアクセプターの前記位置において普通である。 (b) 該アミノ酸がＣＤＲのひとつのすぐ近くである。
【００３２】(c) 該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモ
デルにおいてＣＤＲの約３Å以内に側鎖原子を有し、そ
して抗原とまたはヒト化抗体のＣＤＲと相互作用するこ
とができると予想される。
【００３３】しかしながら、アポトーシス誘導活性を有
するＩｇＧ型ヒト化抗Ｆａｓ抗体の取得に成功した例は
ない。また本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、従
来知られていなかった新規な特徴を有するモノクローナ
ル抗体である。したがって、該モノクローナル抗体をヒ
ト化した例も知られていない。
【００３４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、前記のような異常細胞に対してはその表面のＦａｓ
に結合してアポトーシスを誘導し、一方、正常細胞に対
しては、ＦａｓリガンドのＦａｓへの結合により誘導さ
れるアポトーシスを阻止する機能を有する新規抗Ｆａｓ
抗体、またはそれに類似した分子を提供することにあ
る。
【００３５】ヒトＦａｓに特異的に結合するモノクロー
ナル抗体は、アポトーシス誘導活性を有するものも含め
いくつか知られているが、いずれもマウスＦａｓとは結
合しないことが明らかとなっている。同様にマウスＦａ
ｓと結合するモノクローナル抗体もいくつか知られてい
るものの、いずれもヒトＦａｓとは結合しない。すなわ
ち、既存の抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の医薬とし
ての有効性を評価するにあたっては、上記に挙げたよう
な病態モデルマウスを使用することができない。本発明
の第二の目的は、ヒトＦａｓともマウスＦａｓとも結合
する抗Ｆａｓ抗体、またはそれに類似した分子を提供す
ることにある。
【００３６】本発明の第三の目的は、上記抗Ｆａｓ抗
体、またはそれに類似した分子を有効成分として含有す
る、上記各種疾患に対する予防または治療剤を提供する
ことにある。
【００３７】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１） 霊長
類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエ
ピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴と
する分子、（２） 霊長類がヒトであることを特徴とす
る、（１）記載の分子、（３） 非霊長類動物が齧歯類
動物であることを特徴とする、（１）または（２）記載
の分子、（４） 齧歯類動物がマウスであることを特徴
とする、（３）記載の分子、（５） 哺乳類のＦａｓの
間で保存されているエピトープに特異的な抗原結合領域
を有することを特徴とする分子、（６） マウス−マウ
スハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２
８）により産生されるモノクローナル抗体、（７） マ
ウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５８２８）により産生される抗ヒトＦａｓモノクロ
ーナル抗体由来の６種のＣＤＲと同一のＣＤＲを全て有
することを特徴とする分子、（８） マウス−マウスハ
イブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）
により産生されるモノクローナル抗体により認識される
エピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴
とする分子、（９） 抗体であることを特徴とする、
（１）乃至（５）、（７）または（８）のいずれか一つ
に記載の分子、（１０） 以下の一般式（Ｉ）で示され
るアミノ酸配列を含むことからなる重鎖ポリペプチド： −ＦＲＨ1−ＣＤＲＨ1−ＦＲＨ2−ＣＤＲＨ2−ＦＲＨ3−ＣＤＲＨ3−ＦＲＨ4− （Ｉ） （式中、ＦＲＨ1は１８乃至３０個のアミノ酸からなる
任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＨ1は配列表の配
列番号２で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＨ2は
１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わ
し、ＣＤＲＨ2は配列表の配列番号３で示されるアミノ
酸配列を表わし、ＦＲＨ3は３２個のアミノ酸からなる
任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＨ3は配列表の配
列番号４で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＨ4は
１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わ
し、各アミノ酸はそれぞれぺプチド結合で連結してい
る、）および、以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミノ
酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチド： −ＦＲＬ1−ＣＤＲＬ1−ＦＲＬ2−ＣＤＲＬ2−ＦＲＬ3−ＣＤＲＬ3−ＦＲＬ4− （ＩＩ） （式中、ＦＲＬ1は２３個のアミノ酸からなる任意のア
ミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＬ1は配列表の配列番号５
で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＬ2は１５個の
アミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲ
Ｌ2は配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列を表
わし、ＦＲＬ3は３２個のアミノ酸からなる任意のアミ
ノ酸配列を表わし、ＣＤＲＬ3は配列表の配列番号７で
示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＬ4は１０個のア
ミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、各アミノ
酸はそれぞれぺプチド結合で連結している、）を有する
ことを特徴とする分子、（１１） 少なくとも下記の
ａ）乃至ｆ）のいずれか一つに記載の生物学的性状を有
することを特徴とする、（１）乃至（５）または（７）
乃至（１０）のいずれか一つに記載の分子： ａ）Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス
誘導活性を有する； ｂ）ＭＲＬgld ／gld マウスの自己免疫疾患症状の改善
効果を有する； ｃ）肝臓障害を誘発しない； ｄ）抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２により惹
起される劇症肝炎に対する治療または予防効果を有す
る； ｅ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果を有す
る； ｆ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポト
ーシス誘導活性を有する、（１２） a）乃至ｆ）記載
の生物学的性状の全てを有することを特徴とする、（１
１）記載の分子、（１３） 抗体であることを特徴とす
る、（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の分
子、（１４） ヒト化されていることを特徴とする、
（９）または（１３）記載の分子、（１５） イムノグ
ロブリンＧ型抗体であることを特徴とする、（９）また
は（１３）記載の分子、（１６） ヒト化されているこ
とを特徴とする、（６）記載の抗体、（１７） Ｆａｓ
を発現している異常細胞にアポトーシスを誘導すること
ができ、かつ正常細胞のアポトーシスを防止することが
できることを特徴とする、（１）乃至（５）または
（７）乃至（１５）のいずれか一つに記載の分子、（１
８） （１）乃至（５）、（７）乃至（１３）、（１
５）または（１７）のいずれか一つに記載の分子、もし
くは（６）記載の抗体の、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンドの相
互作用による影響を受けた病態に対する医薬としての効
果を評価する方法であって、前記病態のモデル動物に該
分子または該抗体を投与し、次いで、前記病態の変化を
該分子または該抗体を投与した動物と非投与動物との間
で比較することを特徴とする方法、（１９） 少なくと
も一つのヒトイムノグロブリン軽鎖もしくはその断片、
および、少なくとも一つのヒトイムノグロブリン重鎖も
しくはその断片のそれぞれに、霊長類および非霊長類動
物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的に
結合する抗体から、該抗体のそれぞれのＣＤＲを移植す
ることによって得ることができる、霊長類および非霊長
類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異
的な抗原結合領域を有することを特徴とするヒト化抗
体、（２０） ヒトイムノグロブリン軽鎖およびヒトイ
ムノグロブリン重鎖として、各々、霊長類および非霊長
類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異
的に結合する抗体との間で可変領域の類似性が最も高い
ものが選択されていることを特徴とする、（１９）記載
のヒト化抗体、（２１） 霊長類および非霊長類動物の
Ｆａｓの間で保存されているエピトープに特異的に結合
する抗体から、該抗体の重鎖および／または軽鎖のフレ
ームワーク領域において該抗体の抗原認識部位の構造を
維持するために重要なアミノ酸が、ヒトイムノグロブリ
ン軽鎖もしくはその断片、および／または、ヒトイムノ
グロブリン重鎖もしくはその断片に移植されていること
を特徴とする、（１９）または（２０）記載のヒト化抗
体、（２２） 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
配列からなるペプチドと結合することを特徴とする、
（１）乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１７）また
は（１９）乃至（２１）のいずれか一つに記載の分子ま
たは抗体、（２３） 配列表の配列番号５０のアミノ酸
番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配
列番号５２のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミ
ノ酸配列、配列表の配列番号５４のアミノ酸番号１から
２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号１０
７のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列
または配列表の配列番号１０９のアミノ酸番号１から２
１８に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む軽鎖
ポリペプチドを有することを特徴とする、（１）乃至
（５）、（７）乃至（１５）、（１７）または（１９）
乃至（２２）のいずれか一つに記載の分子または抗体、
（２４） 配列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から
４５１に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号
１１７のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸
配列のいずれか一つを含む重鎖ポリペプチドを有するこ
とを特徴とする、（１）乃至（５）、（７）乃至（１
５）、（１７）または（１９）乃至（２３）のいずれか
一つに記載の分子または抗体、（２５） 配列表の配列
番号５０のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ
酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、および、配列表の配列
番号８９のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ
酸配列を含む重鎖ポリペプチドから構成されることを特
徴とする、（２３）または（２４）記載の分子または抗
体、（２６） 配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号
１から２１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペ
プチド、および、配列表の配列番号１１７のアミノ酸番
号１から４５１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリ
ペプチドから構成されることを特徴とする、（２３）ま
たは（２４）記載の分子または抗体、（２７） （１）
乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１７）または（１
９）乃至（２６のいずれか１つに記載の分子または抗体
中のポリペプチド鎖のいずれか一つをコードするＤＮ
Ａ、（２８） （６）または（１６）記載の抗体の軽鎖
ポリペプチドまたは重鎖ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、（２９） 配列表の配列番号１１のアミノ酸番号１
から２１８に示されるアミノ酸配列を含むことからなる
ポリペプチドをコードするＤＮＡ、（３０） 配列表の
配列番号９のアミノ酸番号１から４４５に示されるアミ
ノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、（３１） 配列表の配列番号５０のアミノ酸番
号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列
番号５２のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ
酸配列、配列表の配列番号５４のアミノ酸番号１から２
１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号１０７
のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列ま
たは配列表の配列番号１０９のアミノ酸番号１から２１
８に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むことか
らなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、（３２） 配
列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から４５１に示さ
れるアミノ酸配列または配列表の配列番号１１７のアミ
ノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列のいずれ
か一つを含むことからなるポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ、（３３） 配列表の配列番号１０のヌクレオチド
番号６１から３９３に示されるヌクレオチド配列を含む
ことからなる、（２９）記載のＤＮＡ、（３４） 配列
表の配列番号１０のヌクレオチド番号６１から７１４に
示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（２
９）記載のＤＮＡ、（３５） 配列表の配列番号８のヌ
クレオチド番号５８から４２０に示されるヌクレオチド
配列を含むことからなる、（３０）記載のＤＮＡ、（３
６） 配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５８から
１３９２に示されるヌクレオチド配列を含むことからな
る、（３０）記載のＤＮＡ、（３７） 配列表の配列番
号４９のヌクレオチド番号１００から７５３に示される
ヌクレオチド配列、配列表の配列番号５１のヌクレオチ
ド番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列、
配列表の配列番号５３のヌクレオチド番号１００から７
５３に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１
０６のヌクレオチド番号１００から７５３に示されるヌ
クレオチド配列または配列表の配列番号１０８のヌクレ
オチド番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配
列を含むことからなる、（３１）記載のＤＮＡ、（３
８） 配列表の配列番号８８のヌクレオチド番号８４か
ら２０４２に示されるヌクレオチド配列または配列表の
配列番号１１６のヌクレオチド番号７８から２０３６に
示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（３
２）記載のＤＮＡ、（３９） （２７）乃至（３８）の
いずれか一つに記載のＤＮＡを含むことからなる組換え
ＤＮＡベクター、（４０） （２９）、（３１）、（３
３）、（３４）または（３７）のいずれか一つに記載の
ＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター、（４
１） （３０）、（３２）、（３５）、（３６）または
（３８）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含むことから
なる組換えＤＮＡベクター、（４２） （３９）記載の
組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、（４
３） （４０）および／または（４１）記載の組換えＤ
ＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、（４４）
（４０）および（４１）記載の組換えＤＮＡベクターで
形質転換された宿主細胞、（４５） 哺乳動物由来であ
ることを特徴とする、（４１）乃至（４３）のいずれか
一つに記載の宿主細胞、（４６） 形質転換大腸菌Ｅ．
ｃｏｌｉ ｐＭＥ−Ｌ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６７）、
（４７） 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＥ−Ｈ
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６８）、（４８） 形質転換大
腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＭＭ６ ＳＡＮＫ ７３６
９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７１）、（４９） 形質転
換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＨＭ１７ ＳＡＮＫ
７３５９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７２）、（５０）
形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＨＨ７ ＳＡＮ
Ｋ ７３４９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７３）、（５
１） 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＨＭ２ Ｓ
ＡＮＫ ７０１９８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７２）、
（５２） 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＨＨ５
ＳＡＮＫ ７０３９８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７
４）、（５３） 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇＨ
ＳＬ７Ａ６２ ＳＡＮＫ７３３９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６０７４）、（５４） 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ｐｇＨＰＤＨＶ３ ＳＡＮＫ７０２９８（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２７３）、（５５） （４４）または（４５）記
載の宿主細胞を培養し、次いで該培養物から抗Ｆａｓ抗
体を回収することを特徴とする、抗Ｆａｓ抗体の製造方
法、（５６） マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７
Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）、（５７） マウス−
マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
８２８）をイムノグロブリン産生が可能な条件下で培養
し、次いで該培養物からイムノグロブリンを回収するこ
とを特徴とする、（６）記載の抗体の製造方法、（５
８） （１）乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１
７）または（１９）乃至（２６のいずれか１つに記載の
分子、あるいは、（６）または（１６）記載の抗体を有
効成分として含有する、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異
常に起因する疾患の予防または治療剤、（５９） Ｆａ
ｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が自己免疫
疾患（全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウ
マチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧
血、アジソン氏病、強皮症、グッドパスチャー症候群、
クローン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症
筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、突発性血小板減
少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病）、アレルギー、
アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、
再生不良性貧血、肝炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス
性肝炎（Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコ
ール性肝炎）、後天性免疫不全症候群および臓器移植後
の拒絶反応からなる群から選択されることを特徴とす
る、（５８）記載の予防または治療剤、（６０） Ｆａ
ｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が自己免疫
疾患（全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウ
マチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧
血、アジソン氏病、強皮症、グッドパスチャー症候群、
クローン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症
筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、突発性血小板減
少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病）であることを特
徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治
療剤、（６１） Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起
因する疾患がアレルギーであることを特徴とする、（５
８）または（５９）記載の予防または治療剤、（６２）
Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が慢
性関節リウマチであることを特徴とする、（５８）また
は（５９）記載の予防または治療剤、（６３） Ｆａｓ
／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が動脈硬化症
であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載
の予防または治療剤、（６４） Ｆａｓ／Ｆａｓリガン
ド系の異常に起因する疾患が心筋炎または心筋症である
ことを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防
または治療剤、（６５） Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の
異常に起因する疾患が糸球体腎炎であることを特徴とす
る、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６６） Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する
疾患が再生不良性貧血であることを特徴とする、（５
８）または（５９）記載の予防または治療剤、（６７）
Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が肝
炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎（Ｃ型肝炎、
Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコール性肝炎）である
ことを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防
または治療剤、（６８） Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の
異常に起因する疾患が後天性免疫不全症候群であること
を特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防また
は治療剤、（６９） Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常
に起因する疾患が臓器移植後の拒絶反応であることを特
徴とする、（５８または５９）記載の予防または治療
剤、を提供するものである。
【００３８】ヒトとマウスの間でアミノ酸配列が保存さ
れている部分をエピトープとし、ヒトおよびマウスのＦ
ａｓのいずれにも結合するマウスモノクローナル抗体を
取得しようとして、ＢＡＬＢ／ｃマウス等の通常のマウ
スをヒトＦａｓで免疫した場合、マウスＦａｓとも結合
するような抗体を産生する細胞は、自己抗原反応性の抗
体産生細胞として胸腺において消去される。この胸腺で
の自己反応性Ｔ細胞の除去にＦａｓ−Ｆａｓリガンド系
が関与しているものと推察されること［米原伸(1994)
日経サイエンス別冊110 、66-77 参照］から、Ｆａｓを
コードする遺伝子を発現不能にしたマウス（以下「Ｆａ
ｓノックアウトマウス」という）等のＦａｓ−Ｆａｓリ
ガンド系に欠損のあるマウスを免疫動物として用いれ
ば、マウスＦａｓにも結合する抗体も取得することが可
能になる。しかしながら、本発明において用いられる免
疫動物はＦａｓノックアウトマウスに限定されず、例え
ばラット、ウサギ等、他の実験動物であっても、Ｆａｓ
−Ｆａｓリガンド系に欠損のあるものは本発明の免疫動
物として用いられ得る。
【００３９】本発明者らは、Ｆａｓノックアウトマウス
をヒトＦａｓで免疫し、該マウスの脾臓細胞とマウスミ
エローマ細胞を融合することにより、ヒトおよびマウス
のＦａｓと結合する新規抗Ｆａｓモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを作出し、その培養上清より該
モノクローナル抗体を精製した。この新規抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体は、Ｆａｓを発現するマウスおよび非ヒ
ト霊長類動物のＴ細胞にアポトーシスを誘導した。すな
わち、本発明により、少なくともヒトを含む霊長類のＦ
ａｓと齧歯類Ｆａｓとの間には、本発明の抗体によって
共通に認識され得、かつ本発明の抗体が結合することに
よりアポトーシス誘導が可能なエピトープが存在するこ
とが明らかにされた。
【００４０】また、この新規抗Ｆａｓモノクローナル抗
体は、自己免疫疾患モデルマウスの症状を軽減する効果
を有していた。さらに驚くべきことに、この新規抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体には、従来のアポトーシス誘導活
性を有する抗Ｆａｓ抗体において知られていた、肝障害
を誘発する副作用がないことが判明した。また、本発明
者らは、上記ハイブリドーマより、新規抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子をそ
れぞれクローニングし、そのヌクレオチド配列を解明し
て、それらの遺伝子にコードされている該重鎖および軽
鎖のアミノ酸配列におけるＣＤＲのアミノ酸配列を決定
した。本発明者らはまた、該重鎖および軽鎖をコードす
る遺伝子を含むことからなる発現ベクターをそれぞれ作
製し、これらのベクターで培養動物細胞をコ・ トランス
フェクションして得られた培養上清中に、Ｆａｓと反応
する組換え抗Ｆａｓ抗体を産生させた。そのようにして
得られた抗Ｆａｓ抗体およびその組換え体は、Ｆａｓを
介するアポトーシスにより引き起こされる劇症肝炎から
肝臓を保護する活性を有しており、しかも慢性関節リウ
マチの予防および治療にそれぞれ有効であることから、
該抗体が異常細胞にはＦａｓを介してアポトーシスを誘
導する活性とＦａｓを介する正常細胞のアポトーシスを
阻止する活性を併せ持ち、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の
異常に起因する疾患に対する予防または治療に有効であ
ることが判明した。本発明者らは、このマウス由来抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体のＣＤＲアミノ酸配列をヒト抗
体に移植することにより、抗Ｆａｓ抗体としての活性を
保持しながらヒトに対する免疫原性を有さない組換え抗
体を作製することに成功し、本発明を完成させた。
【００４１】異種動物由来の同種タンパク質を共通に認
識するモノクローナル抗体がタンパク質抗原に結合する
際の、抗原側の結合部位（エピトープ）周辺において
は、異種動物間においてアミノ酸配列が保存されてい
る、すなわちアミノ酸配列相同性が高く保たれている場
合が多いと考えられるが、本発明の抗体が結合するＦａ
ｓ分子中のエピトープは、そのような一次構造上の相同
性が保たれている領域のみに限定されない。すなわち、
本発明における「霊長類および非霊長類動物のＦａｓの
間で保存されているエピトープ」は、高次構造上の相同
性が異種動物間で保たれ、その結果単一のモノクローナ
ル抗体に共通に認識され得るような領域をも包含する。
【００４２】本発明において「抗原結合領域」とは、抗
体分子中の抗原に対する結合領域と同一の機能を有する
分子内領域をいう。この抗原結合領域は、特定の抗体ま
たは抗体の組み合わせに由来するものに限定されない。
さらに、該抗原結合領域と、特定の抗体分子中の抗原に
対する結合領域とは、該抗原に結合可能である点におい
てのみ類似していればよく、その他の点で類似している
ことは本発明の抗原結合領域の必須要件ではない。した
がって、例えば抗原結合領域が既知の抗体のＣＤＲを基
に設計され、ヒト抗体に移植された場合でも、その結果
作製される抗原結合領域は該既知の抗体の抗原結合領域
と必ずしも類似していなくてもよいが、抗原に対する特
異的結合能力を維持するという観点からは、両者の間の
類似性が高いことが好ましい。
【００４３】本発明における「抗原結合領域を有するこ
とを特徴とする分子」は、好ましくは抗体であるが、こ
れに限定されず、その抗原結合領域がＦａｓ分子中のエ
ピトープに結合するものであればよい。したがって例え
ば、該抗原結合領域はアフィニティ精製用カラムの支持
体に付加されてもよい。しかしながら、以後は特に言及
しない限り「本発明の分子」は通常は抗体を指すものと
する。
【００４４】また、本発明の分子が抗体である場合、該
抗体としてはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、同Ａ（Ｉ
ｇＡ）、同Ｅ（ＩｇＥ）および同Ｍ（ＩｇＭ）のいずれ
の型も好適に用いられうるが、通常はＩｇＧがより好適
である。
【００４５】本発明においては、上述したような、非ヒ
ト動物由来の抗体から少なくとも全てのＣＤＲのアミノ
酸配列をヒト抗体に移植することにより、抗体としての
機能を保持したままでヒトに対する免疫原性を低減させ
た人工改変抗体を、「ヒト化抗体」という。
【００４６】本発明において「ＦＲ」とは、フレームワ
ーク領域を指すものである。例えば、ＦＲＨ1は、重鎖
サブユニット可変領域中の最もＮ末端に存在するフレー
ムワーク領域を指し、ＦＲＬ4は、軽鎖サブユニット可
変領域中のＮ末端から４番目のフレームワーク領域を指
す。同様に、例えばＣＤＲＨ1は、重鎖サブユニット可
変領域中の最もＮ末端に存在するＣＤＲを指し、ＣＤＲ
Ｌ3は、軽鎖サブユニット可変領域中のＮ末端から３番
目のＣＤＲを指す。
【００４７】
【発明の実施の形態】本発明の抗Ｆａｓモノクローナル
抗体は、例えばＦａｓノックアウトマウスをヒトＦａｓ
で免疫し、該マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞
を融合することにより得られるハイブリドーマを培養す
ることにより得ることができる。
【００４８】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。すなわ
ち、（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血
液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定
してから、抗体産生細胞を調製する工程、（ｃ）骨髄腫
細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、（ｄ）抗体
産生細胞とミエローマとの細胞融合、（ｅ）目的とする
抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（ｆ）単一細
胞クローンへの分割（クローニング）、（ｇ）場合によ
っては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハ
イブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した
動物の飼育、（ｈ）このようにして製造されたモノクロ
ーナル抗体の生理活性、およびその認識特異性の検討、
あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【００４９】以下、抗Ｆａｓモノクローナル抗体の作製
法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこ
れに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およ
びミエローマを使用することもできる。
【００５０】（ａ）抗原の精製 抗原としては、ヒトＦａｓの細胞外領域とマウスインタ
ーロイキン３受容体（以下「ＩＬ３Ｒ」という）の細胞
外領域［Nishimura, Y. et al. (1995) J. Immunol. 15
4, 4395-4403参照］との融合タンパク質の発現ベクター
ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２をサル由来細胞株ＣＯＳ−１に導
入し発現させ、部分精製することによって得られる組換
えタンパク質（以下「組換えヒトＦａｓ」という）が有
効である。ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２は、ヒトＦａｓとマウ
スＩＬ３Ｒの融合タンパク質をコードするＤＮＡを、動
物細胞用発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに組み込むことによ
り作製できる。ただし、ＦａｓをコードするＤＮＡ、ベ
クター、宿主等はこれらに限定されない。
【００５１】具体的には、ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２でＣＯ
Ｓ−１細胞を形質転換して得られた形質転換株を培養
し、その培養上清中に産生されるヒトＦａｓとマウスＩ
Ｌ３Ｒの融合タンパク質を、リソースＱカラム（商標
名；ファルマシア社製）を用いたイオン交換クロマトグ
ラフィーを実施することにより、組換えＦａｓを部分精
製することができる。
【００５２】また、ヒト細胞株の細胞膜上に存在するＦ
ａｓそのものを精製したものも抗原として使用すること
ができる。さらに、Ｆａｓの一次構造は公知である［ I
toh,N., et al. (1991) Cell 66, 233-243 参照］の
で、当業者に周知の方法により、配列表の配列番号１に
示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドを化
学合成し、これを抗原として使用することもできる。
【００５３】（ｂ）抗体産生細胞の調製 工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または
不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助
剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験
動物としては、Ｆａｓノックアウトマウスが最も好適に
用いられるが、そのようなマウスは千住らの文献［Senj
u, S., et al (1996) International Immunology 8, 42
3 参照］に記載する方法により作出することができる。
【００５４】マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注
射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射い
ずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好まし
い。
【００５５】免疫は、一回、または、適当な間隔で（好
ましくは１週間から５週間間隔で）複数回繰返し行なう
ことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に
対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を
抗体産生細胞の供給原として用いれば、以後の操作の効
果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜
５日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用い
ることが好ましい。
【００５６】ここで用いられる抗体価の測定法として
は、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」とい
う）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」とい
う）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知
技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、およ
び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法また
はＥＬＩＳＡ法がより好適である。
【００５７】本発明における抗体価の測定は、例えばＥ
ＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により
行うことができる。まず、精製または部分精製したＦａ
ｓをＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着さ
せ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関
係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「Ｂ
ＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体
として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触さ
せ、上記抗原に試料中の抗Ｆａｓ抗体を結合させる。さ
らに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する
抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基
質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等
を測定することにより、抗体価を算出する。
【００５８】（ｃ）ミエローマの調製工程 ミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株
化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ
／ｃ由来）ミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3-U1)［Yelton,
D.E. et al. Current Topics in Microbiology and Imm
unology, 81, 1-7(1978)］、P3／NSI ／1-Ag4-1(NS-1)
［Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511
-519 (1976) ］、Sp2 ／O-Ag14 (SP-2) ［Shulman, M.
et al. Nature, 276, 269-270 (1978)］、P3X63Ag8.653
(653) ［Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 12
3, 1548-1550 (1979)］、P3X63Ag8(X63) ［Horibata,
K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)］
などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当
な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６
４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲ
ンタマイシン、およびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」と
いう）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地]
、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified D
ulbecco's Medium ；以下「ＩＭＤＭ」という）、また
はダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified
Eagle Medium；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養す
るが、細胞融合の３〜４日前に正常培地［例えば、１０
％ ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社
製）］で継代培養し、融合当日に２×１０7以上の細胞
数を確保しておく。
【００５９】（ｄ）細胞融合 抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞である
リンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得ても
よく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを
適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細
胞が最も一般的に用いられる。
【００６０】最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウ
スから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞
と工程（ｃ）で得られたミエローマを融合させる手段と
して現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比
較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを
用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順より
なる。
【００６１】脾細胞とミエローマとを無血清培地（例え
ばＲＰＭＩ１６４０）、またはリン酸緩衝生理食塩液
（以下「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエ
ローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるよう
に混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞
群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０
００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌ
の無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び
上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・ア
ミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液お
よびマウスインターロイキン−２（以下「ＩＬ−２」と
いう）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培地」という）中
に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）
の各ウェルに分注し、５％ 炭酸ガス存在下、３７℃で
２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
【００６２】（ｅ）ハイブリドーマ群の選択 上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である
場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である
場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエロ
ーマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生
存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あ
るいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリド
ーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの
融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中で
の培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエロー
マ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハ
イブリドーマを選択することができる。
【００６３】コロニー状に生育してきたハイブリドーマ
について、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地
（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以
後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法に
より抗Ｆａｓ抗体価を測定する。ただし、ＥＬＩＳＡ用
の抗原として上記融合タンパク質を用いる場合は、マウ
スＩＬ３受容体の細胞外領域に特異的に結合する抗体を
産生するクローンを選択しないように、該クローンを除
外する操作が必要である。そのようなクローンの有無
は、例えばマウスＩＬ３受容体またはその細胞外領域を
抗原としたＥＬＩＳＡ等により確認することができる。
【００６４】以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用
いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドー
マの選択方法に応じて使用することができ、その場合使
用する培地組成も変化する。
【００６５】（ｆ）クローニング 工程（ｂ）の記載と同様の方法で抗体価を測定すること
により、特異的抗体を産生することが判明したハイブリ
ドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。こ
のクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個
のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限
界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟
寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの
細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１
個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられ
るが、限界希釈法が簡便でありよく用いられる。
【００６６】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安
定して抗体価の認められたものを抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。さらに、
マウスＦａｓに結合する抗体を産生するハイブリドーマ
を同様の方法で選択することにより、抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体産生細胞を得る。このとき使用されるマウス
Ｆａｓとしては、例えばマウスＦａｓの細胞外領域とマ
ウスＩＬ３受容体の細胞外領域との融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡの発現プラスミドベクター ｐＭＥ１８
Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣ［Nishimura, Y. et al. (1995)
J. Immunol. 154, 4395-4403参照］を培養動物細胞に導
入して発現させた融合タンパク質や、精製マウスＦａ
ｓ、またはマウスＦａｓを細胞表面に発現している細胞
を使用できる。
【００６７】なお、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体を作製
するにあたっての基礎となる抗体として好適な抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体の産生細胞であるマウス−マウスハ
イブリドーマＨＦＥ７Ａは工業技術院生命工学工業研究
所に平成９年２月１９日付けで国際寄託され、受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８が付されている。したがっ
て、例えばマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａを
用いて抗体を調製する場合は、工程（ｆ）までを省略し
て、以下に記載する工程（ｇ）から抗体の調製を行うこ
とができる。
【００６８】（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクロ
ーナル抗体の調製 クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ
培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大
型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行
われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当
業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明
の予防または治療剤が有効成分として含有する抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統
のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮ
ｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で該ハイブリド−マを増殖させ
ることにより、本発明の予防または治療剤が有効成分と
して含有する抗Ｆａｓモノクローナル抗体を大量に含む
腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、
市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂ
Ｔｒａｐ ＧIIキット；ファルマシア社製）等を利用す
ることもできる。
【００６９】かくして得られるモノクローナル抗体は、
ヒトおよびマウスのＦａｓに対して高い抗原特異性を有
する。
【００７０】（ｈ）モノクローナル抗体の検定 かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプお
よびサブクラスの決定は以下のように行うことができ
る。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ouchterlon
y ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗
体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、
ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清
をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体
として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラス
に対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗
体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能で
ある。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用の
キット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド
社製）等を利用することもできる。
【００７１】さらに、タンパク質の定量は、フォーリン
ロウリー法、および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４
（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より
算出する方法により行うことができる。
【００７２】モノクローナル抗体の認識エピトープの同
定は以下のようにして行なうことができる。まず、モノ
クローナル抗体の認識する分子の様々な部分構造を作製
する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプ
チド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを
作成する方法、遺伝子組換え技術を用いて目的の部分ペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を好適な発現プラスミド
に組み込み、大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があ
るが、上記目的のためには両者を組み合わせて用いるの
が一般的である。例えば、抗原タンパク質のＣ末端ある
いはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペ
プチドを当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製
した後、それらに対するモノクローナル抗体の反応性を
検討し、大まかな認識部位を決定する。
【００７３】その後、さらに細かく、その対応部分のオ
リゴペプチド、または該ペプチドの変異体等を、当業者
に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、
本発明の予防または治療剤が有効成分として含有するモ
ノクローナル抗体のそれらペプチドに対する結合性を調
べるか、または該モノクローナル抗体と抗原との結合に
対するペプチドの競合阻害活性を調べることによりエピ
トープを限定する。多種のオリゴペプチドを得るための
簡便な方法として、市販のキット（例えば、ＳＰＯＴｓ
キット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マ
ルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合
成キット（カイロン社製）等）を利用することもでき
る。
【００７４】次に、本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗
体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡは、上記抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よ
りｍＲＮＡを調製し、該ｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮ
Ａに変換してから、該抗体の重鎖または軽鎖をコードす
るＤＮＡをそれぞれ単離することにより得られる。
【００７５】ｍＲＮＡの抽出にあたっては、グアニジン
・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン
・チオシアネート−グアニジン・塩酸法なども採用しう
るが、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法が
好適である。細胞からのｍＲＮＡの調製は、まず全ＲＮ
Ａを調製し、該全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロース
やオリゴ（ｄＴ）ラテックスビーズ等のポリ（Ａ）+Ｒ
ＮＡ精製用担体を用いて精製する方法、または細胞ライ
セートから該担体を用いて直接精製する方法により実施
できる。全ＲＮＡの調製方法としては、アルカリショ糖
密度勾配遠心分離法［Dougherty, W. G. and Hiebert,
E. (1980) Viology 101, 466-474参照］、グアニジンチ
オシアネート・フェノール法、グアニジンチオシアネー
ト・トリフルオロセシウム法、フェノール・ＳＤＳ法等
も採用し得るが、グアニジンチオシアネートおよび塩化
セシウムを用いる方法［Chirgwin, J. M., et al. (197
9)Biochemistry 18, 5294- 5299参照］が好適である。
【００７６】上記のごとくして得られたポリ（Ａ）+Ｒ
ＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応により一本鎖ｃＤＮ
Ａを合成した後、この一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮ
Ａを合成することができる。この方法としてはＳ１ヌク
レアーゼ法［Efstratiadis,A., et al. (1976) Cel1 7,
279-288 参照］、グブラー−ホフマン法［Gubler,U. a
nd Hoffman, B. J. (1983) Gene 25, 263-269 参照］、
オカヤマ−バーグ法［Okayama, H. and Berg, P. (198
2) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170 参照］等を採用し得
るが、本発明においては、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として
ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Saik
i, R. K., et al. (1988) Science 239,487-49 参照］
を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が好適である。
【００７７】このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを
クローニングベクターに組み込み、得られた組換えベク
ターを大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、テト
ラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性等を指標と
して形質転換体を選択することができる。大腸菌の形質
転換は、ハナハン法［Hanahan, D. (1983) J. Mol. Bio
l. 166, 557-580 参照］、すなわち塩化カルシウムや塩
化マグネシウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製
したコンピテント細胞に、該組換えＤＮＡベクターを加
える方法により実施することができる。なお、ベクター
としてブラスミドを用いる場合は、上記の薬剤耐性遺伝
子を有することが必要である。また、プラスミド以外の
クローニングベクター、例えばラムダ系のファージ等を
用いることも可能である。
【００７８】上記により得られた形質転換株から、目的
の抗ヒトＦａｓ抗体の各サブユニットをコードするｃＤ
ＮＡを有する株を選択する方法としては、例えば以下に
示す各種方法を採用できる。なお、上記ＲＴ−ＰＣＲ法
により目的のｃＤＮＡを特異的に増幅した場合は、これ
らの操作を省略することが可能である。
【００７９】（１）ポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法 目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明
されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセン
スストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラ
ーゼ連鎖反応［Saiki, R. K., et al. (1988) Science
239, 487-49 参照］を行ない、目的の抗ヒトＦａｓ抗体
重鎖あるいは軽鎖サブユニットをコードするＤＮＡ断片
を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、例えば
抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａを産生する
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）のｍＲＮ
Ａより逆転写酵素反応にて合成したｃＤＮＡを用いるこ
とができる。
【００８０】このようにして調製したＤＮＡ断片は、市
販のキット等を利用して直接プラスミドベクターに組み
込むこともできるし、該断片を32Ｐ、35Ｓあるいはビオ
チン等で標識し、これをプローブとして用いてコロニー
ハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼ
ーションを行なうことにより目的のクローンを選択する
こともできる。
【００８１】例えば、本発明の抗Ｆａｓモノクローナル
抗体として好適なモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａは、イ
ムノグロブリンＧ１（以下「ＩｇＧ１」という）分子で
あり、重鎖（γ１鎖）、軽鎖（κ鎖）の各サブユニット
からなる複合体である。これらの各サブユニットの部分
アミノ酸配列を調べる方法としては、電気泳動やカラム
クロマトグラフィーなどの周知の方法を用いて各サブユ
ニットを単離してから、自動プロテインシークエンサー
（例えば、島津製作所（株）製 PPSQ-10）等を利用して
それぞれのサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を解析す
る方法が好適である。
【００８２】上記のごとくして得られた目的の形質転換
株より、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体タンパク質の
各サブユニットをコードするｃＤＮＡを採取する方法
は、公知の方法［Maniatis, T., et al. (1982) in "Mo
lecular Cloning A LaboratoryManual" Cold Spring Ha
rbor Laboratory, NY. 参照］に従い実施できる。例え
ば細胞よりベクターＤＮＡに相当する画分を分離し、該
プラスミドＤＮＡより目的とするサブユニットをコード
するＤＮＡ領域を切り出すことにより行うことが可能で
ある。
【００８３】（２）合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いるスクリーニング法 目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明
されている場合（該配列は、複数個連続した特異的配列
であれば、目的タンパク質のどの領域のものでもよ
い）、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを
合成し（この場合、コドン使用頻度を参考に推測される
ヌクレオチド配列、または考えられるヌクレオチド配列
を組み合わせた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採
用でき、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を
減らすこともできる）、これをプローブ（32Ｐ、35Ｓあ
るいはビオチン等で標識する）として、形質転換株のＤ
ＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイ
ブリダイズさせ、得られたポジティブ株を選別する。
【００８４】このようにして得られるＤＮＡの配列の決
定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Maxa
m, A. M. and Gilbert, W. (1980) in "Methods in Enz
ymology" 65, 499-576参照］やジデオキシヌクレオチド
鎖終結法［Messing, J. andVieira, J. (1982) Gene 1
9, 269-276参照］等により実施することができる。
【００８５】また近年、蛍光色素を用いた自動塩基配列
決定システムが普及している（例えばパーキンエルマー
ジャパン社製シークエンスロボット"CATALYST 800"およ
びモデル373AＤＮＡシークエンサ一等）。
【００８６】こうしたシステムを利用することで、ＤＮ
Ａヌクレオチド配列決定操作を能率よく、かつ安全に行
うことも可能である。このようにして決定された本発明
のＤＮＡの各ヌクレオチド配列、および重鎖および軽鎖
の各Ｎ末端アミノ酸配列データから、本発明のモノクロ
ーナル抗体の重鎖および軽鎖の全アミノ酸配列を決定す
ることができる。
【００８７】イムノグロブリンの重鎖および軽鎖は、い
ずれも可変領域および定常領域からなり、可変領域はさ
らに相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」と記す；重鎖・軽
鎖ともに各３か所）およびそれらに隣接するフレームワ
ーク領域（重鎖・軽鎖ともに各４か所）からなる。
【００８８】このうち、定常領域のアミノ酸配列は、抗
原の種類に関係なく、イムノグロブリンサブクラスが同
一である抗体間では共通である。一方、可変領域、特に
ＣＤＲのアミノ酸配列は各抗体に固有のものであるが、
数多くの抗体のアミノ酸配列データを比較した研究によ
れば、ＣＤＲの位置やフレームワーク配列の長さは、同
じサブグループに属する抗体サブユニットの間ではほぼ
類似していることが知られている［Kabat, E. A., et a
l. (1991) in "Sequence of Proteins of Immunologica
l Interest Vol.II": U.S. Department of Health and
Human Services参照］。従って、例えば抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体ＨＦＥ７Ａ等の抗体の重鎖および軽鎖の各
アミノ酸配列とそれら公知のアミノ酸配列データとを比
較することにより、各アミノ酸配列におけるＣＤＲやフ
レームワーク領域および定常領域の位置を決定すること
ができる。なお、ＦＲＨ1、すなわち重鎖の最もＮ末端
側のフレームワーク領域の鎖長については、通常（３０
アミノ酸）より短いことがあり、例えば、マウスＩｇＧ
１のＨＦＥ７Ａと同じサブタイプとしては該フレームワ
ーク領域が最小１８アミノ酸である例などが知られてい
る［前出 Kabat etal. 参照］。このことから本発明の
抗体においては、抗Ｆａｓ抗体としての機能を損なわな
い限りにおいて、重鎖のＮ末端のフレームワーク領域の
鎖長を１８アミノ酸以上３０アミノ酸以下とするが、好
適には３０アミノ酸である。なお、本発明におけるイム
ノグロブリン重鎖のアミノ酸番号は、特に言及しない限
りＦＲＨ1が３０アミノ酸である場合のものとする。
【００８９】なお、上記のようにして決定された軽鎖ま
たは重鎖のそれぞれのＣＤＲと同じアミノ酸配列、もし
くはその中の連続した部分アミノ酸配列を有するペプチ
ドを、人為的な修飾操作を施して該ＣＤＲが抗Ｆａｓ抗
体分子中で形成する立体構造に近付けることにより、単
独でＦａｓに対する結合活性を付与せしめることが可能
である［例えば、米国特許第５３３１５７３号公報参
照］。したがって、そのように修飾された、ＣＤＲと同
じアミノ酸配列、もしくはその中の連続した部分アミノ
酸配列を有するペプチドも、本発明の分子に包含され、
Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患に対す
る予防または治療のために用いることができる。
【００９０】アミノ酸配列中の任意の一つもしくは二つ
以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するにあたっ
ては、カセット変異法［岸本利光、“新生化学実験講座
２・核酸III 組換えＤＮＡ技術” 242-251参照］など
に従うことができる。
【００９１】この様な各種のＤＮＡは、例えばフォスフ
ァイト・トリエステル法［Hunkapiller, M., et al. (1
984) Nature 310, 105-111参照］等の常法に従い、核酸
の化学合成により製造することもできる。なお、所望ア
ミノ酸に対するコドンは、それ自体が公知であり、その
選択も任意でよく、例えば使用する宿主のコドン使用頻
度を考慮して常法に従い決定することも可能である。こ
れらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常法に従
い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドか
らなるプライマーを利用した部位特異的変異導入法（サ
イトスペシフィック・ミュータジェネシス）［Mark, D.
F., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5
662-5666参照］等に従うことができる。
【００９２】また、あるＤＮＡが本発明の抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡと
ハイブリダイズするか否かは、例えば、該ＤＮＡを、ラ
ンダムプライマー法［Feinberg, A.P. and Vogelstein,
B. (1983) Anal. biochem.132, 6-13 参照］やニック
トランスレーション法［Maniatis, T., et al. (1982)
in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Sp
ring Harbor Laboratory, NY. 参照］等に従い［α−32
Ｐ］ｄＣＴＰ等で標識したプローブＤＮＡを用いて、以
下に記載するような実験を行うことにより調べることが
できる。
【００９３】まず調べようとするＤＮＡを、例えばニト
ロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、必要に応じ
てアルカリ変性等の処理を行なってから、加熱あるいは
紫外線等により固相化させる。この膜を、６×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１
５Ｍ クエン酸三ナトリウム溶液）と５％ デンハート
溶液、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を
含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸し、５５℃で
４時間以上保温してから、先に調製したプローブを同様
のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１
０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように加え、６０℃で一晩保温
する。その後、膜を室温下で６×ＳＳＣで５分間の洗浄
する操作を数回繰り返し、さらに２×ＳＳＣで２０分間
洗浄してから、オートラジオグラフィーを行う。
【００９４】上記のような方法を利用して、任意のｃＤ
ＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから、本発
明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の基礎となる抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡとハイ
ブリダイズするＤＮＡを単離することができる［Maniat
is, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A labo
ratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY.
参照］。
【００９５】上記のごとくして得られる各ＤＮＡを、そ
れぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生物ま
たは真核生物の宿主細胞に導入し、それらの宿主細胞で
各遺伝子を発現させることが可能である。
【００９６】原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）、や枯草菌（Bacillus subtilis
）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞
内で発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリ
コン、すなわち複製起点およびlac UV5 等のプロモータ
ー配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形
質転換すればよい。またべクターは、形質転換した細胞
での表現形質による選択性を付与することができる配列
を有するものが望ましい。例えば大腸菌としては、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ１２株由来のＪＭ１０９株等がよく用いら
れ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系
のプラスミドがよく用いられるが、これらに限定され
ず、公知の各種の菌株およびベクターをいずれも使用で
きる。またプロモーターとしては、大腸菌においては、
トリプトファン（trp ）プロモーター、ラクトース（la
c ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac
）プロモーター、リポプロテイン（lpp ）プロモータ
ー、バクテリオファージ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモ
ーター、ポリペプチド鎖伸長因子Ｔｕ（tufB）プロモー
ターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】枯草菌としては、例えば２０７−２５株が
好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８［Ohmura,
K., et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93 参照］等が
用いられるが、これに限定されない。またプロモーター
としては、枯草菌αアミラーゼ遺伝子の調節配列がよく
用いられ、さらに必要に応じてαアミラーゼのシグナル
ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することに
より、菌体外への分泌も可能となる。
【００９８】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母
等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサル
由来の細胞株であるＣＯＳ−１［Gluzman, Y. (1981) C
ell23, 175-182 参照］等が用いられる。酵母として
は、パン酵母（Saccharomycescerevisiae）やアルコー
ル資化性酵母（Pichia pastoris）、分裂酵母（Schizos
saccharomyces pombe）等が用いられる。ここに例示し
たような細胞が一般に宿主細胞としてよく用いられてい
るが、これらに限定されるものではない。
【００９９】脊椎動物細胞の発現べクターとしては、通
常は発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモ
ーター、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部
位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これ
にはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現
べクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを
有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ［Subramani, S., et al. (198
1) Mol. Cell. Bio. 1, 854-864 参照］等を例示できる
が、これに限定されない。
【０１００】酵母の発現べクターとしては、例えばアル
コール脱水素酵素遺伝子のプロモーター［Bennetzen,
J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3
018-3025 参照］や、ガラクトース代謝系酵素遺伝子
（ｇａｌ １０など）のプロモーター［Ichikawa, K.,
et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57, 1686-1
690 参照］等を利用でき、必要により酵母遺伝子のシグ
ナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結するこ
とにより、細胞外への分泌も可能となるが、これに限定
されるものではない。
【０１０１】宿主細胞としてＣＯＳ−１を用いる場合を
例に挙げると、発現べクターとしては、ＳＶ４０複製起
点を有し、ＣＯＳ−１において自立増殖が可能であり、
さらに転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲ
ＮＡスプライス部位を備えた発現ベクターを用いること
ができる。該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン
法［Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic A
cids Res. 11, 1295-1308 参照］、リン酸カルシウム−
ＤＮＡ共沈法［Graham, F. L. and van der Eb, A. J.
(1973) Virology 52, 456-457 参照］および電気穿孔法
［Neumann, E.,et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845 参
照］などによりＣＯＳ−１に取り込ませることができ、
かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【０１０２】特に、重鎖をコードするＤＮＡを含むこと
からなる発現べクターおよび同軽鎖をコードするＤＮＡ
を含むことからなる発現べクターでＣＯＳ−１をコ・ト
ランスフェクションすることにより、これらのＤＮＡを
同時に発現させ、組換え抗Ｆａｓ抗体を産生する形質転
換体を得ることができる。しかしながら、組換え抗Ｆａ
ｓ抗体を生産する方法は上記に限定されず、例えば、重
鎖および軽鎖のそれぞれをコードするＤＮＡを両方とも
保持し、これらを同時に発現させることができる単一の
発現ベクターを構築し、該ベクターでＣＯＳ−１細胞を
形質転換する方法等も用いることができる。
【０１０３】上記で得られる所望の形質転換体は、当業
者に周知の方法に従って培養することができ、該培養に
より、形質転換体細胞内または細胞外に組換え抗Ｆａｓ
抗体が産生される。該培養に用いられる培地としては、
採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜
選択でき、例えば上記ＣＯＳ−１の場合、ＲＰＭＩ１６
４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）な
どの培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの
血清成分を添加したものを使用できる。
【０１０４】該形質転換体の培養の際の培養温度は、細
胞内のタンパク質合成能を著しく低下せしめない温度で
あればいずれでもよいが、好適には３２〜４２℃、最も
好適には３７℃で培養する。また必要に応じて、１〜１
０％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスを含む空気中で培養すること
ができる。
【０１０５】なお、本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗
体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを動物細胞で発
現させる組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌
株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＥ−ＨおよびＥ．ｃｏｌｉ ｐＭ
Ｅ−Ｌは、それぞれ平成９（１９９７）年３月１２日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６８およびＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５８６７が付されている。従って、該寄託菌株から
単離された組換えＤＮＡベクターでＣＯＳ−１等の培養
動物細胞を形質転換し、この形質転換細胞を培養するこ
とにより、培養物中に組換え抗Ｆａｓ抗体を産生させる
ことができる。
【０１０６】上記により形質転換体の細胞内または細胞
外に生産される、抗Ｆａｓ抗体タンパク質を含む画分
は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用し
た各種公知のタンパク質分離操作法により、分離・精製
することができる。かかる方法としては、具体的には例
えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外ろ過、分
子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、透析
法、およびこれらの組み合わせ等を採用できる。
【０１０７】抗Ｆａｓマウスモノクローナル抗体をヒト
化するためには、決定されたＣＤＲ配列全体およびＦＲ
配列の一部のアミノ酸残基をヒト抗体へ移植するよう
に、可変領域のアミノ酸配列を設計する必要がある。こ
の設計は、以下の方法に従う。従来、ヒト化のデザイン
を行う場合、アクセプターのサブグループの選択指針と
しては、 天然のアミノ酸配列を有する公知のヒト抗体の重鎖、
軽鎖の天然の組合せをそっくりそのまま用いる、 重鎖、軽鎖が属するサブグループとしての組合せは保
存するが、重鎖、軽鎖としては、それぞれ異なるヒト抗
体に由来し、ドナーの重鎖、軽鎖のアミノ酸配列と同一
性が高いアミノ酸配列、または、コンセンサス配列を用
いる、のいずれかが選択されている。本発明において
も、上記の指針に従うことができるが、これらと異なる
方法として、 サブグループの組合せを考慮することなく、ドナーの
ＦＲと最も同一性の高い重鎖、軽鎖のＦＲをヒト抗体の
一次配列のライブラリーの中から選択する、という方法
を採用することも可能である。これらの選択法により、
ドナーおよびアクセプター間での、ＦＲ部分のアミノ酸
の同一性を少なくとも７０％以上とすることが可能とな
る。この方法を採用することにより、ドナーより移植す
るアミノ酸残基の数をより少なくすることが可能とな
り、ＨＡＭＡ応答誘導を減少させることができる。
【０１０８】また、抗体分子の一次配列より三次構造を
予測する操作（以下、この操作を「分子モデリング」と
いう）はその予測精度に限界があり、そのドナーが属す
るサブグループにおいて稀にしか出現しないアミノ酸残
基の役割を十分に特定することができない。クィーンら
の方法に従い、かかる位置においてドナー、アクセプタ
ーのいずれのアミノ酸残基を選択すべきかを判断するこ
とは一般に困難である。の選択法によれば、このよう
な判断をする機会を著しく減少することができる。
【０１０９】本発明者らは、ドナーのＣＤＲの構造およ
び機能を維持するために重要なドナーのＦＲ由来のアミ
ノ酸を同定するための新規な方法を提供することによっ
て、このヒト化の方法をさらに改良している。
【０１１０】軽鎖、重鎖それぞれのヒトアクセプター分
子が選択された後、ドナーのＦＲより移植するアミノ酸
残基を選択する方法は、以下に記載する通りである。
【０１１１】ドナーとアクセプターのアミノ酸配列を並
べ、両者のＦＲの対応する位置でアミノ酸残基が異なっ
ていた場合、どちらの残基を選択するべきかを決定する
必要があるが、この選択においては、ドナー由来のＣＤ
Ｒの三次元構造を損なわないよう選択を行う必要があ
る。
【０１１２】クィーンらは前述の特表平４−５０２４０
８号において、ＦＲ上のアミノ酸残基が、以下の要件の
少なくともひとつに該当する場合、ＣＤＲ配列とともに
アクセプターに移植する方法を提唱した： １）アクセプターのヒトＦＲ領域中のアミノ酸がその位
置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアク
セプターの前記位置において普通である； ２）該アミノ酸がＣＤＲのひとつのすぐ近くである； ３）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいて
ＣＤＲの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とま
たはヒト化抗体のＣＤＲと相互作用することができると
予想される。
【０１１３】ここで２）で示された残基はしばしば３）
の性質を示すことより、本発明ではこの２）の要件を削
除し、別に新たに２種の要件を設ける。すなわち、本発
明では、ＣＤＲと共に移植すべきドナーのＦＲ上のアミ
ノ酸残基については： ａ）アクセプターのＦＲ中のアミノ酸がその位置におい
て稀でありドナーの対応するアミノ酸が当該位置におい
て普通であるか； ｂ）該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、ＣＤＲの
構成アミノ酸原子と抗原または移植すべきＣＤＲループ
との相互作用が予想されるか； ｃ）当該位置がカノニカルクラス決定残基であるか； ｄ）当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成するか、 である場合に、ドナーのＦＲから当該アミノ酸残基を移
植することにする。
【０１１４】ａ）の要件では、前述したカバトの表に従
い、同一サブクラスの抗体について当該位置で９０％以
上の頻度で見いだされるアミノ酸を「普通」、１０％未
満の頻度で見いだされるアミノ酸を「稀」と定義する。
【０１１５】ｃ）の要件では、「当該位置がカノニカル
クラス決定残基であるか」否かについては、前述したチ
ョッチアの表に従い、一義的に決定することができる。
【０１１６】ｂ）、ｄ）の要件については、予め抗体可
変領域の分子モデリングが必要となる。分子モデリング
用ソフトウェアとしては、市販のものならいずれのもの
も採用し得るが、好適には、ＡｂＭ（オックスフォード
・モレキュラー・リミティッド社製）を使用することが
できる。
【０１１７】分子モデリングの予測精度には一定の限界
があるので、本発明においては、種々の抗体の可変領域
のＸ線結晶解析の実験結果を参照することにより、分子
モデリングから得られる構造予測の確からしさを２段階
に区別する。
【０１１８】本発明においては、ＡｂＭ等の分子モデリ
ング用ソフトウェアによって構築されたところの可変領
域の３次元構造において、２原子間の距離が、各々のフ
ァンデルワールス半径の和に０．５Åを加えた値より短
いとき、当該２原子間はファンデルワールス接触してい
ると推定した。主鎖および側鎖のアミド窒素、カルボニ
ル酸素など極性の原子間距離が平均の水素結合距離であ
る２．９Åに０．５Å加えた距離より短い場合は、その
間に水素結合が存在すると推定した。さらに、相反する
電価を持つ原子間が、２．８５Åに０．５Å加えた距離
より短い場合は、その間にイオン対が形成されているも
のと推定した。
【０１１９】一方、種々の抗体の可変領域のＸ線結晶構
造解析の実験結果から、サブグループと無関係に、高頻
度にＣＤＲとの接触が見いだされるＦＲ上の位置とし
て、軽鎖では、１、２、３、４、５、２３、３５、３
６、４６、４８、４９、５８、６９、７１、８８番の位
置、重鎖では、２、４、２７、２８、２９、３０、３
６、３８、４６、４７、４８、４９、６６、６７、６
９、７１、７３、７８、９２、９３、９４、１０３番の
位置が特定される（数字はいずれも前出カバトらの文献
において定義されるアミノ酸番号を表わす。以下におい
て同じ）。分子モデリングと同じ基準を適用した場合、
これらの位置のアミノ酸残基は、公知の抗体可変領域の
３分の２においてＣＤＲのアミノ酸残基との接触が認め
られる。これらの知見に基き、ｂ）の「該アミノ酸が三
次元構造モデルにおいて、ＣＤＲの構成アミノ酸原子が
抗原または移植すべきＣＤＲループとの相互作用が予想
される」とは、以下の要件を意味する。
【０１２０】分子モデリングにおいて、ＦＲとＣＤＲと
の接触の可能性が予見されたＦＲの位置が、Ｘ線結晶解
析により実験的にＦＲとＣＤＲとの接触が高頻度に検出
される位置のいずれかに一致する場合は、ドナーのアミ
ノ酸残基の移植を優先する。それ以外の場合は、この要
件ｂ）は考慮しない。
【０１２１】ｄ）の「当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を
構成する」とは、以下の要件を意味する。種々の抗体の
可変領域のＸ線結晶解析の実験結果から、軽鎖において
は、３６、３８、４３、４４、４６、４９、８７、９８
番目のアミノ酸残基、重鎖においては、３７、３９、４
５、４７、９１、１０３、１０４番目のアミノ酸残基
が、高頻度に重鎖−軽鎖間接触をすることが認められて
いる。分子モデリングにおいて、重鎖−軽鎖間接触の可
能性が予見され、その位置が上述の位置のいずれかに一
致する場合は、ドナーのアミノ酸残基の移植を優先す
る。それ以外の場合は、この要件ｄ）は考慮しない。
【０１２２】本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖および
軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、以下に記載する
方法で製造することができる。
【０１２３】例えば、６０乃至７０ヌクレオチドの、該
ＤＮＡの部分ヌクレオチド配列からなる複数のポリヌク
レオチド断片を、センス側およびアンチセンス側におい
て互い違いになるように化学合成し、その後各ポリヌク
レオチド断片をアニーリングし、ＤＮＡリガーゼにより
結合し、所望のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の
可変領域をコードするＤＮＡを有するＤＮＡを得ること
ができる。
【０１２４】別の方法として、アクセプターの可変領域
の全アミノ酸配列をコードするＤＮＡをヒトリンパ球よ
り分離し、ＣＤＲをコードする領域に当業者に周知の方
法でヌクレオチド置換を行うことにより、制限酵素切断
配列を導入する。対応する制限酵素で該領域を切断した
後、ドナーのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を合
成し、ＤＮＡリガーゼにより結合して、所望のヒト化抗
Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤ
ＮＡを得ることができる。
【０１２５】さらに、本発明では、好適には以下に述べ
るオーバーラップ・エクステンション・ＰＣＲ法（ホル
トンら、Gene, 77, 61-68, (1989) 参照）に従い、所望
のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコ
ードするＤＮＡを得ることができる。
【０１２６】すなわち、接続を所望する２種のアミノ酸
配列をそれぞれコードする２種のＤＮＡを、便宜的に
（Ａ）および（Ｂ）とする。（Ａ）の５’側にアニール
する２０乃至４０ヌクレオチドのセンスプライマ−（以
下、このプライマーを（Ｃ）とする。）および（Ｂ）の
３’側にアニールする２０乃至４０ヌクレオチドのアン
チセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｄ）と
する）を化学合成する。さらに、（Ａ）の３’側の２０
乃至３０ヌクレオチドと（Ｂ）の５’側２０乃至３０ヌ
クレオチドを連結した、キメラ型のセンスプライマー
（以下、このプライマーを（Ｅ）とする）およびこれに
相補的なアンチセンスプライマー（以下、このプライマ
ーを（Ｆ）とする）を合成する。（Ａ）を含む適当なベ
クターＤＮＡを基質にして、センスプライマ−（Ｃ）お
よびキメラ型アンチセンスプライマー（Ｆ）を用いたＰ
ＣＲを行うことにより、（Ａ）の３’末端に（Ｂ）の
５’末端側２０乃至３０ヌクレオチドが付加したＤＮＡ
を得ることができる（この新たに得られたＤＮＡを
（Ｇ）とする）。同様に、（Ｂ）を含む適当なベクター
ＤＮＡを基質にして、アンチセンスプライマー（Ｄ）お
よびキメラ型センスプライマー（Ｅ）を用いたＰＣＲを
行うことにより、（Ｂ）の５’末端に（Ａ）の３’末端
側２０乃至３０ヌクレオチドが付加したＤＮＡを得るこ
とができる（この新たに得られたＤＮＡを（Ｈ）とす
る。）。このようにして得られた（Ｇ）と（Ｈ）は、
（Ｇ）の３’側４０乃至６０ヌクレオチドと（Ｈ）の
５’側４０乃至６０ヌクレオチドにおいて相補的なヌク
レオチド配列を保持している。増幅された（Ｇ）および
（Ｈ）を混合してＰＣＲを行った場合、１回目の変性反
応で（Ｇ）と（Ｈ）は１本鎖になり、その後のアニーリ
ング反応で殆どのＤＮＡは元に戻るが、一部のＤＮＡに
ついては相補的ヌクレオチド配列領域でアニーリングす
るヘテロＤＮＡ２本鎖を形成する。その後の伸長反応
で、突出した１本鎖部分が修復され、（Ａ）と（Ｂ）が
連結したキメラ型のＤＮＡ（以下、このＤＮＡを（Ｉ）
とする。）を得ることができる。さらにこの（Ｉ）を基
質として、センスプライマー（Ｃ）とアンチセンスプラ
イマー（Ｄ）を用いＰＣＲを行うことにより、（Ｉ）を
増幅することができる。本発明では、抗ヒトＦａｓマウ
スモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域を
コードするＤＮＡおよびヒト免疫グロブリンＩｇＧのＦ
Ｒ領域をコードするＤＮＡ、さらには、ヒト免疫グロブ
リンＩｇＧの分泌シグナルをコードするＤＮＡを、それ
ぞれケース・バイ・ケースにより（Ａ）および（Ｂ）と
して上記の連結反応を行うことができる。
【０１２７】なお、所望アミノ酸に対するコドンは、そ
れ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用
する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定で
きる。これらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常
法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオ
チドからなるプライマーを利用したサイトスペシフィッ
ク・ミュータジェネシス（site specific mutagenesis
）（Mark, D. F., etal.(1984) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 81, 5662-5666参照）等に従うことができる。し
たがって、各プライマーを化学合成する際に、予め点突
然変異を導入するように各プライマーを設計することに
より、所望の抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域
をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１２８】このようにして得られた本発明の各ＤＮＡ
をそれぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生
物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることがで
きる。さらに、これらベクターに適当なプロモーターお
よび形質発現に関わる配列を導入することにより、各々
の宿主細胞において各遺伝子を発現させることが可能で
ある。
【０１２９】なお、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の軽鎖
の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ３種の形質
転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＭＭ６ ＳＡＮＫ ７
３６９７株、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＨＭ１７ ＳＡＮ
Ｋ ７３５９７株およびＥ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＨＨ７
ＳＡＮＫ ７３４９７株、ならびに、本発明のヒト化
抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組
み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇＨＳＬ７Ａ６
２ ＳＡＮＫ７３３９７株は、平成９年（１９９７年）
８月２２日に工業技術院生命工学工業技術研究所に国際
寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７
１、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７２およびＦＥＲＭ ＢＰ−
６０７３、ならびにＦＥＲＭ ＢＰ−６０７４が付され
ている。さらに、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の
可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ２種の形質転
換体、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＨＭ２ ＳＡＮＫ ７０１
９８株およびＥ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＨＨ５ ＳＡＮＫ
７０３９８株、ならびに、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体
の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質
転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇＨＰＤＨＶ３ ＳＡＮＫ
７０２９８株は、平成１０年（１９９８年）２月２６日
に工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、
それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７２およびＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６２７４、ならびにＦＥＲＭ ＢＰ−６２
７３が付されている。従って、該寄託菌株からプラスミ
ドを単離するか、もしくは該寄託菌株の抽出物を鋳型に
してＰＣＲを行うなどの方法によりヒト化抗Ｆａｓ抗体
タンパク質の各サブユニットをコードするＤＮＡを取得
することができる。
【０１３０】上記方法により、容易に高収率、高純度で
組換え抗Ｆａｓ抗体を製造できる。このようにして作製
される組換え抗Ｆａｓ抗体がＦａｓと特異的に結合する
ことを確認する方法としては、例えば、マウス免疫時に
抗体価の評価を行う場合と同様のＥＬＩＳＡ法が好適で
ある。
【０１３１】本発明の分子（抗体に限定されない）は下
記のａ）乃至ｆ）の機能的特性を有し、それぞれの特性
は例えば各項目に記載の方法により確認することができ
る： ａ）Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス
誘導活性： 本発明の分子を投与したマウスから胸腺を
摘出し、得られた胸腺細胞を、抗マウスＦａｓ抗体およ
びＴ細胞を特異的に認識する抗体と接触させ、両方の抗
体が結合した細胞の割合をフローサイトメトリーで測定
することにより、Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対する
アポトーシス誘導活性を調べる； ｂ）ＭＲＬgld ／gld マウスの自己免疫疾患症状の軽
減： Ｆａｓリガンドをコードする遺伝子に突然変異が
生じており、自己免疫疾患様の症状を示すＭＲＬgld ／
gld マウス［米原伸 (1994) 日経サイエンス 別冊110
、66-77 参照］に本発明の分子を腹腔内投与すること
により、該マウスの自己免疫疾患様症状である手足の腫
れが軽減するか否かを調べる； ｃ）肝臓障害を誘発しない： 本発明の分子を投与した
ＢＡＬＢ／ｃマウスから末梢血を採取し、血中のグルタ
ミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（以下「ＧＯ
Ｔ」という）値およびグルタミン酸−ピルビン酸トラン
スアミナーゼ（以下「ＧＰＴ」という）値を、自動分析
装置（例えば７２５０型；日立製作所（株）社製）およ
び同装置用試薬（例えばトランスアミナーゼ−ＨＲＩ
Ｉ；和光純薬（株）社製）を用いて測定する。本発明の
分子は、生体に投与されても肝臓障害の指標である血中
のＧＯＴ値およびＧＰＴ値を上昇させない； ｄ）劇症肝炎に対する治療または予防効果： 抗マウス
Ｆａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２をマウスに投与して劇
症肝炎を誘発する実験系において、Ｊｏ２投与と同時、
もしくはＪｏ２投与後に本発明の分子を投与した場合の
効果を調べる； ｅ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果： コ
ラーゲンおよび完全フロイントアジュバントからなるエ
マルジョンをマウスに投与することにより惹起される慢
性関節リウマチモデルに対する、本発明の分子の投与の
効果を調べる； ｆ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポト
ーシス誘導活性： 慢性関節リウマチ患者患部より採取
された滑膜細胞を培養し、本発明の分子を培地に含有せ
しめた時の該細胞の生存率を調べる。
【０１３２】本発明の分子は上記ａ）およびｆ）記載の
活性、すなわち異常細胞に対してアポトーシスを誘導す
る活性と、上記ｃ）およびｄ）記載の活性、すなわち正
常細胞にはアポトーシスを誘導せず、むしろアポトーシ
スを阻害する活性とを併せ持つ、新規な特性を有する物
質であり、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する
疾患に対する予防または治療剤に含有せしめる成分とし
て有用である。
【０１３３】また、本発明の分子がアポトーシス誘導活
性を有することは、被検検体を添加した培地中で細胞
（例えば、ヒトリンパ球細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（Morika
wa, S., et al. (1978) Int. J. Cancer 21, 166-170参
照）またはＪｕｒｋａｔ（American Type Culture No.
TIB-152 ）等）を培養し、その生存率をＭＴＴアッセイ
（Green, L. M., et al. (1984) J. Immunological Met
hods 70, 257-268参照）等の方法で測定することにより
確認することができる。
【０１３４】本発明の分子、特に、ヒトに対する免疫原
性がヒト抗体とほぼ同等の抗Ｆａｓ抗体は、Ｆａｓ／Ｆ
ａｓリガンド系の以上に起因する疾患（自己免疫疾患
（全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマ
チ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、
アジソン氏病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クロ
ーン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無
力症、多発性硬化症、バセドー病、突発性血小板減少性
紫斑病、インスリン依存性糖尿病）、アレルギー、アト
ピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生
不良性貧血、肝炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝
炎（Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコール
性肝炎）、後天性免疫不全症候群または臓器移植後の拒
絶反応）に対し、このものを有効成分とする予防または
治療剤として使用することができる。かかる予防または
治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの
投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、
シロップ剤等による経口投与、または、注射剤、点滴
剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
【０１３５】その投与量は、症状、年齢、体重などによ
って異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１
日約０．１ｍｇ乃至１０００ｍｇであり、これらを１
回、または数回に分けて投与することができる。また、
非経口投与では、１回０．１ｍｇ乃至１０００ｍｇを皮
下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与すること
ができる。
【０１３６】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０１３７】実施例１ 抗原の調製 細胞膜貫通領域を含まない可溶性ヒトＦａｓを得るた
め、ヒトＦａｓの細胞外領域とマウス・インターロイキ
ン３（ＩＬ３）受容体［Gorman, D. M. et al. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5459-5463 参照］の
細胞外領域との融合タンパク質（以下「ヒトＦａｓ融合
タンパク質」という）発現プラスミドベクターを作製し
た。ヒトＦａｓ融合タンパク質をコードするＤＮＡは、
ＰＣＲ法により作製した。
【０１３８】ａ） 鋳型 ＰＣＲを行うにあたり、鋳型として用いたのは、マウス
Ｆａｓの細胞外領域とマウスＩＬ３受容体の細胞外領域
との融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現プラスミ
ドベクター ｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣ［Nishim
ura, Y. et al.(1995) J. Immunol. 154, 4395-4403参
照］およびヒトＦａｓをコードするｃＤＮＡを保持する
プラスミドベクターｐＣＥＶ４［Itoh, N., et al. (19
91) Cell66, 233-243参照］である。
【０１３９】ｂ） プライマー ＰＣＲを行うにあたり、以下に記載するオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成した： 5'- GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT -3' （Ｎ１：配列表の配列番号１２）、 5'- GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA -3' （Ｃ３Ｎ：配列表の配列番号１３）、 ５’− ＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡ ＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣ
ＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡ ＧＡＡＡＣ −３’ （Ｎ３Ｎ：配列表の配列番号１４）、 ５’− ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣ ＧＣＧＴＣＡＣＧＴＧ
ＧＧＣＡＴＣＡＣ −３’ （ＣＴＮ２：配列表の配列番号１５）。
【０１４０】ＰＣＲ用プライマー等のオリゴヌクレオチ
ドの合成は、全てＤＮＡ自動合成機（モデル３８０Ｂ；
（株）パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオ
システムズ事業部製）を用いて、そのマニュアルに従っ
て行った［Matteucci,M.D. and Caruthers,M.H.(1981)
J.Am.Chem.Soc.103,3185-3191 参照］。各オリゴヌクレ
オチドは合成終了後、支持体から開裂させ脱保護を行
い、得られた溶液を凍結乾燥することにより粉末状にし
た。この粉末を蒸留水に溶解し、使用するまで−２０℃
で凍結保存した。
【０１４１】ｃ） 第一段階ＰＣＲ ヒトＦａｓの細胞外領域をコードするＤＮＡ断片 ＨＦ
ＡＳは、以下の条件で作製された。なお、ＰＣＲを実施
するにあたっては、ＬＡ ＰＣＲキット（宝酒造（株）
社製）を使用した。
【０１４２】 反応液組成： 鋳型 ｐＣＥＶ４ ＤＮＡ ２０ｎｇ プライマー Ｎ１ ０．５μｇ Ｃ３Ｎ ０．５μｇ １０倍濃度 ＬＡ ＰＣＲ緩衝液 （キットに添付） ２５μｌ ｄＮＴＰｓ （キットに添付） ２５μｌ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ （キットに添付） １２．５単位 滅菌蒸留水で２５０μｌとした（ｄＮＴＰｓは、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの等モル混合物
を表す。以下の記載において同じ）； 温度条件： ９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１
分、５５℃で１分、７２℃で２分の温度サイクルを３０
回繰り返した後、７２℃で１０分間保温した（以下、実
施例中のすべてのＰＣＲの反応温度調節は、ジーンアン
プＰＣＲシステム９６００；（株）パーキンエルマー・
ジャパン社製を使用した）。
【０１４３】一方、マウスＩＬ３受容体の細胞外領域を
コードするＤＮＡ断片 ＭＡＩＣは以下の条件で作製さ
れた。
【０１４４】 反応液組成： 鋳型 ｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣ ＤＮＡ ２０ｎｇ プライマー Ｎ３Ｎ ０．５μｇ ＣＴＮ２ ０．５μｇ １０倍濃度 ＬＡ ＰＣＲ緩衝液 ２５μｌ ｄＮＴＰｓ ２５μｌ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ １２．５単位 滅菌蒸留水で２５０μｌとした； 温度条件： 上記に同じ。
【０１４５】ＰＣＲ後の増幅されたＨＦＡＳ ＤＮＡお
よびＭＡＩＣ ＤＮＡは、それぞれフェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動され、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムにより染色され
た後、紫外線照射下で検出された。検出されたそれぞれ
のバンド部分のゲル片を剃刀刃で切り取り、遠心管型限
外濾過器セントリコン１０（アミコン社製）を装着した
セントリリューター（アミコン社製）を用いてＤＮＡを
電気的に溶出した。さらにこの溶出液の入ったセントリ
コン１０を取り出して、７５００×ｇ、約１時間の遠心
分離を行うことによりＤＮＡを濃縮した。このＤＮＡを
エタノール沈澱の後、２０μｌの蒸留水に溶解した。
【０１４６】ｄ） 第二段階ＰＣＲ ヒトＦａｓ融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片 Ｆ
ＡＳＡＩＣは、以下の条件で作製された。
【０１４７】 反応液組成： 鋳型ＤＮＡ溶液 ＨＦＡＳ ２０μｌ ＭＡＩＣ ２０μｌ プライマー Ｎ１ ０．５μｇ ＣＴＮ２ ０．５μｇ １０倍濃度 ＬＡ ＰＣＲ緩衝液 ２５μｌ ｄＮＴＰｓ ２５μｌ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ １２．５単位 滅菌蒸留水で２５０μｌとした； 温度条件： 第一段階に同じ。
【０１４８】ＰＣＲ後の増幅されたＦＡＳＡＩＣ ＤＮ
Ａは、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、１％アガ
ロースゲル電気泳動を行い、１μｇ／ｍｌの臭化エチジ
ウムにより染色され、紫外線照射下で検出された。検出
されたバンド部分のゲル片を剃刀刃で切り取り、このゲ
ル片よりセントリリューターおよびセントリコンを用い
てＤＮＡを溶出、濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μ
ｌの蒸留水に溶解した。
【０１４９】ｅ） ベクターの構築 上記ｄ）で得られたＦＡＳＡＩＣ ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＸｂａＩで消化した（ＦＡＳＡＩＣ ＤＮＡ
溶液全量を使用した）後、フェノール−クロロホルム抽
出およびエタノール沈澱を行った。この沈澱を２μｌの
滅菌脱イオン水に懸濁した。
【０１５０】一方、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ
−ＡＩＣ ２μｇをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し
てから脱リン酸化したＤＮＡ断片を調製し、このものと
上記ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したＦＡＳＡＩＣ Ｄ
ＮＡとライゲーションキット（宝酒造（株）社製）を用
いて連結した後、ハナハンの方法［Hanahan,D.(1983)J.
Mol.Biol.166,557-580 参照］に従って大腸菌ＤＨ５α
株（ギブコ・ビーアールエル社製）の形質転換を行なっ
た。この形質転換大腸菌株よりアルカリＳＤＳ法［Mani
atis, T., et al. (1989) in Molecular Cloning: A La
boratory Manual (2nd Edition), Cold Spring Harbor
Laboratory, NY参照］でプラスミドを調製し、目的のプ
ラスミド ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２を得た。
【０１５１】このプラスミドをプラスミド大量調製キッ
ト（マキシプレップ・ ＤＮＡ精製システム：プロメガ社
製）を用いて調製し、２０μｇ相当のＤＮＡをエタノー
ル沈澱させた後、沈澱を滅菌したダルベッコＰＢＳ
（−）（以下「ＰＢＳ」という；日水製薬（株）社製）
２０μｌに溶解した。
【０１５２】ｆ） 発現 ＣＯＳ−１細胞（American Type Culture Collection N
o. CRL-1650 ）を、１０％ ウシ胎児血清（ギブコ社
製）（以下「ＦＣＳ」という）を含むダルベッコ変法イ
ーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という：日水製薬（株）
社製）を入れた細胞培養用フラスコ（培養面積２２５ｃ
ｍ2；住友ベークライト（株）社製）中でセミコンフル
エントになるまで３７℃、５％ 炭酸ガス下で培養した
後、培地を除去してから、フラスコに５ｇ／リットル
トリプシンおよび２ｇ／リットルエチレンジアミン四酢
酸二ナトリウムを含む溶液（以下「トリプシン−ＥＤＴ
Ａ溶液」という；シグマ社製）３ｍｌを入れて３７℃で
３分間保温した。フラスコから遊離した細胞をＰＢＳに
懸濁して回収し、ＰＢＳで２回洗浄してから、ＰＢＳで
６×１０7細胞／ｍｌとなるように調整した。この細胞
懸濁液２０μｌ（１．２×１０6細胞）と上記で調製し
たプラスミド溶液２０μｌずつを混合し、電極間隔２ｍ
ｍのチャンバー（島津製作所（株）社製）に入れ、遺伝
子導入装置（ＧＴＥ−１；島津製作所（株）社製）にセ
ットしてから６００Ｖ−３０μｓｅｃのパルスを１秒間
隔で２回加えた。チャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を
１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ １０ｍｌに加え、細胞培
養用フラスコ（培養面積７５ｃｍ2）中で３７℃、７．
５％ 炭酸ガス下で２４時間培養した。次いで培養上清
を除去し、無血清ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、無血清
ＤＭＥＭ １０ｍｌを加えて、３７℃、７．５％ 炭酸
ガス下でさらに２４時間培養し、培養上清を回収した。
【０１５３】得られた培養上清を透析チューブ（排出限
界分子量１２０００−１４０００；ギブコ・ビーアール
エル社製）に入れ、１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．
０）に対して透析した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣ装
置を用いて以下に記載する条件でヒトＦａｓ融合タンパ
ク質の粗精製を行った： カラム： リソースＱカラム（商標名；φ６．４×３０
ｍｍ、ファルマシア社製）； 溶媒： １０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０） 流速： ５ｍｌ／分； 溶出： 塩化ナトリウム ０．１Ｍ−０．３Ｍ、３０分
間の直線濃度勾配。
【０１５４】溶出液を５ｍｌずつ分画し、以下に記載す
るＥＬＩＳＡ法によりＦａｓ遺伝子発現産物の検定を行
った。まず、各溶出分画 １００μｌを９６穴マイクロ
プレート（コースター社製）のウェルに入れ、３７℃で
１時間保温した。各ウェル中の液を除去後、０．１％
ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）を含むＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ）１００μｌ／ウェルで３回洗浄し、２
％ ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を含
むＰＢＳ １００μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間
保温した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ １００μｌ
／ウェルで３回洗浄した後に、抗マウスＩＬ−３受容体
βサブユニットモノクローナル抗体ＨＣ（１ｍｇ／ｍ
ｌ；医学生物学研究所（株）社製）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで１０００倍希釈した溶液 １００μｌ／ウェルを入
れて３７℃で１時間保温した。さらに、各ウェルをＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ １００μｌで３回洗浄した後に、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎで２０００倍希釈した西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（アマシ
ャム社製）１００μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間
保温してから、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ １００
μｌで３回洗浄した。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ
基質（バイオラッド社製）１００μｌ／ウェルを入れて
５分間静置してから、マイクロプレートリーダー（モデ
ル４５０；バイオラッド社製）を用いて４１５ｎｍの吸
光度を測定した。その結果、吸光度が高かった１９乃至
２３番目の分画を集めて、粗精製ヒトＦａｓ融合タンパ
ク質試料とした。
【０１５５】実施例２ マウスの免疫およびハイブリド
ーマの調製 （２−１） 免疫 実施例１で得られた粗精製ヒトＦａｓ融合タンパク質溶
液 １ｍｌ（全タンパク質量; １００μｇ）に対し、２
Ｎ 塩酸 ２５μｌ、９％ カリミョウバン２５０μｌ
（終濃度１．１％）、２Ｎ 水酸化ナトリウム ２５μ
ｌを添加した後、１０％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム
水溶液 約１２０μｌを添加することによりｐＨ６．５
乃至７．０に調整した。室温で約３０分間放置後、Ｔ細
胞の活性化のために百日咳菌死菌（和光純薬（株）社
製；１．２×１０11菌／ｍｌ）２００μｌを添加し、こ
れをＦａｓノックアウトマウス腹腔内に投与した。Ｆａ
ｓノックアウトマウスは、千住らの文献に記載する方法
により取得されたものを使用した［Senju, S. et al.
(1996) International Immunology 8, 423 参照］。２
週間後、粗精製ヒトＦａｓ融合タンパク質のみ（２０μ
ｇタンパク質／マウス）を腹腔内に投与し追加免疫し
た。
【０１５６】（２−２） 細胞融合 追加免疫３日後のマウスより脾臓を摘出し、これを２０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）、３５０ｍｇ／
ｍｌ 炭酸水素ナトリウム、０．０５ｍＭ β−メルカ
プトエタノール、５０単位／ｍｌ ペニシリン、５０μ
ｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、３００μｇ／ｍｌ Ｌ
−グルタミン酸を含む無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（１
０．４ｇ／リットル ＲＰＭＩ１６４０「ニッスイ」
：日水製薬（株）社製）（以下「無血清ＲＰＭＩ培
地」という）１０ｍｌ中に入れ、メッシュ（セルストレ
イナー：ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶ
した。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して脾臓細
胞を沈澱させた後、この脾臓細胞を無血清ＲＰＭＩ培地
で２回洗浄してから、無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁して細
胞数を測定した。
【０１５７】一方、１０％ ＦＣＳ（ギブコ・ビーアー
ルエル社製）を含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社
製）（以下「血清入りＡＳＦ培地」という）にて、３７
℃、５％ 炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０8細胞
／ｍｌを越えないように培養したミエローマ細胞 ＮＳ
１（American Type Culture Collection TIB-18 ）を同
様に無血清ＲＰＭＩ培地で洗浄し、無血清ＲＰＭＩ培地
に懸濁して細胞数を測定した。
【０１５８】３×１０7個相当のＮＳ１細胞懸濁液と、
３×１０8個相当の脾臓細胞懸濁液を混合し、遠心後、
上清を完全に除去した。以下の細胞融合の操作は、ペレ
ットの入ったプラスチック遠沈管を温水を入れたビーカ
ー中で３７℃に保温しながら実施した。このぺレット
に、５０％（ｗ／ｖ） ポリエチレングリコール １５
００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍｌを、ピペッ
トの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、
予め３７℃に加温しておいた無血清ＲＰＭＩ培地１ｍｌ
を２回に分けてゆっくり添加し、さらに７ｍｌの無血清
ＲＰＭＩ培地を添加した。遠心後、上清を除去し、１０
％ ＦＣＳを含むヒポキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジン培地（以下「ＨＡＴ培地」という；ベーリンガー
・マンハイム社製）１０ｍｌを、ピペットの先でゆっく
り撹拌しながら添加した。さらに１０％ ＦＣＳを含む
ＨＡＴ培地 ２０ｍｌを添加した後に、細胞培養用９６
穴マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、
３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。７〜８日後、培地
が黄色味を帯びたウエルには新しいＨＡＴ培地を１００
μｌ／ウェルずつ加えた。このようにして得られた融合
細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニン
グに供した。
【０１５９】（２−３） 限界希釈 ４〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウス雌（日本エスエルシ
ー社より購入）より胸腺を摘出後、メッシュ（セルスト
レイナー；ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつ
ぶし、メッシュを通過した細胞を１０％ ＦＣＳを含む
ヒポキサンチン・チミジン培地（以下「ＨＴ培地」とい
う；ベーリンガー・マンハイム社製）で２回洗浄した。
マウス１匹分の胸腺細胞を１０％ ＦＣＳを含むＨＴ培
地 ３０ｍｌに懸濁したものをフィーダー細胞液とし
た。上記（２−２）で得られた融合細胞を含む培養液
を、細胞密度に応じてフィーダー細胞液で１０乃至１０
０倍に希釈し、さらに融合細胞の密度が５細胞／ｍｌ、
１細胞／ｍｌ、０．５細胞／ｍｌとなるように、フィー
ダー細胞液で段階希釈した。このようにして調製した各
試料を、細胞培養用９６穴マイクロプレートに１００μ
ｌ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス下で５日
間培養した。
【０１６０】（２−４） 選別 マウスＴリンパ腫細胞ＷＲ１９Ｌ（American Type Cult
ure Collection TIB-52 ）にヒトＦａｓをコードする遺
伝子を発現させたＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞［Itoh, N. et.
al. (1991) Cell 66, 233-243参照］を、１０％ ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％炭酸
ガス下で培養し増殖させてから、１×１０7細胞／ｍｌ
に調整した細胞懸濁液を、Ｕ字底９６穴マイクロプレー
ト（ヌンク社製）に５０μｌ／ウェルずつ分注し、遠心
分離（９０×ｇ、４℃、１０分）した。上清を除去し、
上記（２−３）で培養した融合細胞の培養上清を５０μ
ｌ／ウェル加えて撹拌した後、氷上で１時間静置してか
ら、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除
去した。ペレットを１００μｌ／ウェルのフローサイト
メトリー用緩衝液（５％ ＦＣＳ、０．０４％（ｗ／
ｖ） アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で２回洗浄した
後、５００倍希釈したフルオレッセイン−５−イソチオ
シアネート（Fluorescein-5-isothiocyanate；以下「Ｆ
ＩＴＣ」という）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体ＩｇＧ画
分（オルガノン・テクニカ社製）５０μｌを二次抗体と
して加え、氷上で１時間静置した。遠心分離（９０×
ｇ、４℃、１０分）して上清を除去してから、ペレット
をフローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルで
２回洗浄後、３．７％ ホルマリン溶液 ５０μｌを添
加し、氷上で１０分静置することにより細胞を固定し
た。遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除
去してから、再度フローサイトメトリー用緩衝液１００
μｌ／ウェルで洗浄し、ペレットをフローサイトメトリ
ー用緩衝液１００μｌ／ウェルに懸濁したものをフロー
サイトメトリー用試料とした。各試料中の細胞のＦＩＴ
Ｃ蛍光強度をフローサイトメーター（エピックス・エリ
ート；コールター社製）で測定した（励起波長：４８８
ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）。その結果、融合細胞培
養上清を添加しなかったＷＲ１９Ｌ１２ａ（ＦＩＴＣ蛍
光強度約０．３）よりも明らかに高値（約１００−１０
００）のＦＩＴＣ蛍光強度を示した試料に対応する融合
細胞を選別した。
【０１６１】（２−５） クローニング 上記（２−４）で選別された細胞群について、上記（２
−３）から（２−４）の一連の工程を５回繰返すことに
より、ＷＲ１９Ｌ１２ａと結合するがＷＲ１９Ｌと結合
しない単一な抗体を産生するハイブリドーマを数クロー
ン得た。それらのハイブリドーマが産生する抗体につい
て、（２−４）と同様の方法を用いて、マウスＦａｓに
対する結合能を調べた。マウスＦａｓを発現する細胞と
しては、Ｆａｓをほとんど発現しない細胞株Ｌ５１７８
Ｙ（American Type Culture Collection No. CRL-1722
）にマウスＦａｓ発現ベクターを導入したＬ５１７８
ＹＡ１細胞を使用した。その結果、Ｌ５１７８ＹＡ１細
胞に結合し、Ｌ５１７８Ｙ細胞と結合しない抗体を産生
するマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａを選別し
た。マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａは平成９
年２月２０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に
国際寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８が付
された。
【０１６２】またマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ
７Ａが産生する抗体（以下「ＨＦＥ７Ａ」という）のサ
ブクラスを、モノクローナル抗体アイソタイピングキッ
ト（ピアース社製）を用いて調べた結果、ＩｇＧ１、κ
であることが判明した。
【０１６３】実施例３ ＨＦＥ７Ａモノクローナル抗体
の精製 実施例２で作出されたマウス−マウスハイブリドーマＨ
ＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭＢＰ−５８２８）を、１０％ ＦＣ
Ｓを含むＡＳＦ培地 １リットル中で、３７℃、５％
炭酸ガス下で培養し、１×１０6細胞／ｍｌとなるまで
増殖させた。培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分
間）し、上清を捨て、沈澱した細胞を無血清ＡＳＦ培地
で１回洗浄後、無血清ＡＳＦ培地１リットルに再懸濁
し、３７℃、５％ 炭酸ガス下で４８時間培養した。こ
の培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分間）し、上
清を回収して透析チューブ（排除限界分子量１２０００
−１４０００；ギブコ・ビーアールエル社製）に入れ、
１０倍量の１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．０）に対して透析した。この透析チューブ内液から
のＩｇＧの粗精製を、高速液体クロマトグラフィー装置
（ＦＰＬＣシステム；ファルマシア社製）を用いて以下
に記載する条件で行った： カラム： ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂカラム
（カラムサイズ１０ｍｌ；ファルマシア製）； 溶媒： １０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
０） 流速： １ｍｌ／分； 溶出： １Ｍ 塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−５
０％、１８０分）。
【０１６４】溶出液を５ｍｌずつ分画し、各分画中の抗
Ｆａｓ抗体価を、ヒトＦａｓ融合タンパク質を用いたＥ
ＬＩＳＡ法により検定した。まず、実施例１で調製した
粗精製ヒトＦａｓ融合タンパク質溶液をＥＬＩＳＡ用９
６穴マイクロプレート中に１００μｌ／ウェル入れ、３
７℃で１時間保温した後、この溶液を捨て、各ウェルを
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ １００μｌ／ウェルで３回洗浄し
た。次に２％ ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ １０
０μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間保温した。ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ １００μｌ／ウェルで３回洗浄した後
に、各溶出分画１００μｌを入れて３７℃で１時間保温
した。さらに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ１００μｌ／ウェル
で３回洗浄した後に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２０００倍
希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイム
ノグロブリン抗体（アマシャム社製）１００μｌ／ウェ
ルを添加して３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ １００μｌ／ウェルで３回洗浄した。次に西洋ワ
サビペルオキシダーゼ基質（バイオラッド社製）１００
μｌ／ウェルを入れて５分間静置した後、マイクロプレ
ートリーダーで各ウェルの４１５ｎｍの吸光度を測定し
た。
【０１６５】その結果、吸光度の大きかった２１−３０
番目の分画を集め、抗体アフィニティー精製用カラム
（ハイトラップ・プロテインＧカラム、カラム体積 ５
ｍｌ；ファルマシア社製）２本に供与した。カラム内を
２５ｍｌ／カラムの平衡化緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．０））にて洗浄した後に、１
５ｍｌ／カラムの溶出緩衝液（０．１Ｍ グリシン−塩
酸（ｐＨ２．７））にて抗体を溶出した。それぞれの溶
出液は、１．１２５ｍｌの１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ
９．０）を入れた試験管内に受け、溶出終了後ただちに
遠心管型限外濾過器（セントリプレップ１０；グレース
ジャパン（株）製）の上部に入れて、３０００×ｇ、４
℃で２時間遠心した。濾過器下部に回収された濾液を除
去後、上部に１５ｍｌのＰＢＳを加えて、再び３０００
×ｇ、４℃で２時間遠心する操作を５回繰り返した。た
だし５回目の遠心は濾過器上部内の液量が０．５ｍｌに
なるまで行ない、この濾過器上部に残った液をＨＦＥ７
Ａ試料とした。
【０１６６】実施例４ ｃＤＮＡクローニング （４−１） ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製 実施例２で作製したマウス−マウスハイブリドーマＨＦ
Ｅ７Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）を１０％ ＦＣＳ
を含むＡＳＦ培地 １リットルにて、３７℃、５％ 炭
酸ガス下で１×１０6細胞／ｍｌまで増殖させた後に、
細胞を遠心分離により回収し、グアニジンチオシアネー
ト溶液（４Ｍ グアニジンチオシアネート、１％ サル
コシル、２０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、
１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１％ ア
ンチフォームＡ）で溶解し、溶液を回収した。ポリ
（Ａ）+ＲＮＡの単離は本質的に、“Molecular Cloning
A Laboratory Manual ”［Maniatis,T.et al.(1982) p
p.196-198参照］に記載されているようにして実施し
た。具体的には、以下の手順で行った。
【０１６７】回収した細胞溶解液は、各々２１Ｇの注射
針を装填した１０ｍｌ容の注射筒を用いて、数回吸入排
出を繰り返した。日立製作所（株）製ＲＰＳ４０−Ｔロ
ーター・バケット用のポリアロマー製の遠心管に３ｍｌ
の５．７Ｍ 塩化セシウム−０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）を先に加えておき、その上に上記細胞溶解液を
重層して遠心管を満たした。これを３００００ｒｐｍ、
２０℃で１８時間遠心した後、得られたペレットを４０
０μｌの蒸留水に溶解し、エタノール沈澱を行った。得
られたペレットを再び４００μｌの蒸留水に溶解した
後、等量のクロロホルム／１−ブタノール（４：１、ｖ
／ｖ）を加え撹拌し、遠心分離後水層を回収した。これ
を再度エタノール沈澱した後、沈澱を６００μｌの蒸留
水に溶解したものを、全ＲＮＡ試料とした。
【０１６８】このようにして得られた全ＲＮＡ ６００
μｇから、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム・クロマト
グラフィーにより、ポリ（Ａ）+ＲＮＡを精製した。す
なわち、全ＲＮＡを吸着緩衝液（０．５Ｍ 塩化ナトリ
ウム、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、1 ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ））に溶解し、６５℃で５分間加熱した後、同溶液に
て充填されたオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（タイプ
７；ファルマシア社製）に供与し、溶出溶液（１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、1 ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．０５％ ＳＤＳ）でポリ（Ａ）+ＲＮＡを溶出し、
回収した。このような操作により１００μｇのポリ
（Ａ）+ＲＮＡ画分を得た。
【０１６９】（４−２） ＨＦＥ７Ａの重鎖および軽鎖
のＮ末端アミノ酸配列の決定 実施例３で精製した抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａを含む
溶液の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）した（ゲル濃度１
２％、１００Ｖ定電圧、１２０分）。泳動終了後のゲル
を転写緩衝液（２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ９．
５）、２０％ メタノール、０．０２％ ＳＤＳ）に浸
した後、転写装置（ＫＳ−８４５１；マリソル社製）を
用いて、予め転写緩衝液に浸しておいたポリビニリデン
ジフルオリド膜（以下「ＰＶＤＦ膜」という；ポアーサ
イズ ０．４５μｍ；ミリポア社製）にゲル中のタンパ
ク質を転写した（１０Ｖ定電圧、４℃、１４時間）。転
写後のＰＶＤＦ膜を洗浄緩衝液（２５ｍＭ 塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭ ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
０））で洗浄した後、染色液（５０％ メタノール、２
０％ 酢酸、０．０５％クマシーブリリアントブルー）
に５分間浸して染色してから、９０％ メタノールで脱
色した。このようにしてＰＶＤＦ膜上で可視化された重
鎖（移動度が小さい方のバンド）および軽鎖（移動度が
大きい方のバンド）に相当するバンド部分を切りとり、
脱イオン水にて洗浄した後に、気相式プロテインシーク
エンサー（ＰＰＳＱ−１０；島津製作所（株）社製）を
用いて、自動エドマン法［Edman, P., et al. (1967) E
ur. J. Biochem. 1, 80 参照］によりそれぞれのＮ末端
アミノ酸配列を決定した。
【０１７０】その結果、重鎖に相当するバンドのＮ末端
アミノ酸配列は、 Gln-Xaa-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu （配
列表の配列番号１６）であり、軽鎖に相当するバンドの
Ｎ末端アミノ酸配列は、 Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Va
l-Ser-Leu-Gly-Gln-Arg-Ala-Thr-Ile-Ser （配列表の
配列番号１７） であった。
【０１７１】これらのアミノ酸配列を、カバトらにより
作成された抗体のアミノ酸配列データベース［Kabat,
E. A. et al., (1991) in Sequences of Proteins of I
mmunological Interest Vol. II, U.S. Department of
Health and Human Services参照］と比較したところ、
ＨＦＥ７Ａの重鎖（γ１鎖）は、サブタイプ２ｂであ
り、軽鎖（κ鎖）は、サブタイプ３であることが判明し
た。そこで、これらのマウスサブタイプに属する遺伝子
の５’末端側非翻訳領域の一部および３’末端側翻訳領
域の最末端部分とハイブリダイズする、下記のオリゴヌ
クレオチドプライマーをそれぞれ合成した［前出カバト
らの文献、Matti Kartinen et al. (1988) 25, 859-865
およびHeinrich, G. et al. (1984) J. Exp. Med. 159,
417-435参照］： 5'- GACCTCACCA TGGGATGGA -3' （Ｈ１：配列表の配列番号１８）； 5'- TTTACCAGGA GAGTGGGAGA -3' （Ｈ２：配列表の配列番号１９）； 5'- AAGAAGCATC CTCTCATCTA -3' （Ｌ１：配列表の配列番号２０）； 5'- ACACTCATTC CTGTTGAAGC -3' （Ｌ２：配列表の配列番号２１）。
【０１７２】（４−３） ｃＤＮＡクローニング マウス抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａの重
鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）反応およびＰＣＲ反応を組み合わせて、上記（４−
１）で調製したＨＦＥ７Ａ産生ハイブリドーマ由来のポ
リ（Ａ）+ＲＮＡ画分より任意の配列を特異的に増幅す
る方法（ＲＴ−ＰＣＲ）によりクローニングした。ＲＴ
−ＰＣＲは、ＲＮＡ ＰＣＲキット（ＡＭＶ）バージョ
ン２（宝酒造（株）社製）を使用して行なった。
【０１７３】ａ） 逆転写酵素反応 ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは、上記（４−２）で合成
したオリゴヌクレオチドプライマーのセット（５’末端
側および３’末端側プライマー）を用い、重鎖用または
軽鎖用各プライマーセットを使用したＲＴ−ＰＣＲ反応
を個別に実施した。
【０１７４】 反応液組成： ポリ（Ａ）+ＲＮＡ １μｇ ３’末端側プライマー （Ｈ２またはＬ２） ０．３μｇ トリス−塩酸（ｐＨ８．３） １０ｍＭ 塩化カリウム ５０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １ｍＭ 塩化マグネシウム ５ｍＭ リボヌクレアーゼインヒビター （キットに添付） ０．５単位 逆転写酵素（キットに添付） ０．２５単位 再蒸留水で２０μｌとした； 温度条件： ５５℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃
で５分間の順にインキュベートした。
【０１７５】 ｂ） ＰＣＲ 反応液組成： 逆転写酵素反応液 ２０μｌ １０倍濃度のＲＮＡ ＰＣＲ緩衝液 （キットに添付） １０μｌ 塩化マグネシウム溶液（キットに添付） １０μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（キットに添付） ２．５単位 ５’末端側プライマー （Ｈ１またはＬ１） 最終濃度０．２μＭ 滅菌脱イオン水で全量を１００μｌとなるようにした； 温度条件： ９４℃で２分間加温した後、９４℃で３０
秒、６０℃で３０秒、７２℃で１．５分間の温度サイク
ルを２８回繰り返した。
【０１７６】反応終了後、反応液の一部をとり、１．５
％ アガロースゲル電気泳動を行なった結果、重鎖用プ
ライマーを入れた反応液では約１．４ｋｂｐのバンドが
増幅されており、軽鎖用プライマーを入れた反応液では
約０．７ｋｂｐのバンドが増幅されていた。
【０１７７】これらＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡを、Ｔ
Ａクローニングキット（インビトロジェン社製）を用い
てクローニングした。まず、ＰＣＲ反応液とｐＣＲＩＩ
ベクター（ＴＡクローニングキットに添付）５０ｎｇ
を、１μｌの１０倍濃度リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、５ｍＭ 塩化ナトリウム、７ｍＭ β−メルカプト
エタノール、０．１ｍＭＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍ
Ｍ スペルミジン、０．１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブ
ミン）中に溶解し、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（１μ
ｌ）を加え、滅菌脱イオン水で全量を１０μｌとして、
１４℃で１５時間保温した。次いで、０．５Ｍ β−メ
ルカプトエタノール ２μｌを加えたコンピテント大腸
菌ＴＯＰ１０Ｆ’（ＴＡクローニングキットに添付）５
０μｌに上記リガーゼ反応液２μｌを添加し、氷上で３
０分間静置した後に、４２℃で３０秒間加温してから、
再び氷上で５分間冷却した。このものにＳＯＣ培地（２
％ トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、
０．０５％ 塩化ナトリウム、２．５ｍＭ 塩化カリウ
ム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ グルコー
ス）５００μｌを加え、３７℃で１時間振盪培養した。
この培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
るＬ−ブロス寒天培地（１％ トリプトン、０．５％
イーストエキストラクト、０．５％ 塩化ナトリウム、
０．１％ グルコース、０．６％ バクト・ アガー（デ
ィフコ社製））プレート上に塗り広げ、３７℃にて一晩
静置培養した。プレート上に現れた単一のアンピシリン
耐性コロニーを選択し、このコロニーを白金耳で掻きと
って、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−
ブロス培地にて培養した後に、遠心分離して回収した菌
体からアルカリ法によりプラスミドＤＮＡを調製した。
このようにして得られたプラスミドを、それぞれｐＣＲ
−Ｈ（ＨＦＥ７Ａ重鎖をコードするｃＤＮＡを保持する
プラスミド）およびｐＣＲ−Ｌ（ＨＦＥ７Ａ軽鎖をコー
ドするｃＤＮＡを保持するプラスミド）と命名した。
【０１７８】（４−４） ヌクレオチド配列の解析 （４−３）で得られたプラスミドｐＣＲ−ＨおよびｐＣ
Ｒ−Ｌがそれぞれ保持する、ＨＦＡ７Ａ重鎖をコードす
るｃＤＮＡ（１．４ｋｂｐ）およびＨＦＥ７Ａ軽鎖をコ
ードするｃＤＮＡ（０．７ｋｂｐ）のヌクレオチド配列
を、遺伝子配列解析装置（３１０ジェネティックアナラ
イザー；（株）パーキンエルマージャパン社製）を用い
てジデオキシ法［Sanger, F., et al. (1977) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467参照］により決定し
た。
【０１７９】その結果決定された、ＨＦＥ７Ａ重鎖およ
び軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、そ
れぞれ配列表の配列番号８および１０に示した。また、
これらｃＤＮＡにコードされる、ＨＦＥ７Ａ重鎖および
軽鎖の全アミノ酸配列を、それぞれ配列表の９および１
１に示した。上記（４−１）で判明したＨＦＥ７Ａ重鎖
のＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号１６）は、配
列表の配列番号９のアミノ酸番号１〜１１の配列と、不
明の１残基を除き一致した。また、ＨＦＥ７Ａ軽鎖のＮ
末端アミノ酸配列（配列表の配列番号１７）は、配列表
の配列番号１１のアミノ酸番号１〜２２の配列と一致し
た。すなわち、ＨＦＥ７Ａ重鎖および軽鎖の成熟型タン
パク質のＮ末端は、それぞれ配列番号９および１１のア
ミノ酸番号１のアミノ酸であることが明らかとなった。
【０１８０】また、この重鎖および軽鎖のアミノ酸配列
を、カバトらによる抗体のアミノ酸配列のデータベース
［Kabat, E. A., et al. (1991) in "Sequence of Prot
einsof Immunological Interest Vol.II": U.S. Depart
ment of Health and HumanServices参照］と比較検討し
た結果、重鎖については、配列番号９のアミノ酸番号１
から１２１が可変領域であり、アミノ酸番号１２２から
４４５が定常領域であること、また軽鎖については、配
列番号１１のアミノ酸番号１から１１１が可変領域であ
り、アミノ酸番号１１２から２１８が定常領域であるこ
とが明らかとなった。
【０１８１】さらに、上記のごとく決定されたＨＦＥ７
Ａの重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列におけ
る、それぞれのＣＤＲの位置および配列は、カバトらの
文献［前記Kabat, E. A., et al. (1991) 参照］による
抗体のアミノ酸配列のデータベースとの相同性を比較検
討することによって決定された。該文献によれば、異な
る抗体間でもサブタイプが同じであれば可変領域中のフ
レームワーク領域の鎖長はほぼ一定であり、またそのア
ミノ酸配列には共通性が認められる。一方、ＣＤＲは、
それらのフレームワーク領域にはさまれて存在する固有
の配列である。そこで、ＨＦＥ７Ａの重鎖および軽鎖の
アミノ酸配列を同じサブタイプのものと比較検討した結
果、ＨＦＥ７Ａの重鎖のＣＤＲは、配列表の配列番号９
のアミノ酸番号３１〜３５（ＣＤＲＨ1）、同アミノ酸
番号５０〜６６（ＣＤＲＨ2）および同アミノ酸番号９
９〜１１０（ＣＤＲＨ3）で示されるアミノ酸配列と決
定された。またＨＦＥ７Ａの軽鎖のＣＤＲは、配列表の
配列番号１１のアミノ酸番号２４〜３８（ＣＤＲ
Ｌ1）、同アミノ酸番号５４〜６０（ＣＤＲＬ2）および
同アミノ酸番号９３〜１０１（ＣＤＲＬ3）で示される
アミノ酸配列と決定された。
【０１８２】実施例５ 組換え抗体の調製 （５−１） 発現プラスミドの構築 実施例４でクローニングされたＨＦＥ７Ａの重鎖および
軽鎖をコードするｃＤＮＡを動物細胞用発現ベクターｐ
ＭＳ１８Ｓ［Hara, T., et al. (1992) EMBO J. 11, 18
75参照］に組み込んだ組換え発現ベクターを、以下に記
載する方法で構築した。まず、プラスミドｐＣＲ−Ｈが
保持するｃＤＮＡの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識
部位を付加し、３’末端部分に制限酵素ＸｂａＩ認識部
位および終止コドンを付加するためのオリゴヌクレオチ
ドプライマー： 5'- GGGGAATTCG ACCTCACCAT GGGATGGA -3'（Ｈ３：配列
表の配列番号２２） 5'- GGGTCTAGAC TATTTACCAG GAGAGTGGGA GA -3' （Ｈ
４：配列表の配列番号２３） を合成した。また、プラスミドｐＣＲ−Ｌが保持するｃ
ＤＮＡの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を付加
し、３’末端部分に制限酵素ＮｏｔＩ認識部位および終
止コドンを付加するためのオリゴヌクレオチドプライマ
ー： 5'- GGGGAATTCA AGAAGCATCC TCTCATCTA -3' （Ｌ３：
配列表の配列番号２４） 5'- GGGGCGGCCG CTTACTAACA CTCATTCCTG TTGAAGC -3'
（Ｌ４：配列表の配列番号２５） を合成した。この重鎖用および軽鎖用それぞれのプライ
マーを用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。
【０１８３】 反応液組成： 鋳型 （ｐＣＲ−ＨまたはｐＣＲ−Ｌ） １μｇ プライマー ５’末端側（Ｈ３またはＬ３） ４０ｐｍｏｌ ３’末端側（Ｈ４またはＬ４） ４０ｐｍｏｌ トリス−塩酸（ｐＨ８．０） ２０ｍＭ 塩化カリウム １０ｍＭ 硫酸アンモニウム ６ｍＭ 塩化マグネシウム ２ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．１％ ウシ血清アルブミン、ヌクレアーゼ不含 １０μｇ／ｍｌ ｄＮＴＰｓ ０．２５ｍＭ ネイティブ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ （ストラタジーン社製） ５単位 滅菌蒸留水を加えて１００μｌとした； 温度条件： ９４℃で２分間加温した後、９４℃で３０
秒、６０℃で３０秒、７５℃で１．５分のサイクルを２
８回繰り返した。
【０１８４】上記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを、制
限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（重鎖）あるいはＥｃｏＲ
ＩとＮｏｔＩ（軽鎖）で消化した後に、同じく制限酵素
ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（重鎖用）あるいはＥｃｏＲＩと
ＮｏｔＩ（軽鎖用）で消化し脱リン酸化した動物細胞用
発現プラスミドベクター ｐＭＥ１８Ｓ［Hara, T.,et
al. (1992) EMBO J. 11, 1875参照］と混合し、１０倍
濃度リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５）、６ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ塩化ナト
リウム、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、
０．１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）中で、４単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１４℃で１５時間保温し
た。このリガーゼ反応液２μｌをコンピテント大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株（宝酒造（株）社製）５０μｌに加え、氷上
で３０分間放置した後に、４２℃で３０秒、氷上で５分
間静置した。このものにＳＯＣ培地（２％ トリプト
ン、０．５％ イーストエキストラクト、０．０５％
塩化ナトリウム、２．５ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ塩
化マグネシウム、２０ｍＭ グルコース）５００μｌを
加え、１時間振とう培養した。以下、実施例４（４−
３）に記載した方法で形質転換大腸菌株を単離し、該菌
株からプラスミドＤＮＡを調製した。このようにして得
られたプラスミドを、プラスミドｐＭＥ−Ｈ（ＨＦＥ７
Ａ重鎖をコードするｃＤＮＡを保持する発現プラスミド
ベクター）およびプラスミドｐＭＥ−Ｌ（ＨＦＥ７Ａ軽
鎖をコードするｃＤＮＡを保持する発現プラスミドベク
ター）と命名した。これらのプラスミドを保持する形質
転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＥ−ＨおよびＥ．ｃｏ
ｌｉ ｐＭＥ−Ｌは、平成９（１９９７）年３月１２日
付で工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託さ
れ、それぞれ寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６８および
ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６７が付された。
【０１８５】（５−２） ＣＯＳ−７細胞での発現 上記（５−１）で得られたプラスミドｐＭＥ−Ｈおよび
ｐＭＥ−ＬのＣＯＳ−７細胞への形質転換は、遺伝子導
入装置（ＥＣＭ６００：ビーティーエックス社製）を用
いて、電気穿孔法により行なった。まず、ＣＯＳ−７細
胞（American Type Culture Collection No. CRL-1651
）を１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭを入れた細胞培養
用フラスコ（培養面積２２５ｃｍ2；住友ベークライト
（株）社製）中でセミコンフルエントになるまで培養し
た後、培地を除去してから、３ｍｌのトリプシン−ＥＤ
ＴＡ溶液（シグマ社製）を入れて３７℃で３分間保温し
た。遊離した細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄してか
ら、ＰＢＳで５×１０6細胞／ｍｌとなるように調整し
た。また、プラスミド大量調製キット（マキシプレップ
・ＤＮＡ精製システム：プロメガ社製）を用いて調製し
たプラスミドｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−Ｌ各２０μｇを
エタノール沈澱した後、それぞれ滅菌したＰＢＳ２０μ
ｌに溶解した。なお、２種類のプラスミドでコ・トラン
スフェクションを行なった場合は、各プラスミドは２０
μｇずつ使用した。上記のように調製した細胞懸濁液
２０μｌ（１．２×１０6細胞）とプラスミド溶液２０
μｌとを混合し、電極間隔２ｍｍのチャンバー（ビーテ
ィーエックス社製）に入れ、遺伝子導入装置にセットし
て、１５０Ｖ、９００μＦの設定で１０ミリ秒のパルス
を１回加えた。チャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を１
０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ ４０ｍｌに加え、細胞培
養用プラスチックシャーレ中で３７℃、５％炭酸ガス下
で２４時間培養した。次いで培養上清液を除去し、無血
清ＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ
４０ｍｌを加えて３７℃、５％炭酸ガス下でさらに７２
時間培養し、培養上清を回収した。
【０１８６】上記の方法により、以下に記載するプラス
ミドまたはプラスミドの組み合わせでそれぞれＣＯＳ−
７細胞を形質転換して、形質転換体の培養上清を回収し
た： ［Ａ］ ｐＭＥ−Ｈのみ； ［Ｂ］ ｐＭＥ−Ｌのみ； ［Ｃ］ ｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−Ｌのコ・トランスフ
ェクション。
【０１８７】（５−３） 形質転換体培養上清中の抗Ｆ
ａｓ抗体の検出 上記（５−２）で調製された形質転換ＣＯＳ−７細胞培
養上清中に抗Ｆａｓ抗体が産生されているか否かを、実
施例３に記載したヒトＦａｓ融合タンパク質を抗原とす
るＥＬＩＳＡ法により調べた。その結果、ｐＭＥ−Ｈお
よびｐＭＥ−Ｌでコ・トランスフェクションした場合
（上記［Ｃ］）のみ、培養液上清にヒトＦａｓ融合タン
パク質と反応する抗体が産生されていることが確かめら
れた。
【０１８８】実施例６ エピトープ限定 （６−１） ＥＬＩＳＡ 以下に記載するペプチドを、自動ペプチド合成機（モデ
ル４３０Ａ；（株）パーキンエルマージャパン・アプラ
イドバイオシステムズ事業部）を使用して、Ｆｍｏｃ固
相合成法［Carpino, L. A. and Han, G.Y. (1970) J. A
mer. Chem. Soc. 92, 5748-5749 参照］により合成し
た： Arg-Leu-Ser-Ser-Lys-Ser-Val-Asn-Ala-Gln-Val-Thr-As
p-Ile-Asn-Ser-Lys-Gly-Leu （Ｐ１：配列表の配列番
号２６）； Val-Thr-Asp-Ile-Asn-Ser-Lys-Gly-Leu-Glu-Leu-Arg-Ly
s-Thr-Val-Thr-Thr-Val-Glu （Ｐ２：配列表の配列番
号２７）； Glu-Leu-Arg-Lys-Thr-Val-Thr-Thr-Val-Glu-Thr-Gln-As
n-Leu-Glu-Gly-Leu-His-His-Asp （Ｐ３：配列表の配
列番号２８）； Thr-Gln-Asn-Leu-Glu-Gly-Leu-His-His-Asp-Gly-Gln-Ph
e-Cys-His-Lys-Pro-Cys-Pro-Pro （Ｐ４：配列表の配
列番号２９）； Gly-Gln-Phe-Cys-His-Lys-Pro-Cys-Pro-Pro-Gly-Glu-Ar
g-Lys-Ala-Arg-Asp-Cys-Thr-Val （Ｐ５：配列表の配
列番号３０）； Gly-Glu-Arg-Lys-Ala-Arg-Asp-Cys-Thr-Val-Asn-Gly-As
p-Glu-Pro-Asp-Cys-Val-Pro-Cys-Gln （Ｐ６：配列表
の配列番号３１）； Asn-Gly-Asp-Glu-Pro-Asp-Cys-Val-Pro-Cys-Gln-Glu-Gl
y-Lys-Glu-Tyr-Thr-Asp-Lys-Ala （Ｐ７：配列表の配
列番号３２）； Glu-Gly-Lys-Glu-Tyr-Thr-Asp-Lys-Ala-His-Phe-Ser-Se
r-Lys-Cys-Arg-Arg-Cys-Arg （Ｐ８：配列表の配列番
号３３）； His-Phe-Ser-Ser-Lys-Cys-Arg-Arg-Cys-Arg-Leu-Cys-As
p-Glu-Gly-His-Gly-Leu-Glu-Val （Ｐ９：配列表の配
列番号３４）； Leu-Cys-Asp-Glu-Gly-His-Gly-Leu-Glu-Val-Glu-Ile-As
n-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr （Ｐ１０：配列表の
配列番号３５）； Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr-Lys-Cys-Ar
g-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys （Ｐ１１：配列表の
配列番号３６）； Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Th
r-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp-Pro （Ｐ１２：配列表の
配列番号３７）； Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp-Pro-Cys-Thr-Ly
s-Cys-Glu-His-Gly-Ile-Ile-Lys （Ｐ１３：配列表の
配列番号３８）； Cys-Thr-Lys-Cys-Glu-His-Gly-Ile-Ile-Lys-Glu-Cys-Th
r-Leu-Thr-Ser-Asn-Thr-Lys-Cys （Ｐ１４：配列表の
配列番号３９）； Glu-Cys-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Thr-Lys-Cys-Lys-Glu-Gl
u-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn（Ｐ１５：配列表の配列番号４
０）； Ser-Ser-Gly-Lys-Tyr-Glu-Gly-Gly-Asn-Ile-Tyr-Thr-Ly
s-Lys-Glu-Ala-Phe-Asn-Val-Glu （Ｐ１６：配列表の
配列番号４１）。
【０１８９】Ｐ１乃至Ｐ１５は、ヒトＦａｓ細胞外領域
の１−１５７番目までのアミノ酸配列の部分配列であ
り、それぞれ９乃至１１残基のアミノ酸配列が他のペプ
チドと重複している。Ｐ１６は陰性対照用のペプチドで
あり、ヒトＦａｓとの間に相同性はない。
【０１９０】Ｐ１乃至Ｐ１６は、それぞれ４８μｌのジ
メチルスルホキシド（以下「ＤＭＳＯ」という）で完全
に溶解した後、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含
むＰＢＳを加えて全量が０．８ｍｌとなるように調整
し、ペプチド溶液とした。
【０１９１】Ｃ末端にカルボキシル基を付加したヒトＦ
ａｓ分子細胞外領域に対応するペプチドを、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含む０．０５Ｍ 炭酸−重
炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５０μｇ／ｍｌの濃度に希
釈し、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ヌンク社製）に５
０μｌ／ウェルずつ入れた。このプレートを４℃で一晩
静置することにより、ウェル内面にペプチドを吸着させ
た。各ウェル内の液を捨て、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで４回洗浄した。１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン
（シグマ社製Ａ３８０３）を含むＰＢＳを１００μｌ／
ウェルずつ分注し、３７℃で１時間保温した。各ウェル
をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄後、ＰＢＳで５μｇ／
ｍｌに調製したＨＦＥ７Ａ、およびＣＨ１１を各ウェル
に５０μｌ添加した。３７℃で１時間保温した後、各ウ
ェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗
体（アマシャム社製）をＰＢＳで１０００倍希釈したも
のを、５０μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間保
温した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し
た。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（バイオラッド社
製）を各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温
で１５分間静置した後、マイクロプレートリーダー（コ
ロナ社製）で各ウェルの４１５ｎｍの吸光度を測定し
た。なお、陽性対照としては、実施例１で調製したヒト
Ｆａｓ融合タンパク質を合成ペプチドの代わりに用い
た。
【０１９２】その結果、上記合成ペプチドのうちＰ１１
を吸着させたウェルのみが高い吸光度を示したことか
ら、ＨＦＥ７ＡはＰ１１に含まれるアミノ酸配列と特異
的に結合することが判明した（図３）。
【０１９３】（６−２） 合成ペプチドと細胞表面のヒ
トＦａｓとの競合によるエピトープの限定（競合アッセ
イ法） まず、以下に記載するペプチドを合成した： His-Gly-Leu-Glu-Val-Glu-Ile-Asn-Cys-Thr （Ｐ９５：配列表の配列番号４２）； Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr （Ｐ１００：配列表の配列番号４３）； Arg-Thr-Gln-Asn-Thr-Lys-Cys-Arg-Cys-Lys （Ｐ１０５：配列表の配列番号１）； Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys （Ｐ１１０：配列表の配列番号４４）； Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cy
s-Asp （Ｐ１１５Ｌ：配列表の配列番号４５）； Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn-Asp-Asn （Ｄ３５５−３６４：配列表の配列番号４６）。
【０１９４】Ｐ９５、Ｐ１００、Ｐ１０５およびＰ１１
０は、ヒトＦａｓの細胞外領域中においてＰ１１に対応
するアミノ酸配列の近傍（ヒトＦａｓ細胞外領域の９５
−１２８番目に相当）の、１０残基からなる部分配列で
あり、それぞれ５残基ずつ他のペプチドとアミノ酸配列
が重複する。Ｐ１１５Ｌは、Ｐ１１０と５残基重複する
１０残基のアミノ酸配列： Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys （Ｐ１１５：配列表の配列番号４５のアミノ酸番号１〜
１０）の溶解度の低さを予測して、Ｃ末端側４残基分を
伸長したものである。Ｄ３５５−３６４はヒトＦａｓと
相同性のないペプチドで、陰性対照として使用した。Ｐ
１１５Ｌ以外の上記各ペプチドはそれぞれ１６μｌのＤ
ＭＳＯに溶解後、１ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
むＰＢＳを加えて全量が０．８ｍｌとなるように調製
し、ペプチド溶液とした。Ｐ１１５Ｌは４８μｌのＤＭ
ＳＯに溶解後、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含
むＰＢＳを加えて全量が０．８ｍｌとなるように調製し
た。
【０１９５】ＨＦＥ７Ａ ０．２５μｇと、上記ペプチ
ド溶液（ペプチド２００μｇ相当）のそれぞれとをマイ
クロ試験管中で混合し、１ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ールを含むＰＢＳで全量１００μｌとした。これを３７
℃、１０−２０ｒｐｍで撹拌しながら２時間保温した
後、ＦＣＳを最終濃度が５％となるように添加し、ペプ
チド−抗体混合液とした。
【０１９６】ＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞を、実施例２に記載
した方法で増殖させてから遠心して回収し、無血清ＲＰ
ＭＩ培地を用いて細胞密度が１×１０7細胞／ｍｌとな
るように調整した。この細胞浮遊液をＵ字底９６穴プレ
ートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、マイクロプレー
ト用スウィングローターを使用して、４℃、１０００ｒ
ｐｍ、３分間の遠心分離を行い、上清を除去した。ペレ
ットに各ペプチド−抗体混合液を１００μｌ添加し、１
〜２回ピペッティングした。、４℃で３０分間静置した
後、遠心し上清を除去した。ペレットをフローサイトメ
トリー用緩衝液で３回洗浄してから、フローサイトメト
リー用緩衝液で２５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）を５０μｌ／ウェル
ずつ加え、１〜２回ピペッティングした。プレートを遮
光して４℃で３０分間静置した後、遠心し上清を除去し
た。ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液で３回洗
浄し、組織固定用１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純
薬工業（株）社製）をＰＢＳで１０倍希釈したものを５
０μｌ／ウェルずつ加え、１〜２回ピペッティングして
からプレートを遮光して４℃で１２時間以上静置して細
胞を固定した。フローサイトメトリー用緩衝液 １００
μｌ／ウェルを加えて懸濁後、遠心し上清を除去した。
ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液で３回洗浄し
た後、５００μｌ／ウェルのフローサイトメトリー用緩
衝液に懸濁したものをフローサイトメーター（サイトエ
ース−１５０；日本分光（株）社製）で解析し（励起波
長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）、細胞１個あ
たりのＦＩＴＣ蛍光強度の平均値を算出した。さらに、
ペプチド−抗体混合液を加えなかった場合の値を０％、
Ｄ３５５−３６４の値を１００％として各試料の蛍光強
度平均値を算出した。
【０１９７】その結果、Ｐ１０５はＨＦＥ７ＡとＷＲ１
９Ｌ１２ａ細胞との結合を強力に阻害し、Ｐ１０５のア
ミノ酸配列とそれぞれ半分づつ重複するＰ１００および
Ｐ１１０は、ＨＦＥ７ＡとＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞との結
合をそれぞれ５０％および６０％程度阻害することが判
明した。Ｐ１０５のアミノ酸配列と全く重複しないＰ９
５およびＰ１１５Ｌでは結合阻害はみられなかった（図
４）。以上の結果から、Ｐ１０５はＨＦＥ７ＡとヒトＦ
ａｓの結合を阻害するのに十分なアミノ酸配列であり、
ＨＦＥ７Ａのエピトープは、Ｐ１０５に相当するアミノ
酸配列中に含まれることが示された。なお、Ｐ１０５に
相当する部分は、ヒトＦａｓとマウスＦａｓとの間でア
ミノ酸配列が保存されている領域である。
【０１９８】実施例７ ＨＦＥ７ＡのサルＦａｓに対す
る結合能 チンパンジー（三和化学研究所熊本霊長類パーク）の末
梢血４０ｍｌ、ニホンザルの末梢血２０ｍｌ、カニクイ
ザルの末梢血２０ｍｌまたはマーモセットの末梢血３ｍ
ｌを用いて、以下に記載する試験を行った。まず、ヘパ
リン（ノボヘパリン：ノボ社製）を加えた末梢血を等量
のフィコール・パック溶液（比重１．０７７、ただしカ
ニクイザル用は比重１．０７２となるように調整した：
ファルマシア社製）に静かに積層し、１７００ｒｐｍで
３０分間遠心して、末梢血単核球画分を回収した。この
末梢血単核球画分をハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、
１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０
6細胞／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液にフィ
トヘマグルチニン−Ｐ（シグマ社製）を終濃度 ５μｇ
／ｍｌとなるように加えて、３７℃、５％炭酸ガス下で
２４時間培養した後、遠心して細胞を回収・洗浄してか
ら、１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で再懸
濁した。この懸濁液にインターロイキン２（アマシャム
社製）を終濃度 １０単位／ｍｌとなるように加え、３
７℃、５％炭酸ガス下で７２時間培養することにより、
活性化リンパ球を得た。
【０１９９】次に、この活性化リンパ球 １×１０6個
を試験管に入れ、２０μｇ／ｍｌのＨＦＥ７Ａ５０μｌ
もしくはＰＢＳ ５０μｌに懸濁し、氷上で１時間静置
してから、５００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。この細
胞を２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体
（バイオリソース社製）５０μｌに懸濁し、氷上で３０
分間静置した後、５００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
この細胞を５００μｌのＰＢＳで再懸濁したものを試料
として、フローサイトメーター（サイトエース：日本分
光 (株) 社製）を用いて蛍光強度を測定した。蛍光強度
による細胞数の度数分布を取得し、全細胞数中に占める
染色細胞数の割合を計算した。その結果、ＨＦＥ７Ａを
加えなかった試料では、上記のいずれの種においても染
色細胞が３％未満であったのに対し、ＨＦＥ７Ａを加え
た試料では、少なくとも１７％、最大で８２％の細胞が
染色されていた。従って、ＨＦＥ７Ａはヒトを含む広い
範囲の霊長類Ｆａｓと結合することが示された。
【０２００】実施例８ マウス生体内のＴ細胞に対する
ＨＦＥ７Ａのアポトーシス誘導活性 ６週令の雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（日本クレア社より
購入）に対して、０．０５ｍｇまたは０．１ｍｇ／個体
のＨＦＥ７Ａモノクローナル抗体（いずれも５００μｌ
のＰＢＳに溶解したもの）、あるいは５００μｌのＰＢ
Ｓのみを腹腔内投与し（一群あたり３匹）、投与４２時
間後にマウスをエーテル麻酔し、胸腺を摘出した。この
摘出した胸腺を１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で洗
浄した後に、メッシュ（セルストレイナー；ファルコン
社製）上でスパーテルを用いてつぶし、メッシュを通過
した細胞を１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地
で２回洗浄した。細胞数を測定した後、１０％ ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０6細胞／５０μ
ｌとなるように懸濁した胸腺細胞を、Ｕ字底９６穴マイ
クロプレート（ヌンク社製）に５０μｌ／ウェルずつ分
注し、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）した。
【０２０１】上清を除去し、各ウェルに以下の（ａ）ま
たは（ｂ）の蛍光標識抗体溶液を加えた： （ａ）０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ９
５（Ｆａｓ）抗体（Ｊｏ２：ファーミンジェン社製）１
０μｌ／ウェルおよび０．５ｍｇ／ｍｌのフィコエリト
リン（以下「ＰＥ」という）標識抗マウスＣＤ９０抗体
（Ｔｈｙ−１．２：セダレーン社製）１０μｌ／ウェル
（なお、ＣＤ９０はＴ細胞に特異的に発現する表面抗原
である）； （ｂ）０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４
抗体（Ｌ３Ｔ４：ファーミンジェン社製）１０μｌ／ウ
ェルおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＰＥ標識抗マウスＣＤ８
抗体（Ｌｙ−２：ファーミンジェン社製）１０μｌ／ウ
ェル。
【０２０２】プレートを振盪してウェル内を撹拌し、氷
上で１時間静置した後、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１
０分）した。上清を除去し、フローサイトメトリー用緩
衝液１００μｌ／ウェルで２回洗浄した後、３．７％
ホルマリン溶液 ５０μｌ／ウェルを加え、氷上で１０
分静置することにより細胞を固定した。遠心分離（９０
×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去し、沈澱した細胞
を再度フローサイトメトリー用緩衝液 １００μｌ／ウ
ェルで洗浄後、フローサイトメトリー用緩衝液 １００
μｌ／ウェルに懸濁した。このようにして得られた各ウ
ェル中の細胞懸濁液を試料とし、フローサイトメーター
（エピックス・エリート：コールター社製）を用いて、
１×１０4細胞／試料の蛍光を、以下に記載する条件で
測定した： 励起波長： ４８８ｎｍ； 検出波長： ５３０ｎｍ（ＦＩＴＣ）、６００ｎｍ（Ｐ
Ｅ）。
【０２０３】この測定データから、各試料の細胞集団の
ＦＩＴＣおよびＰＥの蛍光分布を作成し、上記（ａ）の
蛍光標識抗体を加えた試料については、Ｆａｓ陽性でか
つＣＤ９０陽性の細胞（以下「Ｆａｓ+ＣＤ９０+」とい
う）数の全細胞数中に占める割合を算出した。同様に、
上記（ｂ）の蛍光標識抗体を加えた試料については、Ｃ
Ｄ４陽性ＣＤ８陽性細胞（以下「ＣＤ４+ＣＤ８+」とい
う）またはＣＤ４陽性ＣＤ８陰性細胞（以下「ＣＤ４+
ＣＤ８-」という）の数の全細胞数中に占める割合を算
出した。
【０２０４】その結果を表１に示す。
【０２０５】
【表１】
【０２０６】（数値は％） ＨＦＥ７Ａ投与群マウスの胸腺細胞では、ＰＢＳのみ投
与した群と比較して、Ｆａｓを発現しているＴ細胞（Ｆ
ａｓ+ＣＤ９０+）の割合が、どの投与量の場合でも顕著
に減少していた。また、Ｆａｓの発現が顕著であること
が知られているＣＤ４+ＣＤ８+細胞群およびＣＤ４+Ｃ
Ｄ８-細胞群も、ＰＢＳのみ投与した群と比較してＨＦ
Ｅ７Ａ投与により顕著にその数が減少していた。
【０２０７】以上の結果より、抗Ｆａｓモノクローナル
抗体ＨＦＥ７Ａは、生体内でＦａｓ分子を発現している
Ｔ細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することが示
された。
【０２０８】実施例９ 自己免疫疾患モデルに対するＨ
ＦＥ７Ａの効果 Ｆａｓリガンド遺伝子の突然変異体であり、全身性エリ
テマトーデス様自己免疫疾患のモデルマウスであるＭＲ
Ｌgld ／gld マウスを用いて、抗Ｆａｓモノクローナル
抗体ＨＦＥ７Ａ投与の自己免疫疾患症状に対する効果を
以下に記載する方法に従って検討した。
【０２０９】１８週令のＭＲＬgld ／gld マウス（日本
エスエルシー（株）社より購入）の腹腔内に、実施例３
で調製したＨＦＥ７Ａ ０．２ｍｇまたは０．５ｍｇ／
個体（５００μｌのＰＢＳに溶解したもの）、もしくは
５００μｌ ＰＢＳをそれぞれ単回投与した。
【０２１０】自己免疫疾患症状により生じる各被検マウ
スの手首および足首の腫れを観察し、腫れの程度を評価
して、各群の経時的な変化を調べた［米原伸 (1994) 日
経サイエンス 別冊110 、66-77 参照］。その結果、Ｈ
ＦＥ７Ａ投与により、手足首の腫れの程度が著明に減少
していることが明らかとなった。
【０２１１】また、これらの被検マウスから胸腺を摘出
し、上記試験例１に記載した方法により胸腺でＦａｓを
発現しているＴ細胞の割合を調べた結果、試験例１と同
様にＨＦＥ７Ａ投与により胸腺中のＦａｓ発現Ｔ細胞数
は著しく減少していた。
【０２１２】実施例１０ 肝毒性試験 ＢＡＬＢ／ｃマウスに以下のいずれかのものを腹腔内投
与した： i) ＨＦＥ７Ａ ０．２ｍｇ（５００μｌのＰＢＳに溶
解）； ii) ＨＦＥ７Ａ ０．５ｍｇ（５００μｌのＰＢＳに溶
解）； iii) Ｊｏ２（ファーミンジェン社製）０．１ｍｇ（５
００μｌのＰＢＳに溶解）； iv) ５００μｌのＰＢＳのみ。
【０２１３】上記のうち、Ｊｏ２はアポトーシス誘導活
性を有する公知の抗マウスＦａｓ抗体である。投与８時
間後、２４時間後および７２時間後のマウス（Ｊｏ２投
与マウスのみ投与３時間後のマウス）から軽エーテル麻
酔下で後大静脈より全採血し、各試料血液中のグルタミ
ン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（以下「ＧＯ
Ｔ」という）値およびグルタミン酸−ピルビン酸トラン
スアミナーゼ（以下「ＧＰＴ」という）値を、自動分析
装置（７２５０型；日立製作所（株）社製）および同装
置用試薬（トランスアミナーゼ−ＨＲＩＩ；和光純薬
（株）社製）を用いて測定した。その結果、Ｊｏ２投与
群では３時間後にＧＯＴ値およびＧＰＴ値が急上昇した
のに対し、ＨＦＥ７Ａを投与した群のＧＯＴ値およびＧ
ＰＴ値は、ＰＢＳのみ投与した群同様ほとんど変化しな
かった（図５）。以上の結果より、ＨＦＥ７Ａは肝臓障
害を誘発しないことが示された。
【０２１４】実施例１１ 劇症肝炎モデルに対する効果 抗マウスＦａｓ抗体Ｊｏ２をマウス腹腔内に投与する
と、マウスは数時間の内に劇症肝炎を発症して死亡する
ことが知られている［Ogasawara, J., et al. (1993) N
ature 364, 806参照］。そこで、このＪｏ２による肝障
害に対するＨＦＥ７Ａ効果を検討するため、Ｊｏ２と同
時もしくは後からＨＦＥ７Ａを投与した場合のマウスの
生存率を調べた。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス雌（一群
３匹：日本エスエルシー（株）より購入）の腹腔内に、
下記の条件で抗体を投与し、経時観察を行なった： （Ａ） Ｊｏ２ ０．１ｍｇ／０．５ｍｌ； （Ｂ） Ｊｏ２ ０．０１ｍｇ／０．５ｍｌ； （Ｃ） Ｊｏ２ ０．１ｍｇとＨＦＥ７Ａ ０．５ｍｇ
／０．５ｍｌ（同時投与）； （Ｄ） Ｊｏ２ ０．１ｍｇとＨＦＥ７Ａ ０．０５ｍ
ｇ／０．５ｍｌ（同時投与）； （Ｅ） Ｊｏ２ ０．０１ｍｇ／０．２ｍｌ投与後、２
０分後にＨＦＥ７Ａ ０．１ｍｇ／０．２ｍｌを投与。
【０２１５】その結果を図６に示した。Ｊｏ２の単独投
与では、０．１ｍｇ／個体および０．０１ｍｇ／個体い
ずれの場合（（Ａ）および（Ｂ））も９時間以内にすべ
てのマウスが死亡した。しかしながら、Ｊｏ２投与時に
ＨＦＥ７Ａを同時投与（０．５ｍｇ／個体、０．０５ｍ
ｇ／個体）した場合（（Ｃ）および（Ｄ））、マウスは
投与数週間経過後も異常を示さなかったことから、ＨＦ
Ｅ７Ａ投与により劇症肝炎の発症を阻止できることが判
明した。さらに、Ｊｏ２投与２０分後にＨＦＥ７Ａを投
与した場合でも、マウスは正常であり外的症状も何ら認
められなかったことから、肝臓等でのＦａｓ／Ｆａｓリ
ガンド系を介した正常組織の障害に由来する種々の疾病
に対して、ＨＦＥ７Ａが予防および治療効果を有するこ
とが示された。
【０２１６】実施例１２ 慢性関節リウマチに対する効
果 １） コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果 ＢＡＬＢ／ｃマウスの雌とＤＢＡ／１Ｊマウスの雄との
交配で得られたＦ１マウスであるＣＤ１Ｆ１マウス（６
週齢の雌、日本チャールスリバー（株）より購入）を１
週間馴化させた。文献に記載の方法［Phadke, K. (198
5) Immunopharmacol. 10, 51-60参照］に準じて、ウシ
ＩＩ型コラーゲン ０．３％溶液（５０ｍＭ 酢酸溶
液、コラーゲン技術研修会製）を５０ｍＭ 酢酸により
０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、等用量の完全フロ
イントアジュバント（ディフコ社製）を加えて乳化後、
ツベルクリン針を装着したプラスチック製１ｍｌ注射筒
を用い、静注用保定器に保定したマウスの尾根部皮内に
１００μｌ（ウシＩＩ型コラーゲンとして１００μｇ相
当）投与した。初回感作の１週間後に上記と同じ条件で
追加免疫した。追加免疫時に１００μｇのＨＦＥ７Ａま
たは対照用のマウスＩｇＧを腹腔内投与した（各群６
匹）。初回感作後５週目から四肢の腫れが認められるよ
うになった。肉眼的に四肢の関節を観察し、文献記載の
方法［Wood, F. D.,et al. (1969) Int. Arch. Allergy
Appl. Immunol. 35, 456-467参照］に準じてその腫れ
の程度をスコア化した。スコアは、各四肢について以下
の基準で判定した： ０：症状なし； １：四肢の指などの小関節が一本のみ腫脹発赤； ２：小関節二本以上あるいは手首や足首などの比較的大
きな関節が腫脹発赤； ３：一本の手や足全体が腫脹発赤。
【０２１７】すなわち、四肢とも最大に腫れた場合の１
個体のスコアは１２となる。また、四肢の合計スコアが
１以上の個体を「発症マウス」とした。
【０２１８】結果を図７に示した。非特異的なマウスＩ
ｇＧを投与した対照群では初回感作後７週目までに全て
のマウスが発症したのに対し、ＨＦＥ７Ａ投与群のうち
半数のマウスは８週目までに全く発症しなかった（図７
Ａ）。また、ＨＦＥ７Ａ投与群では対照群と比較して平
均スコアが低かった（図７Ｂ）。
【０２１９】２） リウマチ患者由来滑膜細胞に対する
アポトーシス誘導能 慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞の生存率に与える
ＨＦＥ７Ａの影響を、ミトコンドリアの還元能を指標と
する以下に記載の方法により検討した。まずヒト慢性関
節リウマチ患者患部より採取した滑膜組織を１０％ ウ
シ胎児血清（サミット社製）を含むダルベッコ改変イー
グル培地（ギブコ社製）中でハサミで細切し、脂肪を除
去後、終濃度５μｇ／ｍｌとなるようにコラゲナーゼ
（シグマ社製）を添加し、９０分間３７℃でインキュベ
ートした。１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イ
ーグル培地で３７℃、５％ 炭酸ガスの条件下培養した
ものを、リウマチ患者由来滑膜細胞とした。
【０２２０】かくして得られたリウマチ患者由来滑膜細
胞をトリプシン処理により単細胞化した後１０％ ウシ
胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で１×１０
5細胞／ｍｌとなるように懸濁してから、９６穴プレー
トに２×１０4細胞／２００μｌ／ウェルとなるように
播種し、３７℃、５％ 炭酸ガス条件で６日間培養し
た。培養上清を除去後、ハンクス緩衝液（ギブコ社製）
で３回洗浄し、ＨＦＥ７Ａを１０ｎｇ／ｍｌ乃至１００
０ｎｇ／ｍｌ（１０倍希釈系列）および１０％ウシ胎児
血清を含むダルベッコ改変イーグル培地 ２００μｌを
添加した。３７℃、５％炭酸ガス条件で２０時間培養
後、１ｍｇ／ｍｌ ＸＴＴ（２，３−ビス［２−メトキ
シ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラ
ゾリウム−５−カルボキサニリド イナーソルト：シグ
マ社製）、２５μＭ ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェ
ート：シグマ社製）を５０μｌ（終濃度：２５０μｇ／
ｍｌＸＴＴ；５μＭ ＰＭＳ）を添加してさらに４時間
培養後、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２２１】各ウェルの細胞の生存率を、下記式により
算出した： 生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ） （式中、ａは被検ウェルの測定値、ｂは無細胞ウェルの
測定値、ｃは抗体無添加のウェルの測定値をそれぞれ表
す。） その結果を表２に示した。ＨＦＥ７Ａは濃度依存的にリ
ウマチ患者由来滑膜細胞の生存を阻害した。
【０２２２】
【表２】
【０２２３】実施例１３ ＨＦＥ７Ａヒト化抗体の設計 （１）ＨＦＥ７Ａの可変領域の分子モデリング ＨＦＥ７Ａの可変領域の分子モデリングは、一般にホモ
ロジーモデリングとして知られる手法［Methods in Enz
ymology 203, 121-153 (1991) 参照］を用いて行なっ
た。すなわち、プロテイン・データ・バンク（Protein
Data Bank ：Chemistry Department, Building 555, Br
rokheaven National Laboratory, P.O. Box 5000, Upto
n, NY 11973-5000, U.S.A.参照：以下「ＰＤＢ」とい
う）に登録されている、Ｘ線結晶構造解析が行なわれた
ヒト免疫グロブリンの可変領域の一次配列を、ＨＦＥ７
Ａのフレームワーク部分と比較し、相同性の最も高いフ
レームワークの三次元構造として、軽鎖については１Ｇ
ＧＩ、重鎖として２ＨＦＬを選択した。両者を組合せ
て、フレームワーク部分の三次元構造（以下「フレーム
ワークモデル」という）を構築した。
【０２２４】チョッチアらの分類に従うと、ＨＦＥ７Ａ
のＣＤＲのうち、ＣＤＲＬ2はカノニカルクラス１、Ｃ
ＤＲＬ3はカノニカルクラス１、ＣＤＲＨ1はカノニカル
クラス１に分類された。ＣＤＲＬ1、ＣＤＲＨ2、ＣＤＲ
Ｈ3は、特定のカノニカルクラスに対応しなかった。Ｃ
ＤＲＬ2、ＣＤＲＬ3およびＣＤＲＨ1のＣＤＲループ
は、各カノニカルクラス固有のコンホメーションに固定
し、フレームワークモデルに組み込んだ。ＣＤＲＬ1は
ソロントンらの分類［J. Mol. Biol. 263, 800-815 (19
96) 参照］に従いクラスター１５Ｂのコンホメーション
を用いた。ＣＤＲＨ2およびＣＤＲＨ3については、相同
性の高い配列のコンホメーションをＰＤＢより検索し、
エネルギー計算を併用することによって、最も確からし
いＣＤＲループのコンホメーションを構築し、フレーム
ワークモデルに組み込んだ。最終的には、エネルギー的
に不利な原子間の接触をなくすようにエネルギー計算を
行ない、ＨＦＥ７Ａの分子モデルを得た。上述の操作は
市販の一般的な分子モデリングシステムを用いて行い得
るが、本発明では、ＡｂＭ（オックスフォード・モレキ
ュラー・リミテッド社製）を用いた。
【０２２５】得られた分子モデルについては、ソフトウ
エアのプロチェック（PROCHECK：J.Appl. Cryst. (199
3) 26, 283-291参照）を用いて、構造の精度を評価した
後、各残基の表面露出度を計算し、原子間接触の有無を
検索した。
【０２２６】（２）アクセプターの選択 ＨＦＥ７Ａの軽鎖、重鎖のサブグループは、ヒト抗体の
各サブグループのコンセンサス配列との比較において、
軽鎖ではサブグループκＩＶと７９％、重鎖ではサブグ
ループＩと７９％の同一性を示した。しかし、この組合
せを持つヒト抗体は存在しなかった。軽鎖、重鎖が同一
の抗体に由来し、かつ、いずれも７０％以上の同一性を
示すヒト抗体として、軽鎖がサブグループκＩＩＩ、重
鎖がサブグループＩである８Ｅ１０’ＣＬを選択した。
【０２２７】（３）アクセプターに移植するドナー残基
の選択 ソフトウエアのカメレオン（オックスフォード・モレキ
ュラー・リミテッド社製）を用いて、ＨＦＥ７Ａの軽
鎖、重鎖それぞれとアクセプターのアミノ酸配列を整列
し、先に述べたａ）からｄ）の要件に従い、以下の実施
例に示すヒト化可変領域配列をデザインし、抗ヒトＦａ
ｓヒト化抗体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を
含む組換えベクターとして、以下のプラスミドを構築し
た。
【０２２８】実施例１４ ヒト化軽鎖をコードするＤＮ
Ａの調製 （１）ヒト軽鎖（κ鎖）の全長をコードするｃＤＮＡの
クローニング マウス抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａの軽鎖アミノ酸配列
をヒト化するに先立ち、定常領域を含むヒトイムノグロ
ブリン（以下「Ｉｇ」という）軽鎖ｃＤＮＡのクローニ
ングを行なった。
【０２２９】１）プライマーの合成 ヒト軽鎖をコードするｃＤＮＡの分離は、ＰＣＲにより
行なった。ＰＣＲを行なうにあたり、以下に記載する２
種のプライマーを合成した： 5'- GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA -3' （ＨＶＫＩＩ５−４：配列表の配列番号４７）； 5'- GCTCTAGATG AGGTGAAAGA TGAGCTGGAG GA -3' （ＨＫＣＬ３−３：配列表の配列番号４８）。
【０２３０】２）ヒトＩｇ軽鎖ｃＤＮＡを含むプラスミ
ドの構築 ヒトＩｇ軽鎖の全長を含むｃＤＮＡは、ＰＣＲ法により
作製され、プラスミド中に挿入された後、大腸菌でクロ
ーニングされた。
【０２３１】ヒトＩｇ軽鎖の全長をコードするＨＬ−Ｄ
ＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０２３２】 反応液組成： ヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリー（ライフテクノロジー社製） ２５ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマーＨＶＫＩＩ５−４ ５０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＬ３−３ ５０ｐｍｏｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １０μｌ １００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） １０μｌ １Ｍ 塩化カリウム ５μｌ ２５ｍＭ 塩化マグネシウム １０μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社製） １単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量１００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２３３】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２３４】このようにして作製されたＨＬ−ＤＮＡ断
片は、真核生物用ＴＡクローニングキット（インビトロ
ジェン社製）を用い、メーカー指定のプロトコールに従
って、プラスミドｐＣＲ３ＤＮＡに挿入し、同キットに
予め添付されているコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’
株に導入した。これにより、ヒトＩｇ軽鎖のｃＤＮＡで
あるＨＬ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミドｐＨＬ１５
−２７を得た。
【０２３５】（２） ＨＦＥ７Ａのヒト化抗体軽鎖発現
ベクターの構築 １）ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現ベクタープラスミドの
構築 マウス抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａの軽鎖アミノ酸配列
をヒト化するにあたり、ＨＦＥ７Ａ軽鎖アミノ酸配列の
Ｎ末端側から４７番目のアミノ酸（プロリン）と４９番
目のアミノ酸（リジン）（以下「領域Ｉ」という）をそ
れぞれヒト軽鎖（κ鎖）で保存されているアラニンおよ
びアルギニンに置き換えるとともに、８０番目のアミノ
酸（ヒスチジン）、８１番目のアミノ酸（プロリン）、
８２番目のアミノ酸（バリン）、８４番目のアミノ酸
（グルタミン酸）、８５番目のアミノ酸（グルタミン
酸）、８７番目のアミノ酸（アラニン）および８９番目
のアミノ酸（スレオニン）（以下「領域ＩＩ」という）
をそれぞれヒト軽鎖（κ鎖）で保存されているセリン、
アルギニン、ロイシン、プロリン、アラニン、フェニル
アラニン、バリンに置き換えたものを「ＨＨタイプ」と
した。
【０２３６】また、領域Ｉをヒトのアミノ酸残基に置き
換え、領域ＩＩをマウスのアミノ酸残基のままとしたも
のを「ＨＭタイプ」とした。
【０２３７】さらに、領域Ｉ、領域ＩＩともマウスのア
ミノ酸残基のままとしたものを「ＭＭタイプ」とした。
【０２３８】以下、この３種類のヒト化抗ヒトＦａｓ抗
体ＨＦＥ７Ａ−軽鎖アミノ酸配列を有する発現プラスミ
ドをそれぞれ構築した。
【０２３９】２）ヒト化ＨＦＥ７Ａの軽鎖可変および定
常領域作製用プライマーの合成 各ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域とヒ
トＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域を融合した、ＨＨタイプ
ポリペプチド鎖（配列表の配列番号５０）をコードする
ＤＮＡ（配列表の配列番号４９）、ＨＭタイプポリペプ
チド鎖（配列表の配列番号５２）をコードするＤＮＡ
（配列表の配列番号５１）およびＭＭタイプポリペプチ
ド鎖（配列表の配列番号５４）をコードするＤＮＡ（配
列表の配列番号５３）の合成は、それぞれＰＣＲ法を組
み合わせて行なった。
【０２４０】ＰＣＲを行うにあたり、以下に記載する１
３種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した： 5'- CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCT -3' （７ＡＬ１Ｐ：配列表の配列番号５５）； 5'- GAGAGGGTGG CCCTCTCCCC TGGAGACAGA GACAAAGTAC CTGG -3' （７ＡＬ１Ｎ：配列表の配列番号５６）； 5'- CCAGGTACTT TGTCTCTGTC TCCAGGGGAG AGGGCCACCC TCTC -3' （７ＡＬ２Ｐ：配列表の配列番号５７）； 5'- GATTCGAGAT TGGATGCAGC ATAGATGAGG AGTCTGGGTG CCTG -3' （７ＡＬ２Ｎ：配列表の配列番号５８）； ５’− ＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡ ＡＴＣＴＣＧＡＡＴＣ ＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡ
ＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡ ＧＴＧＧＣ −３’ （７ＡＬ３ＰＡ：配列表の配列番号５９）； ５’− ＡＡＡＡＴＣＣＧＣＣ ＧＧＣＴＣＣＡＧＡＣ ＧＡＧＡＧＡＴＧＧＴ
ＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧ ＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧ ＡＣ −３’ （７ＡＬ３Ｎ：配列表の配列番号６０）； 5'- CTCGTCTGGA GCCGGCGGAT TTTGCAGTCT ATTACTGTCA GCAAAGTAAT GAGGATCC -3' （７ＡＬ４Ｐ：配列表の配列番号６１）； 5'- TGAAGACAGA TGGTGCAGCC ACAGTCCGTT TGATTTCCAG CCTGGTGCCT TGACC -3' （７ＡＬ４Ｎ：配列表の配列番号６２）； 5'- GGTCAAGGCA CCAGGCTGGA AATCAAACGG ACTGTGGCTG CACCATCTGT CTTCA -3' （７ＡＬＣＰ：配列表の配列番号６３）； 5'- CCCGAATTCT TACTAACACT CTCCCCTGTT GAAGCTCTTT GTGAC -3' （７ＡＬＣＮ：配列表の配列番号６４）； 5'- TCTGTCCCAG ACCCACTGCC ACTAAACCTG TCTGGGATCC CAGATTCGAG ATTGG -3' （Ｍ７ＡＬ２Ｎ：配列表の配列番号６５）； 5'- GTTTAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CACCTCTACC ATCCATCCTG TGGAG -3' （Ｍ７ＡＬ３ＰＡ：配列表の配列番号６６）； 5'- ATGGTGCAGC CACAGTCCGT TTGATTTCCA GCCTGGTGCC TTGACCGAAC GTCCG -3' （７ＡＬ４ＮＡ：配列表の配列番号６７）。
【０２４１】３）プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨの構築（ヒ
ト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド） 配列表の配列番号５０に示すアミノ酸をコードする配列
表の配列番号４９に示すＶＨＨ−ＤＮＡ断片は、三段階
のＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミドベ
クター中に挿入された後、大腸菌でクローニングされ
た。
【０２４２】ａ）第一段階ＰＣＲ ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図
８に示した。
【０２４３】５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部
位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ1領域の
一部をコードするＬ７Ａ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件
で作製された。
【０２４４】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｌ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製） １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２４５】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２４６】ＦＲＬ1の一部、ＣＤＲＬ1、ＦＲＬ2およ
びＣＤＲＬ2領域の一部をコードするＬ７Ａ２−ＤＮＡ
断片は、以下の条件で作製された。
【０２４７】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｌ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２４８】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２４９】ＣＤＲＬ2およびＦＲＬ3の一部をコードす
るＬ７Ａ３−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０２５０】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｌ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ３ＰＡ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ３Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２５１】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２５２】ＦＲＬ3の一部、ＣＤＲＬ3、ＦＲＬ4およ
び定常領域の一部をコードするＬ７Ａ４−ＤＮＡ断片
は、以下の条件で作製された。
【０２５３】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｌ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２５４】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２５５】ＦＲＬ4の一部および定常領域をコード
し、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加した
Ｌ７Ａ５−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０２５６】 反応液組成： プラスミドｐＨＬ１５−２７ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＰ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２５７】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２５８】ＰＣＲ後の各生成物２００μｌに、等量の
フェノール・クロロホルム（５０％水飽和フェノール、
４８％ クロロホルム、２％ イソアミルアルコール）
を加え、１分間、激しく攪拌した。その後、１００００
×ｇの遠心分離を行い、水層を回収した。得られた水層
に、等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（９６
％ クロロホルム、４％ イソアミルアルコール）を加
え、再び１分間激しく攪拌し、１００００×ｇの遠心分
離により、水層を回収した（以後、この一連の操作を
「フェノール抽出」という）。
【０２５９】回収された上清に、１／１０倍量の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と、２．５倍量のエタノ
ールを加え、ドライアイスにより凍結後、１００００×
ｇの遠心分離を行ない、ＤＮＡを沈澱として回収した
（以後、この一連の操作を「エタノール沈澱」とい
う）。
【０２６０】得られたＤＮＡ沈澱物は、真空乾燥後、再
蒸留水に溶解し、５％ ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍ
ｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物Ｄ
ＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＬ７Ａ１−Ｄ
ＮＡ、Ｌ７Ａ２−ＤＮＡ、Ｌ７Ａ３−ＤＮＡ、Ｌ７Ａ４
−ＤＮＡおよびＬ７Ａ５−ＤＮＡに相当するＤＮＡバン
ドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセン
トリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤ
ＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノー
ル沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２６１】ｂ）第二段階ＰＣＲ ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図
９に示した。
【０２６２】前出Ｌ７Ａ１−ＤＮＡ断片とＬ７Ａ２−Ｄ
ＮＡ断片を融合したＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片は、以下
の条件で作製された。
【０２６３】 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２６４】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２６５】前出Ｌ７Ａ４−ＤＮＡ断片とＬ７Ａ５−Ｄ
ＮＡ断片を融合したＬ７Ａ４．５−ＤＮＡ断片は、以下
の条件で作製された。
【０２６６】 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ４−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ５−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２６７】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２６８】ＰＣＲ後の増幅されたＬ７Ａ１．２−ＤＮ
ＡおよびＬ７Ａ４．５−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出
とエタノール沈澱の後、５％ ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μ
ｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生
成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出した各融合
ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０
およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。
溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮
し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解し
た。
【０２６９】ｃ）第三段階ＰＣＲ ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図
１０に示した。
【０２７０】前出Ｌ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＬ７Ａ
４．５−ＤＮＡ断片およびＬ７Ａ３−ＤＮＡを融合した
ＶＨＨ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０２７１】 反応液組成： 第二段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第二段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ４．５−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ３−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２７２】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２７３】ＰＣＲ後の増幅されたＶＨＨ−ＤＮＡ断片
は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動
後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミド
により染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出し
た。検出したＶＨＨ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出
し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用
いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００ｘｇ
の遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μ
ｌの蒸留水に溶解した。
【０２７４】ＶＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラス
ミド作製方法の概要は図１１に示した。
【０２７５】得られたＶＨＨ−ＤＮＡ断片は、フェノー
ル抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化し
た。クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡ
（宝酒造（株）社製）１μｇを、予め制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、アルカリフォスファター
ゼ（ウシ腸由来：以下「ＣＩＰ」という）で脱リン酸化
した。このようにして得られた脱リン酸化プラスミドｐ
ＨＳＧ３９９ ＤＮＡと、予め制限酵素で消化したＶＨ
Ｈ−ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット バージ
ョン２．０（宝酒造（株）社製）を用い、メーカー指定
のプロトコールに従って連結した。
【０２７６】連結したＤＮＡは、エタノール沈澱で回収
し、５μｌの再蒸留水に溶解し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９エレクトロ−セル（宝酒造（株）社製）と混合し
た。混合物を、ジーンパルサー／Ｅ．ｃｏｌｉパルサー
キュベット ０．１ｃｍ（バイオラッド社製）に移し、
メーカー指定のプロトコールに従い、ジーンパルサーＩ
Ｉ（バイオラッド社製）にて大腸菌ＪＭ１０９株に導入
した（以下、この一連の操作を「形質転換」という）。
形質転換操作を終えた菌体は、最終濃度１ｍＭのＩＰＴ
Ｇ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド、宝酒造
（株）社製）、０．１％のＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、宝
酒造（株）社製）および５０μｇ／ｍｌのクロラムフェ
ニコールを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディ
フコ社製） １０ｇ、バクトイーストエキストラクト
（ディフコ社製） ５ｇ、塩化ナトリウム １０ｇ、バ
クトアガー（ディフコ社製） １５ｇ。蒸留水に溶解
し、１リットルとする］上に塗布し、３７℃で一晩培養
し、大腸菌形質転換体を得た。
【０２７７】得られた白色を呈する形質転換体は、５０
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地
［バクトトリプトン（ディフコ社製） １０ｇ、バクト
イーストエキストラクト（ディフコ社製） ５ｇ、塩化
ナトリウム １０ｇ。蒸留水に溶解し、１リットルとす
る］２ｍｌ中で、３７℃にて一晩培養し、得られた培養
物からアルカリ・ＳＤＳ法［Sambrook,J. et al., （19
89） in "Molecular Cloning A Laboratory Manual Sec
ond edition." Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s.］に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２７８】抽出したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％ アガロー
スゲル電気泳動解析により、ＶＨＨ−ＤＮＡ断片を保持
するクローンを選択した。
【０２７９】以上の操作により、ヒト化ＨＨタイプＨＦ
Ｅ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨ
ＳＧＨＨ７を得た。なお、プラスミドｐＨＳＧＨＨ７を
保持する形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＨＨ
７ ＳＡＮＫ ７３４９７は、平成９年８月２２日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７３が付された。
【０２８０】ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖ポリペ
プチド（配列表の配列番号５０）をコードするＤＮＡ
（配列表の配列番号４９）を保持する発現ベクタープラ
スミドｐ７ＡＬ−ＨＨは、前出プラスミドｐＨＳＧＨＨ
７を用いて作製した。
【０２８１】哺乳動物細胞用発現プラスミドベクターｐ
ＥＥ．１２．１（ロンザ社製）ＤＮＡ １μｇを制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リ
ン酸化した。この脱リン酸化ｐＥＥ．１２．１ ＤＮＡ
１００ｎｇと、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消
化したｐＨＳＧＨＨ７ ＤＮＡ断片１０μｇとをＤＮＡ
ライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）
社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天
培地上に塗布した。
【０２８２】得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・
ＳＤＳ法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出し
たプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消
化し、１％ アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿
入断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＨ
タイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定
常領域をコードするＤＮＡとの融合断片が、サイトメガ
ロウイルス（以下ＣＭＶという）プロモーター下流に正
方向で挿入されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨを得た。
【０２８３】４）プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＭの構築（ヒ
ト化ＨＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド） 配列表の配列番号５２に示すアミノ酸をコードする配列
表の配列番号５１に示すＶＨＭ−ＤＮＡ断片は、二段階
のＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミドベ
クター中に挿入された後、大腸菌でクローニングされ
た。
【０２８４】ａ）第一段階ＰＣＲ ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図
１２に示した。
【０２８５】５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部
位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ1の一部
をコードするＬ７Ａ１−ＤＮＡ断片、ＦＲＬ1の一部、
ＣＤＲＬ1、ＦＲＬ2およびＣＤＲＬ2の一部をコードす
るＬ７Ａ２−ＤＮＡ断片、およびＦＲＬ4の一部および
定常領域をコードし、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切
断部位を付加したＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片は、ＶＨＨ−Ｄ
ＮＡ断片作製で得られたものを用いた［“（２）プラス
ミドｐ７ＡＬ−ＨＨの構築（ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７
Ａ−軽鎖発現プラスミド）”および“ａ）第一段階ＰＣ
Ｒ”参照］。
【０２８６】ＣＤＲＬ2、ＦＲＬ3、ＣＤＲＬ3、ＦＲＬ4
および定常領域の一部をコードするＭＬ７Ａ３−ＤＮＡ
断片は、以下の条件で作製された。
【０２８７】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｌ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ３ＰＡ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４ＮＡ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２８８】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２８９】ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出と
エタノール沈澱の後、５％ ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ
／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成
物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＭＬ７Ａ
３−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを、剃刀で切り出
し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用
いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００ｘｇ
の遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μ
ｌの蒸留水に溶解した。
【０２９０】ｂ）第二段階ＰＣＲ ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図
１３に示した。
【０２９１】前出Ｌ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＭＬ７Ａ
３−ＤＮＡ断片および前出Ｌ７Ａ５−ＤＮＡ断片を融合
したＶＨＭ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０２９２】 反応液組成： 第二段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ３−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ５−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μl
とし、ＰＣＲに供試した。
【０２９３】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０２９４】ＰＣＲ後の増幅されたＶＨＭ−ＤＮＡ断片
は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳
動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミ
ドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出し
た。検出したＶＨＭ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出
し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用
いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇ
の遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μ
ｌの蒸留水に溶解した。
【０２９５】ＶＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラス
ミド作製方法の概要は図１４に示した。
【０２９６】得られたＶＨＭ−ＤＮＡ断片は、フェノー
ル抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した。
【０２９７】クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９
ＤＮＡ（宝酒造（株）社製）１μｇを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し
た。この脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡと、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＶＨＭ−ＤＮＡ断
片とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０
（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ
１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、
０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラム
フェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られ
た白色を呈する形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのクロラ
ムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ
・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出し
たプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消
化した後、１％ アガロースゲル電気泳動解析を行っ
て、ＶＨＭ−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択し
た。
【０２９８】以上の操作により、ヒト化ＨＭタイプＨＦ
Ｅ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨ
ＳＧＨＭ１７を得た。なお、プラスミドｐＨＳＧＨＭ１
７を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＨ
Ｍ１７ ＳＡＮＫ ７３５９７は、平成９年８月２２日
付で工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託さ
れ、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０７２が付された。
【０２９９】配列表の配列番号５２に例示したヒト化Ｈ
ＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖ポリペプチドをコードする配
列表の配列番号５１に例示したＤＮＡを保持する発現ベ
クタープラスミドｐ７ＡＬ−ＨＭは、前出プラスミドｐ
ＨＳＧＨＭ１７を用いて作製した。
【０３００】哺乳動物細胞用発現プラスミドベクターｐ
ＥＥ．１２．１ ＤＮＡ １μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。
この脱リン酸化ｐＥＥ．１２．１ ＤＮＡ １００ｎｇ
と、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＧＨ
Ｍ１７−ＤＮＡ断片１０μｇとをＤＮＡライゲーション
キットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて
連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し
た。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法
によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドを
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル
電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。こ
のようにして、ヒト化ＨＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可
変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡと
の融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入
されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＨＭを得た。
【０３０１】５）プラスミドｐ７ＡＬ−ＭＭの構築（ヒ
ト化ＭＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド） 配列表の配列番号５４に示すアミノ酸をコードする、配
列表の配列番号５３に示すＶＭＭ−ＤＮＡ断片は、三段
階のＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミド
ベクター中に挿入された後、大腸菌でクローニングされ
た。
【０３０２】ａ）第一段階ＰＣＲ ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図
１５に示した。
【０３０３】５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を付加
した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ1の一部をコード
するＬ７Ａ１−ＤＮＡ断片、ならびに、ＦＲＬ4の一部
および定常領域をコードし、３’末端にＥｃｏＲＩ切断
部位を付加したＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片は、ＶＨＨ−ＤＮ
Ａ断片作製で得られたものを用いた［“（２）プラスミ
ドｐ７ＡＬ−ＨＨの構築（ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ
−軽鎖発現プラスミド）”および“ａ）第一段階ＰＣ
Ｒ”参照］。
【０３０４】ＦＲＬ1の一部、ＣＤＲＬ1、ＦＲＬ2、Ｃ
ＤＲＬ2およびＦＲＬ3の一部をコードするＭＬ７Ａ２Ｍ
−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０３０５】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｌ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマーＭ７ＡＬ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３０６】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３０７】ＦＲＬ3の一部、ＣＤＲＬ3、ＦＲＬ4およ
び定常領域の一部をコードするＭＬ７Ａ３Ｍ−ＤＮＡ断
片は、以下の条件で作製された。
【０３０８】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｌ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー Ｍ７ＡＬ３ＰＡ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ４ＮＡ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３０９】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３１０】ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出と
エタノール沈澱の後、５％ ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ
／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成
物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＭＬ７Ａ
２Ｍ−ＤＮＡおよびＭＬ７Ａ３Ｍ−ＤＮＡに相当するＤ
ＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０お
よびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶
出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、
エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３１１】ｂ）第二段階ＰＣＲ ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図
１６に示した。
【０３１２】前出Ｌ７Ａ１−ＤＮＡ断片とＭＬ７Ａ２Ｍ
−ＤＮＡ断片を融合したＭＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片
は、以下の条件で作製された。
【０３１３】 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ２Ｍ−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー Ｍ７ＡＬ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３１４】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３１５】ＰＣＲ後の増幅されたＭＬ７Ａ１．２−Ｄ
ＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５
％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離され
た。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジ
ウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射
下で検出した。検出した融合ＤＮＡバンドを、剃刀で切
り出し、セントリコン−１０およびセントリリューター
を用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００
×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５
０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３１６】ｃ）第三段階ＰＣＲ ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図
１７に示した。
【０３１７】前出ＭＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＭＬ７
Ａ３Ｍ−ＤＮＡ断片およびＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片を融合
したＶＭＭ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０３１８】 反応液組成： 第二段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ３Ｍ−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ５−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μl
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３１９】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３２０】ＰＣＲ後の増幅されたＶＭＭ−ＤＮＡ断片
は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳
動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミ
ドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出し
た。検出したＶＭＭ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出
し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用
いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇ
の遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μ
ｌの蒸留水に溶解した。
【０３２１】ＶＭＭ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド
作製方法の概要は図１８に示した。得られたＶＭＭ−Ｄ
ＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさ
らに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ
で消化した。
【０３２２】クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９
（宝酒造（株）社製）ＤＮＡ １μｇをＨｉｎｄＩＩＩ
とＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この
脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡと、ＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化したＶＭＭ−ＤＮＡ断片とをＤＮＡ
ライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）
社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇ
ａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた白色を呈する形
質転換体は、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを
含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法により
プラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮ
ＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％
アガロースゲル電気泳動解析により、ＶＭＭ−ＤＮＡ断
片を保持するクローンを選択した。
【０３２３】以上の操作により、ヒト化ＭＭタイプＨＦ
Ｅ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨ
ＳＧＭＭ６を得た。なお、プラスミドｐＨＳＧＭＭ６を
保持する形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳＧＭＭ
６ ＳＡＮＫ ７３６９７は、平成９年８月２２日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７１が付された。
【０３２４】配列表の配列番号５４に例示したヒト化Ｍ
ＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖ポリペプチドをコードする配
列表の配列番号５３に例示したＤＮＡを保持する発現ベ
クタープラスミドｐ７ＡＬ−ＭＭは、前出プラスミドｐ
ＨＳＧＭＭ６を用いて作製した。
【０３２５】哺乳動物細胞用発現プラスミドベクターｐ
ＥＥ．１２．１ ＤＮＡ １μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。
この脱リン酸化ｐＥＥ．１２．１ ＤＮＡ １００ｎｇ
と、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＧＭ
Ｍ６ ＤＮＡ断片１０μｇとをＤＮＡライゲーションキ
ットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連
結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し
た。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法
によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドを
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル
電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。こ
のようにして、ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖ＭＭタイプの可
変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡと
の融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入
されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＭＭを得た。
【０３２６】６）ヌクレオチド配列の確認 プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨ、ｐ７ＡＬ−ＨＭおよびｐ７
ＡＬ−ＭＭの挿入ＤＮＡが、目的とするヌクレオチドの
配列を保持していることを確認するため、ヌクレオチド
配列の決定を行なった。ヌクレオチドの配列を決定する
にあたり作製したオリゴヌクレオチドプライマーは以下
に記載する通りであった： 5'- CCCAAGCTTA AGAAGCATCC -3' （ＳＰ１：配列表の配列番号６８）； 5'- ATCTATGCTG CATCCAATCT -3' （ＳＰ２：配列表の配列番号６９）； 5'- GTTGTGTGCC TGCTGAATAA -3' （ＳＰ３：配列表の配列番号７０）； 5'- CCCGAATTCT TACTAACACT -3' （ＳＰ４：配列表の配列番号７１）； 5'- TTATTCAGCA GGCACACAAC -3' （ＳＰ５：配列表の配列番号７２）； 5'- AGATTGGATG CAGCATAGAT -3' （ＳＰ６：配列表の配列番号７３）。
【０３２７】各プライマーが結合する位置を、図１９に
示した。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ
法と塩化セシウム法［いずれもSambrook, J. et al. (1
989） in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual.
Second edition." Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss.参照］により精製した各プラスミドＤＮＡを鋳型と
し、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Sanger, F. S.
et al.(1977) Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463参
照］で行なった。すなわち、３μｇの精製したプラスミ
ドＤＮＡを１３μｌの再蒸留水に溶解し、２μｌの２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡと２μｌの２Ｎ ＮａＯＨを加え、室温で
５分間静置した。その後、４μｌの１０Ｍ 酢酸アンモ
ニウム溶液と１００μｌのエタノールを加え、撹袢の後
ドライアイス上で１０分間静置した。１５０００×ｇの
遠心分離の後、得られた沈澱を８０％ エタノールで洗
浄後、真空乾燥した。真空乾燥したＤＮＡを７μｌの再
蒸留水に溶解し、ヌクレオチド配列決定反応に用いた。
ヌクレオチド配列決定反応は７−デアザ−シークエナー
ゼ・バージョン２．０・キット（ｄＣＴＰ用：アマシャ
ム社製）を用いた。前出プラスミド溶液７μｌに、予め
合成したプライマー１ｐｍｏｌと、１μｌの反応緩衝液
（キットに予め添付されている緩衝液）を加え、６５℃
で２分間保温した。その後、室温まで徐冷しプライマー
とアニーリングさせ、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャ
ム社製）で標識した。反応産物は、１×ＴＢＥ（１００
ｍＭ トリス、１００ｍＭ ホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．３）緩衝液中、８Ｍ尿素を含む５％ ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行なった。ゲルを乾燥し
た後、オートラジオグラフィーを行いヌクレオチド配列
を解読した（以後、ヌクレオチド配列の決定は、上記方
法により行なった）。
【０３２８】その結果、ｐ７ＡＬ−ＨＨは、配列表の配
列番号５０に示したポリペプチドをコードする配列表の
配列番号４９に示すヌクレオチド配列を、ｐ７ＡＬ−Ｈ
Ｍは、配列表の配列番号５２に示したポリペプチドをコ
ードする配列表の配列番号５１に示すヌクレオチド配列
を、ｐ７ＡＬ−ＭＭは、配列表の配列番号５４に示した
ポリペプチドをコードする配列表の配列番号５３に示す
ヌクレオチド配列をそれぞれ保持していることが確認さ
れた。
【０３２９】実施例１５ ＨＦＥ７Ａのヒト化抗体重鎖
発現ベクターの構築 （１）ヒト化ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域ＤＮＡを保持す
るプラスミドの構築 １）ヒト化重鎖可変領域作製用プライマーの合成 ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ−重鎖の可変領域と、Ｉ
ｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端側５残基のアミノ酸を含むポ
リペプチド鎖（配列表の配列番号７５）をコードするＤ
ＮＡ（配列表の配列番号７４）の合成は、ＰＣＲ法を組
み合わせて行なった。
【０３３０】ＰＣＲを行なうにあたり、以下に記載する
８種のプライマーを作製した： 5'- GGGAAGCTTG GCTTGACCTC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT -3' （７ＡＨ１Ｐ：配列表の配列番号７６）； 5'- TGAAGCCCCA GGCTTCTTGA CCTCAGCCCC AGACTGCACC AGTTGGAC -3' （７ＡＨ１ＮＮＥＷ：配列表の配列番号７７）； 5'- TCCACTCAAG CCTCTGTCCA GGGGCCTGTT TTACCC -3' （７ＡＨ２Ｎ：配列表の配列番号７８）； 5'- GTCTGGGGCT GAGGTCAAGA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA AG -3' （７ＡＨ２ＰＮＥＷ：配列表の配列番号７９）； 5'- CAGGCCCCTG GACAGAGGCT TGAGTGGATG GGAGAGATT -3' （７ＡＨ３Ｐ：配列表の配列番号８０）； 5'- TCAGATCTCA GGCTGCTGAG CTCCATGTAG GCTGTGCTAG CGGATGTGTC -3' （７ＡＨ３Ｎ：配列表の配列番号８１）； 5'- TGGAGCTCAG CAGCCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTCTA TTAC -3' （７ＡＨ４Ｐ：配列表の配列番号８２）； 5'- GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTCGCC CCAGT -3' （７ＡＨ４Ｎ：配列表の配列番号８３）。
【０３３１】２）プラスミドｐＢＬ７Ａ２７の構築 配列表の配列番号７５に示すアミノ酸をコードする配列
表の配列番号７４に示すＶＤ−ＤＮＡ断片は、三段階の
ＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミドへ挿
入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０３３２】ａ）第一段階ＰＣＲ ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図２
０に示した。
【０３３３】５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部
位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＨ1のＮ末
端側をコードするＨ７Ａ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件
で作製された。
【０３３４】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｈ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ１ＮＮＥＷ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３３５】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３３６】ＦＲＨ1の一部、ＣＤＲＨ2およびＦＲＨ2
の一部をコードするＨ７Ａ２−ＤＮＡ断片は、以下の条
件で作製された。
【０３３７】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｈ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ２ＰＮＥＷ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３３８】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３３９】ＦＲＨ2の一部、ＣＤＲＨ2およびＦＲＨ3
の一部をコードするＨ７Ａ３−ＤＮＡ断片は、以下の条
件で作製された。
【０３４０】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｈ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ３Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ３Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３４１】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３４２】ＦＲＨ3の一部、ＣＤＲＨ3、ＦＲＨ4およ
びＣＨ１領域のＮ末端側５アミノ酸残基をコードするＨ
７Ａ４−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０３４３】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ−Ｈ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ４Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ４Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３４４】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３４５】ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出と
エタノール沈澱の後、５％ ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、1 μｇ
／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成
物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＨ７Ａ１
−ＤＮＡ、Ｈ７Ａ２−ＤＮＡ、Ｈ７Ａ３−ＤＮＡおよび
Ｈ７Ａ４−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを、剃刀で切
り出し、セントリコン−１０およびセントリリューター
を用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００
×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５
０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３４６】ｂ）第二段階ＰＣＲ ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図２
１に示した。
【０３４７】前出Ｈ７Ａ１−ＤＮＡ断片とＨ７Ａ２−Ｄ
ＮＡ断片を融合したＨ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片は、以下
の条件で作製された。
【０３４８】 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３４９】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３５０】前出Ｈ７Ａ３−ＤＮＡ断片とＨ７Ａ４−Ｄ
ＮＡ断片を融合したＨ７Ａ３．４−ＤＮＡ断片は、以下
の条件で作製された。
【０３５１】 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ３−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ４−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ３Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ４Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３５２】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３５３】ＰＣＲ後の増幅されたＨ７Ａ１．２−ＤＮ
ＡおよびＨ７Ａ３．４−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出
とエタノール沈澱の後、５％ ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μ
ｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生
成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出した各融合
ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０
およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。
溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮
し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解し
た。
【０３５４】ｃ）第三段階ＰＣＲ ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図２
２に示した。
【０３５５】前出Ｈ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＨ７Ａ
３．４−ＤＮＡ断片を融合したＶＤ−ＤＮＡ断片は、以
下の条件で作製された。
【０３５６】 反応液組成： 第二段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第二段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ３．４−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ４Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３５７】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３５８】ＰＣＲ後の増幅されたＶＤ−ＤＮＡ断片
は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳
動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミ
ドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出し
た。検出したＶＤ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、
セントリコン−１０およびセントリリューターを用いて
ゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠
心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの
蒸留水に溶解した。
【０３５９】ＶＤ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作
製方法の概要は図２３に示した。
【０３６０】得られたＶＤ−ＤＮＡ断片は、フェノール
抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで消化した。
【０３６１】プラスミドベクター ｐＢＬＵＥＳＣＲＩ
ＰＴ−ＩＩ ＳＫ＋ ＤＮＡ（ストラタジーン社製）１
μｇをＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで消化し、ＣＩＰで脱
リン酸化した。この脱リン酸化ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ
−ＩＩ ＳＫ＋ ＤＮＡと、ＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩ
で消化したＶＤ−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーション
キットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて
連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃
度１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラ
クトシド、宝酒造（株）社製）、０．１％のＸ−Ｇａｌ
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシド、宝酒造（株）社製）および５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得
られた白色を呈する形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・Ｓ
ＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラス
ミドをＡｐａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロース
ゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認し
た。このようにして、ＶＤ−ＤＮＡ断片が挿入されたプ
ラスミドｐＢＬ７Ａ２７を得た。
【０３６２】（２）ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡ
を保持するプラスミドの構築 １）ヒトＩｇＧ１ ゲノム５’側ＤＮＡ断片作製用プラ
イマーの合成ヒトＩｇＧ１ゲノム５’側ＤＮＡ断片の合
成は、ＰＣＲ法を用いて作製した。ＰＣＲを行なうにあ
たり、以下に記載する２種類のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを作製した： 5'- GGGAAGCTTC CGCGGTCACA TGGCACCACC TCTCTTGCA -3' （５’Ｈｉｎｄ：配列表の配列番号８４）； 5'- GCTCTGCAGA GAGAAGATTG GGAGTTACTG GAATC -3' （ＩＧＧＣＰＳＴＮ：配列表の配列番号８５）。
【０３６３】２）プラスミドｐＩＧ５’０３の構築 ＨｉｎｄＩＩＩ切断配列に続き、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１
領域とイントロンを含むゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤ
ＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により目的ＤＮＡ断片を分離
増幅した後に、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造
（株）社製）中に挿入され、大腸菌でクローン化され
た。目的とするヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域とイントロン
を含むＤＮＡ（以下「ＩＧ５’−ＤＮＡ」という）断片
の作製法の概要を図２４に示した。
【０３６４】ＩＧ５’−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作
製された。
【０３６５】 反応液組成： ヒトゲノミックＤＮＡ（クローンテック社製） ２μｇ オリゴヌクレオチドプライマー ５’Ｈｉｎｄ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＧＧＣＰＳＴＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３６６】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３６７】ＰＣＲ後の増幅されたＩＧ５’−ＤＮＡ断
片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳
動後のゲルを、1 μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミ
ドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出し
た。検出したＩＧ５’−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出
し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用
いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇ
の遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μ
ｌの蒸留水に溶解した。
【０３６８】得られたＩＧ５’−ＤＮＡ断片は、フェノ
ール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化した。
【０３６９】プラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡ（宝酒
造（株）社製）１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓ
ｔＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸
化プラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡと、ＨｉｄＩＩＩ
とＰｓｔＩで消化したＩＧ５’−ＤＮＡ断片とをＤＮＡ
ライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）
社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇ
ａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた白色を呈する形
質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを
含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法により
プラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＰｓｔ
ＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動
を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このように
して、ＩＧ５’−ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐ
ＩＧ５’０３を得た。
【０３７０】（３）ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡ
を保持するプラスミドの構築 １）ヒトＩｇＧ１ゲノム３’側ＤＮＡ断片作製用プライ
マーの合成ヒトＩｇＧ１ゲノム３’側ＤＮＡ断片の合成
は、ＰＣＲ法を用いて作製した。ＰＣＲを行なうにあた
り、以下に記載する２種類のプライマーを作製した： 5'- TCTCTGCAGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCAC -3' （ＩＧＧＣＰＳＴＰ：配列表の配列番号８６）； 5'- GGGGAATTCG GGAGCGGGGC TTGCCGGCCG TCGCACTCA -3' （Ｅｃｏ３’：配列表の配列番号８７）。
【０３７１】２）プラスミドｐＩＧ３’０８の構築 ヒトＩｇＧ１のイントロン、ヒンジ領域、イントロン、
ＣＨ２領域、イントロン、ＣＨ３領域およびＥｃｏＲＩ
切断配列を保持するＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型
とし、ＰＣＲ法により目的ＤＮＡ断片を分離増幅した後
に、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）社製）中
に挿入され、大腸菌でクローン化された。目的とするヒ
トＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域およ
び、イントロンを含むゲノムＤＮＡ（以下「ＩＧ３’−
ＤＮＡ」という）断片の作製法の概要を図２５に示し
た。
【０３７２】ＩＧ３’−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作
製された。
【０３７３】 反応液組成： ヒトゲノミックＤＮＡ（クローンテック社製） ２μｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＧＧＣＰＳＴＰ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー Ｅｃｏ３’ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０３７４】ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した
後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間
の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０
分間加温した。
【０３７５】ＰＣＲ後の増幅されたＩＧ３’−ＤＮＡ断
片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気
泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロ
ミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出
した。検出した各ＤＮＡ断片を、剃刀で切り出し、セン
トリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲル
より溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分
離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留
水に溶解した。
【０３７６】得られたＩＧ３’−ＤＮＡ断片を、フェノ
ール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制
限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化した。
【０３７７】プラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡ（宝酒
造（株）社製）１μｇをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化
し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＨＳＧ
３９９ＤＮＡと、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化した
ＩＧ３’−ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバ
ージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した
後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭ
のＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍ
ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布
した。白色コロニーを選択し、ＩＧ３’−ＤＮＡ断片が
挿入されたプラスミドｐＩＧ３’０８を得た。
【０３７８】（４）ヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖発現ベクタ
ープラスミドの構築 配列表の配列番号８９に示したヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖
ポリペプチドをコードする、配列表の配列番号８８に示
したＤＮＡを保持する発現ベクタープラスミドｐＥｇ７
ＡＨ−Ｈは、前出プラスミドｐＢＬ７Ａ２７、ｐＩＧ
５’０３および、ｐＩＧ３’０８を用いて作製した。作
製手順の概要を図２６に示した。
【０３７９】ヒトＩｇＧ１−重鎖のＣＨ１領域とイント
ロンを含むｐＩＧ５’０３プラスミドＤＮＡ １０μｇ
を、制限酵素ＡｐａＩと制限酵素ＫｐｎＩで消化した。
一方、前出プラスミドｐＢＬ７Ａ２７ ＤＮＡ 1 μｇ
を、制限酵素ＡｐａＩとＫｐｎＩで消化し、ＣＩＰで脱
リン酸化した。この脱リン酸化ｐＢＬ７Ａ２７ ＤＮＡ
１００ｎｇと、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩで消化したｐ
ＩＧ５’０３ ＤＮＡ１０μｇとをＤＮＡライゲーショ
ンキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用い
て連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株でクローニングし
た。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法
によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドを
ＡｐａＩとＫｐｎＩ、あるいはＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動を行うことにより
目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ヒ
ト化ＨＦＥ７ＡのＶＤ−ＤＮＡ断片とＩＧ５’−ＤＮＡ
断片が接続され、挿入されたプラスミドｐＢＬ７ＡＦ１
８４を得た。
【０３８０】次に、得られたプラスミドｐＢＬ７ＡＦ１
８４ ＤＮＡ １０μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと
ＰｓｔＩで消化した。一方、前出プラスミドｐＩＧ３’
０８ＤＮＡ １μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓ
ｔＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸
化ｐＩＧ３’０８ ＤＮＡ １００ｎｇと、ＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＢＬ７ＡＦ１８４ Ｄ
ＮＡ １０μｇを、ＤＮＡライゲーションキットバージ
ョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、
大腸菌ＪＭ１０９株でクローニングした。得られた形質
転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプ
ラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＰｓｔＩ
とＨｉｎｄＩＩＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ
で消化し、アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入
断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＦＥ
７ＡのＶＤ−ＤＮＡ断片と、ヒトＩｇＧ１定常領域をコ
ードするゲノミックＤＮＡ断片が接続され、挿入された
プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２を得た。なお、プラスミ
ドｐｇＨＳＬ７Ａ６２を保持する形質転換大腸菌 Ｅ．
ｃｏｌｉ ｐｇＨＳＬ７Ａ６２ ＳＡＮＫ７３３９７
は、平成９年８月２２日付で工業技術院生命工学工業技
術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６
０７４が付された。
【０３８１】得られたプラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２Ｄ
ＮＡ １０μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ
Ｉにより切断した。一方、哺乳動物細胞用発現プラスミ
ドｐＥＥ．６．１ ＤＮＡ １μｇをＨｉｎｄＩＩＩと
ＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱
リン酸化ｐＥＥ．６．１ ＤＮＡ １００ｎｇと、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐｇＨＳＬ７Ａ
６２ ＤＮＡ １０μｇを、ライゲーションキットを用
いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株でクローニングし
た。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法
によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドを
ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル
電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。こ
のようにして、ヒト化ＨＦＥ７ＡのＶＤ−ＤＮＡ断片
と、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするゲノミックＤＮ
Ａとの融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で
挿入されたプラスミドｐＥｇ７ＡＨ−Ｈを得た。
【０３８２】（５）ヌクレオチド配列の確認 ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈの挿入ＤＮＡが、目的とするヌクレオ
チドの配列を保持していることを確認するため、ヌクレ
オチド配列の決定を行なった。ヌクレオチドの配列を決
定するにあたり作製したオリゴヌクレオチドプライマー
は以下に記載する通りであった： 5'- ACAGCCGGGA AGGTGTGCAC -3' （ＩＧ０１：配列表の配列番号９０）； 5'- AGACACCCTC CCTCCCTGTG -3' （ＩＧ０２：配列表の配列番号９１）； 5'- GTGCAGGGCC TGGGTTAGGG -3' （ＩＧ０３：配列表の配列番号９２）； 5'- GCACGGTGGG CATGTGTGAG -3' （ＩＧ０４：配列表の配列番号９３）； 5'- GTTTTGGGGG GAAGAGGAAG -3' （ＩＧ０５：配列表の配列番号９４）； 5'- CCAGTCCTGG TGCAGGACGG -3' （ＩＧ０６：配列表の配列番号９５）； 5'- CCTGTGGTTC TCGGGGCTGC -3' （ＩＧ０７：配列表の配列番号９６）； 5'- CGTGGTCTTG TAGTTGTTCT -3' （ＩＧ０８：配列表の配列番号９７）； 5'- CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC -3' （ＩＧＰ５：配列表の配列番号９８）； 5'- CCGTCCTGCA CCAGGACTGG -3' （ＩＧＰ６：配列表の配列番号９９）； 5'- GCAGCCCCGA GAACCACAGG -3' （ＩＧＰ７：配列表の配列番号１００）； 5'- AGAACAACTA CAAGACCACG -3' （ＩＧＰ８：配列表の配列番号１０１）； 5'- GCCTGACATC TGAGGACTC -3' （Ｈ５＋：配列表の配列番号１０２）； 5'- GAGTCCTCAG ATGTCAGGC -3' （Ｈ５−：配列表の配列番号１０３）； 5'- GAGCAGTACT CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA CCAG -3' （ＰＥＥＦ：配列表の配列番号１０４）； 5'- GGTATGGCTG ATTAATGATC AATG -3' （ＰＥＥＢ：配列表の配列番号１０５） 。
【０３８３】各プライマーが結合する位置を、図２７に
示した。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ
法と塩化セシウム法により精製した各プラスミドＤＮＡ
を鋳型とし、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法で行なっ
た。その結果、ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈは配列表の配列番号８
９に示したポリペプチドをコードする、配列表の配列番
号８８に示すヌクレオチド配列を保持していることが確
認された。
【０３８４】実施例１６ ＣＯＳ−１細胞での発現 上記で得られたヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖発現プラスミド
および各ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミドのサル
腎臓由来細胞株ＣＯＳ−１細胞への導入を、電極間２ｍ
ｍのチャンバー／ＦＣＴ−１３（島津製作所（株）社
製）を装着した遺伝子導入装置ＧＴＥ−１（島津製作所
（株）社製）を用いて、電気穿孔法により行った。ま
ず、ＣＯＳ−１細胞（American Type Culture Collecti
on No. CRL-1650 ）を、１０％のウシ胎児血清（以下
「ＦＣＳ」という：モアゲート社製）を含む最小必須ア
ルファー培地（以下「α（＋）ＭＥＭ」という：ギブコ
・ビーアールエル社製）を入れた細胞培養用フラスコ
（培養面積２２５ｃｍ2：住友ベークライト（株）社
製）中でセミコンフルエントになるまで培養した。その
後、培地を除去し、３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液
（シグマ社製）中、３７℃、３分間処理することにより
ＣＯＳ−１細胞をフラスコから遊離させた。遊離した細
胞は、８００ｒｐｍ、２分間の遠心分離により回収し、
リン酸緩衝液［０．０２％ 塩化カリウム、０．０２％
リン酸２水素カリウム、０．８％ 塩化ナトリウム、
１．１５％ リン酸水素２ナトリウム。以下「ＰＢＳ
（−）」という；日水製薬（株）社製］で２回洗浄し
た。洗浄したＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ（−）で１×１０
8細胞数／ｍｌとなるよう調製し、ＣＯＳ−１細胞懸濁
液とした。
【０３８５】一方、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム
密度勾配遠心分離法を用いて調製したヒト化ＨＦＥ７Ａ
−重鎖発現プラスミドＤＮＡ ４μｇおよびヒト化ＨＦ
Ｅ７Ａ−軽鎖発現プラスミドＤＮＡ ４μｇを混合した
後、同一チューブ内でエタノール沈澱し、ＰＢＳ（−）
２０μｌに懸濁した。得られたプラスミド懸濁液２０
μｌを、先に調製したＣＯＳ−１細胞懸濁液２０μｌ
（２×１０6細胞数）と混合し、電極間隔２ｍｍのチャ
ンバー／ＦＣＴ−１３（島津製作所社製）に移し、遺伝
子導入装置ＧＴＥ−１（島津製作所（株）社製）にセッ
トした。その後、６００Ｖ、５０μＦのパルスを、１秒
間隔で２回与えることにより、目的とするプラスミドＤ
ＮＡをＣＯＳ−１細胞内に導入した。パルスを与えた後
のチャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を、１０％ ＦＣ
Ｓを含むα（＋）ＭＥＭ ５ｍｌに懸濁し、細胞培養用
フラスコ（培養面積２５ｃｍ2：住友ベークライト
（株）社製）に移した。５％炭酸ガス下、３７℃、７２
時間培養した後に培養上清を回収し、本培養上清中に含
まれる発現生成物を解析した。
【０３８６】上記の方法により、以下に記載するプラス
ミドの組み合わせでそれぞれＣＯＳ−１細胞を形質転換
し、培養上清を回収した： ［Ａ］：プラスミドＤＮＡを含まない条件； ［Ｂ］：ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈおよびｐ７ＡＬ−ＭＭのコ・
トランスフェクション； ［Ｃ］：ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈおよびｐ７ＡＬ−ＨＭのコ・
トランスフェクション； ［Ｄ］：ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈおよびｐ７ＡＬ−ＨＨのコ・
トランスフェクション。実施例１７ ＥＬＩＳＡ法による発現産物の定量 実施例１６で調製した培養上清中のヒト化抗体の発現の
確認および発現生成物の定量検定を、抗ヒトＩｇＧに対
する抗体を用いた酵素結合抗体法（以下「ＥＬＩＳＡ
法」という）により行なった。すなわち、９６穴プレー
ト（マキシソープ：ヌンク社製）の各ウエルに、最終濃
度１μｇ／ｍｌで固相化緩衝液（０．０５Ｍ 炭酸水素
ナトリウム、０．０２％ アジ化ナトリウム、ｐＨ９．
６）に溶解したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクロ
ーナル抗体（カペル社製）１００μｌを加え、３７℃、
２時間保温し、抗体をプレートに固相化した。その後、
０．０５％のツイーン−２０（バイオラッド社製）を含
むＰＢＳ（−）（以後、「ＰＢＳ−Ｔ」という）３５０
μｌで４回洗浄した。洗浄の終わった各ウエルに、１０
％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで希釈した培養上清を
加え、３７℃、２時間保温した。再び、ＰＢＳ−Ｔによ
る洗浄の後、ＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したアルカリ
フォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポ
リクローナル抗体（カルタグ・ラボ社製）１００μｌ
を、各ウエルに加え、３７℃、２時間保温した。再び、
ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後、ｐ−ニトロフェニル燐酸を
１０％ ジエタノールアミン（ｐＨ９．８）で１ｍｇ／
ｍｌに調製した基質溶液を加えた。３７℃、３０分間か
ら１時間保温し、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。な
お、本実験において、培養上清中に含まれるヒト化ＨＦ
Ｅ７Ａ抗体の濃度対照としては、１０％ ＦＣＳを含む
α（＋）ＭＥＭで一定濃度に希釈したヒトプラズマイム
ノグロブリンＧ／サブクラス１（ＩｇＧ１）（バイオピ
ュアＡＧ社製）を用いた。
【０３８７】その結果、実施例１６で調製した培養上清
中の発現生成物のうち、［Ｂ］、［Ｃ］および［Ｄ］の
条件のものは、抗ヒトＩｇＧ抗体により特異的に検出さ
れた。
【０３８８】実施例１８ Ｆａｓに対する結合活性の測
定 以下に記載する方法に従って、実施例１６で調製した形
質転換細胞培養上清中のＦａｓへの結合活性のＥＬＩＳ
Ａ法による検定を行った。まず、実施例１で調製したヒ
トＦａｓ融合タンパク質発現ＣＯＳ−１細胞培養上清を
固相化緩衝液で５倍に希釈し、９６穴プレート（マキシ
ソープ：ヌンク社製）の各ウエルに５０μｌづつ入れ、
４℃で一晩保温することにより、ウエル表面にヒトＦａ
ｓ融合タンパク質を吸着させた。その後、各ウエルをＰ
ＢＳ−Ｔ ３５０μｌで４回洗浄した。洗浄後、５％
ウシ血清アルブミン（和光純薬（株）社製）を含むＰＢ
Ｓ−Ｔを、各ウエルに５０μｌづつ加え、３７℃、１時
間保温することによりブロッキングし、その後再び、各
ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。実施例１６で調製した
培養上清は、予め、実施例１７に記載した方法により、
含有する目的発現生成物の濃度を算出し、最終的な目的
生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように１０％ Ｆ
ＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ培地で調製しておいた。１０
０ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した各発現生成物溶液を、１
０％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ培地で２倍希釈を繰
り返し、希釈系列を作製した。作製された各発現生成物
希釈系列溶液５０μｌを、各ウエルに添加し、３７℃
下、２時間反応させた。その後、再びＰＢＳ−Ｔで洗浄
した後、ＰＢＳ−Ｔにより１００００倍希釈したアルカ
リフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的
ポリクローナル抗体（カルタグ・ラボ社製）５０μｌを
各ウエルに分注し、３７℃下、２時間反応させた。な
お、対照として用いた、マウスハイブリドーマＨＦＥ７
Ａより精製したＨＦＥ７Ａ（ＩｇＧ１）の検出は、アル
カリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的
ポリクローナル抗体の代わりに、ＰＢＳ−Ｔにより５，
０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（ギブコ・ビーアールエ
ル社製）を用いた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄したのち、５０μ
ｌのｐ−ニトロフェニル燐酸を１０％ ジエタノールア
ミン（ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌに調製した基質溶液
を加え、３７℃で３０分間から１時間保温した。各ウエ
ルの４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、各培養
上清中に含まれる発現生成物のヒトＦａｓ融合タンパク
質に対する結合活性を調べた。
【０３８９】その結果、実施例１６で調製した培養上清
中の発現生成物のうち、［Ｂ］、［Ｃ］および［Ｄ］の
条件のものは、ヒトＦａｓ融合タンパク質との結合性を
有するものであることが確認された（図２８）。
【０３９０】実施例１９ ＨＦＥ７ＡのＦａｓへの結合
に対する競合阻害 本発明で得られるヒト化抗Ｆａｓ抗体のＦａｓに対する
結合は、ヒト化設計の基礎となった抗Ｆａｓマウスモノ
クローナル抗体であるＨＦＥ７Ａの結合を阻害するはず
である。そこで、ＨＦＥ７Ａと実施例１６で調製した発
現生成物とのヒトＦａｓ融合タンパク質に対する競合阻
害活性を測定した。
【０３９１】実施例３で得られた精製ＨＦＥ７Ａモノク
ローナル抗体 １ｍｇを、市販のアルカリフォスファタ
ーゼ標識キット（イムノ−リンク ＡＰ アンド ＡＰ
Ｌラベリング キット：ジェノシス社製）を添付のプロ
トコールに従って用いることにより標識した（以下、こ
の標識抗体を「ＡＰ−ＨＦＥ７Ａ」という）。
【０３９２】ヒトＦａｓ融合タンパク質を含むＣＯＳ−
１培養上清を、固相化緩衝液で５倍希釈し、発光検出用
９６穴プレート（ルミネッセント ソリッド アッセイ
プレート、高結合特性：コースター社製）の各ウエル
に５０μｌづつ入れ、４℃で一晩保温することにより、
ウエル表面にヒトＦａｓ融合タンパク質を吸着させた。
吸着後、各ウエルをＰＢＳ−Ｔ３５０μｌで４回洗浄し
た。洗浄後、５％ ウシ血清アルブミン（和光純薬
（株）社製）を含むＰＢＳ−Ｔを、各ウエルに１００μ
ｌづつ加え、３７℃、１時間保温することによりブロッ
キングし、その後再び、各ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し
た。実施例１６で調製した培養上清は、予め、実施例１
７で示す方法により、含有する目的発現生成物の濃度を
算定し、最終的な目的生成物濃度が１μｇ／ｍｌとなる
ように１０％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで調製して
おいた。１μｇ／ｍｌの濃度に調製した各発現生成物溶
液を、１０％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで二倍希釈
を繰り返し、希釈系列を作製した。一方、ＡＰ−ＨＦＥ
７Ａを、１０％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭにより５
０ｎｇ／ｍｌに希釈し、作製した希釈系列と等量混合し
た。発現生成物希釈系列とＡＰ−ＨＦＥ７Ａ混合液を、
洗浄の終わった各ウエルに５０μｌづつ加え、室温で一
晩静置した。その後再び、各ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄
し、各ウエルに１００μｌのＣＤＰ−スター緩衝液
（９．５８ｍｌ ジエタノールアミン、０．２ｇ 塩化
マグネシウム、０．２５ｇ アジ化ナトリウム、ｐＨ
８．５）を加え、１０分間、室温で静置した。その後、
ＣＤＰ−スター緩衝液を除去し、ＣＤＰ−スター基質
（１．２ｍｌ サファイアＩＩ（トロピックス社製）、
２００μｌＣＤＰ−スター（トロピックス社製）、ＣＤ
Ｐ−スター緩衝液で１２ｍｌとする）を５０μｌ／ウエ
ル加え、さらに室温で４０分間静置した。各培養上清中
に含まれる発現生成物のヒトＦａｓ融合タンパク質に対
するＨＦＥ７Ａとの競合阻害活性は、発光強度をルミノ
スキャン（タイターテック社製）により測定することに
より行なった。
【０３９３】その結果、実施例１６で調製した発現生成
物は、マウスハイブリドーマより調製したＨＦＥ７Ａの
ヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合を、特異的に阻
害することが確認された（図２９）。
【０３９４】実施例２０ アポトーシス誘導活性 マウスＴリンパ腫細胞にヒトＦａｓ分子を発現させたＷ
Ｒ１９Ｌ１２ａ細胞［Itoh, N. et. al. (1991) Cell 6
6, 233-243］を用いて、ヒト化抗Ｆａｓ抗体を発現させ
たＣＯＳ細胞培養上清のアポトーシス誘導活性を検討し
た。まず、１０％ ＦＣＳ（ギブコ・ビーアールエル社
製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、３７℃、５％
炭酸ガス存在下で３日間培養したＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞
（１×１０5細胞／５０μｌ）を、９６穴マイクロプレ
ート（住友ベークライト（株）社製）の各ウエルに５０
μｌずつ分注した。実施例１６で調製した培養上清は、
予め実施例１７に記載した方法により、含有する目的発
現生成物の濃度を算定し、最終的な目的生成物濃度が１
００ｎｇ／ｍｌとなるように１０％ ＦＣＳを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地で調製しておいた。１００ｎｇ／ｍｌ
の濃度に調製した各発現生成物溶液を、１０％ ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地で二倍希釈を繰り返し、希
釈系列を作製した。各発現生成物希釈液 ５０μｌを、
各ウエルに添加し、３７℃で１時間保温した。その後、
１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗
浄した後、各ウエルの細胞を７５μｌの１０％ ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁した。その後、各ウ
エルに二次抗体として、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０培地で１．２５μｇ／ｍｌに調製したヤギ抗ヒト
ＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（カペル社製）
を７５μｌ加えた。３７℃下、１２時間反応させた後、
１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴ（２、３−ビス２−メトキシ−４
−ニトロ−５−スルホフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム
−５−カルボキサニリド イナーソルト：シグマ社製）
を含む２５μＭのＰＭＳ（フェナジンメトサルフェー
ト：シグマ社製）５０μｌ（終濃度２５０μｇ／ｍｌ
ＸＴＴ、５μＭ ＰＭＳ）を添加した。３時間培養した
後、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定し、ミトコン
ドリアの還元能を指標とし、細胞の生存率を算定した。
【０３９５】各ウェルの細胞の生存率を、下記式により
算出した： 生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ） （式中、ａは被検ウエルの測定値を、ｂは無細胞ウエル
の測定値を、ｃは抗体無添加のウエルの測定値をそれぞ
れ表わす）。
【０３９６】その結果、実施例１６で調製した発現生成
物は、ヒトＦａｓ抗原を発現したＴリンパ腫細胞株に対
してアポトーシスを誘導することが示された（図３
０）。
【０３９７】実施例２１ ＨＦＥ７Ａの軽鎖のヒト化発
現ベクターの構築 （１） ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現ベクタープラスミ
ドの構築 実施例１４で作成されたＨＨタイプヒト化軽鎖をよりヒ
トに近づけるべく、ＨＨタイプ軽鎖アミノ酸のＮ末端か
ら１番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、８５番目（ア
ラニン）および１０７番目（アルギニン）をそれぞれヒ
ト軽鎖（κ鎖）で保存されているグルタミン酸、グルタ
ミン酸およびリジンに置き換えたものを設計し、これを
「ＰＤＨＨタイプ」とした。同様に、ＨＭタイプ軽鎖ア
ミノ酸のＮ末端から１番目のアミノ酸（アスパラギン
酸）および１０７番目（アルギニン）をそれぞれヒト軽
鎖で保存されているグルタミン酸およびリジンに置き換
えたものを設計し、これを「ＰＤＨＭタイプ」とした。
以下、この２種類のヒト化抗ヒトＦａｓ抗体軽鎖アミノ
酸配列をコードするＤＮＡを保持する発現プラスミドを
それぞれ構築した。
【０３９８】１）プライマーの合成 ＰＤＨＨタイプポリペプチド鎖（配列表の配列番号１０
７）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１０６）お
よびＰＤＨＭタイプポリペプチド鎖（配列表の配列番号
１０９）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１０
８）の合成は、ＰＣＲ法を組み合わせて行なった。
【０３９９】ＰＣＲを行なうにあたり、前出２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ（配列表の配列
番号５５）および７ＡＬＣＮ（配列番号６４）に加え、
さらに６種の配列表のプライマー： 5'- GGTGAGATTG TGCTCACCCA ATCTCCAGG -3' （ＬＰＤ１Ｐ：配列番号１１０）； 5'- CCTGGAGATT GGGTGAGCAC AATCTCACC -3' （ＬＰＤ１Ｎ：配列番号１１１）； 5'- CCATCTCTCG TCTGGAGCCG GAGGATTTTG C -3' （ＬＰＤ２Ｐ：配列番号１１２）； 5'- GCAAAATCCT CCGGCTCCAG ACGAGAGATG G -3' （ＬＰＤ２Ｎ：配列番号１１３）； 5'- CAAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAACGGACT G -3' （ＬＰＤ３Ｐ：配列番号１１４）；および 5'- CAGTCCGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTT G -3' （ＬＰＤ３Ｎ：配列番号１１５）を作製した。
【０４００】２）ＰＤＨＨタイプヒト化軽鎖発現プラス
ミドｐＬＰＤＨＨ７５の構築 配列表の配列番号１０７に示されるアミノ酸配列をコー
ドするＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片（配列表の配列番号１０
６）は、ＰＣＲ法を３回繰り返すことにより作製され、
プラスミド中に挿入された後、大腸菌でクローニングさ
れた。
【０４０１】ａ）第一段階ＰＣＲ ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要
を図３１に示した。
【０４０２】５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部
位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ1領域の
一部をコードするＬＰＤ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件
で作製された。
【０４０３】 反応液組成： プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ１Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４０４】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４０５】ＦＲＬ1領域の一部、ＣＤＲＬ1領域、ＦＲ
Ｌ2領域、ＣＤＲＬ2領域およびＦＲＬ3領域の一部をコ
ードするＬＰＤＨＨ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作
製された。
【０４０６】 反応液組成： プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４０７】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４０８】ＦＲＬ3領域の一部、ＣＤＲＬ3領域および
ＦＲＬ4領域をコードするＬＰＤＨＨ２−ＤＮＡ断片
は、以下の条件で作製された。
【０４０９】 反応液組成： プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ２Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ３Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４１０】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４１１】ＦＲＬ4領域の一部および定常領域をコー
ドし、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加し
たＬＰＤＣ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０４１２】 反応液組成： プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ３Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４１３】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４１４】ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出と
エタノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲ
ルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより
染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出
されたＬＰＤ１−ＤＮＡ、ＬＰＤＨＨ１−ＤＮＡ、ＬＰ
ＤＨＨ２−ＤＮＡおよびＬＰＤＣ−ＤＮＡに相当するＤ
ＮＡのバンドを剃刀で切り出し、それぞれセントリコン
およびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲル
より溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分
離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留
水に溶解した。
【０４１５】ｂ）第二段階ＰＣＲ ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要
を図３２に示した。
【０４１６】前出ＬＰＤ１−ＤＮＡ断片、ＬＰＤＨＨ１
−ＤＮＡおよびＬＰＤＨＨ２−ＤＮＡ断片を融合したＬ
ＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製され
た。 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＨ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＨ２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ３Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４１７】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４１８】ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲル
を、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染
色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出さ
れたＬＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡに相当するＤＮＡのバン
ドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリュ
ーターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出
したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エ
タノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４１９】ｃ）第三段階ＰＣＲ ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要
を図３３に示した。
【０４２０】前出ＬＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡ断片とＬＰ
ＤＣ−ＤＮＡ断片を融合したＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片
は、以下の条件で作製された。
【０４２１】 反応液組成： 第二段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＣ−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４２２】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４２３】ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲル
を、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染
色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出さ
れたＬＰＤＨＨ−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り
出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いて
アクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７
５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の
後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４２４】ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プ
ラスミド作製方法の概要を図３４に示した。
【０４２５】得られたＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片は、フェ
ノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＥｃｏＲＩにより消
化した。
【０４２６】クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９
（宝酒造社製）ＤＮＡ１μｇを、予め制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰでで脱リン酸化し
た。このようにして得られた脱リン酸化プラスミドｐＨ
ＳＧ３９９ＤＮＡと、予め制限酵素で消化したＬＰＤＨ
Ｈ−ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョ
ン２．０（宝酒造社製）を用い、メーカー指定のプロト
コールに従って連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇ
ａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ寒天培地上に塗布した。これを３７℃で培養後、
白色を呈するコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌのク
ロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、この
培養物よりアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡ
を抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％アガロース
ゲル電気泳動で解析することにより、ＬＰＤＨＨ−ＤＮ
Ａ断片を保持するクローンを選択した。
【０４２７】以上の操作により、ＰＤＨＨタイプヒト化
軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、ヒトＩｇκ鎖定
常領域をコードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラ
スミドｐＨＳＨＨ５を得た。なお、プラスミドｐＨＳＨ
Ｈ５を保持する形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳ
ＨＨ５ ＳＡＮＫ ７０３９８は、平成１０年２月２６
日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託さ
れ、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６２７４が付された。
【０４２８】次に、プラスミドｐＨＳＨＨ５を用いて、
以下に記載する方法によりＰＤＨＨタイプヒト化軽鎖ポ
リペプチドをコードするＤＮＡを保持する発現ベクター
プラスミドｐＬＰＤＨＨ７５を作製した。
【０４２９】哺乳動物細胞用発現プラスミドｐＥＥ．１
２．１（ロンザ社製）ＤＮＡ１μｇを、予め制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸
化した。この脱リン酸化プラスミドｐＥＥ．１２．１Ｄ
ＮＡ１００ｎｇと、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃ
ｏＲＩで消化したｐＨＳＨＨ５ＤＮＡ断片 １０μｇを
ＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造
社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天
培地上に塗布した。
【０４３０】得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・
ＳＤＳ法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。このプ
ラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ
で消化し、１％アガロースゲル電気泳動により挿入断片
の有無を確認した。以上の操作により、ヒト化ＰＤＨＨ
タイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定
常領域をコードするＤＮＡとの融合断片とが、ＣＭＶプ
ロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐＬＰ
ＤＨＨ７５を得た。
【０４３１】（３）ＰＤＨＭタイプヒト化軽鎖発現プラ
スミドｐＬＰＤＨＭ３２の構築 配列表の配列番号１０９に示されるアミノ酸配列をコー
ドするＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片（配列表の配列番号１０
８）は、ＰＣＲ法を３回繰り返すことにより作製され、
プラスミド中に挿入された後、大腸菌でクローニングさ
れた。
【０４３２】ａ）第一段階ＰＣＲ ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要
を図３５に示した。
【０４３３】５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部
位を付加した、分泌シグナル配列、およびＦＲＬ1領域
の一部をコードするＬＰＤ１−ＤＮＡ断片、および、Ｆ
ＲＬ4領域の一部と定常領域をコードし、３’末端にＥ
ｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加したＬＰＤＣ−ＤＮＡ
断片は、いずれも上記（２）記載のＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ
断片の作製過程で得られたものを用いた。
【０４３４】ＣＤＲＬ1領域の一部、ＦＲＬ2領域、ＣＤ
ＲＬ2領域、ＦＲＬ3領域、ＣＤＲＬ3領域、およびＦＲ
Ｌ4領域をコードするＬＰＤＨＭ１−ＤＮＡ断片は、以
下の条件で作製された。
【０４３５】 反応液組成： プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ３Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４３６】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４３７】ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出と
エタノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲ
ルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより
染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出
したＬＰＤ１−ＤＮＡ、ＬＰＤＨＭ１−ＤＮＡおよびＬ
ＰＤＣ−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを剃刀で切り出
し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてア
クリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５
００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の
後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４３８】ｂ）第二段階ＰＣＲ ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要
を図３６に示した。
【０４３９】前出ＬＰＤ１−ＤＮＡ断片とＬＰＤＨＭ１
−ＤＮＡ断片とを融合したＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡ断
片は、以下の条件で作製された。
【０４４０】 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＭ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＬＰＤ３Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４４１】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４４２】ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲル
を、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染
色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出さ
れたＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀
で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを
用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮ
Ａを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール
沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４４３】ｃ）第三段階ＰＣＲ ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要
を図３７に示した。
【０４４４】前出ＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡ断片とＬＰ
ＤＣ−ＤＮＡ断片とを融合したＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片
は、以下の条件で作製された。
【０４４５】 反応液組成： 第二段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＣ−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬＣＮ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４４６】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４４７】ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲル
を、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染
色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出さ
れたＬＰＤＨＭ−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り
出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いて
アクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７
５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の
後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４４８】ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プ
ラスミド作製方法の概要は図３８に示した。
【０４４９】まず、上記で得られたＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ
断片を、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに
精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩにより消化した。
【０４５０】次にクローニング用プラスミドｐＨＳＧ３
９９（宝酒造社製）ＤＮＡ１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。
この脱リン酸化プラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡと、
予めＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したＬＰＤＨＭ
−ＤＮＡ断片とを、ＤＮＡライゲーションキットバージ
ョン２．０（宝酒造社製）を用い、メーカー指定のプロ
トコールに従って連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−
Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを
含むＬＢ寒天培地上に塗布した。これを３７℃で培養
後、白色を呈するコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌ
のクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、
この培養物よりアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤ
ＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％アガロース
ゲル電気泳動で解析することにより、ＬＰＤＨＭ−ＤＮ
Ａ断片を保持するクローンを選択した。
【０４５１】以上の操作により、ＰＤＨＭタイプヒト化
軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードする
ＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨＳＨＭ２
を得た。なお、プラスミドｐＨＳＨＭ２を保持する形質
転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉｐＨＳＨＭ２ ＳＡＮＫ ７
０１９８は、平成１０年２月２６日付で工業技術院生命
工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２７２が付された。
【０４５２】次に、プラスミドｐＨＳＨＭ２を用いて、
以下に記載する方法によりＰＤＨＭタイプヒト化軽鎖ポ
リペプチドをコードするＤＮＡを保持する発現ベクター
プラスミドｐＬＰＤＨＭ３２を作製した。
【０４５３】哺乳動物細胞用発現プラスミドｐＥＥ．１
２．１（ロンザ社製）ＤＮＡ １μｇを、予め制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン
酸化した。この脱リン酸化プラスミドｐＥＥ．１２．１
ＤＮＡ（１００ｎｇ）と、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
ＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＨＭ２−ＤＮＡ断片
（１０μｇ）とをＤＮＡライゲーションキットバージョ
ン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換
体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培
地で培養し、該培養物からアルカリ・ＳＤＳ法によりプ
ラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロー
スゲル電気泳動により挿入断片の有無を確認した。以上
の操作により、ＰＤＨＭタイプヒト化軽鎖の可変領域を
コードするＤＮＡと、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードす
るＤＮＡとの融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正
方向で挿入されたプラスミドｐＬＰＤＨＭ３２を得た。
【０４５４】（４）ヌクレオチド配列の確認 上記（２）および（３）で作製されたプラスミドｐＬＰ
ＤＨＨ７５およびｐＬＰＤＨＭ３２が、それぞれ目的と
するヌクレオチド配列を有するＤＮＡを保持しているこ
とを確認するため、ヌクレオチド配列の決定を行なっ
た。ここで使用したプライマーは、前出ＳＰ１（配列表
の配列番号６８）、ＳＰ２（配列表の配列番号６９）、
ＳＰ３（配列表の配列番号７０）、ＳＰ４（配列表の配
列番号７１）、ＳＰ５（配列表の配列番号７２）および
ＳＰ６（配列表の配列番号７３）であった。各プライマ
ーが結合する位置を、図１９に示した。ヌクレオチド配
列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム法によ
り精製した各プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ジデオキシ
ヌクレオチド鎖終結法で行なった。その結果、ｐＬＰＤ
ＨＨ７５は配列表の配列番号１０６に示されるヌクレオ
チド配列を、ｐＬＰＤＨＭ３２は配列表の配列番号１０
８に示されるヌクレオチド配列をそれぞれ保持している
ことが確認された。
【０４５５】実施例２２ ヒト化重鎖発現ベクターの構
築 実施例１５で作製されたヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖をより
ヒトに近づけるべく、該ヒト化重鎖のアミノ酸配列のＮ
末端から４４番目のアミノ酸（アルギニン）および７６
番目のアミノ酸（アラニン）をそれぞれヒト重鎖で保存
されているグリシンおよびトレオニンに置き換えたもの
を設計し、これを「ＨＶタイプ」とした。このＨＶタイ
プヒト化重鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持す
る発現プラスミドを、以下に記載する方法により構築し
た。
【０４５６】 （１）プライマーの合成ＨＶタイプヒト化重鎖ポリペプ
チド鎖（配列表の配列番号１１７）をコードするＤＮＡ
（配列表の配列番号１１６）の合成を、ＰＣＲ法を組み
合わせて行なった。
【０４５７】ＰＣＲを行なうにあたり、前出のプライマ
ー７ＡＨ１Ｐ（配列表の配列番号７６）に加え、さらに
３種のプライマー： 5'- CAGGCCCCTG GACAGGGCCT TGAGTGGATG -3' （ＨＰＤ１Ｐ：配列表の配列番号１１８）； 5'- CATCCACTCA AGGCCCTGTC CAGGGGCCTG -3' （ＨＰＤ１Ｎ：配列表の配列番号１１９）；および 5'- GCTGAGCTCC ATGTAGGCTG TGCTAGTGGA TGTGTCTAC -3' （ＨＰＤ２Ｎ：配列表の配列番号１２０）を作製した。
【０４５８】（２）プラスミドｐｇＨＰＤＨＶ３の構築 配列表の配列番号１１７のアミノ酸番号−１９から８４
に示されるアミノ酸配列をコードするＨＰＤ１．２−Ｄ
ＮＡ断片は、ＰＣＲ法を２回繰り返すことにより作製さ
れ、プラスミドへ挿入された後、大腸菌でクローニング
された。
【０４５９】ａ）第一段階ＰＣＲ ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概
要を図３９に示した。５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵
素切断部位を付加した、分泌シグナル配列、ＦＲＨ1領
域、ＣＤＲＨ1領域およびＦＲＨ2領域の一部をコードす
るＨＰＤ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０４６０】 反応液組成： プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＨＰＤ１Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４６１】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４６２】次に、ＦＲＨ2領域の一部、ＣＤＲＨ3領域
およびＦＲＨ3領域の一部をコードするＨＰＤ２−ＤＮ
Ａ断片は、以下の条件で作製された。
【０４６３】 反応液組成： プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＨＰＤ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＨＰＤ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４６４】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で1分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４６５】ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出と
エタノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲ
ルを、1μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより
染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出
されたＨＰＤ１−ＤＮＡおよびＨＰＤ２−ＤＮＡに相当
するＤＮＡバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよ
びセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより
溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離に
より濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に
溶解した。
【０４６６】ｂ）第二段階ＰＣＲ ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概
要を図４０に示した。前出ＨＰＤ１−ＤＮＡ断片とＨＰ
Ｄ２−ＤＮＡ断片とを融合したＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断
片は、以下の条件で作製された。
【０４６７】 反応液組成： 第一段階ＰＣＲで作製したＨＰＤ１−ＤＮＡ溶液 １０μｌ 第一段階ＰＣＲで作製したＨＰＤ２−ＤＮＡ溶液 １０μｌ オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＨ１Ｐ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＨＰＤ２Ｎ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４６８】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４６９】ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲル
を、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染
色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出さ
れた融合ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出し、セ
ントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリル
アミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×
ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０
μｌの蒸留水に溶解した。
【０４７０】ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片を保持するプラ
スミド作製方法の概要を図４１に示した。
【０４７１】上記で得られたＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片
を、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製
した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＳａｃＩに
より消化した。
【０４７２】前出プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２ＤＮＡ
１μｇを、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで
消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラ
スミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２ ＤＮＡと、予めＨｉｎｄＩ
ＩＩとＳａｃＩで消化したＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片を
ＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造
社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、最終濃度５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコー
ルを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換
体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ
Ｂ液体培地で培養し、この培養物からアルカリ・ＳＤＳ
法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミド
ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
アガロースゲル電気泳動を行って、ＨＰＤ１．２−ＤＮ
Ａ断片を保持するクローンを選択した。
【０４７３】以上の操作により、ＨＶタイプヒト化重鎖
の可変領域をコードするＤＮＡと、ヒトＩｇＧ１定常領
域をコードするゲノミックＤＮＡ断片との融合断片を保
持するプラスミドｐｇＨＰＤＨＶ３を得た。なお、プラ
スミドｐｇＨＰＤＨＶ３を保持する形質転換大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇＨＰＤＨＶ３ ＳＡＮＫ ７０２９
８は、平成１０年２月２６日付で工業技術院生命工学工
業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−６２７３が付された。
【０４７４】次に、ｐｇＨＰＤＨＶ３ ＤＮＡ １０μ
ｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＥｃｏＲＩに
より消化した。一方、哺乳動物細胞用発現プラスミドｐ
ＥＥ．６．１（ロンザ社製）１μｇを、予め制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸
化した。この脱リン酸化プラスミドｐＥＥ．６．１ＤＮ
Ａ（１００ｎｇ）と、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消
化したｐｇＨＰＤＨＶ３ ＤＮＡ（１０μｇ）とを、Ｄ
ＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社
製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株でクロー
ニングした。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、該培養物か
らアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出
た。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと
ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って
挿入断片の有無を確認した。以上の操作により、ＨＶタ
イプヒト化重鎖をコードするＤＮＡが、ＣＭＶプロモー
ター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐＥｇＰＤＨ
Ｖ３−２１を得た。
【０４７５】（３）ヌクレオチド配列の確認 上記（２）で得られたプラスミドｐＥｇＰＤＨＶ３−２
１が、目的とするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを保
持していることを確認するため、ヌクレオチド配列の決
定を行なった。ここで用いられたプライマーは前出ＰＥ
ＥＦ（配列表の配列番号１０４）、ＨＰＤ１Ｐ（配列表
の配列番号１１８）、ＨＰＤ１Ｎ（配列表の配列番号１
１９）およびＨＰＤ２Ｎ（配列表の配列番号１２０）で
あった。各プライマーが結合する位置を、図４２に示し
た。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ法と
塩化セシウム法により精製したプラスミドＤＮＡを鋳型
とし、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法で行なった。そ
の結果、ｐＥｇＰＤＨＶ３−２１は配列表の配列番号１
１６に示されヌクレオチド配列を保持していることが確
認された。
【０４７６】実施例２３ ＣＯＳ−１細胞用発現ベクタ
ーの構築 実施例１４および実施例２１で作製された各種ヒト化Ｈ
ＦＥ７Ａ−軽鎖発現ベクター（ｐ７ＡＬ−ＨＨ、ｐ７Ａ
Ｌ−ＨＭ、ｐ７ＡＬ−ＭＭ、ｐＬＰＤＨＨ７５およびｐ
ＬＰＤＨＭ３２）と、実施例１５および実施例２２で作
製された各種ヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖発現ベクター（ｐ
Ｅｇ７ＡＨ−ＨおよびｐＥｇＰＤＨＶ３−２１）を用い
て、ＣＯＳ−１細胞を用いた遺伝子発現のために最適化
した発現ベクターを以下に記載する方法により作製し
た。
【０４７７】１．ＣＯＳ−１細胞用軽鎖発現ベクターの
構築 各種ヒト化ＨＦＥ−７Ａ軽鎖のＣＯＳ−１細胞用発現ベ
クターの構築法の概要を図４３に示した。
【０４７８】（１）プロモーター増幅用プライマー（軽
鎖用）の合成 ＳＲαプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲによ
り作製するにあたり、以下に記載する２種のオリゴヌク
レオチドプライマー： 5'- TGCACGCGTG GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAG -3' （ＭＬＵＡ：配列表の配列番号１２１）；および 5'- TCCGAAGCTT TTAGAGCAGA AGTAACACTT C -3' （ＨＩＮＤＢ：配列表の配列番号１２２）を作製した。
【０４７９】（２）発現ベクター（軽鎖用）の構築 ＳＲαプロモーター領域を含み、５’末端にＭｕｌＩ制
限酵素切断部位、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切
断部位がそれぞれ付加されたＬＳＲα−ＤＮＡ断片は、
プラスミドｐＭＥ１８Ｓを鋳型とし、以下の条件で作製
された。
【０４８０】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ１８Ｓ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＭＬＵＡ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＨＩＮＤＢ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４８１】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４８２】ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲル
を、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染
色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出さ
れたＬＳＲα−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出
し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてア
クリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５
００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の
後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４８３】次に、実施例１４および実施例２１で作製
されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨ、ｐ７ＡＬ−ＨＭ、ｐ
７ＡＬ−ＭＭ、ｐＬＰＤＨＨ７５またはｐＬＰＤＨＭ３
２１μｇを、制限酵素ＭｕｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミ
ドＤＮＡと、予めＭｕｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した
ＬＳＲα−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーションキット
バージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。
得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ液体培地で培養し、該培養物よりアルカリ・
ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラ
スミドＤＮＡを制限酵素ＭｕｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動を行って、ＬＳＲα−Ｄ
ＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０４８４】以上の操作により、各種のヒト化軽鎖をコ
ードするＣＯＳ−１細胞用発現ベクターｐＳＲＨＨ（Ｈ
Ｈタイプ、ｐ７Ａ−ＨＨ由来）、ｐＳＲＨＭ（ＨＭタイ
プ、ｐ７Ａ−ＨＭ由来）、ｐＳＲＭＭ（ＭＭタイプ、ｐ
７Ａ−ＭＭ由来）、ｐＳＲＰＤＨＨ（ＰＤＨＨタイプ、
ｐＬＰＤＨＨ７５由来）およびｐＳＲＰＤＨＭ（ＰＤＭ
Ｍタイプ、ｐＬＰＤＨＭ３２由来）を得た。
【０４８５】２．ＣＯＳ−１細胞用重鎖発現ベクターの
構築 各種ヒト化重鎖のＣＯＳ−１細胞用発現ベクターの構築
法の概要を図４４に示した。
【０４８６】（１）プロモーター増幅用プライマー（重
鎖用）の合成 ＳＲαプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲによ
り作製するにあたり、前出のプライマーＨＩＮＤＢ（配
列表の配列番号１２２）に加え、さらに１種のプライマ
ー： 5'- AAAGCGGCCG CTGCTAGCTT GGCTGTGGAA TGTGTG -3' （ＮＯＴＡ：配列表の配列番号１２３）を作製した。
【０４８７】（２）発現ベクター（重鎖用）の構築 ＳＲαプロモーター領域を含み、５’末端にＮｏｔＩ制
限酵素切断部位、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切
断部位がそれぞれ付加されたＨＳＲα−ＤＮＡ断片は、
プラスミドｐＭＥ１８Ｓを鋳型とし、以下の条件で作製
された。
【０４８８】 反応液組成： プラスミドｐＭＥ１８Ｓ ＤＮＡ ２００ｎｇ オリゴヌクレオチドプライマー ＮＯＴＡ ８０ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチドプライマー ＨＩＮＤＢ ８０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ混合液 ２０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液 ２０μｌ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０単位 上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ
とし、ＰＣＲに供試した。
【０４８９】ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱
した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２
分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で
１０分間加温した。
【０４９０】ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエ
タノール沈澱の後、５%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲル
を、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染
色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出さ
れＨＳＲα−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出
し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてア
クリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５
００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の
後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４９１】次に、実施例１５および実施例２２で作製
されたプラスミドｐＥｇ７ＡＨ−ＨまたはｐＥｇＰＤＨ
Ｖ３−２１ １μｇを、制限酵素ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸
化プラスミドＤＮＡと、予めＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したＨＳＲα−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーシ
ョンキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連
結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に
塗布した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、該培養物から
アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出し
た。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って、
ＨＳＲα−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０４９２】以上の操作により、各種のヒト化重鎖をコ
ードするＣＯＳ−１細胞用発現ベクターｐＳＲｇ７ＡＨ
（ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈ由来）およびｐＳＲｇＰＤＨ（ｐＥ
ｇＰＤＨＶ３−２１由来）を得た。
【０４９３】実施例２４ ヒト化ＨＦＥ７Ａの各サブユ
ニットをコードする遺伝子のＣＯＳ−１細胞での発現 実施例２３で得られたＣＯＳ−１細胞用発現ベクターに
よるＣＯＳ−１細胞の形質転換は、実施例１６に記載し
た方法により行なった。まず、ＣＯＳ−１細胞を、１０
％ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ（ギブコ・ビーアールエ
ル社製）を入れた細胞培養用フラスコ（培養面積２２５
ｃｍ2：住友ベークライト（株）社製）中でセミコンフ
ルエントになるまで培養した。その後、培地を除去し、
３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）中、
３７℃で３分間保温することにより、ＣＯＳ−１細胞を
フラスコから遊離させた。遊離した細胞を、８００ｒｐ
ｍ、２分間の遠心分離により回収し、ＰＢＳ（−）（日
水製薬（株）社製）で２回洗浄してから、ＰＢＳ（−）
で１×１０8細胞数／ｍｌとなるように調製したもの
を、ＣＯＳ−１細胞懸濁液とした。
【０４９４】一方、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム
密度勾配遠心分離法を用いて調製したヒト化重鎖発現ベ
クター（ｐＳＲｇ７ＡＨまたはｐＳＲｇＰＤＨ）ＤＮＡ
４μｇ、およびヒト化軽鎖発現ベクター（ｐＳＲＨ
Ｈ、ｐＳＲＨＭ、ｐＳＲＭＭ、ｐＳＲＰＤＨＨまたはｐ
ＳＲＰＤＨＭ）ＤＮＡ ４μｇを下記に記載する組み合
わせで混合した後、エタノール沈澱を行って、得られた
沈澱をＰＢＳ（−）２０μｌに溶解した。得られたプラ
スミド溶液２０μｌを、先に調製したＣＯＳ−１細胞懸
濁液２０μｌ（２×１０6細胞）と混合したものを電極
間隔２ｍｍのチャンバー（ＦＣＴ−１３：島津製作所
（株）社製）に入れ、遺伝子導入装置ＧＴＥ−１（島津
製作所（株）社製）にセットした。その後、６００Ｖ
下、５０μＦのパルスを、１秒間隔で２回与えることに
より、目的とするプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−１細胞内
に導入した。パルスを与えた後のチャンバー内の細胞−
ＤＮＡ混合液を、１０％ウシ胎児血清を含むα（＋）Ｍ
ＥＭ ５ｍｌに懸濁し、細胞培養用フラスコ（培養面積
２５ｃｍ2：住友ベークライト社製）に移した。これを
５％ＣＯ2下、３７℃で７２時間培養した後に培養上清
を回収した。
【０４９５】上記の方法により、下記［Ａ］−［Ｆ］の
条件でそれぞれＣＯＳ−１細胞を形質転換し、培養上清
を回収した。
【０４９６】［Ａ］：プラスミドＤＮＡを含まない条
件； ［Ｂ］：ｐＳＲｇＰＤＨおよびｐＳＲＰＤＨＨのコ・ト
ランスフェクション； ［Ｃ］：ｐＳＲｇＰＤＨおよびｐＳＲＰＤＨＭのコ・ト
ランスフェクション； ［Ｄ］：ｐＳＲｇ７ＡＨおよびｐＳＲＨＨのコ・トラン
スフェクション； ［Ｅ］：ｐＳＲｇ７ＡＨおよびｐＳＲＨＭのコ・トラン
スフェクション； ［Ｆ］：ｐＳＲｇ７ＡＨおよびｐＳＲＭＭのコ・トラン
スフェクション。
【０４９７】実施例２５ Ｆａｓに対する結合能の検定 実施例２４で調製されたそれぞれの培養上清試料につい
て、実施例１７に記載した方法により、含有する目的発
現生成物の濃度を算出し、最終的な目的生成物濃度が１
００ｎｇ／ｍｌとなるように１０％ ＦＣＳを含むα
（＋）ＭＥＭで調製した。なお、培養上清試料中の目的
生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌを下回った場合、得られ
た培養上清は、まずセントリプレップ−１０（アミコン
社製）を用いて濃縮された。すなわち、培養上清５ｍｌ
をセントリプレップ−１０に移し、３０００×ｇの遠心
分離により濃縮してから、再び実施例１７に記載した方
法により目的生成物濃度を算出した。
【０４９８】次に、１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製され
た各試料溶液を１０％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで
２倍希釈する操作を繰り返し、希釈系列を作製した。こ
れらの試料について、ヒトＦａｓ融合タンパク質に対す
る結合能を実施例１８に記載したＥＬＩＳＡ法により測
定した。
【０４９９】その結果、実施例２４で調製された培養上
清試料のうち、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および
［Ｆ］の条件のものは、ヒトＦａｓ融合タンパク質との
結合能を有するものを含んでいることが確認された（図
４５）。
【０５００】実施例２６ ＨＦＥ７ＡのＦａｓへの結合
に対する競合阻害 実施例２４で調製された各培養上清試料について、予め
実施例１７で示す方法により、それぞれが含有する目的
発現生成物の濃度を算定し、１０％ ＦＣＳを含むα
（＋）ＭＥＭで最終的な目的生成物濃度が１μｇ／ｍｌ
となるように調製した。なお、培養上清試料中の目的生
成物濃度が１μｇ／ｍｌを下回った場合は、その培養上
清をセントリプレップ−１０を用いて濃縮してから１μ
ｇ／ｍｌとなるように調製した。
【０５０１】次に、この１μｇ／ｍｌの濃度に調製した
試料を１０％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで二倍希釈
する操作を繰り返し、希釈系列を作製した。一方、ＡＰ
−ＨＦＥ７Ａを、１０％ ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ
により５０ｎｇ／ｍｌの濃度に調整し、上記希釈系列試
料と等量混合した。その後、実施例１９記載の方法によ
り、各試料のＨＦＥ７Ａに対する競合阻害活性を測定し
た。
【０５０２】その結果、実施例２４で調製された培養上
清試料のうち、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および
［Ｆ］の条件のものは、ハイブリドーマ培養物より調製
したＨＦＥ７ＡのヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結
合を特異的に阻害することが確認された（図４６）。
【０５０３】実施例２７ アポトーシス誘導活性 実施例２４で調製された培養上清試料を、実施例２２記
載の方法で最終的な目的生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌ
となるように調整した（ただし、調整用培地としては１
０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた）。
この１００ｎｇ／ｍｌの試料を１０％ ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で二倍希釈する操作を繰り返し、希
釈系列を作製した。その後、実施例２０記載の方法によ
り、各試料のＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞に対する細胞傷害活
性を測定した。
【０５０４】その結果、実施例２４で調製された培養上
清試料のうち、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および
［Ｆ］の条件のものは、ハイブリドーマ培養物より調製
されたＨＦＥ７Ａと同様に、ヒトＦａｓ抗原を発現した
Ｔリンパ腫細胞株に対してアポトーシスを誘導すること
が示された（図４７）。
【０５０５】製剤例 本発明の分子は、水またはそれ以外の薬理学的に許容し
得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプル
として使用に供される。また、無菌粉末製剤（本発明の
分子を凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填し
ておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈して
もよい。
【０５０６】
【発明の効果】 本発明により、Ｆａｓ／Ｆａｓリガン
ド系に起因する各種の疾病（自己免疫疾患（全身性エリ
テマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿
主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン氏病、
強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン氏病、自己
免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬
化症、バセドー病、突発性血小板減少性紫斑病、インス
リン依存性糖尿病）、アレルギー、アトピー、動脈硬化
症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝
炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎（Ｃ型肝炎、
Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコール性肝炎）、後天
性免疫不全症候群または臓器移植後の拒絶反応）に対す
る予防または治療薬として有用な、霊長類および非霊長
類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異
的な抗原結合領域を有する分子が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２の構築図。
【図２】 ｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−Ｌの構築図。
【図３】 ＨＦＥ７Ａのエピトープ限定のためのＥＬＩ
ＳＡの結果を表す図。
【図４】 ＨＦＥ７Ａのエピトープ限定のための競合ア
ッセイの結果を表す図。
【図５】 ＨＦＥ７Ａの毒性試験の結果を表す図。
【図６】 劇症肝炎モデルを用いた試験の結果を表す
図。
【図７】 コラーゲン誘導関節炎の発症予防試験の結果
を表す図。
【図８】 ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲ
の概要。
【図９】 ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲ
の概要。
【図１０】 ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣ
Ｒの概要。
【図１１】 ＶＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラス
ミド作製方法の概要。
【図１２】 ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣ
Ｒの概要。
【図１３】 ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣ
Ｒの概要。
【図１４】 ＶＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラス
ミド作製方法の概要。
【図１５】 ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣ
Ｒの概要。
【図１６】 ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣ
Ｒの概要。
【図１７】 ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣ
Ｒの概要。
【図１８】 ＶＭＭ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド
作製方法の概要。
【図１９】 ヒト化軽鎖シークエンシングプライマーの
結合位置を示す図。
【図２０】 ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲ
の概要。
【図２１】 ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲ
の概要。
【図２２】 ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲ
の概要。
【図２３】 ＶＤ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作
製方法の概要。
【図２４】 ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域とイントロンを
含むＤＮＡ（ＩＧ５’−ＤＮＡ）断片の作製法の概要。
【図２５】 ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、
ＣＨ３領域およびイントロンを含むゲノムＤＮＡ（ＩＧ
３’−ＤＮＡ）断片の作製法の概要。
【図２６】 発現ベクタープラスミドｐＥｇ７ＡＨ−Ｈ
の作製手順の概要。
【図２７】 ヒト化重鎖シークエンシングプライマーの
結合位置を示す図。
【図２８】 ヒト化抗Ｆａｓ抗体のヒトＦａｓ融合タン
パク質に対する結合活性を示す図。
【図２９】 ヒトＦａｓ融合タンパク質に対するＨＦＥ
７Ａとヒト化抗Ｆａｓ抗体との競合阻害を示す図。
【図３０】 ヒト化ＨＦＥ７ＡのＷＲ１９Ｌ１２ａに対
する細胞障害活性を示す図。
【図３１】 ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階
ＰＣＲの概要。
【図３２】 ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階
ＰＣＲの概要。
【図３３】 ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階
ＰＣＲの概要。
【図３４】 ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プ
ラスミド作製方法の概要。
【図３５】 ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階
ＰＣＲの概要。
【図３６】 ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階
ＰＣＲの概要。
【図３７】 ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階
ＰＣＲの概要。
【図３８】 ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プ
ラスミド作製方法の概要。
【図３９】 ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第一段
階ＰＣＲの概要。
【図４０】 ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第二段
階ＰＣＲの概要。
【図４１】 ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片を保持するプラ
スミド作製方法の概要。
【図４２】 ＨＶタイプヒト化重鎖をコードするＤＮＡ
のシークエンシングプライマー結合位置を示す図。
【図４３】 各種ヒト化軽鎖をＣＯＳ−１細胞で発現さ
せるために最適化した発現ベクターの構築図。
【図４４】 各種ヒト化重鎖をＣＯＳ−１細胞で発現さ
せるために最適化した発現ベクターの構築図。
【図４５】 各種形質転換ＣＯＳ−１細胞培養上清中の
ヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合活性を示す図。
【図４６】 各種形質転換ＣＯＳ−１細胞培養上清中
の、ヒトＦａｓ融合タンパク質とＨＦＥ７Ａの結合に対
する競合阻害活性を示す図。
【図４７】 各種形質転換ＣＯＳ−１細胞培養上清中の
ＷＲ１９Ｌ１２ａに対する細胞障害活性を示す図。
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys 1 5 10 配列番号：２ 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Ser Tyr Trp Met Gln 1 5 配列番号：３ 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly 配列番号：４ 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 配列番号：５ 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 配列番号：６ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓ
ｅｒ １ ５ 配列番号：７ 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr 1 5 配列番号：８ 配列の長さ：1392 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源 生物名：マウス 細胞の種類：ハイブリドーマ セルライン：HFE7A 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：1..1392 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：58..1392 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..57 特徴を決定した方法：S 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAT TCT CAG GTC CAA CTG CAG CAG CCT GGG GCT GAG CTT GTG AAG 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 1 5 10 CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGC CTT 192 Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATC GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT AGC TAT 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GAT GAT GTG GAG GTG CAC ACA GCT 912 Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala 270 275 280 285 CAG ACG CAA CCC CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACT TTC CGC TCA GTC 960 Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val 290 295 300 AGT GAA CTT CCC ATC ATG CAC CAG AAC TGG CTC AAT GGC AAG GAG TTC 1008 Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asn Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 305 310 315 AAA TGC AGG GTC AAC AGT GCA GCT TTC CCT GCC CCC ATC GAG AAA ACC 1056 Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 320 325 330 ATC TCC AAA ACC AAA GGC AGA CCG AAG GCT CCA CAG GTG TAC ACC ATT 1104 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile 335 340 345 CCA CCT CCC AAG GAG CAG ATG GCC AAG GAT AAA GTC AGT CTG ACC TGC 1152 Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys 350 355 360 365 ATG ATA ACA GAC TTC TTC CCT GAA GAC ATT ACT GTG GAG TGG CAG TGG 1200 Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp 370 375 380 AAT GGG CAG 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Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp 95 100 105 Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 110 115 120 125 Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn 130 135 140 Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr 160 165 170 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val 175 180 185 Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val 190 195 200 205 Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg 210 215 220 Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser 225 230 235 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu 240 245 250 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro 255 260 265 Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala 270 275 280 285 Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val 290 295 300 Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asn Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 305 310 315 Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 320 325 330 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile 335 340 345 Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys 350 355 360 365 Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn 385 390 395 Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser 400 405 410 Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly 415 420 425 Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 430 435 440 445 配列番号：１０ 配列の長さ：714 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 起源 生物名：マウス 細胞の種類：ハイブリドーマ セルライン：HFE7A 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：1..714 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：61..714 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：S 配列 ATG GAG ACA GAC ACA ATC CTG CTA TGG GTG ATG ATG CTC TGG ATT CCA 48 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Met Met Leu Trp Ile Pro -20 -15 -10 -5 GGC TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 1 5 10 GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 15 20 25 GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA 192 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT 240 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 GGG ATC CCA GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT 336 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG 384 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA 432 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 110 115 120 TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC TTG 480 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 125 130 135 140 AAC AAC TTC TAC CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT GAT GGC 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 145 150 155 AGT GAA CGA CAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT CAG GAC AGC 576 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 160 165 170 AAA GAC AGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG ACC AAG GAC 624 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 175 180 185 GAG TAT GAA CGA CAT AAC AGC TAT ACC TGT GAG GCC ACT CAC AAG ACA 672 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 190 195 200 TCA ACT TCA CCC ATT GTC AAG AGC TTC AAC AGG AAT GAG TGT 714 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 205 210 215 配列番号：１１ 配列の長さ：238 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Met Met Leu Trp Ile Pro -20 -15 -10 -5 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 1 5 10 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 15 20 25 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 125 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 145 150 155 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 160 165 170 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 175 180 185 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 190 195 200 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 205 210 215 配列番号：１２ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT 34 配列番号：１３ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA 35 配列番号：１４ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC 35 配列番号：１５ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC 28 配列番号：１６ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Ｇｌｎ Ｘａａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ １ ５ １
０ 配列番号：１７ 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser 20 配列番号：１８ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 配列 GACCTCACCA TGGGATGGA 19 配列番号：１９ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AAGAAGCATC CTCTCATCTA 20 配列番号：２０ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TTTACCAGGA GAGTGGGAGA 20 配列番号：２１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ACACTCATTC CTGTTGAAGC 20 配列番号：２２ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGGAATTCG ACCTCACCAT GGGATGGA 28 配列番号：２３ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣ ＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧ ＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡ ＧＡ
３２ 配列番号：２４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGGAATTCA AGAAGCATCC TCTCATCTA 29 配列番号：２５ 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGGCGGCCG CTTACTAACA CTCATTCCTG TTGAAGC 37 配列番号：２６ 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser 1 5 10 15 Lys Gly Leu 配列番号：２７ 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr 1 5 10 15 Thr Val Glu 配列番号：２８ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ １ ５
１０ １５ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ ２０ 配列番号：２９ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys 1 5 10 15 Pro Cys Pro Pro 20 配列番号：３０ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg 1 5 10 15 Asp Cys Thr Val 20 配列番号：３１ 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp 1 5 10 15 Cys Val Pro Cys Gln 20 配列番号：３２ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr 1 5 10 15 Thr Asp Lys Ala 20 配列番号：３３ 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg 1 5 10 15 Arg Cys Arg 配列番号：３４ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His 1 5 10 15 Gly Leu Glu Val 20 配列番号：３５ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg 1 5 10 15 Thr Gln Asn Thr 20 配列番号：３６ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ １ ５
１０ １５ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ ２０ 配列番号：３７ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu 1 5 10 15 His Cys Asp Pro 20 配列番号：３８ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His 1 5 10 15 Gly Ile Ile Lys 20 配列番号：３９ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser 1 5 10 15 Asn Thr Lys Cys 20 配列番号：４０ 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg 1 5 10 15 Ser Asn 配列番号：４１ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala 1 5 10 15 Phe Asn Val Glu 20 配列番号：４２ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr 1 5 10 配列番号：４３ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr 1 5 10 配列番号：４４ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys 1 5 10 配列番号：４５ 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp 1 5 10 配列番号：４６ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Asp Asn 1 5 10 配列番号：４７ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA 34 配列番号：４８ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCTCTAGATG AGGTGAAAGA TGAGCTGGAG GA 32 配列番号：４９ 配列の長さ： 768 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル： NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号： CDS 存在位置：40..753 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：100..753 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：40..99 配列 CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54 Met Glu Thr Asp Thr -20 ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAC 102 Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp -15 -10 -5 1 ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG 150 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 5 10 15 AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly 20 25 30 GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG GCA CCC AGA 246 Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 35 40 45 CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 65 TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC TCT CGT 342 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 70 75 80 CTG GAG CCG GCG GAT TTT GCA GTC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390 Leu Glu Pro Ala Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu 85 90 95 GAT CCT CGG ACG TTC GGT CAA GGC ACC AGG CTG GAA ATC AAA CGG ACT 438 Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 486 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 145 AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 582 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 150 155 160 AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 630 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC 678 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 726 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 配列番号：５０ 配列の長さ： 238 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 1 5 10 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 15 20 25 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Ala Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 80 85 90 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 95 100 105 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 160 165 170 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 175 180 185 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 190 195 200 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210 215 配列番号：５１ 配列の長さ： 768 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル： NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号： CDS 存在位置：40..753 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：100..753 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：40..99 配列 CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54 Met Glu Thr Asp Thr -20 ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAC 102 Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp -15 -10 -5 1 ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG 150 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 5 10 15 AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly 20 25 30 GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG GCA CCC AGA 246 Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 35 40 45 CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 65 TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC CAT CCT 342 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Pro 70 75 80 GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390 Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu 85 90 95 GAT CCT CGG ACG TTC GGT CAA GGC ACC AGG CTG GAA ATC AAA CGG ACT 438 Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 486 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 145 AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 582 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 150 155 160 AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 630 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC 678 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 726 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 配列番号：５２ 配列の長さ： 238 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 1 5 10 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 15 20 25 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Thr Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 95 100 105 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 160 165 170 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 175 180 185 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 190 195 200 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210 215 配列番号：５３ 配列の長さ： ７６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル： NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号： CDS 存在位置：40..753 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：100..753 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：40..99 配列 CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54 Met Glu Thr Asp Thr -20 ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAC 102 Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp -15 -10 -5 1 ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG 150 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 5 10 15 AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly 20 25 30 GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA 246 Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys 35 40 45 CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 65 TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC CAT CCT 342 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Pro 70 75 80 GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390 Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu 85 90 95 GAT CCT CGG ACG TTC 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配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AAAATCCGCC GGCTCCAGAC GAGAGATGGT GAGGGTGAAG TCTGTCCCAG AC 52 配列番号：６１ 配列の長さ：58 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Ｎｏ 配列 ＣＴＣＧＴＣＴＧＧＡ ＧＣＣＧＧＣＧＧＡＴ ＴＴＴＧＣＡＧＴＣＴ ＡＴＴ
ＡＣＴＧＴＣＡ ＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴ ＧＡＧＧＡＴＣＣ ５８ 配列番号：６２ 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGAAGACAGA TGGTGCAGCC ACAGTCCGTT TGATTTCCAG CCTGGTGCCT TGACC 55 配列番号：６３ 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGTCAAGGCA CCAGGCTGGA AATCAAACGG ACTGTGGCTG CACCATCTGT CTTCA 55 配列番号：６４ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCCGAATTCT TACTAACACT CTCCCCTGTT GAAGCTCTTT GTGAC 45 配列番号：６５ 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCTGTCCCAG ACCCACTGCC ACTAAACCTG TCTGGGATCC CAGATTCGAG ATTGG 55 配列番号：６６ 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTTTAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CACCTCTACC ATCCATCCTG TGGAG 55 配列番号：６７ 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATGGTGCAGC CACAGTCCGT TTGATTTCCA GCCTGGTGCC TTGACCGAAC GTCCG 55 配列番号：６８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCCAAGCTTA AGAAGCATCC 20 配列番号：６９ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 配列 ATCTATGCTG CATCCAATCT 20 配列番号：７０ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA 20 配列番号：７１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCCGAATTCT TACTAACACT 20 配列番号：７２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TTATTCAGCA GGCACACAAC 20 配列番号：７３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGATTGGATG CAGCATAGAT 20 配列番号：７４ 配列の長さ： 457 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル： NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号： ＣＤＳ 存在位置：２１．．４５５ 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：78..455 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：21..77 配列 AAGCTTGGCT TGACCTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu -19 -15 -10 GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCT CAG GTC CAA CTG GTG CAG TCT 98 Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser -5 1 5 GGG GCT GAG GTC AAG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC TGC AAG 146 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 10 15 20 GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG 194 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln 25 30 35 GCC CCT GGA CAG AGG CTT GAG TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT 242 Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp 40 45 50 55 AGC TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT 290 Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 60 65 70 GTA GAC ACA TCC GCT AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG AGA 338 Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 75 80 85 TCT GAG GAC ACG GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA AAT AGG GAC TAT AGT 386 Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser 90 95 100 AAC AAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GAA GGG ACC CTG GTC ACC GTC 434 Asn Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CC 457 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 120 125 配列番号：７５ 配列の長さ： 145 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 30 35 40 45 Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp 95 100 105 Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 110 115 120 125 Gly 配列番号：７６ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGAAGCTTG GCTTGACCTC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT 40 配列番号：７７ 配列の長さ：48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGAAGCCCCA GGCTTCTTGA CCTCAGCCCC AGACTGCACC AGTTGGAC 48 配列番号：７８ 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCACTCAAG CCTCTGTCCA GGGGCCTGTT TTACCC 36 配列番号：７９ 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTCTGGGGCT GAGGTCAAGA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA A 51 配列番号：８０ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Ｎｏ 配列 ＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧ ＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴ ＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧ ＧＧＡ
ＧＡＧＡＴＴ ３９ 配列番号：８１ 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCAGATCTCA GGCTGCTGAG CTCCATGTAG GCTGTGCTAG CGGATGTGTC 50 配列番号：８２ 配列の長さ：44 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGGAGCTCAG CAGCCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTCTA TTAC 44 配列番号：８３ 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTCGCC CCAGT 55 配列番号：８４ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGAAGCTTC CGCGGTCACA TGGCACCACC TCTCTTGCA 39 配列番号：８５ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCTCTGCAGA GAGAAGATTG GGAGTTACTG GAATC 35 配列番号：８６ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCTCTGCAGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCAC 35 配列番号：８７ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGGAATTCG GGAGCGGGGC TTGCCGGCCG TCGCACTCA 39 配列番号：８８ 配列の長さ： 2077 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： DNA (genomic) ハイポセティカル： NOアンチセンス : NO 配列の特徴 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：27..83 特徴を表す記号： intron 存在位置：741..1131 特徴を表す記号： intron 存在位置：1177..1294 特徴を表す記号： intron 存在位置：1625..1721 特徴を表す記号： exon 存在位置：27..740 特徴を表す記号： exon 存在位置：1132..1176 特徴を表す記号： exon 存在位置：1295..1624 特徴を表す記号： exon 存在位置：1722..2077 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：join(84..740, 1132..1176, 1295..1624, 17
22..2042) 特徴を表す記号： CDS 存在位置：join(27..740, 1132..1176, 1295..1624, 17
22..2042) 配列 GGGCGAAAGC TTGGCTTGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe -19 -15 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCT CAG GTC CAA CTG GTG CAG 101 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln -10 -5 1 5 TCT GGG GCT GAG GTC AAG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC TGC 149 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 10 15 20 AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA 197 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys 25 30 35 CAG GCC CCT GGA CAG AGG CTT GAG TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCT TCT 245 Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser 40 45 50 GAT AGC TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG 293 Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu 55 60 65 70 ACT GTA GAC ACA TCC GCT AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG 341 Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 75 80 85 AGA TCT GAG GAC ACG GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA AAT AGG GAC TAT 389 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr 90 95 100 AGT AAC AAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GAA GGG ACC CTG GTC ACC 437 Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr 105 110 115 GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC 485 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 120 125 130 TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC 533 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 135 140 145 150 AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC 581 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 155 160 165 CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA 629 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 170 175 180 CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC 677 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 185 190 195 ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG 725 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 200 205 210 GTG GAC AAG AGA GTT GGTGAGAGGC CAGCACAGGG AGGGAGGGTG TCTGCTGGAA 780 Val Asp Lys Arg Val 215 GCCAGGCTCA GCGCTCCTGC CTGGACGCAT CCCGGCTATG CAGTCCCAGT CCAGGGCAGC 840 AAGGCAGGCC CCGTCTGCCT CTTCACCCGG AGGCCTCTGC CCGCCCCACT CATGCTCAGG 900 GAGAGGGTCT TCTGGCTTTT TCCCCAGGCT CTGGGCAGGC ACAGGCTAGG TGCCCCTAAC 960 CCAGGCCCTG CACACAAAGG GGCAGGTGCT GGGCTCAGAC CTGCCAAGAG CCATATCCGG 1020 GAGGACCCTG CCCCTGACCT AAGCCCACCC CAAAGGCCAA ACTCTCCACT CCCTCAGCTC 1080 GGACACCTTC TCTCCTCCCA GATTCCAGTA ACTCCCAATC TTCTCTCTGC A GAG CCC 1137 Glu Pro 220 AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGTAAGCCAG 1186 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC TGCATCCAGG 1246 GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT CTTCCTCA GCA CCT GAA 1303 Ala Pro Glu 235 CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC 1351 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 240 245 250 ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC 1399 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 255 260 265 GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC 1447 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 270 275 280 285 GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC 1495 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG 1543 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA 1591 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 320 325 330 GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGTGGGACCC GTGGGGTGCG 1644 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 335 340 AGGGCCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC 1704 CAACCTCTGT CCCTACA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG 1754 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 345 350 355 CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC 1802 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 360 365 370 CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC 1850 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 375 380 385 AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC 1898 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 390 395 400 TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC 1946 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT 1994 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 435 CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CCG GGT AAA 2042 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445 450 TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC GAATT 2077 配列番号：８９ 配列の長さ： 470 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 30 35 40 45 Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp 95 100 105 Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 110 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 160 165 170 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 175 180 185 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 190 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 240 245 250 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 255 260 265 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 270 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 320 325 330 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 335 340 345 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 350 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 400 405 410 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 415 420 425 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 430 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 配列番号：９０ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ACAGCCGGGA AGGTGTGCAC 20 配列番号：９１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGACACCCTC CCTCCCTGTG 20 配列番号：９２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTGCAGGGCC TGGGTTAGGG 20 配列番号：９３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCACGGTGGG CATGTGTGAG 20 配列番号：９４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTTTTGGGGG GAAGAGGAAG 20 配列番号：９５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 配列 CCAGTCCTGG 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２０ 配列番号：１０１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGAACAACTA CAAGACCACG 20 配列番号：１０２ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCCTGACATC TGAGGACTC 19 配列番号：１０３ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAGTCCTCAG ATGTCAGGC 19 配列番号：１０４ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAGCAGTACT CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA CCAG 34 配列番号：１０５ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGTATGGCTG ATTAATGATC AATG 24 配列番号：１０６ 配列の長さ： ７６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル： NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号： CDS 存在位置：40..753 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：100..753 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：40..99 配列 CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54 Met Glu Thr Asp Thr -20 ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAG 102 Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu -15 -10 -5 1 ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG 150 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 5 10 15 AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly 20 25 30 GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG GCA CCC AGA 246 Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 35 40 45 CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 65 TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC TCT CGT 342 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 70 75 80 CTG GAG CCG GAG GAT TTT GCA GTC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu 85 90 95 GAT CCT CGG ACG TTC GGT CAA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT 438 Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 486 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 145 AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 582 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 150 155 160 AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 630 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC 678 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 726 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 配列番号：１０７ 配列の長さ： 238 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 1 5 10 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 15 20 25 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 80 85 90 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 160 165 170 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 175 180 185 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 190 195 200 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210 215 配列番号：１０８ 配列の長さ： 768 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル： NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号： CDS 存在位置：40..753 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：100..753 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：40..99 配列 CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54 Met Glu Thr Asp Thr -20 ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAG 102 Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu -15 -10 -5 1 ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG 150 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 5 10 15 AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly 20 25 30 GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG GCA CCC AGA 246 Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 35 40 45 CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 65 TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC CAT CCT 342 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Pro 70 75 80 GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390 Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu 85 90 95 GAT CCT CGG ACG TTC GGT CAA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT 438 Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 486 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 145 AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 582 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 150 155 160 AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 630 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC 678 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 726 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 配列番号：１０９ 配列の長さ： 238 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 1 5 10 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 15 20 25 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Thr Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 160 165 170 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 175 180 185 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 190 195 200 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210 215 配列番号：１１０ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGTGAGATTG TGCTCACCCA ATCTCCAGG 29 配列番号：１１１ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCTGGAGATT GGGTGAGCAC AATCTCACC 29 配列番号：１１２ 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Ｎｏ 配列 ＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧ ＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧ ＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧ Ｃ
３１ 配列番号：１１３ 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCAAAATCCT CCGGCTCCAG ACGAGAGATG G 31 配列番号：１１４ 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CAAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAACGGACT G 31 配列番号：１１５ 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CAGTCCGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTT G 31 配列番号：１１６ 配列の長さ： 2071 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： DNA (genomic) ハイポセティカル： NO アンチセンス： NO 配列の特徴 特徴を表す記号： sig_peptide 存在位置：21..77 特徴を表す記号： intron 存在位置：741..1131 特徴を表す記号： intron 存在位置：1177..1294 特徴を表す記号： intron 存在位置：1619..1715 特徴を表す記号： exon 存在位置：21..734 特徴を表す記号： exon 存在位置：1126..1170 特徴を表す記号： ｅｘｏｎ 存在位置：１２８９．．１６１８ 特徴を表す記号： exon 存在位置：1716..2071 特徴を表す記号： mat_peptide 存在位置：join(78..734, 1126..1170, 1289..1618, 17
16..2036) 特徴を表す記号： CDS 存在位置：join(21..734, 1126..1170, 1289..1618, 17
16..2036) 配列 AAGCTTGGCT TGACCTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu -19 -15 -10 GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCT CAG GTC CAA CTG GTG CAG TCT 98 Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser -5 1 5 GGG GCT GAG GTC AAG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC TGC AAG 146 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 10 15 20 GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG 194 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln 25 30 35 GCC CCT GGA CAG GGC CTT GAG TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT 242 Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp 40 45 50 55 AGC TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT 290 Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 60 65 70 GTA GAC ACA TCC ACT AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG AGA 338 Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 75 80 85 TCT GAG GAC ACG GCG GTC 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1345 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 240 245 250 ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC 1393 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 255 260 265 GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC 1441 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 270 275 280 285 GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC 1489 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG 1537 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA 1585 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 320 325 330 GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGTGGGACCC GTGGGGTGCG 1638 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 335 340 AGGGCCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC 1698 CAACCTCTGT CCCTACA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG 1748 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 345 350 355 CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC 1796 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 360 365 370 CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC 1844 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 375 380 385 AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC 1892 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 390 395 400 TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC 1940 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT 1988 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 435 CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CCG GGT AAA 2036 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445 450 TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC GAATT 2071 配列番号：１１７ 配列の長さ： 470 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp 95 100 105 Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 110 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 160 165 170 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 175 180 185 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 190 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 240 245 250 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 255 260 265 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 270 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 320 325 330 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 335 340 345 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 350 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 400 405 410 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 415 420 425 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 430 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 配列番号：１１８ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CAGGCCCCTG GACAGGGCCT TGAGTGGATG 30 配列番号：１１９ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CATCCACTCA AGGCCCTGTC CAGGGGCCTG 30 配列番号：１２０ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCTGAGCTCC ATGTAGGCTG TGCTAGTGGA TGTGTCTAC 39 配列番号：１２１ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGCACGCGTG GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAG 33 配列番号：１２２ 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCGAAGCTT TTAGAGCAGA AGTAACACTT C 31 配列番号：１２３ 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧ ＣＴＧＣＴＡＧＣＴＴ ＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡ ＴＧＴ
ＧＴＧ ３６ Ｔ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ １１１ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:19 15/02 1:91 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７１ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７４ 早期審査対象出願 (72)発明者 好田 宏子 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 市川 公久 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 大隅 潤 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 大槻 昌彦 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 白石 明郎 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 米原 伸 京都府京都市西京区松尾井戸町９−５ (56)参考文献 国際公開96／040041（ＷＯ，Ａ１) Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，1995，Ｖ ｏｌ．７，Ｎｏ．12，ｐ．1967−1975 Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｆｅｂ, 1997，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．２，ｐ．201 −209 Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｆｅｂ, 1997，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．２，ｐ．307 −316 ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，1996 年，Ｖｏｌ．15，Ｎｏ．３，ｐ．227− 234 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (46)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７
    Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）により産生されるモノ
    クローナル抗体。
  2. 【請求項２】 軽鎖ポリペプチドの可変領域に配列表の
    配列番号１１のアミノ酸番号２４〜３８、５４〜６０及
    び９３〜１０１で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖ポ
    リペプチドの可変領域に配列表の配列番号９のアミノ酸
    番号３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１１０に示され
    るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記
    載の抗体。
  3. 【請求項３】 下記の１）に記載の軽鎖ポリペプチドお
    よび２）に記載の重鎖ポリペプチドから構成されること
    を特徴とする抗体： １）配列表の配列番号５０のアミノ酸番号１から２１８
    に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号５２のアミ
    ノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表
    の配列番号５４のアミノ酸番号１から２１８に示される
    アミノ酸配列、配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号
    １から２１８に示されるアミノ酸配列または配列表の配
    列番号１０９のアミノ酸番号１から２１８に示されるア
    ミノ酸配列のいずれか一つの軽鎖ポリペプチド； ２）配列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から４５１
    に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１１７
    のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列の
    いずれか一つの重鎖ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 配列表の配列番号５０のアミノ酸番号１
    から２１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ポリペ
    プチド、および、配列表の配列番号８９のアミノ酸番号
    １から４５１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ポリ
    ペプチドから構成されることを特徴とする、請求項３に
    記載の抗体。
  5. 【請求項５】 配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号
    １から２１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ポリ
    ペプチド、および、配列表の配列番号１１７のアミノ酸
    番号１から４５１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖
    ポリペプチドから構成されることを特徴とする、請求項
    ３に記載の抗体。
  6. 【請求項６】 マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７
    Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）により産生されるモノ
    クローナル抗体をヒト化した抗体であることを特徴とす
    る、請求項２乃至５のいずれか一つに記載の抗体。
  7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列に特異的な抗原結合領域を有することを特徴とす
    る、請求項１乃至６のいずれか一つに記載の抗体。
  8. 【請求項８】 下記のａ）及びｂ）に記載の生物学的性
    状を有することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれ
    か一つに記載の抗体： ａ）Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス
    誘導活性を有する； ｂ）肝臓障害を誘発しない。
  9. 【請求項９】 抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ
    ２により惹起される劇症肝炎に対する治療または予防効
    果を有することを特徴とする請求項１乃至８のいずれか
    一つに記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 下記のａ）乃至ｃ）の少なくともいず
    れか一つに記載の生物学的性状を有することを特徴とす
    る、請求項１乃至９のいずれか一つに記載の抗体： ａ）ＭＲＬgld ／gld マウスの自己免疫疾患症状の改善
    効果を有する； ｂ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果を有す
    る； ｃ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポト
    ーシス誘導活性を有する。
  11. 【請求項１１】 下記のａ）乃至ｆ）に記載の生物学的
    性状の全てを有することを特徴とする、請求項１乃至８
    のいずれか一つに記載の抗体： ａ）Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス
    誘導活性を有する； ｂ）ＭＲＬgld ／gld マウスの自己免疫疾患症状の改善
    効果を有する； ｃ）肝臓障害を誘発しない； ｄ）抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２により惹
    起される劇症肝炎に対する治療または予防効果を有す
    る； ｅ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果を有す
    る； ｆ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポト
    ーシス誘導活性を有する。
  12. 【請求項１２】 ヒトＦａｓともマウスＦａｓとも結合
    することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一つ
    に記載の抗体。
  13. 【請求項１３】 イムノグロブリンＧ型抗体であること
    を特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載
    の抗体。
  14. 【請求項１４】 Ｆａｓを発現している異常細胞にアポ
    トーシスを誘導することができ、かつ正常細胞のアポト
    ーシスを防止することができることを特徴とする、請求
    項１乃至１３のいずれか一つに記載の抗体。
  15. 【請求項１５】 請求項１乃至１４のいずれか１つに記
    載の抗体中のポリペプチド鎖のいずれか一つをコードす
    るＤＮＡ。
  16. 【請求項１６】 請求項１乃至１４のいずれか一つに記
    載の抗体の軽鎖ポリペプチドまたは重鎖ポリペプチドを
    コードするＤＮＡ。
  17. 【請求項１７】 配列表の配列番号１１のアミノ酸番号
    １から２１８に示されるアミノ酸配列を含むことからな
    るポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  18. 【請求項１８】 配列表の配列番号９のアミノ酸番号１
    から４４５に示されるアミノ酸配列を含むことからなる
    ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  19. 【請求項１９】 配列表の配列番号５０のアミノ酸番号
    １から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番
    号５２のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸
    配列、配列表の配列番号５４のアミノ酸番号１から２１
    ８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号１０７の
    アミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列また
    は配列表の配列番号１０９のアミノ酸番号１から２１８
    に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むことから
    なるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  20. 【請求項２０】 配列表の配列番号８９のアミノ酸番号
    １から４５１に示されるアミノ酸配列または配列表の配
    列番号１１７のアミノ酸番号１から４５１に示されるア
    ミノ酸配列のいずれか一つを含むことからなるポリペプ
    チドをコードするＤＮＡ。
  21. 【請求項２１】 配列表の配列番号１０のヌクレオチド
    番号６１から３９３に示されるヌクレオチド配列を含む
    ことからなる、請求項１７に記載のＤＮＡ。
  22. 【請求項２２】 配列表の配列番号１０のヌクレオチド
    番号６１から７１４に示されるヌクレオチド配列を含む
    ことからなる、請求項１７に記載のＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 配列表の配列番号８のヌクレオチド番
    号５８から４２０に示されるヌクレオチド配列を含むこ
    とからなる、請求項１８に記載のＤＮＡ。
  24. 【請求項２４】 配列表の配列番号８のヌクレオチド番
    号５８から１３９２に示されるヌクレオチド配列を含む
    ことからなる、請求項１８に記載のＤＮＡ。
  25. 【請求項２５】 配列表の配列番号４９のヌクレオチド
    番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列、配
    列表の配列番号５１のヌクレオチド番号１００から７５
    ３に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号５３
    のヌクレオチド番号１００から７５３に示されるヌクレ
    オチド配列、配列表の配列番号１０６のヌクレオチド番
    号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列または
    配列表の配列番号１０８のヌクレオチド番号１００から
    ７５３に示されるヌクレオチド配列を含むことからな
    る、請求項１９に記載のＤＮＡ。
  26. 【請求項２６】 配列表の配列番号８８のヌクレオチド
    番号８４から２０４２に示されるヌクレオチド配列また
    は配列表の配列番号１１６のヌクレオチド番号７８から
    ２０３６に示されるヌクレオチド配列を含むことからな
    る、請求項２０に記載のＤＮＡ。
  27. 【請求項２７】 請求項１５乃至２６のいずれか一つに
    記載のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクタ
    ー。
  28. 【請求項２８】 請求項１７、１９、２１、２２または
    ２５のいずれか一つに記載のＤＮＡを含むことからなる
    組換えＤＮＡベクター。
  29. 【請求項２９】 請求項１８、２０、２３、２４または
    ２６のいずれか一つに記載のＤＮＡを含むことからなる
    組換えＤＮＡベクター。
  30. 【請求項３０】 請求項２９記載の組換えＤＮＡベクタ
    ーで形質転換された宿主細胞。
  31. 【請求項３１】 請求項２８および／または請求項２９
    記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細
    胞。
  32. 【請求項３２】 請求項２８および請求項２９ 記載の組
    換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞。
  33. 【請求項３３】 哺乳動物由来であることを特徴とす
    る、請求項３０乃至３２のいずれか一つに記載の宿主細
    胞。
  34. 【請求項３４】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＥ
    −Ｌ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６７）。
  35. 【請求項３５】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＥ
    −Ｈ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６８）。
  36. 【請求項３６】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳ
    ＧＭＭ６ ＳＡＮＫ７３６９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０
    ７１）。
  37. 【請求項３７】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳ
    ＧＨＭ１７ ＳＡＮＫ７３５９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
    ０７２）。
  38. 【請求項３８】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳ
    ＧＨＨ７ ＳＡＮＫ７３４９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０
    ７３）。
  39. 【請求項３９】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳ
    ＨＭ２ ＳＡＮＫ ７０１９８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２
    ７２）。
  40. 【請求項４０】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨＳ
    ＨＨ５ ＳＡＮＫ ７０３９８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２
    ７４）。
  41. 【請求項４１】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇＨ
    ＳＬ７Ａ６２ ＳＡＮＫ７３３９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−
    ６０７４）。
  42. 【請求項４２】 形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇＨ
    ＰＤＨＶ３ ＳＡＮＫ７０２９８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
    ２７３）。
  43. 【請求項４３】 請求項３３または３４記載の宿主細胞
    を培養し、次いで該培養物から抗Ｆａｓ抗体を回収する
    ことを特徴とする、抗Ｆａｓ抗体の製造方法。
  44. 【請求項４４】 マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ
    ７Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）。
  45. 【請求項４５】 マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ
    ７Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２８）をイムノグロブリン
    産生が可能な条件下で培養し、次いで該培養物からイム
    ノグロブリンを回収することを特徴とする、請求項１記
    載の抗体の製造方法。
  46. 【請求項４６】 請求項１乃至１４のいずれか１つに記
    載の抗体を有効成分として含有する医薬。
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