KR20030055177A - 종양 괴사 인자-관련 세포소멸-유도성 리간드 수용체에선택적인 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 DR5와 상호작용하여 세포 증식의 억제 및 세포소멸을 유도하는 수용체의 하류에서 작용 효과 또는 길항 효과를 나타내는 항체에 관한 것이다. 본 발명에서는 항-DR5 항체의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 밝히고, 이들 서열을 포함하고 발현시키는 세포를 제조하였다. 세포소멸-관련 질환의 치료 및 세포 생육 조절곤란의 치료를 포함하는 본 발명의 항체의 사용 방법도 상세히 개시되었다.

Description

종양 괴사 인자-관련 세포소멸-유도성 리간드 수용체에 선택적인 항체 및 그의 용도{AN ANTIBODY SELECTIVE FOR A TUMOR NECROSIS FACTOR-RELATED APOPTOSIS-INDUCING LIGAND RECEPTOR AND USES THEREOF}
TRAIL은 단백질의 TNF 계열의 구성원이며, 또한 상기 구성원으로는 TNF-α 및 Fas 리간드를 포함한다(1). 이들 단백질은 유력한 세포소멸 유도인자이다. 현재까지 TRAIL에 대한 5종의 수용체가 확인되었으며, 이중 둘은 세포소멸 신호를 변환시킬 수 있는 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2)(2-7)이며 나머지 셋은 세포소멸 신호를 변환시키지 않는 DcR1(TRAIL-R3), DcR2(TRAIL-R4) 및 오스테오프로테게린(OPG)이다(8-12). TRAILDP 대한 상기 5종의 수용체는 모두 세포외 리간드 결합 영역에서 상당한 상동성을 공유한다. Fas 및 TNF 수용체 I(이하, "TNFRI"라 함)와 유사하게, DR4 및 DR5의 세포내 분절은 둘 다 사(死)영역을 함유하며 Fas 관련 사영역 단백질(이하, "FADD"라 함) 및 카스파제 8을 포함하는 경로를 통해 세포소멸 신호를 변환시킨다(6,7). 상기 세포소멸 신호 변환 이외에 DR4 및 DR5 수용체는 또한 NFκB를 포함하는 경로를 활성화시킬 수 있다(6,7).
밝혀진 TRAIL의 생물학적 기능은 정상 세포의 TRAIL 매개된 세포소멸에 대해서는 비교적 내성을 유지하면서 형질전환된 종양 세포의 소멸을 선택적으로 유도하는 TRAIL의 능력을 포함한다(13-15). 이러한 선택성은 Fas 리간드와는 대조적으로 TRAIL을 투여하는 경우 현저한 독성의 유도없이 동물 모델에서 TRAIL의 전신 투여에 의해 밝혀진 바와 같이 매우 낮은 수준의 독성과 관련됨을 시사한다(13). 따라서, TRAIL은 암 및 기타 비정상 세포 증식과 관련된 질병의 치료를 위한 적당한 치료제로 되는 유력한 세포소멸 유도제로서 제안되어 왔다. TRAIL은 또한 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 적당한 유력한 세포소멸 유도제인 것으로 제안되어 왔다. TRAIL 매개된 세포소멸은 T 세포의 활성화 유도 세포사에 관여함으로써 Fas 리간드에 대한 대체 메카니즘으로서 기능하는 것으로 밝혀졌다(16,17). TRAIL 매개된 세포소멸은 또한 T 세포 및 기타 염증성 세포의 세포소멸을 유도하는 기능을 할 수 있으며(18) NK 세포의 치사 활성 및 수지상 세포의 면역조절기능(22,23)에 관여한다. 따라서, TRAIL 매개된 세포소멸은 또한 면역특권(immunopriviliege) 및 면역감시 작용을 할 수 있다.
TRAIL 수용체 시스템은 착체이며 둘 이상의 사(死)수용체, DR4 및 DR5, 및둘 이상의 비세포소멸 수용체, DcR1 및 DcR2를 포함한다. 이들 수용체들은 모두 높은 아미노산 서열 상동성을 공유할뿐만 아니라 TRAILDP 대한 유사한 결합 친화성을 나타낸다(2-12). 세포소멸의 유도없이 TRAIL의 결합에 대해 경쟁하는 DcR1 및 DcR2 수용체의 능력은 이들 수용체가 TRAIL 리간드의 활성을 차단하거자 조절하는 유인 수용체로서 작용함을 시사한다. 더욱이, 미형질전환 세포는 형질전환된 세포보다 높은 수준의 유인 수용체를 발현하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 사(死) 및 유인 수용체 발현을 차동조절하는 경우 TRAIL 매개된 세포소멸에 대한 세포의 감수성을 결정하는 핵심적인 조절 메카니즘을 나타낼 수 있으나 이것은 수용체 특이적 항체의 부족에 기인하는 것으로 보고되어 있다(2). DR4 및 DR5의 발현 및 기능이 광범위하게 연구되어 왔으나, 수용체 특이적 단일클론성 항체의 부족으로 연구의 진전이 지체되고 있다. DR5의 세포 표면 발현을 입증하는 문헌은 존재하지 않는다. 항체를 고착시킬 경우에 국한하여 시험관내에서 흑색종 세포의 세포 소멸을 유도할 수 있는 항-TRAIL 수용체 항체의 패널을 발생시켜 가교결합을 촉진시키고, 경우에 따라, 세포는 액티노마이신 D로 배양하는 것이 요구된다고 보고되어 있다(24). 몇몇 항-DR5 항체가 생성되었다(24). 그러나, 종래 생성된 항-DR5 단일클론성 항체는 가교조건하에서도 시험관내에서 낮은 세포소멸 유도 활성을 갖는다. 생체내 활성 또한 보고된 바 없다. 이들 항체는 TRAIL 수용체의 세포 표면 발현 검사용으로도 사용된 적이 없다(24). 따라서 세포 표면 수용체와 결합할 수 있을뿐만 아니라 가교 또는 고착에 대한 요구조건없이 생체내 및 시험관내 둘 다에서 종양 세포를 포함하는 각종 비정상 세포의 세포소멸을 강력하게 유도할 수 있는 각각의 특이적 TRAIL 수용체에 대해 선택적인 단일클론성 항체가 요구된다. 상기와 같은 항체는 잠재적인 치료제뿐만 아니라 TRAIL 수용체의 기능 분석을 위한 진단기구를 제공하게 된다. 사(死) 유도 수용체 DR4 및 DR5 각각에 대해 특이적인 항체가 특히 요구된다.
흔히 세포가 제거되지 않는 경우 다수 질병의 발달 및 진전이 일어난다. 다수의 자가면역 질병 및 염증성 상태에서 생존하는 활성화된 세포가 정상 조직 또는 세포를 공격한다. 추가로, 종양발생의 진전 및 류마티스성 관절염의 증식성 서혜(鼠溪) 형성은 세포의 미확인 증식에 의해 특성화된다. 따라서, 불충분한 세포소멸은 질병의 발달을 유도하고 세포소멸을 증강시키는 세포소멸 유도 리간드 또는 촉진성 단일클론성 항체를 사용하는 것이 원치않는 세포를 제거하기 위한 잠재적인 치료술로서 고려된다.
예를 들어 류마티스성 관절염(이하, "RA"라 함)은 통상적인 인간의 자가면역 질병이다. 상기 RA의 병리학에 관한 현재의 이해 수준은 자가면역 T 세포 및 B 세포가 관절에서의 염증성 반응을 개시시켜 활막 세포의 과증식을 유도한다. 활막 세포의 과증식에 따라 메탈로프로테이나제(이하, "MMP"라 함)가 과생성되어 RA 특징인 연골 및 골의 미란성 파괴를 추가로 유도한다(25). RA를 치료하기 위한 핵심적인 단계는 염증성 활막 세포의 과증식을 억제하는 것이다. 활막 세포의 과증식을 유도하는 분자적 메카니즘은 아직 알려지지 않았다. 과증식성 활막 세포가 악성이 아니며 형질전환되지 않은 경우에도 형질전환된 세포를 갖는 일부 특징을 공유하는 것으로 다수 연구에서 제안되어 있다(46). "형질전환 발생 윤활구"라 불리우는 상기 세포들은 조밀하고 거친 세포질 세망, 다수의 불규칙 핵 및 정상 스핀들 형상의 세포골격에서의 변화에 의해 특성화된다. 암유전자 및 바이러스 유도 유전자가 도입되는 경우 RA 활막 세포의 형질전환 출현을 위한 1차 유발이 있다고 제안되어 왔다(46).
둘 이상의 양상의 RA는 조절곤란된 세포소멸이 질병과정에 기여할 수 있으며 세포소멸에 의한 치료 유발이 효과적인 치료법임을 시사하고 있다: 활성화된 T 세포의 제거 실패는 Fas 매개된 세포소멸 및 TRAIL 매개된 세포소멸과 관련되는 과정인 T 세포의 감염성 활성화 유도 세포사이며 RA의 활막 세포의 과증식적 성질은 RA 병변의 후기 단계에서 기여하는 인자임을 시사한다. 실제로, 항-Fas 항체를 염증성 관절에 투여하는 경우 인간 RA에 대한 동물 모델인 택스 유전자변형 마우스(tax transgenic mice)에서 만성 관절염의 발달을 억제하는 것으로 밝혀졌다(26). 더욱이, 아데노바이러스성 벡터에 의한 Fas 리간드 유전자로 국부적으로 형질도입시키는 경우 콜라겐 유도 관절염의 예방에 효과적이다(27). Fas 매개된 세포소멸의 증강에 의한 염증성 활막 세포의 과증식의 억제는 상기 두 경우 모두에서 관측된다. Fas 리간드가 RA 활막 세포에서 강력한 세포소멸 유도제인 경우에도 인간에 대한 치료요법으로서 Fas 리간드 매개된 세포소멸의 적용은 치사 간독성에 의해 제한된다.
TRAIL 수용체 유도된 세포소멸은 또한 Fas-리간드 유도된 세포소멸보다 암 치료에 보다 안전하고 효과적인 치료능을 나타낸다. TRAIL 매개된 세포소멸은 정상세포에 대한 영향없이 형질전환된 종양세포의 세포소멸을 특이적으로 유도하는것으로 알려져 있다. 삼량체화된 가용성 TRAIL을 전신 투여하는 경우 실험동물에서 독성을 유발하지는 않으면서도 이식된 종양의 감퇴를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다(13,28). 종래 치료를 위한 보조적인 요법으로서의 가능성은 DR5의 발현 및 유방암 세포의 TRAIL 유도된 세포소멸에 대한 감수성이 방사선에 의해 증강된다는 최근의 발견에 의해 강조되었으며, 이것은 방사선과 결합되는 경우 암요범에서 TRAIL의 효능이 증가됨을 암시한다(29).
또한, TRAIL 수용체 DR5를 암호화하는 유전자는 염색체 8p21-22, 즉 일부 암세포에서 높은 빈도의 돌연변이가 이루어진 좌위에 존재한다(30). 2종 이상의 종양 세포, 소형 폐암(31), 및 두부암 및 경부암(32)은 DR5 유전자의 사영역에서 돌연변이를 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 암의 발달 및 전이에 대한 수용체 에피토프의 변화 효과를 결정하기 위한 암연구에서 항-DR5 항체에 대한 필요성이 존재한다. 추가로, TRAIL 수용체 돌연변이의 작용성은 암의 조기 탐지에서 다른 바이오마커와 함께 사용되거나 종양이 공격함을 예보하는 예보자로서 사용되는 경우 유용한 임상 진단도구임이 입증될 것이다.
본 발명은 단일 유형의 종양 괴사 인자(이하, "TNF"이라 함)-관련 세포소멸-유도성 리간드(이하, "TRAIL"이라 함) 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 보다 구체적으로는 단일 유형 수용체를 발현시키는 생체내 및 시험관내 세포에서 세포소멸을 유도하는 단일클론성 항체, 및 이러한 항체에 기초한 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 TRA-8의 특징에 관한 것이다. 도 1a는 TRA-8의 결합 특이성에 관한 것으로서 웨스턴 블롯 분석법(Western blot analysis; 상부 패널)에 의해 TRA-8 또는 항-인간 IgG로 알아낸 TNFR 부류의 재조합 융합 단백질을 평가한 것이며, 상세한 내용은 하기와 같다:
레인 1 : DR5/hIgG1 융합 단백질(면역원); 레인 2: DR4/hIgG1(TRAIL-R1); 레인 3: DR5/hIgG1; 레인 4: TRAIL-R3(DcR-1)/hIgG1; 레인 5: TRAIL-R4(DcR-2)/hIgG1; 레인 6: CD95/hIgG1; 레인 7: 가용성 TNFRI.
ELISA 분석법(하부 패널): 웰의 번호는 웨스턴 블롯과 일치하되, 단 제 8 웰은 쥐의 DR5/hIgG1 융합 단백질이다.
도 1b는 가용성 TRAIL 및 TRA-8의 DR% 및 DR4에 대한 결합 활성에 관한 것이다. ELISA판을 DR5/hIgG1(좌측 패널) 또는 DR4/hIgG1(중간 패널)로 피복하고, 그다음 TRAIL 또는 TRA-8로 항온배양하였다. 도 1c는 DR5의 표면 발현의 유량세포분석법에 관한 것이다. Cos-7 세포는 전체-길이의 DR5 cDNA를 함유하는 pcDNA3 발현 벡터(속이 채워진 도수분포도), DR4 cDNA(개방형 도수분포도, 직선) 또는 벡터가 없은 경우(개방형 도수분포도, 점선)으로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후 48시간 후에, 세포를 TRA-8로 염색하고, 그다음 PE-접합 항-마우스 IgG1로 염색하였다. 도 1d는 DR5의 동소 면역조직화학에 관한 것이다. Cos-7 세포의 사이토스핀 슬라이드는 DR5 발현부 또는 대조군으로 트랜스팩션되고, 그다음 트랜스팩션 후 48시간 경과한 후에 TRA-8로 염색하였다. 도 1e는 TRA-8의 살해 활성에 관한 것이다. 위르캣(Jurkat) 세포는 TRA-8의 지정된 농도에서 항온배양되었다. 세포 생존성은, 밤새 배양한 후 ATPLite, MTT 및 PI 배척 시험법으로 측정하였다. ATPLite 및 MTT 시험법의 결과는 배지 대조군의 백분율로서 표시하고, PI 분석치는 PI 네가티브 세포의 백분율로서 표시하였다. 도 1f는 카스파제 활성의 웨스턴 블롯 분석치에 관한 것이다. 위르캣 세포를 지정된 시간 동안 500 ng/㎖로 항온배양하였다. 세포용해질은 블롯된 15% SDS-PAGE로 분리하고, 항-카스파제 항체로 찾아내었다. 화살표는 각각의 카스파제의 절단된 서브유닛를 나타낸다. 도 1g는 카스파제 억제 분석치에 관한 것이다. 위르캣 세포를 다양한 농도의 지정된 카스파제 억제제의 존재하에서 밤새 50 ng/㎖ TRA-8로 항온배양하였다. 세포 생존성을 ATPLite 분석법으로 측정하였다.
도 2는 DR5의 표면 발현 및 DR5-매개 세포소멸에 대한 감수성에 관한 것이다. 정상 T 및 B 세포를 말초 혈액으로부터 신선하게 분리하여 T 세포(a 및 a'), 신경교종(b 및 b'), 전립선 암 세포(c) 및 B 세포(d) 세포주를 TRA-8 또는 쥐의 IgG1 동종형 대조군 항체로 항온배양하고, 그다음 PE-접합 염소 항-마우스 IgGI로 항온배양하였다. 개방형 도수분포도는 동종형 항체 대조군을 나타내는 반면, 속이 찬 도수분포도는 TRA-8 염색을 나타낸다. 세포소멸은 a, b' 및 d로서 도시한 바와 같이 가용성 TRAIL(○) 또는 TRA-8(●)으로 밤새 항온배양한 후에 ATPLite 분석법으로 측정하였다.
도 3a'에서 T세포주 U937은 TRA-8 또는 쥐의 IgG1 동종형 대조군 항체로 항온배양하였다. 세포소멸은 가용성 TRAIL(○) 또는 TRA-8(●)에 의해 밤새 항온배양된 후, ATPLite 분석법에 의해 측정하였다.
도 3에서, 신경교종(b) 및 전립선 암(c) 세포주를 TRA-8 또는 쥐의 IgG1 동종형 대조군 항체에 의해 항온배양하였다. 세포소멸은 가용성 TRAIL(○) 또는 TRA-8(●)으로 밤새 항온배양한 후, ATRLite 분석법으로 측정하였다.
도 4는 도 4a에서 나타낸 본 발명의 항체 주의 지정된 농도하에서 (A) 항체주 TRA-1, TRA-8 및 TRA-10 및 (B)TRAIL의 지정된 농도에 노출시킨 후, 인간 위르캣 세포의 세포 생존율을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 5는 정상 조직 및 암 조직에서의 DR5의 발현에 관한 것이다. 정상 조직 및 암 조직의 균질화물을 TRA-8로 찾아내고, 화학발광법으로 발현시켰다. 도 5a는 정상 조직의 DR5 단백질의 웨스턴 블롯 분석법에 관한 것으로 상세한 내용은 하기와 같다: 레인 1 :간, 레인 2: 뇌, 레인 3: 폐, 레인 4: 신장, 레인 5: 비장, 레인 6: 고환, 레인 7: 난소, 레인 8: 심장, 레인 9: 췌장. 도 5b는 암 조직내 DR5 단백질의 웨스턴 블롯 분석치에 관한 것이다. 난소(레인 1) , 폐(레인 2), 간(레인 3), 직장(레인 4), 경부(레인 5), 피부(레인 6), 고환(레인 7), 갑상선(레인 8), 자궁(레인 10), 위(레인 11), 후인두(레인 12) 및 췌장(레인 13)으로부터의 암을 함유하는 암 조직을 블롯하였다. 정상 인간 조직(c) 및 암 조직(d)의 동소 면역조직화학에 관한 것이다. 동결된 부분은 TRA-8로 면역염색하였다.
도 6은 TRA-8의 살종양성 활성에 관한 것이다. SCID 마우스에 1321N1 세포를 피하접종하였다. 종양을 접종한 후 2일째에 100㎍ TRA-8의 단일 투여로 정맥주사하거나(a) 또는 종양을 접종한 후 7일째에 100㎍ TRA-8을 3회 투여로 정맥 주사하였다. 종양의 성장은 중량을 기준으로 측정하고, H&E 염색으로 조직별로 평가하였다. 사진은 대조군 마우스에서는 생세포 종양이 성장하였지만, TRA-8 처리된 마우스(c, 상부 패널)에서는 성장하지 않았음을 나타내고, 하단 패널은 종양의 H&E 염색부(c)이다. SCID 마우스를 106위르캣 세포로 정맥주사하고, 주사한 후 2일째에 TRA-8을 단일 투여함으로써 처리하였다. 7일 후, 비장 세포를 수확하고, 항-인간 CD-3 항체로 염색하고, 유량세포분석법(d) 또는 면역조직화학법(e)으로 분석하였다.
도 7은 RA(a) 및 OA(b) 활막 세포내 세포면 DR5의 발현을 나타낸다. 1×106원발성 배양 활막 세포는 친화도-정제된 TRA-8로 염색되고, 그다음, PE-접합 염소 항-마우스 IgG1 항체로 염색되었다. 10,000 생세포를 FACS 우세정도로 평가하였다.
도 8은 재조합 가용성 TRAIL(○) 또는 친화도-정제된 TRA-8(●)의 다양한 농도에 대한, RA(a) 및 OA(b) 활막 세포의 대표적인 주의 TRAIL 및 TRA-8 농도 유발된 세포소멸의 함수로서 세포 생존율을 나타내는 일련의 그래프이다. 세포 생존율은 처리된 세포의 cpm 대 미처리 세포의 cpm의 백분율이다.
도 9는 RA 활막 세포의 DR5-매개 세포소멸의 카스파제 의존성을 나타내는 일련의 그래프이다. RA 활막 세포(RA512)는 다양한 농도의 카스파제 억제제의 존재하에서 가용성 Fas 리간드(□), 항-Fas 항체(CH-11)(■), 가용성 TRAIL(○) 또는 항-DR5 항체(TRA-8)(●) 50 ng/㎖로 항온배양하였다. 밤새 배양한 후, 세포 생존율을 ATPLite로 측정하였다.
도 10a는 NFκB 활성을 나타내는 전기이동 겔-쉬프트 분석 결과이다. RA1016세포는 전기영동하기 전에 지정된 시간 동안 20ng/㎖ TNF-a, 50ng/㎖ 가용성 TRAIL 또는 50ng/㎖ TRA-8로 항온배양되었다. 도 10b 및 도 10c는 MMP-1 및 MMP-3의 제조를 나타내는 그래프이다. 지정된 RA 활막 세포 1×106/㎖를 지정된 농도의 TNF-a(○), TRAIL(△) 또는 TRA-8(●)로 항온배양하였다. 밤새 배양한 후, 배양액 상청액을 수집하였다. 배양액 상청액내 MMP의 수준을 ELISA로 측정하였다.
도 11에서는 TRA-8가 간세포 독성을 유발하지 않았다. 도 11a에서 정상 간 조직은 DR5를 발현하지 않았다. 2종의 정상 간 조직중 파라핀 부분, 간세포 암 조직 및 HepG2 세포의 사이토스핀 제제를 H&E 염색을 위해 준비하고, 해당 동결 부분을 TRA-8로 염색하였다. 도 11b는 DR5의 세포면 발현의 유량세포분석치를 나타낸다. 2종의 정상 간 조직 및 간세포 암종 조직의 경우로부터 분리한 간세포 및 HepG2 세포를 TRA-8, 항-Fas 항체(DX2) 또는 동종형 대조군 항체로 염색하였다. 속이 채워진 도수분포도는 TRA-8 또는 DX2 염색을 나타내고, 개방형 도수분포도는 해당 동종형 대조군을 나타낸다.
도 12에서 TRA-8 이외에 TRAIL은 간세포 독성을 유발한다. 신선한 정상 인간 간세포를 간세포 배양 배지내에 보관하였다. 도 12a에서 간세포의 세포소멸은 지정된 시간 동안 1㎍/㎖ 가용성 TRAIL + 가교결합제 또는 TRA-8로 유발되었다. 세포 생존율은 ATPLite로 측정되었다. 결과는 배지 대조군에 대한 생세포의 백분율로 나타내었다. 무늬막대는 TRAIL를 나타내고, 검정 막대는 TRA-8을 나타낸다. 도 12b에서, 간세포의 농축 핵을 훽스트 33352로 염색하고 유량세포분석법으로 분석하였다. 도 12c는 간세포 세포소멸에 대한 사이클로헥시미드의 효과에 관한 것이다. 8시간 동안 1㎍/㎖ 사이클로헥시미드의 존재(검색 막대) 또는 부재(흰색 막대)에서 대조군 배지 또는 1㎍/㎖ TRAIL 또는 TRA-8에서 간세포를 배양하였다. 세포 생존율은 ATPLite로 측정하였다. 결과는 2회 시험의 3회 배양물의 평균±SEM으로서 표현하였다. 도 12d는 DR5 및 Fas-매개 세포소멸에 대한 정상 간세포의 감수성을 비교한 것이다. 신선하게 분리한 간세포를 6시간 동안 지정된 농도의 가용성 TRAIL, TRA-8, 가용성 FasL 또는 항-Fas mAb로 항온배양하였다. 세포 생존율은 배지 대조군에 비교하여 생세포의 백분율로 나타내었다. 정상 간세포의 경우, 4개의 정상 개체의 평균±SEM으로 나타내었다. 환자로부터의 간세포암 세포 및 HepG2의 결과는 3회 배양물의 평균값으로 나타내었다.
도 13은 TRAIL이 간염를 유발함을 나타낸다. B6 마우스는 전체 길이의 인간 TRIAL를 암호화하는 아데노바이러스 벡터의 109pfu를 "테트-온(Tet-on)"의 대조군하에서 정맥주사하였다. TRAIL 발현은 테트라사이클린의 지정된 투여량에 의해 유발되었다. 도 13a는 간에서의 인간 TRAIL 발현의 노던 블롯(Northern blot) 분석치에 관한 것이다. 벡터를 주사하고 테트라사이클릭에 의해 유도한 후 24시간 후에, 전체 RNA를 간으로부터 분리하고 인간 TRAIL cDNA 또는 β-액틴으로 찾아내었다. 도 13b는 AST의 혈청 수준에 관한 것이다. TRAIL를 형질도입한 후 24시간 후에, AST의 혈청 수준을 측정하였다. 도 13c는, 아데노바이러스 벡터 감염된 간세포의 TRAIL-매개 세포 살해에 관한 것이다. B6 마우스를 테트라사이클릭-유발성 아데노바이러스 벡터로 정맥 접종하였다. 접종후 48시간 경과후에, 접종된 마우스 및 미접종된 대조군 마우스의 간세포를 분리하고, 지정된 농도의 TRAIL로 8시간(좌측 패널)로 항온배양하였다. 간세포의 세포 생존율은 ATPLite 분석법으로 측정하였다. 전술한 바와 같은 아데노바이러스 벡터로 접종된 마우스는 4시간 후에 10㎍의 가용성 인간 TRAIL로 정맥주사하였다. AST의 혈청 수준은 TRAIL 주사후 24시간에서 측정하였다(우측 패널). 도 13d 및 13e는 TRAIL에 의해 유발된 간 손산의 조직학적 분석에 관한 것이다. 간은 TRAIL를 형질도입한 후 24시간(도 13d) 또는 7일(도 13e)에서 수집하였다. 파라핀 부분을 H&E로 염색하고, 100X(상부 패널) 및 400X(하부 패널)로 사진찍었다.
도 14는 휴지 세포(채우지 않음) 및 활성화(그림자) 세포에 대한 유량세포분석법에 의해 측정되는 바와 같이 인간 PBMC로부터 정제된 활성화 T 세포 및 B 세포가 증가된 수준의 DR5를 발현시킴을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 15는 48시간 동안, 항-CD3 세포 또는 항-μ세포, 활성화 세포 및 피콜-파그(Ficoll Paque)의 상이한 밀도에 의해 수집된 블라스트 세포으로 자극된 도 14에서 제시한 정제 T 세포 및 B 세포에 대한 TRA-8 농도의 함수로서의 생존율 그래프이다.
도 16은 인간 PBMC 및 TRA-8 또는 IgG(대조군)이 주사된 NK 세포 결핍된 NOD/SCID 마우스에 대한 게이트 림프구 개수에 대한 CD3 발현을 나타내는 유량세포분석법 도면과 도수분포도이다.
도 17은 실시예 13에서 상세히 설명하는 바와 같은 마우스의 비장 조직에 대한 CD3 및 투넬 염색된 세포 현미경 사진을 나타낸다.
도 18은 TRA-8, BISVIII 및 이들의 조합의 존재하에서 만성 림프구백혈병(CCL) 및 정상 B 세포(인간) 에 대한 세포독성 도면을 나타낸다.
TRAIL 수용체 DR5을 인식하고 생체내 DR5 발현 세포내 세포소멸을 유발하는 항체를 개시한다. 추가로, DR5는 인식하지만, DR4, DcR1 및 DcR2는 모두 인식하지 못하는 항체도 개시한다. 하이브리도마에 의해 제조된 단일클론성 항체에 대해서는 구체적으로 설명한다.
본 발명에 의해 제공된 방법은 DR5에 결합할 수 있는 항체의 치료량에 세포를 노출시킴으로서 세포 증식을 억제할 수 있다. 또한, DR5에 대해 활성인 단일클로성 항체 치료효과량, 약학적으로 허용가능한 담체, 및 항체와 담체를 내포하는 용기를 포함하는 약리학적 조성물이 개시되어 있다. 추가로, 본 발명은 이상 또는 통제불능 세포의 선택적인 세포소멸을 위한 치료제를 제조하기 위한 DR5를 인식하는 항체의 용도를 제공한다.
본 발명의 향체는, 예를 들어 DR4, DR5, DcR1, DcR2 및 OPG와 같은 종양 괴사 인자 리간드 수용체와 상호작용하여 수용체와 같은 발현 세포내에서 세포소멸을 유발한다. 작용성 또는 길항성 종양 괴사 인자 리간드 수용체 에피토프를 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 항체도 개시되어 있다.
본 발명은 세포소멸 관련 질환을 갖는 목표 조직을 치료효과량의 본 발명의 항체에 노출시킴을 포함하는 방법에 의해서 세포소멸 관련 질환에 대한 치료법을 제공한다.
또한, 대상 내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 면역글로불린 단백질 또는 이들의 분절에 결합된 것으로 10개 이상의 염기를 갖는 길항성 TRAIL 수용체 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 개시한다.
본 발명은 목표 세포가 발현 벡터내에 TRAIL 수용체 핵산 서열과 트랙스펙션되어 TRAIL 수용체가 목표 세포상에서 발현하도록 하는 유전자 치료법을 제공한다. 그다음, 목표 세포는 TRAIL 수용체를 선택적으로 결합하는 항체에 노출된다.
DR5에 대해 선택적인 항체의 중사슬 및 경사슬 면역글로불린을 암호화하는 핵산 서열 및 아미노산 서열이 제공된다. 또한, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 본 발명의 벡터로 변환된 숙주 세포에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 인간화 TRA-8을 제조하는 숙주 세포를 제공한다.
인간화 DR5 항체를 제조하는 방법으로, 숙주를 인간화 면역글로불린 경사슬 및 인간화 면역글로불린 중사슬을 암호화하는 핵산 서열로 변환하고 그다음 변환된 숙주를 미리 정해진 시간 동안 항온배양하는 방법을 설명한다.
또한, 치료효과량의 인간화 DR5 항체와 목표 세포를 접촉시킴을 포함하는 세포 증식을 위한 억제 방법을 개시한다.
DR5에 대해 선택성인 인간화 TRA-8을 포함하며, 사용하기 위한 지침서와 함께 적당한 용기내에 포장되어 있는 산업용 키트도 제공한다.
세포 제거의 부전은, 예시적으로 리간드, 수용체, 또는 세포내 조절자 및 작용자 분자의 발현 또는 작용을 비롯한 결함과 관련된 세포소멸 유발 시스템내 결합에 기인한다. 본 발명은 결핍 세포소멸 유발 시스템을 교정하고 설정된 결손 세포소멸 유발 시스템내에서 선천적인 특이적 결함을 밝히는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 DR5, DR4, DcR1 및 DcR2를 비롯한 특이적 TRAIL 수용체에 대해 생체내 및 생체외 세포소멸 유도 활성에 대해 선택성을 같은 신규한 부류의 단일클론성 항체에 관한 것이다. 본 발명은 세포소멸 신호화 연구를 위한 시약 뿐만 아니라 예시적으로 광범위한 부류의 암 세포, 세포소멸 시스템의 비통제화 및 자가면역 질환인 이상 증식 활막 세포를 비롯한 TRAIL 수용체를 발현하는 세포에 대해 효과적인 치료제로서의 용도를 갖는다. 본 발명에 따른 항체는 이들간의 상동성의 측면에서 특정 유형의 TRAIL 수용체를 결합하는데 있어서 특이적이다. 본 발명의 항체는 목표 TRAIL 수용체를 발현하는 세포에 대해서만 목표화 세포소멸시켜, 목표 수용체를 발현하는 세포의 TRAIL 세포소멸을 차단한다.
본 발명의 항-DR5 단일클론성 항체는 생체외 DR5를 발현하는 세포내 세포소멸의 잠재적 유도인자 및 생체내 세포소멸의 유도인자로서 작용한다. 본 발명의 융합 단백질 항-DR5 항체 및 인간화 항체 주요 사슬상에서 연결된 인간화 분절 CDR 서열은 유사한 세포소멸 특성을 나타낸다.
현재까지, 세포면 DR5에 결합되고 가교결합제의 부재하에서 생체네 및 생체외 둘다에서 DR5를 발현하는 세포의 세포소멸을 유도하는 어떠한 단일클론성 항체도 입수가능하지 않았다. 본 발명은 동물 모델, 예를 들어 이종이식 동물에서 또는 체외에서 질환에 대한 치료제로서 작용가능한 항-DR5 항체를 포함한다. 가용성 TRAIL은 생체내 종양 세포의 세포소멸의 유도에 효과적인 것으로 알려져 있지만, 살해 활성은 매우 낮아서, 대량의 투여량 및 반복 투여가 요구된다(13). 본 발명에 따른 일련의 항-DR5 항체중 하나인 TRA-8은 인간 DR5 형질전환된 동물에 약학적으로 효과적이고, 또한 DR5 및 TRAIL의 역할을 평가하기 위한 모델을 수립하는데 유용하다.
TRAIL 수용체에 대해 야기되는 본 발명에 다른 항체는 실험용 동물로부터 본 발명에 따라 수확되었다. 인간 대상내 감소되고 치료적으로 수용가능한 면역 반응을 끌어내면서 수용체 결합 활성을 유지하기 위해서 본 발명에 다른 항체를 인간화함으로써, 본 발명에 따른 인간화 항-TRAIL 수용체 항체가 설정된 TRAIL 수용체에 대한 치료적 작용물질 또는 길항물질로서 사용된다. 본 발명은, 항-TRAIL 수용체 항체의 제 2 가교결합이 요구되지 않기 때문에 생체내 치료제로서 작용가능하다.
본 발명은 작용성 또는 길항작용성 세포소멸 효과를 갖는 단일 항-TRAIL 수용체 항체를 능가하는 범위로 확장된다. 2종 이상의 항-TRAIL 수용체 항체는 생체외 세포 배양액 또는 생체내 대상물 조직과 접촉하여 상승작용 처리를 형성한다. 예를 들어 신경교종 세포주 U87 및 조혈 세포주 U937 및 몰트-4는 작용성 항-DR4 및 항-DR5에 대한 상승작용 노출에 대해 노출 반응성인 반면, 작용성 항-DR5 항체 단독에 대한 노출은 세포소멸을 유도함에 있어서 제한적인 성공만을 나타낸다.
추가로, 길항성 항-TRAIL 수용체 항체는 항체가 유인용 수용체인 DcR1, DcR2 또는 OPG중 하나의 결합에 대해 특이적인 경우, 본 발명에서 특히 유용하다. 본 발명에 따른 항체에 의한 유인용 수용체의 선택적인 차단은 유인용 수용체를 발현하는 세포 유형에 있어서 세포소멸 신호를 변환할 수 있는 TRAIL 수용체에 대한 TRAIL 결합 평형을 이동시키는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 기타 조합된 치료법에서, 유인용 수용체 결합 항체는 TRAIL 수용체 결합을 변환하는 작용성 세포소멸 신호에 대한 발현 세포를 민감하게 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 설정된 TRAIL 수용체의 작용성 에피토프 및 길항성 에피토프를 밝히는 방법을 제공한다. 추가로, 설정된 TRAIL 수용체와 관련된 개개의 다형이 차이 변수 또는 CDR 영역을 갖는 단일 클로성 항체의 패널을 사용함으로서 본 발명에 따라 밝혔다. 단일클론성 항체의 특징화된 패널은 작용성 및 길항성 에피토프 및 다형을 한정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단일클로성 항체의 패널은 약제 발견 및/또는 질환 성향을 선별하는 대상에 유용하다.
또한, 본 발명의 다른 실시양태는 면역글로불린 단백질, 폴리펩티드 또는 이들의 분절과 결합된 TRAIL 수용체의 항원성 분절을 비롯한 융합 단백질을 포함한다. TRAIL 수용체 분절은 대상 세포면상에서 발현되는 네가티브 TRAIL 수용체에 대한 면역원성 반응을 알아내는 충분한 개수의 염기를 함유하는 것으로 정의된다. TRAIL 수용체 융합 분절은 10개 이상의 아미노산을 포함한다. 면역글로불린 융합 단백질 또는 이들의 분절은 본원에서 대상내에서 면역원성 증폭을 활성화하기 위해서 충분한 개수의 아미노산 염기를 갖는, 천연 또는 합성 단백질 또는 폴리펩티드 분절을 포함하는 것으로 정의된다. 면역글로불린 분절에 결합된 TRAIL 수용체 분절의 융합을 비롯한 본 발명의 면역원은 대상내에서 동소에서 항-TRAIL 수용체 항체를 알아내는 생체네 치료제로서 유용하다.
또한, 추가의 실시양태에서 본 발명은 유전자 치료로서 효력이 있다. 본 발명의 유전자 치료 양태에서, 목적 세포는 TRAIL 수용체에 해당하는 발현가능한 서열을 수송하는 벡터에 의해 트랜스펙션된다. 벡터는 통상적인 것으로 벡터에 대한 목적 세포의 감수성을 기초로 하여 선택된다. 유전자 치료 벡터로는 예시적으로는 아데노바이러스, pAdCMV5를 들 수 있다. 트랜스펙션 TRAIL 수용체를 발현하는 목표 세포 또는 조직상에, 세포 또는 조직은 트랜스펙션 TRAIL 수용체를 결합하는데 특이적인 본 발명에 따른 항체에 노출된다. 항-TRAIL 수용체 항체는 목적하는 치료 결과와 양립하도록 작용성 또는 길항성임이 밝혀졌다.
본 발명의 항체는 또한 민감제와 결합하는데 효력이 있다. 본원에서 사용되는 민감제는 자외선, 구체적으로 비스인돌말레이미드의 부류를 들 수 있는 유기 분자, 중금속 및 유리 라디칼 종을 비롯한, 세포소멸을 유발하는 임의의 자극을 포함하는 것으로 정의된다.
악성 종양 치료의 맥락에서, TRA-8은 제 2 가교결합제의 부재하에서 카스파제 의존성 경향인 대부분의 TRAIL-민감성 암 세포의 세포소멸을 유발할 수 있다. TRA-8은 강한 체외에서 살암세포 활성을 나타낸다. 대부분의 TRAIL 민감성 세포의 세포소멸을 유발하는 TRA-8의 능력은 DR5 단독으로 세포소멸을 촉발할 수 있다는 점을 입증하였다. 본원에서 상세히 설명하는 대부분의 종양 세포는 세포면 DR5 및 TRAIL에 대한 이들의 감수성과 평행선상의 TRA-8 유도된 세포 사망에 대한 감수성을 발현하기 때문에 DRA5는 대부분의 종양 세포에 있어서 TRAIL-매개 세포소멸을 위한 제1의 사망 수용체이다. 따라서, 정상 세포와 암 세포에 의한 DR5에 대한 차별적인 발현은 TRAIL-매개 세포소멸의 선택성에 있어서 효력이 있다. TRA-8은 유인용 수용체를 지나쳐서 TRAIL-매개 세포소멸을 유발한다. 그러나 단지 소수의TRAIL 내성 종양 세포만이 TRA-8에 민감하여, 유인용 수용체는 TRAIL-매개 세포소멸에 대한 종양 세포의 내성이 있어서 주요 역할을 수행하는 것으로 보이지는 않는다.
기존의 연구 결과는, 동물내 가용성 형태의 TRAIL의 전신 투여는 독성(3,4,22)을 유발하지 않고 종양 퇴행을 유발하는 것으로 나타났지만, 인간 TRAIL의 막 결합 형태는 본원에서 도시하는 바와 같이 마우스내의 손상을 유발한다. 그러나, TRAIL의 간 독성은, Fas 리간드에 비해 TRAIL-유도 손상에 대한 정상 간세포의 보다 적은 감수성 및 생체외에서의 TRAIL의 치사률의 부족에 의해 설명되는 바와 같이 Fas 리간드에 비해 다소 잠재적이다. 따라서, TRAIL의 적정은 암 치료에 유용하다.
본원에서 설명하는 바와 같이, 정상 간세포에 의한 상당한 수준의 DR5 단백질 발현의 부재가 밝혀졌으며, 이는 TRA-8 유발 세포소멸에 대한 간세포 내성과 관련된다. 단일클론성 항체와 DR5의 가교결합은 세포소멸을 촉발할 수 있는 사망 수용체의 단독중합체성 형태를 기질화하는데 불충분하다. 마모셋의 시험은 TRA-8 투여의 간 독성에 대한 어떠한 증거도 제시하지 못했다. 따라서, 작용성 단일클로성 항-DR5 항체는 치료제로서 가용성 TRAIL에 비해 보다 선택적이고 보다 안정하다.
선별 분석법으로서, 본 발명은 성장 세포 형태를 나타내는 악성 종양 세포의 작은 클러스터를 검출하기 위해서 적당하다. 본 발명에 따른 라벨링 항체에 의한 폐, 전립선 및 간 암을 비롯한 인간 암 세포의 동소 세포 영역을 염색하면, 용이하게 종양성 세포를 확인가능하다. 이러한 암 세포는 동일한 유형의 정상 세포에 비해 매우 높은 DR5 수준을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 적어도 폐, 전립선 및 간을 비롯한 조직내의 초기 단계의 악성 종양에 대한 민감한 선별 방법으로서 유용한다. 예시적으로 악성 종양 및 림프구 백혈병를 비롯한 질환과 관련된 이상 세포 증삭의 억제를 위한 치료 방법은 본원에서 상세히 설명한다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 RTA-1428를 갖는 것으로 TRA-8로서 표시되는 항-인간 DR5 단일클론성 항체에 대해 본건에서 상세히 설명한다. 작용성 항-인간 DR5 단일클론성 항체 TRA-8에 관련하여 기법 및 결과에 대해 상세히 기재한 기법 및 결과는 길항성 DR5 항체 및 작용성 및 길항성 방식으로 DR4, DcR1 및 DcR2에 대해 작용하는 항체에까지 확장가능하고 적용가능하다.
세포소멸 수용체, 예를 들어 Fas의 발현 수준은 세포소멸에 대한 세포의 감수성과 필수적으로 상관관계를 갖지는 않는다. TRAIL-매개 세포독성에 있어서, TRAIL을 위한 유인성 수용체의 발현은 세포의 감수성에 영향을 미치는 것으로 제안된다. 게다가, DR5는 FADD 및 카스파제 8 경로를 통한 세포소멸 신호의 효과적인 전달을 위해서는 DR4와 관련되어야만 한다. 작용성 단일 클론성 항-DR5 항체의 생체이용률이 DR5 신호화와 TRAIL 매개 세포소멸에 있어서의 이들의 상대적 역할을 조절함을 평가하게 한다. TRAIL 매개 세포소멸에 대한 세포의 감수성과 TRA-8 매개 세포소멸에 대한 세포의 감수성을 비교하면, TRAIL 매개 세포소멸에서의 DR5의 역할 및 감수성에 영향을 미칠 수 있는 기작에 대해 통찰할 수 있다.
이러한 장점은 일반적으로 본 발명의 인간화 항-DR5 항체까지 확장가능하다. DR-5에 대한 항체의 분자 클론은 하기 실시예에서 상세히 설명하는 바와 같은 공지된 기법에 의해 준비되었다. 재조합 DNA 방법론(33)은 단일클론성 항체 분자 또는 이들의 항원 결합 영역을 암호화하는 핵 산 서열을 구성하는데 효력이 있다.
본 발명은 여전히 효과적인 항체 효과기 작용을 갖지만 인간 항-마우스 항체(이하에서 "HAMA"로 지칭됨) 반응(34)를 유발하지 않는 인간화 항-TRAIL 수용체 항체를 구성한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간" 및 "인간화"라는 용어는 항체와 관련하여 인간 대상에 대해 치료적으로 감수가능한 약한 면역원성 반응을 알아낼 것으로 예상되는 임의의 항체에 관한 것이다.
본 발명은 항-DR5 항체, 인간화 항-DR5 항체, TRA-8 고급 및 경사슬 면역글로불린 및 인간화 고급 및 경사슬 면역글로불린을 위해 제공된다. 이러한 단백질 또는 유전자의 특정 절단물은 전체 서열의 단백질 또는 유전자의 조절 또는 효소성 작용을 수행한다. 예를 들어, 이들을 암호화하는 핵산 서열은 단백질 또는 유전자와 동등한 작용을 제공하는 것으로 치환, 부가, 삭제 또는 중합성 발현에 의해 개질될 수 있다. 핵산 암호화 서열의 퇴화로 인해, 천연 생성 단백질의 서열과 실질적으로 동일한 아미노산의 서열을 암호화하는 다른 서열을 본 발명의 실행에서 사용할 수 있다. 이의 예로는, 서열내에서 기능상 동등한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되는, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 모두 또는 일부를 포함하여 무변화를 나타내는 핵산 서열이 포함되나 이로 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열은, 변이가 TRAIL 수용체 DR5를 인식하는 효과적인 항체를 형성하는 한, 표준 방법(문헌["Current Methods in Sequence Comparison and Analysis",MacromoleculeSequencing andSynthesis, Selected Methods and Applications, pp.127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.])에 의해 계산하는 경우 25% 이하의 서열 상동성 변이에 내성이 있는 것으로 판단된다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능상 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산에 의해 치환되어 무변화를 나타낼 수 있다. 서열내 아미노산에 대한 치환체는 아미노산이 속해 있는 부류의 다른 요소로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된(산성) 아미노산으로는 아스파트산 및 글루탐산이 포함된다. 또한, 예를 들어 글리코졸화(glycosolation), 양성자이동(protolytic) 분할, 항체 분자 또는 기타 세포성 리간드에 대한 연결 등에 의해, 번역 도중 또는 번역 후에 상이하게 개질된 단백질 또는 분절 또는 이들의 유도체는 본 발명의 범주내에 포함된다. 또한, 본 발명의 항-DR5 항체의 핵산 서열을 암호화하는 재조합 벡터를 유전가공하여 벡터의 가공처리 또는 표현을 개질시킬 수 있다.
또한, 핵산 서열을 암호화하는 저해제는 생체외 또는 생체내에서 돌연변이되어 번역, 개시 및/또는 종결 서열을 생성하고/하거나 파괴하거나, 암호화 영역에서 변이를 생성하고/하거나 신규한 제한효소 부위를 형성하거나 예비존재하는 부위를 파괴시켜, 추가의 생체외 개질을 촉진시킬 수 있다. 생체외 부위 지향된 돌연변이유발, 문헌[J.Biol.Chem. 253:6551], 탭(Tab) 연계기(파마샤(Pharmacia)에서 제조)의 사용 등을 포함하나 이로 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 돌연변이유발에 대한 임의의 기법을 사용할 수 있다.
X선 결정학 데이타로부터, 접혀진 항체 면역글로불린이 일반적으로 각각 3개 또는 4개의 b-사슬로 이루어진 2개 층의 반평행(antiparallel) b-시이트를 포함하는 장원형 구조를 형성함을 알 수 있다. 가변성 영역에서, H 및 L 사슬의 V 도메인 각각으로부터의 3개의 루프는 함께 군집하여 항원-결합 부위를 형성한다. 이러한 루프를 각각 상보성 결정 부위(complementarity determining region; CDR)라 한다. CDR은 항체로 아미노산 서열에서 최고의 변이성을 갖는다. CDR의 부분이 아닌 가변성 영역 부분은 "골격 영역"("FR" 영역)으로 지칭되며, 일반적으로 CDR 구조를 유지하는 역할을 한다. 바람직하게는, 주어진 항체로부터의 CDR은 모두 수용체 항체로 이식되어, TRAIL 수용체 에피토프 영역을 위한 결합 영역을 보호한다. 총량의 CDR의 일부를 공여자에 이식하는 것은 본원에서 효과적인 것으로 판단된다. 이식은 일반적으로 잔류를 위한 잔기의 교체, 다른 것을 위한 하나의 아미노산 또는 영역의 교체를 포함하는 것으로 이해할 수 있다. 그러나, 경우에 따라 특히 영역의 전이와 함께 하나 이상의 잔기는 목적에 따라 첨가, 생략 또는 치환될 수 있으며, 이러한 삭제 및 삽입 뿐만 아니라 적합한 교체 및 역위도 당해 분야의 기술 범주에 속한다.
본 발명의 항체는 예를 들어 항-TRAIL 수용체 단일클론성 항체의 L 및 H 사슬 아단위의 각각의 CDR을 인간 항체의 상응하는 CDR 영역으로 이식하여 TRAIL-수용체에 대해 효과적인 마우스 단일클론성 항체를 인간화함으로써 수득된다.
분자의 개별특이형을 함유하는 항체 분절은 또한 공지된 기법을 사용하여 본원에서 생성되고 효과적으로 된다. 예를 들어, 이러한 분절의 예로는 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 항-TRAIL 수용체(AB')2 분절, TRAIL 수용체(AB')2 분절의 디설파이드 브릿지의 환원을 통해 발생되는 TRAIL 수용체 항체 AB' 분절, 및 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 발생되는 항체 분절이 포함된다.
특히, 항-DR5 단일클론성 항체 TRA-8은, 인간 DR5로 마우스를 면역시키고 후속적으로 상기 마우스로부터의 비장 세포 또는 림프 결절 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시킴으로써 수득될 수 있는 하이브리도마를 배양시킴으로써 수득될 수 있다.
단일클론성 항체의 제조는 (a) 항원으로서 사용하기 위해 생체거대분자를 정제하는 단계; (b) 항원을 주입하여 동물을 먼저 면역시키고, 상기 동물을 출혈시키고, 항체 적정량을 검정하여 비장 제거 시점을 결정한 후 항체 생성 세포를 제조하는 단계; (c) 골수종 세포를 제조하는 단계; (d) 상기 항체 생성 세포 및 골수종 세포를 융합하는 단계; (e) 목적하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하는 단계; (f) 단일 세포 클론을 제조하는 (클로닝) 단계; (g) 선택적으로 단일클론성 항체의 대규모 제조를 위해, 하이브리도마 세포를 배양하거나, 하이브리도마 세포가 이식되는 동물을 성장시키는 단계; 및 (h) 단일클론성 항체의 생물학적 활성 및 특이성을 시험하거나 표지제(marker agent) 특성을 검정한 후 단일클론성 항체를 제조하는 단계를 포함한다.
항-DR5 단일클론성 항체의 제조 과정은 전술한 단계를 참조로 하여 하기에 보다 상세히 설명된다. 이러한 본 발명의 항체 제조방법은 단지 예시하기 위한 것으로, 이로써 본 발명을 한정하고자 함이 아니다. 다른 공지된 과정은 다음과 같거나, 예를 들어 비장 세포이외의 항체 생성 세포 및 골수종을 사용함으로써 하기 방법을 개질시킬 수 있다.
(a) 항원의 제조
항원으로서 효과적인 재조합 단백질(이하, "재조합 인간 DR5"로 언급됨)은, 인간 DR5의 세포외 도메인 및 인간 IgG1 항체의 Fc 영역(이하, "IgG"로 언급됨)을 포함하는 융합 단백질에 대한 표현 벡터 pAdDR5-IgG(참조, PTA-1428)로 QBI-293A 세포를 전달감염시켜 ADENO-Quest 키트(캐나다 소재 퀀텀 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Quantum Biotechnologies Inc.))를 사용함으로써 표현하고, 상기 표현 생성물을 수집하여 부분적으로 정제함으로써 수득된다. 플라즈미드 pAdDR5-IgG는 인간 DR5 및 인간 IgG 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 동물 세포용 표현 벡터인 pAdCMV5로 삽입함으로써 제조된다. DR5를 암호화하는 DNA, 벡터, 및 숙주와 같은 다른 물질이 본원에 효과적이다.
벡터 pAdDR5-IgG로 전달감염된 QBI-293A 세포의 배양 상청액에서 생성된 인간 DR5 및 IgG 융합 단백질은 단백질A-세파로스(ProteinA-Sepharose) 친화성 크로마토그래피 또는 단백질G-세파로스 친화성 크로마토그래피, 또는 상표명 리소스(Resource) Q-칼럼(파마샤에서 제조)을 이용한 이온-교환 크로마토그래피에의해 부분적으로 정제될 수 있다.
다르게는, 인간 세포 라인의 세포 멤브레인으로부터 수득된 정제된 DR5가 항원으로 사용된다. 또한, DR5의 원발성 구조는 공지되어 있으므로(참조, PTA-1428), 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 샌거(Sanger)법과 같은 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성되어 항원으로서 사용될 수 있다.
(b) 항체 생성 세포의 제조
프론드(Freund)의 완전 또는 불완전 보조약 또는 명반과 같은 보조약과 혼합시킨 단계 (a)에서 제조된 면역원으로 마우스를 면역시킨다. 다른 적합한 실험 동물의 예로는 래트(rat), 기니아 피그(guinea pig), 토끼, 개, 닭, 말, 돼지, 소 및 양이 포함된다.
실험 동물을 면역시키기에 적합한 투여 경로로는 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피내 주사 및 근육내 주사 경로가 포함되며, 피하 주사 및 복강내 주사가 바람직하다.
면역화는 선택적으로 단일 복용 또는 적합한 간격(바람직하게는 1 내지 5주)의 수회 반복 복용에 의해 수행된다. 면역된 동물을 그의 혈청중의 항체 적정량에 대해 모니터하고, 충분히 높은 항체 적정량을 갖는 동물을 항체 생성 세포 공급원으로서 선택한다. 높은 적정량을 갖는 동물을 선택하면 후속 과정이 보다 효율적으로 된다. 후속적인 융합을 위한 세포는 일반적으로 최종 면역화로부터 3 내지 5일 후의 동물에게서 채취한다.
항체 적정량을 검정하는 방법으로는 방사선면역측정법(이하, "RIA"로 언급됨), 고상 효소 면역측정법(이하, "ELISA"로 언급됨), 형광 항체 검정법 및 수동 혈구응집 검정법과 같은 각종 널리 공지된 기법이 포함되며, RIA 및 ELISA가 검출 감도, 신속성, 정확성 및 자동화 가능성의 이유로 바람직하다.
항체 적정량은 후술되는 바와 같이 예를 들어 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 우선, 정제되거나 부분적으로 정제된 DR5를 96-웰 ELISA 판과 같은 고상 표면에 흡착시킨 후, DR5와 결합하지 않은 임의의 잔류하는 표면을 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 항원과 연관되지 않은 단백질로 차단시킨다. 세척 후, 웰 표면을 마우스 혈청의 연속 희석된 샘플과 접촉시켜 상기 샘플내 항-DR5 항체를 상기 항원에 결합시킬 수 있다. 2차 항체로서 효소-표지된 항-마우스 항체를 첨가하여 마우스 항체에 결합시킨다. 세척 후, 효소 기질을 첨가하고, 항체 적정량은 기질 등의 변화에 의해 유발되는 색 발생으로 인한 흡광도 변화를 결정함으로써 평가한다.
(c) 골수종 세포의 제조
확립된 마우스 세포 라인으로부터의 세포는 예를 들어 8-아자구아닌 내성 마우스를 비롯한, BALB/c 골수종주 P3X63Ag8U.1(P3-U1)(35), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)(36), Sp2/0-Ag14(SP-2)(37), P3X63Ag8.653(653)(38) 및 P3X63Ag8(X63)(39)로부터 유도된 골수종 세포의 공급원으로서 작용한다. 선택된 세포 라인은 8-아자구아닌 배지와 같은 적합한 배지로 연속 전이된다. 8-아자구아닌 배지로는 이소코브의 개질된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; "IMDM") 또는 둘베코의 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; "DMEM")가 포함된다. RPMI-1640 배지는 글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타미신, 우태아혈청(이하, "FCS"로 언급됨) 및 8-아자구아닌으로 보충되었다. 이어서, 세포를 융합하기 3 내지 4일 전에 10% FCS 함유 ASF104 배지(아지노모토(Ajinomoto), K.K)와 같은 정상 배지로 전이시켜 융합 당일 2×107세포 이상을 이용할 수 있도록 한다.
(d) 세포 융합
동물의 임의의 적합한 부분으로부터 수득된 림프구 및 플라즈마 세포는 항체를 생성하기 위한 전구 세포이다. 림프구 또는 플라즈마 세포 공급원의 예로는 비장, 림프 결절, 말초혈, 또는 이들의 임의의 적합한 조합물이 포함되며, 비장 세포가 가장 통상적인 공급원이다.
최후의 추가 주사 후, 항체 생성 세포가 존재하는 조직을 예비결정된 항체 적정량을 갖는 마우스로부터 제거한다. 비장 세포와 단계 (c)에서 제조된 골수종 세포와의 융합용으로 현재 유리한 기법은 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이다.
융합 기법은 비장 및 골수종 세포를 혈청 부재(serum-free) 배지(예를 들어, RPMI 1640) 또는 포스페이트 완충된 염수(이하, "PBS"로 언급됨)로 세척하여 비장 세포수 대 골수종 세포수의 비가 대략 5:1 내지 10:1이 되도록 한 후 원심분리하는 것을 포함한다. 상청액을 버리고 펠릿화된 세포를 충분히 느슨하게 한 후, 50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(m.w. 1,000 내지 4,000) 함유 혈청 부재 배지 1ml를 혼합하면서 적가한다. 후속적으로, 혈청 부재 배지 10ml를 서서히 첨가한 후 원심분리시킨다. 상청액을 다시 버리고, 펠릿화된 세포를 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(이하, "HAT"로 언급됨) 및 마우스 인터루킨-2(이하, "IL-2"로 언급됨)의용액을 함유하는 적합한 양의 HAT 배지에 현탁시킨다. 이어서, 상기 현탁액을 배양 판(본원에서 단순히 "판"으로도 언급됨)의 웰(well)에 분배하고, 경우에 따라 HAT 배지를 추가로 첨가하면서 약 2주 동안 37℃에서 5%v/v CO2의 존재하에 항온처리시킨다.
(e) 하이브리도마의 선택
사용된 골수종주가 8-아자구아닌에 내성인, 즉 하이포크산탄 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT)가 결핍상태인 경우, 임의의 비융합 골수종 세포 및 임의의 골수종-골수종 융합물은 HAT 배지에서 살아남을 수 없다. 반면, 항체 생성 세포의 서로간의 융합물 뿐만 아니라 항체 생성 세포와 골수종 세포와의 하이브리도마는 살아남을 수 있으며, 전자만이 제한된 수명을 갖는다. 따라서, HAT 배지에서의 연속적인 항온처리로 인해 목적하는 하이브리도마만이 선택적으로 생성된다.
생성된 하이브리도마는 집락으로 성장한 후, 아미노프테린이 결핍된 HAT 배지(HT 배지)로 전이된다. 이후, 분취량의 배양 상청액을 제거하여 예를 들어 ELISA에 의해 항-Fas 항체 적정량을 결정한다. 전술한 융합 단백질이 ELISA 항원으로서 사용되는 경우, 또한 인간 IgGI의 Fc 영역에 특이 결합된 항체를 생성하는 클론을 제거할 필요가 있다. 이러한 클론의 존재 또는 부재는 예를 들어 항원으로서 Fas-IgG1 또는 IgG1를 사용한 ELISA에 의해 입증된다.
(f) 클로닝
항체 적정량을 결정하기 위해 단계 (b)에서 기술된 바와 유사한 방법을 사용하여 특정 항체를 생성하는 것으로 여겨지는 하이브리도마를 다른 클로닝용 판으로 전이시킨다. 적합한 클로닝법으로는 하이브리도마를 판의 웰 당 하나의 세포를 함유하도록 희석시킨 다음 배양시키는 제한 희석법; 반고형 한천 배지에서 배양시킨 후 집락을 회수하는 반고형 한천법; 배양용의 단일 세포를 분리하기 위해 미세조작장치를 사용하는 방법; 및 단일 세포가 세포 분리기에 의해 분리되는 "클론 분리"법이 포함된다.
예를 들어 제한 희석법에 따른 클로닝 과정은 항체 적정량을 증명하는 각각의 웰에 대해 2 내지 4회 반복되고, 안정한 항체 적정량을 갖는 클론은 항-DR5 단일클론성 항체 생성 하이브리도마로서 선택된다. 항 마우스 DR5 항체를 생성하는 하이브리도마들은 유사 방법에 의해 선택되어 항-DR5 단일클론성 항체 생성 세포 라인을 수득한다.
본 발명의 항체에 기초가 되는 마우스-마우스 하이브리도마 TRA-8은 2000년 3월 1일자 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁하여 수납 번호 PTA-1428을 부여받았다. 따라서, 마우스-마우스 하이브리도마 TRA-8 또는 임의의 다른 확립된 하이브리도마를 사용하여 항체를 제조하는 경우, 단계 (a) 내지 (f)를 생략하고 하기 단계 (g)로부터 출발하는 과정에 따라 제조될 수 있다.
(g) 단일클론성 항체를 제조하기 위한 하이브리도마의 배양
상기 클로닝에 의해 수득된 하이브리도마를 HT 배지에서가 아니라 정상 배지에서 배양시킨다. 규모가 큰 배양은 큰 배양 병을 사용한 회전 병 배양 또는 교반 배양에 의해 수행된다. 이어서, 규모가 큰 배양으로부터의 상청액을 수집하고, 적합한 방법, 예를 들어 당해 분야의 숙련자들에게 널리 공지된 겔 여과법에 의해 정제하여 본 발명의 항체를 위해 기초가 되는 항-DR5 단일클론성 항체를 수득한다. 또한, 하이브리도마를 유전적 동계의 마우스, 예를 들어 BALB/c 마우스 또는 nu/nu 마우스에서 복강내로 성장시켜 항-DR5 단일클론성 항체를 다량 함유하는 복수(腹水)를 수득할 수 있다. 시판중인 단일클론성 항체 정제 키트(예를 들어, MAbTrap GII 키트; 파마샤에서 제조)를 사용하여 수집된 항체를 편리하게 정제한다.
상기와 같이 제조된 단일클론성 항체는 인간 DR5에 대해 높은 특이성을 갖는다.
(h) 단일클론성 항체의 검정
단일클론성 항체의 동종형 및 서브클래스의 적합한 동정(同定) 방법은 유크터로니(Ouchterlony)법, ELISA 및 RIA을 포함한다. 바람직하게는, 상표명 마우스 타이퍼 키트(Mouse Typer Kit; 바이오래드(BioRad))와 같은 시판중인 키트를 동정에 사용한다.
단백질의 정량화는 폴린-로우리(Folin-Lowry)법 또는 280nm에서의 흡광도에 기초한 계산(1.4(OD280)=면역글로불린 1mg/ml)에 의해 수행될 수 있다.
단일클론성 항체가 인식하는 에피토프는 다음과 같이 동정된다. 우선, 단일클론성 항체가 인식하는 분자의 다양한 부분 구조물을 제조한다. 부분 구조물은, 상기 분자의 다양한 부분 펩티드가 공지된 올리고펩티드 합성 기법에 의해 합성 제조되는 방법, 또는 목적하는 부분 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 적합한 표현 플라즈미드에 혼입되고 적합한 숙주, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)에서 표현되어 펩티드를 생성하는 방법에 의해 제조된다. 일반적으로, 상기 방법은 둘다 상기 목적을 위해 종종 조합하여 사용된다. 예를 들어, 항원 단백질의 C- 또는 N-말단으로부터 작용하는, 적절히 감소된 길이를 갖는 일련의 폴리펩티드는 확립된 유전공학 기법에 의해 제조될 수 있다. 분절이 항체와 반응하는 것을 확립함으로써, 에피토프 부위의 근접한 이상(idea)이 성취된다.
에피토프는, 확립된 올리고펩티드 합성 기법을 사용하여 펩티드 또는 그의 돌연변이체에 상응하는 각종 소량의 올리고펩티드를 합성하여 본 발명의 항체의 제조에 기초가 되는 항-DR5 단일클론성 항체에 대한 펩티드의 결합 특성 및 단일클론성 항체를 이용한 펩트의 항원에 대한 결합의 경쟁적 저해를 결정함으로써 더욱 근접하게 동정된다. 스팟(SPOT) 키트(제노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies, Inc.))와 같은 시판중인 키트 및 멀티핀(multipin) 합성법(키론 코포레이션(Chiron Corp.))에 기초된 일련의 멀티핀 펩티드 합성 키트가 다양한 종류의 올리고펩티드를 수득하는데 편리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 후술되는 (a) 내지 (f)의 다양한 기능적 특성을 가지며, 이들은 각각 예를 들어 후술되는 방법에 의해 입증된다.
(a) 인간 DR5를 표현하는 세포에 대한 TRA-8의 특이 결합
본 발명 특유의 특징은 세포면 DR5를 결합하는 능력이다. 이는 DR5를 표현하는 세포의 유량세포분석법에 의해 증명된다. 첫째, DR5를 결합하는 특이 세포면은 인간 DR5를 암호화하는 전체 길이의 cDNA로 전달감염된 COS-7 세포에 의해 확인된다. 구체적으로, TRA-8은 텅빈 대조군 벡터 또는 DR4를 암호화하는 벡터가 아니라, 단지 DR5로 전달감염된 COS-7 세포를 인식할 뿐이다. 둘째, 3개의 상이한 기원, 즉 인간 악성 종양 세포의 조혈, 교종 및 전립선 암을 시험한다. 이러한 변형된 종양 세포는 대부분 표현 수준이 크게 변하더라도 세포면 DR5의 상당한 수준을 표현하였다. 셋째, RA 및 OA 환자로부터의 인간 원발성 윤활 섬유모 세포의 두 패널을 시험한다. 모든 RA 활막 세포는 OA 세포에 비해 상당히 높은 수준의 DR5를 표현하였다.
(b) 가교결합의 부재시 생체외 인간 악성 종양 세포의 세포소멸 유도
TRAIL 수용체를 인식하고 인간 악성 종양 세포의 세포소멸을 직접 유도하는 본 발명에 따른 향상된 항체의 능력은, 다양한 농도의 항체, 특히 TRA-8를 갖는 세포의 생체외 배양 도중 세포 생존성 검정(ATPLite)에 의해 결정된다. 종양 세포는 대부분 TRA-8 유도 세포소멸될 수 있다. 일부의 세포에 대해, TRA-8은 강한 세포소멸 유도 활성을 나타내었는데, 예를 들어 TRA-8은 pg/ml 수준 내에서 인간 위르캣 세포의 세포소멸을 유도할 수 있다. 중요하게도, TRA-8 유도된 세포소멸은 가교결합을 요구하지 않았으며, 대부분의 세포에서 TRA-8은 증강제의 존재하에 재조합 가용성 TRAIL보다 강한 세포소멸 유도 활성을 나타내었다.
(c) 생체내 TRA-8의 종양박멸 활성
TRA-8의 종양박멸 활성은 2개의 SCID/인간 종양 세포 모델에서 평가한다. 첫째, SCID 마우스를 인간 백혈병 위르캣 세포로 정맥내 접종하고, 단일 복용(100㎍)의 TRA-8로 처리한다. 그 결과 주입된 위르캣 세포 대부분은, 유량세포분석법에 의해 위르캣 세포의 동일반응계 면역조직화학 체거름(straining)에 의해 측정하는 경우, TRA-8의 처리에 의해 말초혈 및 비장으로부터 제거된다.
두 번째, 인간 성상세포, 1321N1를 SCID 마우스에 피하접종하고, 상기 담암 마우스를 일회량의 TRA-8로 처리한다. 이식된 1321N1 세포의 성장은 종양의 크기 및 조직 분석으로 측정하는 경우, TRA-8 처리된 마우스내에서 상당히 억제된다.
d) TRA-8에 의한 RA 활막 세포의 확인
8명의 RA 환자 및 4명의 OA 환자들로부터 분리된 원발성 활막 세포로 DR5의 세표면 발현 시험을 수행한다. TRA-8은 모든 RA 세포를 양성으로 염색시킬 수 있으나, 모든 OA 세포는 음성으로 염색시킨다. 따라서, RA는 TRA-8로 검출하는 경우, 세포면 발현에 의해 OA와 구별된다.
e) TRA-8에 의한 RA 활막 섬유모세포에서의 세포소멸의 유도
TRA의 RA 활막 세포의 세포소멸 유도능은 다양한 농도의 TRA-8 존재하에서의 생체외배양 도중 세포 생존성 평가에 의해 결정된다. 모든 RA 세포에서 100ng/㎖의 TRA-8에 대한 민감성은 높은 수준 내지는 중간 수준으로 나타났다. 반면, 모든 OA 세포는 본질적으로 TRA-8 유도 세포소멸에 대한 저항성을 갖는다. TRA-8이 강화제에 가용성인 TRAIL 보다 양호한 RA 활막 세포에 대한 세포소멸-유도 활성을 나타냄은 중요하다. 또한, 항-Fas 항체(CH-11)와 비교하여, TRA-8은 RA 활막 세포에 대해 보다 양호한 선택성을 나타냈다.
f) TRA-8은 RA 활막 세포내 MMP의 생성을 유도하지 않는다.
TRA-8은 TNF-a처럼 RA 활막 세포내 NF-kb 활성화를 유도할 수 있으므로, 활막 세포의 MMP1 및 MMP3의 생성에 대한 TRA-8의 영향을 결정한다. TNF-a가 MMPs의 용량-의존성의 증가를 유도하는 반면, TRA-8은 어떠한 MMP 생성도 유도할 수 없으며, 일부 농도의 TRA-8은 RA 활막 세포에서의 MMP 생성을 약간 감소시켰다.
g) TRA-8은 다중 카스파제 활성화를 유도한다.
카스파제는 세포소멸의 유도에 있어서 결정적인 역할을 한다. TRA-8의 카스파제 활성화 유도능은 인간의 위르캣 세포에서 결정된다. 위르캣 세포가 적은 분량(50ng/㎖)의 TRA-8로 배양되는 경우, 카스파제 8, 카스파제 9 및 카스파제 3의 활성화는 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석 및 카스파제 제거 분석에 의해 15분만에 관찰된다. 시간, 카스파제 활성의 수 및 강도의 관점에서, 예시적 항체 TRA-8을 포함하는 본 발명의 항체는 항-인간 Fas 항체(CH-11)와 같이 임의의 기타 공지된 세포소멸-유도 항체보다 훨씬 양호한 활성을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 항체는 효과 (a) 및 (g)에서 보여주는 바와 같이 병원 세포의 세포소멸을 선택적으로 유도하는 특성을 갖는 물질이다. 따라서, 세포의 부적절한 생존 또는 세포의 부적절한 증식과 관련된 질병, 예를 들어 Fas/Fas 리간드 시스템을 포함하는 세포소멸 시스템의 조절이상에 기인하는 질병을 위한 예방약 및 치료제로서 유용하다.
본 발명의 항체의 세포소멸 유도능은, 시험 샘플이 첨가된 배지 내에서 인간 백혈병 세포계 위르캣(미국 유형 배양 번호 TIB-152) 및 성상세포계 1321N1과 같은 세포를 배양시키고, 생존성을 예를 들어 ATPLite 평가로 측정함으로써 확인된다.
본 발명의 항체, 특히 인간 항체와 거의 동일한 면역원성을 갖는 항-DR5 항체는 자가면역 질병에서의 세포소멸 시스템의 조절 이상에 기인하는 질병, 예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토병(Hashimoto's disease), 류마티스성 관절염, 이식편대숙주병, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 악성 빈혈, 애디슨병(Addison disease), 피부경화증, 굿파스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome), 크론병(Crohn's disease), 자가면역 용혈성 빈혈, 불임증, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도병(Basedow's disease), 혈소판 자반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 알레르기; 아토피병; 동맥경화증; 심근염; 심근병증; 사구체성 신염; 재생 불량성 빈혈; 장기이식후 거부반응 및 페, 전립선, 간, 난소, 림프 및 유방 조직의 많은 악성 종양을 포함하는, 세포의 부적절한 생존 또는 증식과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 약품으로서 사용된다.
이러한 예방제 또는 치료제는 다양한 형태로 투여될 수 있다. 적당한 투여방식은 경구투여(예를 들어, 정, 캡슐, 과립, 분말 및 시럽으로 투여됨) 또는 비경구 투여(예를 들어, 주사, 적하 주사 및 좌약으로 투여됨)를 포함한다.
항체 또는 치료제는 복강내 주사, 경피투여, 흡입 또는 구강 또는 비강 분무에 의해 경구, 직장, 심장내, 경막내, 질내, 비경구(정맥내, 근내 또는 피하적), 국부(분말, 연고 또는 점적제)로 투여될 수 있다. 항체 또는 치료제의 정확한 요구량은 환자의 나이, 체중 및 일반적 상태, 치료할 질병의 심각성, 종양의 위치 및 크기, 사용되는 특정 화합물 및 투여 방식 등에 따라 각각 다를 것이다. 적절한 양은 당해 분야의 숙련자들에 의해 본원에 교시된 통상적인 실험법만을 사용하여결정될 수 있다. 항체의 전형적인 1회분량은 0.1 내지 10,000μg, 바람직하게는 1 내지 100μg이다. 전형적인 담체내 항체의 농도는 운반된 ㎖ 당 0.2 내지 2000ng이다.
목적하는 투여 방식에 따라, 상기 항체 또는 치료제는, 고체, 반고체 또는 액체 투약 형태, 예를 들어 정, 좌약, 알약, 캡슐, 분말, 액체 또는 현탁액 형태, 바람직하게는 정확한 분량으로 단일 투여하기에 적당한 단위 분량의 형태의 약학 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 선택된 기질을 효과량으로 포함할 것이며, 이외에도 기타 의약제, 약학제, 담체 또는 희석액을 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한"이라는 용어는 생물학적으로 또는 다르게 바람직하지 않은 물질이 아닌 것을 의미하며, 이는 매우 바람직하지 못한 생물학적 영향의 유발, 또는 이들 물질에 함유된 상기 약학 조성물중 임의의 다른 성분들간의 해로운 방식의 상호작용 없이, 선택된 물질에 따라 개별적으로 투여될 수 있다.
비경구 주사에 적당한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 멸균 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 멸균 주사용액 또는 분산액으로의 재구성을 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적당한 수성 및 비수성 담체, 희석액, 용매 또는 운반액의 예는 물, 에탄올, 폴리올계(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 글리세롤 등), 이들의 적당한 혼합물, 식용유(예를 들어, 올리브 유) 및 에틸 올리에이트와 같은 주사가능 유기 에스테르를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 피막을 사용하고, 분산액인 경우 요구되는 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용함으로써 적당한 유동성을 유지시킬 수 있다.
또한, 상기 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수도 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산 등으로 미생물의 활동을 예방할 수 있다. 또한, 등장제, 예를 들어 설탕 및 나트륨 클로라이드 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 주사가능한 약학적 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여형태는 캡슐, 정, 환, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여형태인 경우에는 상기 활성 화합물을, 통상적인 불활성 부형제(또는 담체)(예를 들어 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트) 하나 이상, 또는 (a) 녹말, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 마니톨 및 규산과 같은 충진제 또는 증량제, (b) 카복실메틸셀룰로오스, 알리그네이트(alignate), 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스 및 아카시아와 같은 결합제, (c) 글리세롤과 같은 습윤제(humectant), (d) 우뭇가사리, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 녹말, 알긴산, 특정 착물 규산염 및 나트륨 카보네이트와 같은 붕해제, (e) 파라핀과 같은 용해 억제제, (f) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제, (g) 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제(wetting agent), (h) 카올린 및 벤토나이트와 같은 흡착제, 및 (i) 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 또는 이들의 혼합물과 같은 윤활제와 혼합시킨다. 캡슐, 정 및 환의 경우에는, 상기 투여형태가 완충제 또한 포함할 수있다.
또한, 락토오스 또는 유당과 및 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 등의 부형제를 사용한 연질 충진 및 경질 충진된 젤라틴 캡슐에서 유사한 유형의 고체 조성물을 충진제로서 사용할 수도 있다.
정, 당의정, 캡슐, 환 및 과립과 같은 고체 투여형태는 장용피막 및 당해 분야에 익히 공지된 기타물질과 같은, 피막 및 외피를 사용하여 제조할 수 있다. 이들은 불투명화제(opacifying agent)를 함유할 수 있고, 지연된 방식으로 위장관의 특정 부분에 활성 화합물(들)을 유리시키는 조성물일 수도 있다. 사용될 수 있는 내장형 조성물의 예는 중합성 물질 및 왁스이다. 또한, 상기 활성 화합물은 경우에 따라 전술한 부형제 하나 이상을 포함하는 미소캡슐화된 형태일 수 있다.
경구투여를 위한 액체 투여형태는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 상기 활성 화합물 이외에도, 액체 투여형태는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석액(예를 들어, 물 또는 기타 용매), 용해제 및 유화제(예를 들어, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(구체적으로, 목화씨 오일, 땅콩유, 옥수수유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퍼퓨릴 알콜, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
이러한 불활성 희석액 이외에도, 상기 조성물은 습윤제, 유화 및 현탁제, 감미료, 조미료 및 향료와 같은 보조제를 포함할 수도 있다.
활성 화합물 이외에도, 현탁액은 현탁제(예를 들어, 에틸옥실화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르), 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 우뭇가사리 및 트래거캔스(tragacanth) 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
직장투여를 위한 조성물은 바람직하게는 본 발명의 화합물과 적당한 무자극 부형제 또는 담체(예를 들어, 코코아 버터, 폴리에틸렌글리콜 또는 좌약 왁스)의 혼합에 의해 제조될 수 있는 좌약이며, 이들은 상온에서 고체이지만 체온에서는 액체이므로 직장 또는 질 공동에서 용융하여 활성 화합물을 유리시킨다.
본 발명의 화합물을 국소투여하기 위한 투여형태는 연고, 분말, 분무 및 흡입제를 포함한다. 상기 활성화합물은 경우에 따라 멸균 상태하에서 생리학적으로 허용가능한 담체 및 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 범주에 포함되는 한, 안약 조성물, 안구 연고, 분말 및 용액을 고려할 수도 있다.
본원에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 아미드 및 전구약물"이라는 용어는 본 발명의 화합물의 카복실레이트 염, 아미노산 첨가염, 에스테르, 아미드 및 전구약물을 지칭하며, 이들은 유효한 의약법의 범주안에서 합리적인 유익 대비 위험비를 가져 과도한 유독성, 자극 및 알러지 반응 등 없이 환자의 조직에 접촉시키는 용도, 및 이들의 확장된 용도 뿐만 아니라 가능한 본 발명의 화합물을 쯔비터이온 형태로 사용하기에 적당하다. 상기 "염"이라는 용어는 본 발명의화합물의 비교적 무독성의, 무기 및 유기산 첨가염을 지칭한다. 상기 염은 상기 화합물의 최종 분리 및 정제과정 도중 동일 반응계에서 제조되거나, 자유 염기 형태의 상기 정제된 화합물과 적당한 유기 또는 무기산과의 반응, 및 이로써 형성된 염의 분리를 개별적으로 수행함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 비설페이트, 니트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발러레이트, 올리에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말리에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타트레이트, 나프틸레이트 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 메탄 설포네이트 및 라우릴설포네이트 염 등을 포함한다. 이들은 알칼리 및 알칼리 토금속 계열의 양이온, 예를 들어 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 등 뿐만 아니라, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민 및 에틸아민 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 무독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함할 수 있다(예를 들어, 본원의 참조문헌으로 인용된 바르게(S.M. Barge) 등의 문헌["Pharmaceutical Salts",J. Pharm. Sci., 1977, 66:1-19]을 참조한다).
상기 "전구약물"이라는 용어는, 예를 들어 혈액내 가수분해에 의해 생체내에서 신속히 변형되어 상기 화합물의 어미화합물을 생성하는 화합물을 지칭한다. 이에 대한 연구는 히구치(T. Higuchi) 및 스텔라(V. Stella)의 문헌["Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S Symposium Series, and inBioreversilble Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 제공된다.
표적세포는, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 쥐, 생쥐, 돼지쥐, 토끼, 염소, 암소, 말, 닭, 돼지, 명주원숭이 및 흰족제비를 포함하는 동물의 세포이다.
또한, 본 발명의 항체 또는 치료제는 약학적으로 허용가능한 용매, 예를 들어 물 및 에탄올 등으로 용매화되거나 용매화되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 목적을 위해서는 상기 용매화된 형태와 용매화되지 않은 형태가 동등한 것으로 간주된다.
항체 분자는, 예를 들어 아미노 흡수 또는 아미노 친화 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피법 또는 이들의 조합물을 포함하는 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 생물학적으로 활성인 항-TRAIL 수용체항체 또는 인간화된 항-TRAIL 수용체항체를 척추동맥으로 전달시키는 용도의 약학 생성물을 포함한다. 상기 약학 생성물은 약학적으로 효과적인 양의 항-TRAIL 수용체항체 또는 이들의 분절, 약학적으로 허용가능한 담체, 및 상기 담체 및 항체를 멸균 상태로 동봉한 용기를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 약학적으로 효과적인 양의 항-DR5 항체는 표적세포와의 접촉에 의한 세포 증식을 억제시킨다. DR5 인식 항체 또는 DR5 인식 인간화된 항체의 약학적으로 효과적인 양은 개인에게 투여되어 바람직한 효과를 유발하기에 충분한 양이다. DR5 인식 항체의 약학적으로 효과적인 양을 투여함으로써 수득되는 바람직한 효과는 표적세포사, 표적세포의 성장 억제, DR5의 자극, DR5로의 결합 및 표적세포에서의 증가된 NFκB 수치 또는 활성을 포함한다. 표적 세포는 DR5를 발현하고, 예를 들어 비정상적으로 증식하는 세포, 및 유두종 및 사마귀; 유방암, 결장암, 간암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 골수종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 머리 및 목의 종양, 갑상선암, 장궁암 및 뇌의 종양(예를 들어, 아스트로시토마스(astrocytomas)와 같은 악성 종양을 포함하는 세포이다. 생체내에서, 상기 표적세포는, 예를 들어 악성 또는 양성 종양 및 류마티스성 관절염과 같이 비정상적인 세포증식 또는 조절이상을 포함하는 병리학적인 상태를 갖는 개체의 세포이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 표적세포를 치료제와 접촉시킬 수도 있다.
치료제는 병리학적 상태를 개선시키는데 효과적인 화합물 또는 조성물이다. 치료제의 대표적인 예는 항암 화합물을 포함한다.
항암 화합물은 비정상적으로 증식하는 세포의 증식을 억제하거나 제거하는 데 효과적인 화합물 또는 조성물이다. 항암 화합물의 약학적으로 효과적인 양은 개체에 투여되어 비정상적으로 증식하는 세포의 증식 억제 또는 제거를 유발하기에 충분한 양이다. 항암 화합물의 대표적인 예는: 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 닥티노마이신, 디에틸스틸베스트롤 독소루비신, 에토포사이드, 5-플루오로우라실, 프록스우리딘, 멜파란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포사이드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다. 항암 화합물 및 치료제의 추가예는문헌[The Merck Manual of Dialgnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow 등., eds 1987, Rahway, N. J. and Sladek 등, Metabolism and Action of Anti-Cancer Drug, 1987, Powis 등. eds., Tayor and Francis, New York, N.Y]에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 기타 치료요법, 예를 들어 악성 치료에서의 화학요법 및 방사선 치료요법과 추가로 조합될 수 있으며, 치료 효능은 세포소멸-유도 화합물, 예를 들어 비스인돌릴말레이미드Ⅷ에 의해 향상될 수 있다.
앞서 발표된 항 DR5 항체(24)와 비교하여, 본 발명의 예시적인 TRA-8 항체의 세포소멸-유도 활성은 매우 강하고, 생체 외부의 pg/㎖ 수치를 갖는 위르캣 세포의 세포소멸을 유도할 수 있으며, 앞서 보고된 가용성 TRAIL과 비교하여 보다 우월한 생체내 종양 억제 활성을 나타낸다. TRA-8의 일회분량을 정맥 투여하는 것은 고체 종양 및 조혈성 종양 세포 모두의 증식을 억제하기에 충분한 반면, 가용성 TRAIL을 사용하여 생체내 종양 퇴보를 유도하기 위해서는 훨씬 많은 분량(10일 동안 매일 500ug)이 요구된다. 예시 항체 TRA-8은 비변형 섬유모세포의 세포소멸을 유도하지 않으므로 본 발명의 항-TRAIL 수용체항체는 가용성 TRAIL만큼 안전한 것으로 여겨진다.
본 발명의 벡터는, 촉진제 또는 강화제와 같은 조절 요소에 작동가능하게 연결된 항-DR5 항체의 중사슬 또는 경사슬 면역글로불린을 부호화시키는 핵산 서열을 포함한다. 상기 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 이들이 통상적인 기능을 수행하도록 배열된 뉴클레오티드 서열의 배치를 의미한다. 따라서, 폴리펩티드를 부호화시키는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 원소는 상기 폴리펩티드의 전사, 복사 및/또는 번역을 지시할 수 있다. 당해 분야의 숙련자들은 단일 벡터가 항-DR5 항체의 중사슬 및 경사슬 면역 글로불린 모두를 위한 부호화 서열을 임의적으로 포함함을 인식할 것이다.
본 발명에 따른 방법 및 결과를 예시하기 위해 하기 실시예를 기술한다. 상기 실시예들은 본 발명의 모든 양태들을 포함하는 것이 아니라 대표적인 방법 및 결과를 예시하고자 함이다. 상기 실시예들은 본 발명의 동등물 및 변형물을 배제시키고자 함이 아니며, 이는 당해 분야의 숙련자들에게 명백히 인식될 것이다.
실시예 1. DR5 항원의 제조
1.1 DR5 cDNA의 클로닝
인간 DR5 단백질을 부호화시키는 DNA를 다음을 사용한 하기 RT-PCR 방법으로 클로닝시켰다:
a) 주형
HeLa 세포의 총 RNA를 TRIzol 시약(GIBCO BRL)을 사용하여 추출하였다. 상기 PCR 반응을 위한 주형으로 제 1 가닥 cDNA 합성 키트(아머샴 파마샤 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech) 제조)를 사용설명서에 따라 사용함으로써 수득된 cDNA를 사용하였다.
b) PCR 프라이머
상기 PCR을 위한 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
달리 지정되지 않는 한, 하기 실시예의 모든 올리고뉴클레오티드는 라이프테크놀로지(Lifetechnology)에 의해 합성되었다. 모든 올리고뉴클레오티드를 증류수에 용해시킨 후 -20℃에서 보관하였다.
c) PCR 반응
PCR 반응 용액의 조성:
주형 cDNA, 총 33㎕ 반응물 중 5㎕; 프라이머 DR5p1, 10pmol; 프라이머 DR5p2, 10pmol; 10x의 농축된 PCR 완충제(키트에 제공됨), 10㎕; dNTP(각각 2.5mM), 4㎕; 및 Taq 폴리머라제(프로메가), 5 유니트.
상기 용액에 총 부피가 100㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 달리 지정되지 않는 한, dNTP는 동일한 몰의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(각각 2.5mM)의 혼합물이다.
상기 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 우선, 상기 용액에 대하여 94℃에서 30초, 52℃에서 1분, 72℃에서 3분 동안의 가열 주기를 40회 반복 수행한 후, 94℃에서 2분 동안 가열하였다. 상기 과정이 완결된 후, 반응 용액을 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
이로써 수득된, 확장된 DNA 분절을 0.25μg /㎖ 에티디움 브로마이드를 함유하는 1% 아카로우스 젤 상에서 분리시켰다. 목적하는 DNA 분절을 함유한 것으로결정된 띠를 레이저 절단기로 잘라내고 유전자 세척 키트(Gene Clean Kit)(BIO101)를 사용하여 상기 DNA를 회수하였다. 상기 DNA 분절을 TA 클로닝 키트(인비트로겐, CA)를 사용하여 클로닝시켰다. 이를 다음과 같이 수행하였다.
상기 TA 클로닝 키트와 함께 제공된 pCR2.1 벡터 50ng과 함께, 상기 PCR 반응 용액으로부터 회수한 DNA 분절을, T4 DNA 리가제(1㎕) 4 유니트를 첨가한 10 X 리가제 반응 완충액(6mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6mM 마그네슘 클로라이드, 5mM 나트륨 클로라이드, 7mM β-머캅토에탄올, 0.1mM ATP, 2mM DTT, 1mM 스페르미딘 및 보빈 세럼 알부민 0.1mg/㎖) 1㎕와 혼합시켰다. 멸균 탈이온수를 사용하여 상기 혼합물의 총 부피가 10㎕가 되도록 조정하고, 생성된 리가제 용액을 14℃에서 15시간 동안 배양하였다. 15시간 후, 상기 TA 클로닝 키트와 함게 제공된 상기 리가제 반응 용액 중 2㎕를, 0.5M β-머캅토에탄올을 2㎕를 첨가한 TA 클로닝 키트에 제공된 컴피턴트(competent) 이. 콜라이 균주 TOP10F' 50㎕에 첨가하고, 사용설명서에 따라 처리한 다음, 생성된 혼합물을 30분 동안 얼음으로 유지시키고, 30초 동안 42℃에서 유지시킨 다음, 다시 5분 동안 얼음에서 유지시켰다. 다음, 2% v/v 트립톤, 0.5% w/v 이스트 추출물, 0.05% w/v 나트륨 클로라이드, 2.5mM 칼륨 클로라이드, 1mM 마그네슘 클로라이드 및 20mM 글루코스(이후로 "SOC" 배지이라 지칭됨)를 함유하는 배지 500㎕를, 상기 배양액에 첨가하고, 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 흔들면서 배양시켰다. 1시간 후, 상기 배양액을 L-브로Tm 세균 배양기 판에 100μg/㎖을 함유하도록 칠하였다(1% v/v 트립톤, 0.5% w/v 이스트 추출물, 0.5% w/v 나트륨 클로라이드, 0.1% w/v 글루코스 및 0.6% w/v 박토-아가(Difco)). 상기판상에서 암피실린 저항성을 갖는 콜로니를 선택하고 백금 전달 고리로 벗겨내고, 암피실린 100μg/㎖을 함유하는 37℃의 L-브로쓰 배지에서 밤새 200 r.p.m의 속도로 흔들면서 배양시켰다. 배양 후, 원심 분리를 이용하여 세포를 채취하고, 알칼리법을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 이로써 수득된 플라스미드로부터의 ecoRI-EcoRI DR5cDNA 분절을 pcDNA3 플라스미드(인비트로겐, CA)로 아클론화시켰다. pcDNA3내 상기 DR5 유전자의 전체 길이를 나열하여 원형 서열과 일치시켰다. 이로써 수득된 플라스미드를 플라스미드 pcDNA3-DR5로서 지명하였다.
1.2 DR5-IgG 발현 벡터의 구성
막횡단 도메인이 결핍된 인간 DR5의 가용성 형태를 수득하기 위해, 발현 플라스미드 벡터를 제조한다. 이러한 벡터는 인간 IgGl Fc DNA(41)에 융합된 인간 DR5의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하도록 디자인된다. 막횡단 도메인이 결핍된 인간 DR5를 인코딩하는 DNA는 하기 PCR 반응에 따라 수득된다.
a) 주형
PCT 반응을 위한 주형은 pcDNA3-DR5를 사용하였다.
b) PCR 프라이머
하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 합성하였다:
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본 실시예에서 모든 올리고뉴클레오티드는 라이프테크놀로지(Lifetechnologies)에 의해 합성된다. 모든 올리고뉴클레오티드는 희석된 물속에 용해시킨 후 -20℃에서 저장한다.
c) PCT 반응
PCT 반응을 수행하고 실시예 1.1(c)에 따라 단리된 DNA를 증폭시킨다.
이렇게 수득된 플라스미드를 플라스미드 pCR-ΔDR5로 지칭한다. BamHI-EcoRI 단편 인코딩된 인간 Fc 단편(pmFas-hIgGlFc로부터 회수됨)을 pcDNA3의 BamHI 및 EcoRI 멀티-클로닝 자리로 서브클로닝한다. 이렇게 수득된 플라스미드를 pcDNAFc로 지칭한다. 또한, 인간 가용성 DR5 영역을 인코딩하는 BamHI-BamHI 단편(pCR-ΔDR5로부터 회수됨)를 pcDNAFc 플라스미드의 BamHI 자리로 서브클로닝한다. 이렇게 수득된 플라스미드를 플라스미드 pcDNAΔDR5-Fc로 지칭한다. 인간 가용성 DR5-인간 IgG Fc 영역을 인코딩하는 EcoRI 단편(pcDNAΔDR5-Fc 플라스미드로부터 회수됨)을 DNA 폴리머라제 Klenow 단편(GIBCO BRL)을 사용하여 둔단(鈍端)시킨 후, 셔틀벡터 pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., 캐나다 소재)로 서브클로닝하고, 이를 BamHI에 의해 절단한 후 둔단시킨다. 이렇게 수득된 플라스미드를 pAdΔDR5-Fc로 지칭한다.
1.3 인간 DR5-IgGl 융합 단백질의 발현 및 정제
QBI-293A 세포(ADENO-Quest 키트와 함께 제공됨)를 ADENO-Quest 키트(Quantum Biotechnologies, Inc., 캐나다 소재)를 지침서에 따라 사용하여 pAdΔDR5-Fc 및 QBI-바이러스성 DNA(ADENO-Quest 키트와 함께 제공됨)와 함께 공-이입한다. 재조합 바이러스 플라크를 배양하고 DR5-IgG 융합 단백질의 발현을 위해 상청액의 ELISA 분석에 의해 스크리닝한다. 양성 플라크를 QBI-293A 세포중 증폭시키고 바이러스 스톡으로서 -80℃에서 저장한다. QBI-293A 세포 50 디시(150mm)에 pAdΔDR5-Fc 재조합 바이러스를 10 m.o.i.(감염다중도; Multiplicity of Infection)로 이입시킨다. 48시간 동안 이입 후 배지를 수확한다.
DR5-IgG 유전자를 갖는 이입된 세포는 2일 동안 5% v/v CO2의 분위기에서 10% v/v FCS를 함유하는 DMEM (GIBCO) 배지 500㎖중 37℃에서 항온처리에 의해 1 ×106세포/㎖의 세포밀도까지 성장한다. 이어서 배지를 원심분리하고(1,000 rpm, 5분) 상청액을 수거한다. 상청액으로부터 DR5-IgG를 하기 조건하에서 ProteinA-Sepharose CL-4B 친화 크로마토그래피(Pharmacia)를 사용하여 정제한다.
칼럼: ProteinA-Sepharose CL-4B 칼럼(칼럼 크기 2 ml; Pharmacia);
용리 완충액: 0.1M 글리신(pH 2.4), 0.15 M NaCl;
중화 완충액: 1M Tris-HCl (pH 8.5).
상청액 모두를 상기 칼럼에 적용한 후, PBS 20㎖로 3회 세척한 후 용리 완충액 1㎖를 10회 첨가한다. 각각의 용리된 분획(1㎖)의 광학 밀도를 측정한다. 제 2 내지 제 5 분획을 수거하고(OD280≥0.1) 중화 완충액 100㎕를 첨가한 후, 용출물을 투석 튜빙에 별도로 놓고 용출물을 4℃에서 PBS(pH 7.5) 1ℓ에 대해 투석한다. 투석 완충액은 2회 교환한다.
이어서 용출물을 ELISA에 의한 DR5-IgG 유전자 생성물의 발현에 대해 평가한다. 우선, 각 단편 100㎕를 96-웰 마이크로플레이트(Costar)의 웰 안으로 별도로 두고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 웰에서 용액을 제거하고 플레이트를 0.1% v/v Tween 20을 함유하는 PBS(이후, "PBS-Tween"로 칭함) 100㎕/웰로 3회 세척한다. 세척 후, 2% w/v 소혈청 알부민(이후 "BSA"라 칭함)을 함유하는 PBS를 100㎕/웰의 양으로 첨가하고 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 그 후, 웰을 PBS-Tween 100㎕/웰로 3회 추가로 세척한 후 PBS-Tween으로 1000배 희석된 항-인간 IgGI 단일클론성 항체의 용액 100㎕/웰을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 한번 더 항온처리하였다. 이어서 웰을 PBS-Tween 100 ㎕/웰로 3회 세척한다. 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(이후, "TMB"라 칭함) 액체 기질 시스템(Sigma)을 100㎕/웰의 양으로 첨가하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 정치하고 반응을 0.2N H2SO4100㎕/웰을 첨가하여 종결시켰다. 각 웰의 흡수도는 450nm에서 판독되었으며 대조 판독으로서 650nm에서의 흡수도를 사용하여 결합 항체의 농도를 측정하였다. 흡수도를 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 측정한다. DR5-IgGl의 생성은 이러한 ELISA 방법을 사용하여 확인된다. 발현된 DR5-IgGl 융합 단백질의 분자량은 웨스턴 블로팅 분석(western blotting analysis)을 사용하여 측정한다(이때, 항-인간 IgG1 mAb(Sigma)가 겔상의 항체를 검출하기 위해 사용됨). 발현된 DR5-IgGl 융합 단백질의 분자량은 약 50kDa이었다. 달성된 순도는 SDS-PAGE상의 분석 및 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색에 의해 단백질을 검출하는 것에 의해 평가했을 때 90% 이상이었다.
실시예 2: 인간 DR5에 대한 단일클론성 항체의 발생
2.1 접종
6 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스(Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버 소재)에 친화-정제된 인간 DR5/hIgGl 융합 단백질을 접종하였다. 초기 푸트-패드(foot-pad) 접종동안, 융합 단백질(50 ㎍)을 프룬드(Freund) 주형 보조제(Difco, 미국 미시간주 디트로이트 소재)중에 유화시킨다. 이어서 마우스를 하루 걸러서 보조제 없이 투여된 융합 단백질 50㎍의 4회 주입으로 추가 접종하였다. 마지막 주입 후 3일째, 국소 림프절로부터의 림프구를 NS-1 골수종 세포와 융합시키고 하이브리도마를 10% 소태아혈청이 보충된 F104 배지중에 배양한다 양성 하이브리도마는 ELISA에 의해 선택되며, 이때 플레이트를 1 ㎍/ml DR5/hIgGl 또는 대조군으로서 동량의 Fas/hIgGl로 코팅한다. 하이브리도마의 동종형을 마우스 Ig 동종형-특이성 염소 항체 패널(Southern Biotechnology, Birmingham, AL)을 사용하여 ELISA에 의해 측정한다. 단일클로닝 항체는 부동화 항-마우스 IgG1 또는 단백질 G(Sigma)를 사용하여 친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
2.2 세포 융합
추가접종후 3일째, 국소 림프절을 마우스로부터 제거하고, 페니실린 50 유닛/ml, 스트렙토마이신 50 ㎍/ml, 및 L-글루탐산 300 ㎍/㎖을 함유하는 혈청-비함유 RPMI 1640 배지(GIBCO BRL) 10㎖ 안에 넣고 약수저를 사용하여 기관을 메쉬(Cell Strainer ; Falcon)를 통과시켜 분쇄하였다. 생성된 세포 현탁액을 원심분리하여 국소 림프절 세포를 작은 알갱이로 만든 다음 혈청-비함유 RPMI 배지로 2회 세척하였다. 이어서 세척된 세포를 혈청-비함유 RPMI 배지중에 재현탁시키고 계수하였다.
그러는 동안, 골수종 NS1세포(American Type Culture Collection TIB-18)는 5% v/v CO2하에 37℃에서 10% v/v FCS(Gibco BRL)를 함유하는 ASF104 배지(Ajinomoto, K.K.)("혈청을 함유하는 ASF 배지")중 1×108세포/㎖를 초과하지 않는 세포 밀도까지 성장하였고, 이들을 또한 부수고 세척하고 재현탁시키고 계수하였다.
3 ×107세포수를 함유하도록 계산된 NS1 세포 현탁액의 양을 3 × 108세포를 함유하도록 계산된 비장 세포 현탁액의 양과 혼합한다. 생성된 혼합물을 원심분리하고 상청액을 따라 부었다. 세포 융합의 다음 단계를 수행하면서 매번 펠렛을 함유하는 플라스틱 시험관을 온수 비이커중에서 37℃로 유지하였다.
50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 1500(Boehringer Manheim) 1㎖를 서서히 상기 시험관에 가하는 내내, 펠렛을 피펫 끝을 사용하여 교반한다. 후속적으로, 37℃까지 미리 데운 혈청-비함유 RPMI 배지 1㎖를 2회로 서서히 가한 후 혈청-비함유 RPMI 배지 7㎖를 추가로 첨가한다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 따라내고 10% v/v FCS를 함유하는 HAT 배지 10㎖를 첨가하면서 피펫 끝으로 부드럽게 교반한다. 10% v/v FCS를 함유하는 HAT 배지를 추가로 20㎖ 첨가하고, 현탁액을 100㎕/웰에서 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트 안으로 분배하고 5% v/v CO2분위기에서 37℃에서 항온처리한다. 7 또는 8일 후, 새로운 HAT 배지 100㎕/웰을 사용하여 황색을 나타내는 임의의 웰중에 배지를 교체한다. 이들 웰로부터의 융합 세포를 이후 설명하는 한계 희석에 의해 클로닝한다.
2.3 한계 희석에 의한 클로닝
4 내지 10주령 암컷 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)로부터 흉선을 제거하고 상기한 바와 같이 메쉬(Cell Strainer ; Falcon)상에서 부수고, 분쇄된 세포를 10% v/v FCS를 함유하는 HT 배지로 2회 세척한다. 하나의 마우스로부터의 흉선 세포에 해당하는 흉선 세포의 양을 10% v/v FCS를 함유하는 HT 배지 30㎖중에 현탁하여 피더 세포 현탁액을 생성한다. 실시예 2.2에서 상기 수득한 융합 세포 제제를 이러한 피더 세포 현탁액으로 10 내지 100배 희석하고 피더 세포 현탁액으로 일련으로 추가로 희석하여 5, 1 및 0.5 세포/㎖의 융합 세포 밀도를 갖는 현탁액을 제조한다. 이렇게 제조한 샘플을 100㎕/웰에서 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 웰 안으로 분배하고 5% v/v CO2하에 37℃에서 5일 동안 항온처리한다.
2.4 스크리닝
성장 하이브리도마로부터의 배양 상청액을 1 ㎍/ml DR5/hIgGl 또는 대조군으로서 동량의 Fas/hIgGl(41)로 코팅된 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 스크리닝한다. 결합 항체를 기질로서 TMB(Sigma, 미국 미시간주 세이트 루이스 소재)와 함께 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-마우스 면역 글로블린(Southern Biotechnology, Birmingham, AL)을 사용하여 검출한다. 1㎍/㎖의 농도에서 정제된 DR5-IgG1 또는 동량의 Fas-hIgGl을 96-웰 ELISA/RIA STRIP PLATE (Costar, 뉴욕) 웰에 도입한다. 상기 플레이트를 밤새 4℃에서 정치하여 단백질이 웰 표면에 흡착되도록 한다. 그 후, 웰중 용액을 따라내고 각 웰을 PBS-Tween으로 3회 세척한다. 이어서, 1%(w/v) 소혈청 알부민(A3803 ; Sigma Chemicals Co.)을 함유하는 PBS 100㎕을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 이어서 웰을 PBS-Tween으로 3회 추가로 세척한 후 성장 하이브리도마로부터 각 배양 상청액 50 ㎕를 각 웰에 첨가한다. 이어서 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 웰을 다시 PBS-Tween으로 4회 세척한다. 세척 후, PBS로 1000배 희석된, 양고추냉이 퍼옥시다제로 라벨이 붙여진 염소 항-마우스 면역글로불린 항체(Southern Biotechnology. Birmingham, AL) 50㎕을 웰당 첨가하고 플레이트를 다시 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 웰을 PBS-Tween으로 4회 다시 세척하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB) 액체 기질 시스템(Sigma)을 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 정치하고 반응을 0.2N H2S04100㎕/웰을 첨가하여 종결시켰다. 450 nm(대조군은 650nm)에서 각 웰의 흡수도를 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 측정하고 융합 세포를 융합 세포 상청액에 전혀 첨가되지 않은 것(OD 값; 약 0.03)보다 확실히 높은 흡수도를 갖는(450 nm-650 nm, OD 값; > 0.5) 샘플로부터 선택한다.
또한, 성장 하이브리도마로부터의 배양 상청액을 위르캣 세포를 사용하여 세포소멸-유도 활성을 측정하여 기능적으로 스크리닝한다. 위르캣 세포를 함유하는 RPMI 배지(웰당 1000 세포) 50㎕ 및 5 μM 비스인돌릴말레이미드 VIII(BisVIII, Alexis, San Diego, CA)를 성장 하이브리도마로부터 배양 상청액 50㎕의 존재하에96 웰 플레이트중에 첨가한다. 세포를 습도조절된 배양기 안에서 37℃에서 밤새 배양한다. 세포소멸은 제조업체(Packard Instruments)에 의해 지시된 바와 같이 ATPLite 키트를 사용하여 세포 생존능력에 의해 측정하고 샘플을 TopCounter(Packard Instruments)를 사용하여 계수한다.
2.5 TRAIL 및 TRA-8의 수용체에 대한 ELISA 결합
ELISA 플레이트를 DR4-Ig 또는 DR5-Ig 융합 단백질 2 ㎍/ml로 밤새 코팅한다. 3% BSA로 블록킹한 후, 가용성 TRAIL-FLAG 또는 TRA-8을 지시된 농도로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. TRAIL 또는 TRA-8의 결합은 HRP-접합된 항-플래그 항체(Alexis) 또는 HRP-접합된 항-뮤린(anti-murine) IgGl (Southern Biotechnology)로 각각 검출한다. 반응은 TMB 기질 완충제에 의해 전개되고 벤치마크 마이크로플레이트 리더(Benchmark Microplate Reader; BioRad)에 의해 측정된다. Kd 값은 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 비선형 회귀법의 한자리 결합 모델에 의해 측정한다. 경쟁 ELISA에 대해, TRAIL-FLAG 100 ng/ml를 첨가하고 다양한 농도의 TRA-8의 존재하에 항온처리한다. TRAIL의 결합은 위에서와 같이 측정한다.
2.6 클로닝
상기 실시예 2.3 및 2.4에서 설명한 단계들을 2.4에서 선택된 세포에 대해 5회 반복하여, 각각이 DR5-IgG을 결합하되 Fas-IgG는 결합하지 않는 단일 항체를 생성하는 몇가지 하이브리도마 클론의 선택을 가능하게 한다. 이러한 선택절차의 결과로서, TRA-8로서 지칭되고 DR5-IgG에 대해 결합하지만 Fas-IgG는 결합하지 않는항체를 생성하는 마우스-마우스 하이브리도마가 수득된다. 이러한 하이브리도마, 즉 TRA-8은 2000년 3월 1일자에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되었고 수탁번호 No. PTA-1428를 부여받았다.
마우스-마우스 하이브리도마 TRA-8(이후 간략히 "TRA-8"이라 칭함)에 의해 생성된 항체의 아류는 단일클론성 항체 동종형 키트(Pierce)로 시험 후 IgGl, κ로 지칭된다.
면역원으로서 인간 DR5-IgGl 융합 단백질을 사용하여, 7개의 하이브리도마 클론을 초기 ELISA 스크리닝에 의해 수득하고, 이들 모두는 DR5-IgG에 대해서는 강하게 양성이지만 Fas-IgG 융합 단백질에 대해서는 그렇지 않았으며, 이는 수득된 하이브리도마가 DR5의 세포외 부분은 인식하지만 IgG1의 Fc 부분은 인식하지 않는(데이타가 나타나지 않음) 항체를 생성함을 나타낸다.
2.7 웨스턴 블롯 분석
정상적인 인간과 암조직 균등질의 웨스턴 블롯 분석을 위한 필터는 제노 테크놀로지(Geno Technology; St Louis, MO)로부터 구입하였다. 각각의 래인에 항-β-악틴 항체에 의해 측정한 동량의 단백질을 적재한다. 블롯을 밤새 1㎍/㎖ TRA-8로 엄밀히 조사하고, 실온에서 1시간 동안 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgGl(Southern Biotechnology)로 조사하고 화학발광에 의해 전개시켰다.
2.8 제자리 면역조직화학
인간 조직을 티슈 프로큐어먼트 센터(Tissue Procurement Center of UAB)로부터 수득한다. 동결된 섹션을 70% 에탄올중에 고정하고 PBS중 10% 말 혈청으로블록킹한 후 실온에서 60분 동안 친화-정제된 TRA-8의 10㎍/㎖으로 항온처리하였다. 색채 기질로서 디아미노벤지딘을 갖는 항-마우스 IgG ABC 키트(Vector, Burlingame, CA)를 사용하여 반응성을 가시화하였다.
2.9 카스파제 활성의 분석
위르캣 세포(l x l06/ml)를 500 ng/ml TRA-8과 함께 항온처리한다. 세포 용해질중 분취액(단백질 30 ㎍)을 15% SDS-PAGE상에서 분리하고 나일론 막상으로 블롯팅하고, 블롯을 항-카스파제 8, 9 및 3 항체(BD Pharmingen, San Diego, CA)로 엄밀히 조사하고, 이어서 HRP-접합된 2차 항체로 조사하고 절단된 생성물을 화학발광 가시화하였다. 카스파제 억제제 세트는 R&D 시스템(R&D Systems; Minneapolis, MN)으로부터 구입한다. 각각의 카스파제 억제제를 지시된 농도에서 배양액에 첨가한다.
실시예 3. TRA-8 단일클론성 항체의 정제
마우스-마우스 하이브리도마(hybridoma), TRA-8을, 5일 동안 5% v/v CO2하에 37℃에서, 10% v/v FCS를 함유하는 ASF 배지 500 ㎖중에서 항온배양시킴으로써 1 × 106세포/㎖의 세포 밀도로 성장시켰다. 그 다음, 배양액을 (1,000r.p.m., 5분 동안) 원심분리하고, 상청액을 수거하였다. 상기 상청액으로부터의 TRA-8을 하기 조건하에서 단백질G-세파로제 CL-4B 친화성 크로마토그래피(파마샤)를 사용하여 정제하였다.
칼럼: 단백질G-세파로제 CL-4B 칼럼 (칼럼 크기 2㎖; 파마샤)
용출 완충액: 0.1 M 글리신 (pH 2.4), 0.15 M NaCl
중화 완충액: 1M Tris-HCl (pH 8. 5).
모든 상청액을 칼럼에 적용하고, PBS 20㎖를 3회 세척한 후, 용출 완충액을 1㎖의 부피로 10회 첨가하였다. 용출된 분획물(1㎖)의 광학 밀도를 측정하였다. 제 2 내지 제 5 분획물(> OD280= 0.1)을 개별적으로 수거하였다.
중화 완충액 100㎕를 첨가한 후, 용출액을 개별적으로 투석하고, 용출액을 4℃에서 PBS(pH 7.5) 1ℓ에 대해 투석하였다. 상기 투석 완충액은 2번 변하였다. 전술된 기술을 사용하여 제조된 상기 인간 DR5-IgG 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의한 상기 샘플의 항-DR5 항체 활성을 검정하였다.
실시예 4. DR4 항원, DR4-IgG 발현 벡터 및 항-DR4 단일클론성 항체의 제조
실시예 1에서 상세하게 기술된 것 대신, DR4 주형 cDNA 및 프라이머를 사용하는 실시예 1 내지 3의 절차를 반복 실시하여 DR4 항원을 수득하며, 이를 실시예 1.2 내지 3에 따라 DR4에 대해 특이적인 단일클론성 항체를 수득하였다.
실시예 5. DcR1 및 DcR2에 대한 단일클론성 항체
유인(decoy) 수용체 DcR1 및 DcR2에 대한 단일클론성 항체는, 실시예 1에 따라 그에 상응하는 cDNA 및 프라이머를 치환시켜 각각의 항원을 생성시킴으로써 증가되었다. 면역 글로불린 G와의 DcR1 또는 DcR2-융합물 및 생성된 정제 단일클론성 항체를 위한 발현 벡터를 실시예 2 및 3에 따라 제조하였다.
실시예 6. 단일클론성 항체의 특이성
TNFR 부류의 TRAIL 및 기타 단백질에 대한 모든 수용체들이 상당한 상동성을 가짐에 따라, DR5에 대한 예시적인 항체 TRA-8의 특이성은, 2개의 상이한 인간 DR5-IgG 융합 단백질 및 가용성 재조합 형태의 기타 관련 단백질을 사용하는 웨스턴 블로팅 분석에 의해 측정하였다. 제 1 DR5-Ig 융합 단백질은 인간 IgG1의 불변 부위를 암호화하는 DR5 및 cDNA의 세포외 부분의 잔기 1 내지 180으로부터 cDNA를 융합시킴으로써 구성되었다. 융합된 cDNA를 재조합 아데노바이러스 벡터로 클로닝하였다(문헌 "Quantum Biotechnogies, Inc., Montreal, Canada"). 50kDa의 상대 분자량을 갖는 발현된 DR5/hIgG1 융합 단백질은, 항-인간 IgG 친화성 칼럼(미져리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma))을 사용하여 정제하였다. 특이성에 관한 웨스턴 블로팅 분석을 위해, 제 2 재조합 인간 DR5/IgG1 융합 단백질(aa. 52 내지 212) 뿐만 아니라 TRAIL-R1, R3 및 R4 융합 단백질을 알렉시스(Alexis)로부터 구입하였다. 가용성 형태의 인간 Fas 및 TNFR1은 미국 캘리포니아주 싸우전즈 오크 소재의 암겐 인코포레이티드(Amgen, Inc.)의 칼 박사(Dr. Carl Edwards)에게서 친절하게 공급받았다. 사용되는 가용성 재조합 인간 DR4, DcR1, DcR2, TNFR1, R4, 및 Fas 분자는 인간 IgG1 융합 단백질이었다. 각각의 단백질 0.5㎍을 10%의 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로즈 막 위에 블로팅시켰다. 상기 블로팅 생성물을 1시간 동안 실온에서 PBS중에 5% 건조 우유로 블로킹시키고, 밤새도록 4℃에서 정제된 단일클론성 항-DR5 항체(클론: TRA-8) 1㎍/㎖ 또는 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG 0.1㎍/㎖로 탐침하였다. 호르세라디쉬-퍼옥시다제(Horseradish-peroxidase, HRP)-접합된 염소 항-마우스 IgG를, 결합된 TRA-8을 검출하기 위한 제 2 항체로서사용하였다. 블로팅 생성물을 화학발광(chemiluminescence)에 의해 전개시켰다.
전장(full-length) DR5 또는 DR4를 함유하는 pcDNA3 벡터(캘리포니아 팔로 알토 소재의 클론테크(Clontech)), 또는 엠프티(empty) 벡터로 세포감염된 Cos-7 세포가 유세포분석(flow cytometry analysis)을 위해 사용되었다. 전장 cDNA 암호화 인간 TRAIL 또는 뮤린 Fas 리간드를 테트라사이클린-제어가능한 프로모터(클린테크)의 pTRE 벡터 다운스트림으로 클로닝시켰다. pTRE-hTRAIL 또는 pTRE-mFasL의 XhoI-HindIII 단편을 아데노바이러스 셔틀(shuttle) 벡터 pAdBN(퀀툼 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Quantum Biotechnologies, Inc.))으로 추가로 클로닝시켰다. 293개의 숙주 세포를 선형의 pAd-TRE-hTRAIL 또는 pAd-TRE-mFasL 및 아데노바이러스의 큰 단편 DNA로 동시에 세포감염시켰다. 재조합 바이러스 플라크로부터의 기능성 인간 TRAIL 또는 뮤린 Fas 리간드를, 표적으로서 위르캣을 사용하는51Cr-릴리이즈 검정을 사용하여 선별하였다.
TRA-8은 도 1a에서 도시된 바와 같이 면역을 위해 사용되는 DR5-IgG 융합 단백질(약 50kDa)과 강하게 반응하고(DR5, #1), 도 1a에서 도시된 바와 같이 제 2 DR5-IgG 융합 단백질(약 60kDa)과는 약하게 반응하였다(DR5, #2). DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) 또는 TNFRI와 TRA-8의 의미있는 결합은 없었다. 이들 결과에서는, TRA-8이 DR5에 대해 특이적이지만 기타 부류의 일원과는 공유하지 않는 에피토프(epitope)인 것으로 나타났다.
TRA-8은 TNF 수용체 상위 부류(superfamily)의 일원, 예컨대 Fas (CD95) 및TNF 수용체 I과 반응하지 않거나, 또는 TRA-8은 450nm 및 650nm의 광학 흡수율에 의해 제시되는 바와 같이 DR5의 뮤린 동족체(homologue)와 교차-반응하지 않으며, 여기서 저부 패널은 1 내지 7이다(도 1a, 저부 패널의 칼럼 8). 가용성 TRAIL 및 TRA-8은 동등하게 결합하여 DR5를 부동화시켰다(도 1b, 좌측 패널). 반면, TRAIL은 DR4에 결합하지만, TRA-8은 DR4에 대한 어떠한 결합 활성도 나타내지 않았다(도 1b, 중간 패널). DR5에 대한 TRAIL 및 TRA-8의 결합에 관한 Kd 값을 각각 59nM 및 3nM에서 추정하였다. 중요하게는, TRA-8은 ELISA에서 제시된 바와 같이 DR4가 아닌 DR5에 결합하기 위해 TRAIL과 효율적으로 경쟁하였다(도 1b, 우측 패널). 이들 결과는 인간 DR5에 대한 TRA-8의 특이성을 입증하였다.
TRA-8은 DR5의 세포면 발현을 검출할 수 있으며, 유세포 분석에서는 DR4 또는 엠프티 벡터로 세포감염된 Cos-7 세포가 아닌 전장 인간 DR5로 세포감염된 Cos-7 세포의 세포면에 대해 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다(도 1c). 유사하게, TRA-8을 사용하는 동일반응계 면역조직화학(immunohistochemistry)에서는 대조 벡터로 세포감염된 Cos-7 세포와의 반응성이 아닌 전장 DR5 DNA로 세포감염된 Cos-7 세포와의 반응성을 입증하였다(도 1d). TRA-8은 비세포감염된 Cos-7 세포의 세포소멸을 유도하지 않고, 인간 DR5를 암호화하는 한쌍의 프라이머를 사용하는 Cos-7 세포로부터의 RNA의 RT-PCR에서는, 어떠한 특이적 PCR 생성물도 존재하지 않는 것으로 나타났다. 표적으로서 인간 위르캣 세포를 사용하는 추가의 기능성 분석에서는, 가교결합의 부재하에서, TRA-8가 세포 사멸을 강하게 유도하는 것으로 나타나며, 이는 ATPLite, MTT 및 PI 배제(exclusion)를 포함하는 3가지 상이한 세포 생존성에 대한 검정에 의해 입증되었다(도 1e). 위르캣 세포의 50% 이상이 ATPLite 검정에 의해 제시된 바와 같이 나노그램 수준의 TRA-8에 의해 사멸되었다. TRA-8의 사멸 활성은 DR4-Ig 융합 단백질이 아닌 DR5-Ig 융합 단백질에 의해 차단되는 바와 같이 DR5에 대해 특이적이었다(데이타는 제시되지 않음). 카스파제 8, 9, 및 3의 분할은 위르캣 세포의 TRA-8 처리 후 30분 정도의 웨스턴 블로팅 분석에 의해 검출될 수 있었고(도 1f), 위르캣 세포의 세포 사멸은 일반적인 카스파제 저해제(Z-VAD)에 의해 완전히 저해되었다(도 1g). 카스파제 8, 3, 9, 및 10에 대한 개별 카스파제 저해제는 세포 사멸을 일부 저해시켰으며, 이는 또한 TRA-8-중재된 세포 사멸이 주로 카스파제-의존성 세포소멸 메커니즘을 통해서 이루어졌다.
실시예 7. 세포면 DR5의 발현의 유세포 분석: 정상 세포상에서가 아닌 다수의 종양 세포상에서의 주요 사멸 수용체
세포면에서 발현되는 DR5에 결합하려는 TRA-8의 능력, 및 이 반응의 특이성은, 전장 인간 DR5 또는 DR4 cDNA를 함유하는 발현 벡터, 또는 대조군으로서의 엠프티 벡터로 세포감염된 COS-7(어메리컨 타입 컬쳐 콜렉션 번호 CRL-1651) 세포를 사용하여 검정하였다. 피코에리트린(Phycoerythrin)(PE)-접합된 항-마우스 IgG1(파르민겐(Pharmingen))을 제 2 항체로서 사용하여 상기 결합된 TRA-8을 검출하였다. 하기 조건하에서 유세포 분석계(FACSVantage)를 사용하여 1 × 104세포의 형광성을 측정하였다:
여기 파장 : 488nm
검출 파장 : 600nm
유세포 분석에서는, 도 1c의 ■(solid) 막대 그래프에서 도시된 바와 같이 TRA-8이 DR5 벡터로 세포감염된 COS-7 세포의 약 30%로 염색되어 있는 것으로 나타났다. 상기 백분율은 녹색 형광의 단백질(GFP)을 사용하는 세포감염의 분석에 의해 측정된 바와 같은 세포감염 효능에 해당한다(데이타가 제시되지 않음). TRA-8은 DR4 (□(open) 막대 그래프) 또는 대조 벡터 (점선 막대 그래프)로 세포감염된 세포를 크게 염색시키지 않았으며, 이는 TRA-8이 세포면 DR5에 대해 특이적임을 나타냈다.
종양 세포에서의 DR5 발현은 mRNA 수준에서 광범위하게 연구되어 왔을지라도(리거(Rieger J.) 등의 문헌 "1: FEBS Lett 1998 May 1; 427 (1): 124-8"), DR5의 표면 발현은 잘 이해되지 않았다(깁슨(Gibson S. B.) 등의 문헌 "1: Mol Cell Biol 2000 Jan; 20 (1): 205-12"; 킴(Kim K.) 등의 문헌 "1: Clin Cancer Res 2000 Feb; 6 (2): 335-46"). 따라서, 단일클론성 항-DR5 항체를 이용할 수 있음으로 인해 본 발명자들은 DR5의 표면 수준을 검사하여 상기 발현이 TRAIL-중재된 세포소멸로의 세포의 감응성과 연관이 있음을 알게 되었다. 다음 패널의 세포(1 × 106)를 30분 동안 실온에서 친화성 정제된 TRA-8 10㎍/㎖와 함께 배양한 후, 추가의 30분 동안 PE-접합된 항-마우스 IgG1(파르미노겐)로 염색시켰다. 10,000개의 생세포를 하기 조건하에서 FACS 우세(vantage) 유세포 분석계를 사용하여 분석하였다:
여기 파장 : 488nm
검출 파장 : 600nm
시험되는 5개의 조혈 세포주는 위르캣, CEM-6, Molt-4, H-9 및 U937 세포이었다. DR5 발현은 위르캣, CEM-6, H-9, 및 U937 세포의 표면상에서 검출가능하지만, 도 2a 및 2a'에서 도시된 바와 같이 Molt-4 세포상에서는 거의 검출할 수 없었다. 높은 수준의 DR5 RNA 발현이 이전의 (43)에서 기술되어 있을지라도, FACs 분석에서는, 이들 세포가 높은 수준의 표면 DR5를 발현하지 않는 것으로 나타났다. 이들 결과에서는 DR5의 세포면 발현이 DR5의 전사 발현과 관련이 없으며, 이는 이러한 수용체에 있어 뜻밖의 것은 아니었다. DR5의 세포면 발현의 수준은 세포 직계-특이적인데, 이는 대부분의 조혈 기원 세포가 낮은 수준으로 발현하는 반면, 대부분의 교종(glioma) 및 전립선 세포가 높은 수준의 DR5를 발현하기 때문이었다.
상이한 유형의 인간 종양 세포의 패널 사이에서의 DR5의 세포면 발현 뿐만 아니라 TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포소멸 모두에 대한 이들 세포의 감응성을 TRA-8 단일클론성 항체를 사용하여 검사함으로써 TRAIL-중재된 세포소멸의 역할을 측정하였다.
원발성 말초혈 T 세포는 세포면 DR5를 상당 수준으로 발현하지 않았으며, TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포소멸 모두에 대해 저항적이었다(도 2a, 2a' 및 3a). 시험되는 모든 5개의 인간 T-백혈병 세포주는 검출가능하지만 비교적 낮은 수준의 세포면 DR5를 발현하고, 이들중 2개(위르캣 및 CEM-6)는 TRAIL-중재된 및 TRA-8-중재된 세포소멸에 대해 매우 감응성이며, 이는 DR5가 단독적으로 이들 세포의 세포소멸을 유도하는데 충분하다는 것을 나타냈다. Molt-4 및 U937 세포는 TRAIL-중재된 세포소멸에 대해 일부 감응성이지만, TRA-8-중재된 세포소멸에 대해서는 비교적 저항적인데, 이는 기타 TRAIL 수용체가 세포소멸 신호의 변환과 관련되어 있음을 암시하는 것이었다. H-9 세포는 TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포소멸에 대해 저항적이며, 이는 세포내 항-세포소멸 경로에 의한 차단과 관련되는 것이었다.
세포의 패널은 인간 악성 교종 세포주, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 및 정상 인간 성상세포(astrocyte)를 포함하며, 이는 버밍엄 소재의 알라바마 종합대학(University of Alabama)의 신경외과 교실(Neurosurgery Department)의 얀세이 박사(Dr. Yancey Gillespie)에게서 공급받았다. 인간 전립선암 세포주, Du154, PC3 및 LnCap는, 어메리컨 타입 컬쳐 콜렉션으로부터의 세포주를 갖고 있는 버밍엄 소재의 알라바마 종합대학의 병리학 교실(Pathology Department)의 윌리엄 박사(Dr. William Grizzle)에게서 공급받았다. 인간 백혈병 T 세포주, B-세포 림프종, HepG2 위르캣(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 TIB-152) 및 CCRF-CEM CEM-6(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 CCL-119); 단핵구 세포주, U937(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 CRL-2367)을 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 구입하였다. 상기 모든 세포주를 10% FCS가 보충된 RPMI 1640중에서 배양하였다. 인간 성상세포종(astrocytoma) 세포주, 1321N1은 버밍엄 소재의 알라바마 종합대학의 정신의학 교실(Psychiatry Department)의 리차드 박사(Dr. Richard Jope)에게서 공급받았으며, 5% FCS가 보충된 DMEM중에서 배양하였다.
알렉시스 코포레이션(알렉시스 Corporation)(캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구입한 가용성 재조합 인간 TRAIL은, N-말단에서 FLAG-태그에 융합된 인간 TRAIL의 세포외 도메인(aa 잔기 95 내지 281) 및 8개 아미노산 링커 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 이전에 보고된 His-태그된 TRAIL과 달리, 이런 TRAIL의 제조물은 단독으로 위르캣 세포에 대한 반응으로 강한 세포소멸을 유도하지 않으며, 세포소멸을 강화하기 위해 가교결합제로서 항-FLAG 항체를 필요로 한다. 상기 항-FLAG 항체도 또한 알렉시스로부터 구입하였다.
시험되는 모든 10개의 인간 악성 교종 세포는 세포면에서 검출가능한 수준의 DR5을 발현시켰다. 대부분은 도 2b에서 도시된 바와 같이 중간 수준 내지 높은 수준의 DR5를 발현시켰다. 3개의 세포주, D-54MG, U373MG 및 CH-235MG는 높은 수준의 DR5를 발현시키는 반면, 6개의 세포주, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 및 1321N1은 중간 수준의 DR5를 발현시켰다. 단지 하나의 세포주, H-465만이 낮은 수준의 DR5를 발현시켰다. 모든 3개의 전립선암 세포주는 도 2c에서 도시된 바와 같이 높은 수준의 DR5를 발현시켰다.
정상 원발성 T 세포와 같이, 원발성 B 세포는 상당 수준의 DR5를 발현시키지 않고, TRAIL 또는 TRA-8로 처리한 후, 세포소멸이 일어나지 않았다(도 2d). 시험되는 4개의 B 림프종 세포주중 3개(SKW6. 4, EB-3, 및 라지)는 비교적 높은 수준의 DR5를 발현시키고, TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포소멸 모두에 대해서는 매우 감응적이었다. 4번째 세포주, 다우디는 매우 낮은 수준의 DR5를 발현시키고, TRAIL 또는 TRA-8-중재된 세포소멸에 대해서는 매우 낮은 감응성을 나타냈다. 원발성 성상세포가 검출가능한 수준의 세포면 DR5를 발현시키지 않을지라도(도 2b'), 시험되는모든 4개의 교종 세포주는 높은 수준의 DR5를 발현시켰다. T 및 B 세포보다 교종 세포에 대한 DR5의 높은 수준의 발현은, TRAIL 및 DR5-중재된 세포소멸에 대한 매우 높은 감응성에 의해서는 달성되지 않았으며, 이는 DR5의 세포면 발현의 수준이 필연적으로 종양 세포의 세포소멸과 관련되어 있지 않음을 암시하였다. 메시지 수준의 DR4, DR5 및 DcR2를 측정하기 위해 실시되는 RT-PCR은, 시험되는 모든 세포에서의 메시지를 검출하였다(표 1).
그러나, 일반적으로, 원발성 정상 세포는 형질전환된 종양 세포에 비해 비교적 낮은 수준의 DR5를 발현시켰다.
실시예 8. 악성 세포에서 세포외 세포소멸의 유도
세포외에서 TRA-8이 형질전환된 세포내의 세포소멸을 유도하는지를 측정하기 위해, 모든 DR5-양성 종양 세포를 그의 TRA-8 또는 TRAIL에 의해 유도된 세포소멸에 대한 감응성을 검사하였다.
표적 세포(웰당 1 × 103)를 밤새도록 37℃에서 소정 농도의 가용성 TRAIL + 가교결합제(알렉시스) 또는 TRA-8의 존재하에서 96-웰 플레이트내에서 배양하였다. 세포 생존성은, (1) 제조업자의 지시사항에 따른 ATPLite 키트(코넥티컷주 메리덴 소재의 페커드 인스트루먼츠(Packard Instruments)); (2) MTT 세포 증식/생존성 키트(시그마); 또는 (3) 죽은 세포의 PI 염색법을 사용하여 측정하고, 유세포분석계에 의한 분석하였다. 배양의 말단부에서, 세포를 10g/㎖ PI로 염색하고, PI 음성 세포를 생세포로서 수득하였다. 간세포의 응축된 핵의 분석을 위해, 세포를 10ng/㎖의 Hoechst 33352(분자 탐침)로 염색하고, 유세포분석계에 의해 분석하였다.
TRA-8 항체는 악성 인간 교종 세포주 대부분에서(9/10), 3개중 2개의 전립선암 세포주에서, 및 4개중 2개의 DR5-양성 조혈 세포주에서 세포소멸을 유도할 수 있다. Molt-4 세포주에서 세포소멸을 유도하지 못했으며, 이는 거의 검출불가능한 세포면 수준의 DR5를 발현시켰다. 그러나, TRA-8-중재된 세포소멸에 대한 세포의 감응성 수준은 세포주중에서 크게 변했다.
세포소멸을 유도하는 TRA-8 항체에 대한 세포의 감응성의 변이성은, DR5의 최소 수준의 세포면 발현이 요구될지라도, DR5의 세포면 발현은 감응성의 주요 결정인자를 필요로 하지 않으며, 기타 인자는 이 과정에 영향을 미친다. 모든 교종세포가 일반적으로 조혈 세포에서보다 상당히 높은 수준의 표면 DR5를 발현시키며, TRA-8에 의해 유도된 세포소멸에 대한 교종 세포 감응성은 조혈 세포에 비해 정비례로 증가하지 않았다. TRA-8-유도된 세포소멸에 대한 5개의 교종 세포주, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG 및 1321N1의 감응성은 높으며, 도 3b에 도시된 바와 같이 TRAIL-중재된 세포소멸에 대한 그들의 감응성과 동일하다. 2개의 교종 세포주, H-456 및 SMK1은 TRA-8에 의해 유도된 세포소멸에 대해 매우 적은 감응성을 갖는다. H-456 세포의 경우, DR5의 표면 발현은 낮지만; SMK1상의 DR5의 표면 발현은 더욱 감응성인 세포주와 유사한데, 이는 기타 메커니즘이 TRAIL-중재된 세포소멸에 대한 감응성을 결정하는 역할을 담당한다는 것을 암시한다. 모든 3개의 전립선암 세포주는 높은 수준의 DR5를 발현시킬지라도, 도 3c에서 도시된 바와 같이, Du145 세포는 TRA-8-유도된 세포소멸에 대해 매우 민감하고, PC3 세포는 부분적으로 민감한 반면, LnCAP 세포는 완정히 저항적이었다. 조혈 세포중에서, 위르캣 및 CEM-6이 도 2a에 도시된 바와 같이 TRA-8-세포소멸에 대해 매우 감응성인 반면, 이들 세포주 둘다는 낮은 수준의 DR5를 발현시키는 것으로 밝혀졌다. DR5가 U937 세포상에서 검출가능할지라도, 이들 세포는 TRA-8-유도된 세포소멸에 대해 저항적이었다. 유사하게, H-9 세포가 검출가능한 수준의 DR5를 발현시킬지라도, H-9 세포는 TRA-8에 의해 유도된 세포소멸에 대해 저항적이었다. 이들 결과에서는 DR5-중재된 세포소멸에 영향을 미치는 규칙적인 메커니즘의 존재와 관련되어 있다.
추가의 표면 결합성 항-DR5 항체를 실시예 1 내지 3의 절차에 따라 제조하였다. 세포소멸을 유도하여 작용물질로서 작용하거나 또는 역으로 TRAIL-중재된 세포소멸을 차단하여 길항물질로서 작용하는 상대적 능력을 측정하기 위해 TRA-8을 따라, TRA-1 및 TRA-10으로 지정된 2개의 추가 항-DR5 항체를 연구하였다. 인간 위르캣 세포를 표적으로서 사용하여 TRA-1, TRA-8 및 TRA-10을 나타내는 3개의 항-DR5 항체의 작용물질 및/또는 길항물질 활성을 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 세포 생존성은 2.5㎍/㎖를 사용하여 밤새도록 배양함에 따라 TRA-10, TRA-1 및 TRA-8 각각에 대해 약 90%, 70% 및 20%이었다. TRA-8은 투여량-의존성 형태로 강한 세포소멸 반응을 유도하는 반면, TRA-1은 단지 보통의 세포소멸 반응을 유도하고, TRA-10은 단지 약한 반응만을 유도하였다. 따라서, TRA-8은 작용물질 항-DR5 항체로서 분류된다. 도 4에서, 인간 위르캣 세포의 생존성은 TRAIL-유도된 세포소멸의 투여량-의존성 함수로서 도시된다. TRA-10은 낮은 투여량의 TRAIL-유도된 세포소멸 연구에서 인간 위르캣 세포의 세포소멸을 상당한 정도로 차단하였다. 따라서, TRA-10은 길항물질 항-DR5 항체로서 분류되었다. TRA-1은 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 수탁번호 PTA-1741로 기탁되어 있다. 이와 같이, TRA-10은 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 수탁번호 PTA-1742로 기탁되어 있다.
TRA-8-유도된 세포소멸에 대한 5개의 교종 세포주, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG 및 1321N1의 감응성은, 도 3b에 도시된 바와 같이 TRAIL-중재된 세포소멸에 대한 그들의 감응성과 동일한데, 이는 이들 세포중의 TRAIL-유도된 세포소멸이 DR5를 통해 주로 중재됨을 나타냈다. 더욱이, 2개의 교종 세포주, Hs683 및 U251-MG는 TRAIL-유도된 세포소멸에 저항적이지만, 일부는 TRA-8-유도된 세포소멸에 민감한데, 이는 유인 수용체가 이들 세포내에서 기능하고, TRA-8 항체의 용도가이런 규칙적인 메커니즘을 우회하였음을 나타냈다. 전립선암 세포주에서, TRA-8에 의해 유도된 세포소멸에 대한 감응성이 변함에도 불구하고, 이는 TRAIL에 의해 유도된 세포소멸에 대한 세포의 감응성에 필적한데, 이는 다시 DR5가 전립선암 세포에서의 TRAIL-중재된 세포소멸에 대한 주요 역할을 담당함을 나타냈다. 조혈 세포중에서, 위르캣 및 CEM-6이 TRA-8 및 TRAIL-중재된 세포소멸 모두에 매우 민감하다는 것이 밝혀졌다. TRA-8에 의해 유도된 세포소멸의 수준은 도 2a 및 3a'에 도시된 바와 같이 TRAIL에 의해 유도된 세포소멸에 필적할만하다. 오직 하나의 교종 세포주, U87, 및 2개의 조혈 세포주, U937 및 Molt-4는 TRAIL-유도된 세포소멸에 대한 민감성을 나타내지만, TRA-8-유도된 세포소멸에 대해서는 거의 민감 또는 저항적이지 않다. 하나의 세포주, H-9 세포주는 검출가능한 수준의 DR5를 발현시키지만, TRA-8 또는 TRAIL에 의해 유도된 세포소멸에 저항적이었다. 최소 수준의 DR5의 발현 수준이 TRA-8-유도된 세포소멸에 필요한 반면, DR5의 발현 수준은 TRA-8-중재된 세포소멸에 대한 세포의 감응성을 예견할 필요가 없고; 유인 수용체는 몇몇 세포내에서 TRAIL-중재된 세포소멸을 조정하는 역할을 담당하지만, 현재 시험되는 대부분의 세포내에서는 주요 역할을 담당하는 것으로 보여지지 않고; 예견된 바와 같이, TRA-8 항체는 유인 수용체의 효과를 우회하고; DR5 수용체의 기능적 돌연변이가 형질전환된 세포에서 발생할 수 있으며; 최종적으로, TRAIL 및 DR5-중재된 세포소멸에 대한 세포의 감응성을 규정하는데 있어서, 세포내 규칙적인 메커니즘이 중요하거나, 또는 유인 수용체보다 더욱 중요할 수 있다.
종래 연구에서는, DR5에 대한 mRNA가 정상 조직7에서 광범위하게 분포되어 있음을 제시하였다. 단백질 수준에서의 DR5의 발현을 평가하기 위해, 정상 인간 조직 호모게네이트(homogenate)의 패널(미져리주 세인트 루이스 소재의 게노 테크놀로지(Geno Technology))을 웨스턴 블로팅 분석에서 TRA-8 항체로 탐침하였다. 9개의 정상 인간 조직중에서, 뇌 조직은 약한 양성이었다(도 5a, 레인 2). DR5 단백질은 간(레인 1), 폐(레인 3), 신장(레인 4), 비장(레인 5), 고환(레인 6), 난소(레인 7), 심장(레인 8) 또는 이자(레인 9)에서 TRA-8 반응성에 의해 검출할 수 없었다. 반면, 난소(레인 1), 폐(레인 2), 간(레인 3), 직장(레인 4), 경부(cervix)(레인 5), 피부(레인 6), 고환(레인 7), 갑상선(레인 8), 자궁(레인 10), 위(레인 11), 후인두(레인 12) 및 이자(레인 13)에서의 암을 포함하는 모든 13개의 인간 암 조직은 TRA-8(도 5b)로 양성으로 염색되었다. 더욱이, TRA-8을 사용하는 정상 및 암 조직의 동일반응계 면역조직화학에서는, 비장내의 몇몇 산란된(scattered) 양성 세포를 제외하고, 정상 유방, 폐 및 비장 조직에서의 DR5 발현은 검출할 수 없었다(도 5c). 유방 침윤성 관상 암종(breast infiltrating ductal carcinoma), 작은 세포 폐암, 및 림프종을 포함하는 상응하는 암 조직은 TRA-8과 양성적으로 반응하였다(도 5d). 검사하는 모든 22개의 암 조직중에서, 6개중 5개의 유방암, 2개중 2개의 경부암, 5개중 4개의 간암, 8개중 5개의 림프종, 2개중 2개의 폐암, 및 2개중 2개의 전립선암은 TRA-8과 양성적으로 반응하였다. 이들 결과는 유세포 분석과 일치하며, 암 조직이 정상 조직보다 높은 수준의 DR5단백질을 발현시키는 것으로 나타난다.
실시예 9. TRA-8의 생체내 항종양 활성
다양한 이유로, 생체외 연구에서 유망한 것으로 보여지는 다수의 제제가 생체내에서는 효능을 나타내지 않았다. 따라서, 생체내 동물 모델에서 TRA-8의 효능을 시험하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해, TRA-8 항-인간 DR5 항체를, 인간 DR5 분자를 발현하는 인간 이종이식편을 갖는 마우스에 투여하였다. 사용되는 마우스는 생후 6 내지 8주된 NOD/SCID 마우스(잭슨 레보레토리(Jackson Laboratory))이며, 상기 마우스는 인간 성상세포종 1321N1 세포로 피하에 접종하거나(1 × 107), 또는 인간 백혈병 위르캣 세포로 정맥내 접종하였다(1 × 106). 종양을 접종한지 2일 후, 마우스를 TRA-8(100㎍)로 정맥내 접종하였다. TRA-8로 처리한지 5일 후, 1321N1 종양 성장은 종양 덩어리의 크기 및 중량에 의해 결정된다. 위르캣 세포의 성장은 접종된 동물의 비장의 중량, 및 상기 동물의 비장내의 인간 CD3-양성 위르캣 세포의 백분율에 의해 결정된다. 종양 조직의 생체검사를 실시하고 조직 검사를 실시하였다.
종양 접종한지 1일 후, TRA-8 100㎍을 정맥내로 단일 투여로 조기 처리하게 되면, 1321N1 세포가 고형 종양의 형성을 완전히 저해하였다(도 6a). 종양 접종한지 1주일 후, TRA-8 100㎍을 정맥내로 3회 투여로 늦게 처리하게 되면, 종양의 중량이 4배 이상으로 감소하였다(도 6b). 종양 형성은 매번 TRA-8로 처리된 동물에서 관찰되질 않았다(도 6c, 상부 패널). 조직학적 분석에서는, TRA-8로 처리된 동물에서 극히 퇴화된 종양 조직이 드러났다(도 6c, 저부 패널). 유사하게, TRA-8 처리는, 비장내의 CD3-양성 위르캣 세포의 결핍에 의해 확인되는 바와 같이, 위르캣 세포에 의한 비장의 군집을 저해하였다(도 6d, 6e). 이식된 종양의 조직학적 분석에서는, 도 6c에 도시된 바와 같이, 몇몇 종양 세포가 TRA-8-처리된 동물의 연조직내에 분산되어 있는 반면, 대조군은 고형 종양을 형성하는 것으로 나타냈다. 위르캣 세포 모델에서, TRA-8-처리된 동물의 비장내의 위르캣 세포의 수는, 도 6a 및 도 6c의 동일반응계 CD3 염색에 도시된 바와 같이, 유세포 분석에 의해 입증되는 바와 같이 대조 동물의 비장에서 약 10%에 비해 2% 미만이었다.
이들 결과에서는 가교결합된 재조합 TRAIL의 전신계 투여가 생체내에서 종양의 성장을 저해하는 최근의 논증을 확인하고 있다(13). 이들 결과에서는 TRA-8의 단일 투여가 생체내에서 종양 세포의 제거에 매우 효과적임을 나타냈다.
항-인간 항체가 뮤린 모델에 사용됨에 따라, TRA-8 치료의 독성은 검정할 수 없었다. 그러나, 생체내 TRAIL 투여에 관한 연구에서는, 이 치료와 관련된 어떠한 의미있는 독성도 없는 것으로 나타났다(13).
실시예 10. RA 활막 세포는 TRAIL 및 TRA-8-유도된 세포소멸에 대해 감응적이다.
대부분의 종래 기술에서의 TRAIL-중재된 세포소멸에 관한 연구는 악성 세포에 촛점을 맞추어 왔다. 본 발명에 따른 TRAIL-중재된 세포소멸도 또한 RA와 같은 자가면역 및 염증 상태를 치료하는데 효과적이었다.
10. 1 RA 활막 세포에서 세포면 DR5의 발현의 유세포 분석
RA를 앓는 환자로부터의 8개의 배양된 원발성 활막 세포의 패널상에서의 DR5의 발현은, 골관절염(이후 본원에서 "OA"로서 지칭됨)을 앓는 환자로부터의 8개의 배양된 원발성 활막 세포의 패널상에서의 것과 비교하였다.
8개의 인간 원발성 RA 활막 세포 배양액 RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 및 RA-929는, 오츠키 박사(Dr. M. Ohtsuki)(일본 도쿄 소재의 산쿄 캄파니 리미티드(Sankyo Co. Ltd.))에게서 친절하게 공급받았으며, 10% FCS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 DMEM중에서 배양하였다. 7개의 OA 활막 세포 원발성 세포 배양액은, 표준 콜레게나제(collagenas) 방법에 의해 OA 환자의 윤활 조직으로부터 단리하고 동일한 조건하에서 배양하였다. 모든 원발성 세포의 통과수는 10이었다. DR5의 발현은 실시예 5에서 기술된 바와 같이 FACs 분석에 의해 측정하였다.
모든 RA 세포의 원발성 배양액은 높은 수준의 표면 DR5를 발현시켰으며, 도 7a에 도시된 바와 같이 상이한 환자로부터 단리된 이들 활막 세포에서 발현 수준의 변화는 거의 없었다. 반면, OA 환자로부터 단리된 활막 세포의 표면상에서의 표면 DR5의 발현은 도 7b에 따라서 매우 낮거나 검출불가능하였다. SV40-형질전환된 활막 세포는 RA 세포에 의해 나타나는 것보다 높은 수준의 DR5를 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 반면, 비형질전환된 섬유아세포는 도 7b에서와 같이 OA 세포에 의해 나타나는 것보다 낮은 수준의 DR5를 발현시키는 것으로 밝혀졌다.
10. 2 TRA-8 또는 TRAIL에 의해 중재된 세포소멸에 대한 RA 활막 세포의 감응성
일반적으로, RA 환자로부터 다닐된 모든 활막 세포는 TRAIL 및 항-DR5 항체-유도된 세포소멸에 대해 감응적이고, 모든 OA 세포는 도 8a, b에 따르면 TRAIL 및항-DR5 항체-유도된 세포소멸에 대해 저항적이었다.
이들 연구에서는, TRA-8 항체는 정상 세포보다 변형 세포를 표적으로 삼는 것으로 나타난다. 더욱이, TRAIL에 의해 유도된 세포소멸에 대한 감응성 또는 저항성의 패턴은 항-DR5 항체에 의해 유도된 것과 관련되며, 이는 활막 세포가 주로 DR5를 이용하여 TRAIL 세포소멸을 개시하는 것을 의미한다.
악성 세포에 관해 기술된 바와 같이, TRAIL 또는 항-DR5 항체에 의해 유도된 세포소멸에 대한 감응성은 유사한 수준의 DR5를 발현시킬지라도 RA 활막 세포중에서 변하였다. RA-512 및 RA-707이 가장 감응적인데, 이는 80% 이상의 세포가 20 ng/㎖ 미만의 TRAIL 또는 TRA-8 농도에 의해 사멸되기 때문이었다. RA-1014, RA-811, RA-716 및 RA929는 TRAIL 또는 TRA-8에 대한 중간 수준의 감응성을 갖는 것들이며, 높은 농도(>50ng/㎖)의 TRAIL 또는 TRA-8의 존재하에서 거의 100% 세포가 사멸되었다. RA-1016 및 RA1021 세포에서, 대부분(60% 이상)의 세포가 낮은 투여량의 TRAIL 또는 TRA-8에 의해 사멸되며, 일부 세포가 높은 농도의 TRAIL 또는 TRA-8의 존재하에서 생존하였으며, 이는 하위 군집의 세포가 TRAIL-중재된 세포소멸에 대해 저항적임을 나타냈다. 반면, 모든 OA 세포는 TRAIL 및 TRA-8-유도된 세포소멸에 대해 매우 낮은 감응성을 나타냈다. 60% 이하의 세포는 OA52F 및 OA69F중에서 높은 농도의 TRAIL 또는 TRA-8의 존재하에서도 사멸하였다. OA72M 세포는 TRAIL 또는 TRA-8-유도된 세포소멸에 대해 완전히 저항적이었다. SV40 형질전환된 활막 세포도 또한 TRAIL 및 TRA-8-유도된 세포소멸에 대해 감응적이었다(데이타는 제시되지 않음). 반면, 비형질전환된 섬유아세포는 TRAIL 및 TRA-8에 대해 저항적인 것으로 보였다.
종래에서는 DR5가 경로 의존성인 FADD/카스파제 8을 이용하여 세포소멸을 개시하는 것으로 제시되어 왔다(44). RA 활막 세포의 DR5-중재된 세포소멸의 카스파제-의존성을 측정하기 위해, RA 세포를 특정 카스파제 저해제의 존재하에서 TRAIL 또는 항-DR5 항체와 함께 배양하였다. 시험되는 8개의 카스파제 저해제중에서, 카스파제 6, 8 및 10 저해제가 도 9에서 도시된 바와 같이 TRAIL 및 DR5 모두에 의해 유도된 RA 활막 세포의 세포소멸을 저해할 수 있으며, 이는 이들 3개의 카스파제가 DR5-중재된 세포소멸과 관련되어 있음을 나타냈다.
10.3 TRA-8 또는 TRAIL은 MMP의 방출을 증가시키지 않고 RA 윤활 세포에서의 NFκB 활성화를 유도한다.
세포소멸의 신호 및 증식의 신호 사이에 밀접한 관련이 있다는 개념에 대한 상당한 증거가 있다(45). DR5가 세포소멸 신호 형질도입 이외에 NFκB 경로를 활성화시킬 수 있으며, NFκB 활성화가 항-세포소멸 신호를 형질도입할 수 있다는 것이 확증되었다. 따라서, 겔-이동 검정을 수행하였다. 세포를 지시된 시간 동안 증진제 1mg/ml의 존재하에 50ng/ml의 재조합 가용성 TRAIL, Fas 리간드로, 또는 50ng/ml의 TRA-8로 자극하였다. 핵 추출물을 제조하고 2중-착색된 [32P]-표지된 올리고-DNA 탐침과 함께 항온처리하였다. 그 결과를 사이클론 포스파-이매저(cyclone phospha-imager)(TopCount NXT, 신시내티주 소재의 팩커드 인스트루먼트 캄파니(Packard Instrument Company) 제조)를 사용하여 분석하였다.RA 윤활 세포를 TNF-α 또는 TRAIL과 함께 항온처리하고, NFκB를 시간-의존적인 양식으로 활성화시켰다. TRA-8 항체는 NFκB를 강하게 활성화시켰다. 대조적으로, Fas 리간드는 도 10a에서와 같이 NFκB 활성화를 유도할 수 없었다.
따라서, 비록 TRAIL 및 TRA-8 항체가 RA 윤활 세포에서 강한 세포소멸 반응을 유도하지만, 이들은 또한 NFκB를 활성화하고, NFκB 활성화는 RA에서 TNF-α의 전(前)염증성 역할에 기여한다고 생각된다. 따라서, TRAIL은 TNF-α와 마찬가지로 전-염증성 시토카인으로서 작용할 수 있다. TRAIL 및 TNF-α에 의해 유도된 NFκB 활성화의 유사한 생물학적 결과가 있는지 여부를 결정하기 위해, ELISA에 의해 MMP의 생성량을 측정하였다. 윤활 세포를 배지 단독에서, 또는 50 ng/ml 인터류킨(interleukin) 1b, 10 ng/ml TNF-α, 50 ng/ml TRAIL 또는 50 ng/ml TRA-8과 함께 하룻밤 배양하였다. 배지 상청액중의 MMP-1 및 MMP-3의 수준을 ELISA 키트로 측정하였다.
RA 윤활 세포를 전염증성 시토카인, TNF-α 또는 IL-lb와 함께 항온처리하는 경우, MMP-1, 3 및 13의 생성량은 도 10b, c에 도시된 바와 같이 배지 대조군에 비하여 증가하였다. 대조적으로, TRAIL 또는 항-DR5 항체로 처리하는 것은 상기 MMP의 방출의 증가와 연관되지 않았다.
실시예 11A. 간세포 독성 유도의 실패
24-시간 세포 생존성 검정을 위해, 96-웰 플레이트중의 신선한 정상 인간 간세포를 인 비트로 테크롤로지(In Vitro Technology)(메릴랜드주 볼티모어)에서 구입하였다. 1 ㎍/ml의 가용성 TRAIL 또는 TRA-8을 함유하는 간세포 배양 배지에서간세포를 배양하였다. 6-시간 생존성 검정을 위해, 정상 간세포 또는 간세포암 세포를 UAB 조직 조달 센터(Tissue Procurement Center)로부터 수거된 신선한 외과용 견본으로부터 분리하였다. 간세포 관류 완충액, 소화 배지, 세척 배지 및 부착 배지를 포함하는 인간 간세포의 분리를 위한 모든 시약은 깁코(Gibco)로부터 구입하였다. 조직 슬라이드를 37℃에서 간세포 소화 배질중에서 1시간 동안 진탕시켜(50 rpm) 소화시켰다. 분리된 간세포를 저속 원심분리(50 g, 3분)로 수확하고, 간세포 세척 배지로 6회 세척하였다. 간세포의 단일 세포 현탁액을 96-웰 마트리겔(Matrigel) 플레이트(BD)에서 10% FCS를 함유하는 부착 배지중에서 6시간 동안 배양하였다. 부착되지 않은 간세포는 예비-가온된 부착 배지로 2회 세척하여 제거하였다. 부착된 간세포를 가교결합제 존재하에 다양한 농도의 가용성 TRAIL 또는 FasL과 함께, 또는 TRA-8 또는 CH11과 함께 추가로 6시간 동안 항온처리하였다.
TRAIL은 세포소멸을 유도할 수 있는 둘 이상의 수용체(DR4 및 DR5)를 갖는다. TRA-8은 DR5 단독의 가교결합이 정상 간세포의 세포소멸을 유도하기에 충분한지 여부를 결정하는데 사용된다. 초기에 5개의 정상 인간 간 조직 및 5개의 간암 조직의 단백질 수준에서의 DR5의 발현을 TRA-8을 사용한 동일반응계 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의해 검사하였다. 정상 간 조직으로부터의 단면은 DR5를 위한 TRA-8과의 양성 반응성 부재하에(도 11a, 좌측 하단 패널) H&E 착색시(도 11a, 좌측 상단 패널)에 정상 구조 및 세포 형상학을 나타내었다. 대조적으로, 인간 간세포암 조직은 암세포상에서 세포막 및 DR5의 세포질 존재와 일치하는 패턴으로 TRA-8과 양성으로 반응하였다. 인간 간세포암 세포계 HepG2도 또한 DR5에 대해 양성이었다. 상기 결과는 5개의 정상 간 조직에서 일치하며, 5개의 간암 조직중 단지 1개(간 선종)만이 DR5-음성이었다. 상기 결과는 다른 정상 조직과 마찬가지로, 정상 인간 간 조직은 DR5 단백질의 상당한 수준을 나타내지 않는다는 점에서 도 5a에 도시된 웨스턴 블로팅(Western blotting) 데이타와 일치한다. 또한, TRA-8로 탐침검사된 분리된 정상 인간 간세포를 웨스턴 블로팅한 결과 DR5가 검출가능한 수준으로 나타나지 않았다.
유량세포분석법 분석에 의한 인간 간세포상의 DR5의 세포면 발현은 새로이 준비된 정상 간세포가 검출가능한 수준의 세포면 DR5(도 11b, 정상 좌측 패널)를 발현시키지 않았다는 것을 예증하였다. 냉동보존되거나 단기간 배양된 정상 인간 간세포에서는 검출되지 않았다. 대조적으로, 새로이 분리된 간세포암 세포 및 HepG2 세포는 세포면 DR5를 발현시켰다. Fas를 비교용으로 하여, 정상 간세포, 간세포암 세포 및 HepG2 세포는 모두 동등한 수준의 Fas를 발현시켰다(도 11b, 하단 패널). 상기 결과는 동일반응계 면역조직화학 및 웨스턴 블로팅을 이용하여 얻어진 결과와 일치하며 세포면 DR5가 암에 걸린 간 세포에서는 고도로 발현되나 정상 간세포에서는 발현되지 않는다는 것을 시사한다. RT-PCR23에 의해 예증되는, 인간 간세포에서 DR4, DR5, DcR1 및 DcR2에 대한 mRNA 수준의 존재는 인간 간세포가 TRA-8에 의한 검출을 위한 역치 미만인 매우 낮은 수준의 DR5 단백질을 발현시킨다는 것을 암시한다.
TRA-8이 간세포 독성을 유도하는지 여부를 결정하기 위해, TRA-8 및 가용성 TRAIL+가교결합제에 의해 유도된 정상 인간 간세포의 세포소멸 감수성을 검사하였다. 정상 간세포가 고농도의 TRAIL 존재하에 배양되는 경우, 세포 생존성의 시간-의존적인 감소가 ATPLite(도 12a) 및 MTT 검정에 의해 관찰되었다. 정상 간세포의 TRAIL-중개된 세포 죽음은 TRAIL 첨가한지 4시간 후에 이미 나타났다. 24-시간 배양의 말기에, 간세포의 80% 이상이 TRAIL에 의해 죽었다. 대조적으로, 동일한 배양 기간 동안, TRA-8은 정상 간세포에서 상당한 세포 죽음을 유도하지 않았다. 세포소멸의 특징인, 획스트(Hoechst)로 착색된 응축된 핵은 TRAIL-처리된 간세포에서는 증가하였으나 TRA-8-처리된 간세포에서는 그렇지 않았다(도 12b). 세포소멸성 간세포의 수는 ATPLite 검정에 의해 측정된 바와 같은 세포 생존성의 감소와 큰 상관관계가 있었으며, 이는 간세포의 TRAIL-유도된 세포 죽음이 세포소멸에 의해 중개된다는 것을 암시한다. 이는 간세포의 TRAIL-중개된 독성을 저해하는 Z-VAD의 능력으로 확인된다. 사이클로헥시미드가 잠재적인 세포소멸 증진제이므로, 이 화합물의 TRAIL 및 TRA-8-처리된 간세포에서의 효과를 조사하였다. 4-시간 배양동안, 사이클로헥시미드는 TRAIL에 의해 유도되는 간세포의 세포 죽음을 상당히 증진시켰으며, 사이클로헥시미드 존재하에 TRAIL에 의해 70%를 초과하는 간세포가 죽었다(도 12c). 그러나, 사이클로헥시미드 처리는 간세포의 TRA-8-중개된 세포 죽음을 증진시킬 수 없었다. 간세포에서 TRA-8에 의해 유도된 세포소멸의 특징을 TRAIL에 의해 유도된 것과 비교하기 위해, 정상 간세포 및 암 세포를 다양한 농도의 가용성 TRAIL(가교결합제를 가짐) 또는 TRA-8과 함께 항온처리하였다. 6-시간배양 기간 동안, TRAIL은 정상 간세포에서 온건한 세포소멸 반응을 유도하였다. TRAIL 500ng/ml의 존재하에 간세포의 20% 이상이 죽었다(도 12d, 상단 좌측). 정상 간세포를 TRA-8-처리하는 것은 동일한 기간에 걸쳐 어떠한 상당한 세포 죽음을 이끌어내지 않았다. 정상 세포와는 반대로, 원발성 간세포암 세포(도 12d, 상단 중앙) 및 HepG2 세포(도 12d, 상단 우측)는 TRAIL 또는 TRA-8에 의해 중개된 세포소멸에 매우 민감하다. 간세포암 세포의 80% 이상 및 HepG2 세포의 거의 100%가 8-시간 배양 기간 동안 죽었다. 상기 결과는 정상 간세포가 TRA-8-중개된 세포소멸에 완전히 내성이 있으며, 간 암 세포보다는 TRAIL-중개된 세포소멸에 훨씬 덜 민감하다는 것을 시사한다. Fas 리간드 및 항-Fas 항체(CH-11)를 사용하는 경우, 정상 간세포, 간세포암 세포 및 HepG2 세포 사이에 Fas-중개된 세포소멸에 대한 감수성에 뚜렷한 차이는 없었다(도 12d, 하단 패널).
비교예 11B. 생체내에서 간염의 인간 막-결합된 TRAIL 유도
8 내지 10주 나이의 암컷 B6 생쥐에게 109pfu의 Ad/hTRAIL을 동수의 Ad/Tet-on과 함께 정맥주사하였다. 아데노바이러스 매개체의 접종 직후에 음용수중의 상이한 농도의 테트라사이클린을 생쥐에게 먹였다. 간 상해를 AST 진단 키트(시그마(Sigma))를 사용하여 AST의 혈청 수준에 의해 측정하였다. TRAIL의 발현을 노던 블로팅 분석에 의해 측정하였다.
TRAIL의 막 결합된 형태가 생체내에서 간 손상을 유도하는지 여부를 결정하기 위해, 전체 길이의 인간 TRAIL을 인코딩하는 재조합 아데노바이러스매개체(Ad/hTRAIL)를 구성하고, 그의 발현을 테트라사이클린-유도가능한 촉진자의 제어하에 두었다. B6 생쥐에게 Ad/hTRAIL을 정맥 접종한지 24시간 후, 노던 블로팅 분석에 의해 예증되는 바와 같이 간에서 인간 TRAIL의 테트라사이클린-유도된 발현을 투여량-의존적인 양식으로 관찰하였다(도 13a). TRAIL의 발현 수준은 트랜스아미나제의 혈청 수준의 테트라사이클린-의존적 증가에 의해 나타내어지는 바와 같이, 다시 투여량-의존적인 양식으로 간 손상과 큰 상관관계가 있었다(도 13b). 아데노바이러스 매개체 자체를 접종하는 것이 간세포의 TRAIL-중개된 세포소멸에 대한 감수성을 증가시킬 수 있으므로, Ad/TRAIL이 접종된 생쥐로부터의 간세포를 분리하고 TRAIL-중개된 세포 죽음에 대해 시험하였다. Ad/TRAIL 감염된 간세포의 세포 죽음은 대조군 생쥐에 비해 크게 증가하지 않았다(도 13c, 좌측 패널). 게다가, Ad/TRAIL 접종된 생쥐는 가용성 인간 TRAIL의 정맥 주사 후에 간 상해가 증가하지 않았다. 따라서, 결과적으로 Ad/TRAIL에 의해 유도된 간염은 막 형태로 발현된 높은 수준의 TRAIL에 의해 중개된다. 간 단면의 조직학적인 분석으로 매개체를 접종한지 24시간 후에 이미 간세포에 대한 손상이 명백해지며(도 13d), 7일 이상 지속된다(도 13e)하다는 것을 밝혀졌다. 간에서의 상기 병리학적인 변질도 또한 테트라사이클린-의존적이며 투여량-의존적인 방식으로 나타났다. 처리한지 24시간 이내의 TRAIL-유도된 간 손상의 조기 상은 회저의 병소를 특징으로 한다. 감염 세포의 침윤은 이 단계에서는 관찰되지 않았으나, 출혈이 발생하였다. 접종한지 7일 후까지, 두드러진 소열편 난잡성, 불규칙하게 응집된 세포질 및 거대한 투명한 공간을 동반하는 간세포의 심한 퇴화, 및 현저한 세포소멸 및 회저로 확산성 간 손상이 명백하였다. 단핵 세포의 광범위한 침윤이 이 단계에서의 특징이었다. 상기 결과는 막-결합된 형태의 인간 TRAIL이 생체내에서 간 손상을 유도할 수 있다는 것을 시사한다. 인간 TRAIL이 생쥐에게 심한 간염을 일으키는 경향이 있음에도 불구하고, 치명적인 반응은 유도하지 않았다. 대조적으로, Fas 리간드를 인코딩하는 유사한 테트라사이클린-제어된 매개체가 접종된 생쥐는 접종한지 72시간 이내에 테트라사이클린 투여량-의존적으로 다량의 세포소멸 및 간세포의 회저를 갖는 전격성 간염이 발병되었으며 심한 출혈 및 사망을 동반하였다. 치사율은 테트라사이클린 3 mg/ml 이상을 수용하는 하위그룹에서 48시간 이내에 100%에 도달하였다. 대조적으로, Ad/hTRAIL을 수용한 생쥐 모두는 테트라사이클린의 투여량에 관계없이 접종한지 4주 후에 여전히 살아있었다. 따라서, 결론적으로, 생체내에서 TRAIL의 막-결합된 형태는 Fas 리간드보다 효능이 덜한 간세포 손상의 유도자이다. 이들은 또한 TRAIL이 Fas 리간드의 독성의 근원을 이루는 기작과는 상이한 기작을 통해 간 손상을 유도한다는 것을 암시한다.
실시예 12. 활성화된 인간 T 및 B 세포는 증가된 수준의 DR5를 발현시킨다.
DR5가 활성화된 T 세포 및 B 세포의 TRAIL-중개된 세포소멸에 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해, 휴면중인 T 및 B 세포 및 활성화된 T 및 B 세포 상에서 TRA-8을 사용하여 DR5의 표면 발현을 검사하였다. PBMC에서 미자극된 인간 T 세포는 상당한 수준의 DR5를 발현시키지 않았다(도 14). 항-CD3 또는 Con-A로 자극한지 48시간 후에, 세포면 DR5 발현이 상당히 증가하였다. 유사하게, 미자극된 B 세포는 매우 낮은 수준의 DR5를 발현시켰다. 항-μ로 자극하였으나 LPS로는 자극하지 않은 결과 DR5의 세포면 발현이 증가하였다. 상기 결과는 활성화된 T 및 B 세포 모두가 더 높은 수준의 세포면 DR5를 발현시킨다는 것을 시사한다. 세포를 20㎍/ml의 TRA-8 및 PE 항-생쥐 IgG1로 착색하였다.
실시예 13. 활성화된 T 및 B 세포는 TRA-8 중개된 세포소멸에 민감하게 된다.
활성화된 T 및 B 세포가 TRA-8-중개된 세포소멸에 민감한지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC의 T 세포 및 B 세포를 생체외에서 각각 항-CD3 또는 항-μ로 48시간 동안 자극하였다. 생세포 및 증식중인 배아 세포를 구배 원심분리로 수거하고, 다양한 농도의 TRA-8과 함께 항온처리하였다. 미자극된 T 세포 및 B 세포는 TRA-8-중개된 세포소멸에 민감하지 않았다(도 15). 총 자극된 T 세포 및 B 세포는 TRA-8-중개된 세포소멸에 온건하게 증가된 감수성을 나타내었으며, 하룻밤 배양후 TRA-8에 의해 세포의 20%가 죽었다. 고도로 증식중인 배아 T 세포는 TRA-8-중개된 세포소멸에 훨씬 민감하였다. 배아 T 세포의 70% 이상이 TRA-8에 의해 죽었다. 또한, 배아 B 세포는 다른 것들에 비해 TRA-8 중개된 세포소멸에 더욱 민감하였다. 상기 결과는 활성화된 T 및 B 세포가 DR5-중개된 세포소멸에 민감하다는 것을 시사한다.
실시예 14. TRA-8은 인간/SCID 생쥐에서 활성화된 T 세포를 고갈시킨다.
TRA-8의 생체내 항-T 세포 효능을 결정하기 위해, NOD/SCID 생쥐에게 1×108인간 PBMC를 정맥 주사하였다. 보통은, SCID 생쥐의 인간 T 세포는 이종개체 자극에 반응하여 빨리 활성화되었다. 인간 PBMC/SCID 생쥐에게 전달일부터 100㎍ TRA-8 또는 대조용 IgG1를 복막내 주사하였고, 이를 3일 동안 매일 반복하였다. 전달 5일 후에, 단핵 세포를 비장으로부터 분리하고 항-인간 CD3 항체로 착색하고, 림프구 개체군을 유량세포분석법 분석에 의해 관문화하고, CD3 양성 인간 T 세포를 분석하였다. 비장 림프구의 약 30%는 대조 처리된 생쥐에서 항-인간 CD3를 착색함에 의해 측정된 바와 같이 인간 T 세포이다. 그러나, 소수의 인간 T 세포만이(3% 미만) TRA-8 처리된 생쥐의 비장 림프구에서 관찰되었다(도 16). 동일반응계 조직학적 연구로, 투넬 착색에 의해 예증된 바와 같이 대조군 생쥐의 비장에서 인간 T 세포가 비장내 재증식되며 단지 소수의 세포소멸 세포가 관찰된다는 것이 밝혀졌다. 대조적으로, 생존하는 인간 T 세포의 재증식은 TRA-8 처리된 생쥐의 비장에서는 관찰되지 않으며, 오히려 많은 세포소멸성 세포가 관찰되었다(도 17). 상기 결과는 TRA-8이 생체내에서 항-T 세포 활성을 가진다는 것을 예증하며, GVH 질병의 치료를 위한 본 발명의 항체의 용도를 시사한다.
실시예 15. TRA-8의 항-암 치료 활성
15.1 DR5 발현 및 인간 암 조직 및 세포계에서의 기능
i) TRA-8로 동일반응계 착색함에 의한 인간 암 조직에서의 DR5 발현
암 세포 및 조직이 별도로 더 높은 수준의 DR5를 발현시키는지 여부를 결정하기 위해, 20개의 유방암 조직, 6개의 난소암 조직, 5개의 결장암 조직 및 5개의 전립선암 조직을 포함하는 인간 암 조직의 패널을 면역조직화학을 위해 TRA-8로 착색하였다. 상기 암 조직의 대부분이 검출가능한 DR5를 발현시켰다. 상기 암 조직에서의 DR5의 발현 수준은 다양하였다. 일반적으로, 암 조직은 비연관 조직보다더 높은 수준의 DR5를 발현시켰다. 또한, DR5 발현은 p53의 돌연변이와 명백히 상관관계가 없었다.
ii) DR5 발현 및 인간 암 세포계에서의 기능(표 2).
9개의 인간 유방암 세포계, 3개의 난소암 세포계, 3개의 결장암 세포계 및 3개의 전립선암 세포계를 생체외에서 DR5의 세포면 발현 및 TRA-8-유도된 세포소멸에 대한 감수성에 대해 검사하였다. 9개의 유방암 세포계중 7개, 3개의 난소암 세포계중 3개, 3개의 결장암 세포계중 3개 및 3개의 전립선암 세포계중 3개가 다양한 수준의 세포면 DR5를 발현시켰다. 9개의 유방암 세포계중에서, TRA-8-중개된 세포소멸에 대해 3개는 매우 민감하였으며, 3개는 중간이었고 3개는 내성이 있었다. 3개의 난소암 세포계 모두가 매우 민감하였다. 3개의 결장암 세포계중 1개는 매우 민감한 반면, 2개는 중간 감수성을 가졌다. 3개의 전립선암 세포계중 2개는 중간 감수성을 가지고 1개는 내성이 있었다.
iii) 아드리아마이신과의 TRA-8의 조합된 세포독성.
몇개의 유방암 세포계에서, TRA-8-유도된 세포소멸에 대한 아드리아마이신의 효과를 검사하였다. 아드리아마이신을 다량으로 투여하자 추가적인 효과가 나타났다. 그러나, 일부 TRA-8 내성 세포계에서는 소량의 아드리아마이신을 투여하자 TRA-8-유도된 세포소멸이 상승작용적으로 증진되었다.
iv) TRA-8의 인간 암 세포에 대한 생체외 및 생체내 결합 활성.
방사성 동위원소 표지된 TRA-8을 사용하여, TRA-8의 유방암 세포계에 대한결합 활성을 종양이 이식된 SCID 생쥐의 생체외 및 생체내에서 검사하였다. 암 세포에 대한 생체외 결합 활성은 3nM의 Kd값으로 평가되었으며, 이는 ELISA를 사용한 이전의 평가와 일치하고, 가용성 TRAIL보다 50배 이상 높은 것이었다. 생체내에서, TRA-8은 이식된 종양 조직에 집중되었다.
15.2. NOD/SCID 생쥐의 TRA-8을 사용한 만성 림프성 백혈병의 요법
만성 림프성 백혈병(CLL)은 B 세포 악성의 일반적인 형태이다. CLL에서 대부분의 악성 B 세포는 성숙한 표현형이며 많은 세포소멸 자극에 내성이 있다. CLL을 앓는 5명의 환자의 B 세포에서 DR5 발현 및 기능을 검사하였다. 모든 환자가 PBMC에서 95% 이상의 CD19+ B 세포에 의해 나타내어지는 바와 같이 다수의 말초 B 세포를 가졌다. 정상 원발성 B 세포에 비해, 모든 환자의 CLL B 세포는 더 높은 수준의 세포면 DR5를 가졌으며 생체외에서 TRA-8 유도된 세포소멸에 더욱 민감하였다. 흥미롭게도, CLL B 세포는 또한 비스인돌말레이미드 VIII(BisVIII) 유도된 세포독성에 민감하였다. 이후 TRA-8 및 BisVIII로 조합하여 처리한 결과, CLL B 세포의 거의 50%가 죽은 반면 정상 B 세포는 반응하지 않은 채로 유지되었다(도 18). CLL B 세포의 NOD/SCID 생쥐로의 전달은 전달한지 5일 후에 수용 생쥐의 비장에서 재증식된 약 25% 내지 30%의 CD19+B 세포를 야기하였다. 그러나, 100㎍의 TRA-8을 3회 투여하는 치료로 수용 SCID 생쥐의 비장에서 5명의 환자중 4명의 CLL B 세포를 완전히 제거하였다. 따라서, TRA-8은 단독으로 또는 다른 물질과 함께 만성 림프성 백혈병의 치료제로서 활성이 있다.
실시예 16. cDNA 클로닝
(1) TRA-8의 중질 및 경사슬의 N-말단 아미노산 서열의 결정
TRA-8의 중질 및 경사슬의 cDNA를 수득하기 위해, TRA-8의 중질 및 경사슬 및 크로닝된 TRA-8 유전자의 N-말단 아미노산 서열을 공지된 기법으로 결정하였다.
항-인간 DR5 항체 TRA-8을 함유하는 용액 10㎍을 120분 동안 12% w/v의 겔 농도, 100V의 일정 전압을 이용하는 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동("SDS-PAGE")시켰다. 전기영동 후, 겔을 전달 완충액인 25mM Tris-HCl(pH 9.5), 20% 메탄올, 0.02% v/v SDS에 5분 동안 침지시켰다. 이후, 겔의 단백질 내용물을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막("PVDF 막"; 공극 크기 0.45um; 일본 밀리포어(Millipore) 제조)에 전달하고, 10V의 일정 전압, 4℃의 조건하에서 14시간 동안 블로팅 장치(KS-8451; 마리솔(Marisol))를 이용하여 전이 완충액중에 예비침지하였다.
이후, PVDF 막을 세척 완충액인 25mM NaCl, 10mM 붕산나트륨 완충액(pH 8.0)으로 세척한 후, 착색 용액(50% v/v 메탄올, 20% v/v 아세트산 및 0.05% w/v 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue))중에서 5분 동안 착색시켜 단백질 밴드를 위치시켰다. 이어서 PVDF 막을 90% v/v 메탄올 수용액으로 탈착색시키고, 이전에 PDVF 막에 위치된, 중사슬에 해당하는 밴드, 즉 낮은 이동성을 갖는 밴드 및 경사슬, 즉 높은 이동성을 갖는 밴드를 절제하고 탈이온수로 세척하였다.
중질 및 경사슬의 N-말단 아미노산 서열은 기상 단백질 서열기(PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.)를 사용하는 에드맨(Edman) 자동화법(Edman, P., et al., (1987), Eur. J. Biochem., 1, 80)에 의해 결정하였다.
중사슬에 해당하는 밴드의 N-말단 아미노산 서열은 하기와 같이결정되었고:
경사슬에 해당하는 밴드의 N-말단 아미노산 서열은 하기와 같이 결정되었다:
상기 아미노산 서열을 카바트(Kabat) 등에 의해 출판된 항체 아미노산 서열의 데이타베이스(Kabat E.A., et al., (1991), in "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II,"U.S. Department of Health and Human Services)와 비교한 결과, TRA-8의 중사슬(γ1 사슬) 및 경사슬(k 사슬)는 각각 아류형 3d 및 1에 속한다는 것이 밝혀졌다.
(2) cDNA 클로닝
상기 발견에 기초하여, 상기 생쥐 아류형에 속하는 유전자의 5'-미번역된 영역 및 3'-번역된 영역 부분과 혼성될 것으로 기대되는 올리고누클레오티드 프리머를 합성하였다. 이어서, TRA-8의 중질 및 경사슬을 인코딩하는 cDNA를 역전사 및 PCR(RT-PCR)의 하기 조합에 의해 클로닝하였다.
a) 주형
TRA-8 하이브리도마의 전체 RNA(ATCC No.PTA-1428)를 TRIzol 시약(GIBCO BRL)으로 추출하였다. PCR 반응을 위한 주형은 제 1-스트랜드 cDNA 합성 키트(애머셤 파마샤 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))를 사용하여 이 키트와 함께 제공된 안내 설명서에 따라 수득된 cDNA를 사용하였다.
b) PCR 프라이머
하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR용으로 합성하였다:
별도로 특정하지 않는 한, 이들 실시예들에서 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 파마샤 바이오테크(Pharmacia Biotech)에서 합성하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 증류수에 용해시킨 후에, -20℃에서 보관하였다.
c) PCR 반응
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
주형 cDNA, 총 33㎕의 반응 용액중 5㎕; 프라이머 1, 10pmol; 프라이머 2, 10pmol; 10x로 농축된 PCR 완충액(키트에서 제공됨), 10㎕; dNTP(각각 2.5mM), 4㎕; 및 Taq폴리머라제(프로메가(Promega), 5 유니트(unit)).
멸균 증류수를 상기 용액에 첨가하여 총 부피를 100㎕로 만들었다. 별도로 특정하지 않는 한, dNTP는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(각각 2.5mM)의 동몰 혼합물이다.
PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 상기 용액을 먼저 2분간 94℃에서 가열한 후, 94℃에서 30초간, 52℃에서 1분간 그리고 72℃에서 3분간 가열하는 주기를 40회 반복하였다. 이 절차가 완료된 후에, 반응 용액을 72℃에서 10분간 가열하였다.
이와 같이 수득된 증폭된 DNA 단편을 0.25㎍/㎖의 에티듐 브로마이드를 함유하는 1% 아가로즈 겔상에서 분리하였다. 원하는 DNA 단편을 포함하는 것으로 결정된 밴드(band)를 레이저 블레이드(razor blade)로 절단하고, DNA를 진 클린 키트(Gene Clean kit)(BIO101)를 사용하여 밴드로부터 회수하였다. DNA 단편을 pGEM-T 이지(Easy) 벡터(프로메가)를 사용하여 클로닝하였다. 이 클로닝은 다음과 같이 수행하였다:
PCR 반응 용액으로부터 회수한 DNA 단편을 50ng의 pGEM-T 이지 벡터(키트에서 제공됨)와 함께 1㎕의 10x 리가제 반응 완충액(6mM Tris-HCl(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 5mM 염화나트륨, 7mM β-머캅토에탄올, 0.1mM ATP, 2mM DTT, 1mM 스퍼미딘 및 0.1mg/㎖ 소혈청 알부민)과 혼합하고, 여기에 4 유니트의 T4 DNA 리가제(1㎕)를 첨가하였다. 혼합물의 총 부피를 멸균 증류수로 10㎕로 조정하고, 생성된 리가제 용액을 14℃에서 15시간 동안 항온처리하였다. 이후, 2㎕의 리가제 반응용액을 50㎕의 컴피턴트 이. 콜라이 균주 JM109(키트에서 제공되고 지시 매뉴얼에 따라 컴피턴트 균주로 제조함)에 첨가하고, 2㎕의 0.5M β-머캅토에탄올을 첨가한 후, 생성된 혼합물을 얼음중에서 30분간 놓아둔 후, 42℃에서 30초간 그리고 다시 얼음상에서 5분간 놓아두었다. 다음에, 2%(부피/부피(v/v))의 트립톤, 0.5%(중량/부피(w/v))의 효모 추출물, 0.05%(w/v)의 염화나트륨, 2.5mM의 염화칼륨, 1mM의 염화마그네슘 및 20mM의 글루코스를 포함하는 배지(이하, "SOC" 배지로 지칭한다) 500㎕를 상기 배양물에 첨가하고, 이 혼합물을 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 이후, 이 배양물을 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 L-브로쓰(broth) 아가 플레이트(1%(v/v)의 트립톤, 0.5%(w/v)의 효모 추출물, 0.5%(w/v)의 염화나트륨, 0.1%(w/v)의 글루코스 및 0.6%(w/v)의 박토-아가(디프코(Difco))에 도말하였다. 플레이트상에서 생존하는 암파실린 저항성 콜로니를 선별하고 백금 전이 루프(loop)로 긁어내어 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 L-브로쓰 배지에서 200rpm으로 진탕시키면서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 후에, 세포를 원심분리하여 수확하고, 이로부터 플라스미드 DNA를 알칼리 방법으로 제조하였다. 수득한 플라스미드를 TRA-8의 중사슬(heavy chain)에 대해서는 플라스미드 pH62로, TRA-8의 경사슬(light chain)에 대해서는 플라스미드 pL28로 지칭하였다. 이들 플라스미드를 갖는 형질전환된 이. 콜라이 균주를 이. 콜라이 JM109/pH62 및 이. 콜라이 JM109/pL28로 지칭하고, 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 국제 특허 미생물 기탁기관인 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)에 2001년 4월 20일자로 기탁하여 각각 수탁번호 FERM BP-7560 및 FERM BP-7561을 부여받았다. TRA-8의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 이들 DNA의 핵산 서열을 3700 DNA 분석기(ABI PRISM; 일본 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer Applied Biosystems))를 사용하여 디데옥시 방법으로 확인하였다(상거(Sanger, F.S.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74:5463-5467, 1997])
TRA-8의 중사슬 및 경사슬의 핵산 서열을 각각 서열목록의 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 제공하였다. TRA-8의 중사슬 및 경사슬의 아미노산 서열을 각각 서열목록의 서열번호: 23 및 서열번호:24로 제공하였다. 상기 확립된 TRA-8의 중사슬 및 경사슬의 N-말단 아미노산 서열은 정확히 일치하였다. 또한, 중사슬 및 경사슬의 아미노산 서열을 항체들의 아미노산 서열에 대한 데이타베이스와 비교한 결과, 중사슬의 경우 서열번호: 21에서 58번 내지 414번의 뉴클레오티드가 가변 영역을 차지하고, 서열번호: 21에서 415번 내지 1392번의 뉴클레오티드가 항구 영역을 차지하였다. 경사슬의 경우에는 서열번호: 22에서 64번 내지 387번 뉴클레오티드가 가변 영역을 차지하고, 서열번호: 22에서 388번 내지 702번 뉴클레오티드가 항구 영역을 차지하였다. CDR의 위치 및 서열을 또한 데이타베이스에서 상동성을 갖는 서열들을 비교함으로써 밝혀내었다. TRA-8의 중사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열번호: 25, 26 및 27로 나타내었다. TRA-8의 경사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열번호: 28, 29 및 30으로 나타내었다.
실시예 17. TRA-8-항체의 인간화 형태 고안
(1) TRA-8의 가변 영역의 분자 모델링
TRA-8의 가변 영역을 상동성 모델링으로 일반적으로 공지된 방법에 의해 분자 모델링을 수행하였다(문헌[Methods in Enzymology,203,121-153, 1991]). X선 결정학으로부터 유래한 3차원 구조를 제공하는 단백질 데이타 뱅크에 등록된 인간 면역글로불린의 가변영역의 1차 서열(문헌[Nuc. Acid Res.,28, 235-242, 2000])을 상기 결정된 TRA-8의 골격 영역과 비교하였다. 그 결과, 각각 TRA-8의 경사슬 및 중사슬의 골격 영역에 가장 높은 서열 상동성을 갖는 것으로 1NCD 및 1HIL을 선별하였다. 골격 영역의 3차원 구조를 TRA-8의 경사슬 및 중사슬에 상응하는 1NCD 및 1HIL의 좌표를 조합하여 "골격 모델"을 수득함으로써 생성하였다. 초티아(Chothia) 등에 의해 정의된 분류법을 사용하여, TRA-8의 CDR들을 다음과 같이 분류하였다: CDRL1, CDRL2, CDRH1및 CDRH2는 각각 정준 계열 2, 1, 1 및 3에 속하나, CDRL3은 임의의 특정 정준 계열에 속하지 않는다. CDRL1, CDRL2, CDRH1및 CDRH2의 CDR 루프를 그들의 각각의 정준 계열에 고유한 구조로 고정시켜 골격 모델에 통합시켰다. CDRL3은 토른톤(Thornton) 등(문헌[J. Mol. Biol.,263, 800-815, 1996])의 분류법에 따라 클러스터 8A의 구조를 할당하고, CDRH3은 H3 규칙을 사용하여 k(8)C로 분류하였다(문헌[FEBS letter,455, 188-197, 1999]). 그다음 CDRL3및 CDRH3의 대표적인 구조를 골격 모델에 통합시켰다.
최종적으로, 에너지 관점에서 TRA-8의 가변 영역의 가능한 분자 모델을 수득하기 위해, 바람직하지 않은 원자간 접촉을 제거하여 에너지를 계산하였다. 상기 절차는 상업적으로 입수가능한 통상적인 분자 모델링 시스템 ABM(옥스포드 몰레큘라 리미티드 인코포레이티드(Oxford Molecular Limited, Inc.)을 사용하여 수행하였다. 수득된 분자 모델에 대해서, 구조의 정확성을 프로첵(PROCHECK) 소프트웨어를 사용하여 더욱 조사하였다(문헌[J. Appl. Cryst.,26, 283-291, 1993]).
(2) 인간화된 TRA-8의 아미노산 서열 고안
인간화된 TRA-8 항체를 CDR 이식으로 일반적으로 공지된 방법으로 구성하였다(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033, 1989]). 수용자 항체를 골격 영역의 아미노산 상동성에 기초하여 선택하였다. TRA-8의 골격 영역의 서열을 항체들의 아미노산 서열에 대한 카바트 데이타베이스에서 모든 인간 골격 서열과 비교하였다(문헌[Nuc. Acid Res.,29, 205-206, 2001]). 그 결과, mAb58'CL 항체가 골격 영역에 대해 80%의 가장 높은 서열 상동성을 가짐에 따라 이를 수용자로서 선택하였다. mAb58'CL의 골격 영역의 아미노산 잔기를 TRA-8의 골격 영역의 아미노산 잔기와 나란히 정렬하고, 상이한 아미노산이 사용된 위치들을 확인하였다. 이들 잔기들의 위치를 상기 구성된 TRA-8의 3차원 모델을 사용하여 분석하여, 수용자상에 이식될 공여자 잔기를 퀸(Queen) 등(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 10029-10033, 1989])에 의해 제공된 기준에 따라 선택하였다. 인간화된 TRA-8의 서열을 수용자 항체인 mAb58'CL에 몇몇 공여자 잔기를 전달함으로써 하기 실시예에 기술된 바와 같이 구성하였다.
실시예 18. 인간화된 항체의 중사슬에 대한 발현 벡터의 구성
(1) 인간화된 TRA-8의 중사슬 가변 영역 DNA를 포함하는 플라스미드의 구성
인간화된 TRA-8의 활성을 결정하기 위해, 인간화된 TRA-8의 중사슬을 포함하는 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다. 그러나, TRA-8의 인간화는 이들 실시예로 한정되는 것은 아님에 유의한다.
서열목록의 서열번호: 31에 나타난 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 중사슬의 아미노산 서열을 인간화시켜, 13번 아미노산(라이신), 19번 아미노산(라이신), 40번 아미노산(트레오닌), 42번 아미노산(글루탐산), 44번 아미노산(아르기닌), 84번 아미노산(세린), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌) 및 115번 아미노산(류신)을 각각 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 글리신, 글리신, 아스파라긴, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 대체하였다.
인간화된 TRA-8의 중사슬 가변 영역을 암호화하는 DNA를 갖는 플라스미드(서열목록의 서열번호: 31)를 다음과 같이 구성하였다.
PCR을 사용하여 상기에 기술한 것을 각각 포함하는 하기 DNA 서열을 합성하였다.
하기 12개의 올리고뉴클레오티드가 합성되었다.
하기 2개의 PCR 프라이머를 전술한 바와 같이 합성하였다:
IgG-CH1 영역의 N-말단에 분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중사슬의 가변 영역 및 8개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 DNA의 합성을 각각의 PCR 조합을 사용하여 수행하였다.
DNA 단편을 하기와 같이 제조하였다.
PCR 반응 용액의 조성물:
올리고뉴클레오티드 A, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 B, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 C, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 D, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 E, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 F, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 G, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 H, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 I, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 J, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 K, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 L, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P2, 2μM;
10 x 파이로베스트 완충용액II, 10㎕;
dNTP 혼합액, 8㎕;
파이로베스트 DNA 중합효소, 0.5㎕; 및
3차 증류수로 최종 농도 50㎕ 적정.
PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다. 먼저 용액을 94℃에서 5분 동안 가온한 후, 98℃에서 10초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안 가온하는 사이클을 7회 반복하였다. 이 과정이 끝난 후에 반응 용액을 72℃에서 15분 동안 가온하였다. 동일한 양의 페놀-클로로포름(물로 포화된 50%부피/부피의 페놀, 48%부피/부피의 클로로포름 및 2%부피/부피의 이소아밀알콜)을 200㎕의 PCR 생성물을 각각 가하고 1분 동안 격렬하게 혼합하였다. 그리고 나서, 혼합액을 10,000 x g로 원심분리하고, 수성층을 회수하여 동일한 양의 클로로포름-이소아밀 알콜(96%부피/부피의 클로로포름 및 4%부피/부피의 이소아밀 알콜)과 혼합하였으며, 이를 다시 10,000 x g로 원심분리하여 수성층을 회수하였다. 이 단락에서 인용된 일련의 단계는 이후에 "페놀 추출"로서 지칭된다.
이어, 회수된 수성층에 대한 에탄올 추출을 수행하였다. 본원에서 사용되고 지칭된 바와 같이, "에탄올 침전"은 1/10부피의 3M 아세트산 나트륨(pH 5.2) 및 2.5 부피의 100% 에탄올을 처리될 용액에 가하여 혼합하고, 드라이 아이스를 사용하여 혼합액을 냉동시켰다. 이어, 얻어진 혼합액을 10,000 x g로 원심분리하여 DNA를 침전물로서 회수하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 얻어진 DNA 침전물을 진공 건조시키고, 3차 최소량의 증류수로 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기연동으로 분리하였다. 전기연동 후에 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 염색시켜 자외선하에서 DNA를 검출하였다. 인간화 TRA-8 DNA에 대응하는 DNA 밴드를 면도날을 사용하여 잘라내서 진클린 스핀 키트(Geneclean Spin Kit, BIO 101, CA, USA)를 사용하여 겔로부터 용출하였다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA는 7,500 x g로 원심분리하여 농축하고, 이어 에탄올 침전을 수행한 후, 최종적으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
얻어진 추출된 DNA 각각은 하기와 같이 pGEM-T Easy 벡터를 사용하여 클로닝하였다.
PCR 반응에서 회수된 DNA 단편, 5㎕;
10 x 테크 중합효소 완충용액, 1㎕;
dDNT 혼합액, 1㎕
테크 중합효소(5 단위/㎖), 1㎕; 및
3차 증류수로 최종 농도 10㎕ 적정.
상기 용액 각각을 70℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 제작사의 프로토콜에 따라 DNA 연결 키트 버젼 2.0(DNA Ligation Kit version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여 각 DNA 용액과 pGEM-T Easy 벡터를 연결하였다.
15℃에서 4시간 동안 배양한 후, 2㎕의 배양된 반응 용액을 1 내지 2 x 109 세포/㎖의 세포 농도(Takara Shuzo Co., Ltd.)의 100㎕의 컴피턴트 이. 콜라이 균주 JM109와 혼합하고, 혼합액을 얼음에 30분 동안 방치하고 나서, 42℃에서 30초 동안 방치하고, 다시 1분 동안 얼음에 방치하였다. 이어, 500㎕의 SOC 배지(2% 부피/부피의 트립톤, 0.5%중량/부피의 효모 추출물, 0.05%중량/부피의 염화나트륨,2.5mM중량/부피의 염화칼륨, 1mM의 염화마그네슘 및 10mM의 글루코스)에 혼합액을 가하여 교반하면서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 이어, 형질전환 균주를 분리하였고, "분자 클로닝 실험실용 설명서(Molecular Cloning A Laboratory Manual)"에 기술된 바와 같이 상기 균주로부터 플라스미드 DNA을 수득하였다. 인간화 TRA-8의 중사슬을 암호화하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을 3700 DNA 분석기(3700 DNA Analyzer, ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, 일본)를 이용하는 디데옥시 방법(생거(Sanger, F. S.)등(1997),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-5467)으로 확인하였다.
얻어진 플라스미드는 pHB14(인간화 TRA-8의 중사슬을 암호화하는 cDNA를 갖는 플라스미드)로 명명되었다. 이들 플라스미드를 정착하는 이. 콜라이 형질전환 균주(이. 콜라이 JM109/pHB14로 명명됨)를 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 국제 특허 미생물 기탁기관인 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지에 2001년 4월 20일자로 기탁하여 수탁번호 FERM BP-7556을 부여받았다.
(2) 인간화 TRA-8의 중사슬 가변영역 DNA를 갖는 발현 플라스미드의 제조
하기와 같이 인간화 TRA-8의 중사슬(상기에서 클로닝됨)를 암호화하는 DNA를 삽입하여 동물 세포용 제조합 발현 벡터를 제조하였다.
인간화 항-Fas 단일클론성 항체 HFE7A 및 인간 IgG1 불변영역 게노믹 DNA를 갖는 포유동물 세포용 벡터인 플라스미드 pSRHHH3(EP 특허공개 제 0-909-816 호)의 1㎕를 제한효소 HindIII 및 ApaI으로 절단하고 3% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 전기영동 후에 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 염색시켜 자외선하에서 DNA를 검출하였다. 인간화 HFE7A의 중사슬 가변영역은 없으면서 인간 IgG1 불변영역 게노믹 DNA을 갖는 벡터 DNA 밴드를 면도날을 사용하여 잘라내고, 진클린 스핀 키트(BIO 101, CA, USA)를 사용하여 겔로부터 용출하였다. 페놀 추출 후에, 용출된 DNA를 7,500 x g로 원심분리하여 농축한 후 에탄올 침전을 수행하였으며, 최종적으로 5㎕의 증류수에 용해켰고, CIP를 사용하여 탈인산화하였다. DNA 연결 키트 버젼 2.0(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여 인간화 TRA-8의 중사슬 가변영역을 암호화하는 DNA을 함유하는 1㎍의 pHB14 DNA 단편과 얻어진 절단되고 탈인산화된 플라스미드(100ng)를 연결하였으며, 이를 또한 HindIII 및 ApaI으로 절단하였다. 이어, 연결 혼합액을 사용하여 이. 콜라이 JM109를 형질전환시켰고, 이어 이를 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트에 도말하였다.
50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 2㎖의 액체 LB 배지에서 이 방법으로 얻어진 형질전환체를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 이어, 알칼라인-SDS 방법으로 얻어진 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다.
추출된 플라스미드 DNA를 HindIII 및 ApaI으로 절단하고, 3% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 인간화 TRA-8의 중사슬 가변영역을 암호화하는 삽입 DNA의 유무를 확인하였다. 유전자 서열 분석기(ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems)를 사용하여 DNA 염기서열분석에 의해 벡터내의 목적하는 DNA 단편의 삽입 및 방향성을 확인되었다. 인간화 TRA-8의 중사슬을 암호화하는 cDNA를 갖는 얻어진 발현 플라스미드를 pHB14-1로 명명하였다.
실시예 19. 인간화 항체의 경사슬의 발현 벡터의 제조
(1) TRA-8 인간화 항체의 경사슬의 발현 벡터의 제조
서열 목록의 서열번호: 46에 나타낸 바와 같이, 생쥐 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 경사슬의 아미노산 서열을 인간화할 경우에, TRA-8 경사슬의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번 아미노산(히스티딘), 9번 아미노산(라이신), 10번 아미노산(페닐알라닌), 11번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(트레오닌), 20번 아미노산(세린), 42번 아미노산(글루타민), 43번 아미노산(세린), 60번 아미노산(아스파르트산), 63번 아미노산(트레오닌), 77번 아미노산(아스파라긴), 78번 아미노산(발린), 80번 아미노산(세린), 83번 아미노산(류신), 85번 아미노산(아스파르트산), 87번 아미노산(페닐알라닌), 99번 아미노산(글리신), 103번 아미노산(류신) 및 108번 아미노산(알라닌)을 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 라이신, 알라닌, 세린, 세린, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로 각각 치환하였다. 얻어진 서열을 LM2로 명명하였다.
항-인간 DR-5 항체 TRA-8의 인간화 경사슬 아미노산 서열의 이 같은 유형을 갖는 발현 벡터를 하기와 같이 제조하였다.
1) 인간화 TRA-8의 경사슬의 가변영역 및 불변영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
PCR 조합을 사용하여 LM2 폴리펩티드 서열(서열목록의 서열번호: 46)을 암호화하는 DNA를 각각 합성하였으며, 이들 서열 각각은 인간화 항-DR5 항체 TRA-8의 가변영역과 인간 IgG 경사슬(κ사슬)의 불변영역을 융합한 것이다.
7AL1P(서열번호: 47) 및 7ALCN(서열번호: 48)에 더해서, PCR을 위한 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
2) 플라스미드 pCR3.1/M2-1의 구성(인간화 TRA-8 경사슬의 클로닝)
서열 목록의 서열번호: 46에서 정의된 아미노산 서열을 암화화하는 동일한 서열 목록의 서열번호: 55에서 정의된 LM2-DNA 단편을 2단계 PCR을 수행함으로써 제조하고, 플라스미드 벡터에 삽입하여 이. 콜라이에서 클로닝하였다.
a) 제 1 단계 PCR
분비 신호 서열 및 5'-말단에 부가된 HindIII 제한효소 절단 부위를 갖는 FRL1영역의 일부를 암호화하는 LM2-F1-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다. 주형 플라스미드 pHSGHM17 및 pSRPDHH를 유럽 특허공개 0 909 816 호에 기술한 방법에 따라 수득하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pHSGHM17 DNA(유럽 특허공개 0 909 816 호), 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKSPR11, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(Perkin Elmer), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
FRL1, CDRL1, FRL2및 CDRL2를 암호화하는 LM2-F2-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pL28 DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF11, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR12, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(Perkin Elmer), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
CDRL2, FRL3및 CDRL3의 일부를 암호화하는 LM2-F3-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다
CDRL3을 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pDRPDHH DNA(유럽 특허공개 0 909 816 호), 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF22, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR22, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
CDRL3및 FRL4및 3'-말단에 부가된 EcoR1 제한효소 절단 부위를 갖는 불변영역을 암호화하는 LM2-F4-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCF12, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(Perkin Elmer), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 전기영동 이후에 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 염색시켜 자외선하에서 DNA를 검출하였다. 검출된 개개의 DNA 밴드는 면도날로 잘라냈다.
b) 제 2 단계 PCR
상기에서 기술한 LM2-F1-DNA, LM2-F2-DNA, LM2-F3-DNA 및 LM2-F4-DNA 단편이 융합되어 있는 LM2-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
제 1 단계에서 제조된 LM2-F1-DNA의 겔 단편,
제 1 단계에서 제조된 LM2-F2-DNA의 겔 단편,
제 1 단계에서 제조된 LM2-F3-DNA의 겔 단편,
제 1 단계에서 제조된 LM2-F4-DNA의 겔 단편
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(Perkin Elmer), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
제조사의 프로토콜에 따라 유케리오틱 TA 클로닝 키트(Eukaryotic TA cloning Kit, Invitrogen)을 사용하여 상기에서 제조된 LM2-DNA 단편을 플라스미드 pCR3.1DNA에 삽입하고 키트내에 포함된 컴피턴트 이. 콜라이 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을 3700 DNA 분석기(ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, 일본)를 이용하는 디데옥시 방법(생거(Sanger, F. S.)등(1997),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-5467)으로 확인하였다.
얻어진 플라스미드를 pCR3.1/M2-1(인간화 TRA-8의 경사슬 가변영역 및 인간Ig 경사슬 불변영역을 암호화하는 cDNA를 갖는 플라스미드)로 명명하였다.
LM2-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/M2-1을 제한 효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하였다.
DNA 연결 키트 버젼 2.0(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여 1 ㎍의 클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA을 제한 효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하고, CIP로 탈인산화시켰다. 얻어진 탈인산화된 pHSG399 DNA 단편 및 LM2-DNA 단편(제한 효소 HindIII 및 EcoR1로 절단됨)을 연결하였다. 이어, 이. 콜라이 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환시키고, 이를 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)을 함유하는 LB 아가 배지에 도말하였다. 수득된 흰색 형질전환체를 50㎍/㎖의 클로람페니콜이 함유한 액체 LB 배지에 배양하였고, 알칼라인-SDS 방법에 따라 얻어진 배양액으로부터 플라스미드 DNA을 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA을 HindIII 및 EcoR1으로 절단하였고, 이어, LM2-DNA 단편을 갖는 클론을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 선발하였다.
상기 과정의 결과로서, 인간화 LM2 TRA-8 경사슬의 가변영역 및 인간 Igκ 사슬의 불변영역의 융합 단편을 갖는 플라스미드 pHSG/M2-1-4를 수득하였다. 이들 플라스미드를 정착시키고, 이. 콜라이 DH5α/pHSG.M2-1-4로서 명명된 이. 콜라이 형질전환 균주를 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 국제 특허 미생물 기탁기관인 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지에 2001년 4월 20일자로 기탁하여 수탁번호 FERM BP-7563을 부여받았다.
3) 플라스미드 pSR/M2-1(인간화 LM2 TRA-8 경사슬의 발형 벡터)의 제조
인간화 LM2 TRA-8 경사슬의 가변영역 및 인간 Igκ 사슬의 불변영역을 갖는 수득된 플라스미드 pHSG/M2-1-4를 제한효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하였다.
1㎍의 클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허공개 제 0-909-816 호)을 제한효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하고, 이어 CIP로 탈인산화시켰다. DNA 연결 키트 버젼 2.0(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여, 얻어진 탈인산화된 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M2-1-4로부터 수득된 HindIII-EcoR1 DNA 단편을 연결하였다. 이어, 이. 콜라이 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환시키고, LB 아가에 도말하였다. 수득된 형질전환체를 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양하였고, 알칼라인-SDS 방법에 따라 얻어진 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 유전자 서열 분석기(ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems)를 사용하여 DNA 염기서열분석에 의해 pSRPDHH 벡터내에 목적하는 DNA 단편의 삽입 및 방향성을 확인하였다.
인간화 TR-8의 경사슬을 암호화하는 cDNA를 갖는, 얻어진 발현 플라스미드를 pSR/M1로 명명하였다
실시예 20. 인간화 항체의 생산
상기에서 수득된 인간화 TRA-8 중사슬 및 인간화 TRA-8 경사슬의 발현 벡터로 COS-7 세포, 즉 원숭이 신장에서 유래한 세포주의 형질감염은 키트와 함께 제공되는 사용 설명서에 따라 FUGENE6 형질감염 시제 방법(Boehringer Mannheim Biochemica)에 의해 수행되었다.
COS-7 세포(아메리칸 타입 컬처 컬렉션 제 CRL-1651 호)는 10%의 소 태아 혈청(이후에 "FCS"로서 약으로 지칭됨; Moregate)로 추가된 둘베코의 모디파이드 이글 배지(Dubecco's Modified Eagle medium, 이후에 "D-MEM"으로 지칭됨; Gibco BRL)을 함유하는 배양 접시(배양 면적:57㎠; Sumitomo Bakelite)에서 성장하면서 반-융합체(semi-confluent, 3 x 106세포/접시)를 형성하였다.
동시에, 알칼라인-SDS 방법 및 염화세슘 농도 구배 원심분리에 의해 제조된 10㎍/접시(총 5개의 접시)의 인간화 DR5 중사슬 발현 벡터 DNA(pHA15-1) 및 10㎍/접시의 인간화 DR5 경사슬 발현 벡터 DNA를 혼합하고 나서 에탄올로 침전시켰으며, 이어 5㎕/접시의 dH2O에 현탁하였다.
15㎕/접시의 FUGENE6 형질감염 시약을 FCS가 없는 180㎕/접시의 D-MEM과 혼합한 후에, 이 FUGENE6 용액(185㎕/접시)을 10㎕/접시의 인간화 DR5 중사슬 발현 플라스미드 DNA 및 10㎕/접시의 인간화 DR5 경사슬 발현 플라스미드 DNA를 함유하는 5㎕/접시의 DNA 용액과 혼합하였다. 실온에서 15분 동안 배양한 후에, 얻어진 플라스미드 현탁액(200㎕)을 이전에 제조된 COS-7 플레이트에 가하였다. 37℃에서 24시간 동안 5% CO2존재하에서 배양한 후에, 배양 배지를 FCS가 없는 D-MEM으로 바꾸어 주었다. 37℃에서 72시간 동안 5% CO2존재하에서 배양한 후에, 배양 상층액을 회수하여 상층 유동액중의 발현 생성물을 정제하였다. 상기에 기술한 방법에 따라, COS-7 세포를 각각의 하기 플라스미드 조합으로 형질감염시켰다:
(A): 플라스미드 DNA 없음
(B): pHB14-1 및 pSR/M2-1의 동시형질감염
이어, 배양액을 원심분리(1,000r.p.m에서 5분)하여 상층액을 수집하였다. 상층액을 다시 원심분리(9,800r.p.m에서 15분)하고, 0.45㎛ 필터(ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, 카탈로그 넘버 25CS045 AS)로 여과하였다. 프로테인 G-포로스(PROTEIN G-POROS) 친화성 크로마토그래피(Applied Biosystems)을 이용하여 하기의 조건에서 같이 여액으로부터 IgG를 정제하였다:
HPLC: BioCAD 700E(Applied Biosystems)
컬럼: 단백질G-ID 감지기 카트리지(컬럼 크기:2.1 ㎜ID x 30㎜ LD, 층부피: 0.1㎖; 카탈로그 넘버 2-1002-00, Applied Biosystems)
용출 완충용액: 0.1M 글리신-HCl(pH 2.5)
중화 완충용액: 1M 트리스-HCl(pH 8.5)
검출: 280nm
유속:1㎖/분
분획 크기: 0.5㎖/0.5분
분획 시험관:1.5㎖ 폴리프로필렌 마이크로시험관
온도:4℃
모든 여액을 컬럼에 적용한 후에, 30㎖의 PBS(Sigma, 카탈로그 넘버 1000-3)을 사용하여 컬럼을 세척하였다. 용출 완충용액이 적용될 때, 분획 수집기가 작동한다. 각 분획 마이크로시험관은 이미 PBS내에 55㎕의 1M NaCl, 110㎕의 중화 완충용액 및 74㎕의 2㎎/㎖ 우 혈정 알부민(Sigma, 카탈로그 넘버 A-7030)을 함유하고 있었다. 8 내지 10번 분획을 수집하여 슬라이드-A 라이저(Slide-A lyzer, Pierce, 카탈로그 넘버 66450)을 사용하여 4℃에서 1일 동안 1ℓ의 PBS에서 투석하였다. 투석 완충용액을 2회 바꿔주었다.
항-인간 IgG에 대한 항체를 사용하여 ELISA에 의해 인간화 항체의 발현을 확인하고 제조된 배양액 상층 유동액중의 발현 생성물의 양적 측정을 수행하였다.
96 웰 플레이트(MaxiSorp, Nunc)의 각 웰에 흡수 완충용액(0.05M 탄화수소 나트륨, 0.02%, 아지드 나트륨, pH 9.6)에 0.5㎕/㎖의 최종 농도로 용해된 100㎕의 염소 항-인간 IgG Fc 특이 다클론성 항체(Kappel)를 가하였고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하여 항체를 흡수하게 하였다. 이어, 플레이트를 0.05% 트윈-20(BioRad)을 함유하는 350㎕의 PBS(-)(이후에 "PBS-T"로 지칭함)로 5회 세척하였다. 세척한 후 웰에 10% FCS를 함유하는 D-MEM으로 희석된 배양액 상층액을 가하였고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. PBS-T로 다시 세척한 후에, PBS-T로 10,000배 희석된 100㎕의 알칼라인 탈인산화효소-표지된 염소 항-인간 IgG Fc 특이 다클론성 항체(Jackson Immuno Research Lab.)를 각 웰에 가하였고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. PBS-T로 다시 세척한 후에 알칼라인 탈인산화효소 기질 키트(Alkaline Phosphatase Substrate Kit, BioRad)로부터 수득된 p-니트로페닐 포스페이트의 기질 용액을 키트와 함께 제공되는 사용 설명서에 따라 가하였다. 37℃에서 0.5 내지 1시간 동안 배양한 후에 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에서 10% FCS를 함유하는 D-MEM으로 특정 농도로 희석된 인간 플라즈마 면역글로빈 G 하위클라스1(IgG1)(Biopure AG)을 배양 상층 유동액에 함유된 인간화 DR5 항체의 농도 기준 시료로서 사용하였다.
그 결과, 배양 상층액에서 발현 및 정제된 생성물을 항 인간 IgG 항체로 특이적으로 검출하였다. 인간 IgG 항체의 양은 8.96㎍(800㎕)이었다.
실시예 21. 인간화 항체의 세포소멸-유도 활성
저카트 세포(ATCC 제 TIB-152)를 사용하여 정제된 인간화 TRA-8 항체의 세포소멸-유도 활성을 측정하였다.
5% CO2존재하에서 37℃에서 3일 동안 10% FCS(Gibco BRL)를 함유한 RPMI1640 배지에서 배양된 저카트 세포을 96-웰 마이크로플레이트(Sumitomo Bakelite)의 각 웰에 웰당 50㎕씩 분주하였다. 실시예 20에서 제조된 인간화 TRA-8을 실시예 20에 기술한 방법에 따라 유동액중의 이들의 농도를 측정함으로써 10% FCS를 함유하는 RPMI1640 배지로 목적하는 최종 생성물의 농도를 100ng/㎖로 조정하였다. 100ng/㎖로 조정된 발현 생성물의 용액 각각을 사용하여, 10% FCS를 함유하는 RPMI1640으로 연속적인 2배 희석을 반복함으로써 일련의 희석액을 제조하였다. 희석된 인간화 TRA-8 용액 각각을 각 웰에 웰당 50㎕씩 가하였다. 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후에, 1㎎/㎖의 XTT(2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-2H-테트라졸륨-5-카르복시아니라이드 분자내 염; Sigma Chemical Co.)를 함유하는 50㎕의 25μM PMS(페나진 메토설페이트, Sigma Chemical Co.)를 가하였다(XTT에 대해 250㎍/㎖의 최종 농도 및 PMS에 대해 5μM/㎖의 최종 농도). 3시간 동안 배양한 후에, 450nm에서 각각의 웰의 흡광도를 측정하여, 미토콘드라아의 감소 능력을 지표로서 사용함으로써 세포의 생존율을 계산하였다.
각 웰에서의 세포의 생존율은 하기 수학식 1에 따라 계산되었다:
생존율(%) = 100 x (a-b)/(c-b)
상기 식에서,
"a"는 시험 웰의 측정값이고;
"b"는 어떠한 세포도 없는 웰의 측정값이며;
"c"는 어떠한 항체도 첨가하지 않은 웰의 측정값이다.
그 결과, 실시예 20에서 제조된 발현 생성물(인간화 TRA-8)은 인간 DR5 항원을 발현시키는 T 임파구 세포주의 세포에서 세포소멸을 유도하는 것으로 증명되었다.
실시예 22. 다양한 DR5 분자에 대한 TRA-8의 반응성
다양한 DR5 분자에 대한 TRA-8의 반응성을 측정하기 위해 다음과 같이 활성화된 림프구를 사용하여 TRA-8의 반응성을 검사하였다.
먼저, 말초혈 샘플을 인간(30㎖), 명주원숭이(3㎖) 및 게잡이원숭이(20㎖)로부터 채취하였다. 상기 말초혈 샘플은 이들에 첨가된 1㎖의 헤파린(노보헤파린(Novoheparin; Novo)을 포함하고, 이어서 상기 샘플을 동일 부피의 피콜-파크(Ficoll-Paque) PLUS 용액(아머샴 파마샤 바이오테크) 1.072의 비중을 갖는 게잡이원숭이를 제외하고는 모두 비중이 1.077임) 위에 천천히 적층시키고, 말초혈 단핵구 세포 분획을 수득하기 위해 1,700rpm에서 30분간 원심분리하였다.이 단핵구 세포 분획을 행크스(Hanks) 균형 염 용액으로 2회 세척한 후, 세포 밀도가 1x106cell/㎖가 되도록 10% v/v FCS를 포함하는 RPMI 1640 배지 중에 현탁시켰다. 피토헤마글루티닌-P(PHA-P, 시그마 케미칼즈 캄파니(Sigma Chemicals, Co.))를 최종 농도가 5㎍/㎖가 되도록 생성된 현탁액에 첨가하고, 샘플을 37℃에서 5% v/v CO2하에 24시간동안 배양하였다. 24시간 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하고 세척하고 10% v/v FCS를 함유한 RPMI 1640 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 회수된 세포를 활성화하기 위해 인터루킨-2(아머샴 파마샤 바이오텍)를 최종 농도가 10 units/㎖가 되도록 상기 현탁액에 첨가하고, 이를 37℃에서 5% v/v CO2하에 72시간동안 배양하였다.
1x106개의 활성화된 림프구 세포를 함유하도록 계산된 활성화된 제제의 양을 시험관에 넣고 PBS 1㎖ 당 TRA-8를 0.5, 1, 5, 10㎍ 함유하는 각각의 용액 50㎕ 또는 PBS 50㎕ 중에 현탁시켰다. 생성된 현탁액을 얼음 위에서 1시간동안 방치한 후, 세포를 PBS 500㎕ 분취액으로 3회 세척한 후 PBS 1㎖ 당 FITC-표지된 항-마우스 IgG 항체(바이오리소스(Bioresource))의 용액 50㎕ 중에 현탁시켰다. 대조군으로서 PBS 500㎕ 중에 현탁된 세포를 사용하여, 유량세포분석기(FACS Calibur; 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.
형광 강도에 의한 세포수 분포를 얻고 총 세포수에 대한 착색된 세포수의 비를 계산하였다. 또한, 각각의 Kd 값을 TRA-8의 농도 및 총 세포수에 대한 착색된세포수의 비를 사용하여 계산하였다. 인간, 명주원숭이 및 게잡이원숭이의 활성화된 림프구에 대한 각각의 반응성 빈도는 거의 동일하였다. 따라서 TRA-8은 TRA-8이 원래 제조되었던 것에 비해 인간을 비롯한 광범위한 영장류 DR5와 결합할 수 있다.
실시예 23. 명주원숭이에서의 TRA-8 투여량 증감 연구
TRA-8 투여량 증감 예비 독성 연구는 1마리의 수컷 명주원숭이와 1마리의 암컷 명주원숭이를 사용하여 수행되었다. 1회 정맥내 투여 후 7일간의 투여 중지 기간을 두는 것을 1세트로 하여 이를 3번 실시하였다. TRA-8의 투여량을 50, 250 및 1250㎍/body로 설정하였다. 각각 치료한 후 48 시간 후에 대퇴정맥으로부터 혈액을 모아 플라즈마를 제조하였다. 플라즈마 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성을 분석기(FUJI DRI-CHEML: 후지 필름 메디칼 캄파니 리미티드(Fuji Film Medical Co., Ltd))를 사용하여 측정하였다. 모든 혈액을 어떠한 마취 없이 채취하였다. 그 결과, 각각의 치료 후에 간 손상을 나타내는 흔적이 플라즈마 생화학 검사에서 나타나지 않았다.
실시예 24. 암 세포에 대한 TRA-8의 시험관내 및 생체내 약물학적 연구
TRA-8이 항암 치료에 치료 효능을 갖는지의 여부를 측정하기 위해 다양한 암 세포주를 사용하여 TRA-8의 시험관내 치사 활성을 다음과 같이 검사하였다.
5% CO2의 존재하에 37℃에서 10% FCS(깁코(Gibco) BRL)를 포함하는 깁코 BRL로부터 수득된 RPMI1640 배지(위르캣의 경우), DMEM 배지(HCT-116의 경우), MEM-R(WiDr의 경우), 또는 DMEM-F12(COL2-Jck의 경우)에서 배양된 다양한 암 세포(2x103내지 8x103cell/50㎕)를 96개 웰 마이크로플레이트(스미토모 바켈라이트(Sumitomo Bakelite))의 각각의 웰에 분배하였다. 10% FCS를 함유한 배지와 함께 관심있는 최종 생성물의 농도가 100ng/㎖가 되도록 TRA-8을 조절하였다. TRA-8 용액(100ng/㎖)을 10% FCS를 함유한 배지로 연속 2배 희석시킴을 반복하여 일련의 희석액을 만들었다. 각각의 희석된 TRA-8 용액을 각 웰에 웰 당 50㎕로 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 37℃에서 72시간동안 반응시킨 후, 1㎎/㎖의 XTT를 함유한 25μM PMS(페나진 메토설페이트; 시그마 케미칼 캄파니) 50㎕를 첨가하였다(XTT의 최종 농도 250㎍/㎖ 및 PMS 5μM). 3시간동안 배양한 후, 각 웰의 450㎚에서의 흡광도를 측정하고 미토콘드리아의 감소력을 지수로서 사용하여 세포 생존율을 계산하였다.
각 웰에서의 세포 생존율을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다:
수학식 1
생존율(%)=100(a-b)/(c-b)
상기 식에서,
"a"는 시험 웰의 측정값이고;
"b"는 어떠한 세포도 없는 웰의 측정값이며;
"c"는 어떠한 항체도 첨가하지 않은 웰의 측정값이다.
결과를 하기 표 3에 나타내었다:
다양한 암 세포주는 시험관내 조건하에 TRA-8에 의해 강하게 유도된 세포소멸이다.
또한, WiDr 세포가 이식된 나체 마우스에서의 TRA-8의 생체내 항암 효과를 측정하였는데, TRA-8이 쥐과 DR5와 교차반응하지 않기 때문이다.
TRA-8 항인 DR5 항체를 인간 DR5 분자를 발현시키는 인간 이종이식편을 갖고 있는 나체 마우스에 투여하였다. 사용된 마우스는, 인간 결장암 세포주 WiDr(5㎜3)가 이식된 6주된 BAL b/c 누드/누드 마우스(암컷, 클리아 재팬 인코포레이티드(Clea Japan Inc.))였다. 종양 이식 후, 이식된 마우스를 매일 TRA-8(5㎍/body)의 관절내 주사로 14 회까지 치료하였다. WiDr 종양 성장은 종양 덩어리의 크기로 매일 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다:
이러한 방식으로, 치료하지 않은 모든 동물에서는 명백한 종양 성장이 나타냈지만 TRA-8로 치료한 동물에서의 종양 성장은 종양의 크기에 의해 나타난 바와 같이 저해되었다. 이러한 결과로 TRA-8이 생체내 종양 세포의 제거에 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 25. TRA-8의 조합 연구
인간 전립선암 세포주 PC-3은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 수득되고, 10% 태아 소 혈청(FBS, 하이클론(Hyclone)), 1% L-글루타민-200mM(25030-149, 깁코 BRL) 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 용액(P-7539, 시그마)을 함유한 F-12K 양분 혼합물(21127-022, 깁코 BRL)에서 유지되었다. 10% FBS 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 부가된 RPMI1640 배지(MED-008, IWAKI)를 다음의 실험에서 사용하였다. 지수적으로 성장하는 PC-3 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고 신선한 배지로 2회 세척하였다. 이어서 세포를 계측하고 신선한 배지 중에 5x104cell/㎖의 밀도로 재현탁시키고, 실험하기 하루 전날 100㎕/웰의 총 부피로 바닥이 평평한 96개 웰 플레이트(3598, 코닝-코스터(Corning-Coster))에 3중으로 분포시켰다. 디메틸설폭사이드에 용해된 대표적인 항암 약물인 파클리탁셀(Paclitaxel)(169-18611, 와코(Wako))(10㎎/㎖)을 신선한 배지로 희석한 후, 웰 당 50㎖의 세포를 함유한 96개 웰 플레이트에 첨가하였다. 디메틸설폭사이드의 최종 농도는 0.1% 미만이었다. 5% CO2분위기에서 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 신선한 배지로 희석된 TRA-8을 웰에 첨가하였다. 추가로 24시간동안 배양한 후, 1㎎/㎖의 XTT 및 25μM의 PMS를 함유한 최소한의 필수 배지(11095-0098, 깁코 BRL) 50㎕를 웰에 첨가하고, 플레이트를 6시간동안 배양하였다. OD450을 스펙트라 맥스(SPECTRA MAX 250)(Molecular Devices)에 의해 측정하고 세포 생존율을 하기 수학식 2에 따라 계산하였다:
세포 생존율(%) = (탁솔 및/또는 TRA-8(약품(들))로 처리된 세포를 함유한 웰에 대한 OD450- 세포 또는 약품을 함유하지 않은 웰에 대한 OD450) × 100 / (약품 처리되지 않은 세포를 함유한 웰에 대한 OD450- 세포 또는 약품을 함유하지 않은 웰에 대한 OD450)
대표적인 항암 약물인 파클리탁셀과 조합된 TRA-8에 관한 상기 검정의 결과는 다음과 같다. 파클리탁셀은, PC-3 세포의 세포 생존율을 200nM 이하의 농도에서도 여전히 존재하는 생존가능한 암 세포를 나타내는 신호의 40% 이하까지 감소시켰다. 특히, 0.1ng/㎖의 TRA-8의 첨가는 암 세포의 세포 생존율을 10% 이하까지 크게 감소시켰지만, TRA-8 하나만을 상기 농도로 적용한 후에는 세포 생존율의 감소가 나타나지 않았다. 이 결과는 TRA-8이 다른 항암 약물과 조합된 경우에 상승작용적으로 항암 활성을 나타내는 것임을 명백히 보여준다.
실시예 26. TRA-8의 다른 유형의 인간화 항체 분석
(1) 인간화 항체의 설계
TRA-8의 인간화 버젼은 일반적으로 CDR 그래프팅으로서 공지된 방법에 의해 제조되었다. mAB58'CL 항체를 참고 실시예 2에서 기술된 바와 같이 수용체로서 사용하고 TRA-8 항체의 CDR 영역을 수용체 상에서 그래프팅하였다. 골격 영역에서, TRA-8 또는 인간과 일치하는 서열로부터 몇몇 아미노산을 퀸(Queen) 등이 제공한 기준(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, (1989))에 의해 수용체 상에 그래프팅하고 인간화 TRA-8 서열을 하기 기술된 바와 같이 제조하였다.
(2) 다른 유형의 인간화 또는 마우스 TRA-8의 중사슬의 가변성 영역 DNA를 전달하는 플라스미드의 제조
서열목록의 서열번호: 56에 나타낸 바와 같이, 마우스 항인 DR5 항체 TRA-8의 중사슬의 아미노산 서열을 H1형 인간화하여 3번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(라이신), 19번 아미노산(라이신), 40번 아미노산(트레오닌), 42번 아미노산(글루탐산), 44번 아미노산(아르기닌), 84번 아미노산(세린), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌), 115번 아미노산(류신)을 글루타민, 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 글라이신, 글라이신, 아스파라진, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 각각 대체하였다.
서열목록의 서열번호: 59에 나타낸 바와 같이, 마우스 항인 DR5 항체 TRA-8의 중사슬의 아미노산 서열을 H3형 인간화하여 13번 아미노산(라이신), 19번 아미노산(라이신), 40번 아미노산(트레오닌), 42번 아미노산(글루탐산), 44번 아미노산(아르기닌), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌), 115번 아미노산(류신)을 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 글라이신, 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 각각 대체하였다.
서열목록의 서열번호: 60에 나타낸 바와 같이, 마우스 항인 DR5 항체 TRA-8의 중사슬의 아미노산 서열을 H4형 인간화하여 13번 아미노산(라이신), 19번 아미노산(라이신), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌), 115번 아미노산(류신)을 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 각각 대체하였다.
서열목록의 서열번호: 61에 나타낸 바와 같이, 재조합 TRA-8의 중사슬의 가변성 영역 DMA를 전달하는 플라스미드를 "M형"으로 지칭하였다. 또한 실시예 17 및 18에 기술된 인간환 TRA-8을 "H2형"으로 지칭하였다.
인간화 또는 재조합 TRA-8의 DNA 암호화 중사슬의 가변성 영역을 전달하는 플라스미드는 다음과 같이 제조되었다.
PCR을 사용하여 하기 기술된 바와 같이 구성된 각각의 DNA 서열을 제조하였다.
하기 24개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
하기 2개의 PCR 프라이머를 전술한 바와 같이 합성하였다:
분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중사슬의 가변성 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단에 있는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 H1형 DNA 암호화 폴리펩티드 사슬의 합성은 각각 PCR의 조합을 사용하여 수행되었다.
H1형-DNA 단편은 다음과 같이 제조되었다.
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레이티드 A, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 B2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 C, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 D, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 E, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 F, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 G, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 H2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 I, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 J, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 K, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 L, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트(Pyrobest) 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
50㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 재증류수.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다. 먼저 용액을 94℃에서 5분간 가열한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간 가열하는 순환을 7번 반복하였다. 상기 과정을 완결한 후, 반응 용액을 72℃에서 15분간 가열하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 생성된 DNA 침전물을 진공하에 건조시키고, 최소량의 재증류수에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 착색시켜 자외선하에 DNA를 검출할 수 있게 하였다. H1형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도칼로 절단하고, 제네클린 스핀 키트(Geneclean Spin Kit)(미국 캘리포니아주 BIO 101)를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA를 7,500Xg에서의 원심분리에 의해 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중사슬의 가변성 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단에 있는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 H3형 DNA 암호화 폴리펩티드 사슬의 합성은 각각 PCR의 조합을 사용하여 수행되었다.
H3형-DNA 단편은 다음과 같이 제조되었다.
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레이티드 A, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 B, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 C, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 D, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 E2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 F, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 G, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 H, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 I, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 J, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 K2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 L, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
50㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 재증류수.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다. 먼저 용액을 94℃에서 5분간 가열한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간 가열하는 순환을 7번 반복하였다. 상기 과정을 완결한 후, 반응 용액을 72℃에서 15분간 가열하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 생성된 DNA 침전물을 진공하에 건조시키고, 최소량의 재증류수에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 착색시켜 자외선하에 DNA를 검출할 수 있게 하였다. H3형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도칼로 절단하고, 제네클린 스핀 키트를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA를 7,500Xg에서의 원심분리에 의해 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중사슬의 가변성 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단에 있는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 H4형 DNA 암호화 폴리펩티드 사슬의 합성은 각각 PCR의 조합을 사용하여 수행되었다.
H4형-DNA 단편은 다음과 같이 제조되었다.
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레이티드 A, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 B, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 C2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 D, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 E2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 F, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 G, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 H, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 I2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 J, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 K2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 L, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
50㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 재증류수.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다. 먼저 용액을 94℃에서 5분간 가열한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간 가열하는 순환을 7번 반복하였다. 상기 과정을 완결한 후, 반응 용액을 72℃에서 15분간 가열하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 생성된 DNA 침전물을 진공하에 건조시키고, 최소량의 재증류수에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 착색시켜 자외선하에 DNA를 검출할 수 있게 하였다. H4형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도칼로 절단하고, 제네클린 스핀 키트를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA를 7,500Xg에서의 원심분리에 의해 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
분비 신호 서열, 재조합 TRA-8 중사슬의 가변성 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단에 있는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 M형 DNA 암호화 폴리펩티드 사슬의 합성은 각각 PCR의 조합을 사용하여 수행되었다.
M형-DNA 단편은 다음과 같이 제조되었다.
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레이티드 A, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 B3, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 C2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 D, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 E3, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 F2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 G, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 H3, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 I2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 J, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 K3, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 L2, 10 pmol;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레이티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
50㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 재증류수.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다. 먼저 용액을 94℃에서 5분간 가열한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간 가열하는 순환을 7번 반복하였다. 상기 과정을 완결한 후, 반응 용액을 72℃에서 15분간 가열하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 생성된 DNA 침전물을 진공하에 건조시키고, 최소량의 재증류수에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 착색시켜 자외선하에 DNA를 검출할 수 있게 하였다. M형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도칼로 절단하고, 제네클린 스핀 키트를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA를 7,500Xg에서의 원심분리에 의해 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
생성된 각각의 추출된 DNA(H1형, H3형, H4형 및 M형)를 다음과 같이 pGEM-T 이지(Easy) 벡터(프로메가(Promega)를 사용하여 클로닝하였다:
PCR 반응으로부터 회수된 DNA 단편(H1, H3, H4 또는 M), 5㎕;
10 X 태그 폴리머라제 완충액, 1㎕;
dNTP 혼합물, 1㎕;
태그 폴리머라제(5 unit/㎖), 1㎕; 및
10㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 재증류수.
상기 각각의 용액을 70℃에서 30분간 반응시킨 후, 각각의 DNA 용액 및 pGEM-T 이지 벡터를 제작자의 프로토콜에 따라 DNA 연결 키트 버젼 2.0(다카라 수조 캄파니 리미티드(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 연결시켰다.
15℃에서 4시간동안 배양시킨 후, 2㎕의 배양된 반응 용액을 1x109내지 2x109cell/㎖의 세포 밀도로 100㎕의 경쟁 이. 콜라이 JM109(다카라 수조 캄파니 리미티드)과 혼합하고, 혼합물을 얼음상에 30분간, 42℃에서 30초간, 다시 얼음상에 1분간 방치시켰다. 이어서 500㎕의 SOC 배지(2% v/v 트립톤, 0.5% w/v 효모 추출액, 0.05% w/v 염화나트륨, 2.5mM w/v 염화칼륨, 1mM 염화마그네슘 및 20mM 글루코즈)를 상기 혼합물에 첨가하고, 진탕시키면서 추가 1시간동안 배양하였다. 이어서, 형질전환된 균주를 단리시키고, 플라스미드 DNA를 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual"]에 기술된 바와 같이 균주로부터 제조하였다. 인간화 또는 마우스 TRA-8의 DNA 암호화 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 각각 디데옥시 방법(생거(Sanger, F.S.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977)])에 의해 3700 DNA 분석기(ABI PRISM; 일본 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템(Perkin Elmer Applied Biosystems))를 사용하여 확인되었다.
생성된 플라스미드를 pHA15(인간화 TRA-8의 cDNA 암호화 H1형 중사슬을 전달하는 플라스미드), pHC10(인간화 TRA-8의 cDNA 암호화 H3형 중사슬을 전달하는 플라스미드), pHD21(인간화 TRA-8의 cDNA 암호화 H4형 중사슬을 전달하는 플라스미드) 및 pM11(재조합 TRA-8의 cDNA 암호화 중사슬을 전달하는 플라스미드)로 지칭하였다. 이들 플라스미드를 갖는 형질전환된 이. 콜라이 균주를 이. 콜라이 JM109/pHA15, 이. 콜라이 JM109/pHC10, 이. 콜라이 JM109/pHD21 및 이. 콜라이 JM109/pM11로 지칭하고, 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 국제 특허 미생물 기탁기관인 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지에 2001년 4월 20일자로 기탁하여 각각 수탁번호 FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 및 FERM BP-7559를 각각 부여받았다.
(3) 여러가지 유형의 인간화 TRA-8 또는 마우스 TRA-8의 중사슬 가변 영역 DNA를 포함하는 발현 플라스미드의 구성
동물 세포를 위한 재조합 발현 벡터를, 다음과 같이 H1형, H3형 및 H4형 인간화 TRA-8 또는 M형 키메라 TRA-8(상기에서 클로닝됨)을 암호화하는 DNA를 삽입함으로써 구성하였다.
인간화 항-Fas 단일클론성 항체 HFE7A의 중사슬 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역 게놈 DNA(포유류 세포를 위한 발현 벡터)를 포함하는 플라스미드 pSRHHH3(유럽 특허 출원 제 EP 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 ApaI로 분해하고, 3% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 전기영동후, 겔을 1㎍/㎖의 에티듐 브로마이드 수용액으로 염색하여 UV광하에서 DNA를 검출하였다. 인간 IgG1 불변 영역 게놈 DNA를 함유하고 인간화 HFE7A의 중사슬 가변 영역을 함유하지 않는 벡터 DNA 밴드를 레이저 블레이드를 사용하여 절단해내고, 진클린 스핀 키트를 사용하여 겔로부터 용리시켰다. 페놀 추출후, 용리된 DNA를 7,500×g으로 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시키고, 최종적으로 증류수 5㎕에 용해시킨 후, CIP를 사용하여 탈인산화하였다. 분해되고 탈인산화된 수득된 플라스미드(100ng)를 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 사용하여, 역시 Hind III 및 ApaI로 분해된 인간화 또는 키메라 TRA-8의 중사슬 가변 영역을 암호화하는 DNA를 함유한 pHA15, PHC10, pHD21 또는 pM11의 DNA 단편 1㎍과 연결시켰다. 이어서, 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 JM109를 형질전환시키고, 이를 50㎍/㎖의 암피실린을 함유한 LB 한천 플레이트상에 도말하였다.
이러한 방법으로 수득된 형질전환체를 50㎍/㎖의 암피실린을 함유한 액체 LB 배지 2㎖에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 수득된 배양물로부터 알칼리성-SDS법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하였다.
추출된 플라스미드 DNA를 Hind III 및 ApaI로 분해하고 3% w/v의 아가로스 겔 전기영동을 실시하여, 인간화 또는 키메라 TRA-8의 중사슬 가변 영역을 암호화하는 DNA 삽입의 존재 여부를 확인하였다. 벡터내에서의 목적하는 DNA 단편의 삽입 및 배향을, 유전자 서열 분석기(ABI PRISM 3700 DNA 분석기; 어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 DNA를 서열화함으로써 확인하였다. 인간화 또는 키메라 TRA-8의 중사슬을 암호화하는 cDNA를 포함하는 수득된 발현 플라스미드를 각각 pHA15-1, pHC10-3, pHD21-1 및 pM11-1로 명명하였다.
(4) 인간화 경사슬을 위한 벡터의 구성
(4.1) 인간화 항체의 경사슬(LM1형)을 위한 발현 벡터의 구성
서열목록의 서열번호: 72에 도시된 바와 같이, 치환을 수반한 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8 경사슬 아미노산 서열의 다른 인간화(LM1형)에서, TRA-8 경사슬 아미노산 서열의 N-말단으로부터 3번 아미노산(발린), 8번 아미노산(히스티딘), 9번 아미노산(라이신), 10번 아미노산(페닐알라닌), 11번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(트레오닌), 20번 아미노산(세린), 42번 아미노산(글루타민), 43번 아미노산(세린), 60번 아미노산(아스파르트산), 63번 아미노산(트레오닌), 77번 아미노산(아스파라긴), 78번 아미노산(발린), 80번 아미노산(세린), 83번 아미노산(류신), 85번 아미노산(아스파르트산), 87번 아미노산(페닐알라닌), 99번 아미노산(글리신), 103번 아미노산(류신) 및 108번 아미노산(알라닌)을 각각 글루타민, 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 라이신, 알라닌, 세린, 세린, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로 치환하였다. 수득된 서열을 LM1로 명명하였다.
상기 유형의 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 인간화 경사슬 아미노산 서열(LM1형, 서열목록의 서열번호: 72)을 포함하는 발현 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다.
1) 인간화 TRA-8 경사슬(LM1형)의 가변 영역 및 불변 영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각 인간화 항-인간 DR5 항체 TRA-8 경사슬(LM1형)의 가변 영역 및 인간 Ig 경사슬(κ사슬)의 불변 영역의 융합물인, LM1 폴리펩티드 사슬(서열목록의 서열번호: 72)을 암호화하는 DNA를 PCR 조합을 사용하여 각각 합성하였다.
7AL1P(서열번호: 47), 7ALCN(서열번호: 48), HKCDF11(서열번호: 50), HKCDR12(서열번호: 51), HKCDF22(서열번호: 52), HKCDR22(서열번호: 53) 및 HKCF12(서열번호: 54) 이외에, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 합성하였다:
2) 플라스미드 pCR3.1/LM1-2의 구성(인간화 TRA-8 경사슬 LM1형의 클로닝)
서열목록의 서열번호: 72에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 LM1-DNA 단편을 2단계 PCR을 수행하여 제조하고, 플라스미드 벡터내로 삽입하고, 이. 콜라이에서 클로닝하였다.
a) 제 1 단계 PCR
분비 신호 서열, 및 5'-말단에 Hind III 제한 효소 절단 부위가 부가된 FRL1영역의 일부를 암호화하는 LM1-F1-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다. 주형 플라스미드 pHSGHM17 및 pSRPDHH는 유럽 특허 출원 제 EP 0 909 816 A1 호의 기재에 따라 수득하였다.
반응 용액의 조성:
플라스미드 pHSGHM17 DNA 25ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P 50pmol, 올리고뉴클레오티드 프라이머 HKSPR12 50pmol, dNTPs 칵테일 5㎕, 10×PCR 완충액 5㎕ 및 ampliTaq DNA 중합효소(퍼킨엘머) 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
FRL1, CDRL1, FRL2및 CDRL2의 일부를 암호화하는 LM1-F2-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
플라스미드 pL28 DNA 25ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF11 50pmol, 올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR12 50pmol, dNTPs 칵테일 5㎕, 10×PCR 완충액 5㎕ 및 ampliTaq DNA 중합효소 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
CDRL2, FRL3, 및 CDRL3의 일부를 암호화하는 LM1-F3-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
플라스미드 pSRPDHH DNA 25ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF22 50pmol, 올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR22 50pmol, dNTPs 칵테일 5㎕, 10×PCR 완충액 5㎕ 및 ampliTaq DNA 중합효소 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
CDRL3, FRL4및 불변 영역을 암호화하고 3'-말단에 EcoR I 제한 효소 절단 부위가 부가된 LM1-F4-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
플라스미드 pSRPDHH DNA 25ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCF12 50pmol, 올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN 50pmol, dNTPs 칵테일 5㎕, 10×PCR 완충액 5㎕ 및 ampliTaq DNA 중합효소 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
PCR후 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하였다. 전기영동후의 겔을 1㎍/㎖의 에티듐 브로마이드로 염색하여, 생성된 DNA를 UV광하에서 검출하였다. 이렇게 하여 검출된 각각의 DNA 밴드를 레이저로 절개하였다.
b) 제 2 단계 PCR
상기 LM1-F1-DNA, LM1-F2-DNA, LM1-F3-DNA 및 LM1-F4-DNA 단편이 융합된 LM1-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F1-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F2-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F3-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F4-DNA의 겔 단편,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN 50pmol,
dNTPs 칵테일 5.0㎕,
10×PCR 완충액 5.0㎕ 및
ampliTaq DNA 중합효소 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
이렇게 하여 제조된 LM1-DNA 단편을 유카리오틱(Eukaryotic) TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 사용하여 제작자의 프로토콜에 따라 플라스미드 pCR3.1DNA내로 삽입하고, 상기 키트에 함유된 적격 이. 콜라이 TOP10F'내로 도입하였다. 인간화 TRA-8 경사슬(LM1형)을 암호화하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을, 3700 DNA 분석기(ABI PRISM; 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템스, 저팬)를 사용하여 디데옥시법(Sanger, F.S. et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467)으로 확인하였다.
수득된 플라스미드를 pCR3.1/LM1-2(인간화 TRA-8 경사슬(LM1형)의 가변 영역 및 인간 Ig 경사슬의 불변 영역을 암호화하는 cDNA를 포함하는 플라스미드)로 명명하였다.
LM1-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/LM1-2를 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 분해하였다.
클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 분해하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 수득된 탈인산화된 pHSG399 DNA 및 LM1-DNA 단편(제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 분해됨)을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 사용하여 연결시켰다. 이어서, 이. 콜라이 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환시키고, 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖의 클로르암페니콜(최종 농도)을 함유한 LB 한천 배지상에 도말하였다. 수득된 백색 형질전환체를, 50㎍/㎖의 클로르암페니콜을 함유한 액체 LB 배지에서 배양하고, 수득된 배양물로부터 알칼리성-SDS법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA를 Hind III 및 EcoR I로 분해하고, 이어서 LM1-DNA 단편을 포함하는 클론을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 절차의 결과로서, 인간화 LM1 TRA-8 경사슬의 가변 영역 및 인간 Igκ사슬의 불변 영역의 융합 단편을 포함하는 플라스미드 pHSG/M1-2-2가 수득된다. 이들 플라시미드를 내포한 형질전환체 이. 콜라이 균주(이. 콜라이 DH5α/pHSG/M1-2-2로 명명함)를 미생물 기탁에 관한 부타페스트 조약에 따라 국제 특허 유기물 기탁기관인, 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 내셔널 인스티튜트 오브 어드밴스트 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지에 2001년 4월 20일에 기탁하고, 수탁번호 FERM BP-7562를 부여받았다.
3) 플라스미드 pSR/LM1-2의 구성(인간화 LM1 TRA-8 경사슬을 위한 발현 플라스미드)
인간화 LM1 TRA-8 경사슬의 가변 영역 및 인간 Igκ사슬의 불변 영역의 융합 단편을 포함하는 수득된 플라스미드 pHSG/M1-2-2를 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 분해하였다.
클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허 출원 제 EP 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 분해하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. pHSG/M1-2-2로부터 수득된 탈인산화된 pSRPDHH DNA 및 Hind III-EcoR I 단편을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 사용하여 연결시켰다. 이어서, 이. 콜라이 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환시키고, LB 한천상에 깐다. 수득된형질전화체를 100㎍/㎖의 암피실린을 함유한 액체 LB 배지에서 배양하고, 수득된 배양물로부터 알칼리성-SDS법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하였다. pSRPDHH 벡터내에서의 목적하는 DNA의 삽입 및 배향을, 유전자 서열 분석기를 사용하여 DNA를 서열화함으로써 확인하였다.
인간화 LM1 TRA-8 경사슬을 암호화하는 cDNA를 포함한 수득된 발현 플라스미드를 pSR/LM1-2로 명명하였다.
(4.2) 인간화 항체의 경사슬(LM3형)을 위한 발현 벡터의 구성
서열목록의 서열번호: 73에 도시된 바와 같이, 치환을 수반한 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8 경사슬 아미노산 서열의 다른 인간화(LM3형)에서, TRA-8 경사슬 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번 아미노산(히스티딘), 9번 아미노산(라이신), 10번 아미노산(페닐알라닌), 11번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(트레오닌), 20번 아미노산(세린), 42번 아미노산(글루타민), 43번 아미노산(세린), 77번 아미노산(아스파라긴), 78번 아미노산(발린), 80번 아미노산(세린), 83번 아미노산(류신), 85번 아미노산(아스파르트산), 87번 아미노산(페닐알라닌), 99번 아미노산(글리신), 103번 아미노산(류신) 및 108번 아미노산(알라닌)을 각각 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 라이신, 알라닌, 세린, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로 치환하였다. 수득된 서열을 LM3으로 명명하였다.
상기 유형의 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 인간화 경사슬 아미노산 서열(LM3형, 서열목록의 서열번호: 73)을 포함하는 발현 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다.
1) 인간화 LM3 TRA-8 경사슬의 가변 영역 및 불변 영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각 인간화 항-DR5 항체 TRA-8 경사슬의 가변 영역 및 인간 Ig 경사슬(κ사슬)의 불변 영역의 융합물인, LM3 폴리펩티드 사슬(서열목록의 서열번호: 73)을 암호화하는 DNA를 각각 PCR의 조합을 사용하여 합성하였다.
7AL1P(서열번호: 47) 및 7ALCN(서열번호: 48) 이외에, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 합성하였다:
2) 플라스미드 pCR3.1/LM3-3-44의 구성(인간화 TRA-8 경사슬 LM3형의 클로닝)
서열목록의 서열번호: 73에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 LM3-DNA 단편을 2단계 PCR을 수행하여 제조하고, 플라스미드 벡터내로 삽입하고,이. 콜라이에서 클로닝하였다.
a) 제 1 단계 PCR
3'-말단에 Hind III 제한 효소 절단 부위가 부가된 분비 신호 서열 영역, FRL1, CDRL1, FRL2, 및 CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4및 불변 영역의 일부를 암호화하는 LM3-F31B-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F1 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R1 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F22 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R22 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F3 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R3 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F42 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R4 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F5 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R52 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F6 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R6 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R7 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 LR17 50pmol,
dNTPs 칵테일 5㎕,
10×PCR 완충액 5㎕ 및
ampliTaq DNA 중합효소 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
3'-말단에 Hind III 제한 효소 절단 부위가 부가된 불변 영역의 일부를 암호화하는 LM3-F31C-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다.
주형 플라스미드 pSRPDHH는 유럽 특허 출원 제 EP 0 909 816 A1 호의 기재에 따라 수득하였다.
반응 용액의 조성:
플라스미드 pSRPDHH DNA 25ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7 50pmol, 올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN 50pmol, dNTPs 칵테일 5㎕, 10×PCR 완충액 5㎕ 및 ampliTaq DNA 중합효소 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
PCR후 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하였다. 전기영동후의 겔을 1㎍/㎖의 에티듐 브로마이드로 염색하여, 생성된 DNA를 UV광하에서 검출하였다. 이렇게 하여 검출된 각각의 DNA 밴드를 레이저로 절개하였다.
b) 제 2 단계 PCR
상기 LM3-F31B-DNA 및 LM3-F31C-DNA 단편이 융합된 LM3-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM3-F31B-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM3-F31C-DNA의 겔 단편,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN 50pmol,
dNTPs 칵테일 5.0㎕,
10×PCR 완충액 5.0㎕ 및
ampliTaq DNA 중합효소 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 재증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조절하고, PCR에 사용하였다.
PCR 열적 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 열 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
이렇게 하여 제조된 LM3-DNA 단편을 유카리오틱 TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 사용하여 제작자의 프로토콜에 따라 플라스미드 pCR3.1DNA내로 삽입하고, 상기 키트에 함유된 적격 이. 콜라이 TOP10F'내로 도입하였다. 인간화 LM3 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을, 3700 DNA 분석기(ABI PRISM; 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템스, 저팬)를 사용하여 디데옥시법(Sanger, F.S. et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467)으로 확인하였다.
수득된 플라스미드를 pCR3.1/LM3-3-44(인간화 LM3 TRA-8의 경사슬 가변 영역 및 인간 Ig 경사슬 불변 영역을 암호화하는 cDNA를 포함하는 플라스미드)로 명명하였다.
LM3-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/LM3-3-44를 제한 효소 Hind III 및 CcoR I로 분해하였다.
클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 분해하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 수득된 탈인산화된 pHSG399 DNA 및 LM3-DNA 단편(제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 분해됨)을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 사용하여 연결시켰다. 이어서, 이. 콜라이 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환시키고, 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖의 클로르암페니콜(최종 농도)을 함유한 LB 한천 배지상에 깐다. 수득된 백색 형질전환체를, 50㎍/㎖의 클로르암페니콜을 함유한 액체 LB 배지에서 배양하고, 수득된 배양물로부터 알칼리성-SDS법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA를 Hind III 및 EcoR I로 분해하고, 이어서 LM3-DNA 단편을 포함하는 클론을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 절차의 결과로서, 인간화 LM3 TRA-8 경사슬의 가변 영역 및 인간 Igκ사슬의 불변 영역의 융합 단편을 포함하는 플라스미드 pHSG/M3-3-22가 수득된다. 이들 플라시미드를 내포한 형질전환체 이. 콜라이 균주(이. 콜라이 DH5α/pHSG/M3-3-22로 명명함)를 미생물 기탁에 관한 부타페스트 조약에 따라 국제 특허 유기물 기탁기관인, 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 내셔널 인스티튜트 오브 어드밴스트 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지에 2001년 4월 20일에 기탁하고, 수탁번호 FERM BP-7564를 부여받았다.
3) 플라즈미드 pSR/LM3-3-44-10(인간화 LM3 TRA-8 경사슬 발현 플라즈미드)의 구성
수득한 인간화 LM3 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Igk 사슬의 불변 부위의 융합 분절을 갖는 플라즈미드 pHSG/M3-3-22를 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하였다.
클로닝 플라즈미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허 공개 제 EP 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, CIP로 탈인산화시켰다. 생성된 탈인산화 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M3-3-22로부터 수득한 HindIII-EcorRI DNA 분절을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드(Takara Syuzo Co., Ltd.))을 이용하여 연결시켰다. 이어서, 연결된 DNA로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고 LB한천 배지에서 확산배양하였다. 수득한 형질전환주를 10㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지에서 배양하고 생성된 배양물로부터 알칼리성-SDS 방법에 따라서 플라즈미드 DNA를 추출하였다. pSRPDHH 벡터에서 목적하는 DNA 분절의 삽입 및 방향성을 유전자 서열 분석기(ABI 프리즘(Prism) 3700 DNA 분석기; 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 이용한 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
생성된 인간화 LM3 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 cDNA를 갖는 발현 플라즈미드를 pSR/LM3-3-44-10으로 명명하였다.
(4.3) 인간화 항체(LM4형)의 경사슬의 발현 벡터의 구성
서열목록의 서열번호: 74에 나타낸 바와 같이, TRA-8 경사슬의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번 아미노산(히스티딘), 9번 아미노산(라이신), 10번 아미노산(페닐알라닌), 11번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(트레오닌), 20번 아미노산(세린), 42번 아미노산(글루타민), 43번 아미노산(세린), 77번 아미노산(아스파라긴), 78번 아미노산(발린), 80번 아미노산(세린), 83번 아미노산(류신), 85번 아미노산(아스파르트산), 99번 아미노산(글리신), 103번 아미노산(류신) 및 108번 아미노산(알라닌)의 치환을 수반하는 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8 경사슬의 아미노산 서열의 다른 인간화(LM4형)에 의해, 각각 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 라이신, 알라닌, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로 치환되었다. 생성된 서열을 LM4로 명명하였다.
이러한 유형의 항-인간 DR5 항체 TRA-8(LM4형)의 인간화 경사슬 아미노산 서열(서열목록의 서열번호: 74)을 갖는 발현 플라즈미드를 하기와 같이 구성하였다.
1) 인간화 LM4 TRA-8의 경사슬의 가변 및 불변 부위를 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각 인간화 항-DR5 항체 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Ig 경사슬(k 사슬)의 불변 부위의 융합체인, LM4 폴리펩티드 서열(서열목록의 서열번호: 74)을 암호화하는 DNA를 PCR 조합법에 의해 각각 합성하였다.
7AL1P(서열번호: 47), 7ALCN(서열번호: 48), MOD1F1(서열번호: 78), MOD1R1(서열번호: 79), MOD1F22(서열번호: 80), MOD1R22(서열번호: 81), MOD1F3(서열번호: 82), MOD1R3(서열번호: 83), MOD1F42(서열번호: 84), MOD1R4(서열번호: 85), MOD1F5(서열번호: 86), MOD1R52(서열번호: 87), MOD1F7(서열번호: 90), MOD1R7(서열번호: 91) 및 LR17(서열번호: 101)에 추가로, PCR용으로 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
2) 플라즈미드 pCR3.1/LM4-5-3(인간화 TRA-8 경사슬 LM4형의 클로닝)의 구성
서열번호: 74에 정의된 바의 아미노산 서열을 암호화하는 LM4-DNA 분절을, 플라즈미드 벡터에 삽입하고 이. 콜라이에서 클로닝하는 2-단계 PCR을 수행하여 제조하였다.
a) 제 1 단계 PCR
5'-말단에 부가된 Hind III 제한 효소 절단부를 갖는 분비 신호 서열 부위,FRL1, CDRL1, FRL2및 CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4및 불변 부위의 부분을 암호화하는 LM4-F41B-DNA 분절을 하기 조건하에서 제조하였다:
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F1, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R1, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F22, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R22, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F3, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R3, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F42, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R4, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F5, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R52, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F62, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R62, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R7, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 LR17, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5㎕,
10xPCR 완충액, 5㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
3'-말단에 부가된 EcoR I 제한 효소 절단부를 갖는 불변 부위의 부분을 암호화하는 LM4-F41C-DNA 분절을 하기 조건하에서 제조하였다.
주형 플라즈미드 pSRPDHH를 유럽 특허 공개 제 0 909 816 A1 호의 설명에 따라 수득하였다.
반응 용액의 조성:
플라즈미드 pSRPDHH DNA, 25ng,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5㎕,
10xPCR 완충액, 5㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
PCR후 증폭된 DNA 분절을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분리하였다. 전기영동후 겔을 브롬화 에티듐 1㎕/㎖로 염색하여 UV하에서 생산된 DNA를 검출하였다. 그렇게 검출된 각각의 DNA 대를 면도날로 절제해냈다.
b) 제 2 단계 PCR
전술한 LM4-F41B-DNA 및 LM4-F41C-DNA가 융합된 LM4-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다:
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM4-F41B-DNA의 겔 분절,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM4-F41C-DNA의 겔 분절,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5.0㎕,
10xPCR 완충액, 5.0㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
그렇게 제조된 LM4-DNA 분절을 진핵성 TA 클로닝키트(인비트로젠(InVitrogen))를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 플라즈미드 pCR3.1DNA에 삽입하고 키트에 포함된 캄피턴트 이. 콜라이 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 LM4 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 이들 DNA의 뉴클레이티드 서열을 3700 DNA 분석기(ABI 프리즘; 일본 소재의 페르킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer Applied Biosystems))를 이용하여 디데옥시 방법(문헌[Sanger, F. F., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467])에 의해 확인하였다.
생성된 플라즈미드를 pCR3.1/LM4-5-3(인간화 LM4 TRA-8의 경사슬 가변 부위 및 인간 Ig 경사슬 불변 부위를 암호화하는 cNDA를 갖는 플라즈미드)으로 명명하였다.
수득된 LM4-DNA 분절을 포함하는 플라즈미드 pCR3.1/LM4-5-3을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하였다.
클로닝 플라즈미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, CIP로 탈인산화시켰다. 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하여 생성된 탈인산화 pHSG399 DNA 및 LM4-DNA 분절을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시켰다. 이어서, 연결된 DNA로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)을 포함하는 LB 한천 배지에 확산배양하였다. 수득한 백색 형질전환주를 50㎍/㎖ 클로람페니콜을 포함하는 액체 LB 배지에서 배양하고 생성된 배양물로부터 알칼리성-SDS 방법에 따라서 플라즈미드 DNA를 추출하였다. 추출한 플라즈미드 DNA를 HindIII 및 EcoR I로 절단한 후, LM4-DNA를 갖는 클론을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 선별하였다.
상기 과정의 결과로서, 인간화 LM4 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Igk 사슬의 불변 부위의 융합 분절을 갖는 플라즈미드 pHSG/M4-5-3-1을 수득하였다. 이 플라즈미드를 내포하는 형질전환 이. 콜라이주를 이. 콜라이 DH5α/pHSG/M4-5-3-1로 명명하고, 미생물에 관한 부타페스트 조약에 따라 2001년 4월 20일자로 국제 특허 기탁 기관인 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 소재의 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스트 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지에 기탁하여 수탁번호 제 FERM BP-7565 호를 부여받았다.
3) 플라즈미드 pSR.LM4-5-3-3(인간화 LM4 TRA-8 경사슬에 대한 발현 플라즈미드)의 구성
수득된 인간화 LM4 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Igk 사슬의 불변 부위의 융합 분절을 갖는 플라즈미드 pHSG/M4-5-3-1을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하였다.
클로닝 플라즈미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허 공개 제 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, CIP로 탈인산화시켰다. 생성된 탈인산화 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M4-5-3-1로부터 수득한 HindIII-EcorRI DNA 분절을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시켰다. 이어서, 연결된 DNA로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고 LB 한천 배지에서 확산배양하였다. 수득한 형질전환주를 100㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지에서 배양하고 생성된 배양물로부터 알칼리성-SDS 방법에 따라서 플라즈미드 DNA를 추출하였다. pSRPDHH 벡터에서 목적하는 DNA 분절의 삽입 및 방향성을 유전자 서열 분석기(ABI 프리즘 3700 DNA 분석기; 어플라이드 바이오시스템즈)를 이용한 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
인간화 LM4 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 cDNA를 갖는 생성된 발현 플라즈미드를 pSR/LM4-5-3-3으로 명명하였다.
(4.4) 인간화 항체(LM5형)의 경사슬에 대한 발현 벡터의 구성
서열목록의 서열번호: 75에 나타낸 바와 같이, TRA-8 경사슬의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번 아미노산(히스티딘), 9번 아미노산(라이신), 10번 아미노산(페닐알라닌), 11번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(트레오닌), 20번 아미노산(세린), 42번 아미노산(글루타민), 43번 아미노산(세린), 77번 아미노산(아스파라긴), 78번 아미노산(발린), 80번 아미노산(세린), 83번 아미노산(류신), 103번 아미노산(류신) 및 108번 아미노산(알라닌)의 치환을 수반하는 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 경사슬의 아미노산 서열의 다른 인간화(LM5형)에 의해, 각각 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 라이신, 알라닌, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 발린 및 트레오닌으로 치환되었다. 생성된 서열을 LM5로 명명하였다.
이러한 유형의 항-인간 DR5 항체 TRA-8(LM5형)의 인간화 경사슬 아미노산 서열(서열목록의 서열번호: 75)을 갖는 발현 플라즈미드를 하기와 같이 구성하였다.
1) 인간화 LM5 TRA-8의 경사슬의 가변 및 불변 부위를 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각 인간화 항-DR5 항체 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Ig 경사슬(k 사슬)의 불변 부위의 융합체인, LM5 폴리펩티드 서열(서열목록의 서열번호: 75)을 암호화하는 DNA를 PCR 조합법에 의해 각각 합성하였다.
7AL1P(서열번호: 47), 7ALCN(서열번호: 48), MOD1F1(서열번호: 78), MOD1R1(서열번호: 79), MOD1F22(서열번호: 80), MOD1R22(서열번호: 81), MOD1F3(서열번호: 82), MOD1R3(서열번호: 83), MOD1F42(서열번호: 84), MOD1R4(서열번호: 85), MOD1R52(서열번호: 87), MOD1F7(서열번호: 90) 및 LR17(서열번호: 101)에 추가로, PCR용으로 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
.
2) 플라즈미드 pCR3.1/LM5-3-42(인간화 TRA-8 경사슬 LM5형의 클로닝)의 구성
서열번호: 75에서 정의된 바의 아미노산 서열을 암호화하는 LM5-DNA 분절을, 플라즈미드 벡터에 삽입하고 이. 콜라이에서 클로닝하는 2-단계 PCR을 수행하여 제조하였다.
a) 제 1 단계 PCR
5'-말단에 부가된 Hind III 제한 효소 절단부를 갖는 분비 신호 서열 부위,FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4및 불변 부위의 부분을 암호화하는 LM5-F51B-DNA 분절을 하기 조건하에서 제조하였다:
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F1, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R1, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F22, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R22, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F3, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R3, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F42, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R4, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F52, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R52, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F63, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R63, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R72, 5pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 LR17, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5㎕,
10xPCR 완충액, 5㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
3'-말단에 부가된 EcoR I 제한 효소 절단부를 갖는 불변 부위의 부분을 암호화하는 LM5-F51C-DNA 분절을 하기 조건하에서 제조하였다. 주형 플라즈미드 pSRPDHH를 유럽 특허 공개 제 0 909 816 A1 호의 설명에 따라 수득하였다.
반응 용액의 조성:
플라즈미드 pSRPDHH DNA, 25ng,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5㎕,
10xPCR 완충액, 5㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
PCR후 증폭된 DNA 분절을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분리하였다. 전기영동후 겔을 브롬화 에티듐 1㎕/㎖로 염색하여 UV하에서 생산된 DNA를 검출하였다. 그렇게 검출된 각각의 DNA 대를 면도날로 절제해냈다.
b) 제 2 단계 PCR
전술한 LM5-F51B-DNA 및 LM5-F51C-DNA 분절이 융합된 LM5-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다:
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM5-F51B-DNA의 겔 분절,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM5-F51C-DNA의 겔 분절,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5.0㎕,
10xPCR 완충액, 5.0㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
그렇게 제조된 LM5-DNA 분절을 진핵성 TA 클로닝 키트(인비트로젠)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 플라즈미드 pCR3.1DNA에 삽입하고 키트에 포함된 캄피턴트 이. 콜라이 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 LM5 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을 DNA 분석기를 이용하여 디데옥시 방법(문헌[Sanger, F. F., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467])에 의해 확인하였다.
생성된 플라즈미드를 pCR3.1/LM5-3-42(인간화 LM5 TRA-8의 경사슬 가변 부위 및 인간 Ig 경사슬 불변 부위를 암호화하는 cNDA를 갖는 플라즈미드)로 명명하였다.
수득된 LM5-DNA 분절을 포함하는 플라즈미드 pCR3.1/LM5-3-42를 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하였다.
클로닝 플라즈미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, CIP로 탈인산화시켰다. 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하여 생성된 탈인산화 pHSG399 DNA 및 LM5-DNA 분절을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시켰다. 이어서, 연결된 DNA로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)을 포함하는 LB 한천 배지에서 확산배양하였다. 수득한 백색 형질전환주를 50㎍/㎖ 클로람페니콜을 포함하는 액체 LB 배지에서 배양하고 생성된 배양물로부터 알칼리성-SDS 방법에 따라서 플라즈미드 DNA를 추출하였다. 추출한 플라즈미드 DNA를 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, LM5-DNA 분절을 갖는 클론을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 선별하였다.
상기 과정의 결과로서, 인간화 LM5 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Igk사슬의 불변 부위의 융합 분절을 갖는 플라즈미드 pHSG/M5-3-27을 수득하였다.
3) 플라즈미드 pSR.LM5-3-27-1(인간화 LM5 TRA-8 경사슬의 발현 플라즈미드)의 구성
수득된 인간화 LM5 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Igk 사슬의 불변 부위의 융합 분절을 갖는 플라즈미드 pHSG/M5-3-27을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하였다.
클로닝 플라즈미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허 공개 제 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, CIP로 탈인산화시켰다. 생성된 탈인산화 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M5-3-27로부터 수득한 HindIII-EcorRI DNA 분절을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시켰다. 이어서, 연결된 DNA로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고 LB 한천에서 확산배양하였다. 수득한 형질전환주를 100㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지에서 배양하고 생성된 배양물로부터 알칼리성-SDS 방법에 따라서 플라즈미드 DNA를 추출하였다. pSRPDHH 벡터에서 목적하는 DNA 분절의 삽입 및 방향성을 유전자 서열 분석기(ABI 프리즘 3700 DNA 분석기; 어플라이드 바이오시스템즈)를 이용한 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
생성된 인간화 LM5 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 cDNA를 갖는 발현 플라즈미드를 pSR/LM5-3-27-1로 명명하였다.
(4.5) 인간화 항체(키메라형)의 경사슬의 발현 벡터의 구성
서열목록의 서열번호: 76에 나타낸 키메라형 TRA-8의 경사슬의 아미노산 서열을 LM6으로 명명하였다.
이러한 유형의 항-인간 DR5 항체 TRA-8(LM6형)의 인간화 경사슬 아미노산 서열(서열목록의 서열번호: 75)을 갖는 발현 플라즈미드를 하기와 같이 구성하였다.
1) 인간화 LM6 TRA-8의 경사슬의 가변 및 불변 부위를 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각 마우스 항-DR5 항체 TRA-8 경사슬(LM6형)의 가변 부위 및 인간 Ig 경사슬(k 사슬)의 불변 부위의 융합체인, LM6 폴리펩티드 서열(서열목록의 서열번호: 75)을 암호화하는 DNA를 PCR 조합법에 의해 각각 합성하였다.
7AL1P(서열번호: 47) 및 7ALCN(서열번호: 48)에 추가로, PCR용으로 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
2) 플라즈미드 pCR3.1/LM6-1-16(인간화 TRA-8 경사슬 LM6형의 클로닝)의 구성
서열번호: 75에서 정의된 바의 아미노산 서열을 암호화하는 LM6-DNA 분절을, 플라즈미드 벡터에 삽입하고 이. 콜라이에서 클로닝하는 2-단계 PCR을 수행하여 제조하였다.
a) 제 1 단계 PCR
5'-말단에 부가된 Hind III 제한 효소 절단부를 갖는 분비 신호 서열 및 FRL1부위의 부분을 암호화하는 LM6-F1-DNA 분절을 하기 조건하에서 제조하였다. 주형 플라즈미드 pHSGHM17 및 pSRPDHH를 유럽 특허 공개 제 0 909 816 A1 호의 설명에 따라 수득하였다.
반응 용액의 조성:
플라즈미드 pHSGHM17 DNA, 25ng,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKSPR13, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5㎕,
10xPCR 완충액, 5㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제(페르킨 엘머), 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4의 부분 및 불변 부위의 부분을 암호화하는 LM6-F2-DNA 분절을 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
플라즈미드 pL28DNA, 25ng,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MVF11, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MVR12, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5㎕,
10xPCR 완충액, 5㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
3'-말단에 부가된 EcoR I 제한 효소 절단부를 갖는 FRL4의 부분 및 불변 부위의 부분을 암호화하는 LM6-F3-DNA 분절을 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성:
플라즈미드 pSRPDHH DNA, 25ng,
올리고뉴클레오티드 프라이머 MCF11, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5㎕,
10xPCR 완충액, 5㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안 및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
PCR후 증폭된 DNA 분절을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분리하였다. 전기영동후 겔을 브롬화 에티듐 1㎕/㎖로 염색하여 UV하에서 생산된 DNA를 검출하였다. 그렇게 검출된 각각의 DNA 대를 면도날로 절제해냈다.
b) 제 2 단계 PCR
전술한 LM6-F1-DNA, LM6-F2-DNA 및 LM6-F3-DNA 분절이 융합된 LM6-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다:
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM6-F1-DNA의 겔 분절,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM6-F2-DNA의 겔 분절,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM6-F3-DNA의 겔 분절,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol,
dNTP 칵테일, 5.0㎕,
10xPCR 완충액, 5.0㎕, 및
ampliTag DNA 폴리머라제, 2.5단위.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조정하여 PCR에 사용하였다.
PCR 열 조건: 94℃로 2분동안 가열후, 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1분동안및 72℃에서 2분동안의 열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 가열하였다.
그렇게 제조된 LM6-DNA 분절을 진핵성 TA 클로닝 키트(인비트로젠)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 플라즈미드 pCR3.1DNA에 삽입하고 키트에 포함된 캄피턴트 이. 콜라이 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 TRA-8의 경사슬을 암호화하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을 DNA 분석기를 이용하여 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.
생성된 플라즈미드를 pCR3.1/LM6-1-16(마우스 TRA-8의 경사슬 가변 부위 및 인간 Ig 경사슬 불변 부위를 암호화하는 cNDA를 갖는 플라즈미드)으로 명명하였다.
수득된 LM6-DNA 분절을 포함하는 플라즈미드 pCR3.1/LM6-1-16을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하였다.
클로닝 플라즈미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, CIP로 탈인산화시켰다. 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하여 생성된 탈인산화 pHSG399 DNA 및 LM6-DNA 분절을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시켰다. 이어서, 연결된 DNA로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)를 포함하는 LB 한천 배지에서 확산배양하였다. 수득된 백색 형질전환주를 50㎍/㎖ 클로람페니콜을 포함하는 액체 LB 배지에서 배양하고 생성된 배양물로부터 알칼리성-SDS 방법에 따라서 플라즈미드 DNA를 추출하였다. 추출한 플라즈미드 DNA를 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, LM6-DNA 분절을 갖는 클론을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 선별하였다.
상기 과정의 결과로서, 마우스 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Igk 사슬의 불변 부위의 융합 분절을 갖는 플라즈미드 pHSG/M6-1-4-1을 수득하였다. 이 플라즈미드를 내포하는 형질전환 이. 콜라이주를 이. 콜라이 DH5α/pHSG/M6-1-4-1로 명명하고, 미생물에 관한 부타페스트 조약에 따라 2001년 4월 20일자로 국제 특허 기탁 기관인 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 소재의 내셔널 인스티튜트 오브 어드밴스트 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지에 기탁하여 수탁번호 제 FERM BP-7566 호를 부여받았다.
3) 플라즈미드 pSR/LM6-1-4-6(키메라형 LM6 TRA-8 경사슬의 발현 플라즈미드)의 구성
수득한 마우스 TRA-8 경사슬의 가변 부위 및 인간 Igk 사슬의 불변 부위의 융합 분절을 갖는 플라즈미드 pHSG/M6-1-4-1을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단하였다.
클로닝 플라즈미드 pSRPDHH DNA 1㎍을 제한 효소 Hind III 및 EcoR I로 절단한 후, CIP로 탈인산화시켰다. 생성된 탈인산화 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M6-1-4-1로부터 수득한 HindIII-EcorRI DNA 분절을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 슈조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시켰다. 이어서, 연결된 DNA로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고 LB 한천에서 확산배양하였다. 수득한 형질전환주를 100㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지에서 배양하고 생성된 배양물로부터 알칼리성-SDS 방법에 따라서 플라즈미드 DNA를 추출하였다. 벡터에서 목적하는 DNA 분절의 삽입 및 방향성을 유전자 서열 분석기를 이용한 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
생성된 TRA-8(키메라형)의 경사슬을 암호화하는 cDNA를 갖는 발현 플라즈미드를 pSR/LM6-1-4-6으로 명명하였다.
(5) 몇가지 유형의 인간화 또는 키메라 TRA-8 항체의 제조
FUGENE6 형질감염 시약 방법(뵈링거 만하임 비오케미카(Boehringer Mannheim Biochemica))으로 키트에 제공된 설명서에 따라 COS-7 세포를 형질감염시켰다.
COS-7 세포(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 수탁번호: CRL-1651)를 10% 소태아혈청(이후, "FCS"로 약기함; 모어게이트(Moregate))을 보충한 둘베코 변형 이글(Eagle) 배지(이후, "D-MEM"으로 약기함; 기브코(Gibco) BRL)를 포함하는 배양 접시에서 성장시켜 반-융합체(3x106세포/접시)를 형성하였다.
한편, 알칼리성-SDS 방법 및 염화 세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 제조된 10㎍/접시의 인간화 DR5 중사슬 발현 플라즈미드 DNA(pHA15-1)(총 5 접시) 및 10㎍/접시의 인간화 DR5 경사슬 발현 플라즈미드 DNA를 혼합한 후, 에탄올로 침전시키고 이어서 5㎕/접시의 dH2O중에 현탁시켰다.
15㎕/접시의 FUGENE6 형질감염 시약을 FCS가 없는 180㎕/접시의 D-MEM와 혼합한 후, 이 FUGENE 용액(185㎕/접시)을 10㎍/접시의 인간화 DR5 중사슬 발현 플라즈미드 DNA 및 10㎍/접시의 인간화 DR5 경사슬 발현 플라즈미드 DNA를 포함하는 5㎕/접시의 DNA 용액과 혼합하였다. 실온에서 15분동안 배양한 후, 수득한 플라즈미드 현탁액(200㎕)을 미리 제조한 COS-7 플레이트에 첨가하였다. 5% CO2중에서 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 배양 배지를 FCS가 없는 D-MEM으로 바꾸었다. 5%CO2중에서 37℃에서 72시간동안 배양한 후, 배양 상청액을 회수하여 상청액 유체에서 발현 생성물을 정제하였다. 전술한 방법에 의해, COS-7 세포를 하기 각각의 플라즈미드 조합물로 형질감염시켰다:
(A) pHA15-1 및 pSR/LM1-2(H1L1)의 동시형질감염,
(B) pHB14-1 및 pSR/M2-1(H2L2)의 동시형질감염,
(C) pHB14-1 및 pSR/LM3-3-44-10(H2L3)의 동시형질감염,
(D) pHB14-1 및 pSR/LM4-5-3-3(H2L4)의 동시형질감염,
(E) pHC10-3 및 pSR/M2-1(H3L2)의 동시형질감염,
(F) pHC10-3 및 pSR/LM3-3-44-10(H3L3)의 동시형질감염,
(G) pHC10-3 및 pSR/LM4-5-3-3(H3L4)의 동시형질감염,
(H) pHD21-1 및 pSR/LM5-3-27-1(H4L5)의 동시형질감염, 및
(I) pM11-1 및 pSR/LM6-1-4-6(키메라)의 동시형질감염.
이어서 배양액을 원심 분리하고(3,500 rpm, 15분) 상청액을 수거하였다. 상청액을 0.45㎛의 여과기(아드반텍 토요 디스믹(ADVANTEC TOYO DISMIC)-25cs, 캣(Cat) # 25CS045 AS)로 여과하였다. 하기 조건하에 프로테인 G-포로스(Protein G-POROS) 친화성 크로마토그래피(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 사용하여 여과액으로부터 IgG를 정제하였다:
HPLC 시스템: 바이오캐드(BioCAD) 700E(어플라이드 바이오시스템스);
칼럼: 프로테인G-ID 센서 카트리지;
(칼럼 크기: 직경 2.1 mm ×30 mmLD, 층 부피: 0.1㎖; 어플라이드 바이오시스템스)
용출 완충액: 0.1M 글리신-HCl(pH 2.5);
중화 완충액: 1M 트리스-HCl(pH 8.5);
검출: 280nm;
유속: 1 ㎖/분;
분획 크기: 0.5㎖/0.5분;
분획 시험관: 0.5㎖ 폴리프로필렌 마이크로시험관;
온도: 4℃.
여과액을 칼럼에 모두 적용한 후 50㎖의 PBS(시그마(Sigma), 캣 # 1000-3)를 사용하여 칼럼을 세척하였다. 용출 완충액을 적용할 때 분획 수집기를 작동시켰다. 각각의 분획 마이크로시험관은 PBS중의 55㎕의 1M NaCl, 110㎕의 중화 완충액 및 74㎕의 2 mg/㎖의 소 혈청 알부민(시그마, 캣 # A-7030)이 함유되어 있다. 7번에서 8번까지의 분획을 수거하였다.
제조한 배양 상청액 유체중에서 인간화 항체 발현의 확인 및 발현 산물의 정량 분석은 항-인간 IgG에 대한 항체를 사용하여 ELISA에 의해 수행하였다.
96-웰 플레이트(well plate)(맥시소프(MaxiSorp), Nunc)의 각각의 웰에 흡착 완충액(0.05M 탄산수소 나트륨, 0.02% 아지드화나트륨, pH 9.6)중에서 0.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 용해시킨 100㎕의 염소 항-인간 IgG Fc 특이적인 다클론성 항체(카펠(Kappel))를 첨가하고 플레이트를 37℃에서 2시간동안 항온 처리하여 항체를 흡착시켰다. 이어서 플레이트를 350㎕의 PBS-T로 5회 세척하였다. 세척 후웰에 10% FCS를 함유하는 D-MEM으로 희석시킨 배양 상청액을 첨가하고 37℃에서 2시간동안 항온 처리하였다. PBS-T로 다시 세척한 후 PBS-T로 10,000배 희석시킨 100㎕의 알칼리 포스파타제-표시된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적인 다클론성 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab.))을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간동안 항온 처리하였다. PBS-T로 다시 세척한 후 알칼린 포스파타제 서브스트레이트(Alkaline Phosphatase Substrate) 키트(바이오 래드(Bio Rad))로부터 수득된 p-니트로페닐 포스페이트의 기질 용액을 키트와 함께 제공된 지시 설명서에 따라 첨가하였다. 37℃에서 0.5 내지 1시간동안 항온 처리한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에서 10% FCS를 특정 농도로 함유하는 D-MEM으로 희석시킨 인간 혈장 면역 글로불린 G 서브클래스 1(IgG1)(바이오퓨어(Biopure) AG)을 배양 상청액 유체에 함유된 인간화 DR5 항체의 농도 기준 시료로서 사용하였다.
결과로서, 배양 상청액에서 발현 및 정제된 생성물을 항-인간 IgG 항체로 특이적으로 검출하였다. 인간 IgG 항체의 최종 농도는 각각 44.03 ㎍/㎖(H1L1), 39.8 ㎍/㎖(H2L2), 26.7 ㎍/㎖(H2L3), 41.0 ㎍/㎖(H2L4), 39.3 ㎍/㎖(H3L2), 24.7 ㎍/㎖(H3L3), 21.5 ㎍/㎖(H3L4), 16.7 ㎍/㎖(H4L5) 및 18.3 ㎍/㎖(키메라)이다.
(6) 몇몇 유형의 인간화 항체 또는 키메라 항체의 세포소멸-유도 활성
위르캣 세포(ATCC 번호 TIB-152)는 정제된 인간화 TRA-8 항체의 세포소멸-유도 활성을 검사하는데 사용하였다.
10% FCS(깁코(Gibco) BRL)를 함유하는 RPMI1640 배지에서 5% CO2의 존재하에37℃에서 3일동안 배양시킨 위르캣 세포를 96-웰 마이크로플레이트(스미모토 베이클라이트(Sumitomo Bakelite))의 각각의 웰중에 웰 당 50㎕로 분배하였다. 본 실시예 26에서 제조한 인간화 TRA-8을 실시예 26에서 기재된 방법에 따라 유체중에서 그의 농도를 추정함으로써 10% FCS를 함유하는 RPMI1640 배지를 사용하여 100 ng/㎖의 최종 생성물의 농도를 갖도록 조정하였다. 이렇게 100 ng/㎖로 조정된 발현 산물의 각각의 용액은 10% FCS를 함유하는 RPMI1640으로 2배 계단 희석을 반복함으로써 계단 희석물을 제조하는데 사용하였다. 희석시킨 각각의 인간화 TRA-8 용액(H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 또는 H4L5)을 웰 당 50㎕로 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 12시간동안 반응시킨 후 1 mg/㎖의 XTT를 함유하는 25μM PMS 50㎕을 첨가하였다(XTT에 대한 최종 농도 250 ㎍/㎖ 및 PMS에 대하여 5μM). 3시간동안 항온 처리한 후 각각의 웰에 대한 흡광도를 450nm에서 측정하여 미토콘드리아의 환원 능력을 지표로서 사용함으로써 세포 생존율을 계산하였다.
각각 웰에서 세포의 생존율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다:
수학식 1
생존율(%)= 100 ×(a-b)/(c-b)
상기 식에서,
"a"는 시험 웰의 측정값이고;
"b"는 어떠한 세포도 없는 웰의 측정값이며;
"c"는 어떠한 항체도 첨가하지 않은 웰의 측정값이다.
결과로서, 시험한 인간화 항체는 인간 DR5 항원을 발현하는 T 림프종 세포계의 세포에서 세포소멸을 유도하는 것으로 입증되었다.
또한, PC-3에 대한 인간화 TRA-8의 세포소멸-유도 활성은 실시예 25에서 기재된 방법에 따라 탁솔을 첨가함으로써 검사하였다.
인간 전립선 암 세포계 PC-3(ATCC 번호 CRL-1435)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 구입하고 10% 소 태아 혈청(FBS, 하이클론(Hyclone)), 1% L-글루타민-200mM(25030-149, 깁코 BRL) 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 솔루션(P-7539, 시그마)을 함유하는 F-12K 영양 복합 배지(21127-022, 깁코 BRL)중에서 보존하였다. 10% FBS 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 솔루션을 보충한 RPMI1640 배지(MED-008, 이와키(IWAKI))를 하기 실험에서 사용하였다. 지수적으로 성장하는 PC-3 세포를 트립신 처리하여 수거하고 신선한 배지로 2회 세척하였다. 이어서 세포의 수를 세고 5 ×104세포/㎖의 농도로 신선한 배지중에 재부유시키고 실험을 시작하기 하루 전에 100㎕/웰의 총 부피로 편평한-바닥의 96-웰 플레이트(3598, 코닝-코스터(Corning-Coster))중에 3중으로 분배하였다. 대표적인 항-암 약물, 디메틸설폭사이드(10 mg/㎖)중에 용해시킨 파클리탁셀(Paclitaxel)(169-18611, 와코(Wako))을 신선한 배지로 희석한 후 세포를 50 ㎕/웰로 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 디메틸설폭사이드의 최종 농도는 0.% 미만이었다. 5% CO2대기하에 37℃에서 24시간동안 항온 처리한 후 신선한 배지로 희석시킨 인간화 TRA-8 항체(H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 또는 H4L5)를 웰에 첨가하였다. 24시간동안 추가로 항온 처리한 후 1 mg/㎖의 XTT 및 25mM의 PMS를 함유하는 50㎕의 최소 필수 배지(11095-098, 깁코 BRL)를 웰에 첨가하고 플레이트를 6시간동안 항온 처리하였다. 이어서 ARVO HTS 1420 멀티라벨 카운터(Multilabel Counter)(왈락 베르톨드(Wallac Berthold))에 의해 OD450을 측정하고 세포 생존율을 하기 수학식 2와 같이 계산하였다:
수학식 2
세포 생존율(%) = (탁솔 및/또는 TRA-8(약품(들))로 처리된 세포를 함유한 웰에 대한 OD450- 세포 또는 약품을 함유하지 않은 웰에 대한 OD450) × 100 / (약품 처리되지 않은 세포를 함유한 웰에 대한 OD450- 세포 또는 약품을 함유하지 않은 웰에 대한 OD450)
결과로서, 시험한 인간화 항체는 인간 DR5 항원을 발현하는 인간 전립선 암 세포에서 세포소멸을 유도하는 것으로 입증되었다.
본 명세서에서 기술된 임의의 특허 또는 문헌은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련자의 수준으로도 이해된다.
상기 특허 및 문헌은 각각의 개별 문헌이 상세하고 개별적인 경우 참조로 인용된 바와 동일한 범위까지 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 범위는 본 발명의 몇몇의 양태를 예시하는 실시예에서 개시된 상기 기탁물 또는 실시태양에 의해 제한되지 않으며, 기능적으로 등가물인 임의의 실시태양이 본 발명의 요지내에 포함된다. 본원에 나타내고 기술한 본 발명의 변형을 비롯하여 다양한 본 발명의 변형이 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이며, 첨부된 청구의 범위의 요지내에 포함된다.
참고문헌

Claims (63)

  1. 생체내에서 DR5를 발현시키는 세포에 대해 세포소멸-유도 활성을 갖는, 종양 괴사 인자-관련 세포소멸-유도성 리간드(TRAIL) 수용체 DR5를 인식하는 항체.
  2. TRAIL 수용체 DR5를 인식하지만, TRAIL 수용체 DR4, DcR1 또는 DcR2는 인식하지 않는 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단일클론성인 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
    인간 DR5를 항원으로 하는 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    류마티스성 관절염의 활막 세포에 대해 세포소멸-유도 활성을 갖는 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    악성세포에 대해 세포소멸-유도 활성을 갖는 항체.
  7. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 수탁번호 PTA-1428을 갖는 마우스(mouse)-마우스 하이브리도마 TRA-8에 의해 제조된 단일클론성 항체.
  8. DR5를 발현시키는 세포를, 이 세포에 결합할 수 있는 치료량의 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 항체 및 이러한 항체에 적합한 담체에 노출시키는 단계를 포함하는, 세포 증식 억제 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른, DR5에 대해 활성인 치료량의 단일클론성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약리학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    단일클론성 항체를 0.1 내지 10,000 ㎍/투여량의 치료량으로 포함하는 약리학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    단일클론성 항체를 1㎖의 담체당 0.2 내지 2000ng의 농도로 포함하는 약리학적 조성물.
  12. 비정상 세포 또는 생육 조절곤란 세포의 선택적 세포소멸용 치료제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  13. DR4, DR5, DrR1, DrR2 및 오스테오프로테게린(OPG)으로 구성된 군에서 선택된 종양 괴사 인자 리간드 수용체와 상호작용하여 이러한 수용체를 발현시키는 세포에서 세포소멸을 유도하는 이동성 항체.
  14. 작용성 또는 길항성 종양 괴사 인자 리간드 수용체 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 이동성 항체.
  15. 세포소멸 관련 질환을 나타내는 목표 조직을 제 1 항 또는 제 13 항에 따른 치료량의 제 1 항체에 노출시키는 단계를 포함하는, 세포소멸 관련 질환의 치료 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    제 1 항체와 함께 상승효과적으로 작용하는 약학적 효과량의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    치료제가 비스인돌릴말레이미드인 방법.
  18. 제 15 항에 있어서,
    목표 조직을 제 13 항에 따른 치료량의 제 2 항체에 노출시키고, 이때 제 1 항체와제 2 항체가 목표 조직과 상승효과적으로 상호작용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서,
    목표 조직을 제 1 항체에 노출시키기 전에 또는 노출시키는 동안 감작체에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 개체내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 면역글로불린 단백질 또는 그의 단편에 커플링된(coupled), 10개 이상의 염기를 갖는 항원성 TRAIL 수용체 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  21. 목표 세포를 발현가능한 TRAIL 수용체 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염시키는 단계;
    목표 세포에서 TRAIL 수용체 핵산 서열에 의해 암호화된 TRAIL 수용체를 발현시키는 단계; 및
    목표 세포를 TRAIL 수용체에 선택적으로 결합하는 항체에 노출시키는 단계
    를 포함하는, 유전자 치료 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,
    인간화된 항체.
  23. DR5를 인식할 수 있는 항체의 선택적인 중사슬 면역글로불린에 대한 암호화 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
  24. 제 23 항에 있어서,
    서열번호: 21의 1 내지 1398개의 뉴클레오티드로 기재된 뉴클레오티드 서열.
  25. DR5를 인식할 수 있는 항체의 TRA-8 중사슬 면역글로불린에 대한 암호화 서열을 포함하는 아미노산 서열.
  26. 제 25 항에 있어서,
    완전한 개방 판독틀을 포함하고 서열번호: 23의 1 내지 464개의 잔기로 기재된 암호화 서열을 포함하는 아미노산 서열.
  27. DR5를 인식할 수 있는 항체의 TRA-8 면역글로불린 경사슬에 대한 암호화 잔기를 포함하는 뉴클레오티드 서열.
  28. 제 27 항에 있어서,
    서열번호: 22의 1 내지 705개의 뉴클레오티드로 기재된 뉴클레오티드 서열.
  29. DR5를 인식할 수 있는 항체의 TRA-8 면역글로불린 경사슬에 대한 암호화 서열을 포함하는 아미노산 서열.
  30. 제 29 항에 있어서,
    완전한 개방 판독틀을 포함하고 서열번호: 24의 1 내지 234개의 잔기로 기재된 암호화 서열을 포함하는 아미노산 서열.
  31. 인간화된 중사슬 면역글로불린 및 인간화된 경사슬 면역글로불린을 포함하는 인간 DR5에 선택적인 항체.
  32. 제 30 항에 따른 항체의 인간화된 중사슬 면역글로불린에 대한 암호화 서열을 포함하는 아미노산 서열.
  33. 제 32 항에 있어서,
    서열번호: 31의 1 내지 119개의 잔기로 기재된 아미노산 서열.
  34. 제 30 항에 따른 항체의 인간화된 TRA-8 면역글로불린 경사슬에 대한 암호화 서열을 포함하는 아미노산 서열.
  35. 제 34 항에 있어서,
    서열번호: 46의 1 내지 213개의 잔기로 기재된 아미노산 서열.
  36. 제 30 항에 따른 항체의 인간화된 면역글로불린 경사슬에 대한 암호화 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
  37. 제 36 항에 있어서,
    서열번호: 55의 1 내지 711개의 뉴클레오티드로 기재된 뉴클레오티드 서열.
  38. (a) 제 23 항의 뉴클레오티드 서열 및 제 28 항의 뉴클레오티드 서열중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
    (b) 상기 뉴클레오티드 서열이 숙주에서 전사되고 해독되도록 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소
    를 포함하는 벡터.
  39. 제 38 항에 있어서,
    바이러스 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택된 벡터.
  40. 제 39 항에 있어서,
    바이러스가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군에서 선택된 벡터.
  41. 제 31 항에 따른 항체의 인간화된 중사슬 또는 경사슬 면역글로불린을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드.
  42. 제 38 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  43. 제 41 항의 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포.
  44. 제 43 항에 있어서,
    pHB14, pHB14-1, pHSG/M2-1-4, pCR3.1/M2-1 및 pSR/M2-1으로 구성된 군에서 선택된 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포.
  45. 제 22 항의 인간화된 항체를 생산하는 숙주 세포.
  46. (a) 숙주를, 인간화된 경사슬 면역글로불린 또는 인간화된 중사슬 면역글로불린중 하나 이상을 암호화하는 제 1 벡터 및 이 제 1 벡터에서 암호화하지 않는 중사슬 또는 경사슬을 암호화하는 제 2 벡터로 형질전환시키는 단계; 및
    (b) 형질전환된 숙주가 인간 DR5 항체를 생산하도록 소정의 시간 동안 숙주를 항온배양하는 단계
    를 포함하는, 인간화된 DR5 항체의 생산 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    진핵세포 및 원핵세포로 구성된 군에서 선택된 숙주를 사용하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서,
    진핵세포로서 포유동물 세포를 사용하는 방법.
  49. 제 47 항에 있어서,
    포유동물 세포를 생체내에서 사용하는 방법.
  50. 제 48 항에 있어서,
    포유동물 세포를 생체외에서 사용하는 방법.
  51. 제 48 항에 있어서,
    포유동물 세포를 시험관내에서 사용하는 방법.
  52. 목표 세포를 약학적 효과량의 인간화된 DR5 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식 억제 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    목표 세포로서 유방암, 난소암, 결장암, 조혈성 암, 전립선암, 림프암, 폐암, 신경교종암 및 간암으로 구성된 군에서 선택된 인간 암 세포를 사용하는 방법.
  54. 제 52 항에 있어서,
    목표 세포를 약학적 치료 효과량의 치료제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    치료제로서 항암 화합물을 사용하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서,
    항암 화합물이 파클리탁셀, 탁솔, 사이클로헥스이미드, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜키신, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 닥티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포사이드, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포사이드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  57. 제 52 항에 있어서,
    목표 세포로서 인간 세포를 사용하는 방법.
  58. 제 52 항에 있어서,
    목표 세포로서 비인간 영장류, 래트(rat), 마우스, 토끼, 염소, 양, 소, 돼지, 말 및 닭으로 구성된 군에서 선택된 동물에서 유래하는 비인간 세포를 사용하는 방법.
  59. 제 52 항에 있어서,
    목표 세포를 생체내에서 사용하는 방법.
  60. 제 52 항에 있어서,
    목표 세포를 생체외에서 사용하는 방법.
  61. 제 52 항에 있어서,
    목표 세포를 시험관내에서 사용하는 방법.
  62. 적절한 용기에서 팩키지화된(packaged) 인간 DR5에 선택적인 인간화된 항체를 DR5를 발현시키는 사건에 대해 효과적인 치료제로서 사용하기 위한 설명서와 함께 포함하는, 세포 치사를 유도하기 위한 상업적인 키트(kit).
  63. 약학적 효과량의 DR5 선택적 인식 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 NFκB 수준을 증가시키는 방법.
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