CN108251443A - 一种tnfrsf10c重组质粒、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种TNFRSF10C重组质粒、制备方法及其应用，其中所述TNFRSF10C重组质粒包含如下片段：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC。本发明对于进一步明确PPP2R5C与TNFRSF10C调控耐药CML细胞的相关性，了解死亡受体通路在调控耐药CML细胞凋亡中的作用，为进一步思考联合靶向抗耐药CML的目的基因提供新资料，为进一步提供可彻底消灭病变，无副作用和不产生耐药性的CML肿瘤的治疗药物提供了基础。

Description

一种TNFRSF10C重组质粒、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程的技术领域，具体而言，涉及一种TNFRSF10C重组质粒、制备方法及其应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞的常见血液肿瘤，其分子遗传学特征是Ph染色体，位于9号染色体长臂的ABL基因与22号染色体长臂BCR基因平衡异位，形成BCR与ABL基因的融合。这种BCR-ABL融合基因可导致异常持续的酪氨酸激酶的激活，使得信号通路中相关的下游信号分子磷酸化，继而引起造血干、祖细胞的增殖失控。
传统的放化疗、干扰素治疗可降低白细胞数、改善临床症状，但病人体内的微小残留病变很难被彻底消灭，而且往往有较大副作用。异基因造血干细胞移植是至今唯一能治愈CML的疗法，但受供者和受者间HLA配型难、年龄因素等很多限制，而且异基因HSCT还可能并发严重的移植物抗宿主病。
近年来，随着对Bcr-Abl融合蛋白研究的深入，小分子酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼成为目前治疗CML的首选药物。但随着临床应用的积累，部分患者发生伊马替尼耐药，且病人存在原发耐药的情况。
总之，现有的对于CML肿瘤的治疗方法，无法彻底消灭病变，存在较大副作用，对患者有诸多条件的限制，且极易产生一定的耐药性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种TNFRSF10C重组质粒、制备方法及其应用以解决现有技术的不足。
为解决上述问题，本发明提供一种TNFRSF10C重组质粒，所述TNFRSF10C重组质粒包含如下片段：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC。
优选地，所述TNFRSF10C重组质粒由引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC，通过载体重组而成。
优选地，所述载体为GV358。
优选地，其阳性克隆转化子的序列如SEQ ID NO.1所示。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种TNFRSF10C重组质粒的制备方法，包括：
进行GV358载体酶切，得到酶切产物；
对引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC进行PCR扩增，得到PCR产物；
将所述酶切产物与所述PCR产物进行交换反应，得到交换反应产物；
进行交换反应产物转化培养，得到培养菌液；
将所述培养菌液进行质粒抽提，得到TNFRSF10C重组质粒。
优选地，所述“对引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC进行PCR扩增，得到PCR产物”包括：
配置扩增反应体系；
加入所述引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC在PCR仪中进行扩增，得到所述PCR产物。
优选地，所述“将所述酶切产物与所述PCR产物进行交换反应，得到交换反应产物”包括：
优选地，所述“进行交换反应产物转化培养，得到培养菌液”之后，还包括：
对所述培养菌液进行PCR鉴定和测序，以便于对鉴定正确的所述培养菌液进行质粒抽提。
此外，本发明还提供一种融合蛋白的表达方法，将如上述方法获得的所述TNFRSF10C重组质粒转化菌株培养、诱导后收集菌体；破碎菌体细胞获得融合蛋白。
此外，本发明还提供一种筛选TNFRSF10C抑制剂的方法，包括：
所述抑制剂抑制融合蛋白；
所述融合蛋白由上述方法获得的所述TNFRSF10C重组质粒感染的菌株表达。
此外，本发明还提供一种TNFRSF10C重组质粒的应用，所述TNFRSF10C重组质粒在制备抗CML肿瘤药物的应用。
本发明提供一种TNFRSF10C重组质粒、制备方法及其应用。本发明所提供的TNFRSF10C重组质粒，利用基因转染和RNA干扰技术将TNFRSF10C重组质粒和siRNA分别转导至伊马替尼耐药株K562R、K562、原代CML细胞中；通过质粒转染K562细胞转染效率和转然后的RT-PCR检测基因表达情况显示出，在K562细胞中，TNFRSF10C重组质粒具有高表达，对于进一步明确PPP2R5C与TNFRSF10C调控耐药CML细胞的相关性，了解死亡受体通路在调控耐药CML细胞凋亡中的作用，为进一步思考联合靶向抗耐药CML的目的基因提供新资料，为进一步提供可彻底消灭病变，无副作用和不产生耐药性的CML肿瘤的治疗药物提供了基础。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明所提供的一种TNFRSF10C重组质粒GV358的载体酶切图谱；
图2为本发明所提供的一种TNFRSF10C重组质粒的酶切电泳图；
图3为本发明所提供的一种TNFRSF10C重组质粒的目的基因片段PCR电泳图；
图4为本发明所提供的一种TNFRSF10C重组质粒的阳性转化子PCR产物电泳图；
图5为本发明所提供的一种TNFRSF10C重组质粒的质粒转染K562细胞转染效率图1(红色荧光视野图)；
图6为本发明所提供的一种TNFRSF10C重组质粒的质粒转染K562细胞转染效率图2(绿色荧光视野图)；
图7为本发明所提供的一种TNFRSF10C重组质粒的转染K562后RT-PCR检测基因表达情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。
但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
本发明提供一种TNFRSF10C重组质粒，所述TNFRSF10C重组质粒包含如下片段：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC。
优选地，所述TNFRSF10C重组质粒由引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC，通过载体重组而成。
优选地，所述载体为GV358。
上述，需要理解的是，质粒(plasmid)是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学形状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。
优选地，其阳性克隆转化子的序列如SEQ ID NO.1所示。
上述，在进行对TNFRSF10C重组质粒制备过程中，对PCR产物进行测序鉴定，通过与阳性克隆转化子的比对，从而证明测序结果与目标序列完全一致。
本发明提供一种TNFRSF10C重组质粒，利用基因转染和RNA干扰技术将TNFRSF10C重组质粒和siRNA分别转导至伊马替尼耐药株K562R、K562、原代CML细胞中；通过质粒转染K562细胞转染效率和转然后的RT-PCR检测基因表达情况显示出，在K562细胞中，TNFRSF10C重组质粒具有高表达，对于进一步明确PPP2R5C与TNFRSF10C调控耐药CML细胞的相关性，了解死亡受体通路在调控耐药CML细胞凋亡中的作用，为进一步思考联合靶向抗耐药CML的目的基因提供新资料，为进一步提供可彻底消灭病变，无副作用和不产生耐药性的CML肿瘤的治疗药物提供了基础。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种TNFRSF10C重组质粒的制备方法，包括：
进行GV358载体酶切，得到酶切产物；
上述，对GV358进行载体酶切，首先配置酶切体系50μL，加入后，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心后，置于37℃反应3h或过夜。进而对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。
上述，酶切体系包括如下成分及体积：双蒸水42μL、10×CutSmart Buffer5μL、纯化后的质粒DNA(1μg/μL)2μL、AgeI(10U/μL)1μL，总量为50μL。
对引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC进行PCR扩增，得到PCR产物；
上述，对引物通过PCR仪进行扩增，得到PCR产物。
将所述酶切产物与所述PCR产物进行交换反应，得到交换反应产物；
上述，需要理解的是，聚合酶链式反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)(又称：多聚酶链式反应)PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
将所述混合反应物于37℃反应30分钟后冷却，得到所述交换反应产物。
上述，于冰水浴中配制如下反应体系。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
上述，所述反应体系及其体积如下表：
其中，加入线性化载体的DNA和纯化PCR产物片段的最适合的摩尔质量比为1：2。阳性对照加入PCR产物为GAPDH基因。
进行交换反应产物转化培养，得到培养菌液；
上述，将10μL所述交换反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。
将所述培养菌液进行质粒抽提，得到TNFRSF10C重组质粒。
上述，将培养菌液(测序正确)转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下：
1、收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；
2、弃上清,加入250μL细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；
3、加入250μL细胞裂解液，再加入10μL蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；
4、加入350μL中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；
5、10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管；
6、12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转秱至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；
7、加入600μL预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；
8、在超净台中将回收柱转秱至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；
9、往回收柱中加入95μL Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。
优选地，所述“对引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC进行PCR扩增，得到PCR产物”包括：
配置扩增反应体系；
上述，反应体系及各组分体积为双蒸水32.5μL、5×PS Buffer10μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、上游扩增引物(10μM)1μL、下游扩增引物(10μM)1μL、模板(10ng/μL)1μL、PrimeSTAR HS DNA polymerase0.5μL，共计50μL。
加入所述引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC在PCR仪中进行扩增，得到所述PCR产物。
上述，反应条件如下表：
优选地，所述“进行交换反应产物转化培养，得到培养菌液”之后，还包括：
对所述培养菌液进行PCR鉴定和测序，以便于对鉴定正确的所述培养菌液进行质粒抽提。
上述，首先进行菌落PCR鉴定。
PCR鉴定引物如下表
ID seq
KL26742-P3 GTAATTGTACGTCCTGGGATG
FLAG-R-2 CCTTATAGTCCTTATCATCGTC
配制如下表的反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。
上述，PCR鉴定的反应体系为：
试剂 体积(μL)
ddH2O 9.2
2×Taq Plus Master Mix 10
上游引物(10μM) 0.4
下游引物(10μM) 0.4
单菌落 -
Total 20
上述，其反应条件为：
上述，将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。通过比对结果可以说明测序结果与目标序列完全一致。
此外，本发明还提供一种融合蛋白的表达方法，将如上述方法获得的所述TNFRSF10C重组质粒转化菌株培养、诱导后收集菌体；破碎菌体细胞获得融合蛋白。
此外，本发明还提供一种筛选TNFRSF10C抑制剂的方法，包括：
所述抑制剂抑制融合蛋白；
所述融合蛋白由上述方法获得的所述TNFRSF10C重组质粒感染的菌株表达。
此外，本发明还提供一种TNFRSF10C重组质粒的应用，所述TNFRSF10C重组质粒在制备抗CML肿瘤药物的应用。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例：
1、实验条件：
(1)基因信息：
基因名称：TNFRSF10C(NM_003841)
物种：Human
(2)实验材料：
试剂名称 试剂来源 cat.No.
1kp DNA ladder Marker Fermentas公司 #SM0311
250bp DNA ladder Marker 捷瑞公司 DL250+,100T
琼脂糖 赛百盛公司 GA4-100
In-FusionTMPCR Cloning Kit clontech 639626
Taq polymerase SinoBio E001-02B
dNTP Takara D4030A
Primer 捷瑞生物
限制性内切酶 NEB
Plasmid抽提Kit Promega A1460
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 天根生化 DP209-03
(3)主要仪器及器材：
2、载体酶切
2.1载体信息：
(1)载体名称：GV358；
(2)元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin；
(3)克隆位点：AgeI/AgeI；
(4)对照编号：CON238
(5)载体图谱：如图1所示。
2.2酶切结果：
(1)电泳结果：如图2所示；
1#:10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)
2#:载体酶切产物
3#:未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)
3、目的基因片段的获取
(1)引物
ID seq
TNFRSF10C(26742-1)-P1 GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC
TNFRSF10C(26742-1)-P2 TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC
引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因
(2)PCR结果：
PCR产物大小：821
其电泳图如图3所示；
电泳图说明：
Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。
4、重组质粒构建
(1)PCR鉴定引物
ID seq
KL26742-P3 GTAATTGTACGTCCTGGGATG
FLAG-R-2 CCTTATAGTCCTTATCATCGTC
(2)鉴定结果：
阳性转化子PCR产物大小：426
电泳图如图4所示；
电泳图说明：
1#：阴性对照(ddH2O)
2#：阴性对照(空载自连对照组)
3#：阳性对照(GAPDH)
4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp
5-12#:1-8号转化子。
5、阳性克隆测序结果及结果分析
比对结果如SEQ ID NO.1所示；
比对结果说明：测通ok；
质粒转染K562细胞转染效率如图5和图6所示；
转染后的RT-PCR检测基因表达情况如下表和图7所示；
结论：从定量PCR结果可以看出，K562细胞中，OE组的TFRSF10C基因的表达风度是NC的1522.698倍，证明在K562细胞中，TNFRSF10C重组质粒具有高表达。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳人民医院
<120> 一种TNFRSF10C重组质粒、制备方法及其应用
<130> 2018.01.05
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggcccgga tccccaagac cctaaagttc gtcgtcgtca tcgtcgcggt cctgctgcca 60
gtcctagctt actctgccac cactgcccgg caggaggaag ttccccagca gacagtggcc 120
ccacagcaac agaggcacag cttcaagggg gaggagtgtc cagcaggatc tcatagatca 180
gaacatactg gagcctgtaa cccgtgcaca gagggtgtgg attacaccaa cgcttccaac 240
aatgaacctt cttgcttccc atgtacagtt tgtaaatcag atcaaaaaca taaaagttcc 300
tgcaccatga ccagagacac agtgtgtcag tgtaaagaag gcaccttccg gaatgaaaac 360
tccccagaga tgtgccggaa gtgtagcagg tgccctagtg gggaagtcca agtcagtaat 420
tgtacgtcct gggatgatat ccagtgtgtt gaagaatttg gtgccaatgc cactgtggaa 480
accccagctg ctgaagagac aatgaacacc agcccgggga ctcctgcccc agctgctgaa 540
gagacaatga acaccagccc agggactcct gccccagctg ctgaagagac aatgaccacc 600
agcccgggga ctcctgcccc agctgctgaa gagacaatga ccaccagccc ggggactcct 660
gccccagctg ctgaagagac aatgaccacc agcccgggga ctcctgcctc ttctcattac 720
ctctcatgca ccatcgtagg gatcatagtt ctaattgtgc ttctgattgt gtttgtt 777

Claims (10)

1.一种TNFRSF10C重组质粒，其特征在于，所述TNFRSF10C重组质粒包含如下片段：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC。
2.如权利要求1所述TNFRSF10C重组质粒，其特征在于，所述TNFRSF10C重组质粒由引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC，通过载体重组而成。
3.如权利要求2所述TNFRSF10C重组质粒，其特征在于，所述载体为GV358。
4.如权利要求1所述TNFRSF10C重组质粒，其特征在于，其阳性克隆转化子的序列如SEQID NO.1所示。
5.一种TNFRSF10C重组质粒的制备方法，其特征在于，包括：
进行GV358载体酶切，得到酶切产物；
对引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC进行PCR扩增，得到PCR产物；
将所述酶切产物与所述PCR产物进行交换反应，得到交换反应产物；
进行交换反应产物转化培养，得到培养菌液；
将所述培养菌液进行质粒抽提，得到TNFRSF10C重组质粒。
6.如权利要求5所述TNFRSF10C重组质粒的制备方法，其特征在于，所述“对引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC进行PCR扩增，得到PCR产物”包括：
配置扩增反应体系；
加入所述引物TNFRSF10C(26742-1)-P1：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGATCCCCAAGACC和TNFRSF10C(26742-1)-P2：
TCCTTGTAGTCCATACCAACAAACACAATCAGAAGCAC在PCR仪中进行扩增，得到所述PCR产物。
7.如权利要求5所述TNFRSF10C重组质粒的制备方法，其特征在于，所述“进行交换反应产物转化培养，得到培养菌液”之后，还包括：
对所述培养菌液进行PCR鉴定和测序，以便于对鉴定正确的所述培养菌液进行质粒抽提。
8.一种融合蛋白的表达方法，其特征在于：将权利要求5-7中任意一项中获得的所述TNFRSF10C重组质粒转化菌株培养、诱导后收集菌体；破碎菌体细胞获得融合蛋白。
9.一种筛选TNFRSF10C抑制剂的方法，其特征在于，包括：
所述抑制剂抑制融合蛋白；
所述融合蛋白由权利要求5-7中任意一项获得的所述TNFRSF10C重组质粒感染的菌株表达。
10.一种TNFRSF10C重组质粒的应用，其特征在于，所述TNFRSF10C重组质粒在制备抗CML肿瘤药物的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109799A (zh) * 2022-07-26 2022-09-27 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1440424A (zh) * 2000-05-02 2003-09-03 Uab研究基金会 对于肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体选择性的抗体及其应用
CN107207601A (zh) * 2015-01-20 2017-09-26 Igm生物科学股份有限公司 肿瘤坏死因子(tnf)超家族受体结合分子及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1440424A (zh) * 2000-05-02 2003-09-03 Uab研究基金会 对于肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体选择性的抗体及其应用
CN107207601A (zh) * 2015-01-20 2017-09-26 Igm生物科学股份有限公司 肿瘤坏死因子(tnf)超家族受体结合分子及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEGLI-ESPOSTI,M.A. ET AL.: "Homo sapiens TNF related TRAIL receptor (TNFRSF10C) mRNA, complete cds", 《GENBANK:AF014794.2》 *
沈琦等: "下调 PPP2R5C诱导 K562细胞凋亡过程中肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体及调控基因表达水平的研究", 《中华生物医学工程杂志》 *
肖蜜黎: "TRAIL及受体在少突胶质细胞发育中的表达及在诱导OPC调亡中的作用", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109799A (zh) * 2022-07-26 2022-09-27 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药物中的应用

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