HU230399B1 - Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai - Google Patents

Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai Download PDF

Info

Publication number
HU230399B1
HU230399B1 HU0500800A HUP0500800A HU230399B1 HU 230399 B1 HU230399 B1 HU 230399B1 HU 0500800 A HU0500800 A HU 0500800A HU P0500800 A HUP0500800 A HU P0500800A HU 230399 B1 HU230399 B1 HU 230399B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
tra
antibody
dna
apoptosis
Prior art date
Application number
HU0500800A
Other languages
English (en)
Inventor
Tong Zhou
Kimihisa Ichikawa
Robert P. Kimberly
William J. Koopman
Original Assignee
Uab Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uab Research Foundation filed Critical Uab Research Foundation
Publication of HU0500800D0 publication Critical patent/HU0500800D0/hu
Publication of HU230399B1 publication Critical patent/HU230399B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

A TRAIL a fehérjék TNF-családjának tagja, asnely tartalmazza a FNE-a-t és a Fas-sigandumot C1). Ezen fehérjék az apoptózis hatásos mdukálószereí. Mfeámátg a TRAIL 5 receptorát azonosították, amelyek közül kettő, a D R4 (T&AIL-R.3) és DR5 (TRAJL-R2) (2-7) képesek az apoptózis jel továbbítására, míg a másik kéretre a DcRl (TRA'IL-RJ), DcR2 (TSAII,-R4), és ©szíeoprotegerín (OPG) oetn transzdukálja az apoptózis jelet (S~12), Mind az Ss TRAlL-reoeptor szignifikáns hotnológiát mutat az extraceUuiáris liganöumköíő ífeménjében. Hasonlóan a Fas-hoz és TNF-receptor-I-hez (amit a leírásban ezentói „TNÍ RF'-ttek nevezünk), a DR4 és DR5 irííracellnteris szegmense halál-dptsténí tartalmaz, és transzáukálja az apoptózis jelet egy olyan útvonalon keresztül, amelyben részt vesz a Eas-asszoclált fsaláldomén-tehérje tárná a leírásban ezestál ^AD©”nafe nevezünk) és a kaszpéz~S (ő, ?}, Az apoptózis jel továbbítása mellett a DR4 és ©Ró receptorok képesek aktívéin! aHFKbátítemlái is fő, ?>,
A TRAIL demonstrált biológiai fnnkelól közé tartozik a képessége transzformált dagasassejtek ápegtóztsának szelektív indukélásárá, ntíg rrorméils sejtek viszonylag rezsszlensek a TRAlL-kozveiíiett apopiőzlsra (IMS), Ez a szelektivitás azt sugallja, hagy a Fas-ligandummal ellentétben TRAIL beadása nagyon alacsotsy s/ínjt, toxicítássnl jár, amint ezt demonstrálták TRAIL szisztémás beadásával élteti tnodellben, szignifikáns iovk'ü&s indukálása nélkül <13>, Ezáltal a TRAIL-t javasolták Itatásos apoptezts-tedukátó szerként, amely alkalmas lenne terápiás szernek rák és abnormális sejiproliferácíóval járó egyéb betegségek terápiás szereként. Azt Is javasolták, hogy a 'TRAIL hatásos apopfézis-indufcáló szer, amely alkalmas lenne autoimmun és gyulladásos betegségek kezelésére, Demonstrálták, Rogy a TRAIL-közvetített apoptózis részt vesz a T-sejték aktíválás-iadnkáh. halálában, ezáltal a Fas-hgandam alternatív mechaniznms&ként szolgál (16, 17). A TRÁ1Lközvetítetí apoptózis szerepei játszhat I -sejtek ás egyéb gymliadásos sejtek apopfozisának irtdókálásában Is (18), és szerepet játezik az NR-sejiek ólóaktívltásábsh (19-21), és a dendrikus sejtek nmrummodoiátör mlikődésében (22. 21), Ezáltal a TRAlí -közvetített apoptózis szerepet játszhat az inanuriprívtlágnmt és jnunonfelögyefésben is.
A TRAlL-receptor rendszer komplex, és legalább két halákeceptört, a DR4-ei és DRS-öt, és legalább két nem-apoptózisos receptort, a DcRl-et és DcR2-t foglal magában. Ezen receptorok mindegyike nemcsak nagy arotnosav-szekveada homologiáí mulat, hanem hasonló kötést aktivitást a TRAIL írént (2-12). A. DcR 1 és DcR2 receptorok képessége versestgésre a TRAIL kötéséért apoptózis indukálása nélkül azt sugallja, hogy azok áleaíeceptorekként hathatnak, amelyek gátolják vagy modulálják a TRAIL-Iígandtjsn aktivitását. Ezenkívül arról ss beszáíttoltek, hogy sem transzformált sejtek az álcareceptorok magasabb színijét espresszálják, mint a transzformált sejtek. Ezáltal azt javasolták, hogy a haML és áleareceptorok: expresszlojának differenciális modu101408-6051 LOVÁN lácíója kuiesfentosságő szabályozó mechanizmus lehek amely meghaíározza sejtek érzékenységéi TRA1L-közvetített apopíózísru, a reeepíor-sgeeiSkus ellsoányagók hiánya miatt <2> Habár a DR4 és DR5 éxpressziőjár és funkcióját feshatóas tanulmányozták, a haladást gátolta a receptor-specifikus tnonokíonáíis ellenanyagok hiánya. Nem dokmueutákák a.085 sejtfelszíni expresszióját. Beszámolták mől, hogy sntí-TRÁIL-reeeptoreileu: anyagok panelját: állították elő, amelyek képesek mebmóma sejtek apoptőzisáuak indnkálásáí-a in váró, de csak az ellenanyagok ímmobilizálásával a keresztkötés elősegítésére, és.- bizonyos esetekben - :a sejtek akdnomíeínö-vel való tenyésztési: igényeinek (24). Számos anti-DRó eilenanyagoi előállítottak (24), .Azonban ezen korábban előállított antí-DRS monoklonális ellenanyagoknak alacsony az apoptózist indukáló aktivitása m váró, még keresztkőtés melleit is. Nem számoltak be m vivő akti vitásról. Ezen ellenanyagokat nem alkalmazták TRA.1Lreceptorok sejtfelszíni expresszíőjának. vizsgálatára (24):, Ezáltal igény v« az egyes specifikus TRAiLrecepíorokra szelektív monoklonáiis ellénanyagokra, amelyek nemcsak képesek kötődni a sejtfelszíni receptorhoz, hanem képesek erősen apoptózist indukálni abnormális sejtek különféle típusaiban, beleértve dagasatsejtekeg mind m orvé, mind m '.ΊΡό, anélkül, hogy keresztkötésre vagy immobilizációra lesne szükség, Ilyen ellenanyag nemesük lehetséges terápiás szer lesse, hanem diagnosztikai eszköz is a TRAlL-reeeptor funkeíonális elemzésére. Különleges ígériv vau a halál-indukálő ÖR.4 és DR5 receptorok mindegyikére specifikus ellenanyaglrány,
Számos betegség kialakulásában, vagy előrehaladásában gyakran az történik, hogy a sejtek nem tűnnek el, Sok autoimmun betegségben és gyulladásos állapotban a túlélő aktivált sejtek megtámadják a normális szöveteket vagy sejteket. Ezenkívül a tumotígenezis előrehaladását és a remnatoid sütni tsz proliferasív panuszán&k kialakulását is a sejtek ellenőrizetlen prtslílerációja jellemzi. Ezáltal az elégtelen apoptozis betegség kialakulásához vezet, és: az apoptózist indukáló ligandutn vagy ágon ista monokionális ellenanyag alkalmazása apopíózis: fokozására potenciális terápiás stratégiának tekinthető ezen nemkívánatos sejtek eliminálására.
Például a renmatoíd artritisz (amit a leírásban ezentúl „RA^’-nak nevezőnk) gyakori humán autoimmun betegség. Az: RÁ patoiíziológiájának jelenlegi értelmezése az, begy autoimmun T-sejtek és R-seitek gyulladásos választ indítanak üteg az ízületekben, árui létrehozza a szísovioeiták hiperproliferácíoját. A szihőviális sejtek hiperproliierámőjának következményeképpen metalloproteínázok (ámít a leírásban ezentúl „MW^-nek nevezúnk) túltermelődnek, ami ezután a porc és csont eroztv destrukciójához vezet, ami az KA. jellemzője (25). Ezáltal az mllammatorikns: szmoviális sejtek kontrollja kulcslépés az RA kezelésében.. .A. színoviális sejtek hiperprolíferádójához vezető molekuláris meehaniznuis még ismeretlen, Habár a htpesproií&rálő szmoviális sejték nem rossziadulaíUak és nem transzformáltak, sok vizsgálat javasolta, hogy vannak közös tulajdonságaik a transzlbiznáit sejtekkel (46). Ezen sejteket, az úgynevezett „transzformáltuak Úrnő ssfetevioeMtei” saru durva félúletú endoplazmaíikus retíkulum. számos szabálytalan alakú sejtmag és a normálisan orsó alakú sejtváz változása jellemzi. Azt javasolták, hogy onkogének és vírus eredetű gének beépülése leimé az elsődleges oka az RA szinovíális sejtek transzfömtálí kinézetének 146).
Az KA legalább két aspektusa sugallja azt, hogy a szabályozni lan apopíózis hoz * járulhat a betegséghez. és hogy apopíózis terápiás kiváltása hatásos kezelés lehet; az aktivált T-sejtek ellúmetessaek hiánya azt sugallja, hegy ezen T-sejteksek detektív az aktíváoi.ó-inflnkált sejthalála, ami olyan folyamat, amely Fasközvetlted: apoptózist és TRAIL-közvsiheti apoptózist téglái magában, és az RA színoviális sejtek biperproliíeraflv természete hozzájáruló tényező az RA patoflzlológiájának későbbi fázisaiban, Sőt azt is kimutatták, hogy anti-Eas ellenanyag beadása a gyulladt ízületekbe gátolja krónikus artritisz kialakulását: íze transzgeniktss egerekbe»,, amelyek a: humán RA állati modellje (26). Ezeníeldl Eas-ligpnduín génnel adenovóus vektor útján történő lokalizált transzdukeló hatásos a koilagén-iudakák sfírltlsz tuegakadályozásábaa (27). Az «tflammatorikus sxinoviálts sejtek prohferáelójásak gátlását figyelték meg nrindkét esetben Fas-közvetltett apoptézis fokozása tő ven, flahár a Eas-ilganduin erős apoplősis-ítulukálószer R.A sztnoviálís sejtekben, a T'ss ligandsun-közvethert apopfózis alkaltnazása terápiaként emberekben korlátozott a letábs májtoxieitás matt. Ezátel a TRAfL-reeeptor-inóokált ttpoptózis egy biztonságosabb és hatásosabb terápiát jelent áz KA kezelésében, mint a Fas-ligándum-mdukált apoptózis.
A FitAlL-reeeptöröndukáit apoptózis egy btzfonságösabh és hatásosabb terápiát jelent rák kezelésében is, mint a Fas-hgsmöum-indukált apoptózis. A TRAíb-hözvefitett apoptözísrói ismert, hogy specíftteart indukálja transzformált daganatsejtek upoptózisáf, aoélkrd, hogy befolyásolná a aonnális: sejteket. K.hnntatlák, hogy íronerizálí oldható TRAIL szisztémás beadása nem volt toxikus kísérleti állatokban, de mégis képes volt beülteteteit daganatok regressziójának buiukálására (13, 2S), Az alkalmazását jántlékos terápiára hagyományos kezelések mellett kiemeli az: a nemrég! eredmény, hogy a'DRS expressziója és emlóráksejtek érzékenysége TRA1EIndukált apoptózisra fokozódott besugárzás hatására, sugallva, hogy besugárzással kombinálva a WAíL hatásossága növekedne rákterápiában (29).
Ezenfelül a DR5 TRÁlL-recepfort kódoló gént a Rp2I -22 kromoszómára térképezték, amely lokuszuák nagy a mutációs gyakorisága bizonyos ráksejtekben (30). Beszámoltak arról, hogy legalább kétféle daganatsejt, a kis tüdőrák (31) és a fej és nyak rák (32) mutat mutációkat a DR5-gén haiáldoméujében, Ezáltal igény van aníí-DR5 ellenanyagra a rákkutatásban a receptor epitópvarláeiőja hatásának meghatározásra a rákok kialakniásábsn és előrehaladásában. Továbbá a TRÁl.L-reseptor mutációk funkcionalitása hasznos klinikai diagnosztikai eszközsok bizonyulhat, amikor együtt alkalmazzuk más blonrarkerekkel a rákok korul detektálásában és daganatok agresszivitásának megjóslásában.
A találmány tárgya olyan ellenanyag, amely felismeri a 1>RJ TRAiL-reseptort, és amely apoptózsst indukál: DR5-ÖI expresszáló sejtben ló wo. Továbbá a találmány tárgj a olyan el ienanj ag. amely fel ismeri a DR5öt, de nem ismeri fel a f>R.4~et. DeRí-es és DcR2-t. Specifikusan a találmány tárgya a TRA-1 ATCC PTA-1741 jelű hibridóma által -érméit monokionábs ellenanyag, vagy humanizált verziója .
Egy eljárás lehetővé teszi sejiproiiferáció gátlását a sejt kitételével ÖR5-höz kötődni képes ellenanyag terápiás mennyiségének, A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény, amely DRó elleni mosoklonálls ellenanyag terápiás mennyiségét taríahuazza, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozót ős az ellenanyagot és a hordozót tartalmazó tartályt, A tnlálmány tárgyát képezi továbbá DR5~öt felismerő férni ellenanyag alkalmazása abnormális: vagy hibásan szabályozott sejtek szelektív apoptóztsára alkalmas terápiás szer előállítására, •A találmány szerinti ellenanyag köicsöahat tumorneteózis-táktor-llgandunr-reeeptorral, mint például DR4-gyel, DR5-tel, IfeRl -gyei, DóR2-vel és ÖW-vel, opoptözisí indukálva ilyen receptort expresszáló sejtben. A találmány tárgyát képezi olyan ellenanyag, amely képes szelektíven kötődni ago-nísta vagy anísgonista tttawmekrózis-fekter-llgartdmn-reeepfor epitóphoz.
A találmány szerinti ellenanyag alkalmazható apoptósissal kapcsolatos betegség kezelésében olyan eljárással, amely szerint apoptóztssal kapcsolatos betegséget, mutató eélszöveiet kitesztek találmány szerinti ellenanyag terápiás tuesnyisögánek.
A találmány tárgya· továbbá fúziós fehérje, amely legalább 10 báztsnyl anligéshutásö IRAlt-receptor amínosav-szekveneiál: tartalmaz, kapcsolva immunglobulin fehérjéhez vagy ásnák tragmensébez, amely képes tthtntmválasz kiváltására az alifevbam
A találmány tárgya eljárás humanizált ÖRS ellenanyag előállítására, amely szerint gazdát transzdórmálusk humanizált Immnsglohöftnn kősava láncot és humanizált: immunglobulin nehéz láncot kódoló nnkfeinsav·· szekvenciákkal, ami után a transzformált gazdát ínkobáljhk egy előre meghatározott ideig,
A találmány tárgya továbbá eljárás sejtproliferáció gátlására, amely szerint célsejtet érintkezésbe ho~ ztmk humanizált ÖRS ellenanyag gyógyászatitag hatásos mennyiségével.
A találmány tárgya kereskedelemben Forgalmazható rengensfcészlet sejthalál indakálására, amely DR5:re szelektív humanizált TRA-8 ellenanyagot tartalmaz, megfelelő tartályba csomagolva, használati utasítással együtt.
Az alábbiakban röviden isrserteíjök a leíráshoz fertőző ábrákat;
Az, 1. ábrán a TRA-8 jellemzését mutatjuk he. (a) a TRA-8 kőtőspeciíitásm Wesiern-blot elemzés (felső rész); a B4FR családba tartozó rekombináns fúziós fehérjéket próbáztmk TRA-S-eal vagy anti-hntnán-igCsvel. 1. sáv: BRő/blgGl &tíós fehérje (Immonogén); 2, sáv; ÖR4/hlgGt (TRÁ1L-R1); 3. sáv: ÖRS/hlgGI 4. sáv: TRA1L-R3 (DsR-lyhlgCíl; 5. sáv: IRAÍL-R4 (DcR-2)/bIgGi; ó. sáv: CÖ95felgGi 7, sáv: oldható TbiFRI. ELISÁ elemzés (alsó rész): A mérőhelyek száma megegyezik a Wesíern-hlotévak kivéve: a 8. mérőhelyet, amely egér DRdfelgGl fúziós fehérje, (b.) Oldható TRAíL és TRA-8 kötést aktivitása ÖRS-höz és ÖRBhsz: ELíSA rsikroíitorie-mezeket vontunk be DR5/hlgöl-gyel (baloldali részt vagy DRdfelgGJ-gyel (középső rész), és azután íakuhálsuk TRÁÍL-Jel vagy TRA-8-eak (e.) ÖRS felszíni expressziöjás&k áramlási dtometriás elemzése, Cns-7 sejteket tmnszíékfáltnnk pcöN.43 expresszios vektorral, amely tartalmazza a teljes hosszúságó ÖRS cDNS-t (teli hisztogram), Í>R4 cÖNS-t (üres btszfogram, sima vonal), v,agy üres vektorral törés hisztogrsm, szaggatott vonal), 4t> órával a Iranszfekctó után a sejteket festettük TRA-8-cal, majd PE-vel konjagált anti-egérigöi-gyel. td.) ó? s/to ismrmnhisztokémiai reaktivitás ÖR5-re: DR5-öt expresszáló vagy' kontroll vektorral transzfektáh Cos-7 sejtek Cms/fe? lemezeit: Festettük TRA-8-cal 48 órával a trasszfeketó után, (e.j TRA-k ölőaktivitása: Jutkát sejteket inkabáltunk TRA-S jelzett koncentrációival A sejtek életképességét .4 '/'PLies, AÖT, és F7 kizárási vizsgálati eljárásokkal határoztuk meg éjszakán keresztül történd tenyésztés után. Az ATRlíte és MTT vizsgálati eljárások eredményét a tápközeg-komroil százalékában adjuk meg, és a Pl vizsgálati eljárás eredményét a Pl-negatív sejtek százalékában adjuk meg. (I.) Kaszpáz-aktiválás Wesíern-bio; elemzese: .farkai sejtekül Inkuháltnnk 5öö ng/mi TRA-8-cal a jelzett ideig. A sejti izánunokat 15's«-os SÖS-PAGh-n választottuk el, biottoltuk. és próbázmk snti-kaszpáz ellenanyagokkal. A nyilak jelzik a kaszpáz hasított alegységeit, (g. s Kaszpáz-gátiási vizsgálati eljárás: Jarkat sejteket inkubáhuuk 50 ng tnl TRA-8-cai éjszakán kérésedül a jelzett kaszpáz-tuhsbiíorok különböző koncentrációinak jelenlétében. A sejtek életképességét ,47PZ.«a vizsgálati eljárással határoztak meg.
A 2. ábrán ÖRS sejtfelszíni expresszióját és » ÖRS-kőzvetített apoptozisra való érzékenységet mutatjuk be. Perifériás vérből frissen Izolált normál T- és B-sejiteket (a és td), gliömát tb é» b'j, prosztatarák sejtet (c) és B-sejí sejtvonalakaí (d) ínküfeáhunk TRA-8-cal vagy egér feöl tzotlpús konlrol eilépányaggak majd PE-vel konj agáit keeske antt-egér-lgGl-gyel Az üres hisztogramok jelentik az izotípus ellenanyag kontrollt, míg a leli hiszíogramok jelentik a TRA-íhfésiésí, Az apoptózisl az ATPöfe? vizsgálati eljárással határoztok meg éjszakán keresztül Inkabálás után, oldható TRA11,-iel (üres körök) vagy TRA-b-eal (teli körök), sxnint az a, b’ és d ábrást bifnruiatjf-k.
A 3a' ábrán Ü437 T-sejtwsslpi iritebálhmk TRA-S-eal vagy egér Igöl Izotipas-koníroH ellenanyaggat Az. apoptőzsst azATPLite vizsgálati eljárással hsiároztstk.taeg éjszakás teraszig! történő ísknbálás után, oldható TRAR,-lel (8te; körök) vagy TRA-R-caí (teli körök).
A 3. ábráit gliőnta (b) és prosztatarák te) sejt vonalakat intebátenk fR.A-8-eal vagy egér IgGl izoijpas-köníroli ellenanyaggal, Az apoptózíst az A2F£he vizsgalati eljárással határoztak stég éjszakás keresztül történő mknbálás után, oldható TRAit-leí (üres körök) vagy TRA-R-e.al tteli körök)
A 4. ábrán ábrák sorozatát muteíjnk be, amelyek isaríáti Jartet .sejtek életképességét matatják (A) TRA-1, -8 és -1Ö ellenanyag törzsek és (B) TRAlL jelzett koncentrációt val történő Inkubálás után: a találmány szerinti ellesartyagtörzs 4 A, ábrán bemutatott rögzített koncentrációjának jelenlétében.
Az $. ábrán DR5 expressziójáí matatjuk be normál és rákos szövetekben: Normál és rákos szöveti temögenlzátnmőkat prőbáztank TRA-8-eal, és festettünk kemitennteszcettetával (a ) öR5-fehérje Westernblöt elemzése normális szövetekben: L sáv: máj, 2, sáv: agy, 3, sáv: tödé, 4, sáv; vese, 5, sáv; lép, ő. sáv: here, 7, sáv; petefészek, R, sáv: szív, 9. sáv: hasnyálmirigy, (b,) DR5~fehérje Western-bloi elemzése rákos szövetekben, Az alábbi szövetekből származó rákos szöveti hlotoi prőbmtek: petefészek (1, sáv), tüdő (2. sáv), máj (3, sáv), végbél (4. sáv), méhnyak (5. sáv), bor (6. sáv), here (7, sáv), pajzsmirigy 18. sáv), méh (10 sáv), gyomor (H. sáv), garat (12, sáv) és hasnyálmirigy (13. sáv). Normál (c.) és rákos (<S.· szövetek /» sdn immunhisztokémiája. Fagyasztod metezeteteí Immonolögiailag festenünk TRA-8-cal,
A 6. ábrán TRÁ-8 daganatellenes aktivitását matatjuk be. SC1D egereket oltottunk be sznbtetán 132INI sítekkel. Az egereket intravénásán öltetek löt) pg TRÁ-8 egyetlen dózisával a daganat beoltása utáni 2. napon (a,), vagy iöö pg TRA-8 három dózisával 7 nappal a daganat beoltását követben kezdve, (b) A daganatok növekedéséi a tömeg alapján határoztak meg, és szövettanilag elemeztük lí&E festéssel. A fényképek ételképes daganaínövekedésf motairsak a kontrolt egerekben,: de a TRA-8-eat kezelt egerekben nem (¢., felső rész), és a daganat B&E tesíődéséí (e„ alsó rész). SCID egereket oltottunk intravénásán 1Ö-‘ hakni sejttel és kezeltünk TRA-8 egyetlen dózisával az oltás utáni második napon. Bét nappal kéaőbb lápsejíetet gytíjiöiüink, festettük azokat anti-hrnnáo-CD;) ellenanyaggal:, és elemeztük áramlási, eitomeiríával (d.), vagy immnn-bisztdkétnlával (fi·).
A 7, ábrán sejtfelszíni DR5: expresszióját műtejük be RA (A) és QA f>> szinovíális sejtekben, 1x1 ff1 elsődleges tenyésztett szinoviális sejtet festetünk afeínlíás-dszritoti TRA-8-eal, majd EB-vel koujugált kecske anti-egér-tgöl ellenanyaggal. 1ÖÖÖ0 életképes sejtét elemeztünk A,dCfemRog® készüléken.:
.A 8. ábrán ábrák sorozatát mutatjuk he* amelyek sejtek életképességét matatják RA (A) és ÖA (Ő) szinoviális sejtek reprezentatív törzseinek TRAlL és TRA--S koncentráció áltat indukált apoptózisa függvényében,. srekotn bitiért s oldható TRAIL (üres körök) vagy affinitas-tisztitott Ϊ RA.-8 ítélt körök) különböző koncentrációt mellett. A sejtek életképességé- a kezelt sejtek cptn-js és texsietlen sejtek eptn-jo: százalékában adlak meg.
A 9. ábrán az RA, sztnoviáiís sejtek DRő-közvetlteit apí’P^ísának. kaszpáz-fuggését betnaíató ábrasórozatot tntitetmk be. RA szinoviális sejteket (RAS12) mknbáltmk 5Ö ttg/tnl oldható Fas-liganduntntul (ites négyzelek), antí-Fas ellenanyaggal (CH-! 1) (feli négyzetek), oldható TRAIl-lel (üres körök), vagy astl-DR5 el6 lesáoyaggal (TK.A-k) (teli körök) kaszpáz-mhíbitorofc különböző koneeBtrációlnak jelenlétében. Éjszakán kerésztől történő tenyésztés után a sejtek életképességét meghatározzák ATÍTte vizsgálati eljárás alkalmazásával.
A 1ŐA. ábrán eieteförefikos „gékshtS” ybsgáteis eljárást tömtek be, «I Nfkb-aköváfást jelez, RAIbiŐ sejteket infcubálfek 20mg/mi TNF-o-vál, 5Ö ngtel oldható TRAÍL-föí vagy 50 ng/ml TRA-8-cal a jelzek időpontokig, mielőtt elehro&zeüzáljük, A 1.ÖB, és 1ÖC. ábrán NÍMR-1 és MN1F-3 termeléséi mutatjuk be. A jelzett RA sfeovsálls sejtek IxlCiÓmMt mkobáljtsk TNF-tt jelzett koncentrációival (üres körök), TRAIL-Íel (üres háromszögek) vagy TRA-b-eat (teli körük). Éjszakán keresztül történő tenyésztés ötáa a tenyészetek: felülúszóti összegyűjtjük. Az MMP százalékos színijét a tenyészetek felöinszöiban ELíSA-val határozzak meg.
AH. ábrán azt mutatjuk be, hogy TRA-S nem indukál hepatocelluláris toxseúást. (a.) Normál snálszöveí nem expresszál DR5-őt. Két nemiál tnájszövet paraffinos metszetét, egy hepatocelluiáris kareínótnás szövetet, és HepG2 sejtek CvtosjEvn készítményét állitoíhsk elő H&E festéshez, és a nregfelelő fagyasztott metszetekéi festettük TRA-8-C&L (b.) DR5 sejtfelszíni expressziójának áramlást dípnfedás elemzése. Kél normális májszővetből és egy hepstoeellüláris kaiteömás esetből izolált hepaíocifákai és ífepö2 sejtekét feteiíönk TRA-S-eai, anti-Fas ellenanyaggal <DX2) vagy jzoíípns-komrnll ellenanyaggal, A feli hiszíogramok jelzik a. TRA-S vagy 0X2 festést, és: az üres hlsztegramok jelzik a meg felelő izotfpns-kontollökat.
A 12, ábrán azt mtetjnk be, hogy a TRAIL indukálja, de a TRA-8 pedig nem a hepaíoceiuláns toxlcltást. Friss nomnál: humán bepáiöciíákat tartóffek fen Hepaíódia Tenyésztő Tápközegben, (a.) A hepatediák spoptőzisát 1 pg/tnl oldható TRAlh-fel és keresztkotövol, vagy TRA-£~éai indukáltuk a jelzett időpontokig. A sejték életképességét ATPOte vizsgálati eljárással határoztak meg. Az eredményeket életképes sejtek százalékában adjak meg a tápközeg kontrolihoz képest. Az árnyékolt téglalapok jelzik a TRAlL-t, és a feket e téglalapok jelzik a TRÁ-8-at (b.) A bepatneiták kondenzált sejtmagjait ftete 33552-vel festettük meg, és ámsíási ettooteíriávai elemeztük, (e.) Clklohexímid hatása a bepatoelíák apopíózisára. Hepaíoeliákat fenyfeztéitünk kontroll lápkőzegben vagy 1 pgfml TRAfh-lel vagy ?R.A-k-eal: 1 pg/ml dklöheximid jelenlétében (téli téglalap) vagy hiányában (Üres téglalap) 8 árán keresztül. A sejtek életképességét ATPLste vizsgálati eljárással határoztak meg. Az eredményeket két kísérlet három párhazamos tenyészetének átlag * szórásaként adjuk meg. (d.) Normát hepatodták DR5~ és Fss-közvet bért apoptözisra való érzékenységének összehasonlítása. Frissen izolált feepatodiákat mknbáitnnk oldható TRA11„ TRA-8, oldható Pasi, vagy a CH11 antt-Fas monohlosíslis ellenanyag jelzett koncentrációval 6 órán keresztül. A sejtek életképességet XTPte? vizsgálati eljárással határoztak meg. Az eredntényeket életképes sejtek százalékában adjak meg á tépkőzég kontrolihoz képest. Normális hep&todlák esetén négy normál egyén átlag e. szőrás értékét adjuk meg. Az egy pácienstől származó hepaíoeellulária kardsómás sejtek és hlepöS sejtek eredményeit három párhuzamos tenyészet átlagaként adjuk meg.
A 13, ábrán azt matatjuk be, hogy a TRAtt hepatitiszt indukál. Bő egereket isdravénásao oltotínnk NÉ pfe adenovlrus vektorral, amely barnán TRAíL teljes hosszúságát kódolta a „Tet-on” transzkripeiós elem szabályozása alatt, A TRA?t expressziöt ielrsciRlia jelzett dózisával indukállak., (a.) idomán TRAlL-expresszió Nnrtheru-blof elemzése májban. A vaktor beoltása és tetraciklinnel történő índohálása után 24 órával Sssz-RNSt izoláltunk a májból, próbáztönk humán TRAIt cDNS-sel vágy β-aktiopal. (b.j AST szértahszintje. 24 órával a TRAIT transzdukdőja után meghatároztuk az AST szérümszmtjét. (e.) Adenovírus vektorral fertőzött: bepstoelíák TRÁlL-közvetíteft Sőjthálála: B6 egereket tstevénásan öltöttek ietracifclmnel indukálható adeítovite vektorral 48 órával az oltás: márt hepatedfákaí izoláltak az okért és nem öltött kontroll egerekből, és inkubátek azokat a TRAIL jelzett koncentrációival 8 órán kérésztől (baloldal; rész). A bepaiocha sejtek életképességét .-líTIú'i? vizsgálati eljárással határoztak meg, Aáenovínjssal a fenti módos öltött egereket okoltunk intravénásán: 10 pg oldható humán TRAiL-leí 48 órával később. Mértük az. AST szérumszintjét 24 órával a TRAIL injektálása után (jobboldali rész) (ö. és e. s i'R.AIL által indukált májkárosodás szövettani elemzése. A májakat 24 órával (d.) vagy 7 nappal («.) a TRAjt-fel történő tmnszdukeió titán gyűjtöttük be. A paraífinos metszeteket H&E' festettük, és lefényképeztük líiöx (felöl) és 41Mlx (alul) nagyításban.
A 1.4. ábrán ábrák egy sorozatát mutatjuk be, amelyek azt mutatják, begy humán FRMC-hől tisztított fediválf T-sejtek és S-sejfek DR5 tnegpövéksdetf szintjét expresszálják, anilnf azt áramlást elíömebiával meghatároztuk nyugalomban lévő (üres) és aktivált (árnyékolt) sejteket;.
A 15, ábrás életképességi görbéket mutatunk be TRA-8 koncentráció íuggvésyében a 14. ábrát; bemutatott tisztított T-sejtek és B-sejtek esetében, amelyeket 48 órán keresztül stimuláltunk aati-CDd-mai vagy arttip-vel, és különböző süráségü AfeuTARa^uc alkalmazásával gyűjtött aktivált blasztsejtekkel, Az életképességet ,·! 77-7..00 vizsgálati eljárással határozzuk meg,
A 16, ábráit hisztogramot és áramlási ótomeíriás plofoi mntaísmk be, amelyen humán PBMC-vel és TRA-8~cal vagy IgG-vel (kontroll) oltott NÖDZSCÍD- egerek hfeí-sejíekre kimerített kapuzott leukoelta populációjának CD3-expresszíÓját mutatjuk be.
A 17. ábrán CD2-mal és TtJÖlEL-fel festett mikrogramokat mutatunk be a 13. példa szet tül! egér lépsz-övetekból,
A 18. ábrán cltotoxichási ploíokat mutatunk be krónikus llmfecita leukémia íCCL.) és normái B-sejtet hordozó emberekben TRA-8, B1WIH, és azok kombinációja jelenlétében,
A sejtek eltávolításának hiánya az a)>optézis-indakálö rendszer hibái miatt van, amely kapcsolatos olyan hibákkal, amelyek közé szemléltetésként a lig&ndum, a receptor, vagy intracellulárís szabályozó és: efíektsr molekulák expreszszíojának vagy funkciójának hibái tartoznak. A leírás eljárási tár fel & deficicns apoptózis-isdukáló rendszer kijavítására, valamint egy adott hibás apoptözis-mdoksílö rendszer specifikus: hibái nak felderítésére.
A találmány tárgyát snonóklonáiis ellenanyagok egy új osztálya képezi, amelynek szelektív út vivő és út vimo apopiózis-ladukálö aktivitása van specifikus TRAIL-recepterok ellen, beleértve a !3R5-öt, DR4~ei, DeR 1-et és DeR2~t. A találmány reagensként alkalmazható apoptózis jeltovábbítási kutatásban, valamint terápiás szerként alkalmazható TRAlL-reeeptorokat exprcsszáló sejtek ellett, amelyek közé tartozik szemléltetésként ráksejtek széles köre, az apoptozfe rendszer hibás szabályozása ellen, és autoimmun betegségek abnormálisait prolsferáío szjnoviábs sejtjei clfen. A találmány szerinti ellenanyagok kötése specifikus TRAlL-receptorok adott típusaira, a köztük lévő bomuíógia ellenére. A találmány szerinti ellenanyagok lehetővé teszik csak azon sejtek célzott apoptózisát, amelyek a célzott TRAíL-receptort expresszálják, vagy- más: megoldásképpen a célzott receptort expresszáíő sejtek TRAlL-apoptózisásak gátlásáé
A találmány szerinti anfi-DR5 manokltmúlis ellenanyag apoptózis hatásos isdukáiószerként szolgál DRŐ-öt m safeö expresszálő sejtekben, és apoptózis hatásos indnkálószcrc in v/vo. l-famastizált ellcnanysggefincre úiietett humanizált. GDR-székvencia-feagmensek., és íaláhtfeny szerinti ant.i-DR5 ellenanyagok luzíós feltétjei hasonló apontózisos tulajdonságokat mutatnak.
Mindmáig nem volt elérhető olyan monoklonálisellenanyag, amely kötödika sejtfelszíni 15R5-hdz, és keresztkötó hiányában apoptózist indukál DR5-Ö1 expresszáió sejtekben mind fe vivő, mind ·« vtfeo, A találmány tárgya ami~ÖR5 ellenanyag terápiás szerkóm betegség állati modelljében, mini például xenogradolt állatokban, vagy f« O. Habár tó oldható TSAiE-reeépterről kimutatták, hegy hatásos daganátsejtek apoptózisánstk iudnkálasábso d? two, az ölöaktívítás nagyon alaosnnynak dint, és gyakran nagy és ismételt dózisok voltak szükségesek (B). A FRA-k, amely találmány szerinti aníi-DRS ellenanyagok sorozatának egyike, gvógyászadíag hatásos humán DR5 transzgéni hordozó állatokban, és alkalsrsazbatö a DR5 és TRAIL szerepének vizsgálatára szolgáló modell létrehozására is.
Találmány szerinti TRAIL-reoeptor ellen termeltetett ellenanyagot a találmány szerint kísérleti állatból állítunk éld. A ialálntány szerinti ellenanyag humanizálásával - a recsptorkőíö aktivitás Fenntartása és emberi alanyban csökkent és terápiásán elfogadható Immunválaszt kiváltása melleit - találmány szerinti humanizált and-TRÁlL-reeeptor ellenanyagot alkalmazunk terápiás agonistakéní vagy antagonistaként egy adott TRAfEreeepinr ellen. A találmány alkalmas: t« vöm terápiás szerként, mivel nincs szükség az anli-TRÁR,-reeeptor elleni ellenanyag másodlagos: keresztkötésére.
.A találmány továbhnmiaí egyetlen anti.....TRAIL-reeeglör elleni ellenanyagon, amelynek agonista vagy antágonisla apoptézlsos tudása van. Inkább két vagy több anti-'íOik-reeeptór elleni ellenanyagot hozunk érintkezésbe sejttenyészettel t.u vAro, vagy az alany testének, szövetében m zöm, hogy szinergísta kezelést hozzunk létre, Példánl azílS? giíöms sejlvonai és az ÜW és Mob-4 b.emstopoietikus sejtvotsal érzékeny agoníata aníi-DR4 és and-DRó elienanyagokkíd tőriénő érintkezésre, írtig agootsía anti-DR5 ellenanyag egjmtagdban csak korlátozott eredményt matat apöpíózis indukálásában.
A találmány szerinti ellenanyagok szenziíizerrel együtt is alkalmazhatók. A leírás szerinti értelemben szeozittzer alatt bártttdyen stirnulosf értünk, amely apoptózist indokát, beleértve altralhölya tényt, szerves molekulákat,, különösen beleértve a bfszmdohmdeimldékel, nehézfémeket és szabad gyököket.
Rosszirsdtdalú daganatok kezelésével kapcsolatban a TRA-B képes apnptózást irtánkálni a legtöbb 'TRAlL-ié érzékeny daganatsebben, kaszkádlbggö módon és másodlagos keresztkStö nélkül. A TRÁ-8 erós dtsgsoatellenes aktivitást matat p? vivő, A TRA-k képessége « legtöbb TRAIL-érzékesy sejt agoptózisának indukálására megerősíti, hogy a DR5 egymagában elegendő tó apoptózis kiváltására. A leírásban ismerteteti daganatsejtek többsége sejtfelszíni DRS-öt expresszál, és & TRA-8-cal indukált sejthalálra való érzékenységük együtt jár a TRAIL iránti érzékenységükkel, jelezve, irngy a DR5 az. elsődleges haláíreeepíor a TRAll..-.kö?,vedteít apop-ózisban a legtöbb dagamasejíbexi, Ezáltal a DRS differenciális expressziója normái és rákos sejtek között hatásos a FRAlL-közvetiíeít apoptózis szelektivitásában, A TRA-S kikerült az áleareeeptorokaí a TRA1Lközvefilett apoptózis indnkálásában, A TRAlL-rexiszierts daganaiseitsknek azonban. estik a kisebb része érzékeny TRA-8-ra, jelezve, hogy tó áicareeeptorok ne® játszanak főszerepet a daganatsejtek TRAlL-közvettteü apopiózísn elleni rezisztenciában.
Habár korábbi vízsgálaíök. jelezték, hogy a TRAFL. oldható íömtájának szisztéroás beadása állatoknak a daganat regresszióját: indukálja Mleiiás okozása nélkül (3, 4, 22}> a humán. TRAIL mendiránkötöíi formája májkárosodást indákéi egerekben, amint azt: bemutatjuk a leírásban. Azonban a TRAIL hepaiiktis toxiehása sokkal kevésbé erős, mint a Fas-ligundmse, amint ezt a normál Eepatociták kisebb érzékenysége mutatja a TRAIL-índukált károsodásra a Fas-iígandnnmsal összehasonlítva, és ezt mutatja a TRAIL «? vrvn lélaihásának hiánya. Ezáltal a TRAIL bírálása hasznos a rákteráptábait.
Amint részletesen teájuk, kimsíafjuk a DR5 fékétjeexpressziő szignifikáns színijének hiányát normál hepaíecitákban, és ez: kapcsolatos: a hepatocíták rezisztenciájával a TRAIL- Indukált apopíózisbatt, A ÖR5 kereszfeotése monoklonáiís ellenanyaggal sem elegendő az· apoptózist kiváltani képes haiákv&epíor homopolrmer íórmáinife létrehozásához. Selyemmajomban végzett kísérletek nem adnak bizonyítékot a TRA-S beadásának toxíeítására. Ezáltal egy agonista aníi~BR5 tnonoklottálts ellenanyag valószínúteg szelektívebb és biztonságosabb terápiás szerként, mint az oldható TRA1L.
A ialátaány szkrínelp vizsgálat; eljárásként jól alkalmas rosszindulatú sejtek kis csoportjainak detektálására, amelyek még normális selímorfológiát mutathatóak, Humán ráksejtek - beleértve tüdő-. prosztata- és máj rákokat — sejhuefszet in ««.'festése találmány széduti jelölt ellenanyagokkal azonsai azonosítja a rákos sejteket. Ezen. rákos sejtekről megílgyelhefő, hogy ÖR5 nagyon magas szintjét expresszálják, összehasonlítva az azonos típusa normát sejtekkel. Ezáltal a találmány hasznos érzékeny szkrinelést eljárásként rosszindnlatú daganatok korai szkricelesére szövetekben, mist például tüdőben, prosztatába® és májban. A. találmány tárgyát képezi terápiás eljárás ahnormáfls sejipreliferáció gátlására, szemléltetésként rosszimMaíu rákok és limialfeas leukémiák gátlására,
A leírás különösen anti-hmnán-DRS monoklonália ellenanyagot részletez, amelyet TRA-k-nak nevezőnk, és az ATGC elérési száma FTA-142Ő, Nyilvánvaló, hogy az agonista TRA-8 aníi-hnmán-DRS monókfenális ellenanyaggal kapcsolatban leírt módszerek ős eredmények teljes mértékben kiterjeszthetők és alkalmazhatók antagortisía ÖRS ellenanyagokra, valamint mind agonisía, mind aniagomsís mfelon ható, 'ÖR4, DcR.l és DeR2 ellen termeltetett ellenanyagokra.
Egy apoptózis-reeeptor, mint például Eas expressziőjánuk a szintje nem szükségszerben kotrelál a sejtek apoprozis iránti érzékenységével. A TRA.lL-közveíhett apopt&ás esetén azt javasolták, hogy az TRAIEáfeatecepíorok expresszloja befolyásolja a sejtek érzékenységét. IzexíkMit azt .is javasolták, hogy a ÖRS-nek kapcsolatban kell lennie a DR4-gyel az apopfózís jel hatásos átviteléhez a FÁ8Ö és a kaszpáz-$ útvonalon keresztül. Agonisía anti-DRá taonöklonáiis ellenanyag hozzáférhetősége lehetővé tette a ÖRS jeltovábbítás szabályozásának értékelését, es viszonylagos szerepét a 'FRAiL-közvetített apopíózishau. Sejtek TRA-8-közvetített apoptózis iránti érzékenységének összehasonlítása azok TRAlL-közvetóeit apoptózís iránti érzékenységével betekintést nyújt a DRS Í RAlL-közvetitett apoptózisb&n betöltött szerepebe, e t azokba a meehanizmasokba, amelyek befolyásolhatják az érzékenységet.
Ez az. előny általában kiterjed a találmány szerint; humanizál; an; 1-DR5 monOklsnális ellenanyagokra Is. ÖRS elleni ellenanyag molekuláris klörsjá; ismert módszerekkel állítjuk elő, amint az alábbi példákban hemntatjuk Rckomtut-m·. DÓS ;e<.htmiogta (A; hasznos olyan nukicntsdt-szektetKiák eloalhtatóra, ameiyek roonoklonális ellenanyag,-molekulái vagy annak am igen kötő régiójá; kódolják.
A találmány tárgya humanizált ami-TRAlL-receptor ellenanyagok előállítása, amelyek, nem valószínig hogy humán antí-egér ellenanyag {amit a leírásban ezentúl ,,tlAMA”-oak nevezünk) eiietú választ (34) indukálnak, míg még mindig hatásos efrektor ellenanyag fonkulójuk vau, A leírás szerinti értelemben eiíenunyagok yosafeezásáhas a „humán” és „burnamzáfe’ kifejezések alatt olyan ellenanyagot értünk, amelytől azt várjuk, hogy terápiásait toferáfeató, gyenge tamtmögéts válása vált ki emberi sfenyhan,
A találmány tárgyát atsti-DRS ellenanyag és hamaslzált antl-DRÓ ellenanyag. Ezen fehérjék vagy gének bwonvos csonkolt tormái végrehajtják a teljes szekvettciájt; fehérje vagy gén szabályozó vagy enzsnatifeus tunkctótút Például az azokat kódoló nukleinsav-szekveuciákat megváltoztathatjuk szubsztitúciókkal, addieiókhal, deléctókkítl vagy multtmer expresszíövai, amelyek tónké ionálisan ekvivalens fehérjéket vagy géneket eredményezuek. A nukleissavítkst kódoló szekvenciák: degsneráltsága miatt más szekvenciák is: alkalmazhatók a taláhnóny gyakorlatba vételében, amelyek lényegében ugyanazt az ainínosav-szekvenciéi kódolják, adni & természetben előforduló fehérjék. Ezek nem korlátozó példa! kézé tartoznak olyan nukfemsav-szekveneiák, amelyek magukban foglaljak a festi poltpépttdekct. kódoló nüklslssav-szekvenfoák egészét vagy részleteit, és amelyek «mg varrnak változtatva különbőzé ködösök szubsztitúciójával, amelyek funkcionálisan ekvivalens aminosav-oldaliáneoí kódolnak a szekvenciában, ezáltal csendes mutációt hoznak léire, Nyilvánvaló, hogy egy találmány szerinti iinmunglöhuhn mikleotid-szekveíiciája akar 25% szekvcncia-hcmolögía variabilitást is eltűr, annní azt x/okasos módszerekkel -szánutjuk [Corren; Methods in Sequence Comparlson and Anaiysts”, „Macroitsolecnfe Sequenetng and Syuíhssis, Seleeted Mefeods and Appheatlons”, 127-140. old., kiad,: Alán R. Lsss, Inc. (W8)j, mindaddig, ataíg az ilyen variánsok hatásos ellenanyagot aiköfoak, amely felismeri a DR5 TKAlk-receptort. Például egy pollpepíid-szekveneiáhaa szuhszíiíuálhatunk egy vagy több ntamosav-öldalláneut hasonló polaritás?'! másik aminasavval, amely hmkcíonálls ekvivalensként hat, ezáltal csendes változást eredményez, A szekvenciában találhatö ammosavak sztfeszfouesse lehet azon osztály bármelyik tagja, amelybe az amisosav tartozik. Példás! a netnpoláros foidröfób) aminösavak közé tartozik az alanin, fenéin, izoleoem, váltó, prolin, fenrlaiitnia, tripíofán és metiontn. A poláros: semleges: anttnosavak közé tartozik a gifeln, széria. t-eonin, eiszíeín, tirozm, aszparagin és gistamin. A pozitiven töltött (bázifcus) antiaosavak közé tartozik az argóm?, hzsa és htsztldís, A negatívan töltött (savas) atnfeösavafc közé tattozlk az aszparagmsav és gimamittsav. Szintén a találmány tárgyát képezik fehérjék vagy azok ö'agmenseí vagy származékai, amelyek differenciáltsatt módosítottak a transzláció alap vagy ólán, például glikozilációvál, proteobtikas husaassal, ellenanyag-molekulához vagy más sejtbeli hgandmuhoz törtétsö kötéssel, síb, Ezenfelül a találmány szerntt asti-DRS ellenanyagok nnkfelnsav-szekveseiátt kódoló rekombíttám vektort génsebészeti aloo úgy módosíthatjuk, hogy megváltozzon a feldolgozása vagy expressziója.
Ezenfelül inhibitort kódoló nhkfeínsav-szekvencíál mniáltathaíonk fo vime vagy fo vöm, transzlációs, iniciációs és/vagy terminációs szekvenciákat hozva, létre,: vagy variációkat létrehozva, a kódoló régiókban és-'vagy öj restrikciós helyeket kialakítva, vagy korábban létezőket tönkretevő, hogy elősegítsük a további fo vfo zo módosítást. A szakiefotefett ímtlsgeuezlsfe Ismert bármilyen módszer alkaitnttzhatő, nem korlátozó példaként az fo vfo-o heiyspeeífíkus mufogenezis [I Siói. Chcta. 253, 6554. old.]:, Tjfo /foácr-ek iPharmacia) alkalmazása, és hasonlók,
Röttigenkfiszfeliográfial adatok azt matatják, hogy az ellenanyag mmumglöbtdkt fehekereőése áltálában hosszá hengerese szerkezetei alkot, amely két réteg antíparalel β-redőből áll, amelyek mindegyike három vagy- négy f-láncoí tartalmaz. A variábilis régióban három hurok a ki és I. láncok V öoménjatböl áll össze egy anógénkötő helyei alkotva. Ezen hurkokat komplementaritást ineghaiározö régiónak (CÖR) nevezzék. A Cöfeéknek van a legnagyobb .mninosav-variahílitása az eliesanyag-molekulában, A variábilis: régiónak az a részletét, amely nem része a CDfe-nek, vázrégiónak (”ER“ régió) nevezzük, és általában, a CDR szerkezetének fenmartásábas játszik szerepet. Előnyösen egy adott ellenanyag összes CSR-éí akeepiot ólfcnanypgfá visszük rá, »ak érdekében, hogy megőrizzük a TfeAth-reeepfor ephőprégíójánafe a kötöréglőját. híyíivánvalö, hogy á CÖR-ek összessége egy részének donorba történő átültetése is hasznos, Nyilvánvaló, hogy az átültetés alatt általában oldallánconkéntl helyettesítést értünk amrnosavankésí vagy régiónként. Azonban alkalmanként, különösen: régió átvitelénél egy vagy több oldallfoeot tetszés szerint addlctonáitathatunk vagy defeiáibáfonk vagy szuhszijfoálisatunk, és az ilyen deiéelök és inzercíók, valamint megfelelő helyettesítések és inverziók a szakenn ber által megvalósíthatók.
Találmány szeruttí eiiettanysgot például anti-TR.A.it-reeepfor wtas&teaális ellenanyag L-íánea és Hiánea CDR-rőglöjának árvetésével állíthatunk síd humán eíienanyug megfelelő €DR-régió.jáfot, ezáltal ItUtúanizáljuk a TRAfL-reeeptor ellen hatás» egérmímoklonális ellenanyagot
A íöölétoíá idiötípKsát ésrtahnazö ellenanyag-fragtnenst: ismert: módszerekkel álltak elő. Például ilyen fragmens szemléltetésként lehel anti-TRAlL-jwepter (AB’)2 tragmense, amelyet az ellenanyag-molekula pepszmes emésztésével állítunk elő, a ÍRAiL-reeepter ellenanyag ÁS’ bagmense, amelyet a TRAíh-reeeptor (ÁB:’>2 fetgmens redukálásával állítunk éld, és olyas ellenanyag íragmens, amelyet az ellenanyag papainnal és rsdukálőszsrtei történő kezelésével álltak elő.
Közelebbről a TRÁ-8 atPí-DRS monoklonálts ellenanyagot hihridőma tenyésztésével állíthatjuk elé, amelyet pedig egérnek DRő-tel történő hnntunízáiásávaí és tó követően a lépsejteknek vagy nyirokesomósejtéknek egér mielőnta sejtekkel való fúziójával állíthatnak el©..
bíohöklonális ellenanyag előállítása szeosiéhésként az alábbi lépéseket foglalja magában;;
8) bidmakröhmfekufának antigénként történő alkalmazásra való bszíúasa;
b) ellenanyag-termelő sejtek előállítása, először állatnak az antigénnel történő munumzálása, majd az állat véreztelése es az ellenanyag-iker mérése után, annak érdekében, hogy meghatározzuk mikor kell a lépni: eltávolítani;
c) mietóma sejtek előállítása;:
á) az ellenanyag-termelő sejtek és a: túlélőmé sejtek íuzienáltaiása; e) a kívánt elleasnyagoí termelő bibrldóma kiválasztása:; fi egysejtes kolóniák előállítása (klónozás);
g): adott esetben a hibridőmák. tenyésztése, vagy olyan, állatok, növesztése, amelyekbe a Iribriddma. séjjtekeí beültettük, a moneRlfönáiis ellenanyag nagyléptékű előállítása érdekéden;:
fe) az: így előállított monoRionálís ellenanyag biológiai aktivitásának és a speeiStásáaak tesztelése, vagy a marker tulajdonságainak mérése.
Az &ati-DR5 monoklönális ellenanyag előállítására szolgáló eljárást részletesen hemnlaíjak. az alábbiakban a. festi lépések: alapján. Ez az eljárás a találmány szerinti ellenanyag előállítására csak a módszerek: szemléltetését szoigáljá, és nem korlátozza azt, Más^ Ismert eljárásokat is kövelhetílok, vagy az alábbi eljárást módosíthatjuk, példátd más elfesanyag-termelő sejteket alkalmazhatnak, mini lépsej tek és mleléma.
(a) Az antigén előállítása .Antigénként szolgáló rekomhfeáns fehérjét (amit a leírásban ezentúl „retathmáos humán D&S’tak nevesünk) állítunk elő QS1-2H3A sejtek banszfektálásával á pAdDlk5-ígG expressziős vektorral, amely a humán Í.5R5 extraeeiíaláris doménjának és a humán Igöl ellenanyag (amit a leírásban ezentúl „Igö”-nek aeveztmkjívö. ΡΤΑ-Ϊ428) he-réglójának: fúzióját kódosa exprasszáltgtás végett az ADőAG-guert reagenskésziet (Quanittm Bíoteeteo&gies iné., Canada) alkalmazásával, és összegyűjtjük és részlegesen tlszltijök az expresszáltatott terméket. A pAdDR5-ígGplazmldot a humán DK5 és humán IgG fúziós fehérjét kódoló DNS-nek pődt’MVő \ektmba thttcnó tüze?ítidsáw átütjük elő, arneh égj aha© setaben működe expresszit» vektor Más: anyagok, spint például a DRő -öt kódoló DNS, vektor és a gazda Is alkalmazható itt,
A pAdDRő-ígfí vekdorral transzformált QB1-293A sejtek lelühíszfö jóban előállított humán DR5 és: IgG fúziós fehérjét részlegesen megtisztíthatjuk /őtaöM-őepátwve affinitást kromatográíiával vagy fő-otaöSáp/feroíe aíSnltási loomatogrúflával, vagy ioneserélö kremaiográüával Resöi^ee-Q oszlopon: (kereskedelmi «év; Pharmaeia),
Más megoldásképpen tatján sejtvonalak seílmembránjáhől előállított tisztított Dfe5~öt <Un^ antigénként. Ezután - mivel a DR5 elsődleges szerkezete ismén: (vö. .FTA-1428} -, az 1. azooosítószám szerinti amínosav-szekveaeiát íactslfoaző pepiidet kémiai ütőn szintefizálhatjpk: ismert módszerrel, misé például a Sauger-módszerreí, és alkalmazhatjuk antigénként (b) Elfenauyag-fermeiő sejtek elöállhásá
Egeret immunizálunk az (a) lépésben előállítóit, adjövánssal, mint például Fretmd-fele komplett vagy inkomplett adjuváusszi vagy álommal összekevert imnomogénnel. Más szemléltetésként adott alkalmas kísérleti állatok közé tartozik a patkány, tengerbnalac, nyal, kutya, csirke, ló, sertés, szarvasmarha és j ók.
Alkalmas beadási otak kísérleti állat immunizálására & szubkuíán, mtrsperhoneális, intravénás, íntradermális és intranuíszkuláris injekció, előnyős a szubkusán és intraperhoneális injekció.
Á2 immunizálásokat adott cserben egyetlen dózisban vagy számos Ismételt dózisban végezzük megfelelő időközönként (előnyösen 1-5 hetente). Az immunizál; állatokat ellenőrizzük az ellenanyag-ikerre a szérumokban, és egy elegendően magas elfenanyag-tiíero állatot kiválasztunk az antigén-termelő sejtek forrásának. Magas tiferő állat kiválasztása a későbbi eljárást hatékonyabbá feszt. A későbbi blzíehoz a sejteket általában 3-5 nappal a végső :irm»atdzólás után gyűjtjük be az állattól.
Az ellenanyag-liter mérésére szolgáló; eljárások közé tartoznék különféle jól ismert módszerek, mint peldáol a radioaktív immunológiai vizsgálati eljárás (amit a leírásban ezentúl ,,felA”-nak nevezünk), szilárd: fázisú enzimes immunológiai vizsgálati eljárás (amit a leírásban: ezentúl wEOSA”-nak nevezőnk), fluoreszcens ellenanyag vizsgálati: eljárás és passzív hemaggiuilnáciös vizsgálati eljárás; » RÍ A és BUSA előnyös: a detekelő érzékenysége, gyorsasága, pontossága és automatizálási lehetősége miatt.
Az ellenasyag-titer meghatározását például BUSA-val végezhetjük, áz alábbiak szerint. Először tisztított vagy részlegesen tisztított Öhó-őf adszorbeálunk szilárd fázis felszínére, mint például ífe-mérőhelyes BLISA mlkrotíferfemezre. majd blokkoljuk a fennmaradó· felszínt, amelyhez a DR3 nem kőtódött, az antigénnel nem rokon fehérjével, mint például szárvasmarha-szérnmalbnmlnual (BSA). Mosás után a mérőhelyek felszínét érintkezésbe hozzuk sorozatban hígított egérszérmn-míntákkal, hogy lehetővé tegyük az: anh-DRö ellenanyag kötődését a mintában lévő: antigénhez. Enzimmel jelölt antl-egér ellenanyagot adunk másodlagos ellenanyagként a kötött egér eileusrtyagboz, Mosás után enzhisszubszlrátőt adunk, és az eifeoífeyag-tíferí: megbecsüljük az abszorbancía változásából, ame ver u szubszifet megváltozásából adódó színváltozás okoz.
(ej Mielóma sejtek e’oa 1 tas>a
Megállapodott egér sejtvosálakból származó sejtek szolgálnak a mielóma sejtek forrásaként, köztük például 8-azaguanin-rezíszíens egér, amely az alábbi BALWC mielóma törzsekből származik: F3X63Ag8ö..i:(P3-El) (35), P3feiSEl-Ag4-l(NS-l) (36), Sp2fO-Agl<SE-2) (37), P3X63AgB.ö33(6S3) (38) és P3XÓ3Ag8(X63) (39). A kiválasztott sejivenskü: sorozatban hígítjuk megfelelő tápközegben, mint például 8azaguanln tápközegben. A S-azagoamn tápközeg Iseove-íéle Modi/feu Afedivm fápközeg (amit a leírásban ezentúl „ÍMDM”-nek nevezünk) vagy í-Wáepee'·? AWjfW éfegfe Afedúnn tápkőzeg (amit a leírásban ezentúl ,,DMEM'’~sek nevezünk) vagy RPMí-ltRÖ tápközeg, kiegészítve glutamímral, 2-merkapíöetanellal, geníamiejsn®], magzati besjúszérumuial (amit a leírásban ezentúl ,,FC:S”-nek nevezünk), és 8-azagsaaiaaaí, A sejteket azután átvisszük normál tápközegbe, mint például ASE1Ö4 lápközegbe (Ajlnomoto, K, &.), amely 1Ö%
FCS-í tarfalmtrz, 3-4 nappal a fúziót megelőzően, hogy biztosítsuk, hogy legalább 2x18? sejt tegyen jeleu & fúzió napján.
fá) Sejtfúzió
Az állat bármely alkáim&s részéből előállított limfocitak és pinzruasejtek a prekurzor sejtek az ellenanyag előállításához Szemléltető límlherts é& plázmasoil-források köze tartozik a lép, ny irokesomók, perifériás vér, vagy ezek bármilyen megtelek! kombinációja; a lép a leggyakoribb forrás.
Az utolsó megerősítő: oltás után azt a szövetet, amelyben az ellenanyag-termelő sejt található eltávolítjuk a meghatározott: eltertanyag-fitőrö egérből. A jelenleg favorizált módszer lépsejtekuek a-c) lépésben eíóáilitott mielónia sejtekkel történő; fuzionáltatására a polietiléngíikoí alkalmazása.
A fúziós módszer magában foglalja a lep és mielóma sejtek mosását szérummentes íápközeggel (mint: példán! RPM1 lö48) vagy foszfet-pufterelt sóoldaítai (amit a leírásba» ezentúl ,,PBS”-sek nevezünk): oly módon, hogy a lepsejtek óa mtelóma sejtek aránya megközelítőleg 5:1 ás 18:1 között legyen, és azután lecestrífogáljuk azokat. Miután a felSlúszot eldobtuk és a csapadékban lévő sejteket megfelelően fellazffottuk, 1 mi, 58% (w/'v) polieílléngükolt (molekulatömeg 1098-4086) tartalmazó szerummentes: tápköxeget adunk csépienként & sejtekhez kevebetésseí. Azt követben 16: ml szérumutentes tápközeget: adtmk hozzájuk lassan, majd lecenírifegáljuk. .A felüluszól Ismét eldobjuk, és a csapadékban lévő sejtekei telszuszpendáljuk megfeleld mennyiségé HAT tápközegben, amely bipoxanítnt, íimmoptenni és tmndint (amit a leirásbaó ezentúl ,,ΙίΑΤ’-nak nevezünk) és egér interlenkm-2-t (amit a leírásban ezentúl „lEGT-nek nevezünk) tartalmaz. A szuszpenzíói azután tenyésztő lemezek (amit a leírásban ezentúl egyszeri·??! lemeznek nevezünk) mérőhelyeire mérjük szét, és inkubáljuk 5% vív Cfb jelenlétében 37i:C-on körülbelül két héten keresztül, HAT tápközeg további, szükség szerinti hozzáadásával.
e) Bibi·;dómák szelektálása
Amikor az alkalmazott mieiöma törzs reziszíens S-azaguanfora, azaz deíteiens htpozantín-guanmfbszferibozil-tmnszteráz (WPRT) enzimre, bármely nem fuzionáll tpielőma sejt és mtelőma-mielóntá: fúzió képtelen túlélni .HAT tápkózegbén. Mársrészről, eitenanyag-serrnelö sejtek egymás közti luziői, valamint ellenanyag-termelő sejtek és rnielórna sejtek bibridöntái túlélhetnek, de az előbbiek: csak korlátozott ideig. Ennek megfelelően, a folyamatos tenyésztés HAT tápközegben csak a kívánt bibridómák szelekcióját eredményezi.
A kapott bibridómák. kolóniákká nőnek, amelyeket azután somtopteritrí. nem tartalmazó HAT lápközegbc s tizünk ái (Hl íapko/eg) Azelőtt a tenyészet femiuvoiartak altkvottad eítavoiUjak. hogs meghatót ózzuk az anít-kas ellenanyag-titert, példás! EOSA-val, Antikor a fent említett fúziós fehérjét alkalmazzak EkiSA antigénként, szükséges az olyan, ellenanyagokat termelő klósok eltávolítása, amelyek, specifikusan kötik. a. humán igG'I Ifo-régiójáf. Az ilyen klón jelenléte: vagy hiánya ellenőrizhető, például anfigésfeánt Pss-lgGl-et vagy IgGl-et alkalmazó ELISA-vaí.
£) Klónozás
Azokat a hibridőmákaí, amelyről: a b) lépésben az ellenanyag-liter meghatározásra bemutatott eljtfeásboz hasonló módon kimutattuk, hogy specifikus hibridómákst termeinek, azután egy másik lemezre visszük át klónozás végeit. Az alkalmas klónozást eljárások közé tartoznak az alábbiak: korlátozott bigitásí eljárás,, amelyben a btbrídómákat mérőhelyenként egy sejtet tartalmazó krmeentráesóra hígítjuk, és azután tenyésztjük; a lágy ugar eljárás, amelyben kolóniákat állítunk elő lágy agar íápközegen történő tenyésztés után; mlkromanlpulátort alkalmazó eljárás egyedi sejtek tenyésztés céljára történő elválasztására; és a „sort-a-eione” eljárás., amelyóeu egyedi sejteket választunk el sejtválogaíó berendezéssel
A MAtmási eljárást, példás! a korlátozó: hígítást módszer szerint 2-4 alkalommal megísméteíjúk minden egyes mérőhelyre, «efy eliesanyag-íiíerí mutat, és a stabil ellenanyag-therú klánokat kiszelektáljuk anilDR5 monoklonálís ellenanyagot termelő híbrldőmákként. Az asti-sgér-DfeS ellenanyagot termelő hífenáómákat hasonló módszerrel szelektáljnk, and-DRá mönöklösális ellenanyagot termelő snjtvesal előállítására,
Á TRA-k egér-egér Íáhridőmáí letétbe helyeztük az „American Type Cnknre Colfeetion-S^j 3ö(gl, rnárebs f-én, az elérési szánta ETA-1428. Ennek megfelelően a TRA-8 egér-egér hibtidőmával vagy bármely más megállapodott hibrídómával ágy állíthatunk elő ellenanyagot, hogy az alábbi, fg) lépéstől kezdve bemutatott eljárást kővetmk, „íz ízHO lepes<k elhagy adásai ie'i 11 bndöm tenyá^nsc mo; ,>ktorai s el er<m\«g előd, 'tásuhoz
A klónozással előáll flott híbriáóraái azután normál tápközegben tenyésztjük, nem pedig fíT íápkőzegben. Nagyléptékű tenyésztést hajtőnk végre „roller boltié' tenyésztéssel, nagy tenyésztőedények alkalmazásával, vag\ „spsaner bottíe''' tenyésztéssel. A nagyléptékű tenyésztésből származó felúlúszőt megfelelő eljárással begyújtjuk és tisztítjuk, mint például gélszúrésseí, ami jól ismert a szakember számára, hogy előállítsuk az antlPR5 monoklooális ellenanyagot, ami a találmány tárgyát képező ellenanyagok alapja. A bibridómát iulraperitoneállsan Is tenyészthetjük szingés egérben, mint például RAlS/e egórbeo vagy oodm egérben, hogy nagy mennyiségé, artó-ÖR5 monoklonálís ellenanyagot tartalmazó aszeíteszt állítsunk elő. Kereskedelmi forgalomban kapható monoklonálís ellenanyag tisztító reagenskészfetók {például MáMhg? G/f O; Pharmacia) kényelmesen alkalmazhatók a begyűjtött ellenanyagok tisztítására.
A fenti módon tisztított monoklonálís ellenanyagoknak nagy a specílitása barnán 138.5-re.
(h) Monoklonálís ellenanyag vizsgálata
A ntorsöklönálfe ellenanyag u<«j inasának és az alosztályának azonosítására alkalmas eljárások közé: tartózik az Öuebterlötiy eljárás, EL18A és Rí A. Előnyősén: kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészletei: alkalmazunk az azonosításra, mini például a Mwe Vyper A7z~et (kereskedelmi név; Riorad),
A fehérje mennyiségi meghatározását a Eoli-Lowry eljárással végezhet;· jók, vágy a 28(1 nrn-eh, mért ahszoíbaneía alapján.: történő számítással [ 1,4 (OD2ŐO) 1 ntgőnl immhngloboím).
A nmnokiösáiís ellenanyag állal felismert mpltőp azonosítását az alábbiak szerint végezzék. Először előállítjuk a monoklonálís ellenanyag által felismert molekula különféle részleges szerkezetest. A részleges szerkezeteket olyan eljárással állítjuk elő, amelyben a molekula különféle részleges pepddjeit szintetizál jak meg ismert olsgopeptid-szmtézís módszerrel, vagy olyan eljárással, amelyben a kívánt részleges pepiidet, kódoló DNS-t építőnk be alkalmas expressziős plazmidba, és expresszállatjuk alkalmas gazdában, mini például £, eohbán, hogy előállítsuk a peptkieket. Általában a kel eljárást kombinálva alkalmazzák a fenti eél elérése érdekében, Például előállíthatjuk megfelelően: csökkenteti hosszúságú polspeptidek sorozatát, az antigén fehérje étvágy N-termmállstol indulva, bevált génsebészeti módszerek alkalmazásával. Megállapítva,, hogy melyik hagmens reagál az ellenanyaggal, megkőzeiitőieges elképzelésűnk lehet a kapóit epltóp helyéről.
Az epiíópsl ppntósabban azonosítjuk különböző kisebb ojögopepod szintetizálásával, amelyek a pepiidnek vagy mutánsának feleinek meg, bevált ohgopeptíd-szmfezis módszerek alkalmazásával, hogy meghatározzak a péptídek kötődését & találmány szerbit! ellenanyagok előállításának az alapját képező antt-Dfeá iúöxtöklouólis ellenanyaghoz, és meghatározzuk a pepiidnek antigénhez való kötődésének kompethlv gátlását a uíonoklonálls ellenanyaggal. Kereskedelmi fergalombaú kapható reagenskészletek, mist például a AROf's O (öeooáys Ritaebnoiogiies, ide.), és a molíipin szjníézísnjpdszeren alapuló számos multipin peptidszitazis reagenskésxlet (Cblron Corp.) kényelmesen alkalmazhatók különféle oligopeptldek előállítására.
Egy találmány szériád ellenanyagnak különféle. az alábbi a)-f) pontfean lesrí funkeiosálls tulajdonságai vannak, amelyek mindegyikét az alább bemutatott eljárásokká! igazolhatjuk,
a) TRA-6 specifikus kötődése tanán F>RS~öí expresszálá sejtekhez (ret^reacbtóit).
A taiúlmúsy egyedi jellemzője a kötőkégesség sejtfelszíni: DR5-höz. Ezt E>R5-őí expresszálő sejtek áramlási eitomelriás elemzésével demonstráljuk, Először igazoljuk a DR5 kötésé! a tanán ÖRS-ot kódoló teljes hosszúságú eDlkS-ssi íranszfékíálí Cos-7 sejtek alkalmazásával. Közelebbről, a TRÁ-R csak a E>S5-íei trsnszíbktáit CGS-7 sejteket ismer! fél, és nem ismer! fél az üres kontroil vektorral, vagy DR4~eí kódoló vektorral trasMetóáliakat Másodszor, három különböző credctö (hetnstojxiieíikus, glióma és prosztatarák) rosszindulatú tanén daganat sejtjeit teszteljük, Ezen transzformált: daganatsebek többsége sejtfelszíni f>R5 szignifikáns mennyiségét expresszáka, habár az expressziós szint nagymértékben különbözött. Harmadszor, RA és ÖA páciensektől származó tanán elsődleges szonoviális fmrobíasztsejtek két panelja; vizsgáljuk meg. Az összes R.A színovialis sejt szignifikánsan magasabb szintű DR5-Ö! expresszáil az OÁ sejtekhez hasonlítva.
h) Apoptőzis Indukálása keresztkötés nélkül humán rosszindulatú daganatsebekben ú; rtao (referenciaként).
A találmány szerint termeltetett ellenanyag képességét TRAIL-seceptor felismerésén; és apöpíózis közvetlen Ináukálására rosszindulatú: homás daganatsebekben sejféltaépessCgi vizsgálati: eljárással (ÁÍEEúe) határoztuk meg úr vúre a sejteknek különféle koncentrációjú ellenanyaggal, különöse® TRA-8-eul történő mkubátósa tatai. A daganatsebek többsége érzékeny a TRA-lbeal indukált apopíózisra. Bizonyos sejtekben a TRA-S erős apopiózi^lndnkálő 'aktivitást mutatóit, például a TRA-R képes apopfózist tndskáfei humán farkai sejtekben a pgónl szinten.. Fontos módon a TRA-B-cal indukált: apoptőzis nem igényeit keresztkőtésk és a legtöbb sejtben a TRA-8 erősebb apopíözis-indukálő hálást mutatott, mint a rekombináns oldható TRAíL etjhartcsr jelenlétében.
e) A TISA-R daganatellenes hatása í« vivő (referenciaként).
A TRA-R daganatellenes aktivitását két SClö. humán daganatseb modellben értékeljük. Először, SCID egereket intravénásán oltunk humán leukémiás íurkst sejtekkel, és TRÁ-S egyetlen dózisával slöö pg) kezeljük. Az eredmények azt mutatják, hogy a beültetett Imkat sejtek többsége etamálódtk a TÍGW-ea! történő kezelés hatására a perifériás vérből és a lépből, amint azt .huta sejtek áramlás! ehometriás elemzésével és ín sír»: mmmnfeisziókéstai festésével meghatározzuk, Másodszor, humán asztroeita. sejteket (132 INI) szuhkmás oltunk :SOD egerekbe, és a daganatot hordozó egereket TRA-8 egyetlen dózisával kezeljük, A beültetett 1321N1 sejtek növekedése szigmofeansaa gátolt a TRA-S~cai kezelt egerekben, a daganatok mérete alapján és szövettani elemzéssel meghatározva,
d) : RA szinovíálls sejtek azonosítása. TRA-R-cal (referenciaként)
R Rá és 4 ÖA páciensből izolált elsődleges szinovíálls sejteket tesztelünk ÖR5 sejtfelszíni expressziójára...& TRA-& képes pozitiven festeni az összes RA sejtét, de a festés negatív az összes ÖA sejten. Ezáltal megkülönböztetjük az RA-t az ÖA-tol a DR5 felszító expresszíéjával, TRA-k-eal detektálva.
e) Apoptőzis Indukálása RA szlttevíális übroblaszt sejtekbe® TRÁ-R-cal (refereselaként)
- 16 A TRA-8 képességék RA szinovíális sejtek apoptozlsának Indukáiására sejtetetképességi vizsgálati eljáfással határozzak meg m vifeí? tenyészettem, TMA-8 különféle koncmtuáeióíoak jelenlétében., Az összes RA magas-közepes érzékenységet matatott: iöb ag/ntl TRA-8-ra. Ezzel elleniéiben, az összes OA lényegében reziszteos a TEA-á-indukált apoptózisra, Fontos módon a TMA-8 jobb apoptözis-mdukáló aktivitást mutatott RA szlnoviálís: sejtekre, mini az oldluttó TRAkL eíthaneerrel. Ezenkívül, összehasonlítva mi-Fas ellenanyaggal (Cíí-lI). a TMA-8 ellenanyag jobb szelektivitást mutatott MA szinoviahs sebekre.
í) A TRA-8 nem indukálja MMP-k termeléséi MA szlnoviálís sejtekben (reférenciakéní).
Mivel a TRA-S kénes NE-kö aktiválási «tátikáira RA szlnoviális sejtekben. ugyanögy mint a IW-u, meghatározzuk: a ÍRA-S hatását MMP1 és ?MMp3 termelésére szitioviális: sejtekben. Míg a INF-o az MMF-k dezisíüggő növekedését indukálta, a TMA-8 sem véli képes MMP-fc termelésének sndukálására. és: bizonyos, koaeentrációkban a TRA-8 kissé csökkentette a MMF-k termelését szinoviahs sejtekben.
g) A TMA-8 többszörös kaszpáz aktiválási indukál (referenciaként)
Mivel a kaszpáz kulcsszerepet játszik .az apopiózls indukálásábart, meghatározzak a TMA-8: képességét kas/páz-uktiválás Irsdukálására hnutárs Jutkát wjtelben Annkm bukat ^epeket TMA-8 alacsony dézísával (SÖ ugort!) mkubaljuk, kaszpáz-S, kaszpáz-9 es k-u/puz j akíivalaste figyeljük meg, akár 15 perces belől az mkuteila» után. Westem-blöt elemzéssel es kasrpaz hasttest Nemzesse! demonstrálva. Az időzítést, a ksszpázaktiválás számát és erősségét tekintve a találmány szerinti ellenanyagok sokkal jobb aktivitást mutattak, mint bármely más isméd apöptözis-mdukálőellenanyag, mint például: az anti-hurnán-Eas ellenanyag tClI-Hj.
Ezáltal egy találmány szerinti ellenanyag olyan anyag, amelynek az a tulajdonsága, hogy «.telekiÍven apoptözisi indukál paíogén sejtekben, aratet azt lényegében bemutattuk az <a) és (g) pontokban. Ennek: megfeleiőeb az ellenanyag hasznos profílakbfeus és terápiás szerként sejtek nem megfelelő túlélésével vagy sejtek abstormáhs; proliferáeibjával kapcsolatos betegségekben, mini például amelyek az apoptózis rendszer -beleértve a FasíFas-ltgandutn rendszert - hibás szabályozásának tudhatok he.
A telálmány szerinti «iienanyag. képességét: apoptőzis inötakálására sejtekkel történő tenyésztéssel igazoljuk,, mint például a Jutkát humán leukémia sejteonslfel (American Type Cnlwe No. 718-152} és a 152ίΝ1 asziroeíte. sejtvorealhi, olyan tápkőzeghes, amelyhez a tesztmintát hozzáadtuk, és meghatározzak a túlélési arányt, például ATTItte vizsgálati eljárással..
A találmány szerinti ellenanyagot, különösen az: aníi-DR5 ellenanyagokat, amelyeknek majdnem azonos az rmmnnngesstása emberekben, mint humán eítenanyagoknak, alkalmazunk proíllakb'kns vagy terápiás szerként sejtek nem megfelelő túlélésévei vagy sejtek abnormális prollíerációjavat kapcsolatos betegségekben, mint például amelyek az apoptőzis rendszer hibás szabályozásának tudbaíók be autoimmun betegségekben, amelyek szemléltető példái köze tart ozik a szisztémás Jopusz erlíematözus, Sashimöto-lele betegség, retmtateid artrltisz, ’graR-versus-host* betegség, Sjögrés-szindróma, vészes vérszegénység, Addison-feie betegség, szkleroderma, Gtsedpastore-szindrótna, Cróhít-íélé betegség, áutoútumm hemolltikus attémia, steriltíás,. rmaszténia gravis, multiplex szkierozis, Basedosv-íéie betegség, trombopénta pnrpurs, irtzulin-Dlggő diabétesz meiüSosz, allergia; utópikus betegség; arteríoszklerózis; núakardítisz; kardiomiopátia: glomemiárls netritisz; hipeplaszhkus anémia; kilökődés szervátültetés után. és a tüdő, prosztata, máj, peíeíészek. nyirok és emlő szöveteinek számos rosszindulatú megbetegedése.
_ |7 ....
ilye» proltlakfikus és terápiás szereket küiSnfele formákban adhatunk be. Alkalmas beadási módok közé tartozik az orális beadás, mist például tabletták, kapszulák, granulátumok, párok és szirupok, vagy parenterábs beadás, mini példáid Ipjekds, csepegtető mjsketo és. kópék.
Az ellenanyagot vagy terápiás wt beadhatjuk orálisan, rektáíisan, folraeiszternálisan, mteavertókalárisan, fotraktaniálisan, intratekálisan, Iníravaginálisan, parenteráiisan (intravénásán, hfe-amuszkulárisau vagy sznbkntáu), lokálisan (perok, kenöesök vagy cseppek), intraperitoneáhs mjekelóvai, íranszzfertnálisan. inhalálással vagy bakkáils vagy nazális sprav-vel. A szükséges ellenanyag vagy terápiás szer pontos mennyisége válloahat szsnfelyről személyre:, a személy korától, tömegétől és általános állapotától, a kezelt betegség súlyosságától, a daganat helyétől és méretétéi, az alkalmazott vegyuletek fajtájától, a beadás módjától és hasonlóktól faggöeií. A megfelelő mennyiséget a szakember rutin vizsgálattal határozhatja meg a leírás szériád kítasítás értelmében. Tipikus egyedi ellenanyag-dózis a ŐJ-IÖOŐÖ jjg tartományba esik, előnyősén 11ÖŐ pg közé, Tipikus hordozó-ellenanyag koncentráció a 9,2-2000 ng/rnt tartományba esik.
Á beadás tervezett módjától függően az ellenanyag vagy' terápiás szer lehet: gyógyászati készítmény szilárd, felszílárd vagy folyékony adagolási alak formájában, mint például tabletta, kúp, pirnía, kapszula, per, folyadék vagy szuszpenzsö, előnyőse® pontos dózis egyszeri beadására alkalmas egy ;-égdözis formulában. A készítmények a kiválasztott szuhsztráí itatásos mennyiségét tartaimazhstják gyógy aszott tag elfegadhsto hordozóval, és emellett más gyógyhatású szerekkel, gyógyászati szerekkel, hordozókkal vagy oldószerekkel együtt. A «gyógyászatíiag elfogadható’’ kifejezés álad oíytó anyagot értünk, amely biológiailag vagy másképpen, nem káros, és amelyet be lehet adni egy személynek együtt a kiválasztott anyaggal anélkül, hogy sztgniőkitos káros biológiai hatásokat okozna, vagy káros ntodon kölesóuhatrsa annak a gyógyászati készítménynek bármely komponensével, amelynek része.
Psreaterális injektálásra alkalmas készítmények tartalmazhatnak fiziológiailag elfogadható steril vizes vagy nem vizes oldatokat, diszperziókat, sznszpsnfeófcat vagy emulziókat, es steril pereket steril injektálható: oldatokká vagy diszperziókká íörténó feloldásra,. Megfelelő vizes vagy nem vizes hordozók., oldószerek vagy hordozóeszközük példái közé tartozik a víz, etanöi, poliolok (propílénglikol, polietiléngiikol, glicerin és hasonlók), ezek alkalmas keverékei, növényi olajok (mini például, olívaolaj) és iujektálhatö szerves észterek, mint például: etil-oleát. A megfelelő folyékonyságot: például bevonószer, mint: például fecitin alkalmazásával, diszperzió esetén a szükséges részecskeméret fenntartásával és felületaktív anyagok alkalmazásával tarthatjuk fenn..
Ezen készítmények tartalmazhatnak adjavánsokat is, mist például tartósító, nedvesítő, emulgeáló és dlszpergáiő szereket. A mikroorganizmusok hatásának megakadályozását külónfefe baktériumellenes és gombaellenes szerek, mint például parabének, klorobuianöl, fenol, szorhinsav és hasonlók alkalmazásával érhetjük el. Kívánatos lehet ízetótnás szerek, mint például cukrok, nátriam-kíorid: és hasonlók alkalmazása is. Az injekíáibafo gyógyászati készítmény hosszan tartó abszorpcióját: ügy érhetjük el, hogy abszorpciót késleltető szereket alkalmazunk. tntnt például alumfoiutu-monnszteitrátOÍ és zselatint.
Orális beadásra alkalmas szilárd alakok közé tartoznak kapszulák, tabletták, pirulák, porok és: granulátumok. Ilyen: szilárd adagolási alakokban a hatóanyagot összekeverjük legalább egy inért szokásos kötőszerrel (vagy hordozóval), mint például nátrium-cihái vagy díkalcium-foszfet: vagy (a) tohőszerekkel mint például keményítő, laktéz, szukróz, glükóz, mamutot szihka, (b) kütóauyagokkal, mint például karbosiemetíieellnlóz, alignáiok, zselatin, poiívinil-pirrplidon, szukróz és akácra, ic) nedveslíősz,erekkel. nrmt például glicerin, (d) bomlaszfoszerekkek mim például agar-agar. kalcium-karbonát, burgonya- vagy tápióka-keményitő, algasav, btzonyos: komplex szlhkáíok és nátrium-karbonát, <é) oldódást lassító szerekkel, mint példást paraffin, (fj abszorpciót gyorsáé szerekkel, mint példást kvatemer amménium vegyületek (g) nedvesiíoszerékkei; mist példást eetílalkohol és glicerin-möooszíe&réí, (h> adsfebensekks!, mte például kaolin és behtomt, és (1) ksnöasysgokkai, sünt példás! tálkám, kalofeí-sztearát, toagrfezlum-sztesrát, szilárd polletifengíikoiok, náírhim-iauriíszulfáí, vagy esek keverékek Kapszulák, tabletták és pirulák esetében az adagolási alakok puíferelS szereket is tartahttazhatnak.
Hasonló típusú szilárd készítményeket is alhaitnazhatoák töltöanyagokkérd lágy és kemény töltött zselatlnkapszulákbnn, olyan kötószerek alkalmazásával, tatát példás;! lakíóz vagy tejcukor, valamint nagy mofekulatömegü pobetiláuglikolok és hasonlók.
Szilárd adagolás! alakok, mim; példás! tabletták, drazsék, kapszulák, pirulák és grsnuiátomok készíthetők bevonatta! és borokkal, mist példás! a szakterületen ismert easerikss és más bevonatai.. Ezek; tartahnazhaírsak. opallzáló szereket, és olyan készítmények is leijeinek, amelyek a hatóanyagot vagy hatóanyagokat a bélrendszer egy bizonyos részéit szabadipák let késlelteteti módon;. Az alkalmazható bezárd késziímények példái köze tartoznak polimer anyagok és viaszok. A hatóanyagot mlkroeskapszulázhatjuk is, adott esetben egy vagy •öbb fent ismertetett köíöszerrel.
Orális beadásra alkalmas folyékony adagolás! alakok közé tartóznák gyógyászatilag eliogadható emulziók, oldatók, szuszpenziók, szirupok és ellxirek. A hatóanyag mellett, a tblyékony adagolás! alak. tadatmazhal szakterületen ismert inért oldószereket. mint példán! vizet vagy más oldószereket szolubilizáíö szereket és enmígsátorokat, mist példán! etilalkoholt, izopropil-alkolmlt, etil-karbonátot, etö-aeetátot, benzilaíkohoh, henail-benzoátot, propíléüglifeolt, 1,3-botilénghkoh, dimetllformamldo!, olajokat, különösen gyapotoaagoiajat, felöimögyoróolajah kükorlca-esiraölsjat, ©livaofejsl, rfeúmsolajaí és szezámolajat, glicerint, tetrahidrofurfurib alkoholt, poheíllsngllkotokakés szorbitán zsirsavésztereh, vagy ezen anyagok keverékeit, és hasonlókat.
Az inért oldószerek, mellett a készítmény tartalmazhat adprváhsokst is, mini: példán! aedvesitőszereket, emtilgeálószereke; és sznszpendálöszerekek édesítő-, Ízesítő- és illatoshószerekeí.
Sznszpenzlók a hatóanyag mellett tartalmazhatnak sznszpertdálöszerekefc, mint például etoxilált izosztearil alkoholokat, poltoxietllés-szorbitol- vagy szorbkán-észterakeí, mikrokristályos cellulózt, alumíniummetahidroxtool, bertónitót, agar-agart és tragakantgutnit, vagy ezek keverékeit és hasonlókat.
Bestalss beadásra alkalmas készfeények előnyösen köpök, amelyeket a találmány szerinti vegyületek összekeverésével állíthatunk elő alkalmas nem irritáló kötószerekke! vagy hordozókkal, mint példán! kakaóvajjal, polietílénglikollai vagy kúphoz való viasszal, amelyek szilárdak közönséges hőnfersókletea:, de folyékonyak testhőmérsékleten, és ezáltal elolvadnak a végűéiben vagy a hüvelyben és felszabadítsák a hatóanyagot.
Találmány szerinti vegyüíet topikális beadására alkalmas adagolási alakok közé tartoznak kenöosök. porok, spray-ek és inhalánsok, A hatóanyagot steril körülmények közöd összekeverjük fiziológiailag ellögadható hordozóval és feártmlysn szükséges íattösrtöszerrel, püffed vagy vivdanyaggul. ötfemiktts kiszerelések, szemkenbcsok, porok és oldatok szintén a találmány tárgykörébe tartoznak,
A „gyógyászatilag elfogadható sók, észterek, amidok és prodrogok” kifejezés; alak a leiárs szerinti értelemben a találmány szerinti vegyüléíék azon; karboxiía-soit, amlnosav-addfeiós sóit, észtereit, amidjatí és pröárogjmí értjük, amelyek helytálló orvosi vélemény alapján alkalmasak páciensek szöveteivel való érintkezésbe hozásra Indokolatlan tóxiehás, irritáeio, allergiás válasz és hasonlók, nélkül; ésszerű; etónyfeockázaf aránynyal bírnak, és. hatásosak a tervezett célra. Ezek a találmány szerinti vegyületek. íkefiosös iónnál is lehelnek. A.
•9 „sók” kifejezés alatt a taláhnány szerinti vegyüiet viszonylag «» tmdkus, szerveden és szerves savaddlelös sóit értjük,. Ezen sóksí fa sífa álMuüjuk ele a vegyüiet végső izolálásé vagy tisztítása sorsa, vagy külön reagáltam a ííszílfötí vegyüietet szabad tósas formájában megfelel szerves vagy szervetlen savval., és: Izolálva az Így keletkezett sőt. Reprezentatív sók közé tartoznak a hidrobrondd, hidrofelörid, szálfát,, biszalfaí,, nitrát, aeetái, ox&iái, vaferát, ölest, pateitat, sztearát, laurát, borát, benzoák lakiét, fesztét, tozilát, eitráí,, rostest, femarát, szakéinak tartarát, naftilát mezíiáí, ginkoheptonát, láktoblonáí, meiánszulfen® és laöhiszeíföraáí sók és hasonlók. Ezek közé tartozhatnak alkáli- és allíálifóldfem kationok, mint példáid náttittm, lítium, káliéra, kaícíum, magnézium és hasonlók, valamint nem toxikus ammöthrnn, kvatenter áramommá, és ami® kationok, nem korlátozó példaként: ammóniám, teiíaíUeíll-araraőnlmu. tetraetti-ammöranm, mteüsmin, dimeííhumn, tnmetihtmi®, íricíiiarnin, eíilannn és hasonlók (lásd például S.M. Barge és mtsai,, Fbarmaeentlesl Sahs'*, I Pham. Sei, őő,: 1-19, old. (1977), amely hivatkozás útján a kiísohás részét képezi]:.
A „prodrog” kifejezés alatt olyan vegyüle-eket értőnk, amelyek gyorsan átalakulnak in vráo a fenti képlet szeri®! szöiévegyüieteí alkotva, példáéi a vérben történő hidrolízis útján, .Alapos áttekintés található T, Hignehi es V, Stella által Fro-drugs as Növel Delnety Sjstóms, vmunel az ..A.C.S, Symposinm Sértés” 14. kötetébe®, és a „Bloraversihle Carriers in Dmg Design iszerk.: Bdsvard B. Roche, kiad.: .America® Pharmseeutleal Assöcisbön and Pergamen Press 11cimu kön> vnett,
A célsejt állat sejtje, például ember, nem ember főemlős, patkány, egér,, íengerlmsiae, nyál, kecske, jnh, szarvasmarha, ló, csirke, sertés, selyemmgjöm és menyét sejtje,
Ezenfelül tt találmány szerinti ellenanyag vagy terápiás szer nem szol vát formában létezhet, valmnl® szeíváiként,: gyógyászatílag elfogadható oldószerekkel, mi® példáét vízzel, ewmital és hasonlókkal. Áttelában a találmány szempontjából a szol vát fermát ekvivalensnek tekintjük a sem szolvát formával,
Elfenanyag-molekulák® ismert módszerekkel tisztítunk, szemléltetésként amino-abszorpcióval: vagy amlno-adinitási kromatográdávai, kromatográfiás módszerekkel, mint példáid ntagasnyomásd fölyaáékkrontaíögráfiával vagy ezek kombinációjával:,
A találmány egy másik megvalósítási módja gyógyászati tennék biológiailag: aktív anti-fRAfLreceptör ellenanyag vagy hmnaslzált aníi-TRAlt-reeeptor ellenanyag bejnítatásárs gerincesbe. A gyógyászati termek anr-TRAIL-reeeptor ellenanyag vagy annak ffagmense gyógyászaíll&g hatásos mennyiségét, gyógyászatliag elfogadható hordozót és a honfezót és az ellenanyagot steril tnóáo® tartalmazó tartályt tartalmaz.
A találraány egy előnyős megvalósítási módja szerint. anti-DR5 ellenanyag gyágyászaíilsg hatásos mennyisége gátolja g sejtproliiérációt a célsejttel történő érintkezés után. DR5-OT felismerő ellenanyag vagy DR5-öt felismerő humanizált ellenanyag gyógyászaiig hatásos mennyisége olyan mennyiség, amely egy ügyednek beadva elegendő a kívánt hatás eléréséhez. A DR5-öt fel símért! ellenanyagok gyógyászatílag hatásos mennyisége beadásának kívánt hatásai közé tartozik a célsejt halálának indukáláss, Düh sínnulátása, ©Bó-höz történő: kötődés és megnövekedett Wsch-szinl vagy “aktivitás kiváltása a célsejtben. A célsejt olyan sejt, amely DRó-Sí esptesszál, és például lehet abnormálisán növekvő sejt és daganat, mint például: papiilonta és szemölcs; emlőrák, vastagbéhák, hepalóma, lenkémia, tüdőrák, inelanóma, mlefema, oszíeoszarkéma, petefészekrák, hasnyálniirigyrák, prosztatarák, fej. és nyak rák, pígzsmirigyrák, ntéhrák, és agydttgtmaí, mint például ssztrpcifórna. /« vöm a célsejt patológiás egyed sejtje, például amelyben a sejtprollferáció abnormális vagy szaháiyozadan, mint például rosszindulatú vagy jóindulatú rákbt® és réuniateid artrittszhen.
Egy másik előnyös megvalósítási siód szert® a célsejt® érintkezésbe hozzuk terápiás szerrel: is.
Á terápiás szer olyan vegyüiet vagy készkrnény, amely hatásos patológiás: állapot enyhítésére. Terápiás szer szemléltető példája rákellenes vegyöiéí.
Rákellenes vegyidet olyan vegyidet vagy késziteény, amely hatásos abnormálisán növekvő sejt növekedésének gátlására vagy megállítására. Rákellenes szer gyógyászatílag hatásos mennyisége olyan mennyiség, ansely egy egyeditek beadva elegendő abnormálisán növekvő sejt növekedése gátlásának vagy megállításának kiváltására,. Rákellenes vegyáletek szemléltető példái közé tartoznak az alábbiak: bleomfoíu, karbopiarírt, klerambueil, ciszplatin, koiiticin, ciklofosziámid. áaunorobsc'-n, daknnomídrs, díeiüszíitbeszirol, doxoróbiein. etopozid, 5-ffenrooraeil, fi tartóm, melf&hm, meíotrexát, mifomicm, b-mmkapíopmin, tenipöxid, ő-tloguanln, vlnkrisztia és viáblasxíiu. Rákellenes vegyüietek és terápiás szerek további példáit megtalálhatjuk a „The Merek Manna! of Etiagnosis and Tberapy” dmö könyvben jszerk.:; Berkow és mtsak, kiad.: Rahway, N. J. (19117)), ás· Siadek és mtsaí. ...Mélaboiism and .Actíon of Anti-Catscer Drugs” jszerk.: Rovás és misaí., kiad,.; Taylor and Erancis, Név York, N.Y. (1907)] ctntő könyvében.
A találmány szerinti ellenanyagot tovább kombinálhatjuk. a rosszindulatú daganat kezelésére, rnás terápiákkal, mint például kemoterápiával és radloterápiávai együtt, és a terápiás hatásosságot fokozhatják apoptőzss-lndtikálp vegyílleíekkel, mmt például biszisdoitltsaleimíd Vlll-cal,
A korábban leid attfi-DR5 ellenanyaggal (24) összehasonlítva a találmány szerinti szemléltető aníiOR5 ellenanyag apoptozís-mdukáló aktivitása nagyon erős, és képes apoptézist indukálni .kutat sejtekben a pg/pi szinten in νϊΐκ>, és kiváló: in vivő daganatellenes aktivitást mutat a korábban leírt oldható: TRAÍE-bez képest. A TRA-8 egyetlen? dózisának intravénás beadása elegendő mind szilárd daganat, mind bemafopolétlfetá dagssnísejtek növekedésének gátlására, míg a dagatssíregtesszio in vívó tndnkálása oldható TRAIk-lel sokkal magasabb dózist igényel í5í)@ pg?naponta 10 napon, keresztül). A íabthnány szerinti anti-TRAÍL-receptor ellenanyagok ugyanolyan biztonságosnak tömtek, mint az oldható TRAíK mivel a szemléltető TRA-i? ellenanyag nem Indukál apoptózist nem transzformált fibrobiaszt sejtekben.
A találmány? szerimi vektorok asíi-B?R5 ellenanyag nehéz vagy könnyű foreronglnbniin láncát kódoló ammosav-szekvenciát: tartalmaznak működőképesen kapcsolva szabályozó élemhez, snint például promöíethez vagy enhaneerhez,. A „működőképesen: kapcsold' kifejezés: alatt nukieoíid-szekvenelák olyan eirettdezeséi értjük,: amelyben azok a szokásos forfelójukai látják el. Ezáltal poiipeptidet. kódoló mikleötíd-szekveneláböz működőképesen kapcsolt szabályozó elem képes a: poltpeptlá transzkripciójának, repitkáéiójáoak és/vagy transzlációjának irányítására. A szakember szórnám nyilvánvaló, hogy egy vektor adón esethet· az anti-DRS ellenanyag mind a nehéz, mind a könnyű immunglobulin láncát kódoló szekvenciákat is tartalmazhatja.
Az alábbi példákkal részletesebben is bemutatjuk a találmányt és a találmány szerinti eredményeket. Ezen példákat nem tekintjük ágy, hogy a találmány minden aspektusát felölelik, hanem Inkább csak szemléltetésként adjak repreztmiaítv eljárások és eredmények illusztrálására. Ezen példák nem zárják ki a találmány ekvivalenseit és: variációit, amelyek nyilvánvalóak a: szakember szamára.
1. példa. ÖRS antigén előállítása
1,1 A ÖRS cRRS klónozása
A barnán BR5 fehér jót kódoló DNS-t RT-PER eljárással klónozzuk meg az alábbiak alkalmazásával:
~ 21
HeLa sejtek őssz~RMS~éí: extraháljuk TREte reagens (G18CÖ BRL> alkalmazásával. A PCR-reakció templátjaRéní alkalmazott elüNSA ffesí-éürote c.ö,V/í .synítescí reagenskeszka (Amersham Ebarntaeia Bbteeh) alkalmazásával állítják elő a i’eagenskészlethez mellékelt kézikönyv utasításai szerin·.
h) RCR terei üdítők
Az alábbi pllgopukleoíiil lánclndüőkut szintetizáljuk meg a ECR-hez:
S'-gacgatgceegafetaetítaaggg^' (ÖR5pl: 3 .azonosítószámú szekvencia):;:
Stecactgggtgatgttggatggg-Ó1 (DR5p2;2, azonosítószámú szekvencia);.
Hacsak másképpen nenr adjuk tneg, a példákban szereplő összes olígotmkleötidőt a Life teélrno Ingres céggel szinteteáhatjuk meg. Az összes, öllgonukleotidoí -ziRC-os tároltuk miután feloldottuk desztillált vízben.
e) PCR-reakeíó
A PCR-reakelóelegy összetétele az alábbi:; tempiát eDMS, § pl a teljes 33 pl reakcióból ÖR5pi relé ’ancmöiío. fetpmoi;
DR5p2 rehí iancmdíkí. töpmol;
iöx konventeh Pl R-pofíer (a reagepskésztet része), 18 pl; dNTT-k (tmndcet ik 2,5 sM), 4 pl; és Tag-polimeráe (Promegag 5 egység.
Steril desztillált vizei adunk az oldathoz, összeseit 108 p.l--re. Hacsak másképpen sesr adjuk meg, a áNTB-k dATP, dCí P, döí'P és dTTP ekvimelaris keveréke (mindegyik 2,5 tuM).
A PGR-reakcíóí az alábbiak szerint végezzük. Az oldatot először 94°€-ra. melegítjük 2 percre, ami ntán 94°C-en 38 másodperc, 52°C-m 1 perc és ?2Α3-οη 3 perc ciklust 48-szer Ismételtek:. Ezen eljárás befejezése után a reakciós elegyet ?2°C-ra melegítjük 18 perere.
Az így ek'álluou .mg)i.iSkálf BNB-Ragmenseket 1% agarózgélen váiaszljnk el, amely 8,25 pgónl etldjam-bromidoí urtalmaz Azokat a csíkokat, amelyekről meghatároztuk, hogy a kívánt DNS-fragmeuseket tartalmazzák, kivágjuk borotvapengével, és a PNS-t visszanyerjük a öcm? Etem reagenskészlettel (Elöl 81). A BNE-tragmenst a E4 Cforéug Ró (Invitrogen, CA) alkalmazásával klónozzuk:. Ezt az alábbi módon végezzük.
A PCR-reakeiőeiegyfeol visszanyert DNS-tragnsessí 58 ng p€R2 vektorral együlfúínely .TB Cómmg O része) összekeverjük 1 pl löx llgáz reakeiöpofferel fó mbf Tris-HCl (pH 7,5), ö íhRI magnézium-klorid, 5 mM nátrium-kiorid, 7 mM d-merkaptostenol, 8,1 mM ATP. 2: mM OTT, 1 mM spermáim és 0,1 mgónl szarvasmmAa-szérumalbumin), amelyhez 4 egység 14 IbNS-llgáztfl pl) adtunk. Az elegy őssztérfögatáí 10 pl-re áb ihjuk be steril ioncserélt vizzei, és a kapott ligáz-öldatoí 15 érán keresztül inkubáljuk M^Oos. Ezen idő letelte uían 2 pl hgáz reukcioelegyet adunk 58 pl kompetess TOP iöE’ .£. ete törzshöz (amely a Td öomteg kd része, és & használati utasítás szerte lett kompetenssé téve), amelyhez 2 pl 0,5 M (kmerkaptoeianolt adtunk, A kopott elegyét jégen tartjuk 38 percen kérésztől, maid 42uC-os 36 másodpercen keresztül, és ismét jégen 5 percen kérésziül. Azt követően 500 pl, 2% v/V (riptont, 0,5% vv/v éleszfökivonatot, 8,85% név nátriurn-kloridöt, 2,5 mM kálium-kloridot, ) mM magnézlum-kloridof és 28 mM glükózt tartalmazó tápközeget (amit a leírásban ezentúl „S0C” tápközegnek sevezüuk) adnak á tenyészethez, és az elegyel inkubáljuk 1 órán keresztül 3?*ü-on rázaíássai. Ezen idő letelte után a tenyészet szőlészt jók L-tápközeg agaresészére (1% viv tríptos, 8,5% w/v élesztőkivonat, 8,5% w/v nátrium-kiorid, 8,134 w glükóz és 8,6% »7v bakto-agar (Diíeo)j, amely 188 pg/snl ampteilltní tartalmaz. .A csészén megjelenő ampieillterezísziens kolóniákat kiválasztjuk es pi&íiua átvivő kacsesel lekaparjuk, és tenyésztjük 180 pghssl anspicilknt tartalmazó E-tápkőzegbes 37'‘C-on éjszakán: keresztül 208 rpm rázatássak Az inkrtbáiás Pián a sejteket eenírtfugálássai begyajtjílk, és azokból plazatíd DNS-t állítunk elő· az. alk&lsksrs eljárás alkalsauzásávek Az így kapott plazmidokhói az EeoRl-EeoRI DRS elTNS-Ragstsensí szubfelónozzuk pcííNÁJ plazmídka (invíö'ogen, CA), A pcf3hiA3d>an lévő DR5-géní teljes bosszuságbau msgszekvenáljuk, és az megegyezik a publikált szekvenciával. Az Így kapott piszmsdot peí)HA3-ÖR5 plazmidnak nevezzük.
1.2 DRSAgG expresszJós x ektor előállítása
Attilák érdekében, hogy előállítsák a humán DR5 oldható formáját a íranszmemhrárt doniét?euetkül, egy expressziós vektort konstruálunk. Ezt a vektort ágy tervezzük, hogy olyan fiizlós fehérjét kódoljon, asnely a bosnán I>R5 exíracelluláris domésijáí tartalmazza fuzsasxálíatvs a humán IgGl-Fe ÖHS-éhez: Hl),. A transzmembrán: dómén nélküli humán DRő-őt kódoló DNS-t az alábbi PER-reekcióvuf állítják elő,
a) Temphtf
A FCR-teakcióhcz alkalmazott terápiát a pcDNA3-DRS. b> RCR-lándndhók
Az alábbi oligcnukleóííd: láscindsíokai szintetizáljuk mega RCR-hez:
5-gacgalgceegaíetaeíttaaggg-3‘ (HRSpi; 1. azonosttoszámü szekvencia);
S'-ggateeg^gasaeattcgaígte-T (DR^p3:: 3, azortosltószámá szekvencia);
Hacsak másképpen nem adjuk meg, a példákban szereplő összes oilgomskteotsdót a tifé: teeltnologies céggel sgíutetizákaijuR meg, Az összes oligosuskteotldot -28°C-oís tároljuk miután feloldottuk desztillált vízben.
c) FCfeoakciő
A PCR-reakció végrehajtását és azampliískált-'DNS izolálást az f. f je) példa alapján végezzük.
Az: így kapott plazmidot pcR- AÖR5 plazmidnak nevezzük, A humán Fe-fraginenst kódoló RamElEcoRl íragmens!, amelyet a pmFas-hlaGiFc plazmidhól állítottunk elő, szubkkínozzuk a peDNA3 Bambii és EcoRl többszörös klónozó helyeire. Az így előállított plazmidot pcDNAI'e plazmidnak nevezzük. Ezután a p€R-ÁDR5 piazmidból előállított, humán oldható DRS-rágiót kódoló BamHI-BamHl iragmenst szabklőnezzok a pcDNAFc pusztuld Baml-Il helyére. Az így kapott plazmidot pcDNAADR5«Fc plazmidnak nevezzük. A pcDNAÁDR5-!'c plazmidhól előállított, humán oldható DR5 - humán IgG Fe-réglót kódoló EcoRl fragmenst tompa végűvé tesszük a DNS-pollmeráz Klenow-Ragmense (GIBCO BRL) alkalmazásával, és azután szohklönozzuk a pAdGMYS ingázó vektorba (Quantum Bfoíeehnologíes Inc., Canaáa), amelyet tompa végűvé alskhöUnuk Barsffi basiías után:. Az így előállított plazmidot pAdADR5~Fe plazmádnak nevezzük.
1.3 A fúrásán t>R5-ig<H fúziós fehérje ezpresszúltntáss és tisztifása
QBI-293A sejtekcí fax .ID£?A>4Zvéuí O része) együtt traríszlékttiiunk pAdAö:RS-Fe: ptenlddsi: és QSl vitális: BHS-scl (az ,-1B£A?ó>-Gíu'xí A'ő része): az áöEAö-öhcsí A'sí íQu.attirm Bioteeíssofegies íné,, Ganada) alkalmazásával a használati utasítás szerint. A rekombasáus virn startoltok at tenyésztjük,: és sxkt tneijök BRS-igG fúziós féhcsje ezptesszsójára a íélülúszo ELÍSA elemzésével, Á pozitív taHóltokat asőpliOkáljok QBí293A sejtekben: és -ttíRC-ors tároljuk vírus tőrzskelturaksoí. 58 csésze (150 műt) QBÍ~2$3A sejtét tfíínszléhta-lattk. pAdADR5-Fe rekotnbináns vírussal 18 m.o.s, („kfuitípiieity of ihfecíios”) mellett. A tenyésztő tápközeget 4R órán keresztül tartó transzfékcíó után begyüjtjük.
A BRS-igG gént tertulmaző írasts/fektáit sejteket 1 x 18* sejbWI sejtsürűségig növesztjük 58Ö ml 18% v/v FCS-; sartaltnazó DMEM-tápközegben IGÍBCO) 37-C-on 5% v/v CO.-: tartalmú atmoszférában 2 napon ke23 resztül. A tenyészetet azután fecerttrifegáljuk (10OÖ rpm, 5 pere), es a felülúszót Összegyűjtjük. A DR5~ígG iéiülöszóból 'tööéaö tisztbását ?«W«á--ále/>^8ms« Cf-4d affinitás! krouiatográűts (Pharmacia! alkalmazásával az alábbi körűhnények közöli:
oszlop;: /öxáabM-áfep&iüTW C£.~4£ oszlop (oszlöpsaéret 2 ml; Pharmacia) ; elúeiés pufiér: fel M glieln (pH 2,4), 0,15 M ffiO; semlegesítő puffer: 1 M Tris-HCl (pH 8,5).
Miután az összes iélülaszöf felvittük az oszlopra, tnussuk háromszor 26 ml PBS-sel és azután 1 ml eluciös pufiért adnak 1(5 alkaloíntnal. Megmérjük mindet! egyes eluáií frakció (i ml) optikai denzitását. A 2-5. Ifakeiót (amelyeknek nagyobb az ÖD28S értéke Ö, l-nélj Összegyűjtjük, és IC© pl semlegesítő pufiér hozzáadása utat!: az eiuátumokat kölön-ktdöu dialízis csőbe helyezzük, és az eluátumohat diaüzáljtdt 1 liter PBS-sel (pH 7,5) szemben: 4 ffi-on. A dialízis pufiért kétszer cseréljük.
Az eiuátumokat martán megvizsgáljuk a Fffi5-)g(i géstermék expresszidjára ELBA-vaí. Először 100 pl:· t tegzünk mindéi! egyes frakcióból külöo-külön Só-mérSbelyes mjkrofiterleniez (Cosíar) mérőhelyeibe, és mkubáiuk 3?öC-öt! I órán keresztül. Ezen idő letelte: után az mérőhelyen lévő oldatot eitávslitjök, és a mlkíodtertemezt mossuk 3 alkalommal 100 ui mérőhely, 0,1% v/v Tween 2ö-at tartalmazó PBS-sel (amit a leírásban ezentúl PBS~T\veen”-nek nevezünk) A mosás után 2% w(v szawasmarba-szérumalbumltrt (asrdt a ifiírásban ezentúl „SSA”-;osk nevezünk) tartalmazó PBS-t adunk ffiö pbméröheiy mennyiségben, és a mikrotiterlemezt ibkúháljok 2?ó€~on I órán keresztül. Ezen idő lefelts után a mérőhelyeket még háromszor mossuk lOö pl/mérőhely PSS-Tsveen-nek ami után 100 pl/mérőhely oldatot adunk minden egyes mérőhelyhez, amely RBS-Twees-oel IGöÜ-szeresre hígított áhti-hutnán IgOI monoklonális ellenanyagot tartalmaz, és a ndkrohterlentázt meg egy»zer mkubáljuk ?7 í-on I (hát; keresztül, A merőbe Kokéi azután háromszor mossak 108 pl/méröhely PBS-Tween-neb 3,2fe5,5Metrameíii-lxmzídín (amit a leírásban ezentúl „TMB!’-nek nevezünk) Iblyékony szuhsztrátoí (Sigma) adunk 100 pldnérdhely mennyiségben, és a míkjOtíferlemezt hagyjuk szobahőmérsékfeteíí állni 5 percig, és azatán a reakciói: leállittuk, ffiö phméröhely 0,2 H íkSOi hozzáadásával, leolvassuk: útidén egyes: mérőhely abszorfeancláját 4SÖ mo-en, hegy megbecsüljük a kötött ellenanyag mennyiségét, a 658 um-en mért ahszerbanciát alkalmazva kontroll mérésként. Az. ahszorbancíát mikretiterientez-leort'asőval mérjük (Molseuiar Devices). A DR5-lgOi termelését ezzel az ELBA eljárással igazoljuk. Az expresszált DR5Igöl fúziós fehérje molekulatömegét. Wesfem-blot elemzéssel határozzuk meg;, amelyben anti-hutnándgöi moneklösális: ellenanyagot (Sigtna) alkalmazunk az ellenanyag gélben: történő detektálására. Az exprexszált ORS-ígöl fúziós fehérje molekulatömege megközelítőleg 58 kDa. Az elést tisztaság nagyabb mint 9(5%, amint azt SDS-FAÖE-n Cdosmsfe Adna festéssel történő elstnzessel megállapítjuk.
2. példa. Motroklonális ellenanyagok létrehozása humán »RS ellen
2.1 Immunizálás ő-Β hetes nőstény Balb/C egereket (faekson haboraiory. Bar Harbor, M.E) immunizálunk sfímitástiszíitoíf humán DRS/hlgö 1 fúziós fehérjével. A kezdeti, talpon történő bmmmizAláshoz a fúziós fehérjét (50 pg) emalgfiáljuk Frenud-féle kompiéit adjutánsban (Dlfco. Öetrolt, Ml). Az egerek, azután négy megerősítő oltást kapnak 50 pg adptváes nélkül beadott fúziós: fehérje, injektálásával minden második wpp®.. Három nappal az utolsó injekció után nyirokcsomókból származó limfocttákat fuziouáltatunk NS-1 tnieíótna sejtekkel, és a ipbridómákat 10% magzati bptjúszérutamal kiegészített FI 04 tápközegben tenyésztjük:, A pozitív feiferidómákat ELfSA-val szelektálj ttk ki, amelyben a mikrötíterlemezeket vagy l pgiml DRÖdtigGl-gyei vagy kontsöllként azonos mennyiségű: Fas/hlgö 1-gyel vontuk be.: A hibridómüfc kártípusát: BLlSA-vai határozzak meg egér lg ízotipus-speei&us kecske ellensnyagők paneljának alkataszásával: (Souíhem Biotechnoiogy, Birmingham, Al..}. A möttöklosélis ellenanyagokat affinitást krotttatográdával tssartjuk immöhillzálí anti-egér-lgGI vagy Frofein-G alkalmazásával (Sigmaj.
2.2 Sejííazáö
A megerősítő okás után a harmadik napon a nyirokcsomókat eltávöíiijnk az egérből, és 10 ml Sáéra®mentes REMI 1640 íápkSzeghe tesszük (G1BCO BRL), amely 50 egység/ml penicíllist, 30: pgdnl sztreptornscmt és 300 gg/ml Vglüíatsinsayát tartalmaz, és a szervet spatulával szitás történő áísyomással bontjuk szét (ÓW Afrsmry; Taleon), A kapott sejtszeszpenzsőí feeeuttlfegálpik a nyírekcsomő-sejfek csapadékba viteléhez, amelyeket: azután kétszer mosunk szérammentes RFMi-íápközcggel, A mosott sejteket azután felszuszpesdáijnk szérammentes RPMI-tápközegben és leszámoljuk,
Közben rtS-í mielorua sejteket (American Type Culture Coliection TÍB-18) növesztettünk 1 x í.ö* sejí/ml-í meg nem haladó sejtsdrtrtégre ASF104 tápkőzegben (Almomoto, K„ K.), amely 10%. v/v FCS-t. íGiheo SRL) tartalmaz F’ÁSF tápközeg szérummal”) 37öC-en 5% CD2-feen, amelyeket hasonlóképpen feltárunk, mosnak, reszuszpendálusk és számlálunk,.
Az MSI sejisztíszpenziö számított, 3 x 1Ö7 sejtet tartalmazó mennyiségét összekeverjük lépsejtszuszpenzló számított, 3 x lő3 sejtet tartalmazó mennyiségével:. A kapott keveréket ieeentrífugáljuk és a félúlúszot eldobjuk, A sejtfúzió alábbi lépéseit ügy végezzük, hogy a csapadékot mindvégig müanyagesőben tartjuk 3 ?aC-tm egy meleg vízzel töltött főzőpohárban.
ml 30% (w.M poiietiiénghkol-íőOO-at (Boehrínger Manheim) adtunk azután lassan a esőbe, mialatt a csapadékot egy pipetta hegyével keverjük. Azt kővetően 1 ml szérummentes. .HT-ra eiŐmelegifeíí RPM tápközeget adunk lassan kei részletben, majd további 7 ml szérunmremes RPMl tápközegei, A kapott keveréket leeentrífngáijuk, a feiülászót eldobjuk és 10 {R|, 10% FCS-t tartalmazó HA f tápkózeget adunk hozzá, miközben óvatosan keverjük a pipetta hegyével. További 20 ml, 1G% FCS-t tartalmazó ΗΑΊ tápközeget adunk hozzá, és a szuszpenziót szétmérjtsk Oő-mérőhelyes tenyésztő mikrotheriemezre 100 pl'mérőhely mennyiségben, és 37“'Con inktsbáijuk 5% CCh-t tartalmazó atmoszférában, 7-8 nap elteltével 100 pt friss HAT tápközeget alkalmazunk a tápközeg helyettesítésére a sárga árnyalatú mérőhelyekben. Az ezen mérőhelyekből való fúziós sejteket klónozzuk az alább leírt korlátozó hígítás alkalmazásával.
2.3 Küteozás korlátozó hígítással
4-iö hetes nőstény BALBA: egerek (lapun SIC, Inc 1 e'-ecsemőtnirígyeít eltávolítjuk, felfaljuk szitán ít’d/.&KW, 1 u'con), atnn: azt feni leírnia., cs a feltart sejtedet kef&zer mossuk 10% FCS-t tartalmazó! IΓ upközeggel. Egy egérnek megfelelő esecsemőnririgy-sejtet fefezu*z.tendálunk 30 ml, 10% 'FCS-t tartalmazó HT tápkőzegben, fápiáíósejrtszuszpenzlőf létrehozva. A fenti 2,2 példában előáliftort fúziós sejtkészifményt fO-lÖOszorosra hígítjuk ezzel a íáplálősejt szuszpeoziővsl, és tovább hígítjuk sorozatban a iápfáiósejt-szuszpenziövai ő, 1 és 0,3 fúziós sejkml sűrűséget előállítva. Az Így előállítóit mintákat ŐŐ-méróhelyes mikrotíterlemez mérőhelyeibe osztjuk szét IBS gLmérőhely mennyiségben, és 3 7sG-on mknbáimk 5% CCb-ben.
2.4 Szkrfselés
A növekvő híbrtdómsk íenyészeí-fólüíúszőíí ELlSA-vai szkriseijük, vagy i ggrtní drődtlgGi-gyel, vagy kontóiként azottos mennyiségű FasdtlgGl-gyei bevont míkrotiterfemezek alkalmazásává! (41), A kötőd ellenanyagot tormaperoxidázzsi (HRB) konjugálf anti-egér-jpmmnglobulírsokkal (Southern Biotechnoiogy,
Rtrounghaut, Al> detektáljak TMB-t (Slgma, Bt totós MG) alkalmazva sznbszU-áíként. 1 (tg? ml koncentrációjú tisztított DRS-ígöl-et vagy azonos mennyiségű Pas-fgö I -et adtaik R6~mérőhelyes AáófetZSöf 57717? P/..47T' (Costar, HV) mérőhelyeibe. A mikrötlterfemezt őltó hagyjuk 4°€~οο éjszakán keresztül, hogy lehetővé tegyük a fehérje inéröhely felszínére történd adszorpcióját. Szert Idő leteltével a mérőhelyekben lévő oldatot előfejjük, és mérőhelyeket 3-szot mossuk PBS-Twen-t'.ei. Azután 100 p.i, 1% {Vvj szarvasmarha-szérumalbumim (A3803; Sigma Chemicals Co.) tartalmazó PBS-t adunk mindegyik mérőhelyhez, és a ínikrotiterlemezt 37ú3-on tnkubáljuk 1 órán keresztül. A mérőhelyeket azután még 3-szor mossuk PBb-Toees-nel, és 50 gl fenyészeííeitilúszót adunk növekvő híbridómákból az egyes mérőhelyekhez. A míkrotíterlsmext azután Sr^G-on fokubáljuk 1 órás kérésztől, és a mérőhelyeket: megint 4-sz.er mossuk PBS-Tsveen-sel, A. tamás után 50 p! tormaperozidázzal jelölt anti-egér-immunglobuiih ellenanyagot t Southern Biofeehnology, Bimtfeghaftt, AL) 1 ObO-szeresre hígítva PBS-ben - adunk tnsröhelyeoként, és a mtfcrot uerfemezt ismét inkubáljak 37Χ-θ® 1 órán keresttök ami után a nferőhelyekst 4-szer mossak RBB-Tuven-nel, Ő.l’.S.S-tetrítmetif-benzidtn (TMS) folyékony szóhsztráfot (Rigóra) adónk 10Ö pl/méröhely mennyiségben, és a mikrotíterlemezt hagyjuk szobahőmérsékleten állhf 5 percig, és azután a reakciót leállítjuk 180 pl/mérdhely θ,2 N IHSO^ hozzáadásával. Mérjük az egyes mérőhelyek abszorbaueiáját 450 rnn-en (kontroll ŐSÖ nm) mikrotiterfemez-leolvnsé (Mfeeeular Pteviees) alkahnazásával, és kiszelektáljuk azokat a ítiziós sejteket a mintából, amelyeknek az ubszotbartfeája (450 nm650 nm, Ql>érték > 8,5) nyilvánvalóan magasabb, mist azoké, amelyekhez nem fúziós felülüszó lett adva (Ö13érték » 8,83). Ezenkívül a növekvő hibrídőmák tenyészet-felitluszőját. í aukciónál isan is szkrinellük az apoptőzis-mdukúlő aktivitás mérésével,: farkat sejtek alkahsazásával. 51) pl, fúrhat sejtet tartalmazó R PM1 tápkőzeget (1ÜÖ0 sejt mérőhelyenként) és 5 pM biszindoliimalehuíd Víil-at (BlsVill, Alex is, San Blego, C.A) adunk Pö-mérőhelyes mikrobferfemezbe, növekvő liibridóstáhol származó 50 pl tenyészet-felalúszó jelenlétében, A sejtekéi párásliőít inkubátorban tenyésztjük 37cC-on éjszakán keresztül. Az apoptózíst a sejtek életképessége alapján határozzuk meg az Á??’.£?« reagenskészlet tdkaimaxásával, a gyártó utasításai szerint (Packard lüstrámenís), és a mintákat TopGoumer készülékkel számláljuk (Packard Instruments),
2.5 TRAlL, és TRA-8 receptorhoz való kötésének ELiSA-ja
ELISA míkrotiterlemezeket vonunk be 2 pg/tnl DR4-I» vagy DRS-lg fúziós fehérjévé! éjszakán keresztül, 3% BSA-val történő blokkolás mán az oldható IRAlL-RLAG-ot vagy ÍRA-8-at adunk a jelzett koncentrációkban. és inkubáijnk 37%'-οη 1 órán keresztül. A ÍRAIL vagy TRÁ-8 kötődését sorrendben HRP-vel koojagáít anű-ELAG ellenanyaggá; (Alexís) vagy HRP-vel konjugált anti-egér-lgGl-gvel (Southern Riotechnology) detektáljuk. A reakciókat TMB sznbsztráttal hívjuk elő, és PencfVítorá ábbrupfore Reode/· készülékkel (Bloradf nferjük, A Rd-értékeket az: „ors-stfe” kötést moáeif alapján nemlineáris regresszióval a GrnpbPndPTőm szoftver alkalmazásúval íGraphPaá Software, San Dfego, CAf becsüljük meg, Kompctittv ELlSA-hoz 100 ngbnl TRAíL-ELAG-ot alkalmazunk, és Inkubáijnk TRA-R különböző koncentrációinak jelenlétében. A TRAlL kötését a fentiek szerűit határozzuk meg.
2.6 Klónozás
A fenti 2.3 és 2.4 példában leírt lépéseket 5-szőr megismételjük a 2.4 példában kiszelektált sejtekkel, ezáltal lehetővé tesszük több htbndőma klón kiszeíektáiásák amelyek mindegyike olyan egyedi ellenanyagot termel, amely kötődik DRS-lgG-bez, de nem kötődik Pav-fgtn-hez. Lsen szelekciós eljárás eredményeképpen egy egér-egér lubrídőmát állítunk elő, amelyet TRÁ-8-nsk nevezünk, és DRé-lgG-hez kötődő, de Fas-lgG-hsz nem kötődő ellenanyagot termel. Ezt a TRA-8 hibrídómát letétbe helyezték az „Amencaa Type Culture Goheet;ön’'-nál 2ÖÖÖ, március l-én, és a PTA-142S elérést számot kapta,
A TRArS egér-egér hibfiáóxna által termeli ellenanyag (amit a leírásban ezentúl egyszerűen „T&A3Tnak nevezünk) alosztálya Igö 1, R., amit egy xnonokkmáhs ellenasxyag Izotlplzálö reagenskészleítel történő teszteléssel demonstráltunk (Pieree).
A humán BFLS-lgGI fúziós fehérjét íromttnogénként alkalmazva hét hibridem;} klánt állítottunk elő a kezdeti BUSA szkrsseiéssei, aotelysk mindegyike erősen pozitív DRő-lgG-re, de a Fas-lgG fúziós feltétjére nets, jelezve, hogy a kapott hiferidómák olyan ellenanyagokat termelnek, amelyek felismerik a DRS ex&aeelluláris részét, de az IgG Fe-régtoját ttem (adatokat nent közlünk).
2.7 Western-biot elemzés
Normál humán és tokos szöveti boírtogeutzáitunok tesztelésére szolgáló szikokét vásárolunk a Gettó Techsőíögy cégtől (St Loms, MG), Mindegyik sávba azonos mennyiségű íéhesjét viszünk fel, asnmt azt: auti-βaktín ellenanyaggal meghatározzuk. A. biotokat I pg/ml TRÁ-8-eal próházzuk éjszakáit keresztül, és azután flRP-vei konjugált antí-egárAgG 1-gyei {Southern Ssotechsologyj szobahőmérsékleten 1 to keresztül, és kemtfuntmeszcetteíával hívjuk elő.
2.8 fo síin lm sn u ss h Lszí okéstt í a
A. humán szöveteket az „LÍÁB Tíssne Rroeurexnent €etxtex”-iöl szerezzék be, A fagyasztott metszeteket 7Ö% eiaztolban rögzítjük, blokkoljuk IS% löszérnmmsl PBS-bext, és azután: ixtkubáljuk iö jtgónf aífemtástisztftott TRA-8-cal szobahőmérsékleten 6Ö percen keresztül. Antí-egér-ígG ABC reagesskészlctet (Veetor, Bntlisgaxne, C A) alkalmazunk dlaminobenz.idhmef koíoriateifiás szuhsziráíkéní a reaktivitás kitKUtoíásám,
2.9 Kaszpáz alti válás elem zése torkai sejteket (I x iÖfi/ml) htkuháltmk 590 nghnl TRA-8-eaf, A ssjthzáiató alíkvoljsit (39 pg fehérje} elválasztjuk 15% SDS-PAfíS-u, nylon-xttembxánra blottoljuk, és a bioitokat próbázzak anti-kaszpaz-8, -9 és -3 ellenanyagokkal (BB PhaWihgeto San Diego, CA), majd HRP-vel konjugált másodlagos ellenanyaggal, és a hasított termékeket kemilumineszcenclával mutatjuk ki. A kaszpáz-tohíbitor reagtmskészleteí az ,R & D Systems cégtől (Mmneapohs, MN? vásároljuk Mindegyik kaszpáz-inhibitort a jelzet; .koneentráelőhaxí adjuk a tenyészethez,
A TRA-8 egér-egér hibridómát í x 10“ sejt.'xttl seitsűröségig növesztjük 19% y/y F'CS-t tartalmazó 590 xnl ASF íápkösegben 37aC-<m 5% Cörben 5 napou keresztül, A tenyészetet azután lecentn&gáljuk 09ÖŐ rpm, 5 perc), és a felultiszőt összegyűjtjük,. A TRA-8 felülúszóből íörtéuö tisztítását PíOíeto&Sépáoxöse GL-4S alftmtásí fcromatögráfía alkalmazásával végezzük az alábbi körülmények között:
oszlop- Arötomö-Sephííí-öse oszlop foszlopméret 2 xnl; Pharmacia): elúcxös poffer; 0,1 M giiein (pH 2,4)·. 0,15 M NaCi: semlegesítő puíter: 1 M Trís-HCl (pH 8,5).
Miután az összes feíülúszót felvittük az oszlopra. 20 ml PBS-sel mossuk háromszor, és azután eiöeiós puffért adtunk 19-szer 1 txtl térfogatban. Megmérjük minden egyes eiuált frakció ti ml) optikai deszkását A 2S, frakciókat (amelyeknek nagyobb az: BB280 értéke 0,1 -nél) küiöxt-külön összegyűjtjük.
109 pl: semlegesítő puffét hozzáadása után az ebsátomökat knlön-külőn dialízisesébe helyezzük, és: az eíuáiumökat dlalízáijuk 1 liter PBS-sel (pfí 7,5) szemben 4uC-on. A dialízis puffért kétszer cseréljük. Ezt a tsítttát elemezzük smi-DRS ellenanyag aktivitásra ELÍSÁ-val a fent előállított barnás DRS-igö fúziós fehérével, a fent leírt módszer ^alkalmazásával.
1)R4 antigén, f)R4-fgG expressziós vektor és omuokkmáíls ellenanyag elódtilÁz i-3. példában leírt eljárásokat megismételjük DR4 templát-eOfeS és lánebidítók alkalmazásával az 1. példában leírtak helyett, DR4 antigént előállítva, amelyet az 1., 2. és 3. példák szerint alkalmazunk ÖR4-re specifikus monolrtönális eliejwy&g elöáliitásám.
$. példa, OeRl és DR2 elleni monoklonsils eíteaasyagdfe
Monoklonalis ellenanyagokat termeltetünk a DÓRI és OcR2 álcareceptorök ellen a megfeleld eDNS és íúneísdlíók helyettesítésével az megfelelő antigének előállításához az i. példa szerint, A DcRI vagy ÖcR2 és immusgiohulín-ö lissiők expresszlös: vektorait és a megfelelő tisztitött moneklorsális ellenanyagokat a 2. és 3. példa szerint állítjuk elő.
ő. példa· Monoklonális ellenanyag speeiStása
Mivel a I'RAll és a TNER-csafóá más fehérjéinek az összes receptora szignifikáns mértékben homológ, a DR5 ellent szemléltető TRA-S ellenanyag speeíímisát Western-bloí elemzéssel határozzák meg, két különböző humán DRS-lgG fúziós fehérje és más rokon fehérjék oldható rekombináns formálnak alkalmazásával. .Egy első: DR5-ig fúziós fehérjét állítunk elő a fefoS estmceiluláris részletének 1-í Őö öidalláneai cDNS-ések és a fesnáa IgGl állandó régióját kódoló cDHS fezlonáltatásávul. A fozmuáltaíoíi eDNS-í klónozztrfc tetombináns adenovinís vektorba (Quantum Blotechnogies, Inc,, Montreal, Canada). Az expresszáitatoü ÖBdddgGl fúziós fehérjét, ámdysek a relatív molektdafomege 58 kDs, megtisztítják ami-humán-igö affinitást oszlop (Stigma, ÍR. Loais Mö) alkalmazásával. A speeifo.ás Weriern-hlot elemzéséhez egy második rekombiuáns humán DRS/lgö fúziós fehérét (52 212 andnosavak), s.úsmo-t i’RAll-Rl, RJ vs -R4 foziOs feberj-ΐ vásárolunk az Alesss cégtől. A barnán kas és ΎΝΕΚ1 oldható formái Dr. Cári Edwards (Amgen. Inc., Thousands Oaks, CA, Amerikai Egyesült Államok) ajándéka. Az alkalmazott oldható rekemhlnáns humán DR4, Delhi, DeR2, TMERl, R4 és Fás molekulák humán IgG-velalkototí fúziós fehérjéi. Az egyes fehérjékből Ö,5 gg-oí elválasztunk 1Ö5A SÖSPAOE-n és nittoceltolóz membránra htoífoliuk. A bioitokat blokkoljuk PBS-bes oldott 5% tejporral szobahőmérsékleiso 1 órás keresztük és probázzak 1 gg/mi tisztított snti-DR5 monokiöitális ellenanyaggal (klón: TRAS) vagy fel ugiml fíRT-vsl konjugált kecske asit-humán-dgö-vel éjszakán keresztül 4cC-om Ίormaperoxidázzas rt lfetQ konjugúlt kecske and-egér-lgö-í alkalmazunk másodlagos ellenanyagként a kötött TRA-8 detektálására. A hfodokaf komifommeszceneiával hívjuk elő.
Teljes hosszúságú DR5-öi vagy DR4-et tartalmazó ci3NA3 vektorral vagy Üres vektorral teaaszföklalí CÖS-7 sejtekéi (Clonteeh, Ralo Aíto, CA) alkalmazunk áramlási díomeíriás elemzéshez. A humán TRAtL~f vagy egér Eas-bgaadmuof kódoló teljes hosszúságú cDMR-í a pTRE vektorba klónozzuk a leolvasással megegyező irányban a teíracildínnel szabályozható promótertől (Clonteeh),. A p'ERE-hTRÁIL vagy pTRB-mFasL Xhül-Hmdlil foagmeuséí pedig a pAáBN adénovírus ingázó vektorba (Quantum Bioteebnologies, íné.) klónozzuk. A 293-as gazdasejtskei együtt trauszfoktáhuka lisearízáit pAd-TRE-hTRÁlE. vagy pÁfeTRE-mEasL. vektorral és adenovírns DfeS-ének nagy Ragmensévei. A rekorobiuáus vírusfaríoliük működőképes: humán TRA1E vagy egér Fas-íigandsm óxprosszióját' ;Cr-felszubaduiási vizsgálati eljárással szkrtneljtik .ínrkaf sejtekkel.
A TRA-8 erősen reagált a DR5-ÍgG fúziós fehérjével (--58 kDa), amelyet az immunizálásra alkalmaztank, amim ezt az la. ábrán bemutatjuk {DR5, ni), és gyengén a második DR5-IgG fúziós fehérjével (~68 köat, amint ezt az la. ábrás bemulstjok töRS, *2), A TRA-8 sem kötődik szignifikáns tnértéklxm DRd-hez, DcRlhea, ÖcBR-hőz, Fas-hoz (CD95) vagy TNFRl-hez. Ezen eredmények azt mutatják:, begy a 'TRA-8 olyan epítőpókaí ismer lel, üstelyeió spembhtsak a DRS-re, de nem közösek a család más tagjaival..
A TRA-8 nem reagál a TNE-reeeptór szuperosalád más tagjaival, ©ont. példáid Fas-sal (CDS5) és TNF l-es reeeptairai, és a TRA-8 nem kereszíreagál a ÖRS egér hmmRögjával sem, amim ezt a 438 és 458 mn-es optikai: obszöcbsociá: aránya ttmiaíja, az alsó rósz 1 -7 számai alatt (la. ábra, az alsó rész 8. oszlopa). Az oldható TRAIL és TRA-S összemérhető mértekben kötődött az ímmofelllzalt l>RS-lsöz (ib:. ábra, baloldali rész). Ezzel ellentétben a TRAÍE kötődött a DR4~hez, de a TRA-8 nem matatott semmilyen kötöaktivitást a DR4-hez (ib, ábra, középső rész). A TRAÍE és TRA-S DRS-hőz való kötődésének Kd-értékét sorrendben 59 sM-ra és 3 ©XIm becsöltök. Fontos módon a TRA-S hatékonyan verseng a TRÁlL-lei a DBS kötéséért, de a :ÖR4-érí ©ént, amim ezt k&rnpeíiíiv ELtSA-han felmutattak (ib. ábra. jobboldali rész)· Ezen eredmények megalapozzák a TRA-S spéciirtását a humán DR5 iránt,
A TRA-8 képes a DRS sejtfelszíni expresszlójának detektálására áramlási ehometriás elemzésben, specifikus kötődést mutatva teljes hosszúságú humán DR5-tél íranszfefetált Cos-? sejtek .sejtfeis2lnéhez, de ÖR4gyel vagy üres vektorral transzfektálíakhoz nem (1 c, ábra), tlasonlöképpers az ?>? Cm immunhisztokémia TRAR-cal reaktivitást demonstrált: teljes hosszúságii ÖE5 IWS-sel transzlektáh Cos-7 sejtekkel, de ©etn azokkal, aamlyek kontroli vektorral vannak iranszféktálva (l d. ábra), A TRÁ-R nem sminkéi apoptózlsí nem tmnszfektált Cos-7 sejtekben, és Cos-7 sejtekből származó RNS RT-FCR-ie nem mutatott specifikus FCR-termékékat humán OR5-öf kódoló párosított lánc indítókkal. További fenfectónálís elemzés humán ferksi sejtek aikslntazásával azt mutatta^, hogy - keresztfeötés hiányába©: - a TRA-R erőse© sejthalált Indakál, három különböző vizsgálati eljárással demonstrálva: sejtéletképesség, 4 TPLSe, MTT és FMdzáfás (1 e, ábra). A .turkál sejtek több mim 58%-át elpusztította TRA-8 nanogflwn szintje, amint 4 TP/ufó vizsgálati eljárás ©rutaija. A TRA-R ölőakitvliása specifikus ÖRS-re, mivel az gátolható DR5-lg fúziós fehérjével, de nem gátolható DR4~ig fúziós fehérjével (adatokat ©ént közlünk). Raszpáz-S, -9 és -* > nd tsál detektálhatjuk Westem-fclot eteerzésset akár 38 pemeel a fiukat sejtek kezelése ©tán is (If ábra), ás t ’ »l at sejtek sejthalálát teljesen gátolja az általános kaszpáz-tnfoíbtar (Z-VADj (lg. ábra). A kaszpáz-8, -3, -9 és -18 egyedi kaszpáz-mhlbitorat részlegese© gátolták a sejthalált, tovább jelezve, hogy a TRA-R-kÖzvetilett sejthalál elsődlegesen: kaszpáz-ftiggő apoptózísos meehanizníosött kérésztől történik.
7. példa. Sejtfelszíni ÖRS expressziójénak áramlási ciíometrlAs elemzése: fö feddfeeeeptor sok dagnnnfsejtesí, de ©ermáiis sejteke© nem
Azután megvizsgáltuk a TRA-S köíőképessógéí a sejtfólszmen expresszált DRóóhöz, és ezers reakció speeifitását COS-7 sejtek (American Type Cnhure Coliectson CRL-1651) alkalmazásával, amelyek ímoszfektálvo vam-ok teljes höszszóságú DR5 vagy 13R4 cöölS-t tartalmazó expressziós vektorral, vagy kontrollként: üres vektorral. Flkoeriírbmei (Fit) kopjogált onfi-egér-lgG Í -et (Idtarnongeuj ulkatmazonk második elfengnyagfeéní a kötött TRA-8 detektálására, 1 X 18'! sejt fluoreszcenciáját mérjük, áramlási eitométer (BAÖTuefuge) alkalmasával .az alábbi körülmények kozott:
Gerjesztési hullámhossz: 488 nőt; öetekeiós hullámhossz: 608 nm.
Az áramlást clfemetrláséfemzés azt hogy az antMRAlL-reeeptor ellenanyag a DE5-tsl transzferált OOS-7 sejtek megközelítőleg 3Ő%-át festette meg, amint ezt az 1c. ábra teli hlsztogpurün mutstjs, Ess; a százalék párhuzamba állítható a tramszfektálási hatékonysággal, amint azt a tratssz&ktálás elemzésével megállapítottuk zöld íhtoreszeens fehérje (GFP) alkalmazásával (adatokat nem közlünk). A TRÁ-h am festette szigfeiWns mértékben a öR4~gyel (üres hiszfogram) vagy koníröil vektorral (pontozott hfeztogram) tmnszfektált sejteket, jelezve,: hogy a l'RA-k specifikns a sejtfelszíni DR5-re.
Habár a DR5 -expressziót alaposan tanulmány ózták daganatsebekben az mRNS szintjén (fefeger 1 és: mteal, FESS Lett. 427, 124-128:, old 119^)1 a DR5 felszíni exprsszszíőját nem. értjük jól [ölbson S.B. és tfesai,, Mól. Céh Bioi. 20, 205-212. o»d ^20**0», fenn K. és mtsai., Clln. Caneer Rés. ő, 335-346, old. (20ÖÖ)]:. Ezáltal a atiít-llRS soonóklonálís ellenanyag eshetősége lehetővé teszi számunkra & ÖR5 felszíni mennyiségének vizsgáltát, és hogy teelágÁ az expressziót a sejtek TRAlL-kŐzvetitetí apopiózisra való érzékenységével. A sejtek (1 x lö'j alábbi panelját IQ pgőní afiínitás-íisztrtotí íRA-S-eal inkubáljuk szobahőmérsékleten 30 percen kérésztől, és azután festjük. PE-vei konjugált aníi-egér-lgöl-gyei (Pharmingen) még 3Ö percen keresztül 18Ö0O életképes sejtet elemzőnk a. KiCSvmdsge áramfest ettoméíerrel az alábbi körülmények között:
Gerjesztési hullámhossz: 4kS ont;
Deíckciós btillámhossz; Ó80 nm.
Az öt tesztelt hematöpietikus sejtvonai a Jurkat, CEM-ó, Möii-4, M-t és 1)397. !>R5-expressziő detektálható a .birkái, CEM-6, H-9 és: Ö937 sejtek lélszlnáo, de majdnem detektálbatailan a Mofe-4 sejteken, amim ezt a 2a. és 22 ábrán bemutatjuk llabrn HR5 R\'S-expre»»z»ó magas szintjét körtük ko’ábbun (4 >). a h'át'S elemzés jelezte, hogy ezen sejtek nem expresszálnak magas szinten felszíni DR5-öt. Ezen eredmények azt mutatják, hogy a DR5 felszíni expressziója nem korrelál a BR5 üanszkrípeiós espressziójával, ami nem váratlan egy ilyen receptor esetében, A £>R5 sejtfelszíni expresszsőjsnak a mértéke sejt-feszármazás-specifikns lehet, mivel a hsmaiopoíetikus eredetű sejtek többsége alacsony szinten expresszálódik, míg a legtöbb glióma és prosztata sejt DRS tsagás szintjét expresszálta.
TRA-S monok tonális ellenanyagot alkalmazónk a £XR5 szerepének toeghstározására TRAiL-közvedíett spoptozfe ísáukálásában a sejtfelszíni expressziójának vizsgálatával küRmboze típusú barnán daganatsejtek paneljén, valamint ezen sejtek érzékenységét TRAIL- és TRA-k-közvetíteít apoptézisra. Elsődleges perifériás vérsejtek nem expresszáiták sejtfelszíni DRS szignifikáns mennyiségét, és reztszíensek mind a TRA1L-, mind a rRA-S-közvetíiet? apoptézisra <2a., 2á. és 3ak ábra). Habár mind az öt tesztelt hantán T-feukémía .sejtvonal expresszáít detektálható, noha viszonylag alacsony mennyiségű sejtfelszíni DRó-öt, közölök kettő (torkai: és CE-M-ó) nagyon érzékeny mind a 'fRAlt-közvedteü, mind a TRA-k-közvetített spísptözisra, jelezve, hogy a. DR5 egymagában elegendő apoptözls: índakálásáraezekben asejtekben. A Moii-4 és U937 sejtek részlegesen érzékenyek a TRAlL-kezvetbeít apeptoxisra, de viszonylag rezisztensek a TRA-k-közvetíísít apoptőzlsra, sugall vs, hogy más TRAík-ireeeptörok iá részt vehetnek az apoptózis: jel továbbításában. A l-í-9 sejfek rezisiztensék mind a TRA1E-, mind a ÍRA-8-fcözveíiíeít apöptozlsra, feltétetezva egy inüaeelltdáris apoptöziseOenes útvonal által közvetített gátlást,
Az alkatomat sejtek, panelját az alábbiak alkották: a iM83,1725 IMG, D37MÖ, D54MG, Ö373MG, CH235MG» US? humán rosszindulatú: glióma sejrvonalak, és rumnál humán asztrociták, amelyeket Dr. Yaaeey Ödfespie-töl (Rfettrosurgcry Department of tbc femyerslty ©f Alabams at Birmingham) kaptuk. A Dűlőd, EC3 és: LnCap humán prosztatarák sejívönalakst .I5r, Willíam örizzfc-löí {Pathology Department of the IJntvershy of
Aíabamn at Blriningham:) kaptuk, aki a sej:tvonaíakáí Amerleao Type Cultine O'ollecíion-Iől: szerezte be. A humán ieukénóa T-sejtvonalákat, a 8-se|t hmlőmát, HepG2 farkat sejteket (Atwíeaá Type Ctrtere Colfeetioa T1B452> és. a. CCRP-CEM CEM-0 sejteket (Amerfcatt Type Ctttere Coiíectloö CCL-119); az W97 möOöciía sejtvoiudai (American Type Culture Coiíecnon CRL-2367) az Americatí Type Cnltsre Cöíleetion-tői vásároltuk. Az összes fenti sejtvemal&t 103··» FCS-sel kiegészített RPMÍ 1640 tápközegbeti tenyésztettük. Az 1321H1 humán aszíroeita sejtvenal LTr. Riehard Jöpe (Psycbistry Depanrnení of the Lktiversiíy ©f Aiabsima sí Birmingham) ajándéka volt, és 5% FCS-sel kiegészített OMDM tápkőzegben tenyésztettük.
Az oldható rekombináns humán TRA1L, amit az Aíests Corporation cégtől vásároltask (San Diego, CA> egy fúziós fehérje, amely humán TRAIL exírseellulárís óoméaját (95-281.. oidallánc) tartalmazza az Ntermhiáhson FLAG-csnikéhez és 8 amírmsavhöl álló kapcsoiópeptídhez ínzioxtáltaíva. EkenSéthen korábban közölt Hts-efmkézett TRÁlL-lól, a TRAIL ezen preparátuma egymagában nem képes erős apopíozisos választ mdnkáhii farkat sejtekben, és síiti-ELAG ellenanyagot igényel keresztköíökéní az apoptózis fokozására. Az assíiFL.ÁG ellenanyagot is: az Abxis-tol vásároltuk meg.
Mind a 10 tesztelt humán rosszmdnlaíh ghóma sejt detektálható mennyiségű DRS-öl expresszált a sejt felszínén, -A legtöbb közepes-magas színtű DRS-őt expresszált, amint ezt a :2b. ábrán bemutatjuk. Három sejt vonal., a D-54MG, H373F4G és CH-235MG magas sztuíen expressziét DRS-öl, míg hat sejtvonal, a Hs-A83, Ö25IMG, D37-MG, 1387, SMKS és 132IN1 közepes számén expresszált DRS-ól. Csak egy sejtvonsl, a 11-485 espresszált alacsony szinten íMS-öí. Mind a három prosztatarák sejtvonsl magas szinten expresszált: DR5~öí, amint ezt s 2e. ábrán bemutatjaA normál elsődleges T~sejlekhsz hasonlóan az elsődleges B-sejtek nem exgresszákak szignifikáns íReímyiségu DR5-őt, és nem itteniek át apoplóztson TRAlL-id vagy TRA-h-cal: történő kezelés után (2d. ábra), A négy tesztelt iimfóma sejtvonai közt;! három, (SKW6 4, LB-3 és Kuli) expresszált viszonylag magas szinten DR5-ÖL és nagyon érzékenyek voltak mind a TRAIL-, mind a TRA-k-körvetíteit spoptöxísrs, A negyedik sejtvonal, a Daudi nagyon alacsony szinten expresszált PR5-öí. és: sokkal kevésbé volt érzékeny TRAIL- vagy TRA-S-közvetíteí- apoptózisra. Habár az elsődleges asztrociták nem expresszátak detektálható szinten sejttelsziní ÖR5~Öt (2b’. ábra), mind & négy teszteli gliőrsa sejtvonai magas szinten expresszált DRS-öt. A DR5 expressziójának gíiónra sejteken ínért, a T- és S-sejteknél magasabb szintje sem jár együtt szignifikánsan nagyobb érzékenységgel TRAIL- és TRA-8-közvefitett apopíózisra, sugallva, hogy a ÖR5 sejtek sejííeiszipl expressziója nem szükségszerűen korrelál az: apoptózis szintiével dagamstsejiekben, RT-ECR-t végeztünk a DR4, I>R5 és DcR2 ihrvivő színijének meghatározására az összes tesztelt sejtben (1, táblázat). Azonban általában az elsődleges normál sejtek viszonylag alacsony szinten expresszáít&k ÖRő-öt, összehaxrmistva a íranszlbrmáit daganat sejtekkel,
1. Táblázni: A TRAíL receptor expressziójának RT-PCR elemzése*
Sejtek DR5 BR4 DeR2
Elsődleges T-sejtek <0,001 <0,001 0,015
lurkat 0,10 <0,001 0.21
CEM-ö O,50 0,59 0,25
Moít-4 0,10 <ö,ö01 0,05
H-9 0,73: δ,δΐ 0,07
Elsődleges B-sejtek <001 <0,001 0,024
SKW6.4 0.95 0,66 0,45
£83 0,40 <0,001 Ö.35
Raji 0,55 0,11 0,45
Dandi 0,73 0,36 0,63
Normál aszirocí.ták 8,05 <0,001 0,12
SH683 O,SŐ 0..% 0.14
Ü87 0,44 0,56 0,21
054 1,15 0,46 0,12
132 INI 0,25 ' ' 0.35 0,05
* Őssz-RNS-t izoiáiíBnfca sejtekből, és RT-PCR-f végeztünk az Eljárások részben leírtak szermi, A PCR-termékeket 3% ag&rózgélben választottuk ei. és Raor-A 4&SÁ' MíMfeggcr őysíam (Blarsdj alkalmazásával elemeztük. Az értékeket a p-aktmlmz viszonyított arányként mutatjuk be.
8, példa. Apoptőzis indukálása rosszindulatú sejtekbe®: « rte?
Annak meghatározására, hogy a TRA-8 indukál-e apoptőzist tenszformálf sejtekben ír vííra, az összes ÖR5-pa?.tfív daganatsejtet megvizsgáltuk: azok érzékenységére TRA-8 vagy TRAÍL által mdúkáL apopíózisra.
A célsejteket (1 x fö* mérőhelyenként) tenyésztünk 9ő-méröbslyes mikroíiferiemezeken oldható TRAÍL jelzett koncentrációja és keresztkötö (Aiexisj jelenlétében, vagy TRA-8 jelenlétében, 3TC-es éjszakán keresztül. A sejtek életképességét az alábbiak alkalmazásával határozzuk meg ti t 4,'77m? reagenskészlet a gyártó utasításai alapján (Packard Instruments, Meríden, CT), i2) az MTT Celi orokp rtruRmbúrÓKfív áíí (Ssgmak vagy 13) elpusztult sejtek Rí-íéstése, és a sejtek áramtusi eitornetriás eleroe/Csevel A tenyésztés végén a sejteket 10 pg/nd Rí-vel festjük, és a Pl-negatlv sejteket életképes sejtekként kapozzu\ A hepafociíák kondenzált sejtmagjainak elemzésére a sejteket íó pgórtí Nöccfert 53552-vel (Molecslar Prófees) festjük, és áramlási eímmetriáva1 elemezzük;
A TRA-8 ellenanyag képes apoptőzis indofcátására a rosszindulatú barnán güőnta sejtvonafek többségében s9';0l, a 3 prosztatarákos sejívooai közül 2-ben, és a 4 DRS-pozitiv hematopoiedlkms sejívonat közöl 2ben. Nem indukált apopíózist: a. Mnlf-4 sejtvonaibatt, rnuély majdnem detékial&hatstlsu sziüítl sejtfelszíni DR5~ öt expresszált Azonban a sejtek TRA-k-közvertielf apopíózisra való érzékenységének a szintje figyelemreméltó: módon változott a sejívonálak között.
A sejtek TRA-8 ellenanyag által indukál? apoptózisra való érzékenységének változékonysága azt sugallja, hogy itairár szükség van DR5 minimális sejtfelszíni expressziójára, a DR5 sejtfelszíni expresszlőiának szintje sem folíétlenül az elsődleges meghatározója az érzékenységnek, és más faktorok is befolyásolják ezt a folyamatot Habár az összes glióma sejt általában szignifikánsan magasabb színien expresszái; felszíni DR5-öt. mint a henratopoietlkns sejtek, s glsőmg sejtek érzékenysége TRA-8 által indukál! apoptozisra nem növekedett arányosan :a heomtopoietikos: sejtekhez viszonyítva. Az öt glióma sejtvonal, s D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG és 132INI érzékenysége TRA-8 által indukáltapoptozisra magas, és ekvivalens azok érzékenységével TR.A 11.-közvetített spöptőzm, amiül ezt a 3b. ábrán hemulatfek. Két glióma sejtvonal, a »456 ás SMK l, sokkal kevésbé érzékeny TRA-8 által indukált apopíózisra, A 0456 sejtek esetében a DR5 felszíni expresszioja alacsony; azonban a ÖR5 felszíni expressziöja SMKl sejteken hasonló az érzékenyebb sejtekéhez, azt sugallva, hogy ruás mechanizmus, játszhat szerepét á TRAlE-közvetitett anopro/lsra való érzékenység meg32 határozásában. Habár mindhárom prosztatarák sejó/onal magas szinten expresszába a ilRS-öt, a D«145 .sejtek a legérzékényebbek a TRA-8-mdukált apoptózisra, a FC3 sejtek részlegesen érzékenyek, míg a LnCAF sejtek tel· jesen rezisztensefc, amint ezt a 3e. ábrán bemutatjuk, A hematopoietikus sejtek közül azt találjuk, hogy a Jutkái és CEM-6 sejtek nagyon érzékenyek a TRA-S apoptózisra, amint a 2a. ábrán bemutatjuk, habár mindkét sejtvssahői uzt találtuk, hogy alacsony szinten expresszálja a DR5-8t. Habár a DR5 detektálható U397 sejteken, ezen sejtek rezisztensek a TRA-S-indukált apoptózisra. Hasonlóképpen,: a 11-9 sejtek detektálható szinten expresszáiták a £?E5-öt, azonban rezisztensek a TRA-8 által indukált apoptózisRi. Ezen eredmények feltételezik a DRS-kÖzvstiíett apoptózisi szabályozó nreehsníznmsok létezését.
További aníi-DR5 ellenanyagokat állítunk elő az 1-3. példa eljárásai alapján. Két további, TRA-I és TRA-10 jelű anti-DR5 ellenanyagot vizsgálnak a TRA-8 melleit az apoptózis indukálására való komparatív képességük meghatározására, és ezáltal agonistakéní való működésűkre, vagy ellenkezőleg, a TR.Ail.,-xözvetite;t apoptezis gátlására, antagenistakéní működve. Humán Jóikat sejteket alkalmazunk célsejtként s bárom anílDK5 ellenanyag (TRA-1, TRA-8 és TRA-lö) agonisia és/vagy antagoutsia aktivitásának meghatározására. Amint a 4, ábrán bemutatjuk, a sejtek életképessége 90%, 70% és 20% sorrendben a TRA-10, TRA-1 és TRA-k sc’tA esetei eu msotkan ke-es/ ül ' * t £ m'-ref torténo nkubak »tan A 1 Rá 8 e cs apoptoz sós t á a-?t t ? dukált dózis függő módon, mm a TRA-I csak közepes apoptózisus választ indukált és a TRA-tÖ csak gyenge választ indukált. A TRA-8 tehát ttgonista autúDRS ellenanyagként sorolható be, A 4. ábrán a humán furfcst sejtek életképességét a TRAÍk-tndukáli apoptózis dózisfeggó tűggvényekési matatjuk be. A TRA-10 szignifikáns mértekben gátolta humán Jutkát sejtek apoptozisát az alacsony dözisu, TRAlt-mdukálí vizsgálatban. Ezáltal a TRzk-10 tehát amagooista anti-ÖRS ellenauyágkém sorolható be, A TRA-l-et letétbe helyeztük az „Americaa Type Culture Colleetlon”-ítál Ρ3Ά-1741 elérési szám alatt. A TRA-ΙΘ-et hasonlóképpen let étbe helyeslik az „Ainerican Typu Cultare üoiieettön'’~nál FIA-1742 elérési szám alatt.
Az Őt gllótna sejívonal, a ©-37MO, BS4-MÖ, U373-MG, CH235-MG és 132 I N I érzékenysége TRA-8 által indukált apoptózisra ekvivalens azok: érzékenységével TRAtL-közveíkeít apoptózisra, amim ezt a 3b, ábrán bemutatjuk, jelezve, hogy a TEA 1L-indukált spöpíózix ezekben a sejtekben elsődlegesen a DR5-ön keresztül történik. Ezenkívül a ghoma .sejtvonalak közül kettő, a HsőS3 és U25Í-MÖ rezlsztens a TRAlL-indukált apoptózisra, de részlegesen érzékeny a TRÁ-8-indakáli apoptózisra, jelezve, hogy ezekben a sejtekben működnek az álcsrecepíoröfc, és hogy a TRA-8 ellenanyag alkalmazása kikerülte ezt a szabályozó mechanizmust, prosztatarák sejtvoualakbau, a TR.A-S által indukált apoptózisra való kölöfibözö érzékenység ellenére, ez párhuzamos sois a sejtek 1 Efctt által moukalí apeplozssra sálé érzekeaj séges el, trtee m savaiba, hogv a ©R5 főszerepet játszak a TRAl:L-közveiftett aptspíózlsban a prosztatarák sejtekben. A hematopoietíkns sejtek között azt találtuk, hogy a tokát és CEM-ö sejtek nagyon érzékenyek mind a TRA-S-, mind a TRAÍL-közvetiteü apoptózisra. A TRA-Ő által indukált apoptózis: szintje összehasonlítható a TRA1L által indukáltéval, amint a 2tt. és 3 a'. ábrát? bemutattuk, Csak az egyik gllóma sejivonal, az 1387, és két hemaíopöletlkus sejt vonal, az 1.193 7 és MolM mutatott érzékenységet a TRAlL-mdakált apoptózisra, de kevésbé érzékertyefc vagy rezlsziertsek a TRA8 Indukált apoptózisra. Egy sejivonal, a HŐ sejívonal expressz&lí detektálható szinten ÖR5-8t, de rezlsztens: a TRA-8 vagy TRAÍL-indukáh apopióztsra is, Míg mnnrnáiis szintű ©RS-expresxzió szükséges a TRA-8 által indukált apoptőzíshez, a ©R5 expressziás szintje: pete feltétlenül jósolja meg a sejtek érzékenységét a TRA-8kőzveíttett apoptózisra; áicareeeptorok szerepet játszanak a TRAIL-közvetitett apoptózis modulálásában bizonyos sejtekben, de nem táruk úgy, hogy szerepet játszanak az eddig tesztelt sejtek többségében; amint vártuk,:»
TRÁ-S ellenanyag kikerüli az álcameeptorok hatásait; a DRá-receptor ítmkcfonáiis mutációi elöfordulbatnak transzformált sejtekben; és végezetül: lőtfaceilutáris szabályozó mechanizmusok fontosak lehetnek, vagy fontosabbak, mint &?. álearecepforok a sejtek TRAH..- vagy 2'RA-8-kőzvétlteS: ápoptozisra való érzékenységének meghatározásában.
Korábbi vizsgálatuk kimutatták, hogy a DK5 mRNS-e széles körben ekerjedf normái szövetekben (7), A DR5 íéhárjeszinten történő expres&ziőjának értékelésére normál szöveti homogeKizátumok panelját (Geno Teehnology, St Louis, M:O) pröbázlnk a TRA-8 ellenanyaggal Wesíem-blot elemzésben. Kilenc normái humán szövet közül azagyszöveí gyengén pozitív (5a, ábra, 2. sáv), A DR5-fehéne nem detektálható TKA-8 reaktivitással májban (1. sáv), tüdőben (3. sáv), vesében (4. sávjlépben (5. sáv), herében (6. sáv), peteteszekben (7, sáv), szívben (8. sáv) vagy hasnyálmirigyben (9. sáv). Ezzel ellentétben sníod a tizenhárom humán rákos szövet pozitiven festődön TRA-8-cal (5b. ábra), beleértve petefészek (1, sáv), tüdő (2. sáv), máj {3, sáv), végbél (4, sáv), méhnyak (5. sávi, bor (6, sáv), here (7. sáv), pujzsmirigy 18, sáv), méh (10. sáv), gyomor (.11, sáv), garat (12. sávi és hasnyálmirigy (13. sáv) rákját. Ezenkívül normái és rákos szövetek >n sáv immunhisztokénrtája TRA-8-cal megerősítette, hogy néhány iepben található elszórt pozitív sejt kivételével nem detektálható -a .085 expressziója normál emlő, tüdő és lép szövetekben 15c. ábra). A párhuzamos rákos szövetek, közlök az emlőbe megvizsgált rákos szövet között ő közül 5 emlőrák, 2 közöl 2 rnébnyakrák, 5 közül 4 magák, 8 közül 3 limfomtg 2 közül 2 tüdőrák és 2 közül 2 proszlatarák reagált pozitiven TRÁ-8-e»L Ezen eredmények megfelelnek az áramlást citosnetriával kapottaknak,. és azt jelzik, hogy a rákos szövetek magasabb szinten expresszálják a DR5-öt, mint a normál szövetek,
9. példa, TR.A~8 daganatellenes aktivitása őt vöm
Különböző okok miatt sok szer, amely? ígéretesnek mutatkozik /« vírw vizsgálatokban, nem hatásos io vívó. Tehát fontos tesztelhi a TRA-R hatásosságát m v?vo általi modellben. Ennek megvalósítása érdekében IRA-8 snfi-DR5 ellenanyagot adunk be humán OR5 molekulát expresszáió humán xesogratfot hordozó egereknek. Az alkalmazott egerek ö~8 hetes NOD/SCID egerek {j&ekson L&horatory), amelyeket szuhkmán okunk barnán 1321141 asz-roehótna sejtekkel (1 x 10), vagy intravénásán okunk humán leukémiás lurkat sejtekkel (I x ΙΟ”). A daganat beohása után 2 nappal az eeerekel Intravénásán oltjuk TRA-8-eaí (‘00 μη). Öt nappal a fRA-8cai történő kezelés után, meghatározzuk a 13.2INI daganatsebek növekedését a daganat mérete és tömege alapján, A Járkál sejtek növekedését a lép tömegének növekedése és az oltott állatok lépőben található GDS-pozitív humán iurkat sejtek százaléka alapját! határozzuk meg. A daganatos szövetekből biopszkh veszünk, és szövettanilag megvizsgáljuk azokat.
Korai kezelés 100 pg TKA-8 egy szeri intravénás dózisával egy nappal a daganat beoltást! után teljesen gátolta a 132 IN I sejtek számára s szitázd daganat kialakítását {6a. ábra). Késői kezelés TRA-8 három IDŐ gg-os dózisával egy héttel a daganat beoltása níáa negyedére vagy az alá csökkentette a daganat tömegét (6b, ábra). A daganat kialakulása nem látható a TRA-k-eal korán kezelt állatokban (6b. ábra, felső rész). A szövettani elemzés út ástál Htodon degenerált dáganatezövetet tárt fel a TRA-8-cal kezek állsttokbsn (őc, ábra, alsó rész). Elasoniokeppen a TRA-8-kezciés gátolta s, járkál sejtek lépbe történő betelepedését, amint ezt a léphet; megíalálbatő C DJ-pozitív Jurkat sejtek ritkaságával demonstráltuk (öd., óe. ábra). A beültetett daganatos szövetek szövettani elemzése kevés, elszórt: daganatsejfet: mutatott a TRA-8-csl kezelt állatok lágy szöveteiben, míg a kontrollokban szilárd daganatok alakultak ki, amint ezt a őe. ábrán bemutatjuk, A Jurkat sejtes modellben a Jurkál sejtek szá34 ma a TRík-8-cal kezelt állatok lépőben kevesebb, mint 2%, összehasonlítva a majdnem lÖbóAal a kented állatok lépőben, amint azt átmulass eltometriával a 6a. ábrást ás m<?bn €D3-festéssel a be, ábrás bemutatjuk.
Ezen eredmények megerősítik annak a nemrég! demonstrálását, hogy a keteszíkötoft reksmbmáns TRA1E szisztémás beadása gátolja daganat növekedését úr (13). Ezen eredmények azt is jelzik, hogy TRA8 egyetlen dózisa nagyon hatásos daganatsebek eliminálására úr tevő.
Mivel anti-humán ellenanyagot nikalmazttmk az egérmodNlben, a TRÁ-8-kezelés toxiclíását nem tudtak megállapítani. Azonban a TRAIL./«· vivő beadásának vizsgálata azt mutatta, hogy nem kapcsolódik szigniEfcáns ioxieltás «fez a kezeléshez (13).
ÍÖ. példa. Az MA szmbviáhs sejtek érző ke nyék a TRAli,- és TMA-R-rstd okúit κpop tözisrst
A TRAIL.-közvetített apoptőzis legtöbb korábbi vizsgálata rosszíbduiatú sejtekre koncentrált, A találmány szerinti TRAÍi,-közyeiítep:apóptózis terápiás hatású autoimmuu és gyulladásos állapotokban is, mint például RA-bam tiki Sej t felszín ΐ 11R5 expresszió fának áramlási r ltomét riás elemzése MA szmovtáiis sejtekben Összehasonlítjuk a 0M5 expresszióját RA páciensekből származó nyolc elsődleges tenyésztett:
szinoviáiis sejt panelján oszteoartritiszes (amit a leírásban ezentúl „OA^-nak nevezünk) páciensekből származó nyolc elsődleges tenyésztett: szmoviális sejtével. A nyolc komán elsődleges RA szinoviáiis sejt tenyészet a RA11114, RA-1016, RA-1Ö2I, MA-512, R.A-7Ö7, RA-811, RA-716 és RA-929, I3r. M. öhtsuki jSaskyo Co. Líd., Tokyo, lapan) ajándéka, amelyeket: 18% ECS-sel, penicillinnel, sztreptomíciunel és glutamimtal kiegészített ÖMEM íapközegben tenyésztünk:. A bét OÁ sziuovláiis elsődleges sejttenyészetet OA páciensek szlnoviálís szövetéből izoláljuk szokásos kollagenáz eljárással, és azonos körülmények közöli tenyésztjük. Az összes elsődleges sejt passsálási száma í:ö alatti, A. DM5 expresszióját EACS elemzéssel határozzuk meg, amint azt az 5. példában leírtuk.
A RA sejtek Összes elsődleges tenyészete msgas: szinten expresszált felszíni DRS-öt, és csak kis variáció vau az expresszlös szintek között ezekben a különböző páciensektől izolált szlnoviálís sejtekben, amint ezt a. 7 a, ábrán bemutatjuk. Ezzel ellentétben a felszíni DR5 expressziöja az ÖA páciensektől izolált szinoviáiis sejtek felszínén nagyon alacsony vagy deiektáthaístían, amin- a 7b. ábrán bemutatjuk. Azt találtuk, hogy az SV4ő-nel transzformált szlnoviálís sejtek magas szinten expresszáinak DE5-öí, ami Összebasoniítbato az RA sejtekkel. Ezzel ellentétben a nem transzformált ííhrohlaszt sejtek alacsony szinten expresszáltak DRS-öt, ősszehnsoniitfeaté módon: a 7b. ábrán, bemutatott OÁ sejtekkel.
lö»2 MA szinoviáiis sejtek érzékenysége TRA-R vagy TRAlL áitaí közvetített apoptőzisra
Általában a RA páciensektől Izolált összes szinoviáiis sejt érzékeny mind á TMAJL-., mind a TRA-8indukált apoptőzisra, és az összes OA sejt rezisztens a TRAIL- és anti-DRÓ-elienanyag-közveilietí apopíózisra, amint ezí a 8a. és 8b. ábrán bemutatjuk. Ezen vizsgálatok azt mutatják, hogy a TRA-8 ellenanyag célpontjai megváhozoú sejtek, nem pedig normál sejtek. Ezenkívül a TRAIL áltól indukál; apoptóztsra való érzékenység vagy rezisztencia mintázató korrelál az anü-DR5 ellenanyag által indukált apoptózisévai, jefezse, hogy a szinoviáiis sejtek elsődlegesen DRS-öt alkalmaznak a TEÁlt-apoptozis kiváltására.
Amint a rosszindulatú: sejtek esetében leírtuk, a TRAIL vagy antí-BR5 ellenanyag által Indukált apoptőzisra való érzékenység változó a RA szlnoviálís sejtek között, habár hasonló szintes expresszáinak: ÖR5öt. A RA-512 és RA-707 a tegsrzékeuyebb, mivel a sejteknek több mint 8Ö%-a elpusztult 2ő ngjud .alatti. TMÁR, vagy TRA-8 köacentráeiőnál. A KA-1014, RA-811, RA-7 jb ős RA929 azok, amelyek közepesen őrző- 35 kények a TRAfL-re or TRA-8-ix a %sh<W megkőzehtőleg lóö%~a a magas TRÁli- vagy TRA-8 feoneentráeiónt? ',ΆΟ ng mB tbrténsk A KA iOió es RaKGí szűkben - nabar a svnek többsége (óÖ% felett) elpusztul TRAIL vagy- TRA-8 aláeséh) üözisatnk á sejtek egy része túlél TRAíL vagy 'TRA«8 magas kemenstráctőjfeak jelenléfébett, jelezve, hogy a sejtek egy szahpopuláeiója rezisztons a TRÁIE-közvetlietí apoptözlsra, Ezzel elleniéiben az. Összes OÁ sejt sokkal kevésbé érzékeny a TRÁ1L- és TRA-8-kÖzveflíeit apoptőzisra. Nem több mint a sejtek ói)%-a pusztul el az OA52F és OA69F esetében, még. TRAIL vagy TRÁ-8 magas koaeentráe lójának jelenlétében is. Az: OA72M sejtek teljesen rezisztensek a TRAIL- vagy TRA~tadiskált apoptozísra. Az SVéB-nel transzformált szlnoviális sejtek szintén érzékenyek a TRAfL- és TRA-íbmdukáft apppiózisra (adatokat sem köziünk), Ezzel ellentétben a nem transztormált ührohlaszi sejtek rezisztemmek hintek a TRAíE-re és TRA-8-ta,
Korábban kimutatták, hogy a ÖRS egy EÁDÖAaszpáz-8-fuggő útvonalai basznál az spoptózis kiváltására (44). A RÁ sejtek ÖR5~kőzvetlte.tt apopíózisa kaszpáz-függésének meghatározására RA sejteket tenyésztünk TRAíL-tef vagy TRA-8 ellenanyaggal, specifikus kas^áz-inhibltorok jelenlétében. A nyele tesztelt kaszpáz-lnbifeltor közül a kaszpáz-6, -8 és -18 inhibitora képes gátolni RÁ sztuoviáirs sejték TRAIE-és TRA-8bídukált apoptöztsát, amim ezt a 9, ábrán bemutattuk, jelezve, hogy ez a barom kaszpáz-inhibitor részt vesz a DRS-kőzvetstett apoptózisfcan.
Kl.d TRA-8 vagy TRAÍL NP-Kh aktiválást indukál RA szltsovláhs sejtekben MMP-fe megnövekedett felszabadulása nélkül
Kézzelfogható bizonyítékok vannak annak a koncé jx: jónak az alátámasztására, hogy· közeli kapcsolat van az apeptözfs jeltovábbítása és a proltferáetó jeltovábbítása között: (45), Megállapították, hogy a DR5 képes aktiválni az NF-Kb ötyonalaí is az apopfózts-szignáftraHszdtikdó melleit, és az NP-kh-aktiváiás: képes lábét antiapoplézis je l iraítszdakálásárs, Tehát „gél-shift” vizsgálati eljárást haj tünk végre. Sejteket stimulálunk 50 ngAni rekombináns oldható TRÁlL-lei, Eas-hgandurumal 1 mgdnl enhaneer jelenlétében vagy 5Ö ng/ml TRA-8-cal a jelzett ideig. Séjtmag-exítaktnomkat készítünk, és tnkabálusk kétszeresesr festett.(^Pjí-vhí jelölt oligo-DNS prtL búval. Az eredményeket eyefone píxjspíxt-i.wger készülékkel elemezzük (Tz^Cötóí MO) Páckard Ihstrutnent Company, CT)·.. Miután a RÁ szlnoviális: sejteket TW-e-vá vagy TRAiL-lel iskubáljnk, az NTNrb sdéRtggő módon aktiválódik. A TRA-I ellenanyag képes erősen aktiválni az NP-si>t. Ezzel ellentétben a Fas-ligattdtun képtelen NP-kb aktiválás Imfakáiására, amint ezt a 10a.. ábrán bemmntiuk.
Tehát habár a TRAIL és TRA-8 ellenanyag erős apoptózíses választ indukál R.A szisoviáiis sejtekben, azok aktiváljak az .NF-ötf is, és úgy vélik, hogy az bíNxb aktiválás hozzájárul a TNF-.« proínhammatonkus szerepéhez &z RA-fean, Ezáltal lehetséges, hogy a TRAIL, csakúgy, mint a TNF-u, protmflsmmatorlkus eitökiökéot szolgálhat. Annak meghatározására, hogy hasonló biológiai következménye vart-e az NT-sb aktiválásának TRAIL és TNF-ö által, meghatározzuk az: MMP-k termelését BTJSA-val. Szinovtáhs sejteket tenyésztünk tápfcSzeghéo egyedül, vagy 5Ő sg/rnl tnferieukm-ίβ, IB ng/ral TN.F-a, 50 ttg/ml TRAIL vagy 50 rtg/nti TRA-8 feienlótéhőn éjszakán keresztül. Meghatározzuk az MMP-1 és MMP-3 szintjét a Pmyészetek felüföszójóban az FIÚSA reagenskészlsitel.
Amiket a RA szmoviálls sejteket prolnflammatorikus citöksn, TNF-s. vágy IE-Τβ. jelenlétében inkobáljuk, az MMP-I, -3 és -13 termelése nő a tápközeg-kontrolihoz hasonlítva, amint ezt a Töb. és 10c. ábrán bemutatjuk.. Ezzel ellentétben a TRAfL- vagy ami~DR5-ellenaHyag-kezelés nem kapcsolódik ezen MMP-k megnövekedőit fe Iszabatlslásához.
LA példa. íiepaíoóelleferís loxfeitás hiánya órás sejtélelképességi vizsgátokhoz üő-mőrőhelycs rntkrotiterfemezben tévő friss normál humán hepateitákat vásároltak az Is Yítro Technology cégtől (Sáhimore, MÖ). A hepatoeiiákat ϊ gg/ml oldható TRAtL-í vagy TRA-8-at tartalmazó Tfepmocyíe Chfemé Afedfem-hen tenyésztjük, A 6 órás ssjíéfetképességs vizsgálatokhoz normál hepateeilákat vágj' hepatoeellulárís ráksejteket izolálónk friss untai mintákbóL sínelyetó: „15AB Tissue Frocurement Center!,-ben gyűjtöttek. A humán hepatocitak izolálásához alkalmazóit összes reagenst, beleértve a hepatocila perfúziós puffért, emésztési oldatot, mosóoldatot és tapadási oldatot a öibeo cégtől vásároltuk. A szöveti lemezeket hepatocha emésztési oldalba® einészíiük 37°€~οη rázatás mellett (,Ső: rpml I órán keresztül. Az izolált hepatoeRákat alacsony sebességit eentrihigálásssí gyűjtjük be (50 g, 3 perc), és hatszor mossuk hepatocíta mosóoldatbaa. Flepaíociták egysejtes sznszpesziójál: tenyésztjük 1Ö% FCS-í tártálmázó hepatoetta tapadási, oldatban Ü6-mérőheiyes Mífrjgz:! míkrotíteriomezekben (BD) hat órán keresztül. A Nem tapadt hepatomtákat eitávoliíotíufc elömelegitelt tapadási oldattal történő kétszeri: mosással. A letapadt impatöchákal tovább ioknháljuk kütaböző koncentrációjú oldható TRAlL-lel vagy Fas-ligandummal keresztköfe jelenlétében, vagy TRA-8-oai vagy CiTl1-gyel, ó órás keresztül,
A TRAlt-nek legalább két olyan receptora van (DR4 és DR5), amely feépes apoptózist indukálni, TRA-8-at alkalmazóik annak maghatározására, hogy a ÖR5 keresztköiése önmagában elegendö-e normál hepatoclták apoptózlsának Indrdrálására. Megvizsgáljuk a DR5 exprasszlöl felíéijeszmten, kezdetben öt normái: humán raájszövethen: és öt snájráfces: szövetben fe: sápi immunhisztokémiával TRÁ-8 alkalmazásával, A normál: májszővetek metszetei: normális szerkezetét ős spitmorfólőgiáí matattak HdtE festéssel ( li a. ábra, bal felső részek), DR5 iránti pozitív TRA-8; reaktivitás nélkül (Ma. ábra, bal alsó részek). Ezzel ellentétben a humán: irepafoceliníáris kareinóma szövetek pozitiven reagáltak TRA-8-cul, konzisztens nnntázattai s.ÍW sejtmcmbtabeii és ehoplazmatikus jelentésével a rákos sejtekben. A humán Hepö2 hepalocellularis kareinóma sej tvonal szintén pozitív DR5~re, Ezen eredmények konzisztensek az öt normál majszóvet estében, és ót májrákos szövet közül csak egy (máj adenómai DR5-negatlv. Ezen eredmények konzisztensek: azon, ábrán, bemutatod Westem-hlot adásokkal, miszerint mim más normál szövetek, a normál hantán májszövef séta exprcsszáí szigniSkáns szinten DR5-Íéhérjéi. Ezenkívül izolált normál hantán hepatocíták TRÁ-8-eal próbáxoit Western-biotja netn matat detektálható szinten DR5-öt.
ÖRS humán heapíoekákon való sejtfelszíni expresszlőjának áramlási citometriás elemzése kimutatta, hogy frisses preparált normái hepatociták nem exprésszáhak detektálható szinten sejtfelsziní DR5~öt (1: Ib. ábra, bal felső részek). Nem detektáljuk olyast normál haman beptuoeinikon ϊ-esn, amelyeket fagyasztott állapotban társiíanlc vagy rövid időn keresztül tenyésztedünt; Ezzel ellentétben frissen. izolált hepatocoliuiáris kareinóma sejtek valamint Hep<32 sejtek exjtresszdlnak sejtfelszíni DR5-íw í'as-t alkalmazva összehasonlításra, a normál hepatoeiták, hepaíoeeilalárls kareinóma sejtek és HcpO2 sejtek mindegyike ekvívaiéns szinten expresszáií Eas-t (Uh. ábra, alsó részek).. Ezen eredmények konzisztensek a/okkál. amelyekét m són úmnunbisztokémidvai és Wesíern-hlötíal kaptunk, és azt jelzik, hogy a sejtfelszíni DR5 magas szinten expresszálódik rákos raájsejískben, de notmálfe hepatcestakon nem, A DR4, I>R5, DcR 1 és DcR2 mRNS-éaek jelenléte humán hepatocítákban RT-PCR-re! kimutató (23) azt sugallja, hogy a hantán hepmochák nagyon alacsony szinten expresszálhatnak DR5 fehérjét, amely a TRA-8 általi detekció kimutatási: határa alatt van.
Annak meghatározására, hogy a TRA-8 tnddkáLe hepstoeelhiláris toxícltást, megvkögáljufc normái tattá» hepatoeiták érzékenységét: TRA-8 által és oldható TRAÍL és ksreszíköíő által indukált apoptözisra.
Arator normái hepaioeitákot: tenyésztünk TRÁlt magas koneentrácíőjának jelenlétében, időfüggő csökkenést ügyelünk meg a sejtek éleSképességében ΑΤΡίΑο vizsgálati eljárással (12a. ábra) és ΜΓΓ vizsgálati eljárással, A normái bepatoeiták TRAB.-közvetített sejthalálai akár már 4 órával a TE Áll. hozzáadása után is láthatjuk. A 24 őrás tenyésztés végére a hepatseíéák több mint Sfeifoa elpusztul a. TRA1L hatására. Ezzel ellentétben ugyanolyan tenyésztési időszak alatt a TRÁ-8 nem Indukált szignifikáns: sejthalált normái feepatochákban, A éfearfeXéstékkel festett kondenzált sejtmagok száma, ami az apopíőzis jellegzetessége, növekszik a TRAtL-lel kezeit hepafoeitákban, de stem növekszik a TRA-8-cal kezeit feepaíoctíákban 02b. ábra). Az apopiózlsos hepatöeiták száma jől korrelált az AT?őfer vizsgálati eljárással meghatározott csökkent sejtéietképességgel, azt sugallva, hogy a hepsíoeiták TRAlL-tnánkált sejthalálát apoptózis közvetíti, Ezt: megerősíti a Z-VAD képessége hepsíoeiták TRAIL-kőzvetlteíí toxfeitásának gátlására. Mivel a ctktoheximid egy hatásos spoptőzisos enhaneer, megvizsgáljuk ezen vegyüíet: TRA.lt-lel és TRA-8-cal kezelt hepalocltákra gyakorolt hatását. Négyórás tenyésztés ííiatt a eiklöheximid ázlgniftkánsan fokozta a bepatoeiták TRA1L által indukált sejthalálát, a hepatocitáknák több mint 70%-s elpusztult a ukfohsuntl e'cnieiehcr (Te ab al V onot s t < khmevtmd kezek·, képtelen a IRA-S-közvetített sejthalál fokozására hepalocítákban. Azét*, hogy összehasonlítsuk hepatocltákbas szTRA-8 által indukált apoptózls jellegzetességeit a TRAtt áltat indukáltéval, normái bepatoehákaí, valamint rákos sejteket inkuháltmh oldható TEÁIL és keraszíköíő vagy TRA-S különböző koncentrációival. Hatórás tenyésztési időszak alap a T.RÁÍL közepes apoptózisos választ indukált normál hepafockákhan.. A. hepsíoeiták több mint 20%-a elpusztul; 500 ng/ml TRA1EJelenlétében (12d,. ábra, bal felső rész).. Normál bepaioerták TRA8-kezelése nem váltott ki szignifikáns sejthalált ugyanezen. időszak alatt. A normál: hepatoeitákkal ellentétben, elsődleges hepafoeettutáris karcinőm® sejtek f iád. ábra,, felső középső rész) és: Hepö2. sejtek (12d. ábra, jobb felső rész) nagyon érzékenyek akár TRAIE, akár TRA-8 által indukált apoptózisra.. A hepstoceílafórís karcinóma sejtek több mint 8ö%-a és a.HepG2 sejtek majdnem lSö%-8: elpusztult a 8 órás tenyésztési időszak alatt. Ezen eredmények azt jelzik, hogy a normál hepatöehák teljesen rezisztensek a TRA-8-közveíltett apeptózísra, és sokkal kevésbé érzékenyek a TRÁít-közvetített apoptőzisra, mint a májrákos sejtek. Eas-hgaháurn és ántlEas ellenanyag alkalmazásával (CH-11) nincs szigmftkáns köiöhbség a ífes-közvetiteit apeptózísra való érzékenységben a normál hepateehák, hepatoeelfoláris kareínóraa sejtek és: HepC12 sejtek között (12d. ábra, alsó részek).
Összehasonlító 11,8 példa. Hepatitisz ««káiásst űr w humán membránköfott TRÁlt állal
8-10 hetes nőstény Bő egereket mlravérsásan oltunk Hf pln AdfeTRAIL vektorral és azonos számú Ad/Tet-on vektorral. Az egereket különböző koncentrációjú, az ivóvizükbe tett tetracikimneí etetjük közvetlenül az adsnovtms vektor oltása után. A májkárosodást AST szérumszintjének meghatározásával határozzuk meg, AST diagnosztikai rsagenskésziet (Sigma) alkalmazásával. A TRAIL expresszióját Nörthem-blot elemzéssel határozzuk meg.
Annak meghatározására, hogy a TRAit membráskőtöti formája indukál-e rnájkárosodúst út vívó, ieijes hosszúságú humán TRAÍL-t kódoló rekombináns adenovlrus vektort (Ad'hTRAiLs állítunk elő. amelynek az expressziójs a tetracikbnneí indsÁálhaiő ptontóter szabályozása alatt asl. >4 órával Bő egerek AdfeTRAlL-lel történő intravénás oltása után, megfigyeljük a humán TRAIL dőzisluggö módon történő, tehacíkhu-fedukált expresszlójáí a májban, amint gA Norihernfeloi elemzéssel kimutatjuk sj:3a. ábra). .A TRAIL expressziős szintje jől kotreláll a. májkárosodSssal, amint: azt: fettnuíaijuk: a transzaramázok szérumszinljénsk telraeikiís-foggö növekedése útján, ismét dózisfoggő módon (:13b. ábra), felivel az sdenovhus vektor beoltása önmagában növelheti a hspatociták TRAlL-közvetítetí apoptózisra való érzékenységet, az Ad/TRAIE-lel oltott egerekből hepatocitákaí Izolálunk, és teszteljük azokat TRAtE-közvetiísít sejthalálra. hintés szignifikáns mádon megnövekedett sejthalál Ad/TRAIL-iel fertőzött hepatocilákbatt összehaseniitva kontroll, egerekkel (13c. ábra, baloldali rész). Ezenkívül az Ad/TRAfE~leI oltott: egerek nem mutattak megnövekedőit májkárosodást oldható barnán TRA11, intravénás beoltás után. Ebből az következik, hogy az AáíTRAfE által indukált hepatitiszt a taemhrá®kötöíí formában lévő TRAIL magas szintű expresszióla közvetíti. Máj metszetek szövettani elemzése feltárta, hogy a hepstöeiták károsodása láthat» már 24 órával a vektor beohás mán (idd. ábra), és legalább 7 napon keresztül fennmaradt (i3e, ábra). Ezen pafefógiás változások a májban szinté® tetracikli®--uggőek, és dszlsfüggS tnődon történtek. A TRAlLdndnkálí májkárosodás korai lázlsáí, a kezelést követően 24 órán belük nekrözisos gócok jellemzik. inllsmmstorikns sejtek beszüródését nem figyeljük meg ebben a stádiumba®, de vérzés eiőtbrduit. Az oltás utáni hetedik napra dilSiz májkárosodás látható kifejezett lebeny! elváltozásokkal, hepaíoelták súlyos degenerációjával (szabálytalanul összeesapódort eitoplazraa) és nagy üres területekkel, és prominens apoptózissal és nekréxissal Ezen fázis jellemző iulaidonsága a mononnkleáris sejtek nagymértékű hexzteódése. Ezen etetlmények: azt mutatják, hogy a hatná® ΪRA1L a Siemteásfcötötí formájában képes májkátösodási bitekéin! rá tevő. A humán TRAIE azon hajlama ellenére·, hogy súlyos hepatitiszt okoz egérben, nem: okozott letális választ. Ezzel ellentétben a hasonló tefeaciklin-szabályozofí, Eas-hgandamet kódoló vektorokkal oltott egetekben heveny hepatitisz alakult ki erőteljes apöptózlssal és bepattanták nékrőzlsával, amit súlyos vérzés és mortalitás kisert a teteaciklin dózisától függő módon 72 órával az oltás elán. A mortalitási arány 48 órán belül elérte a 100%-ot a 3 mg/int vagy több íete&cikh® kapott alcsoportokban. Ezzel ellentétben az összes egér, amelynek AdfeTRÁIL-t adtunk - függetlenül a teteaciklin dózisától - még, mindig életben volt négy hátfel az oltás: salán, EbbSI tehát az következik, hogy te nívó a TRAiL membránköldte termája kevésbé hatásos lüdükáfeéte a itepatöcelteiáris károsodásnak, mint a Fas-ligandmn. Azt is sugallja, hogy a TRA11 olyan mechanizmuson keresztül tedukálhte májkárósodásí, amely különbözik a Eas-hgandmn íoxiciíását okozó raechanizranslől.
12. példa. Az aktíváit humán T-és R-sejtek megnövekedőit: szintes erpresszáümk DRS-irt
Annak meghatározására, hogy a DBS szerepet játszik-e az aktivált T-és B-sejíek TRÁIL-közvetltett ap<sptóz;sáhan, megvizsgáljuk nyugalomban lévő és aktivált T- és B-sejtek felszíni DRő-exprmszióját. A PBMC-hen lévő stimolálatlan humán T-sejtek seat espresszálnak szignifikáns szinte® D®5-öf (14, ábra), 48 órával antí-CD3 vagy Con-A stimuláció után a sejtfelszíni DR5--exprexszio szignifikánsan növekszik, Hasonlóképpen, a stimuláfeilsn B-sejtek nagyon alacsony szinten expresszaliak PR?-öt, A sfiráulácíó asti-p-vel LES nélkül DR5 megnövekedett sejtfelszíni expresszíöját eredményezte. Ezen eredmények azt jelzik, hogy mind az aktivált ϊ-sejíek, mind az aktivált B-sejíek magasabb szinten expresszálhak sejtfelszíni f>RS-öí, A sejteket 2Ü ggánl TRA-8-eaI és PE-aoti-egér-IgOl-gyel festettük.
13, példa. Az aktivált T-és B-sejtek érzékennyé válnak TRA-R-közvetfteíf apííptózlsra
Annak meghatározására,: hogy Az aktivált T- és S-sejtek érzékenyek-e TRA-8-közvefltctt apöpíózbra,: humán EBMC-eredétS T-sejtekét és: S-sejteket sthnulálunk sorrendben soíi~ÜÖ3 vagy nntí-μ ellenanyaggal: 48 órán keresztül te vímo. Az életképes sejteket és proliferáfe blasztsejteket gradiens centritegálússal összegyűjtjük, és tekubáijuk TRA-8 különböző konceníráeiőival. A nem stimulált T-sejtekés B-sejtek nem érzékenyek a TSÁ-8~kÖzvetítert apoptózisra (15, ábra). Az összes .síinmláh T-sejt és 8-sejt közepese® megnövekedőit érzékenységet mutatott TRA-8-közvethelt apoptózisra, és a sejtek SŐTs-a elpusztult a TRA-8-töl éjszakán keresztül: történd tenyésztés után. Az erőse® proiíferáió blasZtsejtek raés érzékenyebbek á TRA-8-kört!etítétí apoptózisra.
A blsszt T-sejtek több mint 70%-a elpusztítható a TRA-Ö-eat A blaszt B-sejtek szintén érzékenyelibek a TRA8-közvetíted apoptózlsra a többiekkel összehasonlítva. Ezen eredmények azt jelzik, hogy az aktíváit T-és Bsejíek érzéke:·'.y a DE5-kozvetítélt apoptózlsra,
H. példa, A TRA-8 kimeríti az aktlválí l'-sejfeket bttmáuiSCRÖ egerekében A TRA-8 irt vmo sníi-T-sejí hatékonyságának meghatározása érdekében NOtoSOD egereket éltünk intravénásán 1 x 18s hümán PRMC-vel, Normálisan a barnán T-sejtek a SÖD egerekben gyorsan aktiválódnak xenogén síimolálás hatására, A humán PBMC/SQD egereket mtraperifnneállsan oltják löt) ug TRA-k-cal vagy kontrol! !gö~vel az átvitel napjától kezdve, naponta ismételve három napsa kérésztől. Öt nappal az átvitel után izoláljak a moaonukieáns sejteket a légből, és festjük azokat antt-hamán-CD3 ellenanyaggal, és a itofsehapopuláelőt kapozznk áranilásí eiíometriás elemzésben, és elemezzük a CDS-pozitív Iramán T-sejfeket, Megközelítőleg a lép-llmlbciták 36%-a tornán T-sejt, mttt-tamán-CIB festéssel mégbatárözvá kontroll egerekben. Azonban csak néhány humán T-sejt (kevesebb, mint 3%) ügyelhető meg a iep-limitoíták között TRA-8-cai kézéit egerekben (lő. ábra). ín sita szövetet vizsgálat kimntátta, hogy a kontrol! egerek Epében a humán Tsejísk újra betelepedtek a lépbe, és csak néhány apoptózisos sejt figyelhető meg TÜNET, festéssel kimutatva. Ezzel ellenfélben az életképes humán T-sejtek u’rabetcíepedese nem ügyelhető meg a TRA-8-cai kezelt egerek, lepebe. inkább sok apoptózisos sejt figyelhető meg ij? ábrát 1 zen eredmények azt m,utalják, hogy a TRA-8nak anií~f~se|í aktivitása van íz; vivő, és jelzik a találmány s/ermti ellenanyagok hasznosságát GVH-beiegség kezelésében
15.. példa. TRA-S rákdtems teáplás akftvRása
15.1 ÖRS expresszié és lunkeíö barnán rákos szövetekben és sejtvonaIákban i) BR5 expresszié feastáa rákos szövetekben TRA-8-at alkalmazó bt xto festéssel.
Annak meghatározására, hogy rákos sejtek ésszóvetek differenciálisán DR5 magasabb szintjét expresszálják-e, tornán rákos szövetek panelját, benne több mint 2ő emlőrákot, Ö petefészekrákot, 5 vastagbélrákot és 5 prosztatarákot festünk TRA-8-eal Immtsthisztokémsa céljára. Ezen rákos szövetek többsége detektálható mennyiségű DRS-öt expresszált. A DR5 expresszlős szintje ezekben a rákos szövetekben különbözött. Általában a rákos szövetek magasabb szinten expresszálfak DR5-öf, mint a nesn rákos szzövefek. Ezenfelül a BRSexpresssaö látszólag nem korrelál a p53 mutációjával.
11) ÖRS expressztó és fösfeeíó barnán rákos sejtvonalakban (X táblázat).
Kilenc, humán emiőrákos sejtvönaiaí, három petefészekrákos vosialat, három vastagbélrákos vonalat és három prosztaíarákes vonalat vizsgálunk DR5 sejtfelszíni expressziójára és érzékenységére TRA-8~kÖzvelftetf apoptózlsra lú viíra. A. 9 emlőrák közül ?, a 3 petefészekrák közül 3, éa 3 vastagbéhák közül 3 és 3 prosztatarák közöl 3 expresszált változó szinten sejlífelszlai DRS-öt. A 9 erolörákos vonal közűi 3 nagyon érzékeny, három közepesem érzékeny és 3 rezisztens ΤΚΑ-8-közvetsteít apoptózlsra. Mindhárom petef'észektrákos vonal nagyon érzékeny. A. három vasfaghélrákes vonal közül egy nagyon érzékeny, míg kellő közepesen érzékeny. A három prosAatarákos vonal közül kettő közepesen érzékeny és egy rezissfens.
2. Táblázat ÖRS expmsziójs és fontolója kaptán rákos sejtekben.
Sej· vonal Eredet Expresszié' Érzékenység-
2I..MP emlő -E -H-í-r
1.CC6 emlő
MB468 emlő AAA
MB23I emlő AA
ZR-75-1 emlő •Λ'·: AA
SLBR3 emlő :........-A
MB453 emlő AA •r
BT474 emlő A -
DY3ŐT2 emlő -
Caov-3 petefészek i -í- 4--44--4- '
OVCAR-3 pete leszek 4-4- t-W'r
Skov-3 petefészek A 4--:-4-
WiOR vastagbél sCsCsl- 4-4-4-4-
1-1ST2Ö vastagbél :............. 4-4- 4-4-4-
TM vastagbél 4-4-
PC3 prosztata AVA IA
LnCap prosztata A 4
Du-145 prosztata T-
Megjegyzések: * áramlási cítonieh-íávai meghatározva, a sejteket 20 gg/ntl TRA-8-eal festjük és kenitoll eilesanyagltoz hasonlítják.5 ,472%;® vizsgálati eljárással meghatárezva.
-H-+4-; 80% feletti sejtpusziulás. -t-B-j, 0-88% közötti seitpuszlulás, «·: 40-60% közötti sejtpuszmlás, Ά 20-40% közötti sejtpusAulás, - nincs seiípüsztulás.
síi) TRA-8 komhíssh cifofosfehása adríamieinnek Számos entlőrákos vonalban megvizsgáljuk az adrtamietn hatását TRA-8-indakált apeptózfera. Adriamiem magas dózisa :additfv halasi mutatott Azonban bizonyos TRA-S-rezlsztens vonalakban adriamicfe alacsony dózisa szmergétikösan fekózza a TRA-S-iudukáit apopíözssL
Ív) TRA-S fe v&ro és vívíí kötőnk tiv Húsa hu mán rákos sejtekhez,
Rudíoizotóppal jelölt TRA-8-at alkalmazunk. Megvizsgáljuk a TRA-8 kötöaktivitását emlőrákos sejtvomiiakhez ót vfern és m .we SC1D egerekben, amelybe -daganatot ihlettünk he. Az tb rúro kötőaktivítás Kdértékét rákos sejtekhez 3 oM-ra becsültük, ami megfelel a korábbi, EUSA-vai becsük értéknek, és legalább 5Θszer magasabb, mint az oldható T RÁIL-é. Jii- *wo a TRA-8 a beültetett daganatsznveíhen helyezkedett el,
15.2, Krónikus limfohiikns leukémia terápiája MM ÁSOD egerekben TRA-h-cai
Krónikus limföiitikus leukémia -(CLL) a B-sejtes rosszindulaté elváltozások gyakori formája. A CLLbeu a legtöbb rosszindulatú B-sejt érett fenoíipusú, és reziszíens számos apoptóaisns Ingerre. Megvizsgáljuk a DR5 expresszióját és funkcióját Öt CLL-es páciensben. Az. összes páciensnek magas volt a perifériás R-sejiszánm, amint azt a több mini 95% CB ló-e B-sejt mutatta a PBMC-ben. A normál elsődleges B-seitekbez hasonlítva az összes páciensben a CLt B-sepeknek magasabb volt á sejtfelszíni ORí-szinde, és érzékenyebbek voltak a TRA-8·indukált gpopiózísra ?>? vfe-o. Érdekes, ltogy a CÉL B-sejték érzékenyek a biszindoimalemtsd-Vill. (BisVIH) áltál indukált citoinxieitásra is. TRA-8 és BlsVUl együttes kezelését köveiden a CLt B-sejfefe közel 50%-a elpusztul, inig a normál B-sejték érzéketlenek maradnak (18. ábra). CLL B-sejfek. átvitele NÖ1.WCÍD egerekbe azt eredményezte, hogy körülbelül 25-30% CD1.94- B-sejt újra betelepült a feefögadó egerek lépébe öt nappal az átvitel után. Azonban i 00 pg TRA-8 három dózisával történő kezelés teljésen eiindnálía a C1..L B41 sejteket öt közül, négy páéiess eseten á befogadó SC1Ö egerek lépéfeen. Ezáltal -a TRÁ-8 önmagában vagy más anyagokkal együtt terápiás szerként hat krónikus lintíoiltlkus lenkémiában,
16, példa, cííMS klónozás
Q) A TRA-8 nehéz és könnyű lánc N-terminálís asnlnosav-szekvesteiájának maghatározása .Annak érdekében, hogy elpáilltsuk a : TRA-8 nehéz és könnyű tánc eDölS-ét, meghatározzuk a TRÁ-R és klónozott TRA-S-gének nehéz és könnyű lánc N-termináhs ammosavvszekvemrtájáí isaiert módszerek altodmazásávsl.
pg TRA-8 rntti-humán-URS ellenanyagot tartalmazó oldatot SDS-políakrrlamtd-géieikíroforésíssel: vizsgálunk f’SDS-PAGE”), 12% w/v gélkonceníráciö és 108 V állandó feszlMíség mellett, 128 percen keresztül. Az efekíroforézis után a gélt traaszfer-pufeérhe áztatjuk (25 ssM Ttis-HGi (pH 9,5), 28% metanol., 8,82% v/v SDSj 5 percen keresztül, Ezen Idő letelte alán a gél felteíjetartalmát előzetesen üaisszaler-puShrbe áztatott pcíhvmslidés-dinoorid membránra (PVÖF-n:embrán;.8,45 um-es pórasméret; Millípöre, Japan) visszük át, blottolö készülék alkalmazásával (KS-8451; Marysol) 18 V állandó feszültség mellett 4°C-oo 14 órán kérésziül.
Ezen kló letelte után a EVDF-meoibránt mossuk mosópufferrei [25 roM NaCl. 18 mM nátrium-borát (pH 8,0)3,. majd festő oldatban festjük (58% v/v metanol, 20% v/v eeetsav és 8,85% w/v Crx«H<xssí« R«7&m Blieé) 5 percen keresztül a febérjecsikok helyének meghatározására. Azután a PVDF-merabrám lestekteienhjük 80% vizes metanollal, és a PVBf-membránor. korábban meghatározón, helyű nehéz láncnak, alacsonyabb mobilitási könnyű láncnak és a magasabb mobilitásé könnyű láncnak megfelelő csikókat kivágjuk, és ioncserélt vízzel mossak.
A nehéz és könnyű tánc N-tenninális ammosav-szekveneláját az Edmsn-téíe automatizált módszerrel határozzuk meg [Edman, P, és rotsai., Eur. J. Biochem. 1,: 68. old. (1967)], gázfázisú Iehérjeszekvenálő készülék alkalmazásával fPRSQ-10; Sltitnsdzu Seisakusyo, K. K.).
A nehéz láncnak megfelelő esik N-terminálís ammosav-szekvenciájái az,: alábbinak határoztuk meg::
Glu-Val-Met-Leu-Val-öÍu-Ser-Giy-Gly-Gíy-Leu-Val-l..ys-Pro-Gly~Giy-Ser-í,eu-Lys-f.ea (4. azönoshószámű szekvencia); és a könnyű láncnak megfelelő N-terminális amírmsav-szekveneíáját az aiabbk cak határoztuk meg;
A.sp--íle-Vai:-Met-'rhr-Ciln-Ser-{|::is-Eys-Phe-Met-Ser-T:br-Ser-V'£d-Gly-Asp-Arg-V:al-SeF (5. mmnositószámú: szekvencia).
Ezen aminosav-szekvenciák összehasonlítása az ellenanyagok amínosav-szekveneiáít tartalmazó adatbázissal [Kábát E.A., és mtsaS:,, Sepuenees of Protein» of Immunologieaí interest Vol, 1! kiad,: U, S, Department of Health and Haman Services: (1991)] feltárta, hogy a TRA-8 nehéz lánca (yl lánc) és a könnyű lánca (k lánc) sorrendben a 3d és f altípusba tartozik.
í2) cDbfS klónozás:
A fenti eredmények, alapján: öllgtmukfeotld-lánclodiíóksí színíetlzálunk, amelyektől az: várható, hogy hlbridizalnának ezen egér altípusokba tartozó gének 5' nem ixanszíálódö régióinak részleteivel és a 3’ transzlálódó régiók legvégével. .Azután a TRA-8 nehéz és könnyű láncát kódoló eDNS-eket klónozzuk reverztranszkripeíó és PCR (RT~FGR) kombinációjával;
a) Teenpiát
A TRA-8 lubndoma (ATCG elérést szám: PTA-1428) össz-RNS-éí extrakáljuk TRAoí reagens (GIBCO BRL) alkabnazásával. A FGR-reakcíó tempójaként alkalmazod cDNS-t Fó-rt-SzoKd cDAH vs-níhísA reagenskészlet {Ámershnm Pharmacia Bíetecb) alkalmazásával álllijok elő, a magenskészleíkez mellékelt kézikönyv uíasnásal szériát.
is) PCR lésre indítók
Az alábbi olígonúkieetid-láncisditókat szintetizáljuk meg a PCR-hez:.
5?-cagcactgaa caeggaecce~3! (H5NCS1: ő. azonosítószámú szekvencia);
5?-aaaggíasd iaítgagaag-3' (H5NCS2: 7. azonosítószámú szekvenc iá); óteetcaceatg aaeítegggjs-S’ (115SS1: .8. azönositószám:» szekvencia);
S'-eígtígtatg eaemgagae-3*015SS2: 9. azonosítószámú szekvencia);
S'-ga&gígalge tggtggagje-3* (RSCS1: 18, azonosítószámú szekvencia);
S'-agtgtgaagí gaigeigglgM' (H5CS2; 1 1. azonosítószámú szekvencia);
S'-tttaceagga gagtgggaga g-3’ (H3CR; 12. azonosllószámú szekvencia);
S'-tgcsgsgaea gtgaecagag- 3 ’ (í-13 V R: 13. azonosiíöszámu szekvencia);
S’-igúeaggae caecatgggc-3' ttSNCSl; 14, azonosítószámú szekvencia);
S’-aagaeaíttt ggáttcíáítc-3' íL5NCS2: 15. azonosítószámú szekvencia);
5’-tatestgaag t«digtatg~3‘ (L5SS1: 16. azonosítószámú szekvencia);
S'-gaíggagaea eaítetcagg-3:! (L5SS2; 17. azonosítószámú szekvencia);
S'-gacatígíga tgaseeagíe-3' (L5CS; 18. azonosítószámú szekvencia);
S'-íí&ae&eíes ttceigttga-3' (L3CR: 19. azonosítószámú szekvencia); és 5'-gaetgggíea teaeaatgíe-3' (LCSÍL 28; ázönosliószátnö szekvencia), .Hacsak másképpen nem adjuk meg, a példákban szereplő összes oligonukleotidot a Ph&rmscíá Siotech céggel szudetizáitaíiuk meg, Az összes oligosökleotsdot -289C-on tároljuk, miután feloldottuk desztillált vízben.
c) P€R-reakció
A PCR-reskcióeiegy összetétele az alábbi: íemplát eDNS, 5 pl a teljes 33 pl reakcióból
1, ián.cinditó, ÍOpmol;
2. láncinditó. iöpmol;
I Ox koncentrált PCR-pufe (a reagenskészlet része), 18 pl; dNTP-k (mindegyik 2,5 snM), 4 pl; és Tag-polsmeráz (Promegak 5 egység.
Steril desztillált vizet adtunk az oldathoz összesen: 180 pl-re. Hacsak másképpen nem adjuk meg, a dNTP-k dATP, dCT P, di.il P és dTTP ekvimoláris keveréke (mindegyik 2,5 mM).
A PCR-reakciót az alábbiak szerint végezzék. Az oldatotelöször 94°G-ra melegítjük 2 percre, ami ntán 94*€-οη 30 másodperc, 52°C-ou i pere és ?2cGve® 3 perc ciklust 48-szer ismételünk, Ezen eljárás befejezése után a reakciós «legyet ?2A2-ra melegítjük 18 percre.
Az Így előállított ampitfikált WS-frsgmenseket 1% agarózgélen választják el, amely 8,25 ug/ml eddlnm-bromídot tartalmaz. Azokat a csíkokat, amelyekről meghatároztuk, hogy a kívánt DRS-fragtnenssfcá tartalmazzák, kivágjuk borotvapengével, és a DNS-t visszanyerjük a öe»e Cfeao reagenskészlettel (R1Ö181), A
ÖNS-feagmenst a pGÖAT Árny vektor (Promega): alkalmazásával klónozzuk meg. Ezt az alábbi módon végezzük.
A PCS. reakció oldalából visszanyert WS-feagrneust 50 ág ρβΕ&ΑΓ ítay vektorral együtt (amely st reageoskészlei része) összekeverjük 1 pl í9x ligáz makeiőpttóerrel jö m,M Tris-HET (pH 7,5), ó mM mxtgaéztum-kioríd, 5 mM sátrium-kíoríd, 1 m:M p-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, I ruM spensudln és 9,1 mg/tnl szarvasmarhs-széramaibumml, amelyhez 4 egység T4 DNS-llgázt {I pl) adtunk. Az elegy össziértógatáí W pl-re állítjuk be steril Ioncserélt vízzel, és a kapod ligáz-oldsiot: 15 órán keresztül mkubáijuk 14uC-ön, Ezen tdS letelte titán 2 pl ligáz reakcióoltaot attak 58 pl kompetens £ ceti JMW9 törzshöz (ami a reagenskészJet része, és a használati utasítás: szerint tettük kompetenssé), amelyhez 2 pl 9,5 M β-merkuptóetanolt adtunk, és a kaptái keveréket jégen tartjuk 39 percen keresztül, majd 42®C-on 39 másodpercen kérésziül, és ismét jégen 5 percen keresztül. Azt kővetően 590 pl, 2% v/v triptont, 8,5% wto élesztőRivonatot, ö,85% Wv rtátrtai-ktoridot, 2,5 mM káiimn-kioridot, 1. mM tnagttozíum-kloridot és 29 tnM glükózt tartalmazó tápközeget (amit a leírásban ezentól „SÖC” lapközegnek. «evezünk) attak a tenyészethez, és az elegyes inkubáljuk 1 órán keresztül 37®C-on súzatássai. Ezen Idd letelte «tán a tenyészet szétosztjuk 1.,-táptalaj agarcsészére [1% v/v inpton, 0,5% w'vélesztókivonat. 9,5% wfe rtálriusn-ktorid, 0,1% w/v glükóz és 0,6% w-v bakio-agstr (Ditco)], amely 189 gg/ml ampieíllint tartalmaz. A csészén megjelettó amptolHin-rez.ssztens kolóniákat kiválasztjuk és platina átvivő kacscsal lekaparjuk, és tenyésztjük 108 pg/ml ampicíilint tartalmazó L-sápközegbett 37°C-on éjszakán keresztül 208 rpm rázatással. Az ihkufeáta után a sejteket centrifagálással begyújtják, és azokból plazmád DNS~t állteuk elő az aikahkns eljárás alkalmazásával, A kapott plazmáim pH62 plaztnidnak nevezzük a TRA-8 nehéz lánc esetében, éspE2S-nák TRA-8 köünyti lánc esetében. Az ezen plazmidokat hordozó .£ ooA íranszlörmánsokai - amelyeket £ rta JM 189/pH62-nek és R <ta )MI09í'pE28-ttak nevezünk - letétbe: helyeztük az „tóternaíional Fatest Orgasüsm Bepositary, biatlonul iosikufe of Advanced Industrlal Science and Technology” Intézetnél (1-1, Higasht 1 chome Tsukuba-shl, íbaraki-ken, 385-54ÓÓ, topán) 2001. április 28-án & xulkroorganízmusők leiéibe helyezéséről szóló Budapesti: Szerződés szermfc, és ezek sorrendben a TEKM BP-7S60 és FERM RE~?56I feléit számot: kapták, A TRA-8 nehéz: és könnyű láncát kódoló ezen DNS-ek nukleotid-szekvesciáját Igazoljuk a dídeoxi módszerrel fSanger, F..S. és mtsaL Proe, Natl. Aead. Sei. USA 74, 5403-5407. old. (197?)], J7&& DÓM Ans^tze?- alkalmazásával yAZAR/SW; Eerkia Elmer Applied Blosystems, .iapan).
A TRA-8 nehéz és könnyű láncának mAleotid-s/ckveneiáját sotrendben: a 21, és 22,; azonosítószámú szekvencián matatjuk be. A TRA-8 nehéz és könnyű láncának anunosav-szekveseiáját sorrendben: a. 23, és 24. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be, A TRA-8 nehéz és könnyű láncának: feni. megállapított H-termmáiís stntnosav-szekvendája tökéletesen illeszkedett. Ezenkívül amikor a nehéz és könnyű lánc autinosavszekvenciák osszehasonhtjuk az ellenanyagok anúnosav-szekvenelálnak adatbázisával, megállapítható, hogy a nehéz lánc esetében a: a 21, azonositószásnü szekvencia 58-414. nukleoísdjai alkotják a variábilis régiót, míg a 415-1392, noktooíiöok alkották az állandó régiót. A könnyű láse esetében a 22. azöttosiíószámö szekvettcia b4~ 38?.. nukfeötidjai alkotják & variábilis régiói, es a 22. azonosítószámú szekvencia 388-702, nukleotldjat alkotják az állandó régiót. A CDR-sk elhelyezkedéséi és szekvenciái; szintén meghatározzuk a höorolőgiák adatbázissal: történő összehasonlításával, A TRA-8 nehéz láncának CDRI. CDR2 és, €Ö:R3 anpuosav- szekvenciáját sorrendben a 25,, 26. és 27. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be. A TRA-8 könnyű láncának CDRi, CDR2 és CDR3 aminosav-szskveneiáját sorrendben a 28., 29, és 30. azonosítószámú szek vencián mutatjuk be,
17, példa. TRA-8 elieaaaysg bsmaxsszáíi változatának tervezése (1) Λ TRA-8 variábilis régiójasrak molekuláris tnodetlezése
A TRA-8 variábilis régiójának molekuláris modellezését az áltáláimsan homológia-nmáellézés óéven ismert eljárással végezzük (Meötöds :n ttóymoiögy 203,121- 1M tóid. (1991)], A humán immunglobulin variábilis régiójának „Protein Data Bank”-bün regisztrált primer szekvenciáját (Nos, Aeid Re? 28, 23^-242. old. <2000», amelynek rönígendílifrakciós vizsgálatokból származó háromdimenziós szerkezete kozzaferhrio, ússzahasonlítjuk a TR.A-8 fent meghatározott vázrégiőivai. Ennek eredményeképpen az IHCH-l és IHiL-t válaszíjak ki, mint amelyeknek a legmagasabb a homológiája sorrendben a 'ERA-8 könnyű és nehéz láncával. A vázrégiók háromdimenziós szerkezetét ágy .boazak létre, hogy kombinátjuk az IbiCD és 1Rll, koordinátáit, amelyek megléteinek a TRA-8 köonyő és nehéz láncának, a,, vázréglö modellt” létrehozva., A Cbefíúa és mlssi. által definiált osztályozás alkalmazásával a TR.A-8 CDR-jeit az alábbi utódon osztályozzuk; a CDRLt,. CORLa, CÖRH; és €DRí<2 sorrendben a 2., Ií.... 3, kanonikus osztályokba tartoznak, míg a €.ÖRL3. nem tartózik semelyik specifikus kanonikus nszíályba sem. A CDRE,, CDRL·, CI'3Rlíb CHRfE CÖR-burkak rögzítjük a megfelelő kanonikus. osztályok inherens konformációjára, és integráljuk a vázrégió modellbe, A. CDRLyot a 8A konformációs klaszterbe soroljuk be, Thomtón és mtsai, osztályozása alapján: p, Mól. Riói, 263, 8ÖÖ-RI5. old. (1996)], és a ÖÖRH3-at a k.(8j.C-he: osztályozzuk a F13~szabály alapján (FESS kehers 455, 1:88-197. oki. I1999}). A CDRLS és CDRHj reprezentatív konformációit integráljuk a yázrégtó modellbe,
Végezetül energiaszámllásokaí végzünk, hogy elimínőjjak a kedvezőtlen atootók-közöttí érintkezéseket, annak érdekében, hogy a TRA-8: variábilis régiójának valószínű molekuláris modelljét előállítsuk az energia tekintetében, A fenti eljárást kereskedelmi forgalomban kapható molekuláris modellező rendszer, az ASM (Oxford Molectiiar Limited, Inc.) alkalmazásával hajtják végre. A kapott molekuláris modell pttassságáí tovább elemezzük a FROCHECK szöRver (I Appl. Cryst. 26,283-291, old. (1993)] alkalmazásával, (2) Humanizált TRA-8 atnmosav-szekveneláinak megtervezése
A humanizált TRA-8 ellenanyagok előállítását az általánosan „CDR-gradlng” néven Ismert eljárással végezzük (Proe, Kati, Acad. Scl. HSA 86, 19029-11)933. old.. (í9891j. Az akceptor ellenanyagot a vázrégiőhan található homológja; alapján váalsrijnk ki. A TRÁ-8 vázrégiőjának szekvenciáját összehasonlítjuk az ellenanyagok ainínosav-szekvenciájának Kabar-féle adatbázisában lévő összes tanán vázrégió-szekvenciával {fiúd. Add Rés. 29) 29S-2Ö6. old. (29ÖI)],. Ennek eredményeképpen a roABóS'CL ellenanyagot választjuk ki akeeptornak, mivel ennek, van a legmagasabb. 8Ö% szekveue:ia.-bosiolőgiáia a. vázrégiőban. A mAfeák’CL vázrégiójának aminösav-oláallúneail: egymás alá rendezzük a TRA-8-éval, és. azonosítjuk azokat a pozíciókat, ahol különböző ainíaosavuk találhatók. Ezen oldalláncok elhelyezkedéséi elemezzak a TRA-8 font létrehozott háromdimenziós szerkezeiének alkalmazásával, és azokat: a donor oldalláncúkat amelyeket az akeeptorra át kell ültetni, kiválasztjuk a Queen és sntsal. által adott kriíéitaaök alapján jtaoe. Hall. Acad, Sct. USA 86, 10029-19933. old. <1989jj. A humanizált TRA-8 szekvenciákat a következő példa szerint álliíjokelö számos donor amtasav átvitelével a mÁbőd'CL akceptor ellenanyagra.
18, példa. Exprcsszíós vektor előállítása a humanizál! ellenanyag nehéz láncával (1) Humanizált TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját hordozó plazmád előállítása
Annak érdekében, hogy meghatározzuk a humanizált TRA-S okavilását, a: humapizáll: TRA-8 nehéz láncának, variábilis régióját hordozó plsztóidoi állítottak elő az alábbiak szerint. Azonban nyilvánvaló, hogy a TRA-8 humanizálása nem korlátozódik ezekre a példákra.
Amint s 31. azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér anti-immán~ÖR5 ellenanyag könynyú lánca amísosav-szekveneiájának a taaatóáiás& során a 13. asnnösavaí Uízbó. a 19. ausmossvat (&»)» a 40,. ammosiivat (treonsn), a.42, amínosavat (glatammsav), a 44, asimos&vat tárgyún), a 84. aminosavat (szórlak a 88, asnlnosavat (szerin), a 93. antinosavat (metionin) ésa 114. ammosavat itíconln), a 1 í > amínosavat (.leucitO kicseréljük sorrendben: gíutamín, argínin, alsóin, glieln, glieln, aszparagin, alanin, valin, lencse és vasié amínosavakra.
A bnmanizáil TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját (31, azenositószásná szekvencia) kódoló DNS-t hordozó phznútfoí az alábbiak szerint állítj ak elő.
PCR-t alkalmaznakazalábbi DNS-szekvenciák eidúllhására, amelyek mindegyikét fent ismertetjük:
Az alábbi 12 olígöímkleotidof szístetizáljnk meg:
SMíggaíaagc rtggcttgac ctcaccaígg. gatggágctg taícáíeéte úeltggisg eaacagcíae aggtgiecae-3' (A; 32. azonosítószámú szekvencia);
5-tcígaagtaa ígetgglgga gfctggggga ggettagtae agectggagg gfeecígaga eieteetgtg cagcetetggB’ iB; 33. azonosítószámú szekvencia);
5-attcaetttc agtagttatg taaígtctlg ggtlcggcag geaccaggga agggíctgga gtgggítgea aceattagta-Ó1 (€; 34. azonosítószámú szekvencia).;
5’-gtggtggfag líacaectae íatceagaea: gtgtgaaggg eegrtíesee atetceagag acaatgecaa gaoeacectg-A’ (D; 35, gzonosltőszámú szekvencia);
S’dstctgcsaa tgaacsgieí gagagcagag gaeaeggctg tltatíaetg tgcaagaagg ggtgaetcta ígaúacgac-3’ (E; 36, aztmoslíószfesú szekvencia):;
V-geactacígg ggtxsaggga ccciggteac agíctcctca gcctc cacc aagggcceat cggtc-3’ (F; 37. azonosítószámú szekvencia!,
S'-etacéáagaa gaggalgata cageíecaíc eeategtgag gtcaagccaa geúatccaa -3’ (G; 38, azonosúdszátaó szekvencia);
S’-íeíengggac ectecaggct -^actaagcc- tcecceagac iceaecagea ttaetreaga gtggaeaect gtagctgttg-3' (H; 39. azonosítószámú szekvencia);
5-tccagsecct feeelggtge etgccgaacc caagacatíá esfaaeíaeí gaaagfgaaí ceagaggcíg. eacággagsg-3’ (í; 40. azonosítószámú szekvencia);
5-cietggagat ggígaategg eecttcacae: tgtclggata gtaggtgtaa ctaccaceac bctaaíggt ígeaaceeae-3’ (3; 41.. azmmsiföszámú szekvencia),
S'-eeúetfgea eagtaaíana eageegtgrc cfctgcteíc agacígííea tbgcagata cagggtgítc: tlggcaSígt-S' (K; 42. azonosítószámú szekvencia):; és á'-gacegatggg ceettggígg aggetgagga gactgfgaec agggíeectl ggccecagia gteegtegta atcaíagagí caec-3' (k; 43. azonosítószámú szekvencia).
Az alábbi: 2 PCR-Íáneisditóí megszmíetizái jok a fentiek szériák SMtggalaage ttggeftgae-3' (Pl; 44. azonosítószámú. szekvencia); és S'-gaccgatggg, eectíggígg a-3‘ (P2; 45. azonosítószámú szekvencia).
~ 46 ~
Szekréciós szignáiszekveneiál,: TRÁ-8 nehéz fene variábilis régióját év az IgG-GHi régió Nteonhtábsán levő 8 ummosav-öldalláneot tartabnazó polípeptidláneot hódoló DNS szintézisét PCR-ek kombinádójának slkabnázásával hajtjuk vőgte,
A DNS-fragmenst az alábbiak szerint állitjuk elő.
A PCR-reakclÖeiegy összetétele az alábbi;
A jelű oligonokieotid, 18 porol;
jelé olígonukleotid, iöpmob
C jelű olignnukleotid, 10 pmoi;
D jelű olígonukleo-id, 10 pmci:
Éjeié Cíligennkleotid, 10 porol;
F jelű oligooukiemid, 10 pmob
G jelű oligonnkleotíd, 10 pmoi;
Kjein oligonokieotid, I0 porol;
jelű elígontskleotid, 18 porol;
J jelű oligonokieotid, ló porol;
K jelű olígöouklecstid, 18 porol;
L jelű oligonukleotid, 10 pmel;.
FI jelű öligomAleodd-láncindóő, 2 pM;
PRjpiű öligörmkfeötíd-láociodíiő, 2 pM;. löx /br.w;; bsger //, 18 pb dNTP keverék, 8 pl;
/>rwóe.$z DNS-poiioreráz, 0,5 pb és desztillált víz 58 pi vegtérfogsfrs.
A PCR-reakeiót az alábbiak szerint végezzük, Az oldatot először 94':'€-ra melegítjük 5 percre, ami után FSÁf-on 18 másodpere. 55eC-oa 30 orásodpere és ?2°C-on 1 pere crkfest:7-szer lsméíelüsk.:£zen eljárás befejezése után a reakciós elegye! ?2°€-ra melegítjük 15 percre.
Azonos térfogatú fenol-kloroform oldatot (58% v/v vízzel telített fenol, 48% v/v kloroform, 2% v/v tzoamü-alkohol) adnpk 200 pl PCR-termékbez, és erőteljesen keverjük 1 percen keresztül. Ezen idő letelte után a keveréket feeeoírifogáljttfc 10000 x g-vci, és a vizes rétegei visszanyerjük és összekeverjük azonos térfogatú kloröform-ízoamil-alkobollal (9ö% v/v kloroform és 4% v/v ízssamd-afkohol). ismét erőteljesen, és centrifugáljak 10888 x g-vel, és a vizes réteget visszanyerjük. Ást ebben a bekezdés ben felsorolt lépéseket a leírásban ezentúl „fonolos sxtrakclóoak” nevezzük.
Azután etánolos kicsapást bájtunk végre a visszanyert v<zes réteggel. A leírás szerinti értelemben az „etánölox kicsapás” sotek a kezelendő öldaíhozogytized térfogaim t 3 M oá.triunr-ae«tátt>t (pH 5,2) és 2,5 tér?©gatnyl 180%: elánok adunk, és. leíágyssztjuk a keveréke' szárazjég alkalmazásával, A kapott keveréket azután leeentrifogáfjuk 18088 x g-vel a DNS csapadékban történő visszanyerése érdekében.
A fonolös extrakclö és etánolos kicsapás níán. a kapott DNS-csapadékoívakoumban szárit jók, feloldjuk minimális térfogatú desztillált vízben, és 3% agarózgéi-efeRiroforézissei elválasztjuk. Az elektmferézis után a gélt 1 pg/ml etrdram-bromrd vizes oldatával festjük., hogy lelsefové tegyük a DNS festését ÖV-feoybes, A homsoÉsált: TRA-8 DNS-nek megfelelő DNS-esíkot pengével kivágjuk, és eluáljok a gélből Í/wc/cok őpfe Rő (8)0 101, CA, USA) alkalroazásával. Tenulos extrakció után az sluáit ÖNS-í eeniRfogálássaikoncentráljak 7500 x g-n, majd etanollal kicsapjrík, és végül feloldjuk 5 pl desztillál!; vízben.
Az egyes kapott DNS-feaginenseket apíMAATSw vektor (Fromega) alkalmazáséval klónozzuk uz alábbiak szerint:
A PCR-reakcióböl kapót! DN:S-frsgme»s,5 μ 1;
KA Taq-po.limetúz paífer, 1 pl; dMTR keverék, /1 gl;
Taq-pollroeráz <5 egységAnl), 1 pl; és desztillált víz 10 pl véglérfbgatra.
Azután mindegyik fenti oldatot 70-C-w reagáltatjok 3ö percen kérésztől, és mindegyik oldatot és pG&M-T £usy vektort ligáluuk: a OAfe Alga/rón A7r Version 2,8 ('Fakara Sfeazo Ca, Ltd.) alkalmazásával a gyárid niasllásait követve.
óra róknbálás után ISTUon, 2 pl inkubált reakcióelegyet összekeverünk 100 pl kompetens £. coA JMI09 törzzsel 1-2 x 10* sejbml sejtsürilség melled (Takara Sfri/o Co., Ltd ), és az elegye; jégen tartjuk 30 percen keresztül, azutar -=2\~-on lő másodpereim keresztül, es ismét jégén 1 percen kérésziül, Azután 500 pl SOC-tápközeget <2% v v inpton, 0,5% n s élesztők n emu. 0,05% wv natnum-kíortd, 2,5 mM kálíum-klorid, 1 mM rsagnéziaovklond es 20 mM glükózt adunk a ke vérekhez, amelyet további egy órán keresztül mknbáltmk rázalás mellett. Azután transzformáns törzseket izolálónk, es píazmid DNS-t állítunk elő a törzsekből, amint tuti 'Molecslar Cloníng A Láboratory Maaual” cunü könyv leírja. A humanizált TRA-8 nehéz; láncát kódoló ezen DNS-ék nukleutid-szekvenciájáí igazoljuk a dideoxi módszerrel fSanger, f..&, és mísat, Prec. Mail. Acad. Seb USA 74, 5463-5467, old. (1977)], 5700 UAM Án&iyzer alkalmazásával (.-1A7 mW; Perlíis Elmer Applied Riosysisms, .lapun).
A kapott plazmidot pílSí4-oek nevezzük <a fearnariizák TRA-8 nehéz láncát kódoló eDNS-t hordozó plazrold). Az ezen ohzmidot hordozó £ coli ír&nszíermánstamelyet E. col? 3MI09/pHB 14-nek nevezünk ··· letétbe helyeztük az „inísrnuíional Patent ürganisro Deposítary, National lustámé of Advanced Indnstrial Science and Techmslogy” intézetnél (1-1, Higasht 1 chome Tsukuha-shi, íbaraki-ken, 305-5466, .Ispán) 2003. április 20-án u mikroorganizmusok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a.FERM BP-7556 letéti szántót kapta, (2) Humanizált TRa-8 nehéz láncának variábilis régióját hordozó cspressziös pbzmídek előállílássr
Állati sejtekben alkalmazható rekombmáns. expressziós vektorokat állítunk elő a humanizált TRA-8 nehéz láncát kódoló DNS inzertálásával (amit fent klónoztunk) az alábbiak szerint.
pg pSRHRHS plazroids.4 (EP 0-909-SIó-A l száron európai szabadalmi bejelentés), amely a REE7A humanizált aati-Fas monoklosális ellenanyag; variábilis régióját és humán Igöl állandó régiójának genonuális DNS-ér tartalmazó, -emlős sejtekben alkalmazható expressziós vektor, emésztünk Hindi)! és Apui restrikciós enzimekkel, és elválasztjuk: 3% agaróz-géleiekh’oferézissel. Az eíektroferezis után a gólt 1 pg/rol etidimtíbromid vizes oldatával festjük, hogy lehelévé tegyük a DNS festését ÜV-fénybea, A humán Igöl állandó fegiójáttak genömiális DNS-ét a HFE7Á humanizált anti-Fas ntonokiunáils ellenanyag nehéz lánc variábilis régiója nélkül tartalmazó vektort kivágjuk pengével, és editáljuk a gélből a Geneoíenn Apó? Á7í (BIO 101, CA, USA) alkalmazásával, Fenolos extrakelő után az eluáit DNS-t azután centrlíugálássaf koncentráljuk 7500 x g-n5 majd etaaollal kicsapjuk, és végül feloldjak 5 pl desztillált vízben, és azmán áefeszforiléljnk C1R alkalmazásával, A kapott esnészíefí, defoszferiláb. plazmidot (1ÖÖ ng's «gátjuk 1 pg píffií4 ÖNS-fragnsenssei, amely tartahnazza a homsmzálí :'TRA-8 nehéz tánc variábilis: régiót kódoló DNS-g szintén emésztve Hindiit és Apát restríkeiós enzimekkel, a ZM-í Tlgusw Á7? ítensfen 2,9 (Takara Shuzo Ltd.) alkalmazásával. A hgáeiós «legyet aztstán & cőA 3M1Ő9 sejtek transzformálására alkalmazzuk, amit azután Só pg/ml ampieblhn tartalmazó LB-agar csészékre széfesztünk.
Az ezzel az eljárással előáll ltod iranszlormánsokat 2 ml, 5Ó pgiud ampicil Unt tartalmazó folyékony LS-tápközeghsn tenyésztjük éjszakán keresztül, és azt kővetően ptazmid DNS-t extrakáluak a kapott tenyészetből az alkalíkus-SfeS eljárással,·
A kapott ptezmid D'NS-t emésztjük Hindiit és Apai enzimekkel, és 3%: agaróz~géletekwforézissel elválasztjuk, hogy igazoljuk a hmmmizáh TRA-8 nehéz lánc vnríóhlhs régióját kódoló DNS-inzert jelenlétet vagy hiányát. A kívánt DffS-feagmens vektofbeli Inzerclóját és irányítottságát DNS-szekvenálássai igazoljuk génszekvétóa analizátor alkalmazásával (ASZ JTOí 3IW ZWA Aíímfer; Applied Blosysteíus). A kapott expressziós plazmldoí, amely a humanizált TRA-8 nehéz láncát kódoló ClTHS-t hordozza, pW14~ Írnek nevezzük.
19. példa. Espresszíós vektor előállítása a hatóanhált ellenanyag könnyű láncával (f) A TRA-8 ellenanyag hunmnízálí változatainak könnyű láncait kódoló vektorok előállítása
Amint adó. azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér anii-humán-l)R5 ellenanyag könynyü lánca aminosav-szekveneiájának a humanizálása során a TRA-8 könnyű láncának N-íenninálisától számítva a 8: amlnosavat (hlsztidin}, a 9, amlnosavat (lizln), a lő, runmosav&t f fenllntanin). a i 1. ammosav&t («setionink a 13. aminosavnt (treomní, a 3ö. amlnosavat (szerin), a 42. amlnosavat (glm&min). a 43. amlnosavat (szerin), a óö. amlnosavat (aszparag'msav), a 63. aromosavai ítreoróf·), a 77. aminosavat (aszparagin), a 78, aminosavat (valís), &80, aminosavat (széria) a 83. amlnosavat ileucin). a 85. amlnosavat (aszpuruginsuv), a 87. amlnosavat (fenílaiamn) ás a 99. aminosavat (ghein), a 103, aminosavat (lencin) és a 108. amlnosavat íal&aín) helyenesítettük sorrendben prolin, szerin, szerin, leueín, atansn, treoarn, llzüg alanin, szerín, szerb, szerin, leuein, prolin, feniblan in, treonln, f jrozin, glutamírs, v&lín és teeonln ammosavakted. A kapott székveneláf LM2-uek nevezzük.
A TRA-8 aníi~hwán-DR5 ellenanyag ilyen tipnsó humanizált könnyű lánc mnurosav-szekveaeláit hordozó espressziős vektorokat az alábbiak szerint állítjuk elő,
1} Humanizált TRA-8 könnyű lánc variábilis és állandó régióinak előállítására alkalom lándndltők szintézise
Az LM2 pölipeptidláneoí (4ó. azooesítószámá szekvencia) - amely a TRA-8 humanizált anti-DRS ellenanyag variábilis régiójának és » humán lg könnyű láncának (s lánc) fúziója - kódoló DiNS-t FCR-ek kombinációjával szintetizáljuk meg.
A 7ALI.ÍM (47. azonosítószámú: szekvencia) és 7ALCM (48. uzonnsitőszámá: szekvencia) mellett az alábbi ötigonakteoiid láacmditókat szintetizáljak meg a RGR-hez:
ö'-gteccccaca gstgcagaca aagaaettgg sgsttgggic steaeaaígt eaecagtgga -T (HESERI1; 49. azonosítószámú szekvencia);
S’meaagiteft tgteigc&tc agtnggagae agggtcacca tcacctge-3’ (HteGÖFl I; 5ö. azonoshószánm szekvencia);
5'-sgígígecgg gtggatgccc agtaaatcag: tagrtíagga gcttíeectg gtítetg-3’ (OKCD812; 51, azonosítószáaió szekvencia);
ó'-tgggeatcca eccggcncac tggggtccca agcaggttta giggeagt-3' (HRGDF22; 52. azonosítószámú szekvencia);:
S'-ataaeíaeía tattgetgac agtaataggí tgeaaaatee tecggeígea gaetagagat ggt-3’ (DRCDR22; 53. azonosítószámú szekvencia); és
S'-eagcaaíata geageíateg gaegtíeggí eaaggeaeea aggígganat cnaacggaet gtg-5’ (ílRCk 12; 54. szonosltőszámú szekvencia),
2) A pCR3.S/M2-l pfezmkt előállítása (hmuasdzált TRÁ-k könnyű tánc klónozása)
Az 55. azonosítószámú szekvencia szerinti LM2 DMS-&agroe«st( amely a 46. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciát kódolta, kétlepéses PCM-rel állítjuk elő, plazmái vektorba ínzertáljuk, és £. ooA-ban: klónozzuk,
a) Gfeti FGR-lépés
Az LM2-FI DNS-lragmenst, amely szekréciós szígsálszekveneiát. és FRLreégiöt kódol líindlll restrikciós enzim hasítási hellyel: az 5’ véghez adva, az alábbi körülmények között állítják elő. A pBSQHMl? és pSRFDHH terápiát plazmidoí; az EF 09Ö9816 Ál. számú európai szabadalmi bejelentés leírása alapján áOájuk elő.
A reakcióeiegy Összetétele az alábbi;
pHSÖHMl? plazmái DNS (8P 0909816 Al. számú európai szabadalmi bejelentés), 25 ng 7A1,1P ölígonukleoíid-láncínditö, 50 pmol KRSFR1Í oligontikleotidriáneínditö, 50 pírtól 5NTP koktél, 5 pl
10xFGR-ppffer, 5 pl a«pA.'rö^,DN$-polmieráz (Perkin Elmer), 2,5 egység
A fenti összetételű reakeiőelegyet .50 pl vegtérfbgaíra állójuk be desztillált vtz hozzáadásával, és ECRben alkalmazzuk.
A PGR termális köritlményei: melegítés 94cC-en 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 alkalommal: Od^C-on I pere, 55”C-on I perc és'72°C-ea 2 perc, majd melegítjük ?2°C-on 10 percen keresztül.
Az FRL j egy részletét, CDREi-et, ERU-t és GÖRU4 kódoló l,M2 DNS-íragnrenst az alábbi körtílroónyek között állítjuk elő.
A reakcióeiegy Összetétele az. alábbi:
pL28 plazmid.DNS, 25 ng
BKCDÍ-l 1 oligonukleoííd-Sneindlíó, 50 pmol
HKCDRI2 öligooukleotid-iánclndító, 50 pmol «1Ν ΓΡ koktél, 5 pl
Ox PCR-puriér, 5 pl norpOTag DNS-polimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakelóelegyet 50 pl végíertbgatrn állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRben alkalmazzuk..
Sö
A FCR sermális körülményei: OKilegites 94’'€-ηη 2 percig, ami után az alábbi ciklust Ismételjük 38 alkalommal: 9‘R C-on i pere, 55nC-on: 1 perc és 72öC-on 2 pere, majd melegítjük ?2aC-on 10 percen keresztül
A CDRL2-ts i-'Rl,;-;it és az FRts egy részletét kéboiö LM2-T3 DNS-fragtuerföl az alábbi körülmények közölt álöljek elő.
A reakcióelegy összetétele az alábbi:
pSRRDldH plazmidDbiS (EP 090981 fi A!. számé: eerőpal szabadalmi bejelentés), 25 ng
HRCDF22 oiigonukleotld-láncmdltó, 59 pmol
HRCDR22 öligösokleoíid-láneiodlíó, 58 pmol dNTP koktél, 5 pl 1 Ox FCR -pnffer. S pl empATdö DNS-polimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióelegyet 50 pl végíérlbgnlra állítjuk be desztillált: víz hozzáadásával, és PCRben aikateazzuk.
A OCR mrmális körülményei: melegítés 9-4:-C-ori 2 percig, ami mán az alábbi ciklust ismételjük 39 ab kátémmal: :M°C-9n 1 pere, 55°C-on 1 perc és ?23>on 2 pere, mjd melegítjük 72aC-ntt 1.9 percen keresztül.
A GDRLrat, FRRj-eí és az átadó régiói a 3' végen egy BcoR.1 restrikciós: enzim hasítási hellyel együtt tartalmazó LM2-F4 BNS-fragmenst az alábbi körülmények közön áll iíj ük elő..
A reakcióelegy összetétele az alábbi:
pSRílöHii ptnzmld DNS, 25 ng
KKCb 12 nligormfeleoíjd-iáncmditó, 50 pmol
7ÁLCN oligosnkleeíid-iárscinditó, 50 pmol dNTP koktél, 5 pl i Ox PGR-pnffer, 5 pl umídíTi^ DNS-poiimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióelegyet: 59 pl érlbgairn átlkpsk he desztillált: víz hozzáadásával, és PCR-hen alkalmazzak.
A PCR lermális körülményei: melegítés. 94aC~ou 2 percig, ami ötén az alábbi ciklust: ismételjék 30 alkalommal:: 94°C-eo 1 pere, 55°C-on t perc ésTS^C-oa 2 pere, majd melegítjük 18 perces keresztül
Az ampiliikált DNS-ftagmensekei a PCR más .5% pöhakritamid-géiefektrofei-ézssssl választjuk sl. A gélt az elektrotbrézis után 1 gg/ml etídium-hromiddai festjük az előállított: DNS W~lüny alatti detektálásához. Az Így detektált megfelelő fiNS-esikokat pengével kivágjak.
bi Második FCR-lépés
Az 1..M2-.ÖNSA, amelyben a lent leírt bM'2-FÍ-DNS, LM2-F2-DNS, LM2-F3-DNS és I..M2-F4-DNS hsgmensek fuzionálíaíva varinak, az alábbi körülmények között álilijsh elő.
A reakéiőeiégy összetétele az alábbi:
Azeisö PCR-lépésben előállított LR12-F1-DNS gélífagmense,
Az első PCR-lépésben előállított LM2-F2-DNS gélfragmense.
Az első FCR-lépésben előállított LM2-F3-D:NS gclfragmensc,
Az első: PCR-lópésbeo előállítóit LM2-F4-DNS gélffsgmense
7AL1P oligomskleeSid-láneiriditö, 59 pmol
- 3 ί ~
7AÍ..CN öhgonukleöfsd-láneindhó, 58 pmol dNTF koktél, 5,8 pl ίί)χΡ€Κ~?οΠΝ·,5,0μί nmpbAssp DNS-poltméráz, 2,5 egység
A fenti Összetételű reakcióeiégyeí 50 pl végiérfogatra állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és 'FCRbeh alkalmazzuk.
A FCR termák» körülményei:: melegítés 94°C:-ou 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 38 ab kálontmal: 94öC-<m 1 pere, 5:5''C“öo 1 perc és 72X-on 2 perc, majd melegítjük 72°C-en 18 percen keresztül.
Az,Így előállított UM2 ΒΝ'5-iragmsnrt a pCR3,í plazmidha inzertüljuk Abfea/yorte Jfe efomrtg O (fovifeogen) alkalmazásával: a gyártó utasításait követve, és bejuttatjuk a reagenskészlefben lévő kompetens E. e&ii TGP1.ÖF sejtekbe. A humanizált TRA-8 könnyű láncát kódoló ezen DNS-ek nukteotid-szekveneiáját igazoljuk a dideoxí módszerrel (Sanger, E.S. és mtsaí., Froc. Nad. Aead. Sci. USA 74, 5463-5467, old. (1977)), 37&0 &ÍA A^íífyzer alkalmazásával (rtAÍ'TRíSAű Feriin kimer Applied Biosvsíems, Japas).
A kapott plazmiífek&t pCR3,líM2-1-nek nevezzük (a humanizált TRA-8- könnyű lánc variábilis régióját és humán lg könnyű lánc állandó régióját kódoló cDNS-t hordozó plazmid}.
Az 1,M2 DHS-feagmcsst tartalmazó pCRX 1/M2-1 plazmidot emésztjük Hindii! és EeoR.1 resírikeiös enzimekkel, pg pHSO399 klónozó plazmid DNS4 emésztünk Hindii! és FeeRl restrikciós enzimekkel, és azután íiefeszforíláljnk ClF-pel. A kapott defoszfenlait pHSG399 DNS A és a Hindii! és EcoRÍ restrikciós enzimekkel emésztett LM2 DNS-Ragmenst ősszeligáljuk a ÖA.4 Dgm/οκ R.u Femio»· 2,0 (Takam Shuzp Co,,1<) alkalmazásával. Azután A eéA D:H5tx sajtokéi transzformálunk a ligáit DNS-sei, és 8,1 mM IFTO-ζ 0,1% X-öal-t és 58 pg/nrt kloramfemkölt tartalmazó IB-agar tápközégm sxéleszfjük (végkoneenirációk), A kapott fehér transzformáűsökat 58 pgűuí kloramfenikoít tartalmazó folyékony LB-iágközegbes tenyésztjük, és plazmád DNS-t estrshálunk a kapott tenyészetekből az alkalikus-SDS eljárás szerint. Az extrahált plazmid DNS-t emésztjük Hindid! és DeoR? enzlmekkek és azután kiválasztunk egy LM2: DMS-íragínenst hordozó kiónt Sós agarózgéleiektroforézssxeL
A fenti eljárás eredményeképpen elóálihjuk a humanizált LM2 TR.A-8 könnyű lánc variábilis, régióját és komán IgR lánc állandó régióját tartalmazó fúziós fotgmensf hordozó pHS<j/M2-!-4 piaznűdot. Az: ezen plazmidöi hordozó £1 c&E transzfermáns! - amelyet £ veri DH5fepHSG7M2-l-4-nek nevezünk - letétbe helyeztük az ^International Patent Örgamsm Deposh&ry, Natksnai Inssltuíe of Advanced fodustrial Scienee and Teehnoíogy” Intézetnél (1-1, Hígasló I eltörne Tsnkuha-sbi, íbsraki-ken, 305-5466, foganj 2801. április 20-án a ntlkroorganizamsok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a FERM BP-7S53 letéti: számot kapta,
3) A p8R/M2-í pfezmid előállítása (humanizált LM2 TRA-8 könnyű láncot kódoló espresszsós ptozsnid)
A humanizált LM2 TRA-k könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját öataltnszó hmiós foagmenst hordozó: :pHSG/A!2-1-4 piazmidoi emésztjük Hindii! és BeöRÍ(restrikciós enzimekkel.
pg pSRPDHH piamid DNS-t (EP 0909816 Al. számá európai szabadalmi bejelentés) emésztünk Híndtll ás BeföRI restrikciós enzimekkel, és azután defoszforiláljuk CIF-pek A kapott defoszferllált pSRFDHH DNS-t és a pilisG/W I -4 plazmldból előállítóit Hlndlil-bcoRl DNS-foagroenst összeligáljuk a £>AÍ4 áignífos
O f erskm 2.8'(Tákars Shuza Co,, Imi) alltalmazásáyah Azután £ ceü DH5« sejteket teanszlörmáhrnk a ligák DőlS-sel és LB-ngarj-a széieszíjtfc A kepeittránszfornferísokat 100 pgAni ampiciillnt tartsümazö folyékony LB-. tápközegbes teyámjak, és plazmiö DNS-t exirafeáhmk a kapott tenyészetekből az alkalikus-SDS eljms Hat A pSREDHB vektorban lévő kiváni DNS-feagmens mzercióját és irányítottságát DfeS-szekvcrsélással igaXöfoik génszekvencfe analizátor alkalmazásával (H Aí J 7őtí DNá Anctfyzsr, Appi led: 8 lösysiems).
A kapott expressziős plazmidot, amely a humanizált: TRA-g könnyű láncát kódoló eDMS-i hordozza, pSR.M2-l-nek: nevezzük.
20. példa. Humanizált ellenanyag előállítású
CÖS-7 sejtek (majomveséböl származó sejtvonal) íransztekiáiásáí: a. fent előállítóit humanizált TRA-S nehéz láncot és humanizált YRA-& könnyű láncot kódoló cxpresszíös vektorokkal e Ft/GEfoEő transzfekelós reagens eljárással (Boehrlnger Mannheim Bioehemfea): végezzük a reagensfcészleíhez mellékeit kézikönyv utasításai szerint.
CÖS-7 sejteket (.Aosffcan Type Cukoré Cöíleeders, CRL-lőSl) télig összefolyt állapotig növesztünk (3 v ItÖ sejt e.iés/e) tenyésztő csészében fienyesztCM telidet' S'7 on\ Snimtomo Bakelitek amely ÓAnőect.o'', áfonWd £óyfo ,Wm&« lápközege? lartahnaz (amit a leírásban ezentúl J'J-MEM”-nek nevezünk; űibco BRL\ kiegészítve 10% magzati böijuszérumtnal urna a icfeisbun ezentúl J is nek nevezünk. Moregateí közben 18 pg/esésze (összesen 5 csésze) humanizált i.)R5 nehéz lánc expressziős plazmid DbíS-t (pHAlS-i) és 10 pg'csésze humanizált DR5 könnyít lánc expressziós plazmid DNS-t (amelyeket az aikalikusSDS eljárással és cemum-klorid sűrúséggradiens centn fixálással állítottunk elő) összekeverünk, és azután elánodat kicsapunk, majd felszuszpendálimk 5 μΙ/csésze desztillált vízben.
Miután 15 pkesésze F£A3£zVAö transzfekciős reagenst összekeverünk kSQ pl/esesze FGS nélküli B~ MÉM íápközeggei, ezt a Fó/GEfoC-oidatof (1S5 μΙ/csésze) összekeverjük 5 pl/csésze DNS-okfettal, amely 16 ggfesésze humanizált ÖRS nehéz lánc expressziós plszmiá D:NS-i és 10 pg/esésze humanizált DBA könnyű fene expressziős plazrmd DNS-t tartalmaz. 15 pere szobahőmérsékleten történő inkabálás «ián a. kapott plazmidsznszpenzíőt (298 pl) Imzzásdjnk a korábban előkészített CÖS-7-lemezekhez. 24 órás 5% CO-j-ben 37öC-on történő ánkubálás után a tenyésztő iápközege- íeeseféljük FCS nélküli D-MEM Sápközegre. 72 őrás 5% Cö2~ben 37A2-OR történő ínkübálás után a tenyészet télídúszOjaí visszanyerjük a feíülűszöbaí? lévő expressziós teimékekt tisztítása végett. Ezzel a fent leírt módszerrel COS-? sejteket íranszfekíáhmk az alábbi: plazmid-kírtombináciák mindegyikével:
(A): nincs plazmád DNS i B): pHBI4-· és pSR/M2-l együttes íranszfoktálása
A tenyészetet azután leesnírttngáljuk (180Θ rpm, 5 perc), és a felőiászőt összegyűjtjük. A felslüszét ismét eentrtfogáliuk (W9@ rpm, IS pereh és sztrjük 0;>45 pm-es szűrőn (ADVANTEC TOYO ÖÍSMÍC-25cs, Cat# 25CS045 AS)„ Á szőrietekből az: IgG tisztítását Fromfo ű-F(.W2$ áfiínitásí kromaíográfia (Applied Blosystcorsj alkalmazásávíd végezzük: az alábbi: körülmények között:
BPLC: BioC AD 7ÜŐE (Applied Blosysíems) oszlop; ArommG-íö s&otör <mrő7í/ge (osziopméret; 2,1 mm ID x 30 mm ED, tölfodérfoga?;: 0,1 ml; Cafo 2-1002-OÍ1, Applied Biesysíemsj elúclős pufiér: 0,1 M Tris-HCi (pH 2.5) semlegesítő pufién I M T'ris-HCi (pH 8,5) detektálás: 2W w; áramlási .sebesség: í ®fafe frakciómére?; 8,5 mi,U5 perc. gyejtőcső: 1,5 ml-es prtiipropdón míkreesö hőmérséklet:. 4*€
Miután az összes szürletet felvittük az oszlopra, 3ö ml PöS-t (Sigma, Cam 1000-3} alkalmazunk az oszlop mosására. Amikor az elúcios puffért elkezdjük rdvínni, elindítjuk a (rakciókoiiektort. Mindegyik miltrocsö korábban tartalmazott 55 μΙ I M NaCí-t, 110 μΐ semlegesítő puffért és 74 μΐ 2 mg/ml szarvasmarhaszéramalhumint (Sigma, Cats A-7030) PBS-hen. A k-;0. frakciókat összegyűjtjük, és dializáljuk I liter PBS-sel (pH 7,5) szemben TC-on 1 naponkeresztül Sózfe-A lyzer (Plerce, Gabi 66450) alkalmazásával. A dialízis puffért kétszer cseréljük.
A bmhamzálí eUénariyagök expressztőjáttak igazolását és az előállított tenyészeí-felöhlszóban ialálhalő éxpteszsziős termékek mennyiségi elemzését BRfS A-val végezzük, anfi-humán-ígfí ellesi ellenanyag alkalmazásával.
9ó-méröhelyes mikrotiterlemez (Mas.tSörp, Nttnc) mindegyik mérőhelyére 100 pl kecske antl-humánIgG-Ec-re specifikus poliklonáfis ellenanyagot: (Kappel) adunk, amely 8,5 pg/mi végkoncemráeióra van feloldva adszorpelós pnfísrben (0,05 'M oátrium-'hídrogénfearhönát, 8,02% nátrium-ázid, pH 9,6), és a mikroí-íet lemezt 37°C-on iukírháfjuk 2 órán kérésziül az ellenanyag adszorbeálása végett Azután a mikrotitcrlemez? őt alkalommal mossuk 358 pl PSS-scl, amely 8,85% Twetm-Hő-ai (Bíorad) tartalmaz (amit a leírásban ezentúl ,,PBS-TSnsk nevezünk), Mosás után a mérőhelyekbe adjuk a 10% FCS-t íartatoazb D-MBM íápkőzeggel hígított tényésxeí-feteiőszőkat, és 37°C-on mlcabáljuk 2 órást keresztül. Ismételt PBS-T mosás után 1O0 pl, PBS-T-hes iüoüh-szer hígított, alkaiikus foszfatázzal jelölt múi-lmmán-lgG-m specifikus polÍkfesális ellenanyagot (lackson immuné Research Lsh,) adunk mindegyik mérőhelybe, és 3?eC-©a isknháljuk 2 órás kérésziül, ismételt PBS-T mosás után az ARuhue Rkexpóawe SuPHrum áb-ből (Bio Rád) származó p-nltrofenii-lbsztát sztihsztráfoi adunk a mérőhelyekhez a reagertskészlefhez mellékelt kézikönyv utasítását szerint. 37öG-on 0,5-1 órán keresztül törtét© mkubálás után mérjük az abszorbaneiát 485 nm-eu. Ezekben, a kísérletekben 10% FCS-t. tartalmazó D-MEM tápközeghen adott koncentrációkra hígított humán plazma atnnunglubüUa G l-es alosztályt (tgöl) (Siopure Aö) alkalmazunk koncentráció mferenchnnintaként a tenyészet -feh·: úszókban található humanizált DR5 ellenanyagokhoz,
Γnnek eredraőnyeképpen spectfíkusaa detektáljuk a tertyészef-lblülüszohan található tisztított termékek express/topí es az aotj-ünmán-lgG ellenanyaggal. A humán IgG ellenanyag mennyisége 8/76 pg (800 pl).
21, példa. A humnnizáli edeoanyag apnptőzís-indtskálő aktivitása
Jurkat sejteket: (ATCG TIR-152) alkalmazunk a tisztitoti humanizált TRA-8 ellenanyag apoptázismdnfeáló aktivitásának vizsgálatára.
18% FCS-t tartalmazó RPMl ló48:íápküzegben (Gibco BRR) TFO-oa 3 napon keresztül 5% CÖ2 jelenlétében tenyésztett farkat sejteket Őh-méró.helycs mlkroíite?-iemer {Snmüemo Bakelité) uséröhelyeire osztunk szét mérőhtdyenként 58 ul mennyísőgbea. A 28. példában előállított humaaizált TRA-8 yégfemeentráeióját: 188 ng-'mí-re állítjuk be 10% FCS-t tartalmaz RPMIHH0 tápközeggsl, a 20. példában léirt módon heesSlve azok koncentrációját a folyadékokban. Az expresszié® termékek ily módon 188 ngíml-re beállított oldatok alkalmaz54 zsk sorozaíhígttésok előállításra 10% FCS-í tartalmazó RPMÍ1640 tápközeggei. 2-szeres*» hígítva sorozatosa®, A hígított humanizált TRA-8~at adjuk az egyes mérőhelyekhez 50 pi.'mérohdy mennyiségbe®:, Mattá® reagáltak jók 37*C-oö.12 órán keresztül 50 pl 2,5 M PMS-t (fenazÍR-metoszulfo’: Sigmá Chetnieal Oo.) adatik hozzá, amely 1 mgZtó ΧΤΤ-Ί tartalmaz {2,3-biszj2-íneíoxi-4-nitro-5-szulfofenifj-2l%tetrazóiíum-5-karboxianírió belső só;. Sigma Chetnleai Co,) (végkonecntrácíő: 2-5Ö pg/ml XTTés.S pM. PMS). 3 órás ínkubáíás utón mérjük az egyes mérőhelyek abszorbaneiáját 450 nm-ea, ltogy kiszámítsuk & sejtek életképességéi, s mitokondrRusok redukciós képességét indexként alkalmazva.
A sejtek életképességéi az egyes mérőhelyért az alábbi képlet szerint számítjuk::
Életképesség (%) = 100 x (a-hjXc-b) ahol „a” jelentése a teszt mérőhely mérési értéke, „b” jelentése a sejteket nem tartalmazó mérőhely mérési értéke és „e” jelentése az ellenanyagot, nem kapok mérőhely mérési értéke,
Ennek eredményeképpen a 2ít. példában előállított éxpresszlós lennékről (humanizált TRA-8) kimutatjuk, hogy apoptózist indokai humán DR5-öí éxpresszálö I'-lintíórns sejtvonal sejtjeiben,
22. példa, TRA-8 reaktivitása különböző ORS-mofeksiák Iránt
Annak érdekében, hogy meghatározzuk a TRÁ-8 reaktivitását különböző DRS-rnelekulákiránt, megvizsgáljuk a TRA-8 reaktivitását akiivált liinfociták alkalmazásává! az alábbiak szerint.
Először perifériás vérmintákat veszünk embertől (3Ö ml), selyemmajetntól: (3 ml) és CvnöwjgKS majomtól (2Ö ml), A vérmintákhoz, 1 ml heparim (Novobeparm; Movs) adnak, és: a mintákat azután lassan ráréiegezzilk azonos térfogatú EfedAPsfnn TO7$ oldatra (Amersham Pharmaeta Bioteeh,): specifikus sűrűség: 1,077 a Qww«^bs· thajom kivételével:, asnelynek a specifikus sűrűsége 1,072), és 30 percen keresztül cenmlugáljuk 1700 rptn-rael perifériás mononukleáris sejtek előállítása érdekében. Ezt a mononak íeáris: sejttfakciót kétszer mossuk Hanks-féle klegyensülyozott sóoldaít&l, és azután folszuszpend&ljok 10% vív ECS-t tartalmazó RÉMI: ló4Ö lápkőzegben I. x 1(E sejtdnl sdtsőrüségre., Fltobemaggíutísm-F-t (P11A-P, Sigma Chemicals, Cö.) adunk a kapod szuszpeozióhoz 5 pg;ml végkoneenírációhan, és a mintát 37 -C-on inkubáljuk 5% COrben 24 órán kérésziül. Ezen idő Rudié után a sejteket centrifugálással visszanyerjük, mossuk és újrafelszuszpendáljak azokat 10% \ \ ÍR S-t tartalmazó RÍ VI io+ö tupkomgben Azután a vis-zanyert szpek akt;s Hasához m erleuktn 2 t (Amersh&m Phannaeta Bioteeh.) adunk a kapott sznszpenzióboz ÍÖ egyseg/ml végkoneentrárióban, a mintát ΙϊΥΧοη inkubáljuk 5% v/vegyület CO>-hen 72 órán keresztül
A számítások szerint 1 x lö” aktivált iímfoeitát tartalmazó aktíváit készítményt tesztcsobe helyezzük, és leiszuszpesdáijttk 50 pl 0,5, 1, 5, 10 pg/ml TR.A-8-at tarialmezó ÉSS-ben, vagy 50 pl EÖS-ben. A kapott sztsszpenzsóí hagyjuk jeges állni I őrá® keresztül, sml után a sejteket 3 -szar snossuk 500 pl PBS-sel. és azután feiszuszpcndáijuk 50 pl FfTC-ed jelöli: antí-egér-ígG ellenanyag (B ioresouree) 20 pgmd koncentrációjú PSS-es oldatában. 5Ü0 pl PSS-ben felsznszpendak sejteket: alkalmazva kontroliként, mérjük a Éuoreszeenciainteuzáásokat, áramlási eitostoier alkalmazásává; (/.tCXCoOfoz?'; Bccton Öicklnson).
Megkapjuk a sejtszámok fiuoreszeencia-nuesizitás szerinti eloszlását, és kiszámítjuk a. festett sejtek számának arányát az összes sejt számához viszonyítva. Ezenkívül kiszámítjuk az egyes Kd-ertékekeí a TRA-Skoncentráeió és: a festett sejtek száménak arányénak az összes sejt számához: viszony ítaít arányának alkalmazásával. Az ember, sdymnmajom és Qvmw/gas majom irsíadegyikének esetében az: aktivált hmföciták reakilvi55 lásának gyakorisaga majdnem megegyezik. Ennek megfelelően & TRA-8 képes kötődni ioemlős: t>R5-ök széles köréhez, köztük az emberéhez, amely ellen a TRA-8-as eredifeleg termeltettük.
25. példa. TRA-8 emelkedő dózisa vizsgálata seíyemmejomhsn
TRA-8 emelkedő dózisé előzetes ioxlcitási 'vizsgálatát végezzük el 1 hint és I nőstény seiyetnmajom alkalmazásával. Három egyszeri intravénás sdágolasi hajtunk végre ? napos vssszsátlási periódussal elválasztva, A TRA-8 dózisé! 50, 250 és 1250 pgAest ntennyiségre állítjuk be. 48 órával az első kezelés titán vért győjthnk a consbvénából, és plazmát állítunk elő,
Mérjük a plazma aszpattái-anrisotrasszföráz és abntn-aminmranszferáz aktivitását analizátorral (FllJÍ feRí-GíffiAF Fuji Film Medinát Go., Ltd.j, Az összes vérvételt érzéstelenítés nélkül végezzük. Eredményeként sem találunk májkárosádásra utaló bizony kéköt a plazma biokémiai vizsgálatával az egyes kezelések után..
24. példa. TRA-8 is vőro és rá vráo rármnkológias vizsgálata barnán rákos sejtek ellen
Annak meghatározása érdekében, hogy a TRA-8 terápiásán harásös-e rákellenes terápiában, vizsgáljuk TRA-8 rá v/ráö öléakí!vitását különböző rákos sejtvorealskhmt az alábbiak szériát,
Különbőzé rákos sejteket (2-8 x 103 seií/Stl pl) tenyésztőnk REMI1640 tápsőzegben {.indok sejtek esetében), Γ)Μ f-M tápközegben diCT-íló sejtek esetében), MEM-R íápkőzegben (WtBr sejtek esetében) vagy ÖMEM- Γ12 tapközegben (COl ,2-,iek sejtek esetében), amelyeket a öibeo fíRL cégtől szereztünk be, 1Ö% FCSsel (ölbe® BRt) ÜT’C-on 3 napon keresztül SH COj jelenlétében, majd Oó-mérőhelyes mikrotlterfeasez {Samltomo Bakelité) mérőhelyeibe osztjuk szét azokat. A TRÁ-8 koseentráciőíát ügy állítjuk be,, hogy a végkoneenirácló: 100 ngóul legyen 10%. FCS-t tartalmazó: iápkőzeghen, A TRA-8 oldatot (1:00 og/ml) sprozráltigílások előállításra alkalmazzak 10% FCS-t tartalmazó tápközeggel, 2-szeresre higitvs sorozatosén, Az egyes hígított: TRÁ-S-oidatokat 50 pl méíötytséghcn hozzáadjuk a: mérőhelyekhez, és 3?’;C-on kiknbáljuk. Mintán reagáltatjuk 72: érán keresztül 3?öC-ön. 5Ö pl 25 pM EMS-t {feaazin-metöszultát; Sigtna Chemieal Go.) adunk hozzá, amely 1 súghat XTT-í tartalmaz (végköncsmtráció; 2SÖ {igául XTT és 5 pM EMSj, 3 órás ínkstbálás után mérjük az egyes mérőhelyek abszörbauciájái: 450 nm-ea, hogy kiszámítsuk a sejtek életképességéi, a mkokoudriumok redukciós képességét indexként alkalmazva.
A sejtek életképességét az egyes mérőhelyen az alábbi képlet szerinl számlijek:
ÉleSképesség (%) ~ lőö x (a-b)/{e-b) ahol „a” jelentése a teszt mérőhely méress értéke, „h” jelentése a sejteket nem tartalmazó mérőhely mérési értéke és „e jelentése az ellenanyagot nem kapott mérőhely mérési értéke.
A.z eredményeket az alábbi 3. táblázatban mutatjuk be.
3. Táblázat
Sejtek bö50 (pgunl)
.Snrkaí 0,001-0,01
HCT-llő 0,004-0,02
WiDr 0,007-0,03
COL2-.iek 2.2.S
— 56 -*
A különböző rákos sEjívunalakban erősen indukálódik az apoptózís: a TRA-8 hatására fe vúro körülmények között.
Ezenkívül meghatározztsk a TRA-8 m vívó daganatellenes aktivitását beültetett W'SDr sejteket tartalmazó csupasz egerek alkalmazásával, mivel a TRA-8 nem keresztreagál azegér DRS-íel.
TRÁ-8 anti-BRó ellenanyagot adunk be humán DR5 molekulát: expresszáló humán xeuograhot hordozó csupasz egereknek. Az alkalmazott egerek 6 hetes Ráta esupaszfesupasz egerek (nőstény, Ciea Japan, Iné), amelyekbe humán WlDr vastaghélrák sejteket hitettünk he (5 mm5). Egy nappal a daganat beültetés után á taszplantáh egereket naponta kezeljük TRA-8 ilRrartifculárfe injekciójával O pgÁest) 14 alkalommal. A WtDrdaganat növekedését naponta meghatározzuk a daganat méretének, mérésével. Az eredményeket az alábbi 4. táblázatban mutatjuk be.
4. Táblázat
8 nap 11 nap 18 nap 18 nap 22 nap 25 nap i
Konfrötí (ESS) t96 249 469 584 833 1193
SD ±55 *77 ±149 ±23® ±274 ±419
TRt-8 158 97 155 195 363 536 |
SD ±78 ±30 ±60 ±58 ±91 -.135
Míg ebben a modellben: az összes kezeletlen állat látható daganamövekedést mutatott, a daganat növekedése gátolt a TRA-S-eai kezelt egerekben, amint ezt a daganat mérete mutatja. Ez az eredmény azt mutatta, ísogy a íRÁ-8 hatásos a daganaísejt <« wvo eliminálásában.
25. példa. TRÁ-8 kombinációs vizsgábta
A FC-3 humán prosztatarák sejivonalat az ,,American. Tíssue Cukoré Coiíccíiotf'-tói (ATCC) szerezzük be és (MM Antafe Afetora tápkbzeghen (21127-822, öibeo RRE) tartjuk lenn, amely az alábbiakat :fetalmazza: magzati marhaszérum (FBS, ílyolone), lök L-£iiuíamiu-2Ö8 mM (25030-149, ölbe© BM) és 0,5% penícillín-sztreptomicin oldat (R-7539, Sigma). BM ERS-sel és ö,55á penieillin-szíreptomícín oldattal kiegészített RPMi 1640 ispközegeí (,MED-0Ö8, 1 WAKi) alkalmazunk az alábbi klsérletbsa, Exponenciálisan növekvő PC-3 sejteket gyüjtlbk fripiszinizációval, és kétszer mossuk azokat friss: iápközeggei, Azután leszámoljuk a sejteket, újralelszuszpendáljuk friss tápközegben 5 x 18* sejtfrai sőrőségge!, és egy nappal a kísérlet kezdete előd szétosztjuk három párhuzamosban lapos téneká 90-trsérÖheiyes: raikroíiierlemezekben. (3598, Cöming-Cosier) 160 ulőnéröhely ossziér&gaíban, A dimeőlszullbxidbas. feloldett (16 mgónl) (taöfeta reprezentatív rákellenes drogot (169-18611, Wáko) friss tápkőzegbsn hígítjuk, ás azután a sejteket tartalmazó 96-mérŐheiyes mikrötúerfemezekhez adjak 5B plőnérőbely mennyiségben. A dimsíiisznithxid végkoncentráeiójp kisebb, mint 0,1%. 24 órás 37cC-on 5% COj-atmoszlérában történő inkuhálás után friss tápközeghen hígított TRA-8-st adunk a mérőhelyekhez.. További 24 órás inkuhálás: után 5® ni, I sng/'ml XTT-kés 25 M FMS-t tartalmazó ΛΑEssutad Beáta: tápközeget: (11Ö95-09S, Oibeo RRL) adunk a mérőhelyekhez^ és a mikrottterlemezeket 6 órán keresztül mkubahuk Azután, mérjük az ÖD450-el áFECTRá M4X 230 készölékkel (Moiecular Devices), és. & kiszámítjuk a Sejtek elet képességét az alábbiak szerint;
Sejtek életképessége (%) - (a Taxölbl és/vagy TRA-S-szerrel (szerekkel) kezek sejtek OFMSO-érteke) - sem sejtet, sem szert nem tartalmazó mérőhelyek ÖD4S()~ériéhej x 1ΘΟ / (sejtet igen, de szert nem tartalmazd mérőhelyek ö£>4$0-drtéke - sem sejtet, sem szert nem tartalmazó mérőhelyek ÖD4SŐ-értéke)
A reprezentatív rákellenes droggal, a TWhmeei-fel kombinált TRA-8-af alkalmazd fonti vizsgálati eljárások eredménye a következő. A Aooí'daré/ csökkentette a FC-3 sejtek életképességéi, de az életképes ráksejteket: mutató Jetnek több mint 40%-a megmaradt akár 2©ö nM könccntráclöig Is, Figyelemreméltó, hogy (1,1 ngúsl TRA-g hozzáadása nagymértékben csökkentette a ráksejtek életképességét, akár 10%-kai is, nség ha nem is látszott a sejtek életképességének csökkenése FRA-k egyszeri beadása után ebben a kotteenírácidbaa. Ez az eredmény világosan jelzi, hogy a TRA-8 szlnerglkus rákellenes aktivitást raafetott más rákellenes szerekkel kombinálva.
M. példa. Más tipaső Uamasízátt TRA-8 ellenanyagok elemzése (1) Humanizált elkmanyagok tervezése 'FRA-8 humanizált verziójának előállítását az általánosan „CDR-graking” néven ismert eljárással végezzük, nrÁBSRCL ellenanyagot alkalmazunk akcepiorkértt, amint azt a 2. réfercnciapéldában leírjuk, és a TRA-8 ellenanyag CDR-régiöií ráültetjük ae: akceptorra, A vázrégióban bizonyos amínosavakát vagy a TRA-Sböl, vagy humán kenszenzns szekvenciákból ráültetünk az akceptorra, a. Queen és rotsai. atal adott kritériumok alapján (Proc. blatt. Acaá. Sci. USA 8Ő, 1Ö029-IÖÖ33, old. (1989)1, és humán TRA.-Ő szekvenciákat állítunk elő az alábbi leírás szerint.
(2) Más iiptssó ku tsa akták vagy egé r TRA-8 nehéz lánc variábilis régid ÖNS-ét hordozd plazrald előállítása
Amint az §6. azonosítószámú szekvencián: bsmntaprtk, a TRA-8 egér srihhomán-BR5 ollonsnyag nehéz lánca anbnosav-szekvenciájának Hl típusú hámattizálssá során: helyettesítettük a 3. mísosavat ftnetionm), a Í3. aunnesavat (lizm), a. 19. atniaosavat (iíztn), a 4Ö. anrinosavaí (teeonín),» 42, aminosavat (glataminsav), a 44, aminosavat (argmín). a 841 ansmosavst (szerte), a 88.. ammosavat (szerint, a 93. aminosavat (steíiunin), a 114, aminosavat (treonín), a 115. aminosavat (Msem) sorrendben glntemin, gkitanns, arginin, alantn. telem, glseis, aszparagm, atauhp valtn, lene ín és való; ami nova vak kai.
Amint az 59, azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér anti-hsiaán-DRS ellenanyag nehéz tánca anduosav-szekveneiájának H3 típusú humanizáfesa serár, helyettesítettük a 13. aminosavat (liziok a 19. aminosavat (lizis), a 48·. mntsössvat (treonín), a 42. ammosavaí (glutaminsav), a 44. umíaosuvat (srglnín). a SS. aminosavas (szenn), a 93. amiuomvut (metionin}, a 114, aminosavat (treonint, a i 15. aminosavat (lettem) sonendben giutanno, arginm. alanm, gltcsn. gbom, alanm, valm, lenem cs vnhn atomosa akkuk
Amist a 60, azonosítószámú szekvencián bemutatlak, a TRA-8 egér nnti hun»»i-DR5 ellenanyag nehéz tánca anrinosav-sítekveneiájának H4 típusú humanizálása során helyettesítettük a 13. aminosavat (íizin), a 19. aminosavat (llzin), a 88. atntmsavaí (szerin), a 93. aminosavat (metionin), a 114, arainosavat: (tteonin), a 115. aminosavat (fenem) sorrendben glutatnin, arginin, alanln, vaiin, lesein: és vaím áramsavakkal.
Amint a él . azenösltdszámú szekvencián bemutatjuk, a kimérd TRA-8 nehéz: lánc variábilis régióját hordozó pl&zmidoi „M-típusúnak” nevezzük. Ezenfelül a 17. és í 8. példában bemutatott humán TRA-8-ai: „H2iipusúnak·’ nevezzük.
A humanizált vagy kiméra TRÁ-S nehéz lánc variábilis: régióját kódoló DNS-t hordozó plazmldat az alábbiak szerint állítjuk elő,
PCS-t alkalmazunk az siátoí DNS-szekveneiák előállítására:
Az alábbi 24 oligootódeoiidot azintctizáijnk meg:
ó'-ttggat&age Aggettgac etcaccaigg: gatggagctg latóatccic tteftggtag eaaeagetae agsjgtóeae-S’ (A; 32. wsosftőszámí szekvencia);
S-íetgaagtaa igctggigga gictggggga ggetiagtse a.gectggagg gíecetgaga eictectgtg cageetetgg-T (B; 33. azonosítószámú szekvencia):
S'-teigaagmc agciggtggá gtetggggga ggcúagtac agcctggagg gtecsígaga cteteeígfg eagccteígg-31 (B2; 57. azonosítószámú szekvencia);
S’-tóígaagíaa tgctgglgga gtctggggga ggcttagíaa ageetggagg gtccetgaaa eteieelgig eagecfctgg-3’ (83; úó. azonosítószámú szekvencia);
ú’-aíteacttíe agíagitatg taaígtcítg ggttcggeag gcaeeaggga agggteígga gtgggúgcs aceaítagta-S’ (C; 34. azösosííöszAma szekvencia);
5'möeaeúte ag&gítaig iaatgíeitg ggttcggeag aetceagaga agaggeígga gtgggtígea aceatogtó-T (C2; ő4, azonosítószámú szekvencia);
5-gfggtggtag ttaeacetae tatccagaea· gígtgaaggg cegsíteace atóiccagag acastgecaa gaacaeeetg-3' (O; 35. azonosítószámú szekvencia);
SM&teígeaaa tgaaeagtct gagagcagag gacaeggeíg ítíattaeíg tgeaagaagg ggtgaeteta ígastacgae-3' <£; 3ó, azonosítószámú szekvencia):
ó'-tatótgcaaa. tgagcagtet gagageagag gaeaeggeig töatracig tgeaagaagg ggtgaetóta tgaííasgac-3· (E2; 62, azonosítószámú szekvencia);
SMatótgcasa tgagcagíei gagaíeigag gaeaeggota tgíatíaetg ígcaagaagg ggígactem ígaiíaegsetó' (E3; ú7, azonosítószámú szekvencia);
tó-ggacsacigg ggceuaggga eocfggfeac agíeteeíca gcetceacs aagggcccaf cggtó-2’ (F; 37. azonosítószámú s/ekt énein);
ő'-ggactactgg ggccsaggga ecaeteíeac agtefeeíea gectcoacc aagggceeat cggte~3' {F2; 68. azonosítószámú szekvencia);
S’-eiaccaagaa gaggatgaía cagcíecató ecaíggtgag gíeaageeaa gcttsfccaa -3' (6; 38. azonositószátnü szekvencia);
S'-teteagggac eeíeeaggeí gunaaece tcccccagac ieeaceagea tlaeíteaga gíggacaccí gtageígttg-31 (H; 3S. azonosítószámú szekvencia);
^-tcRagggac cctccaggu gíactaagcc uxccvagae mvaecage; gtaertcaga gíggacaeu gtagetgtig-31 (IÍ2. 58. azonosítószámú szekvencia);
S'-íttcagggae ecteeaggct tíactaagcc teccecagae tceaceagca itaeífeaga gíggscaeet glagetgítgrS’ (83; ŐK azonosítószámú szekvencia);
-tceagaceet íccetggigc eígcegaace eaagacatta cataactact gaaagígaat eeagaggeig eaeaggagag~3’ (1; 4ík azonosítószámú szekvencia);
S'-tceagcctcf tetetggagt eígcegasee caagsoatla cataactact gasagtgaat eeagaggcíg escaggsgagtó* (12; 65. azonosítószámú szekvencia);
5'~etctggagaí ggigaaícgg eceíteaeae igtóiggata gtaggtgtaa ctaecaceac tactaatggt fgesaeeeaetó1 (3; 41, azonosítószámú szekvencia):
SS 5'-ceííeúgca csgtáataaa cagccgígíe etctgetete agaetgttca: úígcagata cagggtgttc ttggeatígéA' (fe; 42. szónositószámú szekvencia);
5!-ccÚcttgcá cagtaataas cágcegígtc ctetgcíotc stgaeígttca ötgcagata eagggtglíe úggcaítgtG'· <0; 63. azo-< nosttószómú szekvencia);
S'-ecúettgca eagtáaíaea tágeegtgtc eíeagaíeíe agaetgctea tttgeag&ta eagggtgtte üggcaügí-L’ (K3 ; 70. «KTOsttetoá szekvencia);
S-gacogaíggg eecúggtgg aggetgagga gactgtgacc agggíecetí ggecceagta gtecgícgla atcatgagí eace-T <L; 43·. azonosítószámú szekvencia); és
S'-gaccgaíggg ceeítggtgg aggcigagga gaetgígaga gtggteectt ggeceeagta gseegtcgta ateatagagt eaee-S* (I..2; ?l. azonosítószámú szekvencia).
Az alábbi két PCíGiáneindlíót szfefetízáljok meg a fenti leírás szerint:
S!-síggataage tiggciígse-3’ (Pl; 44. azonosítószámú szekvencia); és
5:-gaeegaíggg eécítggigg a-3‘ (P2; 45. azonosítószámú szekvencia),
Szekréciós szignáiszekvenciát, hamanízáit TRA-8 nehéz lánc variábilis régióját és az ígG-CHJ régió hí-termmállsán lévő 8 ammosav-oidaíláncot tartalmazó p©fe>eptíóiáneot kódoló Hl-ttpasn DhlS szintézisét PCR-dt kotabinácíójúnak alkalmazásával bájtjuk végre.
A 1 ϊ I -típusú DNS- iragtnensí az alábbiak szerint állítjuk elő.
A PCR-reakcióelegy összetétele az alábbi:
.A jelű oiigonukleoíid. ÍÖ pmol;
B2 jelű oligouukleotid, 18 pmol;
C jelű öílgonukleotid. Iöpmol; fejelő oügonuiíieetici, 10 pmei; kjein olígonukleölid, 10 pmol; kjein: öligöítskleoíiíl, 10 pmol;
G jaki oligorntkleotid, 10 ptnoi;
11.2 jelű olígosukleotid, i ö pmol;
I jelű ölsgonnkieotid, 10 prnoi;
.5 jelű ebgonnkleotid, 10 psnoi;
K jelit ohgotmkieoUd, 1Ö: pmol;
L jelű oligonnkleotid, 18 psnoi;
Pl jelűoligonukleötiá-láncinditó, 2 pM;
P2 jeid o:lí^5nnkfeöti0-iáneindSo,2 pM;: íö.\ éjwóe.’íí répA-r A, 10 pl; dNTP keverék, 8 pl;
Ambfösí DNS-peltmeráz, 0,5 μί; és desztiiláií viz 50 p;l végtéríög&tra.
A PCfeeakelőt: az alábbiak szerint végezzük. Az oldatni először RFC-ra ptefegiíjilk 5 percre. feni dián; §MC-oa 10 másodperc, Őó-C-op 30 másodpere és ?2°C-pn t perc ciklust 7-szer ismételünk. Ezen eljárás befejezése pián a reakciós elégyet 72%1-ra melegítjük 15 percre.
- 88 Penelos extrííkció és etauolos klesapás titán a kapott DNS-csapadéket vákuumban szárítjuk, télolájük minimális térfogaté desztillált vízben, és 3% agarózgéi-etektrölbrézsssel elválasztjuk. Az elekiroferézis mán a gélt 1. pg/std siídipm-hfomid vizes oldatával festjük, hogy lehetővé tegyük a DNS festését GV»fenyben. A Hltipusú DNS-nek megfelelő DNS-csikpkat pengével kivágjuk, és eluáljuk a gélből Ge?ieeÍeefi Spm Kit ÍB1O 19!, CA, ÖSÁ) alkalmazásával Tenolos extrakcló után az eluált DNS-t azután eesírit'ugálássai kermeeíráljok 7588 x g-s, majd etznolla! kicsapjuk,: és végül feloldjuk 5 pl desztillált vízben.
Szekréciós szignálszekvenciát, humanizált TKA-k nehéz tánc variábilis régióját és az IgG-ClH régid bl-terminállsán lévő £ wimösav-otóaSáneot: lartálmszö polipeptidláficot kódoló HMipusá DNS· szintézisét PCS-ek kombmáciípáíiak alkalmazásával hajtjuk végre.
A H3-tipnsü DNS-fragmensi az alábbiak szerint állítjuk elő.
A PCR-reakcióelegy összetétele az alábbi:
A jelű oligonukleotld, 18 pmel;
jelű tdigenukleotid, 19 pmel;
C jelű oljgonukleotid, 10 pmel; fejelő olrgonukteoiid, 10 pmel;
£2 jelű oligonnkieetid, 10 pmel;
F jelű oilgonukleetid, I 9 pmel;
G jelű öligönakleeíid, i 0 pmel;
H jelű oÖgönukteetid, i 0 pmel;
jelű i>ligonukleód< 18 pmel;
1' jelű obgmmkieotid, 18 pmel;
K2 jelű eligonukleotid, 18 pmel; t jelű olígersakleotid, löpmol;
Pl jelű sligenukieotid-iáncinditö, 2 pM;
Pl jelű oligonukleetid-iánclnáiíö, 2 pM;
Ox buffi»' S, 18 pl;
dNTP keverék, g pl;
Fyre&es? ÖN$-polimeráz, 8,5 pl; és desztillált víz 58 pl végterihgatra,
A PCR-reakeiőt az alábbiak szerint végezzük. Az oldatot először fefeü-ra melegítjük 5 perem, ami elán 9íCC~öo 18 másodpere, Óő^C-on 38 másodperc és 7ζΤ>οη 1 perc ciklust ?-szer ismételünk. Ezen eljárás befejezése után a reakciós elegyes ?2cC~ra melegítjük 15 percre.
Penolos esírakeiő és: esmoles kiesapás után a kapod ÖNS-esapadékot vákuumban szárítják, feloldjuk minimális térfogatú desztillált vízben, és 3% ugárózgéi-efetórolblézissei elválasztjuk. Az eiektelörézts után a gélt 1 pgóüi stídkím-brmmd vizes oldalával festjük, hogy lehetővé tegyük a DNS festését W-fenybeo, A H3lipusó DNS-nek megfelelő DNS-esikokaí pengével kivágjuk, és ehráijuk a gélből Gemvshw Spm O alkalmazáséval, Fenolok extrakcló után az előáll: DNS-t azután éeütrifegálással koncentráljuk 7590 :x g-n, majd eianelia! kicsapjuk, és végül feloldjuk 5 pl desztillált vízben.
ól
Szekréciós szignálszékvenetáí, humanizált TRA-8 nehéz lánc variábilis régióját és az IgGOi t régió ló-terminálisán lévő 8' aminosav-oldaliáncot: tartalmazó pollpeptídláneot kódoló B4-taposá DHS szintéziséi PCR~ek kombinációjának alkalmazásával bájtjük végre,
A l-kl-táphsű DNS-tragmenst.-az:alábbiak szerint állírjuk elő,
A PCR-reakeióelegy összetétele az alábbi;
A jelű olígonukleotíd, 10 pmol; öjdö oligonukleotid, 10 pmol;
C2 jelű ohgormkieoíkl, 10 pmol;
D jelű oligosukieotid, ló pmol;
E2 jelit oligonnkleoíld, 1© pmol;
Γ jelű oiigenukleobá. 1Ö pmol;
G jelű oligonukleoíid. 10 pmol;
H jelű oiigcsViikieoód, K; pmol;
jelű öllgonnkleotlá, 10 pmol:
.1 jelű oligormkleoiid. 10 pmol;
K2jelű oligoonkleotid, lö pmol;
L jelű oligonoklemid; 10 pmol;
Pl jelóoiigöonkleofld-láneimlbo pM;
PI jeló olígooHklooiíd-láneindt <. 5 μ,Μ;
ÍOx /bv-íídesr buffer ϊί, ló pl; dNIP keverék, 8 pl;
Pyrobesi DNS-poli mente, 0,5 pl; és desztillált, víz 50 pl végíérfőgatra.
A ECR-reaktűőí az, alábbiak szerint végezzük, Az, oldatot először 94nG~ra. melegítjük 5 percre, and után ©tNC-on 10 másodperc, 55QG-on 30 másodpere és: 72üC-on I perc ciklust 7-szer isméteklnk, Ezen eljárás befejezése után a reakciós elegyeí ?2“C-ra melegítjük IS percre,
Renolos extrskeió és: elanolos kiesapás «tárt s kapott DNő-esapadékot vákuumban szárítjuk, feloldjuk minimális térfogatú úeszblküt vízben, és 3% ogarózgél-eiektroiorézissel elválasztjuk. Az elekíroFotézts után a gélt: 1 ggzsnl étidbmrfwmó vizes oldatával lessük, hogy lehetővé tegyük a DNS festését OVrfertybeK, A 114típnsó DNS-uek megfelelő DNS-csikokat pengével kivágjak, és elnáljuk a gélből őnwefew Spin Kii alkalmazásával. Eenolös sxtrakció után az elnálí DNS-í azután centrifugáiássat koncentráljuk 7500: x g-n, majd «móllal kicsapjuk, és végül feloldjak 5 μΐ desztillál: vízben.
Szekréciós sxignálszékvencíát, kiméra TRA-& nehéz lánc variábilis régióját és az IgG-CHí régió N~ termlnálisán lévő 8 aunnosav-oldaikmcot tartalmazó poiipepíidláneot kódoló .M-trpusó DNS szintézisét: PCR-ek konthináetójáRak alkalmazásával hajtsuk végre.
Az M-típusö DNS-íragnrenst az alábbiak, szerint állítjuk elő.
Á PGR-reakeíőelegy összetétele az alábbi;
A jelű ölIgenükleotid, 10 pmol;
B3 jelű oiígönakleoítd, 10 pmol;
€2 jelű ohgonukleotíd, 10 pmol;
jélö öllgonukleotíd, I® ptnol;
£3 jelű ohgonukfeoitd, Illpmol;
F2 jelű oligonukieotld, 10 pntoi;
Ö jelű oHgot-uk lentid, 1 ö pmol;
B3 jelű oíigonukleotirf, 1:0 pmok jelű oligonukleolid, 1 O pmoi;
J jelű oitgonukleodd, lö pútól;
K3 jelű ohgtsnukleot«1, í 1) pmol:
L2 jelű ohgmtnkleotid, 10 pmoí;
P1 jelű olígonukiéotid-kmcindltó, 2 μM;
P2 jel® uitgonukleodd-lánéinditó, 2 μ,Μ;.
Οχ ΑννΑοί &&$>>'/?,. ;0 pl; dNTP keverék, 8 pl;
Aprsőevf DNS-pölítrteráz, ö,5 pl; és desztillált víz 50 pl végtérfogutra.
A BCR-reateidtazalábfelak szedni végezzük. Az oldatot először -Ss^C-ra melegítjük 5 percre, mi után ÜiLC-on10 másodperc, SS^C-on 30: másodpere és 72A3-&& 1 pere ciklust7-szer ismételünk. Ezen eljárás befejezése után a reakciós elegyed 72°C~ra melegítjük 15 percre.
Fenolös. exírakcló és étanolos kiesapás után a kapod DNB-esspadéköí vákuumban szárfouk, feloldjak minimális térfogain desztillált vízben, és 3% agarözgel-elekirnferézissel elválasztjuk. Az elekíröforézis után a. gélt 1 pg/ml eddtum-brömid vizes öldmával fostfok. hogy lehetővé tegyük a DNS festését ÜV-fenyben. Az Mtipusu DbiS-nek megfelelő DblS-esíkokat pengével kivágjuk, és eiuáljuk 3 gélből G'éstvfeör? 8pfo O alkalmazásával. Fesolos extrákéin után az eluslt DKS-t azután eenirifugálássai koncentráljuk 7580 x g-n, naajd etsnollal kicsapjuk, és végül feloldjuk 5 pl desztillált vízben.
A kúpot; extrahált DNS-eke; í Η1 -típusú, HS-ttpusb, H4-tfpusd. és .M-típusu) klónozzuk. vektor (Protnegaj alkalmazásával az alábbiak szerint;
10x Tap-poiimeráz pnffer, 1 pl; dbi'l'P keverék, I pl;
Taq-polimejá? p egv-cg ml), 1. pl; és desztillált ssz 18 pl wgtertbgatm.
Azután mindegyik fenn oldatot ?0°€-öu reugáiiziptk 30 percen kérésziül, és mindegyik vektort és pöSfATjSssy vektor? ligáhrnk a. DAA kigo/K»5 Ó festet 2.0 (Takara Sihuzo Co>, Iád.) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.
óra ínkttbálás után 15°C-on, 2 pl InkPháli reakcióelegyet összekeverünk $00 pl kompetens & 00A
J.M109 törzzsel 1-2 x tb’ sejt/tni sejtsürűség mellett (Takar;?, Shuzo Cö., Lid.), és az Begyei jégen tartjuk 3Ö percen keresztül, azután 42X\o.« .30 másodpercen keresztül, és ismét jégen 1. percen kérésztől, Azután 5W pi SÖC-tápközeget (2%. vfv inpton, 0,5% w/v éiesztőkívönsí, 0,65% w/v nátrium-klorld, 2,5 tnM kálium-klorid, 1 ffiM magnézium-klorid és 20 mM glukóz) adunk n keverékhez, amelyet: további egy órán keresztül mkubálusk rázaiás melleit. Azután transzfbrmáns törzseket izolálunk, éa plazstíd DbíS-t preparáimtk a törzsekből, amint azt —
*M«fce»lar Cloning; A Dahoraíory Manual című könyv feisja. A humanizált vagy egér TRA-8 nehéz láncát kódoló ezen DNS nókleotid-szekvenelájfe igazoljuk a dideoxl módszerrel {Sanger, F.S. és mtsai, Proe, M Áestd, Bet. USA 74, 5463-MÓ7.. old. (W?)), W >$®r alkalmazásával (Λ8Ϊ ?« Perkb Elmer Applied Biosystems, Japan),
A kapóit plazmldekat pH A 1 5-nek (a humanizált TRÁ-8 Hl -típusú nehéz látteát kódoló eDNS-í hordozó plazmid), pHCi.ő-nek {& humanizál· TRA-R ITPtípasu nehéz láncai kódoló cDNS-t hordozó pl&zmid), pHD21-nek {a humanizált TRA-8 H4-tipasö nehéz láncát kódoló eöNS-t hordozó plazmíd) és pMl l-nek (a kiméra TRA-S nehéz láncát· kódoló cDNS-l hordozó plazmidj nevezzük. Az ezen plazmátokat hordozó A atfí íranszformánsokat - amelyeket A eoő JMlőú/pNA 15-nek, A coő JMhÖ9/pHC18-nek, £, eoh JMiö9á>HD21~ nek és A coő JMtWpMl !~nek nevezünk - letétbe helyeztük az „Iniersaklona! Patent Örganlsm Depositary, National Instlíute ofAdvanced Indnstrial Science and Technology” intézetnél 11-1, Bígashi 1 cbome Tsukubasbl, Iharakí-ken, 385-54ÓÓ, Japan) 2001. április 204» a mikroorganizmusok letétbe helyezéséról szóló Budapesti Szerződés szerint és ezek sorrendben a FERM BP-7555, FERM BP-7557, FF.RM BP-7558 és FFRM BP75 59 letéti számot kaplak, (5) Rúíúnbüző típusú humanizált vágj' egér TRA-8 nehéz lánc variábilis régió BNS~ét hordozó expressziós piszmidók előállítása
Állati sejtekben működőképes rekomhináús expresszáós vektorokat állítunk elő a Hl-tipmnk HS-típnsú ésdld-tlpusó: humanizált, vagy Ní-tipusú egér tóméra TPA-8 nehézdánc variábilis régiót kódoló (fent tóónozoit) DNS inzertálásával az alábbiak szerint.
pg pSRHHI-13 plazmiőot. (EP Ö9Ő981Ó Ál. számú európai szabadalmi bejelentés), amely a HFE7Á humanizált ahti-Fas mönőklbnális ellenanyag variábilis régióját és humán IgGl állandó régiójának genomsálts DNS-ét táríafaszó emlős sejtekben alkalmazható expresszíős vektor, emésztünk Hiítáííl és Apai restrikciós enzimekkel, és elválasztjuk 3% agaróz-géieletóroforézissel. Az elektroforézis után a gélt 1 pgyml etídlum-bromid vizes oldatával lestjük, hogy lehetővé tegyük a DNS festését ÜV-íényben, A humán JgG 1 állandó régiójának genomiáks DNS-ét a HFB?Á: humanizált anti-Fas rnonoklonális ellenanyag nehéz lánc variábilis régiója nélkül tartalmazó vektort kivágjuk pengével, és eluáijuk a gélből a éíeuecfeou ,%b« O alkalmazásával Eenolos exirakeiő után az eluált DNS-t áznám eeníriiugálássstl koncentráljak 7500 x g-n, majd etanollai kicsapjak, és végül feloldjuk 5 pl desztillált vízben, és azután defoss ibrtíáljuk C1P alkalmazásával A kapott emésztett, dtónszfodláil: plazmidot (1011 ng) Itgáljuk 1 pg pHAlS, pBCIO. pHD21 vagy pMH DNS-fragmenssel amely tartalmazza a humanizált vagy kánéra TRÁ-8 nehéz lánc variábilis régiót kódoló DNS-t, amelyet szintén emésztettünk Hindlíi és ÁpaPresfeikelős enzimekkel, a Ö&W Mgatio® Kit Pcrsúm 2.Ö (Takara Shuzo Co., Ltd.) aíkalmazásávak A llgáciös elegyet azután A coő JMlőP transzformálására alkalmazzuk, amit azután $0 pg/mi ampicdlim tartalmazó LB-agar csészékre széleszíünk.
Az ezzel az eljárássá! előállított trattszformádsokai 2 ml, SCI pgdnl ainpiciillm tartalmazó folyékony LB-tápkőzegben fenj észtjük éjszakán keresztül 37uC-on, és azt kővetően plazmid DNS-t exlrafeálonk a kapott tenyészetből az aikalskns-SDS eljárással.
Az extrahált plazmid DNS-t emésztjük Hindfií és Apai enzimekkel és 3%: agatóz-géleieklroferézisse! elválasztjuk, hogy igazoljuk a humanizált vagy tóméra TRA-8 nehéz lánc variábilis régióját kódoló DNS-inzert jeleplécét: vagy hiányát. A kívánt DNS-feágmens vektorbeli Inzerclöjáí és irányítottságát DNS-szekvenálással igazoljuk génszekvencia analizátor CjtSZ PRISM 370Ö SNA Anetyzer,. Applied Blosysíeírís} alkalmazásával A
0«· kapott exptsssziós plazmidokat, amelyek a humanizált TEA-® nehéz láncát kódoló eWS-eket bordozzák, woandben pHA!5- 1-nek, pHC 10-3-nak, píO2i-l-nek.ésphíl l-l-nek nevezzük.
14) Humnizált könnyű láncokul kódoló vektorok előállítása (4,1) Lspresszlős vektor előállítása a humanizált elíemutyag. könnyű láncával (LMl-dpusú)
Aíöter a 72, azonosítószámú szekvenciáit bemníatjuk, a TRA-8 egór aníi-bnmátt-DR5 ellenanyag kőnyuyű lánca amiuosav-szekveneiájának más típusa (LMI) humanizálása során a TRA-8 könnyű lánca annsosavszekvencíájának N-torsnlnálisátől számítva helyettesítettük a 3. amínosavat (valin), a 8. snűnosavst (hisziidín), a 9. aminosavst (lízm), a 10. aminosavai (íensíAnin), a 1I. amínosavat (metioniofe a 13,. srninossvat (íreonm), a 28:. amínosavat (szerin), a 42. amínosavat (glutnmín), a. 43. amínosavat (szsrin), a 6*8. amínosavat (aszparagiusav), a 63. aminosavai (treonin), a 77. amínosavat (aszparagio), a 78. amínosavat (valin), a 89. aminosavat (szerin), a 83. amínosavat (lenein), a 85. amínosavat (aszparagínsav),. a 87. amínosavat (fenííalauiu) és a 99. ominosavat (glieln). a 183. asninosavaí (lencin): é.s s 188, atomosa A (Aoin) sorrendben glutamin, pro®», szerin, szerin, ieueín, Antn, tfeotím, iizin, stanm, szerin, széria, szerin, lencin,, prolin, íeniiálánin, íteonin, tírozín, glóíamm, valin és treonin amlnosavakkal. A kapott szekvenciái LM 1 -nek nevezzük:,
A TRA-8 astí-horoán-DRS ellenanyag ilyen típusú (LMl-típusú, 72. azonosítószámú szekvencia) humanizált könnyű lánc antlnosav-szekvenciaít hordozó expressziós vektorokat az alábbiak szerint átlőjük eiö.
1> Rnmauizált TRA-8 könnyű lánca variábilis és állandó régióinak előállítására alkalmas láaeínditók szintézise (LM Mipusú)
Az EMI polipeptidláncot (72. azonosítószámú szekvencia): kódoló ÖNS-t, amely a TRA-8 humanizált aati-DSÓ ellenanyag: könnyű lánc (LM 1-típusú) variábilis régiójának és a barnán lg könnyű láncának <x lánc) feiőja, RCR-ek kombinációjával szimcbzáljstkmeg.
A 3AL1P (47. azonosítószámú szekvencia), 7ALCÍM (48, azonosítószámú szekvencia), HKCDEl 1 (58. azonosítószámú szekvencia), (ÍRCDRIT (51. azonosítószámú szekvencia), RKCDF22 (52. azonosítószámú szekvencia), KKCD822 (53, azonosítószámú szekvencia) és HRCF12 (54, azonosítószámú szekvencia) mellett az alábbi olígonokleoíid Acisditót szmísiízáyak meg a PCR-bez:
S’-gíeececacá gstgeagaca aagaacttgg agahgggíe atetgaatgt cscesgtggs-3' (HLSFR12; 77, azonosítószámú szekvencia).
A. pCRJ.l/LMÍ-2 plazmid előállításit (ííumamzáU TRA-8 LM I-típusú könnyű láncának klónozása)
A 72. azonositószámú szekvencián bematatott ándnosav-szekvencíás kódoló LM. 1 BNS-iragmenst kétlépéses PCR-rel állítjuk ció. piázmid vektorba inzertáljuk, és £. cnh'-ban klónozzuk,
a) Első FCR-lépís
Az LM1-FI DMS-íragmenst, amely a szekréciós szignálszekveneiá! és ESL;~rég.ió? kódol I-iindili restrikciós enzim hasítási hellyel az 5’ véghez adva, állítunk elő az alábbi körülmények között. A pl-ÍSGHMI? és pSRRDHEI templát plazsnidot az: EP 8989816 AL számú európai szabadalmi bejelentés leírass alapján állítjuk elő.
A reakcíóeicgy összetétele az alábbi; pl-lSöíM! 7 plazmül DNS, 25 ng 7AL.1P öiigöuukleötld-iéncindííó, 5*3 pmol: E1KSPRI2 <íligon:ukleotid-lárseinditó, 58 pmol dNTP koktél, 5 pl löx RCS-puRer, 5 pl wpATag' DNS-polimeráz (Periéin Elmer), 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióelegyet 59 μΐ végtérlogatra állítjuk be desztillál!: víz hozzáadásával, és PCR» bea alkalmazzak.
A PCR termális körülméayei: melegítés 94°€«οη 2 percig, «Mi uíás az alábbi ciklust ismételjük 3Ö- ab kálómmal: WC-on 1 perc, 3S°C~on 1 pere és 72öC»öö 2 pere, majd melegítjük 72N2-O© 1.8 perces keresztül.
Az FRL, egy részletét, CDRL,~et, PR1,2A és CDRtH kódoló LM1~F2 ÖNS-fragmeost az alábbi körülSíéavek közön állá jak ele.
A reakcióelegy összeíéísle az alábbi:
pL2S pi&zmid DNs,25bg
MKCDP11 oligonukleotid-lásciadltó, 50 pmol
HKCDRi2 olsgouakfetld-láscísdiló, 58 pmol dNTP koktél, 5 pl lOx PCR-paifer, 5 pl axtpti'fág BNS-polimeráz, 2,5 egység
A festi összetételű reakeiöelegyet :58 pl végiértógatra állítjPk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRben alkalmazzuk.
A PCR termállá kbrüimésyel: melegítés 940C-ím: 2 percig, ami után az alábbi ciklust. NsfefejSk 38 ab kaiommat, 9PY~on 1 perc, ur. i perc A C-oo 2 perc, mául melegítjük 72°C-os 18 peatnkeíes/tül
A CDRlrt, PRLs-at és a CDRL-j egy részletét kódoló LMÍ-F2 DNS-lragmenst az alábbi kSAsények közöd állítjuk elő.
A reakcióelegy összetétele az: alábbi; pSlTPlöHl-l plazmld DNS, 25 ng HKCDF22 oligtmukieotid-lánemdkó, 58 pmol HRCDR22 oiigonukleotld-láncmditó,5ö pmol dNTP koktél, 5 pl 18x PCR-puife, 5 ui űMp/i'Ti};:! DNS-poiímeráz, 2,5 egység
A lést! Összetételű reakcióelegyet 59 pl vegíérfbgaíra állítjuk be desztillált viz hozzáadásával, ó$ PCR» beu alkalmazzuk.
A PCR termális kőrüksésyei: melegítés P4°C-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust Ismételjük 38 alkalossusa:: 94A3-ob 1 pere, 5S<!€~öö 1 pere és 72^0-0© 2 pere, i©ajd melegítjük 72cC-o© 18 perces keresztül.
A CDRL ;~at, PRU-et és az állasáé régiót a; 3’ végen egy EcoR! restrikciós enzim hasítási hellyel tartalmazó LMi~P4 DNS-fragmeusl az alábbi ködtímények között állítjuk elő.
A reakcióelegy összetétele az alábbi: pSRPDHll plazmiáDNS,.25 sg;
HK.CP 12 ollgöKukleotid-lárícinditó, 58 pmol 7Á.LCN oíígonukieotld-láucmditó, 59 zcvO dNTP koktól, 5 pl
10xPCR-puSer,5, μί ös?/?6.?űí}' DNS-pohmeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakelőslegyet 50 pl végléríögaíra állítjuk he desztillált víz hozzáadásával, és PCRbeu alkalmazzuk.
A PCR termállá körülményét: melegítés 94°C-on 2 percig, mi cián az alábbi ciklust ismételjük 30 alkalomnál: 940C-on 1 pere, 55öC-on 1 perc és 72°C~on 2 perc, majd melegítjük 72üü-on 10 perces keresztül.
Az aropiiítkált DNS-fmgmenseket a PCR után 5% peliakrÍlainíd-gélelekiroforézissel választjuk el A gélt az eiektroforézis mán 1 pg/ml etidkun-bromiddal festjük az előállítót· DNS UV-íény alatti detektálásához. Az így detektált megfelelő DNS-csikokaí pengével kivágjuk.
hj Második PCR-iépés
Az LMl-DNS-í, smefyiw a fent leírt LM1-F1-DNS, LM1-P2-DHS, LM1-E3-DNS és LMl-Fd-feNS Irag-mensek luzíonáltatva vannak, az alábbi körülmények között sildjük ele,
Á reakcióélegy összetétele az alábbi
Az első PCR-lépésfeen előállított LM1-P1-DNS gél&agmeuse.
Az első PCR-lépésfeen előállított LM.1-F2-DNS géllragmense,
Az első PCR-iépésfeen előállított LM 1-F3-DNS gétfragmense,
Az első PC R-lépésfeen e tőál!iíott LM. 1-F4-DN S géílragtnertse
7A.L1 P ríligunukieötid-lándndttő, 50 pmo!
7ALCN ötígonuklentidAáne lódító, 50 pmol d'NTP koktél, 5,0 pl lfeFÜR-pö<er,5$ uíspOTHij'DNS-polimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű, reakcióelegyet 50 μί végíérfogaira állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRfeen alkalmazzuk.
A PCR tennáds körülmények melegítés 94°C-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 36 atfcalommal:: WTon 1 perc, 55:'C-on 1 pete és 72°C-on. '2 perc, majdmelegítjük 72Ά>οη 10 percest feefeszöll.
Az így előállított LM 1 DNS-fragmenst a gCRL! plazmidba mzeríáljuk Anáörj>oííe Lí efeumg Áh (Invítíogen) alkalmazásával a gyártó atasításait követve, és bejuttatjuk a reagenskészletbeo lévő kompetens A co/i ΓΟΡ10Γ sejtekbe A hurnam/alt ÍRA-8 konnsú láncát ti Ml-ítpusú'í kodolo S2en HNS-ek nukleotídszekvene iáját igazoljuk a dideoxi módszerrel [Sanger, F.S. és mfstd ,, Proe. Natl, Aead. Scí, USA 74,540-5467. old, 11977) j, 3 ?í)() DNA A'Uiíyzer alkalmazásával (dd/ PR/ÁA/; Periem Elmer Applied Biosystems, Japan).
A kapott piazmidot pCR3.1 /LM I -2-nek nevezzük <a humanizált TRA-8 könnyű l?áne (LMl-tlpnsú) variábilis régióját és huraáo lg könnyű lánc állandó régióját kódoló cDHS-t hordozó plazmidl.
Az LM 1 DNS-íragmeust ísrtateaző pCR3.1/LM 1-2 pfezmidöf emésztjük HindiH és EeoRl. restrikciós euzhnckkel, ug pHSG399 klónozó plszmid DNS-t emésztünk Hindii!és FeoRl restttkelős enzimekkel, és azután déíószfefdáljtik CÍP-pel. A kapott défeszforilák pHSO309 DNS-í és a Hindiül és EeoR? restrikciós enzimekkel emésztett LMü DNS-lragtsesst: összelsgáljuk a Z/garmí? Áh .Fesfar 2.6 (Tékám Shuz© Co., Ltd.) alkalmazásával, Aztttán A etilt 131-15« sejteket ttauszlbíUíAmk a ligák JÖNS-sel, és 0,1 rnM ÜPTGM, 0,1% X-Gal-í és 50 j.tg/nd kloramfeulkolt tartateazó LR-agar tápkőzegre szélesítjük (végkoneettírádók), A kapott fehér hutísz67 fertnánsokat 59 pg/ml klörajntenikelrtartalmaző folyékony LB-íápkőzegben tenyésztjük, és piazmid DHS-t exttahálunk a kapott tenyészetekből az: alkalíkos-SHS eljárás. szerint Az extrahált ptenld l>NS~t emésztjük HindlH és EcoRt enzimekkel, és azután kíválüsztünk egy LM1 DNS-hagmcnst hordozó klóm 1% ngarőzgélefekttöforézisssk
A fenti eljárás eredményeképpen eiőálíüjtíka humanizált TRA-8 LM 1 könnvö lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját tartalmazó fúziós riagmensí hordozó pHSG/M 1-2-2 piazmidot. Az. ezen piazmidot hordozó & coÖ tr&nszforniánst - amelyet £. coó' DH5«dp®GtMl-2-2-nek nevezünk - letétbe heiyezíők az; „lütentational Patent Organism Deposítary, Halional Institafo oí Advanced indnsn-íal Setettee and leehnology” intézetnél (1-1, Higsshi 1 ehome Tsakuba-shi, íbárakl-ken, 3Ő5-5466, Japsn.i 2001. április 29-án a tnikroorganízmasok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a FER.M ÖP-7562 letéti számot kapta,
3) A pSR/LM t-2 píazmid előállítása ihamanizáít TRÁ-8 LM 1 könnyű láncot kódoló espressziős
A humanizált TRÁ-8 LM 1 könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK. lánc adandó régióját tartalmazó fúziós frsgmenst hordozó pHSG/M 1-2-2 piazmidst emésztjük Hindiit és EeoRl restrikciós enzimekkel.
pg pSRPDHH plantid DNS-t (EP ö 999 816 Ál számú európai szabadataij bejelentési emésztünk Hindii! es, feoRl re»lrskcsos enzimekkel, es azumn defosziófilaljok t IP-pe1 A kapott detox/forttált pSRFDHH DNS-t és a pMSGM 1-2-2 píazmidbói: előállított HiodlíLEeoRi ÖNS-íragmenst összeligáljuk a HAH fogota? toí I t-moíi 2 ő 0 akara Shnzo Co, Ltd 1 alkalmazásává kzutan £ λ ή HH5o sepekcí ttunv/tomiákusk a hgáh DNS-sel és l.8~agarra széleszsjdk. A kapott Irartszformánsokat 109 pg/ml ampicilltot tartalmazó folyékony 1..Btáphözegfeen tenyésztjük, és plazmái ONS-t extrahálunk a kapott tenyészetekből az ölkaiikus-SDS eljárás szerint. A pSRPDHTí vektorban lévő kívánt ©HS-ifagarnns Inzercióját és irányítottságát IWS-szekvcnálóss&l igazoljak génszekvenekt analizátor alkalmazásával.
A kapott expressziós piazmidot, amely a humanizált TRA-8 LMl könnyű: láncát kódoló clTNG-i hordozza, pSR/LMi-2-nek nevezzük, (4.2) Expressziós vektor előállítása a humanizált ellenanyag könny ö láncával (LM3-tipu$ő)
Autóita 73. azonoslíószámá szekvencián bemutatjuk, a TRA-8; egér mttj-bumán-HRS ellenanyag kőnynyú lánca aminessv-szekveneiájának más típusú (LM3) humanizálása során a TRA-8 kőnayö lánca aminosavszekvenclájánsk W-terminálisátóI számítva a 8. tofoosavai (hiszíldm), a 9. aminosavaí (Imin), a 19, sminosavai (foniSalanmk « 11. amfoosavat (metiomn), a 13, aminosavaí (treosfo), á 29. mnluosavaí (szerln), a 42. aminosavar (glutamín), a 43. aminosavat (szerin}, a 77. ammosavat (aszpar&giü}, a 78, nminosavat (valln), a 89. aodnosavat (szerín), a 83,. omlnosavat (leneln), a 85. ammosavat (aszparagínsavj, a 87, aminosavat (téndalanin), a 99. aminosavat (gllein), a 103. smlnosirvat (leucinj és a 108. ami sósavat (alanin) helyettesítetttik sorrendben prolin, szenti, szerin, leueia, aianto, rieosin, fóti, alanin, széria, isméin, prolin, fenslalauis, treonia, rirsztn, glatamio, valis es ireonm rmtinosávakkak A kapott szekvenciát LM3-mrk nevezzük.
A TRA-8 anti-humán-DKő ellenanyag ilyen típusú humanizált könnyű lánc ammosav-szekvéneiáit (tM34?p«siL73. azouoshószámó szekveneta) hordozó expressziós vektorokat az alábbiak szeriül: állttjuk éló.
1) Humanizált TRA-8 1..M3 kőhhyö láncának variábilis és állandó régióinak előállítására alkalmas lánchíd siók szintézise
Az LMJ ροΠροροόίήηοοί kódoló DNS· (73. azonosítószámú szekvencia), amely a. TRA-S hsnmuizáit ami’DR.5 ellenanyag variábilis régiójának és a humán lg könnyé láncának (r lánc) fúziója, PCR-ek: komhtódejával szintetizáljuk meg.
A 7AL1P (47. azonosítószámú szekvencia) és 7A.LCN <48. azonoskószáínó. szekvencia) mellett az alábbi oügonakleotid lánctsdlíókaí szintetizáljuk meg a FCR-hez:
S’-atetagííct cagagstgga gacagaeaca atcctgciat gggtgctger getctgggtt csagg-3' (MÖD1F i; 78. azonosító számft szekvencia);.
5'-cagcaceeat ageaggattg tgíetgteíe eatcíeígsg aaetagsíga gaggaígetl ettasgetí-3' (MÓD ÍR 1; 77, azonosltószáraú szekvencia);
SMeoctggt gaeattgiga (gaeccaate tecaagöcí ítgteigeat cigiggggga eagggte-31 (MODIF22; 80, azonosb iószámú szekvencia);
5'-cC’tggagaf ígggU.5tca caaigicace agtggagcct ggaaeccaga gcag-3' (M< Ú) 1R.?M azonositoszánm szekvencia);
5*«aeeateacet geaaggeeag icaggstgtg ggiacígcíg ísgcciggia ccaacagaaa eeaggaa-3' (MÖDIF3; 82, azanesiíöszámú szekvencia);
5>tacagcagía ceeacateet gacíggccá geaggígatg gtgaecctgt eccccaeaga tgcngacaaa ga-3f (MÖD1R3; 83. azonosiíószántó szekvencia);
-aágeáeccáa acíeeteste talígggcat ceacccggca caetggggíc ccagaisggi: tiacaggcag t~3’ (MÖD1F42; 84, azonosítószámú szekvencia);
5'reeeagtgtgc cgggtggatg eeeaatagat gaggagiíig ggtgcítttc ctggtttetg: ttggtaccag ge-3' (MOD1R4; 85. azonosítószámú szekvencia);
5'-gggtetggga cagactteac ectcaceatc íclagíetgc ágccggagga títtgeaaee íat-T (MOD1F5; §b. azsmositószámú szekvencia);
S’-actagagatg gígagggíga agtctgtcec agaeccactg cetgtasaee faieígggae-3' (MÖD1R52; 87, azonosítószámú szekvencia), ő’-íaeígíeage antatagesg etáteggacg íieggícaag gcaccaaggí ggaaatc-3' (MÓD ί Pb; 88, azonosítószámú szekvencia);
S’-egiccgatag ctgctatatí getgacagta ataggttgca aaatcetecg getgeae-3' (MGDlRó; 80)
S-aaacggaeig tggctgeace atetgleíte alcíteeage caíctgatgá g-3f (MÖD1F7; 90, azonosítószámú szekvencia);
S-g&agaígasg acagaiggtg cagccácágt cegltigált Iceácéíígg tgccúgacc gsa-3' (MÖD1R7; 7), azonosítószámú szekvencia); és
S’-agatttcaac tgclcateag atggcgggsa (LS I7; löl. azonosítószámú szekvencia).
2) A pOtX.l<LM3k3r44 plazmád előállítása (fenmaaizáh TRa-8 LMÓ-típasú könnyű láncának klónozása)
A 73, azÁmosltÓszámú szekvencián bemutatott anúnosav-szekvenciát kódoló LM3 DhiS-fragmeast ketlépéses F€R~reí állítják elő. plazntld vektorba inzeriál)uk>, és b, co/Aban kiónozzak.
a) Első FCíMépés
Az 5’ végen hozzáadott: Hindit! restrikciós enzim hasítást helyet tartalmazó szekréciós szígnálszekveneiái, FRDs-et, GDRLret, FRL2-i és :CDRt..2-h FRlj-at, CORLj -at, FRhi-eí és az állandó régió egy részletét tartalmazó t,M3-F31 B DNS-ftagmenst az alábbi körülmények között állítjuk elő,
A reakcióé tégy összetétele az alábbi:
MODlFI cngonukieotki-láttesrídítő, 5 pmol
MOS'.)'· RÍ oUgonukleotid-iándítáitó, 5 pmtsl
MÓD IF22 oiigasakleotid-lántínditó, 5 pmtsl
MOD1R22 olígonokleotld-Iánenuhti), 5 ρηνοΙ
M0D1F3 oilgonukleotld-láncinditó, 5 pmol
MOO i R.; obgonukleotid-lánchíáitő, 5 pmol
MÓDI 1'· 42 ongonukleoiid-lánesnditó, 5 pmol
MÓDI R4 oligonukleeiltl-lánctndiiö, 5 porol
MÓDI rí ollgonukleotid-láseindlíö, 5 pmol
MÓDI R52 oligosuklsotid-iánclndstö, 5 pmol
MÓDI bő ölígöOöRleöisd-lánmnditö, 5 pmol
M0DIR6 digonukleotítl-iáneindító, 5 pmol
MODIF7 olígonukiectíd-láncindító, 58 pmol
MÓDI E7 ollgonukleotíd-lásteinditö, 5 pmol
A L1 F oligermklsotíd-lánclhdttó, 56 psnol t.R 17 obgonukleotid-láneindltó, 50 pmol dNTP koktél, 5 pl l&k FCR-pufíer, 5 pl íímp/ÁRzy DNS-ρο Ismersz, 2,5: egység:
A. tereit összetételű soakesóelegyet 50 pt végtérfbgatra állítják be desztillált víz hozzáadásával, és FCRhers alkalmazzuk.
A PCR termáiig körülmények melegítés: 94’hF-on 2 percig, ami irtán az alábbi ciklust Ismételjük 30 alkalommal: 94°C-on I pere, SóAl-cso 1 pere és ?2GC-ön 2 pere, majd melegítjük ?2°C-ös 10 percen keresztül.
Az állandó régió egy: részletét a 3’ vége® egy EeoRI restrikciós enzim hasítási hetlyel tartalmazó 1,M3« F31C DNS-fragmens! az alábbi körülmények között állít juk elő.
Á pSRPDHB íetnpláí plaztnldm az FF 8909:8 ló Ál. számú európai szabadalmi bejelentés leírása alapján állítják elő.
A reakcíóelegy összetétele az alábbi:
pSRPDHH plazmid DNS, 25 ng
MÓDI F7 í>Sig.cnukleotid-lánctndíió, 50 pmol
7ALCN öllgonukleoíid-íáneindiió, 50 porol dNTP koktél, 5 pl lŐx FCR-pref&r, 5 pt awpÍÍÍ'aq DNS-poíimeráz, 2.5 egység:
A lenti összetételű rettkelöelegyet 50 pl: végtértogatra állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és PORlsen alkalmazzuk.
A PCR termáiis körülményei: melegítés 94'C-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 alkalommal: W’C-on 1 perc, 55®C-on l perc és 72°C~on 2 pete, majd melegítjük ?.T;'C-on 10 percen keresztül.
Az amplíltkálí WS-feagmeKseket a PCR után 5% poliakrdnndd-géfelektroferézjssel választjuk el. A gélt az elekíroferézts után 1 ugiml etldiuns-bromlddal festjük, az elóéllitoít DNS DV-feny alatti detektálásához. Az így detektált megfeleld DNS-csíkokat pengével kivágjak.
b) Második P€R-tépés
Az LM3~l>hi$d, amelyben a fent leirt LM3-P31B és LM3-F31C DhíS-lragmensek fuzionáltsíva vannak, az alábbi körülmények kdzóíí áll ttjuk dó.
Á reskciőelegy összetétele az: alábbi:
Az: első PCR-lépésben előállított LM3-F3 íB-DNS gélfragmense,
Az: első PCR-lépésben előállított I.M3-F3IC-DNS gélhagmense,
AbIPohgonnkfeotid-iáftcindító, 50pntol
7A1,CN ölígőnukleoliddáncindító, 50 pmo! dfeTP bökték 5,0 pl 10>; PCR-puffer, 5,0 pl mj?pií2h</ DNS-pollmeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reahcloslegyei 50 pl végtérfegaha állíijnk be: desztillált víz hozzáadásával, és; PCRben alkalmazzuk.
A PCR termáik körülményei: melegítés 94::'C-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 sb kstloamud: 94®€-ρη 1 pere, SÓ^C-on 1 pere és 72“C-on 2 perc, majd melegítjük ?2*ü-öh 10 percen keresztül.
Az Így elóálliíntt: LM.; DNS-iragmenst a pCRo.í plazmádba inzertáljuk Aaámytw L4 c/ortfeg Án s tnvísrogen) sikahmtzásával a gyártó utasításait követve, és bsjaá&ipík a reagenskészfeíben lévő kompetens A, <.':·>;/ TOP 3 0F’ sejtekbe. A humanizált TRA-8 5. ALI könnyű láncát kódölé ezen DNS-ek nukleolid-szek véne iáját Igazoljuk a dídeoxi módszerrel ISanger, P..S. és mtsíü,, Proe, lkaik Arad, Sei. USA 74, 5463-5467. old, (197?)], 3700 IÁI dzKtlyzer alkalmazásával k-LL PR/SM: Perkín Elmer Applied öiosystents, .lapan'i.
A kapott plazmidót p€R3,lO43-44-nek nevezzük (a humamzáh TRA-8 LM3 könnyű lánc variábilis régióját és humán lg könnyű lánc állandó régióját kódoló cDMS-t hordozó plazmidl.
Az LM3 DNS-fergtnenst tartalmazó pGR3.1/LM3-3-44 píazuódoi: emésztjük Hindii! és EcoRÍ restrikciós enzimekkel.
:gg pHS:G390 klónozó píazmíd DNS-t emésztünk Hindi II és: EcoRl restrikciós enzimekkel, és azután •áeíbszferüáljuk ülP-pei. A kapott détöszlbriláít pH$ű399 DNS-t és: a Hindlll és EcoRl restrikciós enzimekkel emészted LM3 HNR-feagmenst összeiigáljuk a £kR4 /./gírffen O Fesio» 2.í? (Tákara Shnzo Cm, Ltd,) alkalmazásával. Azután eoA Dfl5o sejteket transzformálunk a ligáit DNS-sel, és 0,1 tpM IPTö-t, Ö, 1% A-öal-t és 59 ggínd kloramfenikolf tartalmazó LS-agár tápközegre szétosztják t végkoncestoációk):. A kapott fehér transzfnnnáasokaí 50 pgind klöramfenikolí tartalmazó folyékony LB~íápközegben tenyésztjük, ásplazmid DNS-t extraháltírsk a kapott fenyészetokhdí az alka&us-SDS eljárás szerint. Az extrahált piazmid DNS-t emésztjük Hihdíll és LtooRI enzimekkel, és azután: kiválasztunk egy LM3 DNS-iragmeast: hordozó kiónt 1% agárézgétolekírofórézisseí,
A .fenti eljárás eredményeképpen eléiállitjnk a humanizált TRA-8 LM3 könnyű lánc variábilis régióját: és humán IgR lánc állandó régióját tartalmazó fcíös fragmenst hordozó pHSO/M3-3-22 plazrnidot. Az ezen plazmídot hordozó £ &Aí tegnszibrmánst - amelyet £ coli ÖH5népHSG/M3-3-22-!tek nevezünk - letétbe helyeztíík az „InfernatiotKá Patent örganism Peppsitary, Nlaíianal Insíituts of Advanced Industrisl Science and Technology” intézetnél ()-!, Hsgashi ! chome Tsttkííba^slíi, Ibktskí-ken, 385-5466, Japan) 200!.. április 20-ás a ííűktoorganizmusok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a FERM 8P-7564 letéti számot kapta,
3) A pSR/XM3-3~4418 plazmid előállítása (humanizált TRA-8 LM3 könnyű láncot kódoló expresszié» plazmid)
A humanizált TRÁ-8 LM3 könnyű lánc variábilis· régióját és humán IgK lánc állandó régióját tartalmazó fhziós fmgmenxt hordozd pHSG/M3-3-22 piazmidoi emésztjük Hindi 11 és EcoRI resöíkctós enzimekkel.
pg pSRPPHf l plazmid DNS-í (PP Ö9Ű9816 Al. számai európai szabadalmi bejelentés) emésztünk Hindii! és EcoRI restrikciós enzimekkel, és azután defószforiláljuk CÍP-pei. A kapóit defoszforifált pSRPDRB DNS-t és a pHSG/M3-3-22 pfezmidbói előállított Hindiíl-EeoRI PNS-íragmenst összeligáljuk a £>6ói /Jgohou Á'á kareion 2.ö í fakara Shuzo Co., l.ld.) alkalmazásával. Azután £ eoó DB5« sejteket transzformálunk a ligáit PNS-sel és LB-ag&rra szélesztjük. A kapott íranszíormánsokaí 100 gg/ml ampícUHnt tartalmazó folyékony kötápkbzeghen Tenyésztjük, és plazmid DNS-t extraháiunk a kapott tenyészetekből azalkalíkas-SDS eljárás szerint, ApSRPDBH vektorban lévő kívánt DNS-fragmens inzerciójút és irányítottságát DNS-szekvönáiással igazoljuk gén-szekvencia analizátor alkalmazásával (.-ÍR/ Α9/.8Λ?' 3 W Dóid rtonfesr; Applied Riosystems).
A kapott expressziős plazmidót, amely a humanizált TRA-8 TM3 könnyé láncát kódoló cDNS-t hordozza, pSR. LM3-3-44-Í ö-nek nevezzük, (4.3) Expressziós vektor előá ll kása,a humanizál! ellenanyag könnyű láncával (LM4-t!pusá)
Amint a 74, azonos dós zárná szekvencián bemutatják, a TRA-8 egér antt-hamán-DRS ellenanyag könynyű teca ammosav-szekvcneíájánsk ínás (I.M4 típusú) immunizálása során a TRA-8 könnyű lánca ammosavszekvenciájának N-ternrinálisától számítva a 8, aminosavat (hiszíidin), a 9. aminosavat (lizin.s, a lö. aminosavat (iémlaiasm), a 11, anúaosavat (metiomn), a 13. wtínosavat (treontn), a 20. aminosavat (szerbi), a 42, aminosavat. (gíutamín), a 43. aminosavat (szerin), a 77. aminosavat (aszpatagín), a 78. aminosavat (valin), a 80. amiaosavat tszerin), s 83. aminosavat (feucm), a 85. aminosavat íaszparaginsavt, a 99. aminosavat (gfíclnj, a 163. aminosavat (bucin) és a ÍŐ8, aminosavat (alanini helyettesítettük soncndoen prolin, szerit!, szerit!, leucin, alanin. Peónia, Ikun, alanin, szerin. leucin, proíiu, ienilaíanm, treonín, gíotamíü, vada és treottm aminosavakkal. Á kapott szekvenciát LM4-nek nevezzük.
.A TRA-8 anti-munán-ORö ellenanyag ilyen íiposű (LM4) humanizált könnyű lánc utninosavsxekveneiáit (74. azonosítószámú szekvencia) hordozó expressziös vektorokat az alábbiak szerint átütjük elő.
1) Humanizált TRA-8 LM4 könnyű láncának variábilis és állandó- régióinak előállítására alkuimás láaemőítők szintézise
Az: 12H4 polípeptidiáncot (71 azonosítószámh szekvencia) kódoló PNS-t, amely a TRA-8 humanizált antí-DR5 ellenanyag variábilis régsójá wk és a barnás tg könnyű láncának (k: lánc) fúziója, RGR-ek kombinációjával szintetizálunk.
A 7AL1P (47. azonosítószámú szekvencia), 7Ai.CN (48. azonosűószámű szekvencia), MOP1F1 (78. azonosítószámú szekvencia), MÖD1S.Í (79. azonosítószámú szekvencia), MOD1F22 (80. azonosítószámú szekvenciái, MÍ.)D1R22 (81. szonositöszámú szekvencia), MODIF.3 (82. azonosítószámú szekvencia), MÖDÍR3 (83. azonositószátnű szekvencia), MÖH1F42 (84, azonosítószámú szekvencia), MÖD1R4 (85, azéΤ>
nösltószámú szekvencia).; MÖD1F5 <86. azonosítószámú szekvenciák MOD1R52 (87- azonosítószámú szekvencia), MÖD1E7 (90. azooositószámú szekvencia) és MÓDIR7 $L azonosítószámú szekvencia), LR.17(10t. azonosítószámú szekvencia) méltód az alábbi oitgopukteotid láscindltökat szintetizáljuk meg a PCR-hezc
S’-ítcfgtcage aatótageag ciatcggseg deggícaag geaceaaggt ggaaatc-3’ (MOOIF62; 92, azonosítószámú szekvencia)
5’-cgtccgatag etgetatatt gctgaeagaa aísggílgea. aaalcctccg gcígeag-3' (M0D1RÓ2; 93. azonosítószámú szekvencia)
2) A pCR3d/LM4-S~3 ptatid elóáWíásn (tenmaMR TRA-Ó LM4-típ«sú M»ayi látseáMk klónozása)
A 74, azonosítószámú szekvencián bemutatott anrlsosáv-szekvenoíái kódoló LM3 DNS-fragnaensí kétiépéses PCR-rsl állítjuk elő, plaznnd vektorba Inzertáljnk, és R. eotóban klónozzuk.
a) Első PCR-tópás
Az 5’ végen hozzáadott l-iináll) restrikciós enzim hasítási helyei tartalmazó szekréciós szignálszekveneia régiót, FRL:i-et, CDRlf-et. FRL>-t és CDRJtó-í, FRLj-at, CDRL3-at, FRL4-oi és az állandó régió egy részletét tartalmazó LM4-F418 DNS-R&gmensí az alábbi köbUntónyek között állítjuk elő.
A re&keióelegv összetétele az alábbi;
MŰD IFI oligonskleotiá-láncindító, 5 porol
M0D1RI oligonúktóotid-láncindltó, 5 pmol
MOD1F22 obgoímkfeöítd-láneimlítö, 5 pmol
MÓDI R22 öligemufclceííd-láneíndttó, 5 pmol
MÓDIP3 oiigomtkfeobd-láncmöitó, 5 pmol
MÓDI R3 ongonukleotid-láneindító, 5 pmol
MÖ13IF42 oligonukleotid-láneíndító, .5 prnol
MO15ÍR4 öiígonnkteotiá-lánc indító, .5 pmol
MOI31F5 oligomúíleotíd-bmeindltó, 5 pmol
MÖD1R52 oiignnúkleotíd-láncinditó, 5 pmol
MOD:i-F62 oligömíktóodd-iánclndúó, 5 pmol
MOD1R62 ollgonnkleotid-iáncindltö, 5 pmol
MÖDTP7 oh'gonokieond-lánemdító, 50 pmol
MODIR7oíigormkteotld-láncindltó, 5 omol
7AL4F oagoonkSeodd-iáncinditó, S0 pmol
LR17 öiigönuktóöiid-láncindltó, 50 pmol dNTP koktél, 5 pl Utó PCR-pnftór, 5 pl ompETtó/ DNS-poiimerúz, 2,5 egység
A lőni 1 összetételű reakeióetógyet SÓ pl végtérthgatra állítják be desztillált víz hozzáadásával, és FCRben alkalmazzak.
A PCR termállá körülményei: melegítés 94“C-on 2 percig, arni mán az alabbi ciklust ismételjük 30 alkaiötmnal: 94a€~on I perc, 55Α)-οη 1 perc és 72aC-on,2 perc, majd melegítjük 72öC~on 10 percen keresztül.
Az állandó régió egy részletét a 3’ végen egy BeoRí restrikciós enzim hasítási hellyel fertshnazü LM4F4JC DNS-íragmenst az alábbi kört'dpiények között állítjuk sin.
.A. pS.RPD.HH tompját pfezmidot az EP 8909810 Ál, számú európai szabadalmi bejelentés leírása alapján állítjuk 'elő.
A rettkcióclegy Összetétele az alábbi;
pSRFpHH phoműd DNS, 25 ng
MÓD 1F7 oiigenukléoí íd-láneinditó, 50 pmol
7ALCN plígonukleotid-láireindhő, 39 pmol dNTP koktél, 5 pl
10x PCR-psjí'er, 5 pl a-íííp/iTag DNS-poiuneráz, 2,5 egység
A fenti összetételű i-eakeióeiegyet 58 pl végiéríógatm álltjuk he desztillált víz hozzáadásával., és PCRben alkalmazzuk.
Á PCR. íermális körülményei: melegítés 94*€~on 2: percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 alkalauunai: O-PO-ott .1 pere, SS0C-on í perc és ?2“C-on 2 pere, majd melegítjük 72':'C-oií t{) percen kérésztől.
Az ainphEkáh DNS-feagmensehet a POR után 5% poiiakrílaípid-gélelékiroferázsssel választjuk el. A gélt az elektaídrázis után 1 pg/ml etldlpm-brömiddal festjük az előállított DNS DY-tény alatti detektálásához. Az így detektált megfelelő DNS-csikókat pengével kivágjak,
b) Második RCR-tépés
Az LM4-DNS-t, amelyben a fent leírt LM4-P4ÍB és EM4-F41C QNS-íragmensek fezíónáitatva vannak, az alábbi körülmények között állítják elő.
A reakciöciegy összetétele az alábbi::
Az első PCR-lépésben előállított LM4-F4ÍB-DNS gélS'agtnense,
Az első FGR-iépesfeen előállított LM4-P4i€-DMS gélfeagmease, ?AI, IP oligönükleotíd-láneroditö, 58 pmol
AEüN öligönukleöEd-iánctmihő, 58 pmol dNTP koktél, 5,0: pl íOx PCR-puRer, 5,0 pl amííEDíp DNS-ppllmeráz, 2,5 egység
A lenti összetételű reakciőeiegyet 50 pl végtérlógaím állítjuk be desztillált víz: hozzáadásával, és PCRben slkakuszzuk.
A OCR termálÉs körülményei: melegítés 94Y3-on 2 percig, ami mán az alábbi ciklust ismételjük 30 aikaletranafc WC·® 1 pere, Sá^C-on 1 pere és 72*C~en 2 pere, majd melegítjük. 72flC~on: 10 percen kérésziül.
Az: így előállított Lhí-1 DNS-fmgmenst a pCR3.1 pfozmldba mzertáljök Ruáumdré D? cfemng Kő (Isvitrogeh) alkalmazásával a gyártó utasításait kővetve, és bejuttatjuk a reagenskészletben lévő kompetens A. coli TOP!OF’' sejtekbe. A btammizáh ΓΡ 4- 8 LM4 könnyű láncát kódoló ezen DNE-ek nnkteoiid-szekvenciájáí igazoljuk a dideoxl módszerrel [Sanger, F.S és mtsai., Proc. blatt Ácad. Ser, USA 74, 5463-5407. old. f 1977)j, JZdöDAd .dnmgmr alkalmazásával (4 EZ Zb?< W; Perkin Elmer Applied Biosysietss, Japan).
A kapott plazmidot pCR3 J,/EM4-5-3~nak nevezzük (a humanizált TRA-8 LM4 könnyű lánc variábilis régióját és humán lg könnyű lánc állandó régióját kódoló <ÖNS-t hordozó plazmád).
Az l,M4 SöNS-ftágfláeast tartalmazó pCR3,j/iL,M4-5-3 plazmidöt emésztjük Hindii! és.BcoKI restrikciós enzimekkel.
pg pHSG399 klónozó plazmid DNS-f etnészílfok ttitídlH és EcoRl restrikciós enzimekkel, és azután defoszforiláljak ClP-pel, A kapott deíószforiiak pHSG399 DNS-t és: a. Hindit! és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett RM4 EiNS-t^esesst: összehgáijuk: a £WA ligatton O hívs/oo 2ó{Takars Slmzo Co., kid.) alkalmazásával, Azután £. Wi DH5« sejteket ttmiszfönnahmk a ligáit i3hiS-sel, és 8,1 mM IPTO-t, 0,1% X-öal-t és 5Ö pg/ml klemmfemkötí tartahnazó LB-agar tápközegre szélesztjük (végkoncentt-áciök), A kapott léhér ttanszformánsokítt 58 pg/sti kforamfonikoít tartalmazó folyékony lB~fápkSzegl>en tenyésztjük, és plazmád DHS-t éxíráfeátettk a kapott tenyészetekből az. alkslikus-SÖS eljárás szerint. Az extrahált plazmái DNS-t emésztjük Hindin és EcoRI enzimekkel, és azután kiválasztunk egy I..M4 WS-fagmenst hordozó kiónt 1% ngarózgélclektrofórézissel.
A fenti eljárás eredményeképpen előállítjuk .a humanizált TRA-8 EM4 könnyű lánc variábilis régióját és komán IgR látta állandó régióját tartalmazó fúziós Ifagmepst hordozó ρΗ8(3.·'Μ4·5··3··'ί piazmidot.. Az ezen piazmidot hordozó .£, c»f/ transzformáns! - amelyet R. eoh DH5íbpHSG<M4-S-3-i-nek nevezünk - letétbe helyeztük az „Imernational Patent Organlsm öeposhary, Hátiénál Instiiute öf Advanced tndusttial Science and Technology” intézetnél (1-1, Higashi 1 chorne Tsukuba-shi, Ibaraki-Rss, 3S5-5466, Tapsa) 2881, április 28-án a mikroorganiznmsök letétim helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a EERM 8P-75Ő5 letéti számot kapta.
3) A pSR/RM4~5~3-3 pbzmtd előállítása (lm summáit TRA-8 EM4 könnyű láaeoí kódoló expressziós plazmid)
A humanizált TRA-8 LM4 könnyű láne variábilis régióját és humán IgK. láss Állandó régióját tsrtalmazó fúziós fegmenst hordozó pHSG/M4-5~3-i plaznsdot emésztjük Hindii) és EcoRI restrikciós enzimekkel.
pg pSRPERíH piamsd DHS-í (BF 0909816 Ál, számú esrőpíú szabadalmi bejelentés) emészfünk Hindii! és EeoRI restrikciós enzimekkel, és azután defoszforiialjuk CÍF-pel, A kapott deíószforilált pSREÖHH DNS-t és a pHSG(M4-5-3- l plazmidbói előállított iBodlll-BeoRl DbS-ttagmensl összeligáljuk a ÓRA óiguíion &ΪΪ Fémes?(Takarít Shuzo Co., Etd.) alkalmazásával. Azután .£, c<jRÖH5o sejteket transzformálunk a ligáit: DNS-se! és LR-agarra széiesztjők, A kapott trtmszformánsokst. 180 pghnl smpicilünt tartalmazó folyékony EBtápkőzegben tenyésztjük, és plazmid DMS-t exírahálnnk a kapott tenyészetekből az. alkaltkus-SDS eljárás szerint. A pSRPHHH vektorban lévő kívánt DNS-tragmsns iozercsóját és irányítottságát DNS-szekvenáiással Igazpijnk génszekvencií! analizátor alkalmazásával (XBI Rk/.SA/ 3700 ÖAM Aa&fyzsn Applied Biosystems).
A kapott expressziós piazmidot, amely a humanizált TRA-8 RM4 könnyű láncát kódofo eDriS-t hordozza, pSRdLM4-5-3-3~nek nevezzük.
(4,4) Expressziős vektor előállítása a ísuraardzátt ellenanyag könnyű láncával (LMS-tipnsá)
Amint a 75, azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér ariti-lntmás-BRS ellenanyag könynyö lánca aminosav-szekvenclájának más ÍI,M4 tlpasá) humanizálása során a TRA-8 könnyű lánca amlnosavszekvenciájának N-terminálisátói számítva a 8, mnmosavaí (feiszíidin), a 9, aminosavat (lizin), a ló. aminosavat (fonilaianin), all. anunosavaíOrtetioínn), a 13. ásnínosavaí (íreonin), a 20. amíoosavat (szerb), a 42. atnin csávát (giutamin), a 43. zminosavat (szerin), a 77. ammosavat (aszparagin), a 78. ítminosavat (valin), a 80. sminosavai (szerin), a B. ammosavat (leodn), a 183. sminosavat (leucin) és a 188. ammosavat (alansn) belyetteshet75 túk sorrendben prolin, szerin, szerin, teását, aiatún, treonin, lizin, aíanin, széria, fenéin, prolin, feuílalanin, vaKa és treonin auhnosavakkai. A kapón szekvenciái LMó-ttek nevezzük.
A. TRA-8 anú-hamáa-DRS ellenanyag ilyen típusú (LM5) hmnanizált könnyű lánc amiuosavszekvcneiáít (75. azonosftészámú szekvencia) hordozó expresszíós vektorokat az alábbiak szerint állítjuk elő.
í) Humanizált TRA-8 L.M5 könnyű lánca variábilis és állandó régiósnak előállítására alkalmas láncíadítóh szintézise
Az LM5 polipepddláncot (75. azonosítószámú szekvencia) kódoló DRS-t, amely a TRA-S htnnanízáíí antí-DR5 ellenanyag variábilis réglójáuak és a humán lg kőnoyö láncának (x lánc) lúzieja, PCR-ek kombibáeiőjával szintetizáljuk meg.
A 7AL1P (47, azonosítószámú szekveucla), 7AL.CN (48, azonösltószámú szekvencia). MÓDI FI <78, azonosítószámú szekvencia), M0D1R1 (79. azonosítószámú szekvencia), MODIF22 {80. azonosítószámú szekvencia), MÖD1R22 (81. azonosítószámú szekvencia), MOD1F3 (82. azonosítószámú szekvencia), MOD1R3 (83. .azonosítószámú szekvencia), MÖD1F42 (84, azonosítószámú szekvencia), MÖD1E4 (85. stzonosítószámú szekvencia), MÓD 18.52 (87. azonosítószámú szekvenciát, MOD1F7 (90. azonosítószámú szekvencia) és 1,8.17003. azonosítószámú szekvencia) mellett az alábbi ©Rgonokteotid láncindííókst szintetizáljuk meg st PCR-hez:
5’-gggtctggga eagaettcae eeteaceate tctagteíge agceggttgga ttítgcagai tat-3' (MOD4P52;: 94. azonosítószámú szekvencia) ó’-ttetgteage aataiagcag ciateggacg ttcggtggag geaecaaggt ggaaatc-3' (MÖD1F63; 95, azonosítószámú szekvencia)
5'-egtcegaíag ctgetatatt gctgacagaa ataatetgea saatectecg gctgegg-3* (MODlRóT; 9ú. azonosítószámú szekvencia)
5'-gaagatgaag acagatggtg cageeaeagí eegitlgaú tccaeetigg tgcclceace gaa-3' (MDDIR72; 102, azonosítószámú .szekvencia)
2) A pCRAVLMS-3~42 piazmld elöálíitása (humanizált TRA-8 LMS-ripusú kbnnyú láncának klónozása)
A 75. azonosítószámú szekvencián bemutatott aminosav-szekveneiát kódoló l.MS DRS-íragmenst kétlépéses PCR-reí állítjuk elő, piazmld vektorba inzertaljúk, és £. rob-ban klónozzuk.
a).Első PCR-lépés
Az 5’ végen hozzáadott Ilmdlll restrikciós enzim hasítási helyet iarittteazö szekréciós szígnálszekvenelít régiót, FRl.<-et, €DRt,-ei, FR.Lj-t, CDRL3-i, FRLraí, GDEí ..<-at, rRLj-eí és az állandó régió egy részletét íartahnazó LM5-F51R DNS-&agsnenst az alábbi körülmények között áll ltjuk eíó.
A reakcíöetegy összetétele az alábbi:
MÓDI F 1. obgmmkfetstíd-iáncmdiíö,, 5 pmol
MÖD1R1 ollgonükleotid-lúncinditő, 5 pmol
MOD1F22 ohgonnkléotld-láncindító, 5 pmol
MOD1R22 olígoauk leoitd-ianeindltö, 5 pmol
MÓD 1T-3 oligonukieotkí-láneíndító, 5 pmol
MÓD 1R3 olígomjkíeotid-láecindhó, 5 ptnol
MÓDI F42 oíígouirileotíd-íártcindíló, 5 pmol /6
M0D1R4 ollgtmukíeödd-iáneindhá, 5 poros MÓD IΓ52 öligonukieptid-láncindlíö, 5 posoí MÓD IR52 ökgonükleotiá-iáacindítd, 5 pmol MÓD 1 ftl.3 cligonukleotid-iáncinditö, 5 ρηκϋ MÓDIRő3 oiigonukleotul-lsincirKlitó, 5 pmol MOOií·? oiigosukfootid-iáncindttó, 50 pmol MÓDI R?2 öligonukleolld-iáneiadhö, 5 pmol 7ALAP ollgonukleotid-iáncinditő, 50 pmoi LR s 7 oligonukleötiá-iáncindltó, 50 pmoi dNTP koktél, 5 pl löx PCR-puí&r, 5 pl ö/íípőTöíi' DNS-poltmeráz, 2,5 egység á fentí összetételű reakeiőelegyet 50 pl végtérfogatra áll ltjuk be desztillált víz ®öxzáadásáyak és PCRben alkalmazzak.
A PCR rermális körülményét: melegítés 94*C-tm 2 percig, ami után az alábbi ciklust otoétefük 30 alksküureai: 94cC-on 1 perc, SA'C-on $ perc gs 72°C-ö® 2 perc, magi nreiegiijük tétéC-ost 18 percen keresztül.
Az Állandó régid egy részletét a 3 ’ végen egy .Len RÍ restrikciós enzim has itass hellyel tarta 1 msző LM.5F51C DNS-íragmenst az alábbi körölmények között állítjuk elő. A pSR.PDlitt tetnplát plaz.midot az EP 0009816 AI. számú európai szabadak®! bejelentés leírása alapján állítják elő. A reakcióé légy összetétele az alábbi:
pSRPDHD plszmid DNS, 25 ®g
MÓD If 7 cdsgcmuldeotsd-kmcmditó, 50 pmol
7ALCN eligorntkleorid-láneindkó, 50 pmol
ÖNT.P koktél, 5 pl löx PCR-pntfer, 5 pl msplDag DNSepolipseráz, 2,5 egység
A Fenti összetételű reakeiéelegyet 58 pl végtérfogatra állítják be desztillált ylz hozzáadásával, és PCRbea alkalmazzuk.
A PCR iermálís körülményei: melegítés 94<;C-on 2 percig, ami alán az alábbi ciklust ismételjük 30 alkálómmal: WC-on 1 perc, 5SeC-oö 1 perc és ?2°C-on 2 perc, majd melegítjük 7.2'C-on 10 percen keresztül.
Az ampliflkált DNS-fragmensekét a PCR után 5% pöiiakriiámld-géielektsírfo’ézissel: válásijuk, el, A gélt az elektrororézis után 1 pgóni eiídimrr-hrondddal Festjük az elöállstotí DNS l'V-feny alatti detektálásához. Az: így detektált megfelelő DNS-cslkokat pengével kivágjuk,
b) Második PCR-lépés
Az EM5-DMS-t, amelyben a fent leírt LM5-FS18 és LMS-F5IC DNS-hagm. essek fozionállstya vannak, az alábbi körülmények Közöd állítjuk elő,
A reakelőelegy összetétele az alábbi:
Az első PCR-lépésben előállított LM 5-51B-DNS gélfeagmense.
Az első PCR-lépésbe® előállított LM5-51C-D:NS géifegrnense,
7AI..1 P íiligonukleotld-iárscmdité, 50:pmoi
7.ALCM oügenukteoííd-láneinditó, 58 pmol áNTP koktél. 5.8 pl lOx PCR-pKÍfer, 5,8 pl ampA&q DMS-pöiímeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű rsakeióelegyet 58 pl végtéríógatm állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és :FCRben alkalmazzuk.
A PCR tennálls körülményei: melegítés 94-C-en 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 38 alkalommal; WC-on 1 pere, óS'réJ-on 1 pere és 72°G-on 2 pere, majd melegítjük 72%ktm I® percen keresztül.
Az Így előállított ..LM5 DNS-feagínenst a pCR3. 1 plazmidfea inzertáljuk Anfenyzűfe TA clpmríg Aö (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó: utasításait követve, és bejuttatjuk a reagenskészletben lévő kompetens £. műt TOP 188’ sejtekbe. A humanizált TRA-i IMS könnyű láfteát kódoló ezen DNS-ek nukfeotíd-szekvenciáját igazoljuk a dideosl módszerrel [Sanger, F;§', és mtsal., Proe. blatt, Aesd. Seb USA 74, 5463-5467. old. (197?)] DNS-asaltzsimr alkalmazásával.
A kapott plastmídei:pCR3,lZLMS-3-42-nek nevezzük tn humanizált TRA-8 LMS könnyű lánc variábilis régióját és tanán íg könnyű lánc állandó régióját kódoló eBNS-t hordozó plaztnid).
Az 1245 DNS-lragmeusí tartalmazó pCR3.1Zl.<M5-3-42 plazmidoí emésztjük Olndiil és EcoRI restrikciós enzimekkel pg pH5G399 kloftoz© plazmid BbiS-t emésAünk Hindit! és Beofel restrikciós enzimekkel, és azután deíöszíoriiáljuk CIP-pei. A kapott defeszferilált pHSB399 BőlS-t és aHindiit és EeoRl restrikciós enzimekkel emésztett I..M5 DNS-ifagmenst ősszeiígáliuk a tígatieti Á« {<=»·.$«>« 2.8 (Takaró S'nazo Go., Ltd.t alkalmazásával. Azután A, í:í?o 13145a sejteket transzformálunk a ligáit DNS-sei, és Ö, I mM IPTG-t, 8,1% X-Gal-t és 58 pgAnl klorami'etnkolt tartalmazó Lö-agar tápközegre szslexzsjük {végkoncentráeiók). A kapott fehér ínansztormánxokaí 58 ggőui kloramfeuikolt tartalmazó folyékony LR-tápkőz.egben tenyésztjük, és plazmid OHS-t nxtrsháhmk a kapott tenyészetekből az alkalikns-SBS eljárás szerint, Az extrahált plazmid DNS-t emésztjük í-fodlH és BeoRí enzimekkel, és azután, kiválasztunk egy LM5 DbíS-tfagmenst imrdaző klóm 1% agáróz-géfeiekíroferézlssel.
A lenti eljárás ereáe?őt?yeképpen: előállítják a humanizált TRA~ő IMS könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját tartalmazó Rtziós fragmessí hordozó pHSG/M5~3~2? plaznüáot,
3) A p$R/LM5-3-2?-i plazmid előállítása (humanizált TRA-h LMS könnyű láncot kódoló expmszíős plazmid)
A hnmatűzálí TRA-k LM5 könnyű lánc variábilis régióját és: humán lg& lánc állandó régióját tartalmazó fSztós frsgmenst hordozó pHSG/M5-3-27 plazmldnt emésztjük Hindii! és EcoRl restrikciós enzimekkel.
pg pSRPD.HTí pfamtd DNS-t (EP 0 988 816 A! számú európai szabadalmi bejelentés) emésztünk Plmdílt és EeoRI restrikciós enzimekkel, és aztsíán défoszlóriláljnk ClP-peí, .A kapott dsfesziurilált pSRFDHH DNS-t és a pHSG/MS-?~27 glazmidbél előállított 14indil.LEeoRt DNS-feagmeusí öwelígáljuk a. DAA Zjgatöw .O festou 2.8 (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazásával. Azután A. c&íi 1305a sejteket transzformálunk a ligáit BNS^sel és TB-agarra szélésztiSk, A kapott fehér iranszíormánsökat 188 pg/tnl arnpseilhní tartalmazó folyékony LB-tápközegben tenyésztjük, ős plazmid BNS-t extrahálonk a kapott tett vészei ékből az alkallkus-SDS eljárás szerint. A pSRPDHíí vektorban lévő kívánt Dblg-íragtnens inzereiójáí és irányítottságát DNS78 szekvenálással igazoljuk génszekveactá artálizámr alkalmazásával (AR7 PRO/ 370$ Z).M4 A«<dpmr- Applied Ríosystcms),
A kapod expresszié» plazmidot, amely a taaaaizűM TSArS LM5 könnyű láncát kódoló cDNSa kordozza, p-S R/LM5 -3 -2 7-1, -nek nevezzük.
{4.5) Expresszié.* vektor elösRlííása a humanizált ellenanyag köstoyű táncával (Rtoréra típusú)
A 76. azonosítószámú szekvencián bemutatod szekvenciát, a kánéra típusé TRA-8 könnyű tánc smlnosav-szekvenciáját I ,MP-;;ak nevezzük.
A TRA-8 aöíHmmáfi-IiRá ellenanyag ilyen típusú (LMó) bmrtaáizált köohyö tánc ammosavszekveneiáit (75. azonosítószámú szekvencia) hordozó expressziós vektorokat az alábbiak szerint állítjuk elő.
1) Humanizált TRA-8 LMh körmyű láncának variábilis és állandó régióinuk előállítására alkalmas iánessdiíök szintézise
Az Odú polípeptldtárseo! (75. azonosítószámú szekvencia) kódoló DNS-t, amely a TRA-8 humanizált sntí-DR5 ellénaűysg könnyű latié (LM 1-típusú) variábilis régiójának, és a tormán lg könnyé láncának (k lánc) feiója, PCR-ekkoisblnacsójásoi szintetizáljuk meg.
A 7 Μ IP (47, azonosítószámú szekvencia) és 7.ALCN (48, azonosítószámú szekvencia) mellett az. alábbi öligomikleobd iáscinditókaí szintetizáljak meg aRCR-hez:
5-tgaígtggac aígaatttgt gagaetgggt caícaeaaíg ieaceagígg a -T (HKSPR13; 97. azososiíószámé szekvencia);
ótogggiíecag: gctecaetgg tgacattgig atgaseeagí etcncaáaíl s-T (MVEI 1; 98. azonos ítészántá szekvencia);
5-aagacagaíg gtgcageeae ageeegaig atoecagot íggígeele-3' (RtVRl 1; 99. azoooshószátttö szekvencia); és
5-aage?ggaaa teaaacggge ígtggctgca ecaíctgtct tcate-3'(MCE 11; I98,azonosítószámú szekvencia).
2) A pCR3,l/l,Mó~l-t6 plaztaid elbáOftása (butannízáii TRA-8 EMé-tiposű könnyű láncának klónozása)
A 75. azonosítószámú ^szekvencián feemtatoö· amínosav-szekvenciát kódoló l,Mó DNS-íragmehsa kétlépése» PCR-rei állítjuk elő, plazroid vektorba mzeriáljük, és £. erdtoban klónozzuk.
a) Első FCR-iépés
Az LMő-Fi-DNS feagmensí, amely szekréciós: szigeálszekvendát és FRIT-régisí kódol Hindiit restrikciós enzim hasítási hellyel az 5' reghez adva, az alábbi körülmények között állítjuk eló. A pHSGHMl? és pSRPÖRH templát plazmidot áz EP 899981Ő At. számú európai szabadalmi bejelentés leírása alapján állítjuk elő.
A reascióelegy összetétele az alábbi: PHSGHM17 plazmld DNS, 25 Kg 7A1..IP oligonukleotid-láncindítő, 58pmol 1-1RSPR13 oltgonnkleotid-iáncindító, 58 p-nol dMTP koktél. 5 pl
10x PCK-po.Ter, 5 pl őBtpíO’őp DNS-pollmerűz, 2,5 egység
A festi összetételű reakeiöelegyet SO pl végtériogatra állítjuk be desztillált: víz: hozzáadásával, .és Fülűben alkalmazzak.
A P€R termális körülményei: melegítés 94°ü-on 2 peréig, smi titán az alábbi ciklust ismételjük 30 alkálómmal: 94°C-on 1 pere, ÜS^C-on 1 perc és ?2öC-on 2 perc, majd melegítjük 72%'-on 10 percen keresztül,
Az FRl-s egv részletét, CDRl.,;-et, FRL2-t,CDRi,rt> FRL;-at, CDRL5-at, FRL«-et és az állandó régid egy részletét tartalmazó l.iMb-F2 ÖNS-Ragmenst az alábbi körülmények között állítják elé.
A reakcióeiegy összetétele az alábbi;
pl,28 plazmid DNS, 25 ng .MVFI1 oligonuk lentid-lándiadhö, 50 pmol
MVR12 oisgonúkteotid-íáncináttö, 50 pmol dNTP koktél 5 a!
iöx 'PCR-puffes', 5 pl aínpiíTöt:; DNS-pőlimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakeiöelegyeí 5Ü pl végtérfogatra állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és Fűikben alkalmazzak.
A PCR termálig köröhtteoyéi: melegítés 94°C-®á 2 porcig, ami után az alábbi < ikiust ismételjük 36 alkálómmá!: 94öC-en 1 pere, SSAl-on I perces 72υϋ-οη 2 perc, majd melegítjük 72'C-on 16 percen keresztül.
Az FRR; egy részletét és az állandó régiét a 3’ véges egy FcoRf restrikciós enzim: hasítási hellyel tartalmazó LMO3-ÖNS Ragomat .az alábbi körülmények között állítják elő.
Á regkeiöelegy összetétele az alábbi:
pSRPBffi plazmid DNS, 25 ng
MCE! 1 cligönnkieotid-iáscindüó, 50 pmol
7AI.CN olígonakteotid-láneindító. 50 pntoí d:NTP koktél, 5 pl lOv PCR-pui'íer, 5 pl empiiTaq DNS-poümeraz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakesoe legyet 56 al végtérfcgalra állítjuk be desztillált vtz hozzáadásával, ős PCRbee alkalmazzuk.
A R'8 tennáiís körülmények melegítés 94°C-on 2 perctgj ami után az. alábbi ciklust ismételi ük 31) alkalommal: 94'C-íin. 1 pere, SSAl-on I pere és72oC-on 2 pere,/majd melegítjük 72':'C-on !Ö percen keresztül.
Az umphílkált DNS-lragmePseket a FÜR után 5% poílákrilamíd-géleiektroRsrézissel váltssztjük el. A gélt az eiéktröíorézls után I pg/m.l etidinm-bromkidai festjük az előállított DNS OV- i'éuy alatti detektálásához. Az így detektált megfelelő DNS-csí kokat pengével kivágjuk.
b) Második PÜR-fepés
Az LMb-ÖNSA, amelyben: a fent leírt LMő-El, LMÓ-E2 és LM6-F3 DNS-iragmensek íüziöíiáltatva vannak, az alábbi körülmények között állítjuk eló.
A reakcióeiegy összetétele az alábbi:
Az első FÜR-lépesben előállított i.,M6-H -DNS gs'iíragmense, Az első FÜR-lépésben előállított EMŐ-F2-DNS géHfagmense,
Az első PCR-lépésben eleálhéött LMŐ-P3-DNS gélírugmense,
7ALIP oügonakleotíd-lónentdlló, 59 pmol
AECN olígonukleotiddánesndkó, 50 pmol: dNTP koktél, 5,ö pl löx PCR-puffor, 5,0 pl αΜρίίΧχ? DNS-polimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióelegyet 50 ul végtérfogatra állitjpk be desztillált via hozzáadásával, és PCR»· ben atkateazzuk.
A PCR termális körülmények melegítés P4aC>on 2 percig, ami «tán az alábbi ciklust ismételjük: 39 alkalommal: 94°C-ou 1 pere, 55°C-un 1 pere és 72ΰε»ρη 2 perc, majd melegítjük 72cC-o:n 19 percen kérésziül.
Az Így előáilhoít LM6 BN:S»íragmenst a pCR3.1 plazmidba inzertáljuk Rnáöfyoífe Γ.4 dwMHg Ks (Invürogeoj alkalmazásával a gyárié utasításait követve, és bejuttatjuk a reagenskeszletben lévő kompetens R ö?9 TOPÍ-OF sejtekbe. A humanizált: TRA-á könnyű láncát kódoló ezen. DNS-ek nukteotíá-szekveneiáját igazoljak a dldeoxí módszerre! DNS-an&kzáíor alkalmazásával.
A kapott plazmldot pCS3.i.'L.Mó-1- iŐ-nak nevezzük (az egét TRA-R könnyű lánc variábilis régióját és tanán lg kősnyű lánc állandó régióját kódoló cDNS*t hordozó plazmái).
Az LM6 DNS-lragmenst tartalmazó pCRJ.l/LMó-l-ló piazmidot emésztjük Hjndlli és EcoRl restrikciós enzimekkel, pg pHW399 klónozó plsztnld ÖNS~t emésztünk Híndlll és EcoRl restrikciós ejtzimskkei, ás azután defoszferjláljuk ClP-pel. A kapott defoszforilált pH:Sö399 DNS-t és a Hindit! és EcoRl restrikciós emsírnekkei emészted 1..M6 DNS-iragrneast összetigáljuk a öóíd Lígeí!®» & iforsion 2.9 fí'akara Shazo Cö., IM) alkalmazásával. Azttas R. e&ti DH5« sejteket transzíórnráhmk a ligák DNS-sel, és 9,1 mM IRFÖ-t, 9,3% X-Gal-tés 50 gglrnl klormufeükölt tartalmazó L8-sgar tápközegre szélesztjdk (végfconsentráeiók). A kapod lekér fransziormánsokaí 50 pg?ml kloramlerakott tartalmazó folyékony LB-rápkózegben tenyésztjük, és plazjnid ÖNSri extrabáíank a kapod tenyészetekből az alkallkus-SBS eljárás szerint. Az extrahált plazmád DHS-í emésztjük Hindin és EcoRl enzimekkel, és azután kiválasztunk egy EMó DNS-fragmeost hordozó kiönt 1% agarózgélelektroforézissei.
A fenti eljárás eredményeképpen előállítjuk a egér TRA-8 könnyű lánc: variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját tartalmazó mzsós feagnmust hordozó pHSOZMó-1-4-1 plazmidoí. Az ezen ptazmidot hordozó /2 coli transzforjnánst - amelyet R c&ií DI45e^HSíG/Mő»-t'-4·- 1-nek nevezünk ~ letétbe helyezték az „ínseraalionai Patent Örganism Deposhary, Náííonsl Insiituie: of Advanced luduxírial Science and Technology” Intézetnél <1-1, Hlgashi 1 chome Tsnkaba»shl, !baraki-keös 395-5406, Japan) 2091. április 29-án a mikroorganizmusok letétbe helyezéséről szólít Budapesti Szerződés szerint, és a EERM 8P-756Ő letéti számot kapta.
3) A pSRzLMó~l-4-6 plazmld elóátibása {TRA-8 kunéra típusa EM6 knnnyö láncot kódoló expresszlíős plazmld)
Az egér TRA-8 könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját tartalmazó fozíós ímgmensí hordozó pHSö'LMő-1 ~4-1 ptazmidöl emésztjük HindiO és EcoRt restrikciós enzimekkel.
ug pSRPDHH klónozó plazmld EW-l entészíSnk Hindiit és .EcoRl restrikciós enzimekkel, és azután defoszforiiáhuk ClP-pei. A kapott deiósítforiiáilí pSRPDHH DMS~í és a pHSö/LMó-l-ü-t pfozmidbói előállított Hindii 1-EcoR i DNS-fragmensí összéítgáljük a DM4 Mgaiio® Kit Versien 2;& (Takara Shazo Co., Ltd.) alkalmazásával Azután A. co/f DHS« sejteket. transzformálunk a ligáit DHS-set és EB-agam széleszfjűfc, A kapott transzfomAnsokat löd pg/mi ampicitliní tartalmazó folyékony LE-tápközegbeu tenyésztjük, és pbzmid DHS-t extrahálank a kapod tenyészetekből az alkatlkus-SDS eljárás szerlat. A kívánt DNS-Ragtnens vektofbeli mzsreidjáí és tráuyííoííságát IPNS-szekvenálfosal igazoljuk gényzekveneis analizátor alkalmazásával.
A kapott: expressziős plazmától, amely a TRA-8 (kiméra típusú) könnyű láncát kódoló cDNS-ΐ hordozza, pSRfoMÓ- :1 -4-6-uak nevezzük.
(5) Küldiiközo típusú ftumtttijzálí vugy kínéra T8A~$ #fíeMW}wgí>&
COR-7 sejtek, foutszfektálását á AHö&VEd transztekeiös reagenssel (Boehringer Matrahelm Eioehemica) végezzük a reagcnskészletbez mellékelt kézikönyv utasításai szénát.
€08-7 sejteket (American Type Cnlinre Col leérten CRl,-lőSl) tétig összefolyt állapotig növesztünk (3 x 10 sejt/csésze) tenyésztő csészében (teayészíésí felület; 57 eaT; Saraíiomo Sakeíite) amely .Ördbeacrtb Afodl/W Aógte AM/ú/í?; tápközeget (amit a: leírásban ezentúl „D-xMEfef’-nek nevezünk; ÖiÓeo B-RL> tartalmaz, kiegészítve i 0% magzan ixujúszérmmmd (amit a felársbaa ezeníűl „FCS^-nek nevezünk; Morégate).
Közben fű p.g /csésze (összesen 5 csésze) humanizált DR5 nehéz lánc expréssziós pluzmid DNS-t ípHA 15-i) ex iű pgcíesíc humusn/álí IM5 konnsú lánc cxpresszua. piazmtd Db$4 (amelyeket az alkahku?SDS eljárással és eéztem-híoriá sörüséggradlcns centrifagálással átlitelíuuk elő) összekeverünk, ás azután etauollai kicsapunk, majd felszuszpendálunk 5 μΙ/csésze desztillált vízben.
Miután 15 pl/csésze AlAíEAW traasztekciós reagenst összekevertünk 180 pl/csésze FCít nélküli !> MEM tápkőzeggel, ezt a AÍASAAS-oldmot (185 pkcsésze) összekeverjük 5 μ! csésze ONS-oidaltal, amely tű sg/csésze feaumnízált D:R5 nehéz tánc expressziös piaztnld DNS-f és 10 ugtesesze humanizált DRS könnyű lánc expressziős plazaud DNS-í: tartalmaz. 15 perc szobahőmérsékleten íörtenó mkubátás mán a kapott plazmidssuszpenziot (2ÖÖ pl) hozzáadjuk a korábban: előkészített COS-7-temezekhez. 24 órás: 57« CÖ,-ben 37“Ο-οη történő inkabáiás után a tenyésztő lápközeget lecseréljük FCS nélküli D-MEM tápközegre. 72 órás 5% CO2-to 37€-en történő inkubálás: után a tenyészet félilluszoját visszanyerjük a folütúszőban tévő expressziős termékek tisztítása végett. Ezzel a fent leírt mődszerrel COS-7 sejteket rtanszlektálunk az alábbi plamnld-kmomblttáeiők mindegyikével:
(A); pH A15-1 és pSR/EMl-2 (Η 111) együttes hanszfektálása (3): pHBI4-l és pSR/M2-l (H21..2) együttes mmszfokiálása (C>: pHBhi-1 és pSR/i,M3-3-44-íO (H2E3) együttes bauszfektálása (D) : pHB14-t és pSfo'LM4-5~3-3 (I-Í21..4) együttes íransz&ktáiása (E) ; pí-ICIO-3 es pSR'W-l (H3L2) együttes transzfofctálása (F) : pHCIO-3 és pSR/LM3-3-fo-;Ű 11131..3) együttes transz&ktálása (ö; pHClű-3 és pSR/LM4-5-3-3 (H3 L4> együttes traoszfektálása (H);pH»21-lés;pSR/LM5-3~27~l (H4L5)együttes transzfokíálása (í); pMli-l és pRR/EMó-1-4-6 (kiméra) együttes ínmszfekíátása
A tenyészetet azután leeentriftjgáRuk (3500 rpra, 15 perc), és a telülaszőt összegydjsiük. A fotütúszóí szűrjük 0,45 pm-es szűrőn (ADVANTEC TOYÖ DlSMtC-25cs, Cáfo 25CSÖ45 AS), A szikietekből az igG lisztiiását /-Vutem óARORÖE airutífási krsntaíográiüt (Applied Blesystems) atkafetazásávsl: végezzük az alábbi körülmények között::
HR1,C rendszer; BioCAD 7ŰÖE (Applied Biosystems) oszlop: xmxyor coríí-úfoü (es'ziopméret: 2,1 m 1G x. 30: « W, töltottérfogat: 8>1 ml;
Applied Biosystents) eióciós poBér: ö, 1 M gíicin-HCl (pH 2,5} semlegesítő puffer: 1 M íris-HCl (pH 8,5) detektálás: 280 nm áramlást sebesség: 1 mkmln frakelöméret: 0,5 tnl/0,5 perc) gyöjtőeső: 1,5 ml-es polipropilén mikrocsö hőrnérséklet: 4°€
Mintán sz összes szőrietéf felvittük tat oszlopra, 50 ml PBS-t (Sigtna, Catd 1000-3) alkalmazunk az oszlop mosására. Amikor az eláeiős paffért elkezdjük felvinni; elindítjuk a ffakciókoiiokíort, Mindegyik mikroeső korábban tartalmazott 55 pl 1 M NaCl-t, 110 pl semlegesítő pofiért és 74 pl 2 mgAni szarvasmarhaszérnmaibumint (Sígttta, Gat# Á-783Ö} PBS-es oldatban. A 7-8. frakciókat összegyűjtjük,
A humanizált ellenanyagok expressztojáttak igazolását és az előállított tenyészet-ieiülsszóban található expreszsziós terstGkck mennyiségi elemzését ílLfSA-val végezzük aníl-hnmán-lgG ellent ellenanyag alkaimazásávai.
§ö-méróhelyes ntikroiiterleütez (MaxiSorp, Nőne) mindegyik mérőhelyére 100 pl keeske anti-humánigG-Fc-rs specifikus poiiklonídis ellenanyagot (Kappel) adunk, antely 0,5 pg/ml végköocenlráelóra van feloldva abszorpciós pufiferben (0,05 M: nátrütm-bidrogánktubonát, 8,02% nátrium-azld, pH 0,6), és a míkrotiterietnezí 37cC-on mkubáljuk 2 órán keresztül az ellenanyag adszorbeálása végett. Ázsián a mikro; ttedemezt 5-ször mossuk 350 pl PBS-T-vel. Mosás: titán a mérőhelyekbe adjuk a lö% FCS-t tartaimnzó D-MEM tápközeggei hígított tenyészet-felülászőkat, és oT^C-on kikobáljuk 2 órán keresztül. Ismételt PBS-'F mosás után 100 pl, RBS-T-hen 10000-szer hígított, alkahkmr fosziátázzal jelölt aníi-ha;«ás-Bd3-re specifikus poliklopálls ellenanyagot (dseksot? Immuno Resestrch Láb,) adunk misMcgyík métőltelybe, és 379C-oü inkübáijdk 2 órán keresztül, ismételt FBS-T mosás alán az A/ásdne Α&όψ&Ρζκ; iű-höl (Bio Rád) származó p-niirofejni-ioszfát szühsztfátot adunk a mérőhelyekhez a reagenskészlethez mellékelt kézikönyv utasításai szerint. 37üC-en 0,5-1 órán keresztül történő mkübálás áfán mérjük az abszorbanciát 405 nm-en. Ezekben a kísérletekben 10% FCS-t turtalmazó D-MRM lápközsgóen meghatározott koscentmcidkra hígított G 1 -es alosztálya (IgCI) homárt plazma imtmmglobulim (Biopure ÁG) alfcdmáznnk a íenyészöt-felülászókban található hümanizáit: DR5 ellenanyagok koncentráeiő-referenciamlntájaként.
Ennek eredményeképpen specifikusan detektáljuk a tenyészet-felhlüszőban található tisztított termékek expreszszíójái az anfi-hntnán-igO ellenanyaggal. A humán IgG ellenanyag végkonceafrációja: sorrendben 44,03 pgZml (HILI),. 39,8 pgónl (H2L2), 26,7 pg,)nl (H2Í..3), 41,Ö gg/tul (H2L4), 39,3 pglml (H31..2), 24,7 pgúrtl: (H3L3}, 21,5 pgfnd (B3L4), 16,7 ng/tui (fi4L5) és 18.3 jtgfmi (kunéra).
(6) Különböző típusú humanizált el lettan vágok vagy kunéra ellenanyagok spopfözls-mdnkálő
Jurfett sejteket (A.TCC TiR-152) alkáhssazank. « tisztított hitmanizált TRÁ-8 ellenanyag üpopfözis1 fidnkáló aktivitásának vizsgálatára,
10% FCS-t tartalmazó-MS164Ö: tápkőzegben (Gibeo BRL) 37C-on 3 napon keresztül 5% CO? jelenlétében tenyésztett jurkist sejteket osztunk szét 9ő~méröhe1yes mikroíheffemezío (Sumltomo EtakeHte) mérőbe83
Ivenként 58 pl mennyiségben. Az ebben:s 2ő.: példában előállított hmnsnizált TRA-8 vágkPUKeníráelójáf 108 ng/ml~re állítjuk be 19% F-'CS-t tartalmaz RPM11S4Ö íápközeggsi, a 26. példában leüt medon becsülve azok köheenrráeíóját * folyadékokban. Az expresszm terBtékek Ily módon 188 ng/ml-re beulhioh oldalait atolmazzúk sorozathíghások előáll írásra 10% ECS-t tartalmazó REMI I 640 tápkőzeggel, 2-szeresre hígítva sorozatosan, Mindegyik hígítod humanizált TRA-8-uldátot (Hí‘,1. H2E2, 1331,3, 1121,4, 1131.3. 1131..4 vagy 1-14.1,5,! 50 pl mérőhely metmjdségben adjuk a mérőhelyekbe, 12 órás resgáitatás után 3?°C~öb 58 ni, 1 mg/ml: XT74 tartalmazó 25 p:M RMS-t adunk a mérőhelyekbe (végkoneentráció: .250 pg/ml XTT és 5 pM PMS). 3 őrás inkubálás után tnéíjdk az egyes mételyek absxörbsneiáját 450 nm-en, hogy kiszámítsuk a sejtek: életképességét, a. öütokondriumok redukciós: képességét indexként alkalmazva.
A sejtek életképességét az egyes mérőhelyeken az alábbi képlet szerint számítjuk:
Életképesség i%) ;:::80 x (a-b)A'e-b) almi „a” jelentése a teszt mérőhely mérési értéke, ,,b” jelentése a sejteket sero tartalmazó mérőhely mérési értéke és „c jelentése a« ellenanyagot nem kapott mérőhely mérési értéke.
Ennek eredményeképpen kimutatjuk, hegy a humanizált ellenanyagok: apoptózlst Indukálnak humán DftS-öí expresszáló T-limföma sejtvonal sejtjeiben,
Ezenkívül megvizsgáljak a humanizált TRA-8 apepfózis-ihdukálő aktivitását RC-3 sejtekben íaxoí hozzáadásával, amint azt a 25. példában leírjuk
A PC-? humán pros/tatamk sejtvonalaí (ATCC CRL-1435) az ..American lissae Culhtre Coliért ionsói iA'i'Cs'3) szerezzük be és /-AJK .Yitfwor Vő/un· lápközeghen (21127-822, Gibco BRE) tartjuk fenn, amely az alábbiakat tartalmazza: 10°« magzati murhai-zérum Í.FRS, 1-lyelone), í% i,-G:lutamlo-200 mM (25038-149, Gibco ŐRL) és 8,5% penieiilin-s/ireplomsein oldst (P-7539, Sigma). 10% R3S-sei és 8,5% peíslcrlhnsztreptömicin oldattal kiegészített RRMIIMO uip közeget (MED-008, FWA&Fí: alkalmazunk az alábbi kísérletben. Exponeneiáltssn növekvő: PC--3 sejioket gyűjtőnk tripiszhizáciőval, és kétszer mossuk azekat tbíss: tápfeözeggek Azután a sejteket leszámoljuk, ttjrafélszaszpettdáljuk friss tápközegben 5 x TG4 sejtónl sűrűséggel, és: egy nappal a kísérlet kezdete előtt szétosztjuk három párhuzamosban lapos fenekő 96-mérőhelyes mikrotiíeriemezekbsn (3598, Cóming-Costar) 108 glónl. összíérfegaífean. Á dlínetibzuKoxidban jőibidolt (10 mg/ml j reprezentatív rákellenes: szeri, a Fődteu/A (í69- I8őí 1, Wako) friss tápkozegben hígítjuk, és azután .a sejteket tartalmazó 9ó-mérőbelyes ímkroíiteriemozekhez adjuk 50 piónérőhely mennyiségben, A dimetilszolfoxid végkoücemráeiója kisebb, mint 0,1%. 24 órás 37Τ-οη és 5% CO;-átmoszíérában történő inkabálás után: kumamzáh TRA-S ellenanyagot (Hiti, H2L2, »2L3, H2L4, 1131.2, 1-131,3, 1-131,4 vagy I-M.S) highunk friss sápkőzegben, és hozzáadjak a mérőhelyekhez. További 24 órás inkubalás után 50 pl, 1 mg/ml XTT--t és 25 mM. PMS-t tartalmazóΊΙΜββ» Rsxentűd Me&tem tápközeget (11895-098, Gibco BS.L) adunk a mérőhelyekhez;, és a míkrűtheriemezeket: ó órán keresztül inkubáijak, AztUán mérjük az OD450-et ,4RF'G f/T9 /420 Mu/íi/ahe/ Coímrér készülékkel (Wáilae Serthold), és a kiszámtijnR a sejtek életképességét az alábbiak szerint.
Sejtek életképessége :<%> ~ (a Távollá! és/vagy humanizált TRA-8-xzerre! kezelt sejtek OD450-ériéke)sem sejtet, sem: szert nem tartalmazó mérőhelyek ÖD458-értéke x 100 / (sejtet: Igen, de szeri nem tsrtataazó mérőhelyek GD45ö-értéke - séta sejtet, sem szert nem tartahnazé mérőhelyek OD458-éríéke)
Ennek eredményeképpen kimuta-juk, hogy a humanizált ellenanyagok apoprózist indukálnak humán ORS-öí expresszáló humán prosztatarák sejtekben.
Givslkszdsok
1. Wiley, S.R., Sehooley, K., Smolak, P.X, Db, W.S,, í-feang, G.P., MiefeoF, IX, Södierland, GM, Smkh, Τ.ΓΙ. Randi, G,, Smirfe, C.A., és odssl, ínmundty 3,673-682. old. (1995):
2. Fan, G„ O’Rourke. K„ Chawaiyaa, A.M., Geniz, L. Bbnet, R-, Ni, I, Dixit. V.M., Science 276. 111-113. old. (1997)
3. Wdíezak, II, Degii-Esposd, M.Á., Jebnson, R.S,, Sínolak, F,I, Waugh, J.Y., 8«4 ftw» M.S., Gerhart, M .1, Schooiey, K.A., Smiíh, C.A., Goodwio, R.G., Raueb, Ü.I, FMBO 3. 16,5386-5397. öld. (1997)
4. MacFarlaae, M„ Annrad, M.„ Srinivasula, S.M., Feraandes-Áínetnn, I, Góbén, G.M., Aincmri, B.S., I SíotCbem. 272,25417-25420, old. (1997)
5. Begll-EsposB, MA.., Döugali. W.C, Sísroiak, P.I, Wa«ghx IV,:, Smtdj, C.Á., Goodwb, R,ö„ fomsniiy 7, 8(3-820. oki. C1997)
6. Cfeanáhsry, P.M., Bby, M,, Jasmiu, A., Soökwalier, A., Murray.L, Flood, I,, Enmunky 7, 821-830. old. (1997)
7. Sdmsidsr, P., Thome, M., Burás., R., Bodmer, l.L, Bo&mn, &., Kataeka, T., llölfer, Ü, tsebopg, Immmdiy 7, 831-836.. old. (1997}
S. Degii-EspoAii, MA., Srooíafc, P.I, Walezak, PL, Wangfe, I, Ilaasg, C.P,, DuBose, R.P., Gítodrvb, R.G., Sabíh, G,A.>I Exp. Med. 186, 1165-1170, öld.. ((997)
9. Sberidaa, 3.P.. Marsters, S.A,, PRO, R.M, Gurney, A„ Skubaicb, M„ Raldwfe, Ű„ towtóshsm, L,, Gray, C.L., Baker, R,,. Wood, WX, Goddard, A.D,, Godöwski, F., Asbkenazr, A., Science 277,818-821. old. (1:997)
10. Fás, G, Ni, I, Wei, Y.F., Vú, ö., Gerdz, R„ Dixit V.M., Science 277, 815-818. öld. (1997)
I1 Marsiéra, E.A., Sheridas, IP., Mid, R.M., Pteng, A., Skubaích, M, Baldwin, D., Ynan, 1, Gáirncy,
A. , Goddará,: A.IX, Godnwsfci, P., Asbksnszi, A.., Cnra, Bioi. 7, 1093-1006. old. (1997')
12. EiBery, J.G., McDonnell, P,, Bőrke, MB..( Deeo, K.C., Lyn, S., Silverman. C„ Dal, B., Appelbaum,
B. R., Ifcfenan, C„ DíPrinzlo, R,, Dodds, R.A., tejes, I.E., Rosenberg, M„ Lee, IC., Ymmg, P.R., >. Biel, Gbem. 273, 14363-14367. old. (1998)
13, Wakaak, 14. Miller. R E„ Áriad. K.., diniek, B„ Grli'fRb, IS.. Kabin, M., Gbin, W.. Jones, I, Wooáward, A,, Le, I, Stnith, C., Sroolak, P,,.Gaodwin, R.G.. Rauch. C.'L, Schuh, IC., Byteo üli, Nak Med, 5, 157-163. old, (1999)
MöteR, ¥., Leukémia 15, (817-1:824. old. (1999)
15, Rseger, I, Naurnans, D„ Glasyr, X Áshikeaazs, A., Weller, M., EEBS Beti. 427, 124-128, old.
(1998) ló. Jeremiás, L Plerr, I, Boehler, T., Beba&s, KM, Bor, J. Immunoi. 28, 143-4 52. old, (1998)
1:7, Marímez-Lorenzo,JMJ., Alava, M.A., Gam.es, S., Klór, K,L, ChssRharapai, A,, Pkteiro, A., Niaval, .1, Anel, A., Bar. I Immunoi, 28, 2?14-2725. old, (1998)
18. Phillips, Γ.Λ., Ni, 1., Pa». 6,, Rabén, S.M., Web Y.E., Ince, bL, Hant, IS,, 3. Immunoi. 162, 6053-6059. old. (1999)
19. Kaysgaki, Db, Yamaguohb R, Rskayama, Rt, Takeda, K,,. Ákíba, K., Tsöisöb H„ Okantura, H,, Nafcmishl K„ Okúméra. K„ Yagita, H„ 3. Immunoi 163, 1996-1913. old.«i999s
2Ö. íAssen, A.C., Haux, J , ^teinkjcr, Rntstad, U,. Bgeberg, :K,, Sandan, A,, Áshkenaz), A., Espevlk, T., Cytokine Ib 664-672. old <„ IWs
2.1, Zamat L„ Aataad, M.« Benned, I.M., Azzoni, t„ Alnemri, B.S., Ferussia, B,, í. Exp, Möd. 188, 2375-2380. old. (1998)
22. Fanger, RA., Mabszewskl, O.R., Sehooley, K., örtódth, T.S,, 3, Exp, ML 190, 1155-1164.. old.
(1999)
23. GriRblr, T.S,, Wiley, S.K., Kabin, 54.Z., Sedger, TÁL, Mafcewskb C.R., Fanger, H.A., 3. Exp. Med. 189,1343-1354, old. (1999)
24. Griffiíb, T.S,, Raash, C.T., Smokk, PJ., Wattgb, 3-.Y., Botani, N., Lynch. ElH,, Sftsth, C.A., Oöösfem, K,.íb, Kabin, MZ.„ I. Immanotegy 162,2597-2605. old. (1999)
25. Albánt S. és Csrsos, RA., „Arthritis aad alifed csöditions, a texíhosb of rbearöatology”, 13. kiadás, 2. kötet 979-992.. old. (1997)
26. Fajisaw, K., Asahara, 11., Okamoto, K.., Aono, H.< Hasunnina, T., Kobata, T., Iwafcara, Y., Yonehara, S., Stnnida, T.. és Hisfeioka, K., 3. Clin. lövést. 98,271-278. old, (1996)
27. Zhang, EL, Yang, Y., Honon, 3.L., Samoílöva, E.B., íudge, T.A., Tarka, L.A., Wilson, J.M. és Cben, Y,, I Cím, tevést. 10S, 1.951.-1957. old, (1997)
28. Roth, W,, IseaíRMsi*. S„ Wontann, V., Kngler, S„ Bate, M, öiobgamt 3,, Ashkenazt Á>> Weller, Ab, Löcotegional. Bioebem. Biophys, Rés. Ccmonan. 265,479-483. pld. (1999)
29. Cbinnatyan, A.M., Frasad, El, Shankat, $., Hamstea, RÁ., Sbanaigb, M„ Ctasewt, T.L., Ross, B.H., Rehemíulia, A., Proc, Matt Acad. Se). 97, 1754-1759, old. (2009)
30. Arat T„ Akiyama, Y„ Okabe, Saitö, K., l.wai, T„ Yaasa, Y., Cancer Led. 133, 197-264. old.
(1998) b Lee, $.11, Slnm M.S,, Kim, H.S., Lee, H.K., Fark, W.S., Kim, S.Y., bee, .EH., Han, S.Y., Fa?k,
3.X, Oh, R.R., Jang, 3J„ Han, 3.Y., Lee, 3.Y., Yoo, R3„ Láncé? Kés. 59,5683-5686. old. (1999):
32, Fai, S.L. Wu, Q.S., Ozoreo, R, Wu, L., Jen, 3., Sidransky, R, El-Dcrty, W.S., Caneer Rés, 58. 3513-35 S 8. old. (1998)
33, Maniatis és mtsaí,, „Moipealar Cloning, a. Laboratery Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprlsg Harhor, NY (1982)
34, Sehroíf és mísai., Cancer Rés. 45,879-883, old. (1985)
35, Yeitom RE, és mísai,, Cwcnt Töptes te.Mieröbiotegy and Itntntmology 81,1-7, old. (1978)
36, Koblsr, 6. és mtsai., Ettropean L bnmsnoiogy 6,511-5:19. old.. (1976)
37, Stedman, M és misaí, Hatere 276,269-270. old. (1978)
38..Keatney, í.E. és rstsai., 3. tettrmnology 123, 1548-1.550. old. (1979)
39, Horibata, K. és Hamis, A. W., Nattee 256,495-497. old. (1975)
4Ö, Sheridaa, IP., Marsters, S.Á.. Fiai, B„M,, Gurney, A., Stebaíeh, M„. Beídwfe, D., Rmssatóshjnats, örsy?, C.L., Baker, K., Woe< W.L, Goddard, A.D., Godowski, P. és Asbkenazi, A., Science, 277, 81021. old. (1997)
41. Cherig, X. és mlsak, Science 263, 1759-1762. old. (I994)
42. Béndelé, A.M. és: mtsai,, Clirs. Exp. Rbemnátol, 17^553-560. öld. (1999)
43. Sheridsm.. X.P., Marsters, A,S . Pittb R.M.., Gorney, A., Skubátéh, M.,. Baldwts, 13., Raw&mtem, .1,., Cray, ÜJ.< Baker, K, Woed, W.I., Goddard. Α.Γλ. Godowsfci, P. és Aslfeenazi, A., Science 277, 818-821. éld. (1997)
44. Sclmeider, P., 'Fisomé, M., Burns, K., Bodmer, 1.1,, Hoimano, &., Kanuska, T.( i-ioher, N, Tscbopp, .1. Immtmity 7, 831 -836. óid. (1997)
45. Kennedy,,bő,, Rataoka, T., Tschopp, ,X és Bndd, R.C., X Exp. Med. 1891-1896. old. (1999)
46. Mliisr-Ladner, B.. Gay, R.B. és Gay, S., „Arthritis and allied eonditions, a textbook ©f rhemttaíolőgr, 13. kiadás, I, Mötet, 243-254. old.. (1997)
Előnyösmegvalósítást módokat ismeretünké következő bekezdésekbe!:»
1. Ellenanyag, amely felismeri a ÖR5 TRAiL-recepíorí, és amely apoptőzist Indukál I7R5-ÖS expresszáld sejtben in vivő.
2. Ellenanyag; amely telisstien a BR5 TRAiL-reeeptoA, és amely nem ismeri fel a DBA, BcR 1, és DcB2 TRÁ1I. receptorokat.
3. Az 1. vagy 2, bekezdés szennll ellenanyag. amely monoklonálls ellenanyag.
4, Az 1., 2, vagy F bekezdés szerint: ellenanyag, ahol az antigén humán DRS,
5, Az .1 .,2,, 3. vagy 4, bekezdés szermii ellenanyag, aböl a ssjtrenmatoíd atthritiszes porcsejt.
6, Az 1 .,.2,, 3. vagy 4. bekezdés szermii ellenanyag,. alsói z sejtrosszisdulgtú.
7. A FT A-1428 ATCC elérési számő. TRA-8 egér-egér Isibridóma áltel termeit monökionáiis ellenanyag.
8, Eljárás scjtpívélferáció gátlására, amely magában foglalja DR5-ÖÍ expresszáló sejtek érintkeztetését az ahhoz kötődni képes ellenanyag terápiás mennyiségével és az 1-7. bekezdések bármelyike szerinti ellenanyaghoz mogléieló hordozóval.
9. Az ‘ -7. bekezdések bármelyike szerinti készítmény, .amely tarteimaz: DR5 ellen aktív tnonokionális ellenanyag terápiás mennyiségét; és gyógyászatilag elfogadható hordozót.
10, A 9. bekezdés szerinti gyógyászati készítmény, ahol a terápiás mennyiség 0,1.-1-0000 mikrogratntn per dózis.
14. A 10. bekezdés szerinti készítmény, ahol amonoklonálls ellenanyag 9,2 - 20Ö0;nsnogrammmennyiségben van jelen a hordozó mii lilüetére vonatkoztatva.
12. Az 1-7. bekezdések bármelyike szerinti ellenanyag alkalmazása terápiás szer előállítására abnormális vagy hibásan szabályozott sejtek szelektív apoptózisára,
13. Mobilizált ellenanyag, amely kdlcsöhfeaí a DR4, í>R5, DrR 1, DrRR és GFG állal alkotott csoportból kiváiaszíoít tnsnomekrózis-fáktor llg&ndummsl, apopíózist indukálva ilyen receptort expresszáló sejtben.
14. Mobilizált ellenanyag, amely képes szelektíven kötődni agoniste vagy antageuiste temomekrőzis faktor hgaadnm receptor epitőphoz.
~ 87 ~
15. Eljárás apopt.ézissal kapcsolatos betegség kezelésére, amely inagában foglalja a következő lépéseket: a személy apoptőzlssal kapcsolatos betegséget mutató céiszőveténsk érintkezésbe hozása 1, Vágy 13. bekezdés szedőit első ellenanyag terápiás mennyiségével
16. A 15. bekezdés szerinti eljárás, amely további- magában foglalja a személynek olyan terápiás: szer gyógyásxabhg hatásos menny iségének a beadását is, amely szinerglkusan bat az első ellenanyaggal.
1? A 16 bekezdés szerinti eljárás, ahol a terápiás szer biszindofiimeielmiő.
18. A 15. bekezdés szerinti eljárás, amely továbbá magában foglalja a következő lépéseket is: a szövet érintkezésbe bozAsát 13. bekezdés szerinti második ellenanyag terápiásán hatásos mennyiségévek ahol azelsS ellenanyag, és a második ellenanyag szinergikusan hat a szövetre.
19, A. 15. bekezdés szerinti eljárás, amely továbbá magában foglalja a következő lépéseket is: a szövet érintkezésbe hozását érzéke nyi tó szerrel a szövetnek az első ellenanyaggal történő érlníkezteiését megelőzően.
28. Fúziós: fehérje, amely legalább 18 bázisnyl antigénhatásö TRAlE-receptor amimvsav-szekveííciát tartalmaz, kapcsolva immtmgiehuim: fehérjéhez vagy annak tragmenséhez, amely képes hrmmnválasz kiváltására .az alanyban.
21. Génterápiás eljárás amely magában foglalja a következő lépéseket: célsejtek expresszálbaté TRAíE-r eceptor nokfelnsav-szekvenciát Waltmtzó vektorral történő írsnszfoktálását; a sejteken a TRA1E nuklemsav-szekveneia által kódolt TEAIL-reeepior sxpresszáltatását; és a sejteket éríntkeztetéséí a TRAJL-reeeptor kötésére szelektív séjthalál-ind ak aló e l k· οαην agg al , Az 1-7. bekezdések batmekike szerinti ellenanyag, ahol az ellenanyag humanizált, . Nukleotid-szekvenoia, amely DR5-öt felismerni képes ellenanyag immtmglobuiin nebéziáne kódoló székveneiáját tartalmazza.
24, A 23, bekezdés szerint! nukleoiid-szekverssia, amelyet a SEQ íD NO: 21 1-1.398. mrkleotidjaí matatnak be.
25, Aminosav-szckvesela, amely DR5-őt felismerni képes ellenanyag: TR.A-8 ímrsrangiobulln oebézláne kódoló szekvenciáját tartalmazza,
2ő. A 25. bekezdés szetírrd ammosav-szekveneís, almi n kódoló szekvencia egy tejes nyílt leolvasási fázist tartalmaz, és melyein :SEQ 113 NO:: 23 Mő4, oldailáítesi mutatnak be.
27. Nnkleotid-szekvencia, amely DRS-öt felismerni képes ellenanyag immunglobulin könsyőiáne 3 8. A-8 kódoló szekvenciáját tartalmazza.
28. A. 27, bekezdés szeriutí Uúkieötid-székvsoei», amelyet a SEQ1D NO: 22 1-7Ö5. nokfemidjai mutatnak be,
29. Aminosav-szekveocís, amely DBS-öt felismerni kő:>es ellenanyag Tik A-8 rmmonglohulm nehéziám; kódoló szekvenciáját tartalmazza.
39. A 29. bekezdés szerinti amínosav-szekvsneia, ahol a kódoló szekvencia egy tejes nyílt leolvasást fázist tartalmaz, és melyet & SEQ lí> NO: 24 1-234. oldaíláneai mutatnak be.
31. Humán DK5-re szelektív ellenanyag, amely humanizált nehőzláne immunglobulint és temasisált .könsytllánc immunglobulint tartalmaz.
32. Ámtoesav-szekves?eia, amely 39. bekezdés szerinti ellenanyag humanizált nehézl&ne immunglobulinjának kódoló szekvenciáját tartalmazza.
33. A 32, bekezdés szerinti ammosav-szekveneia, amelyet a 8EQ © NO: 31 1-119. mrkleoildjaí mutatnak he,
34. Aminosav-szekvermja, amely 30:. bekezdés szerinti ellenanyag humanizált TRA-S könnyólane immunglobulinjának kódoló szekvenciáját tart&hpazza.
35, A 34, bekezdés szerinti smmosav-szekvencia, amelyet a SBQII) NO: 46 J-213, onfeieoddjai mutatnak be. 36* Nokleoítá-szekveneia, amely 30. bekezdés: sssemti ellenanyag, humanizált körmyulánc immuaglobalmjának kódoló szekvenciáját í&rialnrazza,
37, A 36. bekezdés: szerinti mAleotid-szekvencíg. amelyet a SBQlö NO: 55 1—711. nakleotidjai mutatnak be.
38, Vektor, amely tartalmaz: fa) a,23, vagy 28. bekezdések legalább egyike szerinti nukleötíd-szekvencíáb és f b) a. ttukleot jd-szekvenciához működőképesen kapcsok szabályozó szekvenciát, oly módon, hogy a rsyklsotidsxekv eíteía átíródik és transzlálédtk. gazdában.
39, A 38. bekezdés szerinti vektor, amely a következők: által alkotott csoportból van kiválasztva: vírus és plazmid.
40: A 30. bekezdés szerinti vektor, ahol a vírus a kővetkezők által alkotott csoportból vankíválászlvaí retrovlros, aáenovirns, adeno-asszoeiált vírus, herpesz vírus és lesíivlros.
41. Hszinld, amely 31. bekezdés szerinti ellenanyag humanizált nehéz- vagy könnyöláne hnraunglobülínjánák kódoló szekveneiáját tartalmazza.
42. Gazdasejt, amely 38. bekezdés szerinti vektorral m transzformálva.
43. Gazdasejt, amely 41. bekezdés szerinti piazoriddaí wt transzformálva.
44. A 43. bekezdés szerinti gazdasejí, ahol a plazmid a a következők alkotta csoportból vas kiválasztva :pHB 14, pW14-i,pHSGfM2-l-4, pCR3.1/M2-l és pSR/kÖ-l.
45.. Gazdasejf, amely .22. bekezdés szerinti humanizált ellenanyagot termel,
4ő. Eljárás humanizált DR5 ellenanyag: előállítására, amely magában foglalja a következő lépéseket: (aj gazda transzformálását legalább egy humanizált immnhglobnlhm könnynláneöi vagy Immarnzák immunglobulin nebézfáheot kódoló első vektorral és egy, a kőnnyniánoot vagy nslsézláneot különböző második vektorral, ha az hiányzik az első vektorról; és (b) a Iranszfotmálf gazda: tskubálásái: megbatározott ideig oly módon, hogy a barnán ÖR5 ellenanyag termelődik.
47, A 46, bekezdés szermti eljárás, ahol a gazda a következők álfal alkotod csoportból van kiválasztva: enkarlóta sejtek és prókarfota sejtek.
45. A 46. bekezdés szerinti eljárás, altot az enkarlóta sejt emlős sejt.
49, A 47, bekezdés szerinti eljárás, ahol az emlős sejt in vivő van,
50< A 48, bekezdésszerinti eljárás, ahol az emlős sejt ex vivő van,
51. A 48, bekezdés szerinti eljárás, ahol az. emlős sejt in vitro vas.
52. Eljárás sejtproliferáciő gátlására, amely magában foglalja a célsejt érinikezteíésének lépését humanizált ÖR5 ellesaayag gyógyászatilag hatásos mennyiségével,
53. Az 52. bekezdés szerinti eljárás, ahol a célsejt humán ráksejt, a következők által alkotott csoportból kiválasztva: emlő, peteleszek, vastagbél, hcmaíopoieíikas, prosztata, nyirok, tüdő, gliónta és máj.
54. Az 52. bekezdés szerinti eljárás, amely továbbá magában foglalja a célsejt érirstkeztetésének lépesét terápiás szer győgyászaiílag hatásos mennyiségével.
55. Az 54. bekezdés szerinti eljárás, ahol a terápiás szer rákellenes vegyidet.
56. A .55. bekezdés szermti eljárás, ahol a rákellenes vegyüleí: a következők által alkotott csoportból van kiválasztva: pacihaxel, faxol, cikiohexitnid. karboplaíín, itíorambuoil, ciszpiatin, kóláiéin, eikíofosziámíd, dannorubiem. aktinormeín, dietiisztilbeszfrol, doxoruhicin, etopozid. 5-fiaorotiracit ífoxuridm, melfálán, metotrexát, mifomicín, ó-merkapmpurm, fenipoziá, 6-tsognaam, vinkrisztín és vinhlasztín.
... £9 ...
57. Az 52 bekezdés s/enofí eljárás, ahol a célsejt hmnao sejt
58. .Az 52. bekezdés szerinti eljárás, ahol a célsejt nent-botttán, sejt, amely g következők által alkotott: csoportból kiválasztott alkuból származik: nem-human löemlos, pötkány,.egér, nyúl kecske, juh. szarvasmarha, sértés, ló és csirke.
5to Λ 52 beke/des szenet; eljárás, ahol a telscp in vua san
60, Λ 52 bekezde* szerűit; eltees, ahol a célsejt e\ w*. ven
61, A 52. bekezdés szerinti eljárás, ahol a célsejt In vstro vau.
62, Kereskedelmi reagenskészlet apoptózis tndekálásúra, amely PR5-5 e\pres*zúbsa ellent te^pizs alkalspszre szsle.kt.lv humanizált ellenanyagot tartalmazglkaltnas tartályban, sgyört utasításokkal DR5 cxpresszálasa elleni terápiás szerként való alkaiírsazásta,
63, Élj árás N KkB .színijének növelésére sejtben,, amely toagában foglalja a kísvelkoző lépést: B:R5-ör szelektfecn toksorért) ellesnnryagíerápiásatr hatásos, mennyiségének beadása.

Claims (7)

1. Tisztított ellenanyag, amely speerkkasan kötődik a DTi.5 TRAlí., receptorhoz, amely ellenanyagot a PT&1741 ATCC elérési szánté TRA-1 egér-egér hibridőma termek vagy amtSk humanizált verziója,
2. Készítmény, amely 1. igéstypont szertntl ekesnpysg gyögyászatiíag hatásos, mennyiségét és gyógyászatllag eiíbgadteó hordozót tanainuiz.
3. A 2, igéítypont szerinti készitsnérty, ahol az ellenanyag 9,2 og - 2099 ngrtnl rnenayiségben w jelen a horddzóra vonatkoztatva.
4. Kereskedelmi készieí, amely 1, igénypont szerinti ellenanyagot tartalmaz tartályban.
5. .Az. 1. igénypont szerinti ílszrtrod ellenanyag alkalmazást» DR5-öt expresszáló célsejtek apopiózlsának szelektív iodúkáiúsa szolgáló készútztétiy előállítására.
d. Az 1, sgénypoto szerinti tisztítóit ellenanyag alkalmazása rák ahtnybas való kezelésére szolgáló készítmény előállítására. ahol a? ellenanyag szelektíven indukálja s ráksejtek apögtőzssák
7. Az 1. igénypont szerinti tisztított ellenanyag alkalmazása az apoptózis rendszer alanyban való bibés szabályozásának kezelésére szolgáié késztímény előállítására.
S. A 6. vagy 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény továbbá kemoterápiás szert is tartalmaz.
9. A 8. igénypont szerinti alkaitnazás. altos a kemoterápiás szer a következők által alkotott csoportból van kivákíy/isn pachtosj ?c\ ir,í''í..o, et Jólessen', kmoop oon, k.ontnbuui, ms/plot n mohert ukíotovtarhd, etopozid, S-flnorotsmcll. mitomicin. vínkrisztin. vinbinsztln, daonnrubtcm, daksinontiem. mellalán. floxttridtn, ienspozíd, ó-fioguantn. dleíilsztúhesztrol és tnetólrexát.
19. Az , 1 igénypont szerinti: bsztllóíí ellenanyag alkalmazása atttormmun gyelfadiásos állapot alanyban való kezelésére szolgáló.készítmény előállítására,
HU0500800A 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai HU230399B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20134400P 2000-05-02 2000-05-02
US60/201,344 2000-05-02
PCT/US2001/014151 WO2001083560A1 (en) 2000-05-02 2001-05-02 An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU0500800D0 HU0500800D0 (en) 2005-10-28
HU230399B1 true HU230399B1 (hu) 2016-04-28

Family

ID=22745456

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0400951A HU229417B1 (hu) 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai
HU0500800A HU230399B1 (hu) 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0400951A HU229417B1 (hu) 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai

Country Status (28)

Country Link
US (6) US7244429B2 (hu)
EP (4) EP2065401B1 (hu)
JP (4) JP4156238B2 (hu)
KR (2) KR20060092292A (hu)
CN (2) CN101585881B (hu)
AT (1) ATE426615T1 (hu)
AU (2) AU5936601A (hu)
BG (3) BG65929B1 (hu)
BR (1) BR0110547A (hu)
CA (1) CA2407965C (hu)
CY (1) CY1109179T1 (hu)
CZ (2) CZ304614B6 (hu)
DE (1) DE60138097D1 (hu)
DK (1) DK1287035T3 (hu)
EE (1) EE05548B1 (hu)
ES (1) ES2323448T3 (hu)
HK (3) HK1050372A1 (hu)
HU (2) HU229417B1 (hu)
IL (1) IL152605A0 (hu)
MX (1) MXPA02010823A (hu)
NO (2) NO329843B1 (hu)
NZ (1) NZ522881A (hu)
PL (1) PL211733B1 (hu)
PT (1) PT1287035E (hu)
RU (1) RU2298013C2 (hu)
TW (1) TWI318983B (hu)
WO (1) WO2001083560A1 (hu)
ZA (1) ZA200209230B (hu)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7528239B1 (en) 1997-02-13 2009-05-05 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
JP4330180B2 (ja) 1997-03-17 2009-09-16 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
AU4817200A (en) * 1999-05-04 2000-11-17 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
US7476383B2 (en) 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
WO2003033514A1 (en) 2001-10-19 2003-04-24 Vascular Biogenics Ltd. Polynucleotide constructs, pharmaceutical compositions and methods for targeted downregulation of angiogenesis and anticancer therapy
US8071740B2 (en) * 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
AU2003222427B8 (en) 2000-11-17 2010-04-29 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
CN100475848C (zh) * 2001-05-18 2009-04-08 麒麟麦酒株式会社 抗trail-r抗体
US20050214209A1 (en) * 2001-05-25 2005-09-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20090226429A1 (en) * 2001-05-25 2009-09-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors
US20050129616A1 (en) * 2001-05-25 2005-06-16 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7348003B2 (en) 2001-05-25 2008-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
CA2446723C (en) 2001-05-25 2014-01-21 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US7361341B2 (en) 2001-05-25 2008-04-22 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
DE60238560D1 (de) * 2001-11-01 2011-01-20 Uab Research Foundation Kombinationen aus anti-dr5-antikörpern und anti-dr4-antikörpern und weiteren therapeutischen agentien
ES2357225T3 (es) * 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
WO2003054216A2 (en) * 2001-12-20 2003-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
EP2075256A2 (en) 2002-01-14 2009-07-01 William Herman Multispecific binding molecules
DE10210427A1 (de) 2002-03-09 2003-10-09 Hans Konrad Mueller-Hermelink Humaner monoklonaler Antikörper
CA2491669A1 (en) 2002-07-04 2004-01-15 Oncomab Gmbh Neoplasm specific antibodies and uses thereof
AU2008201431B2 (en) * 2002-11-27 2011-11-24 Irm, Llc Methods and compositions for inducing Apoptosis in cancer cells
KR100915257B1 (ko) * 2002-11-27 2009-09-03 아이알엠 엘엘씨 단일클론 항-ｄｒ５ 효능제 항체, 그 항체를 발현하는 단리된 세포, 그 항체를 포함하는 제약 조성물 및 그 항체를 사용하는 방법
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
AU2005227322A1 (en) * 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
CN100427505C (zh) * 2004-08-19 2008-10-22 中国医学科学院基础医学研究所 抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体dr5单克隆抗体（ad5-10）及其制法与用途
WO2006063390A1 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Evogenix Ltd Osteoprotegerin variant proteins
JP5562521B2 (ja) 2005-02-02 2014-07-30 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション アポトーシス誘導デスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減することに関する薬剤及び方法
US8029783B2 (en) * 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
JP5004154B2 (ja) * 2005-04-06 2012-08-22 一般財団法人化学及血清療法研究所 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体
AU2006261127B2 (en) 2005-06-17 2012-03-15 Merck Sharp & Dohme Corp. ILT3 binding molecules and uses therefor
UA97096C2 (ru) * 2005-08-31 2012-01-10 Емджен Інк. Выделенное антитело, которое специфически связывает рецептор-2 trail (tr-2)
PE20071101A1 (es) * 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
CN101605887B (zh) 2006-05-16 2012-09-05 协和发酵麒麟株式会社 蛋白的高分泌生产方法
AU2007345745C1 (en) 2006-06-19 2013-05-23 Merck Sharp & Dohme Corp. ILT3 binding molecules and uses therefor
KR100847010B1 (ko) * 2006-07-05 2008-07-17 아주대학교산학협력단 세포사멸 수용체 5 (ｄｒ5)에 특이적으로 결합하는 항체 및이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR100804126B1 (ko) 2007-02-09 2008-02-19 아주대학교산학협력단 종양 괴사 인자―관련 세포사멸―유도 리간드의 수용체에특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체 및 그의항원결합 단편
WO2008154439A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Irm Llc Methods and compositions for inducing apoptosis in cancer cells
CA2695991A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Immunoliposome inducing apoptosis into cell expressing death domain-containing receptor
ES2537806T5 (es) 2007-10-31 2018-10-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Método para la secreción y producción de alto nivel de proteína
WO2010047509A2 (ko) * 2008-10-24 2010-04-29 아주대학교 산학협력단 친화도와 안정성이 향상된 항 ｄｒ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
JP2013505944A (ja) * 2009-09-24 2013-02-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド Ｄｒ５リガンド薬物結合体
WO2011049350A2 (ko) * 2009-10-19 2011-04-28 한올바이오파마주식회사 변형된 인간 종양 괴사 인자 수용체-1 폴리펩티드 또는 그의 절편 및 그의 제조방법
BR112012010698A2 (pt) 2009-11-05 2016-11-29 Uab Research Foundation método para tratamento de um sujeito com câncer, método de triagem de uma célula de câncer de mama, e , anticorpo
WO2011084623A1 (en) 2009-12-16 2011-07-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of death receptor ligands in cancer treatment
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
US9284350B2 (en) 2010-02-12 2016-03-15 Pharmascience Inc. IAP BIR domain binding compounds
WO2011116344A2 (en) 2010-03-18 2011-09-22 The Uab Research Foundation Targeting cancer stem cells
SI2636736T1 (sl) * 2010-10-29 2016-09-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Novo anti-dr5 protitelesce
EP3138581B1 (en) 2011-03-17 2019-01-02 The University of Birmingham Re-directed immunotherapy
JP2014513128A (ja) * 2011-05-03 2014-05-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 血管破壊剤とその使用
AU2013293062A1 (en) 2012-07-19 2014-07-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-Siglec-15 antibodies
CN116574185A (zh) * 2012-07-25 2023-08-11 塞尔德克斯医疗公司 抗kit抗体及其用途
CN103074425B (zh) * 2012-12-29 2014-01-01 深圳市第三人民医院 Cd263基因的用途
US10035847B2 (en) 2013-10-02 2018-07-31 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
CN104710533A (zh) * 2013-12-12 2015-06-17 中国科学院深圳先进技术研究院 sDR5-Fc融合蛋白及其用途
SG10202001779UA (en) 2015-01-20 2020-04-29 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor (tnf) superfamily receptor binding molecules and uses thereof
EP3250601A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 MacroGenics, Inc. Multivalent molecules comprising dr5-binding domains
CN105061604B (zh) * 2015-08-19 2018-03-16 河南大学 sDR5‑Fc融合蛋白突变体及其应用
CN109195626B (zh) 2015-10-30 2022-09-13 银河生物技术有限责任公司 结合死亡受体4和死亡受体5的抗体
CN106924735A (zh) * 2015-12-29 2017-07-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的用途
WO2017139485A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of apoptosis inducing ligands in cancer treatment
BR112018067522A2 (pt) 2016-03-01 2019-02-05 Univ Of Rijeka Faculty Of Medicine anticorpos específicos para receptor de poliovírus humano (pvr)
KR101926166B1 (ko) * 2016-05-24 2018-12-06 재단법인 아산사회복지재단 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법
EP3574017A1 (en) 2017-01-27 2019-12-04 Kymab Limited Anti-opg antibodies
KR101926834B1 (ko) 2017-03-21 2018-12-07 동아에스티 주식회사 항-dr5 항체 및 그의 용도
BR112019025328A2 (pt) 2017-06-07 2020-06-23 Genmab B.V. Composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, métodos para tratar um indivíduo tendo um câncer e para preparar uma composição farmacêutica, e, kit de partes.
MA50195A (fr) * 2017-09-22 2020-07-29 Immunogen Inc Séparation d'anticorps à chaîne triple légère à l'aide d'une chromatographie à échange de cations
WO2019100194A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
WO2019100193A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
CN108251443A (zh) * 2018-01-23 2018-07-06 深圳市人民医院 一种tnfrsf10c重组质粒、制备方法及其应用
CN117126279A (zh) 2018-03-20 2023-11-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
KR20210105890A (ko) 2018-12-17 2021-08-27 레비토프 리미티드 트윈 면역 세포 인게이저
WO2022154664A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut-Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Inducers of senescence, in combination with a selective death receptor 5 (dr5) agonist, for use in a method of treating cancer

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6433147B1 (en) * 1997-01-28 2002-08-13 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor-4
ES2284199T5 (es) * 1997-01-28 2011-11-14 Human Genome Sciences, Inc. Receptor 4 que contiene dominio de muerte (dr4: receptor 4 de muerte), miembro de la superfamilia de receptores de tnf y unión a trail (apo-2l).
US6072047A (en) * 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US6313269B1 (en) * 1997-03-14 2001-11-06 Smithkline Beecham Corporation Tumor necrosis factor related receptor, TR6
US6872568B1 (en) * 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
JP4330180B2 (ja) 1997-03-17 2009-09-16 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
AU734758B2 (en) 1997-04-01 2001-06-21 Sankyo Company Limited Anti-fas antibodies
JP2002512515A (ja) 1997-04-16 2002-04-23 ミレニアム ファーマシューティカルズ インク． 腫瘍壊死因子受容体関連蛋白質ＴＡＮＧＯ−６３ｄおよびＴＡＮＧＯ−６３ｅ
DE69838249T3 (de) 1997-05-15 2012-01-19 Genentech, Inc. Anti-apo-2 antikörper
US6342369B1 (en) * 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
AU8400398A (en) 1997-07-11 1999-02-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
WO1999003992A1 (en) * 1997-07-15 1999-01-28 Immunex Corporation Trail receptor
EP0934421A1 (en) 1997-08-06 1999-08-11 Laboratorio Medinfar-Produtos Farmaceuticos LDA. DNA INTEGRATION INTO "MYCOBACTERIUM spp." GENOME BY TRANS-COMPLEMENTATION USING A SITE-SPECIFIC INTEGRATION SYSTEM
ATE233887T1 (de) * 1997-08-13 2003-03-15 Sortech Ag Sorptionsspeicher, anordnung und verfahren zur speicherung von wärme
WO1999009165A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
ES2286856T3 (es) 1997-09-12 2007-12-01 Biogen Idec Ma Inc. Receptores train ricos en cisteina.
US7105640B2 (en) * 1997-10-17 2006-09-12 Genentech, Inc. Anti-pro792 antibodies
US20040120947A1 (en) 1998-01-26 2004-06-24 Genentech, Inc. DR4 antibodies and uses thereof
ES2368823T3 (es) 1998-01-26 2011-11-22 Genentech, Inc. Anticuerpos del receptor 4 de muerte (dr4) y usos de los mismos.
US6252050B1 (en) * 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
IL145676A0 (en) * 1999-04-12 2002-06-30 Genentech Inc Tumor necrosis factor homologs and nucleic acids encoding the same
AU4817200A (en) 1999-05-04 2000-11-17 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5
WO2000067793A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 4
CA2374599A1 (en) 1999-05-28 2000-12-07 Genentech, Inc. Dr4 antibodies and uses thereof
ES2267547T3 (es) 1999-06-09 2007-03-16 Genentech, Inc. Sinergia de antagonista de receptores del ligando apo-2l y de cpt-11.
US6294546B1 (en) 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
WO2001019861A2 (en) 1999-09-15 2001-03-22 Genentech, Inc. Apo-2 receptor antibodies
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US7279160B2 (en) 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7476383B2 (en) * 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
CA2426710A1 (en) 2000-11-08 2002-10-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US6965023B2 (en) * 2000-11-17 2005-11-15 The Burnham Institute Death domain proteins
ATE433996T1 (de) 2001-07-03 2009-07-15 Genentech Inc Humane dr4-antikörper und deren anwendungen
DE60238560D1 (de) 2001-11-01 2011-01-20 Uab Research Foundation Kombinationen aus anti-dr5-antikörpern und anti-dr4-antikörpern und weiteren therapeutischen agentien
ES2357225T3 (es) 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.

Also Published As

Publication number Publication date
EP2368910B1 (en) 2016-02-10
HU0500800D0 (en) 2005-10-28
BG65929B1 (bg) 2010-05-31
ES2323448T3 (es) 2009-07-16
EP2368910A1 (en) 2011-09-28
BG109275A (en) 2006-10-31
CA2407965C (en) 2014-10-14
CZ304614B6 (cs) 2014-08-06
JP2004502409A (ja) 2004-01-29
RU2002132255A (ru) 2005-01-20
US20140308288A1 (en) 2014-10-16
KR100817967B1 (ko) 2008-03-31
JP4156238B2 (ja) 2008-09-24
US8067001B2 (en) 2011-11-29
JP4575975B2 (ja) 2010-11-04
CY1109179T1 (el) 2014-07-02
JP2007091749A (ja) 2007-04-12
KR20060092292A (ko) 2006-08-22
US7790165B2 (en) 2010-09-07
EP1287035A1 (en) 2003-03-05
HK1050372A1 (en) 2003-06-20
BG107275A (bg) 2004-09-30
NZ522881A (en) 2005-05-27
HU229417B1 (hu) 2013-12-30
US20120076792A1 (en) 2012-03-29
NO329843B1 (no) 2011-01-10
CA2407965A1 (en) 2001-11-08
JP3892466B2 (ja) 2007-03-14
CZ2006291A3 (cs) 2017-11-01
AU5936601A (en) 2001-11-12
NO20025253D0 (no) 2002-11-01
ATE426615T1 (de) 2009-04-15
CN101585881A (zh) 2009-11-25
TWI318983B (en) 2010-01-01
PT1287035E (pt) 2009-06-30
BR0110547A (pt) 2004-06-22
EE05548B1 (et) 2012-06-15
CZ306996B6 (cs) 2017-11-01
US20110008324A1 (en) 2011-01-13
IL152605A0 (en) 2003-06-24
NO338228B1 (no) 2016-08-08
CN101585881B (zh) 2014-11-26
US20130243780A1 (en) 2013-09-19
JP2005232187A (ja) 2005-09-02
HK1162524A1 (zh) 2012-08-31
KR20030055177A (ko) 2003-07-02
ZA200209230B (en) 2004-03-16
PL211733B1 (pl) 2012-06-29
US8715668B2 (en) 2014-05-06
EP2065400B1 (en) 2014-11-05
HUP0400951A3 (en) 2012-09-28
HUP0400951A2 (hu) 2004-07-28
EE200200621A (et) 2004-06-15
EP2065401B1 (en) 2016-08-10
AU2001259366B2 (en) 2005-09-08
US9700618B2 (en) 2017-07-11
NO20025253L (no) 2002-12-18
BG66153B1 (bg) 2011-08-31
EP1287035B1 (en) 2009-03-25
US20030190687A1 (en) 2003-10-09
EP2065400A3 (en) 2009-07-22
EP2065401A2 (en) 2009-06-03
US8329180B2 (en) 2012-12-11
US20070298039A1 (en) 2007-12-27
PL366195A1 (en) 2005-01-24
EP1287035A4 (en) 2004-09-29
NO20054145L (no) 2002-12-18
DE60138097D1 (de) 2009-05-07
JP2009005707A (ja) 2009-01-15
HK1126506A1 (zh) 2009-09-04
MXPA02010823A (es) 2004-05-05
WO2001083560A1 (en) 2001-11-08
CN100497388C (zh) 2009-06-10
EP2065400A2 (en) 2009-06-03
RU2298013C2 (ru) 2007-04-27
DK1287035T3 (da) 2009-06-15
CN1440424A (zh) 2003-09-03
CZ20023917A3 (cs) 2003-05-14
EP2065401A3 (en) 2009-07-22
US7244429B2 (en) 2007-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230399B1 (hu) Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai
US9937268B2 (en) Anti-DLL3 antibody drug conjugates and methods of use
KR101624381B1 (ko) in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체
KR101960509B1 (ko) 클라우딘 6 특이적 항체
US10308721B2 (en) Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
HU230378B1 (hu) Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi
RU2691698C2 (ru) Антитела против sez6 и способы их применения
TW200819464A (en) Anti-NKG2A antibodies and uses thereof
CN102112490A (zh) Notch1受体结合剂和其使用方法
EA009124B1 (ru) Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении
JP2017500028A (ja) 新規の抗ｄｐｅｐ３抗体および使用方法
JP2005532050A (ja) 新規のｒａａｇ１０細胞表面標的および当該標的を認識する抗体ファミリー
EA028336B1 (ru) Полностью человеческие антитела, специфические в отношении cadm1
RU2725950C1 (ru) Антитела против белка-1 запрограммированной клеточной смерти (pd-1) и их применение
CN101583624B (zh) 用于诊断和治疗癌症的组合物及其用途
WO2021170146A1 (zh) 新型抗cd19抗体和cd19-car-t细胞的制备及其应用
TW200526682A (en) Laminin-5γ2-binding peptides, related compositions, and use thereof