PL211733B1

PL211733B1 - Oczyszczone przeciwciało swoiście wiążące receptor DR5 dla TRAIL, kompozycja farmaceutyczna zawierająca to przeciwciało, sposób in vitro wybiórczego indukowania apoptozy, zastosowanie oczyszczonego przeciwciała do wytwarzania leku do wybiórczej śmierci komórkowej, zastosowanie oczyszczonego przeciwciała do leczenia nowotworu i zastosowanie oczyszczonego przeciwciała do leczenia choroby autoimmunologicznej

Info

Publication number: PL211733B1
Application number: PL366195A
Authority: PL
Inventors: Tong Zhou; Kimihisa Ichikawa; Robert P. Kimberly; William J. Koopman
Original assignee: Uab Research Foundation
Priority date: 2000-05-02
Filing date: 2001-05-02
Publication date: 2012-06-29
Also published as: EP2368910B1; HU0500800D0; BG65929B1; ES2323448T3; EP2368910A1; BG109275A; CA2407965C; CZ304614B6; JP2004502409A; RU2002132255A; US20140308288A1; KR100817967B1; JP4156238B2; US8067001B2; JP4575975B2; CY1109179T1; JP2007091749A; KR20060092292A; US7790165B2; EP1287035A1

Description

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy oczyszczonego przeciwciała swoiście wiążącego receptor DR5 dla TRAIL, kompozycji farmaceutycznej zawierającej to przeciwciało, sposobu in vitro wybiórczego indukowania apoaptozy, zastosowania oczyszczonego przeciwciała do wytwarzania leku do wybiórczej śmierci komórkowej, zastosowania oczyszczonego przeciwciała do leczenia nowotworu i zastosowania oczyszczonego przeciwciała do leczenia choroby autoimmunologicznej.

Szczegółowo, wynalazek dotyczy oczyszczonego przeciwciała zdolnego do specyficznego wiązania się z pojedynczym typem receptora dla liganda indukującego apoptozę (określanego tu dalej jako „TRAIL”) spokrewnionego z czynnikiem martwicy nowotworu (określanego tu dalej jako „TNF”), bardziej szczegółowo dotyczy przeciwciała monoklonalnego, które indukuje apoptozę in vivo i in vitro w komórkach z ekspresją pojedynczego typu receptora oraz terapii na nim opartych.

Tło wynalazku

TRAIL jest członkiem rodziny białek TNF, która obejmuje także TNF-α i ligand Fas (1). Białka te są silnymi induktorami apoptozy. Do tej pory zidentyfikowano pięć receptorów dla TRAIL, z których dwa, DR4 (TRAIL-R1) i DR5 (TRAIL-R2) (2-7), są zdolne do przenoszenia sygnału apoptotycznego, podczas gdy pozostałe trzy DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) oraz osteoprotegryna (OPG) nie przenoszą sygnału apoptotycznego (8-12). Wszystkie pięć receptorów dla TRAIL wykazuje znaczną homologię zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligand. Podobnie do receptora I dla Fas i TNF (określanego tu dalej jako „TNFRI”), wewnątrzkomórkowe segmenty, zarówno DR4, jak i DR5 zawierają domenę śmierci i przenoszą sygnał apoptotyczny przez szlak, który angażuje białko z domeną śmierci związane z Fas (określane tu dalej jako „FADD” i kaspazę 8 (6, 7). Ponadto, oprócz przenoszenia sygnału apoptotycznego, receptory DR4 i DR5 mogą także aktywować szlak angażujący Nfcib (6, 7).

Biologiczne funkcje TRAIL, które zostały wykazane obejmują zdolność TRAIL do selektywnej indukcji apoptozy w transformowanych komórkach nowotworowych, przy czym komórki zdrowe są stosunkowo oporne na apoptozę za pośrednictwem TRAIL (13-15). Ta selektywność sugeruje, że w przeciwieństwie do ligandu Fas, podawanie TRAIL jest związane z bardzo niskimi poziomami toksyczności, jak pokazano przez ogólnoustrojowe podawanie TRAIL w modelu zwierzęcym bez indukowania znaczącej toksyczności (13). Tak więc, zaproponowano TRAIL jako silny środek indukujący apoptozę, który byłby odpowiednim środkiem terapeutycznym w leczeniu nowotworu i innych chorób związanych z nieprawidłową proliferacją komórek. Zaproponowano także TRAIL jako silny środek indukujący apoptozę, który mógłby być odpowiedni do leczenia chorób autoimmunologicznych i zapalnych. Wykazano, że apoptoza za pośrednictwem TRAIL jest zaangażowana w śmierć komórek T indukowaną aktywacją komórek, tym samym służąc jako alternatywny mechanizm dla liganda Fas (16, 17). Apoptoza za pośrednictwem TRAIL może także odgrywać rolę w indukcji apoptozy komórek T i innych komórek zapalnych (18) i odgrywa rolę w uśmiercającej aktywności komórek NK (19-21) oraz immunomodulującej funkcji komórek dendrytowych (22, 23). Tak więc, apoptoza za pośrednictwem TRAIL może także odgrywać rolę w nietykalności immunologicznej i nadzorze immunologicznym.

System receptora TRAIL jest złożony i obejmuje przynajmniej dwa receptory śmierci, DR4 i DR5 oraz przynajmniej dwa receptory nieapoptotyczne, DcR1 i DcR2. Wszystkie te receptory wykazują nie tylko dużą homologię sekwencji aminokwasowych, ale także podobne powinowactwo wiązania do TRAIL (2-12). Zdolność receptorów DcR1 i DcR2 do współzawodniczenia w wiązaniu z TRAIL bez indukcji apoptozy sugeruje, że mogą one działać jako receptory przynętowe, które blokują lub modulują aktywność liganda TRAIL. Ponadto stwierdzono, że nie transformowane komórki posiadają wyższy poziom ekspresji receptorów przynętowych niż komórki transformowane. Tak więc, zaproponowano, że różnicująca modulacja ekspresji receptorów śmierci i receptorów przynętowych może reprezentować kluczowy mechanizm regulacyjny, który determinuje podatność komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, lecz dzięki brakowi przeciwciał specyficznych do receptora (2). Pomimo, że ekspresja i funkcja DR4 i DR5 były intensywnie badane, postęp w badaniach był hamowany poprzez brak specyficznych dla receptora przeciwciał monoklonalnych. Ekspresja DR5 na powierzchni komórki nie została udokumentowana. Doniesiono o wytworzeniu zestawu przeciwciał przeciwko receptorowi dla TRAIL, które są zdolne in vitro do indukcji apoptozy w komórkach czerniaka, ale tylko po unieruchomieniu przeciwciał, żeby promować wiązanie krzyżowe, a w niektórych przypadkach komórki wymagają hodowli z aktynomycyną D (24). Wytworzono kilka przeciwciał anty-DR5 (24). Jednakże, wcześniej wytworzone przeciwciała monoklonalne anty-DR5 mają niską aktywność indukcji apoptozy in vitro, nawet

PL 211 733 B1 w warunkach wiązania krzyżowego. Nie stwierdzono żadnej aktywności in vivo. Przeciwciała te nie były używane do badania ekspresji receptorów TRAIL na powierzchni komórki (24). Tak więc, istnieje potrzeba wytworzenia przeciwciała monoklonalnego selektywnego względem każdego specyficznego receptora TRAIL, które jest nie tylko zdolne do wiązania receptora na powierzchni komórki, ale także silnie indukuje apoptozę w różnych typach nieprawidłowych komórek, włączając komórki nowotworowe, zarówno in vivo, jak i in vitro bez potrzeby wiązania krzyżowego lub immobilizacji. Takie przeciwciało nie tylko dostarczyłoby potencjalnego środka terapeutycznego, ale także narzędzia diagnostycznego do funkcjonalnej analizy receptora TRAIL. Istnieje szczególna potrzeba wytworzenia specyficznego przeciwciała przeciwko każdemu z receptorów DR4 i DR5 indukujących śmierć.

Przyczyną rozwoju lub postępu wielu chorób jest to, że komórki nie są eliminowane. W wielu chorobach autoimmunologicznych i w stanach zapalnych, przeżywające zaktywowane komórki atakują zdrowe tkanki i komórki. Ponadto, postęp nowotworzenia i formowanie łuszczki rozrostowej reumatoidalnego zapalenia stawów charakteryzują się niekontrolowaną proliferacją komórek. A zatem, niedostateczna apoptoza prowadzi rozwoju choroby i zastosowania ligandu indukującego apoptozę lub agonistycznego przeciwciała monoklonalnego w celu wzmocnienia apoptozy mogą być rozważane jako potencjalna strategia w eliminacji tych niechcianych komórek.

Na przykład, reumatoidalne zapalenie stawów (określane tu dalej jako „RA” jest powszechną ludzką chorobą autoimmunologiczną. Obecne zrozumienie patofizjologii RA jest takie, że autoimmunologiczne komórki T i komórki B inicjują odpowiedź zapalną w stawach, co powoduje hiperproliferację komórek mazi stawowej. Jako konsekwencja hiperproliferacji komórek maziówkowych, metaloproteiny (określane tu dalej jako „MMPs”) ulegają nadprodukcji, co z kolei prowadzi do erozyjnej destrukcji chrząstki i kości, które jest charakterystyczne dla (25). Tak więc, kontrola hiperproliferacji zapalnych komórek maziówkowych jest kluczowym etapem w leczeniu RA. Mechanizm molekularny prowadzący do hiperpolaryzacji komórek maziówkowych jest nadal nieznany. Pomimo, że hiperproliferujące komórki maziówkowe są niezłośliwe i nie stransformowane, wiele badań sugerowało, że mają one pewne wspólne cechy z komórkami transformowanymi (46). Komórki te, tak zwane „komórki maziówkowe z cechami transformacji” charakteryzują się gęstą szorstką siateczkę śródplazmatyczną, licznymi nieregularnymi jądrami i zmianami w zwykle wrzecionowatym cytoszkielecie komórki. Zaproponowano, że wbudowanie onkogenów i genów pochodzenia wirusowego ma być pierwotnym czynnikiem zmiany komórek maziówkowych RA w kierunku transformacji (46).

Przynajmniej dwa aspekty RA sugerują, że rozregulowana apoptoza może odgrywać rolę w procesie chorobowym i terapeutyczne wywołanie apoptozy może być skutecznym leczeniem: defekt w usuwaniu zaktywowanych komórek T sugeruje, że istnieje defekt w śmierci indukowanej aktywacją tych komórek T, która jest procesem, który angażuje apoptozę za pośrednictwem Fas i apoptozę za pośrednictwem TRAIL, a hiperproliferacyjna natura komórek maziówkowych RA jest istotnym czynnikiem patofizjologii w późniejszych stadiach I RA. Istotnie, wykazano, że podawanie przeciwciała anty-Fas do stawów w stanie zapalnym hamuje rozwój przewlekłego zapalenia stawów w transgenicznych myszach tax, które są zwierzęcym modelem ludzkiego RA (26). Ponadto, zlokalizowana transdukcja genem liganda fas przy pomocy wektora adenowirusowego jest skuteczna w zapobieganiu zapalenia stawów indukowanego kolagenem (27). Zahamowanie proliferacji zapalnych komórek maziówkowych przez wzmocnienie apoptozy za pośrednictwem Fas jest obserwowana w obydwu przypadkach. Pomimo, że ligand Fas jest silnym induktorem apoptozy w komórkach maziówkowych RA, stosowanie apoptozy indukowanej ligandem Fas jako terapii dla ludzi było ograniczone przez letalną toksyczność dla wątroby. Tak więc, apoptoza indukowana przez receptor TRAIL reprezentuje bezpieczniejszą i bardziej skuteczną terapię w leczeniu RA niż apoptoza indukowana ligandem Fas.

Apoptoza indukowana poprzez receptor TRAIL reprezentuje także bezpieczniejszą i bardziej skuteczną terapię w leczeniu nowotworu niż apoptoza indukowana ligandem Fas. Wiadomo, że apoptoza indukowana TRAIL specyficznie indukuje apoptozę transformowanych komórek nowotworowych bez wpływu na komórki zdrowe. Wykazano, że ogólnoustrojowe podawanie rozpuszczalnego trimeru TRAIL nie powoduje toksyczności u zwierząt eksperymentalnych, nadal indukując cofanie się implantowanych guzów (13, 28). Jego zaleta jako terapii wspomagającej tradycyjne sposoby leczenia została podkreślona przez obecne odkrycia ujawniające, że ekspresja DR5 i podatność na apoptozę indukowaną TRAIL komórek nowotworu piersi jest wzmocniona przez napromieniowanie, sugerując, że skuteczność TRAIL byłaby zwiększona w leczeniu nowotworu w połączeniu z napromieniowaniem (29).

PL 211 733 B1

Ponadto, gen kodujący receptor DR5 dla TRAIL został zmapowany do chromosomu 8p21-22, miejsca z wysoką częstością mutacji w pewnych komórkach nowotworowych (30). Stwierdzono, że przynajmniej dwa rodzaje komórek nowotworowych, rak płuc z małych komórek (31) i nowotwór głowy i szyi (32) wykazuje mutacje w domenie śmierci w genie DR5. Tak więc, istnieje potrzeba skonstruowania przeciwciała anty-DR5 w badaniach nowotworu w celu określenia efektu zmian w epitopach receptora podczas rozwoju i progresji nowotworów. Ponadto, funkcjonalna analiza mutacji receptora dla TRAIL dostarczyłaby użytecznego narzędzia diagnostycznego przy użyciu w połączeniu z innymi biomarkerami we wczesnym wykrywaniu nowotworów i określaniu agresywności nowotworu.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczone przeciwciało, które wiąże swoiście receptor DR5 dla TRAIL, posiadające aktywność indukującą apoptozę w nieobecności drugorzędowego wiązania krzyżowego i które nie wiąże się z receptorem DR4, DcR1 lub DcR2 dla TRAIL oraz które zawiera łańcuch ciężki oraz łańcuch lekki, przy czym:

a) łańcuch ciężki zawiera region zmienny zawierający regiony CDR z przeciwciała monklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu PTA-1428; i

b) łańcuch lekki zawiera region zmienny zawierający regiony CDR z przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez TRA-8; i przy czym, w regionach CDR jedna reszta może być dodana, pominięta albo zastąpiona.

W korzystnym aspekcie wynalazku oczyszczone przeciwciało jest przeciwciałem monklonalnym oraz również korzystnie, receptor DR5 jest ludzkim DR5.

Także korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428.

W kolejnym korzystnym aspekcie wynalazku, przeciwciało jest humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428.

W innym korzystnym aspekcie przeciwciało według wynalazku zawiera:

(a) łańcuch ciężki, przy czym ten łańcuch ciężki zawiera region zmienny wybrany z grupy składającej się z reszt aminokwasowych 1-119 z SEK NR ID: 31 albo ich funkcjonalnego równoważnika; reszt aminokwasowych 1-119 z SEK NR ID: 56 albo ich funkcjonalnego równoważnika; reszt aminokwasowych 1-119 z SEK NR ID: 59 albo ich funkcjonalnego równoważnika; reszt aminokwasowych 1-119 z SEK NR ID: 60 albo ich funkcjonalnego równoważnika; oraz reszt aminokwasowych 1-119 z SEK NR ID: 61 albo ich funkcjonalnego równoważnika; i (b) łańcuch lekki, przy czym ten łańcuch lekki zawiera region zmienny wybrany z grupy składającej się z reszt aminokwasowych 1-108 z SEK NR ID: 46 albo ich funkcjonalnego równoważnika; reszt aminokwasowych 1-108 z SEK NR ID: 72 albo ich funkcjonalnego równoważnika; reszt aminokwasowych 1-108 z SEK NR ID: 73 albo ich funkcjonalnego równoważnika; reszt aminokwasowych 1-108 z SEK NR ID: 74 albo ich funkcjonalnego równoważnika; reszt aminokwasowych 1-108 z SEK NR ID: 75 albo ich funkcjonalnego równoważnika; i reszt aminokwasowych 1-108 z SEK NR ID: 76 albo ich funkcjonalnego równoważnika.

W bardziej korzystnym rozwiązaniu, łańcuch ciężki zawiera region stały łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny G1, a taki łańcuch lekki zawiera region stały łańcucha lekkiego kappa ludzkiej immunoglobuliny.

W innym korzystnym rozwiązaniu, oczyszczone przeciwciało według wynalazku zawiera:

(a) łańcuch ciężki, przy czym ten łańcuch ciężki zawiera region zmienny wybrany z grupy składającej się z regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) albo jego funkcjonalnego równoważnika; regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHAl5 (FERM BP-7555) albo jego funkcjonalnego równoważnika; regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557) albo jego funkcjonalnego równoważnika; regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) albo jego funkcjonalnego równoważnika; i regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHMll (FERM BP-7559) albo jego funkcjonalnego równoważnika; i (b) łańcuch lekki, gdzie łańcuch lekki zawiera region zmienny połączony z regionem stałym, wybrany z grupy składającej się z regionu zmiennego połączonego z regionem stałym kodowanym przez

PL 211 733 B1 sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5a/pHSG/M2-1-4 (FERM BP-7563) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; regionu zmiennego połączonego z regionem stałym, kodowanym przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5α/pHSG/Ml-2-2 (FERM BP-7562) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; regionu zmiennego połączonego z regionem stałym, kodowanym przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5α/pHSG/M3-3-2-2 (FERM BP-7564) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; regionu zmiennego połączonego z regionem stałym, kodowanym przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5α/pHSG/M4-5-3-1 (FERM BP-7565) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; i regionu zmiennego połączonego z regionem stałym, kodowanym przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5α/pHSG/M6-1-4-1 (FERM BP-7566) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem.

W bardziej korzystnym wykonaniu łańcuch ciężki zawiera region stały łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny G1, a łańcuch lekki zawiera region stały łańcucha lekkiego kappa ludzkiej immunoglobuliny.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu oczyszczone przeciwciało według wynalazku zawiera:

(a) łańcuch ciężki immunoglobuliny, przy czym łańcuch ciężki zawiera region zmienny o wzorze ogólnym region zrębowy 1-CDR1-region zrębowy 2-CDR2-region zrębowy 3-CDR3-region zrębowy 4, CDR1 składa się z reszt aminokwasowych 1-5 z SEK ID NR: 25, CDR2 składa się z reszt aminokwasowych 1-17 z SEK ID NR: 26 i CDR3 składa się z reszt aminokwasowych 1-10 z SEK ID NR: 27; i (b) łańcuch lekki immunoglobuliny, przy czym łańcuch lekki zawiera region zmienny o wzorze ogólnym region 5 zrębowy 5-CDR4-region zrębowy 6-CDR5-region zrębowy 7-CDR6-region zrębowy 8, gdzie CDR4 składa się z reszt aminokwasowych 1-11 z SEK ID NR: 28, CDR5 składa się z reszt aminokwasowych 1-7 z SEK ID NR: 29, a CDR6 składa się z reszt aminokwasowych 1-8 z SEK ID NR: 30.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, która zawiera skuteczną ilość przeciwciała według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych wyrażających DR5, polegający na tym, że obejmuje etap doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością oczyszczonego przeciwciała zdefiniowanego powyżej.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, komórkami docelowymi wyrażającymi DR5 są komórki nowotworowe lub także korzystnie zapalne komórki maziówkowe, lub też ewentualnie komórkami docelowymi wyrażającymi DR5 są aktywowane komórki T lub komórki B.

W bardziej korzystnej realizacji sposobu według wynalazku, aktywowanymi komórkami T lub komórkami B są aktywowane limfocyty.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do wybiórczej śmierci komórkowej docelowych lub rozregulowanych komórek.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku wybiórczej śmierci komórkowej komórek docelowych Iub rozregulowanych, przy czym lek ten jest do leczenia osobnika z chorobą związaną z apoptozą.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowania przeciwciała zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do wybiórczej śmierci komórkowej komórek docelowych lub rozregulowanych, przy czym lek ten jest do leczenia osobnika z nowotworem, przy czym lek ten jest do podawania osobnikowi i przy czym przeciwciało indukuje wybiórczo apoptozę komórek nowotworowych.

W korzystnym aspekcie wynalazku, lek zawiera ponadto drugie przeciwciało, które zwiększa śmierć komórkową komórek nowotworowych.

Także korzystnie, lek zawiera ponadto czynnik terapeutyczny, a bardziej korzystnie czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

Jeszcze bardziej korzystnie, wspomniany czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu, doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, pakslitakselu, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

W innym korzystnym rozwiązaniu, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, lek jest do leczenia osobnika z chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, przy czym lek jest w postaci do podawania osobnikowi i przy czym, farmaceutycznie skuteczna ilość przeciwciała wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych mających receptory DR5.

PL 211 733 B1

Komórkami docelowymi korzystnie są aktywowane komórki T lub komórki B, a jeszcze bardziej korzystnie aktywowanymi komórkami T lub komórkami B są aktywowane limfocyty.

Komórkami docelowymi w zastosowaniu według wynalazku mogą być także korzystnie zapalne komórki maziówkowe.

Korzystnie, zastosowanie według wynalazku obejmuje ponadto podawanie osobnikowi farmaceutycznie skutecznej ilości drugiego przeciwciała, które zwiększa śmierć komórkową komórek docelowych.

Zastosowanie obejmuje ponadto podawanie osobnikowi farmaceutycznie skutecznej ilości czynnika terapeutycznego, przy czym korzystnie takim czynnikiem terapeutycznym jest bisindolilomaleimid albo metotreksat, a chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną jest reumatoidalne zapalenie stawów.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała będącego humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydom mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428 do wytwarzania leku do leczenia u osobnika nowotworu poprzez indukcję apoptozy komórek nowotworowych.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała będącego humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydom mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428 do wytwarzania leku do leczenia u osobnika choroby autoimmunologicznej, przy czym przeciwciało to wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku oddziałuje z receptorem dla liganda - czynnika martwicy nowotworu, takim jak DR4, DR5, DcR1, DcR2 i OPG, indukując apoptozę w komórkach z ekspresją takiego receptora. Ujawnione przeciwciało według niniejszego wynalazku zdolne jest do selektywnego wiązania agonistycznego lub antagonistycznego epitopu receptora dla liganda w postaci czynnika martwicy nowotworu.

Niniejszy wynalazek pozwala zatem na leczenie choroby związanej z apoptoza przy zastosowaniu sposobu, który obejmuje ekspozycję docelowej tkanki objętej chorobą związaną z apoptoza na terapeutyczną ilość oczyszczonego przeciwciała według niniejszego wynalazku.

W niniejszym wynalazku opisana jest także fuzja białkowa, która zawiera antygenową sekwencję aminokwasową receptora dla TRAIL o długości przynajmniej dziesięciu aminokwasów połączoną z białkiem immunoglobuliny lub jego fragmentem zdolnym do wywołania u pacjenta odpowiedzi immunologicznej.

Niniejszy wynalazek pozwala na rozwinięcie terapii genowej, w której komórka docelowa jest transfekowana sekwencją nukleotydową receptora dla TRAIL na wektorze ekspresyjnym tak, że receptor dla TRAIL jest wyrażany na powierzchni komórek docelowych. Komórka docelowa jest następnie eksponowana na przeciwciało, które selektywnie wiąże się do receptora dla TRAIL.

Dostarczone są sekwencje nukleotydowe i sekwencje aminokwasowe kodujące ciężki i lekki łańcuch immunoglobulin przeciwciała selektywnego dla DR5. Wyszczególnione są także wektory, które zawierają sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku i komórki gospodarza transformowane wektorem według niniejszego wynalazku.

Niniejszy wynalazek dostarcza komórkę gospodarza wytwarzającą humanizowane TRA-8.

Opisany jest sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała wobec DR5, w którym gospodarz jest transformowany sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi humanizowany lekki łańcuch immunoglobuliny i humanizowany ciężki łańcuch immunoglobuliny, po czym gospodarz jest inkubowany przez określony wcześniej okres czasu.

Opisany jest także proces hamowania proliferacji komórek, który obejmuje oddziaływanie farmaceutycznie skutecznej ilości humanizowanego przeciwciała wobec DR5 na komórki docelowe.

Krótki opis rysunków

Figura 1. Charakterystyka TRA-8.

(a.) Specyficzność wiązania TRA-8: analiza typu Western (górny rząd): Rekombinowane fuzje białkowe z rodziny TNFR z użyciem sondy w postaci TRA-8 lub anty-ludzkiego IgG. Ścieżka 1: fuzja białkowa DR5/hIgG1 (immunogen); Ścieżka 2: DR4/hIgG1 (TRAIL-R1); Ścieżka 3: DR5/hIgG1; Ścieżka 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hIgGl; Ścieżka 5: TRAIL-R4(DcR-2)/hIgG1; Ścieżka 6, CD95/hIgG1; Ścieżka 7: rozpuszczalny TNFRI. Analiza testem ELISA (niższy rząd): Numery studzienek odpowiadają tym z analizy techniką Western z wyjątkiem studzienki 8, w którym jest mysia fuzja białkowa DR5/hIgG1.

PL 211 733 B1 (b.) Aktywność wiązania rozpuszczalnego TRAIL i TRA-8 do DR5 i DR4: Płytki do testu ELISA pokryto DR5/hIgG1 (lewy panel) 13 DR4/hIgG (środkowy panel), a następnie inkubowano z TRAIL lub TRA-8.

(c.) Analiza powierzchniowej ekspresji DR5 przy użyciu cytometrii przepływowej. Komórki Cos-7 transfekowano wektorem ekspresyjnym pcDNA3 zawierającym pełnej długości cDNA DR5 (wypełniony histogram), cDNA DR4 (pusty histogram, linia ciągła) lub pustym wektorem (pusty histogram, linia przerywana). Czterdzieści osiem godzin po transfekcji komórki barwiono TRA-8, po czym podawano antymysie IgGl sprzężone z PE.

(d.) Immunohistochemiczna reaktywność DR5 in situ: Cytospinowe preparaty histologiczne komórek Cos-7 transfekowanych wektorem kontrolnym lub ekspresyjnym z DR5 barwiono TRA-8 48 godzin po transfekcji.

(e.) Aktywność zabijania TRA-8: komórki Jurkat inkubowano we wskazanych stężeniach TRA-8. Żywotność komórek oznaczano testami ATPLite, MTT i wymiany PI po nocnej hodowli. Wyniki oznaczeń ATPLite i MTT są zaprezentowane jako procent komórek PI-negatywnych.

(f.) Analiza aktywacji kaspaz techniką Western: komórki Jurkat były inkubowane w 500 ng/ml TRA-8 przez wskazany czas. Lizaty komórek rozdzielono na 15% żelu SDS-PAGE, przeniesiono na filtr i hybrydyzowano z przeciwciałami przeciwko kaspazom. Strzałki wskazują przecięte podjednostki każdej z kaspaz.

(g.) Oznaczanie inhibicji kaspaz: komórki Jurkat inkubowano z 50 ng/ml TRA-8 przez noc w obecności różnych stężeń wskazanych inhibitorów kaspaz. Żywotność komórek była oznaczana testem ATPLite.

Figura 2. Ekspresja DR5 na powierzchni komórki i podatność na apoptozę za pośrednictwem DR5. Zdrowe komórki T i B świeżo wyizolowane z krwi obwodowej, linie komórkowe komórek T (a i a'), glejaka (b i b'), komórek raka prostaty (c) i komórek B (d) inkubowano z TRA-8 lub kontrolnym mysim izotypowym przeciwciałem IgG, po którym podawano kozie anty-mysie IgG sprzężone z RE. Otwarte histogramy przedstawiają kontrolne przeciwciało izotypowe, podczas, gdy wypełnione histogramy przedstawiają barwienie TRA-8. Apoptozę oznaczono testem ATPLite po nocnej inkubacji z rozpuszczalnym TRAIL (puste koła) lub TRA-8 (wypełnione koła), jak pokazano na a, b' i d.

Figura 3a'. Linię komórkową U937 komórek T inkubowano z TRA-8 lub z kontrolnym mysim izotypowym przeciwciałem. Apoptozę oznaczano testem ATPLite po nocnej inkubacji z rozpuszczalnym TRAIL (puste koła) lub TRA-8 (wypełnione koła).

Figura 3. Linie komórkowe glejaka i raka prostaty (c) inkubowano z TRA-8 lub kontrolnym mysim izotypowym przeciwciałem. Apoptozę oznaczano testem ATPLite po nocnej inkubacji z rozpuszczalnym TRAIL (puste koła) lub TRA-8 (wypełnione koła).

Figura 4 jest serią wykresów pokazujących żywotność ludzkich komórek Jurkat po ekspozycji na wskazane stężenia klonów przeciwciał TRA-1, -8, i -10 (A) oraz TRAIL (B) w obecności ustalonego stężenia wynalezionych klonów przeciwciał przedstawionych na fig. 4A.

Figura 5. Ekspresja DR5 w tkankach zdrowych i nowotworowych: Homogenaty tkanek zdrowych i nowotworowych były hybrydyzowane z TRA-8 i uwidocznione przy pomocy chemiluminescencji. (a). Analiza techniką Western białka DR5 w normalnych tkankach: ścieżka 1: wątroba, ścieżka 2: mózg, ścieżka 3: płuco, ścieżka 4: nerka, ścieżka 5: śledziona, ścieżka 6: jądra, ścieżka 7: jajnik, ścieżka 8: serce, ścieżka 9: trzustka. (b.) Analiza techniką Western białka DR5 w tkankach nowotworowych: Hybrydyzowano filtr zawierający tkanki nowotworowe z nowotworów jajnika (ścieżka 1), płuca (ścieżka 2), wątroby (ścieżka 3), odbytnicy (ścieżka 4), szyjki macicy (ścieżka 5), skóry (ścieżka 6), jąder (ścieżka 7), tarczycy (ścieżka 8), macicy (ścieżka 10), żołądka (ścieżka 11), krtani (ścieżka 12), trzustki (ścieżka 13). Immunohistochemia in situ normalnych ludzkich tkanek (c.) i tkanek nowotworowych (d.). Zamrożone skrawki były poddawane immunobarwieniu przy użyciu TRA-8.

Figura 6. Przeciwnowotworowa aktywność TRA-8. Myszy SCID zaszczepiono podskórnie komórkami 1321N1. Myszom wstrzyknięto dożylnie pojedynczą dawkę 100 μg TRA-8 na drugi dzień po zaszczepieniu nowotworu (a.) lub trzy dawki 100 μg TRA-8 poczynając od 7 dnia po zaszczepieniu nowotworu (b). Wzrost nowotworu oznaczono poprzez masę i zbadany histologicznie w barwieniu H & E. Fotografie pokazują intensywny wzrost guza w myszach kontrolnych, lecz nie w komórkach traktowanych TRA-8 (c, górny rząd) i barwienie H & E guza (c, dolny rząd). Myszom SCID wstrzyknięto dożylnie 10⁶ komórek Jurkat i traktowano pojedynczą dawką TRA-8 na drugi dzień po wstrzyknięciu. Siedem dni później wycięto śledzionę, wybarwiono przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD3 i analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej (d.) lub immunohistochemii (e).

PL 211 733 B1

Figura 7 pokazuje ekspresję DR5 na powierzchni komórek w komórkach maziówkowych w RA (A) i OA (B). 1 x 10⁶ hodowanych pierwotnych komórek maziówkowych wybarwiono przy użyciu TRA-8 oczyszczonego na kolumnie powinowactwa, po czym dodano kozie antymysie przeciwciało IgGl sprzężone z PE. 10000 żywotnych komórek przeanalizowano na FACSvantage.

Figura 8 jest serią wykresów pokazujących żywotność komórek jako funkcję stężenia TRAIL i TRA-8 indukujących apoptozę w wybranych szczepach komórek maziówkowych z PA (A) i OA (B) traktowanych różnymi stężeniami rekombinowanego rozpuszczalnego TRAIL (puste koła) lub TRA-8 oczyszczonego na kolumnie powinowactwa (wypełnione koła). Żywotność komórek jest procentem cpm komórek traktowanych w stosunku do cpm komórek niczym nie traktowanych.

Figura 9 jest serią wykresów pokazujących zależność apoptozy indukowanej DR5 od kaspaz w komórkach maziówkowych RA. Komórki maziówkowe RA (RA512) są inkubowane z 50 ng/ml rozpuszczalnego ligandu Fas (puste kwadraty), przeciwciałem anty-Fas (CH-11) (wypełnione kwadraty), rozpuszczalnym TRAIL (puste koła) lub przeciwciałem anty-DR5 (TRA-8) (wypełnione koła) w obecności różnych stężeń inhibitorów kaspaz. Po nocnej hodowli żywotność komórek oznaczano przy zastosowaniu ATPLite.

Figura 10A jest oznaczeniem zmiany migracji podczas elektroforezy w żelu wskazującej na aktywację Nfcib. Przed wykonaniem elektroforezy komórki RA1016 inkubowano z 20 ng/ml TNF-α, 50 ng/ml rozpuszczalnego TRAIL lub 50 ng/ml TRA-8 w ciągu wskazanych okresów czasu.

Figury 10B i C są wykresami pokazującymi produkcję MMP-1 i MMP-3. 1 x 10⁶/ml wskazanych komórek maziówkowych RA inkubowano ze wskazanymi stężeniami TNF-α (puste koła), TRAIL (puste trójkąty) lub TRA-8 (wypełnione koło). Po nocnej hodowli zebrano z hodowli supernatanty. Poziomy MMPs w supernatantach z hodowli oznaczano testem ELISA.

Figura 11. TRA-8 nie indukuje toksyczności w komórkach wątroby.

(a.) W normalnych tkankach wątrobowych nie zachodzi ekspresja DR5. Do barwienia H & E przygotowano skrawki parafinowe dwóch normalnych tkanek wątrobowych, jedna tkanka raka wątroby i cytospinowy preparat komórek HepG2, a odpowiadające im zamrożone skrawki wybarwiono TRA-8.

(b.) Analiza ekspresji DR5 na powierzchni komórki przy użyciu cytometrii przepływowej. Hepatocyty wyizolowane z dwóch normalnych tkanek wątrobowych i jednego przypadku tkanki raka wątroby oraz komórki HepG2 wybarwiono TRA-8, przeciwciałem anty-Fas (DX2) lub izotypowym przeciwciałem kontrolnym. Histogramy wypełnione wskazują na barwienie TRA-8 lub DX2, a puste histogramy są odpowiadającymi im kontrolami izotypowymi.

Figura 12. TRAIL, ale nie TRA-8, indukuje toksyczność komórek wątrobowych. Świeże normalne ludzkie hepatocyty były hodowane w Pożywce do Hodowli Hepatocytów.

(a.) Apoptozę hepatocytów indukowano przy użyciu 1 pg/ml rozpuszczalnego TRAIL z odczynnikiem do wiązania krzyżowego lub TRA-8 przez wskazane okresy czasu. Żywotność komórek oznaczano przy użyciu ATPLite. Wyniki są przedstawione jako procent żywotnych komórek w porównaniu z pożywką kontrolną. Zakreskowane słupki wskazują na TRAIL, a czarne słupki wskazują na TRA-8.

(b.) Skondensowane jądra hepatocytów wybarwiono Hoexhst 33352 i analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej.

(c.) Wpływ cykloheksimidu na apoptozę hepatocytów. Hepatocyty hodowano w pożywce kontroInej lub z 1 μg/ml TRAIL lub TRA-8 w obecności (wypełnione słupki) lub bez (puste słupki) 1 μg/ml cykloheksimidu przez 8 godzin. Żywotność komórek oznaczono przy użyciu ATPLite. Wyniki są przedstawione jako średnia ± błąd standardowy trzykrotnie powtórzonych hodowli z dwóch eksperymentów.

(d.) Porównanie wrażliwości prawidłowych hepatocytów na apoptozę indukowaną DR5 i Fas. Świeżo wyizolowane hepatocyty inkubowano ze wskazanymi stężeniami rozpuszczalnego TRAIL, TRA-8, rozpuszczalnego FasL lub anty-Fas CH11 przez 6 godzin. Żywotność komórek oznaczono testem ATPLite. Wyniki są przedstawione jako procent żywotnych komórek w porównaniu z pożywką kontrolną. Dla normalnych hepatocytów przedstawiono średnie ± błąd standardowy dla czterech zdrowych przypadków. Wyniki dla komórek raka wątrobokomórkowego z jednego pacjenta i komórek HepG2 są przedstawione jako średnie potrójnych hodowli.

Figura 13. TRAIL indukuje zapalenie wątroby. Myszy B6 dożylnie zaszczepiono 10⁹ pfu wektora adenowirusowego kodującego ludzki TRAIL pełnej długości pod kontrolą elementu transkrypcyjnego „Tet-on”. Ekspresja TRAIL była indukowana przez wskazane dawki tetracykliny.

(a.) Analiza techniką Northern ekspresji ludzkiego TRAIL w wątrobie. 24 godziny po wstrzyknięciu wektora i indukcji tetracykliną wyizolowano totalne RNA i hybrydyzowano z ludzkim cM TRAIL lub □-aktyny.

PL 211 733 B1 (b.) Poziomy AST w surowicy krwi. 24 godziny po transdukcji TRAIL oznaczono poziomy AST w surowicy krwi.

(c.) Śmierć hepatocytów zainfekowanych wektorem adenowirusowym za pośrednictwem TRAIL: Myszy B6 zaszczepiono dożylnie adenowirusowym wektorem indukowanym tetracykliną. 48 godzin po zaszczepieniu z zaszczepionych i niezaszczepionych kontrolnych myszy wyizolowano hepatocyty i inkubowano ze wskazanymi stężeniami TRAIL przez 8 godzin (lewy rząd). Żywotność hepatocytów oznaczono testem ATPLite. Myszom zaszczepionym wektorem adenowirusowym jak powyżej 48 godzin później wstrzyknięto dożylnie 10 pg rozpuszczalnego ludzkiego TRAIL. 24 godziny po wstrzyknięciu TRAIL zmierzono poziomy AST w surowicy krwi (prawy rząd).

(d. i e.) Histologiczna analiza uszkodzenia wątroby indukowanego przez TRAIL. Wątroby zostały pobrane 24 godziny (d.) lub 7 dni (e.) po transdukcji TRAIL. Parafinowe skrawki wybarwiono H & E i sfotografowano przy powiększeniu 100 x (górny rząd) i 400 x (dolny rząd).

Figura 14 jest serią wykresów pokazujących, że zaktywowane komórki T i komórki B oczyszczone z ludzkiej PBMC wykazują ekspresję DR5 na podwyższonych poziomach przy oznaczaniu cytometrem przepływowym komórek w stanie spoczynku (niewypełnione) i komórek zaktywowanych (zacieniowane).

Figura 15 to wykresy przeżywalności jako funkcji stężenia TRA-8 dla oczyszczonych komórek T i komórek B przedstawionych na fig. 14, stymulowanych przez 48 godzin anty-CD3 i anty-μ, w porównaniu z komórkami zaktywowanymi i komórkami blastycznymi zebranymi techniką różnicujących gęstości Ficoll-Paque. Żywotność jest oznaczona testem ATPLite.

Figura 16 przedstawia histogram i wykresy z cytometrii przepływowej pokazujące ekspresję CD3 w wybranej populacji limfocytów u myszy NOD/SCID pozbawionej komórek NK, której wstrzyknięto ludzkie PBMC i TRA-8 lub IgG (kontrola).

Figura 17 pokazuje mikrografy komórkowe barwione CD3 i TUNEL mysiej tkanki śledziony, jak wyszczególniono w przykładzie 13.

Figura 18 pokazuje wykresy cytotoksyczności dla przewlekłej białaczki limfolitycznej (CCL) i normalnych ludzkich komórek B w obecności TRA-8, BISVIII i ich kombinacji.

Szczegółowy opis wynalazku

Niemożność usuwania komórek jest spowodowana defektami w systemie indukcji apoptozy, które są związane z defektami obejmującymi przykładowo ekspresję lub funkcjonowanie liganda, receptora albo wewnątrzkomórkowe cząsteczki regulatorowe lub efektorowe. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu korekcji wadliwego systemu indukującego apoptozę, jak również wyjaśnienia specyficznych defektów właściwych danemu systemowi indukcji apoptozy.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowej klasy przeciwciał monoklonalnych, które mają selektywną aktywność indukującą apoptozę in vivo i in vitro przeciwko specyficznym receptorom dla TRAIL, włączając w to DR5, DR4, DcR1 i DcR2. Niniejszy wynalazek ma zastosowanie jako odczynnik w badaniach sygnalizacji apoptozy, jak również jako skuteczny terapeutyk przeciwko komórkom z ekspresją receptorów dla TRAIL przykładowo obejmującym szerokie klasy komórek nowotworowych, rozregulowanie systemu apoptotycznego i nieprawidłowo proliferujące komórki maziówkowe w chorobach autoimmunologicznych. Przeciwciała według niniejszego wynalazku są swoiste w wiązaniu poszczególnych typów receptorów dla TRAIL pomimo istnienia homologii pomiędzy nimi. Przeciwciała według wynalazku umożliwiają docelową apoptozę tylko komórek z ekspresją docelowego receptora dla TRAIL lub odwrotnie, blokowanie apoptozy z udziałem TRAIL w komórkach z ekspresją docelowego receptora.

Przeciwciało monoklonalne anty-DR5 według niniejszego wynalazku służy jako silny induktor apoptozy w komórkach wyrażających DR5 in vitro i jako silny induktor apoptozy in vivo. Humanizowane częściowe sekwencje CDR połączone ze szkieletami humanizowanych przeciwciał i fuzje białkowe przeciwciał anty-DR5 z niniejszego wynalazku wykazują podobne właściwości apoptotyczne.

Do chwili obecnej nie było dostępne żadne przeciwciało monoklonalne, które wiązałoby się z DR5 na powierzchni komórki i indukowało apoptozę w komórkach wyrażających DR5, zarówno in vitro jak i in vivo przy braku odczynnika do wiązania krzyżowego.

Niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciało anty-DR5 skuteczne jako środek terapeutyczny w zwierzęcych modelach chorób, takich jak zwierzęta z przeszczepem ksenogenicznym lub in vivo.

Pomimo, że wykazano, że rozpuszczalny TRAIL skutecznie indukuje apoptozę nowotworowych komórek in vivo, to okazało się, że jego aktywność zabijania była bardzo niska przy dużych i powtarzanych dawkach, które są często konieczne (13). TRA-8, jedno z serii przeciwciał anty-DR5 według niniejsze10

PL 211 733 B1 go wynalazku jest farmaceutycznie skuteczne u zwierząt niosących ludzki transgen DR5, a także na zastosowanie w tworzeniu modelu do badań nad rolą DR5 i TRAIL.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku skierowane przeciwko receptorowi TRAIL jest uzyskiwane według niniejszego wynalazku ze zwierzęcia doświadczalnego. Poprzez humanizowanie przeciwciała według niniejszego wynalazku, aby utrzymać aktywność wiązania receptora, jednocześnie uzyskując zmniejszoną i terapeutycznie tolerowaną odpowiedź immunologiczną u człowieka, humanizowane przeciwciało przeciwko receptorowi dla TRAIL według niniejszego wynalazku można użyć jako terapeutycznego agonistę lub antagonistę dla danego receptora dla TRAIL. Niniejszy wynalazek jest skuteczny jako terapeutyk in vivo, ponieważ wtórne krzyżowe wiązanie przeciwciała przeciwko receptorowi TRAIL nie jest konieczne.

Niniejszy wynalazek wykracza poza pojedyncze przeciwciało przeciwko receptorowi dla TRAIL mające agonistyczne i antagonistyczne efekty apoptotyczne. Lepiej, jeżeli doprowadza się do kontaktu dwa lub więcej rodzajów przeciwciał przeciwko receptorowi TRAIL z hodowlą komórkową in vitro lub tkanką pacjenta in vivo w celu wytworzenia działania synergistycznego. Na przykład, linia komórkowa glejaka U87 i hemopoetyczne linie komórkowe U937 i Molt-4 są wrażliwe na poddanie ich synergistycznemu działaniu przeciwciał anty-DR4 i anty-DR5, podczas gdy poddanie ich działaniu samego agonistycznego przeciwciała anty-DR5 pokazuje ograniczony wpływ ma indukcję apoptozy.

Ponadto, antagonistyczne przeciwciała przeciwko receptorowi dla TRAIL posiadają szczególną użyteczność w niniejszym wynalazku, gdy przeciwciało posiada swoistość wiązania jednego z receptorów przynętowych DcR1, DcR2 lub OPG. Selektywne zablokowanie receptora przynętowego przeciwciałem według niniejszego wynalazku wywołuje zmianę w typach receptorów przynętowych ulegających ekspresji w komórce lub zmianę w równowadze wiązania TRAIL do receptorów dla TRAIL zdolnych do przenoszenia sygnału apoptotycznego. Tak więc, w innej kombinowanej terapii przeciwciało wiążące receptor pułapkę uwrażliwia komórkę z ekspresją na agonistyczny sygnał apoptotyczny indukowany związaniem receptora dla TRAIL.

Niniejszy wynalazek pozwala na określenie agonistycznych i antagonistycznych epitopów dla danego receptora dla TRAIL. Ponadto polimorfizmy pomiędzy ludźmi związane z danym receptorem dla TRAIL są określone według niniejszego wynalazku przez zastosowanie zestawu przeciwciał monoklonalnych, z których każdy ma różny region zmienny lub region CDR. Scharakteryzowany zestaw dostarcza możliwości zdefiniowania agonistycznych i antagonistycznych epitopów i polimorfizmów. Tak więc, zestaw przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku ma zastosowanie w znajdywaniu leków i/lub badaniach przesiewowych w kierunku predyspozycji do choroby.

Niniejszy wynalazek pozwala na wykonanie fuzji białkowej z antygenowyego fragmentu receptora dla TRAIL połączonego z białkiem immunoglobulinowym, polipeptydem lub jego fragmentem. Fragment receptora dla TRAIL jest zdefiniowany tutaj jako zawierający wystarczającą liczbę aminokwasów, aby wywołać odpowiedź immunologiczną w kierunku natywnego receptora dla TRAIL ulegającego ekspresji na powierzchni komórek pacjenta. Fragment receptora TRAIL wchodzący w skład fuzji może obejmować przynajmniej dziesięć aminokwasów. Immunoglobulinowa fuzja białkowa lub jej fragment jest zdefiniowana tutaj jako obejmująca natywne lub syntetyczne białko lub fragment polipeptydu mający wystarczającą liczbę reszt aminokwasowych, aby zaktywować u pacjenta kaskadę odpowiedzi immunologicznej. Immunogen obejmujący fuzję fragmentu receptora dla TRAIL połączonego z fragmentem immunoglobulinowym jest użyteczny jako terapeutyk in vivo do wykazania obecności przeciwciała przeciwko receptorowi dla TRAIL u pacjenta in situ.

Niniejszy wynalazek jest skuteczny także jako metoda terapii genowej. W tym aspekcie, komórki docelowe są transfekowane wektorem niosącym mogącą ulec ekspresji sekwencję odpowiadającą receptorowi dla TRAIL. Wektor jest powszechnie stosowany i wybrany na podstawie podatności komórek docelowych na wektor. Wektory stosowane w terapii genowej przykładowo obejmują adenowirusy, pAdCMV5. Po zajściu ekspresji transfekowanego receptora dla TRAIL w docelowych komórkach lub tkankach, komórki lub tkanki są poddawane działaniu przeciwciała według niniejszego wynalazku specyficznego do wiązania transfekowanego receptora dla TRAIL. Należy zwrócić uwagę, że przeciwciało przeciwko receptorowi dla TRAIL jest zarówno agonistą lub antagonistą zgodnie z pożądanym wynikiem terapeutycznym.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku są także skuteczne w połączeniu ze środkiem uwrażliwiającym. Środek uwrażliwiający używany tutaj jest zdefiniowany jako obejmujący dowolny bodziec stymulujący, który indukuje apoptozę, włączając światło ultrafioletowe, cząsteczki organiczne włączając w to w szczególności klasę bisindolomaleimidów, metale ciężkie i substancje wolnorodnikowe.

PL 211 733 B1

W kontekście terapii nowotworowej, TRA-8 jest także zdolne do indukcji apoptozy większości komórek nowotworowych wrażliwych na TRAIL w sposób zależny od kaspaz przy braku wtórnego wiązania krzyżowego. TRA-8 wykazuje in vivo silną aktywność przeciwnowotworowa. Zdolność TRA-8 do indukcji apoptozy większości komórek wrażliwych na TRAIL potwierdza, że sam DR5 jest wystarczający do włączenia apoptozy. W większości komórek nowotworowych tutaj wyszczególnionych obecna jest ekspresja DR5 na powierzchni komórki i wrażliwość na śmierć komórki indukowaną TRA8 korelując z ich podatnością na działanie TRAIL, co wskazuje na to, że DR5 jest głównym receptorem śmierci dla apoptozy za pośrednictwem TRAIL w większości komórek nowotworowych. Tak więc, zróżnicowana ekspresja DR5 w komórkach zdrowych i nowotworowych przekłada się na selektywność apoptozy za pośrednictwem TRAIL. TRA-8 pomija receptory przynęty przy indukcji apoptozy za pośrednictwem TRAIL. Tylko niektóre z komórek opornych na TRAIL są wrażliwe na TRA-8, jednakże wskazując, że receptory przynętowe nie odgrywają głównej roli w oporności komórek nowotworowych na apoptozę za pośrednictwem TRAIL.

Pomimo, że wcześniejsze badania wskazywały, że ogólnoustrojowe podawanie rozpuszczalnej

3,4,22 formy TRAIL u zwierząt indukuje regresję guza bez wywoływania toksyczności^3,4,22, forma ludzkiego TRAIL związana z błoną powoduje uszkodzenie wątroby w myszach, jak tutaj pokazano. Jednakże toksyczny wpływ TRAIL na wątrobę jest znacznie mniej silny niż ligandu Fas, jak pokazano przez mniejszą wrażliwość prawidłowych hepatocytów na uszkodzenie indukowane TRAIL w porównaniu z ligandem Fas oraz przez brak letalności TRAIL in vivo. Tak więc, miareczkowanie TRAIL ma zastosowanie w terapii nowotworu.

Jak opisano tutaj szczegółowo, brak znaczących poziomów ekspresji białka DR5 w przypadku zdrowych hepatocytów jest wykazany i jest związany z opornością hepatocytów na apoptozę indukowaną TRAIL. Krzyżowe wiązanie DR5 z przeciwciałem monoklonalnym jest niewystarczające to wytworzenia form homopolimerowych receptora śmierci zdolnych do włączenia apoptozy. Eksperymenty na marmosetach wskazują na brak dowodów toksyczności wątroby związanej z podawaniem TRA-8. Tak więc, agonistyczne przeciwciało monoklonalne anty-DR5 jest prawdopodobnie bardziej selektywne i bezpieczniejsze jako środek terapeutyczny niż rozpuszczalny TRAIL.

Jako test przesiewowy niniejszy wynalazek nadaje się do wykrywania małych skupisk komórek nowotworowych, które mogą nadal wykazywać normalną morfologię komórki. Barwienie skrawków komórkowych in situ ludzkich komórek nowotworowych, włączając nowotwory płuca, prostaty i wątroby wyznakowanych przeciwciałem według niniejszego wynalazku łatwo identyfikuje komórki zmienione nowotworowe. W komórkach nowotworowych obserwuje się ekspresję DR5 na wysokich poziomach w porównaniu z komórkami zdrowymi tego samego typu. Tak więc, niniejszy wynalazek ma zastosowanie jako czuła technika w badaniach przesiewowych w kierunku nowotworów we wczesnym stadium w tkankach włączając przynajmniej płuco, prostatę i wątrobę. Wyszczególniony jest tutaj proces terapeutyczny prowadzący do zahamowania proliferacji zmienionych komórek związanych z chorobami przykładowo obejmującymi nowotwory złośliwe i białaczki limfatyczne.

Niniejszy wynalazek jest opisany tutaj szczególnie w odniesieniu do przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu DR5 nazwanego TRA-8, mającego numer dostępu ATCC PTA-1428. Warto zauważyć, że techniki i opisane tutaj wyniki odnoszące się do agonistycznego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu DR5 można w całości rozciągnąć i zastosować dla antagonistycznych przeciwciał DR5 jak również dla przeciwciał skierowanych przeciwko DR4, DcR1 i DcR2 działających w sposób agonistyczny lub antagonistyczny.

Poziomy ekspresji receptora apoptotycznego, takiego jak Fas niekoniecznie korelują z podatnością komórek na apoptozę. W przypadku apoptozy za pośrednictwem TRAIL zasugerowano, że ekspresja receptorów przynętowych dla TRAIL wpływa na podatność komórek na apoptozę. Ponadto zasugerowano, że DR5 musi być związany z DR4 dla efektywnego przenoszenia sygnału apoptotycznego przez szlak FADD i kaspazy 8. Dostępność agonistycznych przeciwciał anty-DR5 pozwoliła na oszacowanie regulacji przenoszenia sygnału przez DR5 i jego względnej roli w apoptozie za pośrednictwem TRAIL. Porównanie podatności komórek na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 z podatnością komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL umożliwia zbadanie roli DR5 w apoptozie za pośrednictwem TRAIL oraz mechanizmów, które mogą wpływać na wrażliwość.

Ta zaleta ogólnie rozciąga się na humanizowane przeciwciała anty-DR5 według niniejszego wynalazku. Molekularny klon przeciwciała przeciwko DR-5 wytwarza się przy zastosowaniu znanych technik, jak opisano w odniesieniu do następujących przykładów. Techniki rekombinowania DNA (33)

PL 211 733 B1 są skuteczne tutaj do wytworzenia sekwencji kwasów nukleinowych, które kodują cząsteczkę przeciwciała monoklonalnego lub jego region wiążący antygen.

Niniejszy wynalazek pozwala na skonstruowanie humanizowanych przeciwciał przeciwko receptorowi TRAIL, które nie powinny indukować odpowiedzi w postaci ludzkich anty-mysich przeciwciał (określanych tu dalej jako „HAMA”) (34), nadal posiadając skuteczną funkcję efektorową przeciwciała. Stosowane tutaj określenia „ludzki” i „humanizowany” w odniesieniu do przeciwciał dotyczą dowolnego przeciwciała, od którego oczekuje się, że będzie wykazywać tolerowaną terapeutycznie słabą odpowiedź immunologiczną u pacjenta.

Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała anty-DR5, humanizowanego przeciwciała antyDR5, ciężkiego i lekkiego łańcucha immunoglobulin TRA-8 i humanizowanego ciężkiego i lekkiego łańcucha immunoglobulin. Pewne krótsze formy tych białek lub genów pełnią funkcje regulatorowe lub enzymatyczne całej sekwencji białka lub genu. Na przykład, sekwencje kwasów nukleinowych je kodujących mogą być w tym celu zmienione przez podstawienia, addycje, delecje lub ekspresję multimeryczną tak, że dostarczają funkcjonalnych odpowiedników białek lub genów. Dzięki degeneracji sekwencji kwasów nukleinowych, inne sekwencje, które kodują zasadniczo te same sekwencje aminokwasowe, jak te w naturalnie występujących białkach mogą być użyte w zastosowaniu niniejszego wynalazku. Obejmują one, między innymi, sekwencje kwasów nukleinowych obejmujących całe sekwencje lub fragmenty sekwencji kwasów nukleinowych kodujących powyższe peptydy, które są zmienione przez podstawienia innych kodonów tak, że kodują funkcjonalnie równoważną resztę aminokwasową w obrębie sekwencji, powodując tym samym tzw. cichą zmianę. Warto zauważyć, że sekwencja nukleotydowa immunoglobuliny według niniejszego wynalazku toleruje zmiany homologii sekwencji do 25%, jak obliczono standardowymi sposobami („Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, str. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.) tak długo, jak wariant tworzy skuteczne przeciwciało, które rozpoznaje receptor DR5 dla TRAIL. Na przykład, jedna lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji polipeptydowej może być podstawiona przez inny aminokwas o podobnej polarności, który działa jak funkcjonalny odpowiednik, dając cichą zmianę. Podstawienia dla aminokwasu w sekwencji mogą być wybrane z innych członków klasy, do której ten aminokwas należy. Na przykład, nie polarne (hydrofobowe) aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne aminokwasy obojętne obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Dodatnio naładowane aminokwasy obejmują argininę, lizynę i histydynę. Ujemnie naładowane (kwaśne) aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i glutaminowy. Zakresem niniejszego wynalazku objęte są również białka lub ich fragmenty lub pochodne, które są różnie zmodyfikowane podczas lub po translacji, np. poprzez glikozylację, cięcie proteolityczne, połączenie z cząsteczką przeciwciała lub innymi ligandami komórkowymi, itp. Ponadto, rekombinowany wektor kodujący sekwencje kwasów nukleinowych przeciwciał anty-DR5 według niniejszego wynalazku może być przekształcany tak, aby zmodyfikować obróbkę lub ekspresję wektora.

Dodatkowo, do sekwencji kwasu nukleinowego kodującego inhibitor można wprowadzić in vitro lub in vivo mutację, aby utworzyć i/lub usunąć sekwencje inicjacji i/lub terminacji translacji albo aby wytworzyć zmiany w obszarach kodujących, i/lub utworzyć nowe lub usunąć istniejące wcześniej miejsca restrykcyjne, aby ułatwić późniejsze modyfikacje in vitro. Można zastosować dowolną technikę mutagenezy ze znanych w tej dziedzinie, między innymi ukierunkowaną mutagenezę in vitro, J. Biol. Chem. 253: 6551, wykorzystanie łączników Tab (Pharmacia) i tym podobne.

Dane uzyskane przy pomocy krystalografii w promieniach rentgenowskich wskazują, że przeciwciało fałduje się zwykle tworząc cylindryczną strukturę zawierającą dwie warstwy przeciwrównoległych kartek β, z których każda składa się z czterech łańcuchów β. W obszarze zmiennym trzy pętle wszystkich domen V łańcuchów H i L łączą się razem, tworząc miejsce wiązania antygenu. Każdą z tych pętli nazywa się regionem determinującym dopasowanie (CDR). Regiony CDR mają najwyższą zmienność aminokwasową w obrębie przeciwciała. Fragmenty obszarów zmiennych nie będące częścią CDR nazywa się obszarem „zrębowym” (obszar FR) i zwykle odgrywają one rolę utrzymywania struktury CDR. Korzystne jest, jeżeli wszystkie regiony CDR danego przeciwciała wszczepia się do przeciwciała akceptorowego w celu zachowania obszaru wiązania dla epitopu receptora TRAIL. Jest oczywiste, że wszczepienie części spośród wszystkich regionów CDR donorowi zachowuje funkcjonalność. Jest zrozumiałe, że wszczepienie zwykle oznacza zastąpienie, reszta za resztę, jednego aminokwasu lub regionu przez inny. Może się jednak zdarzyć, zwłaszcza w przypadku przenoszenia regionu, że jedną lub więcej reszt można dodać lub pominąć, lub zastąpić według potrzeby, a takie

PL 211 733 B1 delecje i insercje, jak również odpowiednie podstawienia i inwersje, mieszczą się w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku otrzymuje się na przykład przez przeszczepienie każdego z CDR łańcucha L i H podjednostki przeciwciała monoklonalnego przeciw receptorowi TRAIL do odpowiedniego obszaru CDR przeciwciała ludzkiego, tym samym skutecznie humanizując mysie monoklonalne przeciwciało przeciwko receptorowi TRAIL.

Wytwarza się również różne funkcjonalne fragmenty przeciwciała zawierające idiotyp cząsteczki przy użyciu znanych technik. Takie fragmenty obejmują na przykład fragment (AB')2 przeciw receptorowi TRAIL, który można wytworzyć przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała, fragmenty (AB')2 przeciwciała przeciw receptorowi TRAIL wytworzone przez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentu (AB')2 przeciw receptorowi TRAIL oraz fragmenty przeciwciała wytworzone przez poddanie cząsteczki działaniu papainy i czynnika redukującego.

W szczególności, przeciwciało monoklonalne TRA-8 przeciw receptorowi DR5 można otrzymać przez hodowlę hybrydomy, którą z kolei można otrzymać immunizując myszy z ludzkim DR5 i następnie doprowadzając do fuzji mysich komórek śledziony lub węzła chłonnego z mysimi komórkami szpiczaka.

Przygotowanie przeciwciał monoklonalnych obejmuje przykładowo następujące etapy:

a) oczyszczenia biomakrocząsteczki do użycia jako antygen;

b) przygotowania komórek wytwarzających przeciwciało; po pierwszej immunizacji zwierzęcia zastrzykami antygenu skrwawienie zwierzęcia i oznaczenie miana przeciwciał w celu określenia czasu pobrania śledziony;

c) przygotowania komórek szpiczaka;

d) fuzji komórek wytwarzających przeciwciała z komórkami szpiczaka;

e) selekcji hybrydomy wytwarzającej pożądane przeciwciało;

f) otrzymania klonu z pojedynczej komórki (klonowanie);

g) opcjonalnie, hodowli komórek hybrydomy lub hodowli zwierząt, którym przeszczepiono komórki hybrydomy do przygotowania przeciwciała monoklonalnego na dużą skalę; oraz

h) badanie biologicznej aktywności i swoistości lub oznaczanie właściwości czynnika markerowego przygotowanego w ten sposób przeciwciała monoklonalnego.

Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego przeciwko DR5 jest opisany szczegółowo poniżej w odniesieniu do opisanych wyżej etapów. Ten sposób przygotowania przeciwciała według niniejszego wynalazku podaje się tylko dla ilustracji sposobów wytwarzania i nie stanowi ograniczenia. Można również wykorzystać również inne znane procedury lub modyfikacje podanych sposobów, na przykład z wykorzystaniem komórek wytwarzających przeciwciała innych niż komórki śledziony i szpiczak.

(a) Wytwarzanie antygenu

Rekombinowane białko (nazywane tu dalej rekombinowanym ludzkim „DR5”) skuteczne jako antygen otrzymuje się przez transfekcję komórek QBI-293A wektorem ekspresyjnym pAdDR5-IgG dla fuzji białkowej złożonej z zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego DR5 i regionu Fc ludzkiego przeciwciała IgG1 (nazywanej tu dalej IgG”), (patrz PTA-1428) w celu jej wyrażenia przy użyciu zestawu ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Kanada) oraz zebranie i częściowe oczyszczenie produktu ekspresji. Plazmid pAdDR5-IgG konstruuje się przez insercję DNA kodującego fuzję białkową ludzkiego DR5 i ludzkiego IgG do pAdCMV5, który jest wektorem ekspresyjnym dla komórek zwierzęcych. Inne materiały, takie jak DNA kodujące DR5, wektor i gospodarz są działającymi w tym systemie.

Fuzję białkową ludzkiego DR5 i IgG wytworzoną w supernatancie hodowli komórek QBI-293A transfekowanych wektorem pAdDR5-IgG można częściowo oczyścić poprzez chromatografię powinowactwa BiałkoA-Sefaroza lub chromatografię powinowactwa BiałkoG-Sefaroza, lub chromatografię jonowymienną przy użyciu kolumny Resource Q (znak towarowy; Pharmacia).

Alternatywnie, jako antygen wykorzystuje się oczyszczony DR5 otrzymany z błon komórkowych ludzkich linii komórkowych. Ponadto, ponieważ znana jest pierwszorzędowa struktura DR5 (patrz PTA-1428), można zsyntetyzować chemicznie peptyd o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 1 jedną ze znanych metod, taką jak metoda Sangera i użyć jako antygen.

(b) Otrzymywanie komórek wytwarzających przeciwciało

Mysz immunizuje się immunogenem wytworzonym w punkcie (a), zmieszanym z adiuwantem, takim jak kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda lub ałun. Inne odpowiednie zwierzęta doświadczalne obejmują dla przykładu szczury, świnki morskie, króliki, psy, kurczaki, świnie, krowy i owce.

PL 211 733 B1

Odpowiednie drogi podawania w celu immunizacji zwierzęcia doświadczalnego obejmują drogi: podskórną, dootrzewnową, dożylną, doskórną i domięśniową, korzystnie podskórną i dootrzewnową. Immunizację przeprowadza się bądź w pojedynczej dawce, bądź w kilku powtarzanych dawkach w odpowiednich odstępach czasu (korzystnie 1 do 5 tygodni). U immunizowanych zwierząt śledzi się miano przeciwciał w osoczu i zwierzę z wystarczająco wysokim mianem przeciwciał wybiera się jako źródło komórek wytwarzających przeciwciała. Wybór zwierzęcia z wysokim mianem przeciwciał czyni kolejne etapy procedury bardziej wydajnymi. Komórki do przeprowadzania fuzji zwykle pobiera się od zwierzęcia 3 do 5 dni po końcowej immunizacji.

Metody oznaczania miana przeciwciał obejmują różne, dobrze znane techniki, takie jak test radioimmunologiczny (nazywany tu dalej „RJA”), enzymatyczny test immunologiczny w stałej fazie (nazywany tu dalej „ELISA”), test przeciwciał fluorescencyjnych oraz test biernej hemaglutynacji, przy czym RIA i ELISA są korzystne ze względu na czułość wykrywania, szybkość, dokładność i możliwość automatyzacji.

Miano przeciwciał można określić na przykład przez ELISA według następującej procedury. Najpierw oczyszczone lub częściowo oczyszczony DR5 adsorbuje się na powierzchni fazy stałej, takiej, jak 96-studzienkowa płytka ELISA, a następnie blokuje się całą pozostałą powierzchnię, do której nie przyłączył się DR5 białkiem nie spokrewnionym z antygenem, takim jak albumina osocza bydlęcego (BSA). Po przemyciu, doprowadza się do kontaktu powierzchni studzienek z seryjnie rozcieńczonymi próbkami mysiej surowicy, aby umożliwić wiązanie przeciwciała przeciw DR5 z próbek z antygenem. Jako drugorzędowe przeciwciało dla związania z przeciwciałem mysim dodaje się wyznakowane enzymatycznie przeciwciało anty-mysie. Po przemyciu dodaje się substrat enzymu, a miano przeciwciał szacuje się określając zmianę absorbancji spowodowaną powstaniem zabarwienia, które spowodowała zmiana w substracie lub tym podobne.

(c) Otrzymywanie komórek szpiczaka

Komórki z uzyskanej mysiej linii komórkowej służą jako źródło komórek szpiczaka i obejmują na przykład mysz oporną na 8-azaguaninę, otrzymaną z linii szpiczaka BALB/c P3X63Ag8U.1 (P3-U1) (35), P3/NS1/1-Ag4-l(NS-1) (36). Sp2/0-Ag14 (SP-2) (37), P3X63Ag8.653 (653) 38) i P3X63Ag8 (X63) (39). Wybraną linię komórkową przenosi się kolejno do odpowiedniej pożywki, takiej jak pożywka z 8-azaguaniną. Pożywka z 8-azaguaniną zawiera pożywkę Dulbecco zmodyfikowaną przez Iscove'a (nazywaną tu „IMDM”) lub pożywkę Eagle'a zmodyfikowaną przez Dulbecco (nazywaną tu „DMEM”). Pożywkę RPMI-1640 uzupełnia się glutaminą, β-merkaptoetanolem, gentamycyną, płodową surowicą cielęcą (nazywaną tu dalej „FCS”) oraz 8-azaguaniną. Następnie, 3 do 4 dni przed fuzją, komórki przenosi się do normalnej pożywki, takiej, jak pożywka ASF104 (Ajinomoto, K. K.) zawierająca 10% FCS w celu zapewnienia dostępności w dniu fuzji przynajmniej 2 x 10⁷ komórek.

(d) Fuzja komórek

Limfocyty i komórki plazmatyczne otrzymane z dowolnej odpowiedniej części zwierzęcia są komórkami prekursorowymi dla wytwarzania przeciwciał. Źródła limfocytów lub komórek plazmatycznych obejmują przykładowo śledzionę, węzły chłonne, krew obwodową lub dowolne odpowiednie ich połączenie, przy czym komórki śledzony są źródłem najczęstszym.

Po ostatnim zastrzyku przypominającym tkankę, w której obecne są komórki wytwarzające przeciwciała pobiera się z myszy o określonym wcześniej mianie przeciwciała. W obecnie faworyzowanej technice fuzji komórek śledziony z komórkami szpiczaka otrzymanymi w punkcie (c) wykorzystuje się glikol polietylenowy.

Technika fuzji obejmuje przemycie śledziony i komórek szpiczaka pożywką bez surowicy (taką, jak RPMI 1640) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (nazywaną tu dalej „PBS”) tak, aby stosunek liczbowy komórek śledziony do komórek szpiczaka wynosił pomiędzy 5:1 a 10:1, a następnie żwirowanie. Po odrzuceniu supernatantu i odpowiednim rozluźnieniu osadu komórek, dodaje się kroplami, mieszając, 1 ml pożywki bez surowicy, zwierającej 50% (wag./obj.) glikolu polietylenowego (masa cząsteczkowa 1000 do 4000). Następnie powoli dodaje się 10 ml pożywki bez surowicy i zwirowuje. Supernatant znów się odrzuca, a zwirowane komórki zawiesza się w odpowiedniej ilości pożywki HAT zawierającej roztwór hipoksantyny, aminopteryny i tymidyny (nazywanej tu dalej „HAT”) oraz mysiej interleukiny-2 (nazywanej tu dalej „IL-2”). Zawiesinę następnie rozdziela się do studzienek płytek do hodowli (nazywanych tu dalej po prostu „płytkami”) i inkubuje w obecności 5% v/v CO2 w 37°C przez około 2 tygodnie, dodając dla uzupełnienia odpowiednie ilości pożywki HAT.

PL 211 733 B1 (e) Selekcja hybrydom

Jeśli użyty typ komórek szpiczaka jest oporny na 8-azaguaninę, np. nie posiada enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantynowoguaninowej (HGPRT), każda nie ulegająca fuzji komórka szpiczaka oraz fuzje komórek szpiczaka z innymi komórkami szpiczaka nie są w stanie przeżyć w pożywce HAT. Z drugiej strony, fuzje komórek wytwarzających przeciwciała, jak również hybrydomy z komórek wytwarzających przeciwciała i komórek szpiczaka przeżywają, z czego te pierwsze tylko przez ograniczony czas. W związku z tym przedłużona inkubacja w pożywce HAT prowadzi do selekcji tylko pożądanych hybrydom.

Otrzymane hybrydomy tworzą kolonie, które następnie przenosi się do pożywki HAT bez aminopteryny (pożywka HT). Następnie, pobiera się próbki supernatantu hodowli w celu określenia miana przeciwciał przeciwko Fas, na przykład metodą ELISA. Jeśli jako antygen w teście ELISA wykorzystuje się wspomnianą wyżej fuzję białkową, konieczne jest także usunięcie klonów wytwarzających przeciwciało specyficznie wiążące się z regionem Fc ludzkiego IgGl. Obecność lub brak takiego klonu można określić na przykład testem ELISA wykorzystującym jako antygen Fas-IgG1 lub IgG1.

(f) Klonowanie

Hybrydomy, dla których wykazano produkcję specyficznych przeciwciał wykorzystując do określenia miana przeciwciał metodę podobną do opisanej w punkcie (b), przenosi się następnie w celu klonowania na inną płytkę. Odpowiednie metody klonowania obejmują: metodę ograniczających rozcieńczeń, w której hybrydomy rozcieńcza się tak, aby w jednej studzience znalazła się jedna komórka, a następnie hoduje; metodę miękkiego agaru, w której kolonie odzyskuje się po hodowli w pożywce z miękkim agarem; metodę wykorzystującą mikromanipulator w celu oddzielenia pojedynczej komórki do hodowli oraz metodę „sortowania klonu”, w której pojedyncze komórki rozdzielane są przy zastosowaniu sortera komórek.

Procedurę klonowania na przykład metodą ograniczających rozcieńczeń, powtarza się 2 do 4 razy dla każdej studzienki wykazującej miano przeciwciała, a jako hybrydomy wytwarzające przeciwciała monoklonalne przeciw DR5 wybiera się klony o stabilnym mianie przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciało przeciw mysiemu DR5 wybiera się w podobny sposób, dla otrzymania linii komórkowej wytwarzającej przeciwciała monoklonalne przeciw DR5.

Hybrydomę TRA-8 mysz-mysz, która jest podstawą dla przeciwciał według niniejszego wynalazku, zdeponowano w American Type Culture Collection 1 marca 2000 i nadano numer dostępu PTA-1428. Dlatego, jeśli przygotowuje się przeciwciała wykorzystując hybrydomę TRA-8 mysz-mysz lub dowolną inną wyprowadzoną hybrydomę, przygotowanie można wykonać według procedury rozpoczynającej się od punktu g) poniżej, z pominięciem punktów od (a) do (f).

(g) Hodowla hybrydom w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych

Hybrydomę otrzymaną przez klonowanie hoduje się w normalnej pożywce, a nie w pożywce HT. Hodowlę na dużą skalę prowadzi się w butelkach obrotowych, używając dużych butelek do hodowli lub butelek z mieszaniem. Supernatant z hodowli na dużą skalę oczyszcza odpowiednią metodą dobrze znaną specjalistom w tej dziedzinie, taką jak filtracja na żelu, w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych przeciw DR5, które stanowią podstawę przeciwciał według niniejszego wynalazku. Hybrydomę można również hodować śródotrzewnowo w syngenicznej myszy, takiej jak mysz BALB/c lub nu/nu, w celu otrzymania płynu puchlinowego zawierającego duże ilości przeciwciała monoklonalnego anty-DR5. Wygodne jest stosowanie do oczyszczania zebranych przeciwciał dostępnych handlowo zestawów do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych (na przykład zestawu MAbTrap GII Kit; Pharmacia). Przeciwciała monoklonalne otrzymane jak wyżej są wysoce swoiste wobec ludzkiego DR5.

(h) Test przeciwciał monoklonalnych

Odpowiednie metody identyfikacji izotypu i podklasy przeciwciała monoklonalnego obejmują metodę Ouchterlony'ego, ELISA i RIA. Korzystnie, do identyfikacji wykorzystuje się komercyjny zestaw, taki jak zestaw Mouse Typer (znak towarowy; BioRad).

Ilościowe oznaczenie białka można przeprowadzić metodą Folin-Lowry'ego lub przez obliczenia oparte o absorbancję przy długości fali 280 nm (1,4 (OD280) = 1 mg/ml immunoglobuliny).

Identyfikację epitopu rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne przeprowadza się jak następuje. Najpierw przygotowuje się różne, częściowe struktury cząsteczki, którą rozpoznaje przeciwciało monoklonalne. Takie częściowe struktury przygotowuje się metodą, w której różne częściowe peptydy cząsteczki są otrzymywane syntetycznie według znanej techniki syntezy oligopeptydów lub metodą, w której DNA kodujący pożądany częściowy polipeptyd włącza się do odpowiedniego plazmi16

PL 211 733 B1 du ekspresyjnego i wyraża się go w celu wytworzenia peptydów w odpowiednim gospodarzu, takim jak E. coli. Zwykle, dla powyższego celu wykorzystuje się często obie metody w połączeniu. Na przykład można przygotować znanymi metodami inżynierii genetycznej zestaw polipeptydów o odpowiednio zredukowanej długości, zaczynając od końca C lub końca N białka antygenowego. Przez określenie, które fragmenty reagują z przeciwciałem, otrzymuje się przybliżone umiejscowienie epitopu.

Epitop identyfikuje się dokładniej syntetyzując, przy użyciu znanych technik syntezy oligopeptydów, wiele mniejszych oligopeptydów odpowiadających peptydowi lub mutacjom peptydu i aby określić właściwości wiązania tych peptydów do przeciwciała monoklonalnego przeciw DR5, które jest podstawą do przygotowania przeciwciała według niniejszego wynalazku, kompetycyjnie blokując wiązanie peptydu do antygenu przeciwciałem monoklonalnym. Do otrzymania wielu wariantów oligopeptydów można wygodnie wykorzystać dostępne handlowo zestawy, takie jak zestaw SPOTs (Genosys Biotechnologies, Inc.), czy seria zestawów syntezy peptydów na wielu końcówkach („multipin” opartych na metodzie syntezy na wielu końcówkach (Chiron Corp.).

Przeciwciało według niniejszego wynalazku posiada różne cechy funkcjonalne, opisane poniżej w punktach od a) do f), wszystkie zweryfikowane np. odpowiednią przytoczoną poniżej metodą.

a) Specyficzne wiązanie TRA-8 do komórek wyrażających ludzki DR5

Unikalną cechą niniejszego wynalazku jest zdolność do wiązania z DR5 na powierzchni komórek. Wykazano to metodą cytometrii przepływowej komórek wyrażających DR5. Po pierwsze potwierdzono specyficzne wiązanie DR5 na powierzchni komórek dla komórek COS-7 transfekowanych pełnej długości cDNA kodującym ludzki DR5. Dokładniej, TRA-8 rozpoznaje tylko komórki COS-7 transfekowane DR5, ale nie kontrolnym pustym wektorem czy wektorem kodującym DR4. Po drugie, badano trzy rodzaje komórek różnego pochodzenia: hematopoetyczne, glejaka i ludzkie komórki złośliwego raka prostaty. Większość tych transformowanych komórek nowotworowych wyrażała w znaczącym stopniu DR5 na powierzchni komórek, chociaż poziomy ekspresji znacznie się różniły. Po trzecie, badano dwa zestawy ludzkich pierwotnych fibroblastów maziówki od pacjentów z RA i OA. Wszystkie komórki maziówki z wyrażały znacząco wyższy poziom DR5 w porównaniu z komórkami OA.

b) Indukcja apoptozy ludzkich komórek nowotworu złośliwego in vitro przy braku wiązania krzyżowego

Zdolność przeciwciała według niniejszego wynalazku do rozpoznawania receptora TRAIL oraz do bezpośredniej indukcji apoptozy ludzkich komórek nowotworu złośliwego określono przez test żywotności komórek (ATPLite) w czasie hodowli in vitro komórek z różnymi stężeniami przeciwciała, a konkretnie TRA-8. Większość komórek nowotworu jest podatna na apoptozę indukowaną TRA-8. Dla niektórych komórek TRA-8 wykazywało silną aktywność indukowania apoptozy; na przykład TRA-8 może wywołać apoptozę ludzkich komórek Jurkat już na poziomie pg/ml. Co ważne, apoptoza indukowana TRA-8 nie wymaga wystąpienia wiązania krzyżowego, a w większości komórek TRA-8 wykazywało silniejszą aktywność indukującą apoptozę niż rekombinowany, rozpuszczalny TRAIL w obecności wzmacniacza.

c) Aktywność zabijania nowotworu przez TRA-8 in vivo

Aktywność zabijania nowotworu przez TRA-8 określono na dwóch modelach SCID/ludzkiego nowotworu. Najpierw myszom SCID dożylnie podano ludzkie komórki białaczkowe Jurkat i poddano je działaniu pojedynczej dawki (100 μg) TRA-8. Wyniki uzyskane metodą cytometrii przepływowej oraz znakowaniem immunohistochemicznym in situ komórek Jurkat pokazują, że większość wszczepionych komórek Jurkat jest eliminowana z krwi obwodowej i śledziony przez działanie TRA-8. Następnie, komórki ludzkiej astrocytomy 1321N1 wszczepia się podskórnie myszom SCID i taką mysz z nowotworem poddaje się działaniu pojedynczej dawki TRA-8. Wzrost implantowanych komórek 1321N1 jest znacząco zahamowany u myszy poddanych działaniu TRA-8, jak określono na podstawie rozmiarów guzów i analizy histochemicznej.

d) Identyfikacja komórek maziówkowych z RA przez TRA-8

Pierwotne komórki maziówkowe od 8 pacjentów RA i 4 pacjentów CA badano pod kątem wyrażania DR5 na powierzchni komórek. TRA-8 ma zdolność do barwienia dodatniego wszystkich komórek RA, ale barwi ujemnie wszystkie komórki OA. Dlatego można odróżnić RA od OA poprzez ekspresję DR5 na powierzchni komórek wykrywaną przez TRA-8.

e) Indukcja apoptozy w fibroblastach maziówkowych przez TRA-8

Zdolność TRA-8 do indukowania apoptozy komórek maziówkowych RA określa się w teście żywotności komórek w czasie hodowli in vitro w obecności TRA-8 o różnych stężeniach. Wszystkie komórki RA wykazywały wysoki do średniego poziom wrażliwości na 100 ng/ml TRA-8. Przeciwnie,

PL 211 733 B1 wszystkie komórki OA są zasadniczo oporne na apoptozę indukowaną TRA-8. Co ważne, TRA-8 wykazuje większą aktywność indukowania apoptozy komórek maziówkowych FA niż rozpuszczalny TRAIL wraz ze wzmacniaczem. Co więcej, w porównaniu do przeciwciała anty-Fas (CH-11), TRA-8 wykazuje większą wybiórczość w stosunku do komórek maziówkowych.

f) TRA-8 nie indukuje wytwarzania MMP w komórkach maziówkowych RA

Ponieważ TRA-8 indukuje aktywację NF-kB w komórkach maziówkowych, podobnie jak TNF-α, można określić wpływ TRA-8 na wytwarzanie MMP1 i MMP3 przez komórki maziówkowe. Podczas, gdy TNF-α indukował zależny od dawki wzrost MMP, TRA-8 nie indukował produkcji MMP w ogóle, a w pewnych stężeniach TRA-8 lekko obniżał produkcję MMP w komórkach maziówkowych RA.

g) TRA-8 indukuje aktywację wielu kaspaz

Ponieważ kaspazy odgrywają kluczową rolę w indukcji apoptozy, zdolność TRA-8 do indukcji aktywacji kaspaz określa się w ludzkich komórkach Jurkat. Kiedy komórki Jurkat inkubuje się z niewielkimi dawkami (50 ng/ml) TRA-8, obserwuje się aktywację kaspazy 8, kaspazy 9 i kaspazy 3 już po 15 minutach inkubacji, jak to określono przez analizę Western oraz analizę cięcia dla kaspaz. Jeśli idzie o czas, liczbę i siłę aktywacji kaspaz, przeciwciała według niniejszego wynalazku, w tym przykładowe przeciwciało TRA-8, wykazywały dużo lepszą aktywność niż inne znane przeciwciała indukujące apoptozę, takie jak ludzkie przeciwciało Fas (CH-11).

A zatem, przeciwciało według niniejszego wynalazku jest substancją o właściwości wybiórczej indukcji apoptozy w komórkach patogennych, jak to pokazano w punktach (a) i (g). Dlatego też jest ono przydatne jako środek profilaktyczny i terapeutyczny w chorobach związanych z nieprawidłową przeżywalnością komórek lub nieprawidłową proliferacją komórek, takich jak te, które przypisuje się nieprawidłowej regulacji apoptozy, w tym systemu opartego na Fas/ligandzie Fas.

Zdolność przeciwciała według niniejszego wynalazku do indukcji apoptozy potwierdza się hodując komórki, takie jak ludzkie białaczkowe linie komórkowe Jurkat (American Type Culture No. TIB-152) oraz linie komórkowe astrocytomy 1321N1 w pożywce, w której dodaje się próbkę testową i określa się stopień przeżywania, na przykład testem ATPLite.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku, zwłaszcza przeciwciała anty-DR5 posiadające niemal identyczną immunogenność dla człowieka jak przeciwciała ludzkie, wykorzystuje się jako środek w profilaktyce lub leczeniu chorób związanych z nieprawidłową przeżywalnością komórek lub nieprawidłową proliferacją komórek, włączając w to te, które przypisuje się nieprawidłowej regulacji apoptozy w chorobach autoimmunologicznych, obejmujących przykładowo toczeń rumieniowaty układowy, chorobę Hashimoto, reumatoidalne zapalenie stawów, chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi, zespół Sjogrena, niedokrwistość złośliwą, chorobę Addisona, sklerodermę, zespół Goodpasture'a, chorobę Crohna, hemolityczną autoimmunologiczną anemię, bezpłodność, miastenię, stwardnienie rozsiane, chorobę Basedowa, plamicę małopłytkową, cukrzycę insulinozależną, alergię; chorobę atopową; miażdżycę tętnic; zapalenie mięśnia sercowego; kardiomiopatię; zapalenie kłębuszków nerkowych; anemię aplastyczną; odrzucenie narządów po przeszczepach oraz liczne nowotwory złośliwe płuc, prostaty, wątroby, jajnika, tkanek limfatycznych i sutka.

Takie środki profilaktyczne lub lecznicze można podawać w różnych postaciach. Odpowiednie sposoby podawania obejmują podawanie doustne, takie jak w tabletkach, kapsułkach, granulkach, proszku i syropy lub podawanie pozajelitowe, takie jak przez iniekcje, iniekcje kroplowe i czopki.

Przeciwciało lub czynnik terapeutyczny można podawać doustnie, doodbytniczo, dojamowo, dokomorowo, doczaszkowo, dooponowo, dopochwowo, pozajelitowo (dożylnie, domięśniowo lub podskórnie), domiejscowo (proszki, maści lub krople), przez iniekcje dootrzewnowe, przezskórne, przez inhalacje lub w rozpylaczu do nosa i do jamy ustnej. Dokładna wymagana ilość przeciwciała lub czynnika terapeutycznego jest różna w zależności od pacjenta i zależy od wieku, wagi, ogólnego stanu pacjenta, ciężkości leczonego stanu, umiejscowienia i rozmiaru guza, użycia konkretnych substancji, sposobu podawania i tym podobnych. Specjalista w tej dziedzinie może określić odpowiednią ilość przeprowadzając jedynie rutynowe doświadczenia według niniejszego opisu. Typowe jednorazowe dawki przeciwciała wahają się między 0,1 a 10000 mikrogramów, korzystnie między 1 a 100 mikrogramów. Typowe stężenia przeciwciała w nośniku wahają się od 0,2 do 2000 nanogramów na dostarczony mililitr.

Zależnie od zakładanego sposobu podawania, przeciwciało lub czynnik terapeutyczny może występować w kompozycji farmaceutycznej w postaci dawki w formie stałej, półstałej lub płynnej, takiej jak na przykład tabletki, czopki, pigułki, kapsułki, proszki, płyny lub zawiesiny, korzystnie w jednostkach dawkowania odpowiednich do jednorazowego podawania precyzyjnej dawki. Kompozycje zawierają skuteczną ilość wybranego substratu w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem

PL 211 733 B1 oraz dodatkowo mogą zawierać inne środki medyczne, farmaceutyczne, nośniki lub rozcieńczalniki. Przez „farmaceutycznie dopuszczalny” rozumie się materiał, który nie jest biologicznie lub w inny sposób niepożądany, który można podawać pacjentowi wraz z wybranym substratem, nie powodując znaczących niepożądanych skutków biologicznych lub szkodliwych interakcji z innymi składnikami kompozycji farmaceutycznej, w której jest zawarty.

Kompozycje odpowiednie do iniekcji pozajelitowych mogą składać się z fizjologicznie dopuszczalnych, sterylnych, wodnych lub nie wodnych roztworów, substancji rozproszonej, zawiesin lub emulsji oraz sterylnych proszków do odtworzenia w postaci sterylnych roztworów do wstrzykiwania lub zawiesin. Przykłady odpowiednich wodnych i nie zawierających wody nośników, rozcieńczalników, rozpuszczalników lub przenośników obejmują wodę, etanol, poliole (glikol propylenowy, glikol polietylenowy, glicerol i tym podobne), odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne (jak oliwa z oliwek) nadające się do wstrzykiwania estry organiczne, jak oleinian etylu. Właściwą płynność można zachować na przykład przez użycie substancji powlekającej, takiej jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząsteczek w przypadku zawiesin i przez użycie środków powierzchniowo czynnych.

Takie kompozycje mogą również zawierać dodatki, takie jak środki konserwujące, zwilżające, emulgujące i dawkujące. Działaniu mikroorganizmów można zapobiegać rozmaitymi środkami przeciwbakteryjnymi i przeciwgrzybowymi, jak na przykład parabeny, chlorobutanol, fenol, kwas sorbinowy i tym podobne. Może być również pożądane włączenie środków izotonicznych, na przykład cukrów, chlorku sodu i tym podobnych. Przedłużone wchłanianie wstrzykiwanej postaci farmaceutycznej można otrzymać stosując środki spowalniające wchłanianie, na przykład monostearynian glinu i żelatynę.

Postaci stałe do podawania doustnego obejmują kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich postaciach do podawania w formie stałej do aktywnego związku dodaje się przynajmniej jedną obojętną zwyczajową zaróbkę (lub nośnik), taką jak cytrynian sodu lub fosforan dwuwapniowy lub (a) wypełniacze, bądź domieszki objętościowe, na przykład skrobia, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol, i Iwas krzemowy, (b) środki spajające, jak na przykład karboksymetyloceluloza, alginian, żelatyna, pirolidon, sacharoza i gunm arabska, (c) czynniki utrzymujące wilgoć, na przykład glicerol, (d) środki rozpraszające, na przykład agar-agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub z tapioki, kwas alginowy, niektóre złożone krzemiany i węglan sodu, (e) opóźniacze rozpuszczania, na przykład parafina, (f) przyspieszacze wchłaniania, na przykład czwartorzędowe związki amonowe, (g) środki zwilżające, na przykład alkohol cetylowy i monostearynian glicerolu, (h) adsorbenty, na przykład kaolin i bentonit oraz (i) lubrykanty, jak na przykład talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe glikole polietylenowe, laurylosiarczan sodowy lub ich mieszaniny. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek postaci do podawania mogą również zawierać środki buforujące.

Kompozycje stałe podobnego rodzaju można zastosować jako wypełniacze do miękkich i sztywno wypełnionych kapsułek żelatynowych przy użyciu zaróbek, takich jak laktoza lub cukier mleczny, jak również glikole polietylenowe o dużej masie cząsteczkowej.

Dawki w postaci stałej, takie jak tabletki, drażetki, kapsułki, pigułki i granulki można wytwarzać w powłokach i łupinach, takich jak powłoki dojelitowe i inne dobrze znane w tej dziedzinie. Mogą one również zawierać czynniki zmętniające i mogą mieć skład powodujący uwalnianie czynnika lub czynników aktywnych w pewnej części przewodu pokarmowego w opóźniony sposób. Przykłady kompozycji do osadzania, które można zastosować, to substancje polimeryczne i woski. Związki aktywne mogą mieć również, gdy jest to pożądane, postać mikrokapsułek z jedną lub więcej z zaróbek wymienionych wyżej.

Postaci płynne do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry. Oprócz związków aktywnych płynne postaci dawkowania mogą zwierać obojętne rozpuszczalniki powszechnie stosowane w dziedzinie, jak woda lub inne rozpuszczalniki, środki zwiększające rozpuszczalność i emulgatory, jak na przykład alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, benozoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3-butylenowy, dimetyloformamid, oleje, a w szczególności olej bawełniany, olej z orzechów ziemnych, olej z kiełków kukurydzy, oliwa z oliwek, olej rycynowy i olej sezamowy, glicerol, alkohol tetrahydrofurfurylowy, glikole polietylenowe oraz estry kwasów tłuszczowych i sorbitolu lub mieszaniny tych substancji i tym podobne.

Oprócz takich obojętnych rozcieńczalników kompozycja może zawierać dodatki, takie jak środki zwilżające, emulgujące i zawieszające, słodzące, nadające smak i zapach.

Zawiesiny oprócz związków aktywnych mogą zwierać czynniki zawieszające, takie jak na przykład etoksylowane alkohole izostearylowe, sorbitol polioksyetylenowy i estry sorbitanowe, celuloza

PL 211 733 B1 mikrokrystaliczna, metawodorotlenek glinu, bentonit, agar-agar i guma tragakantowa lub mieszaniny tych substancji i tym podobne.

Korzystnymi kompozycjami do podawania doodbytniczego są czopki, które można wytworzyć przez zmieszanie związków według niniejszego wynalazku z odpowiednimi, nie podrażniającymi zaróbkami lub nośnikami, takimi jak masło kakaowe, glikol polietylenowy lub wosk do czopków, które są stałe w normalnych temperaturach, ale płynne w temperaturze ciała, a zatem topią się w odbycie lub pochwie i uwalniają związek czynny.

Postaci do podawania związku według tego wynalazku miejscowo obejmują maści, proszki, rozpylane płyny i środki do inhalacji. Związek czynny miesza się w sterylnych warunkach z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem i dowolnym środkiem konserwującym, buforem lub propelentem, w zależności od potrzeb. W zakresie wynalazku są również preparaty dooczne, maści, proszki i roztwory do oczu.

Stosowany tu termin „farmaceutycznie dopuszczalne sole, estry, amidy i proleki” odnosi się do tych soli karboksylowych, aminowych, estrów, amidów i proleków związków według niniejszego wynalazku, które według poważnego osądu medycznego są odpowiednie do użycia w styczności z tkankami pacjentów bez nadmiernej toksyczności, podrażnienia, odpowiedzi alergicznej i tym podobnych, o współmiernym racjonalnym stosunku korzyści do ryzyka i skuteczne przy ich zastosowaniu, jak również, gdy to możliwe, amfoteryczne postaci związków według wynalazku.

Termin „sole” odnosi się do stosunkowo nietoksycznych soli kwasów nieorganicznych i organicznych związków według niniejszego wynalazku. Te sole można przygotować in situ podczas końcowej izolacji i oczyszczania związków lub przez osobne reagowanie oczyszczonego związku w postaci czystej zasady z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym i izolację tak powstałej soli. Przykładowe sole obejmują bromowodorek, chlorowodorek, siarczan, wodorosiarczan, azotan, octan, szczawian, walerian, oleinian, palmitynian, stearynian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosyl, cytrynian, jabłaczan, fumaran, bursztynian, winian, naftylan, metylan, glukoheptan, laktan, sulfonian metanowy i sole laurylosiarczanowe i tym podobne. Mogą one zawierać kationy silnych zasad i wapniowców, jak sód, lit, potas, wapń, magnez i tym podobne, jak również nietoksyczne kationy amonowe, czwartorzędowe kationy amonowe i aminowe włączając w to między innymi amoniak, sole tetrametyloamonowe, tetraetyloamonowe, metyloaminę, dimetyloaminę, trimetyloaminę, trietyloaminę, etyloaminę i tym podobne (patrz na przykład S. M. Barge i wsp., „Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977, 66: 1-19, włączony tu jako odniesienie).

Termin „prolek” odnosi się do związków, które są szybko przekształcane in vivo, dając związek macierzysty według powyższego wzoru, na przykład wskutek hydrolizy we krwi. Szczegółowe omówienie można znaleźć w I. Higuchi i V. Stella, „Pro-drugs as Novel Delivery Systems,” Tom. 14 A. C. S. Symposium Series oraz w „Bioreversible Carriers in Drug Design”, wyd. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Komórka docelowa to komórka zwierzęcia, włączając w to na przykład komórki człowieka, innych naczelnych, szczura, myszy, świnki morskiej, królika, kozy, owcy, krowy, konia, kurczaka, świni, małpy marmoset i fretki.

Dodatkowo, przeciwciało lub środek leczniczy według niniejszego wynalazku może istnieć zarówno w formie nie rozpuszczonej, jak i rozpuszczonej, z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozpuszczalnikami, takimi jak woda, etanol i tym podobne. Na ogół dla celów niniejszego wynalazku postaci rozpuszczone uważa się za równoważne postaciom nie rozpuszczonym.

Cząsteczki przeciwciał oczyszcza się znanymi technikami, dla przykładu obejmującymi aminową chromatografię absorpcyjną lub aminową chromatografię powinowactwa, techniki chromatograficzne, takie jak wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa lub ich połączenie.

Inny aspekt niniejszego wynalazku obejmuje produkt farmaceutyczny do zastosowania do dostarczania kręgowcowi aktywnego biologicznie przeciwciała anty-receptor TRAIL lub humanizowanego przeciwciała anty-receptor TRAIL. Produkt farmaceutyczny obejmuje farmaceutycznie skuteczną ilość przeciwciała anty-receptor TRAIL lub jego fragmentu, farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz pojemnik, w którym nośnik i przeciwciało są jałowo zamknięte.

W korzystnym wykonaniu wynalazku farmaceutycznie skuteczna ilość przeciwciała anty-DR5 hamuje proliferację komórek przez kontakt z komórką docelową. Farmaceutycznie skuteczna ilość przeciwciała rozpoznającego DR5 lub humanizowanego przeciwciała rozpoznającego DR5, to ilość podana osobnikowi, wystarczająca do wywołania pożądanego skutku. Pożądane skutki podania farmaceutycznie skutecznej ilości przeciwciał rozpoznających DR5 obejmują śmierć docelowej komórki,

PL 211 733 B1 zahamowanie wzrostu docelowej komórki, pobudzenie DR5, wiązanie do DR5 i podwyższony poziom lub aktywność NFkB w docelowej komórce. Docelowa komórka to komórka, która wyraża DR5 i dla przykładu obejmuje komórki nieprawidłowo rosnące oraz nowotwory, takie jak brodawczaki i kłykciny, rak sutka, rak okrężnicy, wątrobiak, białaczki, rak płuc, czerniak, szpiczak, kostniakomięsak, rak jajnika, rak trzustki, rak prostaty, nowotwory głowy i szyi, nowotwór tarczycy, nowotwór macicy i guzy mózgu, takie jak astrocytomy. In vivo komórka docelowa to komórka osobnika ze stanem patologicznym, włączając w to takie, w których proliferacja komórek jest nieprawidłowa lub rozregulowana, jak nowotwór łagodny lub złośliwy i reumatoidalne zapalenie stawów.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku komórka docelowa styka się również ze środkiem terapeutycznym.

Środkiem terapeutycznym jest związek lub kompozycja skuteczna w łagodzeniu stanu patologicznego. Przykładem ilustrującym środek terapeutyczny może być związek przeciwnowotworowy.

Związek przeciwnowotworowy to związek lub kompozycja, która skutecznie hamuje lub zatrzymuje wzrost nieprawidłowo rosnących komórek. Farmaceutycznie skuteczna ilość związku przeciwnowotworowego to ilość podana osobnikowi, która wystarcza do wywołania zahamowania lub zatrzymania wzrostu nieprawidłowo rosnących komórek. Przykłady ilustrujące związki przeciwnowotworowe obejmują leki takie jak: bleomycyna, karboplatyna, chlorambucyl, cisplatyna, kolchicyna, cyklofosfamid, daunorubicyna, daktynomycyna, dietylstylbestrol, doksyrubicyna, etopozyd, 5-fluorouracyl, floksurydyna, melfalan, imetotreksat, mitomycyna, 6-merkaptopuryna, tenipozyd, 6-tioguanina, winkrystyna i winblastyna. Dalsze przykłady związków przeciwnowotworowych i środków leczniczych można znaleźć w „The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”, wyd. 15, Berkow i wsp., wyd., 1987, Rahway, N. J. oraz Sladek i wsp., „Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs”, 1987, Powis i wsp. wyd., Taylor i Francis, New York, N.Y.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można dalej łączyć z innymi terapiami, jak chemioterapia i radioterapia w leczeniu złośliwych nowotworów, a skuteczność terapeutyczną można wzmóc związkami indukującymi apoptozę, takimi jak bisindolilomaleimid VIII.

W porównaniu z uprzednio opublikowanym przeciwciałem anty-DR5 (24), aktywność indukowania apoptozy przez przykładowe przeciwciało TRA-8 według niniejszego wynalazku jest bardzo silna i jest ono zdolne do wywołania apoptozy komórek Jurkat w stężeniach rzędu pg/ml in vitro oraz wykazuje większą aktywność zabijania nowotworów w porównaniu z poprzednim, rozpuszczalnym TRAIL. Dożylne podanie pojedynczej dawki TRA-8 wystarcza do zahamowania wzrostu zarówno guza litego, jak i nowotworu komórek hemopoetycznych, podczas gdy wywołanie in vivo cofania się nowotworu przy pomocy rozpuszczalnego TRAIL wymaga o wiele wyższej dawki (500 μg dziennie przez 10 dni). Przeciwciała przeciw receptorowi TRAIL według niniejszego wynalazku wydają się być równie bezpieczne jak rozpuszczalny TRAIL, ponieważ przykładowe przeciwciało TRA-8 nie wywołuje apoptozy nie transformowanych komórek fibroblastów.

Wektory według niniejszego wynalazku zawierają sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ciężki lub lekki łańcuch immunoglobulinowy przeciwciała anty-DR5, połączony funkcjonalnie z elementem regulacyjnym, takim jak promotor lub wzmacniacz. „Połączenie funkcjonalne” odnosi się do takiego ułożenia sekwencji nukleotydowych, że mogą one pełnić swoje właściwe funkcje. A zatem, element regulacyjny połączony funkcjonalnie z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd jest zdolny do kierowania transkrypcją, replikacją i/lub translacją polipeptydu. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że pojedynczy wektor może ewentualnie zawierać sekwencje kodujące zarówno dla immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego przeciwciała anty-DR5.

Następujące przykłady są przedstawione poniżej dla zilustrowania sposobów i wyników według niniejszego wynalazku. Przykłady te nie mają na celu objęcia wszystkich aspektów niniejszego wynalazku, ale raczej zilustrowanie reprezentatywnych sposobów i wyników. Przykłady te nie mają wykluczać ekwiwalentów i wariantów niniejszego wynalazku, które są oczywiste dla specjalisty.

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie antygenu DR5

1.1. Klonowanie cDNA DR5

DNA kodujący ludzkie białko DR5 klonuje się następującą metodą RT-PCR stosując:

a) Matrycę

Całkowity RNA komórek HeLa izoluje się używając odczynnika TRIzol (GIBCO BRL). Jako matrycę do reakcji PCR używa się cCNA otrzymanego przy zastosowaniu zestawu First-Strand cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech) zgodnie z instrukcją dostarczoną z zestawem.

PL 211 733 B1

b) Startery do PCR

Syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl: SEK NR ID:1);

5'-ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5p2: SEK NR ID:2).

Jeżeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie oligonukleotydy w tych przykładach syntetyzowano w Lifetechnologies. Wszystkie oligonukleotydy przechowuje się w -20°C po rozpuszczeniu w wodze destylowanej.

c) Reakcja PCR

Skład mieszaniny reakcji PCR:

matryca cDNA, 5 μΐ z całkowitych 33 μΐ reakcji; starter DR5p1, 10 pmol; starter DR5p2, 10 pmol;

x stężony bufor do PCR (dostarczony w zestawie), 10 μΐ; dNTP (każdy 2,5 mM), 4 μΐ; oraz polimeraza Taq (Promega), 5 jednostek.

Sterylną destylowaną wodę dodaje się do mieszaniny do całkowitej objętości 100 μ|. Jeżeli nie zaznaczono inaczej, dNTP stanowią ekwimolową mieszaninę dATP, dCTP, dGTP i dTTP (2,5 mM każdy).

Reakcję PCR przeprowadza się następująco. Mieszaninę początkowo podgrzewa się w 94°C przez 2 minuty, po czym 40 razy powtarza cykle podgrzewania do 94°C przez 30 sek., 54°C przez minutę i 72°C przez 3 minuty. Po zakończeniu tej procedury, mieszaninę reakcyjną podgrzewa się w 72°C przez 10 minut.

Namnożone fragmenty DNA otrzymane w ten sposób rozdziela się w 1% żelu agarozowym, zawierającym 0,25 μg/ml bromku etydyny. Prążki zawierające pożądane fragmenty DNA wycina się z żelu używając skalpela i odzyskuje z nich DNA stosując zestaw Gene Clean (BIO101). Fragment DNA klonuje się stosując zestaw TA Cloning Kit (Invitrogen, CA). Przeprowadza się to jak następuje.

Fragment DNA odzyskany z mieszaniny reakcji PCR oraz 50 ng wektora pCR2.1, który jest dostarczony w zestawie TA Cloning Kit miesza się z 1 μl 10 x stężonego buforu reakcji ligazy (6 Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorek magnezu, 5 mM chlorek sodu, 7 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidyny i 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej), do którego dodaje się 4 jednostki ligazy DNA T4 (1 μθ. Całkowitą objętość mieszaniny doprowadza się do 10 μl sterylną dejonizowaną wodą i powstałą mieszaninę ligacyjną inkubuje w 14°C przez 15 godzin. Po tym czasie, 2 μl mieszaniny ligazy dodaje się do 50 μl kompetentnych komórek E. coli szczepu TOP10F', dostarczonych z zestawem TA Cloning Kit i doprowadzonych do kompetencji zgodnie z instrukcją, do których dodaje się μl 0,5 M β-merkaptoetanolu i powstałą mieszaninę trzyma w lodzie przez 30 minut, później w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 5 minut. Następnie, do kultury dodaje się 500 μl pożywki, zawierającej 2% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodu, 2,5 mN chlorku potasu, 1 mM chlorku magnezu i 20 mM glukozę (nazywaną tu dalej pożywką „SOC”) i inkubuje mieszaninę przez godzinę w 37°C z wytrząsaniem. Po tym czasie hodowlę rozprowadza się na płytce agarowej z pożywką bulionową L (1% obj./obj. trypton, 0,5% wag./obj. ekstrakt drożdżowy, 0,5% wag./obj. chlorek sodowy, 0,1% wag./obj. glukoza oraz 0,6% wag./obj. bakto-agar (Difco)), zawierającą 100 μg/ml ampicyliny. Selekcjonowano kolonie oporne na ampicylinę pojawiające się na płytce, pobiera się platynową ezą i hoduje w pożywce bulionowej L, zawierającej 100 μ/ml ampicyliny w 37°C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr. na min. Po hodowli z komórek zbieranych przez wirowanie izoluje się plazmidowy DNA metodą lizy alkalicznej. Fragmenty EcoRI-EcoRI DR5cDNA z tak otrzymanych plazmidów subklonuje się do plazmidu pcDNA3 (Invitrogen, CA). Gen DR5 pełnej długości w pcDNA3 sekwencjonuje się i porównuje z opublikowaną sekwencją. Plazmid otrzymany w ten sposób jest nazwany plazmidem pcDNA3-DR5.

1.2. Konstrukcja wektora ekspresyjnego DR5-IgG

W celu otrzymania rozpuszczalnej formy ludzkiego DR5 pozbawionej domeny transbłonowej, skonstruowano plazmidowy wektor ekspresyjny. Wektor ten zaprojektowano tak, by kodował fuzję białkową zawierającą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego DR5 dołączoną do DNA ludzkiego Fc IgGl (41). DNA kodujący ludzki DR5 pozbawiony domeny transbłonowej otrzymano w następującej reakcji PCR:

a) Matryca

Jako matrycę do reakcji PCR używano pcDNA3-DR5.

PL 211 733 B1

b) Startery do PCR

Zsyntetyzowano następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl: SEK NR ID: 1);

5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DR5p3: SEK NR ID: 3).

Jeżeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie oligonukleotydy w tych przykładach syntetyzowano w Lifetechnologies. Wszystkie oligonukleotydy przechowywano w -20°C po rozpuszczeniu w wodzie destylowanej.

c) Reakcja PCR

Reakcję PCR oraz izolację powielonego DNA przeprowadzano jak w przykładzie 1.1(c).

Tak otrzymany plazmid oznaczono jako plazmid pCR^DR5. Fragment BamHI-EcoRI kodujący ludzki fragment Fc, otrzymany z pmFas-hlgGlFc subklonowano w miejsca BamHI i EcoRI w obrębie wielu miejsc do klonowania pcDNA3. Tak otrzymany plazmid oznaczono jako pcDNAFc. Następnie, fragment BamHI-BamHI kodujący rozpuszczalny region ludzkiego DR5 otrzymany z pCR^DR5 subklonowano w miejsce BamHI plazmidu pcDNAFc. Tak otrzymany plazmid oznaczono jako plazmid pcDNAΔDR5-Fc. We fragmencie EcoRI kodującym ludzki rozpuszczalny DR5-ludzki region Fc IgG otrzymany z plazmidu pcDNAΔDR5-Fc wytępiono lepie końce stosując fragment Klenowa polimerazy DNA (GIBCO BRL) i subklonowano do wektora wahadłowego pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., Canada), w którym wytępiono lepkie końce po cięciu BamHI. Tak otrzymany plazmid oznaczono jako pAdΔDR5-Fc.

1.3. Ekspresja i oczyszczanie ludzkiej fuzji białkowej DR5-IgGl

Komórki QBI-293A (dostarczone z zestawem ADENO-Quest Kit) kotransfekowano DNA pAdΔDR5-Fc oraz QBI-viral (dostarczonym z zestawem ADENO-Quest Kit) stosując zestaw ADENO-Quest Kit (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) zgodnie z instrukcją. Hodowano rekombinowane łysinki wirusowe i przeszukiwano pod kątem wyrażania fuzji białkowej DR5-IgG poprzez analizę supernatantu testem ELISA. Dodatnie łysinki amplifikowano w komórkach QBI-293A i przechowywano w -80°C jako zapas wirusa. Pięćdziesiąt szalek (150 mm) z komórkami QBI-293A transfekowano rekombinowanym wirusem pAdΔDR5-Fc przy m. o. i. (ang. Multiplicity of Infection, wielokrotności infekcji) 10. Pożywkę zbierano 48 godzin po transfekcji.

Stransfekowane komórki zawierające gen DR5-IgG hodowano do gęstości 1 x 10⁶ komórki/ml inkubując w 500 ml pożywki DMEM (GIBCO), zawierającej 10% obj./obj. FCS, w 37°C i obecności 5% obj./obj. CO2 przez 2 dni. Następnie hodowle odwirowywano (1000 r. p. m., 5 minut) i zbierano supernatant. Oczyszczano DR5-IgG z supernatantu stosując chromatografię powinowactwa białko A-Sefaroza CL-4B (Pharmacia) w następujących warunkach:

kolumna: kolumna Białko A-Sefaroza CL-4B (wielkość kolumny 2 ml; Pharmacia); bufor do wymywania: 0,1 M glicyna (pH 2,4), 0,15 M NaCl; bufor do neutralizacji: 1 M Tris-HCl (pH 8,5).

Po nałożeniu całego supernatantu na kolumnę, przepłukiwano ją trzy razy 20 ml PBS, następnie 10 razy dodawano 1 ml buforu do wymywania. Mierzono gęstość optyczną każdej wymytej frakcji (1 ml). Zbierano frakcje od drugiej do piątej (OD₂₈₀ > 0,1) i po dodaniu 100 μl buforu do neutralizacji eluaty umieszczano oddzielnie w worku dializacyjnym i dializowano je wobec 1 litra PBS (pH 7,5) w 4°C. Bufor do dializy zmieniano dwukrotnie.

Eluaty następnie oznaczano pod kątem wyrażania produktu genu DR5-IgG w teście ELISA. Początkowo, 100 μl każdej frakcji umieszczano oddzielnie w studzienkach 96-studzenkowej mikropłytki (Costar) i inkubowano w 37°C przez godzinę. Po tym czasie usuwano roztwór ze studzienek i przepłukiwano płytkę 3 razy 100 μl/studzienkę PBS zawierającym 0,1% obj./obj. Tween 20 (nazywany tutaj dalej „PBS-Tween”). Po przepłukaniu, dodawano PBS zawierający 2% wag./obj. albuminę surowicy bydlęcej (nazywany tutaj dalej „BSA”) w ilości 100 μl/studzienkę i inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę. Po tym czasie studzienki przepłukiwano kolejne 3 razy 100 μl/studzienkę PBS-Tween, po czym do każdej studzienki dodawano 100 μl/studzienkę roztworu monoklonalnych przeciwciał antyludzkie IgG rozcieńczonych 1000 razy w PBS-Tween i ponownie inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę. Następne studzienki przepłukiwano 3 razy 100 μl/studzienkę PBS-Tween. Potem dodawano system płynnego substratu w postaci 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (nazywany tutaj dalej „TMB”) (Sigma) w ilości 100 μl/studzienkę i trzymano płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie zatrzymywano reakcję poprzez dodawanie 100 μl/studzienkę 0,2 N H₂SO₄. Absorbancję każdej studzienki odczytywano przy 450 nm w celu oszacowania stężenia związanego przeciwciała, stosując absorbancję przy 650 nm jako odczyt kontrolny. Absorbancję mierzono używając czytnika miPL 211 733 B1 kropłytek (Molecular Devices). Wytwarzanie DR5-IgG1 potwierdzano stosując tę metodę ELISA. Ciężar cząsteczkowy wyrażanej fuzji białkowej DR5-IgG1 określano stosując analizę Western, w której w celu wykrycia przeciwciał na żelu używano anty-ludzkie IgG1 (Sigma). Ciężar cząsteczkowy wyrażanej fuzji białkowej DR5-IgG1 wynosił około 50 kDa. Osiągnięta czystość wynosiła ponad 90%, jak określono poprzez analizę typu SDS-PAGE i wykrywanie białka przez barwienie błękitem Coomassie.

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiemu DR5.

2.1. Immunizacja

Samice myszy Balb/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) w wieku 6-8 tygodni immunizowano ludzką fuzją białkową DR5/hIgG1 oczyszczoną przez powinowactwo. Do wstępnej immunizacji w poduszeczkę łapy tworzono emulsję białka (50 μg) w kompletnym adiuwancie Freunda (Difco, Detroit, MI). Myszy poddawano czterem szczepieniom przypominającym z 50 μg fuzji białkowej podawanej bez adiuwanta każdego następnego dnia. Trzy dni po ostatnim szczepieniu limfocyty z miejscowych węzłów chłonnych poddawano fuzji z komórkami szpiczaka NS-1 i hodowano hybrydomy w pożywce F104 uzupełnionej 10% cielęcą surowicą płodową. Pozytywne hybrydomy selekcjonowano w teście ELISA, w którym płytki opłaszczano 1 μg/ml DR5/hIgG1 lub tą samą ilością Fas/hIgG1 jako kontrolą. Izotypy hybrydom określano przez ELISA stosując zestaw kozich przeciwciał specyficznych wobec mysich izotypów Ig (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Przeciwciała monoklonalne oczyszczano przez chromatografię powinowactwa stosując unieruchomione anty-mysie IgG1 lub białko G (Sigma).

2.2 Fuzja komórek

Trzeciego dnia po szczepieniu przypominającym, z myszy pobierano miejscowe węzły chłonne i umieszczano w 10 ml pożywki RPMI 1640 bez surowicy (GIBCO BRL), zawierającej 50 jednostek/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 300 μg/ml kwasu L-glutaminowego, następnie rozrywano poprzez przepuszczanie organu przez sito (Cell Strainer; Falcon) stosując łopatkę. Powstałą zawiesinę komórek wirowano w celu osadzenia komórek miejscowych węzłów chłonnych, które następnie przepłukiwano dwukrotnie w pożywce RPMI 1640 bez surowicy. Przepłukane komórki zawieszano w pożywce RPMI 1640 bez surowicy i liczono.

Jednocześnie komórki szpiczaka NS-1 (American Type Culture Collection TIB-18) hodowano do gęstości nie przekraczającej 1 x 10⁸ komórek/ml w pożywce ASF104 (Ajinomoto, K. K.) zawierającej 10% obj./obj. FCS (Gibco BRL) („pożywka ASF z surowicą”) w 37°C i obecności 5% obj./obj. CO2, następnie w podobny sposób je rozrywano, przepłukiwano i liczono.

Ilość zawiesiny komórek NS1, zawierającą 3 x 10⁷ komórek mieszano z ilością zawiesiny komórek śledzony, zawierającą 3 x 10⁸ komórek. Powstałą mieszaninę wirowano i odrzucano supernatant. Przeprowadzano następujące etapy fuzji komórek, cały czas trzymając plastykowe probówki z osadem w 37°C w zlewce z ciepłą wodą.

Do probówki powoli dodawano 1 ml 50% (w/v) glikolu polietylenowego 1500 (Boehringer Manheim), mieszając osad końcówką pipety. Następnie dodawano powoli, w 2 porcjach, 1 ml pożywki RPMI 1640 bez surowicy podgrzanej do 37°C, po czym dodawano kolejne 7 ml pożywki RPMI 1640 bez surowicy. Powstałą mieszaninę wirowano, odrzucano supernatant i dodawano 10 ml pożywki HAT zawierającej 10% obj./obj. FCS, delikatnie mieszając końcówka pipety. Następnie, dodawano kolejne 20 ml pożywki HAT zawierającej 10% obj./obj. FCS i zawiesinę rozdzielano do 96-studzenkowej mikropłytki do hodowli komórek po 100 μl/studzienkę i inkubowano w 37°C w obecności 5% obj./obj. CO₂. Po 7 lub 8 dniach, 100 μl/studzienkę świeżej pożywki HAT używano do wymiany pożywki w każdej studzience wykazującej żółte zabarwienie. Komórki fuzji z tych studzienek klonowano poprzez graniczne rozcieńczanie jak opisano poniżej.

2.3 Klonowanie przez graniczne rozcieńczanie

Pobierano grasice 4-10 tygodniowych samic myszy BALB/c (z Japan SLC, Inc.), rozrywano na sicie (Cell Strainer; Falcon) jak opisano powyżej i rozłączone komórki przepłukiwano dwukrotnie pożywką HT zawierającą 10% obj./obj. FCS. Ilość komórek grasicy odpowiadającą ilości z jednej myszy zawieszano w pożywce HT zawierającej 10% obj./obj. FCS w celu wytworzenia odżywczej zawiesiny komórek. Preparat fuzji komórkowej otrzymany powyżej w przykładzie 2.2 rozcieńczano w odżywczej zawiesinie komórek 10-100 razy, a następnie rozcieńczano seryjnie w odżywczej zawiesinie komórek, aby otrzymać zawiesiny mające gęstość komórek fuzji 5,1 i 0,5 komórek/ml. Tak przygotowane próbki rozdzielano do studzienek 96-studzenkowych mikropłytek do hodowli komórek po 100 μl/studzienka i inkubowano przez 5 dni w 37°C w obecności 5% obj./obj. CO2.

PL 211 733 B1

2.4 Przeszukiwanie

Supernatante hodowle hodowanych hybrydom przeszukiwano w teście ELISA stosując płytki opłaszczone 1 μg/ml DR5/hIgG1 lub tą samą ilością Fas/hIgG1 (41) jako kontrolą. Związane przeciwciała wykrywano stosując anty-mysie immunoglobuliny sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (Southern Biotechnology. Birmingham, AL oraz TMB (Sigma, St. Louis, MI) jako substrat. Oczyszczone DR5/hIgG1 w stężeniu 1 μg/ml lub tę samą ilość Fas/hIgG1 umieszczono w studzience 96-studzienkowej ELISA/RIA STRIP PLATE (Costar, NY). Płytkę trzymano w 4°C przez noc w celu umożliwienia adsorpcji białka na powierzchni studzienki. Po tym czasie usunięto mieszaninę ze studzienek i każdą studzienkę przepłukano 3 razy PBS-Tween. Następnie, do każdej studzienki dodawano 100 μl PBS, zawierającego 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (A3803; Sigma Chemicals Co.) i inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę. Następnie, przepłukiwano studzienki 3 razy w PBS-Tween, po czym do każdej studzienki dodawano 50 μl supernatantu każdej hodowli hodowanych hybrydom. Płytkę inkubowano w 37°C przez godzinę, a studzienki ponownie przepłukiwano 4 razy PBS-Tween. Po przepłukaniu, do każdej studzienki dodawano 50 μl koziego przeciwciała anty-mysia immunoglobulina znakowanego peroksydazą chrzanową (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) rozcieńczonego 1000 razy w PBS i ponownie inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę, po czym przepłukiwano studzienki 4 razy PBS-Tween. Następnie dodawano system płynnego substratu w postaci 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) (Sigma) w ilości 100 μl/studzienkę i trzymano płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie zatrzymywano reakcję poprzez dodawanie 100 μl/studzienkę 0,2 N H2SO4. Absorbancję każdej studzienki odczytywano przy 450 nm (650 nm jako kontrola) używając czytnik mikropłytek (Molecular Devices) i wybierano fuzje komórkowe z próbek mających absorbancję 450 nm-650 nm, wartości OD; > 0,5) wyraźnie wyższą niż te, do których nie dodawano supernatantu fuzji komórkowych (wartości OD; ~ 0,03). Następnie, supernatanty hodowli hodowanych hybrydom przeszukiwano pod względem funkcjonalnym poprzez pomiar aktywności indukującej apoptozę używając komórki Jurkat. Pięćdziesiąt μl pożywki RPMI, zawierającej komórki Jurkat (1000 na studzienkę) oraz 5 μM bisindolilomaleimidu VIII (BisVIII, Alexis, San Diego, CA) dodawano do 96-studzienkowych płytek w obecności 50 μl supernatantów hodowli hodowanych hybrydom. Komórki hodowano w nawilżanym inkubatorze w 37°C przez noc. Apoptozę oznaczano poprzez ocenę żywotności komórek stosując zestaw ATPLite kit zgodnie z zaleceniami producenta (Packard Instruments), a próbki zliczano stosując TopCounter (Packard Instruments).

2.5. Test ELISA wiązania TRAIL i TRA-8 do receptorów

Płytki do ELISA opłaszczano przez noc 2 μg/ml fuzji białkowych DR4-Ig lub DR5-Ig. Po blokowaniu 3% BSA dodawano rozpuszczalny TRAIL-FLAG lub TRA-8 we wskazanych stężeniach i inkubowano w 37°C przez godzinę. Wiązanie TRAIL-FLAG lub TRA-8 wykrywano odpowiednio przez przeciwciało anty-Flag sprzężone z HRP (Alexis) lub przeciwciało anty-mysie IgG1 sprzężone z HRP (Southern Biotechnology). Reakcje wywoływano stosując bufor z substratem TMB i mierzono stosując Benchmark Microplate Reader (BioRad). Wartości Kd szacowano stosując model wiązania w jednym miejscu nieliniowej regresji, używając oprogramowania GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Do kompetycyjnego testu ELISA, dodawano 100 ng/ml TRAIL-FLAG i inkubowano w obecności różnych stężeń TRA-8. Wiązanie TRAIL wyznaczano jak powyżej.

2.6 Klonowanie

Etapy opisane w przykładach 2.3 i 2.4 powtarzano 5 razy dla komórek wyselekcjonowanych w 2.4, w ten sposób umożliwiając selekcję kilku klonów hybrybom, z których każdy wytwarzał pojedyncze przeciwciało wiążące DR5-IgG, ale nie wiążące Fas-IgG. W wyniku tej procedury selekcji, otrzymano hybrydomę mysz-mysz, oznaczoną TRA-8, która wytwarzała przeciwciało wiążące DR5-IgG, ale nie Fas-IgG. Hybrydomę tę, TRA-8, zdeponowano w American Type Culture Collection 1 marca 2000 i przypisano jej numer dostępu PTA-1428.

Wykazano, że subklasa przeciwciała wytwarzanego przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 (dla uproszczenia nazywaną tutaj „TRA-8”) to IgGl, κ, po teście zestawem do izotypowania przeciwciał monoklonalnych (Pierce).

Wykorzystując naszą ludzką fuzję białkową DR5-IgG1 jako immunogen, uzyskano siedem klonów hybrydom stosując wstępny test ELISA, z których każdy był silnie pozytywny wobec fuzji białkowej DR5-IgG, ale nie wobec Fas-IgG, co wskazywało, że otrzymane hybrydomy wytwarzały przeciwciała, które rozpoznawały zewnątrzkomórkową część DR5, nie rozpoznając części Fc IgG1 (dane nie pokazane).

PL 211 733 B1

2.7 Analiza typu Western

Filtry do analizy Western z homogenatami zdrowych i nowotworowych tkanek zakupiono od Geno Technology (St. Louis, MO). Do każdej ścieżki nałożono równą ilość białka, co oszacowano stosując przeciwciało anty^-aktyna. Filtry inkubowano z 1 μg/ml TRA-8 przez noc, a następnie z kozimi przeciwciałami anty-mysie IgGl sprzężonymi z HRP (Southern Biotechnology) w temperaturze pokojowej przez godzinę i wywoływano stosując chemiluminescencję.

2.8 Immunohistochemia in situ

Ludzkie tkanki otrzymano od Tissue Procurement Center UAB. Zamrożone skrawki utrwalano w 70% etanolu, blokowano w 10% surowicy końskiej w PBS, a następnie inkubowano z 10 μg/ml oczyszczonego przez powinowactwo TRA-8 w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Do wizualizacji reaktywności jako substrat kolorymetryczny stosowano zestaw anty-mysie IgG ABC z diaminobenzydyną (Vector, Burlingame, CA).

2.9 Analiza aktywacji kaspaz

Komórki Jurkat (1 x 10⁶/ml) inkubowano z 500 ng/ml TRA-8. Próbki (30 μg białka) lizatu komórkowego rozdzielano w 15% SDS-PAGE, przenoszon na błonę nylonową i inkubowano z przeciwciałami anty-kaspaza 8, 9 i 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA), a następnie z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z HRP i odcięte produkty wizualizowano przez chemiluminescencję. Zestaw inhibitorów kaspaz zakupiono od R & D Systems (Minneapolis, MN). Każdy inhibitor kaspazy dodawano do hodowli we wskazanych stężeniach.

P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie przeciwciała monoklonalnego TRA-8

Hybrydomę mysz-mysz TRA-8 hodowano do gęstości 1 x 10⁶ komórki/ml inkubując w 500 ml pożywki ASF, zawierającej 10% obj./obj. FCS, w 37°C i obecności 5% obj./obj. CO2 przez 5 dni. Następnie, hodowle odwirowywano (1000 obr. na min., 5 minut) i zbierano supernatant. Oczyszczania TRA-8 z supernatantu dokonywano stosując chromatografię powinowactwa białko G-Sefaroza CL-4B (Pharmacia) w następujących warunkach:

kolumna: kolumna białko G-Sefaroza CL-4B (wielkość kolumny 2 ml; Pharmacia); bufor do elucji: 0,1 M glicyna (pH 2,4), 0,15 M NaCl; bufor do neutralizacji: 1 M Tris-HCl (pH 8,5).

Po nałożeniu całego supernatantu na kolumnę, przepłukiwano ją trzy razy 20 ml PBS, następnie 10 razy dodawano 1 ml buforu do elucji. Mierzono gęstość optyczną każdej wyeluowanej frakcji (1 ml). Oddzielnie zbierano frakcje od nr 2 do nr 5 (OD280 > 0,1).

Po dodaniu 100 buforu do neutralizacji eluaty umieszczano oddzielnie w worku dializacyjnym i dializowano je wobec 1 litra PBS (pH 7,5) w 4°C. Bufor do dializy zmieniano dwukrotnie. Próbkę testowano pod kątem aktywności przeciwciała anty-DR5 w teście ELISA, używając przygotowaną powyżej ludzką fuzję białkową DR5-IgG i stosując technikę opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie antygenu DR4, wektora ekspresyjnego DR4-IgG i przeciwciała monoklonalnego anty-DR4

Powtórzono procedury z przykładów 1-3 stosując matrycę cDNA i startery dla DR4 w miejsce opisanych w przykładzie 1, aby otrzymać antygen DR4, który użyto jak w przykładach 1.2-3 do otrzymania przeciwciała monoklonalnego specyficznego wobec DR4.

P r z y k ł a d 5. Przeciwciała monoklonalne przeciw DcR1 i DcR2

Przeciwciała monoklonalne przeciw receptorom przynętowym DcR1 i DcR2 uzyskano zastępując odpowiedni cDNA i startery w celu wytworzenia odpowiednich antygenów, jak w przykładzie 1. Wektory ekspresyjne dla fuzji DcR1 lub DcR2 z immunoglobuliną G oraz powstałe w rezultacie oczyszczone przeciwciała wytworzono jak w przykładach 2 i 3.

P r z y k ł a d 6. Swoistość przeciwciała monoklonalnego

Ponieważ wszystkie receptory dla TRAIL i innych białek z rodziny TNFR wykazują istotną homologię, swoistość przykładowego przeciwciała TRA-8 dla DR5 określono w analizie Western stosując dwie różne ludzkie fuzje białkowe DR5-IgG oraz rozpuszczalne, rekombinowane formy innych spokrewnionych białek. Na początku skonstruowano fuzję białkową DR5-Ig łącząc cDNA kodujący reszty 1-180 zewnątrzkomórkowej części DR5 i cDNA kodujący stały region ludzkiej IgGl. Połączony cDNA wklonowano do rekombinowanego wektora adenowirusowego (Quantum Biotechnogies, Inc., Montreal, Canada). Wyrażaną fuzję białkową DR5/hIgG1, mającą względny ciężar cząsteczkowy 50 kDa, oczyszczano stosując kolumnę powinowactwa anty-ludzkie IgG (Sigma, St. Louis, MO). Do analizy specyficzności, drugą rekombinowaną ludzką fuzję białkową DR5/hIgG1 (aa. 52-212), jak również fuzje białkowe TRAIL-R1, R3 i R4 zakupiono od Alexis. Rozpuszczalne formy ludzkiego Fas oraz

PL 211 733 B1

TNFR1 otrzymano dzięki życzliwości Dr. Carla Edwardsa z Amgen, Inc., Thousands Oaks, CA, USA. Użyte rozpuszczalne rekombinowane ludzkie cząsteczki DR4, DcR1, DcR2, TNFR1, R4 i Fas są fuzjami białkowymi ludzkiej IgG1. 0,5 g każdego białka rozdzielono w 10% SDS-PAGE i przenoszono na membranę nitrocelulozową. Filtry blokowano w 5% mleku w PBS w temperaturze pokojowej przez godzinę i inkubowano z 1 μg/ml oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego anty-DR5 (klon: TRA-8) lub 0,1 μg/ml kozich przeciwciał anty-ludzkie IgG sprzężonych z HRP w 4°C przez noc. Kozie przeciwciała antymysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową używano jako przeciwciała drugorzędowe w celu wykrycia TRA-8. Filtry wywoływano stosując chemiluminescencję.

Komórki Cos-7 stransfekowane wektorem pcDNA3 (Clontech, Palo Alto, CA), zawierającym DR5 lub DR4 pełnej długości albo pustym wektorem używano do analizy stosują cytometrię przepływową. Pełnej długości cDNA kodujący ludzki TRAIL lub mysi ligand Fas klonowano w wektor pTRE poniżej promotora kontrolowanego tetracykliną (Clontech). Fragmenty XhoI-Hindlll pTRE-hTRAIL lub pTRE-mFasL klonowano następnie do adenowirusowego wektora wahadłowego pAdBN (Ouantum Biotechnologies, Inc.). Komórki gospodarza 293 kotransfekowano zlinearyzowanym pAd-TRE-hTRAIL lub pAd-TRE-mFasL oraz dużym fragmentem DNA adenowirusa. Ekspresję funkcjonalnego ludzkiego TIRAIL lub mysiego ligandu Fas w zrekombinowanych łysinkach wykrywano stosując test uwalniania ⁵¹Cr z Jurkat jako komórkami docelowymi.

TRA-8 reagowało silnie z fuzją białkową DR5-IgG (~ 50 kDa), którą użyto do immunizacji, jak pokazano na fig. 1a DR5, #1 oraz słabo z drugą fuzją białkową DR5-IgG (~ 60 kDa), jak pokazano na fig. 1a DR5, #2. Nie było znaczącego wiązania TRA-8 do DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) Iub TNFRI. Wyniki te wskazują, że TRA-8 rozpoznaje epitopy, które są specyficzne dla DR5, ale nie występują u innych przedstawicieli rodziny.

TRA-8 nie reagowało z innymi przedstawicielami nadrodziny receptora TNF, takimi jak Fas (CD95) i TNF receptor I, ani nie reaguje krzyżowo z mysim homologiem DR5, jak wykazano poprzez stosunek absorbancji optycznej dla 450 nm i 650 nm, numery 1-7 dolnej części rysunku (fig. 1a, kolumna 8 dolnej części). Rozpuszczalny TRAIL i TRA-8 wiązały się podobnie do unieruchomionego DR5 (fig. 1b, lewa część). W przeciwieństwie do tego, TRAIL wiązał DR4, ale TRA-8 nie wykazywał żadnej aktywności wiązania do DR4 (fig. 1b, środkowa część). Wartości Kd wiązania TRAIL i TRA-8 do DR5 oszacowano odpowiednio na 59 i 3 nM. Co ważne, TRA-8 efektywnie współzawodniczył z TRAIL przy wiązaniu DR5, ale nie przy wiązaniu DR4, jak wykazano w kompetycyjnym teście ELISA (fig. 1b, prawa część). Te wyniki wykazały specyficzność TRA-8 względem ludzkiego DR5.

TRA-8 jest zdolne do wykrywania ekspresji DR5 na powierzchni komórki, stosując analizę cytometrii przepływowej, wykazującą specyficzne wiązanie do powierzchni komórek Cos-7 transfekowanych pełnej długości DR5, ale nie w przypadku komórek Cos-7 transfekowanych DR4 lub pustym wektorem (fig. 1c). Podobnie, immunohistochemia z TRA-8 wykazała reaktywność z komórkami Cos-7 transfekowanymi DNA DR5 pełnej długości, ale nie z tymi transfekowanymi wektorem kontrolnym (fig. 1d). TRA-8 nie wywołuje apoptozy nietransfekowanych komórek Cos-7, a RT-PCR z RNA z komórek Cos-7 przy zastosowaniu pary starterów kodujących DR5 wykazała brak specyficznego produktu PCR. Kolejna analiza funkcjonalna przy zastosowaniu ludzkich komórek Jurkat jako celu wykazała, że przy braku łączenia krzyżowego TRA-8 silnie indukuje śmierć komórek, co wykazano w trzech różnych testach żywotności komórek, włączając ATPLite, MTT i wykluczanie PI (fig. 1e). Więcej niż 50% komórek Jurkat jest zabijanych przez nanogramowe poziomy TRA-8, jak wykazano w teście ATPLite. Zabójcza aktywność TPA-8 jest specyficzna dla DR5, jako że mogła być blokowana przez fuzję białkową DR5-Ig, ale nie przez DR4-Ig (dane nie pokazane). Cięcie przez kaspazy 8, 9 i 3 można było wykryć w analizie Western zaledwie w 30 minut po traktowaniu komórek Jurkat TRA-8 (fig. 1f), a śmierć komórkowa komórek Jurkat jest całkowicie hamowana przez ogólny inhibitor kaspaz (Z-VAD) (fig. 1g). Pojedyncze inhibitory kaspaz dla kaspazy 8, 3, 9 i 10 częściowo hamowały śmierć komórkową, dodatkowo wykazując, że śmierć komórkowa za pośrednictwem TRA-8 następuje przede wszystkim poprzez mechanizm apoptozy zależny od kaspaz.

P r z y k ł a d 7. Analiza cytometrią przepływową ekspresji DR5 na powierzchni komórki: głównego receptora śmierci na wielu komórkach nowotworowych, ale nie na komórkach zdrowych

Zdolność TRA-8 do wiązania DR5 wyrażanego na powierzchni komórki oraz specyficzność tej reakcji była następnie oceniana stosując komórki COS-7 (American Type Culture Collection Nr CRL-1651) transfekowane wektorem ekspresyjnym zawierającym ludzki DR5 pełnej długości, cDNA DR4 lub pustym wektorem jako kontrola. Anty-mysie IgGl sprzężone z fikoerytyryną (PE) (Pharmingen)

PL 211 733 B1 stosowano jako drugorzędowe przeciwciała do wykrywania związanego TRA-8. Mierzono fluorescencję 1 x 10⁴ komórek stosując cytometr przepływowy (FACSVantage) w następujących warunkach:

Długość fali wzbudzenia: 488 nm,

Długość fali detekcji: 600 nm.

Analiza cytometrią przepływową wykazała, że TRA-8 barwiło około 30% komórek COS-7 transfekowanych wektorem DR5, jak pokazano na histogramie fig. 1c. Ten procent odpowiada wydajności transfekcji, jak wykazano stosując analizę transfekcji przy użyciu białka zielonej fluorescencji (GFP) (dane nie pokazane). TRA-8 nie barwiło znacząco komórek transfekowanych zarówno DR4 (histogram nie wypełniony), jak i wektorem kontrolnym (histogram kropkowany), wykazując, że TRA-8 jest specyficzny dla DR5 na powierzchni komórki.

Jakkolwiek ekspresję DR5 w komórkach nowotworowych intensywnie badano na poziomie mRNA (Rieger J. i wsp. 1: FEBS Lett., 1998 May 1; 427 (1): 124-8), powierzchniowa ekspresja DR5 nie jest dobrze poznana, Gibson S. B. i wsp. 1: Mol. Cell. Biol., 2000 Jan; 20 (1): 205-12; Kim K. i wsp. 1: Clin. Cancer Res., 2000 Feb; 6 (2): 335-46. Zatem, dostępność przeciwciała monoklonalnego antyDR5 pozwala nam na badanie poziomów powierzchniowego DR5 oraz na korelację ekspresji z podatnością komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL. Następujący zestaw komórek (1 x 10⁶) inkubowano z 10 μg/ml TRA-8 oczyszczonego przez powinowactwo w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie barwiono anty-mysimi IgGl sprzężonymi PE (Pharmingen) przez następne 30 minut. 10000 żywych komórek analizowano stosując cytometr przepływowy FACS Vantage w następujących warunkach:

Długość fali wzbudzenia: 488 nm,

Długość fali detekcji: 600 nm.

Testowano pięć krwiotwórczych linii komórkowych: Jurkat, CEM-6, Molt-4, H-9 i U937. Ekspresja DR5 była wykrywana na powierzchni komórek Jurkat, CEM-6, H-9 i U937, ale prawie nie była wykrywana na komórkach Molt-4, jak przedstawiono na fig. 2a i 2a'. Chociaż wysokie poziomy ekspresji RNA DR5 opisano poprzednio (43), analiza FACs wykazała, że komórki te nie wyrażają powierzchniowego DR5 na wysokich poziomach. Wyniki te wskazują, że ekspresja DR5 na powierzchni komórki nie koreluje z transkrypcyjną ekspresją DR5, co nie jest nieoczekiwane dla takiego receptora. Poziom ekspresji DR5 na powierzchni komórki może być specyficzny dla danej linii, ponieważ większość komórek pochodzenia krwiotwórczego wyrażała DR5 na niskich poziomach, podczas gdy większość komórek glejakowych i komórek prostaty wyrażała DR5 na wysokich poziomach. Monoklonalne przeciwciało TRA-8 używano do określenia roli DR5 w indukcji apoptozy za pośrednictwem TRAIL poprzez badanie jego ekspresji na powierzchni komórki w zestawie różnych typów ludzkich komórek nowotworowych, jak również podatność tych komórek na apoptozę za pośrednictwem zarówno TRAIL, jak i TRA-8. Pierwotne komórki T krwi obwodowej nie wyrażały DR5 na powierzchni komórki na znaczących poziomach i były odporne na apoptozę za pośrednictwem „nmiL jak i TRA-8 (fig. 2a, 2a' i 3a). Jakkolwiek wszystkie 5 z testowanych linii komórek ludzkiej białaczki T wyrażały DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych, choć względnie niskich poziomach, dwie z nich (Jurkat i CEM-6) były wysoce podatne na apoptozę za pośrednictwem zarówno TRAIL, jak i TRA-8, co wskazywało na to, że sam DR5 jest wystarczający do indukcji apoptozy w tych komórkach.

Komórki Molt-4 i U937 były częściowo podatne na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, będąc względnie odporne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8, co sugeruje, że inne receptory TRAIL mogą być zaangażowane w transdukcję sygnału apoptozy. Komórki H-9 były odporne zarówno na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8, co implikowano blok za pośrednictwem wewnątrzkomórkowej ścieżki przeciwapoptotycznej.

Zestaw komórek obejmował ludzkie komórki glejaka złośliwego, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 oraz zdrowe astrocyty, które były dostarczone przez Dr Yancey Gillespie z Neurosurgery Department of the University of Alabama w Birmingham. Ludzkie komórki nowotworu prostaty, Dul54, PC3 i LnCap, były dostarczone przez Dr William Grizzle of the Pathology

Department of the University of Alabama w Birmingham, który otrzymał je z American Type Culture Collection. Ludzkie linie komórkowe białaczki T, chłoniaka komórek B, HepG2 Jurkat (American Type Culture Collection TIB-152) i CCRF-CEM CEM-6 (American Type Culture Collection CCL-119); linie komórkowe monocytów, U937 (American Type Culture Collection CRL-2367); zakupiono od American Type Culture Collection. Wszystkie powyższe linie komórkowe hodowano w RPMI 1640 uzupełnionej 10% FCS. Ludzką linię komórkową gwiaździaka, 1321N1 otrzymano dzięki życzliwości Dr. Richard

PL 211 733 B1

Jope z Psychiatry Department of the University of Alabama w Birmingham, hodowana w DMEM uzupełnionej 5% FCS.

Rozpuszczalny rekombinowany ludzki TRAIL, zakupiony od Alexis Corporation (San Diego, CA), jest fuzją białkową zawierającą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego TRAIL (reszty aminokwasowe od 95 do 281), połączoną na końcu N ze znacznikiem FLAG i 8-aminokwasowym peptydem łącznikowym. W przeciwieństwie do poprzednio opublikowanego TRAIL ze znacznikiem His, ten preparat TRAIL nie indukuje silnej odpowiedzi apoptotycznej w komórkach Jurkat i wymaga przeciwciała anty-FLAG jako odczynnika do wiązania krzyżowego do podwyższenia apoptozy. Przeciwciało antyFLAG również zakupiono od Alexis. Wszystkie 10 badanych ludzkich komórek glejaka złośliwego wyrażały DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych poziomach. DR5 było najczęściej wyrażane na średnich do wysokich poziomach jak przedstawiono na fig. 2b. Trzy linie D-54MG, U373MG i CH235MG wyrażały DR5 na wysokich poziomach, podczas gdy 6 linii, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 i 1321N1, wyrażało DR5 na średnich poziomach. Tylko jedna linia komórkowa H-465 wyrażała DR5 na niskich poziomach. Wszystkie trzy linie komórkowe nowotworu prostaty wyrażały DR5 na wysokich poziomach, jak przedstawiono na fig. 2c.

Podobnie jak zdrowe pierwotne komórki T, pierwotne komórki B nie wyrażały DR5 na znaczących poziomach i nie przechodziły apoptozy po traktowaniu zarówno TRAIL, jak i TRA-8 (fig. 2d). Trzy (SKW6.4, EB-3 i Raji) z czterech testowanych linii komórkowych chłoniaka B wyrażały DR5 na względnie wysokich poziomach i były bardzo podatne zarówno na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8. Czwarta linia komórkowa, Daudi, wyrażała DR5 na bardzo niskich poziomach i była znacznie mniej podatna zarówno na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8. Chociaż pierwotne astrocyty nie wyrażały DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych poziomach (fig. 2b'), wszystkie cztery testowane linie glejaka wyrażały wysokie poziomy DR5.

Wyższemu poziomowi ekspresji DR5 na komórkach glejaka w porównaniu z komórkami T i B nie towarzyszyła znacząco wyższa podatność na apoptozę za pośrednictwem TRAIL i DR5, co sugeruje, że poziom ekspresji DR5 na powierzchni komórki niekoniecznie koreluje z poziomem apoptozy komórek nowotworowych. Reakcja RT-PCR przeprowadzona w celu określenia poziomów mRNA DR4, DR5 i DcR2, wykryła mRNA we wszystkich testowanych komórkach (tabela 1). Jednakże, ogólnie, pierwotne zdrowe komórki wyrażały DR5 na względnie niskich poziomach w porównaniu z transformowanymi komórkami nowotworowymi.

T a b e l a 1

Analiza RT-PCR ekspresji receptora TRAIL*

Komórki	DR5	DR4	DcR2
Pierwotne komórki T	< 0,001	< 0,001	0,015
Jurkat	0,10	< 0,001	0,21
CEM-6	0,50	0,59	0,25
Molt-4	0,10	< 0,001	0,05
H-9	0,73	0,61	0,07
Pierwotne komórki B	< 0,001	< 0,001	0,024
SKW6.4	0,95	0,66	0,45
EB3	0,40	< 0,001	0,35
Raji	0,55	0,11	0,45
Daudi	0,73	0,36	0,63
Zdrowe astrocyty	0,05	< 0,001	0,12
SH683	0,56	0,96	0,14
U87	0,44	0,56	0,21
D54	1,15	0,46	0,12
1321N1	0,25	0,35	0,05

* Całkowite RNA izolowano z komórek i przeprowadzano RT-PCR jako opisano w metodach. Produkty PCR rozdzielano w 3% żelu agarozowym i analizowano stosując Fluor-S Multilmager System (BioRad). Wartości przestawiono jako względny stosunek do β-aktyny

PL 211 733 B1

P r z y k ł a d 8. Indukcja apoptozy in vitro w komórkach nowotworowych

W celu określenia, czy TRA-8 indukuje apoptozę w transformowanych komórkach in vitro wszystkie komórki DR5-dodatnie badano pod kątem ich podatności na apoptozę indukowaną zarówno przez TRA-8, jak i TRAIL.

₃

Komórki docelowe (1 x 10³ na studzienkę) hodowano w 96-studzienkowych płytkach w obecności wskazanych stężeń rozpuszczalnego TRAIL oraz odczynnika do wiązania krzyżowego (Alexis) lub TRA-8 w 37°C przez noc. Żywotność komórek oznaczano stosując:

(1) zestaw ATPLite zgodnie z zaleceniami producenta (Packard Instruments, Meriden, CT);

(2) zestaw MTT Cell proliferation/viability (Sigma) lub (3) barwienie martwych komórek PI i analizowano stosując cytometrię przepływową.

Na koniec hodowli komórki barwiono, 10 μg/ml PI, a komórki PI ujemne bramkowano jako komórki żywe. Przy analizie skondensowanych jader hepatocytów, komórki barwiono 10 ng/ml Hoechst 33352 (Molecular Probes) i analizowano stosując cytometrię przepływową.

Przeciwciało TRA-8 było zdolne do indukcji apoptozy w większości ludzkich linii komórek złośliwego glejaka (9/10), w 2 z 3 linii komórek nowotworu prostaty oraz w 2 z 4 DR5-dodatnich linii komórek krwiotwórczych. Nie indukowało ono apoptozy w linii komórek Molt-4, która wyrażała DR5 na powierzchni komórki na prawie niewykrywalnych poziomach. Jednakże, poziomy podatności komórek na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 różniły się znacznie wśród linii komórkowych.

Zróżnicowanie podatności komórek na apoptozę indukowaną przez przeciwciało TRA-8 sugeruje, że jakkolwiek minimalny poziom ekspresji DR5 na powierzchni komórki jest wymagany, poziom DR5 wyrażanego na powierzchni komórki niekoniecznie jest podstawowym wyznacznikiem podatności i inne czynniki wpływają na ten proces. Chociaż komórki glejaka ogólnie wyrażały znacznie wyższe poziomy powierzchniowego DR5 niż komórki krwiotwórcze, podatność komórek glejaka na apoptozę indukowaną przez TRA-8 nie jest proporcjonalnie podwyższona w porównaniu z komórkami krwiotwórczymi. Podatność pięciu linii komórek glejaka D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG i 1321N1 na apoptozę indukowaną przez TRA-8 jest wysoka i jest równoważna z ich podatnością na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak pokazano na fig. 3b. Dwie z linii komórek glejaka, H-456 i SMK1, są znacznie mniej podatne na apoptozę indukowaną przez TRA-8. W przypadku komórek H-456 powierzchniowa ekspresja DR5 jest niska, jednakże powierzchniowa ekspresja DR5 na komórkach SMK1 jest podobna do bardziej podatnych linii komórkowych, co sugeruje, że inne mechanizmy mogą odgrywać rolę w wyznaczaniu podatności na apoptozę za pośrednictwem TRAIL. Jakkolwiek wszystkie trzy linie komórkowe nowotworu prostaty wyrażały DR5 na wysokich poziomach, komórki Dul45 są najbardziej wrażliwe na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, komórki PC3 są częściowo wrażliwe, podczas gdy komórki LnCAP są zupełnie odporne, jak pokazano na fig. 3c. Wśród komórek krwiotwórczych wykazano, że Jurkat i CEM-6 są bardzo podatne na apoptozę TRA-8, jak pokazano na fig. 2a, chociaż wykazano, że obie te linie komórkowe wyrażają DR5 na niskich poziomach. Jakkolwiek DR5 jest wykrywalny na komórkach U937, komórki te są odporne na apoptozę indukowaną przez TRA-8. Podobnie, jakkolwiek komórki H-9 wyrażają wykrywalne ilości DR5, komórki H-9 są odporne na apoptozę indukowaną przez TRA-8. Wyniki te wykazały istnienie mechanizmy regulującego, który wpływa na apoptozę za pośrednictwem DR5.

Dodatkowe wiążące się do powierzchni przeciwciała anty-DR5 wytworzono w procedurach przykładów 1-3. Dwa dodatkowe przeciwciała anty-DR5 oznaczone TRA-1 i TRA-10 badano razem z TRA-8 w celu określenia porównywalnej zdolności do indukcji apoptozy i przez to działania jako agonista lub odwrotnie do blokowania apoptozy za pośrednictwem TRAIL i przez to działania jako antagonista. Ludzkie komórki Jurkat używano jako komórki docelowe do określania aktywności agonisty i/lub antagonisty trzech przeciwciał anty-DR5 oznaczonych TRA-1, TRA-8 i TRA-10. Jak pokazano na fig. 4 przeżywalność komórek wynosiła około 90%, 70% i 20% odpowiednio dla TRA-10, TRA-1 i TRA-8 po inkubacji przez noc z 2,5 μg na ml. TRA-8 indukowało silną odpowiedź apoptotyczną w sposób zależny od dawki, podczas gdy TRA-1 indukowało tylko umiarkowaną odpowiedź apoptotyczną, a TRA-10 indukowało zaledwie słabą odpowiedź. Zatem, TRA-8 sklasyfikowano jako agonistyczne przeciwciało anty-DR5. Na fig 4. przeżywalność ludzkich komórek Jurkat pokazano jako zależną od dawki funkcję apoptozy indukowanej przez TRAIL. TRA-10 blokowało apoptozę ludzkich komórek Jurkat w znaczącym stopniu w badaniach małej dawki apoptozy indukowanej przez TRAIL. Tak więc, TRA-10 sklasyfikowano jako antagonistyczne przeciwciało anty-DR5. TRA-1 zdeponowano w American Type Culture Collection pod numerem dostępu PTA-1741. TRA-10 zdeponowano podobnie w American Type Culture Collection pod numerem dostępu PTA-1742.

PL 211 733 B1

Podatność pięciu linii komórkowych glejaka D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG i 1321N1 na apoptozę indukowaną przez TRA-8 jest równoważna w ich podatności na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak pokazano na fig. 3b, co sugeruje, że apoptoza indukowana przez TRAIL w tych komórkach następuje przede wszystkim za pośrednictwem DR5. Ponadto, dwie linie komórkowe glejaka, Hs683 i U251-MG, są odporne na apoptozę indukowaną TRAIL, ale częściowo podatne na apoptozę indukowaną TRA-8, co wskazuje, że receptory przynętowe działają w tych komórkach oraz że użycie przeciwciała TRA-8 pomija ten mechanizm regulatorowy. W liniach komórkowych nowotworu prostaty, mimo zróżnicowania wrażliwości na apoptozę indukowaną przez TRA-8, odpowiada ona wrażliwości komórek na apoptozę indukowaną przez TRAIL, ponownie sugerując, że DR5 odgrywa główną rolę w apoptozie za pośrednictwem TRAIL w komórkach raka prostaty. Wśród komórek krwiotwórczych wykazano, że Jurkat i CEM-6 są bardzo podatne na apoptozę zarówno za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8. Poziom apoptozy indukowany przez TRA-8 był porównywalny z tym indukowanym przez TRAIL, jak pokazano na fig. 2a i 3a'. Tylko jedna linia glejaka U87 i dwie linie komórek krwiotwórczych, U937 i Molt-4, wykazywały wrażliwość na apoptozę indukowaną przez TRAIL, ale były mniej wrażliwe lub odporne na apoptozę indukowaną przez TRA-8. Jedna linia komórkowa, H-9, wyrażała DR5 na wykrywalnych poziomach, ale była odporna na apoptozę indukowaną zarówno przez TRAIL, jak i TRA-8. Podczas gdy minimalny poziom ekspresji jest wymagany przy apoptozie indukowanej przez TRA-8, poziom ekspresji niekoniecznie określa podatność komórek na apoptozę za pośrednictwem TRA-8; receptory przynętowe odgrywają rolę w modulowaniu apoptozy za pośrednictwem TRAIL w niektórych komórkach, ale nie wydają się odgrywać głównej roli w większości testowanych do tej pory komórek; jak przypuszczano przeciwciało TRA-8 pomija efekty receptorów przynętowych; mutacje funkcjonalne receptora DR5 mogą pojawiać się w transformowanych komórkach i wreszcie wewnątrzkomórkowe mechanizmy regulatorowe mogą być tak samo lub bardziej ważne niż receptory przynęty w określaniu podatności komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL i DR5.

Poprzednie badania wykazały, że mRNA DR5 jest powszechna w zdrowych tkankach⁷. W celu zbadania ekspresji DR5 na poziomie białkowym, zestaw homogenatów zdrowych ludzkich tkanek (Geno Technology, St. Louis, MO) inkubowano z przeciwciałem TRA-8 w analizie Western. Wśród dziewięciu zdrowych ludzkich tkanek, tkanka mózgowa była słabo dodatnia (fig. 5a, ścieżka 2). Nie wykrywano białka DR5 przez reaktywność TRA-8 w wątrobie (ścieżka 1), płucach (ścieżka 3), nerce (ścieżka 4), trzustce (ścieżka 5), jądrach (ścieżka 6), jajniku (ścieżka 7), sercu (ścieżka 8) lub trzustce (ścieżka 9). W przeciwieństwie do tego, wszystkie trzynaście ludzkich tkanek nowotworowych barwiło się dodatnio TRA-8 (fig. 5b), włączając w to nowotwory jajnika (ścieżka 1), płuc (ścieżka 2), wątroby (ścieżka 3), odbytnicy (ścieżka 4), szyjki macicy (ścieżka 5), skóry (ścieżka 6), jąder (ścieżka 7), tarczycy (ścieżka 8), macicy (ścieżka 10), żołądka (ścieżka 11), krtani (ścieżka 12) i trzustki (ścieżka 13). Dodatkowo immunohistochemia in situ zdrowych i nowotworowych tkanek z TRA-8 potwierdziła, że oprócz kilku rozproszonych komórek dodatnich w trzustce, ekspresja DR5 w zdrowych tkankach piersi, płuc i śledziony nie jest wykrywana (fig. 5c). Odpowiadające tkanki nowotworowe włączając przewodowy nowotwór naciekowy sutka, nowotwór płuc z małych komórek i chłoniaka reagowały dodatnio z TRA-8 (fig. 5d). Wśród 22 badanych tkanek nowotworowych, 5 z 6 nowotworów sutka, 2 z 2 nowotworów szyjki macicy, 4 z 5 nowotworów wątroby, 5 z 8 chłoniaków, 2 z 2 nowotworów płuc i 2 z 2 nowotworów prostaty reagowały dodatnio z TRA-8. Wyniki te są zgodne z wynikami analizy cytometrią przepływową i wykazują, że tkanki nowotworowe wyrażają wyższe poziomy białka DR5 niż zdrowe tkanki.

P r z y k ł a d 9. Aktywność TRA-8 niszcząca nowotwór in vivo

Z wielu przyczyn, wiele czynników, które wykazują obiecujące działanie w badaniach in vitro nie wykazuje skuteczności in vivo. Ważne jest zatem zbadanie skuteczności TRA-8 w modelu zwierzęcym in vivo. Aby tego dokonać przeciwciało TRA-8 anty-ludzki DR5 podawano myszom z ludzkim heteroprzeszczepam wyrażającym cząsteczkę ludzkiego DR5. Użytymi myszami były 6 do 8 tygodniowe myszy NOD/SCID (Jackson Laboratory), którym podano podskórnie ludzkie komórki gwiaździaka 1321N1 (1 x 10⁷) lub podano dożylnie ludzkie komórki białaczki Jurkat (1 x 10⁶). W dwa dni po podaniu nowotworu, myszom podawano dożylnie TRA-8 (100 μg). Pięć dni po traktowaniu TRA-8 rozwój nowotworu 1321N1 określano po przez wielkość i ciężar masy guza. Rozwój komórek Jurkat określano poprzez ciężar śledziony zwierząt, którym je podano. Pobrano i badano histologicznie biopsje tkanek nowotworowych.

Wczesne traktowanie pojedynczą dożylną dawką 100 μg TRA-8 w dzień po podaniu nowotworu zahamowało zupełnie tworzenie zwartego guza przez komórki 1321N1 (fig. 6a). Późne traktowanie

PL 211 733 B1 trzema dawkami 100 μg TRA-8 tydzień po podaniu nowotworu, zredukowało ciężar guza 4 lub więcej razy (fig. 6b). Tworzenie się guza nie było widoczne u zwierząt traktowanych TRA-8 we wczesnym punkcie czasowym (fig. 6c, górne pole). Analiza histologiczna wykazała silną degenerację tkanki nowotworowej u zwierząt traktowanych TRA-8 (fig. 6c, dolne pole). Podobnie, traktowanie TRA-8 zahamowało populację komórek śledziony przez komórki Jurkat jak pokazano wykazując niedobór CD3-pozytywnych komórek Jurkat w śledzionie (fig. 6d, 6e). Analiza histologiczna wszczepionego nowotworu wykazała kilka komórek nowotworowych rozproszonych w tkance miękkiej u zwierząt traktowanych TRA-8, podczas gdy kontrole wykazały tworzenie się zwartego nowotworu jak pokazano na fig. 6c. W modelu komórek Jurkat, liczba komórek Jurkat w śledzionach zwierząt traktowanych TRA-8 wynosiła mniej niż 2% w porównaniu do prawie 10% w śledzionach zwierząt kontrolnych jak wykazano stosując analizę cytometrią przepływową jak pokazano na fig. 6a oraz barwieniem CD3 in situ - fig. 6c.

Wyniki te potwierdzają niedawne wykazanie, że ogólnoustrojowe podawanie związanego krzyżowo rekombinowanego TRAIL hamuje rozwój nowotworu in vivo (13). Wyniki te wskazują, że pojedyncza dawka TRA-8 jest wysoce skuteczna w eliminacji komórek nowotworowych in vivo.

Ponieważ anty-ludzkie przeciwciało stosowano w modelu mysim, nie można było określić toksyczności taktowania TRA-8. Jednakże badania polegające na podawaniu TRAIL in vivo wykazały, że z traktowaniem nie jest związana znacząca toksyczność (13).

P r z y k ł a d 10. Maziówkowe komórki RA są podatne na apoptozę indukowaną TRAIL i TRA-8

Większość poprzednich badań apoptozy za pośrednictwem TRAIL w tej dziedzinie skupiały się na komórkach złośliwych. Apoptoza za pośrednictwem TRAIL według niniejszego wynalazku jest również lecznicza w stanach autoimmunologicznych i zapalnych, takich jak RA.

10.1 Analiza cytometrią przepływową ekspresji DR5 na powierzchni komórki w komórkach maziówkowych RA

Ekspresję DR5 w zestawie ośmiu pierwotnych hodowanych komórek maziówkowych od pacjentów z RA porównywano z ekspresją na ośmiu pierwotnych hodowanych komórek maziówkowych od pacjentów z zapaleniem kości i stawów (nazywanych tutaj dalej „OA”). Osiem ludzkich pierwotnych hodowli komórek maziówkowych PA RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 i RA-929 otrzymanych dzięki życzliwości Dr M. Ohtsuki (Sankyo Co. Ltd., Tokyo, Japan) hodowano w DMEM uzupełnionej 10% FCS, penicyliną, streptomycyną i glutaminą. Siedem pierwotnych hodowli komórek maziówkowych CA izolowano z tkanek maziówkowych od pacjentów z stosując standardową metodę kolagenazową i hodowano w tych samych warunkach. Liczba pasaży wszystkich pierwotnych linii nie przekraczała 10. Ekspresję DR5 określano poprzez analizę cytometrią przepływową, jak opisano w przykładzie 5.

Wszystkie pierwotne hodowle komórek RA wyrażały powierzchniowy DR5 na wysokich poziomach, z małymi różnicami w poziomach ekspresji wśród komórek maziówkowych izolowanych z różnych pacjentów, jak pokazano na fig. 7a. W przeciwieństwie do tego, ekspresja powierzchniowego DR5 na powierzchni komórek maziówkowych wyizolowanych z pacjentów z OA była bardzo niska lub niewykrywalna, jak na fig. 7b. Wykazano, że komórki maziówkowe transformowanie SV40 wyrażają DR5 na wysokich poziomach, porównywalnych z wykazywanymi przez komórki RA. W przeciwieństwie do tego, nie transformowane komórki fibroblastyczne wyrażały DR5 na niskich poziomach porównywalnych z wykazywanymi przez komórki OA na fig 7b.

10.2 Podatność komórek maziówkowych RA na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 lub TRAIL

Ogólnie, wszystkie komórki maziówkowe izolowane z pacjentów z RA są podatne na apoptozę indukowaną zarówno przez TRAIL, jak i przeciwciało anty-DR5 oraz wszystkie komórki OA są oporne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i przeciwciało anty-DR5, jak pokazano na fig. 8a, b. Badania te wykazują, że przeciwciało TRA-8 wiąże komórki zmienione preferencyjnie do komórek zdrowych. Dodatkowo, wzór podatności lub odporności na apoptozę indukowaną przez TRAIL koreluje z apoptoza indukowaną przez przeciwciało anty-DR5, co wskazuje na to, że komórki maziówkowe przede wszystkim używają DR5 do wyzwalania apoptozy TRAIL.

Jak opisano dla komórek złośliwych, podatność na apoptozę indukowaną przez TRAIL lub przeciwciało anty-DR5 różniła się pomiędzy komórkami maziówkowymi RA pomimo wyrażania DR5 na podobnych poziomach. RA-512 i RA-707 były najbardziej podatne, jako że ponad 80% komórek było zabijanych przy stężaniu TRAIL lub TRA-8 poniżej 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 i 1RA929 były wśród tych ze średnią podatnością na TRAIL lub TRA-8 z prawie 100% śmiercią komórek w obecności wysokich stężeń (> 50 ng/ml) TRAIL lub TRA-8. Dla komórek RA-1016 i RA1021, chociaż większość (ponad 60%) komórek było zabijanych przez niskie dawki TRAIL lub TRA-8, część

PL 211 733 B1 komórek przeżywało w obecności wysokich dawek TRAIL lub TRA-8, co wskazywało, że subpopulacja komórek była odporna na apoptozę za pośrednictwem TRAIL. W przeciwieństwie do tego, wszystkie komórki były o wiele mniej podatne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i TRA-8. Nie więcej niż 60% komórek było zabijanych w przypadku 0A52F i 0A69F nawet w obecności wysokiego stężenia TRAIL lub TRA-8. Komórki OA72M były całkowicie odporne na apoptozę indukowaną przez TRAIL lub TRA-8. Komórki maziówkowe transformowanie SV40 były również podatne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i TRA-8 (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do tego, nie transformowane komórki fibroblastyczne okazały się być odporne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i TRA-8.

Poprzednio wykazano, że do wyzwalania apoptozy DR5 wykorzystuje ścieżkę zależną od FADD/kaspazy 8 (44). W celu określenia zależności apoptozy za pośrednictwem DR5 komórek maziówkowych od kaspazy, komórki RA hodowano z TRAIL i przeciwciałem anty-DR5 w obecności specyficznych inhibitorów kaspaz. Spośród ośmiu badanych inhibitorów kaspaz, inhibitory kaspazy 6, 8 i 10 były zdolne do hamowania apoptozy komórek maziówkowych RA indukowanej zarówno przez TRAIL, jak i DR5, jak pokazano na fig. 9, co wskazuje, że te trzy kaspazy są zaangażowane w apoptozę za pośrednictwem DR5.

10.3 TRA-8 lub TRAIL indukuje aktywację NF-Kb w komórkach maziówkowych RA bez podwyższonego uwalniania MMP

Istnieje ważny dowód potwierdzający koncepcję, że istnieją bliskie powiązania pomiędzy sygnalizacją apoptozy a sygnalizacją proliferacji (45). Wykazano, że DR5 obok transdukcji sygnału apoptotycznego jest zdolny do aktywacji ścieżki NF-Kb oraz że aktywacja NF-Kb może być zdolna do transdukcji sygnału przeciwapoptotycznego. Przeprowadzono zatem test typu opóźnienia migracji w żelu. Komórki stymulowano 50 ng/ml rekombinowanego rozpuszczalnego TRAIL, ligandem Fas w obecności 1 mg/ml wzmacniacza lub 50 ng/ml TRA-8 przez określony czas. Przygotowywano ekstrakty jądrowe i inkubowano z podwójnie zabarwioną sondą DNA-oligonukleotydową wyznakowaną 32

[³²P]. Wyniki analizowano stosując urządzenie cyclone phosphaimager (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). Po inkubacji komórek maziówkowych FA z TNF-α lub TRAIL, NF-Kb był aktywowany w sposób zależny od czasu. Przeciwciało TRA-8 było zdolne do silnej aktywacji NF-Kb. W przeciwieństwie do tego, ligand Fas nie był zdolny do indukcj i aktywacji NF-Kb, jak pokazano na fig. 10a.

Tak więc, jakkolwiek TRAIL i przeciwciało TRA-8 indukowały silną odpowiedź apoptotyczną w komórkach maziówkowych RA, aktywowały również NF-Kb, a aktywację NF-Kb uważano za przyczyniającą się do prozapalnego działania TNF-α w RA. Zatem możliwe jest, że TRAIL, podobnie jak TNF-α, może działać jako cytokina prozapalna. W celu zbadania, czy istnieje podobne następstwo biologiczne aktywacji NF-Kb indukowanej przez TRAIL i TNF-α, określono wytwarzanie MMP stosując ELISA. Komórki maziówkowe hodowano w czystej pożywce lub z dodatkiem 50 ng/ml interleukiny 1b, 10 ng/ml TNF-α, 50 ng/ml TRAIL, 50 ng/ml TRA-8 przez noc. Poziomy MMP-1 i MMP-3 w supernatantach hodowli określano stosując zestawy ELISA.

Kiedy komórki maziówkowe inkubowano z prozapalna cytokiną, TNF-α lub IL-1b, wytwarzanie MMP-1, 3 i 13 było podwyższone w porównaniu z pożywką kontrolną, jak pokazano na fig. 10b, c. W przeciwieństwie do tego traktowanie TRAIL lub przeciwciałem anty-DR5 nie było związane z podwyższonym uwalnianiem tych MMP.

P r z y k ł a d 11A. Niepowodzenie przy indukcji toksyczności hepatocytowej

Do 24 godzinnych testów żywotności komórek, świeże, zdrowe ludzkie hepatocyty na 96-studzienkowych płytkach zakupiono od In Vitro Technology (Baltimore, MD). Hepatocyty hodowano w pożywce do hodowli hepatocytów Hepatocyte Culture Medium zawierającej 1 μg/ml rozpuszczalnego TRAIL i TRA-8. Do 6 godzinnych testów żywotności, zdrowe hepatocyty lub nowotworowe komórki hepatocytowe izolowano ze świeżych próbek otrzymanych z UAB Tissue Procurement Center. Wszystkie odczynniki do izolacji ludzkich hepatocytów, włączając w to bufor do perfuzji hepatocytów, pożywkę do trawienia, pożywkę do płukania oraz pożywkę do przyklejania, zakupiono od Gibco. Skrawki tkanki trawiono w pożywce do trawienia hepatocytów Hepatocyte Digest Medium w 37°C z wytrząsaniem (50 obr. na min.) przez godzinę. Wyizolowane hepatocyty zbierano przez wirowanie z małą prędkością (50 g, 3 min.) i przepłukiwano sześciokrotnie w pożywce do płukania hepatocytów Hepatocyte Washing Medium. Zawiesinę pojedynczych komórek hepatocytów hodowano w pożywce do przyklejania Attachement Medium zawierającej 10% FCS w 96-studzienkowych płytkach Matrigel przez 6 godzin. Nie przyklejone hepatocyty usuwano poprzez dwukrotne płukanie podgrzaną pożywką

PL 211 733 B1 do przyklejania. Przyklejone hepatocyty inkubowano następnie z różnymi stężeniami rozpuszczalnego TRAIL lub FasL w obecności odczynnika do wiązania krzyżowego lub TRA-8 lub CH11 przez 6 godzin.

TRAIL ma przynajmniej dwa receptory (DR4 i DR5), które są zdolne do indukcji apoptozy. TRA-8 używano do określenia czy wyłącznie DR5 przez wiązanie krzyżowe jest wystarczające do indukcji apoptozy zdrowych hepatocytów. Ekspresję DR5 na poziomie białka badano początkowo w pięciu zdrowych ludzkich tkankach wątroby i w pięciu nowotworowych tkankach wątroby, stosując immunocytochemię in situ używając TRA-8. Skrawki zdrowych tkanek wątroby wykazywały normalną budowę i morfologię komórkową przy barwieniu H & E (fig. 11a, lewa górna część) z jednoczesnym brakiem pozytywnej reaktywności z TRA-8 dla DR5 (fig. 11a, lewa dolna część). W przeciwieństwie do tego, ludzka nowotworowa tkanka hepatocytowa reagowała pozytywnie z TRA-8 wykazując wzór zgodny z obecnością DR5 w błonie komórkowej i cytoplazmie nowotworowych komórek. Ludzka nowotworowa hepatocytowa linia komórkowa HepG2 była również dodatnia pod względem DR5. Wyniki te były zgodne dla pięciu zdrowych tkanek wątroby i tylko jedna (gruczolak wątroby) z pięciu tkanek nowotworowych wątroby była negatywna pod względem DR5. Wyniki te były zgodne z danymi pochodzącymi z analizy Western, przedstawionymi na fig. 5a, które pokazują, że podobnie jak inne zdrowe tkanki, zdrowa ludzka tkanka wątroby nie wyraża znaczących poziomów białka DR5. Dodatkowo, analiza Western izolowanych zdrowych ludzkich hepatocytów inkubowanych z TRA-8 nie wykazała DR5 na wykrywalnych poziomach.

Analiza cytometrią przepływową ekspresji DR5 na powierzchni komórki ludzkich hepatocytów wykazała, że świeżo przygotowane zdrowe hepatocyty nie wyrażają DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych poziomach (fig. 11b, górne lewe części). DR5 nie było wykrywane na zdrowych ludzkich hepatocytach, które były zamrażane w obecności czynnika krioochronnego lub umieszczane w hodowli krótkoterminowej. W przeciwieństwie do tego, świeżo izolowane nowotworowe komórki hepatocytowe, jak również komórki HepG2 wyrażały DR5 na powierzchni komórki. Używając Fas dla porównania, zdrowe hepatocyty, nowotworowe komórki hepatocytowe i komórki HepG2 wyrażały odpowiednie poziomy Fas (fig. 11b, dolne części). Wyniki te są zgodne z wynikami otrzymanymi przy zastosowaniu immunohistochemii in situ oraz analizy Western i wykazują, że DR5 na powierzchni komórki jest wyrażany na wysokich poziomach w nowotworowych komórkach wątroby i nie jest wyrażany w zdrowych hepatocytach. Obecność mRNA dla DR4, DR5, DcR1 i DcR2 w ludzkich hepatocytach, wykaza23 na przez RT-PCR²³ sugeruje, że ludzkie hepatocyty mogą wyrażać białko DR5 na bardzo niskich poziomach, będących poniżej poziomu detekcji przez TRA-8.

W celu określenia, czy TRA-8 indukuje toksyczność hepatocytów, badano podatność zdrowych ludzkich hepatocytów na apoptozę wywołaną TRA-8 i rozpuszczalnym TRAIL z odczynnikiem do wiązania krzyżowego. Gdy zdrowe hepatocyty hodowano w obecności dużego stężenia TRAIL, obserwowano zależne od czasu obniżenie żywotności komórek w testach ATPLite (fig. 12 a) i MTT. Śmierć komórkowa za pośrednictwem TRAIL zdrowych hepatocytów była obserwowana zaledwie po 24 godzinach hodowli, ponad 80% hepatocytów było zabijanych przez TRAIL. W przeciwieństwie do tego, podczas tego samego czasu hodowli, TRA-8 nie wywoływało znaczącej śmierci komórkowej zdrowych hepatocytów. Występowanie skondensowanych jąder barwionych Hoechst, charakterystycznych przy apoptozie, było zwiększone w hepatocytach traktowanych TRAIL, ale nie w traktowanych TRA-8 (fig. 12b). Liczba apoptotycznych hepatocytów dobrze korelowała z obniżoną żywotnością komórek określoną w teście ATPLite, co sugeruje, że śmierć komórkowa hepatocytów indukowana TtmiL zachodzi przez apoptozę. Potwierdzono to przez zdolność Z-VAD do hamowania toksyczności hepatocytów za pośrednictwem TRAIL. Ponieważ cykloheksymid jest silnym wzmacniaczem apoptozy, badano wpływ tego związku na hepatocyty traktowane TRAIL i TRA-8. Podczas czterogodzinnej hodowli cykloheksymid znacząco podnosił śmierć komórkową hepatocytów indukowaną przez TRAIL, z ponad 70% zabijaniem hepatocytów przez TRAIL w obecności cykloheksymidu (fig. 12c). Jednakże, traktowanie cykloheksymidem nie było zdolne do podniesienia śmierci komórkowej za pośrednictwem TlRA-8 w hepatocytach. W celu porównania właściwości apoptozy indukowanej przez TRA-8 z indukowaną przez TRAIL w hepatocytach, zdrowe hepatocyty jak również komórki nowotworowe inkubowano z różnymi stężeniami rozpuszczalnego TRAIL z odczynnikiem do wiązania krzyżowego lub TRA-8. Podczas sześciogodzinnego okresu hodowli, TRAIL wywoływał słabą odpowiedź apoptotyczną w zdrowych hepatocytach. Ponad 20% hapatocytów było zabijanych w obecności 500 ng/ml TRAIL (fig. 12d, górna lewa część). Traktowanie zdrowych hepatocytów TRA-8 nie wywoływało znaczącej śmierci komórkowej przez ten sam okres. W przeciwieństwie do tego do zdrowych komórek hepatocytów, pierwotne nowotworowe komórki hepatocytowe (fig. 12d, górna środkowa część) oraz komórki

PL 211 733 B1

HepG2 (fig. 12d, górna prawa część) były wysoce podatne na apoptozę za pośrednictwem zarówno TRAIL, jak i TRA-8. Ponad 80% nowotworowych komórek hepatocytowych i prawie 100% komórek HepG2 było zabijanych podczas 8-godzinnego okresu hodowli. Wyniki te wykazują, że zdrowe hepatocyty są zupełnie odporne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 i są dużo mniej podatne na apoptozę za pośrednictwem TRAIL niż nowotworowe komórki wątroby. Stosując ligand Fas i przeciwciało anty-Fas (CH-11), nie zaobserwowano znaczącej różnicy w podatności na apoptozę za pośrednictwem Fas wśród zdrowych hepatocytów, nowotworowych komórek hepatocytowych i komórek HepG2 (fig. 12d, dolne części).

P o r ó w n a w c z y p r z y k ł a d 11B. Indukcja zapalenia wątroby in vivo przez ludzki TRAIL związany z błoną

8-10-tygodniowe samice myszy B6 szczepiono dożylnie 10⁹ pfu Ad/hTRAIL i równą liczbą Ad/Tet-on. Myszom podawano różne stężenia tetracykliny w wodzie pitnej tuż po podaniu wektorów adenowirusowych. Uszkodzenie wątroby określano przez poziomy AST w surowicy, stosując zestaw diagnostyczny AST (Sigma). Ekspresję TRAIL określano przez analizę Northern.

W celu określenia, czy forma TRAIL związana z błoną indukuje uszkodzenie wątroby in vivo, skonstruowano rekombinowany wektor adenowirusowy kodujący ludzki TRAIL (Ad/hTRAIL) pełnej długości, którego ekspresja jest pod kontrolą promotora indukowanego tetracykliną. Po 24 godzinach od dożylnego podania Ad/hTRAIL myszom B6, obserwowano indukowaną tetracykliną ekspresję ludzkiego TRAIL w wątrobie w sposób zależny od dawki, jak określono w analizie Northern (fig. 13a). Poziomy ekspresji TRAIL dobrze korelowały z uszkodzeniem wątroby jak pokazano przez zależne od tetracykliny podwyższenie poziomu transaminaz w surowicy, ponownie w sposób zależny od dawki (fig. 13b). Ponieważ samo podanie wektora adenowirusowego może podnieść podatność hepatocytów na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, izolowano hepatocyty z myszy, którym podano Ad/TRAIL i badano śmierć komórkowa za pośrednictwem TRAIL.

Nie wykazano istotnego podwyższenia śmierci komórkowej hepatocytów infekowanych Ad/TRAIL w porównaniu z hepatocytami z myszy kontrolnych (fig. 13c, lewa część). Dodatkowo, myszy, którym podano Ad/TRAIL nie wykazywały podwyższonego uszkodzenia wątroby po wszczepieniu dożylnym ludzkiego rozpuszczalnego TRAIL. Zatem znaczy to, że zapalanie wątroby indukowane przez Ad/TRAIL jest za pośrednictwem ekspresji TRAIL w jego błonowej formie na wysokich poziomach. Analiza histologiczna skrawków wątroby wykazała, że zniszczenie hapatocytów jest widoczne zaledwie w 24 godziny po podaniu wektora (fig. 13d) i pozostaje przez przynajmniej 7 dni (fig. 13e). Te zmiany morfologiczne w wątrobie były również zależne od tetracykliny i pojawiały się w sposób zależny od dawki. Wczesna faza, w ciągu 24 godzin traktowania, uszkodzenia wątroby indukowanego TRAIL cechuje się ogniskami nekrozy.

Naciekanie komórkami zapalnymi nie było obserwowane na tym etapie, lecz nastąpił krwotok. Do 7 dnia po podaniu, widoczne było rozproszone zapalenie wątroby z zaznaczonym nieładem płacikowym, poważną degeneracją hepatocytów z nieregularnie zlepioną cytoplazmą oraz dużymi przezroczystymi przestrzeniami oraz wyraźną apoptozą i nekrozą. Obszerny naciek jednojądrowych komórek był charakterystyczną cechą na tym etapie. Wyniki te wskazują, że ludzki TRAIL w swojej formie związanej z błoną jest zdolny do indukcji uszkodzenia wątroby in vivo.

Pomimo skłonności ludzkiego TRAIL do wywoływania ciężkiego zapalenia wątroby u myszy, nie indukował on odpowiedzi śmiertelnej. W przeciwieństwie do tego, myszy, którym podano podobne kontrolowane tetracykliną wektory kodujące ligand Fas rozwinęły gwałtowne zapalenie wątroby z ogromną apoptozą i nekrozą hepatocytów, połączone z ciężkim krwotokiem oraz umieralnością zależną od dawki tertacykliny w ciągu 72 godzin od podania. Umieralność ogólna osiągała 100% w ciągu 48 godzin w tych podgrupach, które otrzymywały 3 lub więcej mg/ml tetracykliny. W przeciwieństwie do tego, wszystkie myszy, które otrzymały Ad/hTRAIL, bez względu na dawkę tetracykliny, były żywe po czterech tygodniach po podaniu. Zatem znaczy to, że in vivo forma TRAIL związana z błonami jest słabszym induktorem uszkodzenia hepatocytów niż ligand Fas. To dodatkowo sugeruje, że TRAIL może indukować uszkodzenie wątroby poprzez mechanizm, który różni się od mechanizmu będącego podłożem toksyczności ligandu Fas.

P r z y k ł a d 12. Aktywowane komórki T i B wyrażają podwyższone poziomy DR5

W celu określenia, czy DR5 odgrywa rolę w apoptozie za pośrednictwem TRAIL aktywowanych komórek B i komórek T, badano powierzchniową ekspresję DR5 na komórkach T i B w stanie spoczynku i aktywowanych używając TRA-8. Nie stymulowane ludzkie komórki T w PBMC nie wyrażały

DR5 na znaczących poziomach (fig. 14). 48 godzin po stymulacji zarówno anty-CD3, jak i Con-A, eksPL 211 733 B1 presja DR5 na powierzchni komórki była znacznie podniesiona. Podobnie, nie stymulowane komórki B wyrażały DR5 na bardzo niskich poziomach. Stymulacja anty-T, ale nie LPS powodowała podwyższoną ekspresję DR5 na powierzchni komórki. Wyniki te wskazują, że zarówno aktywowane komórki T, jak i B wyrażają DR5 na powierzchni komórki na wysokich poziomach. Komórki barwiono 20 μg/ml TRA-8 i anty-mysimi IgGl PE.

P r z y k ł a d 13. Aktywowane komórki T i B stają się podatne na apoptozę za pośrednictwem

TRA-8

W celu zbadania, czy aktywowane komórki T i B są podatne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8, komórki T i B ludzkiego PBMC stymulowano odpowiednio anty-CD3 lub anty-T in vitro przez 48 godzin. Żywotne komórki i proliferujące komórki blastyczne zbierano przez gradientowe wirowanie i inkubowano w różnych stężeniach TRA-8. Nie stymulowane komórki T i B nie były podatne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 (fig. 15).

Wszystkie stymulowane komórki T i komórki B wykazywały nieco podwyższoną podatność na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 z 20% komórek zabitych przez TRA-8 po nocnej hodowli. Mocno proliferujące komórki blastyczne T były nawet bardziej podatne na apoptozę za pośrednictwem TRA. Ponad 70% komórek blastycznych T było zabijanych przez TRA-8.

Komórki blastyczne B były również bardziej podatne na apoptozę za pośrednictwem TRA w porównaniu do innych. Wyniki te wskazują, ze aktywowane komórki T i B są podatne na apoptozę za pośrednictwem DR5.

P r z y k ł a d 14. TRA-8 usuwa aktywowane komórki T u człowieka/myszy SCID

W celu zbadania skuteczności anty-komórki T in vitro dla TRA-8, myszy NOD/SCID szczepiono dożylnie 1 x 10⁸ ludzkich PBMC. Zwykle, ludzkie komórki T w myszach SCID są szybko aktywowane w odpowiedzi na stymulację ksenogeniczną. Ludzkie PBMC/myszy SCID szczepiono dootrzewnowe 100 μg TRA-8 lub kontrolnymi IgGl począwszy od dnia transferu i powtarzano codziennie przez trzy dni. Po pięciu dniach po transferze jednojądrowe komórki izolowano ze śledziony i barwiono przeciwciałem anty-ludzki CD3 i bramkowano populację limfocytów stosując cytometrię przepływową i analizowano ludzkie komórki T dodatnie pod względem CD3.

Około 30% limfocytów śledziony było ludzkimi komórkami T, jak wykazano przez barwienie anty-ludzki CD3 u traktowanych myszy kontrolnych. Jednakże tylko kilka ludzkich komórek T (mniej niż 3%) obserwowano wśród limfocytów śledziony u myszy traktowanych TRA-8 (fig. 16). Badania histologiczne in situ wykazały, że w śledzionie myszy kontrolnych ludzkie komórki T namnażają się w śledzionie, z jedynie kilkoma komórkami apoptotycznymi obserwowanymi poprzez barwienie TUNEL. W przeciwieństwie do tego, nie obserwowano ponownego zasiedlania żywych ludzkich komórek T w śledzionie myszy traktowanych TRA-8, obserwując za to wiele komórek apoptotycznych (fig. 17). Wyniki te pokazują, że TRA-8 aktywność anty-komórki T in vivo i wskazują użyteczność przeciwciał według wynalazku do leczenia choroby GVH.

P r z y k ł a d 15. Przeciwnowotworowa lecznicza aktywność TRA-8

15.1 Ekspresja i funkcja DR5 w ludzkich tkankach nowotworowych

i) Badanie ekspresji DR5 w ludzkich tkankach nowotworowych poprzez barwienie TRA-8 in situ W celu określenia, czy komórki i tkanki nowotworowe w zróżnicowany sposób wyrażają DR5 na podwyższonych poziomach, zestaw ludzkich tkanek nowotworowych włączając w to 20 raków sutka, 6 raków jajników, 5 raków okrężnicy i 5 raków prostaty barwiono TPA-8 do analizy immunocytochemicznej.

Większość z tych tkanek nowotworowych wyrażała DR5 na wykrywalnych poziomach. Poziomy ekspresji DR5 w tych tkankach nowotworowych różniły się. Ogólnie, tkanki nowotworowe wyrażały wyższe poziomy DR5 niż tkanki z tym niezwiązane. Dodatkowo, ekspresja DR5 w oczywisty sposób nie korelowała z mutacją p53.

ii) Ekspresja i funkcja DR5 w ludzkich liniach komórek nowotworowych (tabela 2)

Dziewięć ludzkich linii komórek raka sutka, trzy linie raka jajnika, trzy linie raka okrężnicy, trzy linie raka prostaty badano pod kątem ekspresji DR5 na powierzchni komórki i podatności na apoptozę indukowaną przez TRA-8 in vitro. 7 z 9 linii raka sutka, 3 z 3 linii raka jajnika, 3 z 3 linii raka okrężnicy i 3 z 3 linii raka prostaty wyrażały DR5 na powierzchni komórki na zróżnicowanych poziomach. Z 9 linii raka sutka, trzy były bardzo podatne, trzy średnio i trzy były odporne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8. Wszystkie trzy linie raka jajnika były bardzo podatne. Jedna z trzech linii raka okrężnicy była bardzo podatna, podczas gdy dwie miały średnią wrażliwość. Dwie z trzech linii raka prostaty miały średnią wrażliwość i jedna była odporna.

PL 211 733 B1

T a b e l a 2

Ekspresja i funkcja DR5 w ludzkich liniach komórek nowotworowych

Linia komórkowa	Pochodzenie	Ekspresja¹	Podatność²
2LMP	sutek	+	++++
LCC6	sutek	+++	++ + +
MB468	sutek	+++	+++
MB231	sutek	++	+++
ZR-75-1	sutek	+++	++
SKBR3	sutek	+	+ +
MB453	sutek	++	+
BT474	sutek	+	-
DY36T2	sutek	-	-
Caov-3	jajnik	-	++++
OVCAR-3	jajnik	++	+ +++
Skov-3	jajnik	+	+++
WiDR	okrężnica	++ +	++++
HST29	okrężnica	++	+++
T84	okrężnica	+	++
PC3	prostata	+++	++
LnCap	prostata	+++	+
Du-145	prostata	++ +	+

Należy zauważyć:

¹ wyznaczone cytometrią przepływową, komórki barwiono 20 μg/ml TRA-8 i porównywano do przeciwciała kontrolnego ² wyznaczone w teście ATPLite ++++: ponad 80% zabijanie +++: zabijanie pomiędzy 60-80% ++: zabijanie pomiędzy 40-60% +: zabijanie pomiędzy 20-40%

-: brak zabijania iii) Łączna cytotoksyczność TRA-8 i adriamycyny

W kilku liniach raka sutka, badano wpływ adriamycyny na apoptozę indukowaną TRA-8. Duże dawki adriamycyny wykazywały dodatkowy wpływ. Jednakże, w niektórych liniach odpornych na TRA-8 małe dawki adriamycyny synergicznie wzmacniały apoptozę indukowaną przez TRA-8.

iv) Aktywność wiązania się TRA-8 do ludzkich komórek nowotworowych in vitro i in vivo

Stosowano TRA-8 wyznakowane radioizotopem. Wiązanie się TRA-8 do linii raka sutka badano in vitro i in vivo w myszach SCID, którym wszczepiano nowotwór. Aktywność wiązania in vitro do komórek nowotworowych oszacowano jako Kd o wartości 3 nM, co jest zgodne z wcześniejszym oszacowaniem przy zastosowaniu ELISA i przynajmniej 50 razy wyższe niż dla rozpuszczalnego TRAIL. In vivo, TRA-8 lokalizowało się we wszczepionej tkance nowotworowej.

15. 2. Terapia z użyciem TRA-8 przewlekłej białaczki limfolitycznej u myszy NOD/SCID.

Przewlekła białaczka limfolityczna (CLL) jest częstą formą nowotworu komórek B. Większość komórek B o charakterze nowotworowym w CLL ma dojrzały fenotyp i jest odporna na wiele aktywatorów apoptozy. Badano ekspresję i funkcję DR5 w komórkach B pięciu pacjentów z CLL. Wszyscy pacjenci mieli wysokie ilości obwodowych komórek B, jak wykazano większym niż 95% udziałem komórek B CD19+ w PBMC. W porównaniu ze zdrowymi pierwotnymi komórkami B, komórki B z CLL wszystkich pacjentów miały wyższe poziomy DR5 na powierzchni komórki i były bardziej podatne na apoptozę indukowaną TRA-8 in vitro. Co ciekawe, komórki B z CLL były również wrażliwe na cytotokstczność wywołaną bisindolemaleimidem VIII (Bis VIII). Po łącznym traktowaniu TRA-8 i Bis VIII,

PL 211 733 B1 prawie 50% komórek B z CLL było zabijanych, podczas gdy zdrowe komórki B pozostawały niewrażliwe (fig. 18). Przeniesienie komórek B z CLL do myszy NOD/SCID prowadziło do około 25%-30% ponownego zasiedlania komórek B CD19+ w śledzionie myszy biorców pięć dni po transferze. Jednakże traktowanie trzema dawkami 100 μg TRA-8 zupełnie wyeliminowało komórki B z CLL czterech z pięciu pacjentów ze śledziony myszy SCID biorców. Zatem, TRA-8, pojedynczo lub w obecności innych substancji, jest aktywnym czynnikiem terapeutycznym w przewlekłej białaczce limfolitycznej.

P r z y k ł a d 16. Klonowanie cDNA (1) Ustalenie N-końcowych sekwencji aminokwasowych lekkich i ciężkich łańcuchów TRA-8

W celu otrzymania cDNA lekkich i ciężkich łańcuchów TRA-8, N-końcowe sekwencje aminokwasowe lekkich i ciężkich łańcuchów TlRA-8 i sklonowanych genów TRA-8 ustalono przy zastosowaniu znanych technik.

Dziesięć μg roztworu zawierającego przeciwciało anty-ludzkie DR5, TRA-8, poddaje się elektroforezie w żelu SDS-poliakryloamid („SDS-PAGE”), stosując stężenie żelu 12% wag./obj., stałe napięcie 100 V, przez 120 minut. Po elektroforezie, żel zanurza się w buforze do transferu 25 mM Tris-HCl (pH 9,5), 20% metanol, 0,02% obj./obj. SDS na 5 minut. Po tym czasie, zawartość białkową żelu przenosi się na błonę poliwinylidenodifluorkową („błona PVDF”; rozmiar porów 0,45 μm; Millipore, Japonia) namoczoną uprzednio w buforze do transferu, przy użyciu urządzenia do transferu (KS-8451; Marysol) w warunkach stałego napięcia 10 V, 4°C, przez 14 godzin.

Po tym czasie, błonę PVDF przemywa się buforem do płukania 25 mM NaCl, 10 mM buforowany boran sodowy (pH 8,0), a następnie barwi się w roztworze do barwienia (50% obj./obj. metanol, 20% obj./obj. kwas octowy i 0,05% wag./obj. Coomassie Brilliant Blue) przez 5 minut w celu zlokalizowania prążków białkowych. Błonę PVDF odbarwia się następnie 90% obj./obj. wodnym roztworem metanolu i prążek odpowiadający łańcuchowi ciężkiemu, prążek o niższej ruchliwości i łańcuchowi lekkiemu, prążek o wyższej ruchliwości, zlokalizowane uprzednio na błonie PDVF wycina się i przemywa wodą dejonizowaną.

N-końcową sekwencję aminokwasową łańcuchów ciężkich i lekkich ustala się przy zastosowaniu zautomatyzowanej metody Edmana (Edman, P. i wsp., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) używając sekwenatora białkowego w fazie gazowej (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

N-końcową sekwencję aminokwasową prążka odpowiadającego łańcuchowi ciężkiemu ustalono jako: Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SEK NR ID: 4 z listy sekwencji); a prążka odpowiadającego łańcuchowi lekkiemu ustalono jako: Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SEK NR ID: 5 z listy sekwencji).

Porównanie tych sekwencji aminokwasowych z sekwencjami aminokwasowymi z bazy danych przeciwciał sporządzonej przez Kabat i wsp. (Kabat E. A. i wsp., (1991), w “Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II”, U. S. Department of Health and Human Services) wykazało, że łańcuch ciężki (łańcuch γΐ) i łańcuch lekki (łańcuch κ) TRA-8 należą do podtypów 3d i 1, odpowiednio.

(2) Klonowanie cDNA

W oparciu o powyższe wyniki, syntetyzuje się starter oligonukleotydowy, dla którego spodziewa się hybrydyzacji z częściami 5' nie podlegających translacji regionów i skrajnymi odcinkami podlegających translacji regionów 3' genów należących do tych mysich podtypów. Następnie, cDNA kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy TRA-8 klonuje się przy zastosowaniu następującej kombinacji odwrotnej transkrypcji i PCR (RT-PCR):

a) Matryca

Całkowity RNA z hybrydomy TRA-8 (ATCC nr PTA-1428) ekstrahuje się stosując TRIzol Reagent (GIBCO BRL). W reakcji PCR jako matrycę używa się cDNA, który jest otrzymany przy zastosowaniu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Pharmacia Biotech) zgodnie z instrukcją dostarczoną z zestawem.

b) Startery do PCR

Następujące startery oligonukleotydowe syntetyzuje się w reakcji PCR:

5'-cagcactgaa cacggacccc-3' (H5NCS1: SEK NR ID: 6 z listy sekwencji);

5'-aaaggtaatt tattgagaag-3' (H5NCS2: SEK NR ID: 7 z listy sekwencji);

5'-cctcaccatg aacttcgggc-3' (H5SS1: SEK NR ID: 8 z listy sekwencji);

5'-ctgttgtatg cacatgagac-3' (H5SS2: SEK NR ID: 9 z listy sekwencji);

5'-gaagtgatgc tggtggagtc-3' (H5CS1: SEK NR ID: 10 z listy sekwencji);

PL 211 733 B1

5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3' (H5CS2: SEK NR ID: 11 z listy sekwencji);

5'-tttaccagga gagtgggaga g-3' (H3CR: SEK NR ID: 12 z listy sekwencji);

5'-tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SEK NR ID: 13 z listy sekwencji);

5'-tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SEK NR ID: 14 z listy sekwencji);

5'-aagacatttt ggattctaac-3' (L5NCS2: SEK NR ID: 15 z listy sekwencji);

5'-tatcatgaag tctttgtatg-3' (L5SS1: SEK NR ID: 16 z listy sekwencji);

5'-gatggagaca cattctcagg-3' (L5SS2: SEK NR :nD: 17 z listy sekwencji);

5'-gacattgtga tgacccagtc-3' (L5CS: SEK NR ID: 18 z listy sekwencji);

5'-ttaacactca ttcctgttga-3' (L3CR: SEK NR ID: 19 z listy sekwencji); oraz

5'-gactgggtca tcacaatgtc-3' (LCSR: SEK NR ID: 20 z listy sekwencji).

Jeżeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie oligonukleotydy w tych przykładach zostały zsyntetyzowane przez Pharmacia Biotech. Wszystkie oligonukleotydy po rozpuszczeniu w wodzie przechowuje się w -20°C.

c) Reakcja PCR

Skład roztworu do reakcji PCR: matryca cDNA, 5 μl z 33 μl całkowitej mieszaniny reakcyjnej, starter 1, 10 pmol; starter 2, 10 pmol; 10 x stężony bufor do PCR (dostarczony w zestawie), 10 pl; dNTP (każdy 2,5 mM), 4 pl; oraz polimeraza Taq (Promega), 5 jednostek.

Do roztworu dodaje się sterylną wodę destylowaną do całkowitej objętości 100 pl. Jeżeli nie zaznaczono inaczej, dNTP to ekwimolarna mieszanina dATP, dCTP, dGTP i dTTP (każdy 2,5 mM).

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 2 minuty, po czym 40 razy powtarza się cykl ogrzewania do 94°C przez 30 sek., 52°C przez 1 minutę i 72°C przez 3 minuty. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 10 minut.

Powielone fragmenty DNA otrzymane w ten sposób rozdziela się w 1% żelu agarozowym zawierającym 0,25 pg/ml bromku etydyny. Prążki, dla których ustalono, że zawierają pożądane fragmenty DNA wycina się przy użyciu skalpela i DNA odzyskuje się z niego przy użyciu zestawu Gene Clean (BIO101). Fragment DNA klonuje się przy użyciu wektora pGEM-T Easy (Promega).

Przeprowadza się to jak następuje.

Fragment DNA odzyskany z roztworu reakcji PCR, razem z 50 ng wektora pGEM-T Easy (dostarczonego w zestawie), miesza się z 1 pl 10 x bufor do reakcji ligacji (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorek magnezowy, 5 mM chlorek sodowy, 7 mM (β-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidyna i 0,1 mg/ml albuminy z surowicy wołowej), do których dodawane są 4 jednostki ligazy DNA T4 (1 pl). Całkowitą objętość mieszaniny doprowadza się do 10 pl sterylną wodą destylowaną, a otrzymany w rezultacie roztwór do ligacji inkubuje się w 14°C przez 15 godzin. Po tym czasie dodaje się 2 pl roztworu do ligacji do 50 pl kompetentnego szczepu JM109 E. coli (dostarczonego w zestawie i doprowadzonego do stanu kompetencji zgodnie z instrukcją), do którego dodano 2 pl 0,5 M β-merkaptoetanolu i otrzymaną mieszaninę trzyma się w lodzie przez 30 minut, a następnie w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 5 minut. Następnie do hodowli dodaje się 500 pl pożywki zawierającej 2% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodowego, 2,5 mM chlorku potasowego, 1 mM chlorku magnezowego i 20 mM glukozy (określanej tu dalej jako pożywka SOC) i mieszaninę inkubuje się przez 1 godzinę w 37°C z wytrząsaniem. Po tym czasie, hodowlę wysiewa się na płytki agarowe z bulionem L (1% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,5% wag./obj. chlorku sodowego, 0,1% wag./obj. glukozy i 0,6% wag./obj. baktoagaru (Difco)), zawierające 100 pg/ml ampicyliny. Selekcjonuje się oporne na ampicylinę kolonie pojawiające się na płytce i zdrapuje platynową ezą i hoduje w pożywce L zawierającej 100 pg/ml ampicyliny w 37°C przez noc, z wytrząsaniem przy 200 obr. na min. Po inkubacji zbiera się poprzez wirowanie komórki, z których otrzymuje się plazmidowy DNA przy użyciu metody lizy alkalicznej. Otrzymany plazmid jest nazwany plazmidem pH62 dla łańcucha ciężkiego TRA-8 lub pL28 dla łańcucha lekkiego TRA-8. Szczepy transformantów E. coli niosące te plazmidy, nazwane E. coli JM109/pH62 i E. coli JM109/pL28 zostały zdeponowane w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia, 2001 r., zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano im numery dostępu FEFM BP-7560 i FERM BP-7561, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe DNA kodujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki TRA-8 są potwierdzone przez sekwencjonowanie metodą dideoksy (Sanger, F. S. i wsp. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

PL 211 733 B1

74: 5463-5467) przy użyciu analizatora DNA 3700 DNA Analyzer PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Sekwencje nukleotydowe łańcuchów ciężkich i lekkich TRA-8 są podane jako SEK NR ID: 21 i NR ID: 22 z listy sekwencji, odpowiednio. Sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich TRA-8 są podane jako SEK NR ID: 23 i NR ID: 24 z listy sekwencji, odpowiednio. N-końcowe sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich TRA-8 ustalone powyżej w pełni pasowały do siebie. Ponadto, kiedy porównywano sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich z bazami danych sekwencji aminokwasowych przeciwciał ustalono, że dla łańcucha ciężkiego nukleotydy od nr 58 do 414 w SEK NR ID: 21 stanowiły region zmienny, podczas gdy nukleotydy od nr 415 do 1392 w SEK NR ID: 21 stanowiły region stały. Dla łańcucha lekkiego nukleotydy od nr 64 do 387 w SEK NR ID: 22 stanowiły region zmienny, podczas gdy nukleotydy od nr 388 do 707 w SEK NR ID: 22 stanowiły region stały. Położenie i sekwencje CDR ustalono również poprzez porównanie homologii z bazami danych. Sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcuchów ciężkich TRA-8 są pokazane w SEK NR ID: 25, NR: 26 i NR: 27, odpowiednio. Sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego TRA-8 są pokazane w SEK NR ID: 28, NR: 29 i NR: 30, odpowiednio.

P r z y k ł a d 17. Projektowanie humanizowanej wersji przeciwciała TRA-8 (1) Modelowanie molekularne regionu zmiennego TRA-8

Modelowanie molekularne regionu zmiennego TRA-8 przeprowadza się przy zastosowaniu metody ogólnie znanej jako modelowanie poprzez homologię (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Pierwszorzędowe sekwencje regionów zmiennych ludzkiej immunoglobuliny zarejestrowane w bazie danych białek Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)), dla których dostępne są trójwymiarowe struktury pochodzące z krystalografii promieniami X porównuje się z ustalonymi powyżej regionami zrębowymi TRA-8. W rezultacie, wybrano 1NCD i 1HIL jako mające największe homologie sekwencji z regionami zrębowymi lekkich i ciężkich łańcuchów TRA-8, odpowiednio. Trójwymiarowe struktury regionów zrębowych wytwarza się poprzez łączenie odpowiednich pozycji 1NCD i 1HIL, które odpowiadają łańcuchom lekkim i ciężkim TRA-8, w celu otrzymania „modelu zrębowego”. Stosując klasyfikację zdefiniowaną przez Chothia i wsp., CDR TRA-8 klasyfikuje się, jak następuje: CDRL1, CDRL2, CDRH1 i CDRH2 należą do kanonicznych klas 2, 1, 1, 3, odpowiednio, podczas gdy CDRL3 nie należą do żadnej konkretnej kanonicznej klasy. Pętle CDR: CDRL1, CDRL2, CDRH1, CDRH2 są związane z konformacjami charakterystycznymi dla ich odpowiednich kanonicznych klas i włączone do modelu zrębowego. CDRL3 przypisuje się konformację zgrupowania 8A, zgodnie z klasyfikacją Thornton i wsp. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)), a CDRH3 jest zaklasyfikowany do k(8)C przy zastosowaniu reguły H3 (FEBS letter 455, 188-197 (1999)). Następnie, reprezentatywne konformacje dla CDRL3 i CDRH3 włącza się do modelu zrębowego.

Na koniec przeprowadza się obliczenia energii w celu wyeliminowania niekorzystnych kontaktów międzyatomowych w celu otrzymania prawdopodobnego modelu cząsteczkowego regionu zmiennego biorąc pod uwagę energię. Powyższą procedurę przeprowadza się przy użyciu dostępnego handlowo systemu modelowania molekularnego ABM (Oxford Molecular Limited, Inc.). Dla otrzymanego modelu molekularnego, dokładność struktury ocenia się następnie przy zastosowaniu oprogramowania PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993), 26, 283-291).

(2) Projektowanie sekwencji aminokwasowych humanizowanych TRA-8

Konstrukcję humanizowanych przeciwciał TRA-8 przeprowadzono przy zastosowaniu metody ogólnie znanej jako wszczepianie CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Przeciwciało akceptorowe wybiera się w oparciu o homologię aminokwasową w regionie zrębowym. Sekwencje regionu zrębowego w TRA-8 porównuje się ze wszystkimi sekwencjami zrębowymi w bazie danych sekwencji aminokwasowych Kabat (Nuc. Acid Fs. 29, 205-206 (2001)). W rezultacie, jako akceptor wybrano przeciwciało mAB58'CL ze względu na najwyższą homologię sekwencji wynoszącą 80% dla regionu zrębowego. Reszty aminokwasowe w regionie zrębowym dla mAb58'CL dopasowuje się z tymi dla TRA-8 i identyfikuje pozycje, gdzie użyte są różne aminokwasy. Położenie tych reszt analizuje się dla trójwymiarowych modeli skonstruowanego powyżej TRA-8 i reszty donorowe, które powinny być wczepione do akceptora wybiera się na podstawie kryteriów podanych przez Queen i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Sekwencje humaLnizowanego TRA-8 konstruuje się jak opisano w następujących przykładach poprzez przeniesienie kilku reszt donorowych do przeciwciała akceptorowego, mAb58'CL.

PL 211 733 B1

P r z y k ł a d 18. Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała (1) Konstrukcja plazmidu niosącego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8

W celu ustalenia aktywności humanizowanego TRA-8, konstruuje się plazmid niosący łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 jak następuje. Jednakże należy zwrócić uwagę, że humanizowanie TRA-8 nie ogranicza się do tych przykładów.

Jak pokazano w SEK NR ID: 31 z listy sekwencji, humanizowanie sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie aminokwasu 13 (lizyna), aminokwasu 19 (lizyna), aminokwasu 40 (treonina), aminokwasu 42 (kwas glutaminowy), aminokwasu 44 (arginina), aminokwasu 84 (seryna), aminokwasu 88 (seryna), aminokwasu 93 (metionina), aminokwasu 114 (treonina), aminokwasu 115 (leucyna), odpowiednio, glutaminą, argininą, alaniną, glicyną, glicyną, asparaginą, alaniną, valiną, leucyną oraz valiną.

Plazmid niosący MA kodujący region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8 (SEK NR ID: 31 z listy sekwencji) konstruuje się jak następuje.

PCR stosuje się do konstrukcji następujących sekwencji DNA, każdej z nich zawierającej co opisano powyżej.

Zsyntetyzowano 12 następujących oligonukleotydów:

5' ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEK NR ID: 32);

5' tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B; SEK NR ID: 33);

5' attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEK NR ID: 34);

5' gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SEK NR ID: 35);

5' tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SEK NR ID: 36);

5'-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEK NR ID: 37);

5'-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3' (G; SEK NR ID: 38);

5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H; SEK NR ID: 39);

5'-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (1; SEK NR ID: 40);

5'-ctctg'gagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3' (J; SEK NR ID: 41);

5'-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEK NR ID: 42); oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SEK NR ID: 43).

Następujące 2 startery do PCR syntetyzuje się jak opisano powyżej:

5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (P1; SEK NR ID: 44); oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgg a-3' (P2; SEK NR ID: 45).

Syntezę DNA kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA wytwarza się jak następuje. Skład roztworu do reakcji PCR:

oligonukleotyd A, 10 pmol;

oligonukleotyd B, 10 pmol;

oligonukleotyd C, 10 pmol;

oligonukleotyd D, 10 pmol;

oligonukleotyd E, 10 pmol;

oligonukleotyd F, 10 pmol;

oligonukleotyd G, 10 pmol;

oligonukleotyd H, 10 pmol;

PL 211 733 B1 oligonukleotyd I, 10 pmol; oligonukleotyd J, 10 pmol; oligonukleotyd K, 10 pmol; oligonukleotyd L, 10 pmol; starter oligonukleotydowy P1,2 μM; starter oligonukleotydowy P2, 2 μM;

x bufor Pyrobest II, 10 pl; dNTP mix, 8 pl;

polimeraza DNA Pyrobest, 0,5 pl; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 50 pl.

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 5 minut, po czym 7 razy powtarza się cykl ogrzewania do 98°C przez 10 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 15 minut.

Równą objętość fenolu-chloroformu (50% obj./obj. fenolu nasyconego wodą, 48% obj./obj. chloroformu, 2% obj./obj. alkoholu izoamylowego) dodaje się do 200 pl każdego z produktów PCR i miesza się intensywnie przez 1 minutę. Po tym czasie, mieszaninę odwirowuje się przy 10000 x g, zbiera warstwę wodną i miesza z równą objętością chloroformu-alkoholu izoamylowego 3% obj./obj. chloroform i 4% obj./obj. alkohol izoamylowy), po czym znowu mocno odwirowuje przy 10000 x g i zbiera górną warstwę. Seria etapów przedstawionych w tym akapicie jest tu dalej określana jako „ekstrakcja fenolowa”.

Następnie, zebraną warstwę wodną dodaje się wytrącaniu etanolem. Stosowane tu określenie „wytrącanie etanolem” obejmuje dodawanie z mieszaniem jednej dziesiątej objętości 3 M octanu sodowego (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu do roztworu, który miał być traktowany i zamrażanie mieszaniny przy użyciu suchego lodu. Otrzymaną w rezultacie mieszaninę odwirowuje się przy 10000 x g w celu odzyskania DNA w postaci osadu.

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA humanizowanego 11-8 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 x g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 pl wody destylowanej.

Otrzymany w rezultacie każdy z wyekstrahowanych DNA klonuje się przy użyciu wektora pGEM-T Easy (Promega), jak następuje.

Fragment DNA odzyskany z reakcji PCR, 5 pl;

x bufor dla polimerazy Taq, 1 pl; mieszanina dNTP, 1 pl;

Polimeraza Taq (5 jednostek/ml), 1 pl; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 10 pl.

Po przeprowadzeniu reakcji w każdym z roztworów w 70°C przez 30 minut, każdy roztwór DNA i wektor pGEM-T Easy poddaje się ligacji przy użyciu zestawu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) stosując protokół producenta.

Po 4 godzinach inkubacji w 15°C, 2 pl inkubowanego roztworu reakcyjnego miesza się ze 100 pl kompetentnego szczepu JM109 E. coli przy gęstości 1-2 x 10⁹ komórek/ml (Takara Shuzo Co Ltd.) i mieszaninę trzyma się w lodzie przez 30 minut, a następnie w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 1 minutę. Następnie, dodaje się 500 pl pożywki SOC (2% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodowego, 2,5 mM chlorku potasowego, 1 mM chlorku magnezowego i 20 mM glukozy) do mieszaniny, którą inkubuje się przez dalszą godzinę z wytrząsaniem. Następnie, izoluje się szczepy transformantów, plazmidowy DNA wytwarza się ze szczepów, jak opisano w „Molecular Cloning A Laboratory Manual”. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F. S. i wsp. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) przy użyciu 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pHB14 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8). Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli

PL 211 733 B1

JM109/pHB14 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FEFM BP-7556.

(2) Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych niosących DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8

Zrekombinowane wektory ekspresyjne dla komórek zwierzęcych konstruuje się poprzez wstawienie DNA kodującego łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 (sklonowanego jak wyżej) jak następuje.

Jeden μg plazmidu pSRHHHS (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0-909-816-A1) niosącego region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała monoklonalnego anty-Fas HFE7A i genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgG1, wektora ekspresyjnego dla komórek ssaczych, trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Apal i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 μg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążki wektorowego DNA zawierające genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgG1 bez regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego HFE7A są wycinane przy użyciu skalpela i wymywane z żelu przy użyciu zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, (CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 x g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 μl wody destylowanej, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany w rezultacie strawiony, defosforylowany plazmid (100 ng) poddaje się następnie ligacji z 1 μg fragmentu DNA pHB14 zawierającego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8, który został również strawiony Hindlll i Apal, przy użyciu zestawu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Mieszaninę ligacyjną używa się następnie do transformacji E. coli JM109, który wysiewa się następnie na płytki agarowe LB zawierające 50 μg/ml ampicyliny.

Otrzymane tą metodą transformanty hoduje się w 2 ml płynnej pożywki LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny w 37°C przez noc i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS.

Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i Apal i poddaje elektroforezie w 3% wag./obj. żelu agarozowym w celu potwierdzenia obecności lub nieobecności wstawki DNA kodującej region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F. S. i wsp. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) przy użyciu analizatora sekwencji Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 jest nazwany pHB 14-1.

P r z y k ł a d 19. Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (1) Konstrukcja wektorów dla łańcuchów lekkich humanizowanych wersji przeciwciała TRA-8

Jak pokazano w SEK NR ID: 46 z listy sekwencji, przy humanizowaniu sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, aminokwas 8 (histydyna), aminokwas 9 (lizyna), aminokwas 10 (fenyloalanina), aminokwas 11 (metionina), aminokwas 13 (treonina), aminokwas 20 (seryna), aminokwas 42 (glutamina), 43 (seryna), aminokwas 60 (kwas asparaginowy), aminokwas 63 (treonina), aminokwas 77 (asparagina), aminokwas 78 (walina), aminokwas 80 (seryna), aminokwas 83 (leucyna), aminokwas 85 (kwas asparaginowy), aminokwas 87 (fenyloalanina) oraz aminokwas 99 (glicyna), aminokwas 103 (leucyna) i aminokwas 108 (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8 są zastępowane, odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, treoniną, tyrozyną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM2.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8, są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM2 (SEK NR ID: 46 z listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5,

TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

PL 211 733 B1

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47) i 7ALCN (SEK NR ID: 48), syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga-3' (HKSPR11; SEK NR

ID: 49);

5'-ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc-3' (HKCDF11; SEK NR ID: 50);

5'-agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg-3' (HKCDR12; SEK NR ID: 51);

5'-tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt -3' (HKCDF22; SEK NR ID: 52);

5'-ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt-3' (HKCDR22; SEK NR ID: 53); oraz

5'-cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg-3' (HKCF12; SEK

NR ID: 54).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/M2-1 (klonowanie łańcuchów lekkich humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM2 zdefiniowany w SEK NR ID: 55 z listy sekwencji, kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 46, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM2-F1 kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRLI z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5' jest wytworzony w następujących warunkach. Plazmidy matrycowe pHSGHM17 i pSRPDHH, są otrzymane zgodnie z opisem w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1. Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pHSGHM17 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1), 25 ng; starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol; starter oligonukleotydowy HKSPR11, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pl;

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 pl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM2-F2 kodujący część FRL1, CDRL1, FRL2 i CDRL2 jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pL28, 25 ng; starter oligonukleotydowy HKCDF11, 50 pmol; starter oligonukleotydowy HKCDR12, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pl;

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Fragment DNA LM2-F3 kodujący CDRL2, FRL3 i część CDRL3 jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 Al1, 25 ng; starter oligonukleotydowy HKCDF22, 50 pmol; starter oligonukleotydowy HKCDR22, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pl;

bufor do PCR 10 x, 5 pl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

PL 211 733 B1

Fragment DNA LM2-F4 kodujący CDRL3, FRL4 i region stały z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pSRPDHH, 25 ng; starter oligonukleotydowy HKCF12, 50 pmol; starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pl;

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Powielone fragmenty DRA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

DNA LM2, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM2-F1, LM2-F2, LM2-F3 i LM2-F4 są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM2-F1 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM2-F2 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM2-F3 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA M2-F4 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol, starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol, mieszanina dNTP, 5,0 pl, bufor do PCR 10 x, 5,0 pl, polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Tak wytworzony fragment LM2-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego TRA-8. TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F. S. i wsp. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/M2-1 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/M2-1 zawierający fragment EA LM2 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM2, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 pg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 pg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI,

PL 211 733 B1 a następnie klon niosący fragment DNA LM2 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/M2-1-4 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/M2-1-4 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7563.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/M2-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM2 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M2-1-4 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego LM2 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment EA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M2-1-4, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS.

Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DIA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM2 TRA-8 jest nazwany pSR/M2-1.

P r z y k ł a d 20. Wytwarzanie humanizowanego przeciwciała

Transfekcję komórek COS-7, tj. linii komórkowej pochodzącej z małpiej nerki otrzymanymi powyżej plazmidami ekspresyjnymi dla łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8 i łańcucha lekkiego humanizowanego TRA-8 przeprowadza się przy zastosowaniu metod z odczynnikiem do transfekcji FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem.

Komórki COS-7 (American Type Culture Collection Nr CRL-1651) hoduje się do półkonfluencji (3 x 10⁶ komórek/płytkę) w płytkach hodowlanych (powierzchnia hodowli: 57 cm²; Sumitomo Bakelite) zawierających pożywkę Dulbecco's Modified Eagle medium (określaną tu dalej jako „D-MEM”; Gibco BRL) uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (nazywaną tu dalej w skrócie jako „FCS”; Moregate).

W międzyczasie, miesza się 10 pg/płytkę (w sumie 5 płytek) DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 (pHA15-1) i 10 pg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5 otrzymanych metodą lizy alkalicznej-SDS i wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu, a następnie wytrąca etanolem, po czym zawiesza w 5 pl/płytkę dH2O.

Następnie, miesza się 15 pl/płytkę odczynnika FUGENE6 Transfection Regent z 180 pl/płytkę D-MEM bez FCS, ten roztwór FUGENE (185 pl/płytkę) miesza się z 5 pl/płytkę roztworu DNA zawierającego 10 pg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 i 10 pg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej otrzymaną zawiesinę plazmidów (200 pl) dodaje się do przygotowanych wcześniej płytek COS-7.

Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 24 godziny, pożywkę hodowlaną zamienia się na D-MEM bez FCS. Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 72 godzin, zbiera się supernatant z hodowli w celu oczyszczenia produktów ekspresji z płynów supernatantu. Stosując opisaną powyżej metodę, komórki COS-7 transfekuje się każdą z następujących kombinacji plazmidów:

(A) : bez plazmidowego DNA;

(B) : kotransfekcja pHBl4-1 i pSR/M2-1.

Hodowlę zwirowuje się następnie (1000 obr. na min., 5 minut) i zbiera się supernatant. Supernatant odwirowuje się ponownie (9800 obr. na min., 15 minut) i filtruje przy użyciu filtra 0,45 pm (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, # kat. 25CS045 AS). Oczyszczanie IgG z filtratów uzyskuje się

PL 211 733 B1 stosując chromatografię powinowactwa Protein G-POROS (Applied Biosystems) w następujących warunkach:

HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems);

kolumna: ProteinG-ID sensor cartridge (wielkość kolumny: 2,1 mmID x 30 rmn LD, objętość pusta: 0,1 ml; # kat; 2-1002-00, Applied Biosystems);

bufor do wymywania: 0,1 M Glicyna-HCl (pH 2,5); bufor do neutralizacji: 1 M Tris-HCl (pH 8,5); wykrywanie: 280 nm;

tempo przepływu: 1 ml/min.; wielkość frakcji: 0,5 ml/0,5 min.;

probówki do zbierania frakcji: 1,5 ml mikroprobówka polipropylenowa; temperatura: 4°C.

Po nałożeniu wszystkich filtratów na kolumnę, 30 ml PBS (Sigma, # kat: 1000-3) używa się do przemycia kolumny. Po zastosowaniu buforu do przemywania uruchamia się kolektor frakcji. Każda mikroprobówka do zbierania frakcji zawiera już 55 μl 1 M NaCl, 110 μl buforu do neutralizacji i 74 μl bydlęcej albuminy surowiczej 2 mg/ml (Sigma, # kat; A-7030) w PBS. Frakcje od nr 8 do nr 10 zbiera się i dializuje wobec 1 litra PBS (pH 7,5) w 4°C przez 1 dzień stosując Slide-A lyzer (Pierce, # kat; 66450). Bufor do dializy jest zmieniany dwukrotnie. Weryfikację ekspresji humanizowanych przeciwciał i test ilościowy na produkt ekspresji w otrzymanych płynach znad hodowli przeprowadza się poprzez ELISA z przeciwciałem przeciw anty-ludzka IgG.

Do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki (MaxiSorp, Nunc), dodaje się 100 μl koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (appel) rozcieńczonego do stężenia końcowego 0,5 μg/ml w buforze do adsorpcji (0,05 M wodorowęglan sodowy, 0,02% azydek sodowy, pH 9,6) i płytkę inkubuje się w 37°C przez 2 godziny w celu adsorpcji przeciwciała. Następnie, płytkę przemywa się pięciokrotnie 350 μl PBS(-) zawierającym 0,05% Tween-20 (BioRad) (nazywanym tu dalej jako „PBS-T”). Po przemywaniu do studzienek dodaje się supernatant hodowlany rozcieńczony w D-MEM zawierającej 10% FCS i inkubuje się w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, do każdej studzienki dodaje się 100 μΐ wyznakowanego alkaliczną fosfatazą koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (Jackson Immune Research Lab.) rozcieńczonego 10000-krotnie w PBS-T i inkubuje w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, dodaje się roztwór substratu p-nitrofenylofosforanu otrzymanego w zestawie Alkaline Phosphatase Substrate Kit (Bio Rad) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem. Po inkubacji w 37°C przez 0,5 do 1 godziny, mierzy się absorbancję w 405 nm. W niniejszych doświadczeniach, immunoglobulina G podklasy 1 (IgG1) z ludzkiego osocza (Biopure AG) rozcieńczona w D-MEM zawierającej 10% FCS do pewnych stężeń jest stosowana jako próbki odnośnikowe dla stężenia humanizowanych przeciwciał DR5 zawartych w płynach znad hodowli.

W rezultacie ekspresja i oczyszczone produkty w supernatantach hodowlanych są specyficznie wykrywane przeciwciałem anty-ludzka IgG. Ilość ludzkiego przeciwciała IgG wynosi 8,96 μg (800 μ^.

P r z y k ł a d 21. Aktywność indukowania apoptozy przeciwciała humanizowanego

Komórki Jurkat (ATCC nr TIB-152) używa się do badania aktywności indukowania apoptozy oczyszczonego humanizowanego przeciwciała TRA-8.

Komórki Jurkat hodowane w pożywce RPMI1640 z 10% FCS (Gibco BRL) w 37°C przez 3 dni w obecności 5% CO2 umieszcza się w każdej studzience 96-studzienkowej mikropłytki (Sumitomo Bakelite) po 50 μΐ na studzienkę. Humanizowane TRA-8 wytworzone w przykładzie 20 doprowadza się do stężenia 100 ng/ml dla końcowego produktu będącego przedmiotem zainteresowania pożywką RPMI1640 zawierającą 10% FCS poprzez oszacowanie ich stężeń w płynie zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 20. Każdy z roztworów z produktów ekspresji doprowadzony w ten sposób do 100 ng/ml używa się do sporządzenia serii rozcieńczeń poprzez powtarzanie serii 2-krotnych rozcieńczeń RPMI1640 zawierającą 10% FCS.

Każdy z rozcieńczonych roztworów humanizowanego TRA-8 jest dodawany do każdej studzienki w ilości 50 μΐ na studzienkę. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 12 godzin, dodaje się 50 μΐ 25 pM PMS (metosiarczan fenazyny; Sigma Chemical Co.) zawierającego 1 mg/ml XTT (bierna sól 2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolium-5-karboksyanirydu; Sigma Chemical Co.) (końcowe stężenia 250 μg/ml dla XTT i 5 μM dla PMS). Po inkubacji przez 3 godziny, dla każdej studzienki mierzy się absorbancję przy w 450 nm w celu obliczenia żywotności komórek stosując jako wskaźnik zdolność redukcyjną mitochondriów.

PL 211 733 B1

Żywotność komórek w każdej ścieżce oblicza się zgodnie z następującym wzorem:

Żywotność (%) = 100 x (a-b) / (c-b) gdzie „a” jest pomiarem dla studzienki testowej, „b” jest pomiarem dla studzienki bez komórek, a „c” jest pomiarem dla studzienki bez dodanego przeciwciała.

W rezultacie wykazano, że produkt ekspresji wytworzony w przykładzie 20 (humanizowane TRA-8) indukuje apoptozę w komórkach linii komórkowej chłoniaka T wyrażających ludzki antygen DR5.

P r z y k ł a d 22. Reaktywność TRA-8 wobec różnych cząsteczek DR5

W celu określenia reaktywności TRA-8 wobec różnych cząsteczek DR5, bada się reaktywność TRA-8 stosując aktywowane limfocyty jak następuje.

Najpierw pobiera się próbki krwi obwodowej od człowieka (30 ml), małpy marmoset (3 ml) i małpy cynomolgus (20 ml). Próbki krwi mają dodany 1 ml heparyny (Novoheparin; Novo) i próbki nawarstwia się następnie powoli na równą objętość roztworu Ficoll-Paque PLUS ((Amersham Pharmacia Biotech.) ciężar specyficzny: 1,077 dla wszystkich z wyjątkiem małpy cynomolgus, dla której ciężar specyficzny wynosi 1,072) i zwirowuje przy 1700 obr. na min. przez 30 minut w celu otrzymania frakcji komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej. Tą frakcję komórek jednojądrzastych przemywa się dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa, a następnie zawiesza w pożywce RPMI 1640 z 10% obj./obj. FCS tak, aby gęstość komórek wynosiła 1 x 10⁶ komórek/ml. Do otrzymanej zawiesiny dodaje się fitohemaglutyninę-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) do stężenia końcowego 5 μg/ml i próbkę inkubuje się w 37°C pod 5% obj./obj. CO2 przez 24 godzin. Po tym czasie, komórki odzyskuje się poprzez wirowanie, przemywa i zawiesza ponownie w pożywce R141 1640 zawierającej 10% obj./obj. FCS. Następnie, w celu aktywacji odzyskanych komórrk, do zawiesiny dodaje się interleukinę-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) do stężenia końcowego 10 jednostek/ml i inkubuje się to w 37°C pod 5% obj./obj. CO2 przez 72 godziny.

Ilość aktywowanego preparatu wyliczoną tak, aby zawierała 1 x 10⁶ aktywowanych komórek limfocytów, umieszcza się w probówce testowej i zawiesza albo w 50 μl 0,5, 1, 5, 10 μg/ml TRA-8 w PBS albo 50 μl samego PBS. Otrzymaną zawiesinę pozostawia się w lodzie przez 1 godzinę, po czym komórki przemywa się 3 razy porcjami po 500 μl PBS, a następnie zawiesza w 50 μl 20 μg/ml wyznakowanego FITC przeciwciała anty-mysia IgG (Bioresource) w PBS. Stosując komórki zawieszone w 500 μl PBS jako kontrole mierzy się intensywności fluorescencji, przy użyciu cytometru przepływowego (FACSCalibur; Becton Dickinson).

Otrzymuje się rozkład liczby komórek ze względu na intensywność fluorescencji i oblicza się proporcje liczby komórek wybarwionych do całkowitej liczby komórek. Ponadto, oblicza się wartość Kd, stężenie TRA-8 i proporcje liczby komórek wybarwionych do całkowitej liczby komórek. Każda częstość reaktywności aktywowanych limfocytów człowieka, małpy marmoset i małpy cynomologus jest prawie taka sama. A zatem, TRA-8 ma zdolność wiązania się z DR5 z szerokiego zakresu gospodarzy, włączając w to człowieka, wobec którego TRA-8 jest wyjściowo wytworzony.

P r z y k ł a d 23. Badania wzrastającej dawki TRA-8 u małp marmoset

Wstępne badania nad toksycznością wzrastającej dawki TRA-8 przeprowadzono u 1 samicy i 1 samca małpy marmoset. Podano dożylnie zestaw trzech pojedynczych dawek, które były rozdzielone 7-dniowym okresem przerwy w podawaniu. Dawkę TRA-8 ustalono na 50, 250 i 1250 μg/ciało. Czterdzieści osiem godzin po każdym traktowaniu z żyły udowej pobiera się krew i uzyskuje się osocze. Aktywności aminotransferazy asparaginianowej i aminotransferazy alaninowej osocza mierzy się przy użyciu analizatora (FUJI DRI-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ltd.). Wszystkie próbki krwi pobiera się bez jakichkolwiek anestetyków. W rezultacie, nie zanotowano oznak wskazujących na uszkodzenie wątroby przy badaniu biochemicznym osocza po każdym traktowaniu.

P r z y k ł a d 24. Badania farmakologiczne in vitro i in vivo nad działaniem TRA-8 przeciw komórkom nowotworowym

W celu ustalenia, czy TRA-8 ma skuteczność terapeutyczną w terapii antynowotworowej, aktywność zabijania przez TRA-8 in vitro z użyciem różnych linii nowotworowych bada się jak następuje.

₃

Rozmaite komórki nowotworowe (2-8 x 10 komórkek/50 μθ hodowane w pożywce RPMI1640 (dla Jurkat), pożywce DMEM (dla HCT-116), MEM-R (dla WiDr) lub DMEM-F12 (dla COL2-Jck) otrzymane z Gibco BP z 10% FCS (Gibco BRL) w 37°C przez 3 dni w obecności 5% CO2 umieszcza się w każdej studzience 96-studzienkowej mikropłytki (Sumitomo Bakelite) po 50 μl na studzienkę. TRA-8 doprowadza się do stężenia 100 ng/ml dla końcowego produktu będącego przedmiotem zainteresowania pożywką zawierającą 10% FCS. Roztwór TRA-8 (100 ng/ml) używa się do sporządzenia

PL 211 733 B1 serii rozcieńczeń poprzez powtarzanie serii 2-krotnych rozcieńczeń pożywką zawierającą 10% FCS. Każdy z rozcieńczonych roztworów TRA-8 jest dodawany do każdej studzienki w ilości 50 μl na studzienkę i inkubowany w 37°C. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 72 godziny, dodaje się 50 μl 25 μM PMS (metosiarczan fenazyny; Sigma Chemical Co.) zawierającego 1 mg/ml XTT (końcowe stężenia 250 μg/ml dla XTT i 5 μM dla PMS). Po inkubacji przez 3 godziny, dla każdej studzienki mierzy się absorbancję przy w 450 nm w celu obliczenia żywotności komórek, stosując jako wskaźnik zdolność redukcyjną mitochondriów.

Wyniki są pokazane w tabeli 3, poniżej.

T a b e l a 3

Komórki	ED50 ^g/ml)
Jurkat	0,001-0,01
HCT-116	0,004-0,02
WiDr	0,007-0,03
COL2-Jck	2,28

Rozmaite linie komórek nowotworowych wykazują silną indukcję apoptozy przez TRA-8 w warunkach in vitro.

Ponadto, określa się anty-nowotworowy efekt TRA-8 in vivo u nagich myszy, do których przeszczepiono WiDr, ponieważ TRA-8 nie wykazuje reakcji krzyżowej z mysim DR5.

Przeciwciało TRA-8 anty-ludzki DR5 podaje się nagim myszom niosącym ludzkie heteroprzeszczepy, które wyrażają ludzką cząsteczkę DR5. Użytymi myszami były 6-tygodniowe myszy

BALb/c nagie/nagie (samice, z Clea Japan Inc.), którym wszczepiono ludzką linię komórek raka ₃ okrężnicy WiDr (5 mm³). Jeden dzień po przeszczepie guza, myszy z przeszczepem traktowano codziennie poprzez dostawowe wstrzyknięcie TRA-8 (5 μg/ciało) do 14 razy. Wzrost guza WiDr ustalano codziennie na podstawie rozmiarów guza. Wyniki są pokazane w tabeli 4, poniżej.

T a b e l a 4

	8 dni	11 dni	15 dni	18 dni	22 dni	25 dni
Kontrola (PBS)	196	249	469	584	833	1193
SD	± 55	± 77	± 149	± 230	± 274	± 419
TRA-8	158	97	155	195	365	530
SD	± 78	± 30	± 60	± 58	± 91	± 135

W tym modelu, nie traktowane zwierzęta wykazywały widoczny wzrost guza, natomiast wzrost guza u zwierząt traktowanych TRA-8 był hamowany, co pokazano poprzez rozmiar guza. Wynik ten wskazuje, że TRA-8 jest skuteczny w usuwaniu komórek nowotworowych in vivo.

P r z y k ł a d 25. Badania podawania łącznego dla TRA-8

Ludzka linia komórek raka prostaty PC-3 jest otrzymana z kolekcji American Tissue Culture Collection (ATCC) i utrzymywana w pożywce F-12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS, Hyclone), 1% L-glutamina-200 mM (25030-149, Gibco BRL) i 0,5% roztwór Penicillin Streptomycin Solution (P-7539, Sigma). Pożywka RPMI1640 (MED-008, IWAKI) uzupełniona 10% FT i 05% roztworem Penicillin Streptomycin Solution jest używana w następującym doświadczeniu. Rosnące wykładniczo komórki PC-3 zbiera się poprzez trypsynizację i przemywa dwukrotnie świeżą pożywką. Komórki następnie liczy się, zawiesza ponownie w świeżej pożywce przy gęstości 5 x 10⁴ komórek/ml i umieszcza w trzech powtórzeniach w 96-studzienkowych płytkach (3598, Corning-Coster) w całkowitej objętości 100 μl/studzienkę na dzień przed rozpoczęciem

PL 211 733 B1 doświadczenia. Reprezentatywny lek przeciwnowotworowy, Paclitaxel (169-18611, Wako) rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (10 mg/ml) rozcieńcza się w pożywce, a następnie dodaje do 96-studzienkiowych płytek zawierających komórki w ilości 50 μl/studzienkę. Stężenie końcowe dimetylosulfotlenku wynosi mniej niż 0,1%. Po inkubacji przez 24 godz. w 37°C w atmosferze 5% CO2, do studzienek dodaje się TRA-8 rozcieńczony w świeżej pożywce. Po inkubacji przez dalsze 24 godz., do studzienek dodaje się 50 μl pożywki Minimum Essential Medium (11095-098, Gibco BRL) zawierającej 1 mg/ml XTT i 25 PMS i płytki inkubuje się przez 6 godz. Następnie, mierzy się OD450 przy użyciu SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) i żywotność komórek oblicza się jak następuje.

Żywotność komórek (%) = (OD450 dla studzienki zawierającej komórki traktowane Taxol i/lub (czynnikiem(ami)) TRA-8 - OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek, ani czynnika) x 100 / (OD450 dla studzienki zawierającej komórki bez czynnika - OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek, ani czynnika).

Wynik powyższego testu dla łącznego traktowania TRA-8 z reprezentatywnym lekiem przeciwnowotworowym, Paclitaxelem, jest następujący. Paclitaxel obniżał żywotność komórek PC-3, ale nadal pozostawało ponad 40% sygnału wskazującego na żywe komórki nowotworowe dla stężenia do 200 nM. Watro odnotować, że dodanie 0,1 ng/ml TRA-8 bardzo zmieszało żywotność komórek nowotworowych, aż do 10%, pomimo tego, że nie widać zmniejszenia żywotności komórek przy pojedynczym podawaniu TRA-8 w tym stężeniu. Wynik ten wyraźnie wskazuje, że TRA-8 hamuje synergistycznie aktywność przeciwnowotworowa w połączeniu z innymi lekami przeciwnowotworowymi.

P r z y k ł a d 26. Analiza innych typów humanizowanych przeciwciał TRA-8 (1) Projektowanie humanizowanych przeciwciał

Konstrukcję humanizowanych wersji TRA-8 przeprowadza się przy zastosowaniu metody ogólnie znanej jako wszczepianie CDR. Przeciwciało mAB58'CL używa się jako akceptorowe, jak opisano w przykładzie 2 stanowiącym odniesienie i regiony CDR TRA-8 przeciwciała wszczepia się do akceptora. W regionie zrębowym niektóre aminokwasy są wszczepiane do akceptora na podstawie bądź TRA-8, bądź ludzkich sekwencji największej zgodności według kryteriów podanych przez Queen i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, (1989) i sekwencje humanizowanych TRA-8 konstruuje się jak opisano poniżej.

(2) Konstrukcja plazmidu niosącego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego innych typów humanizowanego albo mysiego TRA-8

Jak pokazano w SEK NR ID: 56 z listy sekwencji, humanizowanie typu H1 sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie 3 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (lizyna), 19 aminokwasu (lizyna), 40 aminokwasu (treonina), 42 aminokwasu (kwas glutaminowy), 44 aminokwasu (arginina), 84 aminokwasu (seryna), 88 aminokwasu (seryna), 93 aminokwasu (metionina), 114 aminokwasu (treonina), 115 aminokwasu (leucyna), odpowiednio, glutaminą, glutaminą, argininą, alaniną, glicyną, glicyną, asparaginą, alaniną, waliną, leucyną i waliną.

Jak pokazano w SEK NR ID: 59 z listy sekwencji, humanizowanie typu H3 sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie 13 aminokwasu (lizyna), 19 aminokwasu (lizyna), 40 aminokwasu (treonina), 42 aminokwasu (kwas glutaminowy), 44 aminokwasu (arginina), 88 aminokwasu (seryna), 93 aminokwasu (metionina), 114 aminokwasu (treonina), 115 aminokwasu (leucyna), odpowiednio, glutaminą, argininą, alaniną, glicyną, glicyną, alaniną, waliną, leucyną i waliną.

Jak pokazano w SEK NR ID: 60 z listy sekwencji, humanizowanie typu H4 sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie 13 aminokwasu (lizyna), 19 aminokwasu (lizyna), 88 aminokwasu (seryna), 93 aminokwasu (metionina), 114 aminokwasu (treonina), 115 aminokwasu (leucyna), odpowiednio, glutaminą, argininą, alaniną, waliną, leucyną i waliną.

Jak pokazano w SEK NR ID: 61 z listy sekwencji, plazmid niosący DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego chimerowego TRA-8 jest nazwany „typem M”. Ponadto, humanizowane TRA-8 opisane w przykładzie 17 i 18 jest nazwane typem „H2”.

Plazmidy niosące DNA kodujące region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego lub chimerowego TRA-8 konstruuje się jak następuje.

PCR stosuje się do konstrukcji następujących sekwencji DNA, każdej z nich zawierającej, co opisano powyżej.

PL 211 733 B1

Zsyntetyzowano 24 następujące oligonukleotydy:

5'-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEK NR ID: 32);

5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B; SEK NR ID: 33);

5'-tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B2; SEK NR ID: 57);

5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B3; SEK NR ID: 66);

5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEK NR ID: 34);

5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta-3' (C2; SEK NR ID: 64);

5'-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SEK NR ID: 35);

5'-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SEK NR ID: 36);

5'-tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E2; SEK NR ID: 62);

5'-tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E3; SEK NR ID: 67);

5'-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEK NR ID: 37);

5'-ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F2; SEK NR ID: 68);

5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H2; SEK NR ID: 58);

5'-tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H3; SEK NR ID: 69);

5'-tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (12; SEK NR ID: 65);

5'-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3' (J; SEK NR ID: 41);

5'-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEK NR ID: 42);

5'-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K2; SEK NR ID: 63);

5'-ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K3; SEK NR ID: 70);

5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SEK NR ID: 43) oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L2; SEK NR ID: 71).

Następujące 2 startery do PCR syntetyzuje się jak opisano powyżej:

5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (Pl; SEK NR ID: 44); oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgg a-3' (P2; SEK NR ID: 45).

Syntezę DNA typu H1 kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu H1 wytwarza się jak następuje. Skład roztworu do reakcji PCR:

oligonukleotyd A, 10 pmol;

PL 211 733 B1 oligonukleotyd B2, 10 pmol; oligonukleotyd C, 10 pmol; oligonukleotyd D, 10 pmol; oligonukleotyd E, 10 pmol; oligonukleotyd F, 10 pmol; oligonukleotyd G, 10 pmol; oligonukleotyd H2, 10 pmol; oligonukleotyd I, 10 pmol; oligonukleotyd J, 10 pmol; oligonukleotyd K, 10 pmol; oligonukleotyd L, 10 pmol; starter oligonukleotydowy P1, 2 pM; starter oligonukleotydowy P2, 2, pM;

x bufor Pyrobest II, 10 pl; dNTP mix, 8 pl;

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu H1 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 x g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 pl wody destylowanej.

Syntezę DNA typu H3 kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu H3 wytwarza się jak następuje. Skład roztworu do reakcji PCR:

oligonukleotyd A, 10 pmol;

oligonukleotyd B, 10 pmol;

oligonukleotyd C, 10 pmol;

oligonukleotyd D, 10 pmol;

oligonukleotyd E2, 10 pmol;

oligonukleotyd F, 10 pmol;

oligonukleotyd G, 10 pmol;

oligonukleotyd H2, 10 pmol;

oligonukleotyd I, 10 pmol;

oligonukleotyd J, 10 pmol;

oligonukleotyd K2, 10 pmol;

oligonukleotyd L, 10 pmol;

starter oligonukleotydowy P1, 2 pM;

starter oligonukleotydowy P2, 2 pM;

x bufor Pyrobest II, 10 pl; dNTP mix, 8 pl;

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3%

PL 211 733 B1 żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu H3 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 x g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 pl wody destylowanej.

Syntezę DNA typu H4 kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu H4 wytwarza się jak następuje. Skład roztworu do reakcji PCR:

oligonukleotyd A, 10 pmol;

oligonukleotyd B, 10 pmol;

oligonukleotyd C2, 10 pmol;

oligonukleotyd D, 10 pmol;

oligonukleotyd E2, 10 pmol;

oligonukleotyd F, 10 pmol;

oligonukleotyd G, 10 pmol;

oligonukleotyd H2, 10 pmol;

oligonukleotyd I2, 10 pmol;

oligonukleotyd J, 10 pmol;

oligonukleotyd K2, 10 pmol;

oligonukleotyd L, 10 pmol;

starter oligonukleotydowy P1, 2 pM;

starter oligonukleotydowy P2, 2 pM;

X bufor Pyrobest II, 10 pl; dNTP mix, 8 pl;

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu H4 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 x g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 pl wody destylowanej.

Syntezę DNA typu M kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu M wytwarza się jak następuje. Skład roztworu do reakcji PCR:

oligonukleotyd A, 10 pmol;

oligonukleotyd B3, 10 pmol;

oligonukleotyd C2, 10 pmol;

oligonukleotyd D, 10 pmol;

oligonukleotyd E3, 10 pmol;

oligonukleotyd F2, 10 pmol;

oligonukleotyd G, 10 pmol;

oligonukleotyd H3, 10 pmol;

oligonukleotyd 12, 10 pmol;

oligonukleotyd J, 10 pmol;

oligonukleotyd K3, 10 pmol;

oligonukleotyd L2, 10 pmol;

starter oligonukleotydowy P1, 2 pM;

starter oligonukleotydowy P2, 2 pM;

PL 211 733 B1 x bufor Pyrobest II, 10 μ!; dNTP mix, 8 μΐ;

polimeraza DNA Pyrobest, 0,5 μΐ; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 50 μΐ.

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 5 minut, po czymi 7 razy powtarza się cykl ogrzewania do 98°C przez 10 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 15 minut.

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 μg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu M jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 x g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 μl wody destylowanej.

Każdy z uzyskanych w rezultacie, wyekstrahowanych DbA (typu H1, typu H3, typu H4 i typu M) jest klonowany przy użyciu wektora pGEM-T Easy (Promega) jak następuje:

Fragment DNA odzyskany z reakcji PCR (H1, H3, H4 lub M), 5 μΐ;

x bufor dla polimerazy Taq, 1 μΐ; mieszanina dNTP, 1 μΐ; polimeraza Taq (5 jednostek/ml), 1 μΐ; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 10 μΐ.

Po 4 godzinach inkubacji w 15°C, 2 μΐ inkubowanego roztworu reakcyjnego miesza się ze 100 μΐ kompetentnego szczepu JM109 E. coli przy gęstości 1-2 x 10⁹ komórek/ml (Takara Shuzo Co Ltd.) i mieszaninę trzyma się w lodzie przez 30 minut, a następnie w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 1 minutę. Następnie, dodaje się 500 μΐ pożywki SOC (2% obj./obj. tryptonu, 05% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodowego, 2,5 mM chlorku potasowego, 1 mM chlorku magnezowego i 20 mM glukozy) do mieszaniny, którą inkubuje się przez dalszą godzinę z wytrząsaniem. Następnie, izoluje się szczepy transformantów, plazmidowy DNA wytwarza się ze szczepów, jak opisano w „Molecular Cloning A Laboratory Manual”. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F. S. i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) przy użyciu 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pHB5 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki typu H1 humanizowanego TRA-8), pHC10 (niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki typu H3 humanizowanego TRA-8), pHD21 (niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki typu H4 humanizowanego TRA-8) i pM11 (niosący cDbA kodujący łańcuch ciężki chimerowego TRA-8). Szczepy transformantów E. coli niosące te plazmidy, nazwane E. coli JM109/pHB15, E. coli JM109/pHC10, E. coli JM109/pHD21 i E. coli JM109/pM11 zostały zdeponowane w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia, 2001 r., zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano im numer dostępu, odpowiednio FERM BP-7555, EIFM BP-7557, ElFM BP-7558 i BP-7559.

(3) Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych niosących regionu zmiennego łańcucha ciężkiego kilku typów humanizowanego albo mysiego TRA-8

Zrekombinowane wektory ekspresyjne dla komórek zwierzęcych konstruuje się poprzez wstawienie DNA kodującego łańcuch ciężki typu H1, typu H3 i typu H4 humanizowanego albo typu M chimerowego TRA-8 (sklonowanego jak wyżej), jak następuje.

Jeden μg plazmidu pSRHHH3 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0-909-816-A1) niosącego region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała monoklonalnego anty-Fas HFE7A i genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgG1, wektora ekspresyjnego dla komórek ssaczych, trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Apal i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym.

Po elektroforezie, żel barwi się 1 μg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wy54

PL 211 733 B1 krycia w świetle UV. Prążki wektorowego DNA zawierające genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgG1 bez regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego HFE7A są wycinane przy użyciu skalpela i wymywane z żelu przy użyciu zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 x g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 pl wody destylowanej, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany w rezultacie strawiony, defosforylowany plazmid (100 ng) poddaje się następnie ligacji z 1 pg fragmentu DNA pHB15, pHC10, pHD21 lub pM11 zawierającego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego lub chimerowego TRA-8, który został również strawiony Hindlll i Apal, przy użyciu zestawu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Mieszaninę ligacyjną używa się następnie do transformacji E. coli JM109, który wysiewa się następnie na płytki agarowe LB zawierające 50 pg/ml ampicyliny.

Otrzymane tą metodą transformanty hoduje się w 2 ml płynnej pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny w 37°C przez noc i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS.

Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i Apal i poddaje elektroforezie w 3% wag./obj. żelu agarozowym w celu potwierdzenia obecności lub nieobecności wstawki DNA kodującej region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F. S. i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Otrzymane w rezultacie plazmidy ekspresyjne niosące cDNA kodujący łańcuch ciężki humanizowanego lub chimerowego TRA-8 są nazwane odpowiednio, pHB 15-1, pHC10-3, pHD21-l i pM11-1.

(4) Konstrukcja wektorów dla humanizowanych łańcuchów lekkich (4.1) Konstrukcja wektorów ekspresyjnych dla łańcuchów lekkich humanizowanego przeciwciała (typu LMl)

Jak pokazano w SEK NR ID: 72 z listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM1) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 3 aminokwasu (walina), 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 (seryna), 60 aminokwasu (kwas asparaginowy), 63 aminokwasu (treonina), 77 aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), 80 aminokwasu (seryna), 83 aminokwasu (leucyna), 85 aminokwasu (kwas asparaginowy), 87 aminokwasu (fenyloalanina), 99 aminokwasu (glicyna), 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8 są zastępowane, odpowiednio, glutaminą, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, seryną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, treoniną, tyrozyną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM1.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 (typu LM1, SEK NR ID: 72 z listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego (typu LM1) humanizowanego TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM1 (SEK NR ID: 72 z listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego (typu LM1) humanizowanego przeciwciała antyludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47), 7ALCN (SEK NR ID: 48), HKCDFll (SEK NR ID: 50), HKCDR12 (SEK NR ID: 51), HKCDF22 (SEK NR ID: 52), HKCDR22 (SEK NR ID: 53) i HKCF12 (SEK NR ID: 54) syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga-3' (HKSPR12; SEK NR ID: 77).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LMl-2 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM1 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM1 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 72, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

PL 211 733 B1

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM1-F1 kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRL1 z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5' jest wytworzony w następujących warunkach. Plazmidy matrycowe pHSGHM17 i pSRPDHH są otrzymane zgodnie z opisem w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1. Skład roztworu do reakcji:

MA plazmidu pHSGHM17 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1), 25 ng; starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol; starter oligonukleotydowy HKSPR12, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pl;

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 jednostek.

Fragment DNA LM1-F2 kodujący część FRL1, CDRL1, FRL2 i CDRL2 jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Fragment DNA LM1-F3 kodujący CDRL2, FRL3 i część CDRL3 jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pSRPDHH, 25 ng; starter oligonukleotydowy HKCDF22, 50 pmol; starter oligonukleotydowy HKCDR22, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pl;

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Fragment DNA LM1-F4 kodujący CDRL3, FRL4 i region stały z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

PL 211 733 B1

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 μg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

DNA LM1, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM1-F1, LM1-F2, LM1-F3 i LM1-F4 są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM1-F1 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM1-F2 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM1-F3 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM1-F4 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol, starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol, mieszanina dNTP, 5,0 μΐ, bufor do PCR 10 x, 5,0 μΐ, polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μΐ poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Tak wytworzony fragment LM1-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F. S. i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM1-2 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch region zmienny łańcucha lekkiego (typu LM1) humanizowanego TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LMl-2 zawierający fragment DNA LM1 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden μg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM2, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 μg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 μg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DRA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM1 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/LM1-2-2 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM1 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/LM1-2-2 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7562.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM1-2 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM1 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M1-2-2 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM1 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden μg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP

909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu

PL 211 733 B1

CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M2-1-4, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LM1 TRA-8 jest nazwany pSR/LM1-2.

(4.2) Konstrukcja wektorów ekspresyjnych dla łańcuchów lekkich humanizowanego przeciwciała (typu LM3)

Jak pokazano w SEK NR ID: 73 z listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM3) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 aminokwasu (seryna), 77 aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), 80 aminokwasu (seryna), 83 aminokwasu (leucyna), 85 aminokwasu (kwas asparaginowy), 87 aminokwasu (fenyloalanina), 99 aminokwasu (glicyna), 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8, odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treonina, lizyną, alaniną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, treoniną, tyrozyną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM3.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8 (typu LM3, SEK NR ID: 73 z listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM3 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM3 (SEK NR ID: 73 z listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47) i 7ALCN (SEK NR ID: 48) syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg-3' (MODIF1; SEK

NR ID: 78);

5'-cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt-3' (MODlR1;

SEK NR ID: 79);

5'-ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3' (MOD1F22; SEK

NR ID: 80);

5'-acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3' (MOD1R22; SEK NR ID: 81);

5'-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa-3' (MOD1F3;

SEK NR ID: 82);

5'-tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga-3' (MOD1R3; SEK NR ID: 83);

5'-aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t-3' (MOD1F42; SEK NR ID: 84);

5'-cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc-3' (MOD1R4;

SEK NR ID: 85);

5'-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat-3' (MOD1F5; SEK BR

ID: 86);

5'-actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac-3' (MOD1R52; SEK NR

ID: 87);

5'-tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F6; SEK NR

ID: 88);

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac-3' (MOD1R6; SEK NR ID: 89);

5'-aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g-3' (MOD1F7; SEK NR ID: 90);

PL 211 733 B1

5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa-3' (MOD1R7; SEK NR ID: 91); oraz

5'-agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SEK NR ID: 101).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM3-3-44 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM3 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM3 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 73, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM3-F31B kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRL1 z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5', FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 i część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

starter oligonukleotydowy MOD1F1, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R1, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F22, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R22, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F3, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R3, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F42, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R4, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F5, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R52, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F6, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R6, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R7, 5 pmol; starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol; starter oligonukleotydowy LR17, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pp1;

bufor do PCR 10 x, 5 μΐ polimeraza DNA ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 jednostek.

Fragment DNA LM3-F31C kodujący część regionu stałego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach.

Plazmid matrycowy, pSRPDHH, jest otrzymany według opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1. Skład roztworu do reakcji:

plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng; starter oligonukleotydowy MODIFI, 50 pmol; starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 μΐ;

bufor do PCR 10 x, 5 μΐ;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Powielone fragmenty DRA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 μg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

PL 211 733 B1

b) Drugi etap PCR

LM3-DNA, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM3-F31B i LM3-F31C są ze sobą połączone, jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

Fragment DLA LM3-F31B z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DI\ LM3-F31C z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol, starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol, mieszanina dNTP, 5,0 pl, bufor do PCR 10 x, 5,0 pl, polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Tak wytworzony fragment LM3-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F.

S. i wsp. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM3-3-44 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM1 TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM3-3-44 zawierający fragment DNA LM3 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM2, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 pg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 pg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM3 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/M3-3-22 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM1 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7564.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM3-3-44-10 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM3 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M3-3-22 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM3 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany MA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M3-3-22, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację po60

PL 211 733 B1 żądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LM3 TRA-8 jest nazwany pSR/LM3-3-44-10.

(4.3) Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (typu LM4)

Jak pokazano w SEK NR ID: 74 z listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM 4) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 aminokwasu (seryna), 77 aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), 80 aminokwasu (seryna), 83 aminokwasu (leucyna), 85 aminokwasu (kwas asparaginowy), 99 aminokwasu (glicyna), 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8, odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, treoniną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM4.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 (typu LM4) (SEK NR ID: 74 z listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM4 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM4 (SEK NR ID: 74 z listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47), 7ALCN (SEK NR ID: 48), MOD1F1 (SEK NR ID: 78), MOD1R1 (SEK NR ID: 79), MOD1F22 (SEK NR ID: 80), MOD1R22 (SEK NR ID: 81), MOD1F3 (SEK NR ID: 82), MOD1R3 (SEK NR ID: 83), MOD1F42 (SEK NR ID: 84), MOD1R4 (SEK NR ID: 85), MOD1F5 (SEK NR ID: 86), MOD1R52 (SEK NR ID: 87), MOD1F7 (SEK NR ID: 90), and MOD1R7 (SEK NR ID: 91), LR17 (SEK NR ID: 101) syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F62; SEK NR ID: 92),

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R62; SEK NR

ID: 93).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM4-5-3 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM4 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM4 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 74, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM4-F41B kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5 FRL1, CDRL1, FRL2 oraz CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 i część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

starter oligonukleotydowy MOD1F1, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R1, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F22, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R22, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F3, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R3, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F42, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R4, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F5, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R52, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F62, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R62, 5 pmol;

PL 211 733 B1 starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R7, 5 pmol; starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol; starter oligonukleotydowy LR17, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 pl;

x PCR bufor, 5 pl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Fragment DNA LM4-F41C kodujący część regionu stałego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach.

Plazmid matrycowy, pSRPDHH, jest otrzymany według następującego opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1. Skład roztworu do reakcji:

plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng; starter oligonukleotydowy MOD1F1, 50 pmol; starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 pl;

bufor do PCR 10 x, 5 pl;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

LM4-DNA w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM4-F41B i LM4-F41C są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

Fragment DbA LM4-F41B z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM4-F41C z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol, starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5,0 pl, bufor do PCR 10 x, 5,0 pl, polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Tak wytworzony fragment LM4-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych TNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego LM4 TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F. S. i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM4-5-3 (plazmid niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM4 TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

PL 211 733 B1

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM4-5-3 zawierający fragment DNA LM4 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM4, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 pg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 pg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM4 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/LM4-5-3-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM4 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/LM4-5-3-1 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7565.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM4-5-3-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM4 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/LM4-5-3-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM4 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment EA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/LM4-5-3-1, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LM3 TRA-8 jest nazwany pSR/LM4-5-3-3.

(4.4) Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (typu LM5)

Jak pokazano w SEK NR ID: 75 z listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM5) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 aminokwasu (seryna), 77 aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), 80 aminokwasu (seryna), 83 aminokwasu (leucyna), 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8, odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM5.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8 (typu LM5) (SEK NR ID: 75 z listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM5 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM5 (SEK NR ID: 75 z listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5,

TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch K) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

PL 211 733 B1

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47), 7ALCN EEK NR ID: 48), MOD1F1 (SEK NR ID: 78), MOD1R1 (SEK NR ID: 79), MOD1F22 (SEK NR ID: 80), MOD1R22 (SEK NR ID: 81), MOD1F3 (SEK NR ID: 82), MOD1R3 (SEK NR ID: 83), MOD1F42 (SEK NR ID: 84), MOD1R4 (SEK NR ID: 85), MOD1R52 (SEK NR ID: 87), MOD1F7 (SEK NR ID: 90), LR17 SEK NR ID: 101), syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat-3' (MOD1F52; SEK NR ID: 94);

5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F63; SEK NR ID: 95);

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R63; SEK NR ID: 96);

5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa-3' (MOD1R72; SEK NR ID: 102)

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM5-3-42 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM5 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM4 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 75, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM5-F51B kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5', FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 i część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

starter oligonukleotydowy MOD1F1, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R1, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F22, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R22, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F3, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R3, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F42, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R4, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F52, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R52, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F63, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R63, 5 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1F1, 50 pmol; starter oligonukleotydowy MOD1R72, 5 pmol; starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol; starter oligonukleotydowy LR17, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 μΐ;

x PCR bufor, 5 μΐ;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Fragment LM5-F51C kodujący część regionu stałego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach. Plazmid matrycowy, pSRPDHH, jest otrzymany według następującego opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1. Skład roztworu do reakcji:

plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng; starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol; starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 μΐ;

bufor do PCR 10 x, 5 μΐ;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

PL 211 733 B1

b) Drugi etap PCR

LM5-DNA, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM5-F51B i LM5-F51C są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM5-F51B z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM5-F51C z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol, starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol, mieszanina dNTP, 5,0 pl, bufor do PCR 10 x, 5,0 pl, polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Tak wytworzony fragment LM4-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego LM5 TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F. S. i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM5-3-42 (plazmid niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM5 TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM5-3-42 zawierający fragment DNA LM5 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg plazmidu do klonowania pHSG399 DbA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM5, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 pg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 pg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM5 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/LM5-3-27 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM4 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM5-3-27-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM5 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M5-3-27 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM5 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany

PL 211 733 B1 z pHSG/LM5-3-27, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LM5 TRA-8 jest nazwany pSR/LM5-3-27-1.

(4.5) Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (typu chimerowego)

Sekwencja pokazana w SEK NR ID: 76 z listy sekwencji, sekwencja aminokwasową łańcucha lekkiego TRA-8 typu chimerowego jest nazwana LM6.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8 (typu LM6) (SEK NR ID: 75 z listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM6 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM6 (SEK NR ID: 75 z listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

5'-tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a-3' (HKSPR13; SEK NR ID: 97);

5'-tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c-3' (MVF11; SEK NR ID: 98);

5'-aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc-3' (MVR11; SEK NR ID: 99);

5'-aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc-3' (MCF11; SEK NR ID: 100).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM6-l-16 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM6 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM6 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 75, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM6-F1 kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRL1 z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5' jest wytworzony w następujących warunkach. Plazmidy matrycowe, pHSGHM17 i pSRPDHH, są otrzymane według następującego opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1. Skład roztworu do reakcji:

plazmid pHSGHM17 DNA, 25 ng; starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol; starter oligonukleotydowy HKSPR13, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 μΐ;

bufor do PCR 10 x, 5 μΐ;

polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Fragment LM6-F2 kodujący część FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 oraz część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

plazmid pL28 DNA, 25 ng; starter oligonukleotydowy MVF11, 50 pmol; starter oligonukleotydowy MVR12, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 μΐ;

x PCR bufor, 5 μΐ;

PL 211 733 B1 polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Fragment DNA LM6-F3 kodujący część FRL4 i region stały z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng; starter oligonukleotydowy MCF11, 50 pmol; starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol; mieszanina dNTP, 5 μ|;

x PCR bufor, 5 μ|;

po|imeraza DNA amp|iTaq, 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μ| poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyk|u termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Powie|one fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 μg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu ska|pe|a.

b) Drugi etap PCR

LM6-DNA, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM6-F1 i LM6-F2 i LM6-F3 są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach. Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM6-F1 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM6-F2 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Tak wytworzony fragment LM6-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do k|onowania Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nuk|eotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego LM6 TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy z zastosowaniem ana|izatora DNA.

Otrzymane w rezu|tacie p|azmidy nazwano pCR3.1/LM6-1-16 (plazmid niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM5 TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany p|azmid pCR3.1/LM6-1-16 zawierający fragment DNA LM6 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hind||| i EcoRI.

Jeden μg plazmidu do klonowania pHSG399 DbA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM6, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 μg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się

PL 211 733 B1 w płynnej pożywce LB zawierającej 50 μg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM6 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/ M6-1-4-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5α/pHSG/M6-1-4-1 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, 20 kwietnia, 2001 r., zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7566.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM6-1-4-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich chimerowego TRA-8 typu LM6)

Otrzymany plazmid pHSG/LM6-1-4-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden μg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M6-1-4-1, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie, E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DRA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego TRA-8 (typu chimerowego) jest nazwany pSR/LM6-1-4-1.

5) Wytwarzanie różnych typów humanizowanego albo chimerowego przeciwciała TRA-8

Transfekcję komórek COS-7 przeprowadza się przy zastosowaniu metod z odczynnikiem do transfekcji FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem.

W międzyczasie, miesza się 10 μg/płytkę (w sumie 5 płytek) DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 (pHA15-1) i 10 μg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5 otrzymanych metodą lizy alkalicznej-SDS i wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu, a następnie wytrąca etanolem, po czym zawiesza w 5 μl/płytkę dH2O.

Następnie, miesza się 15 μl/płytkę odczynnika FUGENE6 Transfection regent z 180 μl/płytkę D-MEM bez FCS, ten roztwór FUGENE (185 μl/płytkę) miesza się z 5 μl/płytkę roztworu DNA zawierającego 10 μg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 i 10 μg/płytkę DPA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej otrzymaną zawiesinę plazmidów (200 μΓ) dodaje się do przygotowanych wcześniej płytek COS-7. Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 24 godziny, pożywkę hodowlaną zamienia się na D-MEM bez FCS. Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 72 godzin, zbiera się supernatant z hodowli w celu oczyszczenia produktów ekspresji z płynów supernatantu. Stosując opisaną powyżej metodę, komórki COS-7 transfekuje się każdą z następujących kombinacji plazmidów:

(A) : kotransfekcja pHA15-1 i pSR/LM1-2 (HlL1), (B) : kotransfekcja pHB14-1 i pSR/M2-1 (H2L2), (C) : kotransfekcja pHB14-1 i pSR/LM3-3-44-10 (H2L3), (D) : kotransfekcja pHB14-1 i pSR/LM4-5-3-3 (H2L4), (E) : kotransfekcja pHC10-3 i pSR/M2-1 (H3L2), (F) : kotransfekcja pHC10-3 i pSR/LM3-3-44-10 (H3L3), (G) : kotransfekcja pHC10-3 i pSR/LM4-5-3-3 (H3L4),

PL 211 733 B1 (H) : kotransfekcja pHD21-1 i pSR/LM5-3-27-1 (H4L5), (I) : kotransfekcja pM11-1 i pSR/LM6-1-4-6 (Chimera).

Hodowlę zwirowuje się następnie (1000 obr. na min., 5 minut) i zbiera się supernatant. Supernatant odwirowuje się ponownie (9800 obr. na min., 15 minut) i filtruje przy użyciu filtra 045 μm (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, # kat. 25CS045 AS). Oczyszczanie IgG z filtratów uzyskuje się stosując chromatografię powinowactwa Protein G-POROS (Applied Biosystems) w następujących warunkach:

system HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems);

kolumna: ProteinG-ID sensor cartridge (wielkość kolumny: 2,1 mmID x 30 mm LD, objętość pusta: 0,1 ml; # kat; 2-1002-00, Applied Biosystems);

tempo przepływu: 1 ml/min.; wielkość frakcji: 0,5 ml/0,5 min.;

Po nałożeniu wszystkich filtratów na kolumnę, 50 ml PBS (Sigma, # kat: 1000-3) używa się do przemycia kolumny. Po zastosowaniu buforu do przemywania uruchamia się kolektor frakcji. Każda mikroprobówka do zbierania frakcji zawiera już 55 μΐ 1 M NaCl, 110 μΐ buforu do neutralizacji i 74 μΐ bydlęcej albuminy surowiczej 2 mg/ml (Sigma, # kat; A-7030) w PBS. Zbiera się frakcje od nr 7 do nr 8.

Weryfikację ekspresji humanizowanych przeciwciał i test ilościowy na produkt ekspresji w otrzymanych płynach znad hodowli przeprowadza się poprzez ELISA z przeciwciałem przeciw anty-ludzka IgG.

Do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki (MaxiSorp, Nunc), dodaje się 100 μΐ koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (Kappel) rozcieńczonego do stężenia końcowego 0,5 μg/ml w buforze do adsorpcji (0,05 M wodorowęglan sodowy, 0,02% azydek sodowy, pH 9,6) i płytkę inkubuje się w 37°C przez 2 godziny w celu adsorpcji przeciwciała. Następnie, płytkę przemywa się pięciokrotnie 350 μΐ PBS-T. Po przemywaniu do studzienek dodaje się, supernatant hodowlany rozcieńczony w D-MEM zawierającej 10% FCS i inkubuje się w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, do każdej studzienki dodaje się 100 μΐ wyznakowanego alkaliczną fosfatazą koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (Jackson Immune Research Lab.) rozcieńczonego 10000-krotnie w PBS-T i inkubuje w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, dodaje się roztwór substratu p-nitrofenylofosforanu otrzymanego w zestawie Alkaline Phosphatase Substrate Kit (Bio Rad) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem. Po inkubacji w 37°C przez 0,5 do 1 godziny, mierzy się absorbancję w 405 nm. W niniejszych doświadczeniach, immunoglobulina G podklasy 1 (IgG1) z ludzkiego osocza (Biopure AG) rozcieńczona w D-MEM zawierającej 10% FCS do pewnych stężeń jest stosowana jabo próbki odnośnikowe dla stężenia humanizowanych przeciwciał DR5 zawartych w płynach znad hodowli.

W rezultacie ekspresja i oczyszczone produkty w supernatantach hodowlanych są specyficznie wykrywane przeciwciałem anty-ludzka IgG. Stężenie końcowe ludzkiego przeciwciała IgG wynosi odpowiednio, 44,03 Mg/ml (HiL1), 39,8 gg/mi (H2L2), 26,7 gg/mi (H2L3), 41,0 gg/mi (H2L4), 39,3 gg/mi (H3L2), 24,7 yg/mi (H3L3), 21,5 yg/mi (H3L4), 16,7 yg/mi (H4L5) i 18,3 yg/mi (chimera).

(6) Aktywność indukowania apoptozy kilku typów przeciwciał humanizowanych albo chimerowych

Komórki Jurkat hodowane w pożywce RPMI1640 z 10% FCS (Gibco BRL) w 37°C przez 3 dni w obecności 5% CO2 umieszcza się w każdej studzience 96-studzienkowej mikropłytki (Sumitomo Bakelite) po 50 μΐ na studzienkę. Humanizowane TRA-8 wytworzone w przykładzie 26 doprowadza się do stężenia 100 ng/ml dla końcowego produktu będącego przedmiotem zainteresowania pożywką RPMI1640 zawierającą 10% FCS poprzez oszacowanie ich stężeń w płynie zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 26. Każdy z roztworów z produktów ekspresji doprowadzony w ten sposób do 100 ng/ml używa się do sporządzenia serii rozcieńczeń poprzez powtarzanie serii 2-krotnych rozcieńczeń RPMI1640 zawierającą 10% FCS. Każdy z rozcieńczonych roztworów humanizowanego TRA-8 (HlL1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 lub H4L5) jest dodawany do każdej studzienki w ilości 50 μΐ na studzienkę. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 12 godzin, dodaje się 50 μΐ 25 pM PMS (metosiarczan fenazyny; Sigma Chemical Co.) zawierającego 1 mg/ml XTT (bierna sól 2,3-bis[2-metoksy-4-niPL 211 733 B1 tro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolium-5-karboksyanirydu; Sigma Chemical Co.) (końcowe stężenia 250 μg/ml dla XTT i 5 μM dla PMS). Po inkubacji przez 3 godziny, dla każdej studzienki mierzy się absorbancję przy w 450 w celu obliczenia żywotności komórek stosując jako wskaźnik zdolność redukcyjną mitochondriów.

Ponadto, aktywność indukowania apoptozy humanizowanego TRA-8 wobec PC-3 bada się poprzez dodanie taksolu według metody opisanej w przykładzie 25.

Ludzka linia komórek raka prostaty PC-3 (ATCC No. CRL-1435) jest otrzymana z kolekcji American Tissue Culture Collection (ATCC) i utrzymywana w pożywce F-12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS, Hyclone), 1% L-glutaminę-200 mM (25030-149, Gibco BRL) i 0,5% roztwór Penicillin Streptomycin Solution (P-7539, Sigma). Pożywka RPMI1640 (MED-008, IWAKI) uzupełniona 10% FBS i 05% roztworem Penicillin Streptomycin Solution jest używana w następującym doświadczeniu. Rosnące wykładniczo komórki PC-3 zbiera się poprzez trypsynizację i przemywa dwukrotnie świeżą pożywką. Komórki następnie liczy się, zawiesza ponownie w świeżej pożywce przy gęstości 5 x 10⁴ komórek/ml i umieszcza w trzech powtórzeniach w 96-studzienkowych płytkach (3598, Corning-Coster) w całkowitej objętości 100 μl/studzienkę na dzień przed rozpoczęciem doświadczenia. Reprezentatywny lek przeciwnowotworowy, Paclitaxel (169-18611, Wako) rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (10 mg/ml) rozcieńcza się w pożywce, a następnie dodaje do 96-studzienkiowych płytek zawierających komórki w ilości 50 μl/studzienkę. Stężenie końcowe dimetylosulfotlenku wynosi mniej niż 0,1%. Po inkubacji przez 24 godz. w 37°C w atmosferze 5% CO2, do studzienek dodaje się humanizowane przeciwciało TRA-8 (HlL1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 lub H4L5) rozcieńczone w świeżej pożywce. Po inkubacji przez dalsze 24 godz., do studzienek dodaje się 50 μl pożywki Minimum Essential Medium (11095-098, Gibco BRL) zawierającej 1 mg/ml XTT i 25 mM PMS i płytki inkubuje się przez 6 godz. Następnie mierzy się OD450 przy użyciu ARVO HTS 1420 Multilabel Counter (Wallac Berthold) i żywotność komórek oblicza się jak następuje.

Żywotność komórek (%) = (OD450 dla studzienki zawierającej komórki traktowane Taxol i/lub (czynnikiem(ami)) TRA-8 - OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek ani czynnika) x 100 / (OD450 dla studzienki zawierającej komórki bez czynnika - OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek, ani czynnika).

Wynik jest taki, iż wykazano, że testowane humanizowane przeciwciała indukują apoptozę w ludzkich komórkach raka prostaty wyrażających ludzki antygen DR5.

Odnośniki

1. Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA i wsp. Immunity 1995 grudzień; 3 (6): 673-82.

2. Pan G, O'Rourke K, Chinnaiyan AM, Gentz R, Ebner R, Ni J, Dixit VM, Science 1997 4 kwiecień; 276 (5309): 111-3.

3. Walczak H, Degli-Esposti MA, Johnson RS, Smolak PJ, Waugh JY, Boiani N, Timour MS, Gerhart MJ, Schooley KA, Smith CA, Goodwin RG, Rauch CT. EMBO J., 1997 1 wrzesień; 16 (17): 5386-97.

4. MacFarlane M, Ahmad M, Srinivasula SM, Fernandes-Alnemri T, Cohen GM, Alnemri ES. J. Biol. Chem. 1997 10 październik 272 (41): 25417-20.

5. Degli-Esposti MA, Dougall WC, Smolak PJ, Waugh JY, Smith CA, Goodwin RG. Immunity 1997 grudzień 7 (6): 813-20.

6. Chaudhary PM, Eby M, Jaśmin A, Bookwalter A, Murray J, Hood L. Immunity 1997 grudzień 7 (6): 821-30.

7. Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer JL, Hofmann K, Kataoka T, Holler N, Tschopp J. Immunity 1997 grudzień 7 (6): 831-6.

PL 211 733 B1

8. Deg|i-Esposti PA, Smo|ak PJ, Wa|czak H, Waugh J, Huang CP, DuBose RF, Goodwin RG, Smith CA. J. Exp. Med. 1997 6 październik 186 (7): 1165-70.

9. Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Ba|dwin D, Ramakrishnan L, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Science 1997 8 sierpień 277 (5327): 818-21.

10. Pan G, Ni J, Wei YF, Yu G, Gentz R, Dixit VM. Science 1997 8 sierpień 277 (5327): 815-818.

11. Marsters SA, Sheridan JP, Pitti RM, Huang A, Skubatch M, Ba|dwin D, Yuan J, Gurney A, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Curr Bio| 1997 1 grudzień 7 (12): 1003-6.

12. Emery JG, McDonne|| P, Burke MB, Deen KC, Lyn S, Si|verman C, Du| E, Appe|baum ER, Eichman C, DiPrinzio R, Dodds PA, James |E, Rosenberg M, Lee T, Young PR. J. Bio|. Chem. 1998 5 czerwiec 273 (23): 14363-7.

13. Wa|czak H, Mi||er P Ariai| K, G|iniak B, Griffith TS, Kubin M, Chin W, Jones J, Woodward A, Le T, Smith C, Smo|ak P, Goodwin RG, Rauch CT, Schuh JK, Lynch DH. Nat. Med. 1999 |uty; 5 (2): 157-63.

14. Gazitt Y. Leukemia 1999 November; 13 (11): 1817-24.

15. Rieger J, Naumann U, G|aser T, Ashkenazi A, We||er M. FEBS Lett. 1998 1 maj; 427 (1):

124-8.

16. Jeremias I, Herr I, Boeh|er T, Debatin KM. Eur. J. Immuno|. 1998 styczeń 28 (1): 143-52.

17. Martinez-Lorenzo MJ, A|ava Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai A, Pineiro A, Nava| J, Jie| A. Eur. J. Immuno|. 1998 wrzesień 28 (9): 2714-25.

18. Phi||ips TA, Ni J, Pan G, Ruben SM, Wei YF, Pace JL, Hunt JS. J. Immuno|. 1999 15 maj 162 (10): 6053-9.

19. Kayagaki N, Yamaguchi N, Nakayama M, Takeda K, Akiba H, Tsutsui H, Okamura H, Nakanishi K, Okumura K, Yagita H. J. Immuno|. 1999 15 sierpień 163 (4): 1906-13.

20. Johnsen AC, Haux J, Steinkjer B, Nonstad U, Egeberg K, Sundan A, Ashkenazi A, Espevik T. Cytokine 1999 wrzesień 11 (9): 664-72.

21. Zamai L, Ahmad M, Bennett IM, Azzoni L, A|nemri ES, Perussia B. J. Exp. Med. 1998 21 grudzień 188 (12): 2375-80.

22. Fanger NA, Ma|iszewski CR, Schoo|ey K, Griffith TS. J. Exp. Med. 1999 18 październik 190 (8): 1155-64

23. Griffith TS, Wi|ey SR, Kubin MZ, Sedger LM, Ma|iszewski CR, Fanger NA. J. Exp. Med. 1999 19 kwiecień 189 (8): 1343-54.

24. Griffith TS, Rauch CT, Smo|ak PJ, Waugh Boiani N, Lynch DH, Smith CA, Goodwin RG, Kubin MZ. J. Immuno|ogy 1999 162: 2597-2605.

25. A|bani S and Carson DA, 1997 Arthritis and a||ied conditions, a textbook of rheumato|ogy, wydanie 13, tom 2, 979-992.

26. Fujisawa K, Asahara H, Okamoto K, Aono H, Hasunuma T, Kobata T, Iwakura Y, Yonehara S, Sumida T i Nishioka K. J. C|in. Invest. 1996 98 (2): 271-278.

27. Zhang H, Yang Y, Horton JL, Samoi|ova EB, Judge TA, Turka LA, Wi|son JM i Chen Y. 1997 J. C|in. Invest. 100 (8), 1951-1957.

28. Roth W, Isenmann S, Naumann U, Kug|er S, Bahr M, Dichgans J, Ashkenazi A, We||er M. Locoregiona|. B|ochem. Biophys. Res. Commun. 1999 19 |istopad 265 (2): 479-83.

29. Chinnaiyan AM, Prasad U, Shankar S, Hamstra DA, Shanaiah M, Chenevert TL, Ross BD, Rehemtu||a A. Proc. Nat|. Acad. Sci. 2000 15 |uty; 97 (4): 1754-1759.

30. Arai T, Akiyama Y, Okabe S, Sa|to K, Iwai T, Yuasa Y. Cancer Lett., 1998 27 |istopad 133 (2): 197-204

31. Lee SH, Shin MS, Kim HS, Lee HK, Park WS, Kim SY, Lee JH, Han SY, Park JY, Oh RR, Jang JJ, Han JH, Lee JY, Yoo NJ., Cancer Res. 1999 15 |istopad 59 (22): 5683-5686.

32. Pai SI, Wu GS, Ozoren N, Wu L, Jen J, Sidransky D, E|-Deiry WS., 1998 Cancer Res. Sier. 15; 58 (16): 3513-3518.

33. Maniatis i wsp., 1982, Mo|ecu|ar C|oning, a Laboratory Manua|, Co|d Spring Harbor Laboratory, Co|d Spring Harber, NY.

34. Schroff i wsp., 1985 Cancer Res., 45, 879-885.

35. Ye|ton, D. E. i wsp., 1978 Current Topics in Microbio|ogy and Immuno|ogy, 81, 1-7.

36. Koh|er, G. i wsp., 1976 European J. Immuno|ogy, 6, 511-519.

37. Shu|man, M. i wsp., 1978 Nature, 276: 269-270.

PL 211 733 B1

38. Kearney, J. F. i wsp., 1979 J. Immunology, 123, 1548-1550.

39. Horibata, K. and Harris, A. W., 1975 Nature, 256, 495-497.

40. Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishinan, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P i Ashkenazi A, 1997 Science, 277, 818-821.

41. Cheng J i wsp. 1994 Science, 263, 1759-1762.

42. Bendele AM i wsp., 1999 Clin. Exp. Rheumatol., 17 (5), 553-560.

43. Sheridan JP, Marsters AS, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CJ, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P i Ashkenazi A., 1997 Science, 277, 818-821.

44. Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer Hofmann K, Kataoka T, Holler N, Tschopp J., 1997 Immunity, grudzień 7 (6): 831-836.

45. Kennedy NJ, Kataoka T, Tschopp J i Budd RC., 1999 J. Exp. Med. 1891-1896.

46. Miiler-Ladner U, Gay i Gay S, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rheumatology, wydanie 13, Tom 1, 243-254.

PL 211 733 B1

Lista sekwencji <110> The UAB Research Foundation <120> Przeciwciało selektywne względem receptora dla liganda indukującego ąpoptozę spokrewnionego z czynnikiem martwicy nowotworu i jego zastosowania <130> SAN-10052/22 <16(0 102 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <210 25 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <40 0 1 gacgatgccc gatctacttt aaggg <210 2 <211> 22 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 2 ccactgggtg atgttggatg gg <210 3 <211> 24 <212> DNA <21 3> konstrukt syntetyczny <400 3 ggatcc.gtgg acacattcga tgtc <210 4 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0 4

Glu Val Met Leu Val G-u Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu 20 <210 5 <210 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15

PL 211 733 B1

Asn Arg Val Ser ’ 23

<210>	6
<211>	20
<212>	DNA
<213>	.konstrukt syntetyczny
<400>	6

cagcactgaa cacggacccc 20 <21Q> 7 <211> 20 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 7 aaaggtaatt tattgagaag 20 <213> 3 <211> 20 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <4Q0> 8 cctcaccatg aacttcgggc 20

<210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 12 tftaccagga gagtgggaga g 21

PL 211 733 B1

PL 211 733 B1 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 20 gactgggtca tcacaatgtc 20 <210> 21 <211> 1398 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21

atgaactt.cg	ggctcagctt	gattttcctt	ątccttgttt	taaaaggtgt	ccagtgtgaa	60
gtgatgctgg	tggagtctgg	gggaggctta	gtgaagcctg	gagggtccct	gaaactctcc	120
tgtgcagcct	ctggattcac	tttcagtagc	tatgtaatgt	cttgggttcg	ccagactccg	180
gagaagaggc	tggagtgggt	cgcaaccatt	agtagtggtg	gtagttacac	ctactatc.ca	240
gacagtgtga	aggggcgatt	caccatctcc	agagacaatg	ccaagaacac	cctgtacctg	300
caaatgagca	gtctgaggtc	tgaggacacg	gccatgtatt	actgtgcaag	acggggggac	360
Lctatgatta	cgacggacta	ctggggccaa	ggcaccactc	teacagtctc	ctcagccaaa	420
acgacacccc	catctgtcta	tccactggcc	cctggaLctg	ctgcccaaac	taactccatg	480
gtgacc.ctgg	gatgcctggt	caagggctat	ttccctgagc	cagtgacagt	gacctgęaac	540
tctggatccc	tgtccagcgg	tgtgcacacc	ttcccagctg	tcctgcagtc	tqacctctac	600
actctgagca	gctcagtgac	tgtcccctcc	agcacctggc	ccagcgagac	cgtcacctgc	660
aacgttgccc	acccggccag	cagcaccaag	gtggacaaga	aaattgtgcc	cagggattgt	720
ggttgtaagc	cttgcatatg	tacagtccca	gaagtatcat	ctgtcttcat	cttcccccca	780
aagcccaagg	atgtgctcac.	caLtactctq	acr.cctaagg	tcacgtgtgt	tgtggtagac	840
atcagcaagg	atgatcccga	ggtccagttc	agctggtttg	tagatgatgt	ggaggtgcac	900
acagctcaga	cgcaaccccg	ggaggagcag	ttcaacagca	ctttccgctc	agtcagtgaa	960
cttcccatca	tgcaccagga	ctggctcaat	ggcaaggagt	tcaaatgcag	ggtcaaeagt	1020
gcagctttcc	ctgcccccat	cgagaaaacc	atctccaaaa	ccaaaggcag	accgaaggct	1080
ccacaggtgt	acaccattcc	acctcccaag	gagcagatgg	ccaaggataa	agtcagtctg	1140
acctgcatga	taacagactt	cttccctgaa	gacattactg	tggagtggca	gtggaatggg	1200
cagcc.agcgq	agaactacaa	gaacactcag	cccatcatgg	acacagatgg	ctcttacttc	1260
gtctacagca	agctcaatgt	gcagaagagc	aactgggagg	caggaaatac	tttcacctgc	1320
tctgtgttac	atgagggcct	gcacaaccac	catactgaga	agagcctctc	ccactcLcct	1380
ggtaaaaatc	actagtga					1398

PL 211 733 B1

<210> 22 <211> 705 <212> DNA < 213 > Mu ε	musculus
<400> 22 atgaagtctt	tgtatgtgtt	agtgtataca	cattatctgt	ttctgtttgc	aggtgttgaa	60
ggagacattg	tgatgaccca	gtcLcacaaa	ttcatgtcca	catcagtagg	agacagggtc	120
agcatcacct	gcaaggccag	tcaggatgtg	ggtactgctg	tagcctggta	tcaacagaaa	180
ccagggcaat	ctcctaaact	actgatttac	tgggcatcca	cccggcacac	tggagtccct	240
gatcgcttca	caggcagtgg	atctgggaca	gatttcactc	tcaccattag	caatgtgcag	300
tctgaagact	tggcagatta	tttctgtcag	caatatagca	gctatcggac	gttcggtgga	360
ggcaccaagc	tggaaatcaa	acgggctgat	gctgcaccaa	ctgtatccat	cttcccacca	420
tccagtgagc	agttaacatc	tęgaggtgcc	tcagtcgtgt	gcttcttgaa	caacttctac	480
eccaaagaca	tcaatgtcaa	gtggaagatt	gatggcagtg	aacgacaaaa	tggcgtcctg	540
aacagttgga	ctgatcagga	cagcaaagac	agcacctaca	gcatgagcag	caccctcacg	600
ttgaecaagg	acgagtatga	acgacataac	agctatacct	gtgaggccac	tcacaagaca	660
tcaacttcac	ccattgtcaa	gagcttcaac	aggaatgagt	gttaa		705

<210> 23 <211> 464 <212> ΡΟ.Τ <213> Mus musculus <400> 23

Met 1

Asn

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Leu

Ile

Phe

Leu 10

Val

Leu

Val

Leu

Lys 15

Gly

Val

Gin

Cys

Glu 20

val

Met

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Leu .30

Val

Lys

Pro

Gly

Gly 35

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser 40

Cys

Ala

Ser

Gly 4 5

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 50

Tyr

Val

Met

Ser

Trp 55

Val

Arg

Gin

Thr

Pro 60

Glu

Lys

Arg

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Thr

Ile 70

Ser

Gly

Ser 75

Tyr

Thr

Tyr

Pro 80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser 90

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu 100

Gin

Met

Ser

Leu 1C5

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Met

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Gly

Asp 120

Ser

Met

Ile

Thr

Thr 125

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ala

Lys

Thr

Pro

PL 211 733 B1

130

135

140

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

Gin

Thr

Asn

Ser

Met

145

150

155

160

Val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

165

170

175

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Gly

vai

His

Thr

Phe

Pro

160

185

190

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Asp

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ser

Val

Thr

Vsl

195

200

205

Pro

Ser

Thr

Trp

Pro

Ser

Glu

Thr

Val

Thr

Cys

Asn

Val

Ala

His

210

215

220

Pro

Ala

Ser

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Ile

Val

Pro

Arg

Asp

Cys

225

230

235

240

Gly

Cys

Lys

Pro

Cys

Ile

Cys

Thr

Val

Pro

Glu

Va 1

Ser

Vai

Phe

245

250

255

Ile

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

Thr

Pro

260

265

270

Lys

Val

Thr

Cys

Val

Ago

Ile

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

Val

275

2 80

285

Gin

Phe

Ser

Trp

Phe

Val

Asp

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

Gin

Thr

290

295

300

Gin

Pro

Arg

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Ser

val

Ser

Glu

305

310

315

320

Leu

Pro

Ile

Met

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Cys

325

330

335

Arg

Val

Asn

Ser

Ala

Ar a

Phe

Pro

Ala

Pro

Ile

Gu;

Lys

Thr

Ile

Ser

340

345

350

Lys

Thr

Lys

Gly

Arg

Pro

Lys

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Ile

Pro

355

360

365

Pro

Lys

Glu

Gin

Met

Ala

Lys

Asp

Lys

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Met

Ile

370

375

380

Thr

Asp

Phe

Pro

Glu

Asp

Ile

Thr

Val

Glu

Trp

Gin

Trp

Asn

Gly

385

390

395

400

Gin

Pro

Ala

Glu

Asn

Tyr

Lys

Asn

Thr

Gin

Pro

Ile

Met

Asp

Thr

Asp

405

410

415

Gly

Ser

Tyr

Phe

Val

Tyr

Ser

Lys

Leu

Asn

Val

Cln

Lys

Ser

Asn

Trp

420

425

430

Glu

Ala

Gly

Asn

Thr

Phe

Thr

Cys

Ser

Val

Leu

His

Glu

Gly

Leu

His

435

440

445

Asn

His

Thr

Glu

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

Asn

His

450 455 460 <210 24 <211> 234

PL 211 733 B1

PL 211 733 B1 <400 26

Thr Ile Ser Ser Gly	Gly	Ser	Tyr	Thr	Tyr	Tyr Pro Asp Ser	Val Lys
1	5					10		15
Gly
<210	27
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Mus jnusculus
<400>	27
Arg Gly Asp Ser Met	Ile	Thr	Thr	Asp	Tyr
1	5					10
<210	28
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	28
Lys Ala Ser Gin Asp	Val	Gly	Thr	Ala	Val	Ala
1	5					10
<210>	29
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400	29
Trp Ala Ser Thr Arg	His	Thr
1	5
<210	30
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	30
Gin Gin	i Tyr Ser Ser	Tyr	Arg	Thr

5 <210 31 <211> 119 <21 2> PRT <213> konstrukt syntetyczny <4CQ> 31

Glu

val

Met

Leu

val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

1 5

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Val

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

40 45

PL 211 733 B1

Ala

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

35

90

95

Ala

Arg

Gly

Asp

Ser

Met

Ile

Thr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

Thr

Leu

Vał

Thr

Vai

Ser

Ser'

115

<21 0> 32 <211> 80 <212> CNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 32 ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag 60 caacagctac aggtgtccac 30 <210> 33 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 33 tctgaagtaa tgctggtgga gt.ctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga 60 ctctcctgtg cagcctctgg 30 <210> 34 <211> 80 <212> CNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 34 attcactttc agt.agttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga 60 gtgggttgca accattagta 80 <210> 35 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 35 gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 60 acaatgccaa gaacaccctg 80 <210> 36 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 733 B1 <4C0> 36 tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg ttrattactg tgcaagaagg 60 ggtgactcta tgattacgac 30 <210> 37 <211> 64 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 37 ggactactgg ggccaaggga ecctggtcac agtctcetca gcctccacca agggcccatc 60 ggtc 64 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 38 ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa <210> 39 <211;

<212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 39 tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacrteaga gtggacacct gtagctgttg <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 40 tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat 60 ccagaggctg cacaggagag 80 <210> 41 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 41 ctctggagat ggtgaatcgg cccLLcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac 60 tactaatggt tgcaacccac 80 <210> 42 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 733 B1 <400> 42 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 60 cagggtgttc trggcattgt 80 <210> 43 <211> 84 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 43 gaccgatggg cccctggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta 60 gtccgtcgta atcatagagt cacc 84 <210> 44 .

<211> 20 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 44 ttggataagc ttggcttgac <210> 45 <211> 21 <21.2> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 45 gaccgatggg cccttggtgg a <210> 46 <211> 213 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny <400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro

5

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Asp

Val

Gly 30

Thr

Ala

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gir.

Pro

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 100

Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 90 95

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 105 110

PL 211 733 B1

Ser

Val

Phe 115

Ile

Phe

Pro

Ser 120

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys 125

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Prc

Arg

Glu

A.1 a

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

150

155

160

145

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

T,ys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Len

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 47 cccaagctha agaagcatcc tctcatctag ttct <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> konstrukt. syntetyczny <40C> 43 cccoaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctcttt gtgac <210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 49 gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga <210> 50 <211> 48 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 50 ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc <400> 51 agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gttctg <210> 51 <211> 57 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 733 B1 <210> 52 <211> 48 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny .

<400> 32 tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt <210> 53 <211> 63 <212> DNA <213> kcnstrukt syntetyczny <400> 53 ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat 60 ggt ⁶³ <210 54 <211> 63 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400 54 cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact 60 gtg 63 <210> 55 <211> 711 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 55

atggagacag	acacaatcct	gctatgggtg	ctgctgctct	gggttccagg	ctccactggt	60
gacattgtga	tgacccaatc	tccaagttct	ttgtctgcat	ctgtggggga	cagggtcacc	120
atcacctgca	aggccagtca	ggatgtgggt	actgctgtag	cctggtatca	acagaaacca	180
gggaaagctc	ctaaactact	gatttactgg	gcatccaccc	ggcacactgg	ggtcccaagc	240
aggtttagtg	gcagtgggtc	tgggacagac	ttcaccctca	ccatctctag	tctgcagccg	300
gaggattttg	caacctatta	ctgtcagcaa	tatagtagtt	atcggacgtt	cggtcaaggc	360
accaaggtgg	aaatcaaacg	gactgtggct	gcaccatctg	tcttcatctt	cccgccatct	420
gatgagcagt	tgaaatctgg	aactgcctct	gttgtgtgcc	tgctgaataa	cttctatccc	480
agagaggcca	aagtacagtg	gaaggtggat	aacgccctcc	aatcgggtaa	ctcccaggag	540
agtgtcacag	agcaggacag	caaggacagc	acctacagcc	tcagcagcac	cctgacgctg	600
agcaaagcag	actacgagaa	acacaaagtc	tacgcctgcg	aagtcaccca	tcagggcctg	660
agctcgcccg	tcacaaagag	cttcaacagg	ggagagtgtt	agtaagaatt	c	711

PL 211 733 B1

<210	56
<211>	119
<212>	PRT
<210	konstrukt	synretyczuy
<4 00	56
Glu Val	Gin Leu	Val Glu Ser ¹

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Sar Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 3C

Val

Met

Ser 35

Trp

Val

Arg

G1 n

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Thr

Ile

Ser

G1 y

Gly

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 57 rctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg

<210>	53
<211 >	80
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	53

tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg <210> 59 <211> 119 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny <400> 59

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

PL 211 733 B1

	20	25	30
Val Mer	Ser Trp Val Arg Gin	Ala Pro Gly Lys	Gly Leu Glu Trp Val
	35	40	45
Ala Thr	Ile Ser Ser G.ly Gly	Ser Tyr Thr Tyr	Tyr Pro Asp Ser Val
50	55		60
Lys Gly	Arg Phe Thr Ile Ser	Arg Asp Asn Ala	Lys Asn Thr Leu Tyr
65	70	75	60
Leu Gin	Met Ser Ser Leu Arg	Ala Glu Asp Thr	Ala Val Tyr Tyr Cys
	85	90	95
Ala Arg	Arg Gly Asp Ser Met	Tle Thr Thr Asp	Tyr Trp Gly Gin Gly
	100	105	110
Thr Leu	Val Thr Val Ser Ser
	115
<210>	60
<211>	119
<212>	PRT
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	60
Glu Val	Met Leu Val Glu Ser	Gly Gly Gly Leu	Vai Gin Pro Gly Gly
1	5	10	15
Ser Leu	Arg Leu Ser Cys Ala	Ala Ser Gly Phe	Thr Phe Ser Ser Tyr
	20	25	30
Val Met	Ser Trp Val Arg Gin	Thr Pro Glu Lys	Arg Leu Glu Trp Val
	35	40	4 5
Ala Thr	Ile Ser Ser Gly Gly	Ser Tyr Thr Tyr	Tyr Pro Asp Ser Val
50	55		60
Lys Gly	Arg Fhe Thr Ile Ser	Arg Asp Asn Ala	Lys Asr- Thr Leu Tyr
65	70	75	80
Leu Gin	Met Ser Ser Leu Arg	Ala Glu Asp Thr	Ala Val Tyr Tyr Cys
	85	90	95
Ala Arg	Arg Gly Asp Ser Met	Ile Thr Thr Asp	Tyr Trp Gly Gin Gly
	100	105	110
Thr Leu	Val Thr Val Ser Ser
	115
<210>	61
<211>	119
<212>	PRT
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	61
Glu Val	Met Leu Val Glu Ser	Glv Gly Gly Leu	Val Lys Pro Gly Gly
1	5	* 10	15
Ser Leu	Lys Leu Ser Cys Ala	Ala Ser Gly Phe	Thr Phe Ser Ser Tyr
	20	25	30

PL 211 733 B1

Val

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Thr

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

15

80

Leu

Gin

Met

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Cys

05

90

95

Ala

Arg

Gly

Asp

Ser

Met

Ile

Thr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

115

<210> 62 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 62 tatctgcaaa tgaqcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg 60 ggtgactcta tgattacgac 80 <210 63 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400 63 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 6C cagggtgttc ttggcattgt 80 <210> 64 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 64 attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga 60 gtgggttgca accatcagta 80

<210	65
<211>	80
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	65

tccagcctct tctctggact ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag <210 66 <211> 80

PL 211 733 B1 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 66 tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg <210>

<211>

<212>

DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 67 tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac <210>

<211>

<212>

DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 68 ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtc <210>

<211>

<212>

DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 69 tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg <210> 70 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <40()> 70 ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata 60 cagggtgttc ttggcattgt 80 <210> 71 <211>

<212>

DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 71 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta

PL 211 733 B1 <210> 72 <211> 212 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny <400> 72

Asp 1

Ile

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 1 0

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

20

25

30

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

SO

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

SO

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Tyr

Ser

Tyr

Arg

Thr

35

90

95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Giy

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

210 <210> 73 <211> 213 <212> PRT

<21

3> konstrukt

syntetyczny

<400> 73

Asp

Ile Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

20

25

30

Val

Ala Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys.

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

PL 211 733 B1

Tyr Trp 50

Ala

Ser

Thr

Arg

His 55

Thr

Gly

Vai

Pro

Asp 60

Arg

Phe

Thr

Gly

Sar Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Tyr

Ser

Tyr

Arg

Thr

85

90

95

Phe Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Pro

100

105

110

Ser Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Thr Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> '

74

<2ii> :

213

<212> :

PRT

<213>

konstrukt syntetyczny

<400>

74

Asp Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

20

25

30

Val Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

50

55

60

Ser Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Phe

cys

Gin

Tyr

Ser

Tyr

Arg

Thr

85

90

95

Phe Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

val

Ala

Pro

100

105

110

Ser Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115 120 125

PL 211 733 B1

Ala

Ser 130

Val

Cys

Leu

Leu 135

Asn

Phe

Tyr

Pro 140

Arg

G.lu

Al a

Lys

Val 145

Gin

Trp

Lys

Val

Asp 150

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser 155

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin 165

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser 170

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser 175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu 130

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 185

Glu

Lys

His

Lys

Val 190

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val 195

Thr

His

Gin

Gly

Leu 200

Ser

Pro

Val

Thr 205

Lys

Ser

Phe

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210>	75
<211>	213
<212>	PRT
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	75

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

2C

25

30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr

Trp 50

Ala

Ser

Thr

Arg

His 55

Thr

Gly Val

Pro

Asp 60

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

I,eu

Gin

Pro

55

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Tyr

Ser

Tyr

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Prc

100

105

I1C

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

17 5

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

1Θ5

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

PL 211 733 B1

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210>	76
<211>	213
<212>	PRT
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	76

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

His

Lys

Phe 10

Met

Ser

Thr

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Ser

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser'

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

20

25

30

Va]

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Cly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Asn

Val

Gin

Ser

65

70

75

80

Glu

Asp

Leu

Ala

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Tyr

Ser

Tyr

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Ala

Val

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Vał

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pra

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Vai

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Gly

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 77 gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga 60 <210> 78 <231> 65

PL 211 733 B1 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400 78 atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg <210> 79 <211> 69 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 79 cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt 60 cttaagctt 69 <210 SO <211> 67 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400 30 ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagtrct ttgtctgcat ctgtggggga 60 cagggtc 67 <210> 61 <211> 54 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 81 acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag <210 82 <211> 67 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 82 accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa 60 ccaggaa 67 <210 83 <211> 72 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 83 tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt. cccccacaga tgcagacaaa ga <210 84 <211> 71

PL 211 733 B1 <212> DNA

<213> <4 00> aagcacc ttacagę	konstrukt syntetyczny
84 ;caa actcctcatc tattgggcat fcag t	ccacccggca	cactggggtc	ccagataggt	SO 71
<210>	85
<211>	7 2
<21 2>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	85
cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat	gaggagtttg	ggtgcttttc	ctggtttctg	6C
ttggtaccag gc				72
<210>	86
<211>	63
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	86
gggtctcgga cagacttcac cctcaccatc	tctagtctgc	ageeggagga	ttttgcaacc	60
tat					63
<210>	87
<211>	60
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400	87
actagagatg gtgagggtga agtctgtccc	agacccactg	cctgtaaacc	tatctgggac	60
<210>	88
<211>	57 .
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<4Q0>	88
tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg	ttcggtcaag	gcaccaaggt	ggasatc	57
<210	89
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	89
cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta	ataggtLgca	aaatcctccg	gctgcac	57

<210> 90 <211> 51 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 90

PL 211 733 B1

aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc	atcttcccgc	catctgatga	g	51
<210>	91
<211>	63 .
<2i2>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	91
gaagatgaag acagatggtg cagccacagt	ccgtttgatt	tccaccttgg	tgccttgacc	60
gaa					63
<21 0>	92
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	92
ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg	ttcggtcaag	gcaccaaggt	ggaaatc	57
<210>	93
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	93
cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa	ataggttgca	aaatcctccg	gctgcag	57
<210>	94
<211>	63
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	94
gggtctggga cagacttcac cctoaccatc	tctagtctgc	agccggagga	ttttgcagat	60
tat					63
<210>	95
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	95
ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg	ttcggtggag	gcaccaaggt	ggaaatc	57
<2i0>	96
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400	96
cgtccga	tag ctgctatatt gctgacagaa	ataatctgca	aaatcctccg	gctgcag	57

<210> 97 <211> 51 <212> DNA

PL 211 733 B1 <213> konstrukt syntetyczny <400> 97 tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a <210> 98 <211> 51 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 98 tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c <210> 99 <211> 49 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 99 aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc <210> 100 <211> 45 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 100 aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 101 agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa <210> 102 <211> 63 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 102 gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa

PL 211 733 B1

Claims

1. Oczyszczone przeciwciało, które wiąże swoiście receptor DR5 dla TRAIL, posiadające aktywność indukującą apoptozę w nieobecności drugorzędowego wiązania krzyżowego i które nie wiąże się z receptorem DR4, DcR1 lub DcR2 dla TRAIL oraz które zawiera łańcuch ciężki oraz łańcuch lekki, przy czym:

a) łańcuch ciężki zawiera region zmienny zawierający regiony CDR z przeciwciała monklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428; i

b) łańcuch lekki zawiera region zmienny zawierający regiony CDR z przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez TRA-8; i przy czym w regionach CDR jedna reszta może być dodana, pominięta albo zastąpiona.

2. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem monklonalnym.

3. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że DR5 jest ludzkim DR5.

4. Przeciwciało według zastrz. 1, które jest przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428.

5. Przeciwciało według zastrz. 1, które jest humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428.

6. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera:

7. Przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że łańcuch ciężki zawiera region stały łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny G1, przy czym łańcuch lekki zawiera region stały łańcucha lekkiego kappa ludzkiej immunoglobuliny.

8. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera:

(a) łańcuch ciężki, przy czym ten łańcuch ciężki zawiera region zmienny wybrany z grupy składającej się z regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) albo jego funkcjonalnego równoważnika; regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555) albo jego funkcjonalnego równoważnika; regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557) albo jego funkcjonalnego równoważnika; regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) albo jego funkcjonalnego równoważnika; i regionu zmiennego kodowanego przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli JM109/pHMll (FERM BP-7559) albo jego funkcjonalnego równoważnika; i (b) łańcuch lekki, przy czym ten łańcuch lekki zawiera region zmienny połączony z regionem stałym, wybrany z grupy składającej się z regionu zmiennego połączonego z regionem stałym zakodowanym przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5a/pHSG/M2-1-4 (FERM BP-7563) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; region zmienny połączony z regionem stałym, kodowanym przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5a/pHSG/M1-2-2 (FERM BP-7562) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; region zmienny połączony z regionem stałym, kodowanym przez sekwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5a/pHSG/M3-3-2-2 (FERM BP-7564) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; region zmienny połączony z regionem stałym, kodowanym przez se98

PL 211 733 B1 kwencję nukleotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-1 (FERM BP-7565) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem; i region zmienny połączony z regionem stałym, kodowanym przez sekwencję nukłeotydową wstawki wektora przenoszonego przez E. coli DH5a/pHSG/M6-1-4-1 (FERM BP-7566) albo jego funkcjonalnym równoważnikiem.

9. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 8, znamienne tym, że łańcuch ciężki zawiera region stały łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny G1, przy czym łańcuch lekki zawiera region stały łańcucha lekkiego kappa ludzkiej immunoglobuliny.

10. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera:

(a) łańcuch ciężki immunoglobuliny, przy czym ten łańcuch ciężki zawiera region zmienny o wzorze ogólnym region zrębowy 1-CDR1-region zrębowy 2-CDR2-region zrębowy 3-CDR3-region zrębowy 4, CDR1 składa się z reszt aminokwasowych 1-5 z SEK ID NR: 25, CDR2 składa się z reszt aminokwasowych 1-17 z SEK ID NR: 26 i CDR3 składa się z reszt aminokwasowych 1-10 z SEK ID NR: 27; i (b) łańcuch lekki immunoglobuliny, przy czym ten łańcuch lekki zawiera region zmienny o wzorze ogólnym region zrębowy 5-CDR4-region zrębowy 6-CDR5-region zrębowy 7-CDR6-region zrębowy 8, gdzie CDR4 składa się z reszt aminokwasowych 1-11 z SEK ID NR: 28, CDR5 składa się z reszt aminokwasowych 1-7 z SEK ID NR: 29, a CDR6 składa się z reszt aminokwasowych 1-8 z SEK ID NR: 30.

11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość przeciwciała zdefiniowanego w zastrz. 1 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

12. Sposób in vitro wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych wyrażających DR5, znamienny tym, że obejmuje etap doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała zdefiniowanego w zastrz. 1.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że komórkami docelowymi wyrażającymi DR5 są komórki nowotworowe.

14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że komórkami docelowymi wyrażającymi DR5 są zapalne komórki maziówkowe.

15. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że komórkami docelowymi wyrażającymi DR5 są aktywowane komórki T lub komórki B.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że aktywowanymi komórkami T lub komórkami B są aktywowane limfocyty.

17. Zastosowanie przeciwciała jak wymieniono w zastrz. 1 do wytwarzania leku do wybiórczej śmierci komórkowej komórek docelowych lub komórek rozregulowanych.

18. Zastosowanie przeciwciała jak wymieniono w zastrz. 1 do wytwarzania leku do wybiórczej śmierci komórkowej komórek docelowych lub komórek rozregulowanych, przy czym lek ten jest do leczenia podmiotu z chorobą związaną z apoptozą.

19. Zastosowanie przeciwciała jak wymieniono w zastrz. 1 do wytwarzania leku do selektywnej śmierci komórkowej komórek docelowych lub rozregulowanych, przy czym lek ten jest do leczenia osobnika z nowotworem, przy czym lek ten jest w postaci do podawania osobnikowi i przy czym przeciwciało indukuje wybiórczo apoptozę komórek nowotworowych.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że lek zawiera ponadto drugie przeciwciało, które zwiększa śmierć komórkową komórek nowotworowych.

21. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że lek zawiera ponadto czynnik terapeutyczny.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu, doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, pakslitakselu, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

24. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że lek jest do leczenia osobnika z chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, przy czym lek ten jest w postaci do podawania osobnikowi i przy czym farmaceutycznie skuteczna ilość przeciwciała wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych mających receptory DR5.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że komórkami docelowymi są aktywowane komórki T lub komórki B.

PL 211 733 B1

26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że aktywowanymi komórkami T lub komórkami B są aktywowane limfocyty.

27. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że komórkami docelowymi są zapalne komórki maziówkowe.

28. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że obejmuje ponadto podawanie osobnikowi farmaceutycznie skutecznej ilości drugiego przeciwciała, które zwiększa śmierć komórkową komórek docelowych.

29. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że obejmuje ponadto podawanie osobnikowi farmaceutycznie skutecznej ilości czynnika terapeutycznego.

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że tym czynnikiem terapeutycznym jest bisindolilomaleimid albo metotreksat.

31. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że tą chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną jest reumatoidalne zapalenie stawów.

32. Zastosowanie przeciwciała jak wymieniono w zastrz. 5 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u osobnika poprzez indukcję apoptozy komórek nowotworowych.

33. Zastosowanie przeciwciała jak wymieniono w zastrz. 5 do wytwarzania leku do leczenia choroby autoimmunologicznej u osobnika, przy czym przeciwciało to wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych.